JPH0753407A - 免疫応答の制御方法並びに免疫細胞および内皮細胞に関連する薬剤 - Google Patents
免疫応答の制御方法並びに免疫細胞および内皮細胞に関連する薬剤Info
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- JPH0753407A JPH0753407A JP4039844A JP3984492A JPH0753407A JP H0753407 A JPH0753407 A JP H0753407A JP 4039844 A JP4039844 A JP 4039844A JP 3984492 A JP3984492 A JP 3984492A JP H0753407 A JPH0753407 A JP H0753407A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
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Abstract
(57)【要約】
【構成】免疫細胞、内皮細胞またはこの両細胞に、
（ａ）ＥＬＡＭ細胞に特異的に結合する抗体またはその
結合部位含有断片、及び（ｂ）ＶＣＡＭ、ＥＬＡＭ、Ｉ
ＣＡＭ、ＶＣＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンド及びＩＣ
ＡＭリガンドからなる群から選ばれた分子に特異的に結
合する抗体またはその結合部位含有断片を結合させるこ
とからなる免疫応答調節方法；及び（Ａ）ＥＬＡＭ分子
に特異的に結合する抗体、またはその結合部位含有断
片、或いは該抗体または断片の薬学的に許容される塩
（Ｂ）ＶＣＡＭ、ＥＬＡＭ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭリガン
ド、ＥＬＡＭリガンド及びＩＣＡＭリガンドからなる群
から選ばれた分子に特異的に結合する少なくとも１種の
抗体、またはその結合部位含有断片、或いは該抗体また
は断片の薬学的に許容される塩及び（Ｃ）薬学的に許容
される担体、希釈剤または賦形剤からなる免疫細胞及び
内皮細胞に関連する薬剤 【効果】免疫応答を特異的に調節することにより各種疾
患を副作用なく治療することができるようになった。
（ａ）ＥＬＡＭ細胞に特異的に結合する抗体またはその
結合部位含有断片、及び（ｂ）ＶＣＡＭ、ＥＬＡＭ、Ｉ
ＣＡＭ、ＶＣＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンド及びＩＣ
ＡＭリガンドからなる群から選ばれた分子に特異的に結
合する抗体またはその結合部位含有断片を結合させるこ
とからなる免疫応答調節方法；及び（Ａ）ＥＬＡＭ分子
に特異的に結合する抗体、またはその結合部位含有断
片、或いは該抗体または断片の薬学的に許容される塩
（Ｂ）ＶＣＡＭ、ＥＬＡＭ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭリガン
ド、ＥＬＡＭリガンド及びＩＣＡＭリガンドからなる群
から選ばれた分子に特異的に結合する少なくとも１種の
抗体、またはその結合部位含有断片、或いは該抗体また
は断片の薬学的に許容される塩及び（Ｃ）薬学的に許容
される担体、希釈剤または賦形剤からなる免疫細胞及び
内皮細胞に関連する薬剤 【効果】免疫応答を特異的に調節することにより各種疾
患を副作用なく治療することができるようになった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体お
よび炎症性過程へのそれらの応用に関する。より詳細に
は、本発明は、インビトロ（試験管内）およびインビボ
（生体内）で活性内皮細胞を指向する新規なモノクロー
ナル抗体に関する。
よび炎症性過程へのそれらの応用に関する。より詳細に
は、本発明は、インビトロ（試験管内）およびインビボ
（生体内）で活性内皮細胞を指向する新規なモノクロー
ナル抗体に関する。
【０００２】本発明はまた、ＩＬ−１処置の結果として
誘発される新規な内皮細胞表面抗原に関する。それら抗
原の一つに対する完全なｃＤＮＡ配列を開示する。それ
らの新規モノクローナル抗体ならびに新規抗原は、内皮
細胞が関与する急性および／または慢性炎症性反応を処
置するための医薬として有用であり、本発明は、かかる
医薬ならびにかかる炎症性反応を処置する方法に関する
ものでもある。さらに、本発明は、初期の移植片拒絶反
応、無症状感染、脈管炎などの内皮細胞関連炎症性反応
を検知する方法に関する。最後に本発明は、ＣＤ４+ Ｔ
−細胞の内皮細胞との反応性を調節することにより免疫
応答を制御する薬剤及び方法に関する。
誘発される新規な内皮細胞表面抗原に関する。それら抗
原の一つに対する完全なｃＤＮＡ配列を開示する。それ
らの新規モノクローナル抗体ならびに新規抗原は、内皮
細胞が関与する急性および／または慢性炎症性反応を処
置するための医薬として有用であり、本発明は、かかる
医薬ならびにかかる炎症性反応を処置する方法に関する
ものでもある。さらに、本発明は、初期の移植片拒絶反
応、無症状感染、脈管炎などの内皮細胞関連炎症性反応
を検知する方法に関する。最後に本発明は、ＣＤ４+ Ｔ
−細胞の内皮細胞との反応性を調節することにより免疫
応答を制御する薬剤及び方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】内皮細胞（ＥＣ）は、慢性および急性の
炎症の主要関与因子である。それらは、血流と血管外空
間との間の細胞および液体の輸送を調節する。さらに、
それらは、諸因子を分泌することによって炎症性の刺激
に対して反応するが、それら因子は、造血〔クウェセン
ベリ( Ｑuensenbry)とジンブロン（Ｇimbrone)、ブラッ
ド、５６巻１０６０〜１０６７頁、１９８０年〕、化学
走性〔ストライター（Ｓtreiter)ら、サイエンス、２４
３巻１４６７〜１４６９頁、１９８９年〕および凝固
〔ベヴィラクア（Ｂevilacqua)ら、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅxp．Ｍed.)、
１６０巻６１８〜６２３頁、１９８４年〕に対して種々
の影響を及ぼす。インターロイキン−１（ＩＬ−１）
は、障害に対する細胞のほぼ普遍的な反応として広範囲
の各種タイプの細胞によって分泌される〔ネタ（Ｎeta)
とオッペンハイム（Ｏppenheim）、アナルズ・オヴ・イ
ンターナル・メディシン（Ａnn．Ｉnt．Ｍed.)、１０９
巻１〜３１頁、１９８８年〕。適当な刺激を受けると多
くのタイプの細胞がこの因子を分泌し、多くのタイプの
細胞が、それも種々の方式で、反応する。ＩＬ−１は、
炎症部位に見出され、精製蛋白質として注射すると、紅
斑および血流からの顆粒球の流入をきたし、二次的には
組織破壊をきたす〔ベック（Ｂeck)ら、ジャーナル・オ
ヴ・インムノロジー（Ｊ．Ｉmmunol.)、１３６巻３０２
５〜３０３１頁、１９８６年；ペティファー（Ｐettiph
er）ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オヴ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.
Ｓci.)、８３巻、８７４９〜８７５３頁、１９８６
年〕。
炎症の主要関与因子である。それらは、血流と血管外空
間との間の細胞および液体の輸送を調節する。さらに、
それらは、諸因子を分泌することによって炎症性の刺激
に対して反応するが、それら因子は、造血〔クウェセン
ベリ( Ｑuensenbry)とジンブロン（Ｇimbrone)、ブラッ
ド、５６巻１０６０〜１０６７頁、１９８０年〕、化学
走性〔ストライター（Ｓtreiter)ら、サイエンス、２４
３巻１４６７〜１４６９頁、１９８９年〕および凝固
〔ベヴィラクア（Ｂevilacqua)ら、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅxp．Ｍed.)、
１６０巻６１８〜６２３頁、１９８４年〕に対して種々
の影響を及ぼす。インターロイキン−１（ＩＬ−１）
は、障害に対する細胞のほぼ普遍的な反応として広範囲
の各種タイプの細胞によって分泌される〔ネタ（Ｎeta)
とオッペンハイム（Ｏppenheim）、アナルズ・オヴ・イ
ンターナル・メディシン（Ａnn．Ｉnt．Ｍed.)、１０９
巻１〜３１頁、１９８８年〕。適当な刺激を受けると多
くのタイプの細胞がこの因子を分泌し、多くのタイプの
細胞が、それも種々の方式で、反応する。ＩＬ−１は、
炎症部位に見出され、精製蛋白質として注射すると、紅
斑および血流からの顆粒球の流入をきたし、二次的には
組織破壊をきたす〔ベック（Ｂeck)ら、ジャーナル・オ
ヴ・インムノロジー（Ｊ．Ｉmmunol.)、１３６巻３０２
５〜３０３１頁、１９８６年；ペティファー（Ｐettiph
er）ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オヴ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.
Ｓci.)、８３巻、８７４９〜８７５３頁、１９８６
年〕。
【０００４】数ヶ所の研究室が、内皮細胞がＩＬ−１に
対して速かに反応することを示しているが、このこと
は、炎症性反応におけるそれらの細胞の補助的性質と一
致している。最もよく記述されている反応のうちの二つ
は、前駆凝固剤（procoagulant）活性の増大〔ベヴィラ
クアら、１９８４年．上掲〕およびそれに随伴しての白
血球に対する粘着能の増大〔ベヴィラクアら、ジャーナ
ル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション
（Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest.）、７６巻２００３〜２０１１
頁、１９８５年〕である。
対して速かに反応することを示しているが、このこと
は、炎症性反応におけるそれらの細胞の補助的性質と一
致している。最もよく記述されている反応のうちの二つ
は、前駆凝固剤（procoagulant）活性の増大〔ベヴィラ
クアら、１９８４年．上掲〕およびそれに随伴しての白
血球に対する粘着能の増大〔ベヴィラクアら、ジャーナ
ル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション
（Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest.）、７６巻２００３〜２０１１
頁、１９８５年〕である。
【０００５】血管の内層として、内皮細胞は、炎症性細
胞およびそれらの反応性副生物における物質輸送を制御
するよう、ユニークな配置をとっている。その上、内皮
細胞は、それ自身、新しく合成された蛋白質を血流中へ
分泌するが、それら蛋白質は炎症過程の初期指標である
かもしれない。この主要な役割にもかかわらず、このタ
イプの細胞の役割を直接的に取扱った治療法上のアプロ
ーチや診断指示薬はほとんど展開、開発されていない。
内皮細胞の生物学は、実験室内でのこれらの細胞の培養
に最近成功したために、やっとより詳細に理解されはじ
めたところである。
胞およびそれらの反応性副生物における物質輸送を制御
するよう、ユニークな配置をとっている。その上、内皮
細胞は、それ自身、新しく合成された蛋白質を血流中へ
分泌するが、それら蛋白質は炎症過程の初期指標である
かもしれない。この主要な役割にもかかわらず、このタ
イプの細胞の役割を直接的に取扱った治療法上のアプロ
ーチや診断指示薬はほとんど展開、開発されていない。
内皮細胞の生物学は、実験室内でのこれらの細胞の培養
に最近成功したために、やっとより詳細に理解されはじ
めたところである。
【０００６】上述の通り、炎症性反応の主要な媒介物質
（メディエイタ）はＩＬ−１である。ＩＬ−１は、マク
ロファージ（大食細胞）その他多くのタイプの細胞によ
り分泌される１７Ｋｄのポリペプチドで、発熱から炎症
性細胞の増殖や骨髄中での前駆体からの成熟白血球の漸
増（レクルートメント）まで幅広い反応を惹起させるこ
とができる〔ディナレロ（Ｄinarello）の総説：ＦＡＳ
ＥＢジャーナル、２巻１０６〜１１５頁、１９８８
年〕。
（メディエイタ）はＩＬ−１である。ＩＬ−１は、マク
ロファージ（大食細胞）その他多くのタイプの細胞によ
り分泌される１７Ｋｄのポリペプチドで、発熱から炎症
性細胞の増殖や骨髄中での前駆体からの成熟白血球の漸
増（レクルートメント）まで幅広い反応を惹起させるこ
とができる〔ディナレロ（Ｄinarello）の総説：ＦＡＳ
ＥＢジャーナル、２巻１０６〜１１５頁、１９８８
年〕。
【０００７】内皮細胞は、炎症過程の極めて初期の段階
でＩＬ−１に反応し、ＩＬ−１を分泌する。グラム陰性
菌による細菌感染の一副産物として、内毒素の産生とそ
の結果としてのＩＬ−１の二次的産生があるが、機械的
障害がＩＬ−１の放出の引き金となりうるかどうかとい
う問題は、スポーツにより誘発された炎症を研究する者
にとっては重要ではあるが、まだ回答が与えられていな
い。
でＩＬ−１に反応し、ＩＬ−１を分泌する。グラム陰性
菌による細菌感染の一副産物として、内毒素の産生とそ
の結果としてのＩＬ−１の二次的産生があるが、機械的
障害がＩＬ−１の放出の引き金となりうるかどうかとい
う問題は、スポーツにより誘発された炎症を研究する者
にとっては重要ではあるが、まだ回答が与えられていな
い。
【０００８】過去１０年間のいくつかの研究室での業績
に基いて、インビトロで内皮細胞のＩＬ−１処理によっ
て模擬の可能なプロセスである血管壁への白血球の結合
が、組織腔への白血球の漏出の第一段階であると、考え
られる。しかし、このプロセスのいくつかの側面は、と
くにそれらが現用抗炎症剤の使用と関係があるのかもし
れないため、不明のままである。
に基いて、インビトロで内皮細胞のＩＬ−１処理によっ
て模擬の可能なプロセスである血管壁への白血球の結合
が、組織腔への白血球の漏出の第一段階であると、考え
られる。しかし、このプロセスのいくつかの側面は、と
くにそれらが現用抗炎症剤の使用と関係があるのかもし
れないため、不明のままである。
【０００９】ＩＬ−１は、培養ヒト内皮細胞の膜の性質
の速かな変化を惹起する。このことは、処理された細胞
の白血球結合能、それらによる前駆凝固剤活性の獲得お
よび機能的性質未知のものも含めて新しい細胞表面抗原
の発現から明らかである。研究されたこれらの諸例で
は、記載された新しい性質の発現がアクチノマイシンＤ
およびシクロヘキシミドの作用に対して感受性で、新し
い伝達暗号（メッセージ）、新しい蛋白質の合成の上で
の一要件が示唆されている。
の速かな変化を惹起する。このことは、処理された細胞
の白血球結合能、それらによる前駆凝固剤活性の獲得お
よび機能的性質未知のものも含めて新しい細胞表面抗原
の発現から明らかである。研究されたこれらの諸例で
は、記載された新しい性質の発現がアクチノマイシンＤ
およびシクロヘキシミドの作用に対して感受性で、新し
い伝達暗号（メッセージ）、新しい蛋白質の合成の上で
の一要件が示唆されている。
【００１０】白血球および造血器起源の腫瘍細胞の、基
底および活性内皮細胞へのならびに毛細血管の「高い」
内皮細胞への結合が、いくつかの研究室によって研究さ
れている。顆粒球、単球、Ｔ細胞およびＢ細胞はいずれ
も、生理的濃度のＩＬ−１による刺激ののちに内皮細胞
に結合できることが証明されている〔ベヴィラクアら、
ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイシ
ョン、７６巻、２００３〜２０１１頁、１９８５年；キ
ャヴェンダー（Ｃavender)ら、ジャーナル・オヴ・イム
ノロジー、１３６巻２０３〜２０７頁、１９８６年；ポ
ールマン（Ｐohlman）ら、ジャーナル・オヴ・イムノロ
ジー、１３６巻４５４８〜４５５３頁、１９８６年〕。
Ｔ細胞結合は、ＩＦＮ−ガンマによる内皮細胞の前処理
によっても〔ユー（Ｙu)ら、クリニカル・アンド・エク
スペリメンタル・インムノロジー（Ｃlin.exp.Ｉmmuno
l.)、６２巻５５４〜５６０頁、１９８５年；マスヤマ
およびカノ、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェ
スティゲイション、７７巻１５９６〜１６０５頁、１９
８６年〕、またＩＬ−１による前処理によっても〔キャ
ヴェンダーら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３
６巻２０３〜２０７頁、１９８６年；ベンダー（Ｂende
r)ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティ
ゲイション、７９巻１６７９〜１６８８頁、１９８７
年〕、ｌｐｓによる前処理によっても〔ユーら、ジャー
ナル・オヴ・イムノロジー、１３６巻５６９〜５７３
頁、１９８６年〕、さらにＴＮＦによる前処理によって
も〔キャヴェンダーら、ジャーナル・オヴ・イムノロジ
ー、１３９巻１８５５〜１８６０頁、１９８７年〕誘発
できる。静止期内皮へのこれらサイトカイン類の前駆付
着作用は、広く、炎症の血管外遊出成分における初期事
象のモデルとみなされている。高内皮小静脈（ＨＥＶ）
の場合、構成成分内皮細胞は、既に何らかの方式で活性
化されていて、ＴおよびＢ細胞の再循環におけるそれら
の役割が容易になっているものと思われる〔総説：イェ
ドノック（Ｙedonock)ら、アドヴァンシズ・イン・イム
ノロジー（Ａdv.in Immunol.）、４４巻３１３〜３７８
頁、１９８９年〕。他の刺激を受けていない培養内皮細
胞への単球の結合〔パヴロフスキ（Ｐawlowski）ら、ジ
ャーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン
（Ｊ．Ｅxp．Ｍed.)、１６８巻１８６５〜１８８２頁、
１９８８年；ウォリス（Ｗallis)ら、ジャーナル・オヴ
・イムノロジー、１３５巻２３２３〜２３３０頁、１９
８５年〕および顆粒球の結合〔ロー（Ｌo)ら、ジャーナ
ル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１６９巻
１７７９〜１７９３頁、１９８９年〕は、循環系内での
これらのタイプの細胞の辺縁趨向のモデルとみなされて
きた。
底および活性内皮細胞へのならびに毛細血管の「高い」
内皮細胞への結合が、いくつかの研究室によって研究さ
れている。顆粒球、単球、Ｔ細胞およびＢ細胞はいずれ
も、生理的濃度のＩＬ−１による刺激ののちに内皮細胞
に結合できることが証明されている〔ベヴィラクアら、
ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイシ
ョン、７６巻、２００３〜２０１１頁、１９８５年；キ
ャヴェンダー（Ｃavender)ら、ジャーナル・オヴ・イム
ノロジー、１３６巻２０３〜２０７頁、１９８６年；ポ
ールマン（Ｐohlman）ら、ジャーナル・オヴ・イムノロ
ジー、１３６巻４５４８〜４５５３頁、１９８６年〕。
Ｔ細胞結合は、ＩＦＮ−ガンマによる内皮細胞の前処理
によっても〔ユー（Ｙu)ら、クリニカル・アンド・エク
スペリメンタル・インムノロジー（Ｃlin.exp.Ｉmmuno
l.)、６２巻５５４〜５６０頁、１９８５年；マスヤマ
およびカノ、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェ
スティゲイション、７７巻１５９６〜１６０５頁、１９
８６年〕、またＩＬ−１による前処理によっても〔キャ
ヴェンダーら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３
６巻２０３〜２０７頁、１９８６年；ベンダー（Ｂende
r)ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティ
ゲイション、７９巻１６７９〜１６８８頁、１９８７
年〕、ｌｐｓによる前処理によっても〔ユーら、ジャー
ナル・オヴ・イムノロジー、１３６巻５６９〜５７３
頁、１９８６年〕、さらにＴＮＦによる前処理によって
も〔キャヴェンダーら、ジャーナル・オヴ・イムノロジ
ー、１３９巻１８５５〜１８６０頁、１９８７年〕誘発
できる。静止期内皮へのこれらサイトカイン類の前駆付
着作用は、広く、炎症の血管外遊出成分における初期事
象のモデルとみなされている。高内皮小静脈（ＨＥＶ）
の場合、構成成分内皮細胞は、既に何らかの方式で活性
化されていて、ＴおよびＢ細胞の再循環におけるそれら
の役割が容易になっているものと思われる〔総説：イェ
ドノック（Ｙedonock)ら、アドヴァンシズ・イン・イム
ノロジー（Ａdv.in Immunol.）、４４巻３１３〜３７８
頁、１９８９年〕。他の刺激を受けていない培養内皮細
胞への単球の結合〔パヴロフスキ（Ｐawlowski）ら、ジ
ャーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン
（Ｊ．Ｅxp．Ｍed.)、１６８巻１８６５〜１８８２頁、
１９８８年；ウォリス（Ｗallis)ら、ジャーナル・オヴ
・イムノロジー、１３５巻２３２３〜２３３０頁、１９
８５年〕および顆粒球の結合〔ロー（Ｌo)ら、ジャーナ
ル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１６９巻
１７７９〜１７９３頁、１９８９年〕は、循環系内での
これらのタイプの細胞の辺縁趨向のモデルとみなされて
きた。
【００１１】白血球の再循環および炎症の初期段階を研
究する上での基本となる一前提は、各種白血球の結合お
よび血管外遊出に対して選択的な機構が存在することで
ある。かかる機構の存在は、白血球の粘膜器官および末
梢リンパ器官を通っての再循環に差のあること〔総説：
イェドノックら、アドヴァンシズ・イン・イムノロジ
ー、４４巻３１３〜３７８頁、１９８９年〕、好中球、
単球およびリンパ球の炎症時管外遊出の速度に差のある
こと〔イッセクッツ（Ｉssekutz)ら、アメリカン・ジャ
ーナル・オヴ・パソロジー（Ａm.Ｊ．Ｐathol.）、１０
３巻４７頁、１９８１年〕およびアテローム発生時の単
球の選択的な結合および蓄積〔テイラー（Ｔaylor)とル
イス（Ｌewis）、アメリカン・ジャーナル・オヴ・パソ
ロジー、１２５巻１５２頁、１９８６年〕から推定され
る。Ｔ細胞は、炎症性障害、とくに慢性形態で継続する
ものの後期の、しかし存続性の、要素である。自己免疫
疾患の病因におけるＴ細胞の役割〔ウォフシ（Ｗofsy）
とシーマン（Ｓeaman)、ジャーナル・オヴ・エクスペリ
メンタル・メディシン、１６１巻３７８〜３９１頁、１
９８５年；レインジズ（Ｒanges)ら、ジャーナル・オヴ
・エクスペリメンタル・メディシン、１６２巻１１０５
〜１１１０頁、１９８５年；トーログ（Ｔaurog)ら、セ
ルラー・イムノロジー（Ｃell.Ｉmmunol.)、７５巻２７
１〜２８２頁、１９８３年；マロン（Ｍaron）ら、ジャ
ーナル・オヴ・イムノロジー、１３１巻２３１６〜２３
２２頁、１９８３年；ロッシーニ（Ｒossini）ら、アニ
ュアル・レヴュー・オヴ・イムノロジー（Ａnn．Ｒev．
Ｉmmunol.)、３巻２８９〜３２０頁、１９８５年〕か
ら、最終的組織障害部位へのそれらの移行に興味がもた
れ、とくに活性化されたまたは前駆付着性内皮細胞要素
との相互作用が強調されている。
究する上での基本となる一前提は、各種白血球の結合お
よび血管外遊出に対して選択的な機構が存在することで
ある。かかる機構の存在は、白血球の粘膜器官および末
梢リンパ器官を通っての再循環に差のあること〔総説：
イェドノックら、アドヴァンシズ・イン・イムノロジ
ー、４４巻３１３〜３７８頁、１９８９年〕、好中球、
単球およびリンパ球の炎症時管外遊出の速度に差のある
こと〔イッセクッツ（Ｉssekutz)ら、アメリカン・ジャ
ーナル・オヴ・パソロジー（Ａm.Ｊ．Ｐathol.）、１０
３巻４７頁、１９８１年〕およびアテローム発生時の単
球の選択的な結合および蓄積〔テイラー（Ｔaylor)とル
イス（Ｌewis）、アメリカン・ジャーナル・オヴ・パソ
ロジー、１２５巻１５２頁、１９８６年〕から推定され
る。Ｔ細胞は、炎症性障害、とくに慢性形態で継続する
ものの後期の、しかし存続性の、要素である。自己免疫
疾患の病因におけるＴ細胞の役割〔ウォフシ（Ｗofsy）
とシーマン（Ｓeaman)、ジャーナル・オヴ・エクスペリ
メンタル・メディシン、１６１巻３７８〜３９１頁、１
９８５年；レインジズ（Ｒanges)ら、ジャーナル・オヴ
・エクスペリメンタル・メディシン、１６２巻１１０５
〜１１１０頁、１９８５年；トーログ（Ｔaurog)ら、セ
ルラー・イムノロジー（Ｃell.Ｉmmunol.)、７５巻２７
１〜２８２頁、１９８３年；マロン（Ｍaron）ら、ジャ
ーナル・オヴ・イムノロジー、１３１巻２３１６〜２３
２２頁、１９８３年；ロッシーニ（Ｒossini）ら、アニ
ュアル・レヴュー・オヴ・イムノロジー（Ａnn．Ｒev．
Ｉmmunol.)、３巻２８９〜３２０頁、１９８５年〕か
ら、最終的組織障害部位へのそれらの移行に興味がもた
れ、とくに活性化されたまたは前駆付着性内皮細胞要素
との相互作用が強調されている。
【００１２】直接的および間接的証拠は、基底内皮細胞
または活性化内皮細胞への白血球の付着が複雑なプロセ
スであることを強く示唆している。活性化内皮細胞表面
の４種の明白に区別される構造が記載されている〔ハー
ゲマイヤ（Ｈagemeier）ら、インタナショナル・ジャー
ナル・オヴ・キャンサー（Ｉnt．Ｊ．Ｃancer)、３８巻
４８１〜４８８頁、１９８６年；ゲルト（Ｇoerdt)ら、
エクスペリメンタル・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｅxpl.Ｃell.Ｂiol.）、５５巻１１７〜１２６頁、１
９８７年；ドゥアイヴェンスティライン（Ｄuijvestili
jn）ら、アメリカン・ジャーナル・オヴ・パソロジー、
１３０巻１４７〜１５５頁、１９８８年；レーウウェン
ベルグ（Ｌeeuwenberg）ら、ヨーロピアン・ジャーナル
・オヴ・イムノロジー（Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.)、１９巻
７１５〜７２０頁、１９８９年〕が、少なくとももう２
種の十分に特性が明らかにされた分子が、付着事象に直
接的に関係ありとされている。ＥＬＡＭ−１蛋白質は、
サイトカイン活性化内皮への顆粒球の付着を主として媒
介する〔ポウバー（Ｐober）ら、ジャーナル・オヴ・イ
ムノロジー、１３６巻１６８０〜１６８７頁、１９８６
年；ベヴィラクアら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシズ、８４巻
９２３８〜９２４２頁、１９８７年；ベヴィラクアら、
サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５頁、１９８９
年〕；ＩＣＡＭ−１蛋白質は、活性内皮細胞へのある種
の単核細胞〔ダスティン（Ｄustin)とスプリンガー（Ｓ
pringer)、ジャーナル・オヴ・セルラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｃell.Ｂiol.）、１０７巻３２１〜３３１頁、１
９８８年〕および顆粒球〔スミス（Ｓmith）ら、ジャー
ナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション８
３巻２００８〜２０１７頁、１９８９年、同８２巻１７
４６〜１７５６頁、１９８８年〕の付着の部分的原因と
なる。これらおよびその他の研究〔ハスカード（Ｈaska
rd）ら、ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３７巻２
９０１〜２９０６頁、１９８６年〕における重要な一致
点は、活性内皮細胞への白血球の付着のためのＩＣＡＭ
−１およびＥＬＡＭ−１非依存性の経路が存在すること
についてである。
または活性化内皮細胞への白血球の付着が複雑なプロセ
スであることを強く示唆している。活性化内皮細胞表面
の４種の明白に区別される構造が記載されている〔ハー
ゲマイヤ（Ｈagemeier）ら、インタナショナル・ジャー
ナル・オヴ・キャンサー（Ｉnt．Ｊ．Ｃancer)、３８巻
４８１〜４８８頁、１９８６年；ゲルト（Ｇoerdt)ら、
エクスペリメンタル・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｅxpl.Ｃell.Ｂiol.）、５５巻１１７〜１２６頁、１
９８７年；ドゥアイヴェンスティライン（Ｄuijvestili
jn）ら、アメリカン・ジャーナル・オヴ・パソロジー、
１３０巻１４７〜１５５頁、１９８８年；レーウウェン
ベルグ（Ｌeeuwenberg）ら、ヨーロピアン・ジャーナル
・オヴ・イムノロジー（Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.)、１９巻
７１５〜７２０頁、１９８９年〕が、少なくとももう２
種の十分に特性が明らかにされた分子が、付着事象に直
接的に関係ありとされている。ＥＬＡＭ−１蛋白質は、
サイトカイン活性化内皮への顆粒球の付着を主として媒
介する〔ポウバー（Ｐober）ら、ジャーナル・オヴ・イ
ムノロジー、１３６巻１６８０〜１６８７頁、１９８６
年；ベヴィラクアら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシズ、８４巻
９２３８〜９２４２頁、１９８７年；ベヴィラクアら、
サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５頁、１９８９
年〕；ＩＣＡＭ−１蛋白質は、活性内皮細胞へのある種
の単核細胞〔ダスティン（Ｄustin)とスプリンガー（Ｓ
pringer)、ジャーナル・オヴ・セルラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｃell.Ｂiol.）、１０７巻３２１〜３３１頁、１
９８８年〕および顆粒球〔スミス（Ｓmith）ら、ジャー
ナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション８
３巻２００８〜２０１７頁、１９８９年、同８２巻１７
４６〜１７５６頁、１９８８年〕の付着の部分的原因と
なる。これらおよびその他の研究〔ハスカード（Ｈaska
rd）ら、ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３７巻２
９０１〜２９０６頁、１９８６年〕における重要な一致
点は、活性内皮細胞への白血球の付着のためのＩＣＡＭ
−１およびＥＬＡＭ−１非依存性の経路が存在すること
についてである。
【００１３】それにもかかわらず、単核細胞の結合にお
けるこれらおよび他の分子の役割は未だ明らかにされて
いない。
けるこれらおよび他の分子の役割は未だ明らかにされて
いない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の一目
的は、インビトロおよびインビボで活性化ヒト内皮細胞
上の抗原に特異的な新規モノクローナル抗体を開発する
ことである。 本発明の第二の目的は、白血球の結合を
ブロックし、それによって活性化内皮細胞関連炎症性反
応を防止するための医薬として、またそのための方法に
おいて有用な、新規モノクローナル抗体を開発すること
である。
的は、インビトロおよびインビボで活性化ヒト内皮細胞
上の抗原に特異的な新規モノクローナル抗体を開発する
ことである。 本発明の第二の目的は、白血球の結合を
ブロックし、それによって活性化内皮細胞関連炎症性反
応を防止するための医薬として、またそのための方法に
おいて有用な、新規モノクローナル抗体を開発すること
である。
【００１５】本発明の第三の目的は、活性化内皮細胞関
連炎症性反応を防止するための医薬として、またそのた
めの方法において有用な、活性化内皮細胞上に発現され
る新規な抗原および／または新規な抗原エピトープを提
供することである。
連炎症性反応を防止するための医薬として、またそのた
めの方法において有用な、活性化内皮細胞上に発現され
る新規な抗原および／または新規な抗原エピトープを提
供することである。
【００１６】本発明の第四の目的は、活性化内皮細胞関
連炎症性反応を検知できる検出法を提供することであ
る。
連炎症性反応を検知できる検出法を提供することであ
る。
【００１７】本発明の第五の目的は、Ｔ細胞と内皮細胞
の間の結合を調節することによりＴ細胞活性を制御する
ための組成物及び方法を開発することにある。
の間の結合を調節することによりＴ細胞活性を制御する
ための組成物及び方法を開発することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】これらおよびその他の目
的は、ＩＬ−１活性化内皮細胞に特異的に結合するモノ
クローナル抗体またはその結合部位含有断片であって、
該モノクローナル抗体が下記モノクローナル抗体(A) 、
(B）および(C) からなる群より選ばれたものであること
を特徴とする前記モノクローナル抗体またはその断片を
提供することによって、達成された： (A) 同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒
球混合物またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単
核細胞には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細
胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しないかま
たは部分的に阻害し、(5) インビトロで、顆粒球のＩＬ
−１活性化内皮細胞への結合を阻害せず、(6) ＩＬ−１
活性化内皮細胞の表面に存在し、第３４Ａ〜３４Ｄ図に
よって規定される１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原に
特異的に結合する； (B) 同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒
球混合物またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単
核細胞には有意には結合せず、(4) 休止及びＩＬ−１活
性化内皮細胞の細胞質中及びＩＬ−１活性化内皮細胞の
表面に存在するＣＭＰ−１７０抗原に特異的に結合す
る；及び (C) 同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒
球混合物またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単
核細胞には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細
胞の活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害し、(5) イ
ンビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合
を完全にまたは部分的に阻害し、(6) ＩＬ−１活性化内
皮細胞の表面に存在するＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗
原のＮ末端２０％に特異的に結合し、(7) ＩＬ−１活性
化内皮細胞の表面に存在する１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋
白質抗原には結合しない。
的は、ＩＬ−１活性化内皮細胞に特異的に結合するモノ
クローナル抗体またはその結合部位含有断片であって、
該モノクローナル抗体が下記モノクローナル抗体(A) 、
(B）および(C) からなる群より選ばれたものであること
を特徴とする前記モノクローナル抗体またはその断片を
提供することによって、達成された： (A) 同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒
球混合物またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単
核細胞には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細
胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しないかま
たは部分的に阻害し、(5) インビトロで、顆粒球のＩＬ
−１活性化内皮細胞への結合を阻害せず、(6) ＩＬ−１
活性化内皮細胞の表面に存在し、第３４Ａ〜３４Ｄ図に
よって規定される１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原に
特異的に結合する； (B) 同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒
球混合物またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単
核細胞には有意には結合せず、(4) 休止及びＩＬ−１活
性化内皮細胞の細胞質中及びＩＬ−１活性化内皮細胞の
表面に存在するＣＭＰ−１７０抗原に特異的に結合す
る；及び (C) 同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒
球混合物またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単
核細胞には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細
胞の活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害し、(5) イ
ンビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合
を完全にまたは部分的に阻害し、(6) ＩＬ−１活性化内
皮細胞の表面に存在するＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗
原のＮ末端２０％に特異的に結合し、(7) ＩＬ−１活性
化内皮細胞の表面に存在する１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋
白質抗原には結合しない。
【００１９】他の一実施態様として、本発明は、上記モ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提
供する。
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提
供する。
【００２０】好ましい実施態様にあっては、該モノクロ
ーナル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイ
ブリドーマ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナ
ル抗体１Ｅ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイ
ブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナ
ル抗体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイ
ブリドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ａ２、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイ
ブリドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナ
ル抗体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１の
ハイブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクロ
ーナル抗体３Ｂ７又はこれらのモノクローナル抗体の結
合部位含有断片である。
ーナル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイ
ブリドーマ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナ
ル抗体１Ｅ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイ
ブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナ
ル抗体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイ
ブリドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ａ２、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイ
ブリドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナ
ル抗体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１の
ハイブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクロ
ーナル抗体３Ｂ７又はこれらのモノクローナル抗体の結
合部位含有断片である。
【００２１】さらに一つの実施態様にあっては、本発明
は、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置するための薬
剤を提供するものであって、該薬剤は、(I) インビトロ
でのＴ細胞の活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害す
る前記モノクローナル抗体(A) 、またはモノクローナル
抗体(C) の少なくとも１種またはその結合部位含有断片
あるいは該モノクローナル抗体または断片の薬学的に許
容しうる塩の医薬としての有効量および(II)薬学的に許
容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含有してなる。
は、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置するための薬
剤を提供するものであって、該薬剤は、(I) インビトロ
でのＴ細胞の活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害す
る前記モノクローナル抗体(A) 、またはモノクローナル
抗体(C) の少なくとも１種またはその結合部位含有断片
あるいは該モノクローナル抗体または断片の薬学的に許
容しうる塩の医薬としての有効量および(II)薬学的に許
容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含有してなる。
【００２２】好ましい一実施態様では、該モノクローナ
ル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７、またはこれらのモノクローナル抗体の結
合部位含有断片である。
ル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７、またはこれらのモノクローナル抗体の結
合部位含有断片である。
【００２３】さらに他の一実施態様として、本発明は、
活性内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法を提供する
ものであって、該方法は、前記薬剤に関して上記したモ
ノクローナル抗体またはその結合部位含有断片あるいは
該モノクローナル抗体または断片の医薬として許容しう
る塩の医薬としての有効量を処置の必要な患者に投与す
ることからなる。
活性内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法を提供する
ものであって、該方法は、前記薬剤に関して上記したモ
ノクローナル抗体またはその結合部位含有断片あるいは
該モノクローナル抗体または断片の医薬として許容しう
る塩の医薬としての有効量を処置の必要な患者に投与す
ることからなる。
【００２４】好ましい一実施態様では、該モノクローナ
ル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７またはこれらのモノクローナル抗体の結合
部位含有断片である。
ル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７またはこれらのモノクローナル抗体の結合
部位含有断片である。
【００２５】本発明はさらに、ＩＬ−１活性内皮細胞上
に見出される実質的に純粋な抗原またはその抗原性断片
を提供するものであり、該抗原または抗原性断片は下記
の(A) 、(B) および(C) よりなる群から選ばれる： (A) 同定のための次の特性をもつ１Ｅ７／２Ｇ７抗原： (1) シアロ糖蛋白質である、 (2) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量（molecular mass）： (a) 約１１４ｋＤａに強いバンド、(b) 約９５ｋＤａに
弱いバンド、 (3) 非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により求めた分子質量： (a) 約１００ｋＤａに強いバンド、(b) 約９３ｋＤａに
弱いバンド、 (4) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量は、Ｏ結合糖鎖除去後、約
１〜２ｋＤａ減少、 (5) ２−Ｄゲル分析により求めた等電点約４．８〜４．
９、 (6) 構成性またはトロンビン刺激末梢血液単核細胞、顆
粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発
現されず、 (7) ＩＬ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ
多糖（ｌｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ
γ）によっては刺激されず、 (8) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ
細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ
７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハ
イブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロー
ナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長
時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってイ
ンビトロで測定した場合、慢性動態を示し、 (9) 慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中での
抗原発現によりインビボで測定した場合、慢性または急
性動態を示し、 (10)ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結合す
る抗体には結合せず、 (11)該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該モノ
クローナル抗体２Ｇ７に結合し、 (12)Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示したｃＤＮＡ配列によりト
ランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって発現される； (B) 同定のための次の特性をもつＣＭＰ−１７０抗原： (1) 還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により求めた分子質量：約１７０ｋ
Ｄａ、(2) 休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆
粒球、繊維芽細胞またはケラチノサイト上では発現され
ず、(3) 休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の細胞
質中に存在し、(4) 活性化内皮細胞の細胞表面での発現
がシクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤにより阻
害され、(5) 内皮細胞内のワイベル−パラド体（Ｗeibe
l-Ｐalade bodies）に局在することなく、(6) Ｌ−１刺
激内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表面で会合（associ
ate)し、(7) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブ
リドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル
抗体３Ａ２が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間
前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってインビ
トロで測定した場合、急性動態を示し、(8) モノクロー
ナル抗体３Ａ２に結合する；及び (C) 同定のための次の特性をもつＥＬＡＭ−１抗原の抗
原性断片からなる抗原： (1) ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、(2)
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ細胞
株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９に
結合する、(3) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７に結合する、(4) 構成性またはトロンビン
刺激末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板、繊維芽細胞ま
たはケラチノサイト上で発現されない、(5) ＩＬ−１活
性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ多糖（ｌｐｓ）
および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）により刺激され
るが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）によっては
刺激されない。
に見出される実質的に純粋な抗原またはその抗原性断片
を提供するものであり、該抗原または抗原性断片は下記
の(A) 、(B) および(C) よりなる群から選ばれる： (A) 同定のための次の特性をもつ１Ｅ７／２Ｇ７抗原： (1) シアロ糖蛋白質である、 (2) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量（molecular mass）： (a) 約１１４ｋＤａに強いバンド、(b) 約９５ｋＤａに
弱いバンド、 (3) 非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により求めた分子質量： (a) 約１００ｋＤａに強いバンド、(b) 約９３ｋＤａに
弱いバンド、 (4) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量は、Ｏ結合糖鎖除去後、約
１〜２ｋＤａ減少、 (5) ２−Ｄゲル分析により求めた等電点約４．８〜４．
９、 (6) 構成性またはトロンビン刺激末梢血液単核細胞、顆
粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発
現されず、 (7) ＩＬ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ
多糖（ｌｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ
γ）によっては刺激されず、 (8) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ
細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ
７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハ
イブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロー
ナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長
時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってイ
ンビトロで測定した場合、慢性動態を示し、 (9) 慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中での
抗原発現によりインビボで測定した場合、慢性または急
性動態を示し、 (10)ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結合す
る抗体には結合せず、 (11)該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該モノ
クローナル抗体２Ｇ７に結合し、 (12)Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示したｃＤＮＡ配列によりト
ランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって発現される； (B) 同定のための次の特性をもつＣＭＰ−１７０抗原： (1) 還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により求めた分子質量：約１７０ｋ
Ｄａ、(2) 休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆
粒球、繊維芽細胞またはケラチノサイト上では発現され
ず、(3) 休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の細胞
質中に存在し、(4) 活性化内皮細胞の細胞表面での発現
がシクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤにより阻
害され、(5) 内皮細胞内のワイベル−パラド体（Ｗeibe
l-Ｐalade bodies）に局在することなく、(6) Ｌ−１刺
激内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表面で会合（associ
ate)し、(7) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブ
リドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル
抗体３Ａ２が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間
前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってインビ
トロで測定した場合、急性動態を示し、(8) モノクロー
ナル抗体３Ａ２に結合する；及び (C) 同定のための次の特性をもつＥＬＡＭ−１抗原の抗
原性断片からなる抗原： (1) ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、(2)
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ細胞
株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９に
結合する、(3) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７に結合する、(4) 構成性またはトロンビン
刺激末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板、繊維芽細胞ま
たはケラチノサイト上で発現されない、(5) ＩＬ−１活
性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ多糖（ｌｐｓ）
および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）により刺激され
るが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）によっては
刺激されない。
【００２６】本発明は、(I) 上記の１Ｅ７／２Ｇ７抗
原、ＣＭＰ−１７０抗原およびＥＬＡＭ−１抗原性断片
からなる群より選ばれた少なくとも１種の実質的に純粋
な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原または断片
の医薬として許容しうる塩の医薬としての有効量および
(II)薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含
有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する
ための薬剤をも提供する。
原、ＣＭＰ−１７０抗原およびＥＬＡＭ−１抗原性断片
からなる群より選ばれた少なくとも１種の実質的に純粋
な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原または断片
