JPH11506313A - Ｃｄ６リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的には、ＣＤ６に関し、特に、胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞及び他の様々な種類の細胞の表面上に存在するＣＤ６リガンドに関する。更に、本発明は、ＣＤ６とそのＣＤ６リガンドの相互作用を阻害する方法及び化合物の中からその相互作用の阻害能をスクリーニングする方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ６リガンド 本発明は、政府の支持により、国立衛生研究所からの補助金（交付番号ＣＡ− ２８９３６及びＡＩ−０７２１７）を基礎に行われた。政府がこの発明に対して 権利を有する。 本件出願は、1993年11月２日に出願の出願番号大08/143,903号の一部継続出願 であり、その内容の全てを参考として本明細書に引用する。 発明の分野 本発明は、一般的にＣＤ６に関し、特に胸腺上皮細胞、単球、活性Ｔ細胞及び 他の様々な種類の細胞の表面に存在するＣＤ６リガンドに関する。本発明はまた 、ＣＤ６リガンドをコードする核酸配列及びこれを含むベクターと宿主細胞に関 する。更に、本発明は、ＣＤ６とそのＣＤ６リガンドの相互作用を阻害する方法 及び化合物の中からその相互作用の阻害能をスクリーニングする方法に関する。 背景 ＣＤ６は、ＣＤ５及びマクロファージスカベンジャーレセプターに類似の１３ ０ｋＤａ糖タンパク質である(Aruffoら、J.Exp.Med．174:949(1991))。 ＣＤ６は、成熟胸腺細胞、末梢Ｔ細胞及びＢ細胞サブセットの表面上に発現され る（Kamounら、J.Immunoｌ．127:987(1981)）。ＣＤ６は、ＣＤ６に対するモノ クローナル抗体（ｍａｂ）がＴ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）仲介による活 性化を増加させるので、Ｔ細胞活性化に関係すると考えられ(Gangemiら、J．Imm unol．143:2439(1989))、そのＣＤ６分子はＴＣＲ仲介Ｔ細胞の引き金となる間 にチロシンリン酸化される(Weeら、J．Exp．Med．177:219(1993))。ＣＤ６に対 するＭａｂは、同種異系骨髄移植の場合のＴ細胞欠損に臨床上有効であることが 示された(Soifferら、J．Clin．Oncol．10:1191(1992)。 Ｔ細胞表面抗原に対するｍａｂのパネルの中から胸腺細胞のヒト胸腺上皮細胞 （ＴＥＣ）への結合阻害能をスクリーニングすることにより得られた結果から、 ＣＤ６が胸腺細胞のＴＥＣへの結合に関係することが示唆された（Vollgerら， J．Immunol．138:358(1987)）。本発明は、その結合に関係したＣＤ６のリガン ド及び該リガンドをコードする核酸配列に関する。 本発明の目的及び要約 本発明の一般的な目的は、ＣＤ６リガンドを提供することである。 本発明の具体的な目的は、単離した形のＣＤ６リガンド及び該リガンドをコー ドする核酸配列を提供することである。 更に、本発明の目的は、ＣＤ６のＣＤ６リガンドへの結合を阻害する方法を提 供することである。 更にまた、本発明の目的は、化合物の中からＣＤ６／ＣＤ６リガンド結合阻害 能をスクリーニングする方法を提供することである。 一実施態様においては、本発明は、単離したＣＤ６リガンドに関し、その形態 としては２価カチオン依存性及び２価カチオン非依存性の双方が含まれる。更に 、本発明は、そのようなリガンドのミメトープに関する。 他の実施態様においては、本発明はＣＤ６リガンドをコードする核酸配列及び これを含むベクター及び宿主細胞に関する。また、本発明は、ＣＤ６リガンドま たはその一部を製造する方法に関し、該方法はＣＤ６リガンドコード配列または その一部を含む宿主細胞を該配列が発現されるような条件下において培養し、Ｃ Ｄ６またはその一部を生産することを含む。 他の実施態様においては、本発明は、第２細胞の表面上に存在するＣＤ６リガ ンドへの、第１細胞の表面上に存在するＣＤ６の結合を阻害する方法に関する。 本方法は、該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６と可溶性ＣＤ６リガンド又は そのミメトープとを、該可溶性ＣＤ６リガンド又はそのミメトープが該第１細胞 の表面上に存在する該ＣＤ６に結合し、もって、該第２細胞の表面上に存在する 該ＣＤ６リガンドの該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６への結合を阻害する ような条件下に接触させる工程を含む。また、本方法は、該第２細胞の表面上に 存在する該ＣＤ６リガンドと可溶性ＣＤ６又はそのミメトープとを、該可溶性Ｃ Ｄ６又はそのミメトープが該第２細胞の表面上に存在する該ＣＤ６リガンドに結 合し、もって、該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６の該第２細胞の表面上に 存在する該ＣＤ６リガンドへの結合を阻害するような条件下に接触させる工程 を含む。 他の実施態様においては、本発明は、試験化合物の中からＣＤ６のＣＤ６リガ ンドへの結合阻害能をスクリーニングする方法に関する。本方法は、ｉ）該試験 化合物とＣＤ６及びＣＤ６リガンドの一方とを、該試験化合物と該ＣＤ６又はＣ Ｄ６リガンド間に複合体が形成することができるような条件下に接触させる工程 、ii）工程（ｉ）から得られたＣＤ６又はＣＤ６リガンドと試験化合物の組合わ せとＣＤ６とＣＤ６リガンドのもう一方とを、該ＣＤ６と該ＣＤ６リガンド間に 複合化が生じることができるような条件下に接触させる工程、及びiii)該ＣＤ６ と該ＣＤ６リガンド間の複合化の程度を求め、もって、該試験化合物について該 ＣＤ６の該ＣＤ６リガンドへの結合阻害能を求める工程を含む。 本発明の他の目的及び利点は、下記の説明から明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１． ＣＤ６−Ｉｇ（＝ＣＤ６−Ｒｇ）の胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）への結合 に関する２価カチオンの影響。ＴＥＣを２％ＢＳＡ、トリス−ＨＣｌ緩衝化食塩 水（ＴＢＳ）及び５mMＣａＣｌ₂、５mMＭｇＣｌ₂又は５mMＭｎＣｌ₂のいずれか を含有するバッファー中５μgのＣＤ６−Ｉｇ又はＣＤ５−Ｉｇとインキュベー トし、間接免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより分析した。種々のバッファ ー中のＣＤ６−Ｉｇの相対結合が示されている。相対結合は、ＴＢＳ中の特異結 合に対する試料バッファー中のＣＤ６−Ｉｇ（ＣＤ６−Ｉｇの蛍光−ＣＤ５−Ｉ ｇの蛍光）の特異結合の比率として求めた。３回の実験の代表が示されている（ ＴＢＳ＋Ｍｇは１回だけ行った）。ＣａＣｌ₂とＭｎＣｌ₂は共に、ＣＤ６−Ｉｇ のＴＥＣへの結合を顕著に高めることができた（ｐ≦０.１）。 図２． ＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合は、Ｍｎ⁺⁺により高められる。ＴＥＣ を２％ＢＳＡ、ＴＢＳ及び種々の濃度のＭｎＣｌ₂を含有するバッファー中５μg のＣＤ６−Ｉｇ又はＣＤ５−Ｉｇとインキュベートし、間接免疫蛍光及びフロー サイトメトリーにより分析した。グラフは、種々の量のＭｎＣｌ₂を含有するバ ッファー中のＣＤ６−Ｉｇの相対結合を示すものである。３回の個々の実験の代 表が示されている。 図３． ＴＥＣへの結合は、ＣＤ６をＣＯＳ細胞中で発現することにより高め られる。ＣＤ６を安定な方法で発現するＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ）又は対 照ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−Ｎｅｏ）をカルセイン−ＡＭ標識ＴＥＣと１：５の比で ４℃において６０分間インキュベートした。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の組合わせ を用いて結合を検出した。３以上の結合ＴＥＣを含むＣＯＳ細胞％である結合を 求めた。ＣＤ６をＣＯＳ細胞中で発現すると、ＣＯＳ細胞のＴＥＣへの結合が高 められ、この結合は抗ＣＤ６抗体によって阻害された。 図４． モノクローナル抗体Ｊ４−８１は、ヒトＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質 のヒトＴＥＣへの結合を阻害する。ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究 会からの４７０ｍａｂの結合パネル及び抗インテグリンｍａｂのパネルの中から ＴＥ細胞に対する反応性をスクリーニングした。ＴＥ細胞と反応した１５４ｍａ ｂのうち１２６を、ＣＤ６−ＩｇのＴＥ細胞への結合を阻害する分析に用いた。 ＴＥ細胞と反応し、かつこの実験に用いた研究会のｍａｂは次のものであった： Ａ００８、Ａ０１４、Ａ０２３−４、Ａ０３６−７、Ａ０４４、Ａ０４７−９、 Ａ０６３、Ａ０６５、Ａ０７０、Ａ０７４、Ａ０８０、Ａ０９０、Ａ０９２、 Ａ１０７、Ａ１１０、Ａ１１３、Ａ１２４、Ａ１３２、Ａ１３９、Ａ１４１、Ａ １４５、Ｂ００２、Ｂ００３、Ｂ００５−６、Ｂ０１１−２、Ｂ０１４、Ｂ０１ ９、Ｂ０２５、Ｂ０２７−９、Ｂ０３１、Ｂ０４６、Ｂ０４９、Ｂ０５２、Ｂ０ ５５−７、Ｂ０５９、Ｂ０６８、ＣＢ１０、ＣＢ２２、ＣＢ２７、Ｅ００１、Ｅ ０１５、Ｅ０３１、Ｅ０４５、Ｅ０５０、Ｅ０５３−４、Ｅ０５６−７、Ｍ０１ −２、Ｍ０９、Ｍ１４−５、Ｍ２５、Ｍ３２、Ｍ３５−８、Ｍ４３−４、ＭＲ１ 、ＭＲ４、ＭＲ６、ＭＲ９、ＭＲ１２、ＭＲ１４、ＸＢ００１、ＮＫ３２、Ｐ０ ０５、Ｐ０１２、Ｐ０２３、Ｐ０３６、Ｐ０４４、Ｐ０９８、Ｐ１０７−８、Ｓ ００９、Ｓ０１３、Ｓ０２３−４、Ｓ０３１、Ｓ０７５、Ｓ１０７、Ｓ１８８、 Ｓ２０１、Ｓ２４１、Ｓ２４５、Ｓ２５２、Ｓ２６３、Ｓ２７１、Ｓ２７３−４ 、５Ｔ−０１５、５Ｔ−０７６、５Ｔ−０８０、５Ｔ−０８４、ＣＤ２４.３、 ＣＤ４０.２、ＣＤ７３.１、ＣＤ７４.１及びＣＤ７７.１。使用した抗インテグ リンｍａｂは次のものであった：ＴＳ２／７、Ｐ１Ｈ６、１２Ｆ１、Ｐ１Ｂ５、 Ｐ４Ｇ９、Ｂ５６１０、Ｐ３０１０、ＥＡ−１−６、１３５−１３Ｃ、Ｐ５０２ 、Ｐ３０９、Ｋ２０、β４、Ｐ３Ｇ８、Ｐ３Ｇ２、Ｐ１Ｈ１２及びＴＳ２／１６ 。 細胞をｍａｂと１：１００の希釈度で４℃において１５分間インキュベートし、 次に、５μgのＣＤ５−Ｉｇ或いはＣＤ６−Ｉｇとインキュベートした。細胞を 洗浄し、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に特異的なフルオレセイン複合抗血清との反応及 びフローサイトメトリーにより検出した。ＣＤ６−Ｉｇ結合とＣＤ５−Ｉｇ結合 の蛍光の差である特異結合を求めた。対照ｍａｂ（Ｐ３）と比べた結合が示され ている。４つの例は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃが試験ｍａｂと交差反応したもの である（Ａ０２４、Ｂ０４９、５Ｔ−０８４及びＣＤ７３.１）。ｍａｂＪ４− ８１（Ｓ２５２）はＣＤ６−Ｉｇ結合を５６±５％だけ阻害した（Ｎ＝２）。 図５． ｍａｂＪ４−８１は、培養したＴＥＣの全ての表面と強く反応する。 培養したＴＥＣをｍａｂＪ４−８１（ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研 究会からのＳ２５２）及び対照ｍａｂ（Ｐ３）と４℃で３０分間インキュベート した。２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した後、フルオレセイン複合ヤギ抗マ ウスＩｇＧとの反応、次にフローサイトメトリーにより結合した抗体を検出した 。対照ｍａｂ（Ｐ３）及びＣＤ６リガンドに対するｍａｂ（Ｊ４−８１）の蛍光 プロファイルが示されている。 図６． ＣＤ６及びそのリガンドの生後のヒト胸腺中での発現。凍結ヒト胸腺 切片（４μm）中ＣＤ６及びそのリガンドを、各々ｍａｂＴ１２及びＳ２５２（ Ｊ４−８１）を用いて間接免疫蛍光により標識した。パネル１はＴ１２に対する 反応性パターンを示すものであり、パネル２はｍａｂＪ４−８１に対する反応性 パターンを示すものである。少なくとも３種類の異なる胸腺組織が同様の結果で 分析された。ＣＤ６は、髄質（ｍｅｄ）中の胸腺細胞上に発現されかつ皮質（ｃ ｔｘ）中の胸腺細胞上に中程度に発現された。ｍａｂＪ４−８１は、髄質胸腺上 皮細胞及びハッサル小体（ＨＢ）を検出した。 図７． ＣＤ６−Ｉｇによる代謝的に標識したＴＥＣからの放射性標識糖タン パク質の免疫沈降。細胞を６−³H−グルコサミンで４８時間標識し、溶解し、溶 解物をＣＤ６−Ｉｇ及び対照としてＣＴＬＡ４−Ｉｇで免疫沈降した。ＴＥＣ溶 解物のＣＤ６−Ｉｇ免疫沈降は、１５mMＥＤＴＡを含めて及び含めずに行った。 １０５ｋＤａ分子及び３５ｋＤａ分子のＣＤ６−Ｉｇによる免疫沈降は２価カチ オン非依存性であり、９０ｋＤａ分子のＣＤ６−Ｉｇによる免疫沈降は２価カチ オン依存性であった。 図８． ＣＤ６−Ｒｇ（＝ＣＤ６−Ｉｇ）は、多数のヒト由来細胞系へ結合す る。ＣＤ６−Ｒｇ（実線）及びＣＤ５−Ｒｇ（破線）の多数のヒト細胞系への結 合をフローサイトメトリーにより調べた。細胞系を、ＣＤ６−Ｒｇの結合能に基 づいて高結合、低結合及び非結合の３種類に分類した。細胞をこれらの３種類に 分類するために用いられる結合％は、蛍光強度がイソタイプ適合ＣＤ５−Ｒｇ融 合タンパク質で染色した細胞より大きい細胞数に基づく（縦の一点鎖線）。試験 したヒト細胞系は次のものであった：（ａ）ＨＢＬ−１００、（ｂ）Ｈ３７１９ 、（ｃ）Ｈ３６０６、（ｄ）ＬＣＬ８６６４、（ｅ）ＧＭ０８３３、（ｆ）ＩＭ Ｒ９０、（ｇ）Ｊｕｒｋａt、（ｈ）Ｐｅｅr、（ｉ）ＨＵＴ７８、（ｊ）ＨＰＢ −ＡＬＬ、（ｋ）ＪＭ、（ｌ）Ｈ９、（ｍ）ＬＴＲ２２８及び（ｎ）Ｒａｊｉ。 全１０⁴細胞を各実験で分析した。 図９． ＣＤ６−Ｒｇ結合は飽和性及びトリプシン感受性である。（Ａ）増加 濃度のＣＤ６−Ｒｇ及びＣＤ５−Ｒｇの乳がん腫細胞系ＨＢＬ−１００への結合 をフローサイトメトリーで調べた。結合％（縦軸）を図８に記載されたように求 めた。全１０⁴細胞を各タンパク質濃度で調べた。（Ｂ）ＣＤ６−Ｒｇのトリプ シン処理ＨＢＬ−１００細胞への結合を、ＣＤ６−Ｒｇ及びCＤ５−Ｒｇの未処 理ＨＢＬ−１００細胞への結合とフローサイトメトリーで比較した。この図は、 ３回実験のうちの代表の結果を示すものである。トリプシン消化物は記載された ように行った。 図１０． ＣＤ６−Ｒｇ結合は２価カチオン依存性である。ＥＤＴＡ（＋ＥＤ ＴＡ、点線）の存在下ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞への結合をＣＤ６−Ｒ ｇ（一点鎖線）及びＣＤ５−Ｒｇ（破線）の結合とフローサイトメトリーで比較 した。ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞への結合に関するＥＤＴＡの影響を調 べた後に、ＣＤ６−Ｒｇ／ＨＢＬ−１００複合体を形成した（＋ＥＤＴＡ、実線 ）。全１０⁴細胞を各実験で調べた。 図１１． ＣＤ６−Ｒｇ結合は抗ＣＤ６ｍＡｂで遮断される。２種類の異なっ た抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＭＢＧ６及びＧ３−６）及び不適当なＩｇＭｍＡｂについて ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞への結合能をフローサイトメトリーで調べた 。 各々の場合において、連続希釈の抗体を試験した。 図１２． ＣＤ６−Ｒｇ結合はサイトカインによりモデュレートされる。ＣＤ ６−Ｒｇ（実線）及びＣＤ５−Ｒｇ（破線）の未処理ＨＢＬ−１００細胞又は指 定したサイトカインで処理したＨＢＬ−１００細胞への結合をフローサイトメト リーで試験した。ＣＤ６−Ｒｇ結合後の蛍光強度が任意のマーカー（一点鎖線） の右の方にあるＨＢＬ−１００細胞％は各パネルに記されている。（Ａ）及び（ Ｂ）欄に示されたデータは、２種類の異なる実験を表している。 図１３． ＣＤ６−Ｒｇ結合タンパク質の免疫沈降。ＨＢＬ−１００細胞を[³ H]グルコサミンで放射能標識した。細胞溶解物からＥＤＴＡの不在下にＣＤ６− ＲｇＣＴＬＡ４−Ｉｇ或いは抗ＥＧＦレセプターｍＡｂと反応性のあるタンパク 質を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。矢印は、ＥＤＴＡの不在下に ＣＤ６−Ｒｇに結合した２つの放射能標識ポリペプチドを示す。分子量はｋＤａ で示されている。 