PL187013B1 - Podjednostka alfa ludzkiej integryny beta 2 - Google Patents

Podjednostka alfa ludzkiej integryny beta 2

Info

Publication number
PL187013B1
PL187013B1 PL97323195A PL32319597A PL187013B1 PL 187013 B1 PL187013 B1 PL 187013B1 PL 97323195 A PL97323195 A PL 97323195A PL 32319597 A PL32319597 A PL 32319597A PL 187013 B1 PL187013 B1 PL 187013B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
seq
human
protein
binding
Prior art date
Application number
PL97323195A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323195A1 (en
Inventor
Michael W. Gallatin
Der Vieren Monica Van
Original Assignee
Icos Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icos Corp filed Critical Icos Corp
Publication of PL323195A1 publication Critical patent/PL323195A1/xx
Publication of PL187013B1 publication Critical patent/PL187013B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70553—Integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Abstract

1. Hybrydoma oznaczona 199 M (numer porzadkowy nadany przez ATCC: HB-12058). 2. Monoklonalne przeciwcialo wydzielane przez hybrydoma wedlug zastrz. 1. PL PL PL

Description

Zgłoszenie to jest kontynuacją w części zgłoszenia USA nr 08/362,652, zgłoszonego 21 grudnia 1994, rozpatrywanego, które jest kontynuacją w części zgłoszenia USA nr 08/286,889, zgłoszonego 5 sierpnia 1994, na które udzielono patentu USA nr 5,470,953 28 listopada 1995, który jest z kolei kontynuacją w części zgłoszenia USA nr 08/173,497, zgłoszonego 23 grudnia 1993, na które udzielono patentu USA nr 5,437,958 1 sierpnia 1995.
Niniejszy wynalazek dotyczy klonowania i ekspresji polinukłeotydów kodujących nową podjednostkę a ludzkiej integryny β2, oznaczonej jako α, która jest pokrewna strukturalnie ze znanymi podjednostkami α ludzkiej integryny β2, CD11a, CD11b i CD1 1c. Niniejszy wynalazek dotyczy również polinukleotydów izolowanych z innych gatunków, które wykazują homologię z sekwencjami kodującymi ludzką adIntegryny stanowią klasę cząsteczek związanych z błoną, które uczestniczą czynnie w adhezji komórkowej. Integryny są śródblonowymi heterodimerami obejmującymi podjednostkę α w niekowalencyjnym połączeniu z podjednostką β. Do tej pory, zidentyfikowano co najmniej czternaście podjednostek α i osiem podjednostek β (opisane w Springer, Nature 346:425-434 (1990)). Podjednostki β są zdolne generalnie do wiązania się z więcej niż jedną podjednostką α, zaś heterodimery o wspólnej podjednostce β sklasyfikowano jako podrodziny populacji integryn.
Jedna klasa ludzkich integryn, której ekspresja ograniczona jest do komórek krwi, charakteryzuje się wspólną podjednostką β2. W wyniku tej ekspresji komórkowo-swoistej, integryny te określane są jako integryny leukocytame, Leu-CAM albo leukointegryny. Z powodu wspólnej podjednostki β2, innym określeniem tej klasy jest określenie integryny β2. Podjednostką β2 (CD 18) została uprzednio wyizolowana w połączeniu z jedną z trzech osobnych podjednostek a, CD11a, CD11b iCD11c. Izolacja cDNA kodującego ludzką CD 18 opisana została wKishimoto i in., Celi 48:681-690 (1987). W oficjalnej nomenklaturze WHO, białka heterodimeryczne określane są jako CD11a/CD18, CD11b/CD18 iCD11c/CD18; wnomenklaturze powszechnej określane są, odpowiednio, jako LFA-1, Mac-1 albo Mol i pl 50,95 albo LeuM5 (Cobbold i in., Leukocyte typing III, wyd. McMichael, Oxford Press, str. 788 (1987)). Podjednostki α ludzkiej integryny β2 CD1la, CD11b iCD11c migrują w elektroforezie w warunkach nie redukujących z ciężarem cząsteczkowym odpowiednio, 180 kDa, 115 kDa i 150 kDa, jak również sklonowano DNA kodujące te podjednostki (CD11a, Larson i in., J. Cell Biol., 108:703-712 (1989); CD11b, Corbi i in., J. Biol. Chem., 263:12403-12411 (1988) i CD11c, Corbi i in., EMBO J., 6:4023-4028 (1987)). Domniemane homologi łańcuchów α i β ludzkiej integryny β2, określone na podstawie podobieństwa ciężaru cząsteczkowego, zidentyfikowano uprzednio u innych gatunków w tym małp i innych naczelnych (Letvin i in., Blood 61:408-410 (1983)), myszy (Sanchez-Madlrid i in., J. Exp. Med., 15-4:1517 (1981)) i psów (Moore i in., Tissue Antigens 36:211-220 (1990)).
Wykazano, że całkowite ciężary cząsteczkowe domniemanych homologów innych gatunków różnią się znacznie (patrz, np. Danilenko i in., Tissue Antigens 40:13-21 (1992)), zaś z powodu braku informacji o sekwencji, była niemożliwa definitywna korelacja pomiędzy podjednostkami ludzkich integryn i zidentyfikowanymi u innych gatunków. Ponadto, obserwowano różnice w liczbie członków rodziny białek pomiędzy różnymi gatunkami. Przykładowo, stwierdzono że u królików występuje więcej izotypów IgA niż u ludzi (Burnett i in.,
187 013
EMBO J 8:4041-4047 (1989) i Schneiderman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7561-7565 (1989)). Podobnie, u ludzi zidentyfikowano przynajmniej sześć odmian białka metalotioneiny (Karin i Richards, Naturę 299:797-802 (1982) i Varshney i in., Mol. Cell. Biol., 6:26-37 (1986)), podczas gdy u myszy stwierdzono tylko dwie takie odmiany (Searle i in., Mol. Cell. Biol., 4:1221-1230 (1984)). Stąd, istnienie licznych członków rodziny białek u jednego gatunku niekoniecznie oznacza, że istnieją odpowiadający członkowie rodziny białek u innego gatunku.
W kontekście integryn β2, u psów zaobserwowano, że psi odpowiednik β2 ludzkiej CD18 jest zdolny do tworzenia dimerów, z nawet czterema potencjalnie różnymi podjednostkami a (Danilenko i in., wyżej). Przeciwciała wytworzone przez immunizacje myszy psimi splenocytami spowodowały powstanie przeciwciał monoklonalnych, które immunoprecypitowały białka określone jako psie homologi ludzkiej CD18, CDI la, CDI lb i CDI lc w oparciu o podobnym, choć nie identycznym ciężarze cząsteczkowym. Inne przeciwciało przeciwko psim splenocytom, Cal 1.8H2, rozpoznaje i precypituje czwartą podjednostkę przypominającą a, również zdolną do wiązania się z podjednostką β2, ale posiadające unikalny ciężar cząsteczkowy i ekspresję ograniczoną do podtypu zróżnicowanych makrofagów tkankowych.
Przeciwciała wytworzone przez immunizację chomików mysimi komórkami dendrytycznymi spowodowały powstanie dwóch przeciwciał przeciwko integrynom (Metlay i in., J. Exp. Med., 171:1753-1771 (1990)). Jedno z przeciwciał, 2E6 immunoprecypitowało główny heterodimer z podjednostkami o ciężarach cząsteczkowych około 180 kDa i 90 kDa oprócz mniejszych prążków w zakresie 150-160 kDa. Drugie przeciwciało, N418 precypitowało inny heterodimer z podjednostkami o ciężarach 150 kDa i 90 kDa. W oparciu o badania nad blokowaniem adhezji, podejrzewa się, że przeciwciało 2E6 rozpoznaje mysi odpowiednik ludzkiej CD 18. O ile ciężar cząsteczkowy antygenu N418 sugerował rozpoznawanie mysiego homologa ludzkiej CDI lc/CD18, dalsza analiza wykazała, że ten mysi antygen wykazywał wzorzec rozmieszczenia tkankowego, który różnił się od wzorca ludzkiej CDI lc/CD18.
Antygeny rozpoznawane przez psie przeciwciało Call.8H2 oraz mysie przeciwciało N418 mogą stanowić odmienny gatunek (np. odmianę glikozylacji albo składania) uprzednio zidentyfikowanych psich albo mysich podjednostek a. Alternatywnie, antygeny te mogą stanowić unikalne psie i mysie podjednostki a integryny. Pod nieobecność konkretnych informacji dotyczących struktury pierwszorzędowej nie można wykluczyć tych możliwości.
U ludzi, CDlla/CD18 ulega ekspresji we wszystkich leukocytach. CDllb/CD18i CDI lc/CD18 są zasadniczo ograniczone do ekspresji na monocytach, granulocytach, makrofagach i naturalnych limfocytach cytotoksycznych (NK), ale CDllc/CD18 stwierdzono również na niektórych rodzajach limfocytów B. Ogólnie, CDI la/CD18 dominuje na limfocytach, CDllb/CD18 na granulocytach zaś CDllc/CD18 na makrofagach (patrz, Amaout, Blood 75:1037-1050 (1990)). Jednakże, ekspresja łańcuchów a jest zmienna w zależności od stanu pobudzenia i różnicowania poszczególnych rodzajów komórek (patrz, Larson i Springer, Immunol. Rev., 114:181-217 (1990)).
Udział integryn β2 w ludzkiej odpowiedzi odpornościowej i zapalnej wykazano przy użyciu przeciwciał monoklonalnych zdolnych do blokowania adhezji komórkowej zależnej od integryny β2. Przykładowo, CDlla/CD18, CDllb/CD18 iCDllc/CD18 uczestniczą czynnie w wiązaniu się naturalnych limfocytów cytotoksycznych (NK) z komórkami chłoniaka i gruczolakoraka (Pattaroyo i in., Immunol. Rev., 114:67-108 (1990)), gromadzeniu się granulocytów (Nourshargh i in., J. Immunol., 142:3193-3198 (1989)), wycieku osocza niezależnym od granulocytów (Arfors i in., Blood 69:338-340 (1987)), odpowiedzi chemotaktycznej pobudzonych leukocytów (Arfors i in., wyżej) i przyleganiu leukocytów do śródbłonka naczyń (Price i in., J. Immunol., 139:4174-4177 (1987) i Smith i in., J. Clin. Invest., 83:2008-2017 (1989)). Fundamentalna rola integryny β2 w odpowiedzi odpornościowej i zapalnej widoczna jest w zespole klinicznym określanym jako niedobór adhezji leukocytów (LAD), w którym objawy kliniczne obejmują nawracające i często zagrażające życiu zakażenia bakteryjne. Lad spowodowany jest mutacją w podjednostce (¼ (Kishimoto i in., Cell 50:193-202 (1987)) zaś ciężkość choroby zależy od stopnia niedoboru ekspresji podjednostki β2. Tworzenie komplet4
187 013 nej cząsteczki heterodimeru integryny zaburzone jest przez mutację β2 (Kishimoto i in., wyżej).
Co ciekawe, przynajmniej jedno przeciwciało swoiste wobec CD 18 hamuje tworzenie syncytiów przez wirusa ludzkiego niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) in vitro, jakkolwiek bezpośredni mechanizm tego zahamowania nie jest jasny (Hildreth i Orentas, Science 244:1075-1078 (1989)). Obserwacja ta jest zgodna z odkryciem, że główny ligand CD11a/CD18, ICAM-1, jest również receptorem powierzchniowym dla dużej grupy serotypów rhinowirusów (Greve i in., Cell 56:839 (1989)).
Znaczenie aktywności wiązania integryny β2 w ludzkiej odpowiedzi odpornościowej i zapalnej podkreśla konieczność zrozumienia tej klasy białek powierzchniowych. Identyfikacja jeszcze nie znanych członków tej rodziny, jak również ich ligandów, oraz wytworzenie przeciwciał monoklonalnych albo innych czynników rozpuszczalnych, które mogą zmieniać aktywność biologiczną integryny β2, może dostarczyć praktycznych sposobów interwencji terapeutycznej w odpowiedzi odpornościowej i zapalnej zależnej od integryny β2.
W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza nowych oczyszczonych i izolowanych polinukleotydów (np. DNA i transkryptów RNA, zarówno nici sensownych jak i antysensownych, kodujących nowe podjednostki a ludzkiej integryny β2, aj, i ich odmian (analogów delecyjnych, addycyjnych i substytucyjnych), które wykazują właściwości wiązania i/lub immunologiczne właściwe dla ad. Korzystne cząsteczki DNA według wynalazku obejmują cząsteczki cDNA, genomowego DNA i częściowo lub całkowicie syntetycznego DNA. Niniejszy korzystny polinukleotyd jest DNA jak to pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 1, kodującym polipeptyd o Identyfikatorze Sekw. Nr 2. Dostarczone są również konstrukty rekombinowane plazmidowego albo wirusowego DNA (konstrukty ekspresyjne), które obejmują sekwencje kodujące ad, w których sekwencja kodująca ad jest połączona funkcjonalnie z homologicznymi albo heterologicznymi elementami regulatorowymi transkrypcji.
Dostarczone są również przez niniejszy wynalazek izolowane i oczyszczone mysie i szczurze polinukleotydy, które wykazują homologię z polinukleotydami kodującymi ludzką ad. Korzystny mysi polinukleotyd pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 52, zaś korzystny szczurzy polinukleotyd pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 54.
Jako inny aspekt niniejszego wynalazku dostarczone są komórki prokariotyczne i eukariotyczne transformowane albo traisfekowane sekwencjami DNA według wynalazku, które ekspresjonują polipeptyd adalbo jego odmiany. Komórki gospodarza według wynalazku są szczególnie przydatne do wytwarzania polipeptydu ad na wielką skalę, który może być następnie izolowany z samej komórki gospodarza albo z pożywki w której hodowana jest komórka gospodarza. Komórki gospodarza, które ekspresjonują polipeptyd oi na powierzchni zewnętrznej błony komórkowej są również przydatne jako immunogen w wytwarzaniu przeciwciał przeciwko aj. Korzystnie, komórki gospodarza transfekowane ad mogą być równocześnie transfekowane w celu ekspresjonowania podjednostki integryny β2 w celu ekspresji na. powierzchni jako heterodimer.
Dostarczone są również według niniejszego wynalazku oczyszczone i izolowane polipeptydy aj, ich fragmenty i odmiany. Korzystne polipeptydy aj podane są jako Identyfikator Sekw. Nr 2. Nowe produkty ad według wynalazku mogą być uzyskane przez izolowanie ze źródeł naturalnych, ale korzystnie są, wraz z innymi odmianami aj, wytwarzane rekombinacyjnie w procedurach obejmujących komórki gospodarza według wynalazku. Całkowicie glikozylowane, częściowo glikozylowane albo całkowicie deglikozylowane postaci polipeptydu aj mogą być wytworzone przez zmienianie komórki gospodarza wybranej do rekombinacyjnego wytwarzania i/lub obróbki po izolacji. Odmiany polipeptydów aj według wynalazku mogą obejmować polipeptydy aj rozpuszczalne albo nierozpuszczalne w wodzie, obejmujące analogi w których jeden albo więcej aminokwasów usunięto albo zastąpiono: (1) bez utraty, zaś korzystnie ze wzmocnieniem jednej lub wielu aktywności biologicznych albo charakterystyki immunologicznej swoistej dla aj; albo (2) ze swoistym wyłączeniem konkretnych funkcji wiązania albo sygnalizowania ligand/receptor. Dostarczone są również polipeptydy fuzyjne, w których sekwencje aminokwasowe aj ekspresjonowane są wraz z sekwencjami aminokwasowymi innych polipeptydów. Takie polipeptydy fuzyjne mogą posiadać zmodyfikowane
187 013 właściwości biologiczne, biochemiczne i/lub immunologiczne w porównaniu z aj typu dzikiego. Uwzględnione są również analogi polipeptydów obejmujące dodatkowe aminokwasy (np. lizynę albo cysteinę), co ułatwia tworzenie multimerów.
Objęte niniejszym wynalazkiem są również polipeptydy i inne cząsteczki niepeptydowe, które swoiście wiążą się z aj. Korzystne cząsteczki wiążące obejmują przeciwciała (np. przeciwciała monoklonalne i poliklonalne), odpowiednie receptory (np. związane z błoną albo w postaci rozpuszczalnej) i inne ligandy (np. cząsteczki występujące naturalnie albo syntetyczne), włącznie z wiążącymi aj kompetycyjnie w obecności przeciwciał przeciwko aa i/lub swoistych odpowiednich receptorów. Cząsteczki wiążące są przydatne do oczyszczania polipeptydów aa oraz identyfikacji rodzajów komórek, które ekspresjonują aa- Cząsteczki wiążące są również przydatne do modulowania (tj. hamowania, blokowania albo pobudzania) aktywności wiązania i/lub przewodzenia sygnału ad in vivo.
Dostarczone są również testy do identyfikacji cząsteczek wiążących aa, w tym testy wiązania unieruchomionego ligandu, testy wiązania w roztworze, zbliżeniowe testy scyntylacyjne, testy przesiewania dihybrydowego itp.
Testy in vitro do identyfikacji przeciwciał albo innych związków które modulują aktywność Od mogą obejmować, przykładowo, unieruchamianie ad albo naturalnego liganda, który wiąże Od, znakowanie umożliwiające wykrycie nie unieruchomionego partnera wiązania, inkubowanie partnerów wiązania ze sobą i określania wpływu badanego związku na ilość związanego znacznika, gdzie zmniejszenie ilości związanego znacznika w obecności badanego związku w porównaniu z ilością znacznika związanego pod nieobecność badanego związku wskazuje, że badany czynnik jest inhibitorem wiązania Od.
Innym rodzajem testu do identyfikacji związków, które modulują oddziaływanie pomiędzy ad i ligandem obejmuje unieruchomienie ad albo jego fragmentu na podłożu stałym opłaszczonym (ałbo impregnowanym) znacznikiem fluorescencyjnym, znakowanie liganda związkiem zdolnym do wzbudzania czynnika fluorescencyjnego, doprowadzenie do kontaktu unieruchomionego ad ze znakowanym ligandem w obecności i pod nieobecność domniemanego związku regulatorowego, wykrywanie emisji światła przez czynnik fluorescencyjny i identyfikację związków modulujących na podstawie ich wpływu na emisję światła przez czynnik fluorescencyjny w porównaniu z emisją światła przez czynnik fluorescencyjny pod nieobecność związku modulującego. Alternatywnie, ligand ad może być unieruchomiony zaś ad może być znakowany.
Jeszcze inny sposób uwzględniany przez wynalazek do identyfikacji związków, które modulują oddziaływanie pomiędzy ad i ligandem obejmuje transformowanie albo transfekowanie odpowiedniej komórki gospodarza konstruktem DNA obejmującym gen reporterowy pod kontrolą promotora regulowanego czynnikiem transkrypcyjnym, posiadającym domenę wiążącą DNA i domenę aktywującą, ekspresjonowanie w komórce gospodarza pierwszej sekwencji hybrydowego DNA kodującej pierwszą fuzję części albo całości ad i albo domeny wiążącej DNA albo domeny aktywującej czynnik transkrypcyjny, ekspresjonowanie w komórkach gospodarza drugiej sekwencji hybrydowego DNA kodującego część albo całość ligandu i domenę wiążącą DNA albo domenę aktywującą czynnika transkrypcyjnego, której nie włączono do pierwszej fuzji, badanie wpływu potencjalnego związku modulującego na oddziaływanie pomiędzy ad i ligandem przez wykrywanie wiązania ligandu i ad w konkretnej komórce gospodarza przez pomiar wytwarzania produktu genu reporterowego w komórce gospodarza w obecności i pod nieobecność domniemanego modulatora, i identyfikowanie związków modulujących jako związków zmieniających wytwarzanie produktu genu reporterowego pod nieobecność związków modulujących. Korzystne do zastosowania w teście są: promotor lexA, domena wiążącą DNA lexA, domena transaktywująca GAL4, gen reporterowy lacZ i komórka gospodarza drożdży.
Zmodyfikowana wersja wyżej opisanego testu może być zastosowana do izolowania polinukleotydu kodującego białko wiążące ad przez transformowanie albo transfekowanie odpowiedniej komórki gospodarza konstruktem DNA obejmującym gen reporterowy pod kontrolą promotora regulowanego czynnikiem transkrypcyjnym posiadającym domenę wiążącą DNA i domenę aktywującą, ekspresjonowanie w komórce gospodarza pierwszej sekwencji
187 013 hybrydowego DNA kodującej pierwszą fuzję części albo całości ad i albo domeny wiążącej DNA albo domeny aktywującej czynnik transkrypcyjny, ekspresjonowanie w komórkach gospodarza drugiej sekwencji hybrydowego DNA kodującego część albo całość ligandu i domenę wiążącą DNA albo domenę aktywującą czynnika transkrypcyjnego, której nie włączono do pierwszej fuzji, wykrywanie wiązania białka wiążącego <αα z aa w konkretnej komórce gospodarza przez pomiar wytwarzania produktu genu reporterowego w komórce gospodarza i izolowania drugiej sekwencji hybrydowego DNA kodującej białko wiążące αd z konkretnej komórki gospodarza.
Linie komórek hybrydoma, które wytwarzają przeciwciała swoiste wobec αd są również objęte wynalazkiem. Techniki wytwarzania hybrydom, które wydzielają przeciwciała monoklonalne są dobrze znane w stanie techniki. Linie komórek hybrydoma mogą być wytworzone przez immunizowanie zwierzęcia oczyszczonym αd, wariantami αd albo komórkami, które ekspresjonują αd albo jego wariant na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Rodzaje komórek będących immunogenem obejmują komórki, które ekspresjonują αd in vivo, albo linie transformowanych komórek prokariotycznych albo eukariotycznych, które normalnie nie wytwarzają αd in vivo. Korzystne przeciwciała według wynalazku wydzielane są przez hybrydomy oznaczone 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2,197A-3, 197A-4,199A, 199H i 199M.
Wartość informacji dostarczonej w ujawnieniu sekwencji DNA i aminokwasowej αdjest wielka. W jednym zestawie przykładów ujawnione sekwencje cDNA αd umożliwiają izolowanie sekwencji genomowego DNA ludzkiego αd, w tym elementów regulujących transkrypcję sekwencji genomowych. Identyfikacja odmian allelicznych αd i DNA gatunków heterologicznych (np. szczura albo myszy) jest również uwzględniona. Izolowanie genomowego DNA ludzkiego αd i DNA innych gatunków może być osiągnięte standardowymi technikami hybrydyzacji DNA/DNA, w odpowiednich warunkach surowości, stosując wszystkie albo część sekwencji cDNA αd jako sondę do przesiewania odpowiedniej biblioteki. Alternatywnie, można zastosować reakcję łańcuchowej polimerazy z użyciem odpowiednich starterów oligonukleotydowych, które zostały zaprojektowane w oparciu q znaną sekwencję cDNA, do amplifikacji i identyfikacji sekwencji genomowego DNA αd. Syntetyczne DNA kodujące polipeptyd αd, w tym jego fragmenty i inne odmiany, mogą być wytworzone konwencjonalnymi metodami syntezy.
Informacja o sekwencji DNA według wynalazku umożliwia również opracowanie, drogą rekombinacji homologicznej albo strategią „knock-out” (patrz, np. Kapecchi, Science 244:1288-1292 (1989)), gryzoni, które nie ekspresjonują czynnego polipeptydu αd albo ekspresjonują odmianę polipeptydu αd. Gryzonie takie są przydatne jako modele do badania aktywności αd i modulatorów ad in vivo.
Sekwencje DNA i aminokwasowe według wynalazku umożliwiają również analizę epitopów ad, które uczestniczą w wiązaniu receptorów jak również epitopów, które mogą raczej regulować niż bezpośrednio uczestniczyć w przekazywaniu sygnału przez błonę komórkową są również objęte wynalazkiem.
DNA według wynalazku jest również przydatny do wykrywania rodzaj ów komórek, które ekspresjonują polipeptyd αd. Standardowe techniki hybrydyzacji DNA/RNA, które wykorzystują DNA ad do wykrywania RNA ad mogą być zastosowane w celu określania konstytutywnych poziomów transkrypcji αd w komórce, jak również zmian w poziomie transkrypcji w odpowiedzi na czynniki wewnętrzne albo zewnętrzne. Identyfikacja czynników, które modyfikują transkrypcję i/lub translację ad może z kolei być oceniona co do przydatności w zastosowaniach terapeutycznych albo profilaktycznych. DNA według wynalazku umożliwia również hybrydyzację in situ DNA αd z komórkowym RNA w celu określenia lokalizacji komórkowej sygnału αd w złożonych populacjach komórek i tkankach.
DNA według wynalazku jest również przydatny do identyfikacji sekwencji polinukleotydowych nie pochodzących od człowieka, które wykazują homologię z sekwencjami ludzkimi αd. Posiadanie sekwencji DNA αd nie pochodzących od człowieka umożliwia opracowanie modeli zwierzęcych (w tym, przykładowo, modeli transgenicznych) układu ludzkiego.
187 013
Jako inny aspekt wynalazku, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne swoiste wobec ad mogą być zastosowane w analizie immunohistochemicznej do lokalizacji ad w przedziale subkomórkowym albo do lokalizacji poszczególnych komórek w tkankach. Analizy immunohistochemiczne tego typu są szczególnie przydatne gdy są stosowane wraz z hybrydyzacją in situ w celu lokalizacji mRNA ad i produktów polipeptydowych genu ad.
Identyfikacja rodzajów komórek, które ekspresjonują ad może mieć znaczenie do opracowania czynników profilaktycznych albo terapeutycznych. Oczekuje się, że produkty według wynalazku pokrewne z ad mogą być zastosowane w leczeniu chorób, w których makrofągi są istotnym elementem procesu chorobowego. Modele zwierzęce wielu stanów patologicznych związanych z aktywnością makrofagów zostały opisane wstanie techniki. Przykładowo, u myszy opisano rekrutację makrofagów do miejsc przewlekłego albo ostrego stanu zapalnego (Jutila i in., J. Leukocyte Biol., 54:30-39 (1993)). U szczurów Adams i in., (Transplantation 53:1115-1119 (1992); Transplantation 56:794-799 (1993)) opisują model miażdżycy przeszczepu po heterotopowym przeszczepie allogenicznym. Rosenfeld i in., (Arteriosclerosis 7: 9-23 (1987); Arteriosclerosis 7:24-34 (1987)) opisują indukowaną miażdżycę u królików żywionych dietą z dodatkiem cholesterolu. Hanenberg i in., (Diabetologia 32:126-134 (1989)) opisują spontaniczny rozwój cukrzycy insulinozależnej u szczurów BB. Yamada i in., (Gastroenterology 104:759-771 (1993)) opisują wywołaną chorobę zapalną jelita grubego, przewlekłe ziarninowe zapalenie okrężnicy u szczurów po wstrzyknięciu polimerów peptydoglikanów-polisacharydów paciorkowców. Cromartie i in., (J. Exp. Med., 146:1585-1602 (1977)) i Schwab i in., (Infection and Immunity 59:4436-4442 (1991)) donoszą, że wstrzyknięcie białek ściany komórkowej paciorkowców szczurom powoduje stan zapalenia stawów charakteryzujący się zapaleniem stawów obwodowych i postępującym zniszczeniem stawów. Na koniec, Huitinga i in., (Eur. J. Immunol., 23:709-715 (1993)) opisują doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, model stwardnienia rozsianego u szczurów Lewis. W każdym z tych modeli, przeciwciała ad, inne białka wiążące ad albo postaci rozpuszczalne ad są wykorzystywane do łagodzenia stanu chorobowego, prawdopodobnie przez inaktywację aktywności makrofagów.
W wynalazku dostarczone są kompozycje farmaceutyczne do leczenia tych i innych chorób. Kompozycje farmaceutyczne przeznaczone są do hamowania oddziaływania pomiędzy ad i jego ligandem i obejmują różne rozpuszczalne i związane z błoną postaci ad (obejmujące cały polipeptyd ad albo jego fragmenty, które aktywnie uczestniczą w wiązaniu ad), rozpuszczalne i związane z błoną postaci białek wiążących ad (przeciwciała, ligandy itp.), wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe modulatory aktywności wiązania ad, i/lub modulatory ekspresji ad i/lub peptydu liganda ad, w tym modulatorów transkrypcji, translacji, obróbki potranslacyjnej i/lub transportu wewnątrzkomórkowego.
Wynalazek obejmuje również sposoby leczenia chorób w których przyczyną jest wiązanie ad albo zlokalizowane gromadzenie komórek, które ekspresjonują ad, w których pacjentowi cierpiącemu na wspomnianą chorobę podaje się pewną ilość kompozycji farmaceutycznej według wynalazku wystarczającą do modulowania poziomów wiązania ad albo do modulowania gromadzenia rodzajów komórek które ekspresjonują ad. Sposób leczenia według wynalazku jest możliwy do stosowania w chorobach takich jak, choć nie ograniczonych do cukrzycy typu I, miażdżycy, stwardnienia rozsianego, astmy, łuszczycy, zapalenia płuc, ostrego zespołu niewydolności oddechowej i reumatoidalnego zapalenia stawów.
Liczne inne aspekty i zalety niniejszego wynalazku staną się oczywiste w świetle poniższego opisu, w odniesieniu do rysunków, w których:
Figura od 1A do 1D obejmuje przyporządkowanie ludzkich sekwencji aminokwasowych CD11b (Identyfikator Sekw. Nr 3), cDł 1c (Identyfikator Sekw. Nr 4) i ad (Identyfikator Sekw. Nr 2).
Niniejszy wynalazek zilustrowany jest poniższymi przykładami dotyczącymi izolowania klonu cDNA kodującego ad z biblioteki cDNA ludzkiej śledziony. Konkretnie, przykład 1 pokazuje zastosowanie przeciwciała przeciwko psiemu ajMi w celu wykrywania homologicznego białka ludzkiego. Przykład 2 przedstawia oczyszczanie psiego a-jM i sekwencjonowanie końca N polipeptydu w celu opracowania starterów oligonukleotydowych do amplifikacji
187 013
PCR genu psiego ατΜΐ· Przykład 3 dotyczy oczyszczania psiego αψΜΐ na wielką skalę w celu sekwencjonowania wewnętrznego w celu zaprojektowania dodatkowych starterów PCR. Przykład 4 opisuje zastosowanie PCR i wewnętrznych starterów sekwencji w celu amplifikacji fragmentu genu psiego a-™. Przykład 5 dotyczy klonowania sekwencji cDNA kodującej ludzki oj. Przykład 6 opisuje analizę metodą hybrydyzacji Northern tkanek i komórek ludzkich w kierunku ekspresji mRNA oj. Przykład 7 pokazuje konstruowanie plazmidów ekspresjonujących ludzki αd i transfekowanie komórek 'COS powstałym plazmidem. Przykład 8 dotyczy analizy ELISA ekspresji aa w transfekowanych komórkach COS. Przykład 9 opisuje analizę FACS komórek COS transfekowanych plazmidem ekspresjonującym ludzkie Od, Przykład 10 dotyczy immunoprecypitacji CD 18 w połączeniu z αd we współtransfekowanych komórkach COS. Przykład 11 dotyczy stabilnej transfekcji konstruktów ekspresyjnych αd w komórkach jajnika chomika chińskiego. Przykład 12 dotyczy zależnego od CD 18 wiązania oj z cząsteczką adhezji międzykomórkowej ICAM-R, zmutowanym białkiem ICAM-R i składnikiem dopełniacza iC3b. Przykład 13 opisuje przesiewowy test scyntylacji zbliżeniowej w celu identyfikacji inhibitorów i wzmacniaczy (tj. modulatorów) oddziaływania wiązania ligand Oj/anty-ligand. Przykład 14 dotyczy konstruowania plazmidów ekspresyjnych, kodujących rozpuszczalne postaci Od i analizę wiązania produktów ekspresji. Przykład 15 dotyczy wytwarzania surowic poliklonalnych i przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec Oj Przykład 16 opisuje analizę rozmieszczenia tkankowego Oj, ekspresji Oj na leukocytach krwi obwodowej i ekspresji Od w zapalnej i nie zapalnej maziówce przy użyciu przeciwciał przeciwko oj. Przykład 17 opisuje izolację sekwencji cDNA szczura, które wykazują homologię z sekwencjami ludzkiego genu Od. Przykład 18 dotyczy konstruowania plazmidów ekspresjonujących oj szczura pełnej długości, plazmidów ekspresjonujących szczurzą domenę Ioj, w tym białka fuzyjne domeny I/IgG i wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko białkom pełnej długości i fuzyjnym domeny I. Przykład 19 dotyczy izolowania mysich sekwencji cDNA, które wykazują homologię z sekwencjami ludzkiego genu oj. Przykład 20 opisuje izolowanie dodatkowych mysich klonów cDNA Od zastosowanych w celu potwierdzenia analizy sekwencji. Przykład 21 dotyczy analizy hybrydyzacji różnych mysich tkanek w celu określenia ekspresji swoistej dla tkanek i komórek domniemanego mysiego homologa ludzkiego oj. Przykład 22 opisuje wytwarzanie konstruktów ekspresyjnych, które kodują domniemany mysi homolog ludzkiego Od- Przykład 23 dotyczy opracowania myszy „knock-out” w której zniszczony jest gen kodujący domniemany mysi homolog ludzkiego oj. Przykład 24 opisuje izolowanie klonów króliczego cDNA, które wykazują homologię z sekwencjami kodującymi ludzki Od. Przykład 25 opisuje modele zwierzęce chorób ludzkich, w których badano przydatność leczniczą modulowania oj. Przykład 26 opisuje ekspresję oj w chorobach zwierzęcych.
Przykład 1
Próby wykrycia ludzkiego homologa psiego o™ 1
Przeciwciało monoklonalne Ca11.8H2 (Moore i in., wyżej), swoiste wobec psiego om badano na aktywność krzyżową wobec ludzkich leukocytów krwi obwodowej w celu zidentyfikowania ludzkiego homologa psiego o·™. Preparaty komórek (zwykle 1x106 komórek) inkubowano z nierozcieńczonym nadsączem hybrydoma albo oczyszczonymi mysimi przeciwciałami kontrolnymi bez IgG (10 pg/ml) na lodzie w obecności 0,1% azydku sodu. Wiązanie przeciwciała monoklonalnego wykrywano przez następującą potem inkubację ze sprzęgniętymi z FITC końskimi przeciwciałami przeciwko mysim IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) w stężeniu 6 pg/ml. Znakowane komórki utrwalano 2% paraformaldehydem w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) i analizowano sorterem komórek wzbudzanym fluorescencją FACStar Plus (Becton-Dickinson, Mountainview, CA). Zwykle, analizowano 10000 komórek stosując amplifikację logarytmiczną natężenia fluorescencji.
Wyniki pokazują, że Ca11.8H2 nie reaguje krz^?^owo z białkami powierzchniowymi ekspresjonowanymi na powierzchni ludzkich leukocytów krwi obwodowej, podczas gdy komórki kontrolne, psie nowotworowe limfocyty krwi obwodowej były zasadniczo wszystkie pozytywne pod względem Otm1
187 013
Ponieważ przeciwciało monoklonalne Call.8H2 swoiste wobec psiej podjednostki a nie reagowało krzyżowo z ludzkim homologiem, izolowanie DNA psiego citmi było niezbędne do wyizolowania ludzkiego odpowiednika jeżeli on istniał.
Przykład 2
Oczyszczanie przez powinowactwo psiego α™ι w celu sekwencj onowania końca N
Psie α-ΓΜΐ oczyszczono przez powinowactwo w celu określenia sekwencji aminokwasowej końca N w celu zaprojektowania sondy oligonukleotydo wej/startera. Pokrótce, przeciwciało monoklonalne przeciwko psiemu αιΜι, Call.8H2 sprzęgnięto z żywicą chromatograficzną Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) i izolowano białko przez swoiste oddziaływanie przeciwciała z białkiem. Przeciwciało sprzęgnięto z żywicą według protokołu sugerowanego przez BioRad, w stężeniu około 5 mg przeciwciała na ml żywicy. Po reakcji koniugacji, nadmiar przeciwciała usunięto i zablokowano żywicę trzema objętościami 0,1 M etanolaminy. Żywicę płukano trzydziestoma objętościami kolumny roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS).
Dwadzieścia pięć gramów śledziony od pojedynczego psa homogenizowano w 250 ml buforu zawierającego 0,32 M sacharozy w 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, z inhibitorami proteaz. Jądra i resztki komórkowe zebrano przez odwirowanie przy 1000 g przez 15 minut. Błony zebrano przez odwirowanie przy 100000 g przez 30 minut. Osad błon zawieszono w 200 ml buforu do lizy (50 mM NaCl, 50 mM boran, pH 8,0, 2% NP-40) i inkubowano przez godzinę na lodzie. Nierozpuszczalny materiał zebrano przez odwirowanie przy 100000 g przez 60 minut. 10 ml sklarowanego lizatu przeniesiono do 15 ml probówki polipropylenowej z 0,5 ml Call.8H2 skoniugowanego z żywicą Affigel 10. Probówkę inkubowano przez noc w4°C obracającą następnie płukano żywicę 50 objętościami kolumny D-PBS. Następnie, żywicę przeniesione do probówki mikrowirowniczej i gotowano przez 10 minut w 1 ml buforu Laemmli (nie redukującym) zawierającym 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 20% gliceryny i 0,002% błękitu bromofenolowego. Żywicę odwirowano i usunięto; nadsącz traktowano 1/15 objętości β-merkaptoetanolu (Sigma, St. Louis, MO) i rozwinięte na 7% żelu poliakrylamidowym. Rozdzielone białka przeniesiono na membranę Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA).
