ES2321687T3 - Receptor activador implicado en la citotoxicidad natural mediada por las celulas destructoras naturales humanas y anticuerpos que identifican dicho receptor. - Google Patents
Receptor activador implicado en la citotoxicidad natural mediada por las celulas destructoras naturales humanas y anticuerpos que identifican dicho receptor. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido aislado con propiedades activadoras del receptor de células destructoras naturales (NK), que es capaz de unirse a péptidos de transducción de señal de CD3xi (grupo determinante), presentando dicho polipéptido una secuencia con por lo menos el 80% de homología con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6 y SEC. ID. nº 7.
Description
Receptor activador implicado en la citotoxicidad
natural mediada por las células destructoras naturales humanas y
anticuerpos que identifican dicho receptor.
La presente invención se refiere a un nuevo
compuesto denominado NKp30 que es expresado de manera selectiva por
todas las células NK maduras y que está implicado en la
citotoxicidad natural humana como receptor activador, a nuevos
anticuerpos que se unen a la estructura NKp30 y a las utilizaciones
farmacéuticas y medicinales de los
mismos.
mismos.
Las células destructoras naturales (células NK)
proporcionan un mecanismo efector eficaz mediante el cual la
inmunovigilancia elimina las células tumorales o infectadas por
virus. Una característica bien definida de las células NK es su
capacidad para lisar células diana deficientes en la expresión de
moléculas MHC de clase I. Esta observación ha sido básica para la
identificación de diferentes receptores inhibidores expresados por
las células NK. En la unión a las moléculas MHC de clase I
expresadas en las células diana, estos receptores liberan señales
inhibidoras que regulan por disminución las funciones citolíticas.
En los seres humanos, el reconocimiento de las moléculas HLA de
clase I está mediado por dos tipos de receptores: los que pertenecen
a la superfamilia Ig que incluyen tanto a las proteínas KIR como a
LIR-1/ILT-2 cuyos ligandos están
representados por varios grupos de alelos HLA-A, -B
y -C y el complejo receptor CD94/NKG2A lectinoide que reconoce las
moléculas HLA-E. La expresión de estos receptores
inhibidores explica cómo las células NK pueden distinguir entre
células HLA deficientes y las normales. Por otra parte, existió
información limitada en los receptores NK activadores responsables
de la activación de la citotoxicidad natural. Sólo recientemente se
ha identificado dos receptores distintos específicos de NK que
desempeñan una función importante en el reconocimiento mediado por
las células NK y la destrucción de células diana defectuosas HLA de
clase I. Estos receptores, denominados NKp46 y NKp44, son miembros
de la superfamilia Ig. Su reticulación provocada por los mAb
específicos conduce a una activación potente de las células NK lo
que produce un aumento de las concentraciones de Ca^{++}
intracelular, en la activación de la citotoxicidad y liberación de
linfocina. Significativamente, el enmascaramiento mediado por el
mAb NKp46 y/o NKp44 produjo la inhibición de la citotoxicidad de NK
frente a la mayoría, pero no todas, las células diana. Estos
descubrimientos, aunque proporcionan pruebas para una función
central de NKp46 y NKp44 en la citotoxicidad natural, también
implicaban la existencia de receptores adicionales.
La presente invención da a conocer la
identificación de un nuevo receptor activador implicado en el
reconocimiento y la destrucción de células diana, mediados por las
células NK. Este nuevo receptor de aproximadamente 30 kD en
SDS-PAGE ha sido denominado NKp30, y es un miembro
de la superfamilia Ig caracterizado por un único dominio de tipo V,
un resto cargado en la porción transmembranaria y la ausencia del
motivo ITAM en la cola citoplasmática. La búsqueda en las bases de
datos EMBUGenbank/DDBJ puso de manifiesto que el ADNc de NKp30
clonado es idéntico a una forma cortada y empalmada alternativamente
identificada previamente del gen 1 C7 (disponible bajo el nº de
registro AF031138). Hasta la fecha, sin embargo, debido a la falta
de anticuerpos monoclonales específicos, no pudo identificarse ni
la función ni la distribución de la superficie en el supuesto
producto del gen 1 C7. El documento WO 99/23867 da a conocer una
secuencia nucleotídica que presenta una homología con la secuencia
que codifica el nuevo receptor de activación, pero codificando
proteínas con diferentes actividades biológicas, es decir BMOG, un
miembro proteico de la familia de la glucoproteína mielina
oligodendrocítica. El documento WO 95/06247 da a conocer una
molécula específica para las células NK pero constituida por un par
glucoproteínico PEN5-\alpha y
PEN5-\beta. La base de datos EMBL de 1 sept. 1999,
nº de registro AJ 22 31 53 da a conocer únicamente una secuencia
nucleotídica específica correspondiente a la SEC. ID. nº 1 y la
base de datos SWISSPROT, 01 enero 1998, nº de registro 01 49 32 una
secuencia de aminoácidos específica correspondiente a la SEC. ID. nº
2.
AcNKp30 se expresa de manera selectiva en la
superficie de las células humanas NK maduras, y se asocia a los
péptidos de transducción de señal CD3\zeta que se transforman en
tirosina fosforilada durante la activación de la célula. NKp30
puede cooperar con NKp46 y/o NKp44 en la producción de citotoxicidad
mediada por NK frente a la mayoría de las células diana, mientras
que representa el mayor receptor de activación en la destrucción de
determinados tumores (por ejemplo melanoma humano de tipo
MEL15).
La invención proporciona anticuerpos que se unen
de manera selectiva a estructuras de NKp30. La reticulación mediada
por anticuerpos de NKp30 produce la activación potente de las
células NK, mientras que el enmascaramiento de NKp30 mediado por
anticuerpos inhibe la citotoxicidad natural de NK. Un hibridoma que
produce anticuerpos monoclonales denominados AZ20 en el apartado
"Ejemplos" más adelante se ha depositado en la C.N.C.M. el 8
de noviembre de 2000 (C.N.C.M. Institut Pasteur; 25, rue du Docteur
Roux; F-75724 Paris Cedex 15; Francia).
La presente invención proporciona de este modo
herramientas útiles para la purificación de células positivas a NK
y para la regulación de la citotoxicidad natural de las células NK.
Las herramientas según la invención son de particular interés para
la regulación de las reacciones del aloinjerto en el hospedador o
del injerto en el hospedador (mejora del injerto o del trasplante,
injerto contra hospedador GvH, pero también injerto contra tumor
GvT o injerto contra leucemia GvL) y para la regulación del
crecimiento de células patológicas tales como las células
tumorales, las células infectadas por microorganismos o infectadas
por virus.
La presente invención se refiere a un
polipéptido aislado tal como se define en las reivindicaciones 1 y
2.
La presente invención da a conocer compuestos
aislados que comprenden por lo menos una secuencia de aminoácidos
que es por lo menos 80% idéntica en toda su longitud a una secuencia
de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por la
SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6, a las
secuencias de aminoácidos de cualquier fragmento inmunógeno de las
mismas y a la secuencia SEC. ID. nº 7.
Entre estos compuestos, se prefieren los que
comprenden por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo
menos 90% idéntica en toda su longitud a una secuencia de
aminoácidos seleccionadas de entre dicho grupo y se prefieren
especialmente aquellos para los cuales dicha identidad es de por lo
menos el 95%. Además, son muy preferidos aquellos para los que
dicha identidad es de por lo menos el 97% y son especialmente muy
preferidos entre aquellos para los que dicha identidad es de por lo
menos el 98% y por lo menos el 99%, con aquellos para los que es de
por lo menos el 99% son las más preferidos.
El término "Identidad", tal como se conoce
en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias
polipeptídicas, o dos o más secuencias polinucleotídicas, como
puede darse el caso, determinada comparando las secuencias. En esta
materia, "identidad" significa también el grado de conexión de
la secuencia entre las secuencias polipeptídicas o
polinucleotídicas, como puede darse el caso, determinado por la
igualdad entre los segmentos de dichas secuencias. La
"identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos
conocidos, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en
Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University
Press, Nueva York, 1988. Los procedimientos para determinar la
identidad se diseñan para dar la mayor compatibilidad entre las
secuencias probadas. Además, los procedimientos para determinar la
identidad están codificados en programas informáticos disponibles
al público, tal como el programa GAP en el paquete del programa GCG
(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research
12(1): 387 (1984), BLAST, BLASTN (Altschul, S.F. et
al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)
y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85;
2444-2448 (1988).
La SEC. ID. nº 2 se refiere al polipéptido
humano NKp30 de 190 aminoácidos (aproximadamente 30 kD en
SDS-PAGE), (que es expresado de manera selectiva
por las células NK, y particularmente las células NK maduras, a la
SEC. ID. nº 4 para la zona extracelular del receptor NKp30 humano,
a la SEC. ID. nº 5 para la zona transmembranaria del receptor NKp30
humano, a la SEC. ID. nº 6 para la cola citoplasmática del receptor
NKp30 humano, a la SEC. ID. nº 7 para un péptido inmunógeno de 15
aminoácidos derivado de la SEC. ID. nº 2. La presente invención da
a conocer también variantes de los polipéptidos mencionados
anteriormente, es decir polipéptidos que varían de los referentes
por sustituciones conservadoras de aminoácidos, mediante las cuales
un resto es sustituido por otro con características similares.
Dichas sustituciones típicas son entre otras Ala, Val, Leu e Ile;
entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln;
y entre los restos básicos Lys y Arg; o los restos aromáticos Phe y
Tyr. Más generalmente, las variantes conservadoras son incluso
capaces de actuar como receptores de activación cuando son
expresados por células NK en una posición apropiada al receptor.
Estos compuestos se denominarán en la presente memoria "compuestos
de aminoácidos de la invención".
Asimismo, se proporcionan compuestos aislados
que comprenden:
- -
- por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica en toda su longitud a una secuencia de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6, las secuencias de aminoácidos de cualquier fragmento inmunógeno de las mismas, y la secuencia SEC. ID. nº 7 (preferentemente ésta es por lo menos una secuencia de aminoácidos 100% idéntica en toda su longitud a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre grupo) y que comprende también
- -
- por lo menos una cadena CD3\zeta.
La expresión "Fragmento inmunógeno",
significa en la presente memoria cualquier fragmento polipeptídico o
peptídico que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria tal
como (i) la generación de anticuerpos que unen dicho fragmento y/o
que unen cualquier forma de la molécula NKp30 que comprende dicho
fragmento, incluyendo el receptor de la membrana y mutantes
procedentes del mismo, (ii) la estimulación de una respuesta de
linfocitos T que implica linfocitos T que reaccionan con el
complejo bimolecular que comprende cualquier molécula MHC y un
péptido derivado de dicho fragmento, (iii) la unión de vehículos
transfectados tales como bacteriófagos o los genes que expresan
bacterias que codifican inmunoglobulinas de mamífero.
Alternativamente, un fragmento inmunógeno se refiere también a
cualquier construcción capaz de provocar una respuesta inmunitaria
como se definió anteriormente, tal como un fragmento peptídico
conjugado con una proteína transportadora por acoplamiento
covalente, un montaje híbrido de polipéptido recombinante que
comprende dicho fragmento peptídico en su secuencia de aminoácidos
y específicamente incluye células transfectadas con un ADNc de cuya
secuencia comprende una fracción que codifica dicho fragmento.
La presente invención da a conocer asimismo
algún compuesto aislado que comprende por lo menos una secuencia
polinucleotídica que es por lo menos 80% idéntica en toda su
longitud a una secuencia polinucleotídica seleccionada de entre el
grupo constituido por las SEC. ID. nº 1, SEC. ID. nº 10, SEC. ID. nº
12, SEC. ID. nº 13 y las secuencias polinucleotídicas que codifican
según el código genético universal y teniendo en cuenta su
redundancia, las secuencias SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4, SEC. ID.
nº 5 y SEC. ID. nº 6, las secuencias de aminoácidos de cualquier
fragmento inmunógeno de las secuencias SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4,
SEC. ID. nº 5 y SEC. ID. nº 6 y la secuencia SEC. ID. nº 17. Entre
estos compuestos, se prefieren los que comprenden por lo menos una
secuencia polinucleotídica que es por lo menos 90% idéntica en toda
su longitud a una secuencia polinucleotídica seleccionada de dicho
grupo y se prefieren especialmente las que dicha identidad es por lo
menos del 95%. Además, son muy preferidas las que dicha identidad
es de por lo menos el 97%; entre éstas, son particularmente
preferidas las que dicha identidad es de por lo menos el 98% y por
lo menos el 99%, con las que son de por lo menos el 99% son las más
preferidas. Preferentemente los compuestos aislados comprenden por
lo menos una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido
que conserva sustancialmente la misma función o actividad biológica
que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEC. ID. nº 1,
SEC. ID. nº 10, SEC. ID. nº 12 y SEC. ID. nº 13. Se proporcionan
compuestos que comprenden por lo menos un polinucleótido que
hibrida, particularmente en condiciones severas, a dichos
compuestos aislados. Dichos polinucleótidos de hibridación incluyen
principalmente el grupo de polinucleótidos complementarios a los de
la SEC. ID. nº 1, SEC. ID. nº 10, SEC. ID. nº 12 y SEC. ID. nº 13.
Un ejemplo específico de condiciones severas de hibridación es la
incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende:
formamida al 50%, 5 \times SSC (NaCl 150 mM, citrato
trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times solución
de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN
de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado, seguido de lavado
del soporte de hibridación en 0,1\times SSC a aproximadamente
65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son muy conocidas y
están ejemplificadas en Sambrook, et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y.,
(1989), particularmente el capítulo 11 en la misma. La solución de
hibridación puede utilizarse también con secuencias
polinucleotídicas proporcionas por la invención. La presente
invención también da a conocer variantes de NKp30 expresadas en
cualquier especie de mamífero aparte de la especie humana,
principalmente en mono, rata, ratón, perro, vaca y conejo. De hecho
dichas variantes parecen muy conservadas entre las especies. Se da
a conocer también los mutantes de NKp30 no funcionales tales como
los mutantes puntuales del dominio transmembranario en los que el
resto R es desplazado por un resto sin carga tal como A. Estos
compuestos se denominarán en la presente memoria "compuestos pln
de la invención".
La SEC. ID. nº 1 se refiere al ADNc de NKp30
humano (ARNm de aproximadamente 1 kb), la SEC. ID. nº 10 a la sonda
de ADNc de NKp30 de 421 bp (posición 57 a posición 477 de la SEC.
ID. nº 1), la SEC. ID. nº 12 a un producto de la ampliación del
ADNc de NKp30 de 606 bp (desde la posición 57 hasta la posición 662
en la SEC. ID. nº 1), la SEC. ID. nº 13 a la secuencia de
codificación NKp30 desde la posición 64 a la posición 636 en la
SEC. ID. nº 1. Los polinucleótidos significan en la presente memoria
que incluyen también oligonucleótidos, y corresponden a cualquier
naturaleza polinucleotídica, incluyendo ADN, ADN genómico, ARN,
ARNt, ARNm y ADNc. La presente invención proporciona también
vectores de transfección que llevan por lo menos un compuesto
aislado seleccionado de entre el grupo constituido por dichos
producto polinucleótidos y con células transfectadas por al menos
uno de dichos compuestos aislados o por al menos uno de dichos
vectores.
La invención da a conocer asimismo compuestos
polinucleotídicos seleccionados de entre el grupo constituido por
la pareja (SEC. ID. nº 8; SEC. ID. nº 9), la pareja (SEC. ID. nº 8;
SEC. ID. nº 11), el polinucleótido con la SEC. ID. nº 10, el
polinucleótido con la SEC. ID. nº 12. Dichos compuestos son
principalmente útiles para la detección de NKp30 en una muestra.
Las parejas tales como la (SEC. ID. nº 8; SEC. ID. nº 9) y la (SEC.
ID. nº 8; SEC. ID. nº 11) pueden utilizarse por ejemplo como pareja
del cebador de la PCR arriba y abajo. Los polinucleótidos tales
como los polinucleótidos con la SEC. ID. nº 10 y la SEC. ID. nº 12
pueden utilizarse como sondas de NKp30. La secuencia SEC. ID. nº 10
corresponde a un ADNc de 421 bp procedente de la sonda de la SEC.
