JP4776845B2 - ヒトナチュラルキラー細胞によって媒介される天然細胞毒性に関連した新規トリガリングレセプターおよび同一の性質を有する抗体 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、全ての成熟ＮＫ細胞により選択的に発現され、活性化レセプターとしてヒトの天然細胞毒性に関する、ＮＫｐ３０と呼称される新規化合物、ＮＫｐ３０構造体に結合する新規抗体、およびその薬剤および医薬品としての使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、免疫監視により腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を除去する効果的なエフェクターのメカニズムを提供する。ＮＫ細胞のよく知られた特徴は、標的細胞を溶解し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を不十分にする能力である。この認識は、ＮＫ細胞により発現される様々な阻害レセプターの定義付けの基礎となっている。標的細胞上に発現したＭＨＣ−クラスＩ分子と結合すると、これらのレセプターが細胞溶解機能をダウン−レギュレートする阻害シグナルを発する。ヒトでは、ＨＬＡ−クラスＩ分子の認識は２種類のレセプターで媒介される：これらはリガンドがＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ対立遺伝子、およびＨＬＡ−Ｅ分子を認識するレクチン−様ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター複合体の種々の群により表されるＫＩＲおよびＬＩＲ−１／ＩＬＴ−２タンパク質の両方を含むＩｇスーパーファミリーに属する。これらの阻害レセプターの発現は、ＮＫ細胞がＨＬＡ−欠乏細胞と正常細胞とをいかに区別できるかを説明する。他方で、天然細胞毒性のトリガリングに応答可能なＮＫ細胞の活性化について記載した情報には限りがある。ごく最近、ＨＬＡ−クラスＩ欠乏標的細胞の認識および殺傷を介してＮＫ細胞中で重要な役割を果たす、２種の別個のＮＫ−特異的レセプターが同定された。これらのレセプターは、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と呼称され、Ｉｇスーパーファミリーに属する。特異的ｍＡｂによって誘引されるこれらの架橋は、強いＮＫ細胞活性化を誘導し、その結果、細胞内Ｃａ⁺⁺レベルが上昇し、細胞毒性が引き起こされ、リンホカインが放出される。重要であるのは、ｍＡｂ−媒介性のＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４のマスキングが、全てではないがほとんどの標的細胞に対するＮＫ細胞毒性を阻害することである。このことは、天然細胞毒性においてＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４が中心的役割を果たすことが明らかにされている反面、他のレセプターが存在することを意味している。
【０００３】
（発明の概要）
本発明の課題は、標的細胞の認識および殺傷に関する、ＮＫ細胞中に含まれる新規トリガリングレセプターを同定することである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから約３０ｋＤであるこの新規レセプターはＮＫｐ３０と呼称され、単一のＶ−タイプドメイン、膜貫通部位での荷電残基、および細胞質尾中のＩＴＡＭモチーフの不在により特徴付けられるＩｇスーパーファミリーの一員である。ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースを検索すると、クローン化ＮＫｐ３０ｃＤＮＡが、以前に同定された任意選択的なスプライシング形の１Ｃ７遺伝子（寄託番号ＡＦ０３１１３８で入手可能）と一致することが分かった。しかし、これまで、特異的モノクローナル抗体がないので、１Ｃ７遺伝子の推定生成物の機能も表面分布も確認できなかった。ＮＫｐ３０はヒト成熟ＮＫ細胞の表面上に選択的に発現し、細胞活性化時にチロシンホスホリル化されるＣＤ３ζシグナル伝達ペプチドに関連する。ＷＯ９９／２３８６７には、新規なトリガリングレセプターをコードするが、異なる生物学的活性のタンパク質、すなわち、ミエリン オリゴデンドロサイト 糖タンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質としてのＢＭＯＧをコードする配列と相同性を有するヌクレオチド配列が開示されている。ＷＯ９５／０６２４７には、ＮＫ細胞に特異的であるが、ＰＥＮ５−α及びＰＥＮ５−βに対する糖タンパク質からなる分子が開示されている。ＥＭＢＬデータベース ０１．Ｓｅｐｔ．１９９９ アクセッションＮｏ．ＡＪ２２３１５３は、配列番号：１に特異的に相当するヌクレオチド配列のみを開示しており、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース ０１．Ｊａｎ．１９９８ アクセッションＮｏ．０１４９３２は、配列番号：２に特異的に相当するアミノ酸配列のみを開示している。ＡｃＮＫｐ３０は、多くの標的細胞に対するＮＫ−媒介細胞毒性誘導時にＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４といっしょに働くことができ、したがって標的細胞（例えばＭＥＬ１５タイプのヒトメラノーマ）の殺傷時の主要トリガリングレセプターである。
【０００４】
本発明の別の課題は、ＮＫｐ３０構造体と選択的に結合する抗体を提供することである。抗体−媒介性のＮＫｐ３０の架橋はＮＫ細胞の活性化を強力に誘導するのに対し、抗体−媒介性ＮＫｐ３０マスキングはＮＫの天然細胞毒性を阻害する。以下の「実施例」の項目のＡＺ２０に参照されるようなモノクローナル抗体を生じるハイブリドーマは２０００年１１月８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．へ寄託されている（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ；２５、ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ；Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５；Ｆｒａｎｃｅ）。
【０００５】
本発明はしたがって、ＮＫ細胞のポジティブ精製およびＮＫ細胞の天然細胞毒性の制御に有用なツールを提供する。本発明のツールは、特に同種異系の移植片／宿主反応または外科移植／宿主反応の制御（移植または外科移植の改善、移植片対宿主ＧｖＨだけでなく移植片対腫瘍ＧｖＴまたは移植片対白血球ＧｖＬ）、および腫瘍細胞、微生物−感染またはウイルス感染細胞等の異常細胞の増殖の制御に役立つ。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、その任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、および配列番号：７配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して、全長が少なくとも８０％相同な少なくとも１種のアミノ酸配列を含有する、任意の単離された化合物に関する。
【０００７】
これらの化合物のうち、前記群から選択されるアミノ酸配列に対して、全長が少なくとも９０％相同な少なくとも１種のアミノ酸配列を有する化合物が有利であり、中でも少なくとも９５％の前記相同性を有するものが特に有利である。さらに、少なくとも９７％の前記相同性を有するものがより有利であり、中でも少なくとも９８％および９９％の前記相同性を有するものが非常に有利であり、特に少なくとも９９％の前記相同性を有するものが好ましい。
【０００８】
「相同性」は、従来技術において公知であるように、２種類以上のポリペプチド配列、または場合により２種類以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較することにより判断される。従来技術において「相同性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列相関の度合いをも意味し、この際、このような一連の配列間の一致により判断される。「相同性」は、公知の方法によって簡単に算出でき、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎｖｅｒｓＩｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８に記載される方法も含むがこれに限定はしない。相同性を決定する方法は、試験配列間で最大の一致を与えるように設定される。さらに、相同性を決定する方法は、公共使用可能なコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージのＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５；２４４４〜２４４８（１９８８））で体系化される。
【０００９】
配列番号：２は、ヒトＮＫｐ３０ １９０ａａポリペプチド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３０ｋＤ）に関し、これはＮＫ細胞、特に成熟ＮＫ細胞により選択的に発現され、配列番号：４はヒトＮＫｐ３０レセプターの細胞外領域に関し、配列番号：５はヒトＮＫｐ３０レセプターの膜貫通領域に関し、配列番号：６はヒトＮＫｐ３０レセプターの細胞質尾に関し、配列番号：７は配列番号：２由来の１５ａａ免疫原性ペプチドに関する。本発明はまた前記ポリペプチドのバリアント、すなわち保存アミノ酸置換によるものとは異なり、残基が同様の特性を有する別のもので置換されているポリペプチドをも含有する。このような置換で典型的なのは、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間である。より一般的に保存バリアントは、ＮＫ細胞によりレセプターの適当な位置に発現される場合、レセプターのトリガリングとしてなお機能できる。これらの化合物をここでは「本発明のａａ化合物」と称す。
【００１０】
本発明は以下のものを含有する単離された化合物も提供する：
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、その任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、配列番号：７配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して、全長の少なくとも８０％相同である少なくとも１種のアミノ酸配列（有利に、この少なくとも１種のアミノ酸配列は、群から選択されるアミノ酸配列に対して、全長が１００％相同である）、さらに
少なくとも１つのＣＤ３ζ鎖を含有する。
【００１１】
「免疫原性フラグメント」は、ここで免疫応答を引き出すこのとできる任意のポリペプチドまたはペプチドフラグメントを意味し、免疫応答とは例えば（ｉ）前記フラグメントと結合する抗体および／または膜レセプターおよびその突然変異体を含む、前記フラグメントを含有するＮＫｐ３０分子の任意の形と結合する抗体の生成、（ｉｉ）Ｔ−細胞が、任意のＭＨＣ分子と前記フラグメントに由来するペプチドとを含む二分子複合体と反応することによるＴ−細胞応答の刺激、（ｉｉｉ）ほ乳類イムノグロブリンをコードする遺伝子を発現したバクテリオファージまたはバクテリアのような形質移入媒体の結合等である。さらに、免疫原性フラグメントは、先に定義したような免疫応答を引き出すことのできる任意の構造体をも意味し、例えば共有結合によりキャリアータンパク質へ結合した前記ペプチドフラグメント、そのａａ配列中で前記ペプチドフラグメントを含有するキメラ組み換えポリペプチド構造体、特に配列が前記フラグメントをコードするタンパク質を含む、ｃＤＮＡで形質移入された細胞が含まれる。
【００１２】
本発明はまた、配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３ポリヌクレオチド配列、および普遍的な遺伝子暗号をコードしかつその重複性を考慮したポリヌクレオチド配列、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６の配列、配列番号：２、配列番号：５および配列番号：６配列の任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、および配列番号：１７配列から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して、全長が少なくとも８０％相同である少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含有する、任意の単離された化合物に関する。これらの化合物のうち、前記群より選択されたポリヌクレオチド配列に対して全長が少なくとも９０％相同なものが好ましく、前記相同性が少なくとも９５％のものが特に好ましい。さらに、前記相同性が少なくとも９７％のものがより好ましく、中でも前記相同性が少なくとも９８％および少なくとも９９％のものが特に好ましく、さらに前記相同性が少なくとも９９％のものが非常に好ましい。好ましい形態は、配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３のＤＮＡによってコードされた成熟ポリペプチドと同様の生物学的機能または活性を十分に保持したポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含有する、単離された化合物である。本発明の好ましい形態は、ストリンジェントな条件下に前記の単離された化合物とハイブリダイズする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有する化合物である。このようなハイブリダイズするヌクレオチドには、特に、配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの群が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特別な例は、以下のものを含有する溶液中の４２℃での一晩のインキュベーション：５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および変性し、切断したサケの精子ＤＮＡ２０マイクログラム／ｍｌ、その後のハイブリダイゼーション支持体の０．１×ＳＳＣ中の約６５℃での洗浄である。ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）の特に１１章に例示されている。液体ハイブリダイゼーションも本発明のポリヌクレオチド配列に使用してよい。本発明はまた、人だけでなくほ乳類の任意の種、特にサル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギで発現するＮＫｐ３０バリアントを包含する。実際このようなバリアントは、種間で高く保存されて現れる。本発明は、Ａ等の非荷電残基でＲ残基が置換されている膜貫通ドメインの部分的突然変異などの、ＮＫｐ３０非機能性突然変異も包括する。これらの化合物をここで「本発明のｐｌｎ化合物」と称する。
【００１３】
配列番号：１はヒトＮＫｐ３０ｃＤＮＡ（約１ｋｂのｍＲＮＡ）に関し、配列番号：１０は４２１ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブ（配列番号：１の位置５７〜位置４７７）に関し、配列番号：１２は６０６ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡ増幅生成物（配列番号：１の位置５７〜位置６６２）に関し、配列番号：１３は配列番号：１の位置６４〜位置６３６の配列をコードするＮＫｐ３０に関する。ここでポリヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡを含む任意のポリヌクレオチド素質に相当するものを意味する。本発明は、前記ポリヌクレオチド生成物から成る群より選択される少なくとも１種の単離された化合物を有する形質移入ベクター、およびこのような単離された化合物の少なくとも１種でまたは前記ベクターの少なくとも１種で形質移入された細胞をも提供する。
【００１４】
本発明は、（配列番号：８；配列番号：９）対、（配列番号：８；配列番号：１１）対、配列番号：１０ポリヌクレオチド、配列番号：１２ポリヌクレオチドから成る群より選択されるポリヌクレオチド化合物にも関する。このような化合物は特にサンプル中でのＮＫｐ３０検出に有用である。（配列番号：８；配列番号：９）および（配列番号：８；配列番号：１１）等の対は、例えば上向および下向ＰＣＲプライマー対として使用できる。配列番号：１０および配列番号：１２ポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドは、ＮＫｐ３０プローブとして使用できる。配列番号：１０配列は、配列番号：１プローブに由来する４２１ｂｐのｃＤＮＡに相当する（配列番号：１の位置５７〜位置４７７）；これを例えば、生物学的サンプル中でＮＫｐ３０遺伝子を同定および単離するためのＮＫｐ３０プローブとして使用してよい。さらにこのＮＫｐ３０遺伝子はほ乳動物種間で高く保存されて発現する。配列番号：１２は配列番号：１に由来する６０６ｂｐのｃＤＮＡに相当する（配列番号：１の位置５７〜位置６６２）；これは配列番号：８および配列番号：１１プライマー対を用いたＰＣＲ増幅を介して得られる生成物に相当する。
【００１５】
別の態様として、本発明は本発明の単離されたａａ化合物（すなわちアミノ酸配列を含有するとして定義された本発明の任意の化合物、すなわち請求項１で定義したもの−）の少なくとも１種でほ乳動物を免疫化し（ここで少なくとも１種のａａ化合物は任意選択的に免疫原性エンハンサーと結合する）、これにより形成された抗血清を回収することにより得られるような抗血清タイプの組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、
抗体−抗原タイプの少なくとも１種の本発明の単離されたａａ化合物の反応中で確認できる、単離された化合物（ここで「本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物」と称す）、および
単離された抗体、および本発明のａａ化合物の少なくとも１種に直接対する単離されたモノクローナル抗体