Żele płukano w wodzie dejonizowanej filtrowanej przez Millipore, i zobojętniano przez 15-45 minut buforem-10 mM kwasu 3-[cykloheksyloamino]-l-propanosulfonowego (CAPS), pH 10,5, z 10% metanolem. Membrany Immobilon zwilżono metanolem, płukano filtrowaną wodą i zobojętniano przez 15-45 minut buforem CAPS. Początkowe przeniesienie przeprowadzono stosując aparat do przenoszenia ustawiony na 70V przez 3 godziny. Membranę Immobilon po przeniesieniu zabarwiono 0,1% barwnikiem Coomassie R250 przez 10 minut. Membrany odbarwiano w mieszaninie 50% metanolu/10% kwasu octowego trzykrotnie po dziesięć minut. Po odbarwieniu, membrany płukano w filtrowanej wodzie i suszono na powietrzu.
Wykryto prążki białka wielkości około 150 kDa, 95 kDa, 50 kDa i 30 kDa. Prawdopodobnie prążki 50 kDa i 30 kDa powstały na skutek zanieczyszczenia przeciwciałami. Sekwencjonowanie końca N rozpoczęto na prążku 150 kDa i 95 kDa, ale białko 95 kDa było zablokowane uniemożliwiając sekwencj ono wanie. Prążek białka 150 kDa wycięto z membrany i sekwencjonowano bezpośrednio na sekwenatorze białka Applied Biosystems (Foster City, CA) model 473A według instrukcji producenta.
Powstałą sekwencję aminokwasową podano w Identyfikatorze Sekw. Nr 5 stosując jednoliterowe oznaczenia aminokwasów.
FNLDVEEPMVFQ (Identyfikator Sekw. Nr 5)
Zidentyfikowana sekwencja obejmowała sekwencję FNLD, charakterystyczną dla podjednostek a rodziny integryn (Tamura i in., J. Celi. Biol., 111:1593-1604 (1990)).
Projektowanie starterów i próby amplifikacji sekwencji psiego ajMi
Na podstawie informacji o sekwencji końca N zaprojektowano do hybrydyzacji trzy sondy oligonukleotydowe: a) „Tommer”, oligonukleotyd w pełni zdegenerowany, b) „Patmer” częściowo zdegenerowany i c) „Guessmer” nie zdegenerowany oligonukleotyd oparty na wykorzystaniu kodonów przez ssaki. Sondy te pokazano poniżej, odpowiednio, jako Identyfika10
187 013 tor Sekw. Nr 6, 7 i 8. Dla wszystkich sekwencji nukleotydowych symbole kwasu nukleinowego są zgodne z 37 C.F.R. $1.882.
5'-T'TYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 6)
5'-TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 7)
5'-TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 8)
W oparciu o dane z sekwencjonowania, nie stwierdzono odpowiednich klonów przy użyciu tych oligonukleotydów w kilku hybrydyzacjach w warunkach małej niskiej surowości z biblioteką cDNA psich makrofagów śledzionowych/krwi obwodowej klonowanej w AZAP (Stratagene, La Jolla, CA).
Następnie opracowano cztery inne oligonukleotydy oznaczone 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg i 3'Spec (jak podano, odpowiednio, na Identyfikatorze Sekw. Nr 9, 10, 11 i 12, w których Deg oznacza zdegenerowany, zaś spec oznacza nie zdegenerowany), w oparciu o wywnioskowanej sekwencji końca N, w celu amplifikacji sekwencji psiego ctmi przez PCR z biblioteki fagowej DNA oczyszczonej z lizatu płytki biblioteki Stratagene opisanej wyżej.
5'-TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 9)
5'-TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 10)
5'-TGRAANACCA TNGGYTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 11)
5'-TTGGAAGACC ATNGGYTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 12)
Startery oligonukleotydowe atMi łączono w pary ze starterami wektora T3 i T7, jak pokazano na Identyfikatorach Sekw. Nr 13 i 14, które hybrydyzowały z sekwencjami flankującymi region łącznikowy fagemidu Bluescript w AZAP
5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 13)
5'-AATACGACTCACTATAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 14)
Amplifikację PCR przeprowadzono w buforze Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), zawierającym magnez ze 150 ng DNA biblioteki, 1 pg każdego ze starterów, 200 μΜ dNTP i 2,5 jednostki polimerazy Taq (Boehringer Mannheim) po czym produkty rozdzielono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym w buforze Tris-octan-EDTA (TAE) z 0,25 pg/ml bromku etydyny. DNA przeniesiono na membranę Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL) przez moczenie przez noc w 10x SSPE. Po przeniesieniu, unieruchomiony DNA denaturowano 0,5 M NaOH z 0,6 M NaCl, neutralizowano 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0 w 1,5 M NaCl i płukano w 2x SSPE po czym sieciowano UV w urządzeniu do sieciowania Stratalinker (Stratagene). Membranę inkubowano w buforze prehybrydyzacyjnym (5xSSPE, 4xDenhardt, 0,8% SDS, 30% formamid) przez 2 godziny w 50°C z wytrząsaniem.
Sondy oligonukleotydowe 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg i 3'Spec, znakowano stosując bufor kinazy Boehringer Mannheim z 100-300 μϋΐ yP32-dATP i 1-3 jednostkami kinazy polinukleotydowej przez 1-3 godziny w 37°C. Niewbudowany znacznik usunięto przez chromatografię na Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) stosując bufor 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 MM EDTA (TE) i ciluat dodawano bezpośrecdno do roztworu prehybiydyzacyjnego. Membrany sondowano przez 16 godzin w 42°C wytrząsając i płukano z końcową płukanką surowych warunków 1xSSPE/0,1% SDS w 50°C przez 15 minut. Membrany eksponowano na klisze Kodak X-Omat AR przez 1,4 godziny w -80°C.
Sondy oligonukleotydowe 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg i 3'Spec hybrydyzowały z produktami PCR z reakcji w których zastosowano je jako startery i nie hybrydyzowały jak oczekiwano z produktami PCR w których nie stosowano ich jako startery. Tak więc, wywnioskowano, że żaden z produktów PCR nie był swoisty wobec ατΜΐ ponieważ żaden produkt nie hybrydyzował ze wszystkimi odpowiednimi sondami.
Przykład 3
Oczyszczanie przez powinowactwo psiego atMi na wielką skalę w celu sekwencjonowania wewnętrznego
W celu dostarczenia sekwencji aminokwasowej do opracowania starterów psie octm oczyszczano w celu wewnętrznego sekwencjonowania. Trzy skrawki zamrożonej śledziony
187 013 (po około 50 g każdy) i zamrożone komórki z dwóch śledzion dorosłych psów zastosowano do wytwarzania białka do sekwencjonowania wewnętrznego. 50 gramów śledziony homogenizowano w 200-300 ml buforu boranowego homogenizatorem Waring. Homogenizowany materiał rozcieńczano 1 objętością buforu zawierającego 4% NP-40 i mieszaninę delikatnie wytrząsano przez godzinę. Powstały lizat klarowano przez odwirowanie w 2000 g przez 20 minut, a następnie filtrowano przez filtr Corning (Corning, NY) ałbo filtr 0,8 μ Corning. Lizat dalej klarowano przez odwirowanie przez filtr 0,4 μ, Corning.
Lizat śledzionowy i żywicę Affigel 10 sprzęgniętą z przeciwciałem i opisaną w przykładzie 2, połączono w stosunku objętościowym 150:1 w 100 ml porcjach i inkubowano przez noc w 4°C wytrząsając. Lizat pobrano po odwirowaniu przy 1000 g przez 5 minut, połączono z następną żywicą Affigel 10 i inkubowano przez noc jak to opisano. Adsorbowaną żywicę połączono i płukano 50 objętościami D-PBS/0,1% Tween 20 i przeniesiono na 50 ml kolumn BioRad. Adsorbowane białko eluowano z żywicy 3-5 objętościami 0,1 1 M glicyny (pH 2,5); frakcje po około 900 μΐ zebrano i neutralizowano 100 μΐ M buforu Tris, pH 8,0. Porcje po 15 μΐ pobrano z każdej frakcji i gotowano z równą objętością 2x buforu Laemmli z 1/15 objętości 1 M ditiotreitolu (DTT). Próbki te poddano elektroforezie na 8% żelach poliakrylamidowych Novex (San Diego, CA) i wizualizowano barwnikiem Coomassie albo srebrem stosując zestaw Daiichi (Enprotech, Natickm MA). Frakcje zawierające największe ilości białka połączono i stężono pod próżnią. Pozostały roztwór rozcieńczono do 50% redukującym buforem Laemmli i rozdzielono na 1,5 mm 7% żelach poliakrylamidowych w buforze Trisglicyna/SDS. Białko przeniesiono z żeli na membranę Immobilon procedurą opisaną w przykładzie 2 stosując urządzenie Hoefer.
Prążki białka odpowiadające psiemu aTMl wycięto z 10 membran PVDF co dało około 47 pg białka całkowitego. Prążki odbarwiono w 4 ml 50% metanolu przez 5 minut, suszono powietrzem i cięto na kawałki 1x2 mm. Kawałki membran zanurzono w 2 ml 95% acetonu na 30 minut w 4°C wytrząsając co jakiś czas i suszono na powietrzu.
Przed cięciem proteolitycznym białka związanego z membraną, 3 mg bromku cyjanogenu (CNBr) (Pierce Rockford, EL) rozpuszczono w 1,25 ml 70% kwasu mrówkowego. Roztwór ten dodano do probówki zawierającej kawałki membran PVDF i inkubowano probówki w ciemności przez 24 godziny. Nadsącz (SI) usunięto do innej probówki i płukano membranę 0,25 ml 70% kwasu mrówkowego. Ten nadsącz (S2) pobrano i dodano do poprzedniego nadsączu (SI). Dwa ml wody MilliQ dodano do połączonych nadsączy (SI i S2) i liofilizowano roztwór. Kawałki membran PVDF suszono pod azotem i ekstrahowano 1,25 ml 60% acetonitrylu, 0,1% kwasu tetrafluorooctowego (TFA) w42°C przez 17 godzin. Nadsącz ten (53) pobrano, zaś kawałki membran ekstrahowano ponownie 1,0 ml 80% acetonitrylu z 0,08% TFA w42°C przez godzinę. Nadsącz ten (S4) połączono z poprzednimi nadsączami (SI, S2 i S3) i osuszono pod próżnią.
Wysuszone fragmenty CNBr rozpuszczono w 63 μΐ 8 M mocznika, 0,4 M NH4HCO3. Fragmenty redukowano 5 μΐ 45 mM ditiotreitolu i inkubowano w 50°C przez 15 minut. Roztwór chłodzono do temperatury pokojowej, po czym fragmenty alkilowano przez dodanie 5 μΐ 100 mM jodoacetamidu (Sigma, St. Louis, MO), Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, próbkę rozcieńczono 187 μΐ wody MilliQ do stężenia końcowego mocznika 2 M. Następnie dodano trypsynę (Worthington, Freehold, NJ) w stosunku 1:25 (wag./wag.) i trawiono białko przez 24 godziny w 37°C. Trawienie przerwano przez dodanie 30 μΐ TFA.
Fragmenty białek rozdzielono przez wysokowydajną chromatografię ciekłofazową (HPLC) na urządzeniu Waters 625 LC (Millipore, Milford, MA) stosując kolumnę Vydac C-18 5 μ, 2,1x250 mm (Vydac, Hesperia, CA) zrównoważoną 0,05% TFA i wodą do HPLC (bufor A). Peptydy eluowano rosnącymi stężeniami 80% acetonitrylu w 0,04% TFA (bufor B) gradientem 38-75% bufora B przez 65-95 minut i 75-98% bufora B przez 95-105 minut. Peptydy frakcjonowano przy przepływie 0,2 ml/minutę i wykrywano przy 210 nm.
Po frakcjonowaniu, sekwencje aminokwasowe peptydów analizowano zautomatyzowaną degradacją Edmana na sekwenatorze Applied Biosystems Model 437A, stosując procedury zalecane przez producenta i oprogramowanie Model 610A Data Analysis, wersja 1.2.1. Wszystkie odczynniki do sekwencj ono wania dostarczyła Applied Biosystems. Sekwencje
187 013 aminokwasowe siedmiu spośród ośmiu wewnętrznych fragmentów podano poniżej, X oznacza aminokwas o niejasnej tożsamości:
VFQEXGFGQ (Identyfikator Sekw. Nr 15)
LYDXVAATGLXQPI (Identyfikator Sekw. Nr 16)
PLEYXDVIPQAE (Identyfikator Sekw. Nr 17)
FQEGFSXVLX (Identyfikator Sekw. Nr 18)
TSPTFIXMSQENVD (Identyfikator Sekw. Nr 19)
LVGAPLEVAVXQTGR (Identyfikator Sekw. Nr 20)
LDXKPXDTA (Identyfikator Sekw. Nr 21)
Opracowanie starterów
Jedną z uzyskanych wewnętrznych sekwencji aminokwasowych (podana jako Identyfikator Sekw. Nr 22) zastosowano do zaprojektowania w pełni zdegenerowanego startera oligonukleotydowego oznaczonego jako p4(R) i podanego jako Identyfikator Sekw. Nr 23)
FGEQFSE (Identyfikator Sekw. Nr 22)
5-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 23)
Przykład 4
Klonowanie przez PCR fragmentu psiego aTMl
Część 5' psiego genu aTMl amplifikowano z dwuniciowego cDNA psiej śledziony przez PCR.
A. Wytwarzanie dwuniciowego cDNA psiej śledziony gram mrożonego materiału ze śledziony młodego psa pokruszono w ciekłym azocie i homogenizowano w 20 ml buforu RNA-Stat 60(TelTest B, Inc., Friendswood, TX). Dodano ml chloroformu i ekstrahowano roztwór przez odwirowanie przy 12000 g przez 15 minut. RNA precypitowano z warstwy wodnej 10 ml etanolu. Następnie, poliA+RNA wyizolowano przy użyciu Dynal Oligo dT Dynabeads (dynal, Oslo, Norwegia). Pięć porcji po 100 pg całkowitego RNA połączono i rozcieńczono równą objętością 2x buforu do wiązania (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Następnie RNA inkubowano przez minut z Oligo dT Dynabeads (1,0 ml albo 5 mg perełek na wszystkie próbki). Perełki płukano buforem zawierającym 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS według protokołu producenta po czym eluowano poliA+RNA 2 mM EDTA, pH 7,5. Dwuniciowy cDNA wytworzono stosując eluowany poliA+RNA i zestaw do syntezy cDNA Boehringer Mannheim według protokołu producenta.
B. Izolowanie częściowego cDNA psiego aTMl
Starteiy oligonukleotydowe 5'Deg (Identyfikator Sekw. Nr 9) i p4(R) (Identyfikator Sekw. Nr 23) zastosowano w standardowej reakcji PCR zużyciem 150 ng dwuniciowego cDNA, 500 ng każdego ze starterów, 200 μΜ dNTP i 1,5 jednostki polimerazy Taq (Boehringer Mannheim) w buforze Taq (Boehringer Mannheim), z magnezem. Powstały produkt (1 μΐ oryginalnej reakcji) poddano drugiej rundzie PCR z tymi samymi starterami w celu zwiększenia ilości produktu. Prążek ten eluowano z 1% żelu agarozowego na papier NA45 Schleicher
Schuell (Keene, NH) w buforze zawierającym 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl w65°C, precypitowano i poddano ligacji z wektorem pCR™II (Invitrogen, San Diego, CA) stosując zestaw do klonowania TA (Invitrogen) i protokoł producenta. Mieszaninę ligacyjną transformowano przez elektroporację do bakterii XL-1 Blue (Stratagene). Jeden z klonów, 2.7, zawierał sekwencję odpowiadającą sekwencji peptydowej aTMl, których nie zastosowano do opracowania starterów.
Sekwencjonowanie wykonano na sekwenatorze Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) stosując zestaw Dye-deoxy Terminator Cycle Sequence Kit (ABI) z dNTP znakowanymi fluorescencyjnie włączonymi w asymetrycznej reakcji PCR (McCabe, Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR; w PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, wyd. Innis i in., str. 76-83, Academic Press: New York (1990)). Próbki utrzymywano w 94°C przez 4 minuty a następnie zostały poddane 25 cyklom po: 15 sekund w 94°C, 1 sekunda w 50°C i 4 minuty w 60°C. Dane o sekwencji automatycznie zbierano na komputerze w pliku zawierającym chromatogram i pliki tekstowe. Sekwencja całej wstawki klonu 2.7 podana jest jako Identyfikator Sekw. Nr 24.
187 013
Próby wyizolowania cDNA psiej aTMl pełnej długości z biblioteki cDNA Stratagene (jak to opisano w przykładzie 2) zakończyły się niepowodzeniem. Około 1x106 łysinek fagów przesiano przez hybrydyzację w warunkach niskiej surowości stosując 50% formamid i klon 2.7 jako sondę, ale nie wykryto klonów pozytywnych. Niepowodzeniem zakończyły się również próby amplifikowania odpowiedniej sekwencji poniżej sekwencji klonu 2.7 przy użyciu swoistych starterów oligonukleotydowych uzyskanych z klonu 2.7 albo zdegenerowanych starterów w oparciu sekwencję aminokwasową innych fragmentów peptydowych w parach ze zdegenerowanymi oligonukleotydami opartymi na zakonserwowanym motywie aminokwasowym GFFKR podjednostek a (Tamura in., wyżej).
Przykład 5
Klonowanie domniemanego ludzkiego homologa psiego aTMl
W celu izolacji ludzkiej sekwencji homologicznej do psiej aTMl fragment aTMl wielkości około 1 kb z klonu 2.7 zastosowano jako sondę. Sondę wytworzono przez PCR w warunkach opisanych w przykładzie 2 stosując startery NT2 (Identyfikator Sekw. Nr 25) i p4(R) (Identyfikator Sekw. Nr 23)
5'-GTNTTYCARGAYGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 25)
Produkt PCR oczyszczono stosując zestaw Quick Spin Quiagen (Chatsworth, GA) i protokoł producenta. Oczyszczony DNA (200 ng) znakowano 200 pCi a P-dCTP stosując zestaw Random Prime Labelling Kit Boehringer Mannheim. Nie wbudowany izotop usunięto przez chromatografię na Sephadex G25. Sondę denaturowano 0,2 N NaOH i neutralizowano 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0 przed zastosowaniem.
Wytworzono odbitki kolonii na filtrach Hybond (Amersham) biblioteki cDNA ludzkiej śledziony wpCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Filtry początkowo denaturowano i neutralizowano jak to opisano w przykładzie 2, a następnie inkubowano w roztworze prehybrydyzacyjnym (8 ml/filtr) w 30% formamidzie w 50°C wytrząsając przez 2 godziny. Znakowaną sondę dodano do roztworu i inkubowano z filtrami przez 14 godzin w 42°C. Filtry płukano dwukrotnie w2x SSC/0,1% SDS w37°C i dwukrotnie w2x SSC/0,1% SDS w50°C. Końcowe płukanie w warunkach surowych wykonano w lxSSC/0,l% SDS w 65°C dwukrotnie (lxSSC jest roztworem 150 mM NaCl, 15 mM cytrynianu sodu, pH 7,0). Filtry eksponowano na klisze Kodak X-Omat AR przez 6 godzin z ekranem wzmacniającym. Kolonie dające sygnał na powtórzonych odbitkach rozsiano na płytki LB z magnezem (LBM)/karbenicyłiną i inkubowano przez noc w 37°C. Powstałe kolonie odciśnięto na filtrach Hybond i traktowano te filtry w wyżej opisany sposób. Filtry hybrydyzowano w jeszcze bardziej surowych warunkach z sondą 1 kb z 2.7, znakowaną w opisany wyżej sposób w roztworze 50% formamidu przez 3 godziny. Sondowane filtry płukano w 0,lxSSC/0,l% SDS w 65°C i eksponowano na klisze X-Omat AR przez 2,5 godziny w -80°C z ekranem wzmacniającym. Kolonie pozytywne identyfikowano i hodowano na podłożu LBM/karbenicylina przez noc. DNA z tych hodowli izolowano stosując zestaw Promega Wizard miniprep kit, według protokołu producenta, zaś powstały DNA sekwencjonowano.
Początkowe przesiewanie dało 18 klonów pozytywnych, podczas gdy powtórne przesiewanie w warunkach wyższej surowości dało jeden klon pozytywny, który oznaczono 19A2. DNA i wywnioskowaną sekwencję aminokwasową ludzkiego klonu aj 19A2 pokazano, odpowiednio na Identyfikator Sekw. Nr 1 i 2.
Charakterystyka cDNA ludzkiego aa i wywnioskowanego polipeptydu
Klon 19A2 obejmował cały region kodujący dojrzałe białko, plus 48 zasad (16 reszt aminokwasowych) sekwencji sygnałowej 5' i 241 zasad nie ulegającej translacji sekwencji 3' nie kończącej się sygnałem poliadenylacji. Ciężar cząsteczkowy dojrzałego białka określono na około 125 kDa, Domena zewnątrzkomórkowa została przepowiedziana od reszty aminokwasowej 17 do 1108 Identyfikatora Sekw. Nr 2. Ten region zewnątrzkomórkowy był homologiczny na przestrzeni około 20 aminokwasów z regionem śródbłonowym ludzkiej CDllc (reszty 1109 do 1128 Identyfikatora Sekw. Nr 2). Domena cytoplazmatyczna obejmowała około 30 reszt aminokwasowych (reszty od 150 do 325) około 202 aminokwasów homologicznych z domeną I (insertion) wspólną dla CDI le, CDI lb i CDI lc (Larson i Springer, wyżej), oe (Shaw i in., J. Biol. Chem., 269: 6016-6025 (1994)) i VLA-1 i VLA-2 (Tamura i in.,
187 013 wyżej). Domena I w innych integrynach uczestniczy, jak wykazano w wiązaniu ICAM (Landis i in., J. Celi. Biol., 120:1519-1527 (1993); Diamond i in., J. Celi. Biol., 120:1031-1043 (1993)) wskazując, że a<j może również wiązać członków rodziny cząsteczek powierzchniowych ICAM. Regionu tego nie wykazano w innych podjednostkach integryn.
Wywnioskowana sekwencja aminokwasową α wykazuje około 36% identyczność z CD11a, około 60% identyczność z CD11b i około 66% identyczność z CD11c. Przyporządkowanie sekwencji aminokwasowych dla CD11b (Identyfikator Sekw. Nr 3), CD11c (identyfikator Sekw. Nr 4) i ad (Identyfikator Sekw. Nr 2) pokazano na figurze 1.
Domeny cytoplazmatyczne podjednostek α integryn β2 są zwykle różne w obrębie gatunku, podczas gdy poszczególne podjednostki a wykazują wysoki stopień homologii międzygatunkowej. Zgodnie z tą obserwacją, region cytoplazmatyczny ad różni się od CD 11a, CD11b i CD11c z wyjątkiem sekwencji aminokwasowej bliższej błonie komórkowej GFFKR, która jest zakonserwowana wśród wszystkich integryn a (Rojiani i in., Biochemistry 30:98599866 (1991)). Ponieważ region cytoplazmatyczny integryn wiązany jest z sygnalizacją typu „inside out” (na zewnątrz) i regulacją zachłanności wiązania (Landis i in., wyżej) możliwe jest, że ad oddziaływuje cząsteczkami cytozolu różnymi od oddziaływujących z CD11a, CD11b i CD11c oraz, w wyniku, uczestniczą w szlaku sygnalizacji innym niż integryny B2.
Domena zewnątrzkomórkowa ad zawiera zakonserwowaną sekwencję aminokwasową DGSGS położoną stycznie do domeny I; W CD11b domena DGSGS jest regionem wiążącym metal, niezbędnym do oddziaływania z ligandem (Michishita i in., Celi 72:857-867 (1993)). Trzy dodatkowe miejsca wiązania kationów CD11b i CD11c są zakonserwowane w sekwencji ad w aminokwasach 465-474, 518-527 i 591-600 w klonie 19A2 (Identyfikator Sekw. Nr 1). Domena I ad jest w 36%, 62% i 57% identyczna z odpowiednimi regionami, odpowiednio, CD11a, CD11b i CD11c, zaś względnie niska homologia w tym regionie wskazuje, że ad może oddziaływać z zestawem białek zewnątrzkomórkowych różnych od białek z którymi oddziaływają integryny β2. Alternatywnie, powinowactwo ad do znanych ligandów integryn βζ, przykładowo ICAM-1, ICAM-2 i/lub ICAM-R, może być różne od opisanych oddziaływań integryn P2/ICAM (patrz, przykład 12).
Izolowanie dodatkowych klonów cDNA ludzkiego a d° potwierdzenia sekwencji
W celu potwierdzenia sekwencji DNA kodującej ludzkie ad dodatkowe ludzkie cDNA wyizolowano przez hybrydyzację z biblioteki cDNA ludzkiej śledziony (Invitrogen) w pCDNA/AMP (opisanej w przykładzie 5), którą frakcjonowano przez elektroforezę na żelu w kierunku cDNA większych niż 3 kb. Sonda do hybrydyzacji pochodziła z regionu 5' ad opisanego poniżej. Warunki hybrydyzacji były jak to opisano wcześniej dla izolacji początkowego klonu ludzkiej ad, z takim wyjątkiem, że po hybrydyzacji filtry płukano dwukrotnie 2xSSC/0,l% SDS w temperaturze pokojowej i raz w 2xSSC/0,1% SDS w 42°C. Filtry eksponowano na kliszę Kodak X-Omat AR przez noc.
Sondę hybrydyzacyjną 5' aa wytworzono przez PCR z klonu 19A2 przy użyciu starterów CD11c 5'For (Identyfikator Sekw. Nr 94) iCDł1c5'Rev (Identyfikator Sekw. Nr 95) w poniższych warunkach. Próbki trzymano w 94°C przez cztery minuty a następnie poddano 30 cyklom amplifikacji po i) 15 sekund w94°C, ii) 30 sekund w 5°C i iii) 1 minutę w72°C w urządzeniu Perkin-Elmer 9600 thermocycler.
CD11c5'For 5'-CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 94)
CD11c5'Rev 5'-CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 95)
Produkt amplifikacji oczyszczono stosując zestaw Prep-A-Gene BioRad (Hercules, CA) według protokołu producenta. Powstała sonda 5'aa miała długość około 720 par zasad, odpowiadając regionowi od nukleotydu 1121 do nukleotydu 1839 Identyfikatora Sekw. Nr 1. Oczyszczony DNA (około 50 ng) znakowano ^P-dCTP stosując zestaw Random Prime Labeling Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) według protokołu producenta. Niewbudowany izotop usunięto stosując kolumny Centrisep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Znakowaną sondę dodano do filtrów w roztworze prehybrydyzacyjnym zawierającym 45% formamidu i inkubowano przez noc w 50°C. Po inkubacji filtry płukano jak to opisano wyżej.
187 013 kolonii dawało sygnał w odbitkach filtrów. Kolonie pozytywne pobrano z płytek wyjściowych, zawieszono wLBM i karbenicyłinie (100 pg/ml) i wysiano w różnych gęstościach na filtry Hybond. Odbitki filtrów hybrydyzowano z tym samym roztworem co w pierwszej hybrydyzacji, zaś po hybrydyzacji filtry płukano w2xSSC/0,ł% SDS w42°C i eksponowano na kliszę.
z początkowych 13 kolonii pozytywnych potwierdzono w drugim przesiewaniu. Wśród tych klonów dwa (A7.Q i A8.Q) sekwencjonowano i stwierdzono, że kodują ludzką aj. Klon A7.Q miał długość 2,5 kb, obejmował sekwencję liderową 5', część regionu kodującego i dodatkowych 60 zasad nie ulegającej translacji sekwencji 5'. Niekompletny region kodujący powstał na skutek błędnego składania regionu intronu w nukłeotydzie 2152 Identyfikatora Sekw. Nr 1. Klon A8.Q miał długość około 4 kb, obejmując cały region kodujący a<j i obejmując sekwencję intronu w zasadach 305 Identyfikatora Sekw. Nr 1). W porównaniu z klonem aj wyizolowanym oryginalnie (Identyfikator Sekw. Nr 1) jedyną różnicą wA7.Q i A8.Q było to, że zawierały one dodatkowe trzy zasady CAG w miejscu 1495. Sekwencje klonów A7.Q i A8.Q podane są, odpowiednio, jako Identyfikator Sekw. Nr 96 i 97, zaś odpowiednie wywnioskowane sekwencje aminokwasowe podano jako Identyfikator Sekw. Nr 98 i 99.
Przykład 6
Analiza Northern błot ekspresji ludzkiej aj w tkankach
W celu określenia względnego poziomu ekspresji i swoistości tkankowej wykonano analizę Northern błot przy użyciu fragmentów klonu 19A2 jako sond. Około 10 pg całkowitego RNA z kilku ludzkich tkanek albo hodowanych linii komórkowych umieszczono na żelu agarozowym z formaliną w obecności 1 pg bromku etydyny. Po elektroforezie przy 100 V przez 4 godziny RNA przenoszono na membranę nitrocelulozową (schleicher&Schuell) przez moczenie przez noc w 10xSSC. Membranę zapieczono przez 1,5 godziny w80°C w próżni. Roztwór prehybrydyzacyjny zawierający 50% formamidu w buforze kwasu 3-(Nmofolino)propano-sulfonowego (MOPS) zastosowano do zablokowania membrany przez 3 godziny w42°C. Fragmenty klonu 19A2 znakowano zestawem Random Prime Labelling Kit jak opisano wyżej, stosując a32P-dCTP i a32P-dTTP. Niewbudowany znacznik usunięto na kolumnie z Sephadex G25 w buforze TE. Membrany sondowano 1,5x106 zliczeń na ml buforu prehybrydyzacyjnego. Następnie membranę płukano kolejno w2xSSC/0,l% SDS w temperaturze pokojowej, 2xSSC/0,l% SDS w42°C, 2xSSC/0,l% SDS w 50°C, lxSSC/0,l% SDS w 50°C, 0,5xSSC/0,l% SDS w 50°C i 0,lxSSC/0, 1% SDS w 50°C. Membrany eksponowano na kliszę przez 19 godzin.
Hybrydyzacja z użyciem fragmentu BstXI klonu 19A2 (odpowiadającego nukleotydom 2011 do 3388 Identyfikatora Sekw. Nr 1) wykazała słaby sygnał wielkości około 5 kb w całkowitym RNA wątroby, łożyska, grasicy imigdałków. Nie stwierdzono sygnałów w próbkach nerek, mózgu i serca. Ilość RNA obecnego w ścieżce nerek była minimalna, jak określono barwieniem bromkiem etydyny.
Przy użyciu drugiego fragmentu klonu 19A2 (obejmującego zasady od 500 do 2100 Identyfikatora Sekw. Nr 1) wykryto transkrypty RNA dwóch różnych wielkości w membranie z RNA wielu narządów człowieka (MTN) stosując połiA+RNA (Clontech). Prążek wielkości około 6,5 kb obserwowano w śledzionie i mięśniach szkieletowych, podczas gdy prążek wielkości 4,5 kb wykryto w płucach i leukocytach krwi obwodowej. Obserwowane różnice w wielkości mogą być spowodowane poliadenylacją swoistą tkankowo, reakcją krzyżową sond z innymi członkami rodziny integiyn albo hybrydyzacją z alternatywnie złożonymi mRNA.
Analiza Northern z użyciem trzeciego fragmentu klonu 19A2, obejmującego nukleotydy od 2000 do 3100 Identyfikatora Sekw. Nr 1 dała wynik zgodny z innymi fragmentami klonu 19A2.
RNA z komórek linii szpikowej sondowano również stosując fragmenty odpowiadające nukleotydom 500-2100 i 2000-3100 Identyfikatora Sekw. Nr 1. Linia komórkowa THP-1, pobudzona uprzednio PMA, dała rozmyty sygnał w tym samym zakresie wielkości (około 5,0 kb), o nieco większym natężeniu niż w innych tkankach. RNA z nie pobudzanych i pobudzanych DMSO komórek HL-60 hybrydyzował z sondą aj z takim samym natężeniem
187 013 co próbki tkanek, traktowanie PMA wydawało się zwiększać natężenie sygnału. O ile PMA i DMSO pobudzają różnicowanie HL-60 w kierunku szlaków, odpowiednio, monocytów/Makrofagów i granulocytów, wynik ten wskazuje zwiększoną ekspresję ad w komórkach typu monocytów/Makrofagów. Nie obserwowano prążków w komórkach Molt, Daudi, H9, JY albo Jurkat.
Przykład 7
Przejściowa ekspresja konstruktów ludzkiej ad
A. Wytwarzanie konstruktów ekspresyjnych
Ludzki klon 19A2 pozbawiony był kodonu początkowej Metioniny i prawdopodobnie części sekwencji sygnałowej 5'. Stąd w celu wytworzenia ludzkiego plazMidu ekspresyjnego zawierającego sekwencję 19A2 zastosowano dwie różne strategie. W pierwszej, skonstruowano dwa plazmidy w których sekwencje peptydu sygnałowego pochodzące z genów kodujących CD11b albo CD11c złożono z klonem 19A2 otrzymując sekwencję chimeryczną ad- W drugim podejściu, skonstruowano trzeci plazmid, w którym zasada adenozyny została dodana w pozycji 0 w klonie 19A2, kodując początkową metioninę.
Trzy plazmidy zawierały różne regiony, które kodowały część 5' sekwencji aa albo chimeryczną sekwencję ad. Region ad amplifikowano przez PCR (patrz warunki w przykładzie 2) swoistym starterem 3' BamRev (patrz niżej w Identyfikatorze Sekw. Nr 26) i jednym z trzech sta^^^<^,w 5'. Startery 5' zawierały sekwencję: (1) identyczne nieswoiste zasady w pozycji 1-6 umożliwiające trawienie, miejsce EcoRI w pozycji 7-12 i sekwencję zgodności Kozak'a w pozycji 13-18; (2) część sekwencji sygnałowej CD11b (starter ER1B) albo CD11c (starter ER1C), albo adenozynę (starter ER1D); i (3) dodatkowych 15-17 zasad nakładających się sekwencję 5' klonu 19A2 w celu umożliwienia przyłączania startera. Startery ERlB, ER1C albo ER 1D podane są, odpowiednio, w Identyfikatorze Sekw. Nr 27, 28 i 29 gdzie kodon początkowej metioniny jest podkreślony, zaś miejsce EcoRI jest podwójnie podkreślone.
5'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3’ (Identyfikator Sekw. Nr 26)
5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 27
5I-AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3I (Identyfikator Sekw. Nr 28)
5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 29)
Powstały produkt PCR trawiono EcoRI i BamHI.
Wszystkie trzy plazmidy zawierały wspólny drugi region ad (wprowadzony bezpośrednio poniżej regionu 5' opisanego w poprzedniM paragrafie) obejmując koniec 3' klonu ad. Drugi region ad, rozciągający się od nukleotydu 625 w miejscu Xbal w regionie łącznika 3' wektora klonu 19A2, wyizolowano przez trawienie klonu 19A2 BamHI i Xbai.
Wykonano trzy reakcje ligacji w których fragment 3' ad BamHI^fc^aI poddano ligacji z jednym z trzech fragmentów 5' ad EcoRI/BamHI stosując bufor ligazy Boehringer Mannheim i ligazę T4 (1 jednostkę na reakcję). Po 4 godzinach inkubacji w 14°C, odpowiednią ilość wektora pcDNA (lnvitrogen) trawionego EcoRI i Xbal dodano do każdej z reakcji z dodatkową jednostką ligazy. Reakcje pozostawiono przez dalsze 14 godzin. 1/10 mieszaniny reakcyjnej transformowano do kompetentnych komórek XL-1 Blue. Powstałe kolonie hodowano, po czym izolowano DNA jak to opisano w przykładzie 5. Trawienie EcoRI zidentyfikowało trzy klony, które były pozytywne pod względem miejsc restrykcyjnych, a więc również zaprojektowanych sekwencji sygnałowych. Klony oznaczono pATM.Bl (CD1lb/ad, ze startera ERlB), pATM.C10 (CD11c/ad, ze startera ER1C) ipATM.D12 (adenozyna/ad ze startera ER 1D). Obecność odpowiednich sekwencji sygnałowych w każdym z klonów potwierdzono sekwencjonowaniem kwasu nukleinowego.
B. Transfekowanie komórek COS
Ekspresję z plazmidów ad opisanych wyżej wywołano przez wspóltransfekowanie komórek COS poszczególnymi plazmidami i plazmidem ekspresjonującym CD18, pRC.CD18. Jako kontrola pozytywna, komórki COS współtransfekowano również plazmidem pRC.CD18 i plazmidem ekspresjonującym CD1 la, pDC.CDl 1A.
187 013
Komórki pasażowano w pożywce (DMEM/10% FBS/penstrep) w 10 cm hodowlanych szalkach Petri'ego Corning, do 50% zlewności 16 godzin przed transfekcją. Komórki pobrano z płytek buforem Versene (0,5 mM NaEDTA w PBS) bez trypsyny. Przed transfekcją, płytki płukano raz bezsurowiczą DMEM. 15 pg każdego z plazmidów dodano do 5 ml buforu do transfekcji (DMEM z 20 pg/ml DEAE-dekstranu i 0,5 mM chlorochiny) w każdej z płytek. Po 1,5 godziny inkubacji w 37°C komórki poddano wstrząsowi przy użyciu DMEM/10% DMSO przez minutę. Ten roztwór DMSO zastąpiono 10 ml/płytkę pożywki hodowlanej.
Powstałe transfektanty analizowano przez ELISA, FACS i immunoprecypitację jak to opisano w przykładach 8, 9 i 10.
Przykład 8
Analiza metoda ELISA transfektantów COS
W celu określenia czy komórki COS współtransfekowane plazmidem ekspresyjnym CD18, pRC.CD18 i plazmidem ekspresyjnym ad, na powierzchni komórki w połączeniu z CDI8, wykonano test ELISA stosując przeciwciała pierwotne wywołane przeciwko CD18 (np. TS1/18 oczyszczone z ATCC HB203). Jako kontrolę pozytywną wykonano ELISA na komórkach współtransfekowanych plazmidem ekspresyjnym CDI la, pDC.CDl 1 A. Pierwotne przeciwciała w tej kontroli obejmowały przeciwciała CD 18 i przeciwciała przeciwko CDI la (np. TS1/22 oczyszczone z ATCC HB202).