図１４． ＣＤ６−Ｒｇはリンパ系器官において細胞に結合する。（Ａ）皮膚 に結合するＣＤ６−Ｒｇ。真皮中に散在する細胞が標識されている。毛幹の非特 異的標識は矢印で示されている。（Ｂ）ヒトＩｇＧ１と連続皮膚切片との反応性 。毛幹の弱い標識のみ明らかである（矢印）。（Ｃ）ＣＤ６−Ｒｇと胸腺組織と の反応性。微細な網目状の標識パターンが皮質内に存在している。（Ｄ）ヒトＩ ｇＧ１と胸腺組織との反応性。わずかなバックグラウンド標識だけが検出された 。（Ｅ）ＣＤ６−Ｒｇとリンパ節との反応性。中間又は皮質傍洞の細胞が標識さ れた。（Ｆ）ヒトＩｇＧ１のリンパ節組織への結合は観察されなかった。 図１５． ヒト表皮ケラチン細胞はＣＤ６の表面リガンドを発現する。培養し た表皮ケラチン細胞とＣＤ６−Ｒｇ、ＣＤ５−Ｒｇ又はＥＬＡＭ１−Ｒｇとの反 応性が示されている。細胞を５μgの融合タンパク質と２％ＢＳＡを含有するＰ ＢＳ中でインキュベートし、洗浄した。その融合タンパク質をヒトＩｇＧに対す るフルオレセイン複合ヤギ抗血清で標識し、フローサイトメトリーで分析した。 図１６． ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用は、ＴＥ−胸腺細胞結合を仲介す る。５回の個々のＴＥ−胸腺細胞結合実験の纏めが示されている。パネルＡは特 異抗体の存在下のロゼット形成量を示し、パネルBは融合タンパク質存在下のロ ゼット形成量を示す。標準誤差は棒線で示されている。抗ＣＤ６抗体及びＣＤ６ −Ｒｇ融合タンパク質は共にＴＥ−胸腺細胞結合を部分的に阻害し、Ｔ１２はロ ゼット形成を４９±９％だけ阻害し、ＣＤ６−Ｒｇはロゼット形成を３５±９％ だけ阻害した。対照と３５.１（ｐ＜０.００３）、Ｔ１２（ｐ＜０.０１５）と ＣＤ６−Ｒｇ（ｐ＜０.０５）間の結合の差は統計的に有意であった。 図１７． ＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合は、ＣＤ６特異的である。 ｍＡｂＴ１２による間接免疫蛍光及びフローサイトメトリーで求めたＣＯＳ−ｎ ｅｏ（対照）細胞及びＣＯＳ−ＣＤ６細胞上のＣＤ６発現のヒストグラムが示さ れている。バックグラウンド蛍光（対照ｍＡｂＰ３）は点線で示され、ＣＤ６発 現は実線で示されている。棒グラフは、ｍＡｂＰ３或いはＴ１２の存在下ＣＯＳ −ｎｅｏ及びＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合を示す。３回の個々の実験の平 均とＳＥＭが示されている。 図１８． ＣＤ６の胸腺細胞サブセット上の発現。胸腺細胞をｍＡｂＴ１２、 ヤギ抗マウスＩｇＧのフルオレセイン複合Ｆａｂフラグメント及びＣＤ４−ＰＥ とＣＤ８−サイクロムの組合わせで染色し、ＦＡＣＳｔａｒ^Plusフローサイトメ ータで分析した。全胸腺細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（未熟、ＤＰ）胸腺細胞、ＣＤ ４＋ＣＤ８−（成熟、ＳＰ４）及びＣＤ４−ＣＤ８＋（成熟、ＳＰ８）胸腺細胞 上のＣＤ６発現のヒストグラムによって３種類の異なる胸腺に関する実験の代表 的データが示されている。 図１９． ＣＤ６は、成熟及び未熟胸腺細胞の双方のＴＥ細胞への結合を仲介 する。ＣＤ１＋又はＣＤ１−胸腺細胞を、対照抗体（Ｐ３）、抗ＣＤ２（３５. １）又は抗ＣＤ６（Ｔ１２）の存在下にＴＥ細胞とインキュベートし、ロゼット 形成を分析した。３回の個々の実験からの抗ＣＤ２及び抗ＣＤ６によるＴＥ−胸 腺細胞結合及びＳＥＭ（対照抗体に相対する）の平均阻害％が示されている。Ｃ Ｄ１＋（未熟）胸腺細胞のＴＥ細胞への結合阻害は白い棒で示され、ＣＤ１（成 熟）胸腺細胞の結合阻害は斜線の棒で示されている。成熟及び未熟サブセットの 双方の胸腺細胞のＴＥＣへの結合は、抗ＣＤ２及び抗ＣＤ６抗体により阻害され る。抗ＣＤ２ｍＡｂ３５.１によるＣＤ１＋対ＣＤ１−細胞の阻害の差は統計的 に有意である（ｐ＜０.０１）が、抗ＣＤ６ｍＡｂＴ１２による阻害の差はなか った （ｐ＜０.２５）。 図２０． 胸腺上皮細胞及び胸腺線維芽細胞はＣＤ６のトリプシン感受性表面 リガンドを発現する。（Ａ）胸腺上皮細胞、胸腺線維芽細胞及び胸腺細胞のＣＤ ６−Ｒｇとの反応性を示す代表的ヒストグラムが示されている。また、各パネル においては、対照融合タンパク質ＣＤ５−Ｒｇによる蛍光のバックグラウンドレ ベルが示されている。（Ｂ）ＣＤ６−Ｒｇの２価カチオン含有培地中ＥＴ細胞へ の結合（−ＥＤＴＡ）、培地中トリプシン処理TE細胞への結合（トリプシン）或 いはＰＢＳ＋１０mMＥＤＴＡ中ＴＥ細胞への結合（ＥＤＴＡ）を試験した。間接 ＩＦ及びフローサイトメトリーにより求めたＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を 示す代表的実験（実施した＞１０回から）のヒストグラムが示されている。 図２１． ＣＤ６−Ｒｇ（７）ＴＥ細胞への結合に関するＪ４−８１及びＪ３ −１１９のプレインキュベーションの影響。２価カチオン（−ＥＤＴＡ）を含む 又は２価カチオンを含まない（＋ＥＤＴＡ）培地中ｍＡｂＰ３（対照）、Ｊ４− ８１又はＪ３−１１９の存在下、間接ＩＦ及びフローサイトメトリーで検出した ＣＤ６−ＲｇのヒトＴＥ細胞の表面への結合のヒストグラムが示されている。各 パネルにおいて対照ヒトＩｇＧの結合が示されている。下のパネルは、Ｐ３、Ｊ ４−８１或いはＪ３−１１９の存在下のＣＤ６−Ｒｇ結合の纏めの混成ヒストグ ラムを示すものである。データは、２価カチオンの存在下の１０回の実験及び２ 価カチオンを含まない２回の実験の代表である。 図２２． ｍＡｂＪ３−１１９は、ビオチニル化Ｊ４−８１のＴＥ細胞の表面 への結合を遮断する。ｍＡｂＡ３Ｄ８、Ｊ３−１１９及びＪ４−８１の増加濃度 の存在下のビオチニル化Ｊ４−８１の特異結合（蛍光単位−バックグラウンド） が示されている。希釈した腹水（１：５０、１：１００、１：２５０及び１：５ ００）を用い、ｍＡｂの相対量は希釈度×１０³の逆数として示されている。Ｔ Ｅ細胞の表面に強く結合するｍＡｂＡ３Ｄ８はＪ４−８１の結合を変えなかった が、Ｊ３−１１９と非ビオチニル化Ｊ４−８１の双方はビオチニル化Ｊ４−８１ の結合を阻害した。データは、２回の実験の代表である。 図２３． ｍＡｂＪ４−８１及びＣＤ６−Ｒｇは、ヒトＴＥ細胞の表面上の同 じ１００ｋＤａ糖タンパク質に結合する。ｍＡｂＰ３（対照）、ｍＡｂＪ４− ８１、ｈＩｇＧ１（ヒトＦｃ対照）或いはＣＤ６−Ｒｇに架橋した¹²⁵I標識ＴＥ 細胞表面タンパク質のオートラジオグラフが示されている。架橋したタンパク質 は、電気泳動の前に２−ＭＥ単独（架橋剤を切断する）或いはトリプシンと２− ＭＥで処理した。ＣＤ６−ＲｇとｍＡｂＪ４−８１の双方が同じトリプシン消化 パターンで１００ｋＤａタンパク質に結合した。データは、２回の個々の実験の 代表である。 図２４． ＣＤ６Ｌ−１００の生後ヒト胸腺における発現。ｍＡｂＪ４−８１ により間接ＩＦで染色した生後２ヵ月のヒト胸腺の凍結切片の光学顕微鏡写真（ ５つの胸腺について代表的実験）が示されている。パネルＡは、ｍＡｂＪ４−８ １により間接ＩＦで染色した胸腺の切片を示すものである。パネルＡは胸腺皮質 の切片を示し、パネルＢはハッサル小体（ＨＢ）を有する胸腺髄質の切片を示す 。胸腺莢膜は、パネルＡでは破線で示されている。皮質内及び髄質のＨＢ内及び 回りの胸腺上皮細胞（矢印）は共に、ｍＡｂＪ４−８１と反応した。胸腺細胞は 、ｍＡｂＪ４−８１と反応しなかった。同じパターンは、ｍＡｂＪ３−１１９を 用いて見られた(図示されていない)(４００×拡大)。 図２５． ＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合はＣＤ６特異的である。 図２５Ａ．ＣＯＳ−ｎｅｏ（対照）及びＣＯＳ−ＣＤ６細胞上へのＣＤ６の発 現のヒストグラムを間接的免疫蛍光法により抗ＣＤ６ｍＡｂＴ１２（Gangemiら 、J．Immunol．143:2439-2447(1989)）（実線）または対照抗体Ｐ３（点線）を 用いて決定した。 図２５Ｂ．棒グラフは、Ｔ１２、Ｊ４−８１またはＰ３ｍＡｂのいずれかの存 在下におけるＣＯＳ−ｎｅｏ及びＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合を示してい る。示されているのは、３回の異なる実験の平均及びＳＥＭである。 図２６． ＡＬＣＡＭと称されるＣＤ６リガンドの予期アミノ酸配列の配列分 析、ＡＬＣＡＭｍＲＮＡ発現のノザン分析、及び活性化Ｔ細胞によるＡＬＣＡＭ 細胞表面発現。 図２６Ａ．ＡＬＣＡＭ（残基３５−５１２）、ＢＥＮ、ニューロリン（neurol in）、ＲＡＧＥ及びＭＵＣ１８の免疫グロブリン様細胞外ドメインの調節。タン パク質名の直前の小文字は種を示している（ヒト(human)はｈ、にわと り(chicken)はｃ、及び魚（fish）はｆで示されている）。コンセンサス残基と は、３種以上のタンパク質において一致するものを言う。不変残基には影をつけ て示してあり、システイン残基はアステリスクを付けて強調している。示されて いるペプチド配列の番号は以下の出版物から得たものである：cBEN，8-484(Pour quieら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5261(1992)); ニューロリン、1ー466(L awssingら、Differentiation 56:21(1994)); RAGE，３種類のIgドメインを含む 、30-307(Neeperら、J．Biol．Chem．267:14998(1992)); MUC18，40-525(Lehman nら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9891(1989))。 図２６Ｂ．末梢血単球からの全ＲＮＡの１５μg及び休止及びＰＨＡ活性化（ ７２時間）末梢血単核細胞、Ｔ細胞リンパ種ＣＥＭ及びＭＯＬＴ４、赤白血病細 胞系Ｋ５６２、Ｂ細胞リンパ種ＲＡＭＯＳ、ＲＡＪＩ及びＤＡＵＤＩ、骨髄単球 細胞系ＨＬ６０及びＵ９３７、大顆粒球リンパ種ＹＴ、ヒト胸腺腫瘍ＨＢＬ−１ ００及びＣＯＳ細胞からの全ＲＮＡの２５μgを使用してＲＮＡブロットを作製 した。ランダムプライムされた(random primed)³²P-ラベル化ＡＬＣＡＭまたは グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡ をプローブとして使用した。 図２６Ｃ．末梢血単核細胞をインビトロにおいてＰＨＡにより活性化し、Ｔ細 胞のＣＤ６−ＲｇまたはＪ４−８１いずれかへの結合能を１０日間、２色免疫蛍 光及びフローサイトメトリー法を用いてモニターした。時間（日）に対する平均 のチャンネル(channel)蛍光をプロットした。 図２７． ヒト染色体地図。ｃＤＮＡプローブのＲバンド染色体への切片上ハ イブリッド形成（ＦＩＳＨ）により、バンドｑ１３．１−ｑ１３.２における染 色体３上の両方の染色分体上にシグナル（矢印で示されている）が発生した。領 域はＧバンドイデオグラム上の括弧で示されている。 図２８． ＡＬＣＡＭのＣＤ６への結合 図２８Ａ．抗ＡＬＣＡＭｍＡｂＪ４−８１及びＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクのＡ ＬＣＡＭ発現ＣＯＳ細胞形質移入体への結合を示すフローサイトメトリーヒスト グラム。 図２８Ｂ．抗ＣＤ６ｍＡｂＧ３−６及びＡＬＣＡＭ−ＲｇのＣＤ６発現ＣＯＳ 細胞形質移入体への結合を示すフローサイトメトリーヒストグラム。ｍＡｂのま たは融合タンパクのみかけの形質転換ＣＯＳ細胞に対するバックグラウンド結合 のレベルは、影の付いたヒストグラムで示されている。 図２９． ＡＬＣＡＭコード配列及び予期アミノ酸配列 発明の詳細な説明 本発明は、結合対の一方の構成部分を示す分子に関するものであり、このとき その結合対のもう一方の構成部分は成熟胸腺細胞、末梢Ｔ細胞及びＢ細胞サブセ ットの表面上に存在するＣＤ６分子である。本明細書中で言及されるＣＤ６リガ ンドは２つの形態で存在し、１つはＣＤ６結合に対して２価カチオン非依存性で あり、もう１つは２価カチオン依存性である。これらの形態の１番目（カチオン 非依存性形態）は、１０５ｋＤａタンパク質を含み（還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅで求めた）、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）と称される。２番目の 形態は、二価カチオン依存性であり、ＡＬＣＡＭとは分離した異なる分子であり 、９０ｋＤａタンパク質を含んでいる（還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで求めた） 。図２９に示される予期アミノ酸配列に基づいたＡＬＣＡＭの分子量は約６５ｋ Ｄａである。図２９に示されるＡＬＣＡＭのアミノ酸配列は、Ｎ−結合グリコシ ル化のための９つの潜在部位を含む。従って、ＡＬＣＡＭＣＤ６リガンドのグリ コシル化された形態は１００〜１０５ｋＤａの分子量を有すると考えられる。 ＡＬＣＡＭは成熟タンパクから開裂したＮ−末端疎水性シグナルペプチド、次 に細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン及び原形質ドメインからなる。単一ド メインまたはドメインの組合せを、様々な相互作用を阻害するために使用するこ とができる。例えば、細胞外ドメイン（単独で、または同じあるいは他の配列と 組み合わせて）は、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ相互作用の阻害のための有用な物質であ ることが期待される。ＡＬＣＡＭの細胞外ドメインは５つの免疫グロブリン（Ｉ ｇ）様ドメインに分けることができる。２つのＮ−末端ドメインはＶ−セットで あり、続く３つのＩｇドメインはＣ２−セットのものである(Pourquieら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:5261(1992); Tanakaら、Neuron 7:535(1991); Burnsら、Nueron 7:209(1991))。これらのＩｇ様ドメインは他の配列から単離し て、または他の配列と組み合わせて使用することができる。 本発明のＣＤ６リガンド（ＡＬＣＡＭ）は、線維芽細胞、皮膚表皮ケラチン細 胞、髄質ＴＥＣ、消化管上皮、膵島及び腺房細胞並びに単球及び活性化Ｔ細胞、 肝細胞及び脳皮質のニューロンを含む様々な種類の組織及び細胞上に存在する。 ＣＤ６リガンドの組織分布は、ＣＤ６／ＣＤ６リガンド系がＴ細胞と単球及び他 の活性化Ｔ細胞並びに上皮細胞、線維芽細胞及び膵島細胞のような特殊化された 細胞との相互作用の仲介に重要であることを示す。ＣＤ６及びＣＤ６リガンドの 脳内での発現はＣＤ６／ＣＤ６リガンド系が神経系細胞の相互作用に関連するこ とを示している。 本発明のＣＤ６リガンドは、下記実施例に記載されるように免疫沈降により、 例えばＣＤ６融合タンパク質を用いて天然源（上記参照）から単離することがで きる。適切な融合タンパク質、ＣＤ６−Ｉｇ（＝ＣＤ６−Ｒｇ）融合タンパク質 は、ＣＤ６の細胞外部分のコーディング配列（Aruffoら，J．Exp．Med．174:949 (1991)）をSeed & Aruffo(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3365(1987))に記載 されているようにヒトＩｇＧのＦｃ部分のコーディング配列に結合することによ り生産することができる。ＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質は、以前に記載されてい るように過渡的トランスフェクションによりＣＯＳ細胞中で発現させることがで きる(Seed & Aruffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3365(1987))。 上記で言及したものを含む細胞源からのＣＤ６リガンドの利用可能性は、ＣＤ ６リガンド遺伝子のクローニングを可能にする。ＣＤ６リガンドの全て又は一部 の配列決定は、ＣＤ６リガンドコーディング配列を、例えば、ｃＤＮＡ又はゲノ ムＤＮＡライブラリーから単離する際の使用に適切な核酸プローブ又はプライマ ーを設計するのに必要な情報を与えるであろう。StratageneからのUnizap XR系 を用いて胸腺上皮細胞から適切なｃＤＮＡライブラリーを調製することができる 。使用することができる他のライブラリーとしては、Stratageneからの脳前頭皮 質及び肝臓腫瘍ＨｅｐＧ２ｃＤＮＡライブラリーが含まれる。 更に詳細には、ＣＤ６リガンドはアフィニティークロマトグラフィーで精製す ることができる。抗ＣＤ６リガンドｍａｂ(５〜１０mg)(例えば、Pesandoら， J．