を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のａａ化合物の少なくとも１種に直接対しかつＴ細胞表面分子だけでなく任意のＢ細胞表面分子にも結合しない、任意の単離された抗体に関する。好ましい抗体は単球、顆粒球に結合せず、好ましくはＮＫ細胞以外の末梢血液由来の有核細胞と結合しない。最も好ましい単離された抗体は、任意のＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４の細胞外部だけでなく、任意の別のＮＫ細胞の細胞外部にも結合しない。
【００１８】
このような結合反応は、ここで、抗体−抗原タイプ認識反応等に好適な実験条件下での抗体−抗原タイプの反応中に見出される結合反応を意味する。例えば末梢血液由来の白血球懸濁液を抗体と接触させ、それにより形成される免疫複合体を検出することにより、例えば蛍光ラベルを施した二次抗−イムノグロブリン試薬と接触させ、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒＸＬ等のフローサイトメーターを用いて抗体と結合した細胞を計数同定することにより、このような結合反応を達成できる。この実験で種々の白血球サブセットの同定は、様々な細胞サブセットの大きさおよび光学特性に基づく。また、前記したような抗体との接触後に、同一の白血球懸濁液を、Ｔ細胞に特異的に結合するＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１のような白血球サブセットへ特異的に結合する蛍光色素−結合抗体と接触させてよく、これにより目的の抗体と結合した白血球サブセットの表現型決定を行うことができる。前記した幾つかの２重標識実験を、サブセット−特異的抗体パネルを使用して実施し、目的の抗体の細胞反応性を明確に描写できるようにする。
【００１９】
本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ＭＨＣクラスＩネガティブ標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種異系細胞に対する天然細胞毒性、（ｉｉ）抗体−被覆標的細胞に対する細胞毒性、（ｉｉｉ）細胞質内Ｃａ²⁺濃度の増加、（ｉｖ）ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−ガンマ酵素、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ等の細胞質アダプター／エフェクター分子のチロシンホスホリル化の誘導、（ｖ）レセプター関連形質導入鎖ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２またはＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマのホスホリル化、（ｖｉ）インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、ケモカイン（例えばＭＩＰ−１アルファ）、ＴＧＦベータ等のサイトカイン分泌、（ｖｉｉ）ＮＫ細胞表面分子、例えばＣＤ６９およびＰＥＮ５それぞれのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションから推定されるように、ＮＫ細胞活性化を統計的に顕著に増加させる（ｐ＜０．０５）。
【００２０】
本発明の好ましい単離された抗体の例には、本発明の単離されたａａ化合物の少なくとも１種に直接対し、かつ標的細胞の存在下に１：１の割合で存在するＮＫ細胞によって引き起こされる天然細胞毒性を少なくとも約４倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約６倍に増加させることが可能な単離された抗体が含まれる。
【００２１】
本発明の最も好ましい単離された抗体は、本発明の単離されたａａ化合物の少なくとも１種と直接対し、任意のＴまたはＢ細胞表面分子とは結合せず、標的細胞の存在下に１：１の割合で存在するＮＫ細胞により引き起こされる天然細胞毒性を少なくとも約４倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約６倍に増加させることができる。
【００２２】
本発明の最も好ましい単離された抗体には、モノクローナル抗体が含まれる。このようなモノクローナル抗体の幾つかの例は、以下の「実施例」の項目に記載されている（例えばＡＺ２Ｏ；Ａ７６；Ｚ２５モノクローナル抗体参照）。本発明のＡＺ２Ｏモノクローナル抗体を生じるハイブリドーマは、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．へ２０００年１１月８日付けで寄託されている（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ；２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ；Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５；Ｆｒａｎｃｅ）：Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号はＩ−２５７６である。本発明はしたがって、ハイブリドーマＩ−２５７６により製造される単離されたモノクローナル抗体に関する。
【００２３】
本発明の任意の単離された抗体は、視覚化の目的で適当な任意の標識と結合してよい。このような標識には、例えば蛍光標識、放射線標識、酵素標識が含まれる。
【００２４】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を生じる任意のハイブリドーマに関する。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、連続した細胞系の培養により抗体分子を製造するための任意の技術を利用して製造できる。これらの技術には、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎオリジナルの技術、Ｎａｔｕｒｅ、２６５：４９５〜４９７（１９７５）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌに記載される変法、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：１８９９（１９８９）が含まれるが、これに限定するものではなく、その内容は参照することによりここに組み込まれたものとする。免疫原として、本発明の任意のａａ化合物が適当である。
【００２６】
ＮＫｐ３０に対する抗体を製造するハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために使用できるスクリーニング法には（１）固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、（２）免疫沈降法または（３）蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析が含まれるが、これに限定するものではない。当業者は、抗−ＮＫｐ３０モノクローナル抗体をスクリーニングするために使用できる多くの様々なＥＬＩＳＡ法を想定できる。
【００２７】
最初のスクリーニングは、そのＮＫ細胞に対するがＴ細胞および単球に対しない反応性に関してフローサイトメトリーによりハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより、実施されるのが好ましい。ハイブリドーマの別の特徴付けを、実施例に詳細する間接免疫蛍光アッセイおよびフローサイトメトリーによりリンパ系および非−リンパ系細胞の精製集団を試験することにより実施できる。ＮＫｐ３０エピトープを認識するモノクローナル抗体は、細胞の少なくとも約７０〜９０％、例えば約８０％の高率でＮＫ細胞上に存在するエピトープと反応するが、ＣＤ３⁺Ｔ細胞またはＣＤ２０⁺Ｂ細胞とは十分に反応しない。好ましい形態において、抗体は単球、顆粒球、血小板および赤血球と非反応性である。
【００２８】
当業者に公知の競合アッセイでこのような抗体と競合するモノクローナル抗体は、基本的に同一のエピトープを認識するようである。
【００２９】
所望のハイブリドーマを選択、クローン化して得られた抗体は、２種類の主要な方法のうちの１種で製造されてよい。最も純度の高いモノクローナル抗体は、所望のハイブリドーマを好ましい培地中で適した時間長さｉｎ ｖｉｔｒｏ培養することにより製造され、その後、沈殿物の所望の抗体を回収した。時間長さおよび培地は公知であるか容易に決定できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、本質的に単一特異性モノクローナル抗体を生成し、実質的に他種抗−ヒトイムノグロブリンを含まない。しかし、生成される抗体の量がわずか約５０μｇ／ｍｌであるので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法ではある目的に対して十分量または十分濃度の抗体が製造されない。
【００３０】
より多くの量のモノクローナル抗体を製造するために、所望のハイブリドーマをマウス等の動物へ接種してよい。
【００３１】
好ましくは、マウスはモノクローナル抗体酸性ハイブリドーマが獲られた株と同系または半同系である。ハイブリドーマの接種は、適当なインキュベーション時間後に抗体産生腫瘍の形成を誘導し、その結果、所望の抗体が宿主動物の腹水中に高濃度で得られる（約５〜２０ｍｇ／ｍｌ）。
【００３２】
抗体分子は公知技術、例えば免疫吸収またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法、またはそれらの組合せにより精製できる。
【００３３】
これらのプロトコールに続き、この技術分野の当業者は、本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ、特にＮＫｐ３０に特異性を示すモノクローナル抗体を容易に単離できる。このようなハイブリドーマの例は、以下の「実施例」に記載され、記載のＡＺ２Ｏモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは２０００年１１月８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号：Ｉ−２５７６）。したがって、本発明はこのような任意のハイブリドーマ、およびその上清から得られる任意のモノクローナル抗体を包括すると考えられる。特に本発明は、所望の抗−ＮＫｐ３０特性を示す任意のモノクローナル抗体、および特に以下による任意のモノクローナル抗体を包括する：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、その任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、配列番号：１７配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して、全長が少なくとも８０％相同である少なくとも１種のアミノ案配列を有するａａ化合物に対して動物を免疫化し、
（ｉｉ）該動物の脾臓細胞からハイブリドーマを産生し、培養上清中にモノクローナル抗体を生成するために培養し、
（ｉｉｉ）免疫原としてステップ（ｉ）で使用したａａ化合物に結合する抗体の存在を調べるために上清を測定し、
（ｉｖ）所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択およびクローニングし、
（ｖ）前記クローンの上清からモノクローナル抗体を回収する。
【００３４】
この方法の後、特に配列番号：１７を免疫原としてステップ（ｉ）で使用した場合、所望のハイブリドーマ数種を非常に高い見込みで連続して製造することができる。クローン化されたハイブリドーマは、所望のように、例えばＮＫ細胞以外の末梢血液由来の任意の細胞と結合せず、かつ／または標的細胞の存在下に１：１の割合で存在するＮＫ細胞によって引き起こされる天然細胞毒性を少なくとも５倍増加させることを含む、任意の所望の特性に応じて、さらにスクリーニングされかつ選択される。
【００３５】
別の態様において、本発明は本発明の単離された抗体およびモノクローナル抗体から成る群より選択される任意の抗体の、単離された免疫反応性フラグメントに関する。このようなフラグメントには、特に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＣＤＲ抗体フラグメントが含まれる。当業者は、特にヒトへ投与する目的で、所望に応じてそれらから本発明のヒトに使用可能な抗体を誘導できることを認識している。「抗体の免疫−反応フラグメント」とは、ここで特に抗原結合部位を有する任意の抗体フラグメントを意味する。したがってこのようなフラグメントには、当業者が公知のように、ペプシンまたはパパイン等のタンパク分解酵素により前記抗体を酵素切断することによって得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびヒンジ領域に位置するスルフヒドリル基の還元によりそこから誘導されるＦａｂフラグメントが含まれる。免疫反応性フラグメントは、その配列が目的の抗体のＣＤＲ領域を含有する組み換え単鎖または二本鎖ポリペプチドを含んでいてよい。単離されたＣＤＲ領域自体も本発明の単離された免疫反応性フラグメントの定義の範疇であると考えられる。
【００３６】
別の態様において、本発明は本発明の単離された抗体または免疫反応性フラグメントを少なくとも１種結合させた任意の固体支持体に関する。前記結合が成された任意の固体支持体が適当である。特に適当な固体支持体には、Ｄｙｎａｌ ａ．ｓ．のＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）等の親和性マトリクスとして使用できる常磁性マイクロスフェアー、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の微小なＭＡＣＳマイクロビーズ、ＵＳ５７６３１９４に記載される中空繊維のアレーから成る半透膜物質、ＵＳ５５７６１８５に記載される沈降による分離を可能にする緻密粒子が含まれる。
【００３７】
本発明の固体支持体の有利な形態では、前記支持体上にさらに結合された抗−ＮＫｐ４６および／または抗−ＮＫｐ４４抗体、またはその免疫原性フラグメントまたは誘導体の支持体上での存在を含む。以下に詳細するように、本発明のＮＫｐ３０レセプターは実際にＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４レセプターと相加的にまたは相乗的に組み合わせることができる。
【００３８】
別の態様では、本発明は本発明の抗血清−タイプの組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、本発明の抗体およびモノクローナル抗体から成る群より選択される少なくとも１種の物質でほ乳動物を免疫化し（ここで少なくとも１種の物質は免疫原性エンハンサーと任意に結合してよい）、こうして得られた抗−抗血清を回収することにより取得されるような抗−抗血清タイプの任意の組成物に関する。本発明はまた、抗体−抗原タイプの反応で本発明のａａ化合物の少なくとも１種を認識できる、単離された抗−抗体およびモノクローナル抗−抗体、および同一のものを含有する医薬品組成物に関する。
【００３９】
本発明の生成物は、様々に使用できる。有利な使用用途にはその医薬品としての使用が含まれる。ＮＫｐ３０は全てのＮＫ細胞により選択的に発現され、いずれもＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＦＬＴ−３リガンド、ＳＣＦ等の１種、２種または多種サイトカインの存在下に新に単離培養され、したがってＮＫ細胞同定のための至適マーカーを意味する。本発明は、特に、当業者が生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出および／または定量化するための方法を実施できるようにし、該方法は、前記サンプル中に存在するＮＫｐ３０分子の検出および／または定量化から成る。本発明の方法は、特に、以下の工程を含む：
−生物学的なサンプルを、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、本発明の単離された抗体、単離された免疫−反応性フラグメント、固体支持体、および本発明のハイブリドーマから成る群より選択される少なくとも１種の物質と接触させ、
−これにより形成される免疫複合体を検出および／または定量化する
または
生物学的サンプルを、本発明の単離されたポリヌクレオチド化合物、本発明の単離されたポリヌクレオチド対、本発明の配列番号：１０および／または配列番号：１２を含有する単離されたポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション生成物の形成に適した条件下に接触させ、
これにより形成されるハイブリダイゼーション生成物を検出および／または定量化する。
【００４０】
本発明はまた、当業者が生物学的サンプルからＮＫ細胞を選択的に除去する方法を実施できるようにし、該方法は、ＮＫｐ３０⁺である細胞の選択的除去から成る。このような方法は特に以下の工程を含む：
−生物学的サンプルを、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、本発明の単離された抗体、単離された免疫反応性フラグメント、固体支持体、および本発明のハイブリドーマから成る群より選択される少なくとも１種の物質と、免疫複合体形成に好適な接触下に接触させ、
−これにより形成される免疫複合体（ポジティブ細胞）を、このような複合体有さないもの（ネガティブ細胞）から除去する。
【００４１】
本発明はまた、当業者が生物学的サンプルからＮＫ細胞の陽性かつ選択的精製方法を実施できるようにし、該方法は、ＮＫｐ３０⁺であるこのような細胞のポジティブかつ選択的精製から成る。このような方法は特に以下の工程を含む：
生物学的サンプルを、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、本発明の単離された抗体、単離された免疫−反応性フラグメント、固体支持体、および本発明のハイブリドーマを、免疫複合体形成に好適な接触条件下に接触させ、
その上に免疫複合体を形成した細胞を除去する。
【００４２】
