JPH05506856A - アテローム性動脈硬化症に関連する単核白血球指向性の内皮接着分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アテローム性動脈硬化症に関連する単核白血球結合性の内皮接着分子関連出願の 相互参照 本出願は米囚特許出願第０７／４８７０３８号（１９９０年３月２日出願）の一 部継続出願である。

発明の分野 本発明は、内皮細胞への単核白血球接着に関与する内皮細胞タンパク質、および 哺乳動物のアテローム性動脈硬化病巣の発生におけるそれらの役割に関する。

発明の背景 血管の内皮裏打ちは通常は血管壁−血液界面での恒常性を維持するうえで重要な 役割を果している（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、　Ｍ、　Ａ、　、　Ｊｒ、　、　”Ｖａ ｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｗ　ｉｎ　Ｈｅｍｏｓ狽≠唐奄■ ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ−（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ 編、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、　）の１頁（１９８６）　：　fｒｙｇｌｅｖｓ ｋｔ、Ｒ，］ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　１２：５３０（１９８８））。し かし、内皮裏打ちに対する変化がアテローム性動脈硬化病巣の発生に関連づけら れている。種々の動物モデルおよびヒト組織の超微細構造研究および免疫組織化 学的研究により、大きい動脈の内側を覆う内皮細胞（Ｅ　Ｃ）に対する血液単核 細胞の接着がアテローム性動脈硬化症において最も初期に検出され得る事象の１ つであることが明らかにされている（Ｇｅｔｒｉｔｙ、　Ｒ，Ｇ、ら、　Ａｍ、 　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　９５　：　７７５（１９７９）　；　Ｇｅｒｒｉｔｙ 、　Ｒ，Ｇ、　、　ＡｍA　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１０３　：　１８１（１９ ８１）　：　Ｇｅｒｒｉｔｙ、　Ｒ，Ｇ、　、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、 　１０３：　１９１（１９８１）　；　Ｊｏｒｉｓ、　１Dら、　Ａ＋＋、　Ｊ 、Ｐａｔｈｏｌ、　１１３：３４１（１９８３）　；　Ｋｌｕｒｆｅｌｄ、Ｄ舅 、、＾ｒｃｈ、　ＰａｔｈｏＬ　Ｌａｂ、　１ｉｅｄ、　１０９　：　４４５（ １９８T）　：　５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　Ｔ。

ら、　Ａｔ　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１００：５７（１９８０）　；　Ｇｏｗｎ 、　Ａ、　Ｍ、ら、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１２T：１９１（１９８ ６）　：　Ｆａｇｇ ｉｏｔｔｏ、　Ａ、ら、　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　４：３２３（１ ９８４）　；　Ｆａｇｇｉｏｔｔｏ、　Ａ、ら、Ａｒｔｅｒ奄盾唐モ撃■窒盾唐 奄■ ４：３４１（１９８４）　；　Ｆｏｗｌｅｒ、　Ｓ、ら、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅ ｓｔ、　４１　：３７２（１９７９）　；　ｆａｔａｎａｂ■Aτ、ら、　Ｌａ ｂ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、　５３：８０（１９８５）　；　ｔａｌｋｅｒ、　Ｌ、　Ｎ、ら、　Ａ ｍ、　Ｊ、　Ｐａｈｔｏｌ、　１２５：４５０（１９８０）@；　Ｓｃｈｗａｒ ｔｚ、　Ｃ，Ｊ。

ら、　Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　Ａｒｃｈ、　（Ｐａｔｈ、　Ａｎａｔ、　）　４０５ ：１７５（１９８５）　：　Ｌｅｖｉｓ、　Ｃ，Ｊ、ら、　`ｎｎ、　ＮＹ　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃ １．４や４：９１．（１９８５））５これに続（単核細胞の経内反移動、脈管内 膜中でのそれらの蓄積および脂質膨潤した“泡沫細胞”への進展は、アテローム 性動脈硬化病巣の開始において重要な過程であると思われる（Ｒｏｓｓ、　Ｒ， 、Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１４：４８８（１９８６）　；Ｄａｖｉ ｅｓ、　Ｐ、　Ｆ、　、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５５　：５（１９８６） 　；Ｍｕｎｒｏ、　Ｊ、　Ｍ、ら、　Ｌａｂ、　Ｉｎ魔■唐煤A　５８：２４９ （１９８ｇ））。

単核細胞およびマクロファージ泡沫細胞は、サイトカインおよび成長因子類を生 産することによってアテローム性動脈硬化病巣の進行にも寄与し得る（Ｌｉｂｂ ｙ、　Ｐ。

、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　９６：４ ９９（１９８７））。次いでこれらは補充を増大し、脈管内膜ヘノ平滑筋細胞の 移動を誘発しくＲｏｓｓ、　Ｒ，、Ｎ、　Ｅｎｇ、　１．１ｌｅｄ、　３１４　 ：　４８８（１９８６）　）、細胞複製を刺激しくＬｉｂｂｙ、　Ｐ、ら、　Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、Ｍｅｄ、　３１８：１４９３（１９８８））、リンパ細胞 補充およびクラスＩＩＭＨＣ抗原の誘導を介して病巣の免疫学的状態を変調させ る（■ａｎｓｓｏｎ、　Ｇ、　Ｋ、ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　９ ：５６７（１９８９））。

白血球移動の最初の過程は、アテローム性動脈硬化症および炎症のどちらにおい ても、内皮裏打ちに対する循環白血球の接着である。アテローム性動脈硬化症で は、動脈脈管内膜中への単核細胞の移動とその結果としてのアテローム性動脈硬 化病巣の形成または拡張が局部的な現象であり（Ｇｅｒｒｉｔｙ、　Ｒ，Ｇ、ら 、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏ１９５ニア７５（１９７９）　；　Ｇｅｒｒｉｔ ｙ、　Ｒ，Ｇ、　、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１０３：１８１（１９８ １）　：　Ｇ■窒窒奄狽凵A　Ｒ，Ｇ、　、　Ａｍ、　Ｊ。

Ｐａｔｈｏｌ、　１０３：　１９１（１９８１）　；　Ｊｏｒｉｓ、　Ｉ、ら、 　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１１３：３４１（１９８R）　：　Ｋｌｕｒ ｆｅｌｄ、　Ｄ、　Ｍ。

、　Ａｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｌａｂ、　１ｌｅｄ−１０９：４４５（１９ ８５）　；　５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　Ｔ、ら、　Ａｍ、　ＪA　Ｐａｔｈｏｌ、 　１００　：５７（１９８０）　：　Ｇｏｗｎ、　Ａ、　Ｍ　ら、　Ａｔ　Ｊ、 　Ｐａｔｈｏｌ、　１２５：　１９１（１９８６）　；　Ｆａｇｇｉｏｔｔｏ、 　ＡAら、　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ。

ｓｉｓ　４：３２３（１９８４）　：　Ｆａｇｇｉｏｔｔｏ、　Ａ、ら、Ａｒｔ ｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　４：３４１（１９８４）　：@Ｆｏｗｌｅｒ、　 Ｓ。

ら、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　４１　：３７２（１９７９）　：　Ｗａｔａ ｎａｂｅ、　Ｔ、ら、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５３：W０（１９８５）　 ；　Ｗａｌｋｅｒ。

Ｌ、　Ｎ、ら、八ｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｓ、　１２５：４５０（１９８６）　 ：　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｃ，Ｊ、ら、　Ｖｉｒｃｈｏｗｓ@Ａｒｃｈ、　（Ｐ ａｔｈ、　Ａｎ ａｔ、　）　４０５：１７５（１９８５）　；　Ｌｅｗｉｓ、　Ｃ，Ｊ、ら、Ａ ｎｎ、　ＮＹＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　４５４　：９１（１９W５）　；　Ｒｏｓ ｓ、　Ｒ，、Ｎ。

Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１４：４８８（１９８６）　：　Ｄａｖｉｅｓ、 　Ｐ、　Ｆ、　、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５５：５（P９８６）　：　１ ｌｕｎｒｏ、　Ｊ−Ｍら。

Ｌｉｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５１１１：２４９（１９８８））、したがって、お そら（局部的機構が機能的に作用しているのであろう。他方、高コレステロール 血症なとの全身性因子は、アテローム性動脈硬化病巣の局在性に間接的に寄与し 得る。

ブタでは、高コレステロール血症が骨髄における単核細胞の副次集団の生産を誘 発し、これは正常コレステロール血症動物からの単核細胞とは異なり単核細胞選 択的化学誘引物質に応答する（Ａｖｅｒｉｌｌ、　Ｌ、　Ｅ、　、　Ａｔ　Ｊ、 　Ｐａｔｈｏｌ、　１３５　：３６９（１９８９）　；　fｅｒ ｒｉｔｙ、　Ｒ，Ｇ、ら、　’Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｌ！ｉｃｓ”（Ｗｅ ｓｔｅｒｈｏｆ、　Ｎ、ら編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）■Q３７頁（１９ ８９））。このような化学誘因物質は、泡沫細胞病巣が発生しやすいブタ大動脈 の領域中に発見されている（Ｇｅｒｒｉｔｙ、　Ｒ，Ｇ、ら、　Ａｒｔｅｒｉｏ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　５：５５（１９８５））。さらに、これらの動物中に認め られる単球増加症は単核細胞補充を容易にし得る。

内皮の超接着性表面変化はタンパク質合成依存性の機構あるいはタンパク質合成 非依存性の機構を介して起こり得る。急性炎症においては、両機構が機能的に作 用しているように思われる（Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、　１．ら、＾ｒａ、　Ｊ 、Ｐａｔｈｏｌ、１３５：２２７（１９８９））。

タンパク質合成依存性機構には内皮−白血球接着分子（Ｅ　Ｌ　ＡＭ）類の発現 が関与しくＣｏｔｒａｎ、　Ｒ，Ｓ、ら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｌｅｄ、　１６４ 　：６６１（１９８６）　：　Ｍｕｎｒｏ、　Ｊ、　１１．ら、Ａ香AＪ、Ｐａ ｔｈｏｌ、１３５：１ ２１（１９８９））、内皮の活性化を示す（Ｃｏｔｒａｎ、　Ｒ，、Ｓら、　” Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ 、　Ｎら編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の３ ３５頁（１９８ｇ））、このような内皮の表面構造物の数種が同定されており、 その中には内皮白血球接着分子−１（ＥＬ　ＡＭ−Ｉ　ＸＢｅｖｉｌａｃｑｕａ 、　Ｍ、　Ｐ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　：８４　：９２３W（１９８７）　；　Ｂｅｖｉｌ ａｃｑｕａ、　Ｍ、　Ｐ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１１６０（１９８９ ））、Ｉ　ＣＡ　Ｍ−１（Ｓｍｉｔｈ、　Ｃ，ｆ　ら、　１D　Ｃ１１ｎ、　Ｉ ｎ ｖｅｓｔ、　８３：２００８（１９８９）　：　Ｓｉｍｍｏｎｓ、　Ｄ、ら、　 Ｎａｔｕｒｅ　３３１：６２４（１９８８）　；　５ｔａｕ獅狽盾氏A　Ｄ、　 Ｅ、ら、Ｃ ｅ１ｌ　５２：９２５（１９８８））、Ｉ　ＣＡ　Ｍ−２（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、 　Ｄ、　Ｅ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：６１（１９８９）j、Ｉ Ｎ　ＣＡＭ−１１０（Ｒｉｃｅ、　Ｇ、　Ｅ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１ ３０３（１９８９））、およびＶＣＡＭ−１（Ｏｓｂｏｒｎルら、Ｃｅ１ｌ　５ ９：１２０３（１９８９））が含まれる。培養ＥＣおよび炎症反応において、そ れらの発現は細菌内毒素（リボ多糖、ＬＰＳ）および炎症性サイトカイン（イン ターロイキン−１，Ｉ　Ｌ−１および腫瘍壊死因子、ＴＮＦ）によって上方調節 される。

これらのＥＣ接着分子のいくつかは白血球選択性を示す。例えば、ＥＬＡＭ−１ は主として好中球の接着を援助するが、リンパ細胞またはリンパ系細胞系統の接 着を援助しないようである。ＩＣＡＭ−１は、そのＣＤ１１ａ／ＣＤ１８との相 互作用を介して、種々のＥＣ−白血球相互作用に関与し得る（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ 、　Ｔ、人、、Ｎａｔｕｒｅ　３４６：４２５−４３４（１９９０））。Ｉ　Ｎ ＣＡＭ−１１０（Ｒｉｃｅ、Ｇ、Ｅ、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、ＩＩＩｅｄ、１７１：１ R６ ９（１９９０））とも同定されているＶＣＡＭ−１は、ＥＬＡＭ−１およびＩＣ ＡＭ−１とは対照的に、ヒト単核細胞、リンパ細胞、骨髄単核細胞性およびリン パ細胞性の白血球細胞系統の接着を援助するが、末梢血液好中球の接着を援助し ない白血球接着分子である（Ｏｓｂｏｒｎ、　Ｌ、ら、　Ｃｅ１ｌ　５９：　１ ２０３（１９８９）、　Ｒｉｃｅ、　Ｇ、　Ｅ、ら、　Ｊ、　ＥＸｐ、@１ｌｅ ｄ、　１７１　： １３６９（１９９０））。

ＥＬＡＭ分布の様式が王として正常組織および炎症状態で調べられている。ＥＬ ＡＭ−１は正常な成人組織によっては発現されず、炎症においては毛細管後の細 静脈および小静脈の内皮中でのみ誘導される（Ｃｏｔｒａｎ、　Ｒ，Ｓ、ら、　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｌ［ｅｄ、　１６４　：６６１−６６６（１９８９）　：　Ｃ ｏｔｒａｎ、　Ｒ，Ｓ、ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０：　１８８３− １８８６（１９８８）　F　Ｍｕｎｒｏ、　Ｊ、　Ｍ、ら。

Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｂｏｌ、　１３５：１２１−１３３（１９８９））。ＩＣ ＡＭ−１は内皮および他の細胞型中で構成的に発現されるが（Ｄｕｓｔｉｎ、　 Ｍ、　Ｌ、ら、　Ｊ、　Ｉｍ＋ｕｎｏ１．１３７・２４５−２５４（１９８６） ）、種々の病態生理学的環境下で上方調節され得る。炎症反応では、ＩＣＡＭ− １の増大した内皮発現が主として毛細管後の細静脈および小静脈に限定されるが （Ｃｏｔｒａｎ、　Ｒ，Ｓ。

ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０＋　１８８３−１８８６（１９８８）　 ；　Ｍｕｎｒｏ、　Ｊ、　Ｍ、ら、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔ■盾戟A　１３５： １２１−１３３（１ ９８９））、これは正常な細動脈の内皮中でも検出されている（Ｆａｕｌｌ、　 Ｒ，Ｊ、およびＲｕ５ｓＧ、　Ｒ，、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　４８：２２６−２ ３０（１９８９））。

過去に記述されたＥＬＡＭ類はいずれもアテローム性動脈硬化病巣中で立証され たことがなく、またこのような病巣の発生および／または進行に関連づけられた こともない。

発明の要約 本発明は、内皮細胞が発現するＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ類と命名されたタンパク 質分子群に関する。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ類は単核白血球に対して選択的であ り、内皮細胞に対する単核細胞およびリンパ細胞の接着に関与し、血管中の初期 アテローム性動脈硬化病巣のマーカー（標識）である。また本発明は、ＡＴＨＥ ＲＯ−ＥＬＡＭに対して特異的なモノクローナル抗体、およびアテローム性動脈 硬化症の診断ならびにその進行の干渉におけるこれらのモノクローナル抗体の使 用に関する。さらに本発明は、アテローム性動脈硬化症の進行を干渉するための 可溶型ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ類の使用に関する。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、大動脈内皮細胞（ＡｏＥＣ）および工大静脈細胞（ＩＶＣＥＣ）に対 するＵ９３７細胞の接着のレベルを表示するグラフである。接着を、大腸菌ＬＰ Ｓ（１ｎｇ／ｍｌ）による内皮細胞の活性化後の時間の関数として測定する。

図ＩＢは、ＬＰＳによるＩＣＶＥＣの活性化後０時間および５時間におけるＩＶ ＣＥＣへのＵ９３７細胞の接着に対するシクロへキサミド（ＣＨＸ、１０μｇ／ ＋１）の効果を示す棒グラフである。