の医薬として許容しうる塩の医薬としての有効量および
(II)薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含
有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する
ための薬剤をも提供する。
【００２７】本発明はさらに、薬剤について上記した実
質的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原
または断片の医薬として許容しうる塩の医薬としての有
効量を処置の必要な患者に投与することからなる活性化
内皮細胞関連炎症性反応の処置方法を提供する。
質的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原
または断片の医薬として許容しうる塩の医薬としての有
効量を処置の必要な患者に投与することからなる活性化
内皮細胞関連炎症性反応の処置方法を提供する。
【００２８】本発明はさらに、(I) 生体液（biological
fluid）を上記モノクローナル抗体またはその結合部位
含有断片のいずれかと接触させる工程、及び(II)該生体
液中の抗原への該モノクローナル抗体またはその結合部
位含有断片の特異的結合をアッセイする工程を包含する
活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する方法をも提供
する。
fluid）を上記モノクローナル抗体またはその結合部位
含有断片のいずれかと接触させる工程、及び(II)該生体
液中の抗原への該モノクローナル抗体またはその結合部
位含有断片の特異的結合をアッセイする工程を包含する
活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する方法をも提供
する。
【００２９】好ましい一実施態様では、該モノクローナ
ル抗体が、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリ
ドーマ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗
体１Ｅ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリ
ドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗
体３Ａ２、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７である。
ル抗体が、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリ
ドーマ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗
体１Ｅ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリ
ドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗
体３Ａ２、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７である。
【００３０】さらに、本発明は、Ｔ細胞−内皮細胞相互
作用に影響することにより免疫応答を調節するための手
段を提供するものである。
作用に影響することにより免疫応答を調節するための手
段を提供するものである。
【００３１】本発明はまた、その細胞間結合を調節する
ＥＣ及び免疫細胞抗原を提供するものである。例えば、
抗原１Ｅ７／２Ｇ７をコードするｃＤＮＡ配列、又はそ
の断片、及び該ｃＤＮＡ配列を運ぶベクター又はその断
片が提供される。
ＥＣ及び免疫細胞抗原を提供するものである。例えば、
抗原１Ｅ７／２Ｇ７をコードするｃＤＮＡ配列、又はそ
の断片、及び該ｃＤＮＡ配列を運ぶベクター又はその断
片が提供される。
【００３２】該ｃＤＮＡ配列は、Fig ３４Ａ〜３４Ｇに
実質的に示されているｃＤＮＡ配列を含むものである。
実質的に示されているｃＤＮＡ配列を含むものである。
【００３３】該ベクターは、Fig ３４Ａ〜３４Ｇに実質
的に示されているｃＤＮＡ配列を含むベクターからな
る。
的に示されているｃＤＮＡ配列を含むベクターからな
る。
【００３４】さらにまた、顆粒球及びＴ細胞表面の区別
可能なＥＬＡＭリガンドが記述される。
可能なＥＬＡＭリガンドが記述される。
【００３５】１９８９年５月２３日提出の別件アメリカ
特許出願第０７／３５５７０１号及び１９９０年３月３
０日提出の別件のアメリカ特許出願第０７／５０２５９
０号の明細書全体をここに明示的に引用して挿入に代え
るものである。
特許出願第０７／３５５７０１号及び１９９０年３月３
０日提出の別件のアメリカ特許出願第０７／５０２５９
０号の明細書全体をここに明示的に引用して挿入に代え
るものである。
【００３６】本発明は、上記および後記実施例記載の同
定用特性を持つ新規なマウス（murine）モノクローナル
抗体を生産する新規ハイブリドーマを提供する。本発明
は、該モノクローナル抗体が特異的に結合する新規な抗
原をも提供する。
定用特性を持つ新規なマウス（murine）モノクローナル
抗体を生産する新規ハイブリドーマを提供する。本発明
は、該モノクローナル抗体が特異的に結合する新規な抗
原をも提供する。
【００３７】本発明の新規モノクローナル抗体について
言う「有意には結合しない」とは、結合の起らない対照
と比較するとき結合が統計的に有意ではないことを意味
する。
言う「有意には結合しない」とは、結合の起らない対照
と比較するとき結合が統計的に有意ではないことを意味
する。
【００３８】本発明の新規モノクローナル抗体について
言う「結合を阻害しない」とは、阻害の起らない対照と
比較するとき阻害が統計的に有意ではないことを意味す
る。
言う「結合を阻害しない」とは、阻害の起らない対照と
比較するとき阻害が統計的に有意ではないことを意味す
る。
【００３９】本発明の新規モノクローナル抗体について
言う「結合を部分的に阻害する」とは、阻害の起らない
対照と比較するとき阻害が統計的に有意であるが、阻害
が完全阻害には至らないことを意味する。
言う「結合を部分的に阻害する」とは、阻害の起らない
対照と比較するとき阻害が統計的に有意であるが、阻害
が完全阻害には至らないことを意味する。
【００４０】本発明の新規モノクローナル抗体について
言う「結合を完全に阻害する」とは、実験誤差の範囲内
で阻害が完全であることを意味する。一般に、Ｔ細胞、
顆粒球および／または単球のごとき細胞の結合の阻害に
関しての実験誤差は、約±１０％である。
言う「結合を完全に阻害する」とは、実験誤差の範囲内
で阻害が完全であることを意味する。一般に、Ｔ細胞、
顆粒球および／または単球のごとき細胞の結合の阻害に
関しての実験誤差は、約±１０％である。
【００４１】本発明の新規モノクローナル抗体および抗
原について言う「活性化内皮細胞関連炎症性反応」と
は、内皮細胞およびそれらがその中に存在する血管が白
血球の安定な結合および／または血流からの組織への遊
出に関与することにより特徴付けられる炎症性反応を意
味する。結合が局所血管系に対する白血球介在障害（da
mage）をもたらすならば、炎症は結合のみに存在するか
もしれない。障害は実際の血管通過から生じ、異なる白
血球サブタイプのいずれかとの周囲組織との相互作用に
よってそれら組織に障害をきたす可能性もある。
原について言う「活性化内皮細胞関連炎症性反応」と
は、内皮細胞およびそれらがその中に存在する血管が白
血球の安定な結合および／または血流からの組織への遊
出に関与することにより特徴付けられる炎症性反応を意
味する。結合が局所血管系に対する白血球介在障害（da
mage）をもたらすならば、炎症は結合のみに存在するか
もしれない。障害は実際の血管通過から生じ、異なる白
血球サブタイプのいずれかとの周囲組織との相互作用に
よってそれら組織に障害をきたす可能性もある。
【００４２】本明細書で言う「シアロ糖蛋白質」とは、
ツニカマイシンによるグリコシル化の阻害および免疫沈
降物または活性内皮細胞の前処理によるシアル酸の除去
の結果としてポリアクリルアミドゲルでの移動度が増す
ところの35Ｓ−システイン取込み能によって定義される
蛋白質を意味する。
ツニカマイシンによるグリコシル化の阻害および免疫沈
降物または活性内皮細胞の前処理によるシアル酸の除去
の結果としてポリアクリルアミドゲルでの移動度が増す
ところの35Ｓ−システイン取込み能によって定義される
蛋白質を意味する。
【００４３】本発明のモノクローナル抗体によって定義
される抗原について言う「実質的に純粋な」とは、該抗
原が天然の状態にはないことを意味する。すなわち、そ
れらは、それら抗原を呈示する細胞あるいはそれら抗原
が存在するいずれの体液とも関連をもたない。
される抗原について言う「実質的に純粋な」とは、該抗
原が天然の状態にはないことを意味する。すなわち、そ
れらは、それら抗原を呈示する細胞あるいはそれら抗原
が存在するいずれの体液とも関連をもたない。
【００４４】本発明の新規モノクローナル抗体により定
義される抗原について言うインビトロアッセイに関して
の「慢性動態」とは、それら抗原がヒト内皮細胞上でＩ
Ｌ−１の存在下に約７２〜９６時間発現され続け、その
発現がＩＬ−１添加時に到達する初期レベルより上のま
たはほぼ等しいレベルにあることを意味する。かかる挙
動の２例を、モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７に
より定義される抗原についてFig １１に、モノクローナ
ル抗体７Ａ９により定義される抗原についてFig ２２に
示す。
義される抗原について言うインビトロアッセイに関して
の「慢性動態」とは、それら抗原がヒト内皮細胞上でＩ
Ｌ−１の存在下に約７２〜９６時間発現され続け、その
発現がＩＬ−１添加時に到達する初期レベルより上のま
たはほぼ等しいレベルにあることを意味する。かかる挙
動の２例を、モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７に
より定義される抗原についてFig １１に、モノクローナ
ル抗体７Ａ９により定義される抗原についてFig ２２に
示す。
【００４５】本発明の新規モノクローナル抗体により定
義される抗原について言うインビトロアッセイに関して
の「急性動態」とは、初期のＩＬ−１の添加から約２４
時間以内にＩＬ−１存在下でのヒト内皮細胞の表面から
それら抗原が減少し、場合により完全に消失することも
あることを意味する。かかる挙動の１例を、モノクロー
ナル抗体３Ａ２により定義される抗原についてFig １１
に示す。
義される抗原について言うインビトロアッセイに関して
の「急性動態」とは、初期のＩＬ−１の添加から約２４
時間以内にＩＬ−１存在下でのヒト内皮細胞の表面から
それら抗原が減少し、場合により完全に消失することも
あることを意味する。かかる挙動の１例を、モノクロー
ナル抗体３Ａ２により定義される抗原についてFig １１
に示す。
【００４６】本発明のモノクローナル抗体により定義さ
れる抗原について言うインビボアッセイに関しての「慢
性動態」とは、慢性炎症を経験している組織の血管中で
該抗原が発現されることを意味する。これは、患者の病
歴を知っている熟練した病理学者によりなされる通例的
判定であり、湿潤白血球（infiltrating leucocytes)の
数および性質およびその他の標準的判定基準に基くもの
である。
れる抗原について言うインビボアッセイに関しての「慢
性動態」とは、慢性炎症を経験している組織の血管中で
該抗原が発現されることを意味する。これは、患者の病
歴を知っている熟練した病理学者によりなされる通例的
判定であり、湿潤白血球（infiltrating leucocytes)の
数および性質およびその他の標準的判定基準に基くもの
である。
【００４７】本発明の新規モノクローナル抗体により定
義される抗原について言うインビボアッセイに関しての
「急性動態」とは、急性炎症が起きている組織の血管中
で該抗原が発現されることを意味する。これは、患者の
病歴を知っている熟練した病理学者によりなされる通例
的判定であり、湿潤白血球の数および性質およびその他
の標準的判断基準に基いている。
義される抗原について言うインビボアッセイに関しての
「急性動態」とは、急性炎症が起きている組織の血管中
で該抗原が発現されることを意味する。これは、患者の
病歴を知っている熟練した病理学者によりなされる通例
的判定であり、湿潤白血球の数および性質およびその他
の標準的判断基準に基いている。
【００４８】以下の言葉は、以下に記載された意味を有
する。
する。
【００４９】“二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）”
とは、二価の抗体または結合部位を含有する断片、例え
ば（Ｆａｂ）2 断片を記載するものであり、そのうち一
方の結合部位は、第１決定群（ｆｉｒｓｔ ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔ）または抗原性部位に対し特異的に結合
し、他方の結合部位は、第１決定群を運ぶものと同一の
または異なる分子上の第２決定群または抗原性部位に特
異的に結合する。該結合部位は、異なる決定群に特異的
に結合する抗体の複数性の一つから生じたものである。
二重特異的抗体は、化学的または組換え手段により製造
でき、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）でも良い。総説として、エム．アール．スレッシ
ュ，エイ．シー．クエロ アンド シー．ミルシュタイ
ン、“二重特異的ｍＡｂ´ｓ フロム ハイブリッド
ハイブリドーマ”メス．エンジ．１２１，ピー．２１０
（１９８６）（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ，Ａ．Ｃ．Ｃｕｅ
ｌｌｏ＆ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｍＡｂ´ｓ ｆｒｏｍｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａｓ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎ ｚｙ．１２１、ｐ．２１０
（１９８６）参照。
とは、二価の抗体または結合部位を含有する断片、例え
ば（Ｆａｂ）2 断片を記載するものであり、そのうち一
方の結合部位は、第１決定群（ｆｉｒｓｔ ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔ）または抗原性部位に対し特異的に結合
し、他方の結合部位は、第１決定群を運ぶものと同一の
または異なる分子上の第２決定群または抗原性部位に特
異的に結合する。該結合部位は、異なる決定群に特異的
に結合する抗体の複数性の一つから生じたものである。
二重特異的抗体は、化学的または組換え手段により製造
でき、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）でも良い。総説として、エム．アール．スレッシ
ュ，エイ．シー．クエロ アンド シー．ミルシュタイ
ン、“二重特異的ｍＡｂ´ｓ フロム ハイブリッド
ハイブリドーマ”メス．エンジ．１２１，ピー．２１０
（１９８６）（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ，Ａ．Ｃ．Ｃｕｅ
ｌｌｏ＆ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｍＡｂ´ｓ ｆｒｏｍｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａｓ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎ ｚｙ．１２１、ｐ．２１０
（１９８６）参照。
【００５０】“ＥＬＡＭ”は、Ｎ末端のレクチン様ドメ
インと炭水化物リガンドの特徴を有する内皮細胞表面分
子の１種またはファミリーを示す。このファミリーは、
セレクチン類（ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ）と呼ばれる。
インと炭水化物リガンドの特徴を有する内皮細胞表面分
子の１種またはファミリーを示す。このファミリーは、
セレクチン類（ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ）と呼ばれる。
【００５１】“ＶＣＡＭ”は、以下に記載される１Ｅ７
／２Ｇ７抗原の特徴を有する内皮細胞表面分子の１種ま
たはファミリーを示す。
／２Ｇ７抗原の特徴を有する内皮細胞表面分子の１種ま
たはファミリーを示す。
【００５２】“ＩＣＡＭ”は、免疫グロブリン超遺伝子
ファミリー（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅ
ｒｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）のメンバーである。それ
は、白血球細胞表面上のインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉ
ｎ）分子のためのリガンドである。
ファミリー（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅ
ｒｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）のメンバーである。それ
は、白血球細胞表面上のインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉ
ｎ）分子のためのリガンドである。
【００５３】“ＥＬＡＭリガンド”は、内皮細胞上のＥ
ＬＡＭに結合することにより内皮細胞に対する免疫細胞
の付着を可能にする免疫系の細胞表面の１種以上の細胞
表面分子を示す。
ＬＡＭに結合することにより内皮細胞に対する免疫細胞
の付着を可能にする免疫系の細胞表面の１種以上の細胞
表面分子を示す。
【００５４】“ＶＣＡＭリガンド”は、内皮細胞上のＶ
ＣＡＭに結合することにより内皮細胞に対する免疫細胞
の付着を可能にする免疫系の細胞表面の１種以上の細胞
表面分子を示す。例として、ＶＬＡ−４が挙げられる。
ＣＡＭに結合することにより内皮細胞に対する免疫細胞
の付着を可能にする免疫系の細胞表面の１種以上の細胞
表面分子を示す。例として、ＶＬＡ−４が挙げられる。
【００５５】“ＩＣＡＭリガンド”は、内皮細胞上のＩ
ＣＡＭに結合することにより内皮細胞に対する免疫細胞
の付着を可能にする免疫系の細胞表面の１種以上の細胞
表面分子を示す。例として、ＬＡＦ−１が挙げられる。
ＣＡＭに結合することにより内皮細胞に対する免疫細胞
の付着を可能にする免疫系の細胞表面の１種以上の細胞
表面分子を示す。例として、ＬＡＦ−１が挙げられる。
【００５６】ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体 本発明のハイブリドーマは、本明細書中実施例１で詳細
に記載したように、確立された方法に従ってルーチンの
実験によって再現可能に生産できる。
に記載したように、確立された方法に従ってルーチンの
実験によって再現可能に生産できる。
【００５７】通常は、免疫細胞調製のための免疫原はＩ
Ｌ−１活性化ヒト内皮細胞である。
Ｌ−１活性化ヒト内皮細胞である。
【００５８】ヒト内皮細胞は、既知の方法〔ジャッフェ
（Ｊaffe）ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴ
ェスティゲイション、５２巻２７４５〜２７５７頁、１
９７３年〕に従って臍帯から得ることができる。簡単に
言えば、細胞を血管壁からコラゲナーゼ処理によっては
がし、ゼラチン被覆組織培養フラスコ中、２０％の低内
毒素ウシ胎児血清、９０μｇ／mlの保存剤不含ブタヘパ
リン、２０μｇ／mlの内皮細胞成長用添加物（ＥＣＧ
Ｓ）、グルタミンおよび抗生物質を含有するＭ１９９培
地中で培養する。ＥＣＧＳは、ウシ視床下部から得られ
る粗製の成長因子製剤で、主要成分は繊維芽細胞成長因
子である。ＥＣＧＳは市販品を入手できる。
（Ｊaffe）ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴ
ェスティゲイション、５２巻２７４５〜２７５７頁、１
９７３年〕に従って臍帯から得ることができる。簡単に
言えば、細胞を血管壁からコラゲナーゼ処理によっては
がし、ゼラチン被覆組織培養フラスコ中、２０％の低内
毒素ウシ胎児血清、９０μｇ／mlの保存剤不含ブタヘパ
リン、２０μｇ／mlの内皮細胞成長用添加物（ＥＣＧ
Ｓ）、グルタミンおよび抗生物質を含有するＭ１９９培
地中で培養する。ＥＣＧＳは、ウシ視床下部から得られ
る粗製の成長因子製剤で、主要成分は繊維芽細胞成長因
子である。ＥＣＧＳは市販品を入手できる。
【００５９】内皮細胞を、ＩＬ−１ベータを１ng／ml添
加して４時間活性化する。ＩＬ−１ベータは当業者なら
ば市販品またはその他のものを容易に入手できる。
加して４時間活性化する。ＩＬ−１ベータは当業者なら
ば市販品またはその他のものを容易に入手できる。
【００６０】ハイブリドーマの生産を予期して免疫する
特定の宿主はマウスとすべきである。ＢＡＬＢ／ｃマウ
スが好ましい。
特定の宿主はマウスとすべきである。ＢＡＬＢ／ｃマウ
スが好ましい。
【００６１】免疫スケジュールおよびマウスの免疫に用
いる活性内皮細胞の量は、当業者なら容易に決定でき
る。たとえば、ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合の適当な免疫
スケジュールの１例は、ＩＬ−１活性化内皮細胞３×１
０6 個を１０日おきに４回注射し、最後の注射は融合の
３〜４日前とするものである。
いる活性内皮細胞の量は、当業者なら容易に決定でき
る。たとえば、ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合の適当な免疫
スケジュールの１例は、ＩＬ−１活性化内皮細胞３×１
０6 個を１０日おきに４回注射し、最後の注射は融合の
３〜４日前とするものである。
【００６２】感作された細胞、たとえば免疫された脾細
胞を分離し、脾細胞を、十分に確立された技術〔ケーラ
ー（Ｋohler)、ジー．とミルスティン（Ｍilstein)、シ
ー、ネイチャー、２５６巻４９５〜４９７頁、１９７５
年およびヤング（Ｙoung）、Ｗ・Ｗら、ジャーナル・オ
ヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１５０巻１００
８〜１０１９頁、１９７９年〕により、ＳＰ２／０骨髄
腫細胞株また他の適当な骨髄腫細胞株と融合させる。融
合はポリエチレングリコールを用いて行うのが好まし
い。
胞を分離し、脾細胞を、十分に確立された技術〔ケーラ
ー（Ｋohler)、ジー．とミルスティン（Ｍilstein)、シ
ー、ネイチャー、２５６巻４９５〜４９７頁、１９７５
年およびヤング（Ｙoung）、Ｗ・Ｗら、ジャーナル・オ
ヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１５０巻１００
８〜１０１９頁、１９７９年〕により、ＳＰ２／０骨髄
腫細胞株また他の適当な骨髄腫細胞株と融合させる。融
合はポリエチレングリコールを用いて行うのが好まし
い。
【００６３】免疫宿主の感作脾細胞との融合のために本
発明では特定の骨髄腫細胞を採用したが、それらに限定
されるものではなく、マウス起源のハイブリドーマ調製
に有用な既知の骨髄腫細胞のいずれであってもよい。か
かる骨髄腫細胞の例としては、ＮＳ／１、ＳＰ１および
ＳＰ２／０細胞などのＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞が
ある。
発明では特定の骨髄腫細胞を採用したが、それらに限定
されるものではなく、マウス起源のハイブリドーマ調製
に有用な既知の骨髄腫細胞のいずれであってもよい。か
かる骨髄腫細胞の例としては、ＮＳ／１、ＳＰ１および
ＳＰ２／０細胞などのＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞が
ある。
【００６４】融合した細胞を、当業者の容易に定めうる
条件下で培養する。
条件下で培養する。
【００６５】適当な培養期間後、ＩＬ−１活性化内皮細
胞とは反応するが、正常な休止内皮細胞とは反応しない
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを限界希
釈法によりクローン化し、またサブクローン化する。
胞とは反応するが、正常な休止内皮細胞とは反応しない
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを限界希
釈法によりクローン化し、またサブクローン化する。
【００６６】通常は、休止またはＩＬ−１活性化内皮細
胞のコンフルエント（confluent)な単層についてスクリ
ーニングを行う。培養上澄みを単層の細胞に添加し、適
当な期間、たとえば６０分間、４℃でインキュベートし
て、培養上澄み中のモノクローナル抗体を単層の細胞と
反応させる。抗原被覆ウェルに結合した抗体は、通常、
二次抗体、たとえばビオチニル化(biotinylated)抗マウ
スＩｇＭおよびＩｇＧヤギまたはウサギ抗体およびそれ
に続く放射性プローブ、たとえば 125Ｉ−ストレプトア
ビジン(streptavidin)により検出する。
胞のコンフルエント（confluent)な単層についてスクリ
ーニングを行う。培養上澄みを単層の細胞に添加し、適
当な期間、たとえば６０分間、４℃でインキュベートし
て、培養上澄み中のモノクローナル抗体を単層の細胞と
反応させる。抗原被覆ウェルに結合した抗体は、通常、
二次抗体、たとえばビオチニル化(biotinylated)抗マウ
スＩｇＭおよびＩｇＧヤギまたはウサギ抗体およびそれ
に続く放射性プローブ、たとえば 125Ｉ−ストレプトア
ビジン(streptavidin)により検出する。
【００６７】本発明に従いこのようにして単離されたハ
イブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体は、
大型バッチのハイブリドーマ細胞培養を増殖させ、上澄
みから抗体を精製するか、そのハイブリドーマ株をマウ
スに注射して腹水の生産を刺激することにより、大量に
生産できる。両方法共、当業界で周知である。
イブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体は、
大型バッチのハイブリドーマ細胞培養を増殖させ、上澄
みから抗体を精製するか、そのハイブリドーマ株をマウ
スに注射して腹水の生産を刺激することにより、大量に
生産できる。両方法共、当業界で周知である。
【００６８】上記の方法に従って、好ましいモノクロー
ナル抗体を生産する５種のハイブリドーマが生産され
た。それら好ましいモノクローナル抗体を１Ｅ７、２Ｇ
７、３Ａ２、７Ａ９および３Ｂ７と名付けた。これらの
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマをハイブ
リドーマ１Ｅ７、２Ｇ７、３Ａ２、７Ａ９および３Ｂ７
と名付け、メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託したが、それ
ぞれのＡＴＣＣ寄託番号はＨＢ１０１３６、ＨＢ１０１
３７、ＨＢ１０１３８、ＨＢ１０１３５およびＨＢ１０
３９１である。
ナル抗体を生産する５種のハイブリドーマが生産され
た。それら好ましいモノクローナル抗体を１Ｅ７、２Ｇ
７、３Ａ２、７Ａ９および３Ｂ７と名付けた。これらの
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマをハイブ
リドーマ１Ｅ７、２Ｇ７、３Ａ２、７Ａ９および３Ｂ７
と名付け、メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託したが、それ
ぞれのＡＴＣＣ寄託番号はＨＢ１０１３６、ＨＢ１０１
３７、ＨＢ１０１３８、ＨＢ１０１３５およびＨＢ１０
３９１である。
【００６９】本発明のモノクローナル抗体１Ｅ７および
２Ｇ７は、ハイブリドーマ細胞株１Ｅ７および２Ｇ７に
よって生産され、本発明のモノクローナル抗体群(A) に
属する２種の好ましいモノクローナル抗体をなす。(A)
群モノクローナル抗体は次の同定特性を持つ： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止またはＩＬ−１活性化顆粒球または
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物
には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細胞のＩ
Ｌ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しないかまたは部
分的に阻害し、(5) インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活
性内皮細胞への結合を阻害せず、(6) ＩＬ−１活性化内
皮細胞の表面に存在し、Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示したｃ
ＤＮＡ配列によって定義される１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖
蛋白質抗原に特異的に結合する。
２Ｇ７は、ハイブリドーマ細胞株１Ｅ７および２Ｇ７に
よって生産され、本発明のモノクローナル抗体群(A) に
属する２種の好ましいモノクローナル抗体をなす。(A)
群モノクローナル抗体は次の同定特性を持つ： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止またはＩＬ−１活性化顆粒球または
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物
には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細胞のＩ
Ｌ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しないかまたは部
分的に阻害し、(5) インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活
性内皮細胞への結合を阻害せず、(6) ＩＬ−１活性化内
皮細胞の表面に存在し、Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示したｃ
ＤＮＡ配列によって定義される１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖
蛋白質抗原に特異的に結合する。
【００７０】上記同定特性のうち、モノクローナル抗体
１Ｅ７を包含するモノクローナル抗体のサブグループ
は、インビトロで、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞へ
の結合を阻害せず、モノクローナル抗体２Ｇ７を包含す
るモノクローナル抗体のサブグループは、インビトロ
で、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的
に阻害する。
１Ｅ７を包含するモノクローナル抗体のサブグループ
は、インビトロで、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞へ
の結合を阻害せず、モノクローナル抗体２Ｇ７を包含す
るモノクローナル抗体のサブグループは、インビトロ
で、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的
に阻害する。
【００７１】(A) 群モノクローナル抗体のサブグループ
のその他の同定特性としては、インビトロで、ＴＨＰ−
１骨髄単球性細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を
部分的に阻害することが含まれる。この特性は、好まし
いモノクローナル抗体２Ｇ７を包含する(A) 群モノクロ
ーナル抗体のサブグループが示すものである。
のその他の同定特性としては、インビトロで、ＴＨＰ−
１骨髄単球性細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を
部分的に阻害することが含まれる。この特性は、好まし
いモノクローナル抗体２Ｇ７を包含する(A) 群モノクロ
ーナル抗体のサブグループが示すものである。
【００７２】好ましいモノクローナル抗体１Ｅ７のその
他の同定特性は、該モノクローナル抗体がマウス（muri
ne）モノクローナル抗体であって、ＩｇＧ２ａのアイソ
タイプをもつことである。
他の同定特性は、該モノクローナル抗体がマウス（muri
ne）モノクローナル抗体であって、ＩｇＧ２ａのアイソ
タイプをもつことである。
【００７３】好ましいモノクローナル抗体２Ｇ７のその
他の同定特性は、該モノクローナル抗体がマウスモノク
ローナル抗体であって、ＩｇＧ１のアイソタイプをもつ
ことである。モノクローナル抗体２Ｇ７は、インビトロ
で、ＴＨＰ−１骨髄単球性細胞のＩＬ−１活性化内皮細
胞への結合をやはり部分的に阻害する。
他の同定特性は、該モノクローナル抗体がマウスモノク
ローナル抗体であって、ＩｇＧ１のアイソタイプをもつ
ことである。モノクローナル抗体２Ｇ７は、インビトロ
で、ＴＨＰ−１骨髄単球性細胞のＩＬ−１活性化内皮細
胞への結合をやはり部分的に阻害する。
【００７４】本発明のモノクローナル抗体３Ａ２は、ハ
イブリドーマ細胞株３Ａ２によって生産され、本発明の
(B) 群モノクローナル抗体に属する好ましい一モノクロ
ーナル抗体をなす。(B) 群モノクローナル抗体は次の同
定特性を持つ： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止またはＩＬ−１活性化顆粒球または
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物
には有意には結合せず、(4) 休止またはＩＬ−１活性化
内皮細胞の細胞質中におよびＩＬ−１活性化内皮細胞の
表面に存在するＣＭＰ−１７０抗原に特異的に結合す
る。
イブリドーマ細胞株３Ａ２によって生産され、本発明の
(B) 群モノクローナル抗体に属する好ましい一モノクロ
ーナル抗体をなす。(B) 群モノクローナル抗体は次の同
定特性を持つ： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止またはＩＬ−１活性化顆粒球または
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物
には有意には結合せず、(4) 休止またはＩＬ−１活性化
内皮細胞の細胞質中におよびＩＬ−１活性化内皮細胞の
表面に存在するＣＭＰ−１７０抗原に特異的に結合す
る。
【００７５】(B) 群モノクローナル抗体のその他の同定
特性としては、それらが休止繊維芽細胞および白血球に
存在するＣＭＰ−１７０に特異的に結合する性質を挙げ
ることができる。
特性としては、それらが休止繊維芽細胞および白血球に
存在するＣＭＰ−１７０に特異的に結合する性質を挙げ
ることができる。
【００７６】好ましいモノクローナル抗体３Ａ２のその
他の同定特性は、該モノクローナル抗体がマウスモノク
ローナル抗体であって、ＩｇＭのアイソタイプをもつこ
とである本発明のモノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ
７は、ハイブリドーマ細胞株７Ａ９および３Ｂ７によっ
て生産され、本発明の(C) 群モノクローナル抗体に属す
る２種の好ましいモノクローナル抗体をなす。(C) 群モ
ノクローナル抗体は次の同定特性を持つ： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止またはＩＬ−１活性化顆粒球または
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物
には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細胞の活
性内皮細胞への結合を部分的に阻害し、(5) インビトロ
で、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全に
または部分的に阻害し、(6) Ｌ−１活性化内皮細胞の表
面に存在するＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗原のＮ末端
２０％に特異的に結合し、(7) ＩＬ−１活性化内皮細胞
の表面に存在する１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原に
は結合しない。
他の同定特性は、該モノクローナル抗体がマウスモノク
ローナル抗体であって、ＩｇＭのアイソタイプをもつこ
とである本発明のモノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ
７は、ハイブリドーマ細胞株７Ａ９および３Ｂ７によっ
て生産され、本発明の(C) 群モノクローナル抗体に属す
る２種の好ましいモノクローナル抗体をなす。(C) 群モ
ノクローナル抗体は次の同定特性を持つ： (1) 正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、(2) 正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、(3) 休止またはＩＬ−１活性化顆粒球または
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物
には有意には結合せず、(4) インビトロで、Ｔ細胞の活
性内皮細胞への結合を部分的に阻害し、(5) インビトロ
で、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全に
または部分的に阻害し、(6) Ｌ−１活性化内皮細胞の表
面に存在するＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗原のＮ末端
２０％に特異的に結合し、(7) ＩＬ−１活性化内皮細胞
の表面に存在する１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原に
は結合しない。
【００７７】上記同定特性に関して、モノクローナル抗
体７Ａ９を包含するサブグループのモノクローナル抗体
は、インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞へ
の結合を完全に阻害し、モノクローナル抗体３Ｂ７を包
含するサブグループのモノクローナル抗体は、インビト
ロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分
的に阻害する。
体７Ａ９を包含するサブグループのモノクローナル抗体
は、インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞へ
の結合を完全に阻害し、モノクローナル抗体３Ｂ７を包
含するサブグループのモノクローナル抗体は、インビト
ロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分
的に阻害する。
【００７８】好ましいモノクローナル抗体７Ａ９のその
他の同定特性は、それがマウスモノクローナル抗体であ
り、そのアイソタイプがＩｇＧ１であるということであ
る。
他の同定特性は、それがマウスモノクローナル抗体であ
り、そのアイソタイプがＩｇＧ１であるということであ
る。
【００７９】好ましいモノクローナル抗体３Ｂ７のその
他の同定特性は、それがマウスモノクローナル抗体であ
り、そのアイソタイプがＩｇＧ２ａであるということで
ある。
他の同定特性は、それがマウスモノクローナル抗体であ
り、そのアイソタイプがＩｇＧ２ａであるということで
ある。
【００８０】上記モノクローナル抗体のいずれかの結合
部位含有断片は、当業界で既知の多くの方法、たとえば
Ｆ（ａｂ′）2 断片を製出するために用いられるペプシ
ン消化によって得ることができる。パーハム（Ｐarha
m)、ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３１巻２８９
３〜２０９２頁、１９８３年を参照されたい。
部位含有断片は、当業界で既知の多くの方法、たとえば
Ｆ（ａｂ′）2 断片を製出するために用いられるペプシ
ン消化によって得ることができる。パーハム（Ｐarha
m)、ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３１巻２８９
３〜２０９２頁、１９８３年を参照されたい。
【００８１】正常休止内皮細胞への結合を測定するため
の特定の一アッセイ法を、実施例２Ｂに記載してある。
しかし、一般的には、このアッセイは、たとえばＤ．
Ｍ．ウェア（Ｗeir)編「ハンドブック・オヴ・エクスペ
リメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６年、１
〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブ
リケーションズ、オックスフォード、英国に記載されて
いるものなどの、当業界で既知のいくつかの操作法に従
って実施することができる。
の特定の一アッセイ法を、実施例２Ｂに記載してある。
しかし、一般的には、このアッセイは、たとえばＤ．
Ｍ．ウェア（Ｗeir)編「ハンドブック・オヴ・エクスペ
リメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６年、１
〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブ
リケーションズ、オックスフォード、英国に記載されて
いるものなどの、当業界で既知のいくつかの操作法に従
って実施することができる。
【００８２】正常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラ
チノサイトあるいは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細
胞への結合を測定するための特定の一アッセイ法を実施
例３(B) に述べてある。
チノサイトあるいは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細
胞への結合を測定するための特定の一アッセイ法を実施
例３(B) に述べてある。
【００８３】しかし、このアッセイは、一般には、たと
えばＤ．Ｍ．ウェア編「ハンドブック・オヴ・エクスペ
リメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６年、１
〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブ
リケーションズ、オックスフォード、英国に記載されて
いるものなどの当該技術分野で既知の諸方法に従って実
施できる。
えばＤ．Ｍ．ウェア編「ハンドブック・オヴ・エクスペ
リメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６年、１
〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブ
リケーションズ、オックスフォード、英国に記載されて
いるものなどの当該技術分野で既知の諸方法に従って実
施できる。
【００８４】休止またはＩＬ−１活性化顆粒球またはＴ
細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物に
上記モノクローナル抗体が結合するかどうかを知るため
の一アッセイ法を実施例３(B) に記載する。 しかし、
一般的には、この測定には、たとえばＤ．Ｍ．ウェア編
「ハンドブック・オヴ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー」、第４版、１９８６年、１〜４巻、ブラックウェ
ル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、オッ
クスフォード、英国に記載されているものなどの、いく
つかの既知の方法を使用できる。
細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物に
上記モノクローナル抗体が結合するかどうかを知るため
の一アッセイ法を実施例３(B) に記載する。 しかし、
一般的には、この測定には、たとえばＤ．Ｍ．ウェア編
「ハンドブック・オヴ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー」、第４版、１９８６年、１〜４巻、ブラックウェ
ル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、オッ
クスフォード、英国に記載されているものなどの、いく
つかの既知の方法を使用できる。
【００８５】インビトロでのＴ細胞のＩＬ−１活性化内
皮細胞への結合を上記モノクローナル抗体が阻害するか
どうかを知るための特定の一アッセイ法を実施例２(E)
に示した。
皮細胞への結合を上記モノクローナル抗体が阻害するか
どうかを知るための特定の一アッセイ法を実施例２(E)
に示した。
【００８６】しかし、たとえばマスヤマとカノ、ジャー
ナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション
（Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest.）、７７巻１５９６〜１６０５
頁、１９８６年に記載のものなどのいくつかの既知の方
法のいずれもが適当である。
ナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション
（Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest.）、７７巻１５９６〜１６０５
頁、１９８６年に記載のものなどのいくつかの既知の方
法のいずれもが適当である。
【００８７】インビトロでの顆粒球のＩＬ−１活性化内
皮細胞への結合を上記モノクローナル抗体が阻害するか
どうかを知るための特定の一方法を実施例２(D) に記載
した。
皮細胞への結合を上記モノクローナル抗体が阻害するか
どうかを知るための特定の一方法を実施例２(D) に記載
した。
【００８８】しかし、たとえばポウバー（Ｐober）ら、
ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３６巻１６８０〜
１６８７頁、１９８６年に記載のものなどのいくつかの
既知の方法のいずれもが適している。
ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３６巻１６８０〜
１６８７頁、１９８６年に記載のものなどのいくつかの
既知の方法のいずれもが適している。
【００８９】１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原、ＣＭ
Ｐ−１７０抗原およびＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗原
に上記モノクローナル抗体が特異的に結合するかどうか
は、実施例２(B) に記載したように、フローサイトメト
リーを行うことによって知ることができる。
Ｐ−１７０抗原およびＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗原
に上記モノクローナル抗体が特異的に結合するかどうか
は、実施例２(B) に記載したように、フローサイトメト
リーを行うことによって知ることができる。
【００９０】上記モノクローナル抗体がＥＬＡＭ−１シ
アロ糖蛋白質抗原のＮ末端２０％に結合するかどうかを
知るための一方法を実施例５に記載した。
アロ糖蛋白質抗原のＮ末端２０％に結合するかどうかを
知るための一方法を実施例５に記載した。
【００９１】新規抗原および抗原性断片 本発明は、ＩＬ−１活性化内皮細胞上に見出される新規
な実質的に純粋な抗原およびその抗原性断片をも提供す
る。それら抗原および抗原性断片は、１Ｅ７／２Ｇ７、
ＣＭＰ−１７０と名付けたもの、および既知の抗原ＥＬ
ＡＭ−１の抗原性断片である新規な抗原である。
な実質的に純粋な抗原およびその抗原性断片をも提供す
る。それら抗原および抗原性断片は、１Ｅ７／２Ｇ７、
ＣＭＰ−１７０と名付けたもの、および既知の抗原ＥＬ
ＡＭ−１の抗原性断片である新規な抗原である。
【００９２】１Ｅ７／２Ｇ７抗原は次の同定特性を持
つ： (1) シアロ糖蛋白質である、 (2) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量（molecular mass）： (a) 約１１４ｋＤａに強いバンド、(b) 約９５ｋＤａに
弱いバンド、 (3) 非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により求めた分子質量： (a) 約１００ｋＤａに強いバンド、(b) 約９３ｋＤａに
弱いバンド、 (4) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気
泳動により求めた分子質量は、Ｏ結合糖鎖除去後、約１
〜２ｋＤａ減少、 (5) ２−Ｄゲル分析により求めた等電点約４．８〜４．
９、 (6) 構成性またはトロンビン刺激誘発性末梢血液単核細
胞、顆粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト
上で発現されず、 (7) ＩＬ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ
多糖（ｌｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ
γ）によっては刺激されず、 (8) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ
細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ
７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハ
イブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロー
ナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長
時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってイ
ンビトロで求めるとき、慢性動態を示し、 (9) 慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中での
抗原発現によりインビボで求めるとき、慢性または急性
動態を示し、 (10)ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結合す
る抗体には結合せず、 (11)該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該モノ
クローナル抗体２Ｇ７に結合し、 (12)Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示したｃＤＮＡ配列によりト
ランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって発現される。
つ： (1) シアロ糖蛋白質である、 (2) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量（molecular mass）： (a) 約１１４ｋＤａに強いバンド、(b) 約９５ｋＤａに
弱いバンド、 (3) 非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により求めた分子質量： (a) 約１００ｋＤａに強いバンド、(b) 約９３ｋＤａに
弱いバンド、 (4) 還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気
泳動により求めた分子質量は、Ｏ結合糖鎖除去後、約１
〜２ｋＤａ減少、 (5) ２−Ｄゲル分析により求めた等電点約４．８〜４．
９、 (6) 構成性またはトロンビン刺激誘発性末梢血液単核細
胞、顆粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト
上で発現されず、 (7) ＩＬ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ
多糖（ｌｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ
γ）によっては刺激されず、 (8) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ
細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ
７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハ
イブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロー
ナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長
時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってイ
ンビトロで求めるとき、慢性動態を示し、 (9) 慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中での
抗原発現によりインビボで求めるとき、慢性または急性
動態を示し、 (10)ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結合す
る抗体には結合せず、 (11)該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該モノ
クローナル抗体２Ｇ７に結合し、 (12)Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示したｃＤＮＡ配列によりト
ランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって発現される。
【００９３】１Ｅ７／２Ｇ７抗原の有用な断片には、モ
ノクローナル抗体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗
体２Ｇ７には結合しないエピトープを含む抗原性断片な
らびにモノクローナル抗体２Ｇ７には結合するがモノク
ローナル抗体１Ｅ７には結合しないエピトープを含む抗
原性断片がある。
ノクローナル抗体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗
体２Ｇ７には結合しないエピトープを含む抗原性断片な
らびにモノクローナル抗体２Ｇ７には結合するがモノク
ローナル抗体１Ｅ７には結合しないエピトープを含む抗
原性断片がある。
【００９４】１Ｅ７／２Ｇ７抗原のその他の同定特性と
しては、炭水化物付加（carbohydrate attachment)を阻
止するためのツニカマイシン処理ののちに還元条件下で
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって求
めたそれの分子質量が約８０ｋＤａであることがあげら
れる。
しては、炭水化物付加（carbohydrate attachment)を阻
止するためのツニカマイシン処理ののちに還元条件下で
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって求
めたそれの分子質量が約８０ｋＤａであることがあげら
れる。
【００９５】ＣＭＰ−１７０抗原は次の同定特性を持
つ： (1) 還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により求めた分子質量：約１７０ｋ
Ｄａ、(2) 休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆
粒球、繊維芽細胞またはケラチノサイトの表面では発現
されず、(3) 休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の
細胞質中に存在し、(4) 活性化内皮細胞の細胞表面での
発現がシクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤによ
り阻害され、(5) 内皮細胞内のワイベル−パラド（Ｗei
bel-Ｐalade)体に局在することなく、(6) ＩＬ−１刺激
内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表面で会合し、(7) Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリドーマ細胞株
３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体３Ａ２が、
ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間前処理したヒト
内皮細胞に結合する能力によってインビトロで求めたと
き、急性動態を示し、(8) モノクローナル抗体３Ａ２に
結合する；ＥＬＡＭ−１抗原の抗原性断片からなる抗原
は次の同定特性をもつ： (1) ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、(2)