細胞回収の便利な方法は当業者に公知である。このような方法は特に以下を含む：（ｉ）細胞とポジティブ細胞に免疫複合体を形成させる物質との結合を機械的に切断する、（ｉｉ）ポジティブ細胞に免疫複合体を形成させる物質を酵素攻撃する（例えばＵＳ５０８１０３０に記載されるようなパパインによる攻撃）、または（ｉｉｉ）免疫複合体と、ポジティブ細胞と結合するために免疫複合体中に含有される抗体と競合できる過剰量の可溶性分子とを接触させ、その結果免疫複合体が中断され、例えばＵＳ５９６８７５３にＣＤ３４⁺細胞の回収について例示される。
【００４３】
本発明はまた、前記の少なくとも１種の（各）物質を含有する生物学的サンプルからＮＫ細胞を検出、定量化、除去および／またはポジティブ精製するための任意のキットに関し、前記物質はコンテナー中に封入される。
【００４４】
本発明の方法を実施するために、適当な生物学的サンプルは、末梢血液、血漿、骨髄穿刺液、リンパ系組織、ならびに血球分離、血漿分離および、滑液、脳脊髄液、気管支肺胞液および腹膜液等の合集液から単離された細胞を含む。
【００４５】
特に有利な態様において、本発明はＮＫ細胞の細胞毒性を刺激する方法に関し、該方法は以下から成る：
前記ＮＫ細胞を、生理学的条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）に、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、単離された抗体、固体支持体、および本発明のハイブリドーマから成る群より選択される少なくとも１種の生成物と接触させる。
【００４６】
前記接触は、前記ＮＫ細胞上でＮＫｐ３０が架橋できるように実施される（配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５およびその保存バリアントに対して、配列全長の少なくとも８０％相同なａａ配列を含有する、前記ＮＫ細胞の表面での、化合物の架橋）。好ましい架橋形態には、前記ＮＫ細胞を生理学的条件下に、少なくとも１種の選択された物質（例えば抗ＮＫｐ３０抗体）を飽和濃度の前記物質を用いて固定化した少なくとも１種の固体支持体と接触させることが含まれる。ＮＫｐ３０レセプター架橋には実際、ＮＫ細胞活性化刺激が含まれる。刺激を優先するネットＮＫ細胞活性化制御平衡の獲得が求められる場合、当業者は明らかに優先してＮＫｐ３０架橋条件を選択するであろう。このような条件には特に、自然に架橋する化合物の使用が含まれる。前記群に列挙される生成物は、そのような化合物、またはその可能な構築体の例に相当する。このような条件にはまた、適当な量、特に前記制御がＮＫ細胞の細胞毒性刺激を優先してより強く平衡化する適当な密度での（例えば飽和濃度）、このような架橋化合物の使用が含まれる。刺激を、記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施してよい。
【００４７】
本発明の刺激法は、有利にＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５のようなインターロイキン中でのＮＫ細胞インキュベーションの通常のステップを必要としない。これらのステップはしかしもちろん排除されない：当業者は、本発明の方法にこれらの通常のステップを付け加えるかを選択できる。
【００４８】
本発明はまた、ＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するためのキットに関し、該キットは前記生成物の少なくとも１種をコンテナー中に封入して含有する。
【００４９】
検出、定量化、除去、完全精製、および／またはＮＫ細胞の細胞毒性刺激のために、本発明の前記方法はさらに、前記生物学的サンプル、または前記ＮＫ細胞を、抗−ＮＫｐ４６または抗−ＮＫ４４抗体と接触させることを含んでよく；前記キットはさらに抗−ＮＫｐ４６または抗−ＮＫｐ４４抗体を含有してよい。本発明はしたがって、前記群から選択される少なくとも１種の生成物を含有するＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するための任意のキットに関し、ここで前記少なくとも１種の生成物はコンテナー中に封入されている。このようなキットはさらに抗−ＮＫｐ４６抗体および抗−ＮＫｐ４４抗体から成る群より選択される１種または数種の抗体を含有してよい。
【００５０】
有利には本発明の精製法をＮＫ細胞活性化と同時に実施でき、逆も可能である。本発明の実施形態である、同時のＮＫ細胞ポジティブ精製およびＮＫ細胞細胞毒性刺激は、生物学的サンプル、特にヒトに由来のサンプルに適用する場合、すなわち治療後に人患者へ再投与する場合に興味深い。
【００５１】
また、本発明はＮＫ細胞の細胞毒性を阻害する方法をも提供し、該方法は、生理学的条件下に前記ＮＫ細胞を少なくとも１種の化合物と接触させることから成る：
（ａ）例えばＮＫｐ３０結合部位をマスキングすることにより、前記ＮＫ細胞上に発現するＮＫｐ３０レセプターへのＮＫｐ３０の天然リガンドの結合を阻害できる化合物、および／または前記ＮＫ細胞により発現されるＮＫｐ３０レセプターの架橋を阻害できる化合物、および／または
（ｂ）前記ＮＫ細胞により発現されるＮＫｐ３０分子、その形質移入エレメント、特にＣＤ３ζ鎖間の相互反応を阻害する化合物。この方法は望みに応じてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【００５２】
（ａ）の化合物は特に、本発明の免疫−反応性フラグメントを含有する（例えばＦａｂ；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）。種々のイソタイプの好適なＮＫｐ３０モノクローナル抗体（ＩｇＭおよび好ましくはＩｇＧ）、またはその免疫反応性の１価または２価フラグメントを、ＮＫ細胞上に発現するＮＫｐ３０をマスクするための各分離定数の１０倍を越える飽和濃度で使用できる。
【００５３】
（ｂ）の化合物は特に、ＮＫｐ３０膜貫通荷電アミノ酸（配列番号：１の位置１４３のアミノ酸Ｒ）と前記形質導入エレメント間の相互作用を阻害できる化合物である。このような（ｂ）化合物は、特に、生理学的条件下にＮＫｐ３０膜貫通領域（配列番号：１の位置１３８〜１５７）へ結合できる脂溶性分子に相当するので、前記膜貫通アミノ酸（位置１４３のＲ）の機能（ＣＤ３ζへの結合）を阻害または遮断できる。ここで生理学的条件とは、ｉｎ ｖｉｖｏ条件、またはｉｎ ｖｉｖｏ条件に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏ条件を意味する。本発明はまた、前記生成物の少なくとも１種、例えば本発明の免疫−反応性フラグメントを含有する、ＮＫ細胞の細胞毒性を阻害するための任意のキットに関する。
【００５４】
ＮＫ細胞を生物学的サンプルから検出／定量化／選択／除去／ポジティブかつ選択的な精製するための、ならびにＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するための方法は、さらに、前記サンプルまたは各ＮＫ細胞と、前記条件下に、ＮＫｐ３０以外のＮＫレセプターの活性を刺激できかつＮＫｐ３０に加えてまたは相乗的に機能する化合物、例えばＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４レセプターと接触させることを含む。刺激は、例えば前記条件下に別のＮＫレセプター、特にＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４を架橋できる化合物を使用することにより達成できる。
【００５５】
もちろんその逆を、本発明のＮＫ細胞の細胞毒性を阻害する方法に適用する、例えば本発明の阻害法はさらに、例えばリガンド結合阻害および／または形質移入／エフェクターエレメント結合阻害により、前記の別のＮＫレセプターの活性を阻害出来る化合物の使用を含む。
【００５６】
本発明の非常に有用な態様は、移植される細胞、移植される組織、移植される器官および宿主有機体から成る群より選択される有機体と、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、単離された抗体、固体支持体、本発明のハイブリドーマ、本発明の精製法で得られるＮＫ細胞、本発明の刺激法で得られるＮＫ細胞から成る群より選択される少なくとも１種の生成物とを接触させることを含む、新規移植法に相当する。ここで「移植」とは「外科移植」をも包括する。前記宿主有機体は人間を含む任意のほ乳動物であってよい。
【００５７】
この新規移植法は特に同種異系移植に有用であり、例えば骨髄／幹移植に利用できる。特にＧｖＨ阻害、またはＧｖＴおよび特にＧｖＬ刺激に有利である。本発明の新規移植法の本質は、前記移植片から精製されかつ本発明の方法およびキットにより活性化されるＮＫ細胞を患者に提供することである。これは特にＭＨＣ−一致または−不一致造血系移植（骨髄／末梢幹細胞）へ利用される。この活性化された同種異系ＮＫ細胞は、特に移植片の注入に近い時間帯で：同時に、および約２日後で、例えば移植される患者に静脈投与されてよい。活性化されたＮＫ細胞の量および患者への投与頻度は病状に依存する。
【００５８】
本発明の新規移植法はまた、抗−腫瘍および／または抗−感染治療、予防または軽減に特に関連がある。この場合、固形または液体腫瘍またはウイルスやその他の微生物感染症を患う患者の、本発明の方法およびキットで精製かつ活性化された自己ＮＫ細胞は、前記ＮＫ細胞を前記腫瘍および／または感染症の原因に対して反応性の飽和濃度のｍＡｂの存在下にインキュベートすることにより、特に腫瘍および／または感染症に対して「武装」することができる。精製し、活性化され、かつ「武装」した本発明のＮＫ細胞を、次に、患者へ静脈投与してよい。「武装」ＮＫ細胞の量および患者への投与頻度は病状に依存する。
【００５９】
本発明の新規移植法は、したがって、ＮＫｐ３０トリガリングを介したＮＫ細胞活性化に基づく、新規のＮＫ細胞をベースとする免疫療法を構築する。本発明の方法は、さらに、ＮＫｐ３０と相加的にまたは相乗的に機能できる別のレセプター、例えばＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４のＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４による架橋化合物の同時活性化も含んでいてよい。
【００６０】
本発明はしたがって、以下から成る群より選択される少なくとも１種の生成物を含有する任意の医薬品組成物をも包括する：
本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、単離された抗体、固体支持体、本発明のハイブリドーマ、本発明の精製法により得られる単離されたＮＫ細胞（および特に本発明の精製法により移植ドナーから精製された、単離されたＮＫ細胞）、本発明の刺激法により得られるＮＫ細胞（本発明の刺激法により細胞毒性を刺激した、単離されたＮＫ細胞）を、製薬学的に利用可能な賦形剤といっしょに含有する。
【００６１】
前記の単離されたＮＫ細胞は、ヒト、特に移植ドナーから集められるか（医薬品組成物が移植片をもらう宿主有機体へ投与されることを意図する場合）、または特にメラノーマ等の腫瘍を有する患者から集められる（医薬品組成物を抗−腫瘍剤として患者へ投与することを意図する場合）。本発明のこのような医薬品組成物は、有利に、さらに抗−ＮＫｐ４６および／または抗−ＮＫｐ４４抗体、またはその免疫原性フラグメントまたは誘導体を含有する。本発明の医薬品組成物は薬剤として使用できる。製薬学的に利用可能な種々の賦形剤は当業者に入手可能であり；主にガレヌス製剤形および所望の投与経路に応じて、適当な１種を選択する。ここで「医薬品組成物」とは錠剤、粉末、ペースト、パッチ、顆粒、微粒子、ナノ粒子、コロイド溶液、水溶液、注射用液、スプレー、リポソーム等の任意のガレヌス製剤形を意味する。Ｉｎ ｖｉｖｏ治療形式における投与経路には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下投与、鼻腔内経路および外科的経路が含まれる。ガレヌス製剤形は徐放形および／または制限放出形であってもよい。
【００６２】
前記の少なくとも１種の生成物を適当に配合し、前記組成物を投与される患者にとって認容性かつ効果的にする。このような適当な配合は当業者に公知である；患者が人間である場合、これらには、前記生成物の人体に適用可能なものまたはキメラ類似体である。またこれには、溶解度および／または化学的および／またはガレヌス製剤特性が所望の投与経路および目的の効果レベルに適応した、製薬学的に使用可能な賦形剤が含まれる。このような賦形剤には、例えば生理食塩水またはデキストロース溶液が含まれる。本発明の組成物はさらに任意のバッファー、および／または任意の安定化剤を含有してよく、当業者は場合に応じて適切なものを見出す。
【００６３】
前記した少なくとも１種の生成物の有効量は、使用する特定の生成物、患者の付加的なまたは相乗的な治療薬（例えば抗−ＮＫｐ４６および／または抗−ＮＫｐ４４抗体、またはそのフラグメントあるいは誘導体）の存在および性質、患者の病状に相関する。有効量は典型的に体重１ｋｇに対して１ｎｇ〜１００ｍｇの範囲である。
【００６４】
このような医薬品組成物は例えば、移植／外科移植の改善、抗−腫瘍的予防、軽減、治療、例えばメラノーマ、肝癌、肺の腺癌の予防、軽減、治療、抗−微生物的予防、軽減、治療、例えば抗−ウイルス的予防、軽減、治療を意図できる。ここで「軽減」とは、患者の健康を向上させることに相当する任意の生物学的結果を意味する；これは特に異常細胞の増殖を任意に遅延させることを含む。
【００６５】
有利な態様において、本発明の医薬品組成物は標的のＮＫ細胞毒性を容認する。このような組成物は、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、単離された抗体、固体支持体、本発明のハイブリドーマ、本発明の精製法により得られる単離されたＮＫ細胞、本発明の刺激法により得られる単離されたＮＫ細胞から選択される少なくとも１種の生成物（前記生成物は生理学的条件下に所望の標的と結合できる物質と直接または間接的に結合している）を、製薬学的に使用可能な賦形剤といっしょに含有する。
【００６６】
前記標的物質の例には、抗−腫瘍抗体、抗−微生物抗体、抗−ウイルス抗体、および同等の機能を有するものが含まれる。標的であるＮＫ細胞毒性のためのこのような医薬品組成物はより有利に、抗−腫瘍的予防、軽減、治療を意図し（メラノーマ、肝癌または肺の腺癌）、抗微生物的予防、軽減、治療を意図する。
【００６７】
本発明はまた、ＮＫｐ３０天然リガンドを同定する方法を提供する。この方法は、抗体、抗体フラグメント、またはＮＫ細胞上の本発明の固体支持体の使用を含む。本発明はしたがって、ＮＫｐ３０天然リガンドの類似体および／または拮抗体のための、化学的および／または生物学的ライブラリーのスクリーニングが可能である。
【００６８】
本発明の抗体、抗体フラグメント、または固体支持体も、ＮＫ−感受性標的細胞により発現される表面ＮＫｐ３０リガンドのレベルの評価、および測定レベルの標準生理学的レベルに対する比較を可能にする。この評価は、腫瘍細胞および／または微生物感染細胞の診断、および適切な予防、軽減、治療ツールの指定を特に意図する。本発明の抗体、抗体フラグメント、または固体支持体は、したがって、腫瘍または感染症の診断のための試薬として使用できる。
【００６９】
本発明の特徴を以下の実施例により詳細する。これらの実施例は例証を目的とするだけであって本発明の概要を制限するものではない。当業者が意図する種々の形態も本発明に包含される。
【００７０】
これらの実施例において、図１Ａ〜９Ｂを参照する（１９枚の図面シート）。
【００７１】
実施例１：ＮＫｐ３０の同定および分子特徴付け
材料および方法
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
以下のｍＡｂを実験室で製造した：ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ３）、ＢＡＢ２８１（Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９７．ｐ４６、ａ ｎｏｖｅｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｈｉｃｈ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９〜１１３６）およびＫＬ２４７（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗−ＮＫｐ４６）、Ｚ２３１（Ｖｉｔａｌｅ．Ｍ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ、Ｒ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．ＮＫｐ４４、ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｏｎ−ＭＨＣ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５〜２０７２）およびＫＳ３８（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗−ＮＫｐ４４）、ＫＤ１およびｃ１２７（それぞれＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１、抗−ＣＤ１６）、ｃ２１８およびＧＰＲ１６５（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ５６）、Ａ６−１３６（ＩｇＭ、抗−ＨＬＡクラスＩ）（Ｃｉｃｃｏｎｅ Ｅ．、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｌ．Ｎａｎｎｉ、Ｃ．Ｄｉ Ｄｏｎａｔｏ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｏ．Ｖｉａｌｅ、Ａ．Ａｍｏｒｏｓｏ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９４．Ｓｅｌｆ Ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｌｙｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１００３〜１００６）、ＧＬ１８３（ＩｇＧ１，抗−ｐ５８．２）（Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ａ．Ｍｅｒｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、Ｇ．Ｐａｎｔａｌｅｏ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ１６＋ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６９５〜７１４）、ＥＢ６（ＩｇＧ１、抗−ｐ５８．１）（Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｏ．Ｖｉａｌｅ、Ａ．Ｍ．Ｏｒｅｎｇｏ、Ｍ．Ｂａｒｂａｒｅｓｉ、Ａ．Ｍｅｒｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ１６＋ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｒｅｃｕｌｅｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｂｓｅｔ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＮＫ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５８９〜１５９８）、Ｚ１９９（ＩｇＧ２ｂ、抗−ＮＫＧ２Ａ）（Ｓｉｖｏｒｉ Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｅ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、１９９６．ＣＤ９４ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＨＬＡ−ＣＬＡＳＳ−Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆｏｒｍ ｏｆ ＣＤ９４ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２４８７〜２４９２）。Ｄ１．１２（ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂおよびＨＰ２．６（ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを、それぞれ抗−ＨＬＡ−ＤＲおよび抗−ＣＤ４として使用した。