Do testu ELISA, komórki z każdej z płytek pobrano buforem Versene i przeniesiono do pojedynczej płytki hodowlanej Corning 96-studzienkowej. Komórki inkubowano w pożywce hodowlanej przez 2 dni przed testem. Następnie, płytki płukano dwukrotnie po 150 pl/studzienkę D-PBS/0,5% roztworem żelatyny ze skóry (Sigma). Bufor ten zastosowano we wszystkich etapach z wyjątkiem opracowywania. Wszystkie płukania i inkubacje wykonywano w temperaturze pokojowej. Przeciwciała pierwotne rozcieńczano do 10 pg/ml w roztworze żelatyny i dodawano po 50 pl do każdej studzienki. Dla każdego pojedynczego przeciwciała nastawiono studzienki w potrójnym powtórzeniu. Po inkubacji przez godzinę płytki płukano 3x po 150 pl/studzienke roztworu żelatyny. Przeciwciało wtórne (kozie przeciwciało przeciwko mysim Ig/HRP swoiste wobec Fc 9Jackson, West Grove, PA) w rozcieńczeniu 1:3500 dodano po 50 pl/studzienkę i inkubowano przez godzinę. Po trzech płukaniach płytki wywoływano przez 20 minut przy użyciu 100 pl/studzienkę roztworu o-fenylodiaminy (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD w buforze cytrynianowym) po czym dodano do każdej studzienki po 50 pl/studzienkę 15% kwasu siarkowego.
Analiza transfektantów w formacie ELISA z przeciwciałem swoistym wobec CD 18 nie wykazała znaczącej ekspresji ponad poziom podstawowy w komórkach transfekowanych tylko plazmidem kodującym CD 18. Komórki współtransfekowane plazmidem zawierającym CDI la i CD 18 wykazywały zwiększoną ekspresję ponad poziom podstawowy jak zanalizowano przeciwciałami swoistymi wobec CD 18 i reagentami swoistymi wobec CDI la. Dalsza analiza komórek współtransfekowanych plazmidem ekspresjonującym CD 18 jednym zkonstruktów aą (pATM.ClO albo pATM.D12) wykazała, że ekspresja powierzchniowa CD 18 przywrócona została przez równoczesną ekspresję ad. Zwiększenie wykrywalnej ekspresji CD 18 w komórkach COS transfekowanych pATM.ClO albo pATM.D12 była porównywalna z obserwowaną we współtransfekowanych komórkach kontroli pozytywnej CDlla/CD18.
Przykład 9
Analiza FACS transfektantów COS
Do analizy FACS komórki w szalkach Petri'ego odżywiono świeżą pożywką dzień po transfekcji i inkubowano przez 2 dni przed badaniem. Komórki transfekowane pobrano z płytki w 3 ml buforu Versene, płukano w 5 ml buforu FACS (DMEM/2% FBS/0,2% azydku sodu) i rozcieńczano do 500000 komórek/próbkę w 0,1 ml buforu FACS. Do każdej próbki dodawano 10 pl 1 mg/ml przeciwciał swoistych wobec CD 18, CDI la albo CDI lb sprzęgniętych z FITC (Becton Dickinson) i tyle samo 800 pg/ml mysiego przeciwciała 23F2G (przeciwko CD18) sprzęgniętego z CFSE (ATCC HB11081). Następnie próbki inkubowano na lodzie przez 45 minut, płukano 3x w 5 ml buforu FACS i zawieszano w 0,2 ml buforu FACS.
187 013
Próbki obrabiano na urządzeniu FACScan Becton Dickinson i analizowano stosując oprogramowanie LysisII (Becton Dickinson).
Komórki COS transfekowane sekwencjami CD 18 nie znakowały się wyłącznie na CD18, CD11a i CD11b. Po współtransfekcji CD11a/CD18 około 15% komórek znakowało się przeciwciałami przeciwko CD11a albo CD 18. Wszystkie komórki transfekowane CD 18 i dowolnym konstruktem aj nie powodowały wykrywalnego znakowania na CD11a i CD11b. Grupy pATM.B1, pATM.C10 i pATM.D12 znakowały się, odpowiednio, w 4%, 13% i 8 % na CD18. Fluorescencja populacji pozytywnej w grupie CD11a/CD18 była 4-krotnie wyższa niż tło. Dla porównania, współtransfekcja konstruktami ad i konstruktem CD 18 powodowała powstanie populacji pozytywnej, która wykazywała 4- do 7-krotnie zwiększenie natężenia fluorescencji ponad tło.
Przykład 10
Immunoprecypitacja znakowana biotyną kompleksów ludzkiej ad/CD18 ze współtransfekowanych komórek COS
Na komórkach współtransfekowanych CD 18 i każdym z plazmidów ekspresjonujących ad wykonano próbę immunoprecypitacji, w celu określenia czy ad można wyizolować jako część kompleksu heterodimeru charakterystycznego dla integryn.
Komórki transfekowane (1-3x10 8/grupę) pobrano z szalek Petri'ego buforem Versene i płukano trzykrotnie w 50 ml/grupę D-PBS. Każdą próbkę znakowano 2 mg Sulfo-NHS Biotyny (Pierce, Rockford, IL) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję przerywano przez 3-krotne płukanie w 50 ml/próbkę zimnego D-PBS. Płukane komórki zawieszano w 1 ml buforu do lizy (1% NP.-40, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 1 mM Ca2+, 2 mM Mg2+ i inhibitory proteazy) i inkubowano 15 minut na lodzie. Materiał nierozpuszczalny żwirowano przy 10000 g przez 5 minut, i pobrano nadsącz do świeżych probówek. W celu usunięcia materiału nieswoiście reagującego z mysią immunoglobuliną, wykonano etap wstępnego oczyszczania. 25 pg mysiej immunoglobuliny (Cappel, West Chester, PA) inkubowano z nadsączami w4°C. Po 2,5 godziny, do każdej próbki dodano 100 pl (25 pg) króliczych Ig przeciwko mysim Ig sprzęgniętych z Sepharozą (wytworzonych z króliczego przeciwciała przeciwko mysim Ig z Zymed, San Francisco, CA, i Sepharozy 4B z białkiem A); inkubację prowadzono w4°C przez 16 godzin wytrząsając. Perełki Sepharozy oddzielono od nadsączu przez odwirowanie. Po wstępnym klarowaniu, nadsącza traktowano 20 pg przeciwciała przeciwko CD 18 (TS1.18) przez 2 godziny w 4°C. Kompleksy antygen/przeciwciało wyizolowano z nadsączy przez inkubację z 100 pl/próbkę preparatu króliczych przeciwciał przeciwko mysim Ig/sepharozy z białkiem A, opisanego powyżej. Perełki płukano 4-krotnie w 10 mM HEPES, 0,2 M NaC1 i 1% Tritonie K-100. Płukane perełki żwirowano i gotowano przez 10 minut w 20 pl 2x buforu Laemmli z 2% β-merkaptoettmolem. Próbki odwirowano i rozdzielono na 8% żelach poliakrylamidowych Novex (Novex) przy 100 V przez 30 minut. Białka przemesiono na membrany nitrocelulozowe (Schleicher&Schuell) w buforze TBS-T przy 200 miliamperach przez godzinę. Membrany zablokowano przez 2 godziny 3% BSA w TBS-T. Membrany traktowano rozcieńczoną 1:6000 streptawidyną spreęgniętą z peroksydazą chrzanową (POD) (Boehringer Mannheim) przez godzinę, a następnie płukano 3-krotnie w TBS-T. Zestaw Amersham Enhanced Chemiluminescence zastosowano według protokołu producenta w celu wywołania wyniku. Membrany eksponowano na kliszę Hyperfilm MP (Amersham przez 0,5 do 2 minut).
Immunoprecypitacja kompleksów CD 18 z komórek transfekowanych pRC.CD18 ipATM.B1, pA'TM.C10 albo pATM.D12 wykazała ekspresję powierzchniową heterodimerów składających się z łańcuchów β o ciężarze około 100 kDa, co było zgodne z przewidywanym ciężarem cząsteczkowym CD 18 i łańcuchów a o ciężarze około 150 kDa, odpowiadających ad.
Przykład 11
Stabilna transfekcja ludzkiej ad w komórkach jajnika chomika chińskiego
W celu określenia, czy ad ulega ekspresji na powierzchni komórek jako heterodimer w połączeniu z CD18, cDNA kodujące każdy z łańcuchów przejściowo i stabilnie transfekowano do komórek linii pozbawionej zarówno adjak i CD18.
187 013
Do tego doświadczenia cDNA αd wyposażono dodatkowo w sekwencję liderową i sekwencję zgodności Kozak'a, jak to opisano w przykładzie 7 i wklonowano do wektora ekspresyjnego pcDNA3. Końcowy konstrukt, oznaczony pATM.D12 współtransfekowano wraz ze zmodyfikowanym wektorem dostępnym w handlu, pDC1.CD18, kodującym ludzką CD 18 do komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) o fenotypie reduktazy dihydrofolianowej (DHFR)'. Plazmid pDC1.CD18 kodował znacznik DHFR+, co umożliwiało selekcję transfektantów przy użyciu pożywki pozbawionej odpowiedniego nukleozydu. Modyfikacje które wykonano na pDC 1 .CD 18 opisano niżej.
Plazmid pRC/CMV (Invitrogen) jest ssaczym wektorem ekspresyjnym, z promotorem wirusa cytomegalii i genem znacznikowym oporności na ampicylinę. Gen DHFR z plazmidu pSC1190-DHFR wprowadzono do pRC/CMV w kierunku 5' od początku replikacji SV40. Oprócz tego, łącznik z regionu 5' plazmidu pHF2G-DHF poddano ligacji z konstruktem pRC/CMV/DHFR, w kierunku 3' od genu DHFR. Sekwencje kodujące CD18 klonowano do powstałego plazmidu pomiędzy region flankujący łącznik 5' i region kodujący sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
Ekspresję powierzchniową CD 18 analizowano cytometrią przepływową stosując przeciwciało monokłonalne TS1/18. Tworzenie heterodimerów wykrywane pomiędzy ad i CD18 w tych komórkach było zgodne z immunoprecypitacją opisaną w przykładzie 10 podczas przejściowej ekspresji w komórkach COS.
Przykład 12
Ludzkie αd wiąże się z ICAM-R w sposób zależny od CD 18
W świetle doniesień, które wykazują oddziaływanie pomiędzy integrynami leukocytów i cząsteczkami adhezji międzykomórkowej (ICAM), które pośredniczą w kontakcie między komórkami (Hynes i in., Celi 69:11-25 (1992)), zdolność komórek CHO ekspresjonujących αd /CD18 do wiązania ICAM-1, ICAM-R albo VCAM-1 oceniano dwoma sposobami.
W podobnych testach, białka fuzyjne IgG1 z rozpuszczalnymi ICAM-1, ICAM-R albo VCAM-1 unieruchamiano na plastiku i badano zdolność transfekowanych ad/CD18 komórek CHO do wiązania unieruchomionego ligandu. Transfekowane komórki znakowano wewnętrznie kalceiną, płukano buforem do wiązania (RPMI 1640 z 1% BSA, i inkubowano w samym buforze (z lub bez 10 pg/ml PMA) albo w buforze z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD 18 w stężeniu 10 pg/ml. Transfekowane komórki dodano do 96-studzienkowych płytek Immulon 4 uprzednio opłaszczonych rozpuszczalnymi białkami fuzyjnymi ICAM-1/IgG1, ICAM-R/IgGl albo VCAM-1/IgGl albo albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako kontrola negatywna. Opracowanie rozpuszczalnych postaci tych cząsteczek adhezyjnych opisano i w pełni ujawniono w równolegle rozpatrywanym i współposiadanym zgłoszeniu patentowym USA nr 08/102,852, zgłoszonym 5 sierpnia 1993. Studzienki zablokowano 1% BSA w PBS przed dodaniem znakowanych komórek. Po płukaniu płytek przez zanurzenie w PBS z 0,1% BSA na 20 minut, całkowitą fluorescencję pozostających komórek mierzono w każdej studzience przy użyciu urządzenia Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA).
W doświadczeniach z unieruchomionymi ICAM, współtransfektanty adCD18 wykazywały w sposób stały 3-5-krotny wzrost wiązania ze studzienkami ICAM-R/IgGl w stosunku do studzienek opłaszczonych BSA. Swoistość i zależność od CD 18 tego wiązania wykazano przez hamujący wpływ przeciwciała przeciwko CD18, TS1/18. Wiązanie komórek transfekowanych CD11a/CD18 ze studzienkami ICAM-1/IgGl było porównywalne związaniem obserwowanym w studzienkach opłaszczonych BSA. Komórki transfekowane CD11a/CD18 wykazywały 2-3 -krotny wzrost wiązania ze studzienkami ICAM-1/IgG1 tylko po uprzednim traktowaniu PMA. Traktowanie PMA transfektantów adCD18 nie wpływało na wiązanie ze studzienkami ICAM-1/IgGl albo ICAM-R/IgG1. Nie obserwowano wykrywalnego wiązania transfektantów a/CD 18 ze studzienkami VCAM-1/IgGl.
Wiązanie komórek transfekowanych a<i/CD18 z rozpuszczalnymi białkami fuzyjnymi ICAM-1/IgG1, ICAM-R/IgG1 albo VCAM-1/IgGl określono cytometrią przepływową. Około milion komórek CHO transfekowanych a/CD18 (hodowanych w butelkach wirowych w celu lepszej ekspresji) na pomiar zawieszono w 100 pi buforu do wiązania (RPMI i 1% BSA) z lub bez 10 pg/ml przeciwciała przeciwko CD 18. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze poko20
187 013 jowej, komórki płukano w buforze do wiązania i dodawano białko o fuzyjne ICAM-1/IgGl albo ICAM-R/IgGl w stężeniu końcowym 5 pg/ml. Wiązanie prowadzono przez 30 minut w 37°C, po czym komóTki płukano trzykrotnie i zawieszono w 100 pi buforu do wiązania zawierającego przeciwciało owcze przeciwko ludzkim IgG1 sprzęgnięte z FITC w rozcieńczeniu 1:100. Po 30 minutach inkubacji próbki płukano trzykrotnie i zawieszano w 200 pl buforu do wiązania w celu analizowania urządzeniem FACScan Becton-Dickinson.
Około 40-50% transfektantów ad/CD18 wykazywało wiązanie z ICAM-RIgGl, ale nie zICAM-1/IgGi albo VCAM-1/IgG1. Traktowanie komórek transfekowanych PMA nie wywierało wpływu na wiązanie ad/CD18 z ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl albo VCAM1/I^C^l1 co było zgodne z testem acdieejj rnńeruchomionej. Wiąąanii z ICAM-R było zmniejszone do poziomu tła po traktowaniu transfektantów ad/CD18 przeciwciałem przeciwko CD 18, TS1/18.
Połączone dane z tych dwóch testów wiązania ilustrują, że adCD18 wiąże się z ICAM-R i robi to preferencyjnie w porównaniu z.IGAM-1 iVCAM-1. Preferencja wiązania ad/CD18 z ICAM-R w stosunku do IGAM-1 jest odwrotna niż obserwowana w przypadku CD11a/CD18 iCD11b/CD18. Tak więc modulowanie wiązania a<j/CD18 może wybiórczo wpływać na normalne i patologiczne funkcje odporności, gdzie ICAM-R odgrywa główną rolę. Ponadto, wyniki podobnych testów w których przeciwciała swoiste wobec różnych domen zewnątrzkomórkowycli ICAM-R badane były pod względem ich zdolności do hamowania wiązania ICAM-R z transfektantami ad/CD18, wskazują, że adCD18 i CDI 1a(CD18 oddziaływujs z różnymi domenami ICAM-R.
Brak wiązania CD11a(CD18 zICAM-1/IgG1 albo VCAM-1/IgGi w roztworze sugeruje, że powinowactwo wiązania pomiędzy CD11a/CD18 i ICAM-1 albo ICAM-R jest zbyt niskie aby umożliwić wiązanie w roztworze. Wykrycie wiązania ad/CD18 zICAM-R/IgG1 sugeruje jednakże niezwykle wysokie powinowactwo wiązania.
Test adhezji FACS opisany powyżej zastosowano w celu zbadania wiązania mutanta ICAM-R, E37A/Ig z komórkami CHO ekspresj^^ąc^^ ad/CD18. Wykazano, że E37A/Ig nie wiąże chimery LFA-1/Ig (Sadhu i in., Cell A^esion and Communication 2:429-440 (1994)). Zmutowane białko ekspresjonowano w postaci rozpuszczalnej z linii komórkowej CHO stabilnie transfekowanej i oczyszczano na kolumnie ProsepA jak to opisano (sadhu i in., wyżej).
Wiązania E37A/Ig z transfektantami ad/CD18 nie stwierdzono w powtarzanych testach. Średnia natężenia fluorescencji (MFI) chimery E37A/Ig wykrywana przez przeciw-ludzkie przeciwciało sprzęgnięte z FITC była identyczna z MFI wykrywającą samo przeciwciało, wskazując, że nie występował jakikolwiek wykrywalny sygnał ponad tło przy użyciu zmutowanego białka E37A/Ig w tym teście. Podobnie, w teście ELISA opisanym w przykładzie 14, mutant E37A/Ig nie wiązał unieruchomionego ad/CD18.
Wiązanie ad z iC3b
Składnik dopełniacza C3 może być przecięty proteolitycznie tworząc kompleks iC3b, który zapoczątkowuje alternatywny szlak aktywacji dopełniacza i prowadzi na koniec do zależnego od komórki zniszczenia celu. Zarówno CD11b jak iCD11c podejrzewa się o wiązanie z iC3b a następnie fagocytozę cząstek opłaszczonych iC3b. Fragment peptydu w domenie I CD11b określono niedawno jako miejsce oddziaływania iC3b (Ueda i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10680-10684 (1994)). Region wiązania iC3b jest tiinis zakonserwowany w CD11b, CD11c i ad wskazując na oddziaływanie wiązania a<j/iC3b. Wiązanie ad z iC3b wykonywano stosując transfektanty albo linie komórkowe naturalnie ekspresjonujące ad (przykładowo, komórki HL-60 pobudzane PMA) i erytrocyty owcy opłaszczone iC3b (sRBC) w teście rozetkowym (Dana i in., J. Clin. ^est., 73:153-159 (1984)). Zdolności transfektantów CHO ad/CD18, transfektantów CHO VLA4 (kontrola negatywna) i komórek HL-60 pobudzanych PMA (kontrola pozytywna) do tworzenia rozetek porównywano w obecności i pod nieobecność przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD 18 (przykładowo TS1/18).
187 013
Przykład 13
Przesiewanie przez test scyntylacji zbliżeniowej
Swoiste inhibitory wiązania pomiędzy ligandami ad według wynalazku i ich partnerami wiązania (para ligand ad/anty-ligand) mogą być określone różnymi sposobami, takimi jak technika testu scyntylacji zbliżeniowej, jak to opisano ogólnie w patencie USA nr 4,271,139, Hart i Greenwald, Mol. Immunol., 12:265-267 (1979) i Hart i Greenwald J. Nucl. Med. 20:1062-1065 (1979), załączone tu jako odnośniki.
Pokrótce, jeden z członków pary ligand ad/anty--lgand jest wiązany z podłożem stałym pośrednio albo bezpośrednio. Pośrednie wiązanie obejmuje przeciwciała monoklonalne, bezpośrednio związane z podłożem stałym, które swoiście rozpoznaje swoisty epitop na końcu C rozpuszczalnego białka łańcucha integryny β. Ten epitop powinien być albo białkiem hemaglutyniny albo epitopem mykobakterii IIIE9 (Anderson i in., J. Immunol., 141:607-613 (1988)). Czynnik fluorescencyjny jest również wiązany z podłożem. Alternatywnie czynnik fluorescencyjny może być integrowany z podłożem stałym, jak to opisano w patencie USA nr 4,568,649. Nie związany z podłożem składnik pary ligand ad/anty-ligand jest znakowany związkiem radioaktywnym, eMitującyM promieniowanie zdolne do wzbudzenia czynnika fluorescencyjnego. Kiedy ligand wiąże się ze znakowanym radioaktywnie anty-ligandem, znacznik jest wystarczająco przybliżany do związanego z podłożem czynnika fluorescencyjnego aby wzbudzić fluorescencję i spowodować emisję światła. Kiedy nie jest związany, znacznik jest ogólnie zbyt daleko od podłoża stałego aby wzbudzić czynnik fluorescencyjny i emisja światła jest słaba. Emitowane światło jest mierzone i korelowane z wiązaniem pomiędzy ligandem i anty-ligandem. Dodanie inhibitora wiązania do próbki powinno zmniejszyć emisję fluorescencji przez powstrzymywanie znacznika radioaktywnego od związania z podłożem. Stąd, inhibitory wiązania mogą być zidentyfikowane przez ich wpływ na emisję fluorescencji z próbek. Potencjalne anty-Ugandy ad mogą być również zidentyfikowane w podobny sposób.
Rozpuszczalne rekombinowane konstrukty ad/suwaka leucynowego CD 18 (patrz przykład 14) zastosowano do testu scyntylacji zbliżeniowej w celu przesiewania modulatorów wiązania CAM w poniższy sposób. Rekombinowaną integrynę unieruchomiono nie blokującym przeciwciałem przeciwko podjednostce a albo podjednostce β, uprzednio opłaszczonym na płytce pokrytej czynnikiem scyntylacyjnym. Związki z biblioteki chemicznej i swoistą biotynowaną chimerę CAM/Ig dodano równocześnie do płytki. Wiązanie chimery CAM/Ig wykrywano znakowaną streptawidyną. W tym teście, ICAM-l/Ig i ICAM-3/Ig są biotynowane NHS-Sulfo-biotyno LC (long chain, Pierce) według protokołu zalecanego przez producenta. Znakowane białka są wciąż zdolne do reakcji z przeciwciałem swoistym wobec CAM i można wykazać ich reakcję z unieruchomioną LFA-1 przez ELISA z wykrywaniem przez streptawidynę-HRP i wywoływanie OPD.
Alternatywnie, białko ^kombinowanego suwaka leucynowego jest oczyszczane, albo częściowo oczyszczane i opłaszczane bezpośrednio na płytce pokrytej scyntylatorem. Nie · znakowana chimera CAM/Ig i związki biblioteki chemicznej dodawane są równocześnie. Związaną CAM/Ig wykrywa się znakowanym 125I przeciwciałem przeciwko ludzkim Ig.
Jako jeszcze inna alternatywa, oczyszczone białko CAM/Ig jest unieruchamiane na płytce scyntylatora. Związki biblioteki chemicznej i stężony nadsącz z komórek ekspresjonujących integrynę o typie suwaka leucynowego dodaje się do płytki. Wiązanie rekombinowanej integryny wykrywa się znakowanym przeciwciałem nie blokującym podjednostki a albo β.
Przykład 14
Konstrukty ekspresyjne rozpuszczalnej ludzkiej ad
Ekspresja heterodimeiycznego, pełnej długości, rozpuszczalnego ludzkiego białka a<j/CD18 dostarcza łatwo oczyszczanego materiału do iMMunlzacji i testów wiązania. Zaletą wytwarzania białka rozpuszczalnego jest to, że może być ono oczyszczane raczej z nadsączu niż z lizatu komórek (jak w przypadku ad/CD18 pełnej długości, związanego z błoną) pozyskiwanie jest więc ułatwione i zmniejszona jest ilość zanieczyszczeń.
Plazmidy ekspresjonujące rozpuszczalną ad skonstruowano w poniższy sposób. Fragment nukleotydowy odpowiadający regionowi od zasady 0 do 3161 Identyfikatora Sekw. Nr 1 klonowanego w plazmidzie pATM.D12 izolowano przez trawienie HindIII i AatII. Fragment
187 013
PCR odpowiadający zasadom 3130 do 3390 w Identyfikatorze Sekw. Nr 1, nakładający się na fragment HindlU/Aatll i zawierający dodatkowe miejsce restrykcyjne Mlul na końcu 3', amplifikowano zpATM.D12 starterami sHAD.5 i s-HAD.3 podane podanymi odpowiednio w Identyfikatorze Sekw. Nr 30 i 31.
5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 30)
5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3’ (Identyfikator Sekw. Nr 31)
Produkt amplifikacji PCR trawiono AatII i Mlul i poddano ligacji z fragmentem HindlD/Aatn. Powstały produkt poddano ligacji z trawionym HindIII/Mlul plazmidem pCDI.s.
Ten konstrukt współekspresjonowano z rozpuszczalną CD 18 w stabilnie transfekowanych komórkach CHO i wykrywano ekspresję przez obrazowanie autoradiograf czne immunoprecypitowanych kompleksów CD 18 pochodzących z komórek znakowanych 35S-metioniną. Konstrukt był również ekspresjonowany z CD 18 w komórkach 293 (Berman i in., J. Celi. Biochem. 52:183-195 (1993)).
Stabilne konstrukty oj pełnej długości
Alternatywne konstrukty ekspresyjne oj są również uwzględniane przez wynalazek. W celu ułatwienia ekspresji i oczyszczania pełnego heterodimeru Od/CD18, plazmid ekspresyjny rozpuszczalnej oj i CD18 skonstruowano w taki sposób, że obejmował sekwencję fuzyjną „suwaka leucynowego”, która powinna stabilizować heterodimer podczas oczyszczania (Chang i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11408-11412 (1994)). Pokrótce, DNA kodujący ciągi kwasowe i zasadowe suwaka wytworzono przez łączenie starterów stosując oligonukleotydy opisane w Chang i in. Sekwencje DNA dalej zmodyfikowano tak, że obejmowały dodatkowe miejsca restrykcyjne Mlu i Xbal na końcach, odpowiednio, 5' i 3' DNA w celu ułatwienia klonowania do opisanych uprzednio konstruktów ekspresyjnych oj i CD18. Oprócz tego, dodano sekwencje odpowiadające białku hemaglutyniny albo sekwencje polihistydynowe, jak również kodon stop wprowadzony bezpośrednio po miejscu Xbal. Sekwencje hemaglutyniny albo polihistydyny włączono w celu ułatwienia oczyszczania przez powinowactwo ekspresjonowanego białka. Sekwencje kodujące ciąg zasadowy suwaka włączono do plazmidu ekspresjonującego CD18; ciąg kwasowy wprowadzono do konstruktu łańcucha a. Uważa się, że po ekspresji zmodyfikowanych białek oj i CD 18 w komórkach gospodarza oddziaływanie pomiędzy ciągami kwasowymi i zasadowymi struktury suwaka powinno stabilizować heterodimer i umożliwić izolowanie kompletnej cząsteczki aa/CD18 przez oczyszczanie przez powinowactwo.
Skonstruowano plazmidy do ekspresji rozpuszczalnej oj i CD18 z sekwencjami zasadowymi i kwasowymi „suwaka leucynowego” i tranfekowano do komórek CHO metodą DEAE/dekstran opisaną w przykładzie 7. Powstałe białko określano jako oj/CD18LZ. Transfekowane komórki hodowano przez 14 dni w warunkach zmniejszonego stężenia surowicy (2%). Nadsącze pobierane co pięć dni z transfekowanych komórek badano na wytwarzanie białka testem ELISA jak to opisano w przykładzie 8. Pokrótce, heterodimer oj/CD18LZ unieruchamiano na płytkach pokrytych przeciwciałem monoklonalnym 169B przeciwko oj (patrz, przykład 15), Kompleks oj/CD18LZ wykrywano przez dodanie biotynowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD18, TS1/18.1 (patrz, przykład 8), a następnie dodanie koniugatu streptawidyiWperoksydaza chrzanowa (HRP) oraz o-fenylodiaminy (OPD). Białko było łatwo wykrywalne w nadsączach.
Testy wiązania z użyciem produktów ekspresyjnych oj pełnej długości.
Testy wiązania funkcjonalnego zużyciem rozpuszczalnego heterodimeru O/CD18LZ pełnej długości opisane powyżej wykonano przez unieruchomienie heterodimeru na płytkach pokrytych przeciwciałem monoklonalnym 169B albo nie blokującym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD 18 (patrz, przykład 15). Studzienki zablokowano żelatyną ze skóry rybiej w celu zablokowania wiązania nieswoistego, po czym dodano chimer CAM/Ig (patrz, przykład 12) w stężeniu początkowym 10 pg/ml. Wiązanie chimer zadCD18 wykrywano koniugatem koziego przeciwciała przeciwko ludzkim Ig z HRP (Jackson Labs) i wywoływano OPD.
187 013
Obserwowano, że VCAM-1/Ig wiąże się z unieruchomionym ttj/CJD18 LZ 3-5-krotnie silniej niż z unieruchomionym CD11a/CD18. ICAM-1/Ig i ICAM-2/Ig wiązały rozpuszczalny heterodimer CD11a/CD18 odpowiednio, około 15- i 10-krotnie powyżej tła, ale nie wiązały aj/CD18. Wiązanie VCAM-1 było zmniejszone około 50% w obecności przeciwciał 130K i 130P, swoistych wobec VCAM-1, w kombinacji.
Test wiązania wykonywano również z białkami ICAM/Ig unieruchomionymi na płytkach 96-studzienkowych, po czym dodawano rekombinowanej rozpuszczalnej integryny w nadsączu komórkowym. Wiązanie rozpuszczalnych integryn wykrywano nie znakowanym, nie blokującym przeciwciałem mysim swoistym wobec podjednostki a albo β, a następnie inkubację z kozim przeciwciałem przeciw-mysim koniugowanym z HRP i wykrywano OPD. Wyniki wskazywały, że nie blokujące przeciwciało wykrywało wiązanie aj/CD18LZ z ICAMR/Ig 10-krotnie silniej, niż wiązanie wykrywane w kontrolnej studzience nie zawierającej przeciwciała. Wiązanie rozpuszczalnej aj/CD18 nie było wykrywane unieruchomioną ICAM1/Ig, jednakże wykrywano wiązanie pomiędzy aj/CD18 i unieruchomionym CD11b/CD18 i CD11a/CD18 z siłą, odpowiednio, 15- i 5-krotnie powyżej wiązania tła.
Ponieważ poprzednie badania wykazały, że CD11b iCD11c wiążą lipopolisacharyd (LPS) (Wright, Curr. Opin. Immunol., 3:83-90 (1991); Ingalls iGolenbock, J. Exp. Med. 181:1473-1479 (1995)), wiązanie LPS zaj/CD18 badano również stosując cytometrię przepływową. i testy płytkowe. Wyniki wskazywały, że LPS znakowany FITC izolowany z S. Minnesota i S. typhosa (uzyskane z Sigma) w stężeniu 20 pg/ml wiązały się słabo z komórkami CHO transferowanymi aj/CD18. Nie wykryto wiązania w nie transfekowanych komórkach CHO. W testach formatu ELISA, biotynowany LPS (Luk i in., Anal. Biochem., 232:217-224 (1995)) w stężeniu 0,5-3,0 pg wiązał unieruchomiony aj/CD18LZ z sygnałem 4-krotnie silniejszym niż samo przeciwciało i reagent blokujący. Widoczne wiązanie LPS zCD11a/CD18 obliczano przez odjęcie od każdego wyniku doświadczalnego wartości tła wiązania przeciwciała przeciwko CD11a, TS2/4.
W celu zidentyfikowania innych ligandów dla aj/CD18, rekombinowane białko aj/CD18LZ zastosowano w dwóch powiązanych badaniach. Wiązanie różnych rodzajów komórek z unieruchomionym białkiem zastosowano w celu określenia, które komórki ekspresjonują ligandy aj na powierzchni. Następnie stosowano zahamowanie przeciwciałami w celu określenia czy obserwowane wiązanie wynika z oddziaływania ze znanymi cząsteczkami adhezji powierzchniowej. Gdy nie wywołano zahamowania, stosowano współprecypitację aj/CD18LZ wiążącej białka z lizatów komórkowych komórek wiążących ad w celu identyfikacji liganda.
Konstrukty ekspresyjne rozpuszczalnej ludzkiej domeny I aj
Uprzednio opisano, że domena I w CD11a może być ekspresjonowana jako niezależna jednostka strukturalna, zachowująca zdolności wiązania ligandu i rozpoznawania przez przeciwciała (Randi i Hogg, J. Biol. Chem., 269:12395-12398 (1994); Zhout i in., J. Biol. Chem., 269:17075-17079 (1994); Michishita i in., Celi 72:857-867 (1993)). W celu wytworzenia białka fuzyjnego obejmującego domenę I aj i ludzką IgG4, domenę I aa amplifikowąno przez PCR przy użyciu starterów zaprojektowanych w taki sposób aby dodawały miejsca restrykcyjne BamHI i Xhol w celu ułatwienia klonowania. Startery te podano na Identyfikatorach Sekw. Nr 32 i 33 z podkreślonymi miejscami restrykcyjnymi.
5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 32)
5'-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 33)
Nukleotyd C bezpośredni 3' od miejsca BamHI w Identyfikatorze Sekw. Nr 32 odpowiadał nukleotydowi 435 w Identyfikatorze Sekw. Nr 1, nukleotyd G 3' od miejsca Xhol w Identyfikatorze Sekw, Nr 33 jest komplementarny do nukleotydu 1067 w Identyfikatorze Sekw. Nr 1. Amplifikowana domena I trawiona była odpowiednim enzymem, oczyszczany fragment poddawano ligacji do ssaczego wektora ekspresyjnego pDCs i ekspresyjnego wektora prokariotycznego pGEX-4T-3 (Pharmacia) po czym sekwencjonowano fragment domeny I.
187 013
Białko fuzyjne poddano następnie ekspresji w komórkach COS, CHO albo E. coli transfekowanych albo transformowanych odpowiednim konstruktem ekspresyjnym.
Uwzględniając powinowactwo aj do ICAM-R, ekspresja domeny I aj może mieć wystarczające powinowactwo aby być przydatnym inhibitorem adhezji komórkowej w której uczestniczy aj.
Analiza białek fuzyjnych ludzkiej domeny I ad!gG4
Białka rozdzielono przez SDS-PAGE w warunkach redukujących i nie redukujących i obrazowano barwieniem srebrem albo błękitem Coomassie. Następnie białka przenoszono na membrany PVDF Immobilion i poddawano analizie Western biot z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkim IgG albo przeciwciał monoklonalnych przeciwko bydlęcym Ig.
Wykrywane białko migrowało w warunkach nie redukujących z ciężarem cząsteczkowym równym około 120 kDa i około 45 kDa w warunkach redukujących. W warunkach nie redukujących wykrywano również mniejsze prążki wielkości około 40-50 kDa, które reagowały z przeciwciałami przeciw-ludzkimi ale nie przeciw-bydlęcymi. Mniejszy prążek wielkości 200 kDa określono metodą Western biot jako bydlęca Ig.
Testy wiązania z użyciem produktów ekspresji domeny I
Zdolność domeny I do swoistego rozpoznawania białka chimerycznego ICAM-R/IgG badano w formacie ELISA. Szeregowe rozcieńczenia białka fuzyjnego domeny I a<j/IgG4 (a<j/IgG4) wTBS inkubowano zlCAM-HgG, ICAM-R/IgG, VCAM-l/IgG albo obojętnym białkiem szpiczaka IgGl unieruchomionymi na płytkach Immulon IV RIA/EIA. Białko chimeryczne domeny I CD11a/IgG i białko szpiczaka ludzkiego IgG4/kappa zastosowano jako kontrolę negatywną. Związane IgG4 wykrywano biotynowanym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko IgG4, HP6023, po czym dodawano koniugat streptawidyny-peroksydazy i wywoływano o-fenylodiaminą.
W powtarzanych testach, nie wykryto wiązania białka CD11a/IgG4 albo białka szpiczaka IgG4 z jakimkolwiek z unieruchomionych białek. Białko I aj/IgG4 nie wiązało się z żelatyną skóry rybiej albo albuminą surowicy bydlęcej, zastosowanymi jako czynniki blokujące, ludzką IgGl albo ICAM-1/IgG. Wykryto 2-3-krotne wzmocnienie sygnału wiązania w stosunku do tła, w studzienkach pokrytych białkiem ICAM-R/IgG przy użyciu stężenia 1-5 pg/ml białka I a,j/IgG4. Sygnał w studzienkach pokrytych białkiem VCAM-l/IgG był 7-10-krotnie silniejszy niż tło. W poprzednich testach, komórki CHO transfekowane aj/CD18 nie wiązały białka VCAM-1/IgG, co sugeruje, że wiązanie VCAM-1 może być charakterystyczne dla izolowanych sekwencji aminokwas owych domeny I.
Dodatkowe konstrukty domeny I aj
Dodatkowe konstrukty domeny I aj wytworzono w ten sam sposób co poprzednie konstrukty, ale wbudowując więcej aminokwasów wokół domeny I aj. Konkretne konstrukty obejmowały: i) sekwencje egzonu 5 (aminokwasy 127-353 Identyfikatora Sekw. Nr 2), poprzedzając niniejszy konstrukt, ii) powtórzenia EF-hand (aminokwasy 17-603 Identyfikatora Sekw. Nr 2) po domenie I, i iii) łańcuch alfa okrojony przy domenie śródbłonowej (aminokwasy 17-1029 Identyfikatora Sekw. Nr 2) z końcówką IgG4 dla celów oczyszczania i wykrywania. Konstrukty te poddano ligacji do ekspresyjnego wektora ssaczego pDCSl albo prokariotycznego wektora ekspresyjnego pGEX-4T-3 (Pharmacia) i sekwencjonowano domenę I. Następnie białka fuzyjne ekspresjonowano w komórkach COS, CHO albo E. coli transformowanych albo transfekowanych odpowiednim konstruktem ekspresyjnym.
Białko oczyszczono na kolumnie ProSepA (Bioprocessing Ltd, Durham, England), badano na aktywność z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko IgG4, HP6023 i obrazowano na żelach poliakrylamidowych barwieniem Coomassie.
W celu konstruowania plazmidu ekspresyjnego dla całego polipeptydu aj, pATM.D12, opisany wyżej, zmodyfikowano w celu ekspresjonowania białka fuzyjnego aj-IgG4 następującym sposobem. DNA kodujący IgG4 izolowano z wektora pDCSl przez PCR stosując startery, które wbudowywały miejsce restrykcyjne 5', AatH (Identyfikator Sekw. Nr 89) i 3' Xbal (Identyfikator Sekw. Nr 90).