Immunol．137:3689(1986))を用いて、Patelら(Virology l49:174(1986))に記 載されているように抗ＣＤ６リガンドをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ(Pharm acia)上に固定化することによりＣＤ６リガンドに対するアフィニティーカラム を調製することができる。タンパク質溶解物、例えば胸腺上皮細胞からの又はＢ 細胞系溶解物からのＣＤ６リガンドは、抗ＣＤ６リガンドセファロースカラムを 用いてアフィニティー精製することができる。ＣＤ６リガンドは、更にトリフル オロ酢酸を含むアセトニトリル／Ｈ₂Ｏ勾配を用いるＣ₁₈逆相ＨＰＬＣカラム(Vy dac)により２４０nmのＵＶ検出で精製することができる。（実施例IVは乳ガン細 胞からのＣＤ６リガンドのＪ４−８１免疫精製の記載を含む。） 純度が決定されると、未処理（intact）ＣＤ６リガンド及びＶ８−プロテアー ゼ、トリプシンまたは他のプロテアーゼにより産生するペプチドのＮ−末端アミ ノ酸配列を決定することができる。アミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプ ライマーを、ＣＤ６リガンドのｃＤＮＡを認識するように設計して、ＣＤ６リガ ンドｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することができる。ＰＣＲ増幅におけるエラーを防御 するために、³²Ｐ−ラベル化ＰＣＲ増幅ＣＤ６リガンドｃＤＮＡを適するｃＤＮ ＡライブラリーからＣＤ６リガンドｃＤＮＡを検出するためのプローブとして使 用することができる。ＣＤ６リガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列は標準的な方 法を用いて決定することができる。（一般的には以下を参照。Sambrook，Fritsh 及びManiatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)） 実施例IVは、パルス−液体タンパク質配列決定装置内における精製したＡＬＣ ＡＭ及びそのＣＮＢｒフラグメントの分析についての記述を含む。未処理タンパ ク及び内部フラグメントからのアミノ酸配列は、ニワトリ神経接着分子ＢＥＮ／ ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰと相同性である。実施例IVは、ニワトリＢＥＮに相 当するＤＮＡフラグメントを使用してＣＤ６リガンドｃＤＮＡを単離することを 記載している。ＡＬＣＡＭｃＤＮＡ配列及び予期アミノ酸配列は図２９に示され ている。 クローン化されると、ＣＤ６リガンドコード配列を発現構築物の中に導入する ことができる。その構築物は、ベクター（例えば、ウイルス又はプラスミド）及 びプロモーターに操作的に連鎖したＣＤ６リガンドコード配列を含んでいる。そ の構築物を用いて原核又は真核宿主細胞を形質転換することができる。ＣＤ６リ ガンドはグリコシル化タンパク質であるので、真核宿主が好ましい。哺乳動物細 胞系が特に有利である（例えば、ＣＯＳＭ６系）。ＣＤ６リガンドは、形質転換 宿主をコード配列が転写されかつその転写物がタンパク質に翻訳されるような条 件下に培養することにより可溶性形態で生産することができる。 本発明は、ＣＤ６リガンド全体に関し、更に、例えば、ＣＤ６リガンドに特異 的な抗体(モノクローナル又はポリクローナル)(又はその結合断片)を生じる標準 免疫化プロトコールに使用することができる抗原としての使用に適切なその一部 に関する（リガンドおよびその一部は化学的にまたは組換えにより合成すること ができる）。その一部は、ＣＤ６リガンドの少なくとも５連続アミノ酸（ＡＬＣ ＡＭ配列の例は図２９に示されている）、好ましくは少なくとも１０〜１２アミ ノ酸、更に好ましくは少なくとも２５連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも ４０、４５または５０アミノ酸を表す。より大きな一部、例えば、少なくとも１ ００、２５０又は５００アミノ酸の一部も使用することができる。本発明は、単 独の、または他のＣＤ６リガンドドメイン配列または非ＣＤ６リガンド配列と組 合せた、シグナル配列、または細胞外、膜貫通あるいは細胞質ドメインに相当す るＣＤ６リガンドを含む。 本発明は、また、ＣＤ６リガンドコード配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）全体及び その一部に関し、これらは、例えばプローブまたはプライマーとしての使用に適 している（strategene及び／またはGibcoによる標準的に記載されるハイブリダ イゼーション条件（例えばＰＣＲに対する）を使用することができる）。そのよ うな部分はＣＤ６リガンドの（例えば、図２９に示される配列の）少なくとも１ ５、２０、３０、７５または１５０ヌクレオチドを表す。また、より大きな部分 、例えば、少なくとも３００、７５０または１５００ヌクレオチドの部分、を使 用することができる。本発明は、シグナル配列または細胞外、膜貫通または細胞 質ドメインに相当するＣＤ６リガンドの一部を含む。そのような部分は、様々な 組合せ及び非ＣＤ６リガンドコード配列（例えばＡＬＣＡＭ−Ｒｇ）との組合せ 中に存在する。 抗ＣＤ６ｍａｂによりＣＤ６をＴ細胞上に結合すると、分離されていないＴ細 胞に効力のあるコマイトジェンシグナルを与え(Gangemiら，J．Immunol．143:24 39(1989); Morimotoら，J．Immunol．140:2165(1988); Weeら，J．Exp．Med．17 7:219(1993))、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを直接活性化し(Swackら，J ．Biol．Chem．266:7137(1991))、ＴＣＲγδを直接活性化するがＴＣＲαβＴ 細胞を活性化しない(Pawlecら，Hum．Immunol．31:165(1991))。即ち、ＣＤ６は ＴＣＲ仲介Ｔ細胞の引き金となることに密接に関係する成熟Ｔ細胞分子であり、 ＴＣＲ複合体の連結反応はＣＤ６リン酸化をもたらす(Weeら，J．Exp．Med．177 :219(1993))。生体内でＣＤ６／ＣＤ６リガンド相互作用を阻害する方法は、効 力のある免疫治療法を与える。 可溶性ＣＤ６リガンド（天然源から単離又は組換え的に生産した）を用いて、 例えば、Ｔ細胞ＣＤ６−ＣＤ６リガンド＋補助細胞接触に依存するＣＤ６仲介Ｔ 細胞活性化を阻害することができる。その免疫治療法は、多発性硬化症のような 活性化Ｔ細胞による疾患、コーガン症候群を含む炎症性葡萄膜炎、リウマチ様関 節炎、ウェゲナー肉芽腫症及び一過性動脈炎のようなＴ細胞仲介脈管炎症候群及 び臓器同種異系移植拒否反応を治療するのに有効である。実際に、同種異系骨髄 （ＢＭ）移植片に用いたＢＭのＣＤ６ｍａｂ欠乏が移植片対宿主疾患を防止する ことが示された(Soifferら，J．Clin．Oncol．10:1191(1992))。 可溶性ＣＤ６リガンドのほかに、可溶性ＣＤ６並びにＣＤ６及びＣＤ６リガン ドのミメトープ(模擬体)(例えば、ランダムＲＮＡ、ＤＮＡ又はペプチドライブ ラリーから、例えば、Szostak(TIBS 17:89(1992))又はTsaiら(J．Immunol.150:1 137(1993))に記載されているように調製された)を、ＣＤ６／ＣＤ６リガンド相 互作用を阻害することを含む方法において免疫治療剤として用いることができる 。抗ＣＤ６及び抗ＣＤ６リガンド抗体（好ましくはモノクローナル抗体）もその 方法に用いることができる。これらの免疫治療剤は、例えば、薬学的に許容しう る担体、希釈剤等と医薬組成物として処方される。組成物中の活性剤の濃度及び 活性剤の投与量は、物質、患者及び探究された効果によって変動する。最適投与 量は容易に決定することができる。 ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用がＣＤ６発現細胞のＴＥ細胞への接着を仲介 するという証明は、ＣＤ６−ＣＤ６リガンド結合がＴ細胞成熟調節の役割を果た していることを示している。ＣＤ２／ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、 ＶＬＡ−３、−４、−６及びフィブロネクチンを含む他の分子は、胸腺細胞−ス トローマル細胞の結合における接着分子として作用する(Singer et al，J．Immu nol．144:2931-2939(1990)，Giunta et al，J．Exp．Med.，173:1537-1548(1991 )，Utsumi et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5685-5689(1991))。ＣＤ６ リガンドの同定により、胸腺細胞-ＴＥ細胞結合及びＴＥ細胞成熟におけるＣＤ ６の相対的寄与を決定することができる。ＣＤ６リガンドはまた、Ｂ細胞の発生 にも関与していてもよい。というのはニワトリにおける研究は、ＡＬＣＡＭ（Ｂ ＥＮ）がファブリシウス(Fabricius)のブルサ（Pourquie et al，Development 1 09:743-752(1990)）（Ｂ細胞が発生する鳥の器官）における内皮細胞上に発現さ れることを示したからである。現在、ＣＤ６リガンドの細胞間シグナルの変換能 については、全く情報がない。抗−ＣＤ６ｍＡＢＴ１２は補助（修飾）細胞の存 在下、かつ架橋ＦｃＲの明確な不在下においてＴ細胞を活性化できるという発見 は、ＣＤ６を通じたシグナルによるＴ細胞の活性化が自己免疫反応性において重 要であることを示している(Gangemi et al，J．Immunol．143:2439-2447(1989)) 。このサポートとして、抗ＣＤ６ｍＡｂは自己ＭＬＲを増強または阻害すること ができる（Gangemi et al，J．Immunol．143:2439-2447(1989)，Bott et al，In t．Immunol．7:783-792(1994))(Singer，N.G．et al，J．Immunol．(1994))。Ｃ Ｄ６リガンドは活性化されたＴ細胞及び単球並びに多数のＴ及びＢ細胞系により 発現されるので、ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用はＣＤ６＋Ｔ及びＢ細胞と活 性化された白血球の間の機能的な相互作用の役割を果たしていると考えられ、Ｃ Ｄ６−ＣＤ６リガンド結合は活性化白血球の間の接着相互作用を仲介すると考え られる。このように、ＡＬＣＡＭは炎症応答の開始に影響しなくてもよいが、リ ウマチ様の関節炎のような慢性的炎症応答の維持を阻害してもよい。 ニワトリにおけるＡＬＣＡＭ（ＢＥＮ）は、初期の胚発生の期間及び脳におい て優位に発現される(Pourquie et al.，Development 109:743-752(1990))。ＡＬ ＣＡＭは、同種親和性接着分子として機能し、かつ神経突起の成長をサポー トする(Tanaka et al，Neuron 7:535-545(1991))，Burns et al, Neuron 7:209- 220(1990))。脳におけるニューロンによるヒトＡＬＣＡＭの発現が報告されてい る（Peter et al，"Identification and characterization of an 100kDa ligan d for CD6 on human thymic epithelial cells"，J．Exp．Med．(1994))。免疫 系及び神経系間の相互作用は、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び筋萎縮性 側索硬化症のような、特定の慢性的神経変性症の病理学において重要である(App el et al，Advances in Neurology 56:405-412(1991)，McGeer et al，Can．J． Neurol．Sci．18:376-379(1991)，Rowland，L．P.，Advances in Neurology 56: 3-23(1991))。ＣＤ６及びＣＤ６リガンドが両方ともこれらの系における細胞に より発現されるという知見は、レセプター／リガンド対が免疫及び神経系間の細 胞性相互作用において機能することを示している。 例えば、炎症は免疫応答の増幅を必要とするので、ＣＤ６結合のブロックは免 疫応答増幅及び炎症を防止することが予想できる。さらに、脳の細胞による白血 球相互作用の阻害は、慢性的神経変性病の治療に使用することができる。ＡＬＣ ＡＭにおける突然変異は、神経及び／または免疫系の障害を誘導することが予想 される。そのような障害が明らかになると、ＣＤ６リガンドヌクレオチド配列ま たはＣＤ６リガンドに対して同定されたＲＦＬＰ（制限フラグメント長多形性） (restriction fragment length polymorphisms)を、遺伝子検索候補のマーカー として使用することができる。例えば、ＡＬＣＡＭは運動ニューロン及び／また は免疫細胞上に発現されるため、ＡＬＣＡＭ変異をスクリーニングする候補の病 気は、筋萎縮性側索硬化症及び多発性硬化症の散発的事例である。 上記に加えて、本発明明細書の記載から、例えば可溶性ＡＬＣＡＭを障害また は重症の神経の再生を誘導するために使用できることが好ましい。障害を受けた 神経の部位に可溶性ＡＬＣＡＭを、例えば注入により投与することにより、誘導 を行うことができる。 ＣＤ６リガンド遺伝子は、神経系及び免疫系に影響するメンデル障害における 変異に対する潜在的候補である。さらなる試験を示唆する病気は、まだ、ＣＤ６ リガンド遺伝子が割り当てられるヒト染色体３の領域に位置づけられていない。 ＣＤ６リガンドｃＤＮＡにおいて同定される多形性は、遺伝子除外研究の候補と して使用することができる（注目される多形性は、ｃＤＮＡは、ＰＨＡ活性化ｃ ＤＮＡライブラリー及びＨＬ６０細胞から得られるという事実に起因するもので あってもよい）。 下記の制限されない実施例において、本発明の具体的な態様が詳細に記載され る。 実施例Ｉ 実験の詳細 ： 細胞及び培養条件。 ＴＥＣを、以前に記載されているように強化培地中で移 植片手法により培養した（Singerら，Human Immunol．13:161(1985)）。ヒト胸 腺組織を、心臓血管矯正手術を受ける子供たちからの廃棄組織としてデュークユ ニバーシティーメディカルセンターの病理科から入手した。汚染している胸腺線 維芽細胞を、ヒト線維芽細胞上の細胞表面抗原に結合するｍＡｂ１Ｂ１０と補体 仲介溶菌により除去し（Singerら，J．Invest．Dermatol．92:166(1989)）、次 にＰＢＳ中０.０２％ＥＤＴＡで処理した。３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層をＰＢ Ｓ中０.０２％ＥＤＴＡで処理した後、培養皿から０.０２％ＥＤＴＡを含有する ＰＢＳ中０.０５％トリプシンでＴＥＣを剥離した。細胞を３回洗浄した後、分 析した。ＴＥＣを、５％ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、０.０２５ μg/mlアンホテリシンＢ(Gibco)、１００U/mlペニシリン及び１０００μg/mlス トレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中５００U/mlＩＦＮ−γで３７℃において ４８〜７２時間活性化した。 胸腺細胞は、胸腺組織からかき裂くことにより得、フィコール−ヒパックで遠 心することにより精製し、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。胸腺細胞を直ちに用い るか又は２０％ＦＣＳ、７.５％ＤＭＳＯ及びＲＰＭＩ１６４０中１０μg/mlゲ ンタマイシン(Scherring)を含有する培地中で凍結した。凍結した胸腺細胞を、 記載されているように３０％ＦＣＳ、１０μg/mlデオキシリボヌクレアーゼＩ(S igma)、１０μg/mlゲンタマイシン及びＲＰＭＩ１６４０中２０U/ml(Upjohn)を 含有する培地中でインキュベートすることにより解凍した(Denningら，J.Immuol ．138:680(1987))。生存胸腺細胞をフィコール−ヒパックで遠心することにより 精製した。 ＣＯＳ−Ｍ６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム (Gibco)、０.０２５μg/mlアンホテリシンＢ(Gibco)、１００U/mlペニシリン及 び１００μg/mlストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で生育した。 