【００７２】
新規ｍＡｂは、一般的に、ＮＫクローン（ＥＣ１およびＳＡ２６０、それぞれＡ７６およびＺ２５ｍＡｂに対する）またはポリクローナルＮＫ細胞群（ＡＺ２０ｍＡｂに対する）のいずれかの活性化（ＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋）ＮＫ細胞で５週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化することにより、最初に誘導された。種々の細胞融合の後、ＦｃγＲ＋Ｐ８１５標的細胞に対する転嫁殺傷アッセイで溶解を誘導する能力によって、ｍＡｂを選択した。適当なｍＡｂには、（ｉ）ＭＨＣクラスＩネガティブ標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種異系細胞に対する天然細胞毒性、（ｉｉ）抗体−被覆標的細胞に対する細胞毒性、（ｉｉｉ）細胞質内Ｃａ²⁺濃度の増加、（ｉｖ）ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−ガンマ酵素、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ等の細胞質内アダプター／エフェクター分子のチロシンホスホリル化の誘導、（ｖ）レセプター−関連形質移入鎖ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２またはＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマのホスホリル化、（ｖｉ）インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、ケモカイン（ＭＩＰ−１アルファ）、ＴＧＦベータ等のサイトカイン分泌、（ｖｉｉ）ＣＤ６９およびＰＥＮ５等のＮＫ表面分子の、それぞれアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションにより推定されるＮＫ細胞活性化を統計的に顕著に増加（ｐ＜０．０５）させるｍＡｂが含まれる。好ましいｍＡｂは、例えば前記ｍＡｂの不在下にエフェクターＮＫ細胞が起こす塩基性標的細胞の溶解と比較して、エフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比１：１で、標的細胞の溶解を少なくとも約５倍に増加させる。したがって３種類のｍＡｂが選択された：Ａ７６；Ｚ２５；ＡＺ２０。ハイブリドーマ産生ＡＺ２０は、２０００年１１月８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．へ寄託された（Ｉ−２５７６）。
【００７３】
末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の精製およびポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞群の生成
末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）は、フィコールハイパーク勾配およびプラスチック付着細胞の除去により健康なドナーから誘導された。多くのＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを抗−ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗−ＣＤ４（ＨＰ２．６）および抗−ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）ｍＡＢと（４℃で３０分）、さらにヤギ抗−マウス被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と（４℃で３０分）インキュベートし、イムノマグネティック除去した（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．、Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｌ．Ｐａｒｅｔｉ、Ａ．Ｍａｚｚｏｃｃｈｉ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｇ．Ｐａｒｍｉａｎｉ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２３８４〜２３９４；Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９７．ｐ４６、ａ ｎｏｖｅｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｈｉｃｈ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｓｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９〜１１３６；Ｖｉｔａｌｅ，Ｍ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ、Ｒ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．ＮＫｐ４４、ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｏｎ−ＭＨＣ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５〜２０７２）。ＣＤ３^-４^-ＤＲ^-細胞は、細胞溶解アッセイに使用されるかまたは１００Ｕ／ｍｌ ｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）および１．５ｎｇ／ｍｌ ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｔｄ．Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｒ，ａｆｔｅｒ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）、ＮＫ細胞クローン（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．１９８５．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１４８〜１５５）の存在下に、照射供給細胞上で培養される。
【００７４】
蛍光フローサイトメトリー分析
細胞を適当なｍＡｂとＰＥ−またはＦＩＴＣ−結合イソタイプ−特異的ヤギ抗−マウス２次試薬で染色した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）。サンプルを１色−または２色細胞蛍光分析（ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により、以前に記載されるようにして（例えばＭｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ａ．Ｍｅｒｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、Ｇ．Ｐａｎｔａｌｅｏ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ１６＋ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６９５〜７１４）分析した。
【００７５】
細胞系および細胞溶解アッセイ
使用されるＦｃγＲ−ネガティブ標的は以下のものである：ＭＥＬ１５（ＭＥＬ１５３９２、ヒトメラノーマ）（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．、Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｌ．Ｐａｒｅｔｉ、Ａ．Ｍａｚｚｏｃｃｈｉ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｇ．Ｐａｒｍｉａｎｉ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２３８４〜２３９４）；Ｍ１４（ヒトメラノーマ）（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０）；ＳＭＭＣ（ヒト肝癌）（Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｅ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９９．ＮＫｐ４６ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＮＫｐ４６ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｏｒ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１６５６〜１６６６）；Ａ５４９（ヒト肺の腺癌；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５．１）；ＦＯ−１および１１７４ｍｅｌ（ヒトメラノーマ）；ＡＵＭＡ（ヒトメラノーマ）。
【００７６】
使用されるＦｃγＲ−ポジティブ標的はＰ８１５（マウスの肥満細胞腫）であった。正常標的細胞として使用されるＰＨＡ−Ｂｌａｓｔｓは、ＰＢＬをＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ）１．５ｎｇ／ｍｌと培養することにより得られた。
【００７７】
細胞を、前記されるような４−ｈ⁵¹Ｃｒ放出アッセイにより、種々のｍＡｂの不在または存在下に、細胞溶解活性を試験した（Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｏ．Ｖｉａｌｅ、Ａ．Ｍ．Ｏｒｅｎｇｏ、Ｍ．Ｂａｒｂａｒｅｓｉ、Ａ．Ｍｅｒｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ１６＋ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｒｕｌｅｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｂｓｅｔ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＮＫ ｃｌｏｎｅｓ ｎａｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｅｓｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５８９〜１５９８；Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｅ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９９．ＮＫｐ４６ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｙｏ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＮＫｐ４６ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｏｒ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔｅｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１６５６〜１６６６）。種々のｍＡｂの濃度はマスキング実験のために１０μｇ／ｍｌであり、転嫁殺傷実験のために０．５μｇ／ｍｌである。Ｅ／Ｔ比は本文中に示される。適当なｍＡｂには、その不在下に観察される細胞溶解活性を顕著に増加させるｍＡｂが含まれる。顕著な増加の適当な例には、前記ｍＡｂの不在下での細胞溶解活性と比較した場合の、前記ｍＡｂの存在下のエフェクター：標的比１：１での細胞溶解活性を少なくとも約５倍増加させることが含まれる。
【００７８】
細胞内遊離カルシウム［Ｃａ⁺⁺］ｉ増加の測定
［Ｃａ⁺⁺］ｉの測定を前記のようにして実施した（Ｐｏｇｇｉ Ａ．、Ｒ．Ｐａｒｄｉ、Ｎ．Ｐｅｌｌａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｖ．Ｒｅｖｅｌｌｏ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９３．ＣＤ４５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＦＡ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉ−ＣＤ４５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｉａ ＬＦＡ１ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２４４５〜２４６３）。Ｆｕｒａ−２−ラベルＮＫ細胞を飽和量の抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ（ＡＺ２０）または培地単独と４℃で３０分インキュベートした。親和精製したヤギ抗−マウス抗血清（ＧＡＭ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、Ｏｈｉｏ）２０μｇ／ｍｌを含むキュベット中へ添加することにより、このレセプターの架橋が起こる。
【００７９】
ＮＫｐ３０分子の生物学的特徴付け
内在性ＮＫ細胞膜タンパク質（Ｂｏｒｄｉｅｒ，Ｃ．１９８１．Ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１６０４〜１６０６）を以下のようにして調製した：２５×１０⁶個の細胞を、ＴＸバッファー中（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で、４℃で３０分溶解し、遠心分離した（５’、１０，０００ＲＰＭ）。上清を３７℃で１０分放置し、遠心分離し、下層をＴＸバッファー中に１：２で再懸濁し、溶解液を透明にするために４℃で１０分放置した。その後、懸濁液を３７℃で１０分放置し、遠心分離し、下層をＥＢ（０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２．３％ ＳＤＳ）中に１：３で再懸濁した。サンプルを不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｅｄｆｏｒｍ、ＭＡ）へ移行させ、ＡＺ２０ｍＡｂ、次いでウサギ抗−マウスＨＲＰＯ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＮＫｐ３０−特異的抗血清、さらにロバ抗−ウサギＨＲＰＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で調査した。Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を検出のために使用した。
【００８０】
ＮＫｐ３０ポリクローナル抗血清
２．５ｋｇのＨＹ／Ｃｒ雄ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ＫＬＨと結合した（Ｐｅｎｄｅ Ｄ．、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｃ．Ｃａｎｔｏｎｉ、Ｓ．Ｖｅｒｄｉａｎｉ、Ｍ．Ｆａｌｃｏ、Ｃ．ＤｉＤｏｎａｔｏ、Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、１９９６．Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＨＬＡ．Ａ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ；ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５８／ｐ７０ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ １４０ｋＤ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｍｅｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：５０５〜５１８）１５ａａペプチドＷＶＳＱＰＰＥＩＲＴＬＥＧＳＣ（配列番号：７：ＮＫｐ３０タンパク質配列配列番号：２中のアミノ酸位置２０〜位置３３由来、加えてＫＬＨへ結合するためのＣアミノ酸）１００μｇ／１００μｌで免疫化した。最初に１００μｌの完全フロイントアジュバントで、それ以外は全て１００μｌの不完全フロイントアジュバントで、４週間処理を行った。最後の処理から１週間後に、血液１０ｍｌを採り、免疫化したペプチドおよび無関係なペプチドに対するＥＬＩＳＡにより、血清を試験し力価測定した。