5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 89)
187 013
5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 90)
Plazmid pATM.D12 trawiono Aatn i Xbal i poddawano ligacji odpowiednio trawiony i oczyszczony produkt PCR IgG4.
Przykład 15
Wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec ludzkiej aj
A. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych
1. Przejściowo transfekowane komórki z przykładu 7 płukano trzykrotnie w roztworze soli buforowanym fosforanem Dulbecco (D-PBS) i wstrzykiwano w ilości 5x106 komórek/mysz myszom BALB/c z 50 gg/mysz muramylodipeptydu (Sigma) w PBS. Myszy nastrzykiwano dwukrotnie w ten sam sposób w odstępach dwutygodniowych. Surowice myszy przed i po immunizacji przesiewano analizą FACS jak to opisano w przykładzie 9 po czym, poddawano fuzji splenocyty myszy o najwyższej aktywności wobec komórek transfekowanych ad/CD18. Nadsącze komórek hybrydoma przesiewano osobno pod kątem braku reakcji wobec komórek COS transfekowanych CDlla/CD18 oraz reaktywności z komórkami współtransfekowanymi plazmidem ekspresyjnym ad i CDI8.
Sposób ten nie spowodował powstania przeciwciał monoklonalnych.
2. Jako alternatywa do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, rozpuszczalne białko fuzyjne domeny I Ud/IgG4 oczyszczono przez powinowactwo z nadsączy stabilnie transfekowanych komórek CHO i zastosowano do immunizacji myszy BALB/c jak to opisano wyżej. Hybrydoma ustalono i ich nadsącza badano przez ELISA na aktywność wobec białka fuzyjnego domeny I aa- Hodowle pozytywne analizowano następnie na aktywność z kompleksami ad/CD18 pełnej długości ekspresjonowanymi w transfektantach CHO.
Mysz 1908 otrzymała trzy immunizacje komórkami CHO transfekowanymi ad/CD18 i dwie kolejne rozpuszczalnym heterodimerem ad/CD18. Dwie końcowe immunizacje obejmowały 50 gg/mysz białka fiizyjnego domeny Iad/IgG4. Fuzja spowodowała wytworzenie 270 studzienek wytwarzających IgG. Nadsącze z 45 studzienek wykazywały co najmniej 7-krotnie wyższe wiązanie białka fuzyjnego Iaa/IgG4 niż ludzkiej IgG4 w teście ELISA. Żaden z nadsączy nie reagował z komórkami CHO transfekowanymi ad/CD18 jak stwierdzono analizą FACS.
W celu określenia czy nadsącz będzie zdolny do rozpoznawania białek podjednostki alfa integryny w innym kontekście, świeże mrożone skrawki śledziony znakowano nadsączami z 24 spośród 45 studzienek. Trzy nadsącza określono jako pozytywne: jeden znakował wielkie komórki w miazdze czerwonej, podczas gdy dwa inne znakowały komórki rozproszone w miazdze czerwonej i beleczkach.
Nadsącze te analizowano pod kątem ich zdolności do immunoprecypitacji biotynowanych kompleksów CD 18 komórek CHO transfekowanych ad/CD18 albo komórek HL-60 pobudzonych PMA. Studzienki fuzyjne z nadsączami, które rozpoznawały Iizaty detergentowe (które nie powinny być zniekształcone konformacyjnie jak białka ekspresjonowane jako heterodimery) wyselekcjonowano do dalszego klonowania. Przeciwciała monokłonalne, które rozpoznawały białko w detergencie mogą być bardziej przydatne do immunoprecypitacji kompleksów heterodimerycznych z transfektantów, tkanek i linii komórkowych.
3. Jako inna alternatywa wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, kompleksy CDI 8 immunoprecypitowano z lizatów splenocytów ludzkich przeciwciałem monoklonalnym 23F2G przeciwko CD 18, po sklarowaniu CDlla/CD18 (z użyciem przeciwciała TS2/4) i CDllb/Cdl8 (przeciwciałem Mo-1). Pięć myszy BALB/c, w wieku 10-12 tygodni, immunizowano podskórnie 30 gg powstałego białka w kompletnym adiuwancie Freunda w dniu 0, po czym dawką przypominającą 30 gg immunogenu/mysz w dniu 28 i 43 w niekompletnym adiuwancie Freunda. Surowice badane pobrano 10 dni po ostatniej dawce przypominającej i badano ich aktywność stosując rozcieńczenie 1:5000 każdej surowicy w celu wykrycia 1 gg/ścieżkę immunogenu w badaniu Western błot. Surowice od trzech myszy wykrywały prążki wielkości około 95 i 150 kDa; nie obserwowano sygnału w ścieżkach traktowanych rozcieńczeniem 1:50 surowic z przed immunizacji. Prążek 150 kDa stanowił prawdopodobnie ad w stanie glikozyłowanym in vivo. Oprócz tego, wszystkie surowice po immunizacji precypitowały białka z lizatów biotynowanych ad/CD18 komórek CHO, które migrowały
187 013 z odpowiednim ciężarem cząsteczkowym na SDS-PAGE reprezentując heterodimer. Na podstawie tych wyników, wybrano mysz #2212 i dalej immunizowano wstrzyknięciami dootrzewnowymi w dniu 64 30 μβ immunogenu w PBS. Mysz zabito w 4 dni później i sterylnie pobrano śledzionę.
Zawiesinę jednokomórkową wytworzono przez rozgniatanie śledziony pomiędzy dwoma MatowyMi szkiełkami Mikroskopowymi zanurzonymi w bezsurowiczej pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 jednostek/ml penicyliny 1100 pg/ml streptomycyny (RPMI) (Gibco, Kanada). Zawiesinę komórkową filtrowano przez sito komórkowe Nitex mesh 70 (Becton-Dickinson, Parsippany, New Jersey) i płukano filtrat dwukrotnie przez odwirowanie przy 200 g przez 5 minut. Powstały osad zawieszono w 20 ml bezsurowiczej RPMI. Komórki grasicy od trzech naiwnych myszy BALB/c wytworzono w podobny sposób.
Przed fuzją, komórki szpiczaka NS-1, utrzymywane w fazie wzrostu logarytmicznego w RPMI z 10% surowicą Fetal clone (FBS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) na trzy dni przed fuzją, odwirowano przy 200 g przez 5 minut, płukano dwukrotnie i liczono. Około 2xl08 splenocytów połączono z 4x107 komórek NS-1 i odwirowano powstałą mieszaninę przy 200 g. Nadsącz usunięto. Osad komórek rozluźniono przez stukanie probówką, po czy dodano 2 ml 50% pEg 1500 w 75 mM HEPES (pH 8,0, 37°C) (Boehringer Mannheim) w ciągu minuty mieszając. Dodatkowe 14 ml bezsurowiczej RPMI dodano w ciągu siedmiu minut, po czym dodano bezpośrednio 16 ml RPMI. Powstałą mieszaninę odwirowano przy 200 g przez 10 minut i usumęto nadsącz. Osad zawieszono w 200 ml RPMI zawierającej 115% FBS, 100 mM hipoksantyny sodu, 0,4 mM αMinoβterjny, 16 mM tymidyny (HAT; (Gibco), 25 jednostek/ml DL-6 (Boehringer Mannheim) i 1,5x106 komórek grasicy/ml, i rozdzielono do 10 płaskodennych płytek 96-studzienkowych (Commg, UK) po 200 μΐ/studzienkę. Komórki odżywiano w 2, 4 i 6 dni po fuzji, przez aspirację około 100pl igłą 18G (Becton-Dickinson) i dodanie 100 μl/studzlenkę pożywki opisanej powyżej, z takim wyjątkieM, że zawierała ona 10 jednostek/ml IL-6 i pozbawiona była tyMocytów.
W 7-10 dni po fuzji, nadsącz z każdej studzienki badano testem wychwytu przeciwciał ELISA, badając je na obecność przeciwciał IgG. Płytki Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, Massachussetts) pokryto 50 μg/studzienkę koziego przeciwciała przeciwko mysim IgA, IgG albo IgM (Organon Teknika) rozcieńczonego 1:5000 w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,6 w 4°C. Płytki płukano trzykrotnie PBS zawierającym 0,5% Tween-20 (PBST) i dodawano do każdej studzienki 50 μΐ nadsączu z każdej studzienki. Po inkubacji w 37°C przez 30 minut studzienki płukano PBST i dodawano po 50 μl peroksydazy chrzanowej sprzęgniętej z kozim przeciwciałem przeciwko mysim IgG(fc) (Jackson ImMunoresearch, West Grove, Pensylvania) rozcieńczonej 1:3500 w PBST. Płytki inkubowano jak wyżej, płukano czterokrotnie PBST i dodawano po 100 μl substratu, składającego się z 1 Mg/ml o-fenylenodiaminy (Sigma) i 0,1 μΡΜ! 30% H2O2 w 100 mM cytrynianie, pH 4,5. Reakcję barwną zatrzymywano po 5 minutach przez dodanie 50 μl 15% H2SO4. Absorbancję Mierzono w każdej studzience stosując czytnik płytek (Dynatech).
Hybrydomy dalej charakteryzowano w następujący sposób.
Nadsącze z hodowli wytwarzających IgG analizowano cytoMetrią przepływową na aktywność wobec komórek CHO transformowanych a<dCD18, ale nie komórek JY (linia limfocytów B pozytywna pod względem LFA-1, ale nie innych integiyn, co zaobserwowano w uprzednich doświadczeniach wewnętrznych). Pokrótce, 5x105 komórek CHO transformowanych ad/CD18 albo komórek JY ad/CD18' zawieszono w 50 μl RPMI zawierającej 2% FBS i 10 mM NaN3 (bufor FACS). Zawiesinę jednokomórkową dodano do 50 μl nadsączy hodowlanych komórek hybrydoma zawierających IgG w studzienkach okrągłodennych płytki 96-studzienkowej (CoMinig) Po 30-Minutowej inkubacji na lodzie, komórki płukano dwukrotnie przez odwirowanie w wirówce, nadsącz z każdej studzienki usunięto i zawieszono osad w 200-300 μl buforu FACS. Ostatnie płukanie zastąpiono 50 μl/studzienkę rozcieńczenia 1:100 fragmentu F(ab')2 owczego przeciwciała przeciwko mysim IgG (H+L) sprzęgniętego z FITC (Sigma) w buforze FACS. Po opisanej wyżej inkubacji, komórki płukano dwukrotnie w PBS Dulbecco (D-PBS) z dodatkiem 10 mM NaN3, a na koniec zawieszano w D-PBS
187 013 zawierającym 1% formalinę. Próbki przeniesiono do probówek polistyrenowych do analizy cytomet^ą przepływową (FACS) w urządzeniu FACScan Bscton-Dickins°n.
Fuzja dała cztery kultury pozytywne pod dla obu kryteriów. Gdy przesiewanie wtórne powtórzono na nadsączach po hodowli w około 4 dni później trzy z czterech kultur pozostały pozytywne. Trzy studzienki oznaczone 169A, 169B, 169D klonowano 2-3 razy przez rozcieńczanie w RPMI, 15% FBS, 100 mM Oip°ksantynis sodu, 16 mM tymidynie i 10 jednostkach/ml IL-6. Studzienki płytek z klonami oceniano optycznie po 4 dniach i zapisywano liczbę kolonii w najmniej gęstych studzienkach. Wybrane studzienki każdego klonowania badano przez FACS po 7-10 dniach. Aktywność stwierdzono w dwóch hodowlach, 169A i 169B. W końcowym klonowaniu studzienki pozytywne zawierające pojedyncze kolonie namnożono w RPMI z 11% FBS. Przeciwciało z nadsączy klonów 169A i 169B izotypowano stosując zestaw IsoStrip (Boeeuingsr Mannheim) według instrukcji producenta i stwierdzono, że są izotypu IgG.
Immunoprecypitacja kompleksów aj/CD18 z transfektantów CHO i komórek HL-60 pobudzonych PMA zastosowano do kolejnego przesiewania w kierunku swoistości. Hybrydomy 169A i 169B precypitowały odpowiednie prążki z komórek CHO, jak również stwierdzono przez SDS-PAGE pojedynczy rodzaj łańcucha a wielkości 150-160 kDa w komórkach HL-60. Hybrydomy 169A i 169'B zdeponowano 31 maja 1995 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rock^He, Maryland 20852 i przydzielono im numery, odpowiednio, HB 11907 i HB 11906.
W celu pełniejszej charakterystyki właściwości wiązania 169A i 169B badano zdolność obu przeciwciał do hamowania nawzajem swego wiązania oraz wiązania przeciwciała przeciwko CD 18, TS1/18.1 z rozpuszczalnym a<j/CD18. Rozpuszczalne aa/CD18 pełnej długości unieruchomiono każdym z n^eznakowanych przeciwciał w płytce 96-studzienkowej i stosowano biotynowane przeciwciało w celu wykrycia białka związanego przez to samo albo inne nieznakowane przeciwciało. Wykryto wiązanie przy użyciu koniugatu koziego przeciwciała przeciko mysim Ig i HRP, po dodaniu substratu OPD. Wyniki wskazywały, że przeciwciało 169A blokowało wiazanes biotynowanego 169A i TS 1/18.1, podczas gdy 169B blokowało tylko siebie.
4. Inną mysz (#2214) immunizowaną według tego samego protokołu co mysz #2212 wybrano do dalszej immunizacji przez dawkę przypominającą poprzedzającą fuzję, w dniu 70 przy użyciu 30 pg oczyszczonego ad z lizatów śledzionowych w PBS. Mysz zabito w cztery dni później i pobrano sterylnie śledzionę.
Fuzję i klonowanie komórek pozytywnych przeprowadzono jak to opisano wyżej. Fuzja spowodowała powstanie pięciu hybrydom monoklonalnych przeciwko ad oznaczonych 170D, 170F, 170E, 170X i 170H, które izotypowano jako IgGl stosując zestaw IsoStrip (Boshringer Mannheim) według instrukcji producenta.
5. Jeszcze dalszą, mysz, #2211, immunizowaną według tego samego protokołu co mysz #2212 i #2214, wybrano do dalszej immunizacji w dniu 88 przy użyciu 30 pg oczyszczonego ad z lizatów śledzionowych w PBS i przez dawkę przypominającą poprzedzającą fuzję, w dniu 203 przy użyciu 30 pg immunogenu. Mysz zabito w cztery dni później i pobrano sterylnie śledzionę po czym przeprowadzono fuzję i klonowanie komórek pozytywnych jak to opisano wyżej.
Nadsącze hybrydoma przesiewano przez ELISA wychwytujący przeciwciała i cytometrię przepływową jak to opisano wyżej.
Zidentyfikowano 15 klonów pozytywnych oznaczonych 188A, 188B, 188C, 188, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R i 188T i izotypowano testem ELISA. Pokrótce, płytki Immulon 4 (Dynatech) pokrywano w 4°C 50 pl/studzienkę koziego przeciwciała przeciwko mysim IgA, G, M (Organon Teknika) rozcieńczonego 1:5000 w 50 mM buforze węglanowym pH 9,0. Płytki blokowano przez 30 minut w 37°C 1% BSA w PBS, płukano trzykrotnie PBS/0,05% Tween-20 (PBST) i dodawano po 50 pl nadsączu hodowli (rozcieńczonego 1:10 w PBST). Po inkubacji i płukaniu, dodawano 50 μ1 koniugatu króliczego przeciwciała przeciwko mysim IgG], G2 albo G3 zperoksydazą chrzanową (Zymed, San Francisco, CA) rozcieńczonego 1:1000 w PBST z 1% normalną surowicą kozią.
187 013
Płytki inkubowano jak wyżej, płukano czterokrotnie w PBST, po czym dodano 100 μΐ substratu, składaj ącego się zl mg/ml o-fenylenodiaminy (Sigma) i 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 w 100 mM cytrynianie, pH 4,5. Reakcję barwną przerwano po 5 minutach przez dodanie 50 μΐ 15% H2SO4. A490 odczytywano na czytniku płytek (Dynatech) i stwierdzono, że wszystkie 15 przeciwciał jest IgG1.
Nadmiar splenocytów myszy #2211 zamrożono w probówkach mrożeniowych i przechowywano w płynnym azocie. Probówki odmrożono szybko przez umieszczenie w łaźni 37°C i poruszanie ruchami obrotowymi do roztopienia się zawartości. Komórki przeniesiono do 15 ml probówki i dodawano pomału ciepłą RPMI zawierającą 11% FBS. Następnie dodano kolejne 5 ml RPMI i pozostawiono na 5 minut, probówkę odwirowano przy 200 g przez 5 minut i usunięto nadsącz. Komórki zawieszono w RPMI i wykonano fuzję jak to opisano wyżej. Nadsącze hybrydoma przesiewano przez wychwyt przeciwciał i cytometrię przepływową jak to opisano wyżej.
Fuzja pozwoliła uzyskać pięć klonów 195A, 195C, 195D, 195E i 195H. Klony izotypowano procedurą ELISA jak to opisano wyżej; stwierdzono, że przeciwciała 195A, 195C, 195D, 195E są IgG1 zaś 195H jest IgG2.
6. W celu zidentyfikowania przeciwciał zdolnych do hamowania funkcjonalnego wiązania oj, do immunizacji zastosowano rozpuszczalną Od/CD18LZ (patrz, przykład 14). Białko izolowano przez chromatografię powinowactwa na żywicy z nadsączy przejściowo transfekowanych komórek COS i Od związaną z żywicą zastosowano jako immunogen. Immunizacja w ten sposób zapobiegała zmianom konformacji białka często związanej z lizą komórek detergentem. Dodatkowe myszy immunizowano rekombinowanym białkiem, również związanym z żywicą, ale nie immunizowano początkowo białkiem oczyszczonym z lizatu komórek.
Hybrydomy wytworzone w opisany wyżej sposób, powstałe na skutek immunizacji, przesiewano przez ELISA rekombinowanym białkiem unieruchomionym z nadsączy hodowli przy użyciu fragmentu Fab przeciwciała nie blokującego. Alternatywnie, stosowano cytometrię przepływową w celu zbadania aktywności wobec komórek JY uprzednio transfekowanych cDNA oj.
7. Jako inna alternatywa, przeciwciała monoklonalne wy tworzono w poniższy sposób. Białko heterodimeru aj/CD18 oczyszczone przez powinowactwo z lizatów detergentowych komórek CHO stabilnie transfekowanych zastosowano z 50 μg/ml dipeptydu muramylowego do immunizacji myszy BALB/c jak opisano wyżej. Myszy otrzymywały trzy immunizacje, po czym oznaczano aktywność surowic wobec O.//CD18 przez immunoprecypitację biotynowanych kompleksów w transfektantach CHO. Hybrydomy ze zwierząt pozytywnych ustalono standardowym protokołem, po czym hodowle hybrydoma wybrano przez cytometrię przepływową stosując transfektanty ^/CD18. Transfektanty CD11a/CD18 zastosowano w celu kontrolowania reaktywności wobec wyłącznie CD 18.
8. Jako dalsza alternatywa wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, myszy BALB/c poddawano protokołowi immunizacji/immunosupresji opracowanemu w celu zmniejszenia reaktywności wobec determinant komórek CHO na transfektantach stosowanych do immunizacji. Protokół ten obejmował immunizację nietransfekowanymi komórkami CHO, a następnie zniszczenie blastów limfocytów B swoistych wobec CHO traktowaniem cyklofosfamidem. Po trzech rundach immunizacji i traktowania cyklofosfamidem, myszy immunizowano komórkami CHO transfekowanymi Od/CD18 jak to opisano wyżej.
9. Jako jeszcze dalsza alternatywa, kompleksy CD18 z lizatów detergentowych komórek HL-60 pobudzanych PMA wzbogacano przez wstępne klarowanie jak to opisano wyżej. Inne integryny β2 klarowano na tych samych kolumnach. Immunizację powstałymi kompleksami, wytwarzanie hybrydom i protokół przesiewania wykonywano jak to opisano wyżej.
B. Wytwarzanie surowic poliklonalnych
Oczyszczoną chimerę domeny Iad/CD18 (przykład 14) zastosowano do wytworzenia poliklonalnych surowic odpornościowych u królików'. Antygen domeny Iad/CD18 wstrzyknięto po 100 μg/królika początkowo w kompletnym adiuwancie Freunda, a następnie w trzech dawkach przypominających tej samej ilości białka w niekompletnym adiuwancie Freunda. Próbki krwi badano po trzecim i czwartym wstrzyknięciu. Immunoglobuliny królika (Ig)
187 013 oczyszczano z surowicy na kolumnie sepharozy-białka A i klarowano na reaktywność z ludzką Ig na kolumnie Affigel 10/ludzkiej IgG. Reaktywność w ELISA wobec chimery domeny I, ale nie ludzkiej IgG wykorzystano w celu potwierdzenia całkowitego oczyszczenia.
Oczyszczone wstępnie surowice poliklonalne zastosowano do immunoprecypitacji białka z lizatów detergentowych powierzchniowo biotynowanych komórek CHO transfekowanych uprzednio wektorami ekspresjonującymi a<j i CD 18. Immunoprecypitację przeprowadzono metodą opisaną uprzednio w przykładzie 10. Wstępnie oczyszczone surowice rozpoznawały kompleks białka o tym samym ciężarze cząsteczkowym co precypitowane przeciwciałem przeciwko CDI8, TS1.18. Oprócz tego, surowice rozpoznawały pojedynczy prążek o odpowiedniej wielkości w analizie Western biot kompleksów CDI8 z komórek CHO transfekowanych ad/CD18. Oczyszczone przez powinowactwo integryny CDlla/CD18, CDIlb/CD18 i VLA4 ze splenocytów ludzkich nie były rozpoznawane przez królicze surowice poliklonalne. Surowice nie reagowały z komórkami CHO transfekowanymi ad w roztworze jak stwierdzono cytometrią przepływową. Wywnioskowano więc, że królicze surowice poliklonalne były zdolne do rozpoznawania zdenaturowanych białek domeny Iad/IgG4.
W celu wytworzenia poliklonalnych surowic odpornościowych przeciwko Od/CD18, myszy immunizowano trzykrotnie komórkami CHO transfekowanymi Od (D6.CHO, ad/CD18) zpeptydem adiuwantowym i raz oczyszczonym heterodimerem ad/CD18. Końcowa dawka obejmowała tylko heterodimer ad/CD18. Około 100 μΐ surowicy immunizowanej oczyszczono wstępnie przez dodanie około 10’ komórek CHO transfekowanych LFA-1 przez dwie godziny w 4°C. Powstałą surowicę badano na aktywność wobec ad w rozcieńczeniach 1/5000, 1/10000, 1/20000 i 1/40000 na normalnych śledzionach ludzkich. Przeciwciało poliklonalne reagowało w rozcieńczeniu 1/20000, zaś rozcieńczenie 1/40000 znakowało słabo.
Przykład 16
Analiza rozmieszczenia ad
Rozmieszczenie tkankowe ad/CD18 określano stosując poliklonalną surowicę odpornościową jak to opisano w przykładzie 15.
Oczyszczone poliklonalne przeciwciało królicze zastosowano w stężeniach pomiędzy 120 ng/ml i 60 pg/ml do analizy immunohistochemicznej skrawków mrożonych śledzion ludzkich. Skrawki o grubości 6 μ mocowano na szkiełkach Superfrost Plus (VWR) i przechowywano w-70°C. Przed użyciem, szkiełko wyjmowano z-70°C i umieszczano w55°C przez 5 minut. Następnie skrawki utrwalano zimnym acetonem przez 2 minuty i suszono na powietrzu. Skrawki blokowano w roztworze zawierającym 1% BSA, 30% normalną surowicę ludzką i 5% surowicę króliczą przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciało pierwotne nakraplano na każdy skrawek przez godzinę w temperaturze pokojowej. Niezwiązane przeciwciało usuwano przez płukanie skrawków trzykrotnie w buforze TBS przez 5 minut. Następnie, królicze przeciwciało przeciwko mysim IgG nakroplono na każdy skrawek w tym samym buforze TBS. Jako przeciwciało wtórne zastosowano układ mysiego przeciwciała przeciwko fosfatazie alkalicznej i fosfatazę alkaliczną (APAAP) inkubowany przez 30 minut. Skrawki następnie płukano 3-krotnie w buforze TBS. Następnie nałożono substrat Fast Blue (Vector) i zatrzymano reakcję barwną przez zanurzenie w wodzie. Skrawki podbarwiono Nuclear Fast Red (Sigma) i zanurzono w wodzie, po czym zatopiono w Aqua Mount (Baxter). Przy użyciu tego reagentu stwierdzono znakowanie w miazdze czerwonej śledziony, ale nie przy użyciu obojętnego przeciwciała króliczego albo nie oczyszczonej surowicy z przed immunizacji od tego samego zwierzęcia.
Gdy stwierdzono, że surowica mysia wykazuje aktywność wobec ad, zastosowano ją do znakowania różnych tkanek limfatycznych i nie limfatycznych. Przeciwciała monoklonalne rozpoznające CD 18, CDI la, CDllb iĆDllc zastosowano jako kontrolę w tym samym doświadczeniu. Znakowanie skrawków normalnej śledziony poliklonalną surowicą aj i przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD 18, CDI la, CDI lb i CDI lc dało następujące wyniki. Wzorzec obserwowany dla surowicy aj nie pokrywał się z wzorcem znakowania dla CDI8, CDI la, CDllb iCDllc. Występował inny wzorzec barwienia niektórych komórek strefy brzeżnej miazgi białej i komórek na zewnątrz od strefy brzeżnej. Wzorzec ten nie był obserwowany dla innych przeciwciał. Znakowały się również pojedyncze komórki rozsiane
187 013 w miazdze czerwonej, ale mogły to być komórki te same albo inne niż znakowane przeciwciałami przeciwko CD1 la i CD 18.
Znakowanie CDllc pokazało nieco komórek w strefie brzeżnej, ale przeciwciało nie wykazywało osobnego pierścieniowatego znakowania wokół miazgi białej w porównaniu z pclikloralną surowicą, ad, ani nie dawało takiego samego wzorca barwienia w miazdze czerwonej co surowica poligonalna ad.
Stąd, wzorzec znakowania obserwowany dla surowicy poliklonalnej ad był unikalny wśród przeciwciał wobec innych integryn β2 (CD1 la, CDllb, CDllc i CD 18) co wskazywało, że rozmieszczenie in vivo ad u człowieka jest różne od innych integryn β2.
Chara^t^^^i^^;yka ludzkiej ekspresji ad przy użyciu przeciwciał monoklonalnych
Przeciwciała wydzielane przez hybrydomy 169A i 169B zastosowano do analizowania ludzkiej ekspresji ad w mrożonych skrawkach tkanek i liniach komórkowych metodą immunchistocheMil i w leukocytach krwi obwodowej cytometrią przepływową. Nadsącze hybrydom zastosowane w obu zestawach doświadczeń pozostały nie rozcieńczone.
Barwienie tkanek
Wszystkie barwienia przeprowadzono jak wyżej, z wyjątkiem skrawków wątroby, które barwiono w następujący sposób. Po utrwaleniu acetonem skrawki unieczynniano 1% H2O2 i 1% azydkiem sodu w TBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po znakowaniu przeciwciałem pierwotnym, nakładano królicze przeciwciało przeciw-mysie sprzęgnięte bezpośrednio zperoksydazą na 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki płukano trzykrotnie w buforze TBS. Świńskie przeciwciało przeciwkrólicze sprzęgnięte bezpośrednio z peroksydazą nakładano w celu wykrycia przeciwciała wtórnego. Następnie, skrawki płukano trzykrotnie w buforze TBS i nakładano substrat AEC (Vector Labs) i umożliwiano reakcję barwną. Skrawki podbarwiano hematoksyliną Gili'a nr 2 (Sigma) a następnie płukano w wodzie, po czym odwadniano i zatapiano.
W skrawkach śledziony, większość ekspresji umiejscowiona była w śledzionowej miazdze czerwonej na komórkach zidentyfikowanych Morfologicznie jako g^^idocyty i Makrofagi. Wśród granulocytów barwiła się znaczna liczba, podczas gdy wyłącznie pewna populacja makrofagów dawała sygnał. Również niewielka liczba komórek dendrytycznych w miazdze białej słabo barwiła się przeciwciałami ad. Barwienie CDlla i CD18 wykrywano w miazdze czerwonej i białej. Barwienie CDllc było bardziej zaznaczone w dużych komórkach, prawdopodobnie makrofagach w śledzionowej miazdze białej i strefie brzeżnej otaczającej miazgę białą; obserwowano również rozsiane znakowanie w miazdze czerwonej. CD1 lb wydawał się mieć rozmieszczenie pokrywające się, ale nie identyczne ztij w miazdze czerwonej bez udziału miazgi białej.
Porównywano ekspresję integryny w normalnych i (reumatoidalnie) zmienionych tkankach maziowych. W normalnej tkance obserwowano minimalne znakowanie dla wszystkich przeciwciał przeciwko integrynom (w tym przeciwko CD1 la, CDllb, CDllc, CD18 jak również ad), z rozsianym rozmieszczenieM na rezydujących komórkach, prawdopodobnie makrofagach. W zmienionej zapalnie maziówce, ekspresja wszystkich integryn była bardziej zlokalizowana do komórek skupionych wokół naczyń limfatycznych. Podczas gdy wzorzec ekspresji ad i CDllb był podobny, CDllc nie wydawała się być silnie ekspresjonowana i ograniczała się do podtypu leukocytów.
U psa, ekspresję CDllb, ale nie ad obserwowano na Makrofagach wątrobowych albo komórkach Browicza-Kuppfera. Barwienie normalnych ludzkich skrawków wątroby (jak to opisano wcześniej w przypadku barwienia skrawków wątroby psa) potwierdziło zakonserwowanie tego wzorca ekspresji u ludzi. Oprócz tego, CDllc wykryto na niższym poziomie. W skrawkach od pacjentów z zapaleniem wątroby, wszystkie leukointegryny barwiły się znacznie silniej niż w wątrobie normalnej, podczas gdy ekspresja ad wykrywana była w tych próbkach na Makrofagach i granulocytach.
Przy użyciu przeciwciał przeciwko ad obserwowano Minimalne barwienie w skrawkach normalnej ludzkiej okrężnicy; obserwowano słabe barwienie mięśniówki gładkiej i leukocytów. Wszystkie leukointegryny wykrywano na wyższym poziomie w skrawkach od pacjentów z chorobą Crohn'a.
187 013
Normalne płuco wykazywało ograniczoną liczbę słabo aj pozytywnych komórek, zostały one określone morfologicznie jako makrofagi i neutrofile. W tkance płucnej pacjenta z rozedmą barwienie a<j obserwowano na neutrofilach i makrofagach zawierających hemosyderynę, pigment zawierający żelazo, wskazując na fagocytownie erytrocytów przez te komórki.
Skrawki normalnego mózgu i zmiany od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS) badano na ekspresję integryn. W normalnym mózgu, znakowanie ad było mniej intensywne niż CDI la, CDI lb i CDI lc oraz ograniczone do komórek określonych jako komórki mikrogleju morfologicznie i barwieniem CD68. Komórki CDllb-pozytywne położone były wokół naczyń i w obrębie tkanki. Komórki CDI lc+ wydawały się być położone w naczyniach, podczas gdy komórki ad+ otaczały naczynia. W skrawkach tkanek MS, ekspresję ad spotykano zarówno w komórkach mikrogleju jak i na podtypie leukocytów nie będących makrofagami; komórki ad + położone były w zmianach, jak również w korze. Sygnał ad był równie silny co CDI lc, ale słabszy niż CDI lb.
Skrawki tkanek aorty piersiowej i aorty brzusznej z PDAY (Pathobiological Determinanta of Atherosclerosis in Youth, LSU Medical Center) badano przeciwciałami przeciwko integrynom i CAM. Badane zmiany były zgodne z blaszkami miażdżycowymi zawierającymi agregaty komórek piankowatych pod błoną wewnętrzną (w większości makrofagów ze sfagocytowanymi lipidami) i naciekami małych leukocytów. Badania z pojedynczym znakowaniem przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi wobec ad i innych łańcuchów a integryn β2 (CDIla, CDllb, CDllc) oraz markerem makrofagów (CD68) wykazały, że większość makrofagów obładowanych lipidami ekspresjonowało umiarkowane ilości ad i makrofagów CDI 8, ekspresjonując CDI la i CDllc, odpowiednio, słabo i umiarkowanie. CDllb ulegała ekspresji jedynie słabo i tylko przez jeden podtyp makrofagów.
Badania z podwójnym znakowaniem przeprowadzono w celu stwierdzenia względnego rozmieszczenia antygenów ad i ICAM-R w skrawkach aorty. Ponieważ komórki piankowate barwiły się na tych skrawkach przeciwciałem Ham 56, swoistym dla makrofagów, ale nie przeciwciałami przeciwko aktynie mięśni, stwierdzono, że komórki piankowate nie pochodziły z komórek mięśniówki gładkiej pod błoną wewnętrzną. Makrofagi CD68-pozytywne ekspresjonujące ad otoczone były i porozdzielane przez małe leukocyty ICAM-R-dodatnie. Wydąje się, że istnieje ograniczona liczba małych leukocytów, które były 68-negatywne, ale barwiły się zarówno przeciwciałami przeciwko ad jak i ICAM-R.
Rozmieszczenie ad w tkankach normalnych wydawało się dotyczyć rezydujących leukocytów ze wzorcem nakładającym się, ale nie identycznym z CDI lb i CDI lc, dwoma innymi łańcuchami a leukointegryn, które uprzednio scharakteryzowano jako wykazujące ograniczone rozmieszczenie na leukocytach. Morfologia komórek wskazywała, że barwienie aj jest w większości ograniczone do makrofagów i granulocytów, z ograniczonym barwieniem limfocytów. Ogólnie, stan zapalny tkanki wydawał się zwiększać liczbę i różnorodność rodzajów leukocytów obserwowanych w konkretnej tkance, wraz ze zwiększeniem barwienia, w tym ad. Ponieważ komórkowe i przestrzenne rozmieszczenie leukointegryn nie było identyczne w tkankach patologicznych wywnioskowano, źe dla każdego członka rodziny istnieją różne funkcje i ligandy, w tym ad w specyficznym kontekście.
Co ciekawe, ekspresja ad we wczesnych zmianach miażdżycowych wydawała się bardziej nasilona niż CDllą CDllb i CDllc, wskazując, że ad może odgrywać kluczową rolę w powstawaniu tych zmian. Obserwowane rozmieszczenie komórek dodatnich pod względem ad i ICAM-R, poparte dowodami sugerującymi oddziaływanie pomiędzy ad i ICAM-R, wskazuje, że ad może mieć związek z rekrutacją leukocytów albo aktywacją na wczesnych etapach powstawania tych zmian.
Barwienie linii komórkowych i leukocytów krwi obwodowej
Przeciwciała 169A i 169B barwiły promielomonocytamą linię komórkową HL60, jak stwierdzono analizą FACS. Ekspresja powierzchniowa ad w tych komórkach jest zaburzona przez pobudzanie PMA, co powoduje, jak opisano, różnicowanie w kierunku makrofagów, ale nie jest zaburzone przez DMSO, który wywołuje różnicowanie w kierunku granulocytów (Collins i in., Blood 70:1233-1244 (1987)). Profile FACS 169A i 169B były odwrotne do uzyskanych z przeciwciałami anty-CDllb ianty-CDllc przy pobudzaniu PMA. Linia monocy32
187 013 tama, THP-1 wykazywała również słabe znakowanie 169A i 169B. Oprócz tego, podtyp komórek w bramkach limfocytów i monocytów w leukocytach krwi obwodowej wydawał się również słabo pozytywny. Podtyp monocytów krwi obwodowej znakował się słabo 169A i 169B, podczas gdy limfocyty B nie wykazywały powierzchniowej ekspresji aj. Podtyp CD8 + limfocytów T był aj. Oprócz tego, przeciwciała 169A i 169B nie wykrywały antygenu na liniach limfocytów B, JY, Ramos, linii bazofilów, KU812 i liniach limfocytów T, Jurkat, SKW i Molt 16.
W świetle wyników z komórkami HL-60, wyizolowano granulocyty krwi obwodowej przez wirowanie na gradiencie ficoll/hypaque, a następnie lizę erytrocytów. We wszystkich preparatach stwierdzono >90% PMN, jak zbadano obrazowaniem morfologii jąder w kwasie octowym. Osobne populacje pobudzano przez 30 minut 50 ng/ml PMA albo 10'8 M peptydu formylowego (fMLP) w celu uwolnienia potencjalnych wewnątrzkomórkowych zasobów integryn. Nie pobudzane populacje wykazywały słabą, ale znaczącą ekspresję antygenów 169A i 169B w stosunku do kontroli IgGl, z wykrywalnym zwiększeniem ekspresji obserwowanej po stymulacji. Poziomy ekspresji powierzchniowej aj i CD11c na PMN były podobne do obserwowanych na komórkach hL-60. Przeciwciało 169B zastosowano do precypitacji heterodimerycznej cząsteczki z lizatów detergentowych biotynowanych PMN o wielkości podjednostki rzędu 150 i 95 kDa dla, odpowiednio ad i CD18,
Obecność ad na PMN nie mogła być wywnioskowana z informacji znanych dla ekspresji aj u psów. Neutrofile psa, w przeciwieństwie do ich odpowiedników u ludzi, ekspresjonują marker CD4 limfocytów T jak również integrynę VLA-4 a więc mogą mieć różne ligandy i funkcje u psów w porównaniu z ludźmi.
Znakowanie podgrup PBL
Niniejsze badanie podjęto w celu określenia rozmieszczenia integryny β2 na leukocytach krwi obwodowej człowieka. Oprócz tego, porównano gęstość powierzchniową aj w stosunku do innych integryn β2- Na koniec, badano ostrą regulację ekspresji aj w oczyszczonych ludzkich eozynofilach.