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ細胞
株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９に
結合する、(3) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７に結合する、(4) 構成性またはトロンビン
刺激末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板、繊維芽細胞ま
たはケラチノサイト上で発現されない、(5) ＩＬ−１活
性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ多糖（ｌｐｓ）
および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）により刺激され
るが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）によっては
刺激されない。
つ： (1) 還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により求めた分子質量：約１７０ｋ
Ｄａ、(2) 休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆
粒球、繊維芽細胞またはケラチノサイトの表面では発現
されず、(3) 休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の
細胞質中に存在し、(4) 活性化内皮細胞の細胞表面での
発現がシクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤによ
り阻害され、(5) 内皮細胞内のワイベル−パラド（Ｗei
bel-Ｐalade)体に局在することなく、(6) ＩＬ−１刺激
内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表面で会合し、(7) Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリドーマ細胞株
３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体３Ａ２が、
ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間前処理したヒト
内皮細胞に結合する能力によってインビトロで求めたと
き、急性動態を示し、(8) モノクローナル抗体３Ａ２に
結合する；ＥＬＡＭ−１抗原の抗原性断片からなる抗原
は次の同定特性をもつ： (1) ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、(2)
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ細胞
株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９に
結合する、(3) ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイ
ブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナ
ル抗体３Ｂ７に結合する、(4) 構成性またはトロンビン
刺激末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板、繊維芽細胞ま
たはケラチノサイト上で発現されない、(5) ＩＬ−１活
性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ多糖（ｌｐｓ）
および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）により刺激され
るが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）によっては
刺激されない。
【００９６】還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動による分子質量測定法は当
該技術分野では周知であり、たとえばボニー・エス・ダ
ンバー（Ｂonnie Ｓ．Ｄunber)、二次元電気泳動および
免疫学的技法（Ｔwo Ｄimensional Ｅlectrophoresis
and Ｉmmunological Ｔechniques)、プレナムプレ
ス、ニューヨーク、１９８７年に記載されている。
アクリルアミドゲル電気泳動による分子質量測定法は当
該技術分野では周知であり、たとえばボニー・エス・ダ
ンバー（Ｂonnie Ｓ．Ｄunber)、二次元電気泳動および
免疫学的技法（Ｔwo Ｄimensional Ｅlectrophoresis
and Ｉmmunological Ｔechniques)、プレナムプレ
ス、ニューヨーク、１９８７年に記載されている。
【００９７】分子質量を記述するに当っての「強いバン
ド」および「弱いバンド」とは、ある一定の実験におい
てのバンドの強度に基いた相対的な用語である。しか
し、当業者であれば、たとえば本出願書類中の図面を観
察することによって、あるバンドが強いバンドであるか
弱いバンドであるかを容易に決定できるのである。
ド」および「弱いバンド」とは、ある一定の実験におい
てのバンドの強度に基いた相対的な用語である。しか
し、当業者であれば、たとえば本出願書類中の図面を観
察することによって、あるバンドが強いバンドであるか
弱いバンドであるかを容易に決定できるのである。
【００９８】該抗原の等電点も、ガレルズ（Ｇarrel
s）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍethods Ｅn
zymol.)、１００巻４１１〜４２３頁、１９８３年およ
びボニー・エス・ダンバー、二次元電気泳動および免疫
学的技法、プレナムプレス、ニューヨーク、１９８７年
に記載されている２−Ｄゲル分析のような当該技術分野
で周知の諸方法によって測定する。
s）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍethods Ｅn
zymol.)、１００巻４１１〜４２３頁、１９８３年およ
びボニー・エス・ダンバー、二次元電気泳動および免疫
学的技法、プレナムプレス、ニューヨーク、１９８７年
に記載されている２−Ｄゲル分析のような当該技術分野
で周知の諸方法によって測定する。
【００９９】Ｏ−結合糖鎖は、実施例４(F) 記載の方法
などの既知の諸方法によって除去できる。
などの既知の諸方法によって除去できる。
【０１００】Ｏ−結合糖鎖除去のために使用できる他の
諸方法は、Ｄ．Ｍ．ウェア編「ハンドブック・オヴ・エ
クスペリメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６
年、１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック
・パブリケーションズ、オックスフォード、英国に記載
されている。
諸方法は、Ｄ．Ｍ．ウェア編「ハンドブック・オヴ・エ
クスペリメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６
年、１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック
・パブリケーションズ、オックスフォード、英国に記載
されている。
【０１０１】本発明の抗原が、休止状態のあるいはトロ
ンビンまたはＩＬ−１で刺激された末梢血単核細胞、顆
粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発
現されるかされないかを知るためのアッセイの特定の一
例を実施例４(J) および(M)に示した。
ンビンまたはＩＬ−１で刺激された末梢血単核細胞、顆
粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発
現されるかされないかを知るためのアッセイの特定の一
例を実施例４(J) および(M)に示した。
【０１０２】休止あるいはトロンビンまたはＩＬ−１刺
激細胞上で該抗原が発現されるかされないかを知るため
に用いうる他の方法は、Ｄ．Ｍ．ウェア編ハンドブック
・オヴ・エクスペリメンタル・イムノロジー、第４版、
１９８６年、１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティ
フィック・パブリケーションズ、オックスフォード、英
国に記載されている。
激細胞上で該抗原が発現されるかされないかを知るため
に用いうる他の方法は、Ｄ．Ｍ．ウェア編ハンドブック
・オヴ・エクスペリメンタル・イムノロジー、第４版、
１９８６年、１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティ
フィック・パブリケーションズ、オックスフォード、英
国に記載されている。
【０１０３】本発明の抗原の発現がＩＬ−１活性化内皮
細胞上でｌｐｓ、ＴＮＦおよび／またはＩＦＮγによっ
て刺激されるかどうかを知るための特定の一方法を実施
例４(K) に示す。
細胞上でｌｐｓ、ＴＮＦおよび／またはＩＦＮγによっ
て刺激されるかどうかを知るための特定の一方法を実施
例４(K) に示す。
【０１０４】本発明の抗原がインビトロで慢性動態およ
び／または急性動態を示すかどうかを知るための一方法
を実施例３(C) および４(I) に示す。
び／または急性動態を示すかどうかを知るための一方法
を実施例３(C) および４(I) に示す。
【０１０５】本発明の抗原がインビボで慢性動態および
／または急性動態を示すかどうかは、慢性あるいは急性
の炎症を経験している組織の血管中での該抗原の発現を
観測することによって知ることができる。これは、患者
の病歴を知っている熟練した病理学者により行われる常
法的な判断であり、湿潤白血球の数および本質ならびに
他の標準的判断基準に基くものである。
／または急性動態を示すかどうかは、慢性あるいは急性
の炎症を経験している組織の血管中での該抗原の発現を
観測することによって知ることができる。これは、患者
の病歴を知っている熟練した病理学者により行われる常
法的な判断であり、湿潤白血球の数および本質ならびに
他の標準的判断基準に基くものである。
【０１０６】該抗原が特定のモノクローナル抗体に結合
するかどうかは、実施例２(B) に記載のようにフローサ
イトメトリーを行うことにより決定できる。
するかどうかは、実施例２(B) に記載のようにフローサ
イトメトリーを行うことにより決定できる。
【０１０７】休止内皮細胞の細胞質内に抗原が存在する
かどうかを知るための特定の一方法を実施例４(P) に示
した。
かどうかを知るための特定の一方法を実施例４(P) に示
した。
【０１０８】要約すると、細胞を、たとえばアセトンま
たはエタノールにより、透過性とし、抗体が細胞質内に
存在する抗原と反応できるようにする。つぎに、細胞
を、該抗体と反応する間接的プローブと反応させたの
ち、常法により可視化する。たとえば、ヤギ抗マウス抗
体に結合させたアルカリホスファターゼを間接的プロー
ブとして用いたFig ２６を参照されたい。
たはエタノールにより、透過性とし、抗体が細胞質内に
存在する抗原と反応できるようにする。つぎに、細胞
を、該抗体と反応する間接的プローブと反応させたの
ち、常法により可視化する。たとえば、ヤギ抗マウス抗
体に結合させたアルカリホスファターゼを間接的プロー
ブとして用いたFig ２６を参照されたい。
【０１０９】活性化内皮細胞表面での抗原の発現がシク
ロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤにより阻害され
るかどうかを知るための特定の一方法を実施例４(O) に
示す。
ロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤにより阻害され
るかどうかを知るための特定の一方法を実施例４(O) に
示す。
【０１１０】上記方法にかえて使用できる他の方法とし
ては、実施例２(B) に記載のようにして行われるフロー
サイトメトリーの採用があげられる。
ては、実施例２(B) に記載のようにして行われるフロー
サイトメトリーの採用があげられる。
【０１１１】抗原がワイベル−パラド体に局在するかど
うかの判定には、常法を使用できる。それらの方法は、
該抗原が、ワイベル−パラド体の主要成分であるフォン
−ウィリブラン（von-Ｗillibrand)因子（ｖＷＦ）と共
に局在するかどうかを判定する（光学顕微鏡により観察
して）ことを包含する。
うかの判定には、常法を使用できる。それらの方法は、
該抗原が、ワイベル−パラド体の主要成分であるフォン
−ウィリブラン（von-Ｗillibrand)因子（ｖＷＦ）と共
に局在するかどうかを判定する（光学顕微鏡により観察
して）ことを包含する。
【０１１２】要約すると、休止ヒト内皮細胞などの適当
な細胞を培養し、たとえばＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いては
がし、顕微鏡のガラススライド上へ吐き出す。細胞をア
セトンで固定し、乾燥して細胞を透過性にする。つぎに
細胞を、当該抗体および抗−ｖＷＦ抗体（市販されてい
る）を用いて、実施例４(P）記載のように、二重染色プ
ロトコールによって染色する。染色された細胞について
ｖＷＦの二重染色を調べる。
な細胞を培養し、たとえばＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いては
がし、顕微鏡のガラススライド上へ吐き出す。細胞をア
セトンで固定し、乾燥して細胞を透過性にする。つぎに
細胞を、当該抗体および抗−ｖＷＦ抗体（市販されてい
る）を用いて、実施例４(P）記載のように、二重染色プ
ロトコールによって染色する。染色された細胞について
ｖＷＦの二重染色を調べる。
【０１１３】なお、当該抗体のみによって染色された細
胞から、当業者ならば、その抗体がワイベル−パラド体
の中にあるかどうかを容易に判定できる。
胞から、当業者ならば、その抗体がワイベル−パラド体
の中にあるかどうかを容易に判定できる。
【０１１４】抗原がＩＬ−１刺激内皮細胞中のＥＬＡＭ
−１と細胞表面で会合するかどうかを知るための特定の
２方法を実施例４(Q) に記載する。
−１と細胞表面で会合するかどうかを知るための特定の
２方法を実施例４(Q) に記載する。
【０１１５】上記の方法にかえて使用できる他の方法
は、Ｄ．Ｍ．ウェア編，「ハンドブック・オヴ・エクス
ペリメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６年、
１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パ
ブリケーションズ、オックスフォード、英国に記載され
ているように、細胞表面での架橋試薬の使用および免疫
共沈を包含する。
は、Ｄ．Ｍ．ウェア編，「ハンドブック・オヴ・エクス
ペリメンタル・イムノロジー」、第４版、１９８６年、
１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パ
ブリケーションズ、オックスフォード、英国に記載され
ているように、細胞表面での架橋試薬の使用および免疫
共沈を包含する。
【０１１６】新規な抗原および抗原性断片は常法によっ
て調製、精製でき、そのいくつかを実施例で詳細に記述
する。
て調製、精製でき、そのいくつかを実施例で詳細に記述
する。
【０１１７】ＥＬＡＭ−１断片の精製は、実施例４(B)
記載の免疫沈降プロトコールによって行いうる。より大
きいスケールでの精製には、１Ｅ７または２Ｇ７モノク
ローナル抗体（たとえば５mg）を、メーカー提供の標準
プロトコールによってアフィゲル−１０ビーズ（たとえ
ば５ml）（市販品）に結合させ、抗体被覆ビーズに液体
（ＥＬＡＭ−１断片産生細胞の上澄み）を反応させるこ
とができる。ビーズをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮによって洗っ
て、非特異的に結合された物質を除き、マーリン（Ｍar
lin)ら、ネイチャー、３４４巻７０〜７２頁、１９９０
年にＩＣＡＭ−１断片について記載されているようない
くつかの標準的手法によって抗原断片を溶出する。
記載の免疫沈降プロトコールによって行いうる。より大
きいスケールでの精製には、１Ｅ７または２Ｇ７モノク
ローナル抗体（たとえば５mg）を、メーカー提供の標準
プロトコールによってアフィゲル−１０ビーズ（たとえ
ば５ml）（市販品）に結合させ、抗体被覆ビーズに液体
（ＥＬＡＭ−１断片産生細胞の上澄み）を反応させるこ
とができる。ビーズをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮによって洗っ
て、非特異的に結合された物質を除き、マーリン（Ｍar
lin)ら、ネイチャー、３４４巻７０〜７２頁、１９９０
年にＩＣＡＭ−１断片について記載されているようない
くつかの標準的手法によって抗原断片を溶出する。
【０１１８】可溶性の形で使用するには、抗原または抗
原性断片を合成的に製造すべきである。抗原を、既知の
方法に従って（たとえばベヴィラクアら、サイエンス、
２４３巻１１６０〜１１６４頁、１９８９年参照）、ク
ローン化し、配列決定できる。活性部位（単数または複
数）の決定も、ペプチド断片の合成と同様に、標準的手
法〔たとえばピーターソン（Ｐeterson)とシード（Ｓee
d)、セル、５４巻６５〜７２頁、１９８８年参照〕によ
る。
原性断片を合成的に製造すべきである。抗原を、既知の
方法に従って（たとえばベヴィラクアら、サイエンス、
２４３巻１１６０〜１１６４頁、１９８９年参照）、ク
ローン化し、配列決定できる。活性部位（単数または複
数）の決定も、ペプチド断片の合成と同様に、標準的手
法〔たとえばピーターソン（Ｐeterson)とシード（Ｓee
d)、セル、５４巻６５〜７２頁、１９８８年参照〕によ
る。
【０１１９】新規な抗原および抗原性断片は、本発明の
モノクローナル抗体が白血球の活性内皮細胞への結合を
ブロックするかどうかを実証するために、そのような結
合のブロッキングをアッセイするのに使用できる。当業
者ならば、適当なアッセイ条件を容易に決定できる。
モノクローナル抗体が白血球の活性内皮細胞への結合を
ブロックするかどうかを実証するために、そのような結
合のブロッキングをアッセイするのに使用できる。当業
者ならば、適当なアッセイ条件を容易に決定できる。
【０１２０】１例として、結合をアッセイしようとする
単核細胞を、抗原または抗原性断片と共に、適当な緩衝
液中で適当な濃度および温度で、全ての抗原結合部位が
飽和されるのに十分な時間、プレインキュベートする。
プレインキュベーションののち、それら単核細胞を、ひ
き続いてのペプチドの存在下に、活性内皮細胞に加え
る。非粘着性単核細胞を緩衝液で洗い去り、活性内皮細
胞に結合した細胞の数を求める。対照として、活性化し
ていない内皮細胞を用いて並行アッセイを実施できる。
単核細胞を、抗原または抗原性断片と共に、適当な緩衝
液中で適当な濃度および温度で、全ての抗原結合部位が
飽和されるのに十分な時間、プレインキュベートする。
プレインキュベーションののち、それら単核細胞を、ひ
き続いてのペプチドの存在下に、活性内皮細胞に加え
る。非粘着性単核細胞を緩衝液で洗い去り、活性内皮細
胞に結合した細胞の数を求める。対照として、活性化し
ていない内皮細胞を用いて並行アッセイを実施できる。
【０１２１】結合を調べようとする細胞の細胞質中へ放
射トレーサー、たとえば51Ｃｒを、当業界に既知の諸方
法により導入し、細胞外カウントがあれば洗って除き、
これらの標識された細胞を内皮細胞の単層の上に置くこ
とによって、検出を定量的に行うことができる。
射トレーサー、たとえば51Ｃｒを、当業界に既知の諸方
法により導入し、細胞外カウントがあれば洗って除き、
これらの標識された細胞を内皮細胞の単層の上に置くこ
とによって、検出を定量的に行うことができる。
【０１２２】白血球の活性内皮細胞への結合のブロッキ
ングを検知するための本発明による一アッセイ法を実施
例４(U) に記載する。
ングを検知するための本発明による一アッセイ法を実施
例４(U) に記載する。
【０１２３】本発明の新規抗原は、それらの可溶性の形
で、以下の「炎症性反応を処置するための医薬および方
法」と題した部分で詳述するように、白血球と活性内皮
細胞との相互作用をブロックするのに有用である。
で、以下の「炎症性反応を処置するための医薬および方
法」と題した部分で詳述するように、白血球と活性内皮
細胞との相互作用をブロックするのに有用である。
【０１２４】炎症性反応を処置するための医薬および方
法 本発明はまた、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置す
るための医薬および方法を提供する。
法 本発明はまた、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置す
るための医薬および方法を提供する。
【０１２５】一実施態様では、該薬剤は、(I) に先に記
載したものであるが、インビトロでのＴ細胞の活性内皮
細胞への結合を部分的に阻害する(A) 群のモノクローナ
ル抗体、または(C）群のモノクローナル抗体の少なくと
も１種またはその結合部位含有断片あるいはそのモノク
ローナル抗体または断片の医薬として許容しうる塩の医
薬としての有効量および(II)薬学的に許容しうる担体、
希釈剤または賦形剤を含有してなる。
載したものであるが、インビトロでのＴ細胞の活性内皮
細胞への結合を部分的に阻害する(A) 群のモノクローナ
ル抗体、または(C）群のモノクローナル抗体の少なくと
も１種またはその結合部位含有断片あるいはそのモノク
ローナル抗体または断片の医薬として許容しうる塩の医
薬としての有効量および(II)薬学的に許容しうる担体、
希釈剤または賦形剤を含有してなる。
【０１２６】第二の実施態様では、該薬剤は、(I) 前記
１Ｅ７／２Ｇ７抗原、ＣＭＰ−１７０抗原およびＥＬＡ
Ｍ−１の抗原性断片からなる群より選ばれた少なくとも
１種の実質的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるい
は該抗原または断片の医薬として許容しうる塩の医薬と
しての有効量を含有してなる。
１Ｅ７／２Ｇ７抗原、ＣＭＰ−１７０抗原およびＥＬＡ
Ｍ−１の抗原性断片からなる群より選ばれた少なくとも
１種の実質的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるい
は該抗原または断片の医薬として許容しうる塩の医薬と
しての有効量を含有してなる。
【０１２７】同様に、一実施態様では、該方法は、上記
のインビトロでＴ細胞の活性内皮細胞への結合を部分的
に阻害する(A) 群のモノクローナル抗体、または上記
(C) 群のモノクローナル抗体の少なくとも１種またはそ
の結合部位含有断片あるいはそのモノクローナル抗体ま
たは断片の医薬として許容しうる塩の医薬としての有効
量を処置の必要な患者に投与することからなる。
のインビトロでＴ細胞の活性内皮細胞への結合を部分的
に阻害する(A) 群のモノクローナル抗体、または上記
(C) 群のモノクローナル抗体の少なくとも１種またはそ
の結合部位含有断片あるいはそのモノクローナル抗体ま
たは断片の医薬として許容しうる塩の医薬としての有効
量を処置の必要な患者に投与することからなる。
【０１２８】第二の実施態様では、該方法は、上記の１
Ｅ７／２Ｇ７抗原、ＣＭＰ−１７０抗原、およびＥＬＡ
Ｍ−１の抗原性断片から選ばれた少なくとも１種の実質
的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいはその抗原
または断片の医薬として許容しうる塩の医薬としての有
効量を処置の必要な患者に投与することからなる。
Ｅ７／２Ｇ７抗原、ＣＭＰ−１７０抗原、およびＥＬＡ
Ｍ−１の抗原性断片から選ばれた少なくとも１種の実質
的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいはその抗原
または断片の医薬として許容しうる塩の医薬としての有
効量を処置の必要な患者に投与することからなる。
【０１２９】医薬として、また上記処置法において有用
なモノクローナル抗体は、インビトロで白血球のＩＬ−
１活性内皮細胞への結合をブロックできる上記のものと
同じであり、好ましい実施態様では、該モノクローナル
抗体は、上記の２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ７である。
なモノクローナル抗体は、インビトロで白血球のＩＬ−
１活性内皮細胞への結合をブロックできる上記のものと
同じであり、好ましい実施態様では、該モノクローナル
抗体は、上記の２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ７である。
【０１３０】本発明の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）
および適当なヒト免疫グロブリンの非ＣＤＲ領域からな
るキメラ抗体も使用可能である〔クウィーン（Ｑueen）
ら、プロシーディング・オヴ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オヴ・サイエンシズ、ＵＳＡ、８６巻１００２９
〜１００３３頁、１９８９年〕。
および適当なヒト免疫グロブリンの非ＣＤＲ領域からな
るキメラ抗体も使用可能である〔クウィーン（Ｑueen）
ら、プロシーディング・オヴ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オヴ・サイエンシズ、ＵＳＡ、８６巻１００２９
〜１００３３頁、１９８９年〕。
【０１３１】医薬として、また該処置法において有用な
抗原は、上記の新規抗原の全てである。しかしながら、
モノクローナル抗体２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ７が特異
的に結合する上記抗原がとくに有用であると期待され
る。
抗原は、上記の新規抗原の全てである。しかしながら、
モノクローナル抗体２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ７が特異
的に結合する上記抗原がとくに有用であると期待され
る。
【０１３２】適当な、医薬として許容しうる塩は、当業
者が容易に決定できる。
者が容易に決定できる。
【０１３３】適当な、薬学的に許容しうる担体、希釈剤
または賦形剤は、当業者が容易に決定できる。例として
は、等張性食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）およびリン
ゲルの静脈内注射用グルコース溶液がある。
または賦形剤は、当業者が容易に決定できる。例として
は、等張性食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）およびリン
ゲルの静脈内注射用グルコース溶液がある。
【０１３４】該薬剤は、当業者により容易に決定される
方法により、たとえば静脈内に、投与できる。
方法により、たとえば静脈内に、投与できる。
【０１３５】投与すべき適当な用量は、炎症性疾患の性
格によっても異なりうるが、当業者が容易に決定できる
ところである。
格によっても異なりうるが、当業者が容易に決定できる
ところである。
【０１３６】一般には、ヒトへの静脈内注射に適した用
量は、モノクローナル抗体またはその結合部位含有断片
あるいは抗原またはその抗原性断片として約２０〜５０
mgである。
量は、モノクローナル抗体またはその結合部位含有断片
あるいは抗原またはその抗原性断片として約２０〜５０
mgである。
【０１３７】図１は、本発明の医薬および処置法がどの
ように作用すると考えられるかを、単純化して模式的に
示したものである。
ように作用すると考えられるかを、単純化して模式的に
示したものである。
【０１３８】該医薬および処置法は、いずれの活性内皮
細胞関連炎症性反応にも適用でき、急性ならびに慢性の
炎症に使用できる。
細胞関連炎症性反応にも適用でき、急性ならびに慢性の
炎症に使用できる。
【０１３９】該新規抗原を一薬剤中でそれに対応するモ
ノクローナル抗体と組合せることをしない限り、種々の
薬物の組合せ使用が常に可能なことはもちろんである。
ノクローナル抗体と組合せることをしない限り、種々の
薬物の組合せ使用が常に可能なことはもちろんである。
【０１４０】当業者ならば、本発明の医薬および処置法
が有用であろう炎症性反応を決定することは容易にでき
る。たとえば、腫瘍細胞介在血管障害、慢性関節リウマ
チ、再灌流後の心筋障害（顆粒球による障害）および成
人呼吸困難症候群（マクロファージおよび顆粒球）があ
る。シンプソン（Ｓimpson）、Ｐ．Ｊ．ら、ジャーナル
・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション、８１
巻６２４〜６２９頁、１９８８年；ヴェダー（Ｖedde
r)、Ｎ．Ｂ．ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イン
ヴェスティゲイション；サイモン（Ｓimon）とウォード
（Ｗard)、炎症；基礎原理および臨床上の相関（Ｉnfla
mmation:Ｂasic Ｐrinciples and Ｃlinical Ｃorre
lates)〔Ｊ．Ｉ．ガリン （Ｇallin)、Ｉ．Ｍ．ゴルド
スタイン（Ｇoldstein）およびＲ．スナイダマン （Ｓ
nyderman）編、レイヴン（Ｒaven）プレス、ニューヨー
ク、１９８８年〕中の「成人呼吸困難症候群」、８１５
頁；カジソン（Ｋadison）とバートン（Ｂarton)「脈管
炎：血管損傷の機序」、同上、７０３頁；およびハリス
（Ｈarris)「慢性関節リウマチの病因：機能不全性免疫
調節関連疾患」、同上、７５１頁にも、例が開示されて
いる。
が有用であろう炎症性反応を決定することは容易にでき
る。たとえば、腫瘍細胞介在血管障害、慢性関節リウマ
チ、再灌流後の心筋障害（顆粒球による障害）および成
人呼吸困難症候群（マクロファージおよび顆粒球）があ
る。シンプソン（Ｓimpson）、Ｐ．Ｊ．ら、ジャーナル
・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲイション、８１
巻６２４〜６２９頁、１９８８年；ヴェダー（Ｖedde
r)、Ｎ．Ｂ．ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イン
ヴェスティゲイション；サイモン（Ｓimon）とウォード
（Ｗard)、炎症；基礎原理および臨床上の相関（Ｉnfla
mmation:Ｂasic Ｐrinciples and Ｃlinical Ｃorre
lates)〔Ｊ．Ｉ．ガリン （Ｇallin)、Ｉ．Ｍ．ゴルド
スタイン（Ｇoldstein）およびＲ．スナイダマン （Ｓ
nyderman）編、レイヴン（Ｒaven）プレス、ニューヨー
ク、１９８８年〕中の「成人呼吸困難症候群」、８１５
頁；カジソン（Ｋadison）とバートン（Ｂarton)「脈管
炎：血管損傷の機序」、同上、７０３頁；およびハリス
（Ｈarris)「慢性関節リウマチの病因：機能不全性免疫
調節関連疾患」、同上、７５１頁にも、例が開示されて
いる。
【０１４１】Ｔ細胞サブセット及び付着分子 ＣＤ４+ Ｔ細胞は、免疫系を調節する鍵の役割を有す
る。マウスにおいて、ＣＤ４+ 細胞に対する細胞の相同
性は、Ｔ細胞及びＢ細胞の応答性のための“ヘルパー／
インデューサー”機能に役立ち、移植片拒絶（ｇｒａｆ
ｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）や遅延型過敏症のような１種
の効果器機能を補助し、“準備された（ｐｒｉｍｅ
ｄ）”細胞のように、既往反応の引き金になる。
る。マウスにおいて、ＣＤ４+ 細胞に対する細胞の相同
性は、Ｔ細胞及びＢ細胞の応答性のための“ヘルパー／
インデューサー”機能に役立ち、移植片拒絶（ｇｒａｆ
ｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）や遅延型過敏症のような１種
の効果器機能を補助し、“準備された（ｐｒｉｍｅ
ｄ）”細胞のように、既往反応の引き金になる。
【０１４２】免疫監視（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌ
ａｎｃｅ）を提供するために、循環から組織空間へのＣ
Ｄ４+ 細胞の移動が、しばしば保証される。該移動は、
付着細胞経路の１種または組み合わせによる障害または
感染部位またはその近傍での循環しているリンパ球の血
管内皮細胞への付着により促進されまたは方向付けられ
ている。
ａｎｃｅ）を提供するために、循環から組織空間へのＣ
Ｄ４+ 細胞の移動が、しばしば保証される。該移動は、
付着細胞経路の１種または組み合わせによる障害または
感染部位またはその近傍での循環しているリンパ球の血
管内皮細胞への付着により促進されまたは方向付けられ
ている。
【０１４３】望ましくないリンパ球−内皮細胞付着が発
生した場合には、移植片拒絶または自己免疫疾患中のよ
うに、付着分子に向けられた１または２以上の抗体を使
用して結合を妨害することなどにより細胞間結合を最小
にすることが有利であることを証明できる。例えば、グ
レーブス病（Ｇｒａｖｅｓ´ ｄｉｓｅａｓｅ）（自己
免疫甲状腺機能亢進症）において、正常な個人に見出さ
れるよりもかなり高い割合で患者の甲状腺組織中にヘル
パーＴ細胞が存在する。（イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ）ら、ジェイ． クリン．エンド．メタブ．（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．），６５：１７−２３，
１９８７）。慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性
関節炎及びライター症侯群のような慢性滑膜炎の場合、
滑膜Ｔ細胞のほぼ９０％がヘルパー−インデューサー
（ＣＤ４+ ４Ｂ４+ ＵＣＨＬ１+ ）細胞である（キング
スレー（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ）ら、スカンド．ジェイ．イ
ム． （Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍ．），２８：２２５−２
３２，１９８８）。ハルシュテンセン（Ｈａｌｓｔｅｎ
ｓｅｎ）らは、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅ
ａｓｅ）の未処置患者の空腸のバイオプシー（ｂｉｏｐ
ｓｙ）により得られた粘膜サンプルからの上皮内リンパ
球集団中のＣＤ４５ＲＯ+ メモリー細胞の割合の増加を
認めた（ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍ
ｍ．），２０：１８２５〜１８３０，１９９０）。
生した場合には、移植片拒絶または自己免疫疾患中のよ
うに、付着分子に向けられた１または２以上の抗体を使
用して結合を妨害することなどにより細胞間結合を最小
にすることが有利であることを証明できる。例えば、グ
レーブス病（Ｇｒａｖｅｓ´ ｄｉｓｅａｓｅ）（自己
免疫甲状腺機能亢進症）において、正常な個人に見出さ
れるよりもかなり高い割合で患者の甲状腺組織中にヘル
パーＴ細胞が存在する。（イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ）ら、ジェイ． クリン．エンド．メタブ．（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．），６５：１７−２３，
１９８７）。慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性
関節炎及びライター症侯群のような慢性滑膜炎の場合、
滑膜Ｔ細胞のほぼ９０％がヘルパー−インデューサー
（ＣＤ４+ ４Ｂ４+ ＵＣＨＬ１+ ）細胞である（キング
スレー（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ）ら、スカンド．ジェイ．イ
ム． （Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍ．），２８：２２５−２
３２，１９８８）。ハルシュテンセン（Ｈａｌｓｔｅｎ
ｓｅｎ）らは、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅ
ａｓｅ）の未処置患者の空腸のバイオプシー（ｂｉｏｐ
ｓｙ）により得られた粘膜サンプルからの上皮内リンパ
球集団中のＣＤ４５ＲＯ+ メモリー細胞の割合の増加を
認めた（ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍ
ｍ．），２０：１８２５〜１８３０，１９９０）。
【０１４４】観察されたヘルパー−インデューサーＴリ
ンパ球の選択的蓄積は、臓器特異的ではなく、炎症状態
での一般的特徴であることは明らかである。ろく膜（ｐ
ｌｅｕｒａｌ）及び腹膜の洗浄から得られたリンパ球
は、ほとんど内皮細胞付着能が亢進したヘルパー−イン
デューサー細胞である（ピツァリス（Ｐｉｔｚａｌｉ
ｓ）ら、ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍ
ｍ．），１８：１３９７−１４０４、１９８８）。免疫
−内皮細胞結合を最小にすることは、免疫細胞の応答性
を最小にすることもできる。
ンパ球の選択的蓄積は、臓器特異的ではなく、炎症状態
での一般的特徴であることは明らかである。ろく膜（ｐ
ｌｅｕｒａｌ）及び腹膜の洗浄から得られたリンパ球
は、ほとんど内皮細胞付着能が亢進したヘルパー−イン
デューサー細胞である（ピツァリス（Ｐｉｔｚａｌｉ
ｓ）ら、ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍ
ｍ．），１８：１３９７−１４０４、１９８８）。免疫
−内皮細胞結合を最小にすることは、免疫細胞の応答性
を最小にすることもできる。
【０１４５】少なくとも４種の細胞表面分子／リガンド
相互作用が、末梢ヒトＣＤ４+ Ｔ細胞の培養されたヒト
臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する付着性を媒介す
るようにみえる。Ｔ細胞リンパ球機能抗原（Ｔ−ｃｅｌ
ｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｔｉ
ｇｅｎ）（ＬＡＦ−１）は、細胞間付着分子（ＩＣＡＭ
−１）及び二者択一的なリガンド（“ＩＣＡＭ−Ｘ”）
と結合する；Ｔ細胞（ＶＬＡ）は、血管細胞付着分子
（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅ）（ＶＣＡＭ−１）と結合する；及び、
Ｔ細胞は、ＥＬＡＭ−１と結合する。細胞結合性は、Ｔ
細胞及びＨＵＶＥＣ両者の活性化の状態並びにＴ細胞の
分化の状態に依存する。
相互作用が、末梢ヒトＣＤ４+ Ｔ細胞の培養されたヒト
臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する付着性を媒介す
るようにみえる。Ｔ細胞リンパ球機能抗原（Ｔ−ｃｅｌ
ｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｔｉ
ｇｅｎ）（ＬＡＦ−１）は、細胞間付着分子（ＩＣＡＭ
−１）及び二者択一的なリガンド（“ＩＣＡＭ−Ｘ”）
と結合する；Ｔ細胞（ＶＬＡ）は、血管細胞付着分子
（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅ）（ＶＣＡＭ−１）と結合する；及び、
Ｔ細胞は、ＥＬＡＭ−１と結合する。細胞結合性は、Ｔ
細胞及びＨＵＶＥＣ両者の活性化の状態並びにＴ細胞の
分化の状態に依存する。
【０１４６】ＥＬＡＭ−１は、休止ＣＤ４+ Ｔ細胞の活
性化ＨＵＶＥＣに対する付着の媒介に重要な役割を果た
す。もう一つの細胞表面分子であるＬＡＦ−１は、フォ
ルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）活性化
Ｔ細胞を支配するが、ＬＡＦ−１リガンドの強度及び優
位性は、ＨＵＶＥＣの活性化状態により決定される。Ｉ
ＣＡＭ−１は、ＩＬ−１で誘導されたＨＵＶＥＣに対
し、優勢なリガンドであり、ＩＣＡＭ−Ｘは、誘導され
ていないＨＵＶＥＣに対する結合に優位である。ＶＬＡ
−４を介する付着は、活性化されたＨＵＶＥＣ上でのそ
のリガンドＶＣＡＭ−１の誘導に依存する。Ｔ細胞のＴ
ＭＡ活性化は、Ｔ／ＨＵＶＥＣ結合モデル及びＶＣＡＭ
−１で形質転換されたＬ−細胞に対する単純化されたＴ
細胞付着モデルの両方において、ＶＬＡ−４で媒介され
た付着を増加させる。ＬＡＦ−１及びＶＬＡ−４と異な
り、ＥＬＡＭ−１で媒介された付着は、Ｔ細胞の活性化
により増加しない。
性化ＨＵＶＥＣに対する付着の媒介に重要な役割を果た
す。もう一つの細胞表面分子であるＬＡＦ−１は、フォ
ルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）活性化
Ｔ細胞を支配するが、ＬＡＦ−１リガンドの強度及び優
位性は、ＨＵＶＥＣの活性化状態により決定される。Ｉ
ＣＡＭ−１は、ＩＬ−１で誘導されたＨＵＶＥＣに対
し、優勢なリガンドであり、ＩＣＡＭ−Ｘは、誘導され
ていないＨＵＶＥＣに対する結合に優位である。ＶＬＡ
−４を介する付着は、活性化されたＨＵＶＥＣ上でのそ
のリガンドＶＣＡＭ−１の誘導に依存する。Ｔ細胞のＴ
ＭＡ活性化は、Ｔ／ＨＵＶＥＣ結合モデル及びＶＣＡＭ
−１で形質転換されたＬ−細胞に対する単純化されたＴ
細胞付着モデルの両方において、ＶＬＡ−４で媒介され
た付着を増加させる。ＬＡＦ−１及びＶＬＡ−４と異な
り、ＥＬＡＭ−１で媒介された付着は、Ｔ細胞の活性化
により増加しない。
【０１４７】ＥＬＡＭ−１は、顆粒球及びＴ細胞の内皮
細胞に対する結合を媒介するのに役立つ。しかし、免疫
細胞の２種のクラスのＥＬＡＭリガンドは、区別可能で
ある。顆粒球（及び単球）のＥＬＡＭリガンドは、シア
リル（ｓｉａｌｙｌ）−Ｌｅx （スプリンガー・アンド
・ラスキー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＆ Ｌａｓｋｙ），ネ
ィチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３ ４９：１９６−１９７、
１９９１中で検討される）からなるが、シアリル−Ｌｅ
x はリンパ球上で発現されない（オオモリ（Ｏｈｍｏｒ
ｉ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） ７４：２５５−２６
１，１９８９）。
細胞に対する結合を媒介するのに役立つ。しかし、免疫
細胞の２種のクラスのＥＬＡＭリガンドは、区別可能で
ある。顆粒球（及び単球）のＥＬＡＭリガンドは、シア
リル（ｓｉａｌｙｌ）−Ｌｅx （スプリンガー・アンド
・ラスキー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＆ Ｌａｓｋｙ），ネ
ィチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３ ４９：１９６−１９７、
１９９１中で検討される）からなるが、シアリル−Ｌｅ
x はリンパ球上で発現されない（オオモリ（Ｏｈｍｏｒ
ｉ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） ７４：２５５−２６
１，１９８９）。
【０１４８】ＣＤ４細胞がシアリル−Ｌｅx 構造を発現
しないことは、二重染色フロー・サイトメトリー（ｄｕ
ａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒ
ｙ）により決定された（シアリル−Ｌｅx 抗体，ＳＮＨ
４，フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２５０：１１３０〜１１３２，１
９９０に記載される）。にもかかわらず、ＣＤ４+ 細胞
は、プラスチック上に固定された可溶性ＥＬＡＭに結合
し、その結合は、抗体７Ａ９により阻害可能である。さ
らに、細胞のシアリダーゼ処理は、約７５％結合性を減
少させ、残りは７Ａ９により阻害可能である。最後に、
シアリルラクトースは固定化されたＥＬＡＭに対するＴ
細胞の結合を阻害しない。
しないことは、二重染色フロー・サイトメトリー（ｄｕ
ａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒ
ｙ）により決定された（シアリル−Ｌｅx 抗体，ＳＮＨ
４，フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２５０：１１３０〜１１３２，１
９９０に記載される）。にもかかわらず、ＣＤ４+ 細胞
は、プラスチック上に固定された可溶性ＥＬＡＭに結合
し、その結合は、抗体７Ａ９により阻害可能である。さ
らに、細胞のシアリダーゼ処理は、約７５％結合性を減
少させ、残りは７Ａ９により阻害可能である。最後に、
シアリルラクトースは固定化されたＥＬＡＭに対するＴ
細胞の結合を阻害しない。
【０１４９】ナイーブおよびメモリー細胞であると理解
されるＣＤ４+ Ｔ細胞サブセット上の付着分子の分化発
現は、Ｔ／ＨＵＶＥＣ付着を調節する。ナイーブＴ細胞
のＨＵＶＥＣに対する付着は、ＶＬＡ−４及びＥＬＡＭ
−１経路にはほとんど或いは全く関与しないＬＦＡ−１
により主として媒介される。これに対し、メモリーＴ細
胞のＨＵＶＥＣに対する結合は、４種のすべての経路を
利用する。
されるＣＤ４+ Ｔ細胞サブセット上の付着分子の分化発
現は、Ｔ／ＨＵＶＥＣ付着を調節する。ナイーブＴ細胞
のＨＵＶＥＣに対する付着は、ＶＬＡ−４及びＥＬＡＭ
−１経路にはほとんど或いは全く関与しないＬＦＡ−１
により主として媒介される。これに対し、メモリーＴ細
胞のＨＵＶＥＣに対する結合は、４種のすべての経路を
利用する。
【０１５０】白血球表面分子のＣＤ４５のアイソフォー
ム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の分化発現は、ＣＤ４+ Ｔ細胞の
２種の相互サブセットで定義される。ＣＤ４５ＲＡアイ
ソフォームを発現するサブセットは、事前に活性化され
ていない（“ナイーブ”細胞）休止の末梢Ｔ細胞からな
る。該相互サブセットは、ＣＤ４５ＲＯアイソフォーム
を発現し、典型的には抗原に曝すことにより事前に活性
化され、および休止状態（“メモリー”細胞）に復帰し
た細胞を発現する。これらのサブセットの分析は、ＣＤ
４５アイソフォームの分化発現に加えて、メモリーＴ細
胞上でのＬＦＡ−１及びＶＬＡ−４を含む多数の細胞表
面分子の増加された発現があることが示された。Ｆｉ
ｇ．３５Ａ及び３５Ｂは、メモリーＴ細胞上のある種の
細胞分子のより大きな発現がＴ／ＨＵＶＥＣ相互作用に
関連することを示している。第１に、精製された休止ナ
イーブＣＤ４+ Ｔ細胞よりも数多くの精製された休止メ
モリーＣＤ４+ Ｔ細胞が、休止またはＩＬ−１で誘導さ
れたＨＵＶＥＣに結合する。
ム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の分化発現は、ＣＤ４+ Ｔ細胞の
２種の相互サブセットで定義される。ＣＤ４５ＲＡアイ
ソフォームを発現するサブセットは、事前に活性化され
ていない（“ナイーブ”細胞）休止の末梢Ｔ細胞からな
る。該相互サブセットは、ＣＤ４５ＲＯアイソフォーム
を発現し、典型的には抗原に曝すことにより事前に活性
化され、および休止状態（“メモリー”細胞）に復帰し
た細胞を発現する。これらのサブセットの分析は、ＣＤ
４５アイソフォームの分化発現に加えて、メモリーＴ細
胞上でのＬＦＡ−１及びＶＬＡ−４を含む多数の細胞表
面分子の増加された発現があることが示された。Ｆｉ
ｇ．３５Ａ及び３５Ｂは、メモリーＴ細胞上のある種の
細胞分子のより大きな発現がＴ／ＨＵＶＥＣ相互作用に
関連することを示している。第１に、精製された休止ナ
イーブＣＤ４+ Ｔ細胞よりも数多くの精製された休止メ
モリーＣＤ４+ Ｔ細胞が、休止またはＩＬ−１で誘導さ
れたＨＵＶＥＣに結合する。
【０１５１】第２に、精製されたナイーブ及びメモリー
Ｔ細胞のＰＭＡによる急性活性化は、ＨＵＶＥＣに対す
る両方の細胞型の付着の増加につながるが、ＰＭＡ活性
化メモリーＴ細胞は、ＰＭＡ活性化ナイーブＴ細胞より
もＨＵＶＥＣに対しより大きな付着性を示す。
Ｔ細胞のＰＭＡによる急性活性化は、ＨＵＶＥＣに対す
る両方の細胞型の付着の増加につながるが、ＰＭＡ活性
化メモリーＴ細胞は、ＰＭＡ活性化ナイーブＴ細胞より
もＨＵＶＥＣに対しより大きな付着性を示す。
【０１５２】ＥＬＡＭは、免疫細胞−内皮細胞付着に初
期の役割を果たし、顆粒球及びＴ細胞のＥＬＡＭリガン
ドは区別されるため、いずれかの細胞型の作用に起因す
る選択的炎症過程の調節が今や可能となり、例えば、顆
粒球は細菌感染の処置に非常に重要であり、Ｔ細胞はあ
る種の自己免疫疾患に非常に重要であることが知られて
おり、それはいずれかの免疫細胞型が活性化された内皮
細胞に影響を与えることによる。
期の役割を果たし、顆粒球及びＴ細胞のＥＬＡＭリガン
ドは区別されるため、いずれかの細胞型の作用に起因す
る選択的炎症過程の調節が今や可能となり、例えば、顆
粒球は細菌感染の処置に非常に重要であり、Ｔ細胞はあ
る種の自己免疫疾患に非常に重要であることが知られて
おり、それはいずれかの免疫細胞型が活性化された内皮
細胞に影響を与えることによる。
【０１５３】そのような特異性の程度は、例えば免疫抑
制的治療における副作用を最小にする。ＥＬＡＭリガン
ドをある生体部位に標的化するための好適な担体として
は、例えばその表面に適当なＥＬＡＭリガンドを発現す
るリポソームが挙げられる。
制的治療における副作用を最小にする。ＥＬＡＭリガン
ドをある生体部位に標的化するための好適な担体として
は、例えばその表面に適当なＥＬＡＭリガンドを発現す
るリポソームが挙げられる。
【０１５４】特別な生体部位に対する薬物の担体の標的
化またはその中に含まれる薬物を輸送する担体を使用す
る概念は、当該技術分野において知られている（バイン
シュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）の“リポソーム（Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓ）：生物物理学から治療学まで”、オ
ストロウ（Ｏｓｔｒｏｗ）編，デッカー（Ｄｅｋｋｅ
ｒ），ニューヨーク １９８７；ヒース（Ｈｅａｔｈ）
ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オヴ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ），８０：１３７７〜１３８１，１９８
３）。担体の例としては、マイクロカプセル、マイクロ
グラニュール（ｍｉｃｒｏｇｒａｎｕｌｅｓ）及びリポ
ソームが挙げられる。薬物送達（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のための標的化の特異性は、
担体の表面上に標的の細胞、組織または器官の近傍又は
表面に表現されている相補的な分子に親和性を有する結
合性分子を持つことにより得られる。結合性分子の例と
しては、抗体、ホルモン及び付着分子リガンドが挙げら
れ、関連する相補的な分子としては抗原、レセプター及
び付着分子が挙げられる。担体は、他の結合性分子の範
疇にあるステロイド、抗菌剤、サイトトキシンなどのよ
うな免疫抑制剤を含むように形成される。
化またはその中に含まれる薬物を輸送する担体を使用す
る概念は、当該技術分野において知られている（バイン
シュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）の“リポソーム（Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓ）：生物物理学から治療学まで”、オ
ストロウ（Ｏｓｔｒｏｗ）編，デッカー（Ｄｅｋｋｅ
ｒ），ニューヨーク １９８７；ヒース（Ｈｅａｔｈ）
ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オヴ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ），８０：１３７７〜１３８１，１９８
３）。担体の例としては、マイクロカプセル、マイクロ
グラニュール（ｍｉｃｒｏｇｒａｎｕｌｅｓ）及びリポ
ソームが挙げられる。薬物送達（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のための標的化の特異性は、
担体の表面上に標的の細胞、組織または器官の近傍又は
表面に表現されている相補的な分子に親和性を有する結
合性分子を持つことにより得られる。結合性分子の例と
しては、抗体、ホルモン及び付着分子リガンドが挙げら
れ、関連する相補的な分子としては抗原、レセプター及
び付着分子が挙げられる。担体は、他の結合性分子の範
疇にあるステロイド、抗菌剤、サイトトキシンなどのよ
うな免疫抑制剤を含むように形成される。
【０１５５】リポソームは、局所放出能により他の幾つ
かの担体と同様に用途の広いものであり、それは標的細
胞との膜融合能が、例えば細胞周囲又は細胞内の送達及
び結合性分子の細胞表面発現となること、及びエンドサ
イトーシスを介する標的細胞による包み込み能による。
かの担体と同様に用途の広いものであり、それは標的細
胞との膜融合能が、例えば細胞周囲又は細胞内の送達及
び結合性分子の細胞表面発現となること、及びエンドサ
イトーシスを介する標的細胞による包み込み能による。
【０１５６】付着分子及び付着分子リガンドの結合性分
子としての使用は、これらの分子及びリガンドが“自
己”であり、通常免疫応答を誘導しないことのために特
別な利点がある。この様に、ＥＬＡＭリガンド、ＶＣＡ
Ｍリガンド及びＩＣＡＭリガンドは、各々相補的付着分
子であるＥＬＡＭ、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭが活性化され
た内皮細胞表面に発現されているために炎症部位への担
体の標的化ための特に好ましい結合性分子である。
子としての使用は、これらの分子及びリガンドが“自
己”であり、通常免疫応答を誘導しないことのために特
別な利点がある。この様に、ＥＬＡＭリガンド、ＶＣＡ
Ｍリガンド及びＩＣＡＭリガンドは、各々相補的付着分
子であるＥＬＡＭ、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭが活性化され
た内皮細胞表面に発現されているために炎症部位への担
体の標的化ための特に好ましい結合性分子である。
【０１５７】炎症性反応検知法 本発明は、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する方
法をも提供するものであり、該方法は、(I) 生体液を、
上記(A) 、(B) または(C) 群のモノクローナル抗体また
はその結合部位含有断片の少なくとも１種と接触させ、
(II)該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体または
その結合部位含有断片の特異的結合をアッセイすること
からなる。
法をも提供するものであり、該方法は、(I) 生体液を、
上記(A) 、(B) または(C) 群のモノクローナル抗体また
はその結合部位含有断片の少なくとも１種と接触させ、
(II)該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体または
その結合部位含有断片の特異的結合をアッセイすること
からなる。
【０１５８】該モノクローナル抗体の製造および精製の
方法は、既に上で述べた。
方法は、既に上で述べた。
【０１５９】「生体液」とは、血清、尿、滑液およびそ
の他の、炎症から生じる抗原を含有すると予想される体
液のすべてを意味する。
の他の、炎症から生じる抗原を含有すると予想される体
液のすべてを意味する。
【０１６０】検知は、インビトロでもインビボでも行な
いうる。インビトロ検知は、ヤング、Ｗ．Ｗ．ら、ジャ
ーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１５
０巻１００８〜１０１９頁（１９７９年）およびカンナ
ギ（Ｋannagi）、Ｒ．ら、キャンサー・リサーチ、４３
巻４９９７〜５００５頁（１９８３年）に記載されてい
るものなどの、周知のインビトロ免疫アッセイ法のいず
れを用いても実施できる。さらに、インビボでの検知
は、バーチェル（Ｂurchell)、Ｊ．ら、インターナショ
ナル・ジャーナル・オヴ・キャンサー、３４巻７６３〜
７６８頁（１９８４年）；エペネトス（Ｅpenetos)、
Ａ．Ａ．ら、ランセット、２巻９ (I) 液を、上記(A) 、(B) または(C) 群のモノクローナ
ル抗体またはその結合部位含有断片の少なくとも１種と
接触させ、(II)該生体液中の抗原への該モノクローナル
抗体またはその結合部位含有断片の特異的結合をアッセ
イすることからなる。
いうる。インビトロ検知は、ヤング、Ｗ．Ｗ．ら、ジャ
ーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１５
０巻１００８〜１０１９頁（１９７９年）およびカンナ
ギ（Ｋannagi）、Ｒ．ら、キャンサー・リサーチ、４３
巻４９９７〜５００５頁（１９８３年）に記載されてい
るものなどの、周知のインビトロ免疫アッセイ法のいず
れを用いても実施できる。さらに、インビボでの検知
は、バーチェル（Ｂurchell)、Ｊ．ら、インターナショ
ナル・ジャーナル・オヴ・キャンサー、３４巻７６３〜
７６８頁（１９８４年）；エペネトス（Ｅpenetos)、
Ａ．Ａ．ら、ランセット、２巻９ (I) 液を、上記(A) 、(B) または(C) 群のモノクローナ