【００８１】
ＮＫｐ３０シグナル伝達複合体の分析
ＮＫ細胞（１０⁸）をナトリウムペルバナデート１００μＭで刺激するかまたは刺激せず（Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、１９９９．ＮＫｐ４４、ａ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６）、１％ジギトニン溶解物をＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ｃｏｕｐｌｅｄ ＫＤ１（抗−ＣＤ１６）ｍＡｂで５回前処理した。次に溶解物をＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣＮＢｒ−結合Ｚ２３１およびＢＡＢ２８１ｍＡｂまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ｃｏｕｐｌｅｄ ＮＫｐ３０−特異的ウサギ抗血清およびウサギ免疫前血清で免疫沈降させた。サンプルを還元条件下に（５％、２Ｍｅ）１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移行し、抗−ホスホチロシンｍＡｂ（ＰＹ２０−ＨＲＰＯ、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）または抗−ＣＤ３ζｍＡｂ（２Ｈ２、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、次いでウサギ抗−マウスＨＲＰＯ（ＤＡＫＯ）で調査した。Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＫＥＮ）を検出のために使用した。
【００８２】
ＣＯＳ−７細胞中でのｃＤＮＡ発現によるライブラリースクリーニング
２人の健康なドナーから前記のようにして得たＩＬ−２−活性化ポリクローナルＮＫ細胞から抽出したＲＮＡを使用して、発現ｃＤＮＡライブラリーをＶＲ１０１２プラスミド中で（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．、ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）調製した（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０、Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ．１９９９．ＮＫｐ４４、ａ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６）。
【００８３】
ライブラリースクリーニング法は記載の通りである（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０、Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ．１９９９．ＮＫｐ４４、ａ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，Ｒ．Ｈ．、Ｍ．Ｇｅｒｒｅｔｓｅｎ、Ｅ．Ｍ．Ｃ．Ｋｎｉｐｐｅｌｓ、Ｍ．ｖａｎ Ｄｉｊｋ、Ｈ．ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ、Ｄ．Ｏ．Ｗｅｇｈｕｉｓ、Ｒ．Ｊ．Ｓｉｎｋｅ、Ｇ．Ｂ．Ｓｎｏｗ、ａｎｄ Ｇ．Ａ．Ｍ．Ｓ．ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ．１９９５．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｅ４８ ａｎｔｉｇｅｎ，Ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙ−６ ａｎｔｉｇｅｎ ＴｈＢ，ｉｓ ａ ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：１６７７〜１６８９）。手短に言えば、ｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ−７細胞へ一時的に形質移入し、ポジティブプールの選択を、特異的抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂＡ７６を使用した免疫細胞化学染色およびｓｉｂ−選択により実施した。
【００８４】
ＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡシークエンシングを、ｄ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔおよび３７７ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施した。
【００８５】
一時的移入
ＣＯＳ−７細胞（５×１０⁵／プレート）を、ＶＲ１０１２−ＮＫ−Ａ１（クローン５Ｃ）またはベクター単独を用いて、記載のようなＤＥＡＥ−デキストランまたはエレクトロポレーション法により形質移入した（Ｐｅｎｄｅ Ｄ．、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｃ．Ｃａｎｔｏｎｉ、Ｓ．Ｖｅｒｄｉａｎｉ、Ｍ．Ｆａｌｃｏ、Ｃ．ＤｉＤｏｎａｔｏ、Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９６．Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＨＬＡ．Ａ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５８／ｐ７０ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ １４０ ｋＤ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｍｅｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：５０５〜５１８）。４８時間後、形質移入細胞を細胞蛍光分析のために使用した。
【００８６】
ノーザンブロッティングによるＮＫｐ３０転写発現の分析
造血器起源の様々な細胞系でのＮＫｐ３０転写発現を分析するために、ＲＮＡを未変性アガロースゲル電気泳動により大きさで細分し、プラスに荷電したナイロン膜上（ＮＥＮ）に移行した。特に、ＣｓＣｌ勾配を用いて調製した全ＲＮＡ１０μｇまたはＯｌｉｇｏｄＴ磁気ビーズ分離（Ｄｙｎａｌ）を用いて調製したポリＡ⁺ＲＮＡ２μｇを、各レーンに負荷した。非常にストリンジェントな条件下に、記載のようにしてノーザンブロッティングを実施した（Ｂｉａｓｓｏｎｉ，Ｒ．、Ｓ．Ｆｅｒｒｉｎｉ、Ｉ．Ｐｒｉｇｉｏｎｅ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｅ．Ｏ．Ｌｏｎｇ．１９８８．ＣＤ３−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ−ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１６８５〜１６８９）。各プライマー２５ｐｍｏｌを用いてＰＣＲ増幅を３０サイクル実施し（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、次いで７２℃で７分インキュベートすることにより、ＮＫｐ３０の４２１ｂｐ ｃＤＮＡプローブ（配列番号：１０）を得た。プライマーの配列は以下の通りである：ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｇ（ＮＫｐ３０上向、配列番号：８）およびＧＡＣ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＴＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＴ Ｇ（ＮＫｐ３０下向；配列番号：９）。ｃＤＮＡフラグメント配列番号：１０はランダムプライミングにより³²Ｐ−標識された（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ．１９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
【００８７】
ＮＫｐ３０ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅
ポリクローナルＮＫおよびＴ細胞群およびクローンならびに種々の造血細胞系由来のＲＮＡｚｏｌ（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて抽出した全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングを使用して逆転写した。ＮＫｐ３０のｃＤＮＡ増幅のために使用したプライマー（６０６ｂｐ；配列番号：１２）は以下の通りである：５’ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｇ（ＮＫｐ３０上流；配列番号：８）および５’ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＡＡ Ｇ（リバースプライマー；配列番号：１１）。各プライマー２５ｐｍｏｌで３０サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、次いで７２℃で７分のインキュベーションにより、増幅を実施した。増幅産物をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によりｐＣＲ２．１中でサブクローニングし、次いで配列決定した。
【００８８】
Ｚｏｏ−ブロット分析
ＮＫｐ３０遺伝子の種間保存（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）の分析を、Ｚｏｏ−ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）により実施した。サザンブロッティングは、ヒト、アカゲザル、ＳＤラット、ＢＡＬＢ／ｃマウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅイースト菌由来のゲノムＤＮＡを含有する。ハイブリダイゼーションプローブは、ノーザンブロッティングのハイブリダイゼーションに使用したのと同一の４２１ｂｐのｃＤＮＡフラグメントであった（配列番号：１０）。記載のようにして、あまりストリンジェントでない条件で洗浄を実施した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
【００８９】
結果
新規ＮＫ−特異的トリガリング表面分子の同定
マウスをＣＤ３^-、１６⁺、５６⁺ＮＫ細胞クローンまたは集群で免疫化した。エフェクター細胞としてポリクローナルＮＫ細胞群またはクローンを用いた転嫁殺傷アッセイ中で、そのＦｃγＲ＋Ｐ８１５標的細胞の溶解を誘導する能力に応じて、様々な融合体由来のモノクローナル抗体を最初に選択した。３種類のｍＡｂ、Ａ７６、ＡＺ２０およびＺ２５（全てＩｇＧ１イソタイプ）が選択され、これらは、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４を含む公知のトリガリングＮＫレセプターに特異的な他のｍＡｂで導かれるのと同様の強い細胞溶解活性を誘導する（図１Ａ）（Ｅ：Ｔ＝１：１で、ｍＡｂの不在下に観察される細胞溶解活性の５倍以上の細胞溶解活性増加）。図１Ｂにおいて、様々な量のＡＺ２０ｍＡｂで誘導されるＮＫ細胞の細胞毒性を、抗−ＣＤ１６または抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプの場合と比較する。ＡＺ２０ｍＡｂに対する細胞溶解応答は、抗−ＣＤ１６ｍＡｂにより誘導されるものと類似するが、抗−ＣＤ５６ｍＡｂでは効果が見られない。さらに、図１Ｃに示すように、ＡＺ２０ｍＡｂで刺激した後に、代表的なクローン３Ｍ１６中で、顕著な細胞内［Ｃａ⁺⁺］の増加が認められた。特に、この抗体で誘導される［Ｃａ⁺⁺］ｉの増大は、活性化レセプターを効果的に架橋するヤギ抗−マウス２次試薬の存在下にのみ誘起される。
【００９０】
Ａ７６、ＡＺ２０およびＺ２５ｍＡｂにより認識できる分子の細胞表面分布の分析を間接的免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析で実施したところ、異なるドナー由来の種々の活性化されたポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞群により反応性が見出された（下記参照）。これらには稀少なＣＤ１６−ネガティブＮＫ細胞クローンも含まれる。これとは異なり、ＰＨＡ−誘導ポリクローナルＴ細胞群またはＴＣＲα／βおよびγ／δＴ細胞クローン（異なるドナー由来）ではｍＡｂの反応性は検出されなかった。ＥＢＶ−誘導Ｂ細胞系、単球およびＤＣ系ならびにＨＬ６０、Ｕ９３７、Ｅｏ／Ａ３、ＴＨＰ−１、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、ＩＧＲＯＶおよび標的細胞として使用される様々な腫瘍細胞系の全種類を含む種々の造血および非−造血腫瘍細胞系でも反応性は検出されなかった。
【００９１】
近年、数人のドナー由来のポリクローナルＮＫ細胞群がＮＫｐ４６分子の蛍光強度の複峰性分布（ＮＫｐ４６^brightおよびＮＫｐ４６^dull）により特徴付けられ、これらの個人に由来するＮＫクローンが安定なＮＫｐ４６^brightおよびＮＫｐ４６^dull表現型を発現することが見出された。重要なのは、ＮＫ感受性の標的細胞に対するＮＫ細胞クローンの細胞溶解活性がそのＮＫｐ４６表現型に強く相関することである。異なるパターンのＮＫｐ４６発現を示す個人に由来するポリクローナルＮＫ細胞群およびＮＫ細胞クローン上の新規ｍＡｂの反応性を分析した。図２Ａに示すように、代表的ドナーＡＭに由来するポリクローナルＮＫ細胞群は、ＡＺ２０または抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂで染色すると均質的にブライトな表現型を示す。これと異なり、ドナーＣＢに由来するポリクローナルＮＫ細胞では、同一のｍＡｂで染色した結果、蛍光は複峰性の分布を示した。特に、ＣＢドナーでは、同一の蛍光強度パターンが、新に精製したＮＫ細胞中でも検出された（図２Ａ）。さらに、ドナーＣＢ由来の幾つかのクローンの分析で、ＮＫｐ４６^brightクローンは一貫してＡＺ２０^brightであり、これに対してＮＫｐ４６^dullクローンは常にＡＺ２０^dull表現型を示すことが明かとなった（図２Ｂ）。
【００９２】
新たに単離されたリンパ球中での新規ｍＡｂの反応性のパターンを決定するために、異なる個人に由来するＰＢＬを有益なｍＡｂを使用して二重蛍光分析することにより評価した。代表的ドナーを図３Ａに示す：ＡＺ２０ｍＡｂにより認識される表面分子は選択的にＣＤ５６⁺細胞上で発現した。さらに多くのＡＺ２０⁺細胞はＣＤ１６分子を同時発現した。これと異なり、ＡＺ２０ｍＡｂはＣＤ３⁺Ｔリンパ球またはＨＬＡ−ＤＲ⁺Ｂリンパ球を染色しなかった。このドナー中で検出されるＣＤ５６⁺ＡＺ２０^-細胞群も表面ＣＤ３分子を発現することが見出された。したがって、新たに誘導されたリンパ球でも、ＡＺ２０ｍＡｂの反応性は抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂの反応性とオーバーラップする。ＮＫｐ４６およびＡＺ２０ｍＡｂ−反応性分子の表面発現の直接比較分析を図３Ａに示す。２種類の分子が同一の細胞サブセットにより明らかに同時発現した。しかし、ＡＺ２０および抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂにより染色された細胞中で対角分布は検出できず、これに対して、細胞を異なるイソタイプの２種類の抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂで同時に染色した場合にこの種の蛍光分布が起きた。
【００９３】
特に、ＡＺ２０ｍＡｂに関して記載されたのと同一の結果がＡ７６およびＺ２５ｍＡｂで得られた。これらのデータは、新規ｍＡｂで認識される分子がＮＫｐ４６とは異なることを示唆した。この可能性を直接評価するために、ＮＫｐ４６ｃＤＮＡで一時的に形質移入したＣＯＳ−７細胞を、そのＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂとの反応性について分析した。種々の抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂと反応させる間、細胞形質移入体はＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂにより染色されなかった。Ａ７６、ＡＺ２０およびＺ２５ｍＡｂはしたがって全ての成熟ヒトＮＫ細胞を規定するが、ＮＫｐ４６とは異なる新規表面分子に特異的であることが分かる。
【００９４】
ＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂにより認識される表面分子の生物学的特徴付けを分析するために、ＮＫ群を¹²⁵Ｉまたはビオチンで表面標識し、１種のまたは別のｍＡｂで免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。このような条件下に、特異的バンドは検出されなかった。したがって、内在性膜タンパク質をＮＫ細胞から調製し、さらにウェスタンブロッティングで種々のｍＡｂの可能な反応性を分析した。図３Ｂに示すように、ＡＺ２０ｍＡｂは特異的に〜３０ｋＤの分子と反応し、以後ＮＫｐ３０と名付けた。同一の条件下に、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂの双方はより低い反応性を示した。
【００９５】
ＮＫｐ３０の架橋は、新たに誘導されたＮＫ細胞中でも細胞溶解活性を誘導する