Ludzkie leukocyty krwi obwodowej rozdzielono przez wirowanie na gradiencie na frakcje komórek jednojądrzastych (zawierającą monocyty, limfocyty i bazofile) i granulocyty (neutrofile i eozynofile) (Warner i in., J. Immunol. Meth., 105:107-110 (1987)). Do niektórych doświadczeń, eozynofile oczyszczano stosując selekcję immunomagnetyczną CD 16, do czystości wyższej niż 95% (Hensel i in., J. Immunol. Meth., 122:97-103 (1989)). Komórki tuczne skóry uwolniono enzymatycznie ze skóry i zagęszczono jak to opisano wcześniej (Lawrence i in., J. Immunol., 139:3061-3069 (1987)).
Komórki znakowano odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciała monoklonalnego swoistego wobec CD11a (MHM24), CD11b (H5A4), CD11c (BU-15) albo aj (169A). Zastosowano również kontrolne IgG1. Komórki płukano, po czym inkubowano z nadmiarem przeciwciał mysich i znakowanego FITC mysiego przeciwciał monoklonalnego albo koziego poliklonalnego swoitego wobec poszczególnych komórek (np. CD3, CD4 albo CD8 dla limfocytów T; CD16 dla komórek NK; anty-IgE dla bazofilów (Bochner i in., J. Immunol. Meth., 125:265-271 (1989)). Próbki badano cytometrią przepływową (Coulter EpICS Profile) stosując odpowiednie bramkowanie w celu zidentyfikowania komórek.
Do badań z ludzkimi eozynofilami, w których badano ostrą regulację dodatnią ekspresji aj, komórki pobudzano przez 15 minut w37°C estrem forbolu (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) (Schall i in., Cytokine 3:165-183 (1991)), albo IL-5 (10 ng/ml) przed znakowaniem różnymi przeciwciałami monoklonalnymi.
Wyniki pokazały, że aj była obecna na wszystkich eozynofilach, bazofilach, neutrofilach, monocytach i komórkach NK krwi obwodowej. Mały podtyp (około 30%) limfocytów CD8 + również ekspresjonował aj. Komórki tuczne skóry i limgocyty CD4+ nie ekspresjonowały aj. Ogólnie, CD11a i CD11b obecne są w większej gęstości na leukocytach niż aj, przy czym ta druga jest ekspresjonowana we względnie małych ilościach podobnych do CD11c. Wśród leukocytów, monocytów i komórek CD8 + miały one największą gęstość ad, podczas gdy eozynofile miały najniższy poziom ekspresji aj. Ekspresja na neutrofilach, bazofilach i komórkach NK była pośrednia.
187 013
Pobudzanie eozynofilów obwodowych chemokiną CC RANTES nie powodowało zmian ekspresji żadnej z integryn β2. Działanie estrem forbolu jednakże powodowało dwukrotne zwiększenie ekspresji CDllb i aj, ale nie wpływało na ekspresję CDI la albo CDllc. Traktowanie EL-5 powodowało wybiórczą regulację dodatnią ekspresji CDI lb bez wpływu na poziomy innych podjednostek integryny.
Podsumowując, wyniki te wskazują, że na leukocytach krwi obwodowej aa ulega ekspresji w ilości porównywalnej z CDI lc. Najwyższe poziomy ekspresji stwierdzono na monocytach i podtypie limfocytów CD8+. Komórki tuczne skóry nie ekspresjonowały a<|. Oczyszczone eozynofile wydawały się zawierać wewnątrzkomórkowe zasoby CDI lc i aj. Jednakże, różna regulacja dodatnia wykazana przez IL-5 względem PMA sugeruje, że te zasoby są oddzielone od siebie.
Określono również wzorzec barwienia dla podgrup leukocytów krwi obwodowej (PBL) stosując połączenie bramkowania i markerów powierzchniowych, jak to opisano wyżej, w celu bardziej precyzyjnego określenia grup limfocytów 169 A/B-ujemnych. PBL izolowano na Ficollu jak to opisano wcześniej i barwiono osobno 169A, 169B i przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD 14 (markem monocytów/makrofagów), CD20 (limfocyty B), CD56 (NK), receptor limfocytów T α/β (limfocyty T), CD 16 (neutrofile) i a4 (marker negatywny neutrofilów). Bramki określono wielkością i rozmieszczeniem znacznika.
Wyniki wskazywały, że komórki w bramce monocytów CD14+ wykazywały niski poziom znakowania 169A i 169B. Dwoisty wzorzec ekspresji obserwowany we wcześniejszych doświadczeniach w bramce limfocytów, rozwikłano przez wzmocnienie rozpraszania na wprost. Mieszana populacja TCR+/CD20+ wydawała się wykazywać niski, ale homogenny poziom ekspresji 169A/B, podczas gdy populacja mapowana przy nieco wyższym rozproszeniu bocznym (złożoność komórkowa), która w 50% znakowała się pozytywnie na CD56, wydawała się być populacją negatywną pod względem 169A/B. Negatywna populacja była również rozpoznawana przez przeciwciała przeciwko TCR, CD20, CD 14 i CD 16.
Rozmieszczenie aa w maziówce
W celu określenia rozmieszczenia komórkowego a<j, innych integryn β2 i ich odpowiednich receptorów w maziówce normalnej i zmienionej zapalnie, zastosowano przeciwciała monoklonalne przeciwko różnym integrynom β2 i nadrodzinom genów immunoglobulinowych w badaniach immunohistochemicznych. Ekspresję białka określano w próbkach maziówki normalnej, zmienionej artretycznie i reumatycznie.
Wyniki pokazały, że warstwa komórek wyściółki maziowej ekspresj ono wała wysoki poziom VCAM-1, CDI lb/CD18 i aa/CD18. W tych komórkach, ekspresja CDI lc/CD18 była ograniczona zaś ekspresji CDlla/CD18 nie było wogóle. W reumatoidalnym zapaleniu maziówki, ekspresja integryn β2 w warstwie komórek maziówki zwiększa się proporcjonalnie do stopnia hiperplazji. Odsetek komórek, które ekspresjonują CDllc zwiększa się znacząco, zbliżając się do poziomu CDI lb i aj, ale nie zwiększa się dla ekspresji CDI la.
W obszarach ^odwyściółkowych tkanki, agregaty i rozsiane nacieki limfocytów CD3/CD1 la/ICAM-I< pooddzielane są makrofagami CD68/CD1 lb/a/. Znaczna liczba agregatów wykazuje intensywne barwienie a<j, zwłaszcza w obszarach bogatych w limfocyty T.
Śródbłonek maziówki zmiennie ekspresjonuje ICAM-1 i ICAM-2 z minimalnym dowodem ekspresji ICAM-R.
Podsumowując, wyniki wskazują, że maziówkowe makrofagi i komórki makrofagopodobne konstytutywnie ekspresjonują wysokie poziomy integryn β2, CDllb i aj. W zapaleniu maziówki, występuje ekspansja tego podtypu komórek w obszarach wyściółki i pod wyściółką, wraz z wyraźnym zwiększeniem ekspresji CDllc. Pewna populacja reumatycznych maziówkowych limfocytów T oprócz ekspresji CDI la i ICAM-R, ekspresjonuje również wysoki poziom aa, przy czym ta ostatnia cząsteczka ekspresj ono wana jest w słabym stopniu przez limfocyty krwi obwodowej.
187 013
Przykład 17
Izolowanie klonów cDNA szczura
W świetle występowania podjednostek psiej i ludzkiej a/, dokonano próby izolowania genów homologicznych innych gatunków, w tym szczura (ten przykład) i myszy (przykład 17, wyżej).
Częściową sekwencję szczurzego cDNA wykazującego homologię z ludzkim genem a/ uzyskano z biblioteki Xgt10 śledziony szczura' (Clontech). Bibliotekę wysiano w gęstości 2x104 pfu/płytkę na płytki 150 mm zagarem/kBM. Bibliotekę odciśnięto na membranach Hybond (Amersham), denaturowano przez 3 minuty, neutralizowano 3 minuty i płukano 5 minut buforami jak to opisano w standardowym protokole (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual str 2.110). Membrany umieszczono w urządzeniu Stratalinker (Stratagene) i sieciowano DNA stosując ustawienia automatyczne. Membrany prehybrydyzowano i hybiydyzowa.no z 30% i 50% formamidem, odpowiednio, dla niskiej i wysokiej surowości. Membrany przesiewano początkowo sondą znakowaną r, wytworzoną z cDNA ludzkiego oj, odpowiadającego zasadom 500-2100 w klonie 19A2 (Identyfikator Sekw. Nr 1). Sondę znakowano stosując zestaw Random Prime Kit (Boehringer Mannheim). Filtry płukano w 2xSSC w 55°C.
Zidentyfikowano dwa klony oznaczone 648.3 i 705.1, które wykazywały homologię sekwencji z ludzka oj, ludzką CD11b i ludzką CD11c. Oba klony odpowiadały ludzkiemu genowi aj w regionie 3' genu, począwszy od zasady 1871 i ciągnąc się do zasady 3012 dla klonu 684.3 i zasady 1551 do 3367 dla klonu 705.1.
W celu izolowania kompletnej sekwencji szczurzej, która obejmowałaby region 5', ta sama biblioteka była ponownie przesiewana przy użyciu tego samego protokołu co zastosowany do początkowego przesiewania, ale zużyciem sondy mysiej wytworzonej z klonu Al 160 (patrz przykład 17, wyżej). Z drugiego przesiewania wyselekcjonowano pojedyncze łysinki, które hodowano jako pojedyncze klony na płytkach agar/LBM. W celu uzyskania DNA do sekwencjonowania zastosowano startery do sekwencjonowania 434FL i 434FR (Identyfikator Sekw. Nr 34 i 35) w standardowym protokole PCR.
5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 34)
5'-T(^.AAG^T^GGG^^T4AAATAACAGA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 35)
DNA z PCR oczyszczono stosując kolumnę Quick Spin (Qiagen) według protokołu producenta.
Zidentyfikowano dwa klony, oznaczone 741.4 i 741.11, nakładające się na klony 684.3 i 705.1; w regionach nakładających się klony 741.1 i 741.11 były w 100% homologiczne z klonami 684.3 i 705.1. Złożony cDNA szczura posiadający homologię z ludzkim genem oj pokazany jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 36; przewidywana sekwencja aminokwasowa podana jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 37.
Klonowanie końca 5' szczurzej aj
Fragment 5' cDNA dla szczurzego genu O/ uzyskano stosując zestaw do klonowania RACE śledziony szczura Clontech według protokołu producenta. Oligonukleotydy swoiste wobec genu miały oznaczenia 741.11#2R i 741.2#1R (Identyfikator Sekw. Nr 59 i 58).
5'-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3i (Identyfikator Sekw. Nr 59)
5'-GGCCTTCiCAGCTGGACAATG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 58)
Oligonukleotyd 741.11 #2R obejmował zasady 131-152 Identyfikatora Sekw. Nr 36, w odwrotnej orientacji, zaś 741.2# IR obejmował zasady 696-715 w Identyfikatorze Sekw. Nr 36, również w odwrotnej orientacji. Pierwszą PCR przeprowadzono stosując oligonukleotyd najbardziej 3' 741.2#IR. Drugą PCR wykonano z użyciem 741.11#2R i DNA wytworzonego w pierwszej PCR.
Na 1% żelu agarozowym wykryto prążek wielkości około 300 bp. Produkt drugiej PCR poddano ligacji do plazmidu pCRTAII (Invitrogen) według protokołu producenta. Pobrano białe (pozytywne) kolonie i dodano do 100 μΐ LBM zawierającej 1 μΐ roztworu kar^^^^^yliny 50 mg/ml i 1 μΐ hodowli faga M13 K07 w pojedynczych studzienkach okrągłodennej płytki 96-studzienkowej. Mieszaninę inkubowano w37°C przez 30 minut. Po inkubacji dodano
187 013
100 μΐ LBM (zawierającej 1 μΐ 50 mg/ml karbenicyliny i rozcieńczenie 1:250 10 mg/ml kanamycyny) i prowadzono inkubację przez noc w 37°C.
Stosując sterylny 96-studzienkowy metalowy stempel, nadsącza z płytki 96-studzienkowej przenoszono na cztery filtry nylonowe Hybond. Filtry denaturowano, neutralizowano i sieciowano standardowymi protokołami. Filtry prehybrydyzowano w 20 ml buforu prehybrydyzacyjnego (5xSSPE, 5x Denhardt, 1% SDS, 50 pg/ml zdenaturowanego DNA spermy łosia) w 50°C przez kilka godzin z wytrząsaniem.
Sondy oligonukleotydowe 741.11#1 i 741.11#1R (Identyfikator Sekw. Nr 56 i 57) obejmujące zasady 86-105 (Identyfikator Sekw. Nr 36) odpowiednio w orientacji naprzód i wstecz znakowano w poniższy sposób.
5'-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 56)
5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 57)
Około 65 ng oligonukleotydowego DNA w 12 μΐ dlhO ogrzewano do 65°C przez dwie minuty. 3 μΐ 10 mCi/ml γ-32Ρ-ΑΤΡ dodano do probówki wraz z 4 μΐ 5x buforu kinazy (Gibco) i 1 μΐ kinazy DNA T4 (Gibco). Mieszaninę inkubowano w 37°C przez 30 minut. Po inkubacji, dodano po 16 μΐ każdej ze znakowanych sond oligonukleotydowych do buforu prehybrydyzacyjnego i prowadzono hybrydyzację przez noc w 42°C. Filtry płukano trzykrotnie w 5xSSPE, 0,1% SDS przez 5 minut w temperaturze pokojowej i poddawano autoradiografii przez 6 godzin. Klony pozytywne namnażano i oczyszczano DNA stosując Zestaw Magie Mini Prep (Promega). Klon 2F7 wyselekcjonowano do sekwencj ono wania i wykazano 100% homologii z klonem 741.11 w regionach nakładających się. Kompletną sekwencję kwasu nukleinowego pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 54; sekwencja aminokwasowa pokazana jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 55.
Charakterystyka szczurzych sekwencji cDNA i aminokwasowej
Nie opisywano uprzednio sekwencji aminokwasowej ani kwasu nukleinowego dla szczurzej podjednostki a integryn fty Jednakże porównanie sekwencji z opisaną podjednostką a integryn β2 wskazuje, że izolowany szczurzy klon i jego przewidywana sekwencja aminokwasowa jest blisko spokrewniona z sekwencją nukleotydową i aminokwasową a<|.
Na poziomie kwasu nukleinowego, izolowany szczurzy klon cDNA wykazuje 80% identyczności z cDNA ludzkiej <x,j; 68% identyczności z ludzką CDllb; 70% identyczności z ludzką CDllc i 65% identyczności z mysią CDllb. Nie stwierdzono istotnej homologii z ludzką CDI la i mysią CDI la. Na poziomie aminokwasowym, przewidywany polipeptyd szczurzy kodowany przez izolowany cDNA wykazuje 70% identyczności z ludzkim polipeptydem α<ι; 28% identyczności z ludzką CDI la; 58% identyczności z ludzką CDllb; 61% z ludzką CDI lc; 28% z mysią CDI la i 55% z mysią CDI lb.
Przykład 18
Wytwarzanie i charakterystyka przeciwciał przeciwko α<ι gryzoni
A. Przeciwciała przeciwko białku fuzyjnemu szczurzej domeny I oj/ludzkiej IgG4. W świetle faktu, że domena I ludzkich integryn β2 uczestniczy w wiązaniu liganda, założono, że powinno być to prawdą również dla szczurzego białka a<|. Przeciwciała monoklonalne swoiste wobec szczurzej domeny Iaj mogą być więc przydatne w szczurzych modelach chorób ludzkich w których udział bierze wiązanie aa.
Oligonukleotydy „rat alpha-DI5” (Identyfikator Sekw. Nr 87) i „rat alpha-DI3” (Identyfikator Sekw. Nr 88) opracowano na podstawie sekwencji szczurzej Od odpowiadającej zasadom 469-493 i 1101-1125 (w orientacji odwrotnej) Identyfikatora Sekw. Nr 54. Oligonukleotydy zastosowano w standardowej reakcji PCR w celu wytworzenia fragmentu DNA szczura zawierającego domenę I obejmującą zasady 459-1125 w Identyfikatorze Sekw. Nr 54. Produkt PCR poddano ligacji do wektora pCRTAII (Invitrogen). Wyselekcjonowano klon pozytywny i namnożono do oczyszczenia stosując zestaw Midi Prep (Qiagen). DNA trawiono Xhol i Bglll w standardowych reakcjach trawienia, po czym oczyszczono na żelu prążek wielkości 600 bp, który następnie ligowano do wektora ekspresyjnego pDCSl/HuIgG4. Wyselekcjonowano kolonię pozytywną, namnożono i oczyszczono DNA stosując zestaw Maxi Prep Qiagen.
Komórki COS wysiano w półzlewności na szalkach 100 mm i hodowano przez noc w 37°C w 7% CO2. Komórki płukano w 5 ml DMEM. Do 5 ml DMEM dodano 50 μΐ dek36
187 013 stranu/DEAE, 2 μΐ chlorochiny i 15 pg DNA szczurzej domeny I a<j/HuIgG4, otrzymanego jak wyżej. Mieszaninę dodano do komórek COS i inkubowano w 37°C przez 3 godziny. Pożywkę usunięto i dodano 5 ml 10% DMSO w CMF-PBS na dokładnie 1 minutę. Komórki przepłukano delikatnie DMEM. Dodano 10 ml DMEM zawierającej 10% FBS i prowadzono inkubację przez noc w 37°C w 7% CO2. Następnego dnia pożywkę zastąpiono świeżą pożywką i prowadzono inkubację przez następne trzy dni. Po trzech dniach pożywkę pobrano ponownie i usunięto płytki. Procedurę powtarzano do momentu żebrania 2 litrów nadsączu.
Zebrany nadsącz wprowadzono do kolumny ProSep-A (Bioprocessing Ltd) i oczyszczono białko jak to opisano.
Kolumnę początkowo płukano 15 objętościami buforu do płukania zawierającego 35 mM Tris i 150 mM NaCl, pH 7,5. Nadsącz wprowadzono powoli w tempie 60 objętości kolumny na godzinę. Po załadowaniu, kolumnę płukano 15 objętościami buforu do płukania, 15 objętościami 0,55 M dietanoloaminy, pH 8,5 i 15 objętościami 50 mM kwasu cytrynowego, pH 5,0. Białko eluowano 50 mM kwasem cytrynowym, pH 3,0. Białko neutralizowano 1,0 M Tris, pH 8,0 i dializowano w sterylnym PBS.
Białko domeny I szczurzej aj analizowano jak to opisano w przykładzie 14. Wykryte białko migrowało w podobny sposób co obserwowany dla ludzkiej domeny I.
B. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko białkom fuzyjnym szczurzej domeny I ad/HuIgG4.
Myszy immunizowano pojedynczo 50 pg oczyszczonym białkiem fuzyjnym szczurzej domeny I a<|/HuIgG4 emulgowanej uprzednio w równej objętości kompletnego adiuwantu Freunda (FCA) (Sigma). Około 200 μΐ preparatu białko/adiuwant wstrzyknięto w 4 miejsca w grzbiet i boki każdej z myszy. Dwa tygodnie później myszom podano dawkę przypominającą 100 μΐ antygenu szczurzej domeny I a<|/HuIgG4 (50 pg/mysz) emulgowanego uprzednio w równej objętości kompletnego adiuwantu Freunda. Po dodatkowych dwóch tygodniach myszom podawano 50 pg antygenu w 200 pl PBS wstrzykniętego dożylnie.
W celu badania mian surowicy immunizowanych myszy, skrwawiano je ze splotu zagałkowego, 10 dni po trzeciej immunizacji. Surowice izolowano ze skrzepniętej krwi przez odwirowanie. Surowicę zastosowano do immunoprecypitacji biotynowanych (BIP) szczurzych splenocytów. Surowica od każdej z myszy immunoprecypitowała prążek białka o oczekiwanej wielkość cząsteczkowej dla szczurzej ad i CDI 8. Jedną z myszy wybrano do fuzji i podawano jej dawkę przypominającą po raz czwarty.
Nadsącze hybrydoma przesiewano w kierunku wychwytu przeciwciał jak to opisano poniżej. Płytki Immulon 4 (Dynatech) pokryto 50 pg/studzienkę koziego przeciwciała przeciwko mysim IgA, IgG albo IgM (Organon Teknika) rozcieńczonego 1:5000 w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,6 w4°C. Płytki płukano trzykrotnie PBS zawierającym 0,5% Tween-20 (PBST) i dodawano do każdej studzienki 50 pl nadsączu z każdej studzienki. Po inkubacji w 37°Ć przez 30 minut studzienki płukano PBST i dodawano po 50 pl peroksydazy chrzanowej sprzęgniętej z kozim przeciwciałem przeciwko mysim IgG(fc) (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pensylvania) rozcieńczonej 1:3500 w PBST. Płytki inkubowano jak wyżej, płukano czterokrotnie PBST i dodawano po 100 pl substratu, składającego się z 1 mg/ml o-fenylenodiaminy (Sigma) i 0,1 pl/ml 30% H2O2 w 100 mM cytrynianie, pH 4,5. Reakcję barwną zatrzymywano po 5 minutach przez dodanie 50 pl 15% H2SO4. Absorbancję mierzono w każdej studzience stosując czytnik płytek (Dynatech).
Hybrydomy dalej charakteryzowano w teście ELISA z unieruchomionym białkiem fuzyjnym szczurzej domeny o ad/HuIgG4. ELISA z płytką opłaszczoną ludzką IgG4 służyła jako kontrola aktywności wobec składnika IgG fuzji. Studzienki pozytywne wybrano do dalszego przesiewania przez BIP na lizatach szczurzych splenocytów przy użyciu technik opisanych niżej.
C. Wytwarzanie surowic poliklonalnych przeciwko białku fuzyjnemu szczurzej domeny I aj/HuIgG.
Dwa króliki skrwawiono przed immunizacją 100 pg oczyszczonego białka fuzyjnego szczurzej domeny I aa/IgG4 w kompletnym adiuwancie Freunda. Wstrzyknięcia powtarzano w tej samej dawce co trzy tygodnie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Po trzech
187 013 wstrzyknięciach króliki skrwawiano i pobrane surowice wykorzystywano w standardowej immunoprecypitacji z lizatami szczurzych splenocytów. Określono, że surowice od obu królików reagowały ze szczurzą ad. Królikom podano dawkę przypominającą 100 pg antygenu w IFA i badano pobrane surowice na zwiększenie aktywności wobec szczurzej ad przez immunoprecypitację. Zwierzętom podano końcową dawkę przypominającą i skrwawiono 10 dni później pobierając surowicę.
Histologia szczurzej ad
Królicze surowice poliklonalne wytworzone przeciwko szczurzej domenie I ad zastosowano w barwieniu immunohistochemicznym skrawków tkanek szczura techniką opisaną w przykładzie 16. Wzorzec barwienia wykrywany na mrożonych i parafinowych skrawkach śledziony szczura był zasadniczo taki sam jak obserwowany z przeciwciałami przeciwko ludzkiej ad, ze znakowaniem pojedynczych komórek w miazdze czerwonej. Wzorzec znakowania różnił się od obserwowanego z przeciwciałami przeciwko szczurzym CDlla, CDllb i CDI 8. Oprócz tego, obserwowano pozytywny wzorzec znakowania w grasicy, z pojedynczymi komórkami w korze. Żadna z tych tkanek nie dawała znakowania z surowicami z przed immunizacji.
D. Analiza swoistości przeciwciał
Szczury zabijano przez uduszenie w CO2 i pobierano śledziony aseptycznie. Splenocyty zbierano przez delikatne przecieranie śledzion przez druciane sito tłoczkiem strzykawki 3 cc w 20 ml RPMI. Komórki zbierano do 50 ml probówki stożkowej i płukano odpowiednim buforem.
• . «89
Komórki płukano trzykrotnie w zimnym D-PBS i zawieszano w gęstości 10-10 w 40 ml PBS. Do zawiesiny komórek dodawano 4 mg NHS-Biotyny (Pierce) i prowadzono reakcję przez dokładnie 15 minut w temperaturze pokojowej. Komórki żwirowano i płukano trzykrotnie zimnym PBS.
Komórki zawieszono w gęstości 108 komórek/ml w zimnym buforze do lizy (1% NP.-40; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCł; 2 mM MgCl; 1:100 roztworu pepstatyny, leupeptyny i aprotyniny, dodanego bezpośrednio przed dodaniem do komórek; i 0,0001 g krystalicznego PMSF dodanego bezpośrednio przed dodaniem do komórek). Lizaty wytrząsano przez około 30 sekund, inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej i dalej inkubowano przez 15 minut na lodzie. Lizaty odwirowano przez 10 minut przy 10000 g w celu żwirowania nierozpuszczalnego materiału. Nadsącz przeniesiono do nowej probówki i przechowywano w temp, od 4°C do -20°C.
ml lizatu sklarowano przez inkubację z 200 μΐ żelu sepharozy-białka A (Zymed) przez noc w 4°C. Sklarowany lizat porcjowano do probówek Eppendorf po 50 μΐ/probówkę dla każdego badanego przeciwciała. 25 μΐ surowicy poliklonalnej albo 100-500 μί przeciwciała monoklonalnego dodawano do lizatów i inkubowano mieszaninę przez 2 godziny w4°C żwirowaniem. Następnie dodano 100 μί króliczego przeciwciała przeciwko mysim IgG (Jackson) związanego z perełkami sepharozy-białka A w PBS i inkubowano przy delikatnym wytrząsaniu i płukano trzykrotnie zimnym buforem do płukania (10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1% Triton Χ-100). Nadsącz pobrano przez aspirację i dodano 20 μΐ 2x buforu próbkowego SDS z dodatkiem 10% β-merkaptoetanolu. Próbkę gotowano przez 2 minuty w łaźni wodnej i umieszczono na 5% żelu SDS-PAGE. Po rozdzieleniu, białko przeniesiono na nitrocelulozę. Filtry nitrocelulozowe zablokowano 3% BSA w TBS-T przez godzinę w temperaturze pokojowej i usunięto bufor blokujący. Dodano rozcieńczenie 1:6000 koniugatu streptawidyny-HRP (Jackson) w 0,1% BSA TBS-T i prowadzono inkubację przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Filtry płukano trzykrotnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej i poddawano autoradiografii stosując zestaw ECL Amersham.
E. Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku szczurzej (ij pełnej długości
Oczyszczanie szczurzego białka ad
Szczurze ad oczyszczano ze splenocytów w celu wytworzenia immunogenu do wytwarzania przeciwciał monoklinalnych przeciwko szczurzej ad. Śledziony z około 50 samic szczurów szczepu Lewis, w wieku 12-20 tygodni, pobrano i wytworzono zawiesinę jednoko38
187 013
Mórkową przez przecieranie tkanki przez cienkie sito druciane. Erytrocyty usunięto przez lizę w buforze 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, PH 7,4, zaś pozostałe leukocyty płukano dwukrotnie PBS. Splenocyty odwirowano i poddano lizie w buforze zawierającym 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl, 10 mM PMSF, leupeptynę, pepstatynę 1% Triton X-100. Lizę splenocytów przeprowadzono na lodzie przez 30 minut z 1 ml buforu do lizy na 5x10 8 splenocytów.
Nierozpuszczalny materiał usunięto przez odwirowanie.
CD1 la, CD1 lb i CDllc usunięto z lizatu przez immuncβrecyβitację. 750 μl żelu sepharozy-białka A inkubowano z 2 mg króliczej iMmunoglobuliny przeciw-mysiej w 4°C przez 30 minut. Sepharozę-białko A-przeciwciało przeciw-mysie płukano trzykrotnie buforem do lizy i zawieszono w objętości 1,5 Ml buforu. Dodano po około 200 μg każdego z przeciwciał przeciwko szczurzym integrynom β2, 515F (przeciwko CDlla), OX-42 (przeciwko CDllb) i 100 g (przeciwko CDllc) do 50 ml lizatu.
Po 30 minutach inkubacji w 4°C, dodano 500 μl sepharozy-białka A-króliczego przeciwciała przeciwko mysim Ig i zmieszano przez odwracanie przez 30 minut w 4°C. Lizat odwirowano przy 2500 g przez 10 Minut odwirowując CDlla, CDllb iCDllc związane z sepharozą-białkiem A, i przeniesiono nadsącz do świeżej probówki 50 ml. IMmunoprecypitację z przeciwciałami 515F, OX-42 i 100 g powtarzano jeszcze dwa razy w celu upewnienia się o całkowitym usunięciu CDlla, CDllb i CDllc.
B2 integryny pozostałe w lizacie izolowano przez oczyszczanie przez powinowactwo. Około 250 pl żelu przeciwciała przeciwko szczurzej CD18, 20C5B, sprzęgniętego z sepharozą CNBr dodano do lizatu i mieszano przez odwracanie przez 30 minut w 4°C. Kompleksy antygen/przeciwciało odwirowano przy 2500 g przez 10 minut i płukano osad trzykrotnie buforem do lizy w 4°C.
ImMunizacja chomików armeńskich
Chomiki armeńskie, w wieku 6-8 tygodni imMunizowano wstępnie około 50 fig białka rekoMbinowanego, składającego się z domeny Iaj poddanej fuzji z łańcuchem ciężkim IgG4 emulgowanym w kompletnym adiuwancie Freunda. Pp pierwotnej immunizacji następowała immunizacja białkiem szczurzej domeny Iaj/IgG4 emulgowanym w niekompletnym adiuwancie Freunda w dniach 14, 33 i 95. Następnie wykonano dwie osobne fuzje oznaczone 197 i 199.
Cztery dni przed fuzją 197 (dzień 306), jednemu z chomików podano kombinację białka szczurzej ad oczyszczonego ze splenocytów i komórek CHO transfeRowanych szczurzą ajDawkę przypominającą przed fuzją podano trzy dni przed fuzją (dzień 307) przy użyciu oczyszczonego białka aa i komórek CHO transfeRowanych aj. Komórki CHO transfeRowane szczurzą aj wytworzono w następujący sposób.
Segment genu kodujący szczurze białko aj pełnej długości wprowadzono do wektora pDCl i transfeRowano przez elektroporację do komórek CHO wraz zkonstrukteM ludzkiej CD18-pRC. Transfekowane komórki hodowano w obecności hipoksantyny w celu selekcji komórek pomyślnie transfekowanych konstrukteM pRC i w obecności G418 w celu selekcji komórek pomyślnie transfekowanych konstruktem pDCl. Po 3 tygodniach, komórki znakowano króliczą surowicą poligonalną przeciwko szczurzej aj i sortowano na FACS. Mały odsetek komórek, które ekspresjonowały najwyższy poziom powierzchniowej aj (około 3% całej populacji) zebrano i namnażarc. Selekcję FACS powtarzano dostarczając populację komórek o wysokim poziomie ekspresji powierzchniowej aj.
Komórki transie kowane aj charakteryzowano również przez cytometrię przepływową stosując surowicę poligonalną swoistą wobec szczurzej aj i przeciwciało Monoklonalne swoiste wobec ludzkiej CD 18, TS 1.18.1. Wyniki potwierdziły, że transfekowane komórki CHO eksplodowały wysoki poziom szczurzej aj jak i ludzkiej CD18.
Na koniec, ekspresję aj i CD 18 w komórkach badano immunoprecypitacją. Surowice poligonalne swoiste wobec szczurzej aj precypitowały białka o różnych ciężarach cząsteczkowych: białko w wyższym ciężarze około 170 kDa i o niższym ciężarze około 95 kDa. Wyniki te były zgodne z ekspresją kompleksów hetercMeryczrych szczurzej aj/ludzkiej CD 18 na powierzchni transfekowanych komórek CHO.
187 013
W dniu fuzji pobrano śledziony i wytworzono zawiesinę splenocytów przez ucieranie tkanki pomiędzy dwoma matowymi końcami szkiełek mikroskopowych, zanurzonymi w bezsurowiczej RPMI 1640 z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 jedn./ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny (RPMI) (Gibco, Kanada). Zawiesinę komórkową filtrowano przez sito komórkowe Nitex mesh 70 (Becton-Dickinson, Parsippany, New Jersey) i płukano filtrat dwukrotnie przez odwirowanie przy 200 g przez 5 minut. Powstały osad zawieszono w 20 ml bezsurowiczej RPMI. Komórki grasicy od trzech naiwnych myszy BALB/c wytworzono w podobny sposób. Przed fuzją, komórki szpiczaka NS-1, utrzymywane w fazie wzrostu logarytmicznego w RPMI z 10% surowicą Fetalclone (FBS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) na trzy dni przed fuzją, odwirowano przy 200 g przez 5 minut, płukano dwukrotnie i liczono.
Około 1,15x108 splenocytów połączono z 5,8x107 komórek NS-1 i odwirowano powstałą mieszaninę przy 200 g. Nadsącz usunięto. Osad komórek rozluźniono przez stukanie probówką, po czym dodano 2 ml 50% PEG 1500 w 75 mM HEPES (pH 8,0, 37°C) (Boehringer Mannheim) wciągu minuty mieszając. Dodatkowe 14 ml bezsurowiczej RPMI dodano wciągu siedmiu minut, po czym dodano bezpośrednio 16 ml RPMI. Powstałą mieszaninę odwirowano przy 200 g przez 10 minut i usunięto nadsącz. Osad zawieszono w 200 ml RPMI zawierającej 15% FBS, 100 mM hipoksantyny sodu, 0,4 mM aminopteryny, 16 mM tymidyny (HAT) (Gibco), 25 jedn./ml IL-6 (Boehringer Mannheim) i 1,5x106 komórek grasicy/ml, i rozdzielono do 10 płaskodennych płytek 96-studzienkowych (Corning, UK) po 200 μΐ/studzienkę. Komórki odżywiano w 4, 5, 6, i 7 dni po fuzji, przez aspirację około 100 μΐ igłą 18G (Becton-Dickinson) i dodanie 100 μΐ/studzienkę pożywki opisanej powyżej, z takim wyjątkiem, że zawierała ona 10 jedn./ml IL-6 i pozbawiona była tymocytów.
Dnia 10 przesiewano nadsącza ze studzienek fuzyjnych cytometrią przepływową na aktywność wobec komórek CHO transfekowanych szczurzą aj/ludzką CD 18. Około 5x105 komórek CHO transfekowanych szczurzą aa zawieszono w 50 μΐ RPMI zawierającej 2% FBS i 0,05% azydku sodu i dodano do 100 μΐ nadsączu hybrydoma w płytce hodowlanej 96studzienkowej. Kontrole pozytywne znakowania obejmowały króliczą surowicę poliklonalną przeciwko aa i TS1/18 (przeciwko ludzkiej CDI8). Komórki inkubowano przez 30 minut na lodzie płukano trzykrotnie w buforze FACS (RPMI, 2% FCS, 0,05% azydku sodu) i inkubowano przez 30 minut z przeciwciałami kozimi przeciw-chomiczymi sprzęgniętymi z FITC (Jackson Immunoresearch Labs) w rozcieńczeniu 1:200 buforze FACS. Komórki płukano trzykrotnie w buforze FACS i analizowano na urządzeniu FACS. W celu upewnienia się, że klony pozytywne są swoiste wobec szczurzej aj, przesiewanie powtórzono z komórkami CHO nietransfekowanymi. Klonowano studzienki spełniające kryterium reagowania ze szczurzą aa i nie reagowania z komórkami CHO nietransfekowanymi.
Po przesiewaniu pierwotnym, komórki ze studzienek pozytywnych klonowano przez podwójne rozcieńczenia a następnie przez rozcieńczenia krańcowe w RPMI zawierającej 15% FBS, 10C mM hipoksantyny sodu, 0,4 mM aminopteryny, 16 mM tymidyny (HAT) (Gibco), 25 jedn./ml Ł-6 (Boehringer Mannheim). Na etapie rozcieńczeń krańcowych procent komórek wykazujących wzrost analizowano i określono klonalność analizą rozkładu Poisson’a. Studzienki wykazujące wzrost analizowano w urządzeniu FACS po 10-12 dniach. Po końcowym klonowaniu, studzienki pozytywne namnożono w RPMI zawierającej 11% FBS. Klonowanie pozwoliło uzyskać jedną kulturę spełniającą kryteria w której wyróżniono podklony 197A-1, 197A-2, 197A-3 i 197A-4.
Przed fuzją 199, drugi chomik otrzymał dawkę przypominającą w dniu 307 w postaci 2,3x106 komórek CHO transfekowanych szczurzą aj. Drugą końcową immunizację podano cztery dni przed fuzją (dzień 334) i ponownie trzy dni przed fuzją. Dawka przypominająca w dniu 334 obejmowała 2x106 komórek CHO transfekowanych szczurzą aa i 200 μΐ oczyszczonej szczurzej aa związanej z sepharozą (opisaną uprzednio) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Dawka przypominająca w dniu 335 obejmowała 5x106 komórek CHO transfekowanych szczurzą aa, również podana dootrzewnowe. Protokoły fuzji i przesiewania dla fuzji 199 były identyczne co dla fuzji 197. Zidentyfikowano i klonowano trzy hybrydomy swoiste wobec szczurzej aa, oznaczone 199A, 199H i 199M. Hybrydoma oznaczona 199M została zde40
187 013 ponowana 1 marca 1996 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod numerem HB12058.
Charakterystyką przeciwciał monoklonalnych przeciwko szczurzej aj
W celu scharakteryzowania przeciwciał przeciwko szczurzej a<j, przygotowano lizaty biotynowanych komórek śledziony jak to opisano w przykładzie 18, wyżej. Lizaty sklarowano przed zastosowaniem immunoprecypitacji. Początkowo, do lizatu dodano 50 pg/ml normalnej mysiej immunoglobuliny i powstały roztwór mieszano przez 30 minut w 4°Ć. Następnie dodano 75 pl żelu sepharozy-białka A opłaszczonej króliczą immunoglobuliną przeciw-mysią i prowadzono mieszanie przez 30 minut. Perełki sepharozy-białka A z króliczym przeciwciałem przeciw-mysim odwirowano przy 15000 rpm przez 5 minut w 4°C i zebrano nadsącz.