ヒト表皮ケラチン細胞（ＥＫ）を新生児前皮膚から培養した。前皮膚をＨＢＳ Ｓ(GIBCO)中２.５mg/mlトリプシンＩＩＩ型(Sigma)中で４℃において一晩インキ ュベートし、表皮を取り出し、単細胞浮遊液の中へかき裂き、マイトマイシンＣ 処理３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上に播種し、記載されているように培養した(H ashimotoら，J．Exp．Med．157:259(1983))。 細胞表面抗原の検出： 非固定培養細胞をＰＢＳ、ＴＢＳ（０.９M ＮａＣｌ 、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.３）或いは２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を 含有するＤＭＥＭに懸濁した。細胞をＣＤ６−Ｒｇ、ＣＤ５−Ｒｇ又はＥＬＡＭ −Ｒｇ(Sandro Aruffo，Bristol-Myers Squibb)、組換え融合タンパク質（１０ ０μg/ml）と４℃で３０分間インキュベートし、２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃ を含有するＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ₁を第２試薬とし て用いた。細胞をFACStar Plusフローサイトメータ（Becton-Dickinson，Inc.、 マウンテンビュー、カリフォルニア州）で分析し、データをソフトウェアプログ ラム PC-Lysys(Becton-Dickinson)を用いて処理した。 ＴＥＣ−胸腺細胞ロゼット結合分析： ＴＥＣ−胸腺細胞ロゼット結合分析を 記載されているように行った（Singerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6588 (1986)）。簡単に述べると、１０⁶胸腺細胞を２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を 含有するＰＢＳ又はＤＭＥ中２×１０⁵ＴＥＣと混合し、２５０ｇで３分間遠心 し、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を弱く再懸濁し、光学顕微鏡によ って計数した。胸腺細胞を３個以上結合したＴＥＣを陽性として評価した。これ らの実験で用いた胸腺細胞を新たに単離するか、液体窒素から解凍するか或いは 亜集団に分離した。胸腺細胞を、Ｎａｌ／３４（抗ＣＤ１；Andrew McMichael、 オックスフォード、英国）及びヤギ抗マウスＩｇＧ(KPL)で間接免疫蛍光染色し た後にFACStar Plusを用いて蛍光活性化細胞選別することによりＣＤ１⁺（未熟 、ＣＤ６^low）又はＣＤ１（成熟、ＣＤ６^hi）亜集団に分離した。選別した細胞 の再分析により全胸腺細胞亜集団は純度＞９５％であった。ＴＥＣ−胸腺細胞結 合は、結合前に胸腺細胞或いはＴＥＣを抗体又は融合タンパク質とプレインキュ ベートすることにより阻止した。使用した抗体は次のものとした：Ｐ３Ｘ６３( 対照ｍａｂ)(ＡＴＣＣ)、３５.１（抗ＣＤ２；John Hansenから、シアトル、ワ シントン州（Martinら，J．Immunol．131:180(1983)）及びＴ１２（抗ＣＤ６；E llis Reinherzから、ボストン、マサチューセッツ州(Reinherz ら，CeII 30:735( 1982)) 。 ＣＯＳ細胞トランスフェクション及び結合実験： 安定なＣＤ６発現ＣＯＳ細 胞系を、ＣＭＶプロモーターの制御下ＣＤ６遺伝子を含むプラスミド(A．Aruffo 、シアトル、ワシントン州 Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991))及びLiao らに記載されているＳＶ４０プロモーターによって誘導された細菌ネオマイシン 耐性遺伝子を含むｐＳＶｎｅｏプラスミド(J．Immunol．12/1,1993)を同時トラ ンスフェクトすることにより作成した。ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞 は、６０μg/mlＧ４１８(GIBCO)を含有するＤＭＥ／１０％ＦＣＳ中でインキュ ベートすることにより選択した。ＣＤ６を発現する細胞は、ｍａｂＴ１２を用い て間接免疫蛍光で同定した。ＣＤ６陽性及び陰性細胞は、Becton-Dickinson FAC Star^Plusフローサイトメータを用いて単細胞選別することによりクローン化した 。 ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ）及び対照ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−Ｎ ｅｏ）を上述したものと同じＴＥ細胞と共に結合実験に用いた。ＣＯＳ細胞とＴ Ｅ細胞とを区別するために、ＴＥ細胞を収集前に１μg/mlカルセインＡＭ(Molec ular Probes、ユージーン、オレゴン州)と３７℃で１５分間代謝的に標識した。 カルセインＡＭ標識細胞は蛍光性であり、蛍光顕微鏡で他の細胞から容易に区別 することができる。 ＣＤ６−Ｒｇ（ＣＤ６−Ｉｇ）キメラ遺伝子の構築及び融合タンパク質の調製 ： 全長ＣＤ６をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（Aruffoら，J．Exp．Me d．174:949(1991)）を制限酵素Ｅｓｐ１で消化することにより、ＣＤ６免疫グロ ブリン融合遺伝子を構築した。次に、Ｅｓｐ１消化プラスミドをＤＮＡポリメラ ーゼとフラッシュし、それに適切なＢａｍＨＩリンカーを加えた。次に、そのプ ラスミドをＢａｍＨＩ及びＮｄｅ１で消化した。次に、ＣＤ６の細胞外ドメイン を 含む断片を単離し、ヒトＩｇＧ１タンパク質の定常部をコードするｃＤＮＡ断片 を含むベクター中にサブクローン化した（Aruffoら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 89:2292(1992)）。ＣＤ５−Ｉｇ及びＣＴＬＡ４−Ｉｇの構築は別に記載され ている(Linsleyら，Science 257:792(1992)及びJ．Exp．Med．174:561(1991))。 適切な遺伝子の５００μgのＤＮＡをＤＥＡＥ−デキストランクロロキン法によ りＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。１８〜２４時間後、１０％ＦＢＳダルベ ッコ変法イーグル培地を無血清培地で置き換え、その後ＰＢＳで洗浄した。細胞 培養液を７〜１０日維持した後、収集した。簡単に述べると、融合タンパク質を 含む上清を２５００rpmで２０分間遠心し、０.４５μmミリポアフィルターでろ 過した。上清を２ml充填プロテインＡカラムに流速１.００ml／分で通過させた 。結合した融合タンパク質をｐＨ３.５、０.１Mクエン酸で溶離し、直ちにｐＨ ９.０、１.０Mトリスで中和した。次に、溶離したタンパク質をＰＢＳ中で一晩 透析し、Bradford法を用いてタンパク質を定量した。 ＣＤ６−ＩｇのＴＥ細胞への結合を阻害するｍａｂのスクリーニング： ヒト 白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からのｍａｂ及び抗インテグリンｍａ ｂのパネル（図４の説明参照）の中から第２試薬としてフルオレセイン複合ヤギ 抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ）を用いて上述のＴＥ細胞表面の反応性をスクリーンし た。ＴＥ細胞に反応した１５４ｍａｂの中の１２６をこの分析に用いた。ＴＥ細 胞（１００ｋ）を腹水又は精製ｍａｂと１：１００で４℃で１５分間インキュベ ートした。この混合液にＣＤ５−Ｉｇ或いはＣＤ６−Ｉｇ（５μg）を加え、４ ℃で２時間反応した。ＰＢＳ含有２％ＢＳＡで洗浄した後、ＣＤ５−Ｉｇ及びＣ Ｄ６−ＩｇをヒトＩｇＧ(Sigma)のＦｃタンパク質に特異的なフルオレセイン複 合ヤギ抗血清で標識した。この試薬は、ほとんどのマウスｍａｂと交差反応しな かった。生じる交差反応性を説明するために、ＣＤ６−ＩｇとＣＤ５−Ｉｇを含 む試料間の蛍光（ΔＦL）の差である結合を求めた。対照ｍａｂＰ３とプレイン キュベートした試料のΔＦＬを１００％結合とした。 免疫沈降及びタンパク質標識条件： １２０μCi/mlグルコサミン（ＮＥＮ） を標識実験に用いた。放射能標識グルコサミンの添加と同時に細胞を無グルコー ス培地＋１０％透析ウシ胎児血清中で４８時間培養した。次に、細胞をＥＤＴＡ を用いて引き上げ、ＨＢＳＳ中で洗浄し、ロイペプチン、ＰＭＳＦ及びペプスタ イン（１μg/ml）、０.０５％胆汁酸ナトリウム、２％ＮＰ−４０を含有する２ ０mMトリス、ｐＨ７.５に溶解した。その溶解物を１００μg/mlヒトＩｇＧ１、 次に５０μlのプロテインＡビーズで前清澄化した。次に、前清澄化した溶解物 を５０μg/mlＣＤ６−Ｒｇ又はＣＴＬＡ４−Ｉｇ又は２μg/ml抗ＥＧＦレセプタ ー抗体とインキュベートした。その溶解物に２mMＣａ++及びＭｇ++を加えた（こ れはＨＢＳＳ結合バッファーに含有した２価カチオンの濃度である）。免疫沈降 物を溶菌バッファーで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローデ ィングバッファー中で煮沸し、８〜１０.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した 。そのゲルを４０％プロパノール中に固定し、ｍＡＭｉＡｍｐｌｉｆｙ^R試薬(Am ersham)で増強し、乾燥し、オートラジオグラフィー理した。結果 ： 抗ＣＤ６ｍａｂ及びCＤ６−Ｉｇ融合タンパク質はＴＥ−胸腺細胞結合を阻害 する： 浮遊液ＴＥ−胸腺細胞結合分析を用いて（表１）、ＣＤ６ｍａｂＴ１２ がＴＥ−胸腺細胞結合を４９±９％（Ｎ＝５）だけ阻害することがわかった。同 様に、組換えＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質はＴＥ−胸腺細胞結合を３５±９％（ Ｎ＝５）だけ阻害した。これにより、ヒトＴＥＣがＣＤ６のリガンドを発現する ことが示された。 対照は、ｍａｂに対してＰ３及びＣＤ６−Ｉｇに対してＥＬＡＭ−Ｉｇとした。 Ｐ値は、ｍａｂ又はＣＤ６−Ｉｇの存在下の結合を対照結合と比較するテイルが ２つのスチューデントのｔ検定を表す。 ヒトＴＥ細胞はＣＤ６のリガンドを発現する： ヒトＴＥＣがＣＤ６のリガン ドを発現することを確認するために、ＴＥＣを組換えＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク 質とインキュベートし、間接免疫蛍光、次いでフローサイトメトリーによりＣＤ ６−ＩｇのＴＥＣへの結合を分析した。負の対照（ＣＤ５−Ｉｇ及びＥＬＡＭ− Ｉｇ）はいずれもＴＥＣ表面に結合しなかったが、ＣＤ６−ＩｇはＴＥ細胞に結 合し（表２）、ヒトＴＥ細胞表面上に発現したＣＤ６のリガンドがあることが示 された。ＣＤ６−ＩｇのＴＥ細胞上のＣＤ６リガンドへの結合は２価カチオン（ Ｃａ⁺⁺及びＭｎ⁺⁺）によって高められ、ＥＤＴＡによって部分的に阻害された（ 図１及び図２）。データは、ＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合に対して少なくとも ２成分があり、１成分（又はリガンド）は２価カチオンに依存し、１成分（又は リガンド）は２価カチオンに依存しない。 ＣＤ６は接着性分子である： Ｔ１２とＣＤ６−Ｉｇが共に胸腺細胞のＴＥＣ への結合を部分的に阻害するという事実は、ＣＤ６が接着性分子であることを示 した。しかしながら、ＴＥロゼット実験は、Ｔ１２とＣＤ６−Ｉｇが立体障害の ためにＴＥ−胸腺細胞結合を阻害する可能性を除外しなかった。ＣＤ６が実際に 接着性分子であるかを求めるために、高レベルのトランスフェクトしたＣＤ６を 発現するＣＯＳ細胞系（ＣＯＳ−ＣＤ６）を作成した。ＣＤ６の存在しないＣＯ Ｓ細胞（ＣＳ−Ｎｅｏ）はＴＥＣに結合しなかったが、ＣＯＳ−ＣＤ６細胞はＴ ＥＣを結合した（図３）。更に、このＣＯＳ−ＣＤ６：ＴＥ細胞結合は、結合が ＣＤ６に対するｍａｂ（Ｔ１２）によって阻害されるのでＣＤ６依存性であった 。 ｍａｂＪ４−８１はＣＤ６のリガンドと反応する： そのＣＤ６リガンドを同 定するために、ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からの抗インテグ リンｍａｂの多量のパネル及び４７９ｍａｂのブラインドパネルの中からＴＥ細 胞に対する反応性をスクリーンした。ＴＥＣと反応した１５４ｍａｂの中の１２ ６ｍａｂを分析に用いてＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合を阻害した。図４に示さ れるように、研究会ｍａｂＳ２５２（Ｊ４−８１）だけがＣＤ６−Ｉｇの ＴＥＣへの結合を阻害することができた。Ｂ細胞表面抗原に対して高めたｍａｂ Ｊ４−８１は、Ｂ細胞上の１０５ｋＤａタンパク質を認識し(Pesandoら，J．Imm unol．137:3689(1986))、培養した全ＴＥＣ上の表面（図５）及びヒト胸腺の凍 結切片中の髄質ＴＥＣ（図６）と強く反応する。 ＴＥＣからの１０５ｋＤａ、９０ｋＤａ及び３５ｋＤａ分子のＣＤ６−Ｉｇに よる免疫沈降： ＥＤＴＡ不在下に、ＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質は分子量１０ ５、９０及び３５ｋＤａを有するタンパク質分子を免疫沈降した(図７、レーン １)(注：約１５０ｋＤａバンド)。ＥＤＴＡ存在下に、ＣＤ６−Ｉｇは１０５及 び３５ｋＤａ分子のみ免疫沈降した(図７、レーン２)(注：約１５０ｋＤａバン ド)。レーン３では、ＥＤＴＡ不在下に、対照融合タンパク質、ＣＴＬＡ４−Ｉ ｇは１０５、９０又は３５ｋＤａタンパク質分子を免疫沈降しなかった。 ｍａｂＪ４−８１はＴＥ細胞のＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ細胞への結合を阻害する：ｍ ａｂＪ４−８１によって検出した１０５／３５ｋＤａタンパク質分子がＣＤ６の リガンドであることを定義するために第３の方法を用いた。上で示したように、 ＣＯＳ−ＣＤ６：ＴＥＣ結合はＣＤ６特異的である。ＣＤ６とＪ４−８１によっ て認識された１０５／３５ｋＤａ分子が接着性分子対を形成することを更に証明 するために、ｍａｂＪ４−８１によるＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ：ＴＥＣ結合が阻害され た（表３）。 Ｐ値は、Ｔ１２又はＪ４−８１の存在下の阻害をＰ３の存在下の阻害と比較する テイルが２つのスチューデントのｔ検定を表す。 間接ＩＦ分析におけるＪ４−８１とヒト組織の反応性： ｍａｂＪ４−８１は 、ＴＥＣ、表皮ケラチン細胞、膵の腺房細胞及び島細胞、消化管上皮、単球（１ ０％）及び活性ＢＰＴ細胞（２１％）と反応した。Ｂ細胞は、Ｈ４−８１にも陽 性である(Pesandoら，J．Immunol．137:3689(1986))。一緒にすると、これらの データからＣＤ６−ＣＤ６リガンド系がＴＥＣ−胸腺細胞相互作用に関係するこ と、ＣＤ６が接着性分子であること及びｍａｂＪ４−８１によって検出された１ ０５／３５ｋＤａタンパク質がＣＤ６のリガンドを含むことが証明される。更に 、ｍａｂＪ４−８１によって定義されたＣＤ６−２価カチオン非依存性リガンド が様々な種類の免疫及び上皮細胞上で発現されることは、ＣＤ６／ＣＤ６リガン ド系が他の免疫細胞と他の免疫細胞との相互作用及び種々の上皮微環境との相互 作用に重要であることを示すものである。 実施例 II 実験の詳細 ： 細胞系、融合タンパク質及び抗体． 結腸がん腫由来細胞系Ｈ３７１９及び黒 色腫由来細胞系Ｈ３６０６は、Drs．K.E．& I．Hellstrom（Bristol-Myers Squi b、シアトル、ワシントン州）からのものであった。ヒト乳房上皮細胞系ＨＢＬ −１００、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系ＬＣＬ、ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０、 成人Ｔ細胞白血病Ｊｕｒｋａｔ、皮膚Ｔ細胞リンパ腫ＨＵＴ７８、ヒト末梢血急 性白血球白血病由来細胞系ＨＰＢ−Ａ１１、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｈ９、ヒトバー キットリンパ腫Ｒａｊｉ、線維芽細胞系ＧＭ０８３３、Ｂ細胞リンパ芽球腫Ｐｅ ｅｒ、Ｔ細胞白血病ＪＭ及びＢ細胞リンパ芽球腫ＬＴＲ２２８を用い、主にアメ リカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ロックビル、メリーランド州）か ら入手した。