ル抗体またはその結合部位含有断片の少なくとも１種と
接触させ、(II)該生体液中の抗原への該モノクローナル
抗体またはその結合部位含有断片の特異的結合をアッセ
イすることからなる。
【０１６１】該モノクローナル抗体の製造および精製の
方法は、既に上で述べた。
方法は、既に上で述べた。
【０１６２】「生体液」とは、血清、尿、滑液およびそ
の他の、炎症から生じる抗原を含有すると予想される体
液のすべてを意味する。
の他の、炎症から生じる抗原を含有すると予想される体
液のすべてを意味する。
【０１６３】検知は、インビトロでもインビボでも行な
いうる。インビトロ検知は、ヤング、Ｗ．Ｗ．ら、ジャ
ーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１５
０巻１００８〜１０１９頁（１９７９年）およびカンナ
ギ（Ｋannagi）、Ｒ．ら、キャンサー・リサーチ、４３
巻４９９７〜５００５頁（１９８３年）に記載されてい
るものなどの、周知のインビトロ免疫アッセイ法のいず
れを用いても実施できる。さらに、インビボでの検知
は、バーチェル（Ｂurchell)、Ｊ．ら、インターナショ
ナル・ジャーナル・オヴ・キャンサー、３４巻７６３〜
７６８頁（１９８４年）；エペネトス（Ｅpenetos)、
Ａ．Ａ．ら、ランセット、２巻９９９〜１００４頁（１
９８２年）；チャタル（Ｃhatal)、Ｊ．−Ｆ．ら、ジャ
ーナル・オヴ・ニュクリアー・メディシン、２６巻５３
１〜５３７頁（１９８５年）に記載のものなどの、周知
のインビボ免疫アッセイ法のいずれを用いても実施でき
る。
いうる。インビトロ検知は、ヤング、Ｗ．Ｗ．ら、ジャ
ーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン、１５
０巻１００８〜１０１９頁（１９７９年）およびカンナ
ギ（Ｋannagi）、Ｒ．ら、キャンサー・リサーチ、４３
巻４９９７〜５００５頁（１９８３年）に記載されてい
るものなどの、周知のインビトロ免疫アッセイ法のいず
れを用いても実施できる。さらに、インビボでの検知
は、バーチェル（Ｂurchell)、Ｊ．ら、インターナショ
ナル・ジャーナル・オヴ・キャンサー、３４巻７６３〜
７６８頁（１９８４年）；エペネトス（Ｅpenetos)、
Ａ．Ａ．ら、ランセット、２巻９９９〜１００４頁（１
９８２年）；チャタル（Ｃhatal)、Ｊ．−Ｆ．ら、ジャ
ーナル・オヴ・ニュクリアー・メディシン、２６巻５３
１〜５３７頁（１９８５年）に記載のものなどの、周知
のインビボ免疫アッセイ法のいずれを用いても実施でき
る。
【０１６４】生体液中の抗原を検知するためのとくに好
ましい一方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ手法である。こ
の方法は、その好ましい形では、当該蛋白質の一エピト
ープに対するモノクローナル抗体をプラスチック製ＮＵ
ＮＣ ＥＬＩＳＡディッシュに付着させることからな
る。これに続いて、生体液中の蛋白質の非特異的結合を
ブロックするために、ウシ血清アルブミンの１％溶液を
加える。ウェルを洗って未結合蛋白質を除いたのち、生
体液（血液、尿など）をディッシュに加えて１時間お
く。洗って未結合生体液を除去したのち、当該蛋白質の
他のエピトープに対する第二のモノクローナル抗体を加
える。第二のモノクローナル抗体は、アルカリホスファ
ターゼなどの適当なリポーター分子と結合させておく。
一定のインキュベーション期間ののち、ウェルを洗って
未結合蛋白質を除き、適当な酵素基質（リポーター分子
が酵素のとき）、たとえばアミノエチルカルバゾールを
加え、反応生成物をＥＬＩＳＡプレートリーダーで定量
する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法実施の一例がロケシュ
ワー（Ｌokeshwar）とリン（Ｌin）、ジャーナル・オヴ
・インムノロジカル・メソッズ、１２３巻１２３〜１２
９頁（１９８９年）に記載されている。
ましい一方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ手法である。こ
の方法は、その好ましい形では、当該蛋白質の一エピト
ープに対するモノクローナル抗体をプラスチック製ＮＵ
ＮＣ ＥＬＩＳＡディッシュに付着させることからな
る。これに続いて、生体液中の蛋白質の非特異的結合を
ブロックするために、ウシ血清アルブミンの１％溶液を
加える。ウェルを洗って未結合蛋白質を除いたのち、生
体液（血液、尿など）をディッシュに加えて１時間お
く。洗って未結合生体液を除去したのち、当該蛋白質の
他のエピトープに対する第二のモノクローナル抗体を加
える。第二のモノクローナル抗体は、アルカリホスファ
ターゼなどの適当なリポーター分子と結合させておく。
一定のインキュベーション期間ののち、ウェルを洗って
未結合蛋白質を除き、適当な酵素基質（リポーター分子
が酵素のとき）、たとえばアミノエチルカルバゾールを
加え、反応生成物をＥＬＩＳＡプレートリーダーで定量
する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法実施の一例がロケシュ
ワー（Ｌokeshwar）とリン（Ｌin）、ジャーナル・オヴ
・インムノロジカル・メソッズ、１２３巻１２３〜１２
９頁（１９８９年）に記載されている。
【０１６５】該方法は、たとえば、初期移植片拒絶反応
あるいは無症状感染または脈管炎の検知に使用できる。
あるいは無症状感染または脈管炎の検知に使用できる。
【０１６６】１Ｅ７／２Ｇ７抗原のｃＤＮＡ配列とこの
ｃＤＮＡを運ぶベクター 本発明はまた、抗原１Ｅ７／２Ｇ７をコードするｃＤＮ
Ａ配列、またはその断片、ならびに該ｃＤＮＡ配列また
はその断片を運ぶベクターをも提供する。
ｃＤＮＡを運ぶベクター 本発明はまた、抗原１Ｅ７／２Ｇ７をコードするｃＤＮ
Ａ配列、またはその断片、ならびに該ｃＤＮＡ配列また
はその断片を運ぶベクターをも提供する。
【０１６７】該ｃＤＮＡ配列は、実質的にFig ３４Ａ〜
３４Ｆに示す通りの配列からなる。ただし、塩基３８４
〜７４３は実質的にFig ３４Ｂに示す通りに存在するも
のとする。
３４Ｆに示す通りの配列からなる。ただし、塩基３８４
〜７４３は実質的にFig ３４Ｂに示す通りに存在するも
のとする。
【０１６８】「実質的に示す通り」とは、Fig ３４Ａ〜
３４Ｇに示されたｃＤＮＡ配列が塩基の欠失、付加およ
び／または置換を含んでいてもよいことを意味する。た
だし、(1) 該ｃＤＮＡ配列が、抗原１Ｅ７／２Ｇ７また
はその抗原性断片の合成を指示するｍＲＮＡを単離する
ためのプローブとして依然として使用できるか、または
(2) 該ｃＤＮＡ配列がコードするリガンドのリガンド結
合性が維持される範囲内とする。
３４Ｇに示されたｃＤＮＡ配列が塩基の欠失、付加およ
び／または置換を含んでいてもよいことを意味する。た
だし、(1) 該ｃＤＮＡ配列が、抗原１Ｅ７／２Ｇ７また
はその抗原性断片の合成を指示するｍＲＮＡを単離する
ためのプローブとして依然として使用できるか、または
(2) 該ｃＤＮＡ配列がコードするリガンドのリガンド結
合性が維持される範囲内とする。
【０１６９】Fig ３４Ａ〜３４Ｇに示された通りのまた
は実質的に示された通りのｃＤＮＡ配列の断片とは、リ
ガンド結合性を維持する１Ｅ７／２Ｇ７抗原の断片をコ
ードする該ｃＤＮＡ配列の断片である。
は実質的に示された通りのｃＤＮＡ配列の断片とは、リ
ガンド結合性を維持する１Ｅ７／２Ｇ７抗原の断片をコ
ードする該ｃＤＮＡ配列の断片である。
【０１７０】ｃＤＮＡ配列またはその断片を、抗原１Ｅ
７／２Ｇ７またはその抗原性断片の合成を指示するｍＲ
ＮＡを単離するためのプローブとしてなお使用できるか
どうかは、当業者ならば、常法によって、必要以上の実
験を行わずに、容易に判定できる。
７／２Ｇ７またはその抗原性断片の合成を指示するｍＲ
ＮＡを単離するためのプローブとしてなお使用できるか
どうかは、当業者ならば、常法によって、必要以上の実
験を行わずに、容易に判定できる。
【０１７１】ｃＤＮＡ配列またはその断片が、リガンド
結合性を維持する蛋白質をコードしているかどうかは、
やはり当業者ならば、以下のように、とくに必要以上の
実験をせずに、常法によって容易に判断できる。
結合性を維持する蛋白質をコードしているかどうかは、
やはり当業者ならば、以下のように、とくに必要以上の
実験をせずに、常法によって容易に判断できる。
【０１７２】まず、当業者ならば、可溶化された形態の
１Ｅ７／２Ｇ７ができることおよびその形態でそれが細
胞に結合することを証明するであろう。可溶性形態は、
細胞質領域およびトランスメンブレン領域を欠失させる
ことによりつくられる。基本的には、コードする配列の
中へストップコドンを挿入して、これらの領域が翻訳さ
れるのを防ぐ。この欠失させた形のｃＤＮＡによってＣ
ＯＳ細胞を常法により、たとえばＣａ++ショックにより
トランスフェクトし、システインおよびメチオニンの35
Ｓアイソトープの存在下で生育させ、これを生育中のＣ
ＯＳ細胞内へ、従って翻訳された抗原の中へ取り込ませ
る。４８時間後にこれら細胞の上澄みを集め、抗原の細
胞表面への結合を、模擬的にトランスフェクトした細胞
と比較して、次のように、測定する。
１Ｅ７／２Ｇ７ができることおよびその形態でそれが細
胞に結合することを証明するであろう。可溶性形態は、
細胞質領域およびトランスメンブレン領域を欠失させる
ことによりつくられる。基本的には、コードする配列の
中へストップコドンを挿入して、これらの領域が翻訳さ
れるのを防ぐ。この欠失させた形のｃＤＮＡによってＣ
ＯＳ細胞を常法により、たとえばＣａ++ショックにより
トランスフェクトし、システインおよびメチオニンの35
Ｓアイソトープの存在下で生育させ、これを生育中のＣ
ＯＳ細胞内へ、従って翻訳された抗原の中へ取り込ませ
る。４８時間後にこれら細胞の上澄みを集め、抗原の細
胞表面への結合を、模擬的にトランスフェクトした細胞
と比較して、次のように、測定する。
【０１７３】ＡＴＣＣから入手しうる細胞株ＲＡＭＯＳ
およびＪＵＲＫＡＴあるいは正常ヒト末梢血単核細胞群
（百万個）のような適当なタイプの細胞を、模擬または
トランスフェクトされた細胞の培養上澄み１mlと共に氷
上で約１時間インキュベートする。インキュベーション
細胞を、ＲＩＡ級ＢＳＡを１％含有するダルベッコのＰ
ＢＳと共に遠心して洗う。洗った細胞を、１％ＳＤＳ洗
剤１００μｌ中に置いて、室温で５分間溶解させる。つ
ぎに、溶解細胞ペレットの全体を適当なシンチレーショ
ン液に加え、結合放射能をシンチレーションカウンター
で測定する。模擬的にトランスフェクトした細胞から得
たｃｐｍから上澄み存在下にインキュベートした細胞か
ら得たｃｐｍを差引いて、特異的に結合したｃｐｍを求
める。
およびＪＵＲＫＡＴあるいは正常ヒト末梢血単核細胞群
（百万個）のような適当なタイプの細胞を、模擬または
トランスフェクトされた細胞の培養上澄み１mlと共に氷
上で約１時間インキュベートする。インキュベーション
細胞を、ＲＩＡ級ＢＳＡを１％含有するダルベッコのＰ
ＢＳと共に遠心して洗う。洗った細胞を、１％ＳＤＳ洗
剤１００μｌ中に置いて、室温で５分間溶解させる。つ
ぎに、溶解細胞ペレットの全体を適当なシンチレーショ
ン液に加え、結合放射能をシンチレーションカウンター
で測定する。模擬的にトランスフェクトした細胞から得
たｃｐｍから上澄み存在下にインキュベートした細胞か
ら得たｃｐｍを差引いて、特異的に結合したｃｐｍを求
める。
【０１７４】つぎに、ストップコドンをＮ末端に次第に
近付けながら一連の欠失ｃＤＮＡ分子を構築し、蛋白質
を発現させ、その結合を上記アッセイでテストすること
により、最小寸法の結合断片を求める。
近付けながら一連の欠失ｃＤＮＡ分子を構築し、蛋白質
を発現させ、その結合を上記アッセイでテストすること
により、最小寸法の結合断片を求める。
【０１７５】該ｃＤＮＡ配列は、実施例５記載のように
して、プラスミドｐＣＤＮ−１に代えて、ｐＥＵＫ−Ｃ
１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏなどの市販の哺
乳動物用発現ベクターを用いて、調製できる。
して、プラスミドｐＣＤＮ−１に代えて、ｐＥＵＫ−Ｃ
１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏなどの市販の哺
乳動物用発現ベクターを用いて、調製できる。
【０１７６】該ｃＤＮＡ配列を運ぶベクターは、当該技
術分野で既知の多くのベクターのいずれであってもよ
い。
術分野で既知の多くのベクターのいずれであってもよ
い。
【０１７７】単にｃＤＮＡ配列の増幅が目的のときは、
該ベクターは、いずれも市販されているｐＢＲ３２２、
ｐＳＰ７２、ｐＵＣなどの多くの既知ベクターのいずれ
であってもよい。
該ベクターは、いずれも市販されているｐＢＲ３２２、
ｐＳＰ７２、ｐＵＣなどの多くの既知ベクターのいずれ
であってもよい。
【０１７８】ｃＤＮＡ配列の発現を目的とするときは、
該ベクターは、いずれも市販されているｐＥＵＫ− Ｃ
１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏなどの、発現制
御配列を含有する多くの既知の哺乳動物用発現ベクター
のいずれであってもよい。
該ベクターは、いずれも市販されているｐＥＵＫ− Ｃ
１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏなどの、発現制
御配列を含有する多くの既知の哺乳動物用発現ベクター
のいずれであってもよい。
【０１７９】ｃＤＮＡ配列は、常法によってベクターに
挿入でき、それらベクターは常法によって増殖、発現さ
せることができる。
挿入でき、それらベクターは常法によって増殖、発現さ
せることができる。
【０１８０】
【実施例】以下、特定の実施例によって本発明を説明す
るが、それら実施例は本発明の範囲を限定するものでは
ない。
るが、それら実施例は本発明の範囲を限定するものでは
ない。
【０１８１】特に断わらない限り、パーセント、比、部
などは全て体積基準のものである。
などは全て体積基準のものである。
【０１８２】実施例で使用した試薬の入手および／また
は処理の方法は下記の通りである：トライトンＸ−１１
４はコダックから入手した。これを１０ｍＭトリス緩衝
液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌで３回抽出して不
純物を除いた。トライトンＸ−１００、ブタ腸ヘパリン
およびコラゲナーゼタイプ１はシグマから購入した。ト
ウィーン２０はアルドリッチから購入した。フェニルメ
チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）はカルビオケ
ムから購入した。ゼラチンはバイオラドから購入した。
ビオチニル化ヤギ抗マウス軽鎖試薬およびＦＩＴＣ−ヤ
ギ抗マウス試薬はジャクソン・ラボラトリーズから購入
した。アフィニティ精製ヤギ抗マウスＩｇＧはカークガ
ード・アンド・ペリー・ラボラトリーズから、 125Ｉ−
ストレプトアビジンおよび35Ｓ−システインはアマーシ
ャムから入手した。組換えヒトＩＬ−１ベータは、徳島
研究所のＹ．ヒライ博士からの恵贈品であった。この材
料は大腸菌から精製すると、還元条件下でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル（１５％アクリルアミド）電気泳
動で、１７ｋＤａのところに単一のバンドを与えた。以
下の実施例に使用するのに適したＩＬ−１は市販品を入
手することもできる。潰瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
はジェンザイムから購入した。比活性３００８Ｕ／mg蛋
白質のヒトαトロンビンは、ジョン・Ｗ．フェントン
（Ｆenton)の好意により入手した。大腸菌リポ多糖（ｌ
ｐｓ）はデイフコから入手した。Ｂ２同族体としてのツ
ニカマイシンはベーリンガー・マンハイムから購入し
た。Ｔ４、Ｔ８、Ｂ１およびＭｏ２モノクローナル抗体
は、コールター社から購入した。Ｗ６／３２抗体は、ア
キュレット・ケミカル・アンド・サイエンティフィック
社から購入し、ＲＲ／１抗体はティモシ・スプリンガー
（Ｓpringer)博士からの恵贈品、１０Ｅ５抗体はバリー
・コラー（Ｃoller)博士からの恵贈品であり、ＭＯＰＣ
−２１骨髄腫蛋白質はＡＴＣＣから入手したＰ３×６３
Ａｇ８細胞株の培養上澄みから精製した。
は処理の方法は下記の通りである：トライトンＸ−１１
４はコダックから入手した。これを１０ｍＭトリス緩衝
液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌで３回抽出して不
純物を除いた。トライトンＸ−１００、ブタ腸ヘパリン
およびコラゲナーゼタイプ１はシグマから購入した。ト
ウィーン２０はアルドリッチから購入した。フェニルメ
チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）はカルビオケ
ムから購入した。ゼラチンはバイオラドから購入した。
ビオチニル化ヤギ抗マウス軽鎖試薬およびＦＩＴＣ−ヤ
ギ抗マウス試薬はジャクソン・ラボラトリーズから購入
した。アフィニティ精製ヤギ抗マウスＩｇＧはカークガ
ード・アンド・ペリー・ラボラトリーズから、 125Ｉ−
ストレプトアビジンおよび35Ｓ−システインはアマーシ
ャムから入手した。組換えヒトＩＬ−１ベータは、徳島
研究所のＹ．ヒライ博士からの恵贈品であった。この材
料は大腸菌から精製すると、還元条件下でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル（１５％アクリルアミド）電気泳
動で、１７ｋＤａのところに単一のバンドを与えた。以
下の実施例に使用するのに適したＩＬ−１は市販品を入
手することもできる。潰瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
はジェンザイムから購入した。比活性３００８Ｕ／mg蛋
白質のヒトαトロンビンは、ジョン・Ｗ．フェントン
（Ｆenton)の好意により入手した。大腸菌リポ多糖（ｌ
ｐｓ）はデイフコから入手した。Ｂ２同族体としてのツ
ニカマイシンはベーリンガー・マンハイムから購入し
た。Ｔ４、Ｔ８、Ｂ１およびＭｏ２モノクローナル抗体
は、コールター社から購入した。Ｗ６／３２抗体は、ア
キュレット・ケミカル・アンド・サイエンティフィック
社から購入し、ＲＲ／１抗体はティモシ・スプリンガー
（Ｓpringer)博士からの恵贈品、１０Ｅ５抗体はバリー
・コラー（Ｃoller)博士からの恵贈品であり、ＭＯＰＣ
−２１骨髄腫蛋白質はＡＴＣＣから入手したＰ３×６３
Ａｇ８細胞株の培養上澄みから精製した。
【０１８３】実施例１ 活性ヒト内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体の調製 (A) 細胞培養：病院の検閲部の許可を得て入手した廃棄
臍帯を、ジャッフェ（Ｊaffe）（ジャーナル・オヴ・ク
リニカル・インヴェスティゲイション、５２巻２７４５
〜２７５６頁、１９７３年）の操作法に従い、これを若
干改良して、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を得
た。要約すると、細胞をコラゲナーゼ処理によって血管
壁からはがし、ゼラチン被覆組織培養フラスコを用い、
下記の培地中で培養した。ワイベル−パラド体の存在お
よび生細胞によるアセチル化低密度リポ蛋白質の取込み
によって、細胞が９５％以上内皮細胞であることを確認
した。細胞を、２０％の低内毒素ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ、ハイクローン）、９０μｇ／mlの保存剤不含ブタヘ
パリン、２０μｇ／mlの内皮細胞成長用補足物（ＥＣＧ
Ｓ）（コラボラティヴ・リサーチから入手）、グルタミ
ンおよび抗生物質を含有するＭ１９９培地（以下「生育
培地」）中で培養した。ウシ視床下部から冷却ブレンダ
ー中での食塩水抽出、４℃での２時間撹拌および不溶物
除去のための１４０００ｇまでの遠心分離によってＥＣ
ＧＳを調製した。脂質の除去および０．４５ミクロンフ
ィルターでの濾過ののち、アリコートを凍結乾燥した。
ヒト顆粒球を、フィコール−ハイパック（FICOLL−HYPA
QUE)を用いての遠心分離により単核細胞を除去したヘパ
リン化末梢血から取得した。顆粒球／赤血球ペレットを
３％デクストラン上で沈降させて赤血球の大部分を除去
した。残留赤血球は、必要により、低張食塩水で溶解さ
せた。顆粒球の純度は、ウェイト−ギームザ染色で求め
るとき、９５％以上であった。フィコール−ハイパック
分離後の単核層からヒトＴ細胞を調製した。これらの細
胞から、ナイロン−羊毛カラムを通すことによってＢ細
胞および単球を除いた。得られた細胞は、市販のモノク
ローナル試薬を用いてのフローサイトメトリーで求めた
ところ、ＭｏｌまたはＢ１陽性細胞含量５％未満であっ
た。正常ヒト表皮ケラチノサイトはクローネティック社
から入手した；繊維芽細胞はヒト包皮組織からの外植に
よって得、ヒト血小板は、正常供血者の酸−クエン酸塩
−デキストロース抗凝固性化血から得た。血小板は数回
洗い、１％ＢＳＡ含有Ｃａ++不含ＰＢＳに再懸濁した。
臍帯を、ジャッフェ（Ｊaffe）（ジャーナル・オヴ・ク
リニカル・インヴェスティゲイション、５２巻２７４５
〜２７５６頁、１９７３年）の操作法に従い、これを若
干改良して、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を得
た。要約すると、細胞をコラゲナーゼ処理によって血管
壁からはがし、ゼラチン被覆組織培養フラスコを用い、
下記の培地中で培養した。ワイベル−パラド体の存在お
よび生細胞によるアセチル化低密度リポ蛋白質の取込み
によって、細胞が９５％以上内皮細胞であることを確認
した。細胞を、２０％の低内毒素ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ、ハイクローン）、９０μｇ／mlの保存剤不含ブタヘ
パリン、２０μｇ／mlの内皮細胞成長用補足物（ＥＣＧ
Ｓ）（コラボラティヴ・リサーチから入手）、グルタミ
ンおよび抗生物質を含有するＭ１９９培地（以下「生育
培地」）中で培養した。ウシ視床下部から冷却ブレンダ
ー中での食塩水抽出、４℃での２時間撹拌および不溶物
除去のための１４０００ｇまでの遠心分離によってＥＣ
ＧＳを調製した。脂質の除去および０．４５ミクロンフ
ィルターでの濾過ののち、アリコートを凍結乾燥した。
ヒト顆粒球を、フィコール−ハイパック（FICOLL−HYPA
QUE)を用いての遠心分離により単核細胞を除去したヘパ
リン化末梢血から取得した。顆粒球／赤血球ペレットを
３％デクストラン上で沈降させて赤血球の大部分を除去
した。残留赤血球は、必要により、低張食塩水で溶解さ
せた。顆粒球の純度は、ウェイト−ギームザ染色で求め
るとき、９５％以上であった。フィコール−ハイパック
分離後の単核層からヒトＴ細胞を調製した。これらの細
胞から、ナイロン−羊毛カラムを通すことによってＢ細
胞および単球を除いた。得られた細胞は、市販のモノク
ローナル試薬を用いてのフローサイトメトリーで求めた
ところ、ＭｏｌまたはＢ１陽性細胞含量５％未満であっ
た。正常ヒト表皮ケラチノサイトはクローネティック社
から入手した；繊維芽細胞はヒト包皮組織からの外植に
よって得、ヒト血小板は、正常供血者の酸−クエン酸塩
−デキストロース抗凝固性化血から得た。血小板は数回
洗い、１％ＢＳＡ含有Ｃａ++不含ＰＢＳに再懸濁した。
【０１８４】(B) ハイブリドーマ産生：８週令の雌性Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに、３×１０6 個のＩＬ−１（４時
間）活性化ＨＵＶＥＣを１０日間おきに４回、腹腔内注
射した。最後の注射は融合の３〜４日前とした。脾臓を
無菌的に摘出し、注射器のプランジャーで細かくほぐ
し、洗い、融合相手のＳＰ２／０細胞〔ファゼカス・デ
・セント・グロス（Ｆaxekas de Ｓt.Ｇroth）、Ｓ．と
シャイデッガー（Ｓcheidegger）、Ｄ．、ジャーナル・
オヴ・インムノロジカル・メソッズ、３５巻１〜２１
頁、１９８０年〕と５：１の割合で混合した。これら細
胞を、前述〔コーラー、Ｇ．とミルステイン、Ｃ．、ネ
イチャー、２５６巻４９５〜４９７頁、１９７５年〕の
ように、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、フ
ィーダー層としてＢＡＬＢ／ｃマウスからの内在腹膜滲
出液細胞を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに
植えた。やはり９６ウェルプレート中の休止またはＩＬ
−１活性化（１ng／mlのＩＬ−１の添加により４時間活
性化）ＨＵＶＥＣのコルフルエントな単層上で、スクリ
ーニングを行った。培養上澄みを単層のＨＵＶＥＣと４
℃で６０分間反応させたのち、細胞を洗い、ビオチニル
化ヤギ抗マウス軽鎖抗体と共に４℃で３０分間インキュ
ベートした。さらに３回洗ったのち、細胞を、ウェル当
り０．３μＣｉの 125Ｉ−ストレプトアビジンと共に４
℃で１５分間インキュベートした。最後に洗ったのち、
細胞を、１％トライトンＸ−１００洗剤溶液で溶解さ
せ、アリコートをガンマーカウンターで計測した。ハイ
ブリドーマを、ＩＬ−１処理ＨＵＶＥＣとのみ反応し、
無処理ＨＵＶＥＣとは反応しない抗体を分泌する能力に
基いて、選択した。
ＡＬＢ／ｃマウスに、３×１０6 個のＩＬ−１（４時
間）活性化ＨＵＶＥＣを１０日間おきに４回、腹腔内注
射した。最後の注射は融合の３〜４日前とした。脾臓を
無菌的に摘出し、注射器のプランジャーで細かくほぐ
し、洗い、融合相手のＳＰ２／０細胞〔ファゼカス・デ
・セント・グロス（Ｆaxekas de Ｓt.Ｇroth）、Ｓ．と
シャイデッガー（Ｓcheidegger）、Ｄ．、ジャーナル・
オヴ・インムノロジカル・メソッズ、３５巻１〜２１
頁、１９８０年〕と５：１の割合で混合した。これら細
胞を、前述〔コーラー、Ｇ．とミルステイン、Ｃ．、ネ
イチャー、２５６巻４９５〜４９７頁、１９７５年〕の
ように、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、フ
ィーダー層としてＢＡＬＢ／ｃマウスからの内在腹膜滲
出液細胞を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに
植えた。やはり９６ウェルプレート中の休止またはＩＬ
−１活性化（１ng／mlのＩＬ−１の添加により４時間活
性化）ＨＵＶＥＣのコルフルエントな単層上で、スクリ
ーニングを行った。培養上澄みを単層のＨＵＶＥＣと４
℃で６０分間反応させたのち、細胞を洗い、ビオチニル
化ヤギ抗マウス軽鎖抗体と共に４℃で３０分間インキュ
ベートした。さらに３回洗ったのち、細胞を、ウェル当
り０．３μＣｉの 125Ｉ−ストレプトアビジンと共に４
℃で１５分間インキュベートした。最後に洗ったのち、
細胞を、１％トライトンＸ−１００洗剤溶液で溶解さ
せ、アリコートをガンマーカウンターで計測した。ハイ
ブリドーマを、ＩＬ−１処理ＨＵＶＥＣとのみ反応し、
無処理ＨＵＶＥＣとは反応しない抗体を分泌する能力に
基いて、選択した。
【０１８５】この方法により、所望のモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマ細胞株５株を得た。これら
のハイブリドーマ細胞株およびそれらが生産するモノク
ローナル抗体を１Ｅ７、２Ｇ７、３Ａ２、７Ａ９および
３Ｂ７と名付けた。それらハイブリドーマは、メリーラ
ンド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託されていて、寄託番号はそれぞれ
ＨＢ１０１３６、ＨＢ１０１３７、ＨＢ１０１３８、Ｈ
Ｂ１０１３５およびＨＢ１０３９１である。
体を生産するハイブリドーマ細胞株５株を得た。これら
のハイブリドーマ細胞株およびそれらが生産するモノク
ローナル抗体を１Ｅ７、２Ｇ７、３Ａ２、７Ａ９および
３Ｂ７と名付けた。それらハイブリドーマは、メリーラ
ンド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託されていて、寄託番号はそれぞれ
ＨＢ１０１３６、ＨＢ１０１３７、ＨＢ１０１３８、Ｈ
Ｂ１０１３５およびＨＢ１０３９１である。
【０１８６】さらに、上記のプロトコールを、１３回に
わたり、合計７１枚のマイクロタイタープレートのハイ
ブリドーマ候補について実施した。最初の融合で、１Ｅ
７ハイブリドーマ細胞株を得た。８回目の融合で、２Ｇ
７および３Ａ２ハイブリドーマ細胞株を得た。７Ａ９ハ
イブリドーマ細胞株は１０回目の、３Ｂ７ハイブリドー
マ細胞株は１３回目の融合で得られた。それゆえ、１３
回の実験のうち２回が、発明の詳細な説明に記載の(A)
群モノクローナル抗体の所望の特性を持つモノクローナ
ル抗体（１Ｅ７および２Ｇ７）を与えた；１３実験のう
ちの１回が、詳細な説明に記載した(B) 群モノクローナ
ル抗体の望ましい特性をもつモノクローナル抗体（３Ａ
２）を与えた；１３実験のうちの２回が、詳細な説明に
記載した(C) 群モノクローナル抗体の所望特性をもつモ
ノクローナル抗体（７Ａ９および３Ｂ７）を与えた。こ
れは、当業者にとっては不適当な実験ではなく、この実
験操作において決定的に重要な段階が欠けているという
こともない。かくして、上記および発明の詳細な説明に
記載した(A) 、(B) および(C) 群モノクローナル抗体製
造法は、再現性のある方法である。
わたり、合計７１枚のマイクロタイタープレートのハイ
ブリドーマ候補について実施した。最初の融合で、１Ｅ
７ハイブリドーマ細胞株を得た。８回目の融合で、２Ｇ
７および３Ａ２ハイブリドーマ細胞株を得た。７Ａ９ハ
イブリドーマ細胞株は１０回目の、３Ｂ７ハイブリドー
マ細胞株は１３回目の融合で得られた。それゆえ、１３
回の実験のうち２回が、発明の詳細な説明に記載の(A)
群モノクローナル抗体の所望の特性を持つモノクローナ
ル抗体（１Ｅ７および２Ｇ７）を与えた；１３実験のう
ちの１回が、詳細な説明に記載した(B) 群モノクローナ
ル抗体の望ましい特性をもつモノクローナル抗体（３Ａ
２）を与えた；１３実験のうちの２回が、詳細な説明に
記載した(C) 群モノクローナル抗体の所望特性をもつモ
ノクローナル抗体（７Ａ９および３Ｂ７）を与えた。こ
れは、当業者にとっては不適当な実験ではなく、この実
験操作において決定的に重要な段階が欠けているという
こともない。かくして、上記および発明の詳細な説明に
記載した(A) 、(B) および(C) 群モノクローナル抗体製
造法は、再現性のある方法である。
【０１８７】特に断わらない限り、以下の実施例で使用
したモノクローナル抗体は全て、ＤＥＡＥイオン交換カ
ラムでのＨＰＬＣまたはＡ蛋白−セファロースでのアフ
ィニティクロマトグラフィーにより、常法に従って精製
したものである。
したモノクローナル抗体は全て、ＤＥＡＥイオン交換カ
ラムでのＨＰＬＣまたはＡ蛋白−セファロースでのアフ
ィニティクロマトグラフィーにより、常法に従って精製
したものである。
【０１８８】実施例２ モノクローナル抗体１Ｅ７、２Ｇ７、３Ａ２、７Ａ９お
よび３Ｂ７の特性 (A) アイソタイプの決定：インディアナ州インディアナ
ポリスのベーリンガー・マンハイムから入手した、必要
な試薬を全て含んでいるキット「スクリーンタイプ」を
用いて、アイソタイプを決定した。アイソタイプ決定
は、メーカーの指示に従って実施した。
よび３Ｂ７の特性 (A) アイソタイプの決定：インディアナ州インディアナ
ポリスのベーリンガー・マンハイムから入手した、必要
な試薬を全て含んでいるキット「スクリーンタイプ」を
用いて、アイソタイプを決定した。アイソタイプ決定
は、メーカーの指示に従って実施した。
【０１８９】結果を第１表にまとめたが、次の通りであ
った：１Ｅ７−１ｇＧ２ａ；２Ｇ７−ＩｇＧ１；３Ａ２
−ＩｇＭ；７Ａ９−ＩｇＧ１；３Ｂ７−ＩｇＧ２ａ。
った：１Ｅ７−１ｇＧ２ａ；２Ｇ７−ＩｇＧ１；３Ａ２
−ＩｇＭ；７Ａ９−ＩｇＧ１；３Ｂ７−ＩｇＧ２ａ。
【０１９０】(B-1) 休止またはＩＬ−１活性化内皮細胞
へのモノクローナル抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７Ａ９および
３Ｂ７の結合：抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ
７は、実施例１記載のようにして、ＩＬ−１処理対未処
理ＨＵＶＥＣを用いたプレート結合アッセイで見出され
たものである。それらの対照またはＩＬ−１内皮細胞と
の反応性を、下記のように、フローサイトメトリーによ
って解析し、抗ＨＬＡモノクローナル抗体Ｗ６／３２お
よびＩＣＡＭ−１に対する抗体ＲＲ／１と比較した。抗
体は全て、予備実験で求めた飽和用量で使用した。
へのモノクローナル抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７Ａ９および
３Ｂ７の結合：抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ
７は、実施例１記載のようにして、ＩＬ−１処理対未処
理ＨＵＶＥＣを用いたプレート結合アッセイで見出され
たものである。それらの対照またはＩＬ−１内皮細胞と
の反応性を、下記のように、フローサイトメトリーによ
って解析し、抗ＨＬＡモノクローナル抗体Ｗ６／３２お
よびＩＣＡＭ−１に対する抗体ＲＲ／１と比較した。抗
体は全て、予備実験で求めた飽和用量で使用した。
【０１９１】要約すると、ＩＬ−１で４時間活性化した
内皮細胞をマイクロタイターウェル中０．１〜１０μｇ
／mlの濃度の抗体で処理し、洗い、つぎにＦＩＴＣ−ヤ
ギ抗マウス間接試薬と共にインキュベートした。細胞を
フローサイトメトリーによって解析し、極大蛍光が得ら
れる最小用量を飽和用量とした。
内皮細胞をマイクロタイターウェル中０．１〜１０μｇ
／mlの濃度の抗体で処理し、洗い、つぎにＦＩＴＣ−ヤ
ギ抗マウス間接試薬と共にインキュベートした。細胞を
フローサイトメトリーによって解析し、極大蛍光が得ら
れる最小用量を飽和用量とした。
【０１９２】フローサイトメトリーは次のように行っ
た：内皮細胞を培養器から２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ
を用いて３７℃で５分間かけてはがした。脱着細胞を、
冷却した１％放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）用ＢＳＡおよ
び０．０２％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡを用いておだやかにピペッティングして、単個細胞
懸濁液をつくった。丸底９６ウェルプレートを用い、５
０万個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０．０２％ナトリウ
ムアジド含有ＰＢＳ（洗浄緩衝液）中に飽和用量のモノ
クローナル抗体を含有する１００μｌ中で、インキュベ
ートした。４℃で３０分間のインキュベーションのの
ち、細胞を３回洗い、１．５μｇ／mlのＦＩＴＣ−ヤギ
抗マウス試薬（ジャクソン・インノリサーチ・ラボラト
リーズ）を含有する洗浄緩衝液１００μｌ中でインキュ
ベートした。対照として、細胞を第２段階の試薬のみと
インキュベートした。さらに４℃で３０分間のインキュ
ベーションののち、細胞を３回洗い、再懸濁して分析に
付した。実際には、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス試薬を用い
て、蛍光のバックグランウドレベルを見積る。ＦＩＴＣ
−アビジンのみで処理された細胞の９５％を含むように
カットオフ点を定める。特定のリガンド結合ののちに蛍
光強度増大方向へシフトした細胞の割合によって、陽性
細胞のパーセントが定まる。フローサイトメトリーは、
アルゴンレーザーおよび石英フローセルを備えたコール
ター５４１型で実施した。
た：内皮細胞を培養器から２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ
を用いて３７℃で５分間かけてはがした。脱着細胞を、
冷却した１％放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）用ＢＳＡおよ
び０．０２％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡを用いておだやかにピペッティングして、単個細胞
懸濁液をつくった。丸底９６ウェルプレートを用い、５
０万個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０．０２％ナトリウ
ムアジド含有ＰＢＳ（洗浄緩衝液）中に飽和用量のモノ
クローナル抗体を含有する１００μｌ中で、インキュベ
ートした。４℃で３０分間のインキュベーションのの
ち、細胞を３回洗い、１．５μｇ／mlのＦＩＴＣ−ヤギ
抗マウス試薬（ジャクソン・インノリサーチ・ラボラト
リーズ）を含有する洗浄緩衝液１００μｌ中でインキュ
ベートした。対照として、細胞を第２段階の試薬のみと
インキュベートした。さらに４℃で３０分間のインキュ
ベーションののち、細胞を３回洗い、再懸濁して分析に
付した。実際には、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス試薬を用い
て、蛍光のバックグランウドレベルを見積る。ＦＩＴＣ
−アビジンのみで処理された細胞の９５％を含むように
カットオフ点を定める。特定のリガンド結合ののちに蛍
光強度増大方向へシフトした細胞の割合によって、陽性
細胞のパーセントが定まる。フローサイトメトリーは、
アルゴンレーザーおよび石英フローセルを備えたコール
ター５４１型で実施した。
【０１９３】結果を第２表に示すが、そこでは、上記Ｆ
ＩＴＣ−ヤギ抗マウス（ＦＧａＭ）試薬（Fig ２Ａ
１）またはＷ６／３２抗ＨＬＡプラスＧａＭ（Fig ２Ａ
２）あるいはモノクローナル抗体１Ｅ７（Fig ２
Ｂ）、２Ｇ７（Fig ２Ｃ）、７Ａ９（Fig ２Ｄ）、３Ｂ
７（Fig ２Ｅ）またはＲＲ１（ＩＣＡＭ−１）（Fig ２
Ｆ）に続いてＦＧａＭで染色された脱着細胞が示されて
いる。試薬は全て飽和用量で使用した。各ヒストグラム
は２５０００細胞の分析結果を示す。横軸の各２５チャ
ンネル当り、蛍光強度ａ．ｕ．＝任意単位がほぼ２倍に
なる。任意単位で表わした細胞数が縦軸に表わされてい
る。誘起なし（…）、ＩＬ−１誘起（−）ＨＵＶＥＣ。
ＩＴＣ−ヤギ抗マウス（ＦＧａＭ）試薬（Fig ２Ａ
１）またはＷ６／３２抗ＨＬＡプラスＧａＭ（Fig ２Ａ
２）あるいはモノクローナル抗体１Ｅ７（Fig ２
Ｂ）、２Ｇ７（Fig ２Ｃ）、７Ａ９（Fig ２Ｄ）、３Ｂ
７（Fig ２Ｅ）またはＲＲ１（ＩＣＡＭ−１）（Fig ２
Ｆ）に続いてＦＧａＭで染色された脱着細胞が示されて
いる。試薬は全て飽和用量で使用した。各ヒストグラム
は２５０００細胞の分析結果を示す。横軸の各２５チャ
ンネル当り、蛍光強度ａ．ｕ．＝任意単位がほぼ２倍に
なる。任意単位で表わした細胞数が縦軸に表わされてい
る。誘起なし（…）、ＩＬ−１誘起（−）ＨＵＶＥＣ。
【０１９４】Fig ２は、刺激しなかったＨＵＶＥＣ上に
ＩＣＡＭ−１蛋白質が存在し、先に報告されているよう
に（ダスティンとスプリンガー、ジャーナル・オヴ・セ
ルラー・バイオロジー、１０７巻３２１〜３３１頁、１
９８８年）、ＩＬ−１刺激後に約８倍に増加するが、Ｉ
Ｌ−１刺激後にはＨＡＬ蛋白質は増加しないことを示し
ている。しかし、アッセイした４種の新規抗体のいずれ
もが無刺激細胞上には検出できず、刺激ＨＵＶＥＣ母集
団内では弱いないし強い陽性の不均一な抗原分布を示し
ている。これらの抗原はいずれも、それらの極大蛍光強
度において、ほぼチャンネル１５０のところに平均蛍光
強度をもつＨＬＡ蛋白質（Fig ２Ａ ２）に量的に匹敵
している。ＨＵＶＥＣのこれら活性化抗原の発現の不均
質のため、意味のあるスキャッチャードの細胞当り部位
数の分析はできなかった。この不均一性は、カバースト
ップ上の単層中の細胞を調べたときにも確認され、ＩＬ
−１曝露の時間または用量には影響されなかった（デー
タは示されていない）。
ＩＣＡＭ−１蛋白質が存在し、先に報告されているよう
に（ダスティンとスプリンガー、ジャーナル・オヴ・セ
ルラー・バイオロジー、１０７巻３２１〜３３１頁、１
９８８年）、ＩＬ−１刺激後に約８倍に増加するが、Ｉ
Ｌ−１刺激後にはＨＡＬ蛋白質は増加しないことを示し
ている。しかし、アッセイした４種の新規抗体のいずれ
もが無刺激細胞上には検出できず、刺激ＨＵＶＥＣ母集
団内では弱いないし強い陽性の不均一な抗原分布を示し
ている。これらの抗原はいずれも、それらの極大蛍光強
度において、ほぼチャンネル１５０のところに平均蛍光
強度をもつＨＬＡ蛋白質（Fig ２Ａ ２）に量的に匹敵
している。ＨＵＶＥＣのこれら活性化抗原の発現の不均
質のため、意味のあるスキャッチャードの細胞当り部位
数の分析はできなかった。この不均一性は、カバースト
ップ上の単層中の細胞を調べたときにも確認され、ＩＬ
−１曝露の時間または用量には影響されなかった（デー
タは示されていない）。
【０１９５】(B-2) １Ｅ７／２Ｇ７ ｃＤＮＡでトラン
スフェクトされたＣＯＳ細胞へのモノクローナル抗体１
Ｅ７、２Ｇ７および３Ｂ７の結合：実施例５記載のよう
に調製された、１Ｅ７／２Ｇ７ ｃＤＮＡ形質転換又は
模擬形質転換ＣＯＳ細胞を用いて結合を実施した。ＣＯ
Ｓ細胞（２×１０4 ／ウェル）を、アッセイの２４時間
前、トランスフェクションの４８時間後に、９６ウェル
平底マイクロタイタープレートに植えた。細胞を、培地
のみと（対照）またはそれぞれ５μｇ／mlの各モノクロ
ーナル抗体と、４℃で６０分間インキュベートした。３
回洗ったのち、細胞をビオチニル化ヤギ抗マウス抗体と
共に４℃で３０分間インキュベートした。３回洗ったの
ち、細胞を、ウェル当り０．３μｌの125Ｉ−ストレプ
トアビジンと共に、４℃で１５分間インキュベートし
た。最後に洗浄後、１％トライトンＸ−１００で細胞を
溶解し、アリコートをガンマーカウンターで計測した。
スフェクトされたＣＯＳ細胞へのモノクローナル抗体１
Ｅ７、２Ｇ７および３Ｂ７の結合：実施例５記載のよう
に調製された、１Ｅ７／２Ｇ７ ｃＤＮＡ形質転換又は
模擬形質転換ＣＯＳ細胞を用いて結合を実施した。ＣＯ
Ｓ細胞（２×１０4 ／ウェル）を、アッセイの２４時間
前、トランスフェクションの４８時間後に、９６ウェル
平底マイクロタイタープレートに植えた。細胞を、培地
のみと（対照）またはそれぞれ５μｇ／mlの各モノクロ
ーナル抗体と、４℃で６０分間インキュベートした。３
回洗ったのち、細胞をビオチニル化ヤギ抗マウス抗体と
共に４℃で３０分間インキュベートした。３回洗ったの
ち、細胞を、ウェル当り０．３μｌの125Ｉ−ストレプ
トアビジンと共に、４℃で１５分間インキュベートし
た。最後に洗浄後、１％トライトンＸ−１００で細胞を
溶解し、アリコートをガンマーカウンターで計測した。
【０１９６】結果をFig ３に示す。Fig ３は、モノクロ
ーナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７は、１Ｅ７／２Ｇ７ ｃ
ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合する
が、３Ｂ７（抗ＥＬＡＭ−１）は結合しないことを示し
ている。
ーナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７は、１Ｅ７／２Ｇ７ ｃ
ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合する
が、３Ｂ７（抗ＥＬＡＭ−１）は結合しないことを示し
ている。
【０１９７】(C) モノクローナル抗体のブロッキング活
性：廃棄臍帯から内皮細胞を実施例１記載のようにして
採取し、培養した。細胞は急速に増殖し、恐らくはイン
ビトロ生育条件の結果としてそれらを区別する性質が減
退するまでに、６回まで他のフラスコに分割（継代）し
た。２回目の植継ぎにより、ブロッキングアッセイを行
うのに十分な細胞が得られていた。組換えヒトＩＬ−１
ベータを、濃度１ng／mlとなるように細胞に加え、通例
通り細胞を６％ＣＯ2 、９４％空気を含有する加湿培養
室中に維持しながら４〜６時間培養した。対照は、ＩＬ
−１不存在下に内皮細胞を培養することからなってい
た。培養期間後、細胞を培地で洗って使われなかったＩ
Ｌ−１を除き、それぞれのモノクローナル抗体を０．０
０１６〜１０μｇ／mlの範囲内の濃度で加え、３７℃に
１時間保った。常法で得たモノクローナル抗体２Ｇ７の
Ｆ（ａｂ′）2 断片もこのアッセイに使用した。結合を
調べんとする細胞を３０〜６０分間上にのせて付着させ
た。使用した細胞は、ヒト単球、顆粒球、またはＴ細
胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる単核細胞混合物であ
った。これらの細胞は当業界で既知の方法により単離、
精製した。非付着性細胞を生育培地で洗い落し、無処理
またはＩＬ−１処理内皮細胞（ＥＣ）に結合された細胞
の数の差を観測した。
性：廃棄臍帯から内皮細胞を実施例１記載のようにして
採取し、培養した。細胞は急速に増殖し、恐らくはイン
ビトロ生育条件の結果としてそれらを区別する性質が減
退するまでに、６回まで他のフラスコに分割（継代）し
た。２回目の植継ぎにより、ブロッキングアッセイを行
うのに十分な細胞が得られていた。組換えヒトＩＬ−１
ベータを、濃度１ng／mlとなるように細胞に加え、通例
通り細胞を６％ＣＯ2 、９４％空気を含有する加湿培養
室中に維持しながら４〜６時間培養した。対照は、ＩＬ
−１不存在下に内皮細胞を培養することからなってい
た。培養期間後、細胞を培地で洗って使われなかったＩ
Ｌ−１を除き、それぞれのモノクローナル抗体を０．０
０１６〜１０μｇ／mlの範囲内の濃度で加え、３７℃に
１時間保った。常法で得たモノクローナル抗体２Ｇ７の
Ｆ（ａｂ′）2 断片もこのアッセイに使用した。結合を
調べんとする細胞を３０〜６０分間上にのせて付着させ
た。使用した細胞は、ヒト単球、顆粒球、またはＴ細
胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる単核細胞混合物であ
った。これらの細胞は当業界で既知の方法により単離、
精製した。非付着性細胞を生育培地で洗い落し、無処理
またはＩＬ−１処理内皮細胞（ＥＣ）に結合された細胞
の数の差を観測した。
【０１９８】このアッセイを、放射性トレーサー、たと
えば51Ｃｒを当業界で既知の方法によって結合研究対象
細胞の細胞質内へ導入し、細胞外のカウントを洗い除
き、これらの標識細胞をＥＣの単層上に置いた。この目
的で用いた51Ｃｒ標識は、３０〜６０分間の結合アッセ
イの間に極小の漏出しか示さなかった。洗って非付着性
細胞を除去したのち、単層を洗剤で可溶化した。各ウェ
ルからカウントされた放射能を結合細胞数の尺度とし
た。
えば51Ｃｒを当業界で既知の方法によって結合研究対象
細胞の細胞質内へ導入し、細胞外のカウントを洗い除
き、これらの標識細胞をＥＣの単層上に置いた。この目
的で用いた51Ｃｒ標識は、３０〜６０分間の結合アッセ
イの間に極小の漏出しか示さなかった。洗って非付着性
細胞を除去したのち、単層を洗剤で可溶化した。各ウェ
ルからカウントされた放射能を結合細胞数の尺度とし
た。
【０１９９】モノクローナル抗体２Ｇ７のＦ（ａｂ′）
2 断片の種々用量および１０μｇ／mlのモノクローナル
抗体１Ｅ７による単核細胞結合の阻害を示す結果をFig
４に示す。それらの結果は、ＩＬ−１活性化内皮細胞の
前処理に使用するとき、モノクローナル抗体２Ｇ７は、
ヒト単核細胞の内皮細胞への結合の用量依存的部分阻害
を惹起するが、モノクローナル抗体１Ｅ７はそうでない
ことを示している。モノクローナル抗体７Ａ９のＦ（ａ
ｂ′）2 断片も、表１に示すように、用量依存的細胞阻
害を示した。
2 断片の種々用量および１０μｇ／mlのモノクローナル
抗体１Ｅ７による単核細胞結合の阻害を示す結果をFig
４に示す。それらの結果は、ＩＬ−１活性化内皮細胞の
前処理に使用するとき、モノクローナル抗体２Ｇ７は、
ヒト単核細胞の内皮細胞への結合の用量依存的部分阻害
を惹起するが、モノクローナル抗体１Ｅ７はそうでない
ことを示している。モノクローナル抗体７Ａ９のＦ（ａ
ｂ′）2 断片も、表１に示すように、用量依存的細胞阻
害を示した。
【０２００】試験した４種のモノクローナル抗体全てに
ついての結果を表１にまとめた。
ついての結果を表１にまとめた。
【０２０１】
【表１】
【０２０２】表１は、本発明のモノクローナル抗体の性
質を公表されている極めて近い抗体の性質と比較してい
る。Ｈ４／１８は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に対して報告
された最初の抗体である（ポーバーら、ジャーナル・オ
ヴ・イムノロジー、１３６巻１６８０〜１６８７頁、１
９８６年）。Ｈ１８／７は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に対
して生じるモノクローナル抗体で、ＩＬ−１刺激内皮細
胞への顆粒球の付着を部分的にブロックする（ベヴィラ
クアら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・
アカデミー、オヴ・サイエンシズ、８４巻 ９２３８〜
９２４１頁、１９８７年）。Ｓ１２は、活性血小板に結
合するモノクローナル抗体で、本発明のモノクローナル
抗体３Ａ２に最も近いと考えられる〔マッケヴァー（Ｍ
ｃＥver)とマーティン（Ｍartin)、ジャーナル・オヴ・
バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻９７９９〜９
８０４頁、１９８４年〕。しかし、予想外なことに、モ
ノクローナル抗体３Ａ２はＩｇＭのアイソタイプをも
ち、一方Ｓ１２のアイソタイプはＩｇＧ１である。Ｉｇ
Ｍというアイソタイプは、モノクローナル抗体としては
若干異例である。ＫＣ４は、抗血小板モノクローナル抗
体である〔スー−リン（Ｈsu−Ｌin）ら、ジャーナル・
オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻，９１
２１〜９１２６頁、１９８４年〕。既発表のモノクロー
ナル抗体のうち、ＫＣ４は、本発明のモノクローナル抗
体３Ａ２の特異性に最も近い特異性をもつ。しかし、モ
ノクローナル抗体ＫＣ４のアイソタイプはＩｇＧ１であ
るが、モノクローナル抗体３Ａ２は予想外のアイソタイ
プＩｇＭをもつ。４Ｄ１０は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に
対して特異性をもつラットモノクローナル抗体である
（ゲルトら、エクスペリメンタル・セル・バイオロジ
ー、５５巻１１７〜１２６頁、１９８７年）。モノクロ
ーナル抗体４Ｄ１０は、本発明のモノクローナル抗体と
は明白な関係を持ってはいない。しかし、モノクローナ
ル抗体４Ｄ１０が結合する抗原が、モノクローナル抗体
７Ａ９が結合する抗原と分子量において極めて近い。
質を公表されている極めて近い抗体の性質と比較してい
る。Ｈ４／１８は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に対して報告
された最初の抗体である（ポーバーら、ジャーナル・オ
ヴ・イムノロジー、１３６巻１６８０〜１６８７頁、１
９８６年）。Ｈ１８／７は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に対
して生じるモノクローナル抗体で、ＩＬ−１刺激内皮細
胞への顆粒球の付着を部分的にブロックする（ベヴィラ
クアら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・
アカデミー、オヴ・サイエンシズ、８４巻 ９２３８〜
９２４１頁、１９８７年）。Ｓ１２は、活性血小板に結
合するモノクローナル抗体で、本発明のモノクローナル
抗体３Ａ２に最も近いと考えられる〔マッケヴァー（Ｍ
ｃＥver)とマーティン（Ｍartin)、ジャーナル・オヴ・
バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻９７９９〜９
８０４頁、１９８４年〕。しかし、予想外なことに、モ
ノクローナル抗体３Ａ２はＩｇＭのアイソタイプをも
ち、一方Ｓ１２のアイソタイプはＩｇＧ１である。Ｉｇ
Ｍというアイソタイプは、モノクローナル抗体としては
若干異例である。ＫＣ４は、抗血小板モノクローナル抗
体である〔スー−リン（Ｈsu−Ｌin）ら、ジャーナル・
オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻，９１
２１〜９１２６頁、１９８４年〕。既発表のモノクロー
ナル抗体のうち、ＫＣ４は、本発明のモノクローナル抗
体３Ａ２の特異性に最も近い特異性をもつ。しかし、モ
ノクローナル抗体ＫＣ４のアイソタイプはＩｇＧ１であ
るが、モノクローナル抗体３Ａ２は予想外のアイソタイ
プＩｇＭをもつ。４Ｄ１０は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に
対して特異性をもつラットモノクローナル抗体である
（ゲルトら、エクスペリメンタル・セル・バイオロジ
ー、５５巻１１７〜１２６頁、１９８７年）。モノクロ
ーナル抗体４Ｄ１０は、本発明のモノクローナル抗体と
は明白な関係を持ってはいない。しかし、モノクローナ
ル抗体４Ｄ１０が結合する抗原が、モノクローナル抗体
７Ａ９が結合する抗原と分子量において極めて近い。
【０２０３】表１の比較は、本発明のモノクローナル抗
体が、公表されている近似のモノクローナル抗体と比較
して、予想外の性質をもつことを明らかにしている。
体が、公表されている近似のモノクローナル抗体と比較
して、予想外の性質をもつことを明らかにしている。
【０２０４】(D) 顆粒球結合の阻害：ＩＬ−１活性化Ｈ
ＵＶＥＣへの未刺激顆粒球の付着における２種の蛋白質
１Ｅ７／２Ｇ７および３Ｂ７／７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）
の４つのエピトープの相対的重要性を、次のようにして
調べた。
ＵＶＥＣへの未刺激顆粒球の付着における２種の蛋白質
１Ｅ７／２Ｇ７および３Ｂ７／７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）
の４つのエピトープの相対的重要性を、次のようにして
調べた。
【０２０５】第４代またはそれ未満のＨＵＶＥＣをゼラ
チンをプレコートした２４ウエルプレートに植え、４８
時間またはコンフルエントになるまで培養した。細胞培
養を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で１ng／
mlのＩＬ−１に曝露するか、または、細胞をＲＰＭＩ−
１６４０プラス１０％ＦＣＳ（洗浄培地）のみで培養し
た。３７℃で４時間のＩＬ−１曝露ののち、培養を洗浄
培地で１回洗った。この時点で単層を、洗浄培地で希釈
した抗体のＦ（ab')2 断片と共に３７℃で３０分間イン
キュベートした。（予備実験の結果、ＨＵＶＥＣと顆粒
球が後者のＦＣＳレセプターを介して架橋するのを避け
るためにＦ（ab')2 断片を使用することの必要性が判明
していた。）対照ウエルは、洗浄培地のみまたは１０μ
ｇ／mlの精製骨髄腫蛋白質ＭＯＰＣ−２１を含有してい
た。全ての実験を３回ずつ行った。単層を、抗体の存在
下に、０．５ml中の51Ｃｒ標識顆粒球約１０6 個と重ね
た。３７℃で４５分後、単層を、室温で洗浄培地により
２回静かに洗った。残った付着性顆粒球を、１％トライ
トンＸ−１００のＰＢＳ溶液３００μｌにより溶解させ
た。この半量（１５０μｌ）をガンマーカウンターで計
算した。モノクローナル抗体による顆粒球結合阻害百分
率を次のように計算した：［（実験−基礎ｃｐｍ）÷
（ＩＬ−１誘発ｃｐｍ−基礎ｃｐｍ）］×１００。ＩＬ
−１−基礎の値は、誘発可能な結合度を表わす。１０6
個の洗った顆粒球によって取込まれる51Ｃｒ量を用い
て、データをｃｐｍ／ウエルから結合細胞数／ウエルに
換算した。溶解に先立って常に単層を点検して、ＨＵＶ
ＥＣの脱離が起っていないことを確認した。
チンをプレコートした２４ウエルプレートに植え、４８
時間またはコンフルエントになるまで培養した。細胞培
養を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で１ng／
mlのＩＬ−１に曝露するか、または、細胞をＲＰＭＩ−
１６４０プラス１０％ＦＣＳ（洗浄培地）のみで培養し
た。３７℃で４時間のＩＬ−１曝露ののち、培養を洗浄
培地で１回洗った。この時点で単層を、洗浄培地で希釈
した抗体のＦ（ab')2 断片と共に３７℃で３０分間イン
キュベートした。（予備実験の結果、ＨＵＶＥＣと顆粒
球が後者のＦＣＳレセプターを介して架橋するのを避け
るためにＦ（ab')2 断片を使用することの必要性が判明
していた。）対照ウエルは、洗浄培地のみまたは１０μ
ｇ／mlの精製骨髄腫蛋白質ＭＯＰＣ−２１を含有してい
た。全ての実験を３回ずつ行った。単層を、抗体の存在
下に、０．５ml中の51Ｃｒ標識顆粒球約１０6 個と重ね
た。３７℃で４５分後、単層を、室温で洗浄培地により
２回静かに洗った。残った付着性顆粒球を、１％トライ
トンＸ−１００のＰＢＳ溶液３００μｌにより溶解させ
た。この半量（１５０μｌ）をガンマーカウンターで計
算した。モノクローナル抗体による顆粒球結合阻害百分
率を次のように計算した：［（実験−基礎ｃｐｍ）÷
（ＩＬ−１誘発ｃｐｍ−基礎ｃｐｍ）］×１００。ＩＬ
−１−基礎の値は、誘発可能な結合度を表わす。１０6
個の洗った顆粒球によって取込まれる51Ｃｒ量を用い
て、データをｃｐｍ／ウエルから結合細胞数／ウエルに
換算した。溶解に先立って常に単層を点検して、ＨＵＶ
ＥＣの脱離が起っていないことを確認した。
【０２０６】Ｆ（ab')2 断片は、パーハム（Parham）の
方法（ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３１巻２８
９５〜２９０２頁、１９８３年）に従って調製した。ペ
プシンを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．１）中の精