図ＩＣは、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｒｂ２／３およびＲｂｌ／９のＡ。

ＥＣに対する結合と、モノクローナル抗体Ｒｂ１／９のＩＶＣＥＣに対する結合 を表示するグラフである。Ｍ、Ａ、ｂｉ＠合を、大腸菌ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ） による内皮細胞の活性化後の時間の関数として測定する。

図ＩＤは、ＬＰＳによるＩＶＣＥＣの活性化ｉ＆０時間および５時間におけるＭ Ａｂ　Ｒｂｌ／９のＩＶＣＥＣへの結合に対するシクロへキサミドの効果を示す 棒グラフである。図ＩＤ中の挿入図は、ＬＰＳによってその発現が変化しなかっ たＥＣ抗原に対するＭＡｂ　Ｒｂ２／３の結合がＣＨＸによる影響を受けなかっ たことを示している。

図２は２つの棒グラフからなる。左の棒グラフは、ＬＰＳによる活性化５時間お よび２４時間後の静［ｔＥＣに対するＵ９３７細胞の接着を示す。

右の棒グラフは、ＬＰＳによる静脈ＥＣ細胞の活性化０時間、５時間および２４ 時間後における、該ＥＣへのＵ９３７細胞の接着に対するＭＡｂ　Ｒｂｌ／９、 Ｒｂ２／４およびＲｂ２／３前処理の効果を表す。

図３は、１８時間ＬＰＳ処理したウサギ大動脈内皮に対する白血球接着のＦ（ａ ｂｏ）、断片による阻害を表す棒グラフである。４℃（白い棒）においてＲｂ　 １／９Ｆ（ａｂ’）２はＵ９３７、ＨＬ６０およびＴ　ＨＰ−１ｍＦ＆系統ｆ； 　ラＵｌニー　’ｃ　ト血液単核細胞およびリンパ細胞の接着を有意に阻害した （上段）。Ｕ９３７およびＨＬ６０接着は３７℃で行った検定でも阻害された（ 黒い棒）。Ｒｂ２／４またはＲｂ２／３　Ｆ（ａｂ’）２では、有意な接着の減 少は観測されなかった（中段および下段）。

図４はウサギ大動脈の免疫化学的染色を表す写真である。（Ａ−Ｄ）１％コレス テロール飼料を９週間与えたウサギから得た下行胸大動脈中に位置する同じアテ ローム性動脈硬化病巣の凍結切片（矢印は病巣の縁を示す）。（Ａ、）　ＭＡｂ 　ＣＧＡ７を用いて平滑筋に関して染色したもの。（Ｅ）ＭＡｂ　ＲＡＭ１１を 用いてウサギマクロファージに関して染色したもの。（Ｃ，Ｄ）Ｒｂｌ／９を用 いてＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに関して染色したもの。（Ｃ挿入図、ヤギ抗ヒトー フォンヴイレプラント因子（ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ）、 Ｉ　ｇＧの１／３０００希釈液、　Ａｔ１ａｎｔｉｃＡｂ。、線＝５０μｆｆ１ ）。（Ｄ挿入図、培養上清、線；１０μｌ１１）。（Ｅ）１８週ＷＨＨＬウサギ の大動脈回申の脈管内膜泡沫細胞豊富病巣を覆うＥＣのＲｂｌ／９染色（線＝１ ０μｍ）。ＣＦ）規定食高コレステロール血症のウサギの下行胸大動脈中の小さ い泡沫細胞凝集に伴う病巣ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ発現（線＝１００μＩｍ）。

図５ＡおよびＢは還元５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを 表しており、このオートラジオグラムはＭＡｂ　Ｒｂｌ／９によるポリペプチド の特異的間接免疫沈降を立証している。

図６は、精製された９８Ｋ　ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭのＮ末端アミノ酸配列（配 列番号２、アミノ酸１〜２２）とヒトＶＣＡＭ−１の予想Ｎ末端配列（配列番号 ７、アミノ酸１〜２２）の間の相同性を表す。

す。図中の下線部は、Ａ　５−ＩＩＩと命名された新たに同定された二者択一的 にスプライスされる領域を示す。ウサギＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを、そのＮ末端 アミノ酸配列（図６）に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＬＰＳで 刺激（４時間）したウサギ静脈内皮から得たｍＲＮＡを用いて構築したラムダｇ ｔｌｌｃＤＮＡライブラリーからクローン化した。

図８は、ウサギＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの推定アミノ酸配列（配列番号２）を表 す。

トＶＣＡＭ−１（配列番号３）のＡ、Ｓ−１ドメインを表し、両者を比較したも のである。

図１０は、Ｉ＝　トＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡｌ、：関して、Ａ　Ｓ　−Ｉ　ト命名 すＦＬり二者択一的にスプライスされるヒトエクソン（配列番号３および５）の ヌクレオチド配列、推定アミノ酸配列、およびその位置を表す。潜在的Ｎ−結合 型グリコシル化部位に下線を付す。

造を表す（配列番号７）。この配列を０２またはＨ型免疫グロブリン領域中の保 存されている残基（ｔｌｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｔ、ら、　Ａｄｖ、　ｉｎ　 工Ｉｌ１ｍｕｎｏＬ　４４：　１−６３（１９８９））に対し■■ べた。各ドメイン中でジスルフィド橋を形成するシスティン残基を矢印で示す。

図１２は、ヒトＡｓ−Ｉ（配列番号５）およびドメイン１（配列番号７．アミノ 酸１〜８９）の構造上の相同性を表す。検査のうえ配列を並列させ、相同領域を 四角で囲んだ（上側がＡＳ−Ｉ、下側がドメイン１）。

図１３Ａは、ＩＬ−１で活性化したヒト謄内皮中のＶＣＡＭ−１の７および６免 疫グロブリン様ドメイン型の同定を表す。ドメイン３および５の領域に対応する プライマーを上部の矢印で示すように用いてＰＣＲを行った。これらのプライマ ーはＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡからそれぞれ７４０ｂｐおよび４６４ｂｐのＡＳ−Ｉ ドメインを伴う生成物およびＡＳ−１ドメインを伴わない生成物を生成するはず である。

ドメイン３、ＡＳ−Ｉ、およびドメイン４の下線部に対応するオリゴヌクレオチ ドプローブを用いるサザンブロソティングによって、両方の分子種の存在を確認 した。予想どおり、ドメイン３およびドメイン４プローブは７４０ｂｐ種および ４６４ｂｐ種の両方とハイブリッド形成し、ＡＳ−Ｉプローブは７４０ｂｐ生成 物とだけハイブリッド形成する。ＰＣＲによって増幅される領域の５°側に位置 するドメイン２プローブはどちらの生成物ともハイブリッド形成しなかった（右 側レーン）。上記のプローブはすべて、ＶＣＡＭ−１の７つの細胞外免疫グロブ リン様ドメインをまたぐプライマーで作成した２、０５ｋｂのＰＣＲ生成物とハ イブリッド形成した（ドメイン２プローブでの結果を示す、左側レーン）。関連 するハイブリッド形成を矢印で示す。分子量標準は、Ｈ１ｎｄｒＩＩおよびＢｓ ｔＥＩＩで消化したバクテリオファージλＤＮＡである（右）。

図１３Ｂは、還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを表し、 このオートラジオグラムは、表面ヨウ素処理しＴＮＦで処理（２４時間）したヒ ト謄静脈内皮細胞由来の１１０ｋＤポリペプチドのＭＡｂ　Ｅｌ／６による免疫 沈降を立証している（Ｃは対照、非結合性ＭＡｂ）。同一の結果が、Ｅ１／６と 同様にヒトＶＣＡＭ−１を指向するＭＡ、ｂＨｕ８／４でも得られた。

履エユは、ヒトＶＣＡＭ−１（ｆ！列番号７）およびウサギＡＴＨＥＲ○−ＥＬ ＡＭ（配列番号２）のアミノ酸配列を表す。面配列を図１１と同様に並列させた 。“ＳＰ”はシグナルペプチドを表し、“ＴＭ／Ｃｙｔｏ”は質膜および細胞質 領域を表し、質膜領域に下線を付す。ウサギＡＳＩＩＩエクソンに対応するヒト Ａ　５−ＩＩエエクソン領域を同定した。

発明の詳細な説明 本発明は、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭと命名された新規ＥＬＡＭに関する。

用語“ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ”は、進行中／活性アテローム性動脈硬化の部位 で発現される内皮細胞表面タンパク質であって、白血球−内皮接着に関与するタ ンパク質を意味する。

用語“ＶＣＡＭ−１”は、いくつかのサイトカインによって内皮細胞の表面上に 誘導される免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素を意味する。

タンパク質に関する“本質的に純粋型の２という表現は、そのタンパク質が生物 学的起源の他の成分を含有しないことを意味する。

抗体に関する用語“結合特性”は、その抗体が特異性を示すタンパク質またはそ の断片を認識し、結合し得る分子を意味する。

タンパク質またはポリペプチドに関する用語“単核細胞結合等価体“または“単 核白血球結合等価体”は、そのタンパク質またはポリペプチドと１以上のアミノ 酸が異なっているにもかかわらず、やはり単核細胞または単核白血球に結合し得 る第２のタンパク質またはその断片を意味する。

用語“４へＴＨＥＲ，Ｏ−ＥＬＡＭの水溶性部分”は、ＡＴＨＥＲ，Ｏ−ＥＬＡ Ｍの細胞外部分を意味する。本発明によれば、この水溶性部分は配列番号２のア ミノ酸１〜７７４を含有する。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの誘導および検定ＡＴＨＥＲ〇−ＥＬＡＭは細菌内毒素 リポ多糖（ＬＰＳ）によって内皮中に誘導され得る。培養において、誘導性内皮 細胞表面タンパク質が単核細胞様Ｕ９３７細抱の接着を援助する。Ｕ９３７接着 はＬＰＳ処理の１〜２時間後に基礎レベルを越えて増大し始め、６〜８時間で最 大値に達し、９６時間維持され続ける。シクロへキンミドによるタンパク質合成 の阻害はこの接着性変化を阻害する。

最初に、単核細胞−内皮接着相互作用の研究を容易にするためにインビトロ系を 開発した。ニューシーラント白ウサギの大きい血管（大動脈および工大静脈）か らＥＣ培養を樹立した。裏返した血管から、それぞれ０．２％または０．４％コ ラ−ゲナーゼを用いてＥＣを単離し、ゼラチン被覆組織培養プラスチック上で、 ２０％胎児ウン血清（ＦＢＳ）、１０〜２０　μｇ／ｍｌ　Ｅ　Ｃミトゲン（Ｂ ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）、および２０ 〜４０　μｇ／ｍｌブタ腸ヘパリン（Ｓｉｇｍａ、等級Ｉ）を含有する培地１９ ９（ハンクス塩類）中で培養した（Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、　Ｉら、　ＦＡＳ ＥＢ　Ｊ、　２　：Ａ１Ａｌ６０３（１９８；　Ｄａｎｔｈｕｌｕｒｉ、　Ｎ、 　Ｒ，ら、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２５５（Ｂｅａｒｔ　Ｃ１ｒｃ 、@ＰｈｙｓｉｏＬ　２４）　：ｌｌ１１ ５４９−Ｈ１５５３（１９８８））。これらの細胞は成長して、分化した内皮に 特徴的な性質を示す全面単層を形成した。グラム陰性菌内毒素（リポ多糖、ＬＰ Ｓ）によるウサギＥＣの活性化は、ウサギ白血球（Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、　 １．ら、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　３：Ａ１３１９（１９８９））およびヒト血液単 核細胞（Ｔｅｒｒｉｔｏ、　Ｍ、　Ｃ，ら５〜ｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ 　９：８２４（１９８９）　；　Ｂｅｒｌｉｎｅ秩A　Ｊ Ａ、ら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８５：　１２６０（１９９０） ）で例証された超接着性表面変化をもたらした。

単核細胞と類似の接着特性を有するヒト白血球細胞系統であるＵ９３７細胞（Ｄ ｉｃｏｒｌｅｔｏ、　Ｐ、　Ｅ、ら、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７ ５：１１５３（１９８５））を選択することによって、この接着性変化をさらに 特徴づけた。比較のためにヒト前骨髄球ＨＬ６０細胞系統を用いた。ウサギ大動 脈および静脈ＥＣに対するＵ９３７接着はＬＰＳ処理の１〜２時間後に基礎レベ ルを越えて増大し始め、６〜８時間で最大に達し、９６時間維持され続けた。シ クロへキシミドによるタンパク質合成の阻害はこの接着性変化を排除した。ＨＬ ６０細胞についても同様の結果が得られた。

ＡＴＨＥＲＯＥＬＡＭに対するモノクローナル抗体Ｕ９３７接着の増大を媒介す るＥＬＡＭ類を同定するために、誘導性ＥＣ表面抗原に対するモノクローナル抗 体（Ｍ、Ａｂ）を作製した。ＬＰＳで活性化したＥＣに対して生成したＭＡｂの パネルの中から、Ｒｂｌ／９、Ｒｂ２／３およびＲｂ２／４と命名された３種の ＭＡｂ（これらはすべてＩｇＧ、免疫グロブリンである）を、細胞表面蛍光免疫 検定においてＬＰＳ誘導性ＥＣ表面抗原を認識するそれらの能力ゆえに選択した 。ＭＡｂ　Ｒｂｌ／９の結合の経時変化はＵ９３７細胞に関するＥＣ接着性変化 と類似しており（非処理ＥＣでは低く、６〜８時間で最大に達し、９６時間持続 した）、シクロへキシミド処理は基礎単層および活性化された単層の両者におい てＲｂ１／９抗原表面発現を除去した。ＭＡｂ　Ｒｂ２／４の結合特性図は基本 的にＲｂｌ／９のものと同一であったが、ＭＡｂ　ＲＢ２／３はより高い基礎発 現と持続的なＬＰＳ誘導上昇を伴う表面モビトープを認識した。

次に、Ｕ９３７接看の援助におけるこれらの誘導性ＥＣ表面抗原の機能上の役割 を接着遮断検定法で評価した。Ｒｂ１／９の飽和濃度による前処理は、基礎ＥＣ 単層および５時間もしくは２４時間活性化したＥＣ単層に対するＵ９３７接看を 有意に阻害した。対照的に、同じ免疫グロブリンクラスに属する他のＭＡｂでは 、Ｒｂｌ／９と同じ分子を認識すると思われるＲｂ２／４およびＲｂｌ／９より 高い密度で基礎および活性化ＥＣ表面に結合するＲｂ２／３を含めて、接着の減 少が認められなかった。対照およびＬＰＳ処理したウサギＥＣ上に高レベルで発 現される構成抗原を認識するＭＡｂ　Ｒｂ２／１３もＵ９３７接着を阻害しなか った。いずれのＭＡｂもＨＬ６０細胞接着を阻害しなかった。これらの結果（転 車核細胞様Ｕ９３７細胞の接着の遮断におけるＲｂ１／９の特異性を立証するも のであり、Ｒｂｌ／９を結合するエピトープが単核白血球の接着にとって重要で あることを示している。

インビトロで単核細胞接着を援助すると思われる誘導性ＥＣ表面タンパク質を同 定したので、じゆく層形成におけるその発現を調べるために、免疫組織化学的技 術を用いた。１％高コレステロール血症飼料を与えたウサギおよびＷａｔａｎａ ｂｅ遺伝性高脂肪血症ウサギでは、泡沫細胞が豊富な脈管内膜病巣を覆う大動脈 内皮に、その種々の進展段階において、Ｒｂ１／９による特異的染色が局在化し た。脈管内膜病巣の縁を越えて、泡沫細胞の極めて小さい脈管内膜蓄積を伴う領 域に集中的に広がるＥＣの染色はとりわけ興味深い。これらの高コレステロール 血症動物の単純な領域中の大動脈ＥＣは、正常なウサギの大きい動脈および静脈 と同様に、一様に染色されなかった。この選択的な免疫組織化学的染色様式は、 Ｒｂｌ／９によって認識される誘導性ＥＬＡＭがＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭである ことを明らよって決定した。Ｒ，ｂｌ／９は、生合成的に標識したＬＰＳ活性化 ＥＣ単層の全細胞溶解液から、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥで相対分子量１１８におよ び９８Ｋを示す２種類のポリペプチドを免疫沈降させた。表面ヨウ素処理した単 層から得た細胞溶解液を免疫沈降することによって決定したところ、これらのポ リペプチドは両方ともＥＣ表面上に発現されるようであった。これらのポリペプ チドの関係をウェスタンブロッティングでさらに調べた。Ｒｂ１／９を結合する エピトープが両ポリペプチド上に見つかり、このことはこれらがヘテロニ量体的 複合体でないことを示唆している。総合すると、これらの免疫化学的データは、 ＭＡｂＲｂ１／９によって認識される誘導性分子が、ＥＣ表面に２つの形態で発 現される新たに合成されたタンパク質であることを示している。ＭＡｂ　Ｒｂ２ ／４はＲｂ１／９と類似の免疫沈降様式を示し、交差免疫沈降によって、両ＭＡ ｂが同じタンパク質を認識することが明らかになった。