ＣＤ５−Ｒｇ（Aruffoら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10242( 1992))、ＥＬＡＭ１−Ｒｇ（Walzら，Science 250:1132(1990)） 及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ(Linsleyら，J．Exp．Med．174:561(1991))は以前に記載 されている。抗ＣＤ６ｍＡｂＧ３−６（ＩｇＧ）は、Dr．J．Ledbetter(Bristol -Myers Squib、シアトル、ワシントン州)(Ledbetterら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 84:1384(1987))からのものであり；抗ＣＤ６ｍＡｂＭＢＧ６（ＩｇＭ）は 、Dr．A．McMichael（オックスフォード大学、オックスフォード、英国）（Bast inら，J．Clin．Exp．Immunol．46:597(1981)）からのものであり；抗ＣＤ６ｍ Ａｂ２Ｈ１は、Dr．C．Morimoto(Dana-Farber Cancer Institute、ボストン、マ サチューセッツ州)(Morimotoら，J．Immunol.140:2165(1988))からのものであり ；抗ＣＤ６ｍＡｂＴ１２は以前に記載されている(Reinherzら，Cell30:735(1982 ))。ＤＮＡ制限酵素及びＤＮＡリンカーはNew England Biolabs(ビバリー、マサ チューセッツ州)から入手し；ＲＰＭＩ、ＨＢＳＳ、ＦＢＳ及び前染色分子量マ ーカーはGIBCO-BRL(ガイザースバーグ、メリーランド州)から入手した。ヒト表 皮ケラチン細胞（ＥＫ）は新生児前皮膚から培養した。前皮膚をＨＢＳＳ(GIBCO -BRL)中２.５mg/mlトリプシンＩＩＩ型(Sigma、セントルイス、ミズーリ州)中で ４℃において一晩インキュベートし、表皮を取り出し、単細胞浮遊液の中へかき 裂き、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上に播種し、(Hashimo toら，J．Exp．Med．145:259(1983))に記載されているように培養した。 ＣＤ６−Ｒｇの調製． ＣＤ６をコードする全長ｃＤＮＡを含むＣＤ６−Ｒｇ をコードするプラスミド(Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991))を制限酵素Ｅ ｓｐＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、Ｂａ ｍＨＩリンカー(New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州)に結合 した。次いで、ベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＣＤ６ の細胞外ドメインを含むＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡをヒトＩｇＧ₁の定常部（ ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードするｃＤＮＡ断片を含むプラスミド中にサ ブクローン化した。ＣＤ６−Ｒｇタンパク質を以前に記載されているように（Ar uffoら，Cell 61(7):1303(1990)）ＣＯＳ細胞中での過渡的発現により調製し、 ＣＯＳ細胞移入体の上清からプロテインＡカラム（Repligen、ケンブリッジ、マ サチューセッツ州）に吸収させ、それから溶離することにより精製した。 ＣＤ６−Ｒｇ細胞結合実験． 典型的には、ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳ／２０mMヘ ペス（洗浄／染色バッファー）中５×１０⁷細胞／mlを５０μg/mlの融合タンパ ク質とインキュベートした。粘着細胞はＰＢＳ中０.５mMＥＤＴＡ（ＰＢＳ／Ｅ ＤＴＡ）を含む皿から剥がし１回洗浄し、非粘着細胞は１回洗浄した後に融合タ ンパク質と１時間氷上でインキュベートした。引き続き、細胞を３回洗浄し、Ｆ ＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０μg/ml，Tago、バーリンガム、カリフォルニア 州）と１時間氷上でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＰＢＳ中１％パラ ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した（Epics V,Coulte r、ヒアリー、フロリダ州）。 この染色手順を用いてＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００への結合が飽和可能であ るかを調べた。これらの実験において、ＣＤ６−Ｒｇ及び対照融合タンパク質は 次の濃度で用いた：１０、２０、３０、４０、５０、１００及び２００μ/ml。 ＣＤ６−Ｒｇリガンドのトリプシンに対する感受性を調べるために、ＨＢＬ−１ ００細胞（５×１０⁷）を０.０５％トリプシン／０.５mMＥＤＴＡで３７℃にお いて３０分間処理し、洗浄／染色バッファーで３回洗浄し、ＣＤ６−Ｒｇとイン キュベートし、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。ＣＤ６−Ｒｇ結 合に２価カチオンが要求されることを調べるために、ＣＤ６−Ｒｇを１５mMＥＤ ＴＡの存在下にＨＢＬ−１００細胞とインキュベートするか或いはＣＤ６−Ｒｇ と予めインキュベートし洗浄したＨＢＬ−１００細胞にＥＤＴＡを加えた。抗Ｃ Ｄ６遮断実験の場合、ＣＤ６−Ｒｇ（５０μg/ml）を１mg/ml抗ＣＤ６ｍＡｂＧ ３−６（ＩｇＧ）又はＭＢＧ６ｍＡｂ(IgM，A.J．McMichaelから）を含む腹水又 はイソタイプ適合（ＩｇＭ）抗体の１：５０、１：１００及び１：２００希釈度 とインキュベートした。ＨＢＬ−１００細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合のサイトカイ ン誘導モジュレーションを調べるために、細胞をＣＤ６−Ｒｇ結合実験の前にＩ Ｌ−１β、ＴＮＦ−α(Genzyme、ボストン、マサチューセッツ州)及びＩＦＮ− γ(Upstat eBiotechnology Inc.、ラックプラシド、ニューヨーク州)(１０ng/ml )と個々に、２つに組合わせて又は全て一緒に３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間イン キュベートした。 免疫沈降実験． 免疫沈降実験の場合、細胞を１０％正常ＲＰＭＩ及び１０％ 透析ＦＢＳを含有する無グルコースＲＰＭＩ中１２０μCi/mlの［６−³H］グル コサミン(NEN Dupont、ボストン、マサチューセッツ州)と３７℃、５％ＣＯ₂で ４８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡを有する培養皿から引き 上げ、ＨＢＳＳ中で洗浄し、ロイペプチン、ＰＭＳＦ及びペプスタチン（１μg/ ml，Boehringer Manheim、インディアナポリス、インディアナ州）を含有する２ ０mMトリス、ｐＨ７.５に溶解した。その溶解物を攪拌して核を除去し、５０μg /mlのヒトＩｇＧ１(Sigma)及び５０μlのプロテインＡ−セファローススラリー( Repligen)と２回４℃で３０分間インキュベートすることにより前清澄化した。 次に、細胞溶解物を２mMＣａ²⁺及びＭｇ²⁺或いは１５mMＥＤＴＡの存在下５０μ lのプロテインＡ−セファローススラリー(Repligen)と共に５０μg/mlの ＣＤ ６−Ｒｇ又はＣＴＬＡ４−Ｉｇ又は２μg/mlの抗ＥＧＦレセプター抗体(Oncogen Science、ユニオンデイル、ニューヨーク州)と４℃で２〜４時間インキュベー トした。次に、プロテインＡ−セファロースビーズを溶菌バッファーで３回洗浄 した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１０.５％勾配ゲル） 、次にオートラジオグラフィーで分析した。 免疫組織学． マウス（Ｂａ１ｂ／ｃ）リンパ系及び非リンパ系組織を切除し 、液体窒素で凍結した。６マイクロメートルクリオスタット組織切片を調製し、 ガラススライド上に取り付け、氷冷却アセトンで固定した。固定した切片を、１ mMＣａ²⁺及びMｇ²⁺、１０％ＢＳＡ及び１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有す るＰＢＳ溶液（染色バッファー）中５０μg/mlのＣＤ６−Ｒｇ又はヒトＩｇＧ１ (Sigma)を用いて室温で１時間染色した。スライドを染色バッファー中で３回洗 浄し、１０μg/mlのフルオレセイン複合アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗 体(Tago)と室温で１時間インキュベートした。染色バッファーで３回洗浄した後 、スライドを蛍光顕微鏡で調べた。結果 ： ＣＤ６レセプターグロブリン、ＣＤ６−Ｒｇ． ＣＤ６のアミノ酸末端シグナ ル配列を含む４００アミノ酸細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片(Aruffo ら，J．Exp．Med．174:949(1991))をヒトＩｇＧ₁のヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２及びＣ Ｈ３ドメインをコードするｃＤＮＡ断片上に融合することによりＣＤ６−Ｒｇ 融合遺伝子を構築し、上記のように哺乳動物発現ベクターＣＤＭ７Ｂ^-（Aruffo ら，Cell 61(7):1303(1990)）中にサブクローン化した。ＩｇＧ定常部をコード するｃＤＮＡ断片は３つの点突然変異を含む。これらのアミノ酸置換により、Ｉ ｇＧＦｃドメインのＦｃＲＩ、ＩＩ及びＩＩＩへの結合が傷害された。 本実験に用いたＣＤ６−Ｒｇタンパク質は、ＣＯＳ細胞内での過渡的発現によ り得られ、プロテインＡカラムに吸収させそれから溶離することにより精製した (Aruffoら，Cell 61(7):1303(1990))。ＣＤ６−Ｒｇは共有結合のホモ二量体と して発現され、ＥＬＩＳＡ分析で試験した抗ＣＤ６ｍａｂ全てによって確認され た（Ｔ１２、２Ｈ１、ＭＢＧ６及びＧ３−６）。以前に記載されたＣＤ５−Ｒｇ （Aruffoら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10242(1990)）、ＥＬＡＭ１−Ｒ ｇ(Walzら，Science 250:1132(1990))及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ(Linsleyら，J．Exp ．Med．174:561(1991))融合タンパク質及び／又はヒトＩｇＧ１は、結合及び免 疫沈降実験全てにおいてイソタイプ適合対照として用いた。 ヒト及びマウス細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合． ＣＤ６−Ｒｇの多数のヒト及び マウス細胞系への結合をフローサイトメトリーを用いる間接免疫蛍光により調ベ た。ＣＤ６−Ｒｇは、試験した細胞系のサブセットに結合した（図８）。ＣＤ６ −Ｒｇ染色後に最も明るい蛍光強度を示す細胞系の中では、ヒト乳房上皮由来細 胞系ＨＢＬ−１００、ヒト結腸がん腫由来細胞系Ｈ３７１９、黒色腫由来細胞系 Ｈ３６０６、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系ＬＣＬ及びヒト線維芽細胞系ＧＭ０８ ３３及びＩＭＲ９０があった。ＣＤ６−Ｒｇ結合後に中間の蛍光強度を示す細胞 系の中では、リンパ系細胞系Ｊｕｒｋａｔ、Ｐｅｅr及びＨＵＴ７８があった。 ＨＰＢＡＬＬ、ＪＭ、Ｈ９、ＬＴＲ２２８及びＲａｊｉを含む他の多数のリンパ 系細胞系は、ＣＤ６−Ｒｇへの結合を示さなかった。これらの細胞系はいずれも 、対照融合タンパク質ＣＤ５−Ｒｇへ有意な結合を示さなかった。ＨＢＬ−１０ ０細胞系への結合を更に確認した。 増加濃度のＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞系への結合は、ＣＤ６−Ｒｇと この細胞系との相互作用は用量依存及び飽和可能であることを示した（１００μ g/ml、図９Ａ）。これらの細胞をトリプシンで処理するとＣＤ６−Ｒｇ結合を消 滅する（図９Ｂ）が、ノイラミニダーゼ又はＮ−グリカナーゼ処理はＣＤ６− Ｒｇ結合を少しだけ減少した。ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００への結合は、キレ ート剤をＣＤ６−Ｒｇ／ＨＢＬ−１００結合前に加えると部分的にＥＤＴＡ感受 性であったが結合後に加えると感受性でなかった（図１０）。更に、ＣＤ６−Ｒ ｇはＰＢＳ中でこの細胞系に極めて弱く結合したが、Ｃａ²⁺或いはＭｇ²⁺を加え ると（最終濃度２mM）、ＨＢＬ−１００細胞への強いＣＤ６−Ｒｇ結合が得られ た。 抗ＣＤ６ｍＡｂＭＧＢ６及びＧ３−６についてＣＤ６のＨＢＬ−１００細胞へ の結合遮断能を調べた。ＭＧＢ６ｍＡｂはＨＢＬ−１００へのＣＤ６−Ｒｇ結合 を濃度依存方式で遮断することができた（図１１）が、Ｇ３−６ｍＡｂはＨＢＬ −１００へのＣＤ６−Ｒｇ結合を０.０２mg/ml程度の高い濃度で遮断することが できなかった（図１１）。 ＣＤ６−Ｒｇ結合に関するサイトカインの影響． サイトカインは、多数の細 胞表面タンパク質の発現を調節する。ＨＢＬ−１００細胞によって発現したＣＤ ６結合タンパク質の発現に関するサイトカインの影響を調べた。それらの細胞を ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＩＦＮ−γの混合物で処理すると、ＣＤ６リガンド発 現のダウンレギュレーションが生じた（図１２）。サイトカインの各々を単独で 又はサイトカインの２つの組合わせで処理すると、ＴＮＦαとＩＦＮ−γの混合 物がこれらの細胞によるＣＤ６リガンド発現のダウンレギュレーションに主に関 与することが示された。 ＣＤ６リガンドの免疫沈降． ＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク質を用いて、ＨＢＬ −１００細胞によって発現したＣＤ６リガンドを免疫沈降した。¹²⁵Ｉ細胞表面 標識又は［³⁵Ｓ］メチオニン／システイン代謝標識後にＣＤ６リガンドを両細胞 系から免疫沈降する多数の試みは不成功であった。対照的に、ＣＤ６−Ｒｇを加 える前にＨＢＬ−１００細胞溶解物から〜９０及び〜４０ｋＤａの［³H］グルコ サミン標識表面糖タンパク質が得られた（図１３）。〜４０ｋＤａタンパク質が ユニークなタンパク質或いは〜９０ｋＤａタンパク質の分解酸物であるかは明ら かでない。同様に、ＣＤ６−Ｒｇは〜９０及び〜４０ｋＤａのタンパク質を［³H ］グルコサミン標識Ｈ３６０６から免疫沈降させることができた。ＣＤ６−Ｒｇ は、ＥＤＴＡが細胞溶解物に存在する場合にはこれらのタンパク質を免疫沈降す るこ とは不可能であった。 更に、ＣＤ６−Ｒｇは、ＥＤＴＡの存在及び不在の両方で放射性標識ＨＢＬ− １００細胞溶解物から分子量〜１００ｋＤａを有するポリペプチドを免疫沈降し たがＣＴＬＡ４−Ｉｇは免疫沈降しなかった（図１３）。この所見は、ＨＢＬ− １００細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合がＥＤＴＡによって完全に遮断されない（図１ ０）がＨＢＬ−１００細胞をトリプシンで前処理することにより完全に消滅した ことを示した細胞結合実験と一致する（図９Ｂ）。この〜１００ｋＤａポリペプ チドもＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク質によってＨ３６０６溶解物から免疫沈降した 。 ＣＤ６−Ｒｇ免疫組織化学． 高レベルのＣＤ６リガンドを発現する組織を同 定するために、マウス脳、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、リンパ節、胸腺及び 小腸から得られた組織切片のパネルについてＣＤ６−Ｒｇ結合を調べた。反応性 は皮膚、リンパ節及び胸腺細胞切片に認められた（図１４）。皮膚では真皮の明 るい中断染色及び毛嚢の染色が認められた（図１４Ａ）が、ヒトＩｇＧ₁も毛嚢 と反応し、この相互作用が分子のＣＤ６部分によって仲介されなかったことが示 された。