製モノクローナル抗体にｗ／ｗ比１：５０で添加した。
消化は３７℃で一夜進行させた。ペプシンの除去はイオ
ン交換クロマトグラフィーによって達成した。還元性お
よび非還元性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％
アクリルアミド）により消化をモニターし、ＩＬ−１活
性化ＨＵＶＥＣの結合活性をフローサイトメトリー（上
述の通りに実施）で求めたところ、未消化抗体を用いて
得られたものと同等であることが証明された。
方法（ジャーナル・オヴ・イムノロジー、１３１巻２８
９５〜２９０２頁、１９８３年）に従って調製した。ペ
プシンを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．１）中の精
製モノクローナル抗体にｗ／ｗ比１：５０で添加した。
消化は３７℃で一夜進行させた。ペプシンの除去はイオ
ン交換クロマトグラフィーによって達成した。還元性お
よび非還元性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％
アクリルアミド）により消化をモニターし、ＩＬ−１活
性化ＨＵＶＥＣの結合活性をフローサイトメトリー（上
述の通りに実施）で求めたところ、未消化抗体を用いて
得られたものと同等であることが証明された。
【０２０７】還元的および非還元的ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を実施するための方法および試薬
は、ボニー・Ｓ・ダンバー、「二次元電気泳動および免
疫学的手法」、プレナムプレス、ニューヨーク、１９８
７年中に記載されている。
ルアミドゲル電気泳動を実施するための方法および試薬
は、ボニー・Ｓ・ダンバー、「二次元電気泳動および免
疫学的手法」、プレナムプレス、ニューヨーク、１９８
７年中に記載されている。
【０２０８】代表的な一実験の結果をFig ５に示す。結
果は、ウエル当りの結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝１３）で
表わされている。
果は、ウエル当りの結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝１３）で
表わされている。
【０２０９】結果は、抗ＥＬＡＭ−１抗体が抗体１Ｅ７
および２Ｇ７よりもより阻害的であることを示してい
る。６つの実験の結果を要約すると、試験に用いた最大
容量（１０μｇ／ml）で１Ｅ７および２Ｇ７は０％およ
び３％の顆粒球結合阻害を示したが、一方、３Ｂ７抗体
は平均８１％の、７Ａ９抗体は平均９５％の、すなわち
完全な阻害を、共に１０μｇ／mlで示した。３Ｂ７およ
び７Ａ９抗体は、ＥＬＡＭ−１の重複しないエピトープ
を規定するものであるが、それらの作用は相加的とは思
われない（データは示さない）。７Ａ９および３Ｂ７と
もに、０．４μｇ／mlという低用量で、有意の顆粒球結
合阻害が見られた。顆粒球は１Ｅ７／２Ｇ７抗原も３Ｂ
７／７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原も発現しないので（表
４）、当業者ならば、観察されたそれらの作用は内皮細
胞レベルでの抗体の作用によるものである、と結論でき
る。
および２Ｇ７よりもより阻害的であることを示してい
る。６つの実験の結果を要約すると、試験に用いた最大
容量（１０μｇ／ml）で１Ｅ７および２Ｇ７は０％およ
び３％の顆粒球結合阻害を示したが、一方、３Ｂ７抗体
は平均８１％の、７Ａ９抗体は平均９５％の、すなわち
完全な阻害を、共に１０μｇ／mlで示した。３Ｂ７およ
び７Ａ９抗体は、ＥＬＡＭ−１の重複しないエピトープ
を規定するものであるが、それらの作用は相加的とは思
われない（データは示さない）。７Ａ９および３Ｂ７と
もに、０．４μｇ／mlという低用量で、有意の顆粒球結
合阻害が見られた。顆粒球は１Ｅ７／２Ｇ７抗原も３Ｂ
７／７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原も発現しないので（表
４）、当業者ならば、観察されたそれらの作用は内皮細
胞レベルでの抗体の作用によるものである、と結論でき
る。
【０２１０】（Ｅ）Ｔ細胞結合の阻害：モノクローナル
抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ７がＩＬ−１活
性化内皮細胞へのＴ細胞の結合を阻害する能力を、顆粒
球結合阻害について述べ方法によって求めた。ただし、
顆粒球に代えてナイロン−羊毛非付着性Ｔ細胞を用い、
各ウエルに０．９×１０6 個のＴ細胞を加えた。
抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７Ａ９および３Ｂ７がＩＬ−１活
性化内皮細胞へのＴ細胞の結合を阻害する能力を、顆粒
球結合阻害について述べ方法によって求めた。ただし、
顆粒球に代えてナイロン−羊毛非付着性Ｔ細胞を用い、
各ウエルに０．９×１０6 個のＴ細胞を加えた。
【０２１１】これら４種のモノクローナル抗体について
ＩＬ−１活性化内皮細胞への無刺激、ナイロン−羊毛非
付着性Ｔ細胞の付着におけるブロック能をテストして得
られた結果を、代表的な一実験についてFig ６に示す。
Fig ６の右に示した併用実験において、各抗体の最終濃
度は１０μｇ／mlであった。表現型解析の結果は、５４
％ＣＤ４＋、３２％ＣＤ８＋、２％Ｍｏ２＋（ＣＤ１
４）および４％Ｂ１＋（ＣＤ２０）であった。結果は、
ウエル当り結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝３）として表わさ
れている。
ＩＬ−１活性化内皮細胞への無刺激、ナイロン−羊毛非
付着性Ｔ細胞の付着におけるブロック能をテストして得
られた結果を、代表的な一実験についてFig ６に示す。
Fig ６の右に示した併用実験において、各抗体の最終濃
度は１０μｇ／mlであった。表現型解析の結果は、５４
％ＣＤ４＋、３２％ＣＤ８＋、２％Ｍｏ２＋（ＣＤ１
４）および４％Ｂ１＋（ＣＤ２０）であった。結果は、
ウエル当り結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝３）として表わさ
れている。
【０２１２】Fig ６は、顆粒球の場合と同様に、１Ｅ７
抗体は試験した最大用量（１０μｇ／ml）で結合阻害を
示さないことを示している。ＭＯＰＣ−２１骨髄腫蛋白
質（ＩｇＧ１）も、別の実験で、Ｔ細胞結合阻害を示さ
なかった（データは示さない）。しかし、他の３種の抗
体の各々について、用量依存性の部分的阻害が一貫して
みられた。６実験においての平均阻害率は、２Ｇ７抗体
で３４％であり、３Ｂ７および７Ａ９抗体については、
それぞれ２１％および３７％という値が得られた。これ
らの抗体が異なる構造上の異なるエピトープを規定して
おり、４種のうちの３種が阻害性であるので、混合実験
を行った。代表的な一実験をFig ６の右方に示す。ここ
で、２種の抗ＥＬＡＭ−１抗体、３Ｂ７および７Ａ９
は、各々１０μｇ／mlで、３１％の阻害を示したが、こ
れは３Ｂ７（１９％）または７Ａ９（４０％）を用いて
個々に得られた結果を加算した値ではない。しかし、抗
ＥＬＡＭ−１抗体のいずれかを２Ｇ７抗体と組合せると
（各１０μｇ／mlで）、相加的な値が得られた。すなわ
ち、２Ｇ７プラス７Ａ９の組合せは６８％の阻害を生じ
（２Ｇ７での２９％および７Ａ９での４０％という個々
の結果に対し）、２Ｇ７プラス３Ｂ７は６６％の阻害を
示した（２Ｇ７での２９％、３Ｂ７での１９％に対
し）。これらの結果は、さらに２回の実験で確認した。
ＩＬ−１に関してFig ６で個々の抗体について見られる
阻害を比較するためのｐ値は、２Ｇ７、３Ｂ７及び７Ａ
９抗体が個々に統計上有意な阻害を与えることを示して
いる（それぞれのｐ値0.0009、0.01および0.002 ）。２
Ｇ７と３Ｂ７または７Ａ９との組合せは、それぞれ単独
の抗体よりも有意に優れている。（いずれの組合せのｐ
値も0.001 未満）。３Ｂ７プラス７Ａ９の組合せは、各
抗体単独に比して有意に優れてはいない。１Ｅ７／２Ｇ
７抗原も３Ｂ７／７Ａ９抗原も７０％がＴ細胞である末
梢血リンパ球上には存在しないので、Fig １５に示され
た作用は、内皮細胞上の抗原の役割に帰することができ
る。
抗体は試験した最大用量（１０μｇ／ml）で結合阻害を
示さないことを示している。ＭＯＰＣ−２１骨髄腫蛋白
質（ＩｇＧ１）も、別の実験で、Ｔ細胞結合阻害を示さ
なかった（データは示さない）。しかし、他の３種の抗
体の各々について、用量依存性の部分的阻害が一貫して
みられた。６実験においての平均阻害率は、２Ｇ７抗体
で３４％であり、３Ｂ７および７Ａ９抗体については、
それぞれ２１％および３７％という値が得られた。これ
らの抗体が異なる構造上の異なるエピトープを規定して
おり、４種のうちの３種が阻害性であるので、混合実験
を行った。代表的な一実験をFig ６の右方に示す。ここ
で、２種の抗ＥＬＡＭ−１抗体、３Ｂ７および７Ａ９
は、各々１０μｇ／mlで、３１％の阻害を示したが、こ
れは３Ｂ７（１９％）または７Ａ９（４０％）を用いて
個々に得られた結果を加算した値ではない。しかし、抗
ＥＬＡＭ−１抗体のいずれかを２Ｇ７抗体と組合せると
（各１０μｇ／mlで）、相加的な値が得られた。すなわ
ち、２Ｇ７プラス７Ａ９の組合せは６８％の阻害を生じ
（２Ｇ７での２９％および７Ａ９での４０％という個々
の結果に対し）、２Ｇ７プラス３Ｂ７は６６％の阻害を
示した（２Ｇ７での２９％、３Ｂ７での１９％に対
し）。これらの結果は、さらに２回の実験で確認した。
ＩＬ−１に関してFig ６で個々の抗体について見られる
阻害を比較するためのｐ値は、２Ｇ７、３Ｂ７及び７Ａ
９抗体が個々に統計上有意な阻害を与えることを示して
いる（それぞれのｐ値0.0009、0.01および0.002 ）。２
Ｇ７と３Ｂ７または７Ａ９との組合せは、それぞれ単独
の抗体よりも有意に優れている。（いずれの組合せのｐ
値も0.001 未満）。３Ｂ７プラス７Ａ９の組合せは、各
抗体単独に比して有意に優れてはいない。１Ｅ７／２Ｇ
７抗原も３Ｂ７／７Ａ９抗原も７０％がＴ細胞である末
梢血リンパ球上には存在しないので、Fig １５に示され
た作用は、内皮細胞上の抗原の役割に帰することができ
る。
【０２１３】実施例３ 本発明のモノクローナル抗体と公表されている抗体との
特異性比較 （Ａ）抗原サイズ：植継ぎ回数の少ない（ｐ６未満）の
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１００mm組織培養
皿中のコンフルエントな培養を一夜、低メチオニン含有
培地中に置いた。翌日、ＩＬ−１を１ng／mlとなるよう
加え、35Ｓ−メチオニン（アマーシャム）を、２５０μ
Ｃｉ／１０7 細胞の割合で加えた。対照にはＩＬ−１を
加えなかった。３７℃で６時間培養後、単層を氷冷した
ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗
い、１％トライトンＸ−１００細胞溶解用緩衝溶液２５
０μｌで溶解させた。
特異性比較 （Ａ）抗原サイズ：植継ぎ回数の少ない（ｐ６未満）の
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１００mm組織培養
皿中のコンフルエントな培養を一夜、低メチオニン含有
培地中に置いた。翌日、ＩＬ−１を１ng／mlとなるよう
加え、35Ｓ−メチオニン（アマーシャム）を、２５０μ
Ｃｉ／１０7 細胞の割合で加えた。対照にはＩＬ−１を
加えなかった。３７℃で６時間培養後、単層を氷冷した
ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗
い、１％トライトンＸ−１００細胞溶解用緩衝溶液２５
０μｌで溶解させた。
【０２１４】ナンクＥＬ１ＳＡ用９６ウエルマイクロタ
イタープレートを、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
５）１００μｌ中のアフイニティ精製ヤギ抗マウス抗体
２５μｇと共に、室温で１時間インキュベートした。ウ
エルをＰＢＳ−０．０５％トウィーン２０で１０回洗
い、続いて、１％ＢＳＡ１００μｌを室温で１時間加え
た。各ウエルに、ＢＳＡの存在下に、精製モノクローナ
ル抗体５μｇを室温で次の１時間加えた。ＰＢＳ−トウ
ィーンで１０回洗ったのち、細胞溶解物１〜３×１０6
ｃｐｍを各ウエルに４℃で２時間、ゆるやかに揺り動か
しながら加えた。ウエルをＰＢＳ−トウィーンで洗い、
乾燥し、還元性試料緩衝液で抽出し、還元性または非還
元性のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）にかけた。ゲルは、３Ａ２および７Ａ９試料の場
合は８％アクリルアミド、１Ｅ７および２Ｇ７試料の場
合は１０％アクリルアミドとした。
イタープレートを、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
５）１００μｌ中のアフイニティ精製ヤギ抗マウス抗体
２５μｇと共に、室温で１時間インキュベートした。ウ
エルをＰＢＳ−０．０５％トウィーン２０で１０回洗
い、続いて、１％ＢＳＡ１００μｌを室温で１時間加え
た。各ウエルに、ＢＳＡの存在下に、精製モノクローナ
ル抗体５μｇを室温で次の１時間加えた。ＰＢＳ−トウ
ィーンで１０回洗ったのち、細胞溶解物１〜３×１０6
ｃｐｍを各ウエルに４℃で２時間、ゆるやかに揺り動か
しながら加えた。ウエルをＰＢＳ−トウィーンで洗い、
乾燥し、還元性試料緩衝液で抽出し、還元性または非還
元性のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）にかけた。ゲルは、３Ａ２および７Ａ９試料の場
合は８％アクリルアミド、１Ｅ７および２Ｇ７試料の場
合は１０％アクリルアミドとした。
【０２１５】結果をFig ７およびFig ８に示すと共に、
第３表にまとめた。結果は次の通りであった（カッコ内
の値は３回の実験の結果の平均値である）： (1) モノクローナル抗体１Ｅ７およびモノクローナル抗
体２Ｇ７処理溶解物は、還元条件下で１２５（１１４）
ｋＤａに強いバンドを、９７（９５）ｋＤａに弱いバン
ドを、非還元条件下で９９（１００）ｋＤａに強いバン
ドを、８７（９３）ｋＤａに弱いバンドを示した（還元
条件下での結果は図面には示されていない）； (2) モノクローナル抗体３Ａ２処理溶解物は、還元およ
び非還元条件下で１７７（１７０）ｋＤａに１本のバン
ドを示した； (3) モノクローナル抗体７Ａ９処理溶解物は、還元条件
下で１００ｋＤａに１本のバンドを、非還元条件下で９
０ｋＤａに１本のバンドを示した。
第３表にまとめた。結果は次の通りであった（カッコ内
の値は３回の実験の結果の平均値である）： (1) モノクローナル抗体１Ｅ７およびモノクローナル抗
体２Ｇ７処理溶解物は、還元条件下で１２５（１１４）
ｋＤａに強いバンドを、９７（９５）ｋＤａに弱いバン
ドを、非還元条件下で９９（１００）ｋＤａに強いバン
ドを、８７（９３）ｋＤａに弱いバンドを示した（還元
条件下での結果は図面には示されていない）； (2) モノクローナル抗体３Ａ２処理溶解物は、還元およ
び非還元条件下で１７７（１７０）ｋＤａに１本のバン
ドを示した； (3) モノクローナル抗体７Ａ９処理溶解物は、還元条件
下で１００ｋＤａに１本のバンドを、非還元条件下で９
０ｋＤａに１本のバンドを示した。
【０２１６】後述の実施例４に示したように、モノクロ
ーナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７が特異的に結合する抗原
は、モノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７が特異的に
結合する抗原と同じ抗原である。
ーナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７が特異的に結合する抗原
は、モノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７が特異的に
結合する抗原と同じ抗原である。
【０２１７】（Ｂ）抗原分布：一般的な結合アッセイを
次のように実施した：20,000ＨＵＶＥＣを、９６ウエル
マイクロタイタープレートの各ウエルのゼラチン被覆表
面上に植えた。培養を一夜生育培地（実施例１参照）中
に置いて十分に付着させた。次の日、細胞を１ng／mlの
ＩＬ−１に４時間曝露し、洗い、個々に５μｇ／mlの各
モノクローナル抗体と共にインキュベートした。対照
は、ＩＬ−１に曝露しないＨＵＶＥＣまたはＩＬ−１に
曝露したが抗体には曝露しなかったＨＵＶＥＣからなっ
ていた。４℃で１時間のインキュベーションののち、細
胞を洗い、１／１０００希釈のビオチニル化ヤギ抗マウ
ス試薬と共にインキュベートした。４℃で３０分間のの
ち、細胞を洗い、１／１０希釈の 125Ｉ−ストレプトア
ビジンに曝露した。４℃で１５分間ののち、細胞を洗
い、トライトンＸ−１００洗剤（１％）で溶解し、アリ
コートをガンマーカウンターで計測した。
次のように実施した：20,000ＨＵＶＥＣを、９６ウエル
マイクロタイタープレートの各ウエルのゼラチン被覆表
面上に植えた。培養を一夜生育培地（実施例１参照）中
に置いて十分に付着させた。次の日、細胞を１ng／mlの
ＩＬ−１に４時間曝露し、洗い、個々に５μｇ／mlの各
モノクローナル抗体と共にインキュベートした。対照
は、ＩＬ−１に曝露しないＨＵＶＥＣまたはＩＬ−１に
曝露したが抗体には曝露しなかったＨＵＶＥＣからなっ
ていた。４℃で１時間のインキュベーションののち、細
胞を洗い、１／１０００希釈のビオチニル化ヤギ抗マウ
ス試薬と共にインキュベートした。４℃で３０分間のの
ち、細胞を洗い、１／１０希釈の 125Ｉ−ストレプトア
ビジンに曝露した。４℃で１５分間ののち、細胞を洗
い、トライトンＸ−１００洗剤（１％）で溶解し、アリ
コートをガンマーカウンターで計測した。
【０２１８】Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球などの非付着性細
胞のアッセイには、培地除去前にプレートを遠心分離機
にかけて細胞をペレット化した。細胞を適当な培地に再
懸濁して次のインキュベーションに用いた。
胞のアッセイには、培地除去前にプレートを遠心分離機
にかけて細胞をペレット化した。細胞を適当な培地に再
懸濁して次のインキュベーションに用いた。
【０２１９】結果をFig ９に示す。Fig ９は、４種のモ
ノクローナル抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７
の全てがＩＬ−１活性化ヒト内皮細胞（ＨＥＣ）に結合
するが、正常な休止ＨＥＣには有意には結合しないこと
を示している。このことは、モノクローナル抗体１Ｅ
７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７が結合する抗原が、実
施例２で報告した結果と合致して、ＩＬ−１活性化ＨＥ
Ｃ上に存在することを意味する。
ノクローナル抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７
の全てがＩＬ−１活性化ヒト内皮細胞（ＨＥＣ）に結合
するが、正常な休止ＨＥＣには有意には結合しないこと
を示している。このことは、モノクローナル抗体１Ｅ
７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７が結合する抗原が、実
施例２で報告した結果と合致して、ＩＬ−１活性化ＨＥ
Ｃ上に存在することを意味する。
【０２２０】４種のモノクローナル抗体の各々に対応す
る抗原の存在を、上記の一般的な結合アッセイと同様に
して調べた。ただし、内皮細胞に加えて、他の細胞タイ
プも使用し、ＩＬ−１とのインキュベーションの時間は
（上と同様）４時間とした。他の細胞タイプは、ヒト線
維芽細胞（ＭＲＨＦ）、ケラチノサイト（ＫＨＥＫ）お
よび内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であった。
る抗原の存在を、上記の一般的な結合アッセイと同様に
して調べた。ただし、内皮細胞に加えて、他の細胞タイ
プも使用し、ＩＬ−１とのインキュベーションの時間は
（上と同様）４時間とした。他の細胞タイプは、ヒト線
維芽細胞（ＭＲＨＦ）、ケラチノサイト（ＫＨＥＫ）お
よび内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であった。
【０２２１】結果を下記表２に示す。
【０２２２】
【表２】
【０２２３】第２表のデータは、４種のモノクローナル
抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７の全てがＩＬ
−１活性化ＨＥＣに結合するが、正常な休止またはＩＬ
−１活性化表皮ケラチノサイトあるいは休止またはＩＬ
−１活性化ヒト線維芽細胞には有意には結合しないこと
を示している。このデータは、モノクローナル抗体１Ｅ
７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７が結合する抗原がＩＬ
−１活性化ＨＥＣ上にあることを示す。
抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７の全てがＩＬ
−１活性化ＨＥＣに結合するが、正常な休止またはＩＬ
−１活性化表皮ケラチノサイトあるいは休止またはＩＬ
−１活性化ヒト線維芽細胞には有意には結合しないこと
を示している。このデータは、モノクローナル抗体１Ｅ
７、３Ａ２、７Ａ９および２Ｇ７が結合する抗原がＩＬ
−１活性化ＨＥＣ上にあることを示す。
【０２２４】上記の一般的な結合アッセイと同じプロト
コールを用いた。ただし、内皮細胞を用いる代りに、顆
粒球および単核細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）を用
いた。顆粒球および単核細胞は、既知の方法に従って、
ヒトヘパリン化血からフィコール−ハイパック分離によ
って単離した。
コールを用いた。ただし、内皮細胞を用いる代りに、顆
粒球および単核細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）を用
いた。顆粒球および単核細胞は、既知の方法に従って、
ヒトヘパリン化血からフィコール−ハイパック分離によ
って単離した。
【０２２５】結果をFig １０に示す。Fig １０は、４種
のモノクローナル抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９および２
Ｇ７が、正常な休止またはＩＬ−１活性化ヒト顆粒球ま
たは単核細胞の混合物に有意には結合しないことを示し
ている。
のモノクローナル抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９および２
Ｇ７が、正常な休止またはＩＬ−１活性化ヒト顆粒球ま
たは単核細胞の混合物に有意には結合しないことを示し
ている。
【０２２６】このデータは、Fig ９および表２のデータ
と共に、モノクローナル抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９お
よび２Ｇ７がＩＬ−１活性化ＨＥＣに対して特異的であ
ることを示す。
と共に、モノクローナル抗体１Ｅ７、３Ａ２、７Ａ９お
よび２Ｇ７がＩＬ−１活性化ＨＥＣに対して特異的であ
ることを示す。
【０２２７】（Ｃ）インビトロでの抗原動態：それぞれ
のペトリ皿（直径３５mm）に、プラスチックをゼラチン
被覆したのち、ＨＵＶＥＣを植えた。生育培地（実施例
１に記載）を加え、細胞を１ng／mlのＩＬ−１を加えた
生育培地中で、実験期間中培養した。細胞を最初に植え
る時期を前後させて、ＩＬ−１添加の時期を異ならせて
細胞によってＩＬ−１に最後の１２時間だけ、または全
９６時間中あるいは途中のある期間曝露させるようにし
たあとでも、同じ日に全ての細胞を採取するようにし
た。ＨＵＶＥＣをペトリ皿からＰＢＳ／ＥＤＴＡを用い
て脱離させ、ＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗い、丸底マイクロ
タイタープレートの各ウエルに75,000細胞ずつ入れた。
これらのウエルに個々に４種のモノクローナル抗体１Ｅ
７、２Ｇ７、３Ａ２および７Ａ９の各々を５μｇ／ml加
え、４℃に３０分間おいた。３回洗ったのち、細胞を１
／４０希釈のＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス試薬に４℃で３０
分間曝露した。さらに３回洗ったのち、細胞の蛍光度を
コールター５４１ＥＰＩＣＳ型フローサイトメーターに
よりメーカー指定の確立されたルーチンの操作法に従っ
て測定した。結果はFig １１に示したが、陽性（細胞）
％対ＩＬ−１曝露時間で表わされている。
のペトリ皿（直径３５mm）に、プラスチックをゼラチン
被覆したのち、ＨＵＶＥＣを植えた。生育培地（実施例
１に記載）を加え、細胞を１ng／mlのＩＬ−１を加えた
生育培地中で、実験期間中培養した。細胞を最初に植え
る時期を前後させて、ＩＬ−１添加の時期を異ならせて
細胞によってＩＬ−１に最後の１２時間だけ、または全
９６時間中あるいは途中のある期間曝露させるようにし
たあとでも、同じ日に全ての細胞を採取するようにし
た。ＨＵＶＥＣをペトリ皿からＰＢＳ／ＥＤＴＡを用い
て脱離させ、ＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗い、丸底マイクロ
タイタープレートの各ウエルに75,000細胞ずつ入れた。
これらのウエルに個々に４種のモノクローナル抗体１Ｅ
７、２Ｇ７、３Ａ２および７Ａ９の各々を５μｇ／ml加
え、４℃に３０分間おいた。３回洗ったのち、細胞を１
／４０希釈のＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス試薬に４℃で３０
分間曝露した。さらに３回洗ったのち、細胞の蛍光度を
コールター５４１ＥＰＩＣＳ型フローサイトメーターに
よりメーカー指定の確立されたルーチンの操作法に従っ
て測定した。結果はFig １１に示したが、陽性（細胞）
％対ＩＬ−１曝露時間で表わされている。
【０２２８】Fig １１のデータは、モノクローナル抗体
１Ｅ７および２Ｇ７によって規定される抗原がＩＬ−１
の存在下に増加し、ＩＬ−１の存在下に発現され続ける
ことを示している。これとは対照的に、モノクローナル
抗体３Ａ２によって規定される抗原は経時的に消失す
る。この図にはゼロ時は示されておらず、最初の時点は
４種の抗原が極大を示すに至る４時間時点である。
１Ｅ７および２Ｇ７によって規定される抗原がＩＬ−１
の存在下に増加し、ＩＬ−１の存在下に発現され続ける
ことを示している。これとは対照的に、モノクローナル
抗体３Ａ２によって規定される抗原は経時的に消失す
る。この図にはゼロ時は示されておらず、最初の時点は
４種の抗原が極大を示すに至る４時間時点である。
【０２２９】モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７に
よって規定される抗原が示す挙動を、これら抗原が慢性
の炎症と関連している可能性を示唆するために、「慢性
動態」と名付けた。一過性の発現を、これら抗原が急性
の炎症と関連している可能性を示唆するために、「急性
動態」と名付けた。
よって規定される抗原が示す挙動を、これら抗原が慢性
の炎症と関連している可能性を示唆するために、「慢性
動態」と名付けた。一過性の発現を、これら抗原が急性
の炎症と関連している可能性を示唆するために、「急性
動態」と名付けた。
【０２３０】実施例３のデータは、本発明のモノクロー
ナル抗体および本発明の新規抗原を特徴付ける追加の特
性をなすものである。それらデータを表３にまとめ、極
めて近い既知の公表されているモノクローナル抗体につ
いての類似のデータと比較した。
ナル抗体および本発明の新規抗原を特徴付ける追加の特
性をなすものである。それらデータを表３にまとめ、極
めて近い既知の公表されているモノクローナル抗体につ
いての類似のデータと比較した。
【０２３１】
【表３】
【０２３２】表３のデータは、本発明のモノクローナル
抗体が、最も近い公表されている既知のモノクローナル
抗体と予想外に相異していることを明らかにしている。
抗体が、最も近い公表されている既知のモノクローナル
抗体と予想外に相異していることを明らかにしている。
【０２３３】実施例４ 抗原１Ｅ７／２Ｇ７、１Ａ７／３Ｂ７およびＣＭＰ−１
７０の詳細な解析 （Ａ）休止およびＩＬ−１刺激ＨＵＶＥＣからの膜蛋白
質の２−Ｄゲル分析：ＩＬ−１への短期曝露後の内皮細
胞によって合成される新規膜蛋白質の数を推定するため
に、トライトンＸ−１１４で溶解した細胞からの洗剤ペ
レットを、以下の通り、２−Ｄゲル分析によって調べ
た。
７０の詳細な解析 （Ａ）休止およびＩＬ−１刺激ＨＵＶＥＣからの膜蛋白
質の２−Ｄゲル分析：ＩＬ−１への短期曝露後の内皮細
胞によって合成される新規膜蛋白質の数を推定するため
に、トライトンＸ−１１４で溶解した細胞からの洗剤ペ
レットを、以下の通り、２−Ｄゲル分析によって調べ
た。
【０２３４】植継ぎ回数の少ない（ｐ６未満）ＨＵＶＥ
Ｃを１００mm組織培養皿でコンフルエントになるまで培
養したものを、システイン不含Ｄ−ＭＥＭ（ギブコ）プ
ラス２０％透析ウシ胎児血清およびその他の内皮細胞生
育培地成分を含有する生育培地中に一夜置いた。翌日、
１ng／mlのＩＬ−１および２５０μＣｉ／１０7 細胞の
割合の35Ｓ−システイン（アマーシャム）を加えた。３
７℃で６時間培養後、単層を氷冷ダルベツコリン酸緩衝
食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗い、１０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳＦ
を含有する細胞溶解用１％トライトンＸ−１１４の緩衝
液溶液２５０μｌで溶解させた。ボルディエ（Bordier
）、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２５６巻１６０４〜１６０７頁、１９８１年の記載
に準じて、水相蛋白質からの疎水性蛋白質の分離を行っ
た。５分後、細胞溶解物を皿から１．５mlエッペンドル
フ管へかき取って集め、12,000ｇ、４℃で１０分間遠心
し、上澄みを６％スクロース蛋白質の分離を行った。５
分後、細胞溶解物を皿から１．５mlエッペンドルフ管へ
かき取って集め、12,000ｇ、４℃で１０分間遠心し、上
澄みを６％スクロース、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．
４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０６％トライトンＸ
−１１４からなる溶液３００μｌ上に積層した。この勾
配を３７℃に正確に１分間おいて相分離を起こさせたの
ち、８５０ｇ、室温で１０分間遠心分離した。上澄みの
水相を取出し、４℃で新しい１０％トライトンＸ−１１
４と合せて、洗剤濃度を１％とした。この再抽出上澄み
を、もとのスクロース勾配／トライトンＸ−１１４洗剤
ペレット上に置き、１分間３７℃とし、先と同様に再遠
心分離した。この操作は、最終的には、最初の洗剤相と
水相との分離および続いての洗剤再添加による水相の３
回の再抽出からなっていた。各試料について集めた洗剤
ペレット１部に対し９部の緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐ
Ｈ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ）を加えることにより、
希釈した。この材料を、スクロースクッション上に置
き、３７℃で１分間インキュベートし、上記の通り再遠
心分離することにより、再抽出した。最後の水相および
スクロースクッションを捨て、洗剤ペレットを、２−Ｄ
ゲル分析まで−７０℃で凍結しておいた。
Ｃを１００mm組織培養皿でコンフルエントになるまで培
養したものを、システイン不含Ｄ−ＭＥＭ（ギブコ）プ
ラス２０％透析ウシ胎児血清およびその他の内皮細胞生
育培地成分を含有する生育培地中に一夜置いた。翌日、
１ng／mlのＩＬ−１および２５０μＣｉ／１０7 細胞の
割合の35Ｓ−システイン（アマーシャム）を加えた。３
７℃で６時間培養後、単層を氷冷ダルベツコリン酸緩衝
食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗い、１０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳＦ
を含有する細胞溶解用１％トライトンＸ−１１４の緩衝
液溶液２５０μｌで溶解させた。ボルディエ（Bordier
）、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２５６巻１６０４〜１６０７頁、１９８１年の記載
に準じて、水相蛋白質からの疎水性蛋白質の分離を行っ
た。５分後、細胞溶解物を皿から１．５mlエッペンドル
フ管へかき取って集め、12,000ｇ、４℃で１０分間遠心
し、上澄みを６％スクロース蛋白質の分離を行った。５
分後、細胞溶解物を皿から１．５mlエッペンドルフ管へ
かき取って集め、12,000ｇ、４℃で１０分間遠心し、上
澄みを６％スクロース、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．
４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０６％トライトンＸ
−１１４からなる溶液３００μｌ上に積層した。この勾
配を３７℃に正確に１分間おいて相分離を起こさせたの
ち、８５０ｇ、室温で１０分間遠心分離した。上澄みの
水相を取出し、４℃で新しい１０％トライトンＸ−１１
４と合せて、洗剤濃度を１％とした。この再抽出上澄み
を、もとのスクロース勾配／トライトンＸ−１１４洗剤
ペレット上に置き、１分間３７℃とし、先と同様に再遠
心分離した。この操作は、最終的には、最初の洗剤相と
水相との分離および続いての洗剤再添加による水相の３
回の再抽出からなっていた。各試料について集めた洗剤
ペレット１部に対し９部の緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐ
Ｈ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ）を加えることにより、
希釈した。この材料を、スクロースクッション上に置
き、３７℃で１分間インキュベートし、上記の通り再遠
心分離することにより、再抽出した。最後の水相および
スクロースクッションを捨て、洗剤ペレットを、２−Ｄ
ゲル分析まで−７０℃で凍結しておいた。
【０２３５】この操作法は、膜蛋白質は、それらが疎水
性トランスメンブレン領域をもつので、水相よりもむし
ろ疎水性（洗剤）相に分配されるのを助けることを示し
ている（ボルディエ、ジャーナル・オヴ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２５６巻１６０４〜１６０７頁、１
９８１年）。これは、ミトコンドア、血漿および他の膜
蛋白質についても言える。膜蛋白質が水相抽出液か洗剤
相抽出液かに見出される選択性の予備測定を、Ｎ−ヒド
ロキシースクシンイミドビオチン１００μｇ／mlを含有
する蛋白質不含ＰＢＳ中で１０7 個の細胞を氷上（４
℃）で３０分間インキュベートして表面をビオチニル化
した細胞の分画によって行った。１％ＢＳＡのＰＢＳ溶
液を加え、遠心分離によって細胞を洗い、再懸濁して未
反応薬品を除くことによって、反応を停止させた。トラ
イトンＸ−１００により細胞を溶解させ、１０％還元性
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で処理した。つぎ
に、このゲルを、２相からの等量の蛋白質を用いてのニ
トロセルロース上へのウェスタンブロッティングに付し
た。これに続いて、ストレプトアビジン−β−ガラクト
シダーゼを用いて検出を行った。これは、定量的ではな
いが、ビオチンの大部分が洗剤層と会合することを示し
た（データは示さない）。
性トランスメンブレン領域をもつので、水相よりもむし
ろ疎水性（洗剤）相に分配されるのを助けることを示し
ている（ボルディエ、ジャーナル・オヴ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２５６巻１６０４〜１６０７頁、１
９８１年）。これは、ミトコンドア、血漿および他の膜
蛋白質についても言える。膜蛋白質が水相抽出液か洗剤
相抽出液かに見出される選択性の予備測定を、Ｎ−ヒド
ロキシースクシンイミドビオチン１００μｇ／mlを含有
する蛋白質不含ＰＢＳ中で１０7 個の細胞を氷上（４
℃）で３０分間インキュベートして表面をビオチニル化
した細胞の分画によって行った。１％ＢＳＡのＰＢＳ溶
液を加え、遠心分離によって細胞を洗い、再懸濁して未
反応薬品を除くことによって、反応を停止させた。トラ
イトンＸ−１００により細胞を溶解させ、１０％還元性
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で処理した。つぎ
に、このゲルを、２相からの等量の蛋白質を用いてのニ
トロセルロース上へのウェスタンブロッティングに付し
た。これに続いて、ストレプトアビジン−β−ガラクト
シダーゼを用いて検出を行った。これは、定量的ではな
いが、ビオチンの大部分が洗剤層と会合することを示し
た（データは示さない）。
【０２３６】先に記載されているように（ガレルス、ジ
ャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５
４巻７９６１〜７９７７頁、１９７９年；ガレルス、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、１００巻４１１〜４
２３頁、１９８３年）、プロティン・データベース・イ
ンク（ＰＤＩ）により２−Ｄゲル分析が行われた。要約
すると、細胞蛋白質（５〜２０μｇ）中へ導入された35
Ｓ−システイン400,000 ｄｐｍを含有する２０μｌ以下
の試料を、ＬＫＢアンフォライトを用いたｐＨ３．５〜
１０の一次元勾配ゲルにかけた。二次元目は、アクリル
アミド１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で還元条件下に
実施した。フィルムを乾燥したゲルおよび一連のデンシ
トメリー標準試料に時間を変えて曝露した。既知の値を
もつ蛋白質との比較で、分子量および等電点を決定し
た。ゲルのコンピューター解析を、文献記載通りに行な
った（カレルス、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・
ケミストリー、２６４巻５２６９〜５２８２頁、１９８
９年）。
ャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５
４巻７９６１〜７９７７頁、１９７９年；ガレルス、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、１００巻４１１〜４
２３頁、１９８３年）、プロティン・データベース・イ
ンク（ＰＤＩ）により２−Ｄゲル分析が行われた。要約
すると、細胞蛋白質（５〜２０μｇ）中へ導入された35
Ｓ−システイン400,000 ｄｐｍを含有する２０μｌ以下
の試料を、ＬＫＢアンフォライトを用いたｐＨ３．５〜
１０の一次元勾配ゲルにかけた。二次元目は、アクリル
アミド１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で還元条件下に
実施した。フィルムを乾燥したゲルおよび一連のデンシ
トメリー標準試料に時間を変えて曝露した。既知の値を
もつ蛋白質との比較で、分子量および等電点を決定し
た。ゲルのコンピューター解析を、文献記載通りに行な
った（カレルス、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・
ケミストリー、２６４巻５２６９〜５２８２頁、１９８
９年）。
【０２３７】結果をFig １２Ａおよび１２Ｂに示す。35
Ｓ−システイン標識内皮細胞からの膜蛋白質がFig １１
Ａに、ＩＬ−１活性化内皮細胞からのものがFig １１Ｂ
に示されている。各ゲル当り、400,000 ｃｐｍを用い
た。この図では、フィルムを乾燥ゲルに２２日間曝露し
ている。見掛けの分子量および等電点を、データベース
中の既知蛋白質との比較に基づいて示してある。
Ｓ−システイン標識内皮細胞からの膜蛋白質がFig １１
Ａに、ＩＬ−１活性化内皮細胞からのものがFig １１Ｂ
に示されている。各ゲル当り、400,000 ｃｐｍを用い
た。この図では、フィルムを乾燥ゲルに２２日間曝露し
ている。見掛けの分子量および等電点を、データベース
中の既知蛋白質との比較に基づいて示してある。
【０２３８】Fig １２Ａは、６時間経過後の休止および
コンフルエント細胞中の35Ｓ−システイン取込み蛋白質
のパターンを示す。右側に、ＩＬ−１および35Ｓ−シス
テインに６時間曝露された細胞により合成された蛋白質
が示されている。Fig １２Ａ左上方の３本の矢印は、未
誘発細胞には見られないが、誘発細胞には存在するスポ
ット群を指している。これらのパターンは、このような
６回の分析で極めて再現性がよく、代謝標識として35Ｓ
−メチオニンを用いて得られた結果と本質的に均等であ
る。この代表的な実験では、コンピューター解析で２枚
のフィルムに計６５２のスポットが確認され、うち３０
０が毎分当り崩壊数（ｄｐｍ）が３０を超えていた。こ
れら３０ｄｐｍを超えるＩＬ−１誘発２−Ｄゲルのスポ
ットのうち、１９が、未誘発２−Ｄゲル中のレベルの２
倍以上のｄｐｍ値を示した。それら１９スポットの大部
分を含む３つのクラスターが、全６回の実験での認めら
れる限りの主要誘発蛋白質であった。
コンフルエント細胞中の35Ｓ−システイン取込み蛋白質
のパターンを示す。右側に、ＩＬ−１および35Ｓ−シス
テインに６時間曝露された細胞により合成された蛋白質
が示されている。Fig １２Ａ左上方の３本の矢印は、未
誘発細胞には見られないが、誘発細胞には存在するスポ
ット群を指している。これらのパターンは、このような
６回の分析で極めて再現性がよく、代謝標識として35Ｓ
−メチオニンを用いて得られた結果と本質的に均等であ
る。この代表的な実験では、コンピューター解析で２枚
のフィルムに計６５２のスポットが確認され、うち３０
０が毎分当り崩壊数（ｄｐｍ）が３０を超えていた。こ
れら３０ｄｐｍを超えるＩＬ−１誘発２−Ｄゲルのスポ
ットのうち、１９が、未誘発２−Ｄゲル中のレベルの２
倍以上のｄｐｍ値を示した。それら１９スポットの大部
分を含む３つのクラスターが、全６回の実験での認めら
れる限りの主要誘発蛋白質であった。
【０２３９】（Ｂ）１Ｅ７／２Ｇ７抗原の特性：ＩＬ−
１活性化または未活性化ＨＵＶＥＣのトライトンＸ−１
１４溶解産物（上記と同様にして調製）を分画して、洗
浄ペレットを得た。ＩＬ−１活性化膜ペレットの一部を
用いて、１Ｅ７および２Ｇ７抗原の免疫沈降を行った。
１活性化または未活性化ＨＵＶＥＣのトライトンＸ−１
１４溶解産物（上記と同様にして調製）を分画して、洗
浄ペレットを得た。ＩＬ−１活性化膜ペレットの一部を
用いて、１Ｅ７および２Ｇ７抗原の免疫沈降を行った。
【０２４０】免疫沈降は次のように行った。ヌンクＥＬ
ＩＳＡ用９６ウエルプレートを、０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．５）１００μｌ中のアフィニティ精製ヤギ抗
マウス抗体２５μｇと共に室温で１時間インキュベート
した。ウエルをＰＢＳ−０．０５％トウィーン２０で１
０回洗ったのち、１％ＢＳＡ２００μｌを室温で１時間
加えておいた。各ウエルに、ＢＳＡの存在下に、精製モ
ノクローナル抗体５μｇを次の１時間加えておいた。Ｐ
ＢＳ−トウィーンで５回洗ったのち、１〜３×１０6 ｃ
ｐｍの溶解産物を各ウエルに加え、ゆっくり揺り動かし
ながら４℃に２時間おいた。ウエルをＰＢＳ−トウィー
ンで洗い、過剰の液体を除去した。免疫沈降材料を２％
ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノールで抽出し、これ
ら沈降物の各々の一部を、トライトンＸ−１１４溶解産
物膜画分と混合して２−Ｄゲル分析に付した。
ＩＳＡ用９６ウエルプレートを、０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．５）１００μｌ中のアフィニティ精製ヤギ抗
マウス抗体２５μｇと共に室温で１時間インキュベート
した。ウエルをＰＢＳ−０．０５％トウィーン２０で１
０回洗ったのち、１％ＢＳＡ２００μｌを室温で１時間
加えておいた。各ウエルに、ＢＳＡの存在下に、精製モ
ノクローナル抗体５μｇを次の１時間加えておいた。Ｐ
ＢＳ−トウィーンで５回洗ったのち、１〜３×１０6 ｃ
ｐｍの溶解産物を各ウエルに加え、ゆっくり揺り動かし
ながら４℃に２時間おいた。ウエルをＰＢＳ−トウィー
ンで洗い、過剰の液体を除去した。免疫沈降材料を２％
ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノールで抽出し、これ
ら沈降物の各々の一部を、トライトンＸ−１１４溶解産
物膜画分と混合して２−Ｄゲル分析に付した。
【０２４１】Fig １３は、１Ｅ７および２Ｇ７免疫沈降
物単独および未誘発（−ＩＬ−１）および誘発（＋ＩＬ
−１）ＨＵＶＥＣからの総膜蛋白質との混合物の２−Ｄ
ゲル分析結果を示す。８個の正方形の各々に、Fig １２
で分析されたゲル全体の左上方４分の１に対応する２−
Ｄゲル部分が示されている。Fig １３Ａおよび１３Ｂ
は、１Ｅ７（上部）または２Ｇ７（下部）抗体のみとの
免疫沈降物である。これらのゲルの他の部分には、それ
以上のスポットは見られなかった。Fig １３Ｃおよび１
３Ｄは、免疫沈降物を添加しないときの未誘発（−ＩＬ
−１、上方）または誘発（ＩＬ−１、下方）ＨＵＶＥＣ
からの総膜蛋白質を示す。Fig １３Ｅおよび１３Ｆは、
未誘発ＨＵＶＥＣの膜蛋白質への１Ｅ７（上方）または
２Ｇ７（下方）免疫沈降物の添加の影響を示す。Fig １
３Ｇおよび１３Ｈは、ＩＬ−１誘発ＨＵＶＥＣからの膜
蛋白質への１Ｅ７（上方）または２Ｇ７（下方）免疫沈
降物の添加の影響を示す。プラス（＋）は各ゲルの酸性
末端を、マイナス（−）は塩基性末端を示す。
物単独および未誘発（−ＩＬ−１）および誘発（＋ＩＬ
−１）ＨＵＶＥＣからの総膜蛋白質との混合物の２−Ｄ
ゲル分析結果を示す。８個の正方形の各々に、Fig １２
で分析されたゲル全体の左上方４分の１に対応する２−
Ｄゲル部分が示されている。Fig １３Ａおよび１３Ｂ
は、１Ｅ７（上部）または２Ｇ７（下部）抗体のみとの
免疫沈降物である。これらのゲルの他の部分には、それ
以上のスポットは見られなかった。Fig １３Ｃおよび１
３Ｄは、免疫沈降物を添加しないときの未誘発（−ＩＬ
−１、上方）または誘発（ＩＬ−１、下方）ＨＵＶＥＣ
からの総膜蛋白質を示す。Fig １３Ｅおよび１３Ｆは、
未誘発ＨＵＶＥＣの膜蛋白質への１Ｅ７（上方）または
２Ｇ７（下方）免疫沈降物の添加の影響を示す。Fig １
３Ｇおよび１３Ｈは、ＩＬ−１誘発ＨＵＶＥＣからの膜
蛋白質への１Ｅ７（上方）または２Ｇ７（下方）免疫沈
降物の添加の影響を示す。プラス（＋）は各ゲルの酸性
末端を、マイナス（−）は塩基性末端を示す。
【０２４２】Fig １３からいくつかの結論を導くことが
できる。まず、１Ｅ７および２Ｇ７抗原により免疫沈降
したスポットのパターンは区別できない（Fig １３Ａ、
それぞれ上方および下方）。第二に、１Ｅ７または２Ｇ
７免疫沈降物との混合実験は、それらが、総膜溶解産物
の他のスポットと比較して、サイズおよび電荷に関して
同じ位置を占めることを示している。これは、１Ｅ７ま
たは２Ｇ７免疫沈降物を未誘発（−ＩＬ−１）溶解産物
に加えたときに極めて容易に見ることができる（Fig １
３Ｅおよび１３Ｆ）。第三に、１Ｅ７および２Ｇ７抗原
が同じであり、これらの免疫沈降物をＩＬ−１誘発溶解
産物に加えたときにそれらが重なり合う誘発膜溶解産物
中に存在する蛋白質を規定する。（Fig １３Ｇおよび１
３Ｈ）。これらのスポットは、常にシステイン（または
メチオニン）標識細胞からの２−Ｄゲルの最も顕著な一
組のセットであるFig １１の中央の矢印に対応する。こ
れらの混合実験およびFig １２に示した２−Ｄゲルから
の、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル上で
処理した既知蛋白質の分子質量および等電点に基づいて
の結論は、１Ｅ７／２Ｇ７抗原の分子質量はほぼ１１０
ｋＤａを中心とし、等電点の範囲は４．８〜４．９であ
るということになる。
できる。まず、１Ｅ７および２Ｇ７抗原により免疫沈降
したスポットのパターンは区別できない（Fig １３Ａ、
それぞれ上方および下方）。第二に、１Ｅ７または２Ｇ
７免疫沈降物との混合実験は、それらが、総膜溶解産物
の他のスポットと比較して、サイズおよび電荷に関して
同じ位置を占めることを示している。これは、１Ｅ７ま
たは２Ｇ７免疫沈降物を未誘発（−ＩＬ−１）溶解産物
に加えたときに極めて容易に見ることができる（Fig １
３Ｅおよび１３Ｆ）。第三に、１Ｅ７および２Ｇ７抗原
が同じであり、これらの免疫沈降物をＩＬ−１誘発溶解
産物に加えたときにそれらが重なり合う誘発膜溶解産物
中に存在する蛋白質を規定する。（Fig １３Ｇおよび１
３Ｈ）。これらのスポットは、常にシステイン（または
メチオニン）標識細胞からの２−Ｄゲルの最も顕著な一
組のセットであるFig １１の中央の矢印に対応する。こ
れらの混合実験およびFig １２に示した２−Ｄゲルから
の、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル上で
処理した既知蛋白質の分子質量および等電点に基づいて
の結論は、１Ｅ７／２Ｇ７抗原の分子質量はほぼ１１０
ｋＤａを中心とし、等電点の範囲は４．８〜４．９であ
るということになる。
【０２４３】（Ｃ）３Ｂ７／７Ａ９抗原と１Ｅ７／２Ｇ
７抗原との比較：３Ｂ７および７Ａ９抗原の免疫沈降物
の２−Ｄゲル中での予備分析により、それらが同一で且
つ混合実験で重なるプロフィールをもつことが示され
た。免疫沈降、２−Ｄゲル電気泳動および混合実験は、
すぐ上に述べた通りに行った。各沈降物はほぼ１０個の
スポットからなり、それらの分子質量範囲は約１１０〜
１２０ｋＤａ、等電点範囲は約４．３〜５．０であっ
た。それゆえ、仮説として、３Ｂ７および７Ａ９抗体は
各々同じポリペプチドを規定すると結論できた。１Ｅ７
／２Ｇ７蛋白質と３Ｂ７／７Ａ９およびＩＣＡＭ−１蛋
白質との関係を試験し、Fig １１に示したＩＬ−１誘発
可能膜蛋白質との関係でこれらの各々を位置付けるため
に、異なる免疫沈降物の混合物の２−Ｄゲル分析を、上
記と同様にして行った。ＩＬ−１活性化、35Ｓ−システ
イン標識ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物の各等約１０4 ｃ
ｐｍを分析した。免疫沈降に用いた抗体は、ＲＲＩ（抗
ＩＣＡＭ−１）、２Ｇ７、７Ａ９、ＲＲＩ＋２Ｇ７、Ｒ
ＲＩ＋７Ａ９および２Ｇ７＋７Ａ９であった。
７抗原との比較：３Ｂ７および７Ａ９抗原の免疫沈降物
の２−Ｄゲル中での予備分析により、それらが同一で且
つ混合実験で重なるプロフィールをもつことが示され
た。免疫沈降、２−Ｄゲル電気泳動および混合実験は、
すぐ上に述べた通りに行った。各沈降物はほぼ１０個の
スポットからなり、それらの分子質量範囲は約１１０〜
１２０ｋＤａ、等電点範囲は約４．３〜５．０であっ
た。それゆえ、仮説として、３Ｂ７および７Ａ９抗体は
各々同じポリペプチドを規定すると結論できた。１Ｅ７
／２Ｇ７蛋白質と３Ｂ７／７Ａ９およびＩＣＡＭ−１蛋
白質との関係を試験し、Fig １１に示したＩＬ−１誘発
可能膜蛋白質との関係でこれらの各々を位置付けるため
に、異なる免疫沈降物の混合物の２−Ｄゲル分析を、上
記と同様にして行った。ＩＬ−１活性化、35Ｓ−システ
イン標識ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物の各等約１０4 ｃ
ｐｍを分析した。免疫沈降に用いた抗体は、ＲＲＩ（抗
ＩＣＡＭ−１）、２Ｇ７、７Ａ９、ＲＲＩ＋２Ｇ７、Ｒ
ＲＩ＋７Ａ９および２Ｇ７＋７Ａ９であった。
【０２４４】結果をFig １４に示す；Fig １４Ａ−ＲＲ
Ｉ（抗ＩＣＡＭ−１）；Fig １４Ｂ−２Ｇ７；Fig １４
Ｃ−７Ａ９；Fig １４Ｄ−ＲＲＩ＋２Ｇ７；Fig １４Ｅ
−ＲＲＩ＋７Ａ９；Fig １４Ｆ−２Ｇ７＋７Ａ９。６つ
の２−Ｄゲルの各々の左上４分の１のみを示した。他の
領域には他のスポットはなかった。
Ｉ（抗ＩＣＡＭ−１）；Fig １４Ｂ−２Ｇ７；Fig １４
Ｃ−７Ａ９；Fig １４Ｄ−ＲＲＩ＋２Ｇ７；Fig １４Ｅ
−ＲＲＩ＋７Ａ９；Fig １４Ｆ−２Ｇ７＋７Ａ９。６つ
の２−Ｄゲルの各々の左上４分の１のみを示した。他の
領域には他のスポットはなかった。
【０２４５】ＩＣＡＭ−１、２Ｇ７および７Ａ９につい
ての個々の免疫沈降物をそれぞれFig １４Ａ、１４Ｂお
よび１４Ｃに示す。Fig １４Ｄは、２Ｇ７およびＩＣＡ
Ｍ−１両蛋白質の相異性およびそれらの相互関係を示し
ている。Fig １４Ｅは、７Ａ９とＩＣＡＭ−１との比較
を、Fig １４Ｆは、２Ｇ７と７Ａ９との比較を示す。最
後の場合にのみ、僅かに酸性度がより高く、分子量もよ
り高いプロフィールを示す７Ａ９とのスポットの部分的
重なりがある。結果は、Fig １２の３本の矢印の同定を
可能にするものである。最も左の矢印は、３Ｂ７／７Ａ
９蛋白質の酸性末端を、中央の矢印は１Ｅ７／２Ｇ７蛋
白質の領域を、右側の矢印は、ＩＣＡＭ−１領域を同定
するものである。対応する誘発蛋白質は、Fig １２に明
らかである（＋ＩＬ−１）。１Ｅ７／２Ｇ７および３Ｂ
７／７Ａ９蛋白質の差およびそれらと先に同定されたＥ
ＬＡＭ−１構造（ベヴィラクアら、プロシーディングズ
・オヴ・ザ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエン
シズ、８４巻９２３８〜９２４２頁、１９８７年；ベヴ
ィラクアら、サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５
頁、１９８９年）との関係を、次の実験でテストした。
ての個々の免疫沈降物をそれぞれFig １４Ａ、１４Ｂお
よび１４Ｃに示す。Fig １４Ｄは、２Ｇ７およびＩＣＡ
Ｍ−１両蛋白質の相異性およびそれらの相互関係を示し
ている。Fig １４Ｅは、７Ａ９とＩＣＡＭ−１との比較
を、Fig １４Ｆは、２Ｇ７と７Ａ９との比較を示す。最
後の場合にのみ、僅かに酸性度がより高く、分子量もよ
り高いプロフィールを示す７Ａ９とのスポットの部分的
重なりがある。結果は、Fig １２の３本の矢印の同定を
可能にするものである。最も左の矢印は、３Ｂ７／７Ａ
９蛋白質の酸性末端を、中央の矢印は１Ｅ７／２Ｇ７蛋
白質の領域を、右側の矢印は、ＩＣＡＭ−１領域を同定
するものである。対応する誘発蛋白質は、Fig １２に明
らかである（＋ＩＬ−１）。１Ｅ７／２Ｇ７および３Ｂ
７／７Ａ９蛋白質の差およびそれらと先に同定されたＥ
ＬＡＭ−１構造（ベヴィラクアら、プロシーディングズ
・オヴ・ザ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエン
シズ、８４巻９２３８〜９２４２頁、１９８７年；ベヴ
ィラクアら、サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５
頁、１９８９年）との関係を、次の実験でテストした。
【０２４６】ポリメラーゼ連鎖反応によりクローン化さ
れたＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡのコード配列をｐＣＤＮ−
１発現ベクター（Fig １５）へ挿入し、ＣＯＳ細胞のト
ランスフェクションに用いた。
れたＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡのコード配列をｐＣＤＮ−
１発現ベクター（Fig １５）へ挿入し、ＣＯＳ細胞のト
ランスフェクションに用いた。
【０２４７】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＥ
ＬＡＭ−１ｃＤＮＡクローニングは次のように行った。
ＥＬＡＭ−１コード領域を増幅するために次のＰＣＲプ
ライマーを用いた： プライマー 1 5'-GGGGGGCTCG AGTGAAGTCA TGATTGCTTC A
CAGTTTCTCTC-3'プライマー 2 5'-GGGGGGACGC GTAACTTAAA GGATGTAAGA AGGCTT
TTGGTA-3' これら２本のプライマーは、ＥＬＡＭ−１ｍＲＮＡのコ
ード領域をかこみ、開始コドンまたは終止コドンを含む
ように選んだ。ＰＣＲ増幅産物の発現ベクタへのクロー
ニングを容易にするために、これらプライマーに、制限
酵素部位Ｘｈｏ−ＩおよびＭｌｕ−Ｉも組込んだ。ＰＣ
Ｒ増幅ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡを、２種の異なるアプロー
チ法により調製した。第１法では、ＩＬ−１活性化ＨＵ
ＶＥＣからのポリＡ ＲＮＡを用い、インヴィトロゲン
コピーキットを使用してｃＤＮＡを作成した。ＨＵＶＥ
Ｃの総ＲＮＡを酸性フェノール抽出［コムチンスキ（Ch
omczyn-ski）とサクリ（Saccri）、アナリティカル・バ
イオケミストリー、１５２巻１５６〜１５９頁、１９８
７年］により単離した。ポリＡ ＲＮＡをオリゴｄＴセ
ルロースクロマトグラフィー［アヴィヴ（Aviv）とレダ
ー（Leder)、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オヴ・サイエンシズ、６９巻１４０８
〜１４１２頁、１９７２年］により単離した。つぎにそ
のｃＤＮＡを用い、上記２種のプライマーおよびシータ
ス社から入手した遺伝子増幅キットを使用して、ＰＣＲ
によるＥＬＡＭ−１コード配列の増幅［サイキ（Saiki)