ＮＫｐ３０分子が新たなＮＫ細胞上に発現したので、これが細胞の細胞溶解活性を誘起できるかどうかを分析した。図４Ａに示すように、ＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂはＰ８１５標的細胞に対する細胞溶解活性を著しく増加させ、これに対して抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプは効果を示さなかった。このトリガリング効果は抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂで得られる効果に匹敵した。さらに、この実験で、ＡＺ２０Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの使用は、細胞溶解活性のトリガリングを誘導せず、このことはｍＡｂ−依存性ＮＫｐ３０刺激が、標的細胞上でＦｃγＲにより媒介される効率的な架橋を必要とすることを示している。
【００９６】
正常または腫瘍細胞に対する天然細胞毒性の誘導へのＮＫｐ３０の関与
先のデータは、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４のｍＡｂ−媒介性のマスキングが活性化ＮＫ細胞による非ＭＨＣ−制限腫瘍細胞溶解を阻害することを示した。さらに、ＮＫｐ４６のマスキングはまた、新たに単離された末梢血液ＮＫ細胞により媒介される天然細胞毒性を阻害した。ＮＫｐ３０のマスキングが新たに誘導されたＮＫ細胞またはＮＫクローンにより媒介される、ＦｃγＲ−ネガティブ腫瘍標的細胞のパネルに対する細胞溶解活性に影響を及ぼすことが出来るかどうかを調べた。図４Ｂに示すように、抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプではなくて、抗ＮＫｐ３０ｍＡｂが、ＨＬＡクラスＩネガティブ１１７４ｍｅｌ、ＡＵＭＡおよびＦＯ−１メラノーマ細胞系に対する、新たなＮＫ細胞によって媒介される天然細胞毒性を阻害した。抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂを抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂと組み合わせて使用した場合に付加的なより優れた阻害効果が認められた。ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６はしたがって、新たなＮＫ細胞の天然細胞毒性をトリガリングする際に相互に依存して働くレセプターである。
【００９７】
これらのデータから、活性化ＮＫ細胞により殺傷される腫瘍細胞上のＮＫｐ３０のｍＡｂ−媒介性のマスキングの効果をさらに分析した。図５は、２種のメラノーマ（ＭＥＬ１５およびＭ１４）、肝癌（ＳＭＭＣ）および肺の腺癌（Ａ５４９）を含む種々の腫瘍標的に対する細胞溶解アッセイで分析された３種類の代表的ＮＫ細胞クローンを示す。これまでの研究で、Ｍ１４メラノーマに対する細胞溶解活性が、ＮＫｐ４６^bright表現型を示すＮＫクローンに限定されかつＮＫｐ４６レセプターのｍＡｂ−媒介性のマスキングにより阻害できることを示した。これに対してＮＫｐ４６^brightクローンはＭＥＬ１５をも殺傷するが、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４のマスキングはその細胞溶解活性をそれほど阻害しなかった。前記のように、ＮＫｐ３０はＮＫｐ４６^brightクローン中で明かに発現する；したがってＮＫｐ３０がＭＥＬ１５標的細胞の殺傷に重要な役割を果たしているかもしれないと考えられる。実際、図５に示すように、抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂはＭＥＬ１５細胞のＮＫ−媒介性の溶解を明かに阻害した（＞５０％の阻害）。抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂは僅かな効果を示すが、抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプでは効果を示さなかった。これとは異なり、Ｍ１４メラノーマは抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂにより阻害されるが、抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂは実際には効果がなかった。したがって、ＮＫｐ４６がＭ１４の溶解に関する腫瘍レセプターとして現れるのに対して、ＮＫｐ３０はＭＥＬ１５の殺傷に中心的役割を果たす。
【００９８】
ＳＭＭＣおよびＡ５４９等の別の腫瘍標的細胞に対する細胞溶解アッセイに関する同一ＮＫクローンの分析（図５）は、細胞毒性誘導に対してＮＫｐ４６とＮＫｐ３０とが同等に寄与することを明かにした。実際、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ３０単独のｍＡｂ−媒介性マスキングではある程度の阻害効果しか起こらないのに対して、２分子を同時にマスキングすると顕著に阻害された。これらの結果は、２種類のレセプターが特定の標的細胞に対する細胞毒性の誘導に相乗効果を持って影響を及ぼすことを示している。更なる分析により、ＮＫｐ３０が、ＮＫ−媒介性細胞毒性の誘導において、ＮＫｐ４６だけでなくＮＫｐ４４とも相加効果的または相乗効果的に働くことが分かった。図６Ａは、代表的ＮＫクローンであるＭＩＬ６９のＦＯ−１またはＡ５４９腫瘍細胞に対する細胞溶解活性を示している。標的細胞の溶解はＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６レセプターのｍＡｂ−媒介性マスキングにより部分的にのみ阻害された。しかし、２種類のレセプターを組み合わせてマスキングするとより高い効果が得られ、３種類のレセプターを同時にマスキングすると最大の阻害が得られた。抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプは、単独でまたは他のｍＡｂと組み合わせて使用しても、阻害効果を示さなかった。ＮＫｐ３０単独または他のレセプターを組み合わせた場合の役割を、正常標的細胞源としてＰＨＡ−誘導Ｔ細胞芽細胞を使用した細胞溶解アッセイにおいて分析した。この実験で、ＮＫ細胞クローンによる自己細胞の溶解は、標的細胞上のＨＬＡクラスＩ分子のｍＡｂ−媒介性マスキングでＮＫ細胞上に発現したＨＬＡクラスＩ特異的阻害レセプターとの相互作用を混乱させることにより達成される。これらの実験条件でも、１種類のレセプターのｍＡｂ−媒介性マスキングでは細胞毒性に対して部分的な効果しか得られなかった（図６Ｂ）。これに対して、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４レセプターの同時のマスキングは標的細胞の溶解を顕著に抑制した（または実際に阻止した）（代表的クローンＭＸ３６１またはＰ９参照）。
【００９９】
これらのデータは、これらのレセプターによって認識されるリガンドが腫瘍だけでなく正常細胞中でも発現することを意味している。
【０１００】
最後に、マウスの標的細胞の認識におけるＮＫｐ３０の可能な関与について分析した。ＮＫｐ３０のｍＡｂ−媒介性マスキングはＢＷ１５０２およびＹＡＣ−１のマウス胸腺腫瘍細胞のいずれの溶解にも効果を示さなかった。
【０１０１】
前記のデータを考え合わせると、主要レセプターであるＮＫｐ３０の機能が、正常標的細胞および多くのしかし全てではない腫瘍細胞に対するＮＫ媒介性細胞毒性に関与することを示している。さらに、ＮＫｐ３０はＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と協力して働いてもよく、これは多くの場合、分析される標的細胞による特異的なリガンドの発現に応じてなされると考えられる。
【０１０２】
ＮＫｐ３０分子をコードするｃＤＮＡの分子クローニング
ＮＫｐ３０分子をコードするｃＤＮＡを同定するために、ヒトポリクローナルＮＫ抗体のｍＲＮＡからｃＤＮＡ発現ライブラリーを精製した（Ｐａｓｓｉｎｏｍ Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０）。種々のｃＤＮＡライブラリープールで形質移入したＣＯＳ−７細胞を免疫細胞化学的な検出法によりＡ７６ｍＡｂで染色した。５７３ｂｐの単一の読みとり枠（ＯＲＦ）（配列配列番号：１３をコードする）を含む６７４ｂｐのｃＤＮＡ（ＮＫｐ３０クローン５Ｃ、配列番号：１）を単離した。クローン５ＣｃＤＮＡ構築体によるＣＯＳ−７細胞の形質移入の結果、細胞蛍光分析により推定されるように、抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂではなく全ての種類の抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ（図７Ａ）により認識される分子が表面発現した。図７Ｂに示すように、推定１９０アミノ酸ペプチド（配列番号：２）をコードするクローン５ＣＯＲＦは、免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ−ＳＦ）に属し、１８アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：３）およびＶ−タイプのＩｇ−様ドメインを形成する１２０アミノ酸の細胞外領域（配列番号：４）により特徴付けられる。細胞外部には２つの潜在的なＮ−結合グリコシル化部位とＯ−結合グリコシル化のための非共通配列が含まれる。疎水性アミノ酸に富む領域な潜在的にタンパク質−タンパク質相互作用に関連し、膜貫通領域でＩｇＶ−様ドメインと結合する。１９アミノ酸膜貫通領域（配列番号：５）は＋に荷電したアミノ酸、Ａｒｇを含有し、３３アミノ酸細胞質部（配列番号：６）は典型的なＩＴＡＭ共通配列に欠けている。膜貫通ドメイン中の荷電アミノ酸の存在は、ＮＫ細胞上に発現する別のトリガリングレセプターに共通の特徴である。これらの荷電残基は、通常、シグナリングポリペプチドを含むＩＴＡＭとの関連性が考えられる。
【０１０３】
ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベース検索は、クローン５ＣｃＤＮＡ（配列番号：１）がこれまでに規定された別の１Ｃ７遺伝子のスプライシング形（寄託番号ＡＦ０３１１３８）に７６．８％相同であることを明らかにした。この遺伝子は、ヒトクロモソーム６上、ＭＨＣ遺伝子複合体のＴＮＦクラスター中にマップしている（Ｎａｌａｂｏｌｕ，Ｓ．Ｒ．、Ｈ．Ｓｈｕｋｌａ、Ｇ．Ｎａｌｌｕｒ、Ｓ．Ｐａｒｉｍｏｏ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ２２０−ｋｂ ｒｅｇｉｏｎ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ ＴＮＦ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３１：２１５〜２２）。とはいえしかし、１Ｃ７遺伝子の推定生成物の機能も表面分布も特定できず；１Ｃ７に特異的なｍＡｂを入手できなかった。さらに１Ｃ７転写産物は、種々の組織および細胞系のノーザンブロッティングでは明らかにできなかった。これに対して、ＲＴ−ＰＣＲにより１Ｃ７転写産物を脾臓（しかしそれ以外の組織からではない）または特定のリンパまたは骨髄細胞系から単離されたＲＮＡにより増幅できた。これらのデータは、１Ｃ７転写産物がそれほど重要でなく、細胞種の狭い範囲でのみ十分なレベルで発現できることを示唆した。ノーザンブロッティングによるＮＫｐ３０発現の最近の分析は、ポリクローナルＮＫ細胞群およびＮＫＬおよびＮＫ３．３を含むＮＫ細胞系中の約１ｋｂのｍＲＮＡを明かにした。これとは異なり、抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂによる反応性の欠如に密接して、ヒト単球またはＵ９３７、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０およびＬＣＬ７２１．２２１細胞を含む種々のヒストタイプの細胞中でＮＫｐ３０ｍＲＮＡは検出できなかった（図８Ａ）。ノーザンブロッティングではｍＲＮＡを発現しない（および抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ表面染色にネガティブである）このような細胞系は、ＲＴ−ＰＣＲ技術によって分析した場合に転写産物を検出できる。この発見は、ＮＫｐ３０転写産物の低いレベルがＮＫｐ３０表面発現を欠如させる結果を招くことを示唆する。さらに、人間の様々な組織のノーザンブロッティング分析により、脾臓でのみＮＫｐ３０転写産物の選択的発現が認められた。これらのデータは全て、ＮＫｐ３０発現がかなりＮＫ−特異的であるという事実に一致する。
【０１０４】
最後に、ヒトＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブを、サル、ラット、マウス、犬、ウシおよびウサギのゲノムＤＮＡでハイブリダイズした。このデータは、ＮＫｐ３０をコードする遺伝子が異なる種に高く保存されているという事実を支持するものである（図８Ｂ）。
【０１０５】
ＮＫｐ３０複合体の生化学的特徴付け
Ｎ−末端ＮＫｐ３０ペプチドでウサギを免疫化して、ＮＫｐ３０−特異的抗血清を生成した。図９Ａに示すように、ウェスタンブロッティングで見られる抗血清分子は、ＡＺ２０ｍＡｂにより先に検出されたものと同一である。ＡＺ２０ｍＡｂと異なり、ポリクローナルＮＫ細胞群由来の抗血清免疫沈降ＮＫｐ３０分子をビオチンでラベルした。したがって、ナトリウムペルバナデートで処理したまたは処理していないポリクローナルＮＫ細胞群を、ＮＫｐ３０−特異的抗血清で免疫沈降させ、抗−ホスホチロシンｍＡｂで調べた。ウサギ免疫グロブリンのＣＤ１６分子への非特異的な結合を回避するために、細胞溶解物を抗−ＣＤ１６ｍＡｂで徹底的に前処理した。さらに、全ての実験で、ウサギ免疫前血清をネガティブコントロールとして使用した。これらの実験で、ＮＫｐ３０レセプターのチロシンホスホリル化は検出されなかった。これに対してＮＫｐ３０レセプターは、ナトリウムペルバナデート処理時にチロシンホスホリル化される分子に関与し（図９Ｂ）、ＮＫｐ４６−関連ＣＤ３ζ鎖と一緒に移動する。ＮＫｐ３０−関連分子とＣＤ３ζポリペプチド間の同一性は、その抗−ＣＤ３ζｍＡｂによる反応性で直接実証された（図９Ｂ）。
【０１０６】
したがって、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６を含む他のＮＫトリガリングレセプターに類似したＮＫｐ３０は、ＩＴＡＭ−含有ＣＤ３ζポリペプチドと共同して活性化シグナルを伝達できる。これらのデータは、ＮＫｐ３０細胞質尾中のＩＴＡＭの欠如およびその膜貫通部位中の荷電残基の存在と一致している。
【０１０７】
議論
この研究では、特異的ｍＡｂの生成により、休止および活性化ヒトＮＫ細胞のいずれの天然細胞毒性で重要な役割を果たす新規トリガリングレセプターであるＮＫｐ３０を同定しかつ特徴付けた。ＮＫｐ４６に類似して、ＮＫｐ３０は、新たに単離されたおよびＩＬ−２中で培養した両方の全てのＮＫ細胞により選択的に発現し、したがってＮＫ細胞同定のための至適マーカーである。Ｉｇスーパーファミリーに属するにもかかわらず、ＮＫｐ３０はこれまでに同定されたＮＫレセプターと任意に十分な相同性を示さない。多くの点で、ＮＫｐ３０はＮＫｐ４６と類似している。実際それらの（稀少なＣＤ１６−細胞を含む）全てのＮＫ細胞上での同等の発現、両方の分子におけるそれらの類似した機能的特性と合わせた表面発現の高密度または低密度発現パターンの存在は、新規ｍＡｂによって認識される表面分子がＮＫｐ４６と同一であるかまたは非常に類似していることを想起させた。しかし、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６は異なる分子量を示し、機能的には天然細胞毒性の誘導では相補的役割を果たす。さらに、分子クローニングにより、ＮＫｐ３０がＮＫｐ４６と非常に制限された相同性を有するタンパク質であり、２種類の分子はたった１３％の同一性と１５％の類似性を示し、異なるクロモソーム上に位置する遺伝子でコードされていることが明らかとなった。
【０１０８】
天然細胞毒性および腫瘍細胞溶解においてＮＫ細胞トリガリングに応答するレセプターはこれまで定義されないままであった。得られたデータが、天然細胞毒性に関する種々のトリガリングＮＫレセプターの存在の仮説に一致した。ここで、最近ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４が同定され、この２種類のレセプターは種々の腫瘍標的の認識および溶解に関連する。いずれもＩｇスーパーファミリーに属するが、あまり同一性はない。これらは、ＮＫ細胞活性化時にチロシンホスホリル化される、異なるシグナル形質移入ポリペプチドに関連する（それぞれ、ＣＤ３ζ／ＦｃεＲＩγおよびＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２）。ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４は、ヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞溶解の過程で共に働くことが見出された。しかし、特定の標的細胞の溶解はほとんどＮＫｐ４６−および／またはＮＫｐ４４−依存性ではなく、というのも、これらの分子をｍＡｂ−媒介性マスキングしても細胞毒性は十分に阻止されないからである。さらに、明らかにＮＫｐ４６−および／またはＮＫｐ４４−依存性であっても、他の腫瘍細胞系に対する細胞溶解活性はいずれの分子をｍＡｂ−媒介性マスキングしても阻止できず、このことはＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共に働く別のレセプターの存在を再び示唆する。実際ここで、ＮＫｐ３０が種々の標的細胞に対する細胞毒性の誘導に、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共に働くレセプターであることが示される。おそらく、より重要なのは、ＮＫｐ３０が、溶解がほぼＮＫｐ４６／ＮＫｐ４４−非依存的な特定の腫瘍標的細胞（例えばＭＥＬ１５タイプのメラノーマ）のＮＫ−媒介性の殺傷誘導における主要なレセプターであることである。ＮＫｐ４６と非常に類似したＮＫｐ３０も、ＮＫ細胞活性化および新たなＮＫ細胞による標的細胞殺傷に関連する。
【０１０９】