胸腺では主な反応性は皮質で認められ（図１４Ｃ）、リンパ節では明る い染色が中間洞に沿って見られた（図１４Ｅ）。 これらの所見に基づいて、ＣＤ６−Ｒｇのマウス胸腺上皮由来細胞系Ｚ２１０ への結合及び培養したヒト表皮ケラチン細胞（ＥＫ）への結合を調べた。ＣＤ６ −ＲｇがＺ２１０及びＥＫ細胞の双方に結合することがわかった（図１５）。Ｚ ２１０細胞への結合はトリプシン感受性、２価カチオン依存であり、ＨＢＬ−１ ００細胞と同様の方法でサイトカインによりモデュレートされた。対照融合タン パク質ＣＤ５−Ｒｇは、Ｚ２１０又はＥＫ細胞に結合しなかった（図１５）。 実施例 III 実験の詳細 ： 細胞及び培養条件． ＴＥ細胞及び胸腺線維芽細胞（ＴＥ）を、記載されてい るように移植片手法により培養した(Singerら，Human Immunol．13:161 1985);S ingerら，J．Invest．Dermatol．92:166(1989))。ヒト胸腺組織を、心臓血管矯 正手術を受ける子供たちからの廃棄組織としてデュークユニバーシティーメデ ィカルセンターの病理科から入手し、胸腺細胞を記載されているように調製した (Denningetら，J．Immunol．139:2573(1989))。ＣＯＳ−Ｍ６細胞（ＡＴＣＣ、 ロックビル、メリーランド州）及びＨＢＬ−１００細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム、０.０２５μg/mlアンホテリシンＢ、１０ ０U/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で 生育した。 モノクローナル抗体． 本実験に用いられる抗体は次のものである：Ｐ３Ｘ６ ３／Ａｇ８（対照ｍＡｂ；ＡＴＣＣ）、３５.１（抗ＣＤ２；J．Hansen、シアト ル、ワシントン州）、Ｔ１２（抗ＣＤ６；E．Reinherz、ボストン、マサチュー セッツ州）、Ｎａｌ／３４（抗ＣＤ１ａ; A．McMichael、オックスフォード、英 国）、Ａ３Ｄ８（抗ＣＤ４４；（Telenら，J．Clin．Invest．71:1878(1983)） 、Ｊ４−８１及びＪ３−１１９（Pesandoら，J．Immunol．137:3689(1986)）、 フィコエリトリン複合抗ＣＤ４（ＣＤ４−ＰＥ; Dako，カーピンテリア、カリフ ォルニア州）、サイクロム複合抗ＣＤ８（ＣＤ８−Ｃｙ; Pharmingen、サンジエ ゴ、カリフォルニア州）及びヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会（Sh aw，分化抗原発現の交差系統（ブラインドパネル）分析の概念：白血球型別、Sc hlossmanら、編集、オックスフォード大学出版、オックスフォード(1994)）。 細胞表面抗原の検出： 非固定培養ＴＥ細胞、ＴＦ、ＣＯＳ細胞又はＨＢＬ− １００細胞をＰＢＳ、ＴＢＳ（０.９ＭＮａＣｌ、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７.３；５mMＣａＣｌ₂、５mMＭｇＣｌ₂又は５mMＭｎＣｌ₂を含めるか又は含めず に）或いは２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を含有するＤＭＥＭ（１０mMＥＤＴＡ を含めるか又は含めずに）に懸濁した。細胞をＣＤ６−Ｒｇ(Weeら，Cell，Immu nol．(1994))又はＣＤ５−Ｒｇ(Arrufoら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:102 42(1991))、ＥＬＡＭ−Ｒｇ(Walzrら，Science 250:1132(1990))、ＣＴＬＡ４− Ｒｇ組換え融合タンパク質(Linsleyら，J．Exp．Med．174:561(1991))又は対照 としてヒトＩｇＧ(Sigma、セントルイス、ミズーリ州)(１００μg/ml）と４℃で ３０分間インキュベートし、２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を含有するＰＢＳで 洗浄した。フルオレセイン複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ₁(Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.，ガイザースバーグ、メリーランド州)を第２試薬 として用いた。細胞をPrifile IIフローサイトメータ(Coulter Corp.，ヒアリー 、フロリダナ巾或いはFACStar^Plusフローサイトメータ（Becton-Dickinson，Inc .、マウンテンビュー、カリフォルニア州）で分析し、データをソフトウェアプ ログラムPC-Lysysを用いて処理した。融合タンパク質相互作用のトリプシン感受 性を求めるために、細胞を１mMＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中０.２％トリプシン と３７℃において３０分間インキュベートし、融合タンパク質と反応する前に十 分に洗浄した。３色免疫蛍光実験を行った。 ＴＥ−胸腺細胞ロゼット結合分析． ＴＥ−胸腺細胞ロゼット結合分析を記載 されているように行った（Singerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6588(198 6)）。胸腺細胞を、Ｎａｌ／３４及びヤギ抗マウスＩｇＧによる間接免疫蛍光染 色後にFACStar^Plus蛍光活性化細胞選別機を用いて蛍光活性化細胞選別すること によりＣＤ１⁺（未熟、ＣＤ６^lo）又はＣＤ１^-（成熟、ＣＤ６^hi）亜集団に分離 した。選別細胞の再分析により胸腺細胞亜集団は純度＞９５％であった。ＴＥ− 胸腺細胞結合分析に用いたｍａｂは飽和結合力価で又は超過力価で用いた。 ＣＯＳ細胞トランスフェクション及び結合実験． 安定なＣＤ６発現ＣＯＳ細 胞系を、ＣＭＶプロモーターの制御下ＣＤ６遺伝子を含むプラスミドＣＤ６−１ ５(A．Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991))及び記載されているＳＶ４０プ ロモーターによって誘導された細菌ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶｎｅｏ プラスミド(Liao ら，J．Imm皿ol．151:6490(1993))を同時トランスフェクトす ることにより構築した。ＣＤ６を発現するＣＯＳ細胞は、ｍＡｂＴ１２を用いる 間接免疫蛍光分析で同定した。ＣＤ６＋及びＣＤ６−細胞は、Becton-Dickinson FACStar^plus蛍光活性化細胞選別機を用いてクローン化した。 ｐＳＶｎｅｏ（ＣＯＳ−Ｎｅｏ）をトランスフェクトしたＣＤ６発現ＣＯＳ細 胞（ＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ）及び対照ＣＯＳ細胞をＴＥ細胞と共に懸濁結合分析に用 いた。ＣＯＳ細胞とＴＥ細胞とを区別するために、ＴＥ細胞を収集前に１μMカ ルセインＡＭ（MolecularProbes、ユージーン、オレゴン州）で３７℃において １５分間ＰＢＳ中で代謝的に標識した。カルセインＡＭ標識細胞は蛍光性であり 、蛍光顕微鏡で非標識細胞から区別することができる。 ＴＥ細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合を阻害するｍＡｂのスクリーニング． ヒト白 血球分化抗原に関する第５回国際研究会のブラインドパネルからのｍａｂ及び抗 インテグリンｍａｂパネルの中からＴＥ細胞表面の反応性をスクリーンした。Ｔ Ｅ細胞と反応した１５４ｍａｂの中の１２６をこの分析に用いた。細胞（１００⁵ ）を腹水又は精製したｍａｂと１：１００で４℃１５分間インキュベートした 。この混合液にＣＤ５−Ｉｇ或いはＣＤ６−Ｉｇ（５μg）を加え、４℃で２時 間反応させた。２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した後、ＣＤ５−Ｒｇ及びC Ｄ６−ＲｇをヒトＩｇＧ（Sigma）のＦｃタンパク質に特異的なフルオレセイン 複合抗血清で標識した。フルオレセイン複合ヤギ抗血清で生じるマウスＩｇとの 交差反応性を説明するために、ＣＤ６−ＲｇとＣＤ５−Ｒｇを含む試料間の蛍光 （ΔＦＬ）の差として結合を求めた。対照ｍＡｂＰ３とプレインキュベートした 試料のΔＦＬを１００％結合とした。 抗体遮断実験． ｍＡｂＪ４−８１をプロテインＧ−セファロースカラム（Pi erce、ロックフォード、イリノイ州）を用いて腹水から精製し、製造業者によっ て勧められているようにスルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Pierce)でビオチニル化した 。ビオチン−Ｊ４−８１（１μg/ml）をｍＡｂＡ３Ｄ８、Ｊ４−８１又はＪ３− １１９の可変量の存在下にＴＥ細胞の表面に結合した。ＦＩＴＣ複合ストレプト アビジン(Soughern Biotechnology Associates，lnc.、バーミンガム、アラバマ 州）とインキュベートした後、細胞を洗浄し、０.４％パラホルムアルデヒドで 固定し、フローサイトメトリーで分析した。 免疫沈降及びタンパク質標識条件． ＴE細胞を１２０μCi/ml ³H-グルコサミ ン(New England Nuclear、ボストン、マサチューセッツ州）で代謝的に標識し、 収集し、以前にに記載されているように免疫沈降した(Weeら，Cell．Immunol.(1 994))。ＴＥ細胞表面タンパク質を、ラクトペルオキシダーゼを用いて¹²⁵Ｉ(New England Nuclear)で以前に記載されているように標識した(Jones、放射性標識 リンパ球タンパク質の１次元及び２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動による 分析：細胞免疫学における選択法、Mishell & Shiigi，eds．W.H．Freeman & Co mpany，New York，pp．398-440(1980))。 タンパク質架橋． ¹²⁵Ｉで表面標識したＴＥ細胞をｍＡｂ（１：１００腹水 ）、 精製した免疫グロブリン（２００μg/ml）又は組換え免疫グロブリン融合タンパ ク質（２００μg/ml）とＤＭＥ／５％ＦＢＳ中で２〜４時間インキュベートした 。冷ＰＢＳで十分に洗浄した後、結合した免疫グロブリンをＰＢＳ中１mMＤＴＳ ＳＰ(Pierce)で４℃で６０分間細胞表面タンパク質に架橋した。ＤＴＳＳＰを２ ０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）で不活性化し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄した。 細胞を、１％ＮＰ−４０、１mMPＭＳＦ、０.１mMＴＬＣＫ及び０.１％ＮａＮ₃を 含有するＰＢＳに溶解した。免疫グロブリン複合体をプロテインＡ−セファロー スビーズ(Sigma)で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、タンパク質複合体を２ ％２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含有するＳＤＳローディングバッフ ァー（２％ＳＤ、１０mMトリス−ＨＣｌｐＨ７.４、２０％グリセロール、ブロ モフェノールブルー）で可溶化して架橋剤を切断した。タンパク質の同一性を確 認するために、精製したタンパク質複合体を１mMＥＤＴＡ中０.２％トリプシン で２５℃において３０分間処理した(Patelら，Virology 149:174(1986))後、可 溶化し架橋剤を切断した。不連続ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でタンパク 質を電気泳動した後、ゲルを４０％メタノールに固定し、Amplify^R試薬（Amersh am、アーリントンハイツ、イリノイ州）を含浸し、乾燥し、オートラジオグラフ ィー膜に露光するか又はPhorphorlmager System(Molecular Dynamics、サニーベ イル、カリフォニアナ州)を用いて画像にした。 免疫組織学． 正常ヒト組織を廃棄組織としてデュークユニバーシティーメデ ィカルセンターの病理科から入手し、液体窒素で凍結した。アセトン固定組織切 片についてｍＡｂ反応性の間接ＩＦ分析を記載されているように行った(Haynes ら，J．Invest．Dermatol．768:323(1982))。結果 ： ＴＥ−胸腺細胞結合に関する抗ＣＤ６抗体及びＣＤ６−Ｒｇの影響． 胸腺細 胞のＴＥ細胞への結合におけるＣＤ６の役割を、ＴＥ−胸腺細胞懸濁結合分析を 用いて求めた。ＣＤ６（Ｔ１２）及び組換えＣＤ６免疫グロブリン融合タンパク 質（ＣＤ６−Ｒｇ）に対する抗体は共に、胸腺細胞のＴＥ細胞への結合を阻害し た（図１６）。以前に報告されているように(Patel & Haynes，Semin．Immunol. 5:283(1993))、抗ＣＤ２ｍＡｂ３５.１（正の対照として）はＴＥ−胸腺細胞結 合を７６±５％（ｐ＜０.００３）だけ阻害した。抗ＣＤ６抗Ｔ１２はＴＥ−胸 腺細胞結合を４９±９％（ｐ＜０.０１５）だけ阻害した。同様に、ＣＤ６ヒト Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ６−ＲｇはＴＥ−胸腺細胞結合を３５±９％（ｐ＜０ .０５）だけ阻害した。飽和量のｍＡｂ３５.１とＴ１２の組合わせをＴＥ−胸腺 細胞結合分析に加えると、ｍＡｂ３５.１単独による遮断とほとんど違わないレ ベルの結合阻害（７４±１０％阻害）が得られた。それにもかかわらず、抗ＣＤ ６ｍＡｂ及びＣＤ６−Ｒｇによるデータから、ＣＤ６が胸腺細胞のＴＥ細胞への 結合で沈降する接着性分子であること及びヒトＴＥ細胞上にＣＤ６に対するリガ ンドがあることが示された。 ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞のＴＥ細胞への結合． 抗ＣＤ６抗体とＣＤ６−Ｒｇの 双方によるＴＥ−胸腺細胞結合阻害はＣＤ６が接着性分子であることを示すが、 ＴＥ−胸腺細胞結合の阻害は立体障害のために起こることもある。ＣＤ６が接着 性分子であることを確認するために、ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６） の安定な移入体を構築した（図１７）。ｐＳＶｎｅｏだけをトランスフェクトし たＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ｎｅｏ）はＴＥ細胞に十分に結合しなかった（６±１％ ＣＯＳ−ｎｅｏ結合ＴＥ細胞）が、ＣＯＳ−ＣＤ６はＴＥ細胞に結合した(２５ ±２％ＣＯＳ−ＣＤ６結合ＴＥ細胞、ｐ＜０.０１)(図１７)。ＣＯＳ−ＣＤ６／ ＴＥ結合の特異性は、ＣＤ６ｍＡｂＴ１２によるＣＯＳ−ＣＤ６／ＴＥ結合阻害 を試験することにより調べた。対照ｍＡｂＰ３及びＣＯＳ−ｎｅｏ細胞（６±１ ％ＣＯＳ−ｎｅｏ結合ＴＥ）と比べると、ＣＤ６ｍＡｂＴ１２はＣＯＳ−ＣＤ６ のＴＥ細胞への結合（５±１％ＣＯＳ−ＣＤ６結合ＴＥ、ｐ＜０.０１）を基線 レベルの結合まで完全に阻害し（図１７）、ＣＯＳ−ＣＤ６／ＴＥ結合がＣＤ６ 特異的であることが確認された。 胸腺細胞サブセットのＴＥ細胞への結合に関する抗ＣＤ６ｍＡの影響． ＣＤ ６の胸腺細胞サブセット上での発現を調べると共に選別した成熟対未熟胸腺細胞 サブセットのＴＥ細胞への結合をＣＤ６ｍＡｂの存在下に試験することにより、 胸腺細胞サブセットの結合におけるＣＤ６の役割を求めた。ＣＤ６の胸腺細胞サ ブセット上の発現は、３色免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより求めた（図 １８）。胸腺細胞は全てＣＤ６を発現したが、未熟なＣＤ４＋ＣＤ８＋二重 陽性（ＤＰ）胸腺細胞はＣＤ６^loであり、成熟ＣＤ４＋ＣＤ８−又はＣＤ４−Ｃ Ｄ８＋一重陽性（ＳＰ）胸腺細胞はＣＤ６^hiであった。 胸腺細胞サブセットのＴＥ細胞への結合におけるＣＤ６の役割を求めるために 、胸腺細胞を蛍光活性化細胞選別によりＣＤ１＋及びＣＤ１−に分離した。ＣＤ １＋胸腺細胞がＤＰＣＤ６^lo細胞でありＣＤ１−がＳＰＣＤ６^hiであることから ＣＤ１を選び、ＣＤ１ｍＡｂはＴＥ−胸腺細胞結合を阻害しない（Patel & Hayn es，Semin．Immunol．5:283(1993)）。ＣＤ１＋及びＣＤ１−胸腺細胞は共にＴ Ｅ細胞に十分に結合した（各々４５±４％及び５４±６％、Ｐ＝ＮＳ）。ＣＤ２ ｍＡｂ３５.１は、成熟胸腺細胞の結合より（５２±１１％阻害）未熟な胸腺細 胞の結合を阻害した(７７±９％阻害)(ｐ＜０.０１)。ＣＤ６ｍＡｂＴ１２も未 熟（２２±７％阻害）及び成熟（３９±１７％阻害）胸腺細胞共にＴＥ細胞への 結合を阻害した(ｐ＜０.