ら、サイエンス、２３９巻４８７〜４９１頁、１９８８
年］を行った。ＰＣＲ増幅は、次の条件を用いて３０サ
イクル行った：変性：９４℃、１分間；アニーリング：
５０℃、２分間；伸長：７２℃、３分間。最後のサイク
ルの間には、伸長時間を７分間とした。第２法では、Ｉ
Ｌ−１活性化ＨＵＶＥＣからのポリＡ ＲＮＡ５００ｎ
ｇを、ＰＣＲプライマー１およびＢＲＬから入手したＭ
ｕＬＶ逆転写酵素により販売者規定の条件を用いて全反
応体積２０μｌ中で逆転写させた。このｃＤＮＡをつぎ
に、第１法の条件に従って、ＥＬＡＭ−１コード配列を
増幅するのに用いた。両方法からのＰＣＲ増幅産物をア
ガロースゲル電気泳動によって分離した。両場合共、Ｅ
ＬＡＭ−１コード配列の予想される１．８５Ｋｂ産物が
得られた。
ＬＡＭ−１ｃＤＮＡクローニングは次のように行った。
ＥＬＡＭ−１コード領域を増幅するために次のＰＣＲプ
ライマーを用いた： プライマー 1 5'-GGGGGGCTCG AGTGAAGTCA TGATTGCTTC A
CAGTTTCTCTC-3'プライマー 2 5'-GGGGGGACGC GTAACTTAAA GGATGTAAGA AGGCTT
TTGGTA-3' これら２本のプライマーは、ＥＬＡＭ−１ｍＲＮＡのコ
ード領域をかこみ、開始コドンまたは終止コドンを含む
ように選んだ。ＰＣＲ増幅産物の発現ベクタへのクロー
ニングを容易にするために、これらプライマーに、制限
酵素部位Ｘｈｏ−ＩおよびＭｌｕ−Ｉも組込んだ。ＰＣ
Ｒ増幅ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡを、２種の異なるアプロー
チ法により調製した。第１法では、ＩＬ−１活性化ＨＵ
ＶＥＣからのポリＡ ＲＮＡを用い、インヴィトロゲン
コピーキットを使用してｃＤＮＡを作成した。ＨＵＶＥ
Ｃの総ＲＮＡを酸性フェノール抽出［コムチンスキ（Ch
omczyn-ski）とサクリ（Saccri）、アナリティカル・バ
イオケミストリー、１５２巻１５６〜１５９頁、１９８
７年］により単離した。ポリＡ ＲＮＡをオリゴｄＴセ
ルロースクロマトグラフィー［アヴィヴ（Aviv）とレダ
ー（Leder)、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オヴ・サイエンシズ、６９巻１４０８
〜１４１２頁、１９７２年］により単離した。つぎにそ
のｃＤＮＡを用い、上記２種のプライマーおよびシータ
ス社から入手した遺伝子増幅キットを使用して、ＰＣＲ
によるＥＬＡＭ−１コード配列の増幅［サイキ（Saiki)
ら、サイエンス、２３９巻４８７〜４９１頁、１９８８
年］を行った。ＰＣＲ増幅は、次の条件を用いて３０サ
イクル行った：変性：９４℃、１分間；アニーリング：
５０℃、２分間；伸長：７２℃、３分間。最後のサイク
ルの間には、伸長時間を７分間とした。第２法では、Ｉ
Ｌ−１活性化ＨＵＶＥＣからのポリＡ ＲＮＡ５００ｎ
ｇを、ＰＣＲプライマー１およびＢＲＬから入手したＭ
ｕＬＶ逆転写酵素により販売者規定の条件を用いて全反
応体積２０μｌ中で逆転写させた。このｃＤＮＡをつぎ
に、第１法の条件に従って、ＥＬＡＭ−１コード配列を
増幅するのに用いた。両方法からのＰＣＲ増幅産物をア
ガロースゲル電気泳動によって分離した。両場合共、Ｅ
ＬＡＭ−１コード配列の予想される１．８５Ｋｂ産物が
得られた。
【０２４８】この１．８５Ｋｂバンドを電気溶出し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ＢＲＬ）で処理
し、プラスミドｐＳＰ７２Ａに連結し、ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム）で処理し
た。
ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ＢＲＬ）で処理
し、プラスミドｐＳＰ７２Ａに連結し、ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム）で処理し
た。
【０２４９】プラスミドｐＳＰ７２Ａは、プロメガバイ
オテクから入手したプラスミドｐＳＰ７２の修飾体であ
る。詳しくは、ｐＳＰ７２（プロメガバイオテク；カタ
ログ番号Ｐ２１９１）を、その多重クローニング部位
（ＭＣＳ）を次の部位を含有する新しい多重クローニン
グ部位で置換えることによって修飾した：ＮｄｅＩ、Ｎ
ｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄIII 、ＮｒｕＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＳａｃII、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、ＥａｇＩお
よびＢｇｌII。修飾されたＭＣＳをコードするオリゴヌ
クレオチドの合成は、標準的プロトコールを用いて遺伝
子合成機中で行った。このオリゴヌクレオチドを、Ｎｄ
ｅＩ／ＢｇｌII消化ｐＳＰ７２に挿入して、ベクターｐ
ＳＰ７２Ａを導いた。
オテクから入手したプラスミドｐＳＰ７２の修飾体であ
る。詳しくは、ｐＳＰ７２（プロメガバイオテク；カタ
ログ番号Ｐ２１９１）を、その多重クローニング部位
（ＭＣＳ）を次の部位を含有する新しい多重クローニン
グ部位で置換えることによって修飾した：ＮｄｅＩ、Ｎ
ｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄIII 、ＮｒｕＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＳａｃII、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、ＥａｇＩお
よびＢｇｌII。修飾されたＭＣＳをコードするオリゴヌ
クレオチドの合成は、標準的プロトコールを用いて遺伝
子合成機中で行った。このオリゴヌクレオチドを、Ｎｄ
ｅＩ／ＢｇｌII消化ｐＳＰ７２に挿入して、ベクターｐ
ＳＰ７２Ａを導いた。
【０２５０】ＥＬＡＭ−１コード配列挿入片を含むクロ
ーンを、ＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡのコード領域内の合成
オリゴマークローンを用いてのコロニーハイブリダイゼ
ーションによって得た。６クローンを単離し、ＥＬＡＭ
−１ ｃＤＮＡのコード領域に沿って一定間隔で配置さ
れる８種の異なる合成オリゴマープローブを用いて配列
決定した。全てのクローンが、ＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡ
の公表されている配列（ベヴィラクア、サイエンス、２
４３巻１１６０〜１１６５頁、１９８９年）とは異なる
ランダム分布の異種配列を含んでいた。これは、ＰＣＲ
増幅の間の誤りによると考えることができた。しかし、
ＰＣＲ増幅ＥＬＡＭ−１コード配列のクローンの全て
に、公表されている配列の１５１８位および１９１６位
のヌクレオチドにおける２種の変種が存在していた。そ
れゆえ、正しい配列はこの新しい配列であると信じられ
る。クローンの一つＳＰＥＬＡＭ−４は、１５１８位お
よび１９１６位のヌクレオチドにおける相違を除いて、
公表されている配列と同じ配列を含んでいた。このクロ
ーンから、ＮｏｔＩおよびＳｍａＩによる消化に続い
て、ＥＬＡＭ−１コード配列挿入片をとり出し、発現ベ
クターｐＣＤＮ−１中へクローン化した。
ーンを、ＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡのコード領域内の合成
オリゴマークローンを用いてのコロニーハイブリダイゼ
ーションによって得た。６クローンを単離し、ＥＬＡＭ
−１ ｃＤＮＡのコード領域に沿って一定間隔で配置さ
れる８種の異なる合成オリゴマープローブを用いて配列
決定した。全てのクローンが、ＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡ
の公表されている配列（ベヴィラクア、サイエンス、２
４３巻１１６０〜１１６５頁、１９８９年）とは異なる
ランダム分布の異種配列を含んでいた。これは、ＰＣＲ
増幅の間の誤りによると考えることができた。しかし、
ＰＣＲ増幅ＥＬＡＭ−１コード配列のクローンの全て
に、公表されている配列の１５１８位および１９１６位
のヌクレオチドにおける２種の変種が存在していた。そ
れゆえ、正しい配列はこの新しい配列であると信じられ
る。クローンの一つＳＰＥＬＡＭ−４は、１５１８位お
よび１９１６位のヌクレオチドにおける相違を除いて、
公表されている配列と同じ配列を含んでいた。このクロ
ーンから、ＮｏｔＩおよびＳｍａＩによる消化に続い
て、ＥＬＡＭ−１コード配列挿入片をとり出し、発現ベ
クターｐＣＤＮ−１中へクローン化した。
【０２５１】得られたＥＬＡＭ−１発現プラスミドをFi
g １５に示す。Fig １５は、ｐＳＶ２ＮＥＯ［サザン
（Southern）とバーグ（Berg）、ジャーナル・オヴ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジェネティックス、
１巻３２７〜３４１頁、１９８２年］から導いたＳＶ４
０初期プロモーター（斜線域）、ＳＶ４０“ｔ”スプラ
イス配列およびポリＡ付加配列（点領域）を含有するプ
ラスミドｐＣＤＮ−１［Ｔ．Ｖ．ゴパル（Gopal)、未発
表業績］を示している。プラスミドの残りはｐＢＲ３２
２（−）配列を含んでいる。重要な制限部位は図に示し
てある。ＭＣＳは多重クローニング部位を示す。ＣＯＳ
細胞におけるＥＬＡＭ−１の一過性発現の研究には、ｐ
ＥＵＫ−Ｃ１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（ク
ロンテックラボラトリーズ、カリフォルニア）などの他
の普通に入手できる哺乳動物用発現ベクターをｐＣＤＮ
−１に代えて使用できる。
g １５に示す。Fig １５は、ｐＳＶ２ＮＥＯ［サザン
（Southern）とバーグ（Berg）、ジャーナル・オヴ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジェネティックス、
１巻３２７〜３４１頁、１９８２年］から導いたＳＶ４
０初期プロモーター（斜線域）、ＳＶ４０“ｔ”スプラ
イス配列およびポリＡ付加配列（点領域）を含有するプ
ラスミドｐＣＤＮ−１［Ｔ．Ｖ．ゴパル（Gopal)、未発
表業績］を示している。プラスミドの残りはｐＢＲ３２
２（−）配列を含んでいる。重要な制限部位は図に示し
てある。ＭＣＳは多重クローニング部位を示す。ＣＯＳ
細胞におけるＥＬＡＭ−１の一過性発現の研究には、ｐ
ＥＵＫ−Ｃ１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（ク
ロンテックラボラトリーズ、カリフォルニア）などの他
の普通に入手できる哺乳動物用発現ベクターをｐＣＤＮ
−１に代えて使用できる。
【０２５２】４種のモノクローナル抗体の反応性の試験
に、模擬的にまたはＥＬＡＭ−１でトランスフェクトし
たＣＯＳ細胞を用いた。ここには示さない予備実験で、
ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトした細胞の約２〜５％
がＨＬ−６０腫瘍標的に結合するが、模擬的にトランス
フェクトした細胞は時々しかＨＬ−６０への結合を示さ
ないことが示された。模擬的にトランスフェクトされた
およびＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞を、
実施例１記載のものと同様のプレート結合アッセイでス
クリーニングした。
に、模擬的にまたはＥＬＡＭ−１でトランスフェクトし
たＣＯＳ細胞を用いた。ここには示さない予備実験で、
ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトした細胞の約２〜５％
がＨＬ−６０腫瘍標的に結合するが、模擬的にトランス
フェクトした細胞は時々しかＨＬ−６０への結合を示さ
ないことが示された。模擬的にトランスフェクトされた
およびＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞を、
実施例１記載のものと同様のプレート結合アッセイでス
クリーニングした。
【０２５３】要約すると、ＣＯＳ細胞（２×１０4 ／ウ
エル）を、アッセイ２４時間前、トランスフェクション
４８時間後に、マイクロタイターウエルに植えた。細胞
を、培地のみ（対照）または４種の精製モノクローナル
抗体の各々１μｇ／mlと共にインキュベートし、続いて
ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体および 125Ｉ−ストレプ
トアビジンと共にインキュベートした。
エル）を、アッセイ２４時間前、トランスフェクション
４８時間後に、マイクロタイターウエルに植えた。細胞
を、培地のみ（対照）または４種の精製モノクローナル
抗体の各々１μｇ／mlと共にインキュベートし、続いて
ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体および 125Ｉ−ストレプ
トアビジンと共にインキュベートした。
【０２５４】トランスフェクション（形質転換）は次の
ように行った。ｐＣＤＮ ＥＬＡＭ−１プラスミドＤＮ
Ａ２０μｇで約１×１０6 ＣＯＳ細胞を、ウィグラー
（Wigler）ら（セル、１６巻７７７〜７８５頁、１９７
９年）のＤＮＡ−ＣａＰＯ4 共沈法によりトランスフェ
クトした。ＤＮＡ−ＣａＰＯ4 沈澱を添加してから４時
間後、細胞を１５％グリセロールにより、パーカー（Pa
rker）とスターク（Stark)（ジャーナル・オヴ・ヴィロ
ロジー、３１巻３６０〜３９６頁、１９７９年）の方法
に従い、室温で２分間処理した。挿入断片を有さないベ
クタープラスミドＤＮＡを対照として同量用いて、１×
１０6 細胞をトランスフェクトして、模擬的にトランス
フェクトされた細胞を得た。グリセロールショックから
約４８時間後に細胞を集め、抗体結合研究に用いた。Ｅ
ＬＡＭ−１でトランスフェクトした細胞はＨＬ６０細胞
を効果的に結合したが、模擬的にトランスフェクトされ
た細胞はそうではなかった（データは示さない）。
ように行った。ｐＣＤＮ ＥＬＡＭ−１プラスミドＤＮ
Ａ２０μｇで約１×１０6 ＣＯＳ細胞を、ウィグラー
（Wigler）ら（セル、１６巻７７７〜７８５頁、１９７
９年）のＤＮＡ−ＣａＰＯ4 共沈法によりトランスフェ
クトした。ＤＮＡ−ＣａＰＯ4 沈澱を添加してから４時
間後、細胞を１５％グリセロールにより、パーカー（Pa
rker）とスターク（Stark)（ジャーナル・オヴ・ヴィロ
ロジー、３１巻３６０〜３９６頁、１９７９年）の方法
に従い、室温で２分間処理した。挿入断片を有さないベ
クタープラスミドＤＮＡを対照として同量用いて、１×
１０6 細胞をトランスフェクトして、模擬的にトランス
フェクトされた細胞を得た。グリセロールショックから
約４８時間後に細胞を集め、抗体結合研究に用いた。Ｅ
ＬＡＭ−１でトランスフェクトした細胞はＨＬ６０細胞
を効果的に結合したが、模擬的にトランスフェクトされ
た細胞はそうではなかった（データは示さない）。
【０２５５】同じ結果を与えた３回の実験の一つからの
データをFig １６に示す。この図で、結果は、ウエル当
りの総ｃｐｍの平均（±s.e.m.、ｎ＝３）として表わさ
れている。この図は、１Ｅ７抗体も２Ｇ７抗体もＥＬＡ
Ｍ−１遺伝子産物と反応しないが、３Ｂ７および７Ａ９
は共に反応することを示している。この反応性パターン
は、代謝性標識後のこれらと同じ細胞の免疫沈降解析に
よって確認された。３Ｂ７および７Ａ９抗原のみが、Ｅ
ＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞からの約１０
０ｋＤａの分子質量の蛋白質を沈降させたが、模擬的に
トランスフェクトされた細胞からのそれは沈降させなか
った（データは示さない）。それゆえ、簡単化のため、
２Ｇ７および７Ａ９抗体のみを、これら２種の蛋白質の
以下の比較の大部分で用いた。
データをFig １６に示す。この図で、結果は、ウエル当
りの総ｃｐｍの平均（±s.e.m.、ｎ＝３）として表わさ
れている。この図は、１Ｅ７抗体も２Ｇ７抗体もＥＬＡ
Ｍ−１遺伝子産物と反応しないが、３Ｂ７および７Ａ９
は共に反応することを示している。この反応性パターン
は、代謝性標識後のこれらと同じ細胞の免疫沈降解析に
よって確認された。３Ｂ７および７Ａ９抗原のみが、Ｅ
ＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞からの約１０
０ｋＤａの分子質量の蛋白質を沈降させたが、模擬的に
トランスフェクトされた細胞からのそれは沈降させなか
った（データは示さない）。それゆえ、簡単化のため、
２Ｇ７および７Ａ９抗体のみを、これら２種の蛋白質の
以下の比較の大部分で用いた。
【０２５６】（Ｄ）ツニカマイシン処理後のＩＣＡＭ−
１、２Ｇ７および７Ｇ９蛋白質の比較：Ｎ結合糖鎖の程
度についてＩＣＡＭ−１、２Ｇ７および７Ａ９蛋白質を
さらに比較した。コンフルエントＨＵＶＥＣを、ＩＬ−
１ １ng／mlの存在下に、ツニカマイシンＢ２ １μｇ
／mlの存在下または不存在下に６時間処理した。ツニカ
マイシンは、ＩＬ−１および35Ｓ−システインの添加時
に添加した。トライトンＸ−１００溶解産物を、上記と
同様に、ただしウエルを６０℃の湯浴中還元性試料緩衝
液で５分間抽出して、免疫沈降させた。免疫沈降物を１
０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲルで分析し
た。トライトンＸ−１００溶解産物は、上記のトライト
ンＸ−１１４溶解産物の場合と同様にして調製した。た
だし、相分離操作は省略した。
１、２Ｇ７および７Ｇ９蛋白質の比較：Ｎ結合糖鎖の程
度についてＩＣＡＭ−１、２Ｇ７および７Ａ９蛋白質を
さらに比較した。コンフルエントＨＵＶＥＣを、ＩＬ−
１ １ng／mlの存在下に、ツニカマイシンＢ２ １μｇ
／mlの存在下または不存在下に６時間処理した。ツニカ
マイシンは、ＩＬ−１および35Ｓ−システインの添加時
に添加した。トライトンＸ−１００溶解産物を、上記と
同様に、ただしウエルを６０℃の湯浴中還元性試料緩衝
液で５分間抽出して、免疫沈降させた。免疫沈降物を１
０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲルで分析し
た。トライトンＸ−１００溶解産物は、上記のトライト
ンＸ−１１４溶解産物の場合と同様にして調製した。た
だし、相分離操作は省略した。
【０２５７】結果をFig １７に示す。Fig １７は、ＩＣ
ＡＭ−１糖蛋白質が、ツニカマイシン処理後に、天然お
よびコア蛋白質構造の混合物として存在し、コア蛋白質
構造は５０ｋＤａのところにあることを示している。１
１４ｋＤａおよび９５ｋＤａの強いおよび弱いバンドを
有する２Ｇ７免疫沈降物は、ツニカマイシン処理後に、
天然の１１４ｋＤａおよび８０ｋＤａのコア蛋白質の混
合物として存在していた。１１４ｋＤａバンドの発現の
減少は、ツニカマイシンがこの蛋白質の合成を若干低下
させた可能性を示唆している。２−Ｄゲルに見られる複
雑なパターンと一致する７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原
は、１１０ｋＤａ領域の幅広いバンドであり、これはツ
ニカマイシン処理後にほとんど完全に分子質量約６７ｋ
Ｄａの蛋白質へと減成される。
ＡＭ−１糖蛋白質が、ツニカマイシン処理後に、天然お
よびコア蛋白質構造の混合物として存在し、コア蛋白質
構造は５０ｋＤａのところにあることを示している。１
１４ｋＤａおよび９５ｋＤａの強いおよび弱いバンドを
有する２Ｇ７免疫沈降物は、ツニカマイシン処理後に、
天然の１１４ｋＤａおよび８０ｋＤａのコア蛋白質の混
合物として存在していた。１１４ｋＤａバンドの発現の
減少は、ツニカマイシンがこの蛋白質の合成を若干低下
させた可能性を示唆している。２−Ｄゲルに見られる複
雑なパターンと一致する７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原
は、１１０ｋＤａ領域の幅広いバンドであり、これはツ
ニカマイシン処理後にほとんど完全に分子質量約６７ｋ
Ｄａの蛋白質へと減成される。
【０２５８】（Ｅ）２Ｇ７および７Ａ９（ＥＬＡＭ−
１）抗原のシアル酸含量：２Ｇ７および７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）抗原の免疫沈降物の２−Ｄゲル分析で示された
スポットのパターン（Fig １２およびFig １３）は、シ
アル酸含量の相異によるのかもしれないところの電荷不
均一性を示唆する。それゆえ、ＨＵＶＥＣを35Ｓ−シス
テインの存在下にＩＬ−１で６時間活性化し、ＰＢＳ／
ＥＤＴＡ（対照）またはノイラミニダーゼ処理によって
脱着させた。このような細胞の生育力は常に９５％以上
であった。これらの細胞のトライトンＸ−１００抽出物
（上記と同様にして得た）を２Ｇ７または７Ａ９抗体に
より上記の方法で免疫沈降させた。これらの免疫沈降物
の２−Ｄゲル分析（上記と同様に実施）を行った。
１）抗原のシアル酸含量：２Ｇ７および７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）抗原の免疫沈降物の２−Ｄゲル分析で示された
スポットのパターン（Fig １２およびFig １３）は、シ
アル酸含量の相異によるのかもしれないところの電荷不
均一性を示唆する。それゆえ、ＨＵＶＥＣを35Ｓ−シス
テインの存在下にＩＬ−１で６時間活性化し、ＰＢＳ／
ＥＤＴＡ（対照）またはノイラミニダーゼ処理によって
脱着させた。このような細胞の生育力は常に９５％以上
であった。これらの細胞のトライトンＸ−１００抽出物
（上記と同様にして得た）を２Ｇ７または７Ａ９抗体に
より上記の方法で免疫沈降させた。これらの免疫沈降物
の２−Ｄゲル分析（上記と同様に実施）を行った。
【０２５９】ＨＵＶＥＣのノイラミニダーゼ処理は次の
ように行った。細胞を１回Ｄ−ＰＢＳで洗い、0.05Ｕの
ノイラミニダーゼのＰＢＳ溶液を約３×１０6 個の細胞
に３７℃で２０分間加えておいた。脱離して完全に生育
力のある細胞を遠心分離で集め、上述のように１％トラ
イトンＸ−１１４の添加によって溶解させた。
ように行った。細胞を１回Ｄ−ＰＢＳで洗い、0.05Ｕの
ノイラミニダーゼのＰＢＳ溶液を約３×１０6 個の細胞
に３７℃で２０分間加えておいた。脱離して完全に生育
力のある細胞を遠心分離で集め、上述のように１％トラ
イトンＸ−１１４の添加によって溶解させた。
【０２６０】Fig １８は、４つの２−Ｄゲルの各々の一
部を示す。両抗原について、検出可能なスポットの数に
有意の減少があり、同時に、分子量が約５ｋＤａ減少
し、等電点として約０．５だけ電荷の増大した新しいス
ポット（単数または複数）が出現した。これは、両蛋白
質が種々の置換度でシアル酸を含有することの証拠であ
る。
部を示す。両抗原について、検出可能なスポットの数に
有意の減少があり、同時に、分子量が約５ｋＤａ減少
し、等電点として約０．５だけ電荷の増大した新しいス
ポット（単数または複数）が出現した。これは、両蛋白
質が種々の置換度でシアル酸を含有することの証拠であ
る。
【０２６１】（Ｆ）２Ｇ７および７Ａ９（ＥＬＡＭ−
１）抗原のＯ−結合糖含量：両抗原の35Ｓ−システイン
免疫沈降物（マイクロタイターウエル中で上記の通り調
製）をまず消化用緩衝液のみまたはノイラミニダーゼ
（ベーリンガーマンハイム）１Ｕ／ml含有緩衝液により
３７℃で１時間処理した。消化用緩衝液は、１ｍＭ酢酸
カルシウムを含有する０．１５５Ｍリン酸ナトリウム、
ｐＨ６．０からなっていた。消化用緩衝液はこのほか
に、ロネットら［ロネット（Ronnett)ら、ジャーナル・
オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻４５６
６〜４５７５頁、１９８４年］記載通りのプロテアーゼ
インヒビターのカクテル（ロイペプチン、ベンズアミジ
ン、アプロチニン、アンチパイン、ペプスタチンおよび
キモスタチンからなる）を含んでいた。ノイラミニダー
ゼ処理後、ウエルを未処理のままでおくかまたはノイラ
ミニダーゼ処理に用いたのと同じ緩衝液中の２５ｍＵ／
mlのエンド−アルファー−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ（Ｏ−グリカナーゼ）で処理した。Ｏ−グリカナ
ーゼ処理は３７℃で一夜続けた。翌日、ウエルをＰＢＳ
−トウィーンで２回洗い、試料緩衝液で上記と同様に抽
出し、抽出物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元
性ゲルで分析した。
１）抗原のＯ−結合糖含量：両抗原の35Ｓ−システイン
免疫沈降物（マイクロタイターウエル中で上記の通り調
製）をまず消化用緩衝液のみまたはノイラミニダーゼ
（ベーリンガーマンハイム）１Ｕ／ml含有緩衝液により
３７℃で１時間処理した。消化用緩衝液は、１ｍＭ酢酸
カルシウムを含有する０．１５５Ｍリン酸ナトリウム、
ｐＨ６．０からなっていた。消化用緩衝液はこのほか
に、ロネットら［ロネット（Ronnett)ら、ジャーナル・
オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻４５６
６〜４５７５頁、１９８４年］記載通りのプロテアーゼ
インヒビターのカクテル（ロイペプチン、ベンズアミジ
ン、アプロチニン、アンチパイン、ペプスタチンおよび
キモスタチンからなる）を含んでいた。ノイラミニダー
ゼ処理後、ウエルを未処理のままでおくかまたはノイラ
ミニダーゼ処理に用いたのと同じ緩衝液中の２５ｍＵ／
mlのエンド−アルファー−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ（Ｏ−グリカナーゼ）で処理した。Ｏ−グリカナ
ーゼ処理は３７℃で一夜続けた。翌日、ウエルをＰＢＳ
−トウィーンで２回洗い、試料緩衝液で上記と同様に抽
出し、抽出物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元
性ゲルで分析した。
【０２６２】結果をFig １９に示す。Fig １９に示した
ように、無傷の細胞の処理によって得られた結果（Fig
１８）と一致して、ノイラミニダーゼ処理後に２Ｇ７お
よび７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）両抗原について約５ｋＤａ
の質量減少があった。Ｏ−結合糖除去処理は、２回の実
験で、２Ｇ７および７Ａ９両抗原について、約１〜２ｋ
Ｄａの僅かな質量減少を惹起しただけであった。
ように、無傷の細胞の処理によって得られた結果（Fig
１８）と一致して、ノイラミニダーゼ処理後に２Ｇ７お
よび７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）両抗原について約５ｋＤａ
の質量減少があった。Ｏ−結合糖除去処理は、２回の実
験で、２Ｇ７および７Ａ９両抗原について、約１〜２ｋ
Ｄａの僅かな質量減少を惹起しただけであった。
【０２６３】（Ｇ）抗原合成の動態：２Ｇ７および７Ａ
９糖蛋白質の類似点および差をさらに示すため、それら
糖蛋白質を、ＨＵＶＥＣ培養にＩＬ−１を添加したのち
の種々の時点で上記と同様にして免疫沈降させた。ＩＬ
−１添加時に35Ｓ−システインを加えた。トライトンＸ
−１００溶解物をつくり、２Ｇ７または７Ａ９抗体によ
って免疫沈降物を形成させた。免疫沈降物を１０％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド還元性ゲルを用いて分析した。
９糖蛋白質の類似点および差をさらに示すため、それら
糖蛋白質を、ＨＵＶＥＣ培養にＩＬ−１を添加したのち
の種々の時点で上記と同様にして免疫沈降させた。ＩＬ
−１添加時に35Ｓ−システインを加えた。トライトンＸ
−１００溶解物をつくり、２Ｇ７または７Ａ９抗体によ
って免疫沈降物を形成させた。免疫沈降物を１０％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド還元性ゲルを用いて分析した。
【０２６４】Fig ２０に示した結果は、１時間目にのみ
弱いながらも７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原を検出できる
ことを示している。それは、この時点でのその質量が、
ツニカマイシン処理後の６７ｋＤａではなく、約７９ｋ
Ｄａであるので、恐らく既にある程度のグリコシル化を
受けているのであろう。２時間後には、２Ｇ７免疫沈降
物は、約９５ｋＤａおよび１１４ｋＤａのところに強度
の等しい２本のバンドを示し、一方、この時点で、７Ａ
９（ＥＬＡＭ−１）抗原は９５ｋＤａ付近の幅広いバン
ドという「成熟」形になっている。６時間後、２Ｇ７抗
原は１１４ｋＤａに強いバンドを示す。
弱いながらも７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原を検出できる
ことを示している。それは、この時点でのその質量が、
ツニカマイシン処理後の６７ｋＤａではなく、約７９ｋ
Ｄａであるので、恐らく既にある程度のグリコシル化を
受けているのであろう。２時間後には、２Ｇ７免疫沈降
物は、約９５ｋＤａおよび１１４ｋＤａのところに強度
の等しい２本のバンドを示し、一方、この時点で、７Ａ
９（ＥＬＡＭ−１）抗原は９５ｋＤａ付近の幅広いバン
ドという「成熟」形になっている。６時間後、２Ｇ７抗
原は１１４ｋＤａに強いバンドを示す。
【０２６５】（Ｈ）競合結合アッセイ：これら２種の蛋
白質上で異なるモノクローナル抗体によって規定される
４つのエピトープの空間的関係を調べるために、精製モ
ノクローナル抗体の各々をＦＩＴＣと結合させ、それら
の同種および異種の組合せにおける競合能をフローサイ
トメトリーによって調べる競合結合アッセイを行った。
白質上で異なるモノクローナル抗体によって規定される
４つのエピトープの空間的関係を調べるために、精製モ
ノクローナル抗体の各々をＦＩＴＣと結合させ、それら
の同種および異種の組合せにおける競合能をフローサイ
トメトリーによって調べる競合結合アッセイを行った。
【０２６６】各モノクローナル抗体１Ｅ７、２Ｇ７、７
Ａ９、３Ｂ７のＦＩＴＣ結合物を、ＩＬ−１活性化内皮
細胞に作用させて、飽和を僅かに下まわる用量を求め
た。この用量のＦＩＴＣ抗体を未結合モノクローナル抗
体４種の各々の５０倍過剰と予備混合した。この混合物
を次に、１％ＢＳＡおよび０．０２％ナトリウムアジド
含有ＰＢＳ中でＩＬ−１活性化ＨＵＶＥＣの単細胞懸濁
液に４℃で３０分間加えておいた。細胞を同じ緩衝液で
３回洗い、再懸濁してフローサイトメトリー分析に用い
た。
Ａ９、３Ｂ７のＦＩＴＣ結合物を、ＩＬ−１活性化内皮
細胞に作用させて、飽和を僅かに下まわる用量を求め
た。この用量のＦＩＴＣ抗体を未結合モノクローナル抗
体４種の各々の５０倍過剰と予備混合した。この混合物
を次に、１％ＢＳＡおよび０．０２％ナトリウムアジド
含有ＰＢＳ中でＩＬ−１活性化ＨＵＶＥＣの単細胞懸濁
液に４℃で３０分間加えておいた。細胞を同じ緩衝液で
３回洗い、再懸濁してフローサイトメトリー分析に用い
た。
【０２６７】ｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸緩衝液中４mg／
mlでのモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）のＦＩＴＣとの
結合は文献記載通りに［ハーディ（Hardy)、ハンドブッ
ク・オヴ・エクスペリメンタル・インムノロジー第４版
１巻、１９８６年（Ｄ．Ｍ．ウエア（Weir）編、ブラッ
クウエル・サイエンティフィック・パブリケィション
ズ、オックスフォード、英国、３１０１〜３１１２頁］
行った。
mlでのモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）のＦＩＴＣとの
結合は文献記載通りに［ハーディ（Hardy)、ハンドブッ
ク・オヴ・エクスペリメンタル・インムノロジー第４版
１巻、１９８６年（Ｄ．Ｍ．ウエア（Weir）編、ブラッ
クウエル・サイエンティフィック・パブリケィション
ズ、オックスフォード、英国、３１０１〜３１１２頁］
行った。
【０２６８】結果をFig ２１に示す。図に示した４実験
の各々に用いた特定のＦＩＴＣ−抗体は次の通りであっ
た：Fig ２１Ａ：１Ｅ７；Fig ２１Ｂ：２Ｇ７；Fig ２
１Ｃ：３Ｂ７；Fig ２１Ｄ：７Ａ９。縦軸は陽性細胞％
を示す。
の各々に用いた特定のＦＩＴＣ−抗体は次の通りであっ
た：Fig ２１Ａ：１Ｅ７；Fig ２１Ｂ：２Ｇ７；Fig ２
１Ｃ：３Ｂ７；Fig ２１Ｄ：７Ａ９。縦軸は陽性細胞％
を示す。
【０２６９】結果は、５０倍過剰で１Ｅ７、２Ｇ７およ
び３Ｂ７は同種ＦＩＴＣ−モノクローナル抗体の結合に
対してのみ競合することを示している。７Ａ９抗体は、
２Ｇ７抗体の結合を再現性よく妨害し、２Ｇ７：７Ａ９
モル比１：５０のとき極大６２％である点で、異なって
いる。
び３Ｂ７は同種ＦＩＴＣ−モノクローナル抗体の結合に
対してのみ競合することを示している。７Ａ９抗体は、
２Ｇ７抗体の結合を再現性よく妨害し、２Ｇ７：７Ａ９
モル比１：５０のとき極大６２％である点で、異なって
いる。
【０２７０】（Ｉ）細胞表面での抗原発現の動態：ＨＵ
ＶＥＣを１ng／mlのＩＬ−１中種々の時間培養し、本質
的にハイブリドーマスクリーニングアッセイのために行
ったと同様の９６ウエルプレート結合アッセイ法により
２Ｇ７および７Ａ９抗原について分析した。全ての細胞
を同時に分析した。
ＶＥＣを１ng／mlのＩＬ−１中種々の時間培養し、本質
的にハイブリドーマスクリーニングアッセイのために行
ったと同様の９６ウエルプレート結合アッセイ法により
２Ｇ７および７Ａ９抗原について分析した。全ての細胞
を同時に分析した。
【０２７１】結果をFig ２２に示す。図での黒丸は抗体
２Ｇ７を黒三角形は抗体７Ａ９を表わす。結果は平均c.
p.m.±s.e.m.（ｎ＝３）として表わしてある。
２Ｇ７を黒三角形は抗体７Ａ９を表わす。結果は平均c.
p.m.±s.e.m.（ｎ＝３）として表わしてある。
【０２７２】Fig ２２に示した結果は、２時間までに７
Ａ９（ＥＬＡＭ−１）蛋白質が極大に発現され、一方２
Ｇ７抗原は極大の半分しか発現されないことを示してい
る。４時間後には、２Ｇ７抗原が極大レベルに達してい
る。この結果は、生合成標識実験（Fig ２０）での７Ａ
９（ＥＬＡＭ−１）蛋白質の若干早い発現と一致してい
る。興味あることには、ひき続いてのＩＬ−１の存在下
で、両蛋白質が７日間まで細胞表面で高レベルに発現さ
れている。ＩＬ−１を除去すると、それらは２４時間以
内に基線レベルへもどる（データは示さない）。
Ａ９（ＥＬＡＭ−１）蛋白質が極大に発現され、一方２
Ｇ７抗原は極大の半分しか発現されないことを示してい
る。４時間後には、２Ｇ７抗原が極大レベルに達してい
る。この結果は、生合成標識実験（Fig ２０）での７Ａ
９（ＥＬＡＭ−１）蛋白質の若干早い発現と一致してい
る。興味あることには、ひき続いてのＩＬ−１の存在下
で、両蛋白質が７日間まで細胞表面で高レベルに発現さ
れている。ＩＬ−１を除去すると、それらは２４時間以
内に基線レベルへもどる（データは示さない）。
【０２７３】（Ｊ）２Ｇ７および７Ａ９抗原の細胞分
布：種々の初代培養細胞を、ＩＬ−１処理を行いまたは
行わずに、２Ｇ７または７Ａ９糖蛋白質の発現について
試験した。これらの実験は、実質的にハイブリッドーマ
スクリーニングアッセイで行った通りに、９６ウエルプ
レート中で行った。すなわち、所定の細胞タイプを９６
ウエルプレートに置いた。アッセイの２４時間前に次の
細胞を記載の濃度で播いた：線維芽細胞、ケラチノサイ
トおよびＨＵＶＥＣ、２×１０4 ／ウエル；アッセイの
日に、末梢血モノクローナル細胞を５×１０4 ／ウエ
ル、顆粒球を１０5 ／ウエル、血小板を１０5 ／ウエル
接種した。血小板は、抗原発現アッセイ前の１時間にわ
たり１Ｕのヒトアルファートロンビンにより刺激した。
布：種々の初代培養細胞を、ＩＬ−１処理を行いまたは
行わずに、２Ｇ７または７Ａ９糖蛋白質の発現について
試験した。これらの実験は、実質的にハイブリッドーマ
スクリーニングアッセイで行った通りに、９６ウエルプ
レート中で行った。すなわち、所定の細胞タイプを９６
ウエルプレートに置いた。アッセイの２４時間前に次の
細胞を記載の濃度で播いた：線維芽細胞、ケラチノサイ
トおよびＨＵＶＥＣ、２×１０4 ／ウエル；アッセイの
日に、末梢血モノクローナル細胞を５×１０4 ／ウエ
ル、顆粒球を１０5 ／ウエル、血小板を１０5 ／ウエル
接種した。血小板は、抗原発現アッセイ前の１時間にわ
たり１Ｕのヒトアルファートロンビンにより刺激した。
【０２７４】結果を表４に示す。
【０２７５】
【表４】
【０２７６】表４の結果は、線維芽細胞、顆粒球、未分
画末梢血単核細胞、ケラチノサイトまたは血小板（トロ
ンビン刺激ありまたはなし）上ではこれらの抗原が検出
可能なレベルでは発現されないことを示している。血小
板は、高レベルの非特異的 125Ｉ−ストレプトアビジン
結合を示すようであった。
画末梢血単核細胞、ケラチノサイトまたは血小板（トロ
ンビン刺激ありまたはなし）上ではこれらの抗原が検出
可能なレベルでは発現されないことを示している。血小
板は、高レベルの非特異的 125Ｉ−ストレプトアビジン
結合を示すようであった。
【０２７７】（Ｋ）１Ｅ７／２Ｇ７および７Ａ９／３Ｂ
７抗原発現に対するＴＮＦ、ＬＰＳおよびＩＦＮγの影
響：４時間の１ｐｓ刺激、６時間のＴＮＦ刺激および長
期ＩＦＮγ刺激が１Ｅ７／２Ｇ７抗原および７Ａ９／３
Ｂ７抗原の発現に及ぼす影響を検討した。すなわち、Ｈ
ＵＶＥＣを次の通り種々の誘発剤に曝露した：ガンマ−
ＩＦＮ、１００μｇ／ml、２．５日間；１ｐｓ、１μｇ
／ml、６時間；ＴＮＦ、１μｇ／ml、４時間；ＩＬ−
１、１ng／ml、４時間。これらの誘発剤を洗い除いたの
ち、所定の抗体を飽和用量で用いてプレート結合アッセ
イでの抗原発現を調べた。
７抗原発現に対するＴＮＦ、ＬＰＳおよびＩＦＮγの影
響：４時間の１ｐｓ刺激、６時間のＴＮＦ刺激および長
期ＩＦＮγ刺激が１Ｅ７／２Ｇ７抗原および７Ａ９／３
Ｂ７抗原の発現に及ぼす影響を検討した。すなわち、Ｈ
ＵＶＥＣを次の通り種々の誘発剤に曝露した：ガンマ−
ＩＦＮ、１００μｇ／ml、２．５日間；１ｐｓ、１μｇ
／ml、６時間；ＴＮＦ、１μｇ／ml、４時間；ＩＬ−
１、１ng／ml、４時間。これらの誘発剤を洗い除いたの
ち、所定の抗体を飽和用量で用いてプレート結合アッセ
イでの抗原発現を調べた。
【０２７８】結果を表５に示した。平均±s.e.m.（ｎ＝
３）として表現されている。
３）として表現されている。
【０２７９】
【表５】
【０２８０】先にＥＬＡＭ−１について示したように、
ｌｐｓおよびＴＮＦ刺激は１Ｅ７／２Ｇ７蛋白質の発現
をもたらした。しかし、ＩＦＮγは、２．５日間のイン
キューベーション後に、ＨＬＡ−ＤＲを予期通り発現さ
せたが、１Ｅ７／２Ｇ７誘発には無効であった。
ｌｐｓおよびＴＮＦ刺激は１Ｅ７／２Ｇ７蛋白質の発現
をもたらした。しかし、ＩＦＮγは、２．５日間のイン
キューベーション後に、ＨＬＡ−ＤＲを予期通り発現さ
せたが、１Ｅ７／２Ｇ７誘発には無効であった。
【０２８１】（Ｌ）３Ａ２抗原の表面発現：１ng／mlの
ＩＬ−１で４時間前処理し、５０μｇ／mlの３Ａ２抗体
で染色した内皮細胞のフローサイトメトリー分析を行っ
た。相対蛍光強度から任意単位での細胞数を求めた。比
較のため、ＨＬＡおよびＩＣＡＭ−１抗原の発現も、Ｗ
６／３２抗ＨＬＡ抗原および抗ＩＣＡＭ−１抗体ＲＲ／
１を用いて調べた。フローサイトメトリーは上記と同様
に行った。染色は、ＦＩＴＣ標識抗体を用いて常法によ
り行った。
ＩＬ−１で４時間前処理し、５０μｇ／mlの３Ａ２抗体
で染色した内皮細胞のフローサイトメトリー分析を行っ
た。相対蛍光強度から任意単位での細胞数を求めた。比
較のため、ＨＬＡおよびＩＣＡＭ−１抗原の発現も、Ｗ
６／３２抗ＨＬＡ抗原および抗ＩＣＡＭ−１抗体ＲＲ／
１を用いて調べた。フローサイトメトリーは上記と同様
に行った。染色は、ＦＩＴＣ標識抗体を用いて常法によ
り行った。
【０２８２】結果をFig ２３に示す。Fig ２３は、間接
試薬のみ（Fig ２３Ａ）、Ｗ６／３２抗ＨＬＡ抗原（Fi
g ２３Ｂ）、抗ＩＣＡＭ−１抗体ＲＲ／１（Fig ２３
Ｃ）および３Ａ２抗体（Fig ２３Ｄ）で染色した休止
（……）またはＩＬ−１刺激（−）内皮細胞を示してい
る。
試薬のみ（Fig ２３Ａ）、Ｗ６／３２抗ＨＬＡ抗原（Fi
g ２３Ｂ）、抗ＩＣＡＭ−１抗体ＲＲ／１（Fig ２３
Ｃ）および３Ａ２抗体（Fig ２３Ｄ）で染色した休止
（……）またはＩＬ−１刺激（−）内皮細胞を示してい
る。
【０２８３】３Ａ２抗体によって規定される抗原は、休
止内皮細胞の表面には検出されないが、ＩＬ−１に曝露
後は、２時間以内に検出可能となる。結果は、ＨＬＡま
たはＩＣＡＭ−１蛋白質とは異なり、３Ａ２抗体がチャ
ンネル５０からチャンネル１５０にわたる、蛍光強度約
８倍範囲の、不均一分布の抗原を検出することを示して
いる。最も強く陽性の細胞は、蛍光強度で、ＩＣＡＭ−
１よりは低いが、ＨＬＡ抗原と同等である。先に報告さ
れているように（ダスティンとスプリンガー、ジャーナ
ル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、１０７巻３
２１〜３３１頁、１９８８年）、ＩＣＡＭ−１は、４時
間のＩＬ−１曝露ののち内皮細胞上で約８倍の増加を示
している。
止内皮細胞の表面には検出されないが、ＩＬ−１に曝露
後は、２時間以内に検出可能となる。結果は、ＨＬＡま
たはＩＣＡＭ−１蛋白質とは異なり、３Ａ２抗体がチャ
ンネル５０からチャンネル１５０にわたる、蛍光強度約
８倍範囲の、不均一分布の抗原を検出することを示して
いる。最も強く陽性の細胞は、蛍光強度で、ＩＣＡＭ−
１よりは低いが、ＨＬＡ抗原と同等である。先に報告さ
れているように（ダスティンとスプリンガー、ジャーナ
ル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、１０７巻３
２１〜３３１頁、１９８８年）、ＩＣＡＭ−１は、４時
間のＩＬ−１曝露ののち内皮細胞上で約８倍の増加を示
している。
【０２８４】（Ｍ）３Ａ２抗原の組織発現：顆粒球、末
梢血単核細胞（ＰＢＬ）、ケラチノサイトおよび線維芽
細胞について、１ng／mlのＩＬ−１に４時間曝露する前
および曝露後の３Ａ２抗原の膜発現を調べた。使用した
方法は、１Ｅ７／２Ｇ７および７Ａ９／３Ｂ７抗原につ
いて上記した方法である。ただし、細胞をトロンビンの
代りにＩＬ−１で刺激した。結果を表６に示す。
梢血単核細胞（ＰＢＬ）、ケラチノサイトおよび線維芽
細胞について、１ng／mlのＩＬ−１に４時間曝露する前
および曝露後の３Ａ２抗原の膜発現を調べた。使用した
方法は、１Ｅ７／２Ｇ７および７Ａ９／３Ｂ７抗原につ
いて上記した方法である。ただし、細胞をトロンビンの
代りにＩＬ−１で刺激した。結果を表６に示す。
【０２８５】
【表６】
【０２８６】表６は、内皮細胞のみが３Ａ２抗原発現誘
発性を示したことを示している。
発性を示したことを示している。
【０２８７】（Ｎ）３Ａ２抗原の特性決定：初期継代内
皮細胞を、１ng／mlのＩＬ−１および２５０μＣｉの35
Ｓ−システインの存在下または不存在下に、４時間培養
し、35Ｓ−システイン標識細胞を１％トライトンＸ−１
００で溶解し、上記と同様にして、内皮Ｔ細胞付着構造
指向性の抗体３Ａ２、７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）または
２Ｇ７で免疫沈降させた。免疫沈降物を、還元条件下の
８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。
結果をFig ２４に示す。図中、（−）は無処理の、
（＋）はＩＬ−１処理細胞を示す。結果は、ＩＬ−１未
処理細胞はＥＬＡＭ−１抗原を示さないが、ＩＬ−１処
理細胞は、予期通り７Ａ９抗体と反応する１１０〜１２
０ｋＤａの分子および上記の通り２Ｇ７抗体と反応する
１１４ｋＤａの蛋白質を沈降させることを示している。
３Ａ２抗体は、ＩＬ−１の存在下および不存在下に１７
０ｋＤａの蛋白質を沈降させる。さらに、３Ａ２抗体
は、ＩＬ−１処理細胞のみから、２Ｇ７および７Ａ９蛋
白質の領域に弱い１本のバンドを沈降させる。この結果
は、３Ａ２抗原複合体が２種の蛋白質またはサブユニッ
トからなり、そのうちの一方が構成性、他方が誘導性で
ある可能性を示唆する。細胞表面でのＩＬ−１による３
Ａ２抗原の発現は誘導性であるが（Fig ２３）、細胞質
内での抗原の発現は構成性であるかもしれない。
皮細胞を、１ng／mlのＩＬ−１および２５０μＣｉの35
Ｓ−システインの存在下または不存在下に、４時間培養
し、35Ｓ−システイン標識細胞を１％トライトンＸ−１
００で溶解し、上記と同様にして、内皮Ｔ細胞付着構造
指向性の抗体３Ａ２、７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）または
２Ｇ７で免疫沈降させた。免疫沈降物を、還元条件下の
８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。
結果をFig ２４に示す。図中、（−）は無処理の、
（＋）はＩＬ−１処理細胞を示す。結果は、ＩＬ−１未
処理細胞はＥＬＡＭ−１抗原を示さないが、ＩＬ−１処
理細胞は、予期通り７Ａ９抗体と反応する１１０〜１２
０ｋＤａの分子および上記の通り２Ｇ７抗体と反応する
１１４ｋＤａの蛋白質を沈降させることを示している。
３Ａ２抗体は、ＩＬ−１の存在下および不存在下に１７
０ｋＤａの蛋白質を沈降させる。さらに、３Ａ２抗体
は、ＩＬ−１処理細胞のみから、２Ｇ７および７Ａ９蛋
白質の領域に弱い１本のバンドを沈降させる。この結果
は、３Ａ２抗原複合体が２種の蛋白質またはサブユニッ
トからなり、そのうちの一方が構成性、他方が誘導性で
ある可能性を示唆する。細胞表面でのＩＬ−１による３
Ａ２抗原の発現は誘導性であるが（Fig ２３）、細胞質
内での抗原の発現は構成性であるかもしれない。
【０２８８】（Ｏ）細胞膜での３Ａ２、２Ｇ７および７
Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原の発現はＲＮＡおよび蛋白質
の合成を必要とする：９６ウエル平底プレート中の単層
培養中の内皮細胞を、１μｇ／mlのシクロヘキシミドで
３０分間または１μｇ／mlのアクチノマイシンＤで１５
分間、ＩＬ−１の添加に先立って前処理した。
Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原の発現はＲＮＡおよび蛋白質
の合成を必要とする：９６ウエル平底プレート中の単層
培養中の内皮細胞を、１μｇ／mlのシクロヘキシミドで
３０分間または１μｇ／mlのアクチノマイシンＤで１５
分間、ＩＬ−１の添加に先立って前処理した。
【０２８９】ＩＬ−１活性化の間、薬品を培養内に残し
ておいた。４時間後、培養物を洗い、上記通りのプレー
ト結合アッセイにおいて、相当するモノクローナル抗体
と共にインキュベートした。単層培養中の生細胞につい
て、これら３種の蛋白質の表面発現を調べた。
ておいた。４時間後、培養物を洗い、上記通りのプレー
ト結合アッセイにおいて、相当するモノクローナル抗体
と共にインキュベートした。単層培養中の生細胞につい
て、これら３種の蛋白質の表面発現を調べた。
【０２９０】結果をFig ２５に示す；Fig ２５Ａ：ＩＬ
−１±シクロヘキシミド；Fig ２５Ｂ：ＩＬ−１±アク
チノマイシンＤ（act Ｄ）。
−１±シクロヘキシミド；Fig ２５Ｂ：ＩＬ−１±アク
チノマイシンＤ（act Ｄ）。
【０２９１】Fig ２５は、試験した全ての抗原がＲＮＡ
および蛋白質合成への発現の依存性を示したことを示し
ている。
および蛋白質合成への発現の依存性を示したことを示し
ている。
【０２９２】（Ｐ）３Ａ２抗原の光学顕微鏡評価：休止
およびＩＬ−１刺激内皮細胞について、３Ａ２抗原の細
胞質発現を調べた。ＨＵＶＥＣを１ng／mlの存在下また
は不存在下に４時間培養した。培養したＨＵＶＥＣは、
ＰＢＳ−ＥＤＴＡへの短時間曝露によって脱着され、ガ
ラス製顕微鏡スライド上に吐き出した。細胞をアセトン
により室温で１０分間固定し、風乾して、細胞を透過性
とし、３Ａ２および７Ａ９抗体で染色した。
およびＩＬ−１刺激内皮細胞について、３Ａ２抗原の細
胞質発現を調べた。ＨＵＶＥＣを１ng／mlの存在下また
は不存在下に４時間培養した。培養したＨＵＶＥＣは、
ＰＢＳ−ＥＤＴＡへの短時間曝露によって脱着され、ガ
ラス製顕微鏡スライド上に吐き出した。細胞をアセトン
により室温で１０分間固定し、風乾して、細胞を透過性
とし、３Ａ２および７Ａ９抗体で染色した。
【０２９３】染色のためには、抗体０．１μｇを含有す
る抗体溶液１００μｌを固定した細胞上に室温で３０分
間置いた。細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗い、アルカリ
ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体５μｇ／mlと共に
３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗
ったのち、スライドを色素原ＡＥＣと共にインキュベー
トして発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。カバ
ースリップをのせたのち、スライドを観察した。
る抗体溶液１００μｌを固定した細胞上に室温で３０分
間置いた。細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗い、アルカリ
ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体５μｇ／mlと共に
３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗
ったのち、スライドを色素原ＡＥＣと共にインキュベー
トして発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。カバ
ースリップをのせたのち、スライドを観察した。
【０２９４】結果をFig ２６に示す。Fig ２６Ａ：ＩＬ
−１なし、抗体７Ａ９で染色；Fig２６Ｂ：＋ＩＬ−
１、抗体７Ａ９で染色；Fig ２６Ｃ：ＩＬ−１なし、抗
体３Ａ２で染色；Fig ２６Ｄ：＋ＩＬ−１、抗体３Ａ２
で染色。Fig ２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄの大きい斑点
は染色の赤色によるもので、この赤色は対応する抗原の
存在を示す。Fig ２６Ａの小さい暗色のスポットは青く
染色された核であるが、赤い細胞質染色によってとり囲
まれてはいない。
−１なし、抗体７Ａ９で染色；Fig２６Ｂ：＋ＩＬ−
１、抗体７Ａ９で染色；Fig ２６Ｃ：ＩＬ−１なし、抗
体３Ａ２で染色；Fig ２６Ｄ：＋ＩＬ−１、抗体３Ａ２
で染色。Fig ２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄの大きい斑点
は染色の赤色によるもので、この赤色は対応する抗原の
存在を示す。Fig ２６Ａの小さい暗色のスポットは青く
染色された核であるが、赤い細胞質染色によってとり囲
まれてはいない。
【０２９５】Fig ２６に示したように、無処理およびＩ
Ｌ−１処理細胞の両者に３Ａ２による染色が見られた
が、７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）による染色はＩＬ−１処
理ＨＵＶＥＣにのみ見られた。ＩＬ−１処理細胞と無処
理細胞とを比較しての３Ａ２抗原の強度および分布の上
での差に注目されたい。ＩＬ−１処理細胞での染色はよ
り小斑点で、場合によって膜と関連しているのを認める
ことができる。追加の実験で、フォン・ウィレブラント
因子に対する抗体を、ＩＬ−１無処理内皮細胞上での３
Ａ２抗体との二重染色プロトコール（２種のマウス一次
抗体用のザイメド（Zymed)二重染色キットを使用し、メ
ーカーの指示書に従う）に使用した；これらの抗原はワ
イベル・パラド体に共局在することがない。従って、Fi
g ２４の免疫沈降実験により示唆されているように、３
Ａ２抗原は１７０ｋＤａのポリペプチドとして細胞内に
前から存在しているにちがいない。この理由から、この
蛋白質は細胞質−膜蛋白質１７０（ＣＭＰ−１７０）と
名付けられている。
Ｌ−１処理細胞の両者に３Ａ２による染色が見られた
が、７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）による染色はＩＬ−１処
理ＨＵＶＥＣにのみ見られた。ＩＬ−１処理細胞と無処
理細胞とを比較しての３Ａ２抗原の強度および分布の上
での差に注目されたい。ＩＬ−１処理細胞での染色はよ
り小斑点で、場合によって膜と関連しているのを認める
ことができる。追加の実験で、フォン・ウィレブラント
因子に対する抗体を、ＩＬ−１無処理内皮細胞上での３
Ａ２抗体との二重染色プロトコール（２種のマウス一次
抗体用のザイメド（Zymed)二重染色キットを使用し、メ
ーカーの指示書に従う）に使用した；これらの抗原はワ
イベル・パラド体に共局在することがない。従って、Fi
g ２４の免疫沈降実験により示唆されているように、３
Ａ２抗原は１７０ｋＤａのポリペプチドとして細胞内に
前から存在しているにちがいない。この理由から、この
蛋白質は細胞質−膜蛋白質１７０（ＣＭＰ−１７０）と
名付けられている。
【０２９６】（Ｑ）ＣＭＰ−１７０共沈降構造の本質：
本実施例の目的は、ＩＬ−１処理内皮細胞中のＣＭＰ−
１７０と会合する１１０〜１２０ｋＤａの物質を同定す
ることである。トライトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳＯ、
オクチルグルコシド、トライトンＸ−１１４、ＣＨＡＰ
Ｓ、デオキシコール酸塩などの一連の洗剤を用いての予
備研究により、ＩＬ−１処理細胞からの３Ａ２抗原の可
溶化は通例的であるが、時によってはより低分子量のバ
ンドの共沈降を伴うことが示された。この共沈降は洗剤
トライトンＸ−１１４の存在下で最適かつ再現性のある
ことが見出された。従って、未処理またはＩＬ−１処理
内皮細胞を１％トライトンＸ−１１４洗剤で溶解し、３
Ａ２抗体または対照としてのヤギ抗マウスＩｇＭ試剤の
みを用いて、上記の方法により免疫沈降させた。これら
の免疫沈降物の一部を、非還元性または還元性条件下に
８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。
３Ａ２免疫沈降物を含有する追加のウエルをトライトン
Ｘ−１００で再抽出して３Ａ２抗原複合体を解離させ、
７Ａ９または２Ｇ７抗体を入れたウエルへ移し、第二の
免疫沈降を行わせた。これらの試料を、還元条件下に８
％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド上で泳動させた。
本実施例の目的は、ＩＬ−１処理内皮細胞中のＣＭＰ−
１７０と会合する１１０〜１２０ｋＤａの物質を同定す
ることである。トライトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳＯ、
オクチルグルコシド、トライトンＸ−１１４、ＣＨＡＰ
Ｓ、デオキシコール酸塩などの一連の洗剤を用いての予
備研究により、ＩＬ−１処理細胞からの３Ａ２抗原の可
溶化は通例的であるが、時によってはより低分子量のバ
ンドの共沈降を伴うことが示された。この共沈降は洗剤
トライトンＸ−１１４の存在下で最適かつ再現性のある
ことが見出された。従って、未処理またはＩＬ−１処理
内皮細胞を１％トライトンＸ−１１４洗剤で溶解し、３
Ａ２抗体または対照としてのヤギ抗マウスＩｇＭ試剤の
みを用いて、上記の方法により免疫沈降させた。これら
の免疫沈降物の一部を、非還元性または還元性条件下に
８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。
３Ａ２免疫沈降物を含有する追加のウエルをトライトン
Ｘ−１００で再抽出して３Ａ２抗原複合体を解離させ、
７Ａ９または２Ｇ７抗体を入れたウエルへ移し、第二の
免疫沈降を行わせた。これらの試料を、還元条件下に８
％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド上で泳動させた。
【０２９７】結果をFig ２７に示す。ここに、（−）は
無処理の、（＋）は処理した内皮細胞を示す。Fig ２７
Ａ：非還元条件下で操作したゲル；Fig ２７Ｂ：還元条
件下で操作したゲル：Fig ２７Ｃ、第一および第二レー
ン：ＩＬ−１活性化細胞からの７Ａ９および２Ｇ７抗体
との免疫沈降物（対照として）；Fig ２７Ｃ、第三およ
び第四レーン：７Ａ９または２Ｇ７抗体による第二の免
疫沈降。
無処理の、（＋）は処理した内皮細胞を示す。Fig ２７
Ａ：非還元条件下で操作したゲル；Fig ２７Ｂ：還元条
件下で操作したゲル：Fig ２７Ｃ、第一および第二レー
ン：ＩＬ−１活性化細胞からの７Ａ９および２Ｇ７抗体
との免疫沈降物（対照として）；Fig ２７Ｃ、第三およ
び第四レーン：７Ａ９または２Ｇ７抗体による第二の免
疫沈降。
【０２９８】Fig ２７Ａおよび２７Ｂに示した結果は、
まず、３Ａ２抗原の分子量が、非還元および還元条件下
で１７０ｋＤａであることを示している。還元条件下で
３Ａ２抗原がシャープになることは、この抗原の多量化
が若干起りうることを示唆する。溶解および試料用の緩
衝液中でのヨードアセトアミドの存在から、この効果が
人為的であるとは考えられない。第二に、Fig ２７Ａお
よび２７Ｂの結果は、共沈降構造が、分子質量１１０〜
１２０ｋＤａで、ＣＭＰ−１７０と共有結合によって会
合しているのではないことを示す。何故なら、非還元条
件下でも還元条件下でもそれが現われるからである。
まず、３Ａ２抗原の分子量が、非還元および還元条件下
で１７０ｋＤａであることを示している。還元条件下で
３Ａ２抗原がシャープになることは、この抗原の多量化
が若干起りうることを示唆する。溶解および試料用の緩
衝液中でのヨードアセトアミドの存在から、この効果が
人為的であるとは考えられない。第二に、Fig ２７Ａお