Dla każdej klonowanej hybrydomy, około 300 pl nadsączu umieszczano w probówce eppendorf do której dodano 30 pl 10% Tritonu Χ-100, 30 pl 100x roztworu pepstatyny, leupeptyny iaprotyniny, 100 pg krystalicznego PMSF i 50 pl biotynowanego lizatu śledziony szczurzej. Próbki wytrząsano delikatnie i umieszczano na chybotce na 30 minut w 4°C. Próbki kontrolne wytworzono przez dodanie 10 mg/ml poliklonalnego przeciwciała przeciwko szczurzej aa do 50 pl lizatu śledziony szczurzej.
Po 30 minutach inkubacji, dodano 75 pl perełek sepharozy-białka A w PBS i inkubowano przez odwracanie przez 30 minut w4°C. Perełki sepharozy odwirowano przy 15000 rpm przez 5 minut w 4°C i zebrano nadsącz. Perełki płukano kolejno w 1 ml płukankach: buforu #1 zawierającego 10 mM Tris, 400 mM Na-Cl, 1% Triton Χ-100, pH 8,0; buforu #2 zawierającego 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5% Triton Χ-100, pH 8,0; buforu #3 zawierającego 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0,1% dezoksycholanu, pH 8,0; i buforu #4 zawierającego 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCh, pH 8,0. Na koniec przeprowadzono płukanie buforem #1. Perełki wytrząsano delikatnie pomiędzy płukaniami i wirowano w wirówce stołowej. Nadsącze usuwano pipetą, zaś po ostatnim płukaniu nadsącz usunięto strzykawką Hamiltona. Porcje po 50 pl buforu do próbek SDS z błękitem bromofenolowym i pironiną γ i β-merkaptoetanolem, w stężeniu końcowym 10% dodano do każdego osadu. Mieszaninę energicznie wytrząsano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut. Próbki odwirowano przez 5 minut w 15000 rpm w4°C i zebrano uwolnione białko i przeniesiono do nowych probówek. Porcje każdej próbki gotowano przez 4 minuty w łaźni wodnej po czym wprowadzono na 7,5% żel SDS-PAGE. Po rozdzieleniu przez PAGE, białka przeniesiono na filtr nitrocelulozowy przez godzinę w 200 mAmp i zablokowano filtry roztworem 3% BSA/TBS-T przez noc w4°C. Do każdego filtra dodano roztwór 0,1% BSA-TBS-T zawierający rozcieńczenie 1:6000 streptawidyny-OPD i prowadzono inkubację przez godzinę w temperaturze pokojowej. Filtry płukano pięciokrotnie po 10 minut w TBS-T i wywoływano stosując zestaw ECL Amersham.
Stwierdzono, że klon 199M immunoprecypituje białko heterodimeryczne. Większa podjednostka białka miała ciężar cząsteczkowy około 170-175 kDa, co było zgodne z wielkością białka precypitowanego przez kontrolę króliczej surowicy poliklonalnej przeciwko szczurzej aj. Precypitowano również drugie białko o ciężarze cząsteczkowym około 95 kDa, co było zgodne z ciężarem CDI8.
Przykład 19
Izolowanie mysich klonów cDNA
Hybiydyzację międzygatunkową wykonano stosując dwie sondy wytworzone przez PCR: fragment wielkości 1,5 kb, odpowiadający zasadom 522-2047 z ludzkiego klonu 19A2 (Identyfikator Sekw. Nr 1) i fragment wielkości 1,0 kb, który odpowiadał zasadom 1900-2900 ludzkiego klonu 19A2 (Identyfikator Sekw. Nr 1). Sondę ludzką wytworzono przez PCR stosując pary starterów oznaczone ATM-2 i 9-10.1 podane na Identyfikatorach Sekw. Nr 38 i 39; sondę szczurzą wytworzono stosując parę starterów 434L i 434R, podanych na Identyfikatorach Sekw. Nr 34 i 35.
Próbki inkubowano w 94°C przez 4 minuty, a następnie poddano je 30 cyklom po 2 minuty w 94°C i 50°C i 4 minuty w 72°C.
5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 38)
5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 39)
187 013
Produkty PCR oczyszczono zestawem Qiagen Quick Spin, i około 180 ng DNA znakowano 200 pCi[32P]-dCTP stosując zestaw Random Primer Labeling Kit Boehringer Mannheim. Niewbudowany izotop usunięto stosując kolumnę CentriSep Spin Column (Princeton Separations). Sondy denaturowano 0,2 N NaOH i neutralizowano 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0 przed użyciem.
Bibliotekę cDNA startowaną oligo dT mysiej grasicy w lambda ΖΑΡΠ (Stratagene) wysiano w gęstości około 30000 łysinek na 15 cm szalkę. Odbitki łysinek na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher&Schuell) inkubowano w 50°C z wytrząsaniem w roztworze prehybrydyzacyjnym (8 ml/odbitkę) zawierającym 30% formamid przez godzinę. Znakowane sondy ludzkie i szczurze dodano do roztworu prehybrydyzacyjnego i prowadzono inkubację przez noc w50°C. Filtry płukano dwukrotnie w2xSSC/0,l% w temperaturze pokojowej, raz w 2xSSC/0,l% SDS w 37°C i raz w 2xSSC/0,l% SDS w 42°C. Filtry eksponowano na kliszę Kodak X-Omat AR w -80°C przez 72 godziny z ekranem wzmacniającym.
Cztery łysinki dające pozytywny sygnał w powtórzonych odbitkach rozsiano na podłoże LB z magnezem (LBM)/karbenicyliną (100 mg/ml) i inkubowano przez noc w 37°C. Łysinki faga odbito na filtrach Hybond (Amersham) i eksponowano na kliszę Kodak X-Omat AR przez 24 godziny z ekranem wzmacniającym w -80°C.
łysinek dających pozytywny sygnał przeniesiono do niskiego stężenia Mg zawierającego 10 mM Tris-HCl i 1 mM MgCl2. Wielkość wstawki określono przez amplifikację PCR z użyciem starterów T3 i T7 (Identyfikator Sekw. Nr 13 i 14) i następujących warunków reakcji. Próbki inkubowano w 94°C przez 4 minuty, a następnie poddano 30 cyklom po 15 sekund w 94°C, 30 sekund w 50°C i 1 minutę w 72°C.
Sześć próbek dawało pojedynczy prążek wielkości od 300 bp do 1 kb. Fagemidy uwolniono przez współinfekcję fagiem pomocniczym i recyrkularyzowano tworząc pBluescript SK' (Stratagene). Powstałe kolonie hodowano na LBM/karbenicylinie (100 mg/ml) przez noc. DNA izolowano stosując zestaw Promega Wizard miniprep (Promega). Analiza restrykcyjna EcoRI potwierdziła ciężar cząsteczkowy który stwierdzono przez PCR. Wstawkę DNA sekwencjonowano starterami Ml3 i M13reverse. 1, podanymi jako Identyfikator Sekw. Nr 40 i 41.
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 40)
5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3’ (Identyfikator Sekw. Nr 41)
Sekwencjonowanie wykonano jak to opisano w przykładzie 4.
Wśród sześciu klonów tylko 2, oznaczone 10.3-1 i 10.5-2, dostarczyły informacji o sekwencji i posiadały identyczne fragmenty po 600 bp. Sekwencja 600 bp była w 68% identyczna z odpowiednim regionem ludzkiej ad, 40% identyczna z ludzką CDlla, 58% z ludzką CDI lc i 54% identyczna z mysią CDI lb. Fragment ten zastosowano do izolowania kompletnej sekwencji cDNA kodującej domniemany homolog mysiej ad.
Bibliotekę cDNA śledziony mysiej (startowanej oligo dT i starterami losowymi) w lambda ZAPII (Stratagene) wysiano w gęstości 2,5x104 faga/szalkę 15 cm z LBM. Łysinki odciśnięto na membranach nylonowych Hybond, denaturowano 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl, neutralizowano 0,5 M Tris Base/1,5 m NaCl/11.6 HCl i płukano w 2xSSC. DNA sieciowano z filtrami przez naświetlenie UV.
Około 500000 łysinek przesiano stosując sondy 10.3-1 i 10.5-2 opisane uprzednio. Sondy dodano do roztworu prehybrydyzacyjnego i inkubowano przez noc w 50°C. Filtry płukano dwukrotnie w 2xSSC/0,l% w temperaturze pokojowej, raz w 2xSSC/0,l% SDS w 37°C i raz w2xSSC/0,l% SDS w42°C. Filtry eksponowano na kliszę Kodak X-Omat AR w-80°C przez 72 godziny z ekranem wzmacniającym. 14 łysinek dających sygnał pozytywny na powtórzeniach odbitek poddano drugiemu przesiewaniu identycznemu jak pierwsze z takim wyjątkiem, że dołączono dodatkowe płukania w warunkach surowych w2xSSC/0,l% w50°C, raz w 0,5xSSC/0,l% SDS w 50°C i 55°C i raz w 0,2xSSC/0,l% SDS. Filtry eksponowano na kliszę Kodak X-Omat AR w -80°C przez 13 godzin z ekranem wzmacniającym.
pozytywnych łysinek przeniesiono do roztworu o niskim stężeniu Mg i określano wielkość wstawki przez PCR. Siedem próbek dawało pozytywny prążek w zakresie od 600 bp do 4 kb. Analiza restrykcyjna EcoRI oczyszczonego DNA potwierdziła wielkości obserwo42
187 013 wane w PCR. DNA sekwencjonowano starterami M13 i M13reverse.l (Identyfikator Sekw. Nr 40 i 41).
Jeden z klonów, oznaczony B3800 zawierał wstawkę 4 kb, która odpowiadała regionowi 200 zasad poniżej końca 5' ludzkiego klonu aj 19A2 i obejmowała 553 zasady nie ulegającego translacji końca 3'. Klon B3800 wykazywał 77% identyczność z odpowiednim regionem ludzkiej ad, 44% identyczność z odpowiednim regionem ludzkiej CD11a, 59% identyczność z odpowiednim regionem ludzkiej CD1 lei 51% identyczność z odpowiednim regionem mysiej CD11b. Drugi klon Al 160 posiadał wstawkę wielkości 1,2 kb, która była styczna do końca 5' regionu kodującego ludzką aj w około 12 bp poniżej początkowej metioniny. Klon 1160 wykazywał 75% identyczności z odpowiednim regionem ludzkiej aj, 46% identyczności z odpowiednim regionem ludzkiej CD11a, 62% z odpowiednim regionem ludzkiej CD11c i 66% z odpowiednim regionem mysiej CD11b.
Klon Al 160, fragment bliższy końcowi 5' ludzkiego klonu 19A2, jest fragmentem długości 1160 bp i wykazuje wspólny region z klonem B3800 od zasady 205 do 1134. Klon Al 160 ma wstawkę 110 bp (zasady 704-814) nieobecne w nakładającym się regionie B3800. Wstawka ta występuje prawdopodobnie na granicy egzon-intron (Fleming i in., J. Immunol., 150:480-490 (1993)) i została usunięta przed ligacjąklonu A1160 i B3800.
Szybka amplifkacja końców 5' cDNA klonu mysiej aj. W celu uzyskania brakującej sekwencji 5' klonu mysiej aj zastosowano RACE-PCR (Frhman, RACE: „Rapid Amplification of cDNA Ends”; pCr protocols: A Guide to Methods and Applications, wyd. Innis i in., str. 28-38, Academic Press, New York (1990)). Zestaw RACE-Ready (Clontech) mysiej śledziony zastosowano według protokołu producenta. Zaprojektowano dwa startery antysensowne Al 160 RACEl-primary i Al 160 RACE2-nested (Identyfikator Sekw. Nr 42 i 43) w celu wykonania pierwotnej i gniazdowej PCR.
5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 42)
5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 43)
Startery o Identyfikatorze Sekw. Nr 42 i 43 odpowiadały regionom rozpoczynającym się odpowiednio na zasadach 302 i 247 końca 5'. PCR wykonywano jak to opisano wyżej, stosując starter kotwiczący (Identyfikator Sekw. Nr 44) i mysi cDNA dostarczony w zestawie.
5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGG!T'CCAGAATCGATAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 44)
Elektroforeza produktu PCR wykazała prążek wielkości około 280 bp, który klonowano stosując zestaw TA cloning (Invitrogen). Powstałe kolonie hodowano, izolowano DNA i sekwencjonowano. Tym sposobem zidentyfikowano 60 dodatkowych zasad końca 5', które odpowiadały zasadom 1-60 Identyfikatora Sekw. Nr 45.
Charakterystyka mysiego cDNA i przewidywana sekwencja aminokwasową
Złożoną sekwencję mysiego cDNA kodującego domniemany homolog ludzkiej aj pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 45.
Jakkolwiek homologia pomiędzy domenami zewnętrznymi klonów ludzkich i mysich jest wysoka, homologia domen cytoplazmatycznych wynosi tylko 30%. Obserwowana odmienność może wskazywać na różnice funkcjonalne końca C w biału ludzkim i mysim. Alternatywnie, odmienność domen cytoplazmatycznych może być spowodowana istnieniem dodatkowych genów integryn β2.
Na poziomie aminokwasowym, mysi cDNA przewiduje białko (Identyfikator Sekw. Nr 46) o 28% identyczności z mysią CD11a, 53% identyczności z ludzką CD11b, 59% identyczności z ludzką CD11c i 70% identyczności z ludzką aj. Porównanie sekwencji aminokwasowych domen cytoplazmatycznych ludzkiej aj i domniemanego homologa mysiego wykazuje regiony o tej samej długości, ale posiadające różne struktury pierwszorzędowe. Podobna długość sekwencji w tym samym regionie wskazuje różnorodność gatunków, a nie odmiany składania transkryptu. Porównywane z przewidywanym polipeptydem szczurzym, przykład 16, wyżej, mysie i szczurze domeny cytoplazmatyczne wykazują identyczność większą niż 60%.
Przykład 20
Izolacja dodatkowych klonów cDNA mysiej aj do potwierdzenia sekwencji
187 013
W celu weryfikacji sekwencji aminokwasowych opisanych w przykładzie 19, dla mysiej otd, wyizolowano dodatkowe sekwencje w celu potwierdzenia.
Izolowanie mysiego cDNA przez hybrydyzację z dwiema homologicznymi sondami ad (3' i 5') wykonano na mysiej śledzionowej bibliotece cDNA startowanej losowymi starterami i oligo dT w lambda ΖΑΡΠ (Stratagene), Bibliotekę wysiano w gęstości 5x105 fagów na płytkę 15 cm LBM. Łysinki odciśnięto na membranach nylonowych Hybond (Amersham) denaturowano 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl, neutralizowano 0,5 M Tris Base/1,5 m NaCl/11.6 HCl i płukano w 2xSSC. DNA sieciowano z filtrami przez naświetlenie UV.
Sondy wytworzono stosując startery opisane niżej w reakcji PCR w poniższych warunkach. Próbki trzymano w 94°C przez 4 minuty po czym poddano je 30 cyklom amplifikacji (15 sekund w 94°C, 30 sekund w 50°C, 1 minuta w 72°C w urządzeniu Perkin-Elmer 9600).
Sonda 3' miała około 900 zasad długości i obejmowała region od nukleotydu 2752 do 3651 (Identyfikator Sekw. Nr 1) (5'—>3') i została wytworzona starterami ll.b-l/2FORll i ll.b-l/2REV2 jak to pokazano na Identyfikator Sekw. Nr 69 i 70. Sondę tę zastosowano w pierwszym zestawie odbitek.
Sonda 5' miała około 800 zasad długości i obejmowała region od nukleotydu 149 do 946 (Identyfikator Sekw. Nr 1) (5'—>3') i została wytworzona starterami 1 l.b-l/2FORl i 1 l.a-1/2REV1 jak to pokazano na Identyfikator Sekw. Nr 50 i 85. Sondę tę zastosowano w drugim zestawie odbitek.
W trzecim zestawie odbitek, obie sondy opisane wyżej zastosowano na tych samych płytkach.
Przesiano około 500000 łysinek stosując dwie powyższe sondy które znakowano w sposób analogiczny co opisany w przykładzie 17. Znakowane sondy dodano do roztworu prehybrydyzacyjnego, zawierającego 45% formamidu i inkubowano przez noc w 50°C. Filtry płukano dwukrotnie w 2xSSC/0,l% SDS w temperaturze pokojowej (22°C). Końcowe płukanie przeprowadzono w2xSSC/0,l% SDS w temperaturze 50°C. Autoradiografię prowadzono przez 19 godzin w -80°C na kliszy Kodak X-Omat AR z ekranem wzmacniającym.
łysinek dających pozytywny sygnał w przynajmniej powtórzonych odbitkach poddano drugiemu przesiewaniu jak to opisano dla przesiewania pierwszego z takim wyjątkiem, że znakowane sondy 5' i 3' zastosowano do hybrydyzacji, zaś końcowe płukanie obejmowało 2xSSC/0,l% SDS w 65°C. Autoradiografię prowadzono jak to opisano wyżej przez 2,5 godziny.
łysinek (oznaczonych od MS2P1 do MS2P13) dających pozytywny sygnał przeniesiono do buforu o niskim stężeniu Mg. Wielkość wstawki określono przez amplifikację PCR (Perkin Elmer 9600) stosując startery T3 i T7 które przyłączały się do fagemidu pBluescript w ZAP II (opisana uprzednio sekwencja) w warunkach opisanych wyżej, Prążki miały wielkości od 500 bp do 4 kb. Fagemidy izolowano, preparowano i sekwencjonowano starterami Ml3 i M13reverse.l (Identyfikator Sekw. Nr 40 i 41). Pięć spośród nich: MS2P-3, MS2P-6, MS2P9, MS2P-12 i MS2P-13 sekwencjonowano i stanowiły one razem region od zasady około 200 końca 5' do około 300 zasad po kodonie stop 3'.
Sekwencjonowanie automatyczne wykonywano jak to opisano w przykładzie 4 przez zastosowanie najpierw Ml3 i M13reverse.l (Identyfikator Sekw. Nr 40 i 41) w celu sekwencjonowania końca każdego z klonów i określenia pozycji względem konstruktu #17 (Identyfikator Sekw. Nr 45). Następnie każdy z klonów sekwencjonowano stosując startery (podane niżej) odpowiednie do konkretnego regionu.
187 013 .b-1/2FOR1 11 .a-1/1FOR2 11 .a-1/1FOR3 11 .b-1/2FOR4 11. b-l/2FOR5 11 .b-1/2FOR6 11 .b-1/2FOR7 11 .b- 1/2FOR8 11.b-1/2FOR9 .b- 1/2FOR10 11 .b-1/2FOR1 1 1Lb-1/2FOR12 11 .b-1/2FOR13 11 .b-1/2FOR14 11 .b-1/2FOR15 11 .b-1/2REV2
I 1.b-1 /2REV3
II .b-1 /2REV4 11 .b-1/2REV5
I l.-^l/RMV66
II .b-1/2REV7 11 .b-1/2REV8 11 .b-1/2REV9 11 .b-1/2REV10 11 .b-1/2REV1 1 11 .b-1/2REV12 11 .b-1/2REV13
I 1.a-1/1REVl
II ,a1/IREV2 (S3EQ ID NO: 50) (SE ID NO: 60) (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 62) (SEQ E ND: 63) (SIE) UD NO: 64) (SE UD NO: 65) (SEQ ID NO: 66) (SEQ ID NO: 68) (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) '-GCAGCCAGłCTTCGGACAGAC-3'
-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3' '-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3 '-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3 '
-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-G' '-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3'
-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3'
-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3 '
-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3 (SEQ ID NO: 67) '-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3 '
-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3 '
-GTCACAGAGGGAACCTCC-3'
-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3 (SEQ ID NO: 71) 5 -GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3' (SEQ ID NO: 72) 5 '-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3' (SEQ ID NO: 73) 5 '-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3' (SE UD NO: 14) 5 'CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3' '-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3' '-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3' '-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3' '-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3' '-GATCCAACGCCAGATCATACC-3 ' '-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3 '
-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3 ' '-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3 '
-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3 ' (SEQ JD NO: 83) 5 -GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3 ' (SEQ ID NO: 84) 5 '-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3' (SEQ ID NO: 85) 5 '-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3 ' (SEQ ID NO: 86) (SE UD NO: 15) (SE BD NO: 17) (S1EQ ID NO: 11) (SE BD NO: 78) (SEQ ID NO: 79) (SEQ ID NO: 80) (SEQ ID NO: 81) (SEQ ID NO: 82) (SEQ ID NO: 51)
187 013
Sekwencje edytowano i porównano z uprzednio izolowaną sekwencją mysiej aj (konstrukt # 17, Identyfikator Sekw. Nr 45).
Przyrównanie nowej sekwencji wykazało brak 18 zasad wkonstrukcie #17, począwszy od nukleotydu 2308, delecji która nie powodowała zmiany ramki odczytu. Klon MS2P-9 opisany wyżej również wykazał tę samą delecję 18 zasad. Delecję obserwowano w 50% klonów mysich, które obejmowały region, ale nie wykryto ich w klonach szczurzych i ludzkich. Delecja 18 zasad charakteryzowała się 12-zasadową sekwencją palindromową AAGCAGGAGCTCCTGTGT (Identyfikator Sekw. Nr 91). Te odwrócone powtórzenie w sekwencji kwasu nukleinowego jest samokomplementame i może ulegać wypętleniu, powodując cięcie podczas transkrypcji. Sekwencja mysiej aa, która obejmowała dodatkowe 18 zasad została pokazana na Identyfikatorze Sekw. Nr 52, wywnioskowaną sekwencję aminokwasową pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 53.
Przykład 21
Hybrydyzacja in situ u myszy
Rozmieszczenie tkankowe określono dla mysiej aa w celu dostarczenia porównania z ludźmi, co opisano w przykładzie 6.
Pojedynczą nić sondy 200 bp mRNA wytworzono na matrycy DNA, co odpowiadało nukleotydom 3460-3707 regionu cytopłazmatycznego mysiego cDNA, przez transkrypcję RNA in vitro wbudowującą a-UTP (Amersham).
Całe mysie embriony (pobrane w dniu 11-18 ciąży) i różne tkanki mysie, obejmujące śledzionę, nerki, wątrobę, jelito i grasicę poddano hybrydyzacji in situ ze znakowaną radioaktywnie jednoniciową sondą mRNA.
Tkanki skrawano na grubość 6 pm, przytwierdzano do szkiełek pokrytych Vectabond (Yector Laboratories Inc.) i przechowywano w -70°C. Przed użyciem szkiełka pobierano z -70°C i umieszczano w 50°C na około 5 minut. Skrawki utrwalano 4% formaliną przez 20 minut, w4°C, odwadniano rosnącym gradientem etanolu (70-95-100%) przez minutę w 4°C w każdym ze stężeń i suszono na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki denaturowano przez 2 minuty w 70°C w 70% formamidzie/2xSSC, płukano dwukrotnie w 2xSSC, odwadniano w opisanym wyżej gradiencie etanolu i suszono na powietrzu przez 30 minut. Hybrydyzację przeprowadzano przez noc (12-16 godzin) w 55°C w roztworze zawierającym znakowane 35S sondy rybonukleinowe w ilości 6x105 cpm/skrawek i wodę traktowaną dietylopirokarbonianem (DEPC) dając stężenie końcowe 50% formamidu, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% siarczanie dekstranu, lx roztwór Denhardta, 100 mM ditiotreitol i 5 mM EDTA. Po hybrydyzacji skrawki płukano przez godzinę w temperaturze pokojowej w4xSSC/10 mM DTT, 40 minut w60°C w 50% formamidzie/2xSSC/l 0 mM DTT, minut w temperaturze pokojowej w 2xSSC i 30 minut w temperaturze pokojowej w 0,lxSSC.
Skrawki odwadniano, suszono na powietrzu 2 godziny, pokrywano emulsją fotograficzną Kodak NTB2, suszono na powietrzu przez 2 godziny, wywoływano (po przechowywaniu w 4°C w całkowitej ciemności) i podbarwiano hematoksyliną/eozyną.
Tkanka śledziony dawała silny sygnał głównie w miazdze czerwonej. Wzorzec ten był zgodny z rozmieszczeniem makrofagów w śledzionie, ale nie wykluczał innych komórek.
Przykład 22
Wytwarzanie mysich konstruktów ekspresyjnych
W celu konstruowania plazmidu ekspresyjnego obejmującego mysi cDNA wykazujący homologię z ludzką a.d wstawki klonów Al 160 i B3800 poddano ligacji. Przed ligacją, jednakże, do klonu otl 160 dodano sekwencję liderową 5', obejmującą początkową metioninę. Zaprojektowano starter oznaczony ,,5'-PGR Leader” (Identyfikator Sekw. Nr 47) zawierający (1) identyczne nieswoiste zasady w pozycji 1-6 umożliwiające trawienie, (2) miejsce BamHI (podkleślone w Identyfikatorze Sekw. Nr 47) od pozycji 7 do 12 w celu ułatwienia klonowania do wektora ekspresyjnego, (3) sekwencję zgodności Kozak’a od pozycji 13 do 18, (4) sekwencję sygnałową, obejmującą kodon dla początkowej metioniny (wytłuszczony na Identyfikatorze Sekw. Nr 47) i (5) dodatkowe zasad swoiście nakładającej się sekwencji 5' z klonu Al 160 w celu umożliwienia przyłą46
187 013 czania startera. Drugi starter oznaczony „3' end ffag” (Identyfikator Sekw. Nr 48) zastosowano ze starterem „5' PCR leader” w celu amplifikacji z klonu Al 160.
5'-AGTTACGGATęęGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3' Identyfikator Sekw. Nr 47)
5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 48)
Powstały produkt PCR nie trawił się BamHI sugerując, że niedostateczna liczba poprzedzała miejsce restrykcyjne, uniemożliwiając rozpoznanie przez enzym. Długość „ogona” sekwencji poprzedzającej miejsce BamHI w starterze 5' (Identyfikator Sekw. Nr 47) wydłużono i powtórzono PCR na produkcie amplifikacji z pierwszej PCR. Starter 5' oznaczony mAD.5'.2 (Identyfikator Sekw. Nr 49) zaprojektowano z dodatkowymi zasadami w pozycji 1-4 i dodatkowymi 20 zasadami nakładającymi się swoiście na uprzednio zaprojektowaną sekwencję startera „5' PCR leader”.
5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 49)
Starter „mAD.5'.2” i ,,3'end frag” zastosowano razem w PCR z produktem z pierwszej amplifikacji jako matrycą. Powstały wtórny produkt PCR wklonowano do plazmidu pCRtmll (Invitrogen) i transformowano nim kompetentne komórki One Shot (Invitrogen). Zidentyfikowano jeden klon zawierający produkt PCR przez analizę restrykcyjną z użyciem BamHI i EcoRI i sekwencjonowaniem. Po zweryfikowaniu sekwencji, wstawkę izolowano przez trawienie BamHI i EcoRI i oczyszczono na żelu.
Wstawkę klonu B3800 wyizolowano przez trawienie EcoRI i Notl, oczyszczono na żelu i dodano w reakcji ligacji, która obejmowała fragment EcoRI/BamHI Al 160. Ligację prowadzono przez 14 godzin w 14°C. Wektor pcDNA.3 (Invitrogen), trawiony BamHI i Notl, dodano do reakcji ligacji wraz z dodatkową ligazą i prowadzono reakcję przez dalsze 12 godzin. Porcję mieszaniny reakcyjnej transformowano do kompetentnych komórek E. coli, powstałe kolonie hodowano i zidentyfikowano jeden klon w pozytywny przez analizę PCR ze starterami ll.b-l/2FORl i 1 l.b-l/2REVll (Identyfikator Sekw. Nr 50 i 51). Startery te obejmowały fragmenty Al 160 i B3800, stąd wykrycie produktu wskazywało że te dwa fragmenty uległy ligacji. Sekwencja klonu pozytywnego została potwierdzona starterami podanymi jako Identyfikator Sekw. Nr 50 i 51, które amplifikowały od zasady 100 do 1405 po początkowej metioninie.
Przykład 23
Konstruowanie myszy knock-out
W celu dokładnej oceny roli immunologicznej białka kodowanego przez domniemany mysi cDNA aa, zaprojektowano mysz „knock-out”, w której sekwencje genomowego DNA, kodującego domniemany homolog mysi a<j przerwano rekombinacją homologiczną. Znaczenie białka kodowanego przez zniszczony gen jest w ten sposób oceniane pod nieobecność kodowanego białka. Wytwarzanie myszy „knock-out” opisano w Deng i in., Mol. Cell, Biol., 13:2134-2140(1993).
Projektowanie takiej myszy rozpoczyna się konstrukcją plazmidu zawierającego sekwencje do znokautowania zjawiskiem rekombinacji homologicznej. Fragment wielkości 750 bp z mysiego cDNA (odpowiadający nukleotydom 1985 - 2733 Identyfikatora Sekw. Nr 45) zastosowano do identyfikacji mysich sekwencji genomowego DNA kodujących domniemany mysi homolog α<ι z biblioteki genomowej AFIXII. Pierwsze przesiewanie spowodowało izolację 14 pozytywnych łysinek, spośród których siedem potwierdzono w drugim przesiewaniu. Płynne lizaty uzyskane z dwóch łysinek dawały silny sygnał i ADNA wyizolowano standar-dowymi sposobami. Mapowanie restrykcyjne i analiza Southern potwierdziły autentyczność jednego z klonów, 14-1, zaś jego wstawkę wyizolowano przez trawienie Notl. Fragment ten klonowano do wektora Bluescript SKII*.
W celu identyfikacji fragmentu restrykcyjnego wielkości około 9-14 kb, długości optymalizującej prawdopodobieństwo rekombinacji homologicznej, wykonano hybrydyzację Southern z sondą cDNA wielkości 750 bp. Przed hybrydyzacją, skonstruowano mapę restrykcyjną dla klonu 14-1. Zidentyfikowano fragment wielkości 12 kb jako prawdopodobnego kandydata i fragment ten wklonowano do pBluescript SKII+ w pozycji w której mysi DNA flanko187 013 wany jest przez kasety kodujące kinazę tymidynową. Dalsza analiza klonu sondą domeny I aa wykazała, że klon nie zawiera sekwencji kodującej domenę I aj.
Stosując tę samą sondę domeny I, ponownie przesiewano bibliotekę λΡΙΧΙΙ. Początkowo zidentyfikowano sześć klonów, z których jeden pozostał pozytywny po drugim przesiewaniu. DNA izolowany z tego klonu reagował silnie w analizie Southern z sondą domeny I. Nie stwierdzono reaktywności stosując oryginalną sondę 750 bp, jednakże wskazywało to, że klon ten zawiera regiony 5' nukleotydów 1985-2773 Identyfikatora Sekw. Nr 45.
Alternatywnie, brak hybrydyzacji z sondą 750 bp może wskazywać, że klon ten był innym członkiem rodziny integryn. W celu określenia czy takie wyjaśnienie jest możliwe, fragment 13 kb wklonowano do pBluescript SKII+. Oczyszczony DNA sekwencjonowano stosując startery odpowiadające sekwencji domeny I aj 441-461, 591-612, 717-739 i odwrotną 898-918 (Identyfikatora Sekw. Nr 52). Uzyskaną informację o sekwencji uzyskano stosując jedynie starter 4441-4461 i tylko egzon najbardziej 5' domeny I amplifikował. Pozostałość domeny I nie amplifikowała. Powstały klon obejmował więc egzon 6 genu mysiej ad i sekwencje intronowe 3' i 5' końca egzonów. Egzon 7 nie występował w klonie. Po sekwencjonowaniu, wytworzono konstrukt zawierający geny oporności na neomycynę i kinazy tynmidynowej.
Gen oporności na kanamycynę (neor) wprowadzono do powstałego plazmidu w sposób przerywający sekwencję kodującą białko sekwencji genomowej mysiego DNA. Powstały plazmid zawierał więc gen neor w sekwencjach genomowego DNA, które są położone w regionie kodującym kinazę tymidynową. Konstruowanie plazmidu w ten sposób jest wymagane w celu przeważenia rekombinacji homologicznej nad rekombinacją losową (Chisaka i in., Nature, 355:516-520(1992)).
Przykład 24
Klonowanie króliczego aj - konstruowanie i przesiewanie króliczej biblioteki cDNA
Identyfikacja homologa ludzkiego ad u szczura i myszy, doprowadziła do zbadania obecności homologa króliczego, który byłby przydatny w króliczych modelach chorób ludzkich opisanych wyżej.
PoliA RNA wytworzono z całej śledziony królika stosując zestaw FastTrack Invitrogen. Z 1,65 g tkanki, wyizolowano 73 pg PoliA RNA. RNA śledziony królika zastosowano do konstruowania biblioteki cDNA ZAP Express, przy użyciu zestawu Stratagene. Powstały cDNA był bezpośrednio klonowany w miejsce EcoRI i Xhol ramion lambda wektora fagemidowego pBK-CMV. Gigapack II Gold (Stratagene) zastosowano w celu upakowania ramion lambda do cząstek wirusowych. Miano powstałej biblioteki oceniono na 8x105 cząstek, o średniej wielkości wstawki 1,2 kb.
Bibliotekę amplifikowano raz przez wysianie do zlewnego wzrostu łysinek i pobranie lizatu komórek. Amplifikowana biblioteka wysiana została w gęstości około 30000 pfu na szalkę 150 mm z E. coli i powstałą mieszaninę inkubowano przez 12-16 godzin w celu umożliwienia wytworzenia się łysinek. DNA fagów przeniesiono na membrany nylonowe Hybond N+ (Amersham). Membrany hybrydyzowano z mieszaniną dwóch losowo startowanych sond DNA Od znakowanych radioaktywnie. Pierwsza sonda wytworzona została z produktu PCR obejmującego nukleotydy 149-946 i Identyfikatorze Sekw. Nr 52. Druga sonda pochodziła z PCR obejmującego nukleotydy 2752-3651 Identyfikatora Sekw. Nr 52. Sondy znakowano radioaktywnie losowymi starterami (zestaw Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim) po czym mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez kolumnę z Sephadex G-50 w celu usunięcia nie wbudowanych nukleotydów. Roztwór hybrydyzacyjny składał się z 5xSSPE, 5x roztwór Denhardta, 1% SDS, 40% formamidu i znakowanych sond o aktywności lxl06 dpm/ml. Hybrydyzację przeprowadzono w42°C przez 16-18 godzin. Filtry płukano intensywnie w2xSSPE/0,l% SDS w temperaturze pokojowej i eksponowano na kliszę rentgenowską w celu uwidocznienia łysinek.
Zidentyfikowano dwa klony o znacznej homologii sekwencji z ludzką α<ι. Klon #2 miał długość około 800 bp i mapował się na koniec 5' ludzkiego aj. Klon #7 miał długość około 1,5 kb i obejmował początkową metioninę. Koniec 5' klonu #7 nakładał się na klon #2, podczas gdy koniec 3' kończył się w punkcie poza sekwencjami domeny I. Klon #7 sekwencjo48
187 013 nowano w całości metodą „primer walking”. Sekwencja nukleotydowa i wywnioskowana sekwencja aminokwasową pokazana została na, odpowiednio, Identyfikatorze Sekw. Nr 100 i 101.
Wywnioskowana sekwencja aminokwasową końca N króliczej ad, określona na podstawie klonów #2 i #7 wykazywała 73% identyczności z ludzką ad, 65% z mysią ad i 58 z mysią CD11b, ludzką CD11b i ludzką CD11c. Sekwencję nukleotydowa klonu #2 pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 92, przewidywaną sekwencję aminokwasową na Identyfikatorze Sekw. Nr 93.
Izolacji cDNA króliczej ad pełnej długości próbowano przy użyciu znakowanego klonu #7 i ponownego przesiewania biblioteki cDNA. Zidentyfikowano 25 dodatkowych klonów, przy czym jeden z nich, 49, okazał się największym. Klon 49 całkowicie sekwencjonowano stosując technikę zagnieżdżonych delecji. Sekwencję nukleotydową klonu 49 pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 102, przewidywaną sekwencję aminokwasową na Identyfikatorze Sekw, Nr 103. Ponieważ klony #7 i #49 nie nakładały się, zaprojektowano olignaukieotydy jako startery do reakcji PCR na pierwszej nici króliczego cDNA w celu amplifikacji brakującej sekwencji.
Stosunek domniemanej sekwencji aminokwasowej tych dwóch klonów częściowych do innych leuknlategrya został opisany na tabeli 1.
Tabela 1
Procent identyczności członków rodziny integryn β2 na poziomie aminokwasowym
ludzka Od króliczy #7 króliczy
ludzka Od 100 74 80
mysia Od 70 67 74
szczurza Od 70 66 73
mysia CD11a losowa* 28 28
mysia CD11b 55 59 53
ludzka CD11a 36 28 28
ludzka CD11b 60 58 55
ludzka CD11c 66 59 62
*jeżeli identyczność <25% jest to wyłącznie przyporządkowanie losowe i nie jest istotne
Izolowanie klonu króliczej ad umożliwia ekspresję białka na powierzchni transfektantów albo jako postać rozpuszczalna o okrojonej długości.
Białko to stosuje się następnie jako immunogen do wytwarzania przeciwciał mnankionalnych do zastosowania w modelach króliczych chorób ludzkich.
Przykład 25
Modele zwierzęce do określania przydatności leczniczej ad
Dane πnmunohistologiczae z psa i hybrydyzacji in situ u szczura i myszy pozwoliły stwierdzić, że w śledzionie ad ulega ekspresji głównie w makrofagach obecnych w miazdze czerwonej, zaś w węzłach chłonnych spotykana jest głównie w rdzeniu i zatokach. Wzorzec ekspresji jest niezwykle podobny z opisanym dla dwóch antygenów mysich określonych przeciwciałami mono^o^lnymi F4/80 i SK39. Podczas gdy charakterystyka biochemiczna wykazała, że te antygeny mysie są różne od ad, jest bardzo prawdopodobne, że ad określa ten sam podtyp makrofagów co antygeny przeciwciał F4/80 i SK39.