ID. nº 1 (desde la posición 57 hasta la posición 477 en la SEC. ID.
nº 1); puede utilizarse por ejemplo como sonda de NKp30 que permite
identificar y aislar el gen NKp30 en una muestra biológica. Este gen
NKp30 aparece además como muy conservado entre las especies de
mamífero. La SEC. ID. nº 12 corresponde a un ADNc de 606 bp
procedente de la SEC. ID. nº 1 (desde la posición 57 hasta la
posición 662 en la SEC. ID. nº 1); corresponde con el producto
obtenido por ampliación por PCR con la pareja cebadora SEC. ID. nº 8
y nº 11.
En un aspecto adicional, la invención da a
conocer una composición de tipo antisuero que es tal como la
obtenida inmunizando un mamífero con por lo menos un compuesto de
aminoácidos aislado de la invención (es decir cualquier compuesto
de la invención que se define que comprende una secuencia de
aminoácidos, es decir, definido en la reivindicación 1), por lo
menos este compuesto de aminoácidos que está opcionalmente acoplado
a un mejorador de inmunogenicidad y recoger el antisuero producido
de este modo.
Asimismo, se dan a conocer:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La presente invención se refiere a un anticuerpo
aislado definido en las reivindicaciones 3 a 7.
La invención da a conocer más en particular
algún anticuerpo aislado que está dirigido contra por lo menos un
compuesto de aminoácidos de la invención y que no se une a ninguna
molécula de la superficie de los linfocitos T, ni a ninguna
molécula de la superficie de los linfocitos B. Los anticuerpos
preferidos no se unen a monocitos, granulocitos y preferentemente
no se unen a ninguna célula nucleada de la sangre periférica excepto
a las células NK. Los anticuerpos aislados más preferidos no se
unen a ningún fragmento extracelular de NKp46 ni de NKp44, ni a
ningún otro fragmento extracelular de las células NK.
Dichas reacciones de unión significan en la
presente memoria reacciones de unión tales como las observadas en
las reacciones de tipo anticuerpo-antígeno en
condiciones experimentales apropiadas para dichas reacciones de
reconocimiento de tipo anticuerpo-antígeno. Dichas
reacciones de unión pueden conseguirse por ejemplo poniendo en
contacto una suspensión de leucocitos de la sangre periférica con el
anticuerpo, detectando los complejos inmunitarios formados de este
modo, por ejemplo poniendo en contacto con un reactivo secundario de
anti-inmunoglobulina que lleva un marcador
fluorescente y enumerando e identificando las células que se unen al
anticuerpo utilizando un citómetro de flujo tal como el Coulter XL
de Beckman. La identificación de varios subconjuntos de leucocitos
en este experimento se basa en la magnitud y las propiedades ópticas
de varios subconjuntos de células. Alternativamente, una vez que se
contacta con el anticuerpo de interés como se describió
anteriormente, la misma suspensión de leucocitos puede ponerse en
contacto con un anticuerpo conjugado con fluorocromo que se une
específicamente a un subconjunto de leucocitos tal como el
anticuerpo UCHT-1 de CD3 que se une específicamente
a los linfocitos T, permitiendo de este modo una definición
fenotípica del subconjunto de leucocitos que es une al anticuerpo
de interés. Pueden realizarse varios experimentos de marcado doble
descritos, utilizando un panel de anticuerpos específicos para el
subconjunto, para delimitar más la reactividad celular del
anticuerpo de interés.
Los anticuerpos preferidos pueden producir un
aumento (p<0,05) estadísticamente significativo en la activación
de las células NK evaluado por (i) la citotoxicidad natural hacia
las dianas negativas MHC de clase I, las células tumorales, las
células infectadas por virus, las células de aloinjerto, (ii) la
citotoxicidad hacia las células diana recubiertas con anticuerpo,
(iii) aumentos de la concentración intracitoplásmica de Ca^{2+},
(iv) inducción de la fosforilación de tirosina de las moléculas de
adaptador/efector intracitoplásmicas tales como ZAP70, Syk, LAT,
SLP76, Shc, Grb2, enzimas de fosfolipasa C-gamma,
fosfatidil-inositol 3-cinasas, (v)
fosforilación de las cadenas KARAP/DAP12 que translucen el receptor
asociado o CD3zeta o FcRgamma, (vi) secreción de citocina tal como
interferón gamma, factores de la necrosis tumoral, IL5, IL10,
quimiocinas (tal como MIP-1alfa); TGFbeta, (vii)
regulación por aumento o disminución de las moléculas de la
superficie de las células NK, tales como CD69 y PEN5
respectivamente.
Ejemplos de anticuerpos aislados preferidos de
la invención incluyen los anticuerpos aislados que están dirigidos
contra por lo menos un compuesto de aminoácidos aislado de la
invención y que pueden provocar un aumento de por lo menos
aproximadamente 4, preferentemente por lo menos aproximadamente 5,
más preferentemente por lo menos aproximadamente 6 veces, en la
citotoxicidad natural activada por una célula NK colocada en
presencia de una célula diana en una proporción 1:1.
Los anticuerpos aislados más preferidos de la
invención están dirigidos contra por lo menos un compuesto de
aminoácidos aislado de la invención, no se unen a ninguna molécula
de la superficie de los linfocitos T o B y pueden provocar un
aumento de por lo menos aproximadamente 4, preferentemente por lo
menos aproximadamente 5, más preferentemente por lo menos
aproximadamente 6 veces, en la citotoxicidad natural activada por
una célula NK colocada en presencia de una célula diana en una
proporción 1:1.
Los anticuerpos aislados más preferidos de la
invención incluyen los anticuerpos monoclonales. Varios ejemplos de
dichos anticuerpos monoclonales se describen en el apartado
"Ejemplos" a continuación (véase por ejemplo los anticuerpos
monoclonales AZ20; A76 y Z25). El hibridoma que produce el
anticuerpo monoclonal AZ20 de la invención se ha depositado el 8 de
noviembre de 2000 en la C.N.C.M. (C.N.C.M. Collection Nationale de
Microorganismes; Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux;
F-75724 París Cedex 15; Francia): el nº de
depósito en la C.N.C.M. es I-2576. La invención se
refiere de este modo al anticuerpo monoclonal aislado que es
producido por el hibridoma I-2576.
Cualquier anticuerpo aislado de la invención
puede estar acoplado a cualquier marcador apropiado con fines de
observación. Dichos marcadores incluyen por ejemplo los marcadores
fluorescentes, los marcadores radioactivos y los marcadores
enzimáticos.
La presente invención se refiere también a
cualquier hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal de la
invención.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
pueden prepararse utilizando cualquier técnica que proporcione la
producción de moléculas de anticuerpo por estirpes celulares
continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero no se limitan a, las
técnicas originales de Köhler y Milstein, Nature,
265:495-497 (1975), modificadas tal como se
describe en Anderson et al., J. Immunol. 143:1899
(1989). Como inmunógeno, es apropiado cualquier compuesto
aminoácidos de la invención.
Los procedimientos de cribado que pueden
utilizarse para cribar células de hibridoma que producen anticuerpos
contra NKp30 incluyen, pero no se limitan a (1) ensayo de
inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA), (2) inmunoprecipitación
o (3) análisis de clasificación de células fluorescentes activadas
(FACS). Muchos ELISAS diferentes que pueden utilizarse para
identificar anticuerpos monoclonales anti-NKp30
pueden ser previstos por los expertos en la materia.
El cribado inicial se realiza preferentemente
mediante el cribado de sobrenadantes de hibridoma por citometría de
flujo para su reactividad con células NK, pero no con linfocitos T,
y monocitos. La caracterización adicional de los hibridomas puede
realizarse ensayando en poblaciones purificadas de células linfoides
y no linfoides mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta y
citometría de flujo, sustancialmente tal como se describe en los
Ejemplos en la presente memoria. Los anticuerpos monoclonales que
reconocen un epítopo de NKp30 reaccionarán con un epítopo que está
presente en un alto porcentaje de células NK por ejemplo, por lo
menos aproximadamente del 70 al 90%, por ejemplo aproximadamente el
80%, de dichas células, pero no reaccionará significativamente con
los linfocitos T de CD3^{+} o con los linfocitos B de CD20^{+}.
En las formas de realización preferidas, el anticuerpo será también
no reactivo con monocitos, granulocitos, plaquetas y glóbulos
rojos.
Los anticuerpos monoclonales que compiten con
dichos anticuerpos en ensayos de competencia bien conocidos por los
expertos en la materia son probablemente para reconocer
esencialmente los mismos epítopos.
Uno de los hibridomas seleccionados se ha
seleccionado y clonado, el anticuerpo resultante puede ser producido
por una de las dos vías principales. El anticuerpo monoclonal más
puro es producido por cultivo in vitro del hibridoma deseado
en un medio adecuado durante un periodo de tiempo adecuado, seguido
de la recuperación del anticuerpo deseado del sobrenadante. El
periodo de tiempo y el medio son conocidos o pueden determinarse
fácilmente. Esto en la técnica in vitro produce esencialmente
anticuerpo monoclonal monoespecífico, exento esencialmente de otras
especies de inmunoglobulina anti-humana. Sin
embargo, el procedimiento in vitro puede no producir una
cantidad o concentración suficiente de anticuerpo para algunos
fines, ya que la cantidad de anticuerpo generada es solamente de
aproximadamente 50 \mug/ml.
Para producir una cantidad mucho mayor de
anticuerpo monoclonal, puede inyectarse el hibridoma deseado en un
animal, tal como un ratón.
Preferentemente, los ratones están
isotrasplantados o semisotrasplantados con la cepa de la que se
obtiene el anticuerpo monoclonal que produce hibridomas. La
inyección del hibridoma produce la formación de tumores que
producen anticuerpos después de un periodo de incubación adecuado,
que producirá una concentración elevada del anticuerpo deseado
(aproximadamente 5 a 20 mg/ml) en la ascitis del animal
hospedador.
Las moléculas de anticuerpo pueden purificarse
por técnicas conocidas por ejemplo por inmunoabsorción o
cromatografía por inmunoafinidad, procedimientos cromatográficos
tales como la cromatografía líquida de alta resolución o una
combinación de las mismas.
Siguiendo estos protocolos, cualquier experto en
la materia en esta área de la tecnología puede aislar fácilmente
hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la invención, y
en particular un anticuerpo monoclonal que presenta especificidad
para NKp30. Los ejemplos de dichos hibridomas están descritos en el
apartado "Ejemplos" a continuación y el hibridoma que produce
el anticuerpo monoclonal AZ20 descrito se ha depositado en la
C.N.C.M. el 8 de noviembre de 2000 (nº de depósito en la C.N.C.M.:
I-2576). Se contempla de este modo que la presente
invención comprende algunos de dichos hibridomas y algún anticuerpo
monoclonal que puede obtenerse a partir de su sobrenadante. La
invención da a conocer en particular cualquier anticuerpo monoclonal
que presenta las características anti-NKp30
deseadas y principalmente cualquier anticuerpo monoclonal:
- (i)
- inmunizando un animal contra un compuesto de aminoácidos que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica en toda su longitud a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5 y SEC. ID. nº 6, las secuencias de aminoácidos de cualquier fragmento inmunógeno de las mismas y la secuencia SEC. ID. nº 17,
- (ii)
- produciendo hibridomas de las células del bazo de este animal y cultivándolas para producir anticuerpos monoclonales en sus sobrenadantes del cultivo,
- (iii)
- evaluando en los sobrenadantes la presencia de un anticuerpo que se une al compuesto de aminoácidos que se ha utilizado en la etapa (i) como inmunógeno,
- (iv)
- seleccionando y clonando los hibridomas que producen el anticuerpo deseado,
- (v)
- recuperando el anticuerpo monoclonal del sobrenadante por encima de dichos clones.
Siguiendo este procedimiento, principalmente
cuando se utiliza la SEC. ID. nº 17 en la etapa (i) como inmunógeno,
existe una probabilidad muy alta de éxito en la producción de
varios de los hibridomas deseados. Los hibridomas clonados pueden
ser como se desea además cribados y seleccionados para cualquier
propiedad deseada tal como por ejemplo no unirse a ninguna célula
de la sangre periférica excepto a las células NK y/o provocar un
aumento de por lo menos 5 veces en la citotoxicidad natural
desencadenada por una célula NK colocada en presencia de una célula
diana en una proporción 1:1.
La presente invención se refiere a un fragmento
inmunorreactivo aislado definido en la reivindicación 8 y a un
anticuerpo humanizado definido en la reivindicación 10.
En otro aspecto, la invención da a conocer
fragmentos inmunorreactivos aislados de cualquier anticuerpo
seleccionado de entre el grupo constituido por los anticuerpos
aislados y los anticuerpos monoclonales según la invención. Dichos
fragmentos incluyen principalmente los fragmentos de anticuerpo Fab,
F(ab')_{2} y de CDR. El experto en la materia observará
que los anticuerpos humanizados de la invención pueden proceder de
esta memoria como se desea, principalmente cuando se desea
administrarlos a un experto en la materia. La expresión
"Fragmentos inmunorreactivos de un anticuerpo", significa
principalmente en la presente memoria cualquier fragmento de
anticuerpo que comprenda la secuencia de fijación del anticuerpo.
Dichos fragmentos incluyen de este modo los fragmentos
F(ab')_{2} obtenidos ya sea por digestión enzimática de
dicho anticuerpo por enzimas proteolíticas tales como la pepsina o
la papaína y los fragmentos derivados de los mismos por reducción de
los grupos sulfhidrilo situados en las zonas bisagra, conocidos por
cualquier experto. Los fragmentos inmunorreactivos pueden comprender
también una cadena individual recombinante o polipéptidos diméricos
cuya secuencia comprende las zonas de la CDR del anticuerpo de
interés. Las propias zonas de CDR aisladas se contemplan también en
la definición de los fragmentos inmunorreactivos aislados de la
invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a
cualquier soporte sólido en el que está acoplado por lo menos un
anticuerpo aislado o un fragmento inmunorreactivo de la invención.
Cualquier soporte sólido que permita dicho acoplamiento es
apropiado. Particularmente los soportes sólidos apropiados incluyen
microesferas paramagnéticas que pueden utilizarse como matriz de
afinidad tales como Dynabeads de Dynal a.s. (Oslo, Noruega),
microperlas submicroscópicas MACS de Miltenyi Biotec GmbH
(Gladbach, Alemania), sustrato semipermeable constituido por una red
de fibras huecas tal como se describe en la patente US nº
5.763.194, partículas densas que permiten la separación por
sedimentación tal como se describe en la patente US nº
5.576.185.
Una forma de realización ventajosa de estos
soportes sólidos de la invención comprende la presencia, en dichos
soportes, de anticuerpos anti-NKp46 y/o
anti-NKp44, o fragmentos inmunógenos o derivados de
los mismos acoplados además en dicho soporte sólido. Como se
ilustra a continuación, el receptor NKp30 de la invención puede de
hecho cooperar de manera adicional o sinérgica con los receptores de
NKp46 y/o NKp44.
En un aspecto adicional, la invención da a
conocer cualquier composición de tipo anti-antisuero
que es tal como la que se obtiene inmunizando un mamífero con por
lo menos una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido
por las composiciones de tipo antisuero según la invención, los
compuestos de tipo anticuerpo-antígeno aislados de
la invención, los anticuerpos y anticuerpos monoclonales de la
invención, esto es por lo menos una sustancia que está
opcionalmente acoplada a un potenciador de inmunogenicidad y recoger
el anticuerpo producido de este modo. Se refiere asimismo a
anticuerpos aislados y anticuerpos monoclonales que pueden reconocer
en una reacción de tipo anticuerpo-antígeno por lo
menos un compuesto aminoácidos aislado de la invención y a las
composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos.
Los productos de la invención pueden utilizarse
de varias maneras. Las maneras ventajosas incluyen las aplicaciones
medicinales de los mismos. NKp30 es expresado de manera selectiva
por todas las células NK, tanto las recién aisladas como las
cultivadas en presencia de una, dos o múltiples citocinas tales como
IL-2, IL-12, IL-15,
ligando FLT-3, SCF, representando de este modo un
marcador óptimo para la identificación de células NK. La presente
invención permite principalmente al experto en la materia llevar a
cabo un procedimiento para detectar y/o cuantificar la presencia de
células NK en una muestra biológica, que comprende la detección y/o
cuantificación de las moléculas NKp presentes en dicha muestra. Los
procedimientos de la invención comprenden principalmente:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La presente invención permite asimismo al
experto en la materia llevar a cabo un procedimiento para la
eliminación selectiva de células NK de una muestra biológica que
comprende la eliminación selectiva de las células que son NKp30+.