ヌクレオチド配列 Ｒｂｌ／９によって認識される上記２つのポリペプチドの一次構造を解明するた めに、これらをＬＰＳで処理したウサギの肺から免疫アフィニティークロマトグ ラフィーおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて精製し、イモピロン−Ｐ　（Ｉｍｍｏ Ｍｌｏｎ−Ｐ）に電気的に転移させ、Ｎ末端アミノ酸配列を得た。

９８にバンドは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの最近クローン化さ れたサイトカイン誘導性構成要素であるヒトＶＣＡＭ−１の予想Ｎ末端配列（配 列番号７．アミノ酸１〜２２）と高い相同性（２２アミノ酸中２０１図６：配列 番号２、アミノ酸１〜２２）を示した。ＶＣＡＭ−１はヒトＥＣの表面上で同定 されており、ＥＣに対する単核白血球の結合を媒介する。ヒトＥＣによるＶＣＡ Ｍ−１の発現は炎症性サイトカイン・インターロイキン−１および腫瘍壊死因子 −αによって誘導された（Ｏｓｂｏｒｎら）。

Ｎ末端アミノ酸配列（図６ｌ配列番号１．アミノ酸１〜２２）に基づくオリゴヌ クレオチドプローブを用いて、ウサギ内皮細胞ラムダｇｔｌｌｃＤＮＡライブラ リーからＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭをクローン化した。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ　 ｃＤＮＡクローン（その読み取り枠のヌクレオチド配列を図７に示す：配列番号 １）は２つの質膜タンパク質をコード化しており、その一方は８つの細胞外免疫 グロブリン様ドメインを伴い、他方は７つの細胞外免疫グロブリン様ドメインを 伴っていた（図１４）。これら２つのタンパク質は、質膜ドメインに隣接する追 加の細胞外免疫グロブリン様ドメイン１つの存在を除いて同一であった。ＡＳ− ＨＩと命名したこのドメインは、二者択一的なｍＲＮＡスプライシングの結果で ある。

ＡＳ−ＩＩＴドメインは、ウサギＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ読み取り枠中のヌクレ オチド２０６０〜２３２６の配列を有する２６７塩基対（図７．下線部の配列： 配列番号７．ヌクレオチド２０６０〜２３２６）によってコード化されている。

二者択一的なｍＲＮＡスプライシングによって生じるＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの ２つの型の存在は、ＭＡｂ　Ｒｂｌ／９による免疫沈降（図５）によって同定さ れた、同じＮ−末端アミノ酸配列を有する（図６）２つの異なるポリペプチドの 説明となる。

ＡＳ−ＩＩＩドメインは、発表されたヒトＶＣＡＭ−１の配列（Ｏｓｂｏｒｎ、 　Ｌら、Ｃｅ１ｌ　５９：１２０３−１２１１（１９８９））中では同定されな かった。

ウサギＡＴＨＥＲ〇−ＥＬＡ、Ｍ細胞外免疫グロブリン様ドメインの６つは、ヒ トＶ　ＣＡ　Ｍ−１（Ｏｓｂｏｒｎ、　Ｌ、ら、Ｃｅ１１５９：１２０３−１２ １１（１９８９）　；図１４．配列番号２）と高度に相同である。ＡＳ−工ＩＩ ドメインに加えて、第２の新しい免疫グロブリン様ドメインが同定された。ＡＳ −１と命名されたこのドメインはドメイン３とドメイン４の間に位！しており（ 図１４）、２７６塩基対から構成されており、図７のヌクレオチド９２９〜１２ ０７（配列番号６）によってコード化されている。ＡＳ−Ｉは、この領域を覆う ウサギＡＴＨＥＲＯ−ＥＬ、Ａ、Ｍ　ｃＤＮＡクローンのすべてに存在した（図 １４：配列番号２）。

ヒトＶＣＡＭ　１におけるＡＳ−１ドメインの同定ヒトＶＣＡＭ　１におけるＡ Ｓ−１ドメインを同定し、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭとＶＣＡＭ−１をさらに比較 するために、ＶＣＡＭ−１の細胞外領域に対応する部分的ｃＤＮＡを、丁Ｌ−１ で刺激したヒト贋静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ｍＲＮＡからＰＣＲによって作製 した。このｃＤＮＡは２．０５ｋｂ長であり、発表されたヒトＶＣＡＭ−１配列 （Ｏｓｂｏｒｎら）から予想され得るものより約０．２５ｋｂ長かった。

配列決定によれば、この増幅されたｃＤＮＡのコード化領域は過去に報告された ＶＣＡＭ−Ｉ　ＨＵＶＥＣｃＤＮＡクローン（Ｏｓｂｏｒｎら）のアミノ酸残基 １から３０９（配列番号７）までと同一であり、この位置から配列が異なってい た。ヌクレオチドＩノベルでは、これらの配列は発表された配列のｂｐ１０３４ までが同一であり、その後に２７６ｂｐ（図１０；配列番号３）が挿入されてお り、その後再び２つの配列が同一であった。この転写構造の相違は、第３免疫グ ロブリンドメインと第４免疫グロブリンドメインの間の９２残基によって、予想 されるタンパク質を延長する。

この追加領域のアミノ酸配列はウサギＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ　ＡＳ−Ｉドメイ ン（図９）と相同であった。ＡＳ−１はＣ２またはＨ型の免疫グロブリン様ドメ インであり（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｔ、ら、　Ａｄｖ、　ｉｎ、　Ｉｍ＋ ｍｕｎｏ１．４４．１−６３（１９８９））、ＶＣＡＭ−１の■ の６細胞外ドメインと一致する。さらに、この配列はＮ末端免疫グロブリン様ド メイン（ドメイン１）と７３％相同であった（図１２：ＡＳ−１，配列番号５． ドメイン１．配列番号７．アミノ酸１〜８９）。ＡＳ−１ドメインは追加の潜在 的Ｎ結合型グリコリル化部位をも含有する。

２つのＶＣＡＭ−１転写物が二者択一的なｍＲＮＡスプライシングによって誘導 されることを立証するために、ヒトＶＣＡＭ−１遺伝子の対応する領域をヒトゲ ノムライブラリーからクローン化した。ウサギの部分的ｃＤＮ、Ａを用いてヒト ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、１つのファージクローン を得た。ＡＳ−１ドメインは、ドメイン３およびドメイン４を含有するエクソン の間に位置する１つのエクソンに対応した。ＡＳ−Ｉエクソンに隣接するスプラ イス供与配列およびスプライス受容配列はコンセンサスに一致する（ＳＩｏｉｔ ｈ、　Ｃ，Ｉｌｌ、　Ｊ。

ら、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２３：５２７−５７７（１９８９） ）。Ａ　Ｓ　−Ｉ　エクソンのヌクレオチド配列はＰＣＲ°増幅によって得たｃ ＤＮＡ配列のものと同一であった。ＶＣＡＭ−１細胞外ドメインのＰＣＲ増幅に よって生成した２、０５に、ｂ生成物（図１３Ａ）は、７ドメイン型が主要なｍ ＲＮＡ種であることを示唆した。

ＩＬ−ＩＦ活性化り、たＨＵＶＥｃＪ＜ＶＣＡＭ−１ｍＲＮＡの両方の型を発現 することを確認するために、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）　Ｐ　ＣＲを利用した 。１次鎖ｃＤＮＡ合成と第１回ＰＣＲ（実施例１５を参照のこと）には同一のプ ライマ一群を用いたが、ドメイン３およびドメイン５中の領域のためにネステッ ドプライマー（ｎｅｓｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）を選択した（それぞれ、ＡＡＴＴ ＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＧＡ、Ｇ。

配列番号８、およびＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡＴ、配列番号９）。臭化 エチジウム染色ならびにドメイン３、ＡＳ−１，およびドメイン４の領域に対す るオリゴヌクレオチドプローブを用いるサザンブロッテイングによれば、主要な ＰＣＲ生成物は７４０ｂｐであり（図１３Ａ）、これは７ドメイン型と一致した 。しかし、ＡＳ−１プローブとハイブリッド形成しない４６４ｂｐ生成物も同定 され、ＶＣＡＭ−１の６免疫グロブリンドメイン型がＨＵＶＥＣによって発現さ れることが確認された。

７ドメインＶＣＡＭ−１ｍ、ＲＮＡが活性化されたＨＵＶＥＣ中で主要であると いう観測結果は、生合成的に標識した細胞のモノクローナル抗体Ｅ１／６による 免疫沈降によって決定した１１０ｋＤタンパク質の発現と一致する（Ｒｉｃｅ、 　Ｇ、　Ｅら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１３０３−１３０６（１９８９））。Ｅ１／６は活性 化されたＨＵＶＥＣに対する白血球接着を遮断しくＲｉｃｅ、　Ｇ、　Ｅら、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：　１３０３−１３０６（１９８９）　；　Ｒｉｃｅ、 　Ｇ、　ＥAら、Ｊ Ｅｘｐ、　１ｌｅｄ、　１７１　：　１３６９−１３７４（１９９０））、ＭＡ ｂ　Ｅｌ／６およびＨｕ８／４ｔ＝よる表面ヨウ素処理ＨＵＶＥＣの免疫沈降は １１０ｋＤポリペプチドのみを検出した（図１３Ｂ）。

総合すると、これらのデータは、活性化されたＨＵＶＥＣ表面において単核白血 球の接着を援助するのが７ドメイン型であることを示唆している。トランスフェ クションされたＣＯ８細胞上で発現される６ドメインＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡも単 核白血球接着を援助する（Ｏｓｂｏｒｎ、　Ｌ、ら、Ｃｅ１１５９：１２０３− １２１１（１９８９）　；　Ｅｌｉｃｅｓ、　Ｍ、　Ｊ。

ら、Ｃｅ１１６０：５７７−５８４（１９９０））。こコニ立証したヒトＶＣＡ Ｍ−１遺伝子ノ二者択−的なスプライソングを考慮すれば、７ドメイン型と６ド メイン型は異なる親和性または特異性の微妙な相違を有し得ると考えられる。

好ましい呼種の説明 ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭをコード化しているＤＮＡを用いることによって、ＡＴ ＨＥＲ○〜ＥＬＡＭの可溶型をコード化する遺伝子構築物を作製することができ る。質膜ドメインの直ぐ５′側の終始コドンを含有するｃ　Ｄ　？’Ｊ　Ａを遺 伝子的に加工処理することによって可溶性質膜タンパク質を製造することができ る。適切な細胞中で発現される場合、このｃＤＮＡから合成されたタンパク質は 分泌され、これを培養培地から回収することができる。

さらに本発明はＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを認識する抗体に関する。ＡＴＨＥＲＯ −ＥＬＡＭを認識する抗体は、予めＬＰＳで活性化しておいた培養ウサギ下大静 脈（ＩＶＣ）細胞でマウスを免疫化することによって製造され得る。免疫化した マウスの膵臓細胞を、当該技術分野で既知の方法を用いて骨髄腫細胞と融合する （Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｇ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）　： 　Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、　１．　、１ｌｏｎｏｃｌｏｎａｌ@Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ：　Ｐｒ １ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ（１９８６））。ＬＰＳで処理■ たＥＣ細胞および対照ＥＣ細胞を用いてハイブリドーマをスクリーニングするこ とにより、ＬＰＳで誘導される細胞表面分子に結合し得るモノクローナル抗体を 選択することができる。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに対して特異的なモノクローナ ル抗体のさらなる選択は、対照および活性化ＥＣ細胞に対する単核細胞様Ｕ９３ ７細胞の接着を阻害するモノクローナル抗体の能力を決定することによって達成 される。

モノクローナル抗体Ｒｂｌ／９は、活性化されたＥＣ単層に対するＵ９３７接看 を遮断する際に特に有効である。しかし、本明細書に記述するモノクローナル抗 体の結合特性を有する他のモノクローナル抗体も使用できる。活性化されたＥＣ 単層に対するＵ９３７接着を遮断する能力、および活性化されたＥＣ表面上の新 たに合成されたタンパク質Ａ、ＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ、Ｍに結合する能力はＲｂ１ ／９の結合特性である。活性化されたＥＣ表面上の新たに合成されたＡＴＨＥＲ Ｏ−ＥＬＡＭに結合する能力はＲｂ２／４の結合特性である。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭＩ：対する抗体は、組換、ｔＡＴＨＥＲｏ−ＥＬＡＭ＊ たはＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ断片でマウスを免疫化することによっても製造され 得る。

用語“ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ”断片は、この分子のあらゆるポリペプチド部分 集合を意味する。特に好ましいＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ断片には単核細胞結合性 断片が含まれる。単核細胞結合性断片は、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ　ｃＤＮＡを 種々の制限酵素またはエキソヌクレアーゼで切断し、得られた断片をクローン化 し、これらを発現させ、当該技術分野で既知の方法に従って単核細胞結合活性に ついてスクリーニングすることによって得ることができる。

種々のＤＮＡ断片の結合は、連結のための平滑化末端または突出化末篤、適切な 末端を得るための制限酵素消化、付着末端の適当な補充、望ましくない結合を避 けるためのアルカリおよびホスファターゼ処理、および適当なりガーゼによる連 結を使用する従来法に従って行われる。遺伝子構築物は任意に、組換えタン／く り質の効率的な発現を可能にする先導配列をコード化してもよい。

組換えＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ、Ｍを発現させるためには、適当な宿主要素中で認 識される転写および翻訳ノブナルが必要である。哺乳類細胞は、正しい折り畳み および適切な部位のグリコノル化を提供する組換えタンパク質の翻訳後修飾を提 供する。本発明の実施に使用できる哺乳類細胞にはＣＯ８細胞、チャイニーズｌ −ニスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、白血球、骨髄腫細胞もしくは他の形質転換リン パ細胞または腫瘍原性リンパ細胞、例えばＥＢＶ−形質転換細胞、ＶＥＲＯなど の線維芽細胞起源の細胞、あるいはハイブリドーマ５Ｐ２１０ＡＧ１４や骨髄Ｉ ｆ！Ｐ３ｘ６３Ｓｇｈなどのリンパ系起源の細胞、およびそれらの誘導体が含ま れる。他の宿主にはＢＨＫ細胞および肝腫瘍細胞が含まれる。

一般に、ある宿主細胞と適合性の種由来のレプリコンおよび制御配列がその宿主 と組み合わせて使用される。通常ベクターは複製部位ならびに形質転換細胞に表 現型選択を提供し得る特殊な遺伝子を保持している。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを コード化する遺伝子の発現を、非形質転換状態にある細胞系統と同系統であり得 る他の制御因子による制御下に置くこともできる。例えばラクトース依存性大腸 菌染色体ＤＮＡは、酵素β−ガラクトシダーゼを合成することによってラクトー ス利用を媒介するラクトースまたはｌａｃオペロンを含有する。このｌａｃ要素 は、大腸菌に感染する細菌ファーンラムダｐｌａｃ　５から得ることができる。

ｌａｃプロモーター−オペレーター系をＩＰＴＧで誘導することができる。

他のプロモーター／オペレーター系またはその部分も同様に使用できる。例えば コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン、キ ンロースなどが使用できる。