２５)(図１９)。 ＣＤ６−Ｒｇの胸腺微環境の細胞への結合． ＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク質の ＴＥ細胞、胸腺線維芽細胞及び胸腺細胞への結合能を間接ＩＦ及びフローサイト メトリーにより求めた。ＣＤ６−Ｒｇは、ＴＥ細胞の表面及び胸腺線維芽細胞に 結合したが、胸腺細胞に結合しなかった（図２０Ａ）。ＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞 への結合は、トリプシン感受性であり、２価カチオンに部分的に依存性であった （図２０Ｂ）。ＣＤ６−ＲｇはＤＭＥ及び５％ＦＢＳを含有するバッファー中で ＴＥ細胞に十分に結合したが、１０mMＥＤＴＡの存在下にＣＤ６−ＲｇのＴＥ細 胞への結合は５４±４％だけ阻害した（Ｎ＝５、ｐ＜０．００１、図２０Ｂ）。 ＣＤ６−Ｒｇ結合の２価カチオン依存性を更に評価するために、５mMＣａＣｌ₂ 、５mMＭｇＣｌ₂又は５mMＭｎＣｌ₂を含有するバッファー中でＣＤ６−Ｒｇ結合 を求めた。ＣａＣｌ₂及びＭｎＣｌ₂は共にＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を高 めた（各々１４４±５％、ｐ＝０.０１及び３１８±２２％、ｐ＜０.０１）が、 ＭｇＣｌ₂はＣＤ６−Ｒｇ結合に影響しなかった（９４±２％、ｐ＝ＮＳ）。 ＴＥ細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合の抗体仲介阻害． ＣＤ６リガンドの同定を始 めるために、ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からの４７９ｍＡｂ のパネルの中からＴＥ細胞表面に対する反応性を間接免疫蛍光及びフローサイト メトリーによりスクリーンした(Shaw，分化抗原発現の交差系統（ブラインドパ ネル）分析の概念：白血球型別、Schlossmanら、編集、オックスフォード大学出 版、オックスフォード(1994))。ＴＥ細胞の表面と反応した１５４ｍＡｂの中の １２６ｍＡｂを分析に用いてＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を阻害した。第２ 抗血清と反応しなかった１２２ｍＡｂの中の１つだけ（Ｊ４−８１）がＣＤ６− ＲｇのＴＥ細胞への結合を阻害した。ｍＡｂＪ４−８１は、ＣＤ６−ＲｇのＴＥ 細胞への結合を６０±７％（Ｎ＝１０、ｐ＜０.００１）及び乳房細胞系ＨＢＬ −１００への結合を４０±３％（Ｎ＝３、ｐ＜０.０２）だけ阻害し（図４）、 ＣＤ６−Ｒｇを結合することも示された(Weeら，Cell．Immunol.(1994))。フロ ーサイトメトリー分析においては、ＴＥ細胞及びＨＢＬ−１００細胞の双方がｍ ＡｂＪ４−８１と強く反応した。 Ｊ４−８１で検出された分子上の第２エピトープと反応することが報告された ｍＡｂＪ３−１１９(Pesandroら，J．Immunol．137:3689 (1989))は、ＣＤ６−R gのＴＥ細胞への結合（図２１）を４８±５％（Ｎ＝３、ｐ＜０.００５）だけ及 びＨＢＬ−１００細胞への結合を４５±１１％（Ｎ＝３、ｐ＜０.１）だけ高め た。ｍＡｂＪ３−１１９がｍＡｂＪ４−８１と同じタンパク質を認識することを 確認するために、ｍＡｂＪ３−１１９のビオチニル化Ｊ４−８１のＴＥ細胞への 結合遮断能を試験した。ＣＤ４（ＴＥ細胞の表面に十分に結合する）に対するｍ ＡｂＡ３Ｄ８はＪ４−８１結合に効果がなかったが、Ｊ４−８１とＪ３−１１９ ｍＡｂは共にビオチニル化Ｊ４−８１の結合を阻害した(各々９９％と８２％)( 図２２)。更に、ｍＡｂＪ４−８１は、Ｊ３−１１９によって検出された抗原の Ｂ細胞上の表面発現をモデュレートした(Pesandroら，J．Immunol.137:3689(198 6))。 ｍＡｂＪ４−８１がＣＤ６に対するリガンドを認識することを更に決定するた めに、Ｊ４−８１についてＣＯＳ−ＣＤ６細胞のＴＥ細胞へのＣＤ６特異結合阻 害能を試験した。ｍＡｂＪ４−８１はＴＥ細胞のＣＯＳ−ＣＤ６細胞への結合を 顕著に阻害し（８７±１％、Ｎ＝３、ｐ＜０.００１）、もって、Ｊ４−８１が ＣＤ６リガンドを認識することが確認された。 ｍＡｂＪ４−８１及びＣＤ６−Ｒｇは、同じ１００ｋＤａＴＥ細胞タンパク質 を結合する。ＣＤ６−Ｒｇに結合するＴＥ細胞表面タンパク質を同定するために ある方策が考えられ、もって、ＣＤ６と表面¹²⁵Ｉ標識ＴＥ細胞上のＣＤ６リガ ンドとの相互作用をＤＴＳＳＰ、遊離アミノ基と反応性の切断可能なホモ二官能 性架橋試薬で安定し、ＣＤ６−Ｒｇ含有複合体をプロテインＡ−セファロースビ ーズを用いて精製した。この方策を用いると、ＣＤ６−Ｒｇは１００ｋＤａＴＥ 細胞表面タンパク質と特異的に反応した（図２３）。¹²⁵Ｉ標識ＴＥ細胞に架橋 したｍＡｂＪ４０−８１もＣＤ６−Ｒｇによって認識された１００ｋＤａタンパ ク質と移動する１００ｋＤａタンパク質を生じた（図２３）。トリプシン消化実 験は、Ｊ４−８１によって同定された１００ｋＤａタンパク質がＣＤ６−Ｒｇに よって同定された１００ｋＤａタンパク質と同じトリプシン消化パターンを有す る（図２３）ことを示し、両タンパク質が同一であることが示された。ｍＡｂＪ ４−８１も、³H−グルコサミンで代謝的に標識したＴＥ細胞の抽出液から１００ ｋＤａタンパク質を特異的に免疫沈降した。 １００ｋＤａＣＤ６リガンドはＣＤ６に対して２価カチオン非依存リガンドで ある。免疫沈降実験（上記）は、ＣＤ６−Ｒｇが２価カチオンの存在下及び不在 下に１００ｋＤａタンパク質を免疫沈降することができることを示した。即ち、 １００ｋＤａタンパク質は２価カチオン非依存ＣＤ６リガンドであることができ る。更に、Ｊ４−８１だけが２価カチオンの存在下にＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞へ の結合を部分的に阻害し、ＣＤ６に対して１を超えるリガンドがあることが示さ れた。ｍＡｂＪ４−８１はＥＤＴＡの存在下にＴＥ細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合を ほぼ完全に阻害し(８０±１０％阻害、ｐ＜０.１)(図２１)、主として２価カチ オン非依存ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用に関係することが確認された。対照 的に、ｍＡｂＪ３−１１９は２価カチオンの不在下にＣＤ６−Ｒｇ結合を４７± ７％（Ｐ＜０.１）だけ高めた（図２１）。 ｍＡｂＪ４−８１反応性の組織分布． Ｊ４−８１によって認識された１００ ｋＤａ糖タンパク質の組織分布を種々のヒト組織の凍結切片について間接ＩＦに より調べた（表５）。ｍＡｂＪ４−８１とヒト組織及び細胞系との反応は広範囲 であった。ＣＤ６は生後のヒト胸腺内の胸腺細胞上で発現したが、１００ｋＤａ ＣＤ６リガンドは皮質及び髄質ＴＥ細胞及びハッサル体上で発現した（図２４） 。胸腺以外の組織では、Ｊ４−８１は表皮ケラチン細胞、消化管上皮、乳房上皮 、膵臓の腺房細胞及び島細胞、肝細胞、尿細管上皮、大脳皮質のニューロン及び 線維芽細胞と反応した。 各種類の組織においてｍＡｂＪ４−８１と反応する細胞の種類を挙げる。 実施例 IV 実験の詳細 ： 細胞系、組織培養および抗体． ＴＥ細胞を報告されている外殖技術により培 養した(Singer et al，Human Immunol．13:161(1985)；Singer et al，J．Inves t．Dermat．92:166，(1989))。ＣＯＳ細胞、乳ガンＨＢＬ−１００、Ｂ−細胞リ ンパ細胞系Ｒａｍｏｓ、ＲａｊｉおよびＤａｕｊｉ、Ｔ細胞リンパ球細胞系ＣＥ ＭおよびＭＯＬＴ４、赤白血球細胞系Ｋ５６２、および単球様細胞系ＨＬ６０お よびＵ９３７をＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ）から入手し、イスコブ（Iscove's ）変性ダルベコ培地に１０％ウシ血清を加えた標準組織培養条件下において維持 した。ＮＫ−様細胞系ＹＴはポダック(E．Podack)(Univ．of Miami Sch．of Med icine)から入手した。この実験に使用した抗体は、腹水とし てＪ４−８１（Pesando et al．J．Immunol．137:3689(1986)）、Ｌｅｕ４（抗 ＣＤ３）−フィコエリトリン(Becton Dichkinson，San Jose，CA)，G3-6（J.Led ibetter，Bristol-Myers Squibbからの抗ＣＤ６）、抗Ｌ６（BristolーMyers Squ ibb）、Ｔ１２（抗−ＣＤ６、ＡＴＣＣ）、およびＰ３（ＡＴＣＣ）である。 ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞形質移入体へのＴＥ細胞の結合． ＣＯＳ−ＣＤ６およ びＣＯＳ−ｎｅｏ細胞をＣＤ６をコードするプラスミド(Aruffo et al，J．Exp ．Med．174:949(1991))、およびｐＳＶｎｅｏプラスミド(Liao et al，J．Immun ol．151:6490(1993))を同時に形質移入することにより作成した。Ｇ４１８選択 後、ＣＤ６＋細胞をベクトンディッキンソンＦＡＣＳｔａｒ^PLUS蛍光活性化細胞 選別機を使用してクローンを行った。ＣＯＳ−ｎｅｏおよびＣＯＳ−ＣＤ６ＴＥ 細胞を、懸濁結合アッセイにおいて使用した。ＣＯＳ細胞とＴＥ細胞を区別する ために、ＴＥ細胞を１μｍのカルセインＡＭ(分子プローブ、Eugene,OR)を用い て、３７℃において１５分間、ＰＢＳ中で標識を行ってから収集した。カルセイ ンＡＭ−標識化細胞は蛍光性であり、蛍光顕微鏡により標識を行っていない細胞 と区別することができる。ＴＥ細胞と複合化したＣＯＳ−ＣＤ６細胞の割合をス コアにすることにより接着を定量化した。接着をブロックするために、抗体Ｔ１ ２、Ｊ４−８１、およびＰ３を飽和結合タイターの過剰下において用いた。 ｍＡｂＪ４−８１により認識される抗原の遺伝子のクローニングおよびキャラ クタリゼーション． ＨＢＬ−１００細胞（〜３×１０⁹）からのＡＬＣＡＭの Ｊ４−８１免疫親和性精製を記載されるように行った（Bowen et al，J．Immuno l．151:5896(1993)）。精製したタンパクおよびＣＮＢｒフラグメントは、パル ス−液体タンパクシークエンサーにおいて、既に記載された方法により分析を行 った(Maresh et al，Arch．Biochem．Biophys．311:95(1994))。アミノ末端配列 を、ジェネティックコンピューターグループ（ＧＣＧ）配列分析ソフトを使用し てスイスプロットデータベース (SwissProt data base)に対してスクリーニング を行った。ニワトリＢＥＮプローブは、ニワトリ胚ｃＤＮＡライブラリー（Clon tech）からＰＣＲにより合成され、³²Ｐ−ｄＣＴＰによりランダム、プライム標 識化され、ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン グするために使用された。一部のｃＤＮＡクローンを単離し、該ｃＤＮＡの５’ エンドの２００ｂｐを使用して、全てのコード領域を含むクローンをＨＬ６０ｃ ＤＮＡライブラリーから単離した。ＡＬＣＡＭのｃＤＮＡ誘導ペプチド配列を用 いたデータベース検索を、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて行い、４つの最も高い スコアリングヒットの整列化およびコンセンサス配列の誘導化をＧＣＧ配列分析 ソフトからのPileupおよびPrettyプログラムを用いて行った。 ノザン分析． 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をリンパ球分離培地(Organon Tec nika，Dufham，NC)か、製造者の指示書に従い分離した。ＰＢＭＣを１μg／ｍｌ の植物性血球凝集素（ＰＨＡ；Boehringer Mannheim Indianapolis，IN）を用い て刺激を行った。全体の細胞性ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて調製した(Gib co BRL，Gaithersburg，MD)。単球をＰＢＭＣからプラスチックへ２.５時間付着 することにより単離した。ＲＮＡは変性ホルムアルデヒドゲル上で分画した；２ ５μgのＲＮＡを単球（１５μgが添加されている）を除く全ての試料に添加した 。ＲＮＡをニトロセルロースＴＣ(Schleicher and Schuell，Keene，NH)に移動 し、³²Ｐ−ｄＣＴＰによりランダム、プライム標識化されたＡＬＣＡＭまたはＧ ＡＰＤＨｃＤＮＡによりプローブとした。フィルターを−７０℃においてフィル ムに露出させ、現像した。 ＰＨＡブラスト調製および染色． ＰＢＭＣを単離し、上述したようにＰＨＡ により活性化を行い、ｍＡｂＪ４−８１腹水（１：２００）またはＣＤ６−Ｒｇ （５０μg／ｍl）、次にＦＩＴＣ標識化第二抗体および抗−ＣＤ３−ＰＥにより 選択した日数染色した；Ｊ４−８１染色Ｔ細胞の細胞蛍光分析をＦＡＣＳｃａｎ （Becton Dickinson，San Jose，CA）上で、ＣＤ３正細胞上にゲートすることに より行った。 ＡＬＣＡＭコード遺伝子の染色体地図． ＣＤＭ７中の２.２ｋｂおよび１.９ ｋｂ挿入物を含むヒトＡＬＣＡＭ遺伝子の二種類の重複ｃＤＮＡを、記載されて いるように切片上ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における蛍光のためのプ ローブとして使用した(Milatovich et al，Genomics 11:1040(1991))。プローブ をビオチン−ｄＵＴＰを用いて、ニックトランスレーション法により標識を行い 、５００ng／５０μｌ（スライドあたり）の濃度で、予備処置および変性を行 ったヒトＰＨＡ−刺激リンパ球培養からの分裂中期染色体にハイブリダイズを行 った。非ヒトゲノミックＤＮＡではないが、キャリアの役割をするサーモン精子 ＤＮＡを競合者として使用した。インキュベーション、洗浄、アビジン−ＦＴＩ Ｃ(Vector Laboratories)によるシグナル検出およびビオチン化ヤギ抗−アビジ ンＤ抗体(Vector Laboratories)による一回の増幅の後、染色体はヨウ化プロピ ジウムで対比染色を行い、アクシオホト（Axiophot(Zeiss)）エピ蛍光顕微鏡下 で上述したように分析を行った（Milatovich et al，Genomics 11:1040(1991) ）。ハイブリダイゼーションシグナルは、シグナルが染色体の双方の染色分体上 に観察される場合にのみ、特異的であるとした。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カ メラ（Photometrics PM512）を用いてデジタル画像により記録を行い、疑似色で 表示した。 ＡＬＣＡＭ−Ｒｇの構造． ＡＬＣＡＭ−Ｒｇは、ＣＤ６−Ｉｇと同様のＰＣ Ｒ技術により構築した（Aruffoetal，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2292(199 2))。ｐＣＤＭ８におけるＡＬＣＡＭｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。 ｐＤＣＭ８のＣＭＶプロモーター中のＭ１ｕＩ部位を包含する正オリゴヌクレオ チドプライマー(GGCCAGATATACGCGTTGACATT)、およびＢａｍＨＩ部位を含み、Ａ ＬＣＡＭの細胞外膜基部残基をコードするヌクレオチドに特異的な逆プライマー (TGTATCATGTGGATCCGCCTGGTCATTCACCTTTTCTCT)を切断ＡＬＣＡＭをコードするＤ ＮＡフラグメントをコードするフラグメントを合成するのに使用した。このＰＣ Ｒ生産物をＭ１ｕＩおよびＢＡＭＨＩにより消化を行い、同様に消化を行ったヒ トＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ１、およびＣＨ２ドメインをコードするベクター（ｐ ＣＤＭ７）に結紮した。ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパクに融合したＡＬＣＡＭの細 胞外領域をコードするキメラ遺伝子を生じた。タンパクがＣＯＳ細胞におけるＡ ＬＣＡＭ−Ｒｇの一過性の発現により生産され、かつタンパクＡセファロースへ の吸着および溶出により精製された。簡単に述べると、プラスミドＤＮＡをＣＯ Ｓ細胞にＤＥＡＥ−デキストランクロロキン法により形質移入した。１８〜２４ 時間後、１０％ＦＢＳダルベコ変性イーグルス培地をＰＢＳですすぎ洗浄をした のち血清を含まない培地と交換した。細胞培養は７〜１０日間維持した後、収集 した。