Dicho procedimiento comprende principalmente:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La presente invención permite asimismo al
experto en la materia llevar a cabo un procedimiento para la
purificación positiva y selectiva de células NK en una muestra
biológica, que comprende la purificación positiva y selectiva de
las células que son NKp30^{+}. Dicho procedimiento comprende
principalmente:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
De este modo, la invención refiere asimismo a
cualquier kit para detectar, cuantificar, eliminar y/o purificar
positivamente células NK en una muestra biológica que comprende por
lo menos dicho objeto (respectivo), estando dicho objeto contenido
en un recipiente.
Para la ejecución de los procedimientos de la
invención, las muestras biológicas apropiadas incluyen sangre
periférica, plasma, aspirados de médula ósea, tejidos linfoides, así
como las células aisladas procedentes de la citaféresis,
plasmaféresis y de recogida de fluidos tales como los fluidos
sinovial, cerebroespinal, broncoalveolar y peritoneal.
En un aspecto particularmente ventajoso, la
presente invención se refiere a un procedimiento para la
estimulación in vitro de la citotoxicidad de células NK, que
comprende:
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- Dicha puesta en contacto se realiza para que permita la reticulación de NKp30 en dichas células NK (reticulación de un compuesto en la superficie de dichas células NK que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica en toda su secuencia a las SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5 y las variantes conservadoras de las mismas). Una forma de realización preferida de la reticulación incluye la puesta en contacto de dichas células NK en condiciones fisiológicas con por lo menos un soporte sólido de la invención en el que dicho objeto seleccionado por lo menos (por ejemplo anticuerpos anti-NKp30) se inmoviliza utilizando concentraciones de saturación de este objeto. La reticulación del receptor NKp30 de hecho provoca la estimulación de la actividad de las células NK. Cuando se desea conseguir un equilibrio de la regulación de la actividad de las células NK neto a favor de la estimulación, el experto en la materia seleccionará de este modo las condiciones que favorecen de manera significativa la reticulación de NKp30. Dichas condiciones incluyen principalmente la utilización de los compuestos cuya naturaleza permite una reticulación. Los productos listados en el grupo anterior corresponden a ejemplos de dichos compuestos o permiten la construcción de los mismos. Dichas condiciones pueden incluir también la utilización de dichos compuestos de reticulación en dichas cantidades y principalmente en una densidad tal (por ejemplo concentración de saturación) que dicha regulación se equilibra más fuertemente a favor de la estimulación de la citotoxicidad de las células NK. La estimulación puede realizarse in vitro.
- \quad
- El procedimiento de estimulación de la invención no requiere de manera ventajosa las etapas convencionales de incubación de células NK en interleucinas tales como IL-2, IL-12 e IL-15. Estas etapas, desde luego, no están sin embargo excluidas: el experto en la materia puede seleccionar añadir estas etapas convencionales al procedimiento de la invención. La presente invención se refiere asimismo a cualquier kit para estimular la citotoxicidad de las células NK, comprendiendo por lo menos uno de dichos productos contenidos en un recipiente.
Para la detección, cuantificación, eliminación,
purificación positiva y/o estimulación de la citotoxicidad de las
células NK, dichos procedimientos de la invención pueden comprender
además poner en contacto dicha muestra biológica, o dichas células
NK con unos anticuerpos anti-NKp46 o
anti-NKp44; y dichos kits pueden comprender además
anticuerpos anti-NKp46 o anti-NK44.
La presente invención se refiere de este modo a cualquier kit para
estimular la citotoxicidad de células NK que comprende por lo menos
un producto seleccionado de dicho grupo, estando por lo menos dicho
producto contenido en un recipiente. Dicho kit puede comprender
además uno o varios anticuerpos seleccionados de entre el grupo
constituido por anticuerpos anti-NKp46 y anticuerpos
anti-NKp44.
De manera ventajosa, el procedimiento de
purificación de la invención puede simultáneamente realizar una
activación de células NK y viceversa. La purificación positiva
simultánea de células NK y la forma de realización de estimulación
citotóxica de células NK de la invención es de particular interés
cuando se aplica a muestras biológicas, y particularmente a
muestras que proceden de persona(s) y significa volver a
administrar a un paciente humano tras el tratamiento.
Alternativamente, la presente invención da a
conocer también un procedimiento para inhibir la citotoxicidad de
células NK, que comprende poner en contacto dichas células NK en
condiciones fisiológicas por lo menos con un compuesto:
- (a)
- capaz de inhibir la fijación de ligandos naturales NKp30 a receptores NKp30 expresados en dichas células NK, por ejemplo enmascarando secuencias de fijación de NKp30 y/o capaces de inhibir la reticulación de los receptores NKp30 expresados por dichas células NK, y/o
- (b)
- capaces de inhibir las interacciones entre las moléculas NKp30 expresadas por dichas células NK y sus elementos de transducción, principalmente CD3\zeta. Este procedimiento puede realizarse in vivo o in vitro según se desee.
Los compuestos según (a) comprenden
principalmente los fragmentos inmunorreactivos de la invención (por
ejemplo fragmentos Fab; F(ab')_{2}). Los anticuerpos
monoclonales solubles NKp30 de varios isotipos (IgM y
preferentemente IgG) o los fragmentos divalentes o monovalentes
inmunorreactivos de los mismos pueden utilizarse a concentraciones
de saturación correspondientes a un exceso de 10 veces su constante
de disociación respectiva para enmascarar NKp30 expresado en las
células NK.
Los compuestos según (b) comprenden
principalmente los compuestos capaces de inhibir las interacciones
entre el aminoácido cargado de la transmembrana de NKp30
(aminoácido R en la posición 143 en la SEC. ID. nº: 1) y dichos
elementos de transducción. Dichos compuestos de (b) pueden
corresponder principalmente a una molécula liposoluble capaz en
condiciones fisiológicas de fijarse a la zona de la transmembrana de
NKp30 (posición 138 a 157 de la SEC. ID. nº: 1) con el fin de
inhibir o bloquear los grupos funcionales (fijación a CD3\zeta)
de dicho aminoácido cargado de la transmembrana (R en la posición
143). Condiciones fisiológicas, significa en la presente memoria
las condiciones in vivo o las condiciones in vitro que
simulan las condiciones in vivo. La invención da a conocer
también algún kit para la inhibición de la citotoxicidad de las
células NK que comprende por lo menos dicho producto, por ejemplo
un fragmento inmunorreactivo según la invención. La presente
invención se refiere a un procedimiento definido en la
reivindicación 22 y a un kit definido en la reivindicación 23.
Los procedimientos de la presente invención para
la detección/cuantificación/selectiva/eliminación/positiva y la
purificación selectiva de células NK de una muestra biológica, y
para la estimulación de la citotoxicidad de las células NK puede
comprender además la puesta en contacto de dicha muestra o de las
células NK respectivamente, con compuestos capaces en dichas
condiciones de estimular la actividad de receptores NK aparte de
NKp30 y que puede funcionar además de con NKp30, o en sinergia con
el mismo, por ejemplo los receptores NKp46 y/o NKp44. La
estimulación puede conseguirse por ejemplo mediante la utilización
de compuestos capaces en dichas condiciones de reticular dichos
otros receptores de NK, principalmente NKp46 y/o NKp44.
Lo contrario, desde luego, aplica al
procedimiento para inhibir la citotoxicidad de las células NK según
la invención, por ejemplo el procedimiento de inhibición de la
invención puede comprender además la utilización de compuestos
capaces de inhibir la actividad de dichos otros receptores de NK,
por ejemplo por inhibición de la fijación del ligando y/o
inhibición de la fijación del elemento de transducción/efector.
Un aspecto muy útil de la invención corresponde
a un nuevo procedimiento de injerto que comprende poner en contacto
un organismo seleccionado de entre el grupo constituido por una
célula que va a injertarse, un tejido que va a injertarse, un
órgano que va a injertarse y el organismo hospedador con por lo
menos un producto seleccionado de entre el grupo constituido por:
los compuestos de tipo anticuerpo-antígeno aislados
según la invención, los anticuerpos aislados, los soportes sólidos,
los hibridomas según la invención, las células NK que pueden
obtenerse por el procedimiento de purificación de la invención, las
células NK que pueden obtenerse por el procedimiento de
estimulación de la invención. "Injerto" en la presente memoria
comprende también "trasplante". Dicho organismo hospedador
puede ser cualquier mamífero, incluyendo un ser humano.
Este nuevo procedimiento de injerto es
particularmente útil para el aloinjerto, y puede aplicarse por
ejemplo para el injerto de médula ósea/células madre. También es de
particular interés para la inhibición de GvH, o GvT y en particular
para la estimulación de GvL. La esencia del nuevo procedimiento de
injerto de la invención consiste en administrar al paciente células
NK que han sido purificadas en dicho injerto y que han sido
activadas según los procedimientos y los kits de la invención. Esto
se aplica notablemente a injertos hematopoyéticos compatibles o
incompatibles con MHC (células madre de médula ósea/periféricas).
Estas células NK alogénicas activadas pueden, por ejemplo, ser
infundidas por vía intravenosa en el paciente que va a ser
injertado, y preferentemente en un intervalo de tiempo próximo a la
infusión del injerto: al mismo tiempo, y hasta aproximadamente 2
días después. Las cantidades de células NK activadas y la frecuencia
de infusión en los pacientes dependen de la patología.
El nuevo procedimiento de injerto de la
invención es también de particular interés en el tratamiento
antitumoral y/o contra la infección, la prevención, o paliación. En
estos casos, las células NK autólogas de pacientes que padecen
tumores sólidos o líquidos, o de una infección vírica u otro
organismo miao, que han sido purificadas y activadas según los
procedimientos y kits de la invención pueden estar "armadas"
para con el tumor específico y/o la infección, por ejemplo
incubando dichas células NK en presencia de una concentración de
saturación de mAb reactivo para con dicho tumor y/o agente de
infección. Las células NK purificadas, activadas y "armadas"
según la invención pueden inyectarse a continuación por vía
intravenosa a los pacientes. Las cantidades de células NK
"armadas" y la frecuencia de infusión en los pacientes dependen
de la patología.
Estos nuevos procedimientos de injerto de la
invención constituyen de este modo una nueva inmunoterapia basada
en las células NK basada en la activación de las células NK por
activación de NKp30. Los procedimientos de la invención pueden
comprender además la activación conjunta de otros receptores que
pueden funcionar además de con NKp30 o en sinergia con NKp30 tales
como los compuestos de reticulación NKp46 y/o NKp44 a través de
NKp46 y/o NKp44. Por consiguiente, la presente invención se refiere
a las utilizaciones definidas en las reivindicaciones 28 a 30.
La presente invención por consiguiente comprende
también cualquier composición farmacéutica que comprenda por lo
menos un producto seleccionado de entre el grupo constituido
por:
- \quad
- los anticuerpos aislados, los soportes sólidos y los hibridomas según la invención, las células NK aisladas que pueden obtenerse por el procedimiento de purificación de la invención (y en particular las células NK aisladas purificadas del donante del injerto mediante el procedimiento de purificación de la invención), las células NK aisladas que pueden obtenerse por el procedimiento de estimulación de la invención (células NK aisladas de cuya citotoxicidad ha sido estimulada mediante el procedimiento de estimulación de la invención), junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Dichas células NK aisladas pueden recogerse de
un ser humano, y en particular del donante del injerto (cuando se
desea administrar la composición farmacéutica a un organismo
hospedador que recibe el injerto) o de un paciente quien tiene un
tumor tal como principalmente un melanoma (cuando se desea
administrar la composición farmacéutica, tal como un fármaco
antitumoral, al paciente). Dichas composiciones farmacéuticas de la
invención pueden comprender además de manera ventajosa anticuerpos
anti-NKp46 y/o anti-NKp44, o
fragmentos inmunógenos de derivados de los mismos. Las
composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse como
fármaco. Una variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables
están disponibles para el experto en la materia; la selección de
uno apropiado depende principalmente de la forma galénica y de la
vía de administración deseada. La expresión "composiciones
farmacéuticas" de este modo significa en la presente memoria
cualquier forma galénica tal como un comprimido, polvo, pastillas,
parches, gránulos, microgránulos, nanopartículas, solución coloidal,
solución acuosa, soluciones inyectables, atomizadores o liposomas.
La vía de administración para las modalidades terapéuticas in
vivo puede incluir la vía intradérmica, intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa, o la inyección subcutánea, la vía
intranasal y la vía quirúrgica. La forma galénica puede corresponder
también a formas de liberación lenta y/o controlada.
Dicho por lo menos un producto ha de ser
formulado propiamente para que sea tolerado y eficaz para el
paciente al que se administrará dicha composición. Dichas
formulaciones propias son bien conocidas por el experto en la
materia; cuando el paciente es un ser humano, éstas incluyen por
ejemplo la humanización de miméticos híbridos de dicho producto.
Puede también incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable de
cuya solubilidad y/o propiedades químicas y/o galénicas se adapta a
la vía de administración deseada y al nivel de eficacia pretendido.
Dichos vehículos pueden por ejemplo incluir soluciones salinas o de
dextrosa. La composición de la invención puede comprender también
además cualquier tampón y/o cualquier compuesto estabilizante que el
experto en la materia encontraría apropiado al caso. La dosis
eficaz de por lo menos dicho producto estará en función del producto
específico empleado, de la presencia y naturaleza del o de los
reactivo(s) terapéutico(s) adicional(es) o
sinérgico(s) (por ejemplo los anticuerpos
anti-NKp46 y anti-NKp44 o fragmentos
o derivados de los mismos), del paciente y de su estado clínico.
Una dosis eficaz por lo general oscila entre 1 ng y 100 mg/kg de
peso corporal.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden por
ejemplo estar dirigidas a la mejora del injerto/trasplante, para la
prevención, paliación, terapia antitumoral, tales como prevención,
paliación, terapia para melanoma, hepatocarcinoma, adenocarcinoma
pulmonar, para la prevención, la paliación, la terapia
antimicrobiana, tal como la prevención, paliación y terapia
antivírica. El término "Paliación", en la presente memoria
significa cualquier resultado biológico que corresponda a una
mejora de la salud del paciente; esto principalmente incluye
cualquier ralentización del crecimiento de las células
patológicas.
En un aspecto ventajoso, la composición
farmacéutica de la invención permite una citotoxicidad dirigida de
NK. Dicha composición comprende por lo menos un producto
seleccionado de entre el grupo constituido por:
- \quad
- los anticuerpos aislados, los soportes sólidos y los hibridomas según la invención, las células NK aisladas que pueden obtenerse por el método de purificación de la invención, las células aisladas que pueden obtenerse por el procedimiento de estimulación de la invención, estando dicho producto directa o indirectamente relacionado con una sustancia capaz de unirse en condiciones fisiológicas a la diana deseada,
- \quad
- junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Ejemplos de dicha sustancia de dirección
incluyen los anticuerpos antitumorales, los anticuerpos contra
microorganismos, los anticuerpos antivíricos y los equivalentes
funcionales de los mismos. Dicha composición farmacéutica para la
citotoxicidad dirigida de NK está dirigida más específicamente a la
prevención, paliación, terapia antitumoral (por ejemplo melanomas,
hepatocarcinoma o adenocarcinoma pulmonar) y a la prevención,
paliación y terapia antimicrobianas.
La presente invención da a conocer también un
procedimiento para identificar los ligandos naturales NKp30. Este
procedimiento comprende la utilización de los anticuerpos, de los
fragmentos de anticuerpo o de los soportes sólidos según la
invención o las células NK. La presente invención permite de este
modo el cribado de bancos químicos y/o biológicos para miméticos
y/o antagonistas para los ligandos naturales de NKp30.
Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpo y
los soportes sólidos según la invención permiten también la
evaluación del nivel del ligando NKp30 superficial expresado por una
célula diana sensible a NK, y la comparación de este nivel medido
con la del patrón fisiológico. Esta evaluación es de especial
interés para el diagnóstico de células tumorales y/o células
infectadas por microorganismos y la prescripción de herramientas de
prevención, paliación y terapia apropiadas. Los anticuerpos, los
fragmentos de anticuerpo, los soportes sólidos de la invención
pueden por consiguiente utilizar reactivos para el diagnóstico del
tumor o de la infección.