哺乳類宿主については、数種の候補ベクター系を発現に利用できる。ある種類の ベクターは、ウノバビローマウイルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、 ワタシニアウイルス、バクロウィルス、レトロウィルス（ＲＳＶＳＭＭＴＶまた はＭＯＭＬＶ）、あるいはＳＶ４０ウィルスなどの動物ウィルス由来のＤＮＡ要 素を利用する。ＤＮＡをその染色体中に安定に組込んだ細胞は、トランスフエク ションされた宿主細胞の選択を可能にする１以上の標識を導入することによって 選択され得る。この標識は栄養要求性宿主に原栄養性を与えたり、殺生物剤耐性 （例えば抗生物質あるいは銅などの重金属類）を与えるものであり得る。選択可 能な標識遺伝子を発現されるべきＤＮＡ配列に直接連結するか、あるいは同時形 質転換によって同じ細胞中に導入することができる。ｍＲＮＡの最適な合成のた めには追加要素も必要であろう。これらの要素には転写プロモーター、エン／％ ンサー、および終止ノブナルと共にスプライスノブナルが含まれ得る。このよう な要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターにはＯｋａｙａｍａ、　Ｈ，、Ｍｏ１ ．　Ｃｅｌ、　ＢｉｏＬ　、　３：２８０（１９８３）その他に記述されている ものが含まれる。

発現のためにその構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列を作製したら、そ のＤＮＡ構築物を適当な宿主中に導入する。プロトプラスト融合、リン酸カルシ ウム沈殿法、エレクトロポレーションあるいは他の従来技術など種々の技術を使 用することができる。トランスフェクションの後、細胞を培地中で生育させ、例 えば上述の抗体を用いて、適当な活性についてスクリーニングする。これらの遺 伝子の発現はＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの生産をもたらす。

形質転換細胞は、培養フラスコ中の適切な栄養培地中で生育させるか、ある（Ｘ は共同的宿主（例えばマウスまたはラット）または免疫不全宿牟または宿主部位 （例えばヌードマウスまたは／％Ａスター嚢）中に注射することができる。具体 的１こ：ま細胞を動物の腹腔中に導入することによって、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ Ｍまたはその断片を含有する腹水液を生産させることができる。別法として、細 胞を皮下（こ注射し、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭをその宿主から収集することでき る。これらの゛　細胞はハイブリドーマと同じ方法で使用できる。

発現した。へＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭまたはその断片を発酵培地または細胞培養か ら単離し、従来の条件（例えば抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティ ークロマトグラフィー、電気泳動など）に従って精製すること力（できる。

例えば、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ、Ｍは、表面タンパク質を含有している溶液を、 ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに特異的な固定化された抗体（例えば、上記の抗体Ｒｂ １／９）を含有しているカラムに通すことによって精製することができる。次い で、所望のタンパク質を溶離液のｐＨを下げることによって溶離することができ る。

また、Ａ、ＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに指向性の抗体を用いて組織試料中のＡＴＨＥ ＲＯ−ＥＬＡＭの存在を、疾患過程に伴われるＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ、Ｍの発現 の指標として検出することも可能である。即ち、本発明は、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬ ＡＭの検定によって哺乳動物におけるＡ、ＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの内皮細胞発現 を検出するための方法てあって、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに指向性の検出可能に ラベルした抗体をＡＴＨＥＲ，Ｏ−ＥＬＡＭを含んでいることが疑われている試 料、または表面にＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを発現している細胞と接触させ、コン プレックスが形成されるか否かを検出することからなる方法にも関している。

抗原性物質および生物学的試料の検出および定量にあは免疫検定法が利用される ことが多い。これらの方法は、検定しようとする抗原性物質（例えば、ＡＴＨＥ ＲＯ−ＥＬ、ＡＭ）と抗体または抗体群の間のコンプレックスの形成に基づいて いる（ここで、このコンプレックスの一方または他方の構成物質は検出可能にラ ベルされていてよい）。本発明においては、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗 体を任意の通常のラベルで標識していてよい。

即ち、本発明のこの態様においては、生物学的試料をニトロセルロースまたは他 の固体支持体（細胞、細胞粒子または可溶性タ：ノバク質を固定化することがで きる）で処理してよい。次いで、この支持体を適当な緩衝液で洗浄し、続いて検 出可能にラベルされたＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的抗体で処理する。次いて、 この固相支持体をもう一度緩衝液で洗浄して未結合の抗体を除去する。次いで、 抗体上の結合ラベルをｔ法によって検出することができる。

試料中のラベル化、へＴＨＥＲ，０−ＥＬＡ、Ｍ特異的抗体／Ａ、ＴＨＥＲＯ− ＥＬ、ＡＭコンプレックスを、固定化した抗体またはタンパク質（免疫グロブリ ンに特異的なものであり、例えばプロティンＡ１プロテインＧ１抗■ｇＭまたは 抗丁ｇＧ抗体である）と接触させることによって、反応混合物から該コンプレッ クスを分離することができる。このような抗免疫グロブリン抗体はモノクローナ ルまたはポリクローナルであってよい。次いで、この固体支持体を適当な緩衝液 で洗浄して、固定化されたＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ／ラベル化ＡＴＨＥＲＯ−Ｅ ＬＡ、Ｍ特異的抗体のコンプレックスを得る。次に、タンパク質上のラベルを検 出して内生のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを測定し、それによって内皮細胞がＡＴＨ ＥＲＯ−ＥＬＡＭを発現している程度を調べることができる。

本発明のこの態様は、試料中のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭまたはその単球結合フラ グメントを検出するための方法であって、（ａ）ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを含ん でいることが疑われている試料を、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに結合するＡＴＴ（ ＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体またはそのフラグメントと接触させ： （ｂ）コンプレックスが形成されるか否かを検出する。

からなる方法に関する。

また、本発明は試料中のＡ、　Ｔ　ＨＥ　Ｒ〇−ＥＬＡＭを検出する方法であっ て、（ｃ）工程（ａ）で得た混合物を、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体に 特異的であって固相支持体に固定されたＦｃ結合分子（抗体、プロティンＡ１ま たはプロティンＧなど）と接触させて、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ／ＡＴＨＥＲＯ −ＥＬＡＭ特異的抗体を固定化した抗体コンプレックスを得：（ｄ）工程（ｃ） で得た固相支持体を洗浄して未結合のＡ、ＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ／ＡＴＨＥＲＯ −ＥＬＡＭ特異的抗体コンプレックスを除去し；（ｅ）、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ Ｍ特異的抗体上のラベルを検出する：ことをさらに含む方法に関する。

勿論、検出可能にラベルされた抗体およびＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの特定の濃度 、インキュベーションの温Ｉおよび時間、ならびにその他の検定条件は、試料中 のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの濃度、試料の性質などを含む種々の因子に依存して 変化するであろう。当業者なら、通常の実験を用いてそれぞれの測定に対して有 効かつ最適の検定条件を決定することができるであろう。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬ、Ａ、Ｍ特異的な抗体を検出可能にラベルしつる方法の１つ は、それを酵素に結合させることによる。この酵素は次いて後にその基質に暴露 したときに、例えば、分光学的に、蛍光的に、または視覚的に検出しつる化学的 部分を生成するように該基質と反応するであろう。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異 的な抗体を検出可能にラベルするのに使用しつる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲ ナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−■−ステロイドイソメラーセ、酵母アル コールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフエートデヒドロケナーゼ、トリオ ースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ ァターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ 、リポヌク１ノアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−ホスフェ ートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが 含まれるが、これらに限定される訳ではない。

さらに、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体を、ガンマカウンター、シンチレ ーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを使用するなどの手段によっ て測定しうる放射活性同位体でラベルしてもよい。本発明の目的に有用な同位体 は当分野で周知である。

また、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体を蛍光化合物でラベルすることもで きる。蛍光的にラベルされた抗体を適当な波長の光に当てると、その存在を染料 の蛍光によって検出することができる。最も普通に用いられる蛍光ラベル化合物 は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン、フィ コンアニン、アロフィコンアニン、０−フタルアルデヒドおよびフルオレアミン である。

さらに、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体を、蛍光放射金属を用いて検出可 能にラベルすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレー ト化団を用いてＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体に結合させることができる 。

また、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体を化学発光化合物に結合させること によって、それを検出可能にラベルすることもてきる。次いて、化学発光の標識 を付けたＡＴＨＥＲＯ−ＥＬ、ＡＭ特異的な抗体の存在を、化学反応の過程中に 生成する発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光ラベ ル化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチイックアクリジニウム エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびンユウ酸エステルである。

同様に、生物発光化合物を用いて本発明のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体 をラベルしてもよい。生物発光は生物学的な系において見い出される化学発光の 一種であり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク 質の存在を発光の存在の検出によって測定する。ラベルの目的に重要な生物発光 化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体の検出は、例えば、検出可能なラベルが放 射活性なγ放射であるときにはγシンチレーションカウンターによって、また例 えば、ラベルが蛍光物質であるときには蛍光計によって行なうことができる。

酵素ラベルである場合には、該酵素の基質を用いる比色法によって検出を行なう ことができる。また、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準と視覚的に比 較することによって検出を行なってもよい。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの発現は、この抗原を認識および結合しつる免疫グロブ リンまたはそのフラグメントを用いて検６することができる。さらに、抗体をラ ベルして哺乳動物への投与の後にそれを検出することができる。この免疫グロブ リンはポリクローナルまたはモノクローナルに由来するものであってよい。

所望なら、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭで免疫し、次いで血液を集め、それを規定さ れた方法に従って処理した所望の種の免疫した個体の血液から、ポリクローナル 免疫グロブリン調製物を調製することができる。非特異的なポリクローナル免疫 グロブリン調製物の顕著な利点は、免疫グロブリンを注射する同一の種から免疫 グロブリンを調製することによって、種の障壁を交差する免疫反応が防止され、 同じ生成物の繰返し注射によって副作用が引き起こされる可能性が低いことであ 本発明の方法に従って用いることができるモノクローナル免疫グロブリンは、ｏ ｎなどの寄託当局から入手しつるセルラインなどの既知の分泌ミエローマセルラ インから誘導することができる。

個体の初期アテローム性動脈硬化症の発生を検出する際には、検出可能にラベル した免疫グロブリンを診断に有効な量で投与するのが好都合である。この「診断 に有効な」なる用語は、投与される検出可能にラベルされた免疫グロブリンの量 が、バンクグラウンドングナルと比較したときにアテローム性動脈硬化症プラー ク（斑）の部位を検出しつるに十分なものであることを意味する。

通常、診断のための検出可能にラベルした免疫グロブリンの用量は、患者の年齢 、症状、性別および疾患の程度などの考慮事項に依存して変化するであろう。

また、この用量は、もしあれば対指標に、およびその他の変動因子に依存し、個 々の医師によって調節されるであろう。用量は０．０１〜２．　ＯＯＯｍｇ／ｋ ｇ、好ましくは０．１〜１．０００＋ａｇ／ｋｇに変化してよい。

本明細書で用いる「免疫グロブリンまたはそのフラグメント」なる用語は、無傷 の分子ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ）ｚフラグメン トなどであって、移植組織の抗原決定基に結合しうるものを意味する。

「診断用にラベルされた」なる用語は、免疫グロブリンが診断用に検出しうるラ ベルに結合していることを意味する。

当業者には既知の多数の異なるラベルおよびラベル化法が存在する。本発明にお いて使用することができる種類のラベルの例には放射活性同位体および常磁性同 位体が含まれる。

当業者なら、本発明において用いる免疫グロブリンに結合させるための池の適切 なラベルを知っているであろうし、また、通常の実験によってそれを確かめるこ とができるであろう。さらに、これらラベルの免疫グロブリンへの結合は、当業 者には普通である常法を用いて行なうことができる。

診断用のインビボのイメージングのためには、利用可能な検出装置の種類がある 放射性核種を選択する際の主要な因子である。選択される放射性核種は、ある種 の装置によって検出しつる種類の崩壊を有するものでなければならない。通常は 、診断用イメージングを可視化するための任意の常法を本発明に従って利用する ことができる。

インビボの診断のための放射性核種を選択する際の別の重要な因子は、放射性核 種の半減期が、十分に長くて標的による最大の取込みの時点でなお検出可能であ るが、十分に短くて宿主に対する有害な放射が最少になることである。理想的に は、インビボのイメージングに用いる放射性核種は、微粒子の放射を欠いている が、１４０〜２００ｋｅＶの範囲に多数の光子（通常のガンマ写真機によって容 易に検出することができる）を生成するであろう。

インビボの診断のためには、媒介の官能基を用いて放射性核種を直接または間接 的に免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在する放射 性核種を免疫グロブリンに結合させるために使用されることが多い媒介の官能基 はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（Ｅ ＤＴＡ）である。

また、本発明の方法において用いられる免疫グロブリンを、インビボの診断用の 常磁性同位体でラベルすることもできる。この方法口磁気共鳴イメージング（Ｍ Ｒｌ）法など〕において特に有用な元素は当業者には既知である。

本発明はさらにＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを治療用に使用することに関する。１つ の態様では、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭまたはその単球結合分画を患者に投与して 単球の内皮組織への接着を防止することができる。即ち、Ａ、ＴＨＥＲＯ−ＥＬ ＡＭまたはその単球結合フラグメントは、アテローム性動脈硬化症の損傷発生の 初期段階に特徴的な変化を受けた内皮細胞への単球の接着を防止するであろう。

１つの態様では、可溶型のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭを投与することができる。

「可溶型」なる用語は、トランスメンブランおよび細胞質ドメインが削除された Ａ、　Ｔ　ＨＥ　Ｒ○−ＥＬＡＭ分子を意味する。この可溶型は、可溶型のＡＴ ＨＥＲＯ−ＥＬＡＭをコードしている遺伝子構築物の宿主細胞中での発現によっ て得ることができる。

また、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに対するモノクローナル抗体を投与して、へＴＨ ＥＲＯ−ＥＬ、ＡＭを発現している内皮細胞の単球接着部位をブロックすること もできる。これらの細胞は初期のアテローム性動脈硬化症の損傷において存在す ることができ、損傷における単球の接着をブロックすることによってこの損傷の 後の進行を防止する。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ分子もしくはそのフラグメント、またはＡＴＨＥＲＯ− ＥＬＡＭに指向性の抗体および抗体フラグメントは、既知の方法に従って、例え ば薬学的に許容しうる担体と混合することによって薬学的に有用な組成物に製剤 化することができる。有効な投与に適当な薬学的に許容しつる組成物を得るため には、このような組成物は、治療学的有効量のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ、可溶型 のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの７ラグメント、マタハＡ ＴＨＥＲ○−ＥＬＡＭに指向性の抗体もしくは抗体フラグメントを、単独でまた は適切量の担体と共に含有しているであろう。

内皮細胞への単球接着の防止のために使用するときには、この医薬組成物は１ｐ ｇ／ｋｇ〜１０　ｍｇ／ｋｇのＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ、可溶型のＡＴＨＥＲＯ −ＥＬＡＭｌまたは、へＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭのフラグメントを含有しているで あろうが、さらに高いかまたは低い用量も可能である。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに指向性の抗体は、アテローム性動脈硬化症の損傷を治 療するための薬物とコンジュゲート化することができる。この目的に有用な薬物 の例は、抗増殖、抗凝固、抗酸化および抗炎症薬物である。

追加の薬学的方法を用いて作用期間を制御することができる。制御された放出の 調製物は、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭフラグメント、ま たはＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに指向性の抗体もしくは抗体フラグメントをコンプ レックス化または吸収させるためにポリマーを使用することによって得ることが できる。制御された放出は、適切な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミ ノ酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、 メチルセルロース、カルボキンメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラク チド／グリコリドコポリマー）を選択することによって達成することができる。

また、薬物放出の速度は、このような巨大分子の濃度を変えることによって制御 することができる。作用期間を制御するための別の可能な方法は、ポリエステル 、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコリドコポリマーまたはエチ レン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー物質の粒子中に治療用薬物を導入する ことからなる。別法では、例えばコアセルベーンコン法もしくは界面重合によっ て調製したマイクロカプセルに治療薬物を封入することができ（例えば、ヒドロ キシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルまたはポリ（メチルメ タクロレート）マイクロカプセルをそれぞれ使用することによって）、また、コ ロイド薬物放出系、例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマ ルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルまたはミクロエマルジオン中に封入すること ができる。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ、可溶型のＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ、、ＡＴＨＥＲＯ− ＥＬＡＭのフラグメント、またはＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに指向性の抗体もしく は抗体フラグメントは、当分野で周知の方法によって患者に投与することができ る。このような投与法には、経口、鼻内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、また はその他の非経口投与が含まれる。