簡単に述べると、融合タンパクを含む上澄み液を２５００ ｒｐｍで２０分間遠心分離をし、0.45μｍミリポアフィルターで濾過を行った。 この上澄み液をタンパクＡセファロースカラムに１.００ml／min.の流速で通し た。結合した融合タンパクをｐＨ３.５、０.１Ｍクエン酸で溶出し、すぐにｐＨ ９.０、１.０Ｍトリスで中和した。融合タンパクをＰＢＳに対して透析を行い、 Certicor concentrator(Amicon)を用いて濃縮を行つた。 ＣＤ６−ＲｇのＡＬＣＡＭ発現ＣＯＳ細胞への結合およびＡＬＣＡＭ−Ｒｇの ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞への結合． ＣＯＳ細胞は、ＤＥＡＥ−デキストラン法に より、親ベクターＣＤＭ８、またはＣＤ６或いはＡＬＣＡＭをコードするｃＤＮ Ａクローンにより形質移入された（Aruffo et al，Proc．Natl．Acad．Sci.，US A 84:8573(1987)）。形質移入して３日後、細胞をＰＢＳ／０.５ｍＭＥＤＴＡに より脱離を行い、ＰＢＳで洗浄し、およびｍＡｂまたは融合タンパクを次の濃度 で含むＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％ＮａＮ₃（ＰＢＡ）中に再懸濁した：Ｊ４− ８１（ａＡＬＣＡＭ）腹水の１：２００希釈、Ｇ３−６（ａＣＤ６）５μg／ｍ ｌ、ＣＤ６−Ｒｇ５０μg／ｍｌ、およびＡＬＣＡＭ−Ｒｇ２５μg／ｍｌ。氷上 で３０分おいた後、細胞をＰＢＡで２回洗浄し、ヤギ抗−マウスまたはヒトＩｇ Ｇ−ＦＩＴＣのいずれかを含有するＰＢＡ中に氷上で３０分間再懸濁を行った。 細胞を二回ＰＢＡで洗浄し、ＰＢＳで一回洗浄を行い、ＰＢＳ／１％ホルムアル デヒド中に固定化し、かつフローサイトメトリーで分析を行った。結果 ： 形質移入ＣＯＳ細胞上のＣＤ６はＴＥ細胞接着を促進する． 胸腺細胞−ＴＥ 細胞接着におけるＣＤ６の役割を直接調査するために、ＣＤ６を発現する安定な ＣＯＳ細胞形質移入体を作成した。ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６）は ＴＥ細胞接着を支持したが、一方、親ベクターのみにより形質移入されたＣＯＳ 細胞（ＣＯＳ−ｎｅｏ）は支持しなかった（図２５）。ＴＥ細胞のＣＯＳ−ＣＤ ６細胞への接着は、ＣＯＳ−ＣＤ６細胞を抗−ＣＤ６ｍＡｂＴ１２により前処理 するか、またはＴＥ細胞をＪ４−８１ｍＡｂにより前処理することにより阻害さ れ（図２５ｂ）、これはＣＤ６仲介によるＴＥ細胞への接着がｍＡｂＪ４−８１ により認識される分子に関連していることを示している。 ｍＡｂＪ４−８１により認識される抗原のクローニングおよびキャラクタリゼ ーション（活性化白血球−細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ））． Ｊ４−８１アフィ ニティーカラムをＨＢＬ−１００、ＣＤ６リガンドを高レベルで発現するガン腫 細胞系（Wee et al，Cell，Immunol．158:353(1994)）およびＪ４−８１により 認識される抗原（Patel et al，J．Exp．Med．(1994)）からタンパクを精製する ために使用した。未処理タンパクおよび内部ペプチドフラグメントから得られる アミノ酸配列は、ニワトリ神経接着分子ＢＥＮ／ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰ(P uorquie et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA B9:5261(1992)；Tanaka et al，N euron 7:535(1991)，Burns et al，Neuron 7:209 81991),これらはまた活性化ニ ワトリ白血球により発現されると報告されている（Corbel et al,Cell Immunol ．141:99(1992)）と実質的に相同性であることが見いだされた。ニワトリＢＥＮ に相当するＤＮＡフラグメントはＰＣＲにより得られ、ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。完全コード領域を 含まない単一クローンが単離された。このクローンの５’領域から誘導された２ ００ｂｐＰＣＲフラグメントを、ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーから完全コード 配列を含む−１.９ｋｂｃＤＮＡクローンを単離するために使用した（ヌクレオ チド配列はGenBankに寄託された；受け入れ番号＃Ｌ38608）。２種類のｃＤＮＡ クローンは、重複領域の３つのヌクレオチド位置において多形性を示し、そのう ちの二つはタンパクレベルの相違を生じる（位置８３６におけるＨＬ６０からＴ 細胞クローンへのＧからＡの変化はＮ２３１のＳによる置換を生じる;位置９６ ５におけるＨＬ６０からＴ細胞クローンへのＣからＴの変化はＮ２７４のＴによ る置換を生じる） ニワトリＢＥＮのヒト相同性予期アミノ酸配列（ＡＬＣＡＭ）、Ｉ型膜タンパ クは、２７アミノ酸（ａａ）Ｎ−末端疎水性シグナルペプチド、続いて５００ａ ａ細胞外ドメイン、２４ａａ疎水性膜貫通ドメインおよび３２ａａ細胞質ドメイ ンからなる（図２９参照）。ＡＬＣＡＭのグリコシル化は、−６５ｋＤａの予期 分子量と免疫沈降により観察される分子量１００−１０５ｋＤａとの間の相違の 大部分の原因であると考えられる(Patel et al，J．Exp．Med．(1994))；Pesand o et al，J．Immunol，137:689(1986)）。ＡＬＣＡＭとデータベース内の他のア ミノ酸配列の比較は、ニューロリン（Lawssingetal，Differentiatio n 56:21(1994)）、金魚の視覚系の神経軸策に発現されるタンパク（３８％同一 性／５５％類似性）、ＲＡＧＥ(Neeper et al，J．Biol．Chem．267:14998(1992 ))、進行性グリケーション終末産物のレセプター（２８／４３％）およびＭＵＣ 18(Lehmann et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9891(1989))、その発現が 転移性メラノーマ細胞に関連する細胞表面タンパク（２３／４９％）に相同性で あることを示した（図２６Ａ）。 ＡＬＣＡＭは活性化白血球により発現される． ノザンブロット分析により、 分裂促進因子により発現された−５.２ｋｂｍＲＮＡとハイブリダイズしたＡＬ ＣＡＭｃＤＮＡプローブは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および多数のＴ細胞、 Ｂ細胞、単球および癌誘導細胞系を活性化した；活性化された単球は、−１０お よび８.５ｋｂの二種類の付加的マイナー種を示した（図２６Ｂ）。 ＡＬＣＡＭｍＲＮＡは未活性化ＰＢＭＣ内では検出されなかった。活性化Ｔ細胞 中のＡＬＣＡＭ転写物の存在がＪ４−８１およびＣＤ６−Ｒｇ結合タンパクの発 現に相当するかどうかを調査するために、ＰＢＭＣをＰＨＡにより活性化し、バ ルク培養の一部をフローサイトメトリーで１０日間試験した。Ｔ細胞上のＪ４− ８１およびＣＤ６結合タンパクの発現は活性化２日後に観察され、３日めに最大 となり、活性化８日後に検出不可能レベルにまで低下した（図２６Ｃ）Ｊ４−８ １およびＣＤ６−Ｒｇ活性化Ｔ細胞への結合は、同じ動態学を示し、これらの２ 分子が同じ分子ターゲットを認識することを示している。 ヒトＡＬＣＡＭ遺伝子の染色体バンド３ｑ１３.１〜ｑ１３.２への割り当て． ＡＬＣＡＭｃＤＮＡクローンをプローブとして使用した蛍光切片上ハイブリダ イゼーション実験は、ヒト染色体３の基部ロングアーム上の単一部位へ遺伝子を 局在化させた。分析された２５の分裂中期のスプレッドのうち、２０がこの部位 における双方の染色分体上に特異的な蛍光シグナルを示し、および１３および２ ０が両方の染色体３ホモローグ上にシグナルを有した。染色体は、細胞培養を同 調した後、ＢｒｄＵの挿入により産生されるＲ−バンド形成パターンにより同定 された。ＡＬＣＡＭシグナルは、バンド３ｑ１３.１−ｑ１３.２に割り当てられ た（図２７）。 ＡＬＣＡＭはＣＤ６リガンドである． ＨＬ６０細胞から単離されたＡＬＣＡ ＭｃＤＮＡクローンがＪ４−８１およびＣＤ６−Ｒｇに結合するタンパクの発現 を支配するものであるかどうか直接調査するために、ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞内に 形質移入した。形質移入３日後、ＣＯＳ細胞のＪ４−８１（ａＡＬＣＡＭ）また はＣＤ６−Ｒｇに結合する能力をフローサイトメトリー法で試験を行った。図２ ８Ａに示されるように、ＡＬＣＡＭ発現ＣＯＳ細胞はＪ４−８１およびＣＤ６− Ｒｇ両方に結合可能であった。ＡＬＣＡＭはＣＤ６リガンドであるということを さらに確認するために、ＡＬＣＡＭ−Ｒｇをコードするキメラ遺伝子を構築した 。この部分を共有結合性ホモダイマーとして、−２００ｋＤａの分子集団として 発現し、ｍＡｂＪ４−８１により認識した。ＡＬＣＡＭ−ＲｇのＣＤ６への結合 を示すために、ＣＯＳ細胞をＣＤ６をコードするｃＤＮＡクローンにより形質移 入し(Aruffo et al，J．Exp．Med．174:949(1991))、フローサイトメトリーによ り３日後に試験した。ＣＤ６により形質移入されたＣＯＳ細胞は、Ｇ３−６（ａ ＣＤ６）およびＡＬＣＡＭ−Ｒｇ（図２８Ｂ）両方に結合した。これらの結果は 、ＣＤ６およびＡＬＣＡＭがレセプター／リガンド対であることを示している。 ニワトリＢＥＮは同型接着を仲介することが報告されている(Pourquie et al ，Proc．Natl，Acad，Sci，USA 89:5261(1992))； Tanaka et al，Neuron 7:53 5(1991))；Burns et al，Neuron 7:209(1991))。ＡＬＣＡＭ−Ｒｇは、ＡＬＣＡ Ｍを発現するＣＯＳ細胞に結合することができ、これはＡＬＣＡＭが同種親和性 および異種親和性接着双方を仲介することを示している。 ＊ ＊ ＊ 上記で言及した文献は全て参考として本明細書に引用する。 本発明の開示を読み取ることから、当業者は方式及び詳細の種々の変更を本発 明の真の範囲から逸脱することなく行うことができることを理解するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヘインズ バートン エフ アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27707 ダーラム ウェントワース ドラ イヴ 4923 (72)発明者 アルーフォ アレジャンドロ アメリカ合衆国 ワシントン州 98020 エドモンズ スプルース ストリート 1012 (72)発明者 パテル ダーヴァルクマー アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27712 ダーラム ディアチェイス ウィ ンド 3012 (72)発明者 ボーウェン マイケル エイ アメリカ合衆国 ワシントン州 98109− 4100 シアトル ロイ ストリート 200 −＃540 (72)発明者 マーカード ハンス アメリカ合衆国 ワシントン州 98040− 4408 マーサー アイランド サウスイー スト フォーティシックスス ストリート 9222

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．精製したＣＤ６リガンド、又は少なくとも５つの連続アミノ酸からなるその 一部分。 ２．前記リガンドのＣＤ６への結合が２価カチオン非依存性である請求項１記載 のリガンド。 ３．前記リガンドのＣＤ６への結合が２価カチオン依存性である請求項１記載の リガンド。 ４．前記リガンドが図２９に示されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のリガ ンド。 ５．前記リガンドが胸腺上皮細胞から誘導可能である請求項１記載のリガンド。 ６．前記胸腺上皮細胞がヒト細胞である請求項５記載のリガンド。 ７．還元条件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で求め た分子量が約３５ｋＤａである単離したＣＤ６リガンド、又は少なくとも５つの 連続アミノ酸からなるその一部分。 ８．還元条件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で求め た分子量が約１００ｋＤａである単離したＣＤ６リガンド、又は少なくとも５つ の連続アミノ酸からなるその一部分。 ９．還元条件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で求め た分子量が約９０ｋＤａである単離したＣＤ６リガンド、又は少なくとも５つの 連続アミノ酸からなるその一部分。 10．請求項１、７、８又は９のいずれか１項に記載の該ＣＤ６リガンド及び薬学 的に許容しうる担体を含む組成物。 11．請求項１、７、８又は９のいずれか１項に記載の該ＣＤ６リガンドのミメト ープ。 12．前記ミメトープがＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質である請求項１１記載のミ メトープ。 13．請求項１１記載の該ミメトープ及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物。 14．第１細胞の表面上に存在するＣＤ６の第２細胞の表面上に存在するＣＤ６リ ガンドへの結合を阻害する方法であって、前記第１細胞の表面上に存在する前 記ＣＤ６と可溶性ＣＤ６リガンド又はそのミメトープとを、前記可溶性ＣＤ６リ ガンド又はそのミメトープが前記第１細胞の表面上に存在する前記ＣＤ６に結合 し、もって、前記第２細胞の表面上に存在する前記ＣＤ６リガンドの前記第１細 胞の表面上に存在する前記ＣＤ６への結合を阻害するような条件下に接触させる 工程を含む方法。 15．第１細胞の表面上に存在するＣＤ６の第２細胞の表面上に存在するＣＤ６リ ガンドへの結合を阻害する方法であって、前記ＣＤ６リガンドと可溶性ＣＤ６又 はそのミメトープとを、前記可溶性ＣＤ６又はそのミメトープが前記第２細胞の 表面上に存在する前記ＣＤ６リガンドに結合し、もって、前記第１細胞の表面上 に存在する前記ＣＤ６の前記第２細胞の表面上に存在する前記ＣＤ６リガンドへ の結合を阻害するような条件下に接触させる工程を含む方法。 16．前記第１細胞がＴ細胞、Ｂ細胞又は神経細胞であり、前記第２細胞が胸腺上 皮細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、上皮細胞、膵腺房細胞、膵島細胞、繊 維芽細胞又は神経細胞である請求項１４又は１５記載の方法。 17．試験化合物の中のＣＤ６のＣＤ６リガンドへの結合阻害能をスクリーニング する方法であって、 ｉ）試験化合物とＣＤ６又はＣＤ６リガンドの一方、又は各々の結合部位とを 、前記試験化合物と前記ＣＤ６又はＣＤ６リガンド間に複合体が形成することが できるような条件下に接触させる工程； ii）前記ＣＤ６又はＣＤ６リガンドのもう一方と工程（ｉ）から得られた組合 わせとを、前記ＣＤ６又は各々の結合部位の前記ＣＤ６リガンド又は各々の結合 部位への結合が起こることができるような条件下に接触させる工程； iii)前記ＣＤ６又は各々の結合部位の前記ＣＤ６リガンド又は各々の結合部位 への結合の程度を求め、もって、前記試験化合物について前記ＣＤ６の前記ＣＤ ６リガンドへの結合阻害能を求める工程： を含む方法。 18．前記ＣＤ６又はＣＤ６リガンド又は各々の結合部位の少なくとも一方が可溶 性形態である請求項１７記載の方法。 19．前記ＣＤ６及びＣＤ６リガンドの少なくとも一方が細胞の表面上に存在する 請求項１７記載の方法。 20．約９０ｋＤａ（還元条件下ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル 電気泳動によって求めた）形態のＣＤ６リガンドに対する抗体。 21．ＣＤ６リガンド又はその少なくとも５つのアミノ酸部分をコードする配列を 有する単離された核酸分子。 22．前記分子がｃＤＮＡ分子である請求項２１記載の分子。 23．請求項２１記載の該分子及びベクターを含む発現構築物であって、前記分子 が該ベクター内でプロモーターに実施可能なように連結されている発現構築物。 24．前記ＣＤ６リガンドが図２９に示される配列を有する請求項２１記載の分子 。 25．前記分子が図２９に示される配列を有する請求項２４記載の分子。 26．請求項２３記載の該発現構築物を有する宿主細胞。 27．ＣＤ６リガンド又はその一部の作製方法であって、請求項２６記載の該宿主 細胞を前記核酸分子が発現されるような条件下に培養し、もって、前記ＣＤ６リ ガンドを作製する方法。