Estas y otras características y ventajas de la
invención se pondrán de manifiesto a partir de los ejemplos
siguientes. Estos ejemplos se proporcionan a título ilustrativo
únicamente, y de ninguna manera pretenden restringir el alcance de
la presente invención. Las formas de realización alternativas
pretendidas por cualquier experto en la materia estarán
comprendidas en la presente invención.
En estos ejemplos, se hace referencia a las
figuras 1A a 9B (19 hojas con dibujos):
- Las figuras 1A, 1B y 1C ilustran la activación
de la actividad citolítica mediada por NK provocada por tres nuevos
mAb según la invención (mAb anti-NKp30).
- \quad
- En la Figura 1A, se analizó una población representativa de células NK policlonales (% de liberación específica de ^{51}Cr) para la actividad citolítica en un ensayo de destrucción redirigido contra la estirpe de células diana P815 positiva a Fc\gammaR en ausencia o en presencia de los mAb c127 (anti-CD16), BAB281 (anti-NKp46), Z231 (anti-NKp44), AZ20, A76, Z25 (anti-NKp30 mAb) y c218 (anti-CD56). La relación E/T (efector:diana) utilizada fue 1:1.
- \quad
- En la Figura 1B, se analizó el clon 3M16 de NK representativo (% de liberación específica de ^{51}Cr) en un ensayo de destrucción redirigido contra las células diana P815 (relación E/T 1:1) en presencia de cantidades graduales de los mAb AZ20 (cuadrados negros), c127 (anti-CD16) (triángulos blancos) o c128 (anti-CD56) (círculos blancos). Todos los mAb utilizados son del isótopo de IgG1.
- \quad
- En la Figura 1C, se analizó la movilización de [Ca^{++}]i en el clon 3M16 ([Ca^{++}]i nM en función del tiempo en segundos) en presencia de mAb AZ20 seguido del segundo reactivo anti-ratón de cabra (GAM). La referencia negativa está representa por las células tratadas con GAM solo.
- Las figuras 2A y 2B ilustran el análisis
citofluorométrico de las células NK, policlonales o clonales, en
reposo o activadas.
- \quad
- En la figura 2A, las poblaciones de las células NK policlonales, procedentes de donantes AM y CB (líneas del gráfico horizontal superiores y medias) y las células NK recién aisladas, procedentes del donante CB (líneas del gráfico horizontales inferiores), se analizaron por inmunofluorescencia y análisis FACS utilizando c218 (anti-CD56; segunda columna vertical), BAB281 (anti-NKp46; tercera columna vertical del gráfico) o AZ20 (anti-NKp30; última columna vertical del gráfico los mAb seguido de IgG1 anti-ratón de cabra conjugada con PE. La referencia (primera columna vertical del gráfico) está representada por las células incubadas con el segundo reactivo solo.
- \quad
- En la figura 2B, los clones de las células NK, procedentes del donante CB, se analizaron por inmunofluorescencia y análisis FACS utilizando los mAb BAB281 (anti-NKp46; columna media vertical del gráfico) o AZ20 (anti-NKp30; columna vertical a mano derecha del gráfico) seguidos por IgG1 anti-ratón de cabra conjugada con PE (las referencias están representadas en la columna vertical del gráfico a mano izquierda).
- Las figuras 3A y 3B ilustran el modelo de
expresión de NKp30 en los linfocitos de la sangre periférica y en
el análisis por transferencia Western.
- \quad
- En la figura 3A, los linfocitos de la sangre periférica recién aislados, procedentes de un donante representativo, se analizaron por inmunofluorescencia de dos colores y análisis FACS con mAb AZ20 en combinación con GPR 165 (IgG2a, anti-CD56). Los mAb KD1 (IgG2a, anti-CD16), JT3A (IgG2a, anti-CD3), D1-12 (IgG2a, anti-HLA-DR), KL247 (IgM, anti-NKp46) seguidos por FITC específico para isótopos o los segundos reactivos anti-ratón de cabra conjugados con PE (gráficos en izquierda superior y derecha, izquierda en la mitad y derecha e izquierda inferior). Se muestra también (a la derecha más abajo) la inmunofluorescencia doble con dos mAb anti-NKp46 de diferentes isotipos (KL247, IgM frente a BAB281, IgG1). Las representaciones del contorno se dividieron en cuadrantes que representan células no teñidas (izquierda inferior), células con sólo fluorescencia roja (izquierda superior), las células con fluorescencia roja y verde (derecha superior) y las células con sólo fluorescencia verde (derecha inferior).
- \quad
- En la figura 3B, las proteínas integrales de la membrana procedentes de Daudi (linfoma de Burkitt, referencia negativa) y de una población de células NK policlonal se analizaron en un SDS-PAGE al 11% en condiciones no reductoras y se sondaron con el mAb AZ20. Los marcadores de peso molecular (kDa) se indican a la izquierda.
- Las figuras 4A y 4B ilustran estas funciones
de NKp30 como activador.
- \quad
- En la figura 4A, se analizó la actividad citolítica (% de liberación de ^{51}Cr específica) de los linfocitos NK de la sangre periférica recién aislados, procedentes de un donante representativo, en un ensayo de destrucción redirigido contra la estirpe de células diana P815 positivas para Fc\gammaR en ausencia o en presencia de los mAb c127 (anti-CD16), BAB281 (anti-NKp46), AZ20, A76, Z25 y c218 (anti-CD56). La relación E/T utilizada fue 20:1.
- \quad
- En la figura 4B, en las células NK de la sangre periférica recién aisladas se analizó la actividad citolítica contra las estirpes celulares de melanoma I-negativas de clase HLA/negativa/- Fc\gammaR indicadas en ausencia o presencia de mAb para las moléculas indicadas: se utilizaron los mAb c218 (anti-CD56), AZ20 (anti-NKp30), BAB281 (anti-NKp46). La relación E/T fue 20:1.
- La figura 5 ilustra la implicación de NKp30 y
NKp46 en la lisis de la célula tumoral mediada por los clones de la
célula NK. En tres clones de la célula NK se analizó la actividad
citolítica contra MEL15, M14, SMMC y las estirpes de la célula
diana negativa para A549 Fc\gammaR en ausencia (barras blancas) o
en presencia de los mAb AZ20 (anti-NKp30; barras
negras), BAB281 (anti-NKp46; barras listadas) o
tanto AZ20 como BAB281 (barras listadas). La relación E/T fue
4:1.
- Las figuras 6A y 6B ilustran que NKp30 coopera
con NKp46 y NKp44 en la provocación de citotoxicidad mediada por NK
contra las células diana autólogas tumorales o normales.
- \quad
- En la figura 6A, se analizó la actividad citolítica (% de liberación de ^{51}Cr específica) del clon MIL69 de NK representativo contra FO-1 o las líneas de las células diana negativas para A549 Fc\gammaR en ausencia o presencia de los mAb para las moléculas indicadas. Se utilizaron los siguientes mAb: KL247 (anti-NKp46), AZ20 (anti-NKp30), KS38 (anti-NKp44). Las relaciones de E/T fueron: 2:1 (FO-1) y 3:1 (A549).
- \quad
- En la figura 6B, se analizó la actividad citolítica en los clones de las células NK (MX361 y P9) (% de liberación específica de ^{51}Cr) contra PHA Blasts autólogos en ausencia (barras blancas) o en presencia de los mAb para las moléculas indicadas (barras negras). Los mAb utilizados fueron A6-136 (anti-HLA clase I), KL247 (anti-NKp46), KS38 (anti-NKp44), AZ20 (anti-NKp30). La relación E/T fue de 10:1.
- Las Figuras 7A, 7B y 7C ilustran el análisis
citofluorimétricos de las moléculas NKp30 expresadas en
transfectados de células COS-7; la secuencia de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 2) y la representación de la hidrofobia de
NKp30.
- \quad
- En la figura 7A, las células COS-7, transfectadas con el montaje de ADNc del clon 5C se tiñeron con anti-NKp30 (de izquierda a derecha: A76, AZ20 y Z25) o con el mAb anti-NKp46 (BAB 281) seguido de IgG1 anti-ratón de cabra conjugada con PE y analizado por citometría de flujo. Los perfiles blancos representan células incubadas con el segundo reactivo solo (es decir, referencias negativas).
- \quad
- En la figura 7B, el péptido señal (SEC. ID. nº: 3) se indica en letras minúsculas, la zona de la transmembrana (SEC. ID. nº: 5) está subrayada. La secuencia de la zona extracelular de NKp30 (SEC. ID. nº: 4) corresponde a la secuencia dada entre el péptido de señal y la zona de la transmembrana. La secuencia de la zona intracelular NKp30 (SEC. ID. nº: 6) corresponde a la secuencia dada después (C-terminal) de la secuencia de la transmembrana. Las cisteínas implicadas en el pliegue de tipo Ig están dentro de círculos, las supuestas secuencias de N-glucosilación están encasilladas. En la parte inferior se presenta la representación de hidrofobia de Kyte-Doolittle. Los análisis del ADN y de la secuencia de proteínas se realizaron utilizando GeneWorks, series de MacVector, NetOGlyc 2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc) y PSORT Prediction Servers (www.psort.nibb.ac.jp:8800/).
- \quad
- En la figura 7C, está representada la secuencia de ADNc de NKp30 (SEC. ID. nº: 1). La secuencia de codificación de NKp30 va desde la posición 64 hasta la posición 636 (SEC. ID. nº: 13). La sonda de ADNc de 421 bp (SEC. ID. nº: 10) para NKp30 corresponde a la secuencia dada desde la posición 57 a la posición 477 de la SEC. ID. nº: 1. El ADNc de 606 bp (SEC. ID. nº: 12) ampliado a partir de NKp30 para la clonación en pCR2.1 corresponde a la secuencia dada desde la posición 57 hasta la posición 662 de la SEC. ID. nº: 1.
- Las figuras 8A y 8B ilustran el análisis por
transferencia Northern de la expresión del transcrito NKp30 y el
análisis por inmunotransferencia Zoo.
- \quad
- En la figura 8A, se aisló ARN completo de las células de diferente origen. Bandas 1 y 2: poblaciones policlonales de células NK; banda 3: blanco; banda 4: estirpe celular NK (NKL); banda 5: estirpe celular NK (NK3.3); banda 6: monocitos humanos; banda 7: estirpe celular de linfoma histiocítico (U937); banda 8: estirpe celular de linfoma T (Jurkat); banda 9: estirpe celular de leucemia promielocítica aguda (HL60); banda 10: estirpe de linfocitos B transformados por EBV (LCL721.221). Diez microgramos de cada preparación de ARN (2 microgramos de poli A^{+} ARN procedente de las bandas 1 y 2 de las poblaciones de células NK policlonales) se hibridaron con la sonda de ADNc de NKp30 de 421 bp. Las posiciones de las subunidades 28S y 18S del ADN ribosómico se indican a la izquierda.
- \quad
- En la figura 8B, una transferencia Southern que contiene ADN genómico procedente del ser humano, macaco Rhesus, rata Sprague-Dawley, ratón BALB/c, perro, vaca, conejo, pollo y levadura Saccharomyces cerevisiae se hibridó en condiciones de baja severidad con la sonda de ADNc de NKp30 de 421 bp.
- Las figuras 9A y 9B ilustran el análisis
bioquímico del complejo receptor de NKp30 mediante la utilización
de un antisuero específico.
- \quad
- En la figura 9A, las proteínas de la membrana completas procedentes de Daudi (como referencia negativa) y de la población de células NK policlonales se analizaron en un SDS-PAGE al 11% en condiciones no reductoras y se sondaron con antisuero de conejo específico para NKp30 (I). Los marcadores de peso molecular (kDa) están indicados a la izquierda.
- \quad
- En la figura 9B, los lisados celulares con Digitonina al 1% procedentes de una población de células NK policlonal sin tratar (-) o tratada (+) con pervanadato sódico, se inmunoprecipitaron con mAb Z231 (anti-NKp44), mAb BAB281 (anti-NKp46), antisuero de conejo específico para NKp30 (I) y suero de conejo pre-inmunitario (pI). Se analizaron las muestras en un SDS-PAGE al 15% en condiciones reductoras y se sondaron con anti-fosfotirosina (anti-PTyr) o mAb anti-CD3\zeta (anti-\zeta). Las cadenas ligeras de Ig (Ig(L)), CD3\zeta fosforilado con Tyr (P-\zeta), KARAP/DAP12 fosforilado con Tyr (P-KARAP/DAP12) y la forma no fosforilada de CD3\zeta están indicadas por flechas. Los marcadores de peso molecular (en kDa) se indican a la derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mAb siguientes se produjeron en el
laboratorio de los autores: JT3A (IgG2a, anti-CD3),
BAB281 (Sivori, S., M. Vitale, L. Morelli, L. Sanseverino, R.
Augugliaro, C. Bottino, L. Moretta y A. Moretta. 1997. p46, a novel
Natural Killer cell-specific surface molecule which
mediates cell activation. J. Exp. Med. 186:
1129-1136) y KL247 (IgG1 e IgM, respectivamente,
anti-NKp46), Z231 (Vitale, M., C. Bottino, S.
Sivori, L. Sanseverino, R., Castriconi, R. Marcenaro, R.
Augugliaro, L. Moretta y A. Moretta. 1998. NKp44, a novel triggering
surface molecule specifically expressed by activated Natural Killer
cells is involved in non-MHC restricted tumor cell
lysis. J. Exp. Med. 187:2065-2072) y KS38
(IgG1 e IgM, respectivamente, anti-NKp44), KD1 y
c127 (IgG2a e IgG1, respectivamente, anti-CD16),
c218 y GPR165 (IgG1 e IgG2a, respectivamente,
anti-CD56), A6-136 (IgM,
anti-HLA de clase I) (Ciccone E., D. Pende, M.
Vitale, L. Nanni, C. Di Donato, C. Bottino, L. Morelli, O. Viale,
A. Amoroso, A. Moretta y L. Moretta. 1994. Self Class I molecules
Protect normal cells from lysis mediated by autologous Natural
Killer Cells. Eur. J. Immunol. 24:1003-1006),
GL183 (IgG1, anti-p58.2) (Moretta, A., G. Tambussi,
C. Bottino, G. Tripodi, A. Merli, E. Ciccone, G. Pantaleo y L.
Moretta. 1990. A novel surface antigen expressed by a subset of
human CD3-CD16+ Natural Killer cells. Role in cell
activation and regulation of cytolytic function. J. Exp.
Med. 171:695-714), EB6 (IgG1,
anti-p58.1) (Moretta A., C. Bottino, D. Pende, G.
Tripodi, G. Tambussi, O. Viale, A.M. Orengo, M. Barbaresi, A. Merli,
E. Ciccone y L. Moretta. 1990. Identification of four subset of
human CD3-CD16+ NK cells by the expression of
clonally distributed functional surface molecules. Correlation
between subset assignment of NK clones and ability to mediate
specific alloantigen recognition. J. Exp. Med.
172:1589-1598), Z199 (IgG2b),
anti-NKG2A) (Sivori, S., M. Vitale, C. Bottino, E.
Marcenaro, L. Sanseverino, S. Parolini, L. Moretta y A. Moretta,
1996. CD94 functions as a natural killer cell inhibitory receptor
for different HLA-CLASS-I alleles.
Identification of the inhibitory form of CD94 by the use of novel
monoclonal antibodies. Eur. J. Immunol.
26:2487-2492). El mAb 01.12 (IgG2a) y el mAb HP2.6
(IgG2a) se utilizaron como
anti-HLA-DR y
anti-CD4, respectivamente.