以上に本発明を一般的に記載したが、以下に挙げる特定の実施例を参照すること によって本発明をさらに理解することができよう。これらの実施例は例示の目的 でのみ挙げるものであって特記することがなければ本発明を限定しようとするも のではない。

実施例１　ウサギ内皮の単離および培養ウサギの大動脈（Ａｏ）および工大静脈 （ＩＶＣ）内皮細胞（Ｅ　Ｃ）を、０．２％または０．４％コラゲナーゼ［Ｉ型 ；　ｆｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｃａｒｐ、　］をそれぞれ用い て、外転させた血管から単離した［Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、　１．ら、　ＦＡ ＳＥＢ　Ｊ？：　Ａ１６０３　（１９８８）；　Ｄａｎｔｈｕｌｕｒｉ、　Ｎ、 　Ｒ，ら、Ａ＠、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、２５５　（Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒ、Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、２４）：　Ｈ１５４９|Ｈ１５５３ （１９８８）］。ＥＣを、２０％ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）、１０〜２０μｇ ／ＩＩＥｃミトゲン［Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎ ｃ、コおよび２０〜４０　μｇ／ｍｌブタ腸ヘパリン［Ｓｉｇｍａ　ニゲレード エコを含有するＭｅｄｉａｍ　１９９　（バンクの塩）中、ゼラチン被覆した組 織培養プレートで培養した。標準的なプロトコールに従ってＥＣをトリプシン／ ＥＤＴＡで継代培養した。

実施例２　ウサギ白血球の単離、精製、特性化およびラベル化ウサギ白血球を供 与ウサギの耳中心動脈から得た血液から単離する。赤血球を１％ヒドロキシエチ ルセルロースを用いて沈澱させ、血小板を遠心により白血球に冨む血漿から分離 する。ペレット中の白血球を、１％ヒトアルブミンＵＳＰ［Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ］を含み２価カチオンを含まないＨＢＳＳに再懸濁する。好 中球（およびデンス細胞である好酸球）を密度比重遠心によって単核白血球から 分離する［Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、　：、ら、　ＡｍＪ、Ｐａｔｈｏｌ、　１ ２５：　１　（１９８６）コ。この純度をサイトスピンのｆｒｉｇｈｔ’　ｓ− Ｇｉｅｍｓａ染色によって調べる。

単球は１５〜３０％の単核細胞を構成している。これらはリンパ球よりも大きく 、通常のプロトコールに従う水難によって単離する［Ｄｏｈｅｒｔｙ、　Ｄ、　 Ｅら、　Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　５９：　２００　（１９８８）］。この単球 調製物の純度をサイトスピンの非特異的なエステラーゼ染色によって評価する［ Ｙａｍ、　Ｌ、　Ｔら、　Ａｌｅｒ、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、１２５：　 １　（１９８６）］。この方法によって８５〜９５％の純度および５０〜８０％ の回収が達成される。

Ｔリンパ球（血液中の主なリンパ球）を、パンニング（選別）法を用いて８９２ ３球を除去することによって精製する。この方法は、ウサギ免疫グロブリンに指 向性の抗体をプラスチック皿に吸着させ、水難したリンパ球を４℃で１時間イン キュベートすることからなる。表面上で免疫グロブリンを発現する８９２３球を 吸着させた抗体によって結合させる。非吸着性のＴ細胞を集め、その純度をウサ ギＴ細胞に対するＭＡｂを用いる免疫染色によって評価する［Ｌ１１／１３５　 ：ＡＴＣＣから〕。必要なら、ナイロン・ウール精製工程を用いる［Ｊｕｌｉｕ ｓ、　Ｍ、　Ｈら、　Ｅｕｒ、Ｊ。

ウサギ白血球を、蛍光ｐＨ指示プローブＢ　ＣＥ　ＣＦ　［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ プローブ］によってラベルする。　１０７／ｍｌで懸濁した細胞を、タンパク質 を含有する緩衝液中、Ｂ　ＣＥ　ＣＦ／ＡＭ（１０〜２０μＭ）と１５〜３０分 間（３７℃）インキュベートする。ＢＣＥＣＦのアセトキシメチルエステル型は 細胞に透過性であり、細胞質中に入るとエステラーゼ酵素によって加水分解され た後に捕捉される。接着性ＢＣＥＣＦラベル化白血球を定量するときには、溶解 緩衝液のｐＨをＢＣＥＣＦＣＥＣ上って最適値に調節する（ｐＨ８，８）。

また、ウサギ白血球は標準的プロトコールに従ってＮａ２”ＣｒｙｓまたはＩｌ ｌ　ｆを用いてラベルする［Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、　Ｉら、　ＡｍＪ、Ｐａ ｔｈｏｌ、　１２５：　１　（１，９８６）；　Ｄａｎｐｕｒｅ。

Ｅｌ、　Ｊ、ら、Ｂｒ１ｔＪ、Ｒａｄｉｏｌ、５５＋　２４７　（１９８２）］ 。

ｍｕｎｏ１．１４２：　２２５７　（１９８９）］に従って行なう。簡単に説明 すると、ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳに懸濁したＢＣＥＣＦラベル化Ｕ９３７白血球細 胞を全面ＥＣ単層（継代数２または３）に３７℃で１０分間吸着させ、次いでウ ェルを緩衝液で満たし、プレートをシールし、反転し、そして２５０ｘｇで５分 間遠心する。接着性の白血球を０１％ＳＤＳを用いて５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ ｐＨ８，８）に溶解し、蛍光を自動プレートリーダー［Ｐａｎｄｅｘ、　Ｂａｘ ｔｅｒ　Ｂｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃｏｒｐ、　］で定量し・そしてそれぞれのウ ェルに吸着された白血球の数を計算する。比較的短い吸着時間（１０分間）を選 択して、長いインキュベートのときに起こるＥＣ単層下での移動よりも白血球の 吸着に焦点を合わせる。

接着阻害検定のために、ＥＣ単層を飽和濃度のＭ　Ａ　ｂ　Ｆ　（ａｂ’　）　 ２フラグメントと２２℃で３０分間プレインキュベー１・する。最大表面結合に 必要なＦ　（ａｂ’　）　２フラグメントの濃度は蛍光免疫検定においてそれぞ れのＭＡｂに対して決定され、１０〜２５μｇ／１００μｍ／ウェルの適当な範 囲内にあるであろう。

実施例４　モノクローナル抗体法 マウスを、ＬＰＳまたは池の適当な刺激物質で活性化したウサギ内皮を用いてス の膵臓リンパ球をＮ５−１またはＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ネズミミエローマ 細胞と融合させることによってハイブリドーマを調製する。この融合体を４つの ９６ウ工ル微量滴定プレートにブレーティングし、約２週間後に一次スクリーニ ングである細胞表面蛍光免疫検定を行なう。このスクリーニング（実施例５を参 照）によって、通常は融合あたり１５ウエルまでの、ウサギ内皮上のＬＰＳ−上 方調節された抗原を認識する免疫グロブリンを含有するウェルが同定される。こ れらウェル中のハイブリドーマを限界希釈法［Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、１．、　Ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ。

坦Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　２ｎｄ　ｅｄ、　、＾ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８６j］に よってクローンし、次いで二次スクリーニングを行なう。これには、Ｕ９３７細 胞を用いる接着ブロック検定およびコレステロール飼育したＷＨＨＬウサギ由来 の大動脈の免疫組織化学染色が含まれる。

ｂ）腹水中での免疫グロブリンの調製、精製およびＦ　（ａｂ’　）　２の調製 免疫グロブリンをネズミ腹水中に産生させ（１００＋ｍｇ　−Ｉｇ量）、常法に よる硫酸アンモニウム沈澱およびそれに続＜　Ａ　Ｂ　ｘ（Ｂａｋｅｒ）クロマ トグラフィーによって精製する［Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉ ｃ■A　２ ｎｃｌ　ｅｄ、、　Ａｃａｄｅ＠ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８ ６）；　Ｎａｕ、Ｄ、Ｒ，、ＢｉｏＣｒｏｍａｔｏｇｒａｐ■凵@４：　４　（ １ ９８９）］。精製した免疫グロブリンをペプンンにより、最適酵素濃度およびｐ Ｈで消化してＦ　（ａｂ’　２）フラグメントにする［Ｌａｍｏｙｉ、　Ｅ、ら 、　Ｊ、ＩｍＩＩｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　５６＋　２３５（１９ｇ３）：　 Ｐａｒｈａｍ、Ｐ、、　ＪＪｍｏ＋ｕｎｏ１．１３１：　２８９５　（１９８３ ）］。

実施例５　蛍光免疫検定 飽和濃度のＭＡｂ上清とそれに続いてフルオレセイン−コンジュゲート化したＦ 　（ａｂ’　２）ヤギ抗ネズミＩ　ｇＧ　［Ｃａｌｔａｇ　Ｌａｂｓ］を用いて 、生存している全面ＥＣ単層について４℃で細胞表面結合検定を行なう。蛍光量 は自動プレートリーダー［Ｐａｎｄｅｘ３を用いて測定し、ウサギＥＣに結合し ないＩｇＧ、抗体を用いて得られた蛍光の読み値を差し引くことによって特異的 なＭＡｂ結合を算出する（約５０相対蛍光単位）。

ＥＣタンパク質は、３５Ｓ−Ｌ−システィンおよび３５Ｓ　Ｌ−メチオニンを用 いて生合成的に５時間ラベルする（２〜６時間のＬＰＳ処理）［Ｂｅｖｉｌａｃ ｑｕａ、Ｍ、Ｐ、ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：　９２３８　 （１９８７）コ。表面ＥＣタンパク質はグルコースオキシダーセ／ラクトペルオ キシダーゼブロトコールを用いて１２５Ｉでラベルする［Ｈｕｂｂａｒｄ、　Ａ 、　Ｌ、ら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６４＋　４３８　（１９７５）コ。Ｅ Ｃを１００ｍＭトリス−ＨＣｌでｐＨ７，４）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｌＭ 　ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリドおよび０．３％ＣＨＡＰ Ｓ中で溶菌し、不溶性物質を遠心によって除去する（１２．　ＯＯＯｘ　ｇ、　 ０．５時間、４℃）。免疫沈澱において、ＥＣ溶菌液（１００μｌ溶菌液／レー ン中に約５ｘｌＯ’細胞）をＭＡｂ培養物上清（１００μｍ）と２〜４時間（４ ℃）インキュベートし、次いでセファロース−４Ｂ　（Ｃａｐｐｅｌ）に結合さ せたヤギ抗ネズミＩｇＧと２〜４時間インキュベートする。このセファロースは 未ラベルの溶菌液で予め処理して、ラベルしたタンパク質の非特異的な接着を減 少させる。また、生合成的にラベルしたＥＣの溶菌液も非結合性のＭＡｂで予め 処理する。セファロース・ビーズに特異的に結合した抗原を徹底的に洗浄し、５ 〜１２％直線勾配ゲルにより還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかける［Ｌａｅｍｍｌ ｉ。

によってＦ　（ａｂ’　２）フラグメントをヨウ素化する。ヨウ素化とゲル濾過 クロマトグラフィーによる遊離ヨウ素の除去の後に、内皮標的に結合するその能 力を、ヨウ素化していないものと比較する。別のラベル化プロトコール、例えば Ｂｏｌｔｏｎ−Ｂｕｎｔｅｒ法［Ｂｏｌｔｏｎ、　Ａ、　Ｅら、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｊ、　１３３：　５２９　（１９７３）］を用いてもよい。

実施例７　形態学的方法 ａ）免疫組織化学 免疫ペルオキシダーゼ染色を、アセトンまたは１：１のアセトン、メタノール中 、−２０℃で５分間固定した４〜６μｍの凍結切片で行なう。切片を、順次、Ｍ Ａｂ（２時間）、ビオチン化したウマ抗ネズミＩｇＧ（１時間）およびアビジン ービオチンペルオキシダーゼコンプレックス（４５分間）［Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａ ｂｓ３とインキュベートする。ペルオキシダーゼを３−アミノ−９−エチルカル バゾール［Ｓｉｇｍａｌで可視化し、切片をＧ１１ｌのへマドキシリンで対比染 色する。

ｂ）オイル・レッドＯによる染色 大動脈組織中の脂質を、ＡｄａｍｓおよびＢａｙｌｉｓｓ［Ａｄａｍｓ、　Ｃ， Ｙ、　１１．ら、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｌＩｉｃａｌ　ａ ｎｄ　Ｂｊ、ｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｉｌｌｏｒｐｈｏｌｏｇｙ中、　Ｖｏｌ、２ ．　Ｇ１１ｃｋ、Ｄら（編）A　ｆｉｌｅｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、　９９　（１９７５）］に従って、不活性な曲回溶性 のビス−アゾ染料であるオイル・レッドＯで染色する。７０％イソプロピルアル コールで大動脈をすすいだ後、これらを６０％インプロピルアルコール中のオイ ル・レッドＯの濾過した飽和溶液で３０分間染色し、次いでアルコールで短時間 すすぎ、再水和する。

大動脈セグメントの内皮内領域を、Ｐｏｏｌｅら［Ｐｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｃ，Ｆ 、ら、　Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　７５：　１３３　（１９５ ８）］のプロトコールに従って硝酸銀で染色する。

ｄ）走査電子顕微鏡 大動脈をバンクのバランス塩溶液で潅流して血液を除き、次いで緩衝化された２ 、５％グルタルアルデヒドを用いて生理学的圧力（１００闘Ｈｇ、１５分間）の もと、その場で潅流固定する。これを取り、外膜を解剖し、さらに固定した後、 標準的なプロトコールに従って、大動脈の部分をエタノールで脱水し、臨界点乾 燥し、アルミニウム・スタブに乗せ、そして全標的を用いてスパッター被覆する 。

試料を走査電子顕微鏡で観察する。

実施例８　分子生物学的方法 オリゴマー−プライムされたライブラリー用に、＠Ｒ，ＮＡを第２ラウンドのオ リゴ（ｄＴ）り０７トグラフイーで精製する。このｔａ　Ｒ，Ｎ　Ａを、Ｇｕｂ ｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ［Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕら、　Ｇｅｎｅ　２５：　２ ６３　（１９８３）］によって修飾が加えられた０ｋａｙａ、ｍａおよびＢｅｒ ｇ［Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１Ｂｌｏ１？：　１６１　（１ ９８２）］の方法によって、２本鎖のｃＤＮＡに変換する。簡単に説明すると、 ランダムなヘキサヌクレオチド・プライマーまたはオリゴ（ｄＴ）を用いて逆転 写酵素により、１本鎖のｍＲＮＡを、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに変換する 。次に、このＲＮＡ−ＣＤＮＡハイフリットを、ＲＮアーゼＨ（ＲＮＡを切断す るため）とＤＮＡポリメラーゼ（プライマーとしてニックを入れたＲＮＡを用い て第２のｃＤＮＡ鎖を合成するため）の組合せを用いて２本鎖のｃＤＮＡに変換 する。第２のｃＤＮＡ鎖の不完全な合成は大腸菌ＤＮＡリガーゼで修復する。次 いで、２本鎖のｃＤＮＡをメチル化による消化から保護し、Ｔ４　ＤＮＡポリメ ラーゼによって平滑末端型に変換し、そしてＥｃｏＲＩリンカ−を付加する。Ｅ ｃｏＲＩでリンカ−を切断して大きさによる選択を行なった後、ｃＤＮＡをＥｃ ｏＲＩ切断したｇｔｌｌ原核性発現ベクターに連結する。

ｂ）オリゴヌクレオチドの合成 例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉａｓｙｓｔｅａｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８１Ａなどの ＤＮＡ合成機により、通常のホスホルアミダイトの化学（脱トリチル化、付加、 キャッピング、酸化および脱保護の繰返いを用いてオリゴヌクレオチドを合成す る。