U myszy, makrofagi SK39-dndataie zidentyfikowano w śledzionowej miazdze czerwonej, gdzie mogą one uczestniczyć w oczyszczaniu krążenia z obcych materiałów oraz w rdzeniu węzłów chłonnych (Jutila i in., J. Leucocyte Biol., 54:30-39 (1993)). Makrofagi SK39dodatnie opisano również w miejscach ostrych i przewlekłych stanów zapalnych. Ponadto, monocyty rekrutowane do jamy otrzewnej podrażnionej tingiikniaaem również ekspresjonują
187 013 sjonują antygen SK39. Podsumowując te wyniki wskazują, że jeżeli komórki SK39+ są również a/, są one odpowiedzialne za usuwanie obcego materiału w śledzionie i uczestniczą w stanie zapalnym gdzie główną rolę odgrywają makrofagi.
Podczas gdy funkcja aj pozostaje niejasna, inne lepiej scharakteryzowane integryny β2 opisano jako biorące udział w różnych zjawiskach adhezji ułatwiających migrację komórek, zwiększanie fagocytozy i promowanie oddziaływania międzykomórkowego, zjawiskach, które wiodą do regulacji dodatnie zjawisk zapalnych. Stąd, jest niezwykle prawdopodobne, że zakłócanie normalnej czynności α<ι może również zakłócać stan zapalny w którym istotną rolę odgrywają makrofagi. Taki wpływ przeciwzapalny może być spowodowany: i) blokowaniem rekrutacji makrofagów do miejsca stanu zapalnego, ii) uniemożliwiania aktywacji makrofagów w miejscu stanu zapalnego, iii) zakłócania funkcji efektorowych makrofagów, które niszczą normalne tkanki gospodarza przez ich odpowiedź autoagresyjną albo w wyniku uszkodzenia na skutek „efektu sąsiedztwa”.
Stany chorobowe, w których istnieją dowody na istotną rolę makrofagów obejmują stwardnienie rozsiane, zapalenie stawów, miażdżycę w przeszczepie, niektóre postaci cukrzycy i choroby zapalnej jelita grubego. Modele zwierzęce dyskutowane poniżej, mogą odzwierciedlać wiele z chorób ludzkich. Inhibitory funkcji a<j badane są w tych układach modelowych w celu określenia czy istnieje możliwość leczenia odpowiednich chorób ludzkich.
A. Miażdżyca przeszczepu
Przeszczep serca jest obecnie przyjętą formą interwencji terapeutycznej w niektórych rodzajach schyłkowej niewydolności serca. Jako że zastosowanie cyklosporyny A zwiększyło odsetek przeżywalności jednorocznej do 80%, rozwój postępującej miażdżycy w przeszczepie stał się wiodącą przyczyną śmierci u osób z przeszczepem serca po pierwszym roku od przeszczepu. W ostatnich badaniach stwierdzono, że występowanie istotnej miażdżycy przeszczepu w 3 lata po przeszczepieniu waha się w granicach 36-44% [Adams i in., Transplantation 53:1115-1119 (1992), Adams i in., Transplantation 56:794-799 (1993)].
Miażdżyca przeszczepu typowo obejmuje rozlane, okrężne uszkodzenie śródbłonka dotyczące wszystkich ścian tętnic wieńcowych, często towarzyszy temu odkładanie lipidów. Dopóki patogeneza miażdżycy przeszczepu pozostaje nieznana, wydaje się, że jest związana z różnicami zgodności tkankowej między dawcą biorcą i ma przyczyny immunologiczne. Histolologicznie, obszary scieńczenia śródbłonka składają się pierwotnie z makrofagów, również komórki T występują sporadycznie. Jest możliwe, że makrofagi ekspresjonujące α<ι mogą odgrywać znaczącą rolę w wywoływaniu i/lub rozwoju miażdżycy przeszczepu. W tym wypadku, przeciwciała monoklonalne i inhibitory drobnocząsteczkowe funkcji aa (na przykład, rozpuszczalne ICAM-R) mogą być podawane profilaktycznie osobnikom po przeszczepie serca z ryzykiem rozwoju miażdżycy przeszczepu.
Mimo, że miażdżyca w przeszczepionym sercu wykazuje największe zagrożenie dla życia to miażdżyca przeszczepu jest również obserwowana w innych przeszczepach narządówlitych, nerek i wątroby. Terapeutyczne zastosowanie czynników blokujących aj może zapobiegać miażdżycy przeszczepu innych narządów i zmniejszać komplikacje wynikające z niewydolności przeszczepu.
Model miażdżycy przeszczepu u szczura obejmuje heterotopowe allogeniczne przeszczepy serca transplantowane przez słabe bariery zgodności tkankowej. Gdy przeszczepy allogeniczne Lewisa transplantowano biorcom F-344 zgodnym w klasie MHC I i Π, 80% przeszczepów allogenicznych przezywało przynajmniej 3 tygodnie, podczas gdy 25% przeszczepów utrzymało się stale. Podczas odrzucania przeszczepu niskiego stopnia, uszkodzenia miażdżycowe powstawały w sercu dawcy. Uszkodzenia miażdżycowe w 120 dniowych przeszczepach allogeniczych typowo posiadają rozlane, włókniste scieńczenia śródbłonka nie do odróżnienia od uszkodzeń miażdżycowych występujących w odrzuconych allogenicznych przeszczepach serc u ludzi.
Szczurom przeszczepiano serca niezgodne względem słabych antygenów zgodności tkankowej, na przykład Lewis dla F-344. Przeciwciała monoklonalne swoiste dla szczurzej aj lub drobnocząsteczkowych inhibitorów aa podawano okresowo biorcom przeszczepu. Oczekiwano, że leczenie to zmniejszy występowanie miażdżycy przeszczepu w nie odrzuconych
187 013 sercach pochodzących od dawców. Leczenie szczurów przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko aj lub drobnocząsteczkowymi inhibitorami nie ograniczano do leczenia profilaktycznego. Blokowanie funkcji aj również wydawało się zmniejszać naciek zapalny, w którym pośredniczą Makrofagi, które umożliwiało odwrócenie uszkodzenia tętnic w przeszczepie.
B. Miażdżyca u królików karmionych cholesterolem.
Króliki otrzymujące dietę Miażdżycorodną zawierającą dodatek cholesterolu przez około 12-16 tygodni rozwinęły uszkodzenie śródbłonka pokrywające większość powierzchni światła aorty wstępującej [Rosenfeld i in., Arteriosclerosis 7:9-23 (1987); Rosenfeld i in., Artericsclercsis 7:24-34 (1987)]. Uszkodzenie miażdżycowe obserwowane u tych królików są podobne do tych u ludzi. Uszkodzenia zawierają dużą ilość limfocytów T, większość z których ekspresjonuje CD45DRO, znacznik związany z limfocytami T pamięci. Około połowa naciekających limfocytów T ekspresjonuje antygen MHC klasy II i niektóre ekspresjonują receptory dla IL-2, które sugerują, że wiele z tych komórek jest w stanie aktywacji.
Cechą uszkodzeń miażdżycowych znalezionych u królików karmionych cholesterolem, lecz zwykle nieobecna w modelach gryzoni, jest akumulacja w uszkodzeniu komórek piankowatych. Komórki piankowate są wynikiem wychwytu utlenionych lipoprotein małej gęstości (LDL) przez swoiste receptory Makrofagów. Cząsteczki utlenionych LDL są toksyczne dla niektórych typów komórek włączając w to komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich. Wychwyt potencjalnie toksycznych, utlenionych cząsteczek LDL przez makrofagi działa jako czynnik drażniący i aktywuje makrofagi, biorące udział w zapaleniu związanym z uszkodzeniem miażdżycowym.
Gdy wytworzono morcklcnalne przeciwciała przeciwko króliczym ad zastosowano je u królików karmionych dietą cholesterolową. Leczenie obejmowało profilaktyczne podawanie mcnoklonalnych przeciwciał przeciwko króliczym aj lub inhibitorów drobnocząsteczkowych, w celu pokazania, że aj+ Makrofagi są włączone w proces chorobowy. Dodatkowe badanie mogło wykazać, że Monoklonalne przeciwciała przeciwko króliczym aj lub inhibitory drobnocząsteczkowe są zdolne do odwrócenia uszkodzenia stwierdzanego u królików karmionych dietą miażdżycorodną.
C. Cukrzyca insulinozależna.
Szczury BB spontanicznie rozwijają cukrzycę insulinozależną w 70-150 dniu życia. Przy użyciu immunohistocheMii, makrofagi klas II+ ED1+ mogą być wykryte w nacieku wysepek trzustkowych we wczesnych stadiach choroby. Wiele Makrofagów jak się wydaje jest zaangażowanych wfagccytczę resztek komórkowych lub normalnych komórek. Wyrazem postępu choroby jest większa liczba makrofagów naciekających wysepki, jakkolwiek znacząca ilość limfocytów T, a później i limfocytów B nacieka miejsce chorobowe. [Hanenberg i in., Diabetologia 32:126-134(1989)].
Rozwój miażdżycy u szczurów B wydaje się być zależny zarówno od wczesnego nacieku makrofagów jak i następowej migracji liMfocytów T. Leczenie szczurów BB cząstkami krzemionki, które są toksyczne dla makrofagów, powoduje zablokowanie wczesnego nacieku wysepek. Przy braku wczesnego nacieku wysepek, nie występowało kolejne uszkodzenie tkanek spowodowane populację autoagresyjnych limfocytów. Podawanie przeciwciał moncklcnalnych OX-19 (swoistych dla szczurzych CD5) lub przeciwciał monoklonalnych OX-B (swoistych dla szczurzych CD8), blokujących związaną z limfocytami T fazę chorobową Jest również skuteczne w hamowaniu rozwoju cukrzycy.
Podstawowa rola makrofagów w modelu tej patologii czyni atrakcyjnym badanie inhibitorów funkcji aj- Szczury genetycznie predysponowane do rozwoju cukrzycy insuliozależ^nej leczono przeciwciałaMi mcnokίonalnyMi przeciwko aj lub inhibitorami drobnocząsteczkowymi i oceniano ich wpływ na rozwój choroby. Zapobieganie lub opóźnienie klinicznego wystąpienia choroby jest dowodem, że aj gra kluczową rolę w powodowanym przez makrofagi uszkodzeniu komórek wysepek trzustkowych.
D. Zapalenia jelita grubego (choroba Crohn'a, wrzodziejące zapalenie jelita grubego)
Modele zwierzęce wykorzystywane w badaniu zapalnych chorób jelita grubego (IBD) są generalnie wywoływane przez doodbytnicze podanie szkodliwych środków drażniących (tj. kwasu octowego lub kwasu trinitrobeIr:enosulfonowego/e1arcl). Zapalenie jelita grubego
187 013 wywoływane przez te czynniki wynika z metabolicznego lub chemicznego uszkodzenia powodującego przewlekle i spontanicznie nawracające zapalenie związane z ludzkim IBD. Jednakże ostatnio opisano model używający posurowicówkowego wstrzyknięcia oczyszczonych polimerów peptydoglikanu polisacharydowego (PG-PS) z paciorkowców zarówno grupy A jak i D jest to bardziej fizjologiczny środek wyzwalający ludzkie IBDJYamada i in., Gastroenterology 104:759-771 (1993)].
W tym modelu PG-PS jest wstrzykiwany w warstwę podsurowicówkową dystalnego odcinka jelita grubego. Wywoływana odpowiedź zapalna jest dwufazowa z początkowym ostrym epizodem w trzy dni po wstrzyknięciu, po którym następuje spontaniczna faza przewlekła w trzy do czterech tygodni później. Odpowiedzią fazy późnej jest naciek ziaminiakowy, powodujący scieńczenie ściany jelita grubego, adhezję grudek jelita grubego i uszkodzenie śluzówki. Poza uszkodzeniem śluzówkowym, PG-PS często prowadzi do zapalenia stawów, niedokrwistości i ziaminiakowatego zapalenia wątroby. Do pozajelitowych objawów klinicznych choroby, co czyni ten model tak atrakcyjnym w badaniach nad choroba Crohn'a, jest to, że duża liczba pacjentów cierpiących z powodu choroby Crohn'a ma towarzyszące zapalenie stawów i nacieki żółciowe w wątrobie.
Ziarniniakowate uszkodzenia są wynikiem przewlekłego zapalenia prowadzącego do migracji i następowej aktywacji komórek linii monocytowo-makrofagowej. Obecność ziarniniakowatych uszkodzeń w chorobie Crohn'a i powyższego modelu zwierzęcego jest atra<cyjnym celem klinicznym dla przeciwciał monoklonalnych przeciwko a/ lub inhibitorów drobnocząsteczkowych. Oczekuje się, że inhibitory funkcji a/ będą blokować powstawanie uszkodzeń związanych z IBD lub nawet odwracać uszkodzenie komórkowe obserwowane w tej chorobie.
E. Zapalenie stawów
Zapalenie stawów wydaje się być wieloczynnikowym procesem chorobowym, wpływają na niego różnorodne typy komórek zapalnych obejmujących granulocyty obojętnochłonne, limfocyty T i makrofagi fagocytujące. Mimo, że istnieje wiele modeli zapalenia stawów preparaty z protcoglikanu ściany komórkowej paciorkowców wywołują zaburzenia najbardziej zbliżone do choroby występującej u ludzi.
W szczurów ściany komórkowe paciorkowców wywołują zapalenie stawów obwodowych charakteryzujące się powtarzającymi epizodami postępu choroby, po których następują remisje i ewentualnie powodują zniszczenie stawów w okresie kilku miesięcy [Cromartie i in., J. Exp. Med. 146:1585-1602 (1977); Schwab i in., Infection and immunity 59:4436-4442 (1991)].W trakcie fazy przewlekłej choroby, fagocyty mononukleame i makrofagi wydaje się, że grają główną rolę w uszkodzeniu błony maziowej. Dalej, czynniki, które hamują migrację makrofagów do błony maziowej skutecznie zmniejszają zapalenie i zmiany chorobowe chadla zapalenia stawów.
Główna rola makrofagów w destrukcji błony maziowej wskazuje na to, że przeciwciała monoklonalne przeciwko oj lub inhibitory funkcji oj mogą pełnić funkcje leczniczą w tych schorzeniach. Podobnie jak we wcześniej opisanych modelach przeciwciała monoklonalne przeciwko O/ lub inhibitory drobnocząsteczkowe podawane profilaktyczne wydają się blokować lub hamować zapalenie i zapobiegać destrukcji błony maziowej. Czynniki wpływające na funkcje O/ mogą również umiarkowanie wpływać na toczące się zapalenie przez zapobieganie migracji do stawów dodatkowych makrofagów i blokowanie aktywacji makrofagów. Podstawowym wynikiem może być odwrócenie toczącego się zniszczenia stawów i ułatwienie naprawy tkankowej.
F. Stwardnienie rozsiane
Jakkolwiek patogeneza stwardnienia rozsianego pozostaje niejasna, jest ogólnie przyjęte, że w chorobie pośredniczą limfocyty T CD4+, które rozpoznają autoantygeny w ośrodkowym układzie nerwowym i inicjują kaskadę zapalną. Powstająca odpowiedź immunologiczna powoduje migracje dodatkowych komórek zapalnych, włączając w to aktywację makrofagów, biorących udział w rozwoju choroby. Doświadczalne autoimmunologiczne zapalenie opon mózgowych i mózgu (EAE) w modelu zwierzęcym naśladuje niektóre aspekty MS. Ostatnio wykazano, że przeciwciała monoklonalne reagujące zCD11b/CD18 [Huitinga
187 013 i in., Eur. J. bnmunol. 23:709-715 (1993)] obecnymi na makrofagach powodują zahamowanie występowania objawów klinicznych i zmian histologicznych. Wyniki sugerują, że przeciwciała monoklonalne lub inhibitory drobnocząsteczkowe ad mogą skutecznie hamować odpowiedź zapalną w EAE. Takie czynniki mają również istotne zastosowanie lecznicze w MS.
G. Zapalenie pęcherzyków płucnych wywołane kompleksami immunologicznymi
Makrofagi pęcherzykowe znajdujące się w kanalikach pęcherzykowych, tkance łącznej dróg oddechowych i przestrzeniach surowiczych płuc odpowiadają za pierwszą linię obrony przeciwko wdychanym czynnikom środowiskowym. W odpowiedzi na stymulację przez te czynniki, włączając w to pochodzące z bakterii LPS, IFN-y i kompleksy immunologiczne, makrofagi pęcherzykowe uwalniają wiele silnych zapalnych mediatorów, obejmujących wysoce reaktywne rodniki tlenowe i związki pośrednie azotu. Podczas gdy aniony nadtlenkowe, nadtlenek wodoru i tlenek azotu (NO) grają istotną rolę w eradykacji patogenów i lizie docelowych nowotworów, czynniki te mogą uszkadzać normalne tkanki.
W szczurzym modelu zapalenia pęcherzyków płucnych wywołanych kompleksami immunologicznymi NO uwalniane z makrofagów pęcherzykowych pośredniczy w takim uszkodzeniu płuc [Mulligan i in., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 88:638-6342) (1991)]. NO jest wiązany jako mediator innych uszkodzeń wywołanych kompleksami immunologicznymi włączając w to zapalenie skómonaczyniowe [Mulligan i in., powyżej] i mogą potencjalnie odgrywać rolę w takich chorobach jak kłębkowe zapalenia nerek.
Uszkodzenie komórek, w którym pośredniczy NO nie ogranicza się do zapalenia wywołanych kompleksami immunologicznymi. Na przykład komórki glejowe stymulowane przez takie czynniki jak PMA, LPS, IFN-y wytwarzają NO w poziomach zdolnych do zabijania olidodendrocytów [Merrill i in., Immunol. 151:2132 (1993)]. Komórki wysepek trzustkowych okazały się również być wrażliwe na NO i uwalnianie przez makrofagi tego mediatora może wywoływać uszkodzenie w tych komórkach prowadzące do cukrzycy [Kroncke i in., BBRC 175:752-758 (1991)]. Ostatnio, definitywnie stwierdzono, że uwalnianie NO odgrywa rolę we wstrząsie toksycznym [MacMicking i in., Celi. 81:641-650 (1995)]. Podawanie lipopolisacharydu (LPS) myszom typu dzikiego wywoływało ciężki postępujący spadek ciśnienia tętniczego wywołujący zgon. Myszy z defektem indukcji tlenku azotu doświadczały znacznie mniejszego spadku ciśnienia tętniczego w odpowiedzi na LPS i wszystkie przeżywały doświadczenia.
W testach in vitro wykazano, że blokada aj skutecznie hamuje, niektóre aspekty aktywacji makrofagów (lub ogólnie leukocytów ekspresjonujących aj) włączając w to uwalnianie NO. Okazało się, że makrofagi pęcherzykowe stymulowane INF-y w obecności poliklonalnej surowicy przeciwko aj (wytwarzana przez króliki przeciwko szczurzym domenom polipeptydowym α I) wytwarzają znacząco mniej produktów rozpadu NO azotynów/azotanów niż makrofagi traktowane kontrolną surowicą. Wskazuje to, że monoklonalne przeciwciała przeciwko aj, szczególnie domenie I mogą być skutecznymi czynnikami, z potencjalnym zastosowaniem w MS, cukrzycy, zapaleniu płuc i wstrząsie toksycznym. Następnie w odróżnieniu do CD 18, który wpływa na funkcję dużej różnorodności rodzajów leukocytów, ograniczone rozmieszczenie aj czyni go bardziej atrakcyjnym celem niż CD 18 w zapobieganiu aktywacji makrofagów (lub ogólnie leukocytów ekspresjonujących aj).
Szczurze zapalenie pęcherzyków indukowane przez kompleksy immunologiczne IgG jest szeroko wykorzystywanym modelem doświadczalnym w zrozumieniu ostrego uszkodzenia płuc. Uszkodzenie jest wywoływane przez podawanie przeciwciał przeciwko albuminie surowicy bydlęcej (BSA) do płuc przez zaintubowaną tchawicę, po którym następowało dożylne wstrzyknięcie BSA. Powstawanie kompleksów immunologicznych w mikrokrążeniu płuc powodowało aktywację dopełniacza i migracje granulocytów obojętnochłonnych do płuc. Uogólniając, powstawanie kompleksów immunologicznych w płucach poprzedza wynaczynienie leukocytów z łożyska naczyniowego i następową migracje leukocytów przez śródbłonek naczyniowy. Następuje uwolnienie mediatorów obejmujących rodniki, TNF-a i tlenek azotu (NO) ze /.aktywowanych komórek śródbłonka, granulocytów obojętnochłonnych i makrofagów, biorących udział w postępie choroby. Cechy patologiczne choroby obejmują
187 013 zwiększoną przepuszczalność naczyń prowadzącą do obrzęku i do obecności dużej liczby erytrocytów i PMN w przestrzeni pęcherzykowej.
Surowica poliklonalna przeciwko swoistej domenie I aa badano w szczurzym modelu zapalenia pęcherzyków, w którym pośredniczą kompleksy immunologiczne. Surowicę poliklonalną przeciwko aj podawano przez zaintubowaną tchawicę w tym samym czasie co antyBSA dostawało się do płuc. Uszkodzenie płuc było następnie wywoływane przez dożylne podanie BSA łącznie ze śladową ilością BSA znakowanego 125I (około 800000 cpm) do ilościowej oceny obrzęku powodowanego uszkodzeniem płuc. Uszkodzenie trwało przez 4 godz. i oceniano je wartością przepuszczalności płuc, która jest definiowana jako stosunek BSA znakowanego 125I w płucach do ilości znacznika obecnego w 1,0 ml krwi. Typowo wartości przepuszczalności płuc dla kontroli dodatniej wahały się miedzy 0,6 a 8,0, podczas gdy kontrola ujemna (szczury nie otrzymujące BSA) posiadała wskaźnik przepuszczalności w granicach 0,1-2,0.
Wstępne badania wskazują na to, że leczenie poliklonalną surowicą przeciwko α<ι zmniejszało wartość przepuszczalności płuc aż do 50%, co powodowało dramatyczną poprawę uszkodzenia płuc. Historycznie leczenie anty-CD18 redukowało wartość przepuszczalności do 60%. Odkrycia te wskazują, że aa może być najistotniejszą w trakcie uszkodzenia płuc integryną p2, jakkolwiek nie jest możliwe precyzyjne określenie efektu surowicy odpornościowej hamującego wynaczynienie leukocytów z łożyska naczyniowego i migracji przez śródbłonek płucny.
Dodatkowym dowodem na to, że aj hamuje uszkodzenie płuc jest wykrycie poziomu TNF-α wpłynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Leczenie surowicą odpornościową przeciwko aa zmniejsza poziom TNF-α czterokrotnie. TNF-α od dawna jest uważany za ważny mediator w ostrym zapaleniu płuc i jest odpowiedzialny za migrację komórek zapalnych do miejsca zapalenia, ich aktywację i uszkodzenie komórek. Reasumując, surowica odpornościowa przeciwko aa blokuje aktywacje przebywających w pęcherzykach makrofagów w trakcie trwania zapalenia pęcherzyków płucnych wywoływanego przez kompleksy immunologiczne i przez to hamuje uwalnianie TNF-α i NO i zmniejsza następujące uszkodzenie tkankowe powodowane przez te czynniki i migrację granulocytów obojętnochłonnych.
P r z y k ła d 26
Ekspresja aa w modelu przedklinicznym
W celu oceny różnych ekspresji aa w różnych stanach chorobowych, skrawki tkankowe z różnych zwierzęcych modeli chorób znakowano surowicą poliklonalną anty- aa wytwarzaną jak opisano powyżej (patrz przykład 18). Tkanki zdrowych i chorych szczurów skrawano na grubość 6 pm i suszono na powietrzu na szkiełkach Superfrost Plus (VWR Scientific) w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu skrawki przechowywano w -70°C aż do wykorzystania. Przed stosowaniem, skrawki usuwano z -70°C i umieszczano w 50°C na około 5 minut. Skrawki utrwalano w zimnym acetonie (4°C) (Stephens Scientific) przez 10 min w temperaturze pokojowej i suszono w pokojowej temperaturze. Każdy skrawek blokowano 150 pl roztworu zawierającego 30% normalną surowicę szczurzą (Harlan Bioproducts), 5% normalną surowicę kozią (Vector Laboratories) i 1% surowicę bydlęcą (BSA) (Sigma Chemical Company) w 1 x TBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie skrawki delikatnie osuszono. Królicza surowica poliklonalna, o stężeniu białka 34 pg/ml, i preimmunizowana surowica od tych samych królików o stężeniu białka 38,3 pg/ml była rozcieńczana w roztworze blokującym i 100 pl oddzielnie podawano na każdy skrawek tkanki przez 30 min w 37°C. Skrawki osuszano z roztworu surowicy i nie związane przeciwciała usuwano przez trzykrotne przemywanie w 1 x TBS przez 5 min. Nadmiar TBS usuwano przez osuszanie po końcowym przemywaniu. Biotynowane kozie przeciwciała anty-królicze z zestawu Rabbit IgG Vectastain ABC (Vector) przegotowano zgodnie z protokołem sugerowanym przez producenta i 100 pl końcowego roztworu podawano na każdy skrawek na 15 min w temp. 37°C. Skrawki przemywano w 1 x TBS każdorazowo przez 5 min, po któiych 100 pl konjugatu streptawidyna-złoto (Goldmark Biologicals) rozcieńczonego 1:100 w 5% normalnej surowicy szczurzej i 1% BSA podawano na każdy skrawek na 1 godz. w temp, pokojowej. Skrawki przemywano trzykrotnie w TBS każdorazowo przez 5 min i 100 pl 1% glutaraldehydu (Sig54
187 013 ma) w buforze TBS podawano na 5 min w temperaturze pokojowej. Skrawki ponownie przemywano trzykrotnie w IBS każdorazowo przez 5 min i pięć razy w sterylnej dejoaiznwαaej wodzie każdorazowo przez 3 min. Każdy skrawek osuszano z nadmiaru płynu i na każdy skrawek podawano 2 krople wzmacniającego roztworu srebra (Goldmark Biologicals). Reakcje prowadzono przez 20-30 min w temperaturze pokojowej, a następnie skrawki dokładnie przemywano sterylną dejonizowaną wodą, suszono na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc i zatapiano w Cytoseal 60 (VWR). Jako kontrolę skrawki tkanek znakowano przeciwciałami mnnokinnalaymi rozpoznającymi CD11a, CD11b, CD11c i CD18 w tych samych doświadczeniach z identycznym protokołem.
Znakowanie poligonalną surowicą ad i przeciwciałami mono^o^lnymi rozpoznającymi CD11a, CD11b, CD11c i Cd 18 wykazał wzorzec barwienia dla ad odmienny niż obserwowany dla innych podjednostek a.
W normalnej tkance płuc, ekspresję ad określano w nabłonku oddechowym oskrzeli (lecz nie na nabłonku przestrzeni pęcherzykowych) i na poszczególnych komórkach, które wydają się być makrofagami pęcherzykowymi wewnątrz dróg oddechowych. Sygnał obserwowany z poligonalną surowicą był znacząco wyższy niż poziom sygnału tła sprzed immunizacji. W ziarninie tkanki płucnej, 24 i 96 godzin po podaniu glikanu, inny sygnał wykrywano z nabłonka oddechowego znakowanego ad wyścielającego przestrzenie pęcherzykowe, a silniejszy sygnał wykrywano na tym co wydawało się być makrofagami pęcherzykowymi dróg oddechowych. W tkance płucnej zwierząt, które prawdopodobnie wyzdrowiały (zabite 16 dnia po podaniu glikanu), nie obserwowano żadnego sygnału z przeciwciałem przeciwko ad.
Obserwowano bardzo małe tło przy pre-immunizacji surowicą w każdej z tych tkanek.
Stosując tkanki płucne od szczurów będących modelem astmy indukowanej przez antygen, bardzo silny sygnał z przeciwciałem przeciwko ad wykrywano w nabłonku oddechowym zarówno z oskrzeli jak i z przestrzeni pęcherzykowych. Sygnał był znacząco wyższy niż sygnał tła w kontroli pre-immunizowanej surowicą.
Oczekuje się, że specjaliści w dziedzinie zauważą liczne modyfikacje i odmiany wynalazku jak pokazano w powyższych ilustrujących przykładach. Stąd, wynalazek ograniczony jest jedynie jak to pokazano w dołączonych zastrzeżeniach.
187 013
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Gallatin, W. Michael Van der Vieren, Monica (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Podjednostka alfa ludzkiej integryny beta 2.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 103 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRES: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych PATPOL sp.zoo.
(B) ULICA: ul. Nowoursynowska 162J (C) MIASTO: WARSZAWA (D) KRAJ: Polska (E) KOD: 02-766 {v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/173,497 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 23-DEC-1993 (vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/286,889 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 5-AUG-1994 (vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/362,652 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 21-DEC-1994 (viii) INFORMACJE O RZECZNIIUJ:
(A) NAZWISKO: GOWSHALL, Jonathan Vallance (B) NUMER SPRAWY: PI1779PL-JVG/smt (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYjNE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX: (48) 391 218 15 (C) TELEX: N/A
187 013 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. nr 1:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3726 par zasad (B) TYP: kwas - nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZK! - cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 3.-3485 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:1:
TG ACC TTC GGC ACT GTG CCT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT (AT 47
Thr Phe Gly Thr Val eeu euu Luu rer VLe Leu .WLa Syr Tyr His
10 11
GGA TTC AAC Asn CTG Leu GAT Asp 20 GTG Val IAG Glu GLu CCT Pro ACG Thr 25 ACC Ile TTC Phe CAG Gln CgAG Glu GAT Asp 30 GCA Ala 95
Gly Phe
GGC GGC tcc GGG AGG AGC GTG TCT GAG TTC GGT GGA TCT CGA CTC GTG 143
Gly Gly Phe Gly 35 Gln Ser Val VaL Gln 40 Phe Gly Gly Ser Arg 40 Leu Val
GTG GGA GGA CCC CTG CAG GTG GCG GCG GCC AAC CAG ACG GdA CGG CTG 191
Val Gly /ALa 50 Pro Leu Glu Val VaL 55 Ala Ala Asn Gln Thr 60 Gly Arg Leu
SAS GAC TGC GCA GCT GCC ACC GGC ATG TGC CAG CCC ATC CCG CTG CAC 039
Tyr Asp 65 Cys ALa ALa ALa Thr 77 GLy Met Cys Gln Pro 75 Ile Pro Leu His
ATC CGC CCT GAG iCC C GTG GAC ATG TCC TTG GGC CTG ACC CTG GCA GCC :277
lle 80 Arg Pro Gin ALa Val 85 GAn Met Ser Łeu Gly 90 Leu Thr Leu Ala Ala 95
TCC ACC jaa GGC CCC CGG CCC CCG GCC TGT GGC CCG ACC CTG CAC AdA 3335
Ser Thr Asn GGy Ser 100 TAsg Leu Luu GALa Cys 105 Gly Pro Thr Leu Hi.i 110 Arg
GTC CGC GGG GAG ACC TCA ISA CCA GAG GGT TCC CGC CCC CTG CTG GGC 383
Val Cys Gly GGl; 115 Asn Sur Gs^r Sur Lys 110 Gly Ser Cys Llu Leu 110 Leu GGy
CCG CGC TTG GAG ATC AAC GCA ACA GTC CCC GAC GCC ACG CCCA IAG TGT 431
Ser Arg Tsp 130 Glu lle LLr Gln Thr 133 Val Piso Asp ALa Thr 110 Ppo Glu CCy
CCA CAT CAA GAG TTG GGA AAC GCC TTC CTG ATT CAC GGG ICC GCA AGC 47 9
Pro His 145 G!u Glu Met A^f) Ilu 115 Val Phe Leu Ilu Asp 115 GGy Asi: GGy Aur
187 013
AGG Ile 160 GAC Asp CAA Gln AACT Asn GAC Asp TTT Phe 165 AAC Asn CAG Gln ATG Met AAG Lys GGC Gly 170 TTT Phe GTC Val CCAA Gln GCT Ala GTC Val 175 527
AGG GGC CAG TTT GAG GGC ACT GAC ACC CTG TTT Gd CTG ATG CiAG TAC 575
Met Gly Gin Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe ALa Leu Met Gin Tyr
180 185 190
GCA AAC CTC CTG AAG ATC CAC TTC ACC TTC ACC CCAA TTC CGG ACC AGC 623
Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe .Arg Thr Ser
195 200 205
CCG Pro AGC Ser CAG Gln 210 CAG Gln AGC Ser CGG Leu GGG dl CCC Pro AGC LLe GGC VaI CAA GLn CGG Leu 220 AAA Lys GGC Gly CGG Leu 671
Val Asp 21.5
ACG GGC ACG GGC ACG GGC ATC CTG T.CA GTG GTG ACA CAG CTA TTT CAT 719
Ghr Phe 225 Thr AAl Thr Gly Ile 220 Leu TGr Val Tal Thr 223 CTn Llu Phe Hii
CAG AAG ΑΙΓ GGG ACC Cd TAAA AGT GGC TAAG AAG ATC CCC ATT GTC ATC 767
His 240 Lys Asn Gil Ala Arg 245 Lys SSr TAe Lys Lyy 220 Ile Llu Ile Val Ile; 225
ACA GAG GGG CAG AAG GAC AAA GAC CCC CTC GAA GAC ACT GAG GGC AGC 815
Ghr Asp Gly Gln Lys 260 Gyr Lys Asp Pro Leu 265 GLu Gyr Ser Asp VaI 220 Lle
CCC CAG GCA GAG AAG GCG GGC AGC AGC CGC GAC GCG AGC GH GTC Gd 863
Pro Gln Ala Glu 275 Lys Ala Gly lle LLe 280 Arg Gyr Ala LLe Gly 28 5 VaI Gly
CAC GCG GGC CAG GGA CCC ACG GCC AGG CAG GAG CGG AAG ACC AGC AGC 911
His Ala Phe 290 Gln Gly Pro Ghr Ala 229 Arg Gln GLu Leu Asn 330 Ghr LLe Ser
GCA GCG CCG CCG CAG GAC CAC GTC GGC AAG GGG GAC AAC GGG GCA GCC 959
Ser Ala 305 Pro Pro Gin Asp His 330 Val Phe Lys VaI Asp 331 Asn Phe Ala Ala
CGG GGC AGC AGC CAG AAG CAG CGG CAG GAG AAG AGC GAG GCA CTC GAG 1007
Leu 320 Gly Ser lle Gln Lys 322 Gln Leu Gln Glu Lys 333 LLe Gyr Ala Val GLu 333
GGA ACC CAG GCC AGG GCA AGC AGC GCC GGC CAG CAC dG ATC GCC CAA 1055
Gly Ghr Gln Ser Arg 340 Ala Ser Ser Ser Phe 335 GLn His Glu Met Ser 335 GLn
GAA GGC GGC AGC ACA GCC CGC ACA AGG GAG GGC CGC GGC CTC GGG GCG 1103
Glu Gly Phe Ser 355 Ghr Ala Leu Ghr Met 330 Asp GLy Leu Phe Leu 336 GLy ALa
GTG GGG AGC TTT AGC TGG TCT Gd GGG GCC TT CCTGTAT CCC Cd TAA 1151
187 013
Val Gly Ser 370 Phe Ser Trp Ser Gly 375 Gly Ala Phe Leu Tyr 380 Pro Pro Asn
ATG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGG 1199
Met Ser 385 Pro Thr Phe lle Asn 390 Met Ser Gln Glu Asn 395 Val Asp Met Arg
GAC TCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GAG CTA GCC CTG TGG AAG GGG GTA 1247
Asp 400 Ser Tyr Leu Gly Tyr 405 Ser Thr Glu Leu Ala 410 Leu Trp Lys Gly Val 415
CAG AAC CTG GTC CTG GGG GCC CCC CGC TAC CAG CAT ACC GGG AAG GCT 1295
Gln Asn Leu Val Leu 420 Gly Ala Pro Arg Tyr 425 Gln His Thr Gly Lys 430 Ala
GTC ATC TTC ACC CAG GTG TCC AGG CAA TGG AGG AAG AAG GCC GAA GTC 1343
Val lle Phe Thr 435 Gln Val Ser Arg Gln 440 Trp Arg Lys Lys Ala 445 Glu Val
ACA Thr GGG Gly ACG Thr 450 CAG Gln ATC lle GGC Gly TCC Ser TAC Tyr 455 TTC Phe GGG Gly GCC Ala TCC Ser CTC Leu 460 TGC Cys TCC Ser GTG Val 1391
GAT GTG GAC AGC GAT GGC AGC ACC GAC CTG ATC CTC ATT GGG GCC CCC 1435
Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu lle Leu lle Gly Ala Pro
465 470 475
CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG GGC CAG GTG TCC GTG TGT CCC TTG 1487
His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu
480 485 490 495
CCT AGG GGG CAG AGG GTG CAG TGG CAG TGT GAC GCT GTT CTC CGT GGT 1535
Pro Arg Gly Gln Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly
500 505 510
GAG CAG GGC CAC CCC TGG GGC CGC TTT GGG GCA GCC CTG ACA GTG TTG 1582
Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu
515 520 525
GGG GAT GTG AAT GAG GAC AAG CTG ATA GAC GTG GCC ATT GGG GCC CCG 1631
Gly Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu lle Asp Val Ala lle Gly Ala Pro
530 535 540
GGA GAG CAG GAG AAC CGG GGT GCT GTC TAC CTG TTT CAC GGA GCC TCA 1679
Gly Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser
545 550 555
GAA TCC GGC ATC AGC CCC TCC CAC AGC CAG CGG ATT GCC AGC TCC CAG 1727
Glu Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg lle Ala Ser Ser Gln
560 565 570 575
CTC TCC CCC AGG CTG CAG TAT TTT GGG CAG GCG CTG AGT GGG GGT CAG 1775
Leu Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln
580 585 590
187 013
GAC Asp CTC Lru ACC Thr (CAG Gin 595 GAT Asp GGA Gly CTG Leu ATG Met GAC Asp 600 CTG Leu GCC Ala GTG Val GGG Gly GCC Ala 605 CCG /Ag GGC Gly 1823
CAG GTG CTC CCTG CTC AGG AGT CTG CCG GTG CTG AAA GTG GGG GTG GCC 1871
Gln Val Leu 610 Keu. Leu Arg Ser Leu 615 Pro Val Leu Lys Val 620 Gly Val Ala
ATG AGA TTC AGC CCT GTG GAG GTG GCC AAG GCT GTG TAC CGG TTG TGG 1919
Met Arg 625 Phe Ser Pro Val Glu 630 Val Ala Lys Ala Val 635 Tyr Arg CCS Trp
GAA GAG AAG CCC AGT GCC CTG (GAA GCT GGG (GAC GCC ACC GTC T^T CTC 1967
Glu 640 Glu Lys Pro Ser Ala 645 Leu Glu Ala Gly Asp 650 Ala Thr Val Ccs Leu 655
ACC ATC CAG GAAA AGC TCA CTG mc CAG CTA GGT (GAC ATC TAC AAG TCT 2015
Thr Ile Gin Lys Ser 660 Ser Leu Asp Gin Leu 665 Gly Asp II^€S Gin Ssr 670 Ser
GTC AGG ttt mT CTG GCCC CTG GAC CCCC GGT CGT CTG ACT TCT CCT GCC 2063
Val Arg Phe UA>p 675 Leu TUa Leu (Asp Pro 680 Gly Arg Leu Thr Ser 668 Αγ- Ala
ATT Ile TTC Phe AAT Asn 690 GAA Glu ACC Thr AAG AAC CCC ACT TTG Leu ACT Thr CGA AGA AAA ACC Thr CTG Leu 2111
Lys Asn Pro 665 Thr Arg Arg 700 Lys
GGA CTG GGG GATT GAC TGT mA ACC CTG AAG CTG CTT TTG CCA (rST TGT 215S
Gly Leu Gly 1 lo His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu hro Asp Cys
705 710 7115
GTG GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC TASC TTC· -TCA CTG 2207
Val Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ilu Leu His Leu Asn hhr Ser Leu
720 725 730 735
GTG AGA GACA CCC ATC CCC TCC CCC CAG TACC CTG CGT CCT CTC CTG GCC 2255
Val Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pito Gln Asn Llu Arg Peo Val Leu TALa
740 745 750
GTG GGC TCA CPAA mc CTC TTC ACT GCT TCT TTC CCC TTC GAG TACG TACC 2303
Val Gly Ser GGn Asp Leu Phe Thr Ala Ssr Llu Per Phh Glu Lyy Asn
755 760 765
TCT GGG CWA GAA GGC CTC TGT (nss CCC mc ATT GG^T CT^C ACC CTC AGC 2351
Cys Gly Gin 7A>p Gly Lsu Ccs CTu Gly Asp Glu GGu Vs1 Thr Llu Ssr
770 775 778
TTC TCA GGC TTT CAG ACC CTG AAC GTG GGG AA^C TTT TTT GAG CTC TACC 2399
Phe Ser GlG Slu Glu TTr Llu T^h- Tal GGy Ssr Tsr Tlu Glu Llu Asn
785 770 779
GTG ATT GTG ATT GTG TGG AAC GCA GGT GAG GAT TCT TAC GGA ACC GTG 244.