先に論じたように、ＮＫｐ３０の表面発現はＮＫｐ４６のそれと同等である。実際、ＮＫｐ４６^dullまたはＮＫｐ４６^bright表現型を示すＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０^dullまたはＮＫｐ３０^bright蛍光によっても特徴付けられた。ＮＫｐ４６^dull表現型が一貫して少ない量のＮＫｐ４４を発現することによりＮＫ細胞クローンが特徴付けられることは前に述べた。ＮＫ細胞が異なるトリガリングレセプター同等の密度で発現するという発見は、異なる「自然（天然）」細胞溶解活性を示す別のＮＫ細胞サブセットの存在を説明するものである。例えば、かなりＮＫｐ４６−非依存性であるにもかかわらず、ある標的細胞（例えばＭＥＬ１５）に対する細胞溶解活性が、何故、ＮＫｐ４６^bright表現型を発現するＮＫクローンに実質的に限定されるのかを理解するのは困難であった。現在は、ＮＫｐ４６^bright細胞のみが高濃度でＮＫｐ３０レセプターを発現するという発見により、これらの結果を説明できる。したがって、ＮＫｐ４６^dullおよびＮＫｐ４６^bright細胞の細胞用か活性における最大の相違点に関する先の証拠は、現在、異なるＮＫｐ３０表現型を示すＮＫ細胞にも当てはめることができる。この主張の通り、ＮＫｐ３０^dullＮＫ細胞クローンの細胞溶解活性は、ＮＫｐ３０^brightクローンのそれと比較して著しく低下した。
【０１１０】
ＮＫｐ４６と類似したＮＫｐ３０は、レセプター複合体を介したシグナリングに大きく関連すると思われるＣＤ３ζに関係を有する。しかしＣＤ３ζは、少なくともＣＯＳ−７細胞中では、いずれのレセプターの表面発現にも必須ではない。分子クローニングにより、ＮＫｐ３０が、ヒトクロモソーム６上、ＨＬＡクラスＩＩＩ領域中に予めマップされた遺伝子である、ヒト１Ｃ７の生成物であることが明らかとなった（Ｎａｌａｂｏｌｕ，Ｓ．Ｒ．、Ｈ．ＳＨｕｋｌａ、Ｇ．Ｎａｌｌｕｒ、Ｓ．Ｐａｒｉｍｏｏ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ２２０−ｋｂ ｒｅｇｉｏｎ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ ＴＮＦ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３１：２１５〜２２：Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ．１９９９．Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ａ Ｖ−ＡＴＰａｓｅ Ｇ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｒｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ＴＮＦ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４７４５〜４７５４）。
【０１１１】
しかし、１Ｃ７遺伝子の推定生成物の機能も細胞分布も知られておらず、その天然細胞毒性における役割についての記載もない。さらに、ノーザンブロッティング分析では検出できないので、１Ｃ７転写産物発現の分析はＲＴ−ＰＣＲに限られた。特異的ｍＡｂが欠如しているために、転写産物と表面産物間で相関関係をうち立てられなかったことも強調すべきである。本発明において、３種類の異なるｍＡｂで染色することにより測定したＮＫｐ３０の表面発現と、ノーザンブロッティングにより評価されたｍＲＮＡ発現との間の明らかな相関関係を示す。逆に、ＲＴ−ＰＣＲによる１Ｃ７転写産物の検出から１Ｃ７／ＮＫｐ３０分子の表面発現は予測できない。
【０１１２】
最後に、ＮＫｐ３０分子は、非−ＨＬＡリガンドを認識する際にＮＫ細胞トリガリングに関与するレセプターの新規ファミリー（天然細胞毒性レセプター（ＮＣＲ））の３番目のメンバーである。これらのレセプターは、ＮＫ細胞による標的細胞溶解の誘導において、相補的に出現する。各レセプターの相対的な寄与は、標的細胞上の特異的リガンドの発現／密度に反映されると考えられる。この主張の通り、ＣＤ１６もまた天然細胞毒性に関連していることが近年明らかとなり、このことから、Ｆｃ結合およびＡＤＣＣに加えて、ＣＤ１６がＮＫ細胞機能の制御に働いていることが示唆される。ＣＤ１６および異なるＮＣＲの他に、ＮＫ細胞トリガリングを媒介できる幾つかの別の表面分子が人間および齧歯類で同定された。これらには、ＣＤ２、ＣＤ６９、ＣＤ２８、２Ｂ４およびＮＫＲ−Ｐ１が含まれる。しかし、多くの場合、これらの活性化構造体はＮＫ−制限されないので、天然細胞毒性でのそれらの実際の役割をさらに明確にする必要がある。
【０１１３】
最後に、種々のＮＣＲの同定が、ＮＫ細胞の生理学に関する我々の理解の先にある主要ステップを構成するにもかかわらず、標的細胞上のＮＣＲ天然リガンドの性質および分布の両方をさらに明らかに決定する必要がある。入手したデータに基づいて、ＮＫ−特異的トリガリングレセプターにより特異的に認識されるリガンド分子の（腫瘍細胞における）ダウンレギュレーションから成る、腫瘍回避の新規メカニズムを予測することができる。したがって、このようなリガンドの同定は、正常細胞対腫瘍細胞でのそれらの分布を分析することを可能にし、かつリガンド発現と種々の腫瘍細胞によるＮＫ−媒介性溶解への感受性との間に相関関係が存在するかを定義することが可能になる。
【０１１４】
実施例２：抗−ＮＫｐ３０抗体の製造
前記実施例１に詳細したようにしてＮＫｐ３０タンパク質配列配列番号：２が得られれば、抗−ＮＫｐ３０抗体は常用の抗体生成法により製造できる。これらの方法には、マウスまたはラット等の動物を、ここで定義したＮＫｐ３０免疫原性フラグメントで免疫化することが含まれる。反復して免疫化を実施できる。抗体応答は、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー等の種々の技術でモニターでき、免疫化した動物の血清中の、免疫原に結合した免疫グロブリンの存在が実証される。顕著な抗体応答が検出される場合、動物は犠牲となり、ケラーミルステイン法（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ １９７５、２５６：４９５〜４９７；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、１９８８、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）または免疫脾臓細胞を回収しかつそれをハイブリドーマ細胞系へ融合する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８８９）等の常用の方法に記載されるようにしてモノクローナル抗体が生成される。
【０１１５】
抗体で染色された細胞サブセットを、前記したフローサイトメトリーにより図式化し、生物学的サンプル中でＮＫ細胞を選択的に認識する所望の能力を有する抗体を同定する。得られたモノクローナル抗体の刺激能をさらに特徴付けるために、実施例１に記載したように、以下の任意の項目をバイオアッセイに利用できる：（ｉ）ＭＨＣクラスＩネガティブ標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種異系細胞に対する天然細胞毒性の誘導、（ｉｉ）抗体−被覆標的細胞に対する細胞毒性の刺激、（ｉｉｉ）細胞質内Ｃａ²⁺濃度の増加、（ｉｖ）ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−ガンマ酵素、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ等の細胞質アダプター／エフェクター分子のチロシンホスホリル化の誘導、（ｖ）レセプター関連形質導入鎖ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２またはＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマのホスホリル化、（ｖｉ）インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、ケモカイン（例えばＭＩＰ−１アルファ）、ＴＧＦベータ等のサイトカイン分泌、（ｖｉｉ）ＮＫ細胞表面分子、例えばＣＤ６９およびＰＥＮ５それぞれのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション。
【０１１６】
ＮＫｐ３０免疫原性フラグメントと結合でき、その表面にオリゴマー形で免疫グロブリンフラグメントのレパートリーを発現するファージライブラリーを特異的にスクリーニングできる抗体を製造するために、別の方法を利用できる。このスクリーニングは、固層上で組み換えＮＫｐ３０分子をパニングし、ファージ件濁液をこの被覆表面と接触させ、維持された結合ファージを洗浄し、これらのファージを複製し、その表面により少ない免疫フラグメントを発現するファージ構築体でこのスクリーニング法を数回反復し、免疫原性分子に最も高い親和性を示すフラグメントを選択することにより、実施できる。最終的に得られたフラグメントを、生物学的サンプル中のＮＫ細胞を選択的に染色する能力および前記したような任意の機能性アッセイで任意に刺激した抗体と競合する能力について試験してよい。
【０１１７】
実施例３：ＮＫ細胞の精製および活性化
抗−ＮＫｐ３０抗体等の抗−ＮＫｐ３０反応体は有利に、血漿交換法または細胞交換法で回収したサンプル等の複合体生物学的サンプルからのＮＫ細胞精製に適したＮＫ細胞特異性を示す。当業者は種々の細胞精製形態を決定できる。
【０１１８】
例えば、抗−ＮＫｐ３０抗体ＮＫｐ３０は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ｇｍｂｈ（Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）の極微小ＭＡＣＳマイクロビーズへ共有結合できる。次いで、細胞交換法またはドナーの末梢血液サンプルの傾瀉により得られるドナー血液由来の百万〜十億個の細胞の件濁液を磁気ビーズと接触させ、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＭＡＣＳセルソーター等の磁気分離装置へ導入した。また、抗−ＮＫｐ３０抗体はＤｙｎａｌ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）粒子へ結合できる。ドナー細胞の件濁液をビーズとインキュベートし、Ｂａｘｔｅｒ社製Ｉｓｏｌｅｘ装置の磁場へ置き、ＮＫｐ３０抗原と競合して細胞の放出を可能にするペプチド分子とインキュベートすることにより回復させる。
【０１１９】
精製直後ポジティブ細胞を適当な等張媒質中で回復し、１０万〜１億個の用量で患者に与えることができる。この細胞を精製ステップの後、臨床使用の前に凍結させることも可能である。自家移植法では、ＮＫ細胞を患者自身の血液から取得する。この場合、抗−腫瘍治療は、精製ＮＫ細胞をさらに、腫瘍により発現した抗原（例えばＢ細胞リンパ腫ではＣＤ２０）と結合した抗体とインキュベートし、処理細胞を抗−腫瘍抗体といっしょに患者へ再度与えることにより、実施される。また、骨髄外科移植等の同種異系外科移植で見られるＧｖＨＤ（移植物対宿主疾患）を回避するための方法では、ＮＫ細胞をドナー血液から精製し、受容者へ再−導入できる。
【０１２０】
ＮＫ細胞のポジティブ精製物をベースとするＮＫｐ３０は実際、特定の状況下に、同時にＮＫ細胞を活性化できるという利点を有する。これらの状況には特に、ある密度での抗−ＮＫｐ３０反応物の使用および／またはＮＫ細胞上でＮＫｐ３０分子の架橋を可能にする天然物の使用が含まれる。典型的に、このようなマトリクスは飽和量の抗−ＮＫｐ３０抗体で被覆された固層、例えば中空繊維、デキストラン粒子または磁気粒子を含む。
【０１２１】
本発明の同時精製−活性化法により、ＮＫ細胞のために常用されるインキュベーションステップ（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅの存在下に精製ＮＫ細胞をインキュベートする）は、もう必須のステップではない。このような常用のステップはしかしながら任意に実施できると理解すべきである：当業者はこのような常用のステップを、例えば最適化の目的で、本発明の方法に付け加えることを選択できる。
【０１２２】
略号：ＮＫ、ナチュラルキラー、ＫＩＲ、キラー阻害レセプター、ＮＣＲ、天然細胞毒性レセプター、ＩＴＡＭ、免疫レセプターのチロシンを基礎とする活性化モチーフ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｉｇ−ＳＦ、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応、ＯＲＦ、読みとり枠、ｍＡｂ、モノクローナル抗体。
【０１２３】
本明細書において、参考文献は、免疫学、細胞生物学、分子生物学および薬理学の当業者に公知の様々な方法論を提示している。参考文献が提示した方法論等に記載される出版物および他の材料は、参照によりここにその全てを包括して組み込んだものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 本発明の３種の新規ｍＡｂで誘導されるＮＫ−媒介性細胞溶解活性（抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ）のトリガリングを示す図である。図１Ａにおいて、ｃ１２７（抗−ＣＤ１６）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６）、Ｚ２３１（抗−ＮＫｐ４４）、ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５（抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ）およびｃ２１８（抗−ＣＤ５６）ｍＡｂの不在または存在下に、ＦｃγＲ−ポジティブＰ８１５標的細胞系に対する転嫁殺傷アッセイで、細胞溶解活性について代表的なポリクローナルＮＫ細胞群を分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。使用したＥ／Ｔ（エフェクター対標的）比は１：１であった。
【図１Ｂ】 本発明の３種の新規ｍＡｂで誘導されるＮＫ−媒介性細胞溶解活性（抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ）のトリガリングを示す図である。図１Ｂにおいて、段階的な量のＡＺ２０（黒四角）、ｃ１２７（抗−ＣＤ１６）（白三角）またはｃ１２８（抗−ＣＤ５６）（白丸）ｍＡｂの存在下に、Ｐ８１５標的細胞（Ｅ／Ｔ比１：１）に対する転嫁殺傷アッセイで、代表的ＮＫクローン３Ｍ１６を分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。使用した全てのｍＡｂはＩｇＧ１イソタイプであった。
【図１Ｃ】 本発明の３種の新規ｍＡｂで誘導されるＮＫ−媒介性細胞溶解活性（抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ）のトリガリングを示す図である。図１Ｃにおいて、ＡＺ２０ｍＡｂの存在下でヤギ抗−マウス２次試薬（ＧＡＭ）を用いて、［Ｃａ⁺⁺］ｉ誘発（秒時間の関数としての［Ｃａ⁺⁺］ｉｎＭ）について、クローン３Ｍ１６を分析した。ネガティブコントロールはＧＡＭ単独で処理した細胞である。
【図２Ａ】 休止または活性化、ポリクローナルまたはクローナル、ＮＫ細胞の細胞蛍光分析を示す図である。図２Ａにおいて、ドナーＡＭおよびＣＭ由来のポリクローナルＮＫ細胞群（上側および中程の水平なグラフ線）、ドナーＣＢ由来の新しく単離されたＮＫ細胞（下側の水平なグラフ線）を、ｃ２１８（抗−ＣＤ５６；２つ目の垂直柱）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６；３つ目の垂直グラフ柱）またはＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０；最後の垂直グラフ柱）ｍＡｂとＰＥ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１とを使用して、免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により分析した。コントロール（最初の垂直グラフ柱）は第２の試薬だけを用いてインキュベートした細胞である。
【図２Ｂ】 休止または活性化、ポリクローナルまたはクローナル、ＮＫ細胞の細胞蛍光分析を示す図である。図２Ｂにおいて、ドナーＣＢ由来のＮＫ細胞クローンを、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６；垂直な中程のグラフ柱）またはＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０；垂直な右側のグラフ柱）ｍＡｂとＰＥ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１とを用いて、免疫蛍光およびＦＡＣＳにより分析した（コントロールは、垂直な左側のグラフ柱である）。
【図３Ａ】 末梢血液リンパ球中でのＮＫｐ３０の発現パターンとウェスタンブロッティング分析を示す図である。図３Ａにおいて、各ドナーから新に単離した末梢血液リンパ球を、ＧＰＲ１６５（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ５６）、ＫＤ１（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ１６）、ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ３）、Ｄ１−１２（ＩｇＧ２ａ、抗−ＨＬＡ−ＤＲ）、ＫＬ２４７（ＩｇＭ、抗−ＮＫｐ４６）ｍＡｂと組み合わせたＡＺ２０ｍＡｂとイソタイプ−特異的ＦＩＴＣまたはＰＥ−結合ヤギ抗−マウス２次試薬を用いて（上側の左および右、中程の左および右、ならびに下側の左のグラフ）、二色免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により分析した。異なるイソタイプの２種類の抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂを用いた二重免疫蛍光（ＫＬ２４７、ＩｇＭ対ＢＡＢ２８１、ＩｇＧ１）も示す（下側の右）。輪郭プロットを、それぞれ非染色細胞（下側左）、赤色蛍光のみでの細胞（上側左）、赤色および緑色蛍光での細胞（上側右）および緑色蛍光のみでの細胞（下側右）の四分区画に分割した。