Ｃ）プローブの放射ラベル化 ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、＾、Ｐら、 　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＠、１３２：　６　（１９８３）n のオリゴヌクレオチドのラベル化法を用いてｃＤＮＡプローブの放射ラベル化を 行なう。この方法は、３２ｐ−ラベルされたヌクレオチドの存在下でのＤＮＡポ リメラーゼＩによって触媒されるＤＮＡ合成のために、ランダムなヘキサデオキ シリボヌクレオチドをプライマーとして利用する。オリゴヌクレオチド・プロー ブをＴ４ポリメラーゼ・キナーゼを用いてラベルして、３２ｐラベルをＡＴＰの γ位からオリゴＤＮＡの５’ＯＨ基に特異的に移転させる［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 　Ｊら、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ｊｏｎｊｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｐｒｅ唐刀A　Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）コ。

ｄ）ＤＮＡの配列決定 Ｓａｎｇｅｒの７デオキシ媒介の鎖成長停止法［Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡ　７４：　５４６３　（ １９７７）］に従う市販のキットを利用して配列決定を行なう。ＳＦ３、Ｔ７お よびオリゴヌクレオチド・プライマーを用いる。

ｅ）ノーザン・プロソテＩング スクロース沈澱、プロトコ−ルに消化およびフェノール／クロロホルム抽出によ って細胞質ＲＮＡを単離する［５ａＩｌｂｒｏｏｋ、、　Ｊ、ら、　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　gａｒｂｏｒ、Ｎ ａｖ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）］。ミニゲルにおける分光学的定量および分析の 後、ＲＮＡをホルムアルデヒド／アガロースゲルで電気泳動にかけ、毛管作用に よってニトロセルロース膜に移す。放射ラベルしたプローブを膜にハイブリダイ ズさせ、洗浄し、そして結合した放射活性をオートラジオグラフィーで可視化す る［Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ　ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ@Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ　（１９８９）コ。

実施例９　ＬＰＳ処理内皮細胞への白血球結合の阻害ＬＰＳ処理の後、ＥＣ単層 （継代２）を洗浄し、次いでＦ　（ａｂ’　）２の飽和濃度（５μｇ１０．１＠ ｊ！ＲＰＭ！　１％ＦＢＳ／−ｙイクｏ９イ９−”７ニル）、！：共に３０分間 、前インキュベートした（３７℃または４℃）、ＲＰＭＩＩ％ＲＢＳ（２Ｘ１０ ’１０、ｌ　ｇｌ）に懸濁したＢＣＥＣＦ−標識化白血球を適当な温度にて各ウ ェルに加えた。３７℃における接着検定では、白血球を内皮細胞と共に静的条件 下で１ｏ分間インキュベートし、次いでウェルを緩衝液で充満させ、ンールし、 得られた平板を反転させ、遠心（２５０Ｘ９．５分）した。４℃における接着検 定は３０分間であり、平板のシーリング（ｓｅａｌｉｎｇ）及び２０分間の反転 によって非接着白血球を除去した。Ｆ　（ａｂ’　）２−前インキュベート単層 への白血球接着を、対照緩衝液（ＲＰＭＩ　１％ＦＢＳ）で処理した単層と比較 し、対Ｔ検定により統計学的な有意差を得た（＊＝ｐ＜０．０５）。平均および 標準偏差（３つの測定ｆｆ１）をプロットした（第３図）。

４℃において、Ｒｂｌ／９　Ｆ（ａｂ’）ｚはＵ９３７、ＨＬ６０およびＴＨＰ −１セルライン、ならびに遠心により洗浄したヒト血液単球およびリンパ球の接 着を有意に阻害した（篤３図、上方のパネル）。Ｕ９３７およびＨＬ６０の接着 は３７℃にて行った検定でも阻害された。ヒト白血球における主要な組織適合性 抗原を認識するが、ウサギＥＣにおけるそれは認識しないモノクローナル抗体で あるｗ６／３２　Ｆ（ａｂ’）、、またはＲｈ２／４もしくはＲｂ２／３　Ｆ（ ａｂ’）ｔでは、接着の有意な減少は観察されなかった（第３図、中部および下 方のパネル）。非活性化ウサギ内皮細胞への接着は、いずれのＦ　（ａｂ“）２ 断片によっても有意に阻害されなかった。ＬＰＳ−活性化内皮細胞へのＰＭＮ接 看はどの条件下でもＲｂｌ／９　Ｆ（ａｂ’）２によって阻害されなかつた。総 合すると、Ｒｂｌ／９が皿核白血球に見かけ上選択的である白血球接着分子を認 識することをこれらのデータは示している。

実施何重０　ウサギ動脈の免疫組織化学的染色高コレステロール性の食餌を与え たウサギおよびワタナベ遺伝性高脂血症（Ｗ−ナル抗体Ｒｂｌ／９による特異的 な染色は発色の種々の段階で、泡沫細胞に富む動脈の内膜損傷を覆う内皮に局在 した。

１％コレステロール食餌を９週間与えたウサギから得た下行性胸部動脈に局在し た同じ動脈硬化損傷の凍結切片を第４図のＡ−Ｄに示す。Ａ切片では、損傷が平 滑筋細胞に関してモノクローナル抗体ＣＧＡ７（平滑筋細胞−特異的なα−アク チンに特異的である。腹水による１／３００希釈度　ＥＮＺＯＢｉｏｃｈｅｍ、 　Ｉｎｃ、　）によって染色された。Ｍ＝中等度、ＩＬ＝内膜損傷、ｂａｒ＝　 １００　！ｘ０Ｂ切片では、損傷がウサギマクロファージに関してモノクローナ ル抗体ＲＡＭＩＩ（腹水による１／３０００希釈Ｉ）によって染色された。ｂａ ｒ＝　１００μ菖。ＣおよびＤ切片では、損傷がＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに関し てＲｂｌ／９（培養上清）によって染色された。

ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ発現はＥＣ重層部および内膜損傷に近接する部位にて検 出された。

隣接した非関連動脈（ＬＩＡ）のＥＣは、Ｒｂｌ／９によって染色されなかった が、構成ＥＣマーカτでは染色された（第４図、Ｃ挿入図、ヤギ抗−ヒトｖｏｎ 　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、ＩｇＧによる１／３０００希釈度、＾ｔｌａｎｔ ｉｃ　Ａｂ、　、　ｂａｒ＝　５０　＃ｍ）。隣接した切片では、ＥＣは非結合 性のアイソタイプ適合モノクローナル抗体Ｅ　１／Ｃ１５によって染色されなか った（Ｄ挿入図、培養上清、ｂａｒ＝　１０　ｕ）。ＦＣ＝泡沫細胞、ＩＥＬ＝ 内部弾性層、第４Ｃ図および第４Ｄ図の棒（ｂａｒ）はそれぞれ５０および１０ μ票を示している。第４Ｅ図は、１８週ＷＨＨＬウサギの動脈部における内膜の 泡沫細胞に冨む損傷を重層するＥＣのＲｂｌ／９染色を示している（ｂａｒ＝１ ０μＭ）。第４Ｆ図は、高コレステロールの食餌を与えたウサギの下行性胸部動 脈における小泡沫細胞凝集に付随する焦点、へＴＨＥＲ○−ＥＬＡ、Ｍ発現を示 している（ｂａｒ＝　１００１１１）。

免疫ペルオキシダーゼ染色を、アセトンまたはアセトン・メタノール（１１）中 に５分間−２０℃で固定化させた４　−６ａｍ凍結切片を用いて行った（ＣＧＡ ７およびＲＡＭＩＩに関して）。切片をモノクロ−アル抗体（２時間）、ビオチ ニル化つマ抗−不ズミＴｇＧ（１時間）およびアビジンービオチンベルオキシダ ーセ複合体（４５分間）　［Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、　］と共に連続してイン キュベートした（２２℃）。ペルオキシダーゼは、３−アミノ−９−エチルカル バゾール［シグマ］で視覚化し、切片はＧ１１１のへマドキシリンで対比染色し た。ウサギＥＣに対して生成させたＲｂ１／９などのモノクローナル抗体は、培 養または組織切片における正常または活性化ヒト内皮細胞のエピトープを認識し ない。

実施例１１　モノクローナル抗体Ｒｂｌ／９によるポリペプチドの免疫沈降３５ Ｓ−Ｌ−システィンおよび３！Ｓ　Ｌ−メチオニンにより、ＥＣタンパク質を５ 時間生合成的に標識した［ＬＰＳ処理の２時間から７時間口（ルンンスカス（Ｌ ｕｓ］。グルコースオキシダーゼ／ラクトペルオキシダーゼブロトコール［Ｈｕ ｂｂａｒｄ、　Ａ。

Ｌ、らのＪ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　６４１３８（１９７５）コを使用し、 表面ＥＣタンパク質を１２５Ｊで標識した。

１００ｍＭ　トリス−Ｈ（ＪｐＨ７，４，１５０＊Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、１２Ｍフェニルメチルスルホニル・フルオライドおよび領　３％ＣＨＡＰ Ｓ中でＥＣを細胞溶解し、不溶性物質を遠心（１２，０ＯＯＸ９．０．５時間、 ４℃）により除去した。免疫沈降では、ＥＣ溶解物（１００μ！細胞溶解物／レ ーン中、約５ｘ１０５細胞）をモノクローナル抗体培養上清１００μｌと共に２ −４時間インキュベートしく４℃）、次いでセファロース−４Ｂ　［Ｃａｐｐｅ ｌ］にカップリングさせたヤギ抗−ネズミＩｇＧ１００μｌと共に２−４時間イ ンキュベートし、それを標識タンパク質の非特異的接着を減少させるために非標 識化細胞溶解物で前処理した。

生合成的に標識したＥＣの細胞溶解物も非結合モノクローナル抗体によって前も って清浄化した。セファロースビーズに特異的に結合する抗原を十分に洗浄し、 ５−１２％直線勾配ゲルの還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析［Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、 　Ｋ、のＮａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０）コに供した。

モノクローナル抗体Ｒｂｌ／９およびＲｂ２／４との免疫沈降では反射的な抗原 の特異的枯渇が認められた。これとは対照的に、モノクローナル抗体Ｒｂ２／３ との２つの連続免疫沈降は、Ｒ，ｂｌ／９およびＲｂ２／４によって認識される ポリペプチドを枯渇させなかった（第５Ｂ図）。

精製した９８にポリペプチド（ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡ、Ｍ）から得られるＮ−末 端アミノ酸配列は、ヒトＶＣＡ、Ｍ−１（配列番号７、アミノ酸１−２２）の推 定Ｎ−末端配列との間に２２アミノ酸のうち２０個に相同性が認められた（第６ 図）。１１８におよび９８にポリペプチドのＮ−末端１列は同一であり、ウニス ターン・プロットでは両ポリペプチドともにモノクローナル抗体Ｒｂｌ／９によ って認識され、このことはこれらが同じ遺伝子の産物であることを示している。

ポリペプチドは、ＬＰＳ静脈内注射（１００μｇ／ｋｇ）の４時間後に死亡させ た１０匹のウサギの肺から得られた細胞膜調製物からＲｂｌ／９免疫アフイニテ イークロマトグラフイー［Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｈｚ、　Ｂｉｏ　Ｒａｄ］および ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって精製した。５ＤＳ−ＰＡＧＥした後、得られたポリペ プチドをＩ韮ｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ、コに電気移 動させ（２５ｍＭ）リス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８゜３．２０％メタノール 緩衝液、１００ＶＸ１００分、４℃）、切除したクーマシー・ブリリアント・ブ ルー染色バンドから得たＮ−末端アミノ酸配列を、自動気相配列決定装置［＾ｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ｌを使用し、フェニルイソチオンアネート 分解サイクルにより配列決定した［ＬｅＧｅｎｄｒｅ、　Ｎ、らのＡ　Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｕ ｒｊ、ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　Ｍａｔ ｓｕｄａｉｒａ、Ｐ、　（編■j、アカ デミツク・プレス、サンシエゴ、４９頁（１９８９）］。

第５Ａ図は、生合成的に標識した細胞（左欄、［−コ＝対照ＥＣ，Ｃ＋］＝ＬＰ Ｓ−活性化）、および表面ヨード化ＬＰＳ活性化細胞（右欄）を示している。モ ノクローナル抗体Ｈｕ５／３およびＥｌ／Ｃ１Ｃ１５（Ｉ＋）はヒトＥＣとは結 合するが、ウサギＥＣとは結合せず、特異的にポリペプチドを沈降させなかった 。

実施例１２　ＥＣ単層に対する細胞及びモノクローナル抗体の結合性マイクロタ イター平板にて定量的接着検定を行った。ＢＣＥＣＦで標識しかつＲＰＭＩ　１ ％ＲＢＳ（２Ｘ１０５細胞１０．　２１／／ウエル）に懸濁したＵ９３７細胞を ３７℃で１０分間ＥＣ単層に接着させ、次いで各ウェルを緩衝液で充満し、得ら れた平板をシールし、反転させ、遠心した（２５０　Ｘ９．５分間、２２℃）［ ル／ンスカス（Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ、　Ｆ、　ｆ、　）らのＪ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１４２：２２５７（１９８９）　；　Ｂｅｖｉｌａｃ曹浮＝A　Ｍ、　 Ｐ。

標準的なプロトコールに従い、５時間ＬＰＳ処理ＩＶＣＥＣで免疫したマウスか ら得た膵臓細胞とＮ５−１骨髄腫細胞とを融合させ、モノクローナル抗体を生成 させた。飽和濃度にあるモノクローナル抗体上清とフルオレセイン−コンジュゲ ート化Ｆ　（ａｂ’　）２ヤギ抗−ネズミＩ　ｇＧ　［Ｃａｌｔａｇ　Ｌａｂｓ ］とを利用し、生存ＥＣ単層において細胞表面結合検定を４℃で行った。自動平 板解読袋！［Ｐａｎｄｅｘ、　ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃａｒｐ、 　］を使用して蛍光レベルを測定し、ウサギＥＣには結合しない丁ｇＧ、抗体に よって得られる蛍光読み値（約５０相対蛍光単位）を差し引（ことにより、特異 的なモノクローナル抗体結合を測定した。

第゛１図は、同じニューシーラント白色ウサギの大動脈（Ａｏ）及び下部大静脈 （ＩＶＣ）から得たＥＣ単層（継代２）に対するＵ９３７接看（ＡおよびＢ）お よび特異的モノクローナル抗体結合（ＣおよびＤ）を示すものである。ＬＰＳ（ Ｅ、ｃｏｌｉ、　１（ｒ　ｇ　／ｍｊ’）によるＥＣ活性化はＵ９３７接看（Ａ ）およびモノクローナル抗体結合（Ｃ）共に経時的に増大した。ＩＶＣＥＣのＬ ＰＳ処理（５時間）の間にシクロへキシミド（ＣＨＸ、１０μｇ／麓ｌ、黒色柱 ）と共にインキュベートすると、ＬＰＳ誘導されるＵ９３７接着（Ｂ）およびＲ Ｂ１／９細胞表面結合（Ｄ）の増大が完全に抑制された。ＣＨＸはＥＣ単層の完 全性、またはＬ　Ｐ　Ｓによってはその発現は改変されない豊富な構成ＥＣ抗原 へのモノクローナル抗体Ｒｈ２／１３の結合性には影響を与えなかった（Ｄ挿入 図）。各グラフにおけるデータ点は、４回の測定の平均および標準偏差を示して いる。

実施例１３　可溶性ＡＴＨＥＲ○−ＥＬＡＭの調製可溶性のトランスメンブラン ・タンパク質は、トランスメンブランドメインの５′に隣接する終止コドンを含 有するｃＤＮＡを遺伝子的に操作して調製すビことができる。適当な細胞にて発 現させると、このｃＤＮＡから合成されるタンパク質は分泌され、その培養から 回収することができる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するウサギ内皮由来の可溶性ＡＴＨＥＲ Ｏ−ＥＬＡＭの調製： ウサギ内皮細胞を３７℃にてＩＩＩｇ／菖１ＬＰＳで４−８時間処理する：洗浄 性細胞溶解プロトコール［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、らのｌ１ｌｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ２版、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｅａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリン グ＋ハーバ−、ニューヨーク、　（１９８９）］によって細胞質ＲＮＡを調製す る。ＲＮＡ１μｇを鋳型として使用し、またＡＴＨＥＲＯ−ＥＬ、ＡＭｍＲＮＡ の３′非翻訳領域に見いだされる配列に相補的な適切であるオリゴヌクレオチド プライマー５０ｎｇ、およびトリ骨髄芽球種痘ウィルス逆転写酵素［ＭｏＬｅｃ ｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ、　タンパ、　ＦＬコ１００Ｕ を使用し、１時間インキュベートすること（４２℃、最終反応容量４０μｌ）に より、最初の鎖ｃＤＮＡを合成する。