Los nuevos mAb procedían en primer lugar
convencionalmente de inmunizar ratones Balb/C de 5 semanas de vida
con células NK (CD3-, CD56+, CD16+) bien clones de NK (EC1 y SA260
para los mAb A76 y Z25 respectivamente) o una población de células
NK policlonales (para el mAb AZ20). Después de diferentes fusiones
celulares, se seleccionaron los mAb por la capacidad de provocar
lisis en ensayos de destrucción redirigidos contra células diana
Fc\gammaR+ P815. Los mAb apropiados incluyen los que provocan un
aumento estadísticamente significativo (p<0,05) en la activación
de las células NK evaluado por (i) toxicidad natural hacia las
dianas negativas MHC de clase I, células tumorales, células
infectadas por virus, células de alotrasplante, (ii) citotoxicidad
hacia células diana recubiertas por anticuerpo, (iii) aumentos en la
concentración intracitoplásmica de Ca^{2+}, (iv) inducción de la
fosforilación con tirosina de moléculas adaptadoras, efectoras
intracitoplásmicas tales como ZAP70, Syk, LAT, SLP76, Shc, Grb2,
fosfolipasa C-enzimas gamma, fosfatidilinositol
3-cinasas, (v) fosforilación de las cadenas
KARAP/DAP12 o CD3zeta o FcR-gamma que translucen el
receptor asociado, (vi) secreción de citocinas tales como
interferón gamma, factores de la necrosis tumoral, IL5, IL10,
quimiocinas (tal como MIP-1alfa), TGFbeta, (vii)
regulación por aumento o disminución de las moléculas de la
superficie de las células NK, tales como CD69 y PENS
respectivamente. Los mAb preferidos provocan por ejemplo un aumento
de por lo menos aproximadamente 5 en la lisis de las células diana
con una proporción efector:diana (E:T) de 1:1 en comparación con la
lisis de las células diana básica realizada por las células NK
efectoras en ausencia de dichos mAb. De este modo se seleccionaron
tres mAb: A76; Z25; AZ20. Un hibridoma que produce AZ20 se ha
depositado en la C.N.C.M. (I-2576) el 8 de
noviembre de 2000.
Los linfocitos de la sangre periférica (PBL)
procedían de donantes sanos por gradientes de
Ficoll-Hipaque y eliminación de las células
adherentes en plástico. A fin de obtener células PBL de NK
enriquecidas se incubaron con los mAb anti-CD3
(JT3A), anti-CD4 (HP2.6) y
anti-HLA-DR (D1.12) (30 min. a 4ºC)
seguido de Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) recubiertas con
anti-ratón de cabra (30 min. a 4ºC) y eliminación
inmunomagnética (Pende, D., L. Accame, L. Pareti, A. Mazzocchi, A.
Moretta, G. Parmiani y L. Moretta. 1998. The susceptibility to
Natural Killer cell-mediated lysis of HLA class
I-positive melanomas reflects the expression of
insufficient amounts of HLA class I alleles. Eur. J.
Immunol. 28:2384-2394; Sivori, S., M. Vitale, L.
Morelli, L. Sanseverino, R. Augugliaro, C. Bottino, L. Moretta y A.
Moretta. 1997. p46, a novel Natural Killer cell- specific surface
molecule which mediates cell activation. J. Exp. Med. 186:
1129-1126; Vitale, M., C. Bottino, S. Sivori, L.
Sanseverino, R. Castriconi, R. Marcenaro, R. Augugliaro, L. Moretta
y A. Moretta. 1998. NKp44, a novel triggering surface molecule
specifically expressed by activated Natural Killer cells is involved
in non-MHC restricted tumor cell lysis. J. Exp.
Med. 187:2065-2072). Se utilizaron células
CD3^{-}4^{-}DR^{-} en ensayos citolíticos o células
alimentadoras cultivadas o irradiadas en presencia de 100 U/ml de
rIL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, USA) y
1,5 ng/ml de PHA (Gibco Ltd, Paisley, Escocia) a fin de obtener
poblaciones de células NK policlonales o, después de la dilución
limitativa), clones de células NK (Moretta, A. 1985. Frequency and
surface phenotype of human T lymphocytes producing
interleukin-2. Analysis by limiting dilution and
cell cloning. Eur. J. Immunol.
151:148-155).
Se tiñeron las células con el mAb apropiado
seguido de segundo reactivo anti-ratón de cabra
específico para el isotipo, conjugado con PE o FITC (Southern
Biotechnology Associated, Birmingham, AL). Se analizaron las
muestras por análisis citofluorimétrico de uno o dos colores
(FACScan Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) como se
describió anteriormente (por ejemplo Moretta A., G. Tambussi, C.
Bottino, G. Tripodi, A. Merli, E. Ciccone, G. Pantaleo y L. Moreta.
1990. A novel surface antigen expressed by a subset of human
CD3-CD16+ Natural Killer cells. Role in cell
activation and regulation of cytolytic function. J. Exp. Med.
171:695-714).
Las dianas negativas a Fc\gammaR utilizadas
fueron las siguientes: MEL15 (MEL15392, melanoma humano) (Pende,
D., L. Accame, L. Pareti, A. Mazzocchi, A. Moretta, G. Parmiani y L.
Moretta. 1998. The susceptibility to Natural Killer cell mediated
lysis of HLA class I-positive melanomas reflects the
expression of insufficient amounts of HLA I alleles. Eur. J.
Immunol. 28:2384-2394); M14 (melanoma humano)
(Pessino, A., S. Sivori, C. Bottino, A. Malaspina, L. Morelli, L.
Moretta, R. Biassoni y A. Moretta. 1998. Molecular cloning of NKp46:
a novel member of the immunoglobulin superfamily involved in
triggering of natural cytotoxicity. J. Exp. Med.
188:953-960); SMMC (hepatocarcinoma humano) (Sivori,
S., D. Pende, C. Bottino, E. Marcenaro, A. Pessino, R. Biassoni, L.
Moretta y A. Moretta. 1999. NKp46 is the major triggering receptor
envolved in the natural cytotoxicity of fresh or cultured human
natural killer cells. Correlation between surface density of NKp46
and natural cytotoxicity against autologous, allogeneic or
xenogeneic target cells. Eur. J. Immunol.
29:1656-1666); A549 (adenocarcinoma pulmonar
humano; ATCC número CCL-185.1); FO-1
y 1174 mel (melanomas humanos); AUMA (melanoma humano).
La diana positiva a Fc\gammaR fue P815
(mastocitoma murino). PHA-Blasts, utilizadas como
células diana normales, se obtuvieron cultivando PBL con 1,5 ng/ml
de PHA (Gibco).
Se determinó la actividad catalítica en las
células en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 h. (como se
describió anteriormente), en ausencia o en presencia de varios mAb
(Moretta A., C. Bottino, D. Pende, G. Tripodi, G. Tambussi, O.
Viale, A.M. Orengo, M. Barbaresi, A. Merli, E. Ciccone y L. Moretta.
1990. Identification of four subset of human
CD3-CD16+ NK cells by the expression of clonally
distributed functional surface molecules. Correlation between
subset assignment of NK clones and ability to mediate specific
alloantigen recognition. J. Exp. Med.
172:1589-1555; Sivori, S., D. Pende, C. Bottino,E.
Marcenaro, A. Pessino, R. Biassoni, L. Moretta y A. Moretta. 1999.
NKp46 is the major triggering receptor involved in the natural
cytotoxicity of fresh or cultured human natural killer cells.
Correlation between surface density of NKp46 and natural
cytotoxicity against autologous, allogeneic or xenogeneic target
cells. Eur. J. Immunol. 29:1656-1666). Las
concentraciones de varios mAb fueron de 10 microgramos/ml para los
experimentos de enmascaramiento y de 0,5 microgramos/ml para los
experimentos de destrucción redirigida. Las relaciones E/T están
indicadas en el texto. Los mAb apropiados incluyen aquellos que
aumentan de manera significativa la actividad citolítica observada
en su ausencia. Ejemplo de dicho aumento significativo apropiado
comprende un aumento de por lo menos aproximadamente 5 veces la
actividad citolítica observada con una relación efector:diana de
1:1 en presencia de dichos mAb en comparación con la actividad
citolítica observada en ausencia de estos mAb.
La determinación de [Ca^{++}]i se
realizó como se describió anteriormente (Poggi A., R. Pardi, N.
Pella, L. Morelli, S. Sivori, M. Vitale, V. Revello, A. Moretta y
L. Moretta. 1993. CD45-mediated regulation of LFA1
function in human natural killer cells. Anti-CD45
monoclonal antibodies inhibit the calcium mobilization induced via
LFA1 molecules. Eur. J. Immunol.
23:2445-2463). Se incubaron células NK marcadas con
Fura-2 durante 30' a 4ºC con cantidades de
saturación de mAb anti-NKp30 (AZ20) o medio solo. La
reticulación de este receptor se obtuvo añadiendo en la cubeta 20
\mug/ml de antisuero anti-ratón de cabra
purificado por afinidad (GAM) (ICN Biomedicals, Aurora, Ohio).
Se prepararon proteínas de la membrana de
células NK íntegras (Bordier, C. 1981. Phase separation of integral
membrane proteins in Triton X-114 solution. J.
Biol. Chem. 256:1604-1606) de la forma
siguiente: se lisaron 25\times10^{6} células en 100 \mul de
tampón TX (tampón de fosfato sódico 20 mM, 1% de Triton
X-114, EDTA 10 mM, pH 8) 30' a 4ºC, se
centrifugaron (5', 10.000 RPM). Se dejó 10' a 37ºC el sobrenadante,
se centrifugó y se volvió a poner en suspensión la fase inferior
1:2 en tampón TX y se dejó 10' a 4ºC a fin de clarificar los
lisados. Se dejó a continuación la suspensión 10' a 37ºC, se
centrifugó y se volvió a poner en suspensión la fase inferior 1:3
en EB (Tris 0,0625, pH 6,8, glicerol al 10%, SDS al 2,3%). Se
analizaron las muestras en SDS-PAGE discontinuo, se
transfirieron a Immobilon P (Millipore Corp, Bedform, MA) y se
sondaron con el mAb AZ20 seguido de HRPO anti-ratón
de conejo (DAKO A/S, Dinamarca) o con antisuero específico para
NKp30 seguido de HRPO anti-conejo de mono
(Amersham, Buckingamshire, UK). Para la detección se utilizó el kit
de quimioluminiscencia Renaissance (NEN, Boston, MA).
Se inmunizó un conejo macho HY/Cr (Charles
River) de 2,5 kg con 100 microgramos/100 microlitros del péptido
WVSQPPEIRTLEGSC de 15 aminoácidos (SEC. ID. nº: 7: desde la posición
20 de aminoácidos a la posición 33 en la secuencia de proteínas de
NKp30 SEC. ID. nº: 2, más un aminoácido C para enlace a KLH)
conjugado con KLH (Pende D., R. Biassoni, C. Cantoni, S. Verdian,
M. Falco, C. Di Donato, L. Accame, C. Bottino, A. Moretta y L.
Moretta. 1996. The Natural Killer cell receptor specific for HLA.A
allotypes: a novel member of the p58/p70 family of inhibitory
receptors that is characterized by three
immunoglobulin-like domains and is expressed as a
140 kD disulphide-linked dimer. J. Exp. Med.
184:505-518). Se realizaron cuatro tratamientos a la
semana, el primero junto con 100 microlitos de adyuvante completo
de Freund y todos los demás con 100 microlitros de adyuvante
incompleto de Freund. Después de una semana a partir del último
tratamiento, se extrajeron de 10 ml de sangre y el suero se analizó
y valoró por ELISA frente al péptido inmunizante y los
irrelevantes.
Se estimularon o no células NK (10^{8}) con
pervanadato sódico 100 microM (Cantoni, C., C. Bottino, M. Vitale,
A. Pessino, R. Augugliaro, A. Malaspina, S. Parolini, L. Moretta, A.
Moretta y R. Biassoni. 1999. NKp44, a triggering receptor involved
in tumor cell lysis by activated human Natural Killer cells, is a
novel member of the immunoglobulin superfamily. J. Exp. Med.
189:787-796) y los lisados de digitonina al 1% se
preclarificaron cinco veces con mAb KD1 acoplado a Sepharose
proteína A (anti-CD16). Los lisados se
inmunoprecipitaron a continuación con Z231 acoplado a
Sepharose-CNBr y los mAb BAB281 o con antisuero de
conejo específico para NKp30 acoplado a Sepharose proteína A y
suero de conejo preinmunitario. Se analizaron las muestras en un
SDS-PAGE al 15% en condiciones reductoras (5% de
2Me), se transfirieron a Immobilon P (Millipore) y se sondaron con
mAb anti-fosfotirosina (PY20-HRPO,
Transduction Laboratories, Lexington, KY) o mAb
anti-CD3\zeta (2H2, Immunotech, Marsella, Francia)
seguido de HRPO anti-ratón de conejo (DAKO). Para
la detección se utilizó el kit de quimioluminiscencia Renaissance
(NEN).
Se preparó el banco de expresión de ADNc en el
plásmido VR1012 (Vical Inc., San Diego, CA), utilizando ARN
extraído de células NK policlonales activadas por
IL-2 obtenidas de dos donantes sanos como se
describió anteriormente (Pessino, A., S. Sivori, C. Bottino, A.
Malaspina, L. Morelli, L. Moretta, R. Biassoni y A. Moretta. 1998.
Molecular cloning of NKp46; a novel member of the immunoglobulin
superfamily involved in triggering of natural cytotoxicity. J.
Exp. Med. 188:953-960, Cantoni, C., C. Bottino,
M. Vitale, A. Pessino, R. Augugliaro, A. Malaspina, S. Parolini, L.
Moretta, A. Moretta y R. Biassoni. 1999. NKp44, a triggering
receptor involved in tumor cell lysis by activated human Natural
Killer cells, is a novel member of the immunoglobulin superfamily.
J. Exp. Med. 189:787-796).
El procedimiento de cribado del banco fue como
se describe (Pessino, A., S. Sivori, C. Bottino, A. Malaspina, L.
Morelli, L. Moretta, R. Biassoni y A. Moretta. 1998. Molecular
cloning of NKp46; a novel member of the immunoglobulin superfamily
involved in triggering of natural cytotoxicity. J. Exp. Med.
188:953-960, Cantoni, C., C. Bottino, M. Vitale, A.
Pessino, R. Augugliaro, A. Malaspina, S. Parolini, L. Moretta, A.
Moretta y R. Biassoni. 1999. NKp44, a triggering receptor involved
in tumor cell lysis by activated human Natural Killer cells, is a
novel member of the immunoglobulin superfamily. J. Exp. Med.
189:787-796, Brakenhoff, R.H., M. Gerretsen, E.M.C.
Knippels, M. van Dijk, H. van Essen, D.O. Weghuis, R.J. Sinke, G.B.
Snow y G.A.M.S. van Dongen. 1995. The human E48 antigen. Highly
homologous to the murine Ly-6 antigen ThB, is a
GPI-anchored molecule apparently involved in
keratinocyte cell-cell adhesion. J. Cell.
Biol., 129:1677-1689). En resumen, el banco de
ADNc se transfirió temporalmente a células COS-7 y
se llevó a cabo la selección de grupos positivos por tinción
inmunocitoquímica utilizando el mAb A76 anti-NKp30
específico y selección con sib.
Se realizó el secuenciado del ADN utilizando el
kit d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing y el
secuenciador automático 377 de Applied Biosystems (Perkin
Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA).
Se transfectaron células COS-7
(5\times10^{5}/placa) con
VR1012-NK-A1 (clon 5C) o con el
vector solo mediante los procedimientos con
DEAE-dextrano o de electroporación descritos (Pende
D., R. Biassoni, C. Cantoni, S. Verdiani, M. Falco, C.Di Donato, L.
Accame, C. Bottino, A. Moretta y L. Moretta. 1996. The Natural
Killer cell receptor specific for HLA.A allotypes: a novel member
of the p58/p70 family of inhibitory receptors that is characterized
by three immunoglobulin-like domains and is
expressed as a 140 kD disulphide-linked dimer.
J. Exp. Med. 184:505-518). Después de 48 h.,
se utilizaron las células transfectadas para el análisis
citofluorimétrico.
A fin de analizar la expresión del transcrito
NKp30 en diferentes estirpes celulares de ARN de origen hemopoyético
se fraccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de
agarosa desnaturalizante y se transfirieron a una membrana de nilón
cargada positivamente (NEN). En particular, 10 \mug de ARN total
preparado utilizando el gradiente de CsCl o 2 \mug de poli
A^{+} ARN preparado utilizando separación de perlas magnéticas con
oligo dT (Dynal) se colocó en cada banda. Se realizaron
inmunotransferencias Northern en condiciones de alta severidad como
se describe (Biassoni, R., S. Ferrini, I. Prigione, A. Moretta y
E.O. Long. 1988. CD3-negative
lymphokine-activated cytotoxic cells express the CD3
epsilon-gene. J. Immunol.