よび２７Ｂの結果は、共沈降構造が、分子質量１１０〜
１２０ｋＤａで、ＣＭＰ−１７０と共有結合によって会
合しているのではないことを示す。何故なら、非還元条
件下でも還元条件下でもそれが現われるからである。
【０２９９】７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）および２Ｇ７抗原
のサイトカイン誘発性および分子量の類似性（１１０〜
１２０ｋＤａの範囲内）から、それらを共沈降構造の候
補と考えた。該追加のバンドの本質を、それらの会合を
助長しないトライトンＸ−１００で共沈降材料を抽出
し、２Ｇ７または７Ａ９抗体で免疫沈降させることによ
り調べた。Fig ２７Ｃに示した結果は、７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）蛋白質が共沈降し、２Ｇ７蛋白質は共沈降しな
いことを示している。７Ａ９および２Ｇ７抗原の免疫沈
降物をパネルＣの最初の２レーンに比較のために示し
た。
のサイトカイン誘発性および分子量の類似性（１１０〜
１２０ｋＤａの範囲内）から、それらを共沈降構造の候
補と考えた。該追加のバンドの本質を、それらの会合を
助長しないトライトンＸ−１００で共沈降材料を抽出
し、２Ｇ７または７Ａ９抗体で免疫沈降させることによ
り調べた。Fig ２７Ｃに示した結果は、７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）蛋白質が共沈降し、２Ｇ７蛋白質は共沈降しな
いことを示している。７Ａ９および２Ｇ７抗原の免疫沈
降物をパネルＣの最初の２レーンに比較のために示し
た。
【０３００】ＣＭＰ−１７０：ＥＬＡＭ−１会合を確認
するために、もう一つのアプローチも行った。これは、
予備実験で、未処理ＣＯＳ細胞の細胞質中にもＣＭＰ−
１７０が存在することが示されたために、可能となった
ものである。これにより、代謝的に標識され、トライト
ンＸ−１１４で溶解されたＥＬＡＭ−１トランスフェク
トＣＯＳ細胞がＣＭＰ−１７０とＥＬＡＭ−１との間の
会合（association)を示すかどうかについてテストでき
た。
するために、もう一つのアプローチも行った。これは、
予備実験で、未処理ＣＯＳ細胞の細胞質中にもＣＭＰ−
１７０が存在することが示されたために、可能となった
ものである。これにより、代謝的に標識され、トライト
ンＸ−１１４で溶解されたＥＬＡＭ−１トランスフェク
トＣＯＳ細胞がＣＭＰ−１７０とＥＬＡＭ−１との間の
会合（association)を示すかどうかについてテストでき
た。
【０３０１】すなわち、ＣＯＳ細胞（内因性ＣＭＰ−１
７０を有するサル腎細胞株）を模擬（mock）トランスフ
ェクションに付すかまたはＣＤＮプラスミド中のＥＬＡ
Ｍ−１ ｃＤＮＡにより常法でトランスフェクトした。
トランスフェクションから４８時間後に、３×１０6 細
胞を、２５０μＣｉの35Ｓ−システインで６時間代謝的
に標識し、上述の方法でトライトンＸ−１１４により溶
解し、抗体７Ａ９または３Ａ２により上述の方法で免疫
沈降させた。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド還元ゲル上で泳動させた。
７０を有するサル腎細胞株）を模擬（mock）トランスフ
ェクションに付すかまたはＣＤＮプラスミド中のＥＬＡ
Ｍ−１ ｃＤＮＡにより常法でトランスフェクトした。
トランスフェクションから４８時間後に、３×１０6 細
胞を、２５０μＣｉの35Ｓ−システインで６時間代謝的
に標識し、上述の方法でトライトンＸ−１１４により溶
解し、抗体７Ａ９または３Ａ２により上述の方法で免疫
沈降させた。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド還元ゲル上で泳動させた。
【０３０２】結果をFig ２８に示す。図中、（−）は模
擬トランスフェクションを、（＋）はＥＬＡＭ−１ ｃ
ＤＮＡによるトランスフェクションを示す。
擬トランスフェクションを、（＋）はＥＬＡＭ−１ ｃ
ＤＮＡによるトランスフェクションを示す。
【０３０３】Fig ２８に示した結果は、予期した通り、
ＥＬＡＭ−１蛋白質が、先行実験の通り（ベヴィラクア
ら、サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５頁、１９
８９年）、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ細胞からは沈降するが、模擬トランスフェクションの
細胞からは沈降しないことを示している。レーン５で
は、３Ａ２抗体が、レーン３（対照レーン）では見られ
ない１７０ｋＤａ構造を免疫沈降させた。興味あること
に、対照レーンでは見られない約１００ｋＤａの顕著な
追加のバンドがある。右端のレーン（レーン６）では、
３Ａ２抗体が、１７０ｋＤａ構造に加えて、ＥＬＡＭ−
１抗原を明瞭に共沈降させた。レーン５の１００ｋＤａ
のところに見られる内因性３Ａ２関連ＣＯＳ蛋白質が、
トランスフェクトされた細胞中のＥＬＡＭ−１によって
置換されているかどうかは、それらの分子量が近似して
いるため決定できなかった。レーン１から知りうる通
り、７頁、１９８９年）、ＥＬＡＭ−１でトランスフェ
クトされたＣＯＳ細胞からは沈降するが、模擬トランス
フェクションの細胞からは沈降しないことを示してい
る。レーン５では、３Ａ２抗体が、レーン３（対照レー
ン）では見られない１７０ｋＤａ構造を免疫沈降させ
た。興味あることに、対照レーンでは見られない約１０
０ｋＤａの顕著な追加のバンドがある。右端のレーン
（レーン６）では、３Ａ２抗体が、１７０ｋＤａ構造に
加えて、ＥＬＡＭ−１抗原を明瞭に共沈降させた。レー
ン５の１００ｋＤａのところに見られる内因性３Ａ２関
連ＣＯＳ蛋白質が、トランスフェクトされた細胞中のＥ
ＬＡＭ−１によって置換されているかどうかは、それら
の分子量が近似しているため決定できなかった。レーン
１から知りうる通り、７Ａ９抗体は模擬的にトランスフ
ェクトされたＣＯＳ細胞からの蛋白質を沈降させなかっ
た。また、ＣＯＳ細胞（Fig ２８のレーン２）および内
皮細胞（Fig ２７Ｃのレーン１）からの７Ａ９を用いて
の免疫沈降データも、１７０ｋＤａで共沈降するバンド
を示さなかった。それゆえ、ＥＬＡＭ−１とＣＭＰ−１
７０との共沈降は一方向性である。
ＥＬＡＭ−１蛋白質が、先行実験の通り（ベヴィラクア
ら、サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５頁、１９
８９年）、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ細胞からは沈降するが、模擬トランスフェクションの
細胞からは沈降しないことを示している。レーン５で
は、３Ａ２抗体が、レーン３（対照レーン）では見られ
ない１７０ｋＤａ構造を免疫沈降させた。興味あること
に、対照レーンでは見られない約１００ｋＤａの顕著な
追加のバンドがある。右端のレーン（レーン６）では、
３Ａ２抗体が、１７０ｋＤａ構造に加えて、ＥＬＡＭ−
１抗原を明瞭に共沈降させた。レーン５の１００ｋＤａ
のところに見られる内因性３Ａ２関連ＣＯＳ蛋白質が、
トランスフェクトされた細胞中のＥＬＡＭ−１によって
置換されているかどうかは、それらの分子量が近似して
いるため決定できなかった。レーン１から知りうる通
り、７頁、１９８９年）、ＥＬＡＭ−１でトランスフェ
クトされたＣＯＳ細胞からは沈降するが、模擬トランス
フェクションの細胞からは沈降しないことを示してい
る。レーン５では、３Ａ２抗体が、レーン３（対照レー
ン）では見られない１７０ｋＤａ構造を免疫沈降させ
た。興味あることに、対照レーンでは見られない約１０
０ｋＤａの顕著な追加のバンドがある。右端のレーン
（レーン６）では、３Ａ２抗体が、１７０ｋＤａ構造に
加えて、ＥＬＡＭ−１抗原を明瞭に共沈降させた。レー
ン５の１００ｋＤａのところに見られる内因性３Ａ２関
連ＣＯＳ蛋白質が、トランスフェクトされた細胞中のＥ
ＬＡＭ−１によって置換されているかどうかは、それら
の分子量が近似しているため決定できなかった。レーン
１から知りうる通り、７Ａ９抗体は模擬的にトランスフ
ェクトされたＣＯＳ細胞からの蛋白質を沈降させなかっ
た。また、ＣＯＳ細胞（Fig ２８のレーン２）および内
皮細胞（Fig ２７Ｃのレーン１）からの７Ａ９を用いて
の免疫沈降データも、１７０ｋＤａで共沈降するバンド
を示さなかった。それゆえ、ＥＬＡＭ−１とＣＭＰ−１
７０との共沈降は一方向性である。
【０３０４】(R) ３Ａ２：ＥＬＡＭ−１会合の動態：３
×１０6 の内皮細胞を２５０μＣｉの35Ｓ−システイン
と共に４５分間または１２０分間パルスに付し、直ちに
上記の方法でトライトンＸ−１１４により溶解するか、
その前に１または２時間チェイスした。溶解物を３Ａ２
または７Ａ９抗体により上記の方法で免疫沈降させ、免
疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲ
ル上で泳動させた。さらに、ＩＬ−１に４時間曝露した
内皮細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡで脱着させ、下記のラクト
ペルオキシダーゼ法によって 125Ｉで標識した。細胞を
トライトンＸ−１１４洗剤によって溶解し、３Ａ２また
は７Ａ９抗体を用いて免疫沈降物を作成した。それら免
疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲ
ル上で泳動させた。
×１０6 の内皮細胞を２５０μＣｉの35Ｓ−システイン
と共に４５分間または１２０分間パルスに付し、直ちに
上記の方法でトライトンＸ−１１４により溶解するか、
その前に１または２時間チェイスした。溶解物を３Ａ２
または７Ａ９抗体により上記の方法で免疫沈降させ、免
疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲ
ル上で泳動させた。さらに、ＩＬ−１に４時間曝露した
内皮細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡで脱着させ、下記のラクト
ペルオキシダーゼ法によって 125Ｉで標識した。細胞を
トライトンＸ−１１４洗剤によって溶解し、３Ａ２また
は７Ａ９抗体を用いて免疫沈降物を作成した。それら免
疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲ
ル上で泳動させた。
【０３０５】細胞表面沃素化には、５００万の内皮細胞
をＰＢＳ−ＥＤＴＡ処理によって脱着し、２回洗い、４
℃で２００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。この管に、
０．５ｍＣｉの 125Ｉ、５０μｌのラクトペルオキシダ
ーゼ（０．２mg／ml）を加え、続いて、ハーディにより
記載された方法（Ｒ．Ｒ． Ｈardy、ハンドブック・オ
ヴ・エクスペリメンタル・イムノノジー、第１巻２０．
８頁、Ｄ．Ｍ．ウェア編、ブラックウェル・サイエンテ
ィフィック・パブリケイションズ、オックスフォード、
英国）により、３０％Ｈ2 Ｏ2 ２０μｌを１分間隔で、
１／２７，０００、１／９，０００、１／ ３，０００
および１／１，０００の希釈率で、加えた。細胞を３回
洗い、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ
７．４）、２ｍＭＰＭＳＦおよび１ｍＭヨードアセトア
ミドを含有する１％トライトンＸ−１１４洗剤で溶解さ
せた。
をＰＢＳ−ＥＤＴＡ処理によって脱着し、２回洗い、４
℃で２００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。この管に、
０．５ｍＣｉの 125Ｉ、５０μｌのラクトペルオキシダ
ーゼ（０．２mg／ml）を加え、続いて、ハーディにより
記載された方法（Ｒ．Ｒ． Ｈardy、ハンドブック・オ
ヴ・エクスペリメンタル・イムノノジー、第１巻２０．
８頁、Ｄ．Ｍ．ウェア編、ブラックウェル・サイエンテ
ィフィック・パブリケイションズ、オックスフォード、
英国）により、３０％Ｈ2 Ｏ2 ２０μｌを１分間隔で、
１／２７，０００、１／９，０００、１／ ３，０００
および１／１，０００の希釈率で、加えた。細胞を３回
洗い、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ
７．４）、２ｍＭＰＭＳＦおよび１ｍＭヨードアセトア
ミドを含有する１％トライトンＸ−１１４洗剤で溶解さ
せた。
【０３０６】結果をFig ２９に示す。Fig ２９Ａは、４
５分間後に溶解させた35Ｓ−システインパルス標識細胞
（pulse 、最初の２レーン）またはさらに１または２時
間チェイス（chase)したもの（それぞれレーン３および
４またはレーン５および６）についての結果を示す。Fi
g ２９Ｂは細胞表面沃素化の結果を示す。
５分間後に溶解させた35Ｓ−システインパルス標識細胞
（pulse 、最初の２レーン）またはさらに１または２時
間チェイス（chase)したもの（それぞれレーン３および
４またはレーン５および６）についての結果を示す。Fi
g ２９Ｂは細胞表面沃素化の結果を示す。
【０３０７】Fig ２９Ａに示した結果は、ＩＬ−１添加
４５分後に、免疫沈降可能な発生期の７Ａ９（ＥＬＡＭ
−１）蛋白質があることを示している。同様に、同じ７
９ｋＤａ分子質量の蛋白質がＣＭＰ−１７０により共沈
降する。細胞を２時間パルスし、もう１または２時間チ
ェイスするとき、３Ａ２抗体は、７Ａ９（ＥＬＡＭ−
１）抗体により沈降する同じ分子質量の物質をひき続き
共沈降させる。それゆえ、ＣＭＰ−１７０／ＥＬＡＭ−
１会合を、ＥＬＡＭ−１合成の最も早い時点からそれが
成熟サイズに達するまで、検出できる。Fig ２９Ｂに示
した結果は、３Ａ２抗体も細胞表面からの７Ａ９（ＥＬ
ＡＭ−１）蛋白質を共沈降させるが、見られるように、
３Ａ２抗原はそれ自身はあまりよく標識されないようで
ある。
４５分後に、免疫沈降可能な発生期の７Ａ９（ＥＬＡＭ
−１）蛋白質があることを示している。同様に、同じ７
９ｋＤａ分子質量の蛋白質がＣＭＰ−１７０により共沈
降する。細胞を２時間パルスし、もう１または２時間チ
ェイスするとき、３Ａ２抗体は、７Ａ９（ＥＬＡＭ−
１）抗体により沈降する同じ分子質量の物質をひき続き
共沈降させる。それゆえ、ＣＭＰ−１７０／ＥＬＡＭ−
１会合を、ＥＬＡＭ−１合成の最も早い時点からそれが
成熟サイズに達するまで、検出できる。Fig ２９Ｂに示
した結果は、３Ａ２抗体も細胞表面からの７Ａ９（ＥＬ
ＡＭ−１）蛋白質を共沈降させるが、見られるように、
３Ａ２抗原はそれ自身はあまりよく標識されないようで
ある。
【０３０８】(S) ＣＭＰ−１７０および７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）抗原の細胞表面での発現の動態：平底マイクロ
タイタープレート中でコンフルエントになるまで生育さ
せた内皮細胞を０〜４８時間１ng／ml／ＩＬ−１に曝露
し、つぎにハイブリドーマによる生産について上記した
のと類似のプレート結合アッセイで、７Ａ９および３Ａ
２抗原の発現を調べた。
Ｍ−１）抗原の細胞表面での発現の動態：平底マイクロ
タイタープレート中でコンフルエントになるまで生育さ
せた内皮細胞を０〜４８時間１ng／ml／ＩＬ−１に曝露
し、つぎにハイブリドーマによる生産について上記した
のと類似のプレート結合アッセイで、７Ａ９および３Ａ
２抗原の発現を調べた。
【０３０９】結果をFig ３０に示す。Fig ３０におい
て、白抜きの円は７Ａ９抗原を、白抜きの三角形は３Ａ
２抗原を表わす。Fig ３０の結果からわかるように、両
蛋白質の発現が同時に起り、２〜４時間あたりにピーク
となる。しかし、７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原は、ＩＬ
−１が存在する限り高いレベルに維持され、一方、３Ａ
２抗原は４８時間で基礎レベルまで低下する。追加の実
験（詳述しない）により、ＥＬＡＭ−１と同様に、ＣＭ
Ｐ−１７０が、ＴＮＦおよびリポ多糖への内皮細胞の曝
露によって誘発されるが、ガンマーインターフェロンへ
の曝露によっては誘発されないことが示されている。
て、白抜きの円は７Ａ９抗原を、白抜きの三角形は３Ａ
２抗原を表わす。Fig ３０の結果からわかるように、両
蛋白質の発現が同時に起り、２〜４時間あたりにピーク
となる。しかし、７Ａ９（ＥＬＡＭ−１）抗原は、ＩＬ
−１が存在する限り高いレベルに維持され、一方、３Ａ
２抗原は４８時間で基礎レベルまで低下する。追加の実
験（詳述しない）により、ＥＬＡＭ−１と同様に、ＣＭ
Ｐ−１７０が、ＴＮＦおよびリポ多糖への内皮細胞の曝
露によって誘発されるが、ガンマーインターフェロンへ
の曝露によっては誘発されないことが示されている。
【０３１０】(T) モノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ
７が結合するＥＬＡＭ−１のエピトープの決定および可
溶形態のＥＬＡＭ−１の調製：Fig ３１は、モノクロー
ナル抗体７Ａ９および３Ｂ７が結合するエピトープを決
定すべく調製したＥＬＡＭ−１の種々の截頭形態（trun
cated versions）を示す。それらのＥＬＡＭ−１截頭形
は、ＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡの欠失形の３′末端の終止
コドン、たとえばＴＡＡまたはＴＡＧを含むＰＣＲプラ
イマーを用いて、この実施例の(C) で記載したようなＰ
ＣＲプライマーによって構築した。かかるプライマーの
構築は常法に属する。ＣＯＯＨ末端を、ＥＬＡＭ−１分
子の截頭形がレクチンドメイン（Ｌ−ＥＬＡＭ−１）、
レクチン＋ＥＧＦドメイン（ＬＥ−ＥＬＡＭ−１）、レ
クチン＋ＥＧＦ＋補体調節ドメイン（complement regul
atary domain）の一部（ＬＥＣ−ＥＬＡＭ−１）および
レクチン＋ＥＧＦ＋補体調節ドメインの全部マイナスＥ
ＬＡＭ−１分子のトランスメンブレンおよび細胞質テイ
ル（ＥＬＡＭ−１Ｔｍ- ）をそれぞれ含むように選択し
た。Ｌ−ＥＬＡＭ−１、ＬＥ−ＥＬＡＭ−１、ＬＥＣ−
ＥＬＡＭ−１および成熟形ＥＬＡＭ−１を、外来遺伝子
（ＥＬＡＭ−１の截頭形）を駆動するＲＳＶプロモータ
ーおよび別の優性選択マーカーＳＶ２ＤＨＦＲを含む発
現ベクター中へクローン化した。このようなベクター
は、ＡＴＣＣから入手可能なプラスミド（ｐＲＳＶｎｅ
ｏ（ＡＴＣＣNo. ３７１９８）およびｐＳＶ２ＤＨＦＲ
（ＡＴＣＣNo. ６７１１０））を用いて常法により構築
できる。トランスメンブレン欠失形ＥＬＡＭ−１、すな
わちＥＬＡＭ−１Ｔｍ- はｐＣＤＮ−１ベクター中へク
ローン化した。それらプラスミドを、本実施例の(C) に
記載したＤＮＡ−ＣａＰＯ4 共沈法によってＣＯＳ細胞
へ導入した。ＤＮＡトランスフェクションから４８時間
後に、トランスフェクトされた細胞の一部を用いて、Ｅ
ＬＡＭ−１特異抗体７Ａ９および３Ｂ７ならびに抗体３
Ａ２との免疫沈降（本実施例の(C) に記載と同様）を行
った。トランスフェクトされた細胞の上澄みならびに細
胞溶解物を用いて、35Ｓ−システインによる細胞の代謝
性標識ののち、免疫沈降を行った。
７が結合するＥＬＡＭ−１のエピトープの決定および可
溶形態のＥＬＡＭ−１の調製：Fig ３１は、モノクロー
ナル抗体７Ａ９および３Ｂ７が結合するエピトープを決
定すべく調製したＥＬＡＭ−１の種々の截頭形態（trun
cated versions）を示す。それらのＥＬＡＭ−１截頭形
は、ＥＬＡＭ−１ ｃＤＮＡの欠失形の３′末端の終止
コドン、たとえばＴＡＡまたはＴＡＧを含むＰＣＲプラ
イマーを用いて、この実施例の(C) で記載したようなＰ
ＣＲプライマーによって構築した。かかるプライマーの
構築は常法に属する。ＣＯＯＨ末端を、ＥＬＡＭ−１分
子の截頭形がレクチンドメイン（Ｌ−ＥＬＡＭ−１）、
レクチン＋ＥＧＦドメイン（ＬＥ−ＥＬＡＭ−１）、レ
クチン＋ＥＧＦ＋補体調節ドメイン（complement regul
atary domain）の一部（ＬＥＣ−ＥＬＡＭ−１）および
レクチン＋ＥＧＦ＋補体調節ドメインの全部マイナスＥ
ＬＡＭ−１分子のトランスメンブレンおよび細胞質テイ
ル（ＥＬＡＭ−１Ｔｍ- ）をそれぞれ含むように選択し
た。Ｌ−ＥＬＡＭ−１、ＬＥ−ＥＬＡＭ−１、ＬＥＣ−
ＥＬＡＭ−１および成熟形ＥＬＡＭ−１を、外来遺伝子
（ＥＬＡＭ−１の截頭形）を駆動するＲＳＶプロモータ
ーおよび別の優性選択マーカーＳＶ２ＤＨＦＲを含む発
現ベクター中へクローン化した。このようなベクター
は、ＡＴＣＣから入手可能なプラスミド（ｐＲＳＶｎｅ
ｏ（ＡＴＣＣNo. ３７１９８）およびｐＳＶ２ＤＨＦＲ
（ＡＴＣＣNo. ６７１１０））を用いて常法により構築
できる。トランスメンブレン欠失形ＥＬＡＭ−１、すな
わちＥＬＡＭ−１Ｔｍ- はｐＣＤＮ−１ベクター中へク
ローン化した。それらプラスミドを、本実施例の(C) に
記載したＤＮＡ−ＣａＰＯ4 共沈法によってＣＯＳ細胞
へ導入した。ＤＮＡトランスフェクションから４８時間
後に、トランスフェクトされた細胞の一部を用いて、Ｅ
ＬＡＭ−１特異抗体７Ａ９および３Ｂ７ならびに抗体３
Ａ２との免疫沈降（本実施例の(C) に記載と同様）を行
った。トランスフェクトされた細胞の上澄みならびに細
胞溶解物を用いて、35Ｓ−システインによる細胞の代謝
性標識ののち、免疫沈降を行った。
【０３１１】これらの細胞の上澄みを用いた免疫沈降実
験の結果をFig ３２に示す。結果は、レクチンおよびＥ
ＧＦ様ドメインにより規定される分子のＮ末端３０．７
％という小さい断片（ＬＥ−ＥＬＡＭ−１）が７Ａ９お
よび３Ｂ７抗体の両方と反応することを示している。
験の結果をFig ３２に示す。結果は、レクチンおよびＥ
ＧＦ様ドメインにより規定される分子のＮ末端３０．７
％という小さい断片（ＬＥ−ＥＬＡＭ−１）が７Ａ９お
よび３Ｂ７抗体の両方と反応することを示している。
【０３１２】(U) 白血球の活性内皮細胞への結合のブロ
ッキングを検出するアッセイ：実施例１記載のようにし
て、廃棄臍帯から内皮細胞を得て、培養する。細胞は速
かに増殖し、それらの分化された性質が低減するまでに
６回まで他のフラスコへ分割（継代）する。２回目の植
継ぎにより、ブロッキングアッセイを行うのに十分な細
胞を入手できる。組換えヒトＩＬ−１ベータを１ng／ml
濃度で細胞に加え、細胞を通常通り６％ＣＯ2 、９４％
空気含有加湿培養室中に維持しながら４〜６時間培養す
る。対照は、ＩＬ−１の不存在下に内皮細胞を培養する
ものとする。培養期間後、細胞を培地で洗い、使用され
なかったＩＬ−１を除く。
ッキングを検出するアッセイ：実施例１記載のようにし
て、廃棄臍帯から内皮細胞を得て、培養する。細胞は速
かに増殖し、それらの分化された性質が低減するまでに
６回まで他のフラスコへ分割（継代）する。２回目の植
継ぎにより、ブロッキングアッセイを行うのに十分な細
胞を入手できる。組換えヒトＩＬ−１ベータを１ng／ml
濃度で細胞に加え、細胞を通常通り６％ＣＯ2 、９４％
空気含有加湿培養室中に維持しながら４〜６時間培養す
る。対照は、ＩＬ−１の不存在下に内皮細胞を培養する
ものとする。培養期間後、細胞を培地で洗い、使用され
なかったＩＬ−１を除く。
【０３１３】単核細胞、たとえば単球、顆粒球、または
Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を包含する単核細胞の混
合物をヒトから得て、当該技術分野で既知の方法により
単離、精製する。
Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を包含する単核細胞の混
合物をヒトから得て、当該技術分野で既知の方法により
単離、精製する。
【０３１４】単核細胞を、抗原１Ｅ７／２Ｇ７またはＥ
ＬＡＭ−１の抗原性断片類の存在下に、３７℃で３０分
間プレインキュベートする。抗原は、単核細胞上のリガ
ンド結合部位を飽和させるのに十分な量だけ用いる。
ＬＡＭ−１の抗原性断片類の存在下に、３７℃で３０分
間プレインキュベートする。抗原は、単核細胞上のリガ
ンド結合部位を飽和させるのに十分な量だけ用いる。
【０３１５】単核細胞をつぎに、引続いて抗原の存在下
に、内皮細胞に３０〜６０分間加えておいて、付着させ
る。非付着性細胞を生育培地で洗い去り、未処理または
ＩＬ−１処理内皮細胞（ＥＣ）に結合した細胞の数の差
を調べる。
に、内皮細胞に３０〜６０分間加えておいて、付着させ
る。非付着性細胞を生育培地で洗い去り、未処理または
ＩＬ−１処理内皮細胞（ＥＣ）に結合した細胞の数の差
を調べる。
【０３１６】このアッセイは、放射性トレーサー、たと
えば51Ｃｒを既知の方法によって、結合研究対象細胞の
細胞質中へ導入し、細胞外カウントを洗い去り、これら
の標識した細胞をＥＣの単層上にのせることによって、
定量的に行う。この目的で用いた51Ｃｒ標識は、３０〜
６０分間の結合アッセイの間は極小の漏出しか示さな
い。洗って非付着性細胞を除去したのち、単層を洗剤で
可溶化する。各ウェルからカウントされた放射能を結合
細胞数の尺度とする。
えば51Ｃｒを既知の方法によって、結合研究対象細胞の
細胞質中へ導入し、細胞外カウントを洗い去り、これら
の標識した細胞をＥＣの単層上にのせることによって、
定量的に行う。この目的で用いた51Ｃｒ標識は、３０〜
６０分間の結合アッセイの間は極小の漏出しか示さな
い。洗って非付着性細胞を除去したのち、単層を洗剤で
可溶化する。各ウェルからカウントされた放射能を結合
細胞数の尺度とする。
【０３１７】実施例５ １Ｅ７／２Ｇ７抗原のｃＤＮＡ配列 最近、ＶＣＡＭ−１と呼ばれる付着分子が記述されてい
る〔オズボーン（Ｏsborn)ら、セル、５９巻１２０３〜
１２１１頁、１９８９年〕。ｃＤＮＡ発現クローニング
によって１Ｅ７／２Ｇ７抗原をクローン化する試みに先
立って、１Ｅ７／２Ｇ７抗原がＶＣＡＭ−１と関係があ
るかないかを知る目的で、ＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡをクロ
ーン化した。ＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡは、ＩＬ−１活性化
ＨＵＶＥＣからのポリＡ+ ＲＮＡを用いて、実施例４
(C) 記載のように、ＰＣＲプライマーによってクローン
化した。次のＰＣＲプライマーを、約２．０ｋｂの大き
さに対応するＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡの公表されているコ
ード配列を増幅するだけの目的で選んだ：約２．０ｋｂ
のコード配列を得る代りに、ＰＣＲ増幅の主産物とし
て、２．３ｋｂバンドを、得た。この２．３ｋｂバンド
を、実施例４(C) 記載の方法で、発現ベクターｐＣＤＮ
−１中へクローン化し、いくつかのクローンを単離し
た。５クローンについて、実施例４(B-2) 記載の方法
で、ＣＯＳ細胞を用いる一過性発現アッセイにより１Ｅ
７／２Ｇ７抗体の結合を試験した。５クローン全てが、
モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７に対して強い結
合を示した。
る〔オズボーン（Ｏsborn)ら、セル、５９巻１２０３〜
１２１１頁、１９８９年〕。ｃＤＮＡ発現クローニング
によって１Ｅ７／２Ｇ７抗原をクローン化する試みに先
立って、１Ｅ７／２Ｇ７抗原がＶＣＡＭ−１と関係があ
るかないかを知る目的で、ＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡをクロ
ーン化した。ＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡは、ＩＬ−１活性化
ＨＵＶＥＣからのポリＡ+ ＲＮＡを用いて、実施例４
(C) 記載のように、ＰＣＲプライマーによってクローン
化した。次のＰＣＲプライマーを、約２．０ｋｂの大き
さに対応するＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡの公表されているコ
ード配列を増幅するだけの目的で選んだ：約２．０ｋｂ
のコード配列を得る代りに、ＰＣＲ増幅の主産物とし
て、２．３ｋｂバンドを、得た。この２．３ｋｂバンド
を、実施例４(C) 記載の方法で、発現ベクターｐＣＤＮ
−１中へクローン化し、いくつかのクローンを単離し
た。５クローンについて、実施例４(B-2) 記載の方法
で、ＣＯＳ細胞を用いる一過性発現アッセイにより１Ｅ
７／２Ｇ７抗体の結合を試験した。５クローン全てが、
モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７に対して強い結
合を示した。
【０３１８】これらクローンの常法を用いて行った制限
分析により、ＰＣＲ増幅クローンが発表されているＶＣ
ＡＭ−１配列と同じ配列を含んでいるとすれば予想され
るバンドとは異なるパターンが示された。これらの研究
は、発表されている遺伝子のほぼ中央に約２８２ｂｐの
挿入配列のあることも示唆した。１クローンをサンガー
法（Ｓanger ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オヴ・サイエンシズ、ＵＳＡ、７
４巻５４６３〜５４６７頁、１９７７年）に従って配列
決定したところ、ＶＣＡＭ−１分子の３０８番アミノ酸
位置に９４アミノ酸からなる挿入配列が示された（Fig
３３）。かくして、１Ｅ７／２Ｇ７抗原は、発表されて
いるＶＣＡＭ−１分子とは異なる。１Ｅ７／２Ｇ７抗原
をコードするｃＤＮＡ配列および相当する分子のアミノ
酸配列をFig ３４Ａ〜３４Ｇに示す。
分析により、ＰＣＲ増幅クローンが発表されているＶＣ
ＡＭ−１配列と同じ配列を含んでいるとすれば予想され
るバンドとは異なるパターンが示された。これらの研究
は、発表されている遺伝子のほぼ中央に約２８２ｂｐの
挿入配列のあることも示唆した。１クローンをサンガー
法（Ｓanger ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オヴ・サイエンシズ、ＵＳＡ、７
４巻５４６３〜５４６７頁、１９７７年）に従って配列
決定したところ、ＶＣＡＭ−１分子の３０８番アミノ酸
位置に９４アミノ酸からなる挿入配列が示された（Fig
３３）。かくして、１Ｅ７／２Ｇ７抗原は、発表されて
いるＶＣＡＭ−１分子とは異なる。１Ｅ７／２Ｇ７抗原
をコードするｃＤＮＡ配列および相当する分子のアミノ
酸配列をFig ３４Ａ〜３４Ｇに示す。
【０３１９】実施例６ 細胞、モノクローナル抗体及びＴ細胞サブ−ポピュレー
ション ＨＵＶＥＣは、継代２以下の新鮮なものを用いた。マウ
スＬ−細胞が、５％ＦＣＳ及び抗菌剤を含有するＩＭＥ
Ｍ培地（バイオフルイズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ），ロッ
クビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ），エムディー（ＭＤ））
中で標準の手順により培養された。休止ヒト抹消ＣＤ４
+ Ｔ細胞が、ホーガン・アンド・シャウ（Ｈｏｒｇａｎ
＆ Ｓｈａｗ）（クル．プロトコールズ イム．（Ｃ
ｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ Ｉｍｍ．）、コリガン
（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、文献投稿中）のようにマグネ
ティック・ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ）を
用いる厳格なネガティブ・イムノセレクション（ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により
通常のドナーから単離された。ネガティブ・セレクショ
ンは、Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞及び単球上のＨＬＡクラス
ＩＩ、Ｂ細胞上のＣＤ２０、エヌケイ（ＮＫ）細胞上の
ＣＤ１６、単球上のＣＤ１１ｂ、単球上のＣＤ１４、赤
血球及びＣＤ８上のグリコフォリン（ｇｌｙｃｏｐｈｏ
ｒｉｎ）に対するｍＡｂｓのカクテル（ｃｏｃｋｔａｉ
ｌ）を用いて行われた。好ましい抗体は、腹水液の希釈
液として使用され且つ公に入手できる、以下のｍＡｂｓ
を含む：ＣＤ２０ ｍＡｂ １Ｆ５，ＣＤ１６ ｍＡｂ
３Ｇ８，ＣＤ１４ ｍＡｂ ＭＭａ、グリコフォリン
ｍＡｂ １０Ｆ７及びＣＤ８ ｍＡｂ ３９．８。以
下のｍＡｂ類は、精製されたＩｇＧとして用いられる：
ＨＬＡ クラスＩＩ ｍＡｂ ＩＶＡ１２及びＣＤ１１
ｂ ｍＡｂ ＮＩＨ１１ｂ−１（表７参照）。
ション ＨＵＶＥＣは、継代２以下の新鮮なものを用いた。マウ
スＬ−細胞が、５％ＦＣＳ及び抗菌剤を含有するＩＭＥ
Ｍ培地（バイオフルイズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ），ロッ
クビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ），エムディー（ＭＤ））
中で標準の手順により培養された。休止ヒト抹消ＣＤ４
+ Ｔ細胞が、ホーガン・アンド・シャウ（Ｈｏｒｇａｎ
＆ Ｓｈａｗ）（クル．プロトコールズ イム．（Ｃ
ｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ Ｉｍｍ．）、コリガン
（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、文献投稿中）のようにマグネ
ティック・ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ）を
用いる厳格なネガティブ・イムノセレクション（ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により
通常のドナーから単離された。ネガティブ・セレクショ
ンは、Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞及び単球上のＨＬＡクラス
ＩＩ、Ｂ細胞上のＣＤ２０、エヌケイ（ＮＫ）細胞上の
ＣＤ１６、単球上のＣＤ１１ｂ、単球上のＣＤ１４、赤
血球及びＣＤ８上のグリコフォリン（ｇｌｙｃｏｐｈｏ
ｒｉｎ）に対するｍＡｂｓのカクテル（ｃｏｃｋｔａｉ
ｌ）を用いて行われた。好ましい抗体は、腹水液の希釈
液として使用され且つ公に入手できる、以下のｍＡｂｓ
を含む：ＣＤ２０ ｍＡｂ １Ｆ５，ＣＤ１６ ｍＡｂ
３Ｇ８，ＣＤ１４ ｍＡｂ ＭＭａ、グリコフォリン
ｍＡｂ １０Ｆ７及びＣＤ８ ｍＡｂ ３９．８。以
下のｍＡｂ類は、精製されたＩｇＧとして用いられる：
ＨＬＡ クラスＩＩ ｍＡｂ ＩＶＡ１２及びＣＤ１１
ｂ ｍＡｂ ＮＩＨ１１ｂ−１（表７参照）。
【０３２０】実施例７ ＶＣＡＭ−１ Ｌ−細胞トランスフェクタントに対する
ＣＤ４+ Ｔ細胞の活性化−依存性結合 Ｔ細胞の、内皮細胞のＶＣＡＭ−１に対するＶＬＡ−４
で媒介された結合は、Ｔ細胞の急性活性化により増加す
ることを確認するため、休止及びＰＭＡ活性化ＣＤ４+
Ｔ細胞のＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡクローンを用いてトラ
ンスフェクトされたマウスＬ−細胞に対する付着性が調
べられた。Ｆｉｇ３６は、休止及びＰＭＡ活性化ＣＤ４
+ Ｔ細胞が、トランスフェクトされていないＬ−細胞コ
ントロールに対し最小に結合することを示す。休止Ｔ細
胞はまたＶＣＡＭトランスフェクタントに対し最小に結
合する一方、ＰＭＡ活性化Ｔ細胞の付着は、明確に観察
された。該結合は特異的であり、それはＶＣＡＭ−１、
ＶＬＡ−４ α鎖及び共通のＶＬＡ β鎖に対し特異的
なｍＡｂｓによりブロックされるが、ＬＡＦ−１、ＶＡ
Ｌ−５、ＥＬＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１に対し特異的な
他の無関係のｍＡｂｓによってはブロックされないから
である（表８参照）。
ＣＤ４+ Ｔ細胞の活性化−依存性結合 Ｔ細胞の、内皮細胞のＶＣＡＭ−１に対するＶＬＡ−４
で媒介された結合は、Ｔ細胞の急性活性化により増加す
ることを確認するため、休止及びＰＭＡ活性化ＣＤ４+
Ｔ細胞のＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡクローンを用いてトラ
ンスフェクトされたマウスＬ−細胞に対する付着性が調
べられた。Ｆｉｇ３６は、休止及びＰＭＡ活性化ＣＤ４
+ Ｔ細胞が、トランスフェクトされていないＬ−細胞コ
ントロールに対し最小に結合することを示す。休止Ｔ細
胞はまたＶＣＡＭトランスフェクタントに対し最小に結
合する一方、ＰＭＡ活性化Ｔ細胞の付着は、明確に観察
された。該結合は特異的であり、それはＶＣＡＭ−１、
ＶＬＡ−４ α鎖及び共通のＶＬＡ β鎖に対し特異的
なｍＡｂｓによりブロックされるが、ＬＡＦ−１、ＶＡ
Ｌ−５、ＥＬＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１に対し特異的な
他の無関係のｍＡｂｓによってはブロックされないから
である（表８参照）。
【０３２１】ＶＣＡＭ−１トランスフェクタントに対す
るメモリーＴ細胞の付着は、ＰＭＡ活性化により劇的に
増加する一方、ナイーブＣＤ４+ Ｔ細胞のＰＭＡ活性化
は、結合に最小の変化を起こすのみである。これらの結
果は、さらにメモリー細胞は、ナイーブＣＤ４+ Ｔ細胞
よりももっと大きな程度でＰＭＡによる急性活性化後の
ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１付着経路を利用することを示
唆する証拠を提供する（Ｆｉｇ３７）。
るメモリーＴ細胞の付着は、ＰＭＡ活性化により劇的に
増加する一方、ナイーブＣＤ４+ Ｔ細胞のＰＭＡ活性化
は、結合に最小の変化を起こすのみである。これらの結
果は、さらにメモリー細胞は、ナイーブＣＤ４+ Ｔ細胞
よりももっと大きな程度でＰＭＡによる急性活性化後の
ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１付着経路を利用することを示
唆する証拠を提供する（Ｆｉｇ３７）。
【０３２２】インビボにおいてＣＤ４+ 細胞の活性化を
媒介する抗原（ＰＭＡに対するものとして）は、抗原を
表示する細胞（例えば内皮細胞）と物質的な関係が要求
されるので、我々は、ＥＬＡＭ−１は内皮細胞に対する
メモリーＣＤ４+ 細胞の最初の付着を媒介すると推測し
ている。そのような付着の阻害は、ＥＬＡＭ−１に対す
る７Ａ９抗体のような薬物を障害する複合免疫過程のも
っとも感受性の高い相である。
媒介する抗原（ＰＭＡに対するものとして）は、抗原を
表示する細胞（例えば内皮細胞）と物質的な関係が要求
されるので、我々は、ＥＬＡＭ−１は内皮細胞に対する
メモリーＣＤ４+ 細胞の最初の付着を媒介すると推測し
ている。そのような付着の阻害は、ＥＬＡＭ−１に対す
る７Ａ９抗体のような薬物を障害する複合免疫過程のも
っとも感受性の高い相である。
【０３２３】ＥＬＡＭ−１に対するメモリーＴ細胞の結
合の増加の程度は、精製したＥＬＡＭ−１を用いた研究
で明確に示される（Ｆｉｇ．３８及び３９Ａ〜Ｄ）。メ
モリーＴ細胞のＥＬＡＭ−１に対する結合とフィブロネ
クチンおよびＩＣＡＭ−１のようなインテグリン・リガ
ンドに対する結合との間に２種の重要な区別がある（Ｆ
ｉｇ．３９Ａ〜Ｄ）。第１に、ナイーブ及びメモリーＴ
細胞は、フィブロネクチンおよびＩＣＡＭ−１に付着す
ることができる一方、ＥＬＡＭ−１に対するＴ細胞の結
合は、完全にメモリー細胞特異的である。第２に、多く
の付着経路の強さは、Ｔ細胞の急性活性化により劇的に
制御されており、例えばフィブロネクチンのようなリガ
ンドに対するナイーブ及びメモリーＴ細胞のインテグリ
ン媒介付着は、ＴＰＡ活性化により急速かつ劇的に増加
する。これに対し、メモリーＴ細胞は活性化なしに精製
されたＥＬＡＭ−１に対し十分に付着し、結合は、ＴＰ
Ａ活性化によっては増加しない。この様に、ＥＬＡＭ−
１は、メモリーＣＤ４+ 細胞の活性化非依存性の付着を
介在する。
合の増加の程度は、精製したＥＬＡＭ−１を用いた研究
で明確に示される（Ｆｉｇ．３８及び３９Ａ〜Ｄ）。メ
モリーＴ細胞のＥＬＡＭ−１に対する結合とフィブロネ
クチンおよびＩＣＡＭ−１のようなインテグリン・リガ
ンドに対する結合との間に２種の重要な区別がある（Ｆ
ｉｇ．３９Ａ〜Ｄ）。第１に、ナイーブ及びメモリーＴ
細胞は、フィブロネクチンおよびＩＣＡＭ−１に付着す
ることができる一方、ＥＬＡＭ−１に対するＴ細胞の結
合は、完全にメモリー細胞特異的である。第２に、多く
の付着経路の強さは、Ｔ細胞の急性活性化により劇的に
制御されており、例えばフィブロネクチンのようなリガ
ンドに対するナイーブ及びメモリーＴ細胞のインテグリ
ン媒介付着は、ＴＰＡ活性化により急速かつ劇的に増加
する。これに対し、メモリーＴ細胞は活性化なしに精製
されたＥＬＡＭ−１に対し十分に付着し、結合は、ＴＰ
Ａ活性化によっては増加しない。この様に、ＥＬＡＭ−
１は、メモリーＣＤ４+ 細胞の活性化非依存性の付着を
介在する。
【０３２４】精製されたＥＬＡＭ−１を使用すること
で：（１）Ｔ細胞は特異的にＥＬＡＭ−１に結合するこ
と；及び（２）ＥＬＡＭ−１に対するＴ細胞の付着は、
ＶＬＡ−４およびＬＡＦ−１のようなインテグリンで媒
介されるものから区別されることが示された。ＥＬＡＭ
−１に対するナイーブＴ細胞ではなくメモリーＴ細胞に
特異的結合は、印象的なことであり、フィブロネクチン
およびＩＣＡＭ−１のようなインテグリン・リガンドに
対するメモリーＴ細胞のより大きな結合性がある一方、
ナイーブＴ細胞は急性活性化の後でさらに結合すること
ができる。ＥＬＡＭ−１に対するＴ細胞付着の活性化非
依存性はこの付着経路を他のものから区別するものであ
り、活性化は付着の増加または排除に重要な調節の役割
を果たす。
で：（１）Ｔ細胞は特異的にＥＬＡＭ−１に結合するこ
と；及び（２）ＥＬＡＭ−１に対するＴ細胞の付着は、
ＶＬＡ−４およびＬＡＦ−１のようなインテグリンで媒
介されるものから区別されることが示された。ＥＬＡＭ
−１に対するナイーブＴ細胞ではなくメモリーＴ細胞に
特異的結合は、印象的なことであり、フィブロネクチン
およびＩＣＡＭ−１のようなインテグリン・リガンドに
対するメモリーＴ細胞のより大きな結合性がある一方、
ナイーブＴ細胞は急性活性化の後でさらに結合すること
ができる。ＥＬＡＭ−１に対するＴ細胞付着の活性化非
依存性はこの付着経路を他のものから区別するものであ
り、活性化は付着の増加または排除に重要な調節の役割
を果たす。
【０３２５】
【表７】
【０３２６】表７中の参考文献１〜９は以下のものであ
る。
る。
【０３２７】１ ジェイイーエヌ（ＪＥＮ） １７０：
１１３３（１９８９） ２ ジェイ．イム．（Ｊ．Ｉｍｍ．）１３８：１５１０
（１９８７）；イーエムビーオー・ジェイ．（ＥＭＢＯ
Ｊ．）８：１３６１（１９８９） ３ ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ．）
１３：２０２（１９８３） ４ ピーエヌエイエス（ＰＮＡＳ）８５：３０９５（１
９８８） ５ ヒューム．イム．（Ｈｕｍ．Ｉｍｍ．）１５：３０
（１９８９） ６ ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ．）
２０：１１１１（１９９０） ７ イム．（Ｉｍｍ．）５８：６３（１９８６） ８ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（シミズ（Ｓｈｉｍｉ
ｚｕ）ら、文献投稿中） ９ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３１，８６（１９８
８） 以下の表８に、ＶＣＡＭ−１+ Ｌ−細胞トランスフェク
タントＬＶＥ３に対するＣＤ４+ Ｔ細胞付着の特異性に
ついての結果を示す。
１１３３（１９８９） ２ ジェイ．イム．（Ｊ．Ｉｍｍ．）１３８：１５１０
（１９８７）；イーエムビーオー・ジェイ．（ＥＭＢＯ
Ｊ．）８：１３６１（１９８９） ３ ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ．）
１３：２０２（１９８３） ４ ピーエヌエイエス（ＰＮＡＳ）８５：３０９５（１
９８８） ５ ヒューム．イム．（Ｈｕｍ．Ｉｍｍ．）１５：３０
（１９８９） ６ ユーロ．ジェイ．イム．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ．）
２０：１１１１（１９９０） ７ イム．（Ｉｍｍ．）５８：６３（１９８６） ８ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（シミズ（Ｓｈｉｍｉ
ｚｕ）ら、文献投稿中） ９ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３１，８６（１９８
８） 以下の表８に、ＶＣＡＭ−１+ Ｌ−細胞トランスフェク
タントＬＶＥ３に対するＣＤ４+ Ｔ細胞付着の特異性に
ついての結果を示す。
【０３２８】
【表８】
【０３２９】ＰＭＡ活性化ＣＤ４+ Ｔ細胞のＶＣＡＭ−
１+ Ｌ−細胞トランスフェクタントＬＶＥ３に対する結
合は、既述のようにして行った。付着は、１５μｇ／ｍ
ｌの飽和濃度で示されたｍＡｂｓの持続的な存在下に測
定された。トランスフェクトされていないＬ−細胞コン
トロールに対するＰＭＡ活性化ＣＤ４+ Ｔ細胞の付着の
結合のバックグラウンドは、特異的な結合から差し引か
れた；示されたｍＡｂの存在下での示された結合阻害率
は、ｍＡｂの不存在下での結合に関連して計算された
（トップライン）。 以上、本発明を詳細に、また特定
の実施例を挙げて説明したが、当業者ならば、本発明の
精神および範囲を逸脱することなく、種々の変更、装飾
をなしうることは明らかであろう。
１+ Ｌ−細胞トランスフェクタントＬＶＥ３に対する結
合は、既述のようにして行った。付着は、１５μｇ／ｍ
ｌの飽和濃度で示されたｍＡｂｓの持続的な存在下に測
定された。トランスフェクトされていないＬ−細胞コン
トロールに対するＰＭＡ活性化ＣＤ４+ Ｔ細胞の付着の
結合のバックグラウンドは、特異的な結合から差し引か
れた；示されたｍＡｂの存在下での示された結合阻害率
は、ｍＡｂの不存在下での結合に関連して計算された
（トップライン）。 以上、本発明を詳細に、また特定
の実施例を挙げて説明したが、当業者ならば、本発明の
精神および範囲を逸脱することなく、種々の変更、装飾
をなしうることは明らかであろう。
【０３３０】寄託の記述 ハイブリドーマ１Ｅ７、２Ｇ７、３Ａ２および７Ａ９
は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約の条項に従い、１９８９年５月９日に、メ
リーランド州２０５８２、ロックヴィル市パークローン
ドライヴ９２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号はそれぞ
れＨＢ１０１３６、ＨＢ１０１３７、ＨＢ１０１３８お
よびＨＢ１０１３５である。ハイブリドーマ３Ｂ７は、
１９９０年３月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号はＨＢ
１０３９１である。本出願に対して米国特許が付与され
たときは、入手に対する全ての制限が取消し不能的に除
かれるであろう。
は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約の条項に従い、１９８９年５月９日に、メ
リーランド州２０５８２、ロックヴィル市パークローン
ドライヴ９２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号はそれぞ
れＨＢ１０１３６、ＨＢ１０１３７、ＨＢ１０１３８お
よびＨＢ１０１３５である。ハイブリドーマ３Ｂ７は、
１９９０年３月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号はＨＢ
１０３９１である。本出願に対して米国特許が付与され
たときは、入手に対する全ての制限が取消し不能的に除
かれるであろう。
【図１】Fig １は、本発明の新規モノクローナル抗体
（ＭＡｂ）が白血球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合
をブロックする機構および本発明の新規抗原（ペプチ
ド）が炎症をブロックするように働く機構を模式的に示
したものである。
（ＭＡｂ）が白血球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合
をブロックする機構および本発明の新規抗原（ペプチ
ド）が炎症をブロックするように働く機構を模式的に示
したものである。
【図２】Fig ２は、未誘導（…）およびＩＬ−１誘導
（−）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のフローサイ
トメトリー分析を示す。横軸上の各２５チャンネルは蛍
光強度a.u.＝任意単位がほぼ２倍になることを意味す
る。任意単位での細胞数を縦軸に示す。Fig ２Ａで、１
は、間接蛍光ヤギ抗マウス試薬のみで染色した内皮細胞
上の蛍光強度を示す。２は、以降の図と比較するための
標準であるＷ６／３２抗ＨＬＡ試薬の強度を示す。Fig
２Ｂで、実線は１Ｅ７抗体による染色を示す。Fig ２Ｃ
は、抗体２Ｇ７による染色を示す。Fig ２Ｂ及び２Ｃの
点線は未誘導ＨＵＶＥＣの示されたモノクロナール抗体
をに寄る染色を意味する。
（−）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のフローサイ
トメトリー分析を示す。横軸上の各２５チャンネルは蛍
光強度a.u.＝任意単位がほぼ２倍になることを意味す
る。任意単位での細胞数を縦軸に示す。Fig ２Ａで、１
は、間接蛍光ヤギ抗マウス試薬のみで染色した内皮細胞
上の蛍光強度を示す。２は、以降の図と比較するための
標準であるＷ６／３２抗ＨＬＡ試薬の強度を示す。Fig
２Ｂで、実線は１Ｅ７抗体による染色を示す。Fig ２Ｃ
は、抗体２Ｇ７による染色を示す。Fig ２Ｂ及び２Ｃの
点線は未誘導ＨＵＶＥＣの示されたモノクロナール抗体
をに寄る染色を意味する。
【図３】Fig ２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆは、それぞれ抗体２
Ｇ７、７Ａ９、３Ｂ７およびＲＲ１（抗ＩＣＡＭ−１）
による染色を示す。Fig ２Ｄ〜２Ｆの点線は未誘導ＨＵ
ＶＥＣの示されたモノクローナル抗体による染色を意味
する。
Ｇ７、７Ａ９、３Ｂ７およびＲＲ１（抗ＩＣＡＭ−１）
による染色を示す。Fig ２Ｄ〜２Ｆの点線は未誘導ＨＵ
ＶＥＣの示されたモノクローナル抗体による染色を意味
する。
【図４】図４中、Fig ３は、モノクローナル抗体１Ｅ
７、２Ｇ７および３Ｂ７の１Ｅ７／２Ｇ７ ｃＤＮＡト
ランスフェクトＣＯＳ細胞との反応性を示すヒストグラ
ムである。結果は、ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体に続
いての 125Ｉ−ストレプトアビジンのＣＰＭ×１０-3で
表わされている。また、Fig ４は、モノクローナル抗体
２Ｇ７のＦ(ab') 2 断片の種々の用量で又は本発明のモ
ノクローナル抗体１Ｅ７の１０μｇ／mlで前処理された
ＩＬ−１活性化内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのヒト単核細
胞の結合の阻害を示すグラフである。
７、２Ｇ７および３Ｂ７の１Ｅ７／２Ｇ７ ｃＤＮＡト
ランスフェクトＣＯＳ細胞との反応性を示すヒストグラ
ムである。結果は、ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体に続
いての 125Ｉ−ストレプトアビジンのＣＰＭ×１０-3で
表わされている。また、Fig ４は、モノクローナル抗体
２Ｇ７のＦ(ab') 2 断片の種々の用量で又は本発明のモ
ノクローナル抗体１Ｅ７の１０μｇ／mlで前処理された
ＩＬ−１活性化内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのヒト単核細
胞の結合の阻害を示すグラフである。
【図５】Fig ５は、ＨＵＶＥＣへの顆粒球の付着に対す
るモノクローナル抗体の影響を示すヒストグラムであ
る。結果は、ウェル当り結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝３）
で表わされている。
るモノクローナル抗体の影響を示すヒストグラムであ
る。結果は、ウェル当り結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝３）
で表わされている。
【図６】Fig ６は、ＨＵＶＥＣへのＴ細胞の付着に対す
るモノクローナル抗体の影響を示すヒストグラムであ
る。結果は、ウェル当り結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝３）
で表わされている。
るモノクローナル抗体の影響を示すヒストグラムであ
る。結果は、ウェル当り結合細胞数±s.e.m.（ｎ＝３）
で表わされている。
【図７】Fig ７は、本発明のモノクローナル抗体１Ｅ７
および２Ｇ７によって規定される抗原の非還元条件下で
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）パターン（１０％アクリルアミド）である。
分子量標準も示す。
および２Ｇ７によって規定される抗原の非還元条件下で
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）パターン（１０％アクリルアミド）である。
分子量標準も示す。
【図８】Fig ８は、本発明のモノクローナル抗体３Ａ２
および７Ａ９によって規定される抗原の還元条件下（Fi
g ８Ｂ）および非還元条件下（Fig ８Ａ）でのＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン（８％アクリ
ルアミド）である。分子量標準も示す。
および７Ａ９によって規定される抗原の還元条件下（Fi
g ８Ｂ）および非還元条件下（Fig ８Ａ）でのＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン（８％アクリ
ルアミド）である。分子量標準も示す。
【図９】図９中、Fig ９は、正常な休止およびＩＬ−１
活性化内皮細胞（ＥＣ）への本発明のモノクローナル抗
体の結合（ＥＣ抗原発現に対するＩＬ−１の効果）を示
すグラフである。また、Fig １０は、ＩＬ−１不存在下
での正常なヒト白血球、顆粒球又は単核細胞（Ｔ細胞、
Ｂ細胞および単球）への本発明のモノクローナル抗体の
結合（白血球上での内皮抗原発現）を示すグラフであ
る。
活性化内皮細胞（ＥＣ）への本発明のモノクローナル抗
体の結合（ＥＣ抗原発現に対するＩＬ−１の効果）を示
すグラフである。また、Fig １０は、ＩＬ−１不存在下
での正常なヒト白血球、顆粒球又は単核細胞（Ｔ細胞、
Ｂ細胞および単球）への本発明のモノクローナル抗体の
結合（白血球上での内皮抗原発現）を示すグラフであ
る。
【図１０】Fig １１は、２〜９６時間の種々の時間ＩＬ
−１に曝露された内皮細胞への本発明のモノクローナル
抗体の結合を示すグラフである。
−１に曝露された内皮細胞への本発明のモノクローナル
抗体の結合を示すグラフである。
【図１１】Fig １２Ａは、35Ｓ−システインで標識され
た休止内皮細胞の２−Ｄゲルパターンである。未誘起細
胞（−ＩＬ−１）２−Ｄゲル（Fig １２Ａ）の左上方の
３本の矢印は、Fig １２Ｂ（＋ＩＬ−１）の誘起ゲル中
で誘発蛋白質が現われる領域を示す。データベース中の
既知蛋白質との比較に基いて、見掛けの分子量および等
電点を示した。
た休止内皮細胞の２−Ｄゲルパターンである。未誘起細
胞（−ＩＬ−１）２−Ｄゲル（Fig １２Ａ）の左上方の
３本の矢印は、Fig １２Ｂ（＋ＩＬ−１）の誘起ゲル中
で誘発蛋白質が現われる領域を示す。データベース中の
既知蛋白質との比較に基いて、見掛けの分子量および等
電点を示した。
【図１２】Fig １２Ｂは、35Ｓ−システインで標識され
たＩＬ−１活性化内皮細胞からのトライトンＸ−１１４
洗剤ペレット（膜蛋白質）の２−Ｄゲルパターンであ
る。
たＩＬ−１活性化内皮細胞からのトライトンＸ−１１４
洗剤ペレット（膜蛋白質）の２−Ｄゲルパターンであ
る。
【図１３】Fig １３は、１Ｅ７および２Ｇ７免疫沈降物
単独ならびに未誘起（−ＩＬ−１）および誘起（＋ＩＬ
−１）ＨＵＶＥＣからの総膜蛋白質と混合したときの１
Ｅ７および２Ｇ７免疫沈降物の２−Ｄゲルパターンであ
る。８つの正方形の各々には、Fig １２で分析された総
ゲルの左上方の４分の１に相当する２−Ｄゲルの部分が
示されている。Fig １３Ａおよび１３Ｂは、１Ｅ７（上
方）または２Ｇ７（下方）抗体による免疫沈降物のみで
ある。これらのゲルの他の部にはそれ以上のスポットは
見られなかった。Fig １３Ｃおよび１３Ｄは、免疫沈降
物を加えていない、未誘起（−ＩＬ−１、上方）または
誘起（ＩＬ−１、下方）ＨＵＶＥＣからの総膜蛋白質を
示す。Fig １３Ｅおよび１３Ｆは、未誘起ＨＵＶＥＣの
膜蛋白質への１Ｅ７（上方）または２Ｇ７（下方）免疫
沈降物添加の影響を示す。Fig１３Ｇおよび１３Ｈは、
ＩＬ−１誘起ＨＵＶＥＣからの膜蛋白質への１Ｅ７（上
方）または２Ｇ７（下方）免疫沈降物添加の影響を示
す。プラス（＋）は各ゲルの酸性末端を、マイナス
（−）は塩基性末端を意味する。
単独ならびに未誘起（−ＩＬ−１）および誘起（＋ＩＬ
−１）ＨＵＶＥＣからの総膜蛋白質と混合したときの１
Ｅ７および２Ｇ７免疫沈降物の２−Ｄゲルパターンであ
る。８つの正方形の各々には、Fig １２で分析された総
ゲルの左上方の４分の１に相当する２−Ｄゲルの部分が
示されている。Fig １３Ａおよび１３Ｂは、１Ｅ７（上
方）または２Ｇ７（下方）抗体による免疫沈降物のみで
ある。これらのゲルの他の部にはそれ以上のスポットは
見られなかった。Fig １３Ｃおよび１３Ｄは、免疫沈降
物を加えていない、未誘起（−ＩＬ−１、上方）または
誘起（ＩＬ−１、下方）ＨＵＶＥＣからの総膜蛋白質を