ＰＣＲの２ラウンド目は、対になった（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、および最初 の鎖ＣＤＮＡまたは１ラウンド目のＰＣＲ産物５μｌを鋳型として利用して行う ［５ａｉｋｉ。

ＲＫ、らの５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：１３５０（１９８８）コ。１ラウンド目の ＰＣＲでは、プライマー３０Ｑｎｇを使用する。５′プライマーは、開かれた解 読枠の５′側領域（５′非翻訳領域）に相当しており、３゛プライマーはｃＤＮ Ａ合成のために使用したものと同じである。２ラウンド目のＰＣＲでは、プライ マー１５０ｎｇを使用する。５゛プライマーは５゛非翻訳領域に依然として対応 するが、１ラウンド目のＰＣＲに使用したプライマーの３′側にある。３′プラ イマーはトランスメンブランドメインの５′に隣接する領域と相補的であり、解 読枠内に終止コドン（例えば、ＴＡ、Ａ）を含有している。プライマーには、遺 伝子的に操作された便利なＭ１限酵素部位をサブクローニングを目的として含有 させることができる。上記両ラウンドのＰｃＲを適切な条件下で２６サイクル行 うのが好ましい　例えば、９４℃における変性１分、５０℃におけるアニル９２ フ２分、および７２℃における延長６分（最初のサイクルでは４０分の延長時間 ）Ｄ次いで、ＰＣＲ産物を標準的なアガロースゲル電気泳動およびサザーン・プ ロッティングにより分析する。

次に、６個のＰＣＲ反応チューブの同一（パラレルな）組みから得た主要な反応 産物をプールし、精製する。ＰＣＲ産物の末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ ー断片により修復し、Ｔ４キナーゼによりリン酸化し、得られた断片をプラスミ ドベクターｐ　Ｂ　Ｓ　［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ジョラ、　ＣＡＩのＨｉ ｎｃＩＩ部位にサブクローンする。次いで、精製したプラスミドＤＮＡを適当な 制限酵素で切断し、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ　ｃＤＮＡ挿入体を適当な真核生物 発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ−Ｉ　［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ジニゴ 、　ＣＡＩにサブクローンする。この構築物を適当な細胞、例えばＣＯ８細胞に トランスフェクトする。

実施例１４　ヒトＶＣＡＭ−１遺伝子のクローニングおよび配列決定ベクターＥ 　Ｍ　Ｂ　Ｌ　３　［Ｂｏｎｔｈｒｏｎ、　Ｄ、　ＴらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、@８５：１４９２− １４９６（１９８８）］中のヒト末梢血ＤＮＡのバクテリオファージスライブラ リ−をプレートし、常法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　ＪらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　’　：Ｉ−ルド・スプリ ング＋ハーバ−、二ｓ−ヨーク（１９８９）］に従ってニトロセルロースフィル ターを調製し、ＶＣＡＭ−１についてウサギ部分的ｃＤＮＡを用いてスクリーニ ングした。このｃＤＮＡプローブを、ヘキサヌクレオチドプライマーおよび［α −”Ｐ］ｄｃＴＰｌ：Ｆｅｉｎｇｅｒｇ、Ａ、Ｐ、らの＾ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２：６−１３（１９８３）］の存在下にＤＮＡポリメラ ーゼ■のクレノー断片を用いて標識した。６ＸＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ中にてフ ィルターを放射活性化プローブと共に６５℃でインキュベートし、０．５ＸＳＳ Ｃ，０，５％５ＤＳ（６５℃）で洗浄した。ハイブリダイズしたバクテリオファ ージを精製し、増幅し、バクテリオファージＤＮＡを調製し、ＶＣＡＭ−１遺伝 子を含有する制限断片をプラスミドベクターｐＢＳに連結したＥＳａｒａｂｒｏ ｏｋ、　Ｊ、らの１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＪｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａ、ｎｕａｌ　２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８ ９）コ。

ヌクレオチド配列の決定は、改変Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ［Ｕｎｉｔｅｄ　５ ｔａｔｅｓ　Ｂｆｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、クリーブランド、オハイオ 」および［α−３ｓＳ］−ｄＡＴＰを用いるジデオキシヌクレオチド・チェイン ・ターミネーション法によって行った。オリゴヌクレオチドブライマーをオリゴ ヌクレオチド合成装ｆｔ　［Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍＳ、フォスタ ー・シティ−、ＣＡＩにより合成し、それを精製せずに使用した。

実施例１５７免疫グロブリンドメイン可溶性ヒトＶＣＡＭ−１の生産２個から６ 個の多帯から単離した継代培養２ヒＩＪＩ静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）　［Ｂ ｅｖｉｌａｃｑｕａ　１１．　Ｐ、らの５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１１６０−１ １６５（１９８９）］をＩＯＵ／ｍｆの組換えヒトＩＬ−１β［Ｂｉｏｇｅｎ、 　ボストン、　ＭＡｉで３７℃にて６時間処理した。洗浄性細胞溶解プロトコー ル［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　：！−ルド・スプリング＋ハーバ−、ニュー ヨーク、　（１９８９）］によって細胞質ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ１μｇを鋳 型として使用し、またＶＣＡＭ−１国ＲＮＡ−ＧＧＧＴＣＡＴＡＴＡＧＴＣＴＴ ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣ（配列番号１０）の３”非翻訳領域に見い だされる配列に相補的なオリゴヌクレオチドブライマー５０ｎｇ、およびトリ骨 髄芽球種痘ウィルス逆転写酵素［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ ｏｕｒｃｅｓ、　タンパ、ＦＬ］１００Ｕを使用し、１時間インキュベートする こと（４２℃、最終反応容量４０μｌ）により、最初の鎖ｃＤＮＡを合成した。

ＰＣＲの２ラウンド目は、対になったプライマー、および最初の鎖ＣＤＮＡまた は１ラウンド目のＰＣＲ産物５μＥを鋳型として利用して行った［５ａｉｋｉ、 　Ｒ，Ｋ。

らの５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：１３５０（１９８８）］。１ラウンド目のＰＣＲ ではブライ７７−３００ｎを使用し、２ラウンド目には１５０ｎｇを使用した。

ｍＲＮＡ−ＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＴ Ｇ（配列番号１１）の５°非翻訳領域に対するプライマーおよびｃＤＮＡ合成に 使用したものと同じ３′プライマーを１ラウンド目のＰＣＲに使用した。対にな った組みのプライマーは、ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡＣＴＡＴＴＴＴＧＴＣ ＡＴＣ（配列番号１２）、およびＧＴＴＴＡＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡＧ ＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡ（配列番号１３）に相補的な配列から構成されて いる。この後者のプライマーは、ＶＣＡＭ−１トランスメンブランドメインの５ ゛に隣接する終止コドン（ＴＡＡ）をコードしている。

上記両ラウンドのＰＣＲを以下の条件下で２６サイクル行った２９４℃における 変性１分、５０℃におけるアニーリング２分、及び７２°Ｃにおける延長６分（ 最初のサイクルでは４０分の延長時間）。次いで、標準的なアガロースゲル電気 泳動およびサザーンープロツテイング［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、らのＭｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ 版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド ・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、　（１９８９）］によって、ＰＣＲ産 物（１０μｌ）を分析した。

次に、６個のＰＣＲ反応チューブのパラレルな組みから得た主要な２．０５ｋｂ 反応産物をプールし、精製した。ＰＣＲ産物の末端をＤＮＡポリメラーゼＩのク レノー断片により修復し、Ｔ４キナーゼによりリン酸化し、得られた断片を常法 ［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、、　ＪらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｌ１ａｎｕａｌ　２版、Ｃｏ１ｄ@Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリングＨハーバ−、ニュ ーヨーク、　（１９８９）］に従ってプラスミドベクターｐ　Ｂ　Ｓ　［Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ、う・ジョラ、　ＣＡＩのＨｉｎｃＩｒ部位にサブクローンした 。得られたＰＣＲ挿人体をｐｃＤＮＡ−Ｉ　［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ジ ェゴ、　ＣＡＩにサブクローンし、ＣＯ８細胞にて発現させた。

当業者ならば、本発明の本質を逸脱することな（、先に説明した本発明の態様に 種々の改変を施せることは理解されよう。以下に添付の請求や範囲内にあるこの ような改変は、すべて本発明に包含されるものである。

配列表 （１）一般的情報 （１）特許出願人、　シブルスキー、マイロン・アイジムブロン、マイケル・ニ ー コリンズ、タッカ− （ｉｉ）　発明の名称：　アテローム性動脈硬化に関連する単核白血球指向性内 皮接着分子 （ｆｆｉ）　配列の数：１３ （憧）連絡先 （Ａ）　名宛人・スターン、ケスラー、ゴールドスティン・アンド・フォックス （Ｂ）　通り・エヌ・ダブリュ・スウィート３００゜コネクティカット・アベニ ュー１２２５８（Ｃ）　市；ワシントン （Ｄ）　州　コロンビア特別区 （Ｅ）　国　アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：２００３６ （ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型・フロッピーディスク （Ｂ）　コンピューター・ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・システム コＰ　Ｃ−Ｄ　ＯＳ　／　Ｍ　Ｓ　−Ｄ　Ｏ５（Ｄ）　ソフトウェア：　Ａｓｃ ｉｉ （ｖｉ）　本出願のデータ： （Ａ、）　出願番号：未　定 （Ｂ）　出願口　本　日 （Ｃ）　分類：未　定 （報）優先権主張出願のデータ （Ａ）　出願番号：米国０７／４８７．０３８（Ｂ）　出願臼：１９９０年３月 ２日 （ｖｉ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名・ボタ−、ジェーン・イー・アール（Ｂ）　登録番号：３３．３３ ２ （Ｃ）　参照／整理番号：　０６２７．２１００００４（Ｌｘ）　電話連絡先情 報 （Ａ）　電話番号：　（２０２）８３３−７５３３（２）　配列番号１の情報 （１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：２４８７塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列、配列番号１： ＪＬＴＧＣＣＴＧＧＧＡλＧＡＴＧＧＴＣＣＴ　ＧＧＴσ−ｔχλ（：ＴＣＴＣ ＡＡＣＩＸ’Ｃ’ＴＡＣＴＩＴＧＧＡＴ　５０ＴＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＡＧＡ ＧＡＴＣＣＡＣＡＡ入’Ｉ％ＡＧ　ＣＴＧＡＧＣＧＧτＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡ 　１２５０ＴＧＧＧｃＧｃＣＣＴ　ＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡ　ｃＯ力イハＴＣＣＴ ＡＡＴＧＴＧ　ＴＡＣＣ５１００ＡＣＡαＡ１１ｆｆＣＴＧ　ＧＴＡＧＡＡＧＣ ＡＣＡＧＡＡ入τＣ入ＡＡ入ＧＴＧＴＡＧ　２４８７（２）　配列番号２の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ、　）　長さ、８２８アミノ酸 （Ｂ）　型アミノ酸 （Ｄ）　トポコノ−Ｘ鎖状 （１１）　配列の種類　ペプチド （刀）　配列、配列番号２ Ｍａｌ　Ｇｌｙ’Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　エコ＠　Ｔｈｒ　Ｗａｌ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　 Ｌａｕ　、Ｖａｌ　Ｐｒｏ　１．ｐ　、Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐ秩B １コ０　１３５　１４０ Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｒｑ　、ＩＪｕ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ｋｕ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　丁’ｙｒ　ＬａＩ３　にｃ４　Ｌxｓ １４．５　１５０　１５５　１６０ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｔｂｘ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　工１ｅ　！；ｅｒ　’Ｐｒｏ　Ｌ凾■ ２１０　２工５　２２０ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍａｌ　Ｉｌｍ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　ＪＬｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ 　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　（ｎｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌ■ ２２５　２コ０　２３５　−　２４０ Ｔｙｒ　ＶａｌＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｉｎ　Ｇｉｎ工１＊　Ｇｌ ｙ　！、７ｓ　５ａｒ　ｋηＬＹＳ　Ｇｌｕ　Ｖｌ。

２９０　２９５　コＯＯ ＶａｌＪｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　’Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉ’ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ 　Ｓａｒ　シ１Ａｒｇ　Ｔｂｒ　Ｇｍ工１ｅＭｐ３４０　ゴ４５　コラ０ Ｔｈｒシ＝ｕ、　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　’Ｔｌａｌ　Ｓｔｒ　Ｐｈａ　（Ｊｕ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　ｓａｒ　）アシ専Ｃｙｓ　’ｒｈｒ３７０　、、　３７５ 　３８０ Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　五ｓｐ　：ｈ−ａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｍ 　Ｇｌｕ　Ｌｃｕ　ｓａｒ　Ｇａｙ　Ｐｒｏ　Ｘ’ｒｏ　Ｖ≠P ＡＳｎ　’Ｇｌｙ　、Ａｒｇ　ｐｒｏ　７ａ工〒ｈｒＷａユ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　 Ｌｙｓ　’Ｖａｌ　Ｉ’ｒｏ　ｘｓｎ　Ｍａｌ　Ｔｙｒ：’oｒ。

Ｐｂｅ　ｋψＡｒｇｒｊｌｕ　Ｇｌｕｌｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕシｕ　Ｉ、ｙｓ　 Ｇａｙ　Ｇｌｕフｗ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ４コ５　４４０　４４５ Ａｓｎ　ＬＹｓＧｌｕ　Ｐｈｅシｌｕ　Ｇｌｕ　ａｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒ＋ｐ　Ｌ ｙＳ　ＬｙＳ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｔｉ　フ「ＬｙｓＳｅｒ　Ｌｅｕαｌｕ　 Ｍａｔ　Ｔｂｒ　Ｘ’ｈａ工１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｂｒ　Ｍ＊ｊ−Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ｔｈｒ　Ｇ１７　Ｌｙ；　Ｖａ１４６．５　４７０　４フ５　４８゜ １、−ｐ　Ｘ１＠　Ａｈａ　Ｍａｌ　ｉｒＰ　Ｖａｌ　Ｓｅｘ　Ｐｒｏ　Ｓｅｘ 　Ｓｅｒ　ｌｌｅ　ｖａｘ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧＩＹ　入ｒX ５ユ５　５２０　５２５ Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　工１ａ　Ｓｅｒ　ｋ　ＬＹ Ｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｇｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　エコｅＰｒｏ　Ｓｅｘ：　１Ｌ ７ｓ　Ｓｅｘ　Ｍａｌ　ＸＹＩＡ　Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ａｇｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｎ工 １ｅ工１ａ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈ■ ６’ｌ−０６Ｌｉ　６２０ １￥ｓ　Ｇｌｙ　Ｉｕｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　’ｒｈｒ　Ｔｒｐ　工１ ｅ　エコａ　Ｉａｕ　Ｉ＋ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ’　Ａｌａ@Ｇｌｕ Ｔｈｒ　ＧＩＹ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　工ａｕ　Ｌｙｓ　５ａｒ　エコ、＠ 　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔ’ｆ’ｒ　’Ｊココ】＝　工PｅＡｒｇ Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｃｌｎ　］、ａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　Ｔｙ：　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓａｒ　ＬＹＳ　入５■ Ｇｌｕ　Ｖａ、ｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｉａｕ　：ｋｒｑ、Ｓｅｘ工１ｅ 　Ｔｈｒ　Ｉｎｕ　Ａｓｐ　ＶａｌＬＹｇ　Ｖａｌ　Ｐ’ｒB ６７５　ε８０　６１１５ Ｐｒｏん７　Ｍｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｍ　Ｓｕｒ工ｍｅ　ｌ１ｉｓ　Ｐｒｏ 　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｉｎ　ｖａｌ　Ｌ”ｙｓ　Ｇｌｕ６り０　６９５　フｏ。