140:1685-1689). La sonda de ADNc de NKp30 de 421 bp
(SEC. ID. nº: 10) se obtuvo por ampliación por PCR llevada a cabo
con 25 pmoles de cada cebador durante 30 ciclos (30 s. a 94ºC, 30
s. a 60ºC, 30 s. a 72ºC), seguido de una incubación de 7 min. a
72ºC. Las secuencias de los cebadores son: CAG GGC ATC TCG AGT TTC
CGA CAT GGC CTG GAT GCT GTT G (NKp30 arriba; SEC. ID. nº: 8) y GAC
TAG GAT CCG CAT GTG TAC CAG CCC CTA GCT GAG GAT G (NKp30 abajo; SEC.
ID. nº: 9). El fragmento de ADNc SEC. ID. nº: 10 estaba marcado con
^{32}P mediante cebado aleatorio (Maniatis, T., E.F. Fritsch
& J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: A laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
El ARN completo extraído utilizando ARNzol
(Cinna/Biotecx, Houston, TX) de poblaciones de NK policlonal y
linfocitos T y clones de diferentes estirpes de células
hemopoyéticas se transcribió a la inversa utilizando cebado con
oligo dT. Los cebadores utilizados para la ampliación con ADNc de
NKp30 (606 bp; SEC. ID. nº: 12) fueron los siguientes: 5' CAG GGC
ATC TCG AGT TTC CGA CAT GGC CTG GAT GCT GTT G (NKp30 arriba; SEC.
ID. nº: 8) y 5' GAT TTA TTG GGG TCT TTT GAA G (cebador inverso;
SEC. ID. nº: 11). La ampliación se realizó con 25 picomoles de cada
cebador durante 30 ciclos (30 s. a 94ºC, 30 s. a 60ºC, 30 s. a
72ºC), seguido de 7 min. de incubación a 72ºC. Los productos de la
ampliación se subclonaron en pCR2.1 mediante el kit de clonación
TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuenciaron
posteriormente.
Se realizó el análisis de conservación cruzada
de especies del gen NKp30 utilizando una
Zoo-inmunotransferencia (Clontech, Palo Alto, CA).
La inmunotransferencia Southern contenía ADN genómico procedente del
hombre, macaco Rhesus, rata Sprague-Dawley, ratón
BALB/c, perro, vaca, conejo, pollo y levadura Saccharomyces
cerevisiae. La sonda de hibridación fue el mismo fragmento de
ADNc de 421 bp (SEC. ID. nº: 10) utilizado para hibridar la
inmunotransferencia Northern. Se realizaron lavados en condiciones
de baja severidad tal como se describe (Maniatis, T., E.F. Fritsch
& J. Sambrook. 1982. Molecular Cloning: A laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Se inmunizaron ratones con clones de células NK
CD3^{-}, 16^{+}, 56^{+} o la mayoría de las poblaciones. Se
seleccionaron en primer lugar los anticuerpos monoclonales de
diferentes fusiones según su capacidad para provocar lisis de las
células diana Fc\gammaR+ P815 en un ensayo de destrucción
redirigido utilizando poblaciones de células NK policlonales o
clones como células efectoras. Se seleccionaron tres mAb A76, AZ20 y
Z25 (todas del isótopo IgG1) que provocaron una fuerte actividad
citolítica (fig. 1A) similar a la provocada por otros mAb
específicos para receptores de NK de activación conocidos incluyendo
CD16, NKp46 y NKp44 (aumento de actividad de más de cinco veces la
actividad citolítica observada en ausencia de los mAb con E:T de
1:1). En la fig. 1B, la citotoxicidad de las células NK provocada
por cantidades graduales del mAb AZ20 se compara con la de los mAb
anti-CD16 o anti-CD56 compatibles
con isótopos. La respuesta citolítica al mAb AZ20 fue paralela a la
provocada por mAb anti-CD16 aunque mAb
anti-CD56 no tuvo ningún efecto. Además, como se
muestra en la fig. 1C, un aumento intracelular agudo de [Ca^{++}]
se detectó en el clon 3M16 representativo tras la estimulación con
el mAb AZ20. Notablemente, los aumentos de [Ca^{++}]i
provocados por este anticuerpo se produjeron solamente en presencia
del segundo reactivo anti-ratón de cabra,
permitiendo la reticulación eficaz del receptor de activación.
El análisis de la distribución en la superficie
celular de la(s) molécula(s) reconocido por los mAb
A76, AZ20 y Z25, se realizó por inmunofluorescencia indirecta y
análisis FACS, puso de manifiesto la reactividad con varias
poblaciones de células NK policlonales o clonales activadas
procedentes de diferentes donantes (véase a continuación). Éstos
incluyeron también los clones de células NK negativas a CD16
infrecuentes. Por el contrario, no se detectó reactividad de mAb
con las poblaciones de linfocitos T policlonales inducidos por PHA o
los clones de linfocitos T, TCR, \alpha/\beta y
\gamma/\delta (procedentes de diferentes donantes). Tampoco se
detectó reactividad con las estirpes de linfocitos B provocada por
EBV, las estirpes monocíticas y DC y diferentes estirpes de células
tumorales hemopoyéticas y no hemopoyéticas incluyendo HL60, U937,
E\sigma/A3, THP-1, Daudi, Jurkat, IGROV y todas
las diversas estirpes de células tumorales que se utilizaron como
células diana.
Los autores demostraron recientemente que las
poblaciones de células NK policlonales procedentes de algunos
donantes se caracterizaban por una distribución bimodal de la
intensidad de fluorescencia de las moléculas NKp46
(NKp46^{brillante} y NKp46^{mate}) y que los clones NK
procedentes de estos individuos expresaban un fenotipo estable de
NKp46^{brillante} o de NKp46^{mate}. Significativamente, la
actividad citolítica de los clones de las células NK contra las
células diana sensibles a NK se correlacionó estrictamente con su
fenotipo de NKp46. Los autores analizaron a continuación la
reactividad de los nuevos mAb en poblaciones de células NK
policlonales y los clones de las células NK se liberan de individuos
que presentan diferentes modelos de expresión de NKp46. Como se
muestra en la fig. 2A, la población de células NK policlonales
procedente del donante AM representativo presentaba un fenotipo
brillante de manera homogénea cuando se teñía con AZ20 o mAb
anti-NKp46. Por el contrario, en las células NK
policlonales procedentes del donante CB, que se tiñen con los
mismos mAb produjo una distribución bimodal de la fluorescencia.
Principalmente, en el donante CB el mismo modelo de intensidad de
fluorescencia fue también detectable en células NK purificadas
recientes (fig. 2A). Además, el análisis de varios clones
procedentes del donante CB, pusieron de manifiesto que los clones
de NKp46^{brillante} eran consecuentemente AZ20^{brillante},
mientras que los clones de NKp46^{mate} siempre presentaban un
fenotipo de AZ20^{mate} (fig. 2B).
A fin de definir más el modelo de reactividad de
los nuevos mAb en linfocitos recién aislados, PBL procedente de
diferentes individuos se evaluó por análisis doble de fluorescencia
utilizando los mAb informativos. Un donante representativo se
presenta en la fig. 3A: la molécula de la superficie reconocida por
el mAb AZ20 se expresó de manera selectiva en las células
CD56^{+}. Además la mayoría de las células AZ20^{+} coexpresaron
moléculas de CD16. Por otra parte, el mAb AZ20 no teñía los
linfocitos T de CD3^{+} o los linfocitos B de
HLA-DR^{+}. Obsérvese que la población de células
AZ20^{-} de CD56^{+} detectadas en este donante sólo expresaban
las moléculas CD3 de la superficie. Por consiguiente, también en los
linfocitos recién derivados, la reactividad del mAb AZ20 se solapa
con la del mAb anti-NKp46. Un análisis comparativo
directo de la expresión en superficie de NKp46 y de las moléculas
reactivas al mAb AZ20 se presenta en la fig. 3A. Las dos moléculas
fueron expresadas conjuntamente de manera clara por el mismo
subconjunto de células. Sin embargo, ninguna distribución en
diagonal pudo detectarse en las células teñidas por AZ20 y mAb
anti-NKp46 mientras que este tipo de distribución
de fluorescencia se daba cuando las células eran teñidas
simultáneamente por dos mAb anti-NKp46 de diferente
isotipo.
Notablemente, se obtuvieron resultados idénticos
a los descritos para el mAb AZ20 con los mAb A76 y Z25. Estos datos
sugirieron que la molécula reconocida por los nuevos mAb puede ser
distinta de NKp46. Para evaluar directamente esta posibilidad,
células COS-7 transfectadas temporalmente con ADNc
de NKp46 se analizó su reactividad con los mAb AZ20, A76 y Z25. Los
transfectados celulares, aunque reaccionan con diferentes mAb
anti-NKp46, no se teñían con los mAb AZ20, A76 y
Z25. Los mAb A76, AZ20 y Z25 aparecen de este modo como específicos
para una nueva molécula de superficie que define todas las células
NK humanas maduras, pero es distinta de NKp46.
A fin de analizar las características
bioquímicas de las moléculas de la superficie reconocidas por los
mAb AZ20, A76 y Z25, las poblaciones de NK se marcaron en
superficie con ^{125}I o biotina, se inmunoprecipitaron con uno u
otro mAb y se analizaron por SDS-PAGE. En estas
condiciones no pudo detectarse ninguna banda específica. De este
modo, se prepararon proteínas íntegras de la membrana a partir de
células NK para analizar más una posible reactividad de varios mAb
en inmunotransferencia Western. Como se muestra en la fig. 3B, el
mAb AZ20 reaccionó específicamente con una molécula de 30 kD, en lo
sucesivo denominada NKp30. En las mismas condiciones, tanto los mAb
A76 como Z25 presentaban una reactividad más escasa.
Ya que la molécula NKp30 se expresó en células
NK recientes, los autores analizaron si podía desencadenarse la
actividad citolítica de estas células. Como se muestra en la fig. 4,
los mAb AZ20, A76 y Z25 provocaban un fuerte aumento de actividad
citolítica contra las células diana P815 mientras que el mAb
anti-CD56 incompatible con el isotipo no tuvo
efecto. El efecto desencadenante fue comparable al obtenido con el
mAb anti-NKp46. Además, en estos experimentos, la
utilización de fragmentos F(ab')_{2} de AZ20 no produjo
desencadenamiento de la actividad citolítica lo que indica que la
estimulación de NKp30 dependiente de mAb requiere reticulación
eficaz mediada por Fc\gammaR en las células diana.
Los datos anteriores demostraban que el
enmascaramiento mediado por el mAb NKp46 o de NKp44 inhibía la lisis
de las células tumorales MHC restringidas por células NK activadas.
Además, el enmascaramiento de NKp46 inhibió también la
citotoxicidad natural mediada por las células NK de la sangre
periférica recién aisladas. Los autores evaluaron a continuación si
el enmascaramiento de NKp30 podría afectar la actividad citolítica
mediada por células NK recién derivadas o clones de NK frente a un
panel de células diana tumorales negativas a Fc\gammaR. Como se
muestra en la fig. 4B, el mAb anti-NKp30, pero no el
mAb anti-CD56 compatible con el isotipo, inhibía la
citotoxicidad natural mediada por células NK recientes contra las
estirpes celulares de melanoma 1174 mel, AUMA y
FO-1 negativas de HLA de clase I. Además se produjo
un efecto inhibidor mayor cuando se utilizaron los mAb
anti-NKp30 en combinación con mAb
anti-NKp46. NKp30 y NKp46 representan de este modo
receptores que actúan sinérgicamente en el desencadenamiento de la
citotoxicidad natural de células NK recientes.
A la vista de estos datos, se analizó más el
efecto de enmascaramiento de NKp30 mediado por mAb en la destrucción
de las células tumorales por las células NK activadas. La Fig. 5
presenta tres clones de células NK representativos en un ensayo
citolítico frente a las dianas del tumor diferentes incluyendo dos
melanomas (MEL15 y M14), un hepatocarcinoma (SMMC) y un
adenocarcinoma pulmonar (A549). En los estudios anteriores, los
autores demostraron que la actividad citolítica contra el melanoma
M14 estaba confinada a clones de NK que presentan el fenotipo de
NKp46^{brillante} y pudo inhibirse mediante enmascaramiento
mediado por el mAb del receptor NKp46. Por otra parte, los clones
de NKp46^{brillante} también destruyeron MEL 15, sin embargo ni el
enmascaramiento de NKp46 ni el de NKp44 inhibieron de manera
significativa su actividad citolítica. Como se ilustró
anteriormente, NKp30 se expresa brillantemente en los clones de
NKp46^{brillante}; por consiguiente es concebible que pueda
desempeñar una función en la destrucción de células diana MEL15. De
hecho, como se muestra en la fig. 5, el mAb
anti-NKp30 inhibió la lisis mediada por NK de las
células MEL15 (>50% de inhibición). El mAb
anti-NKp46 ejerció un efecto menor, mientras que un
mAb anti-CD56 compatible con el isotipo no tuvo
efecto. Por el contrario, la lisis de melanoma M14 fue inhibida por
mAb anti-NKp46, mientras que el mAb
anti-NKp30 no presentó teóricamente ningún efecto.
Por lo tanto, mientras que NKp46 aparece como el receptor principal
implicado en la lisis de M14, NKp30 desempeña una función principal
en la destrucción de MEL15.
El análisis de los mismos clones de NK en
ensayos citolíticos frente a otras células diana tumorales tales
como SMMC y A549 (fig. 5) puso de manifiesto una contribución
equilibrada de NKp46 y NKp30 a la provocación de citotoxicidad. De
hecho, mientras que el enmascaramiento de NKp46 o NKp30 mediado por
mAb sólo ejercía un moderado efecto inhibidor, el enmascaramiento
simultáneo de las dos moléculas produjo una inhibición
significativa. Estos resultados indican que los dos receptores
pueden ejercer un efecto sinérgico en la provocación de
citotoxicidad frente a determinadas células diana. Además el
análisis puso de manifiesto que NKp30 podía ejercer un efecto
aditivo o sinérgico en la provocación de citotoxicidad mediada por
NK no solamente con NKp46 sino también con NKp44. La fig. 6A
presenta la actividad citolítica del clon MIL69 de NK representativo
frente a las células tumorales FO-1 o A549. La
lisis de las células diana se inhibió solo parcialmente por
enmascaramiento mediado por el mAb de los receptores NKp30, NKp44 o
NKp46. Sin embargo, el enmascaramiento combinado de dos receptores
produjo un efecto inhibidor mayor mientras que el enmascaramiento
simultáneo de los tres receptores proporcionó la máxima inhibición.
El mAb anti-CD56 compatible con el isótopo no
ejerció ningún efecto inhibidor ni cuando se utilizó solo ni en
combinación con otros mAb. Los autores analizaron además la función
de NKp30 solo o en combinación con otros receptores, en el ensayo
citolítico utilizando linfoblastos T producidos por PHA como fuente
de células diana normales. En estos experimentos, la lisis de las
células autólogas por los clones de las células NK se obtuvo por
enmascaramiento mediado por el mAb de las moléculas HLA de clase I
en las células diana para destruir la interacción con los
receptores inhibidores específicos de HLA de clase I expresados en
las células NK. Asimismo en estas condiciones experimentales, el
enmascaramiento mediado por el mAb de los receptores individuales
ejerció solamente un efecto inhibidor parcial en la citotoxicidad
(fig. 6B). Por otra parte, el enmascaramiento simultáneo de los
receptores de NKp30, NKp46 y NKp44 redujo fuertemente (o suprimió
prácticamente) la lisis de las células diana (véanse los clones
representativos MX361 y P9).
Estos datos apoyan la idea de que los ligandos
reconocidos por estos receptores se expresan no solamente en el
tumor sino también en las células normales.
Por último, los autores analizaron la posible
implicación de NKp30 en el reconocimiento de las células diana
murinas. El enmascaramiento de NKp30 mediado por mAb no ejerció
ningún efecto en la lisis de las células diana del timoma murino
tanto BW1502 como YAC-1.
En conjunto lo datos anteriores indican que las
funciones de NKp30 como receptor principal implicado en la
citotoxicidad mediada por NK contra células diana normales y la
mayoría pero no todas las células tumorales. Además, NKp30 puede
cooperar con NKp46 y NKp44, dependiendo lo más probablemente de la
expresión de los ligandos específicos por la célula diana
analizada.