【図３Ｂ】 末梢血液リンパ球中でのＮＫｐ３０の発現パターンとウェスタンブロッティング分析を示す図である。図３Ｂにおいて、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫、ネガティブコントロール）由来のおよびポリクローナルＮＫ細胞群由来の内在性膜タンパク質を、非−還元条件下にＡＺ２０ｍＡｂをプローブとして１１％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。分子量マーカ（ｋＤａ）を左に示す。
【図４Ａ】 ＮＫｐ３０が新たなＮＫ細胞中でレセプター活性化に働き、その天然細胞毒性に関連することを示す図である。図４Ａにおいて、各ドナーから新に単離された末梢血液ＮＫリンパ球を、ｃ１２７（抗−ＣＤ１６）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６）、ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５およびｃ２１８（抗−ＣＤ５６）ｍＡｂの不在または存在下に、ＦｃγＲ−ポジティブＰ８１５標的細胞系に対する転嫁殺傷アッセイで、細胞溶解活性について分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。使用したＥ／Ｔ比は２０：１であった。
【図４Ｂ】 ＮＫｐ３０が新たなＮＫ細胞中でレセプター活性化に働き、その天然細胞毒性に関連することを示す図である。図４Ｂにおいて、新に単離した末梢血液ＮＫ細胞を、規定分子に対するｍＡｂの不在または存在下に（ｃ２１８（抗−ＣＤ５６）、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６）ｍＡｂを使用した）、規定のＦｃγＲ−ネガティブ／ＨＬＡクラスＩ−ネガティブメラノーマ細胞系に対する細胞溶解活性について分析した。Ｅ／Ｔ比は２０：１であった。
【図５】 ＮＫ細胞クローンによって媒介される腫瘍細胞溶解における、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６の関与を示す図である。３種のＮＫ細胞クローンを、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０；黒色バー）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６；ストライプバー）あるいはＡＺ２０とＢＡＢ２８１の両方（点画バー）ｍＡｂの不在（白色バー）または存在下に、ＭＥＬ１５、Ｍ１４、ＳＭＭＣおよびＡ５４９ＦｃγＲ−ネガティブ標的細胞系に対する細胞溶解活性について分析した。Ｅ／Ｔ比は４：１であった。
【図６Ａ】 ＮＫｐ３０が、腫瘍または正常自己標的細胞に対するＮＫ−媒介性細胞毒性の誘導において、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共同で機能することを示す図である。図６Ａにおいて、代表的ＮＫクローンＭＩＬ６９を、規定分子に対するｍＡｂの不在または存在下に、ＦＯ−１またはＡ５４９ＦｃγＲ−ネガティブ標的細胞系に対する細胞溶解活性について分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。以下のｍＡｂを使用した：ＫＬ２４７（抗−ＮＫｐ４６）、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０）、ＫＳ３８（抗−ＮＫｐ４４）。Ｅ／Ｔ比は２：１（ＦＯ−１）および３：１（Ａ５４９）であった。
【図６Ｂ】 ＮＫｐ３０が、腫瘍または正常自己標的細胞に対するＮＫ−媒介性細胞毒性の誘導において、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共同で機能することを示す図である。図６Ｂにおいて、２種類のＮＫ細胞クローン（ＭＸ３６１およびＰ９）を、規定分子に対するｍＡｂの不在（白色バー）または存在（黒色バー）下に、自己ＰＨＡ Ｂｌａｓｔに対する細胞溶解活性について分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。使用したｍＡｂはＡ６−１３６（抗−ＨＬＡクラスＩ）、ＫＬ２４７（抗−ＮＫｐ４６）、ＫＳ３８（抗−ＮＫｐ４４）、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０）であった。Ｅ／Ｔ比は１０：１であった。
【図７Ａ】 ＣＯＳ−７細胞形質導入物で発現したＮＫｐ３０分子の細胞蛍光分析、ＮＫｐ３０のアミノ酸配列（配列番号：２）および疎水性プロットを示す図である。図７Ａにおいて、クローン５ＣｃＤＮＡ構築対で形質導入したＣＯＳ−７細胞を、抗−ＮＫｐ３０（左から右へ：Ａ７６、ＡＺ２０、Ｚ２５）または抗−ＮＫｐ４６（ＢＡＢ２８１）ｍＡｂとＰＥ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１とで染色し、フローサイトメトリーで分析した。白色プロファイルは第２試薬のみでインキュベートした細胞である（すなわちネガティブコントロール）。
【図７Ｂ】 ＣＯＳ−７細胞形質導入物で発現したＮＫｐ３０分子の細胞蛍光分析、ＮＫｐ３０のアミノ酸配列（配列番号：２）および疎水性プロットを示す図である。図７Ｂにおいて、シグナルペプチド（配列番号：３）を小文字で示し、膜貫通領域（配列番号：５）に下線を引く。ＮＫｐ３０細胞外領域配列（配列番号：４）はシグナルペプチドと膜貫通領域の間の配列に相当する。ＮＫｐ３０細胞内領域配列（配列番号：６）は膜貫通配列（Ｃ−末端）の後ろの配列に相当する。Ｉｇ−様の折り畳中に存在するシステインを丸で囲み、推定Ｎ−グリコシル化部位を四角で囲む。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットを下方に示す。ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｓｕｉｔｅｓ、ＮｅｔＯＧｌｙｃ２．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ）およびＰＳＯＲＴ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅｒｓ（ｗｗｗ．ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ：８８００／）を使用してＤＮＡおよびタンパク質配列を分析した。
【図７Ｃ】 ＣＯＳ−７細胞形質導入物で発現したＮＫｐ３０分子の細胞蛍光分析、ＮＫｐ３０のアミノ酸配列（配列番号：２）および疎水性プロットを示す図である。図７ＣにＮＫｐ３０ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号：１）。ＮＫｐ３０コード配列は位置６４〜位置６３６である（配列番号：１３）。ＮＫｐ３０のための４２１ｂｐのｃＤＮＡプローブ（配列番号：１０）は配列番号：１の位置５７〜位置４７７の配列に相当する。ｐＣＲ２．１中でのクローニングのためにＮＫｐ３０から増幅された６０６ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号：１２）は配列番号：１の位置５７〜位置６６２の配列に相当する。
【図８Ａ】 ＮＫｐ３０転写発現のノーザンブロッティング分析およびＺｏｏ−ブロット分析を示す図である。図８Ａにおいて、全ＲＮＡを起源の異なる細胞から単離した。レーン１および２：ポリクローナルＮＫ細胞群；レーン３：ブランク；レーン４：ＮＫ細胞系（ＮＫＬ）；レーン５：ＮＫ細胞系（ＮＫ３．３）；レーン６：ヒト単球；レーン７：細網肉腫細胞系（Ｕ９３７）；レーン８：Ｔリンパ腫細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）；レーン９：急性前骨髄球性白血病細胞系（ＨＬ６０）；レーン１０：ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系（ＬＣＬ７２１．２２１）。各ＲＮＡ調製物１０μｇ（レーン１および２のポリクローナルＮＫ細胞群からポリＡ⁺ＲＮＡ２μｇ）を４２１ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。２８Ｓおよび１８ＳリボゾームＲＮＡサブユニットの位置を左に示す。
【図８Ｂ】 ＮＫｐ３０転写発現のノーザンブロッティング分析およびＺｏｏ−ブロット分析を示す図である。図８Ｂにおいて、ヒト、アカゲザル、ＳＤラット、ＢＡＬＢ／ｃマウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅイースト菌由来のゲノムＤＮＡを、それほどストリンジェントでない条件下に、４２１ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることから成る、サザンブロットを示す図である。
【図９Ａ】 特異的抗血清を使用することによりＮＫｐ３０レセプター複合体の生物学的分析を示す図である。図９Ａにおいて、Ｄａｕｄｉ由来の（ネガティブコントロール）およびポリクローナルＮＫ細胞群由来の内在性膜タンパク質を、非−還元条件下にＮＫｐ３０−特異的ウサギ抗血清（Ｉ）をプローブとして１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。分子量マーカー（ｋＤａ）を左に示す。
【図９Ｂ】 特異的抗血清を使用することによりＮＫｐ３０レセプター複合体の生物学的分析を示す図である。図９Ｂにおいて、ナトリウムペルバナデートで処理していない（−）または処理した（＋）ポリクローナルＮＫ細胞群に由来する１％ジギトニン細胞溶解物を、Ｚ２３１ｍＡｂ（抗−ＮＫｐ４４）、ＢＡＢ２８１ｍＡｂ（抗−ＮＫｐ４６）、ＮＫｐ３０−特異的ウサギ抗血清（Ｉ）および前−免疫ウサギ血清（ｐＩ）で免疫沈降させた。還元条件下に抗−ホスホチロシン（抗−ＰＴｙｒ）または抗−ＣＤ３ζ（抗−ζ）ｍＡｂをプローブとして、サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｉｇ軽鎖（Ｉｇ（Ｌ））、Ｔｙｒ−ホスホリル化ＣＤ３ζ（Ｐ−ζ）、Ｔｙｒ−ホスホリル化ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２（Ｐ−ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２）およびＣＤ３ζの非ホスホリル化形を矢印で示す。分子量マーカー（ｋＤａ）を右に示す。
【配列表】

Claims (21)

1. 生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出かつ／または定量化する方法において、
   配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体と生物学的サンプルとを接触させ、
   前記接触により形成される免疫複合体を検出しかつ／または定量化する
   ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出しかつ／または定量化する方法。
2. 生物学的サンプルからＮＫ細胞を検出するためのキットにおいて、
   配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体を含み、
   前記単離された抗体がコンテナー中に封入されている
   ことを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞を検出するためのキット。
3. 生物学的サンプルからＮＫ細胞を選択的に除去するための方法において、
   配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体と生物学的サンプルとを接触させ、
   前記接触により形成される免疫複合体を前記生物学的サンプルから除去する
   ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞を選択的に除去するための方法。
4. 生物学的サンプルからＮＫ細胞をポジティブかつ選択的に精製するための精製方法において、
   配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体と生物学的サンプルとを接触させ、
   前記接触により形成される免疫複合体から細胞を回復する
   ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞をポジティブかつ選択的に精製するための精製方法。
5. 生物学的サンプルからＮＫ細胞を除去しかつ／またはポジティブに精製するためのキットにおいて、
   配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体を含み、
   前記単離された抗体がコンテナー中に封入されている
   ことを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞を除去しかつ／またはポジティブに精製するためのキット。
6. ＮＫ細胞の細胞毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激するための刺激方法において、
   生理学的条件下にｉｎ ｖｉｔｒｏで、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体と、前記ＮＫ細胞とを接触させる
   ことを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の細胞毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激するための刺激方法。
7. ＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するためのキットにおいて、
   配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体を含み、
   前記単離された抗体がコンテナー中に封入されている
   ことを特徴とする、ＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するためのキット。
8. 抗ＮＫｐ４６抗体および抗ＮＫｐ４４抗体から成る群より選択される抗体をさらに含有することを特徴とする、請求項２、５及び７のいずれか一項に記載のキット。
9. 移植の改善、ＧｖＨの阻害、または、ＧｖＴおよびＧｖＬの刺激を意図することを特徴とする、請求項２、５、７及び８のいずれか一項に記載のキット。
10. ＮＫ細胞の細胞毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害のための方法において、
    生理学的条件下にｉｎ ｖｉｔｒｏで、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体とＮＫ細胞とを接触させる
    ことを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の細胞毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害のための方法。
11. ＮＫ細胞の細胞毒性を阻害するためのキットにおいて、
    配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体を含有する
    ことを特徴とする、ＮＫ細胞の細胞毒性を阻害するためのキット。
12. 該単離された抗体は、標的細胞の存在下に、標的細胞と１：１の割合で置かれたＮＫ細胞によって引き起こされる天然細胞毒性の、少なくとも５倍の毒性の増加を誘導できる
    ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
13. 該単離された抗体は、標的細胞の存在下に、標的細胞と１：１の割合で置かれたＮＫ細胞によって引き起こされる天然細胞毒性の、少なくとも５倍の毒性の増加を誘導できる
    ことを特徴とする、請求項７に記載のキット。
14. 該単離された抗体は、ＮＫ細胞により誘導される天然細胞毒性を阻害する
    ことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
15. 該単離された抗体は、ＮＫ細胞により誘導される天然細胞毒性を阻害する
    ことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
16. 該単離された抗体は、ＮＫｐ３０結合部位をマスキングする
    ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
17. 該単離された抗体は、ＮＫｐ３０結合部位をマスキングする
    ことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
18. 該単離された抗体は、ＮＫ細胞により発現されるＮＫｐ３０レセプターの架橋を阻害する
    ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
19. 該単離された抗体は、ＮＫ細胞により発現されるＮＫｐ３０レセプターの架橋を阻害する
    ことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
20. 前記配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体は、ハイブリドーマ Ｉ−２５７６（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．インスティテュート パスツール、パリ、フランス）から生産される単離されたモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する
    ことを特徴とする、請求項１、３、４、６、１０のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する単離された抗体は、ハイブリドーマ Ｉ−２５７６（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．インスティテュート パスツール、パリ、フランス）から生産される単離されたモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する
    ことを特徴とする、請求項２、５、７、８、９、１１のいずれか一項に記載のキット。

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