ＧｌＹ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　エコ＊　Ｔｈｒ　Ｘｌ、ｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ 　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｓｅｒ　！！ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　λ■■ ’Ｖａｌ工１ｅ工１＠　Ｌｅｕ　ＬＹｓｋｌｖａｌ　Ａｓｐ　シｕ　Ａｌａ　妬 ｎＧｌｕ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ｃｙｓｉ５ｅｒ　ＬＹＳ　Ａｎｎ　Ｇｌｙ Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｔｂｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　 ５；ｓｒ　Ａｊｐ　ＴｂｒＧｌｙ　Ｖａｌ　ＴｙｒＶａｌＩｌｅ　ｋｌＡｌａ　 ５α１−ｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｎ　Ｇａｙ　ｘｓｐ　Ａｓｐ　Ｂａｒ　Ｇｌｙ７５５ 　フロ０　７６５ ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　′Ｌａｕ　Ｌｅｕ　ｖａｚ　Ｌａｕ　丁ｙｒ　Ｃｙｓ 　Ａｌａ　ｓｅｒ　ｓａｒ　Ｌａｕ　工１ｅ　工１ｅ　ＰｒB に１工Ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ工１・工１ｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ｊｕａ　Ａｒｇ　 ＬｙＳ　Ａｌａ　ＪＬｉｎ　Ｍｅｔ　ＬＹｓ　Ｇｌｙ８０５　８ユ０　８１５ ５＠ｒ　圧１Ｅａｒ　ｋｕ　’ＶａｌＧｌｕにＬａ　Ｇｈ　Ｌｙｓ　Ｂａｒ　Ｌ ｙｓ　Ｖａ１（２）　配列番号３の情報 （１）　配列の特徴 （、へ）　長さ　２７６塩基対 （Ｂ）　型　核酸 ぐＤ）　トポロジー、ＩＩ直鎖 状ｊｌ）　配列の種類　ＤＮＡ （Ｘｌ）　配列・配列番号３４ （２）　配列番号４の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：９２アミノ酸 ＣＢ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ペプチド （江）　特徴：配列番号４は配列番号２の３１０−４０１のアミノ酸である。

（ｘｌ）　配列：配列番号４： Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　工１ｍ　Ｓｅｒ　 Ｘ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ｈｒｑ　エユｅ　Ａｌａ　Ａｌ■ ｌ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｐｒｏｊａｒ　Ｐｈａ　Ｂａｒ　’Ｉ’ｒｐ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｇｉｎ工 ｘ−４ｓａｒ　ｐｒｏ　ｍｕ　Ａ＄ｎ　Ｇｌｙ（２）　配列番号５の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：９２アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）　配列の種類：ペプチド （ｉｘ）　特徴：配列番号５は配列番号７の２８６−３７７のアミノ酸である。

（ＸＩ）　配列：配列番号５、 （２）　配列番号６の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：２７６塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 Ｑｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｔｘ）　特徴：配列番号６は配列番号１の９２９−１２０のアミノ酸である。

（Ｘｉ）　配列：配列番号６・ （２）　配列番号７の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：６６２アミノ酸 ＣＢ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ペプチド （ｘｌ）　配列・配列番号７： Ｘ’ｂ＊　Ｌｙｓ　ｎｅ　Ｇｌｕ　’ａｒ　Ｔｂｘ　ｈ℃Ｇｌｕシｒ　ｋ１Ｔ７ ｒ−Ａｌａ　Ｇｉｎ工１４ｋ　Ｇｌｙユ　５　ユＯ１５ Ｐｈｅ　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｔｂｘ　Ｇｉｎ工１ｍ　ｈａｐ　Ｓｅｘ　’ Ｘ’２℃Ｘｄｋｕ　Ｍｎ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　’ｎｚＡｓｎ　Ｇｌｕ　Ｈ ｉｓ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＣｙＳ−Ａｌａ　’ｒｈｒ　ａｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓａｒ　Ａｒｇ　ＬＹＥ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　工ｌｅ　（Ｊｎ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｕ　工１ｅ　’ｒｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　 ＰＴＯＧｌｔ{ 工１ｅ　Ｐｈ１ｓ　Ｌａｕ　Ｓｅｊ：　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　ＧユＵ　入１ ａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　工ｌ＊　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌ凾■ ｌｏｏ　１０５　１：Ｌ。

Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　入１ａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　 Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　エユＣ入Ｓｐ　Ｌｅｕ１工５　）２０　１２ ５ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｙ工１＠Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　−Ｐ ｈｅ　打ｏ　ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕコア０　コア５　３８０ Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｔｒ　ＶａＩＴｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｘｕ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇシｕ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ４０５　４１０　４：Ｌ５ Ｌａｕ　Ｌｙｒ＋　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｎよ・　工１＊　Ｌａｕ　ＧユＵ　λａ ｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｓ　Ｌａｕ　ＧユＵ　入５ｐ　τ■■ Ｇ１ｎ＋ｑｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｉｌ＠　Ｌａｕ　 Ｔｒｐ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　’ＬＡｐ　ｐｒｏ　λｓ■ ５工５　、５２０　５２５ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｗａｇ工ｌｅ工１＊　Ｓｔｒ　ＣｆＳ　紮ａｙｓ　Ｇａｙ　ｋ ｍＶａｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ５９５　６００　６０５　’ （２）　配列番号８の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ、２０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （Ｘｌ）　配列：配列番号８゜ ＡＡ丁ＴＴＡＴＧＴＧ　ＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧ　２０（２）　配列番号９の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：１７塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｌ）　配列：配列番号９゜ ＴＴＣＴＧＴＧ＾＾ＴＡＴＧＡＣＡＴ　１．７（２）　配列番号１０の情報 ゛　（１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　３２塩基 （Ｂ）　型：核酸 ぐＤ）　トポロジー・直鎖状 （１１）　配列の種類・核酸 （ｘｌ）　配列：配列番号１０゜ ＧＧＧＴＣＡＴＡＴＡ　ＧＴＣＴ丁ＧＴＡＧＡ　ＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡ　ＴＣ３ ２（２）　配列番号１１の情報 （］）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　３２塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類、核酸 （２ｉ）　配列：配列番号１１・ ＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡ　ＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧ　ＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧ　ＴＧ　 ３２（２）　配列番号１２の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：２７塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （Ｘｌ）　配列：配列番号１２： ＧＧＧＴＴｎＧＧＡ　ＡＣＣＡＣＴＡｍ　ＴＧＴＣＡ丁Ｃ２７（２）　配列番号 １３の情報 （１）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ・３２塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （１１）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号１３コ ＧＴＴＴＡＡＣＡＣＴ　ＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡ　ＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡ　ＡＣＴ ＡＡ　３５Ｆ１ｇｕｒｅ　１ 内皮活性化（時） Ｆｌｇｕｒｅ　２ Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｉｇｕｒｅ　４ Ｆ１廖げｅ５ ６６−　・ １　′シ Ｆｉｇｕｒｅ　６ Ｆｉｇｕｒｅ　７ つ？ｌＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭオーブン解読粋のヌクレオオー配列８免疫グロブ リン様ドメイン型　。

Ｆｉｇｕ８−ｅ　８ ウサギＡＴ）ＩＥＲＯ−ＥＬＡＭのアミノ酸配列８免疫グロブリン様ドメイン型 ＡｍＣＭ■πＡＲ痣憔ｏＳＨ５Ｌ　ｖヒｑｏ寡ｇ２９Ｆｊｇｕｒｅ　９ ウサギおよびヒトＡＳ−４ドメインのヌクレオチド配列の比較ＡにＡＡＡ（ＴＣ ＣＡ　ＡＡＡＣＣにＡＡＴｃ　ＣｋにＧＴＧＬ：、ＡＧＣ，ＴＣＴＡＣＴＦｉｇ ｕｒｅ　１０ Ａｓ−エ　ドメインニ Ｏ −−ＡＣ；ＡＡＡＣＣＡＴＴ　ＴＡＣｒ：ＣＡＣＡＴＣＴＣＩ：ＣＣＴＧ　Ｃ； ＡＣＣＣＣＧＧｋττＧＣ’ｒＣＣＴＣａにＥ）ＣＩ’Ｆ　ＴＶＥ　ＩＳ１’Ｇ 　ＰＲＹ　ＡＡＱ臼ｇｕｒｅ　１３Ａ ドメイン２　ドメイン３ＡＳ−１ドメイン４　ドメイン５Ｆｉｇｕｒｅ　１３Ｂ ＣＥ１／６ 要　約　書 本発明は、ＡＴＨＥＲＯＥＬＡＭと命名した新規な内皮細胞−白血球接着分子に 関する。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ分子は細菌性ＬＰＳによって刺激された培養内 皮細胞において発現され、内皮細胞への単球の結合を選択的に媒介する。ＡＴＨ ＥＲＯ−ＥＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体は初期のアテローム性動脈硬化 症の損傷に関与している血管内皮細胞に結合するが、非関与の動脈組織の血管内 皮細胞には結合しない。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭおよびＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ に指向性の抗体を、初期のアテローム性動脈硬化症の損傷の同定に、ならびにア テローム性動脈硬化症の治療および予防に用いることができる。

国際調査報告 エエＸ、Ｃｌａｉｍｓ　９−１ゴ＊　’ｄｒａｗｎ　ｔＱ　ｄｌａｏｎｏｓｔｉ ｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕ濡１ｎａ　＠ｎｆ−１ｂ６ｄＹｃｌａ璽ｇｉｆｉｅｄ　ｉ ｎ　Ｃ１ａｓｓ　４３６．　ｍｕｂｅＬｓｓｍ　５１８Ｖ！、　Ｃｌａｉｍ　コ ２＋　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｃｏｍｐｃ＋ｓ＋１ｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｐｒｅｖｅｎ ｔｉｎｇ　槽・ｎｏｅｙｔ＊　ａｄ■■唐奄盾■ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４２４．　ｍｕｂｅＬｓｓｍ　８５ ．８ＧＴＯｕｐ　１工Ｘ　、Ｃ１暢１ｍ１１　４Ｇ−４３、ｄｒ＠Ｖｎ　ＬＯＩ ＩＩ）ｔ−Ｆ　ＩＯｄ　Ｑｉ　ｔｒｅｍｔｉｎ（ｌ　Ｗ　１ｊｈ@＠ｎｔ１ｂＯ ｄＹ ｃｏｎ１υａｓｔｅｄ　ｔｏ　５ｔｈｅｒｏｓ＋ｃｉ瞼ｒｏｔｉｃｄｒｕａ　ｃ ｌａｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎ　Ｃ１ｍｍｍ　４２４．　＊ｕｂロH４Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アテローム性動脈硬化損傷にて発現される単核白血球に選択的な内皮白血球 接着分子（ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ）からなる実質的に精製されたタンパク質。 ２．該ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭが分子量約１１８ｋＤを有している請求項１に記 載のタンパク質。 ３．該ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭが分子量約９８ｍを有している請求項１に記載の タンパク質。 ４．配列番号２で示されるアミノ酸配列を有している請求項１に記載のタンパク 質。 ５．配列番号１で示されるヌクレオチド配列によってコードされている請求項１ に記載のタンパク質。 ６．ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭに結合できるモノクローナル抗体。 ７．モノクローナル抗体Ｒｈ１／９の結合特性を有しているモノクローナル抗体 。 ８．モノクローナル抗体Ｒｂ２／４の結合特性を有しているモノクローナル抗体 。 ９．哺乳動物の動脈内皮細胞からのＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ発現を検出すること を特徴とする、該哺乳動物のアテローム性動脈硬化症の診断方法。 １０．該動脈内皮細胞にＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭと精舎できる抗体を暴露させ、 得られた結合抗体を検出することを特徴とする請求項９に記載の方法。 ！１．該抗体が検出可能に標識されている請求項１０に記載の方法。 １２．該抗体が放射線標識されている請求項１１に記載の方法。 １３．該抗体がモノクローナル抗体Ｒｈ１／９の結合特性を有している請求項１ ０に記載の方法。 １４．内皮細胞にて発現される単核白血球一選択的な接着分子と結合できる抗体 に内皮細胞を暴露させることを特徴とする、内皮細胞への単球の結合を防止する ための方法。 １５．該接着分子がＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭである請求項１４に記載の方圧。 １６．該接着分子が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質から なる請求項１５に記載の方法。 １７．該接着分子が配列番号１で示されるヌクレオチド配列によってコードされ ているタンパク質からなる請求項１５に記載の方法。 １８．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。 １９．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒｂ１／９の結合特性を有し ている請求項１８に記載の方法。 ２０．アテローム性動脈硬化損傷を有する疑いのある哺乳動物を処置するための 方法であって、該損傷にて発現される単核白血球−選択的な接着分子と結合でき るモノクローナル抗体の医薬的有効量を含有する組成物を、該哺乳動物に投与す ることを特徴とする方法。 ２１．該接着分子がＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭである請求項２０に記載の方法。 ２２．該接着分子が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質ま たは単球結合性の該タンパク質等価物からなる請求項２０に記載の方法。 ２３．該接着分子が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列によってコードさ れているタンパク質または単球結合性の核タンパク質等価物からなる請求項２０ に記載の方法。 ２４．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒｂ１／９の結合特性を有し ている請求項２０に記載の方法。 ２５．該哺乳動物がヒトである請求項２０に記載の方法。 ２６．該組成物が製薬的に許容され得る担体をさらに含有している請求項２０に 記載の方法。 ２７．アテローム性動脈硬化損傷を有する哺乳動物を処置するための方法であっ て、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭまたはその単球結合性分画の医薬的有効量を含有す る組成物を、該哺乳動物に投与することを特徴とする方法。 ２８．該ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭが配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する タンパク質または単球結合性の該タンパク質等価物からなる請求項２７に記載の 方法。 ２９．該ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭが配列番号１で示されるヌクレオチド配列によ ってコードされているタンパク質または単球結合性の該タンパク質等価物からな る請求項２７に記載の方法。 ３０．該哺乳動物がヒトである請求項２７に記載の方法。 ３１．該組成物が製薬的に許容され得る担体をさらに含有している請求項２７に 記載の方法。 ３２．ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭ特異的な抗体またはＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭと結 合できる抗体断片の治療学的有効量、および製薬的に許容され得る担体を含有す る、アテローム性動脈硬化損傷への単球の接着を防止するための組成物。 ３３．ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭと結合できる検出可能に標識された抗体またはそ の断片を含有する、アテローム性動脈硬化損傷を検出するための組成物。 ３４．該抗体がモノクローナル抗体Ｒｂ１／９またはＲｂ２／４の結合特性を有 している請求項３３に記載の組成物。 ３５．（ａ）ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭと結合できる検出可能な標識物と診断可能 にコンジュゲートされた免疫グロブリン分子であって該標識された免疫グロブリ ンが該アテローム性動脈硬化損傷に実質的に蓄積するものまたはその断片を含有 する組成物を個体に投与し、 （ｂ）該標識された免疫グロブリンの存在を検出することを特徴とする、個体の アテローム性動脈硬化損傷を検出するための方法。 ３６．該免疫グロブリンがモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である 請求項３５に記載の方法。 ３７．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒｂ１／９またはＲｂ２／４ の結合特性を有している請求項３６に記載の方法。 ３８．該検出可能な標識物が放射活性同位体である請求項３５に記載の方法。 ３９．該放射活性同位体が１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、９７Ｒｖ、６７ Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒおよび２０１Ｔｌからなる群の 中から選ばれる請求項３８に記載の方法。 ４０．ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭと結合できる免疫グロブリン分子またはその断片 とコンジュゲートされた抗−アテローム性動脈硬化損傷の医薬的有効量を個体に 投与することを特徴とする、該個体におけるアテローム性動脈硬化症を処置する ための方法。 ４１．該免疫グロブリンがモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である 請求項４０に記載の方法。 ４２．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒｂ１／９またはＲｂ２／４ の結合特性を有している請求項４１に記載の方法。 ４３．該抗−アテローム性動脈硬化損傷が抗−増殖薬、抗−炎症薬、抗−酸化薬 、および抗−擬血薬からなる群の中から選ばれる請求項４０に記載の方法。 ４４．ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭの水溶性部分からなる実質的に精製されたタンパ ク質。 ４５．配列番号２におけるアミノ酸１から７７４間の配列からなる請求項４４に 記載のタンパク質。 ４６．請求項４４または請求項４５に記載のタンパク質またはその単核白血球結 合性の等価物、および製薬的に許容され得る担体を含有する、単核白血球の内皮 への接着を防止するためにインビボにおいて有用である組成物。 ４７．内皮への単核白血球の接着を防止するに有効な量にある請求項４６に記載 の組成物を個体に投与することを特徴とする、該個体のアテローム性動脈硬化症 を予防するための方法。