En un intento de identificar el ADNc que
codifica la molécula de NKp30, se generó un banco de expresión de
ADNc a partir del ARNm de las células NK policlonales humanas
(Pessino, A., S. Sivori, C. Bottino, A. Malaspina, L. Morelli, L.
Moretta, R. Biassoni y A. Moretta. 1998. Molecular cloning of NKp46:
a novel member of the immunoglobulin superfamily involved in
triggering of natural cytotoxicity. J. Exp. Med.
188:953-960). Las células COS-7
transfectadas con diferentes grupos del banco de ADNc se tiñeron con
mAb A76 por un procedimiento de detección inmunocitoquímica. Se
aisló un ADNc de 674 bp (clon 5C de NKp30, SEC. ID. nº 1) que
contenía un único marco de lectura abierto (ORF) de 573 bp
(secuencia codificadora SEC. ID. nº 13). La transfección de las
células COS-7 con el montaje del ADNc del clon 5C
produjo la expresión en la superficie de una molécula que fue
reconocida por todos los diversos mAb anti-NKp30
(fig. 7A) pero no por los mAb anti-NKp46 evaluados
por análisis citofluorimétrico. Como se muestra en la fig. 7B, el
clon 5C ORF codificó un supuesto polipéptido de 190 aminoácidos
(SEC. ID. nº 2), que pertenece a la superfamilia de las
inmunoglobulinas (Ig-SF), caracterizado por un
péptido señal de 18 aminoácidos (SEC. ID. nº: 3) y por una zona
extracelular de 120 aminoácidos (SEC. ID. nº: 4) que forma un
dominio similar a Ig de tipo V. La fracción extracelular contiene
dos secuencias de glucosilación potenciales unidas a N y ninguna
secuencia de consenso para la glucosilación unida por O. Una zona
rica en aminoácidos hidrófobos, potencialmente implicados en las
interacciones proteína-proteína, está conectando el
dominio de tipo Ig V con la zona de la transmembrana. La zona de la
transmembrana de 19 aminoácidos (SEC. ID. nº: 5) contiene el
aminoácido Arg cargado positivamente y la fracción citoplásmica de
33 aminoácidos (SEC. ID. nº: 6) carece de secuencias de consenso
ITAM típicas. La presencia de un aminoácido cargado en el dominio
de la transmembrana es una característica común a otros receptores
de activación expresados en las células NK. Estos restos cargados
se cree normalmente que están implicados en la asociación con
polipéptidos de señalización que contienen ITAM.
La búsqueda en las bases de datos EMBL/GenBank
pusieron de manifiesto que el ADNc del clon 5C (SEC. ID. nº: 1) era
76,8% idéntico a una forma cortada y empalmada alternativamente
identificada anteriormente del gen 1 C7 (nº de registro AF031138).
Este gen ha sido cartografiado en el cromosoma 6 humano, en el grupo
TNF del gen MHC complejo (Nalabolu, S.R., H. Shukla, G. Nallur, S.
Parimoo y S.M. Weissman. 1996. Genes in a 220-kb
region spanning the TNF cluster in human MHC. Genomics
31:215-22). En la medida en que sin embargo, ni la
función ni la distribución de la superficie del supuesto producto
del gen 1 C7 pudo identificarse; y ningún mAb específico para 1 C7
estaba disponible. Además, el transcrito 1 C7 no pudo ser puesto de
manifiesto por la inmunotransferencia Northern en diferentes
tejidos y estirpes celulares. Por otra parte, el transcrito 1 C7
pudo ser ampliado por RT-PCR mediante el ARN aislado
del bazo (pero no de otros tejidos) o determinadas estirpes
celulares linfoides y mieloides. Estos datos sugirieron que los
transcritos de 1 C7 podrían estar escasamente representados o
podrían estar expresados en niveles sustanciales solamente en un
intervalo estrecho de tipos de células. El presente análisis por
los autores de la expresión de NKp30 por inmunotransferencia
Northern puso de manifiesto un ARNm de aproximadamente 1 kb en las
poblaciones de células NK policlonales y en las estirpes celulares
de NK incluyendo NKL y NK3.3. Por el contrario, coherente con la
falta de reactividad con los mAb anti-NKp30, no
pudo detectarse ningún ARNm de NKp30 en monocitos humanos o en
estirpes celulares de diferente histotipo incluyendo células U937,
de Jurkat, HL60 y LCL 721.221 (fig. 8A). En algunas de estas
estirpes celulares que eran negativas para la expresión de ARNm por
inmunotransferencia Northern (y para la tinción en superficie de
mAb anti-NKp30) ha sido posible detectar transcritos
cuando se analizan por la técnica RT-PCR. Este
descubrimiento es probable que refleje un bajo nivel de la
transcripción de NKp30 dando como resultado la falta de expresión
en la superficie de NKp30. Además, el análisis por
inmunotransferencia Northern de múltiples tejidos humanos demostró
expresión selectiva del transcrito de NKp30 solamente en el bazo. En
conjunto estos datos son coherentes con el hecho de que la
expresión de NKp30 es en gran parte específica de
NK.
NK.
Por último, la sonda de ADNc de NKp30 humana se
hibridó con el ADN genómico de mono, rata, ratón, perro, vaca y
conejo. Estos datos apoyan el hecho de que el gen que codifica a
NKp30 está muy conservado en diferentes especies (fig. 8B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó antisuero específico para NKp30
inmunizando conejos con un péptido NKp30 N-terminal.
Como se muestra en la fig. 9A, el antisuero reconoció en
inmunotransferencia Western una molécula idéntica a la detectada
anteriormente por el mAb AZ20. A diferencia del mAb AZ20, el
antisuero inmunoprecipita moléculas NKp30 procedentes de
poblaciones de células NK policlonales marcadas con biotina. De este
modo, una población de células NK policlonales, tratadas o no con
pervanadato sódico, se inmunoprecipitó con el antisuero específico
de NKp30 y se sondó con mAb anti-fosfotirosina. A
fin de evitar la unión no específica de la inmunoglobulina de conejo
con las moléculas CD16, los lisados celulares se preclarificaron
extensamente con mAb anti-CD16. Además, en todos
los experimentos se utilizó suero de conejo preinmunitario como
referencia negativa. En estos experimentos no pudo detectarse
ninguna fosforilación de tirosina del receptor de NKp30. Por otra
parte, el receptor de NKp30 asociado a una molécula que se
transforma en tirosina fosforilada en el tratamiento con pervanadato
sódico (fig. 9B) y que migra conjuntamente con la cadena CD3\zeta
asociada a NKp46. La identidad entre la molécula asociada a NKp30 y
los polipéptidos CD3\zeta se demostró directamente por su
reactividad con el mAb anti-CD3\zeta (fig.
9B).
De este modo, NKp30, similar a otros receptores
de activación de NK incluyendo CD16 y NKp46, puede transducir
señales de activación mediante la asociación con los polipéptidos
CD3\zeta que contienen ITAM. Estos datos están de acuerdo con la
falta de ITAM en la cola citoplásmica de NKp30 y con la presencia de
un resto cargado en su fracción transmembranaria.
En el presente estudio, gracias a la generación
de los mAb específicos, los autores identificaron y caracterizaron
NKp30, un nuevo receptor de activación que desempeña una función
importante en la citotoxicidad natural tanto de las células NK
humanas en reposo como activadas. De manera similar a NKp46, NKp30
es expresado de manera selectiva por todas las células NK, tanto
las recién aisladas como las cultivadas en IL-2,
representando de este modo un marcador óptimo para la
identificación de las células NK. Aunque pertenece a la superfamilia
Ig, NKp30 no presenta ninguna homología sustancial con los
receptores de NK identificados anteriormente.
En muchos aspectos NKp30 parece similar a NKp46.
De hecho, su expresión paralela en todas las células NK (incluyendo
las células CD16 raras), la existencia, para ambas moléculas, de un
modelo de densidad alta o baja de la expresión en superficie junto
con sus características funcionales similares condujo a la creencia
de que la molécula de la superficie reconocida por los nuevos mAb
podría ser idéntica a NKp46 o estrictamente relacionada con ésta.
Sin embargo, NKp30 y NKp46 presentaban diferentes masas moleculares
y, funcionalmente, parecía desempeñar una función complementaria en
la producción de citotoxicidad natural. Además, la clonación
molecular puso de manifiesto que NKp30 es una proteína con
homología muy limitada con NKp46 ya que las dos moléculas presentan
solamente el 13% de identidad y el 15% de similitud y son
codificadas por genes situados en cromosomas diferentes.
Los receptores responsables de la activación de
las células NK durante la citotoxicidad natural y la lisis de las
células tumorales han sido difíciles de localizar hasta hace poco.
Los datos disponibles eran coherentes con la hipótesis de la
existencia de múltiples receptores de NK activadores implicados en
la citotoxicidad natural. En este contexto, los autores
identificaron hace poco a NKp46 y NKp44, dos receptores implicados
en el reconocimiento y la lisis de varias dianas tumorales. Ambos
pertenecen a la superfamilia Ig pero no presentan identidad
significativa. Se asocian a diferentes polipéptidos de transducción
de señal (CD3\zeta/Fc\varepsilonRI\gamma y KARAP/DAP12,
respectivamente) que se convierten en tirosina fosforilada durante
la activación de las células NK. Se demostró que NKp46 y NKp44
cooperan en el proceso de la lisis de las células tumorales por las
células NK humanas. Sin embargo, la lisis de determinadas células
diana era solamente dependiente de NKp46 y/o NKp44 marginalmente,
ya que el enmascaramiento mediado por el mAb de estas moléculas no
interfirió significativamente con la citotoxicidad. Además, aunque
claramente dependiente de NKp46 y/o de NKp44, la actividad
citolítica frente a otras estirpes de células tumorales no pudo ser
suprimida por el enmascaramiento mediado por el mAb de ambas
moléculas lo que sugiere de nuevo la existencia de
receptor(es) adicional(es) que cooperan con NKp46 y
NKp44. De hecho, los autores demuestran aquí que NKp30 representa un
receptor que puede cooperar con NKp46 y NKp44 en la producción de
citotoxicidad frente a una variedad de células diana. Quizás, más
significativamente, NKp30 representa el receptor principal en
provocar la destrucción mediada por NK de determinadas células diana
tumorales cuya lisis es en gran medida independiente de NKp46/NKp44
(por ejemplo melanoma de tipo MEL15). Notablemente, NKp30, al igual
que NKp46, está también implicado en la activación de células NK y
la destrucción de células diana por células NK recientes.
Como se expuso anteriormente, la expresión en
superficie de NKp30 es paralela a la de NKp46. De hecho, las
células NK que presentan un fenotipo de NKp46^{mate} o
NKp46^{brillante}, se caracterizaban también por fluorescencia de
NKp30^{mate} o NKp30^{brillante}. Los autores demostraron
anteriormente que los clones de células NK caracterizados por un
fenotipo de NKp46^{mate} expresan continuamente bajas cantidades
de NKp44. El descubrimiento de las células NK expresan densidades
paralelas de diferentes receptores de activación puede explicar la
existencia de subconjuntos de células NK que presentan diferente
actividad citolítica "natural". Por ejemplo, era difícil
entender por qué la actividad citolítica contra algunas células
diana (tal como MEL15) aunque en gran medida independiente de
NKp46, estaba esencialmente confinada a los clones de NK que
expresan el fenotipo de NKp46^{brillante}. Estos resultados
pueden explicarse ahora por el descubrimiento de que solamente las
células NKp46^{brillante} expresan alta densidad del receptor de
NKp30. De este modo, la demostración anterior de las mayores
diferencias en la actividad citolítica de las células NKp46^{mate}
y de NKp46^{brillante} puede aplicarse actualmente también a las
células NK que presentan diferentes fenotipos de NKp30. A lo largo
de esta línea, la actividad citolítica de los clones de las células
NK NKp30^{mate} se redujo notablemente en comparación con los
clones de NKp30^{brillante}.
NKp30, al igual que NKp46, se asocia con
CD3\zeta que está implicado lo más probable en la vía de
señalización del complejo receptor. Sin embargo, CD3\zeta no
parece ser necesario para la expresión en superficie de ambos
receptores por lo menos en las células COS-7. La
clonación molecular puso de manifiesto que NKp30 es el producto de
1C7, un gen cartografiado anteriormente en el cromosoma 6 humano en
la zona HLA de clase III (Nalabolu, S.R., H. Shukla, G. Nallur, S.
Parimoo y S.M. Weissman. 1996. Genes in a 220-kb
region spanning the TNF cluster in human MHC. Genomics
31:215-22; Neville, M.J. y R.D. Campbell. 1999. A
new member of the Ig superfamily and a V-ATPase G
subunit are among the predicted products of novel genes close to the
TNF locus in the human MHC. J. Immunol.
162:4745-4754).
Sin embargo, ni la función ni la distribución
celular del supuesto producto del gen IC7 eran conocidas y no
existía ninguna indicación sobre su función en la citotoxicidad
natural. Además, el análisis de la expresión del transcrito 1 C7 se
limitó a RT-PCR aunque no ha sido posible ninguna
detección por análisis de inmunotransferencia Northern. Debe
también destacarse que no pudo establecerse ninguna correlación
entre el transcrito y la expresión en la superficie debido a la
falta de los mAb específicos. En la presente invención, los autores
demuestran que existe una correlación precisa entre la expresión en
superficie de NKp30, determinada tiñendo con tres mAb diferentes, y
la expresión de ARNm, evaluada por inmunotransferencia Northern. Por
el contrario, la detección de transcritos de 1C7 por
RT-PCR no permite predecir la expresión en la
superficie de la molécula 1 C7/NKp30.
En conclusión, la molécula NKp30 representa un
tercer miembro de una familia emergente de receptores, denominados
receptores de citotoxicidad natural (NCR), que están implicados en
la activación de células NK durante el reconocimiento de ligandos
distintos de HLA. Estos receptores parecen complementarse entre sí
en la producción de la lisis de células diana por las células NK.
La contribución relativa de cada receptor es probable que refleje
la expresión/densidad de sus ligandos específicos en células diana.
A lo largo de esta línea, se ha demostrado recientemente que
también CD16 está implicada en la citotoxicidad natural sugiriendo
de este modo que además de la fijación de Fc y ADCC, CD16 pueden
desempeñar una función en la regulación de la función de las
células NK. Además de CD16 y las diferentes NCR, varias otras
moléculas de la superficie que pueden mediar en la activación de
las células NK han sido identificadas en seres humanos y roedores.
Éstas incluyen CD2, CD69, CD28, 2B4 y NKR-P1. Sin
embargo, su función real en la citotoxicidad natural tiene que ser
clarificada todavía ya que en la mayoría de los casos estas
estructuras de activación no están limitadas a NK.
Por último, aunque la identificación de las
diferentes NCR constituye una etapa principal hacia la comprensión
por los autores de la fisiología de las células NK, tanto la
naturaleza como la distribución de los ligandos naturales de NCR en
las células diana continúa sin ser determinada con más precisión.
Basándose en los datos disponibles, es posible prever un mecanismo
nuevo de escape del tumor consistente en la regulación por
disminución (en las células tumorales) de moléculas de ligando
específicamente reconocidas por los receptores de activación
específica de NK. De este modo, la identificación de dichos ligandos
permitirá el análisis de su distribución en células normales frente
a tumorales y definir si existe una correlación entre la expresión
de ligando y la sensibilidad para la lisis mediada por NK por
diferentes células tumorales.
Una vez proporcionada la secuencia de la
proteína NKp30 SEC. ID. nº: 2 ilustrada en el ejemplo 1 anterior,
los anticuerpos anti-NKp30 pueden generarse mediante
procedimientos de producción de anticuerpos convencionales. Éstos
incluyen animales para inmunización tales como ratones o ratas con
un fragmento inmunógeno de NKp30 como se define en la presente
memoria. Puede realizarse inmunización repetida. La respuesta al
anticuerpo puede controlarse utilizando varias técnicas diferentes
tales como ELISA o citometría de flujo para demostrar la presencia
en el suero del animal inmunizado de las inmunoglobulinas que se
unen al inmunógeno. Cuando se detecta una respuesta significativa
al anticuerpo, se sacrifica el animal a fin de generar anticuerpos
monoclonales tal como se describe en los procedimientos
convencionales, tal como el procedimiento de Köhler y Milstein
(Nature 1975, 256: 495-497; Antibodies, a
laboratory manual, 1988, Harlow y David Lane, ed. Cold Spring
Harbor laboratory), o tal como recoger los
esplenocitos inmunitarios y fusionarlos en una estirpe celular de hibridoma (Anderson, 1989, J. Immunol. 143: 1889).
esplenocitos inmunitarios y fusionarlos en una estirpe celular de hibridoma (Anderson, 1989, J. Immunol. 143: 1889).