示す。Fig １３Ｅおよび１３Ｆは、未誘起ＨＵＶＥＣの
膜蛋白質への１Ｅ７（上方）または２Ｇ７（下方）免疫
沈降物添加の影響を示す。Fig１３Ｇおよび１３Ｈは、
ＩＬ−１誘起ＨＵＶＥＣからの膜蛋白質への１Ｅ７（上
方）または２Ｇ７（下方）免疫沈降物添加の影響を示
す。プラス（＋）は各ゲルの酸性末端を、マイナス
（−）は塩基性末端を意味する。
【図１４】Fig １４は、免疫沈降物の単独および組合せ
の２−Ｄゲルパターンである。免疫沈降に用いたモノク
ローナル抗体は次の通りである：Fig １４Ａ、ＲＲ１
（抗ＩＣＡＭ−１）；Fig １４Ｂ、２Ｇ７；Fig １４
Ｃ、７Ａ９；Fig １４Ｄ、ＲＲ１＋２Ｇ７；Fig １４
Ｅ、ＲＲ１＋７Ａ９；Fig １４Ｆ、２Ｇ７＋７Ａ９。６
つの２−Ｄゲルの各々左上方４分の１のみを示した。他
の領域には、追加のスポットはなかった。
の２−Ｄゲルパターンである。免疫沈降に用いたモノク
ローナル抗体は次の通りである：Fig １４Ａ、ＲＲ１
（抗ＩＣＡＭ−１）；Fig １４Ｂ、２Ｇ７；Fig １４
Ｃ、７Ａ９；Fig １４Ｄ、ＲＲ１＋２Ｇ７；Fig １４
Ｅ、ＲＲ１＋７Ａ９；Fig １４Ｆ、２Ｇ７＋７Ａ９。６
つの２−Ｄゲルの各々左上方４分の１のみを示した。他
の領域には、追加のスポットはなかった。
【図１５】図１５中、Fig １５は、ｐＣＤＮ−ＥＬＡＭ
−１発現プラスミドのダイアグラムである。ＥＬＡＭ−
１ ｃＤＮＡを、ｐＳＶ２ ＮＥＯ（サザンとバーグ、
ジャーナル・オヴ・モレキュラー・アンド・アプライド
・ジェネティックス、１巻３２７〜３４１頁、１９８２
年）から導いた、ＳＶ４０初期プロモーター（斜線部）
ならびにＳＶ４０“ｔ”スプライス配列およびポリＡ付
加配列（点を打った領域）を含むプラスミド（ｐＣＤＮ
−１；Ｔ．Ｖ．ゴパル、未発表）中にクローン化した。
プラスミドの残余はｐＢＲ３２２（ − ）配列を含ん
でいた。重要な制限部位は図中に示してある。ＭＣＳは
多重クローニング部位を意味する。また、Fig １６は、
ＥＬＡＭ−１で、および模擬的にトランスフェクトされ
たＣＯＳ細胞のモノクローナル抗体結合アッセイのヒス
トグラムである。結果はウェル当り総ｃｐｍの平均（±
s.e.m.ｎ＝３）で表わされている。
−１発現プラスミドのダイアグラムである。ＥＬＡＭ−
１ ｃＤＮＡを、ｐＳＶ２ ＮＥＯ（サザンとバーグ、
ジャーナル・オヴ・モレキュラー・アンド・アプライド
・ジェネティックス、１巻３２７〜３４１頁、１９８２
年）から導いた、ＳＶ４０初期プロモーター（斜線部）
ならびにＳＶ４０“ｔ”スプライス配列およびポリＡ付
加配列（点を打った領域）を含むプラスミド（ｐＣＤＮ
−１；Ｔ．Ｖ．ゴパル、未発表）中にクローン化した。
プラスミドの残余はｐＢＲ３２２（ − ）配列を含ん
でいた。重要な制限部位は図中に示してある。ＭＣＳは
多重クローニング部位を意味する。また、Fig １６は、
ＥＬＡＭ−１で、および模擬的にトランスフェクトされ
たＣＯＳ細胞のモノクローナル抗体結合アッセイのヒス
トグラムである。結果はウェル当り総ｃｐｍの平均（±
s.e.m.ｎ＝３）で表わされている。
【図１６】Fig １７は、ツニカマイシンＢ２なしでまた
は用いてＩＬ−１で処理され、２Ｇ７または７Ａ９モノ
クローナル抗体で免疫沈降させられたコンフルエントＨ
ＵＶＥＣの１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲ
ルパターンである。
は用いてＩＬ−１で処理され、２Ｇ７または７Ａ９モノ
クローナル抗体で免疫沈降させられたコンフルエントＨ
ＵＶＥＣの１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲ
ルパターンである。
【図１７】Fig １８は、ＩＬ−１で活性化され、35Ｓ−
システインで代謝的に標識されたＨＵＶＥＣの２−Ｄゲ
ルパターンである。細胞は無処理のままか、溶解前に３
０分間ノイラミニダーゼ処理した。トライトンＸ−１０
０溶解物を２Ｇ７（Fig １８Ａ）または７Ａ９（Fig １
８Ｂ）抗体で免疫沈降させた。４つの２−Ｄゲルの各々
の一部を図に示した。
システインで代謝的に標識されたＨＵＶＥＣの２−Ｄゲ
ルパターンである。細胞は無処理のままか、溶解前に３
０分間ノイラミニダーゼ処理した。トライトンＸ−１０
０溶解物を２Ｇ７（Fig １８Ａ）または７Ａ９（Fig １
８Ｂ）抗体で免疫沈降させた。４つの２−Ｄゲルの各々
の一部を図に示した。
【図１８】Fig １９は、７Ａ９または２Ｇ７抗体で免疫
沈降させたＩＬ−１活性化35Ｓ−システイン標識ＨＵＶ
ＥＣのトライトンＸ−１００溶解物の１０％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド還元性ゲルパターンである。免疫沈降
物は、緩衝液のみ、ノイラミニダーゼ（Ｎ′ase)または
ノイラミニダーゼおよびそれに続くエンド−α−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼ（Ｏ−gly'case）により処
理した。
沈降させたＩＬ−１活性化35Ｓ−システイン標識ＨＵＶ
ＥＣのトライトンＸ−１００溶解物の１０％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド還元性ゲルパターンである。免疫沈降
物は、緩衝液のみ、ノイラミニダーゼ（Ｎ′ase)または
ノイラミニダーゼおよびそれに続くエンド−α−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼ（Ｏ−gly'case）により処
理した。
【図１９】Fig ２０は、指定の期間ＩＬ−１と共にイン
キュベートしたＨＵＶＥＣの１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド還元性ゲルパターンである。トライトンＸ−１
００溶解物の免疫沈降物は、２Ｇ７または７Ａ９抗体を
用いて形成させた。
キュベートしたＨＵＶＥＣの１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド還元性ゲルパターンである。トライトンＸ−１
００溶解物の免疫沈降物は、２Ｇ７または７Ａ９抗体を
用いて形成させた。
【図２０】Fig ２１は、フルオレセイン結合モノクロー
ナル抗体１Ｅ７、２Ｇ７、３Ｂ７または７Ａ９を用いて
行った競合アッセイのヒストグラムを示す。Fig ２１
Ａ、１Ｅ７；Fig ２１Ｂ、２Ｇ７；Fig ２１Ｃ、３Ｂ
７；Fig ２１Ｄ、７Ａ９。縦軸に陽性細胞百分率をとっ
てある。データはフローサイトメトリーから導いたもの
である。
ナル抗体１Ｅ７、２Ｇ７、３Ｂ７または７Ａ９を用いて
行った競合アッセイのヒストグラムを示す。Fig ２１
Ａ、１Ｅ７；Fig ２１Ｂ、２Ｇ７；Fig ２１Ｃ、３Ｂ
７；Fig ２１Ｄ、７Ａ９。縦軸に陽性細胞百分率をとっ
てある。データはフローサイトメトリーから導いたもの
である。
【図２１】Fig ２２は、指定の期間ＨＵＶＥＣをＩＬ−
１に曝露した結果を示すグラフである。抗体２Ｇ７
（●）または７Ａ９（▲）を飽和濃度でサンドイッチ結
合アッセイに用いた。結果は、平均cpm ±s.e.m.（ｎ＝
３）として表わされている。
１に曝露した結果を示すグラフである。抗体２Ｇ７
（●）または７Ａ９（▲）を飽和濃度でサンドイッチ結
合アッセイに用いた。結果は、平均cpm ±s.e.m.（ｎ＝
３）として表わされている。
【図２２】Fig ２３は、間接試薬のみ（Fig ２３Ａ）、
Ｗ６／３２抗ＨＬＡ抗原（Fig ２３Ｂ）、抗ＩＣＡＭ−
１抗体ＲＲ／１（Fig ２３Ｃ）および３Ａ２抗体（Fig
２３Ｄ）で染色した休止（…）またはＩＬ−１刺激
（−）内皮細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
Ｗ６／３２抗ＨＬＡ抗原（Fig ２３Ｂ）、抗ＩＣＡＭ−
１抗体ＲＲ／１（Fig ２３Ｃ）および３Ａ２抗体（Fig
２３Ｄ）で染色した休止（…）またはＩＬ−１刺激
（−）内皮細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図２３】Fig ２４は、無処理で（−）またはＩＬ−１
で処理し（＋）、１％トライトンＸ−１００で溶解し、
指定の抗体で免疫沈降させた代謝標識内皮細胞からのＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル（８％アクリルア
ミド）パターンを示す。図中、ＭＡｂ７およびＭＡｂ３
はそれぞれモノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７を表
わす。
で処理し（＋）、１％トライトンＸ−１００で溶解し、
指定の抗体で免疫沈降させた代謝標識内皮細胞からのＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル（８％アクリルア
ミド）パターンを示す。図中、ＭＡｂ７およびＭＡｂ３
はそれぞれモノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７を表
わす。
【図２４】Fig ２５は、ＩＬ−１およびアクチノマイシ
ンＤまたはシクロヘキシミドで処理したのち、プレート
結合アッセイで２Ｇ７、７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）また
は３Ａ２抗原の発現を調べた内皮細胞のヒストグラムを
示す。Fig ２５Ａ、ＩＬ−１±シクロヘキシミド；Fig
２５Ｂ、ＩＬ−１±アクチノマイシンＤ（ａｃｔＤ）。
ンＤまたはシクロヘキシミドで処理したのち、プレート
結合アッセイで２Ｇ７、７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）また
は３Ａ２抗原の発現を調べた内皮細胞のヒストグラムを
示す。Fig ２５Ａ、ＩＬ−１±シクロヘキシミド；Fig
２５Ｂ、ＩＬ−１±アクチノマイシンＤ（ａｃｔＤ）。
【図２５】Fig ２６は、３Ａ２抗原の光学顕微鏡評価を
示す。Fig ２６Ａ、生育培地のみで培養し、抗体７Ａ９
で染色した内皮細胞；Fig ２６Ｂ、ＩＬ−１で活性化
し、抗体７Ａ９で染色した内皮細胞；２６Ｃ、生育培地
のみで培養し、抗体３Ａ２で染色した内皮細胞；Fig ２
６Ｄ、ＩＬ−１で活性化し、抗体３Ａ２で染色した内皮
細胞。Fig ２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄの大きい斑点
は、対応する抗原の存在を示す染色由来の赤色による。
Fig ２６Ａの小さい暗スポットは、青く染色されたが、
赤い細胞質染色には囲まれていない核である。
示す。Fig ２６Ａ、生育培地のみで培養し、抗体７Ａ９
で染色した内皮細胞；Fig ２６Ｂ、ＩＬ−１で活性化
し、抗体７Ａ９で染色した内皮細胞；２６Ｃ、生育培地
のみで培養し、抗体３Ａ２で染色した内皮細胞；Fig ２
６Ｄ、ＩＬ−１で活性化し、抗体３Ａ２で染色した内皮
細胞。Fig ２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄの大きい斑点
は、対応する抗原の存在を示す染色由来の赤色による。
Fig ２６Ａの小さい暗スポットは、青く染色されたが、
赤い細胞質染色には囲まれていない核である。
【図２６】Fig ２７は、３Ａ２抗体（ＭＡｂ３）または
対照のヤギ抗マウスＩｇＭ試薬のみ（ＭＡｂ−）で免疫
沈降させた未処理（−）またはＩＬ−１処理（＋）内皮
細胞のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルパターンを示
す。これらの免疫沈降物の一部を、非還元（Fig ２７
Ａ）または還元（Fig ２７Ｂ）条件下に８％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上で泳動させた。Fig ２７Ｃ、第
一および第二レーン：ＩＬ−１活性化細胞からのモノク
ローナル抗体７Ａ９または２Ｇ７（それぞれｍＡｂ７、
ＭＡｂ２）による免疫沈降物（対照として）；Fig ２７
Ｃ、第三および第四レーン：３Ａ２免疫沈降物からの７
Ａ９または２Ｇ７抗体による免疫沈降物。それゆえ、第
二のバンドは、Fig ２７Ａおよび２７Ｂのモノクローナ
ル抗体３Ａ２（１７０ｋＤａ）および７Ａ９と共沈降し
たが、２Ｇ７抗原とはしなかった。
対照のヤギ抗マウスＩｇＭ試薬のみ（ＭＡｂ−）で免疫
沈降させた未処理（−）またはＩＬ−１処理（＋）内皮
細胞のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルパターンを示
す。これらの免疫沈降物の一部を、非還元（Fig ２７
Ａ）または還元（Fig ２７Ｂ）条件下に８％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上で泳動させた。Fig ２７Ｃ、第
一および第二レーン：ＩＬ−１活性化細胞からのモノク
ローナル抗体７Ａ９または２Ｇ７（それぞれｍＡｂ７、
ＭＡｂ２）による免疫沈降物（対照として）；Fig ２７
Ｃ、第三および第四レーン：３Ａ２免疫沈降物からの７
Ａ９または２Ｇ７抗体による免疫沈降物。それゆえ、第
二のバンドは、Fig ２７Ａおよび２７Ｂのモノクローナ
ル抗体３Ａ２（１７０ｋＤａ）および７Ａ９と共沈降し
たが、２Ｇ７抗原とはしなかった。
【図２７】Fig ２８は、模擬トランスフェクションに付
した（−）、またはＣＤＮプラスミド中のＥＬＡＭ−１
ｃＤＮＡによりトランスフェクトした（＋）ＣＯＳ細胞
の７Ａ９または３Ａ２免疫沈降物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド還元性ゲル（１０％アクリルアミド）パターン
である。モノクローナル抗体７Ａ９はＥＬＡＭ−１蛋白
質を沈降させ、モノクローナル抗体３Ａ２はＣＯＳ細胞
内因性１７０ｋＤａ抗原を沈降させ、ＥＬＡＭ−１を共
沈降させる。
した（−）、またはＣＤＮプラスミド中のＥＬＡＭ−１
ｃＤＮＡによりトランスフェクトした（＋）ＣＯＳ細胞
の７Ａ９または３Ａ２免疫沈降物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド還元性ゲル（１０％アクリルアミド）パターン
である。モノクローナル抗体７Ａ９はＥＬＡＭ−１蛋白
質を沈降させ、モノクローナル抗体３Ａ２はＣＯＳ細胞
内因性１７０ｋＤａ抗原を沈降させ、ＥＬＡＭ−１を共
沈降させる。
【図２８】Fig ２９は、35Ｓ−システインと４５または
１２０分間パルス（pulse)し、４５分後に溶解するか
（Fig ２９Ａ、最初の２レーン）または溶解前に１また
は２時間さらにチェイス（chase)した（Fig ２９Ａ、残
りのレーン）内皮細胞の免疫沈降物のＳＤＳ−ポリアク
リルアミド還元性ゲル（１０％アクリルアミド）パター
ンを示す。Fig ２９Ｂの場合、内皮細胞をＩＬ−１に４
時間曝露したのち、 125Ｉで表面標識しておいた。ゲル
は３Ａ２：ＥＬＡＭ−１会合の動態を示す。図中、ＭＡ
ｂ３およびＭＡｂ７はそれぞれモノクローナル抗体３Ａ
２および７Ａ９を意味する。
１２０分間パルス（pulse)し、４５分後に溶解するか
（Fig ２９Ａ、最初の２レーン）または溶解前に１また
は２時間さらにチェイス（chase)した（Fig ２９Ａ、残
りのレーン）内皮細胞の免疫沈降物のＳＤＳ−ポリアク
リルアミド還元性ゲル（１０％アクリルアミド）パター
ンを示す。Fig ２９Ｂの場合、内皮細胞をＩＬ−１に４
時間曝露したのち、 125Ｉで表面標識しておいた。ゲル
は３Ａ２：ＥＬＡＭ−１会合の動態を示す。図中、ＭＡ
ｂ３およびＭＡｂ７はそれぞれモノクローナル抗体３Ａ
２および７Ａ９を意味する。
【図２９】Fig ３０は、ＣＭＰ−１７０および７Ａ９
（ＥＬＡＭ−１）抗原の細胞表面発現の動態を示すグラ
フである。白抜きの円は７Ａ９抗原を、白抜きの三角形
は３Ａ２抗原を表わす。
（ＥＬＡＭ−１）抗原の細胞表面発現の動態を示すグラ
フである。白抜きの円は７Ａ９抗原を、白抜きの三角形
は３Ａ２抗原を表わす。
【図３０】Fig ３１は、抗原ＥＬＡＭ−１の種々の截頭
形態のダイアグラムを示す。
形態のダイアグラムを示す。
【図３１】Fig ３２Ａは、抗原ＥＬＡＭ−１の種々の截
頭形のモノクローナル抗体３Ａ２、３Ｂ７および７Ａ９
との共沈降パターンを示す。抗原性断片は、所定のＥＬ
ＡＭ−１構築物でトランスフェクトし、４８時間後に、
35Ｓ−システインで１４時間標識したＣＯＳ細胞の上澄
みのみから得た。截頭形の各構造をFig ３１に示す。
頭形のモノクローナル抗体３Ａ２、３Ｂ７および７Ａ９
との共沈降パターンを示す。抗原性断片は、所定のＥＬ
ＡＭ−１構築物でトランスフェクトし、４８時間後に、
35Ｓ−システインで１４時間標識したＣＯＳ細胞の上澄
みのみから得た。截頭形の各構造をFig ３１に示す。
【図３２】Fig ３２Ｂは、完全な（intact）ＥＬＡＭ−
１抗原のモノクローナル抗体３Ａ２、３Ｂ７および７Ａ
９との共沈降パターンを示す。抗原性断片は、所定のＥ
ＬＡＭ−１構築物でトランスフェクトし、４８時間後
に、35Ｓ−システインで１４時間標識したＣＯＳ細胞の
上澄みのみから得た。截頭形の各構造をFig ３１に示
す。
１抗原のモノクローナル抗体３Ａ２、３Ｂ７および７Ａ
９との共沈降パターンを示す。抗原性断片は、所定のＥ
ＬＡＭ−１構築物でトランスフェクトし、４８時間後
に、35Ｓ−システインで１４時間標識したＣＯＳ細胞の
上澄みのみから得た。截頭形の各構造をFig ３１に示
す。
【図３３】Fig ３３は、ＶＣＡＭ−１抗原および１Ｅ７
／２Ｇ７抗原のダイアグラムである。
／２Ｇ７抗原のダイアグラムである。
【図３４】Fig ３４Ａは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の２４番目〜３８３番目塩基（コード領域）の
ｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、アミノ
酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の２４番目〜３８３番目塩基（コード領域）の
ｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、アミノ
酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図３５】Fig ３４Ｂは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の３８４番目〜７４３番目塩基（コード領域）
のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、アミ
ノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の３８４番目〜７４３番目塩基（コード領域）
のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、アミ
ノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図３６】Fig ３４Ｃは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の７４４番目〜１１０３番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の７４４番目〜１１０３番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図３７】Fig ３４Ｄは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の１１０４番目〜１４６３番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の１１０４番目〜１４６３番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図３８】Fig ３４Ｅは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の１４６４番目〜１７５１番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の１４６４番目〜１７５１番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図３９】Fig ３４Ｆは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の１７５２番目〜２０３９番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の１７５２番目〜２０３９番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図４０】Fig ３４Ｇは、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコード
する分子の２０４０番目〜２２４３番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
する分子の２０４０番目〜２２４３番目塩基（コード領
域）のｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、
アミノ酸の標準的な１文字記号を用いて示した。
【図４１】Ｆｉｇ３５Ａ及び３５Ｂは、ナイーブ（ｎａ
ｉｖｅ）及びメモリー（ｍｅｍｏｒｙ）ＣＤ４+ Ｔ細胞
の休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）及びＩＬ−１誘導ＨＵＶＥＣ
への結合を示す棒グラフである。ナイーブ（ＣＤ４+ Ｃ
Ｄ４５ＲＡ+ ）及びメモリー（ＣＤ４+ ＣＤ４５Ｒ
Ｏ+ ）Ｔ細胞は、代表的なドナーから単離され、休止及
び活性化されたＨＵＶＥＣへの結合について評価され
た。サブセット（ｓｕｂｓｅｔ）の純度は、フローサイ
トメトリー分析により測定された値として＞９５％であ
った。休止ナイーブ（塗り潰した棒（ｓｏｌｉｄ ｂａ
ｒｓ））及びメモリー（内部が空白の棒（ｏｐｅｎ ｂ
ａｒｓ））ＣＤ４+ Ｔ細胞並びにＰＭＡ活性化ナイーブ
（格子線を引いた棒（ｈａｔｃｈｅｄ ｂａｒｓ））及
びメモリー（多数の点で影をつけた棒（ｓｈａｄｅｄ
ｂａｒｓ））細胞が示される。異なるドナーから単離さ
れたナイーブ及びメモリー細胞を用いた、独立した２種
の実験結果が示される。
ｉｖｅ）及びメモリー（ｍｅｍｏｒｙ）ＣＤ４+ Ｔ細胞
の休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）及びＩＬ−１誘導ＨＵＶＥＣ
への結合を示す棒グラフである。ナイーブ（ＣＤ４+ Ｃ
Ｄ４５ＲＡ+ ）及びメモリー（ＣＤ４+ ＣＤ４５Ｒ
Ｏ+ ）Ｔ細胞は、代表的なドナーから単離され、休止及
び活性化されたＨＵＶＥＣへの結合について評価され
た。サブセット（ｓｕｂｓｅｔ）の純度は、フローサイ
トメトリー分析により測定された値として＞９５％であ
った。休止ナイーブ（塗り潰した棒（ｓｏｌｉｄ ｂａ
ｒｓ））及びメモリー（内部が空白の棒（ｏｐｅｎ ｂ
ａｒｓ））ＣＤ４+ Ｔ細胞並びにＰＭＡ活性化ナイーブ
（格子線を引いた棒（ｈａｔｃｈｅｄ ｂａｒｓ））及
びメモリー（多数の点で影をつけた棒（ｓｈａｄｅｄ
ｂａｒｓ））細胞が示される。異なるドナーから単離さ
れたナイーブ及びメモリー細胞を用いた、独立した２種
の実験結果が示される。
【図４２】Ｆｉｇ３６は、ＶＣＡＭ−１ Ｌ−細胞トラ
ンスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）に対す
るＣＤ４+ Ｔ細胞の活性化依存性結合を示す。休止（塗
り潰した棒）及びＰＭＡ活性化（多数の点で影をつけた
棒）ＣＤ４+ 細胞のＬ−細胞コントロール及びＶＣＡＭ
−１+ Ｌ−細胞トランスフェクタントＬＶＥ３に対する
付着性が評価された。データは、３重のウエルからの平
均の細胞結合率として表された。
ンスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）に対す
るＣＤ４+ Ｔ細胞の活性化依存性結合を示す。休止（塗
り潰した棒）及びＰＭＡ活性化（多数の点で影をつけた
棒）ＣＤ４+ 細胞のＬ−細胞コントロール及びＶＣＡＭ
−１+ Ｌ−細胞トランスフェクタントＬＶＥ３に対する
付着性が評価された。データは、３重のウエルからの平
均の細胞結合率として表された。
【図４３】Ｆｉｇ３７は、ナイーブ及びメモリーＣＤ４
+ Ｔ細胞のＶＣＡＭ−１トランスフェクタントに対する
異なる結合性を示す棒グラフである。同一のドナーから
単離された３世代のＴ細胞のＶＣＡＭ−１ Ｌ−細胞ト
ランスフェクタントＬＶＥ３に対する結合が評価され
た：ＣＤ４+ 、ＣＤ４+ ナイーブ（ＣＤ４+ ＣＤ４５Ｒ
Ａ+ ）及びＣＤ４+ メモリー（ＣＤ４+ ＣＤ４５Ｒ
Ｏ+ ）。休止（塗り潰した棒）及びＰＭＡ活性化（多数
の点で影をつけた棒）Ｔ細胞の付着性が示される。すべ
てのＣＤ４+ 細胞の形質転換されていないコントロール
Ｌ−細胞に対する結合性は、＜１０％であり、示された
値から差し引かれていない。データは、３重のウエルか
らの平均の細胞結合率として表される。
+ Ｔ細胞のＶＣＡＭ−１トランスフェクタントに対する
異なる結合性を示す棒グラフである。同一のドナーから
単離された３世代のＴ細胞のＶＣＡＭ−１ Ｌ−細胞ト
ランスフェクタントＬＶＥ３に対する結合が評価され
た：ＣＤ４+ 、ＣＤ４+ ナイーブ（ＣＤ４+ ＣＤ４５Ｒ
Ａ+ ）及びＣＤ４+ メモリー（ＣＤ４+ ＣＤ４５Ｒ
Ｏ+ ）。休止（塗り潰した棒）及びＰＭＡ活性化（多数
の点で影をつけた棒）Ｔ細胞の付着性が示される。すべ
てのＣＤ４+ 細胞の形質転換されていないコントロール
Ｌ−細胞に対する結合性は、＜１０％であり、示された
値から差し引かれていない。データは、３重のウエルか
らの平均の細胞結合率として表される。
【図４４】Ｆｉｇ３８は、細胞のＥＬＡＭ−１に対する
結合を示すグラフである。精製されたＥＬＡＭ−１は、
９６−ウエルのＥＬＩＳＡプレート（ヌンク（Ｎｕｎ
ｃ））に４℃で一夜適用された；プラスチックは、ＰＢ
Ｓ／２．５％ＢＳＡにより３７℃で２〜３時間ブロック
され、次いで該ウエルは、１００μｌＰＢＳ／０．５％
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の最終容量になるように
各ウエルに５００００個の51ＣｒでラベルされたＣＤ４
+ Ｔ細胞を添加する前に、ＰＢＳで３回洗浄された。４
℃で１時間処理した後で、非付着細胞は洗い流された。
ウエルの内容物は１％トライトン エックス−１００
（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）で分離され、ウエルの内
容物のガンマ放射が測定された。
結合を示すグラフである。精製されたＥＬＡＭ−１は、
９６−ウエルのＥＬＩＳＡプレート（ヌンク（Ｎｕｎ
ｃ））に４℃で一夜適用された；プラスチックは、ＰＢ
Ｓ／２．５％ＢＳＡにより３７℃で２〜３時間ブロック
され、次いで該ウエルは、１００μｌＰＢＳ／０．５％
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の最終容量になるように
各ウエルに５００００個の51ＣｒでラベルされたＣＤ４
+ Ｔ細胞を添加する前に、ＰＢＳで３回洗浄された。４
℃で１時間処理した後で、非付着細胞は洗い流された。
ウエルの内容物は１％トライトン エックス−１００
（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）で分離され、ウエルの内
容物のガンマ放射が測定された。
【図４５】Ｆｉｇ３９Ａおよび３９Ｂは、ナイーブＣＤ
４+ Ｔ細胞ではなく精製されたメモリーＣＤ４+ Ｔ細胞
が活性化依存性の態様で精製されたＥＬＡＭ−１に付着
することを示すグラフである。Ｆｉｇ３９Ａ及び３９Ｂ
は、ある個体からの細胞を用いた結果を示す。ＣＤ４+
Ｔ細胞（正方形）、ＣＤ４+ ＣＤ４５ＲＡ+ ナイーブ
（三角形）及びＣＤ４+ ＣＤ４５ＲＡ- メモリー（円
形）Ｔ細胞サブセットの、精製されたＥＬＡＭ−１（３
９Ａ）またはフィブロネクチン（３９Ｂ）の指示された
濃度に対する結合が評価された。休止のＴ細胞（塗り潰
した形（ｓｏｌｉｄ ｆｉｇｕｒｅｓ））と１０ｎｇ／
ｍｌのＴＰＡ（内部が空白の形（ｏｐｅｎｆｉｇｕｒｅ
ｓ））により３７℃で１５分間活性化されたＴ細胞の結
合性が評価された。コントロール蛋白質タイプＩＩＩコ
ラーゲンに対するＣＤ４+ Ｔ細胞の結合は、＜６％であ
り、示されたデータから差し引かれなかった。データ
は、３重のウエルからの平均の細胞結合率として表され
る。
４+ Ｔ細胞ではなく精製されたメモリーＣＤ４+ Ｔ細胞
が活性化依存性の態様で精製されたＥＬＡＭ−１に付着
することを示すグラフである。Ｆｉｇ３９Ａ及び３９Ｂ
は、ある個体からの細胞を用いた結果を示す。ＣＤ４+
Ｔ細胞（正方形）、ＣＤ４+ ＣＤ４５ＲＡ+ ナイーブ
（三角形）及びＣＤ４+ ＣＤ４５ＲＡ- メモリー（円
形）Ｔ細胞サブセットの、精製されたＥＬＡＭ−１（３
９Ａ）またはフィブロネクチン（３９Ｂ）の指示された
濃度に対する結合が評価された。休止のＴ細胞（塗り潰
した形（ｓｏｌｉｄ ｆｉｇｕｒｅｓ））と１０ｎｇ／
ｍｌのＴＰＡ（内部が空白の形（ｏｐｅｎｆｉｇｕｒｅ
ｓ））により３７℃で１５分間活性化されたＴ細胞の結
合性が評価された。コントロール蛋白質タイプＩＩＩコ
ラーゲンに対するＣＤ４+ Ｔ細胞の結合は、＜６％であ
り、示されたデータから差し引かれなかった。データ
は、３重のウエルからの平均の細胞結合率として表され
る。
【図４６】Ｆｉｇ３９Ｃおよび３９Ｄは、ナイーブＣＤ
４+ Ｔ細胞ではなく精製されたメモリーＣＤ４+ Ｔ細胞
が活性化依存性の態様で精製されたＥＬＡＭ−１に付着
することを示すグラフである。このことは、これらの細
胞のフィブロネクチン（Ｆｉｇ３９Ｂ）及びＩＣＡＭ−
１（Ｆｉｇ３９Ｄ）に対する結合と比較される。Ｆｉｇ
３９Ｃ及び３９Ｄは、もう一つの個体からの細胞を用い
た結果を示す。ＣＤ４+ Ｔ細胞（正方形）、ＣＤ４+ Ｃ
Ｄ４５ＲＡ+ ナイーブ（三角形）及びＣＤ４+ ＣＤ４５
ＲＡ- メモリー（円形）Ｔ細胞サブセットの、精製され
たＥＬＡＭ−１（３９Ｃ）またはフィブロネクチン（３
９Ｄ）の指示された濃度に対する結合が評価された。休
止のＴ細胞（塗り潰した形（ｓｏｌｉｄ ｆｉｇｕｒｅ
ｓ））と１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（内部が空白の形（ｏ
ｐｅｎ ｆｉｇｕｒｅｓ））により３７℃で１５分間活
性化されたＴ細胞の結合性が評価された。コントロール
蛋白質タイプＩＩＩコラーゲンに対するＣＤ４+ Ｔ細胞
の結合は、＜６％であり、示されたデータから差し引か
れなかった。データは、３重のウエルからの平均の細胞
結合率として表される。
４+ Ｔ細胞ではなく精製されたメモリーＣＤ４+ Ｔ細胞
が活性化依存性の態様で精製されたＥＬＡＭ−１に付着
することを示すグラフである。このことは、これらの細
胞のフィブロネクチン（Ｆｉｇ３９Ｂ）及びＩＣＡＭ−
１（Ｆｉｇ３９Ｄ）に対する結合と比較される。Ｆｉｇ
３９Ｃ及び３９Ｄは、もう一つの個体からの細胞を用い
た結果を示す。ＣＤ４+ Ｔ細胞（正方形）、ＣＤ４+ Ｃ
Ｄ４５ＲＡ+ ナイーブ（三角形）及びＣＤ４+ ＣＤ４５
ＲＡ- メモリー（円形）Ｔ細胞サブセットの、精製され
たＥＬＡＭ−１（３９Ｃ）またはフィブロネクチン（３
９Ｄ）の指示された濃度に対する結合が評価された。休
止のＴ細胞（塗り潰した形（ｓｏｌｉｄ ｆｉｇｕｒｅ
ｓ））と１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（内部が空白の形（ｏ
ｐｅｎ ｆｉｇｕｒｅｓ））により３７℃で１５分間活
性化されたＴ細胞の結合性が評価された。コントロール
蛋白質タイプＩＩＩコラーゲンに対するＣＤ４+ Ｔ細胞
の結合は、＜６％であり、示されたデータから差し引か
れなかった。データは、３重のウエルからの平均の細胞
結合率として表される。
配列番号：１ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGCTCG AGTGAAGTCA TGATTGCTTC ACAGTTTCTC TC 42 配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGACGC GTAACTTAAA GGATGTAAGA AGGCTTTTGG TA 42 配列番号：３ 配列の長さ：２２２０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATG CCT GGG AAG ATG GTC GTG ATC CTT GGA GCC TCA AAT ATA CTT TGG 48 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 5 10 15 ATA ATG TTT GCA GCT TCT CAA GCT TTT AAA ATC GAG ACC ACC CCA GAA 96 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu 20 25 30 TCT AGA TAT CTT GCT CAG ATT GGT GAC TCC GTC TCA TTG ACT TGC AGC 144 Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser 35 40 45 ACC ACA GGC TGT GAG TCC CCA TTT TTC TCT TGG AGA ACC CAG ATA GAT 192 Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp 50 55 60 AGT CCA CTG AAT GGG AAG GTG ACG AAT GAG GGG ACC ACA TCT ACG CTG 240 Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu 65 70 75 80 ACA ATG AAT CCT GTT AGT TTT GGG AAC GAA CAC TCT TAC CTG TGC ACA 288 Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr 85 90 95 GCA ACT TGT GAA TCT AGG AAA TTG GAA AAA GGA ATC CAG GTG GAG ATC 336 Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile 100 105 110 TAC TCT TTT CCT AAG GAT CCA GAG ATT CAT TTG AGT GGC CCT CTG GAG 384 Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Len Ser Gly Pro Leu Glu 115 120 125 GCT GGG AAG CCG ATC ACA GTC AAG TGT TCA GTT GCT GAT GTA TAC CCA 432 Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro 130 135 140 TTT GAC AGG CTG GAG ATA GAC TTA CTG AAA GGA GAT CAT CTC ATG AAG 480 Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys 145 150 155 160 AGT CAG GAA TTT CTG GAG GAT GCA GAC AGG AAG TCC CTG GAA ACC AAG 528 Ser Gln Glu Phe Len Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys 165 170 175 AGT TTG GAA GTA ACC TTT ACT CCT GTC ATT GAG GAT ATT GGA AAA GTT 576 Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val 180 185 190 CTT GTT TGC CGA GCT AAA TTA CAC ATT GAT GAA ATG GAT TCT GTG CCC 624 Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro 195 200 205 ACA GTA AGG CAG GCT GTA AAA GAA TTG CAA GTC TAC ATA TCA CCC AAG 672 Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys 210 215 220 AAT ACA GTT ATT TCT GTG AAT CCA TCC ACA AAG CTG CAA GAA GGT GGC 720 Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly 225 230 235 240 TCT GTG ACC ATG ACC TGT TCC AGC GAG GGT CTA CCA GCT CCA GAG ATT 768 Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile 245 250 255 TTC TGG AGT AAG AAA TTA GAT AAT GGG AAT CTA CAG CAC CTT TCT GGA 816 Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly 260 265 270 AAT GCA ACT CTC ACC TTA ATT GCT ATG AGG ATG GAA GAT TCT GGA ATT 864 Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile 275 280 285 TAT GTG TGT GAA GGA GTT AAT TTG ATT GGG AAA AAC AGA AAA GAG GTG 912 Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val 290 295 300 GAA TTA ATT GTT CAA GAG AAA CCA TTT ACT GTT GAG ATC TCC CCT GGA 960 Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly 305 310 315 320 CCC CGG ATT GCT GCT CAG ATT GGA GAC TCA GTC ATG TTG ACA TGT AGT 1008 Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser 315 320 325 GTC ATG GGC TGT GAA TCC CCA TCT TTC TCC TGG AGA ACC CAG ATA GAC 1056 Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp 330 335 340 AGC CCT CTG AGC GGG AAG GTG AGG AGT GAG GGG ACC AAT TCC ACG CTG 1104 Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu 345 350 355 ACC CTG AGC CCT GTG AGT TTT GAG AAC GAA CAC TCT TAT CTG TGC ACA 1152 Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr 360 365 370 GTG ACT TGT GGA CAT AAG AAA CTG GAA AAG GGA ATC CAG GTG GAG CTC 1200 Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu 375 380 385 390 TAC TCA TTC CCT AGA GAT CCA GAA ATC GAG ATG AGT GGT GGC CTC GTG 1248 Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val 395 400 405 AAT GGG AGC TCT GTC ACT GTA AGC TGC AAG GTT CCT AGC GTG TAC CCC 1296 Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro 410 415 420 CTT GAC CGG CTG GAG ATT GAA TTA CTT AAG GGG GAG ACT ATT CTG GAG 1344 Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu 425 430 435 AAT ATA GAG TTT TTG GAG GAT ACG GAT ATG AAA TCT CTA GAG AAC AAA 1392 Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys 440 445 450 AGT TTG GAA ATG ACC TTC ATC CCT ACC ATT GAA GAT ACT GGA AAA CGT 1440 Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala 455 460 465 470 CTT GTT TGT CAG GCT AAG TTA CAT ATT GAT GAC ATG GAA TTC GAA CCC 1488 Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro 475 480 485 AAA CAA AGG CAG AGT ACG CAA ACA CTT TAT GTC AAT GTT GCC CCC AGA 1536 Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg 490 495 500 GAT ACA ACC GTC TTG GTC AGC CCT TCC TCC ATC CTG GAG GAA GGC AGT 1584 Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser 505 510 515 TCT GTG AAT ATG ACA TGC TTG AGC CAG GGC TTT CCT GCT CCG AAA ATC 1632 Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile 520 525 530 CTG TGG AGC AGG CAG CTC CCT AAC GGG GAG CTA CAG CCT CTT TCT GAG 1680 Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Lys Ser Glu 535 540 545 550 AAT GCA ACT CTC ACC TTA ATT TCT ACA AAA ATG GAA GAT TCT GGG GTT 1728 Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val 555 560 565 TAT TTA TGT GAA GGA ATT AAC CAG GCT GGA AGA AGC AGA AAG GAA GTG 1776 Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val 570 575 580 GAA TTA ATT ATC CAA GTT ACT CCA AAA GAC ATA AAA CTT ACA GCT TTT 1824 Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe 585 590 595 CCT TCT GAG AGT GTC AAA GAA GGA GAC ACT GTC ATC ATC TCT TGT ACA 1872 Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr 600 605 610 TGT GGA AAT GTT CCA GAA ACA TGG ATA ATC CTG AAG AAA AAA GCG GAG 1920 Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu 615 620 625 630 ACA GGA GAC ACA GTA CTA AAA TCT ATA GAT GGC GCC TAT ACC ATC CGA 1968 Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg 635 640 645 AAG GCC CAG TTG AAG GAT GCG GGA GTA TAT GAA TGT GAA TCT AAA AAC 2016 Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn 650 655 660 AAA GTT GGC TCA CAA TTA AGA AGT TTA ACA CTT GAT GTT CAA GGA AGA 2064 Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg 665 670 675 GAA AAC AAC AAA GAC TAT TTT TCT CCT GAG CTT CTC GTG CTC TAT TTT 2112 Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu Tyr Phe 680 685 690 GCA TCC TCC TTA ATA ATA CCT GCC ATT GGA ATG ATA ATT TAC TTT GCA 2160 Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr Phe Ala 695 700 705 710 AGA AAA GCC AAC ATG AAG GGG TCA TAT AGT CTT GTA GAA GCA CAG AAA 2208 Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala Gln Lys 715 720 725 TCA AAA GTG TAG 2220 Ser Lys Val - 729
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２３】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２９】
【図３２】
【図２０】
【図２２】
【図２７】
【図３１】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２８】
【図３０】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図４０】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨージ シミズ アメリカ合衆国 48109 ミシガン アン アーバー ユニバーシティ オブ ミシ ガン オブ マイクロバイオロジー アン ド イムノロジー内 (72)発明者 ジェイ． ステファン ショウ アメリカ合衆国 20817 メリーランド グレンウッド ロード ベテスダ 5708
Claims (22)
- 【請求項１】免疫細胞、内皮細胞またはこの両細胞に、
（ａ）ＥＬＡＭ細胞に特異的に結合する抗体またはその
結合部位含有断片、及び（ｂ）ＶＣＡＭ、ＥＬＡＭ、Ｉ
ＣＡＭ、ＶＣＡＭリガンド、ＥＬＡＭリガンド及びＩＣ
ＡＭリガンドからなる群から選ばれた分子に特異的に結
合する抗体またはその結合部位含有断片を結合させるこ
とからなる免疫応答調節方法。 - 【請求項２】前記免疫細胞が、Ｔ細胞、顆粒球または単
球である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記免疫細胞が、Ｔ細胞である請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】前記Ｔ細胞が、ＣＤ４+ 細胞である請求項
３に記載の方法。 - 【請求項５】前記ＣＤ４+ 細胞が、メモリー細胞である
請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】前記抗体（ａ）の結合部位含有断片または
少なくとも１種の前記抗体（ｂ）の１種、及び少なくと
も１種の前記抗体（ｂ）の結合部位含有断片が２重特異
性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体からなる請求項１に記
載の方法。 - 【請求項７】少なくとも１種の前記抗体（ｂ）、または
その結合部位含有断片が、前記ＶＣＡＭ分子に特異的に
結合する請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】少なくとも１種の前記抗体（ｂ）、または
その結合部位含有断片の第２成分が、ＩＣＡＭ分子に特
異的に結合する請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】前記抗体、またはその結合部位含有断片
が、同一の分子に特異的に結合しない請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１０】前記抗体、またはその結合部位含有断片
が、内皮細胞分子に特異的に結合し且つもう一つの抗
体、またはその結合部位含有断片が、該内皮細胞分子の
リガンドである免疫細胞分子に特異的に結合する請求項
９に記載の方法。 - 【請求項１１】抗体７Ａ９またはその結合部位含有断
片、或いは抗体２Ｇ７またはその結合部位含有断片から
なる請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】さらに抗体、またはその結合部位含有断
片が、ＶＣＡＭリガンド分子に特異的に結合し、或いは
抗体、またはその結合部位含有断片が、ＥＬＡＭリガン
ド分子に特異的に結合する請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】（Ａ）ＥＬＡＭ分子に特異的に結合する
抗体、またはその結合部位含有断片、或いは該抗体また
は断片の薬学的に許容される塩； （Ｂ）ＶＣＡＭ、ＥＬＡＭ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭリガン
ド、ＥＬＡＭリガンド及びＩＣＡＭリガンドからなる群
から選ばれた分子に特異的に結合する少なくとも１種の
抗体、またはその結合部位含有断片、或いは該抗体また
は断片の薬学的に許容される塩；及び （Ｃ）薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、
からなる免疫細胞及び内皮細胞に関連する薬剤。 - 【請求項１４】前記抗体（ａ）の結合部位含有断片また
は少なくとも１種の抗体（ｂ）の１種、及び少なくとも
１種の抗体（ｂ）の結合部位含有断片が、二重特異性抗
体からなる請求項１３に記載の薬剤。 - 【請求項１５】抗体、またはその結合部位含有断片が、
Ｔ細胞表面の分子に特異的に結合する請求項１３に記載
の薬剤。 - 【請求項１６】抗体、またはその結合部位含有断片が、
顆粒球表面の分子に特異的に結合する請求項１３に記載
の薬剤。 - 【請求項１７】前記少なくとも１種の抗体（ｂ）の１
種、またはその結合部位含有断片が、ＶＣＡＭ分子に特
異的に結合する請求項１３に記載の薬剤。 - 【請求項１８】前記少なくとも１種の抗体（ｂ）または
その結合部位含有断片の補助剤が、前記ＩＣＡＭ分子に
特異的に結合する請求項１７に記載の薬剤。 - 【請求項１９】前記抗体、またはその結合部位含有断片
が、同一の分子に特異的に結合しない請求項１３に記載
の薬剤。 - 【請求項２０】前記抗体、またはその結合部位含有断片
の１種が、内皮細胞分子に特異的に結合し且つもう一種
の前記抗体、またはその結合部位含有断片が、該内皮細
胞分子のリガンドである免疫細胞分子に特異的に結合す
る請求項１９に記載の薬剤。 - 【請求項２１】抗体７Ａ９またはその結合部位含有断
片、或いは抗体２Ｇ７またはその結合部位含有断片から
なる請求項１３に記載の薬剤。 - 【請求項２２】さらに抗体、またはその結合部位含有断
片が、ＶＣＡＭリガンド分子に特異的に結合し、或いは
抗体、またはその結合部位含有断片が、ＥＬＡＭリガン
ド分子に特異的に結合する請求項２１に記載の薬剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66104791A | 1991-02-26 | 1991-02-26 | |
| US07661047 | 1991-02-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0753407A true JPH0753407A (ja) | 1995-02-28 |
Family
ID=24651996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4039844A Pending JPH0753407A (ja) | 1991-02-26 | 1992-02-26 | 免疫応答の制御方法並びに免疫細胞および内皮細胞に関連する薬剤 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0505749A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0753407A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100523128B1 (ko) * | 2001-09-26 | 2005-10-19 | 주식회사 한국프라시스 | 표면에 나무질감의 무늬가 형성되는 프로파일을 제조하기위한 장치 |
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|---|---|---|---|---|
| US5827670A (en) * | 1990-08-02 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods of isolating and detecting bone marrow stromal cells with VCAM-1-specific antibodies |
| US7449186B1 (en) | 1990-08-02 | 2008-11-11 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods of blocking the interaction between stromal cells and hemopoietic cells with anti-VCAM-1 antibodies |
| US5610148A (en) * | 1991-01-18 | 1997-03-11 | University College London | Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment |
| US5629287A (en) * | 1991-01-18 | 1997-05-13 | University College London | Depot formulations |
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| US5643873A (en) * | 1992-05-06 | 1997-07-01 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind selectins including endothelial leukocyte adhesion molecule 1 |
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| IL294921A (en) | 2020-01-24 | 2022-09-01 | Pfizer | Antibodies against E-selectin, preparations and methods of use |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
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-
1992
- 1992-02-25 EP EP19920103152 patent/EP0505749A3/en not_active Withdrawn
- 1992-02-26 JP JP4039844A patent/JPH0753407A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100523128B1 (ko) * | 2001-09-26 | 2005-10-19 | 주식회사 한국프라시스 | 표면에 나무질감의 무늬가 형성되는 프로파일을 제조하기위한 장치 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0505749A2 (en) | 1992-09-30 |
| EP0505749A3 (en) | 1993-06-23 |
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