La delineación de los subconjuntos de células
teñidos por el anticuerpo puede conseguirse por citometría de flujo
tal como se describió anteriormente a fin de identificar aquellos
anticuerpos que tienen la capacidad deseada para reconocer
selectivamente células NK entre una muestra biológica. Cualquiera de
las indicaciones siguientes puede utilizarse en bioanálisis tal
como se describe en el ejemplo 1 para caracterizar más la capacidad
de estimulación de los anticuerpos monoclonales obtenidos: (i)
producción de citotoxicidad natural hacia las dianas negativas MHC
de clase I, células tumorales, células infectadas por virus, células
de alotrasplante, (ii) estimulación de la citotoxicidad para con
las células diana recubiertas de anticuerpos, (iii) aumentos en la
concentración intracitoplásmica de Ca^{2+}, (iv) inducción de la
fosforilación de tirosina de moléculas intracitoplásmicas de
adaptador/efector tales como ZAP70, Syk, LAT, SLP76, Shc, Grb2,
enzimas fosfolipasa C-gamma,
fosfatidil-inositol 3-cinasas, (v)
fosforilación de las cadenas KARAP/DAP12 o CD3zeta o FcRgamma de
transducción asociada al receptor, (vi) secreción de citocinas tales
como el interferón gamma, factores de la necrosis tumoral, IL5,
IL10, quimiocinas tal como MIP-1alfa), TGFbeta,
(vii) regulación por aumento o disminución de moléculas de la
superficie de las células NK, tales como CD69 y PEN5
respectivamente.
Puede utilizarse otro procedimiento para generar
anticuerpos que sean capaces de unirse a un fragmento inmunógeno de
NKp30 y específicamente el cribado de bancos de fago que expresan un
repertorio de fragmentos de inmunoglobulina en una forma
oligomérica en su superficie. Esta identificación puede conseguirse
apelmazando moléculas de NKp30 recombinantes en una fase sólida,
poniendo en contacto una suspensión del fago con esta superficie
recubierta, lavando los fagos unidos retenidos, replicando estos
fagos y volviendo a iterar varias veces este procedimiento de
cribado con un montaje del fago que expresa menos un fragmento de
inmunoglobulina en su superficie a fin de seleccionar los
fragmentos que presentan la afinidad mayor hacia la molécula
inmunógena. En los fragmentos opcionalmente obtenidos puede
determinarse su capacidad para teñir selectivamente las células NK
en muestras biológicas y para competir con cualquier anticuerpo
estimulante en cualquier ensayo funcional como se describió
anteriormente.
Los reactivos anti-NKp30 tales
como los anticuerpos anti-NKp30 presentan de manera
ventajosa una especificidad de las células NK apropiada para la
purificación de las células NK a partir de muestras biológicas del
complejo tales como muestras de recogida de plasmaféresis o
citaféresis. El experto en la materia puede establecer varias
formas de realización para la purificación de células.
Por ejemplo, los anticuerpos de NKp30
anti-NKp30 pueden injertarse por enlace covalente a
microperlas MACS submicroscópicas de Miltenyl Biotec gmbh
(Gladbach, Alemania). A continuación se pone en contacto una
suspensión de un millón a 1000 millones de células nucleadas de la
sangre del donantes obtenidas por citaféresis o por elutriación de
la muestra de sangre periférica del donante con perlas magnéticas y
se aplica a un dispositivo de clasificación magnética tal como el
clasificador de células MACS de Miltenyl. Alternativamente, los
anticuerpos anti-NKp30 pueden injertarse a
partículas Dynabeads® de Dynal (Oslo, Noruega). La suspensión de
células del donante se incuba con las perlas, se somete a un campo
magnético en un dispositivo tal como un dispositivo Isolex de
Baxter, y se recubre más por incubación con una molécula peptídica
que permite la liberación de las células por competitividad con el
antígeno NKp30.
Una vez purificadas, las células positivas deben
recuperarse a continuación en un medio isotónico apropiado, y
pueden infundirse al paciente a una dosis que oscila entre 0,1 y 100
millones. Las células pueden congelarse también después de la etapa
de purificación antes de su utilización clínica. En los
procedimientos autólogos, se extraen las células NK de la sangre
del propio paciente. En este escenario, el tratamiento antitumoral
puede conseguirse incubando más las células NK purificadas con un
anticuerpo que se une a un antígeno expresado por un tumor, tal
como CD20 en el caso del linfoma de Bell y volviendo a infundir las
células tratadas al paciente junto con el anticuerpo antitumoral.
Alternativamente, en un procedimiento diseñado para prevenir GvHD
(injerto contra la enfermedad del huésped) la aparición en el
alotrasplante, tal como el trasplante de médula ósea, las células
NK pueden purificarse en la sangre del donante y volver a infundirse
como tales en el receptor.
La purificación de células NK positivas basada
en NKp30 presenta de hecho la ventaja adicional de permitir una
activación de células NK simultánea, en determinadas circunstancias.
Estas circunstancias incluyen principalmente la utilización de
reactivos anti-NKp30 en tal densidad y/o de tal
naturaleza que permiten la reticulación de la molécula NKp30 en las
células NK. Por lo general, dicha matriz consta de una fase sólida
recubierta con una cantidad de saturación del anticuerpo
anti-NKp30, tal como fibras huecas, partículas de
dextrano o partículas magnéticas.
Con el procedimiento simultáneo de
purificación-activación según la invención, las
etapas de incubación convencionales para la activación de las
células NK tal como la incubación de las células NK purificadas en
presencia de interleucinas (por ejemplo IL-2,
IL-12, IL-15) no son una etapa
necesaria ya. Debe sobreentenderse que dichas etapas convencionales
no obstante pueden ser realizadas opcionalmente: el experto en la
materia puede elegir añadir una etapa convencional al procedimiento
según la invención, por ejemplo con fines de optimización.
Abreviaturas: NK, destructor
natural; KIR, receptor del inhibidor destructor; NCR,
receptores de citotoxicidad natural; ITAM, motivo de
activación a base de tirosina inmunorreceptora;
SDS-PAGE, electroforesis en gel de
dodecilsulfato sódico-poliacrilamida;
Ig-SF, superfamilia de inmunoglobulina;
RT-PCR, reacción en cadena de transcriptasa
inversa-polimerasa; ORF, marco de lectura
abierto; mAb, anticuerpo monoclonal.
En la presente descripción, se hace referencia a
varias metodologías conocidas por los expertos en materia de
inmunología, biología celular, biología molecular y
farmacología.
<110> INNATE PHARMA S.A.S.
\hskip1cm UNIVERSITA DI GENOVA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptor activador implicado en la
citotoxicidad natural mediada por las células destructoras naturales
humanas y anticuerpos que identifican dicho receptor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NKp30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido derivado de una secuencia natural, útil para la
producción de antisuero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador superior para la ampliación ADNc de NKp30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagggcatct cgagtttccg acatggcctg gatgctgttg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inferior para la ampliación de ADNc de NKp30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactaggatc cgcatgtgta ccagccccta gctgaggatg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inferior para la ampliación de ADNc de NKp30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatttattgg ggtcttttga ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 573
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm10
Claims (29)
1. Polipéptido aislado con propiedades
activadoras del receptor de células destructoras naturales (NK), que
es capaz de unirse a péptidos de transducción de señal de CD3\xi
(grupo determinante), presentando dicho polipéptido una secuencia
con por lo menos el 80% de homología con una secuencia seleccionada
de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 4,
SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6 y SEC. ID. nº 7.
2. Polipéptido aislado según la reivindicación
1, que comprende asimismo una cadena de CD3\xi.
3. Anticuerpo aislado dirigido contra por lo
menos un polipéptido aislado según la reivindicación 1.
4. Anticuerpo aislado según la reivindicación 3,
caracterizado porque no se une a ninguna molécula de la
superficie de los linfocitos T ni a ninguna molécula de la
superficie de los linfocitos B.
5. Anticuerpo aislado según la reivindicación 3
ó 4, caracterizado porque puede provocar un aumento de por lo
menos 5 veces en la citotoxicidad natural desencadenada por una
célula NK colocada en presencia de una célula diana en una
proporción 1:1.
6. Anticuerpo aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque es un anticuerpo
monoclonal.
7. Anticuerpo aislado según la reivindicación 6,
en el que dicho anticuerpo monoclonal se produce a partir del
hibridoma 1-2576 (C.N.C.M. Institut Pasteur, Paris,
Francia).
8. Fragmento inmunorreactivo aislado de un
anticuerpo según cualquiera de las reacciones 3 a 7, que comprende
el punto de fijación al antígeno de dicho anticuerpo.
9. Anticuerpo humanizado que comprende un
fragmento según la reivindicación 8.
10. Soporte sólido sobre el cual se acopla por
lo menos un anticuerpo aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7, 9.
11. Hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.
12. Hibridoma según la reivindicación 11, en el
que dicho hibridoma es el hibridoma 1-2576 (C.N.C.M.
Institut Pasteur, Paris, Francia).
13. Procedimiento para detectar y/o cuantificar
la presencia de células destructoras naturales (NK) en una muestra
biológica, que comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
14. Kit para detectar y/o cuantificar células
destructoras naturales (NK) de una muestra biológica que comprende
por lo menos un objeto seleccionado de entre el grupo constituido
por los anticuerpos aislados según las reivindicaciones 3 a 7, 9;
los fragmentos inmunorreactivos aislados según la reivindicación 8,
los soportes sólidos según la reivindicación 10 y los hibridomas
según las reivindicaciones 11 y 12, estando dicho objeto contenido
en un
recipiente.
recipiente.
15. Procedimiento para la eliminación selectiva
de células destructoras naturales (NK) de una muestra biológica,
que comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
16. Procedimiento para la purificación positiva
y selectiva de células naturales destructoras (NK) de una muestra
biológica, que comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
17. Kit para la eliminación y/o purificación
positiva de células destructoras naturales (NK) de una muestra
biológica que comprende por lo menos un objeto seleccionado de entre
el grupo constituido por los anticuerpos aislados según las
reivindicaciones 3 a 7, 9; los fragmentos inmunorreactivos aislados
según la reivindicación 8, los soportes sólidos según la
reivindicación 10 y los hibridomas según las reivindicaciones 11 y
12, estando contenido dicho objeto en un recipiente.
18. Procedimiento para la estimulación in
vitro de la citotoxicidad de células destructoras naturales
(NK), caracterizado porque comprende: poner en contacto
dichas células NK in vitro en condiciones fisiológicas con
por lo menos un producto seleccionado de entre el grupo constituido
por los anticuerpos aislados según las reivindicaciones 3 a 7, 9,
los soportes sólidos según la reivindicación 10 y los hibridomas
según las reivindicaciones 11 y
12.
12.
19. Kit para la estimulación de la citotoxicidad
de células destructoras naturales (NK), que comprende: por lo menos
un producto seleccionado de entre el grupo constituido por los
anticuerpos aislados según las reivindicaciones 3 a 7, 9; los
soportes sólidos según la reivindicación 10, los hibridomas según
las reivindicaciones 11 y 12, estando contenido por lo menos un
producto en un recipiente.
20. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
14, 17 y 19, que comprende asimismo un anticuerpo seleccionado de
entre el grupo constituido por anticuerpos
anti-NKp46 y anticuerpos
anti-NKp44.
21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
14, 17, 19 y 20 que está dirigido a la mejora de trasplantes, a la
inhibición de GvH, GvT y en particular a la estimulación de GvL.
22. Procedimiento para la inhibición in
vitro de la citotoxicidad de las células destructoras naturales
(NK), caracterizado porque comprende: poner en contacto in
vitro dichas células NK en condiciones fisiológicas con un
fragmento Fab o F(ab')_{2} de un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.
23. Kit para inhibir la citotoxicidad de las
células destructoras naturales (NK) que comprende un fragmento Fab
o F(ab')_{2} de un anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7.
24. Composición farmacéutica que comprende por
lo menos un producto seleccionado de entre el grupo constituido por
los anticuerpos aislados según las reivindicaciones 3 a 7, 9; los
soportes sólidos según la reivindicación 10, los hibridomas según
las reivindicaciones 11 y 12, las células NK aisladas que pueden
obtenerse por el procedimiento de purificación según la
reivindicación 16 y las células NK aisladas que pueden obtenerse por
el procedimiento de estimulación según la reivindicación 18, junto
con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. Composición farmacéutica según la
reivindicación 24, caracterizada porque por lo menos dicho
producto seleccionado está directa o indirectamente unido a un
anticuerpo antitumoral, a un anticuerpo
anti-microorganismo o a un anticuerpo
antivirus.
26. Composición farmacéutica según la
reivindicación 24 ó 25, caracterizada porque dichas células
NK aisladas se han recogido de un ser humano, y en particular de un
donante del trasplante, o de un paciente que tiene un tumor, tal
como un melanoma.
27. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 26, caracterizada porque comprende
asimismo un anticuerpo seleccionado de entre el grupo constituido
por anticuerpos anti-NKp46 y anticuerpos
anti-NKp44.
28. Utilización de por lo menos un producto
seleccionado de entre el grupo constituido por los anticuerpos
aislados según las reivindicaciones 3 a 7, 9, los soportes sólidos
según la reivindicación 10, los hibridomas según las
reivindicaciones 11 y 12, las células NK aisladas que pueden
obtenerse por el procedimiento de purificación según la
reivindicación 16 y las células NK aisladas que pueden obtenerse por
el procedimiento de estimulación según la reivindicación 18 para la
preparación de un medicamento destinado a la mejora de trasplantes,
a la inhibición de GvH, GvT y en particular a la estimulación de
GvL, y/o para la prevención, paliación y/o terapia de tumores
sólidos o líquidos y/o de la infección por microorganismos,
principalmente de la infección vírica.
\newpage
29. Utilización de por lo menos un producto
seleccionado de entre el grupo constituido por los anticuerpos
aislados según las reivindicaciones 3 a 7, 9, los soportes sólidos
según la reivindicación 10, los hibridomas según las
reivindicaciones 11 y 12, las células NK aisladas que pueden
obtenerse por el procedimiento de purificación según la
reivindicación 16 y las células NK aisladas que pueden obtenerse por
el procedimiento de estimulación según la reivindicación 18 para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de melanoma,
hepatocarcinoma y adenocarcinoma pulmonar.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44051499A | 1999-11-15 | 1999-11-15 | |
| CA2288307 | 1999-11-15 | ||
| CA2288307A CA2288307C (en) | 1999-11-15 | 1999-11-15 | Novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells and antibodies that identify the same |
| US440514 | 1999-11-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00989877T Expired - Lifetime ES2321687T3 (es) | 1999-11-15 | 2000-11-15 | Receptor activador implicado en la citotoxicidad natural mediada por las celulas destructoras naturales humanas y anticuerpos que identifican dicho receptor. |
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| JP2006514024A (ja) * | 2002-12-23 | 2006-04-27 | イネイト・ファーマ | Ｎｋ細胞の増殖に対する効果を有する医薬組成物及びそれを使用する方法 |
| EP1445614A1 (en) * | 2003-02-06 | 2004-08-11 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | A method for the in vitro assessment of the progression status of an HIV virus in an invidual |
| DK1648507T3 (en) | 2003-07-24 | 2017-05-01 | Innate Pharma Sa | PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF THERAPEUTIC ANTIBODIES USING COMPOUNDS THAT POTENTATE NK CELLS |
| CA2564244A1 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Innate Pharma | Compositions and methods for enhancing nk cell activity |
| AU2005264993A1 (en) * | 2004-06-18 | 2006-01-26 | Genentech, Inc. | Use of Apo2L receptor agonists and NK cells or NK cell activators |
| CA2575607C (en) | 2004-08-03 | 2017-07-11 | Innate Pharma | Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor |
| EP1626059A1 (en) * | 2004-08-09 | 2006-02-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Angiogenic and immunologic applications of anti-CD160 specific compounds obtainable from mAb CL1-R2 |
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| CA2697992C (en) * | 2007-10-04 | 2017-08-22 | Zymogenetics, Inc. | B7 family member zb7h6 and related compositions and methods |
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