187 013
Val 800 Ile Val Thr Val Trp 805 Asn Ala Gly Glu Asp 810 Ser Tyr Gly Thr Val 815
GT0 AGO OTO TAO TAT OOA GOA GGG OTG TOG OAO OGA OGG GTG TOA GGA 2495
Val Ser Leu Tyr Tyr 820 Pro Ala Gly Leu Ser 825 His Arg Arg Val Ser 830 Gly
GOO OAG AAG OAG OOO OAT OAG AGT GOO OTG OGO OTG GOA TGT GAG AOA 2543
Ala Gln Lys Gln 835 Pro His Gln Ser Ala 840 Leu Arg Leu Ala Oys 845 Glu Thr
GTG OOO AOT GAG GAT GAG GGO OTA AGA AGO AGO OGO TGO AGT GTO AAO 2591
Val Pro Thr 850 Glu Asp Glu Gly Leu 855 Arg Ser Ser Arg Oys 860 Ser Val Asn
OAO OOO ATO TTO OAT GAG GGO TOT AAO GGO AOO TTO ATA GTO AOA TTO 2639
His Pro 865 lle Phe His Glu Gly 870 Ser Asn Gly Thr Phe 875 Ile Val Thr Phe
GAT GTO TOO TAO AAG GOO AOO OTG GGA GAO AGG ATG OTT ATG AGG GOO 2687
Asp 880 Val Ser Tyr Lys Ala 885 Thr Leu Gly Asp Arg 890 Met Leu Met Arg Ala 895
AGT GOA AGO AGT GAG AAO AAT AAG GOT TOA AGO AGO AAG GOO AOO TTO 2735
Ser Ala Ser Ser Glu 900 Asn Asn Lys Ala Ser 905 Ser Ser Lys Ala Thr 910 Phe
OAG OTG GAG OTO OOG GTG AAG TAT GOA GTO TAO AOO ATG ATO AGO AGG 2783
Gln Leu Glu Leu 915 Pro Val Lys Tyr Ala 920 Val Tyr Thr Met lle 925 Ser Arg
OAG Gln GAA Glu GAA TOO AOO Thr AAG Lys TAO Tyr TTO Phe 935 AAO Asn TTT Phe GOA Ala AOO Thr TOO Ser 940 GAT Asp GAG Glu AAG Lys 2831
Glu 930 Ser
AAA ATG AAA GAG GOT GAG OAT OGA TAO OGT GTG AAT AAO OTO AGO OAG 287S
Lys Met 945 Lys Glu Ala Glu His 950 Arg Tyr Arg Val Asn 955 Asn Leu Ser Gln
OGA GAT OTG GOO A1’O AGO ATT AAO TTO TGG GTT OOT GTO OTG OTG AAO 2927
Arg 960 Asp Leu Ala lle Ser 965 lle Asn Phe Trp Val 970 Pro Val Leu Leu Asn 975
GGG GTG GOT GTG TGG GAT GTG GTO ATG GAG GOO OOA TOT OAG AGT OTO 2975
Gly Val Ala Val Trp 980 Asp Val Val Met Glu 985 Ala Pro Ser Gln Ser 990 Leu
OOO TGT GTT TOA GAG AGA AAA OOT OOO OAG OAT TOT GAO TTO OTG AOO 3023
Pro Oys Val Ser 995 Glu Arg Lys Pro Pro Gln 1000 His Ser Asp Phe 1005 Leu 1 Thr
OAG ATT TOA AGA AGT OOO ATG OTG GAO TGO TOO ATT GOT GAO TGO OTG 302
Gln Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Oys Ser I le Ala Asp Oys Leu
1010 1015 1020
187 013
CAG Gin TTC CGC Phe Arg 1025 TGT Cys GAC Asp GTC Val CCC TCC Pro Ser 1030 TTC Phe AGC Ser GTC Val CAG GAG Gin Glu 1035 GAG Glu CTG Leu GAT Asp 3119
TTC ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG 3167
Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu
1040 1045 1050 1055
CAG AAG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GAA ATT ACG TTC GAC ACA 3215
Gin Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr
1060 1065 1070
TCC GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG 3263
Ser Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin Glu Ala Phe Met Arg Ala Gin
1075 1080 1085
ATG GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC 3311
Met Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile
1090 1095 1100
ATC ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA 3359
Ile Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr
1105 1110 1115
GCC ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AAG GAA ATG 3407
Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met
1120 1125 1130 1135
CTG GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC 3455
Leu Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe
1140 1145 1150
AGC TGT GTG GCC CCA AAT GTG CCT TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT 3505
Ser Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser
1155 1160
TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA 35 66
CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG 3625
AGATAGAGAT TGTAATGTTT TTACATATCT GTCCATCTTT TTCAGCAATG ACCCACTTTT 368 5
TACAGAAGCA GGCATGGTGC CAGCATAAAT TTTCATATGC T 3726 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1161 aminokwasów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:2:
187 013
Thr 1 Phe Gly Thr Val 5 Leu Leu Leu Ser Val 10 Leu Ala Ser Tyr His 15 Gly
Phe Asn Leu Asp 20 Val Glu Glu Pro Thr 25 lle Phe Gln Glu Asp 30 Ala Gly
Gly Phe Gly 35 Gln Ser Val Val Gln 40 Phe Gly Gly Ser Arg 45 Leu Val Val
Gly Ala 50 Pro Leu Glu Val Val 55 Ala Ala Asn Gln Thr 60 Gly Arg Leu Tyr
Asp 65 Cys Ala Ala Ala Thr 70 Gly Met Cys Gln Pro 75 lle Pro Leu His lle 80
Arg Pro Glu Ala Val 85 Asn Met Ser Leu Gly 90 Leu Thr Leu Ala Ala 95 Ser
Thr Asn Gly Ser 100 Arg Leu Leu Ala Cys 105 Gly Pro Thr Leu His 110 Arg Val
Cys Gly Glu 115 Asn Ser Tyr Ser Lys 120 Gly Ser Cys Leu Leu 125 Leu Gly Ser
Arg Trp 130 Glu Ile lle Gln Thr 135 Val Pro Asp Ala Thr 140 Pro Glu Cys Pro
His 145 Gln Glu Met Asp lle 150 Val Phe Leu lle Asp 155 Gly Ser Gly Ser lle 160
Asp Gln Asn Asp Phe 165 Asn Gln Met Lys Gly 170 Phe Val Gln Ala Val 175 Met
Gly Gln Phe Glu 180 Gly Thr Asp Thr Leu 185 Phe Ala Leu Met Gln 190 Tyr Ser
Asn Leu Leu 195 Lys lle His Phe Thr 200 Phe Thr Gln Phe Arg 205 Thr Ser Pro
Ser Gln 210 Gln Ser Leu Val Asp 215 Pro lle Val Gln Leu 220 Lys Gly Leu Thr
Phe 225 Thr Ala Thr Gly lle 230 Leu Thr Val Val Thr 235 Gln Leu Phe His His 240
Lys Asn Gly Ala Arg 245 Lys Ser Ala Lys Lys 250 lle Leu Ile Val lle 255 Thr
Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val lle Pro
260 265 270
Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly His 275 280 285
187 013
Ala Phe 290 Gln Gly Pro Ghr Ala 295 Arg Gin GIu Leu Asn 300 Thr lle Ser Sur
Ala Pro Pro Gln Asp His VaI Phe Lys VaI Asp Asn Phe da da Lru
305 330 315 320
Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr da Vsl Glu Gly
325 330 333
Thr Gln Ser .Arg Ma Ser Ses S^r Phe Gln His GIu Met Ser Gln Glu
340 334 335
Gly Phe Ser Thr da Leu Thr Met Asp GIy Leu Phe Leu dy dl Val
355 360 365
Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly GIy Ala Phe Leu Gyr Pro Pro Asn Mrt
370 337 380
Ser Pro Thr Piie; Ile /Asn Met Ser Gln Glu Asn VaI SS^sp Mrt dg Asp
385 330 395 400
Ser Tyr Leu Gly Tyr S^j? Ghr du Leu da Leu Tgp Lys Gly Val Gln
405 440 441
Asn Leu Val Leu GIy da Pro dr Sy^r Gln His Ghr Gly Syr da Val
420 442 443
lle Phe Thr Gln lal i>^r Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala GIu Val Thr
435 440 445
Gly Thr Gln Ile Gly Ser TTr Phe Gly da Ses Leu Cys Ser Sal Asp
450 445 460
VaI Asp Ser /Ap dy SSe Thr Asp Leu Ile Leu Ile dy Ala Pro His
4 65 470 445 480
Tyr Tyr Glu dn SGi dr Gly dy Gln Val Ser Val Cys Pro Leu Pro
485 440 449
Arg Gly dn Arg VaI Gln Tnp dl SCr Asp A1 a VaI Leu dr dl Glu
500 555 550
Gln Gly His Hro Trp Gly Arg Phe Gly Ala da Leu Thr Val Leu dy
515 550 552
Asp VaI Asn Glu Asp Lys Lee Ile Asp VaI da Ile Gly da Pro Gly
530 553 550
Glu Gln dl Ass Asr Sly da VaI Tt^j^ Ilu Stu Hii Gly Ala Ser Glu
545 550 555 550
Ser Gly Ilu Ser Pro Sen His Ser Gln Arg Iie Ala Ser Ser Gin Lru
565 570 575
187 013
Ser Pro Arg Leu 580 Gln Tyr Phe Gly Gln 585 Ala Lsu Ser Gly Gly 590 Gln Asp
Leu Thr Gln Asp lir Leu Met Asp Leu Ala VuS Gly Ala Arg Gly Gln
595 600 605
Val Leu Leu Lsu Arg Ser Leu Pro Val Lsu Lys Val Gly Val Ala Met
610 615 620
Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lyr Ala Val Tyr Arg Cys Trp du
625 630 6135 640
Glu Lys Pro S er Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thi? Val Cys Leu Thr
645 650 665
lle Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val
660 66 5 660
Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp - Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile
675 660 68 5
Phe Asn Glu Thr Lys /Asn Ppo Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
690 669 700
Leu Gly Ile SIis Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val
705 770 775 720
Glu Asp Val Val Ser Pro Ile; lle Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val
725 730 775
Arg Glu Pro Ile ror Ser Pro Gln Asn Lsu Arg Pro Val Leu Ala Val
740 7 75 770
Gly Ser Gln Assp LeU Phe Thr Ala Ser Lsu Pro Pile Glu Lli Asn Cys
755 770 165
Gly Gln Asp Gly Leu Cyy du Gly Asp Leu Gly Val Thr Llu Ser Phe
770 775 780
Ser Gly Leu Gln Thr Llu TTr Val Gly Ser Ser Leu f!u Llu Asn Val
785 770 775 800
lle Val Thy Vvl Tt? Asn SAu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Tir Val Val
805 880 881
Ser Leu Tyy Tyr Pro ALa Gly Lis ree Hls ATg Ar tg Vv1 Sss Glę! Ala
820 822 883
Gln Lys G ln Pro His dn Ser Ala Sus Arg Leu ALa Cci du TTr Val
835 840 880
Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His
850 855 860
187 013
Pro 865 Ile Phe His GLi GLy 870 Ser Asn Gly Thr Phr 875 ILe VvL Thr hhr Asp 880
Val Ser Syr Lys ALa 885 Cho Leu GLy Asp Arg 890 Met Lei Met Aog ALa 895 Ser
ALa Ser Suo GLi 900 Asn Asn Lys ALa Ser 905 Seo Sur Lys ALa Thr 910 Phe GLn
Leu Glu Leu 915 Pro Val Lys Tyr ALa 920 Val Tyr Thr Met le- 255 Uo i Arg dn
Gli GLu 930 Sep Thr Lys Tyr Phi 935 Asn Phe Ala Thr Suo 940 Asp Gli Lys Lys
Met 945 Lys Glu AL-a Glu hsi 95I Arg Cyo AOgg Val Asn 55I Assn Leu Seo Gln JArg 960
Asp Leu JA a Ile Ser 965 Ile Assn Phie Trp Val 979 Pro Val Leu Lei Asn 975 Gly
VaL Ala Val Trp 980 Asp Val VaI Met Glu 9(3 5 ALa Pro Ser Gln Ser 990 Leu Pro
Cys VvL Ser 995 Glu Aog Lys Pro Pro Gln 0005 Hii Ser Asp Phe Leu 1055 hhr dn
Lle Ser Aog 1010 Ser Ppo Met Lru Asp 0505 Cyy Ser Ilu AALi Asp 1020 Cys Lei Gln
Phe Arg 1025 Cys .Asp VaL Poo Ser 1030 Phe Ser Val Lii Lii 005 I GiA Leu Asp PPU 1040
Thr Leu Lys GLy Asn Lru 1045 Ser Phe Gly Trp VuI 1010 Ar- Glu Thr Leu 1055 GGn
Lys Ley Val Luu 106C Val 1 Val Ser Val ALa 1065 Glu 1 LLr Thr Phe Asp 107C Thr 1 Sur
Val Syr Ser 1075 Gln Lru Pro Gly Gln 0585 GLu I ALv Phe Met Arg ALv 1085 Gln Mrt
Glu Met 1090 VaL 1 Lri GLu Glu Asp 1095 GLu VvL Syr Asn ALa 1W0 Lle 1 Pro ILe LLe
Met 1105 Gly Ser Ser VaL Gly UW JALa Leu Leu Leu Leu 115I Jlla Leu lle hhr AAu 1120
Thr Leu Syr Lys Leu 1125 Gly Phe hhr Lys Arg im His Tyr Lys di Met 1135 Leu
GLi Asp Lys Poo 1140 Glu Asp Thr Ala Thr 3145 hhr Ser GLy Asp Asp 3155 hhr Ser
187 013
Cys VaI Ala Pro Asn VaI Pro Lys Ser 1155 1160 (2) INFORMACJA DLA WERYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:
( i) CHAIRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 0052 aminokwasy (B) GYP:aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:pojrdsnczl (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSGECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI : WERYFIKATOR SEKWENCJI NR:3:
Met 1 ALa Lye .Arg Val 5 Lru Leu Leu Thr AILa 1T Lru Ghr Lru Cys His 15 Gly
Phe Asn Llu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn TALa A\og
20 25 30
Gly Phe GIy Gln Ser Val Val GIn Leu Gln Gly Se. Arg Val Val VaI
35 40 45
Gly Ala Pro Gln Glu I le IrT Ala AIa Asn Gln Arg G1 y Ser LeA Tgi
50 55 60
GLn Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys Glu Poo I1t AOrg Leu Gln ViI
65 70 75 80
Pro VaI Glu ALa Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala ALLa Gho
85 90 95
Ghr Ser P ro Pro GIn Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr V^<^1 Hj_i GGn Wo
100 105 110
Cys Ser GIu Thr Tyr SoT Lvi Lys Is T Cys Phe Le u Phr rup Ugi
115 120 m
Asn Leu Arg Gin GIn Pro GIn Lys Phe Pro Glu An- Llu TArg GGy Cys
130 135 no
Pro Gln Glu Asp Srr Asp Ile ALLa Phu Leu lle Asp Gly Ser Gly Seo
155 150 155 160
Ile Ile Pro His Asp Phe Arg Arg Mrt Lys Glu Phe Val Ser Ghr VaI
165 170 175
Met Glu G in Leu Lys T ys Se t Lys· Thr Lou Phe hry Leu PhU Gln O .r
180 185 119
Ser Glu Glu PPe Arg Ile His Phe Πο Phr Lys Glu PPh Tie A^n Asn
195 200 225
187 013
Pro Asn 210 Pro Ar^g Srr Leu Val 22.5 Lys Pro Ile Thr Gin 220 LLe Leu Giy Arg
Thr His Thr Ala Thr Gly Ile Arg Lys Val Vii Arg Glu Leu Phe Asn
225 230 235 240
Ile Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn TAla Ptie Lys Ile Leu Vai Val Ile
245 250 255
Thr Asp Gly Glu Ly s Phe ys r Ash rro Im Gly Tyr Glu Gny VaT In
260 265 270
Pro Glu AIi Asp Arg Glu Gly Val Ile Arg Tyr Val Ile Giy Val Gly
275 220 285
Asp Ala Phe Arg Ser Glu Lyy Ser Arg Gln Glu Leu AAn Thr Ile Ala
290 229 300
Ser Lys Pro Pro Arg Asp ris Vvl Phh Πη Val Asn Asn Phe Glu Ali
305 310 315 320
Leu Lys Thr Ile Gln /As rln rm .Trg nu Lys Ile Phe Ala Ile Glu
325 330 335
Gly Thr Gln Thr Gly Ser Ser Ser Ser Phe Glu His Giu Met Ser Gln
340 345 330
Glu GIiz Phe Ser Ala Ala Ile TTir Ser Asn Gly Pro Leu Leu Ser Thr
355 330 365
Vil Gly See Tyr Asp Hp AAl Gly Gly Vii Phe Leu TTy Thr Ser Lys
370 335 330
Glu Lys Ser Thr Phe 11l Asn net TTr TAr Tal Asp Ser Asp Met Asn
385 330 395 400
Asp Ala Tyr Leu Gly TTr H.n TAn TAi Hu Ile Llu TArg Asn Arg Val
405 4 40 44.5
Gln Ser Leu Vil Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gin His Ile Giy Leu Vii
420 425 430
Ala Met Phe Arg Gln Asn Thr Gly Met Trp Glu Ser Asn Ala Asn ViI
435 440 445
Lys Gly Thr Gln Ile Gly Ala Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Oys Ser VaI
450 455 460
Asp Vil Asp Ser Asn Gly Ser Thr Asp Leu Vil Leu Ile Gly Ali Prc
465 470 475 480
His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gin ViI Ser Vai Oys Pro Leu
485 490 495
187 013
Pro Arg Gly G Gn 500 Lrg ALa AUl Trp G Ln 5005 Cys Asp Ala Val LAn 51.0 Lyr gul
Glu Gln Gly 515 G Gn Lro T rp TOy Arg 520 Phe Gly Ala Ala Ueu 525 TAu V al eei
Gly Asp 530 Val Asn GIy Asp Lys 535 Leu Thr Asp VaU Ala 540 IUe GIy AUa Poo
Gly 545 Glu Glu Asp Asn TArg 550 GIy AULa Val Tti Llu 555 Phe His Gly Tho Ser 560
Gly Ser Gly UUe Ser 565 Poo Seo His Ser Gin 570 LArg UUe AUa GIy Seo 575 Lys
Leu Ser Pro Arg 580 Leu Gln Tir Phe Gly 555 GUn Ser Leu Ser Gly 590 Gly Gln
Asp Leu Thr 595 Met Asp Gly Leu Val 600 /Asp Leu Thr Val Gly 605 Ala Gln GJLy
His VaI 610 Leu Leu Leu Arg Ser 61r, Gln Pro Val Leu AOrg 620 Val Lys AUla UUe
Met 625 Glu Phe Asn Pro Arg 33 L Glu Val AULa AOg As>n 635 Val Phe Glu Cys Asn 640
Asp Gln Val Val Lys 645 G1l Lys Glu AUa Gly 650 Glu Val AOrg Val Cys 655 Leu
His Val Gln Lys 660 Ser Thr Arg Asp AOg 665 Leu Arg ULu Gly Gln 667 He Gln
Ser VgU VaU 675 Thr Tyr Asp Leu AULg 680 Luu Asp Ser Gly Arg 685 Ppo His Ser
Arg Ala 690 Val Phe Asn GIu Thr 695 Lys Asn Ser Thr Arg 700 Arg dn Thr Gln
VaI 705 Leu Gly L eu Thr Gln 710 Tho Cys Glu Tho Lee 715 Lys Leu GUn Leu Pro 720
Asn Cys Ile G Ul Asp 725 Pro Val Ser Poo Ule 730 Val Leu Arg Leu AAsn 735 Phe
Ser Leu Val Gly 740 Thr PrL Leu Ser Ala 745 Phe Gly Asn Leu AArg 750 Pro Val
Leu Ala Glu 755 Asp AULa Gln AOrg Leu 760 Phe Th o AAla Leu Kie 765 Pro Phe Glu
Lys Asn 770 Cys Gly Asn Asp Asn 775 UUe Cys GUn Asp Asp 780 Leu Ser IUe Thr
187 013
Phr 785 Ser Phe Met Ser Llu 779 Asp Cys Leu Val Val 7 95 Gly Gly Pro
Phe Asn Val Thr Val TTr Val AOg Asn Asp Gly Glu Asp Ser
805 810
Thr Cln VaV T Cr Thr Thr Phe Pro Leu Asp Leu S ss Uuu Ar p
820 825 830
Ser Thr Leu GTu Ass PTu Arg Ser Gin Arg Ser T sp Aeg Le p
835 840 88 5
CUu Ser TAL a Ser Seo Thr Glu Val Ser Gly AUa Leu Lys Ser
850 855 860
Cys Srr ILll Asn His Per Ile hhr hro Glu Asn Ser Glu Val
8 65 887 885
Asn UUe TTr Phe Asp VaJ Asp Srr Lys JALa Ser Leu Gly Asn
885 890
Leu Leu Lys Ma A sn nAM Thr Ser G lu Asn Asn Mas Aso Arp
900 905 99^0
Lys Thr Gln Phh TTn Teu Tlu Leu P ro Val Lys Pya sys Sl T
915 990 995
VaU Vv1 TTr Sro His Gly Val Ser Thr Lls Tyr Llu Asn Phe
930 995 990
Srr Glu Asn Thr Sro Arg VaU Mrt Gin His CUn Tyr lUn Val
945 950 955
Leu Gly Gin Arg Srr Leu Pro Ile Ser Leu VaU hhr Lru Val
965 979
Aog Lru Asn Glu TTr Vaa Ule Trp Asp Aog hro Gln aal. Thr
980 985 990
Tlu Asn Leu T er Ser Thr Cyp His Thr Lys Tlu Arg Leu Pro
995 1000 1005
Ser Asp Phe: L lu Ala Tlu Leu Arg Lys TALa hro VaT Val Asn
1010 105T 1020
Ule AUa VaU Cys CUn Arg IUe Gin Cys Asp Ule hro err hhu
1025 1030 1035
CUn CUu CUu hhr Asn TAL a Thr Leu Lys Gly Asn Lru Srr hhr
1045 1010
Arg Glu 800
Tyr Arg 815
Lys sos
Ala Ogs
Thr Ser
Thr Phe 880
Lys Leu 8 95
Thr Osa
Tyr UiV
Thr TALa
Ser Asn 960
Pro a^ć^l 975
Phe Seo
Sro His
Cys Ser
CUy lUr 1040
Asp Toc 1055
Tyo llr Lys Tho Sro iis Asn iis Leu Lru Ulr Val Sro Tho Ala Glu 1060 1065 1070
187 013
Iie Leu Phe Asn Asp 1075 Ser Val Phe Thr .1080 Lru Leu Pro Gly Gln Giy da 101)8-5
Phe VaI Arg Ser Gln 1090 Thr Glu Thr Lys 1055 Val Glu Pro Phe Glu Val Pro 1100
Asn 0000 Pro Lru Pro Leu Iie VaI 1110 Gly Ser Ser Val 11.1 5 Gly Gly Leu Lru Leu 1200
Leu Ala Lru Ile Thr 0000 Aia Ala Leu Tyr Lys 1130 Leu 1 Giy Phe P1u Lys Arg 1135
Gin Gyr Lys sssp Met Met Ser Glu Gly Gly Pm Pro Giy da Giu Pro
1140 1170 0000
Gin (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 0003 aminokwasy (B) TYP:aminokwas (C) NICIOWOŚĆ^ojudyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:4:
Mrt 1 Thr dg Thr dg 5 da SULa Leu Leu Lru 10 hUs Thr Aia Leu da 15 Thr
Ser Leu Gly PPi Asa nsu yysu Ths G Su Glu Leu Thr da Phe dg UaP
20 275 30
Asp Sur Ala G ly Shr Gly Alp Ses: Val VaV Ha dyn ds Asn Ssn Trp
35 40 45
Val VaI VaI Gly Aia Pro Gin Lys ile Ile SULa da Asn Gin Ile Gly
50 55 60
Giy Leu Tyr Gln Cys GLy Tyr Sur TIii Gly da Cys Glu Pro Ile Gly
65 70 7S 80
Leu Gin VaI Ppo Pro Giu SUa Vai Asn Met Ser Leu Giy Leu Ser Leu
85 90 95
Aia Suo IOs hr i Ser Pro Ser Gin Leu Leu da Cys Gly Prr G1o VvL
100 105 m
His His nu a cy s Giy Arg Asn Met Tyr Lsu Thr Gly Leu Ccs Phe Les
115 120 125
Leu Giy Pro G1o Gln Lsu Thr Gln dg Leu Pro VhL Ser Arg Gin Gly
130 135 114
187 013
Cys 045 Pro Arg Gln Glu Gln 150 Asp IIs Val Phe Leu 155 lle Asp Gly Ses Gly 160
Ssr lle Ser Ser Arg 165 Asn Phe Ala Thr Met 117 Mst Asn Ptse Val Arg 755 Ala
Val lle Ser Gln 180 Phe Gln Arg Pro Ssr 185 Thr Gln Phe Ssr Leu 190 Mst Gln
Phs Ser Asn 195 Lys Phe dn. Thr His 22130 Phs Thr Phe GIul Glu 205 Phs Arg Arg
Thr Ser 210 Asn Pro Lsu Ssr Lsu 211 Leu Ala Srr Val His 2220 Gln Leu dn Gly
Phe 225 Thr Tyr Thr Ala Thr 230 Ala lle Gln Asn Val 235 Val His Arg Leu Phs 240
His Ala Ssr Tyr Gly 245 Ala Arg Arg Asp Ala 225 Ile Lys lle Lsu He 255 Val
lls Thr Asp Gly 260 Lys Lys Glu Gly Asp 2 65 Ser Lsu Asp Tyr Lys 270 Aas Val
lle Pro Met 275 Ala Asp Ala Ala dy 280 lls lir Arg Tyr Ala 285 lle dl Gal
Gly Leu 290 AALa Phe Gln Asn Arg 229 Asn Ser Trp Lys Glu 300 Leu Asn Asf> Ile
Ala 305 Ser Lys Pro Ser Gln 310 Glu His lle Phs Lys 315 Val Glu Asp Phs Asp 3220
Ala Leu Lys Asp lle 325 Gln Asn Gln Lsu Lys 330 Glu Lys lle Phe Ala 335 Ile
Glu Gly Thr Glu 340 Thr lle Ser Ser Ser 334 Ses Phs Glu Leu Glu 350 MeS Ala
Gln Glu dy 355 PPr Ses AALa Val Phs 360 Thr Pro Asp dy Pro 365 Val Lls Gl^
Ala Val 370 Gly Ser Phs Thr Trp 375 Ser Gly Gly Ala Phe 380 Lsu Tyr Pro Pro
Asn 385 Mst Ser Pro Thr Phs 390 lle Asn Met Ssr Gln 395 Glu Asn Val Asp Mst 400
Arg Asp Ssr Tyr Leu 405 Gly Tyr Ser yrr Glu 410 Leu Ala Lsu Trp Lys 415 Gly
Val Gln Ser Leu 420 Val Lsu Gly Ala Pro 425 Arg Tyr Gln His lle 430 Gly Lys
187 013
Ala VaI Ile 025 Phe IIe Gln VaI
Val Ile 550 Gly Thr Gln He GIy 4 55
Val 56!5 Asp Val Asp Thr Asp 470 Gly
Poo His Tyr Tyr Glu 585 Gln Thr
Leu Poo AArg Gly 500 Trp AOrg Arg
Glu Gln GGy 515 His Pro Trp Gly
GIy Asp 530 Val Asn Gly Asp Lys 535
Gly 555 Glu Giu Glu Asn Arg 550 Gly
Gly Poo SSr Ile Ser 565 Pro Ser
Leu Seo SSr Arg 580 Leu Gln Tyr
Asp Leu Thr 595 GIn Asp Gly Leu
GIn VaI 610 Llu Leu Leu Arg Tho 615
Met 020 Gln Phe Ile Pro Ala 660 Glu
Glu GIn Vv1 VaI Ser 655 Glu Gln
Gyo Ile Aas Lys 660 Aorg Ser Lys
Seo Sro Vaa. 675 Thr Leu Asp Leu
Aog Ala 690 Ile Phe GIn Glu Gho 695
VaI 705 Leu Gly Lru Lys AIi 710 His
Arg GIn Trp Arg Met 455 Lys AAla Glu
Tyr Phe GIy Ala 460 Ser Leu Cys Ser
Thr Asp Luu 575 VaI Leu Ile Gly AALa 4130
Gly Gly 490 GIn VaI Ser Val Cys 495 Pro
TlOP 505 Cys Asp Ala Val Leu 510 Tyr Gly
Phe Gly Arna Ala Leu 525 Thr Val Leu
Thr Asp VaI Val 540 Ile Gly Ala Pro
Val Tyr Leu 050 Phr His Gly Val Leu 550
Ser Gln 550 Arg IIu AALa Gly Ser 555 Gln
Gly 555 Gln Ala Leu Ser Gly 590 Gly Gln
Asp Leu Ala Val Gly 665 Ala TAog Gly
Pico Val Leu Trp 620 Val Gly Val Ser
Pro TAog Seo 635 ALa Phe Glu Cys AArg 660
Leu Val 660 Gln Srr AAsn 11(5 Cys 665 Llu
Leu 666 Leu Gly Ser Arg Asp 660 Leu Gin
Leu ALa Poo Gly Arg 668 Leu SSr Piso
Asn Arg Ser Leu 700 Sro Arg VaI Aog
GLu Asn Phr 715 Asn Lru Lru Leu Poe 720
187 013
Sal Cys Val Tlu Asp 725 Seo VaU Uir hoe Ilr 730 Ulr Uru Aog Ueu Asn 735 Phr
Thr Lru Val Gly Lyp Pr o Leu Le u ru. t Phe Arg Ar p Lep AU p Lrp Met
740 775 750
Uru JALa Ala Cna Ala Gln Aap Tna The Lhc ATa Ser Aga Aaa Phe LSu
755 760 765
Uys Asn Cys Gly Ala Asp His sT e Cys UAt Ac;p Asn Ltu Asp sne 3tl
770 775 780
Phr Srr Phu hos Gly Ueu Uys Ser Leu Leu VaL Cly Sal Asn Ueu Alu
785 790 7 95 800
Uru Asn AUa Tlu VaL Met Val Top Asn Asp TLy CLu Asp Seo Tyr Cly
805 810 815
Tho TAo Ulu Tho hhr Sal His PAe AUa TLy Ueu Seo Tyr Aog Tyo VaU
820 882 880
AUa GTu Tly CUn Lys Gln Gly CUn Leu Aog Sur Lau His Luu Tho Ccs
835 840 845
Cys Srr AUa Peo Val Tly Seo Gln Gly Tho Top Ser CAr Ser Cys JArg
850 855 860
UUr Asn His Ueu UUr hhr Aog Tly Gly AUa Cln nar CAr Phr Ueu ALa
865 870 875 980
Thr hhr Asp VaL Ser hos Uys AUi Val CLy Ueu Asp Aog Ueu Uru Lru
885 890 895
Lir AUa Asn aal Ser Ser Glu Asn Asn ULr Peo Arg Thr Seo Lys Thr
900 9ΰ5 910
UUe hhr (Tin Leu Glu Leu Pro aaU Lys Tyr CULa Val Tyr Ile Val Val
915 920 925
Srr Srr His GTu Pin Phe ruc L ps Tyr Ssp Asn Phe 3t r Asn Ars LTu
930 93 5 940
CUu Lys Glu Ser His VaU AUa Mrt His Aog Tyr Cln VaL Asn Asn Uru
945 950 955 960
CUy CUn Aog Asp Lru hro VaU Sro nar Asn PAe Top VaL Pre Val CLu
965 990 975
Lru Asn (Tn Glu AA a pa i Tc- Mrt Ass pan Glu Val Ser His Pro Gln
980 998 990
Asn hos Sal Lru Aog Cys Seo Sro Tlu Lys Uie AUa hos Pro AUa Sal 995 1000 1005
187 013
Asp Phe Leu Aia 1010 His I le ner Lgi Asy 105T Pro Val Leu Asp 1020 Vin SeL u Ta
Aia Gly Oys Leu Sr?g Phe Arg Cyr sssp VaT Por Srr Phe Ser Val Gln
1025 0H I 1000
Giu Glu Leu Asp Phe Thr Leu Lys Gly ys t Leu Ter Phe Gey Tep he I
1045 1050 1(0^^
Arg Gin Ile Leu Gln Lys Lys Val Ser VuI Val Ser Val Ala Giu n e
1060 1651 1070
ile Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu AU i Phe
1075 1801 1085
Met Arg Ali Gln Thr Ile Thr Val Leu Glu Lys Tyr Lys Vil His Asn
1696 10995 1066
Pro ile Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Ile Gly Gly Leu Leu Leu Leu
1105 111.0 1151 im
Ali Leu ile Thr SULa Val Leu Tyr Lys Val Gly Phe Phe Lys Arg Gln
1125 1130 11^3^
Tyr Lys G!u Met Met Glu Glu SULa sssn Gly Gln Ile Ala Pro Giu Asn
1010 114T mo
Giy Thr GGn Thr Pro Ser Pro Pro Ser Glu Lys
1155 1.160 (2) INFORMAOJA DLS IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:5:
(i ) OHARAKIERYSTYKA SEKWENOO JI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 ^śnokwisów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:5:
Phe Asn Leu Asp Vai Glu Glu Pro Met Val Phe Gln 15 10 (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:6:
(i)OHARAKTERYSTYKS SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA
187 013 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:6:
CSYAAYYCGG AYGCNGARGA RCCNACGGSN ChYCA 35 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:
( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:7:
CCCCACCCGT AGTTGGCGTA GCGGCCTGSG CCGGCC 3 6 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:8:
CSCCAGGCGG CGTCNTCASsA NCGCCSGGCG CCGGCA 36 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:
(L)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedynczl (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:9:
CCYCAYYSNG AYGCNGARGA RCC 23 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NRTi.!:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
187 013 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:10:
TGYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:11:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) GYP: kwas nukleinowy (C) NlClOWOŚĆ:Gojudyacza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:11:
TGRAANACCA GNGGYTC 11 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ^ojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (Ci) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:12:
GGGGSAGACC ATNGGYTC 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) GYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ^ojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:13:
AGTSACCCTC ACTAAAG 11 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:
(lJCfflSRĄKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
187 013 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:14:
CATACGCCSC CGCACCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 15:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: llamilokwαnr (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: prptyd (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:15:
VaL Phr Gln GLu Xaa Gly ALa GLy Phr GLy Gln 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: prptyd (Xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:16:
Leu Syr Asp Xaa VaL ALa AUi Cho GLy Lru Xaa Gln Pro ILr 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:17:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 02lminokwasr (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: prptyd (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:17:
hro Lru GLu Tyr Xaa Asp Val ILr hoo GIi ALa GLu 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:18:
( i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa
187 013 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:18:
PIu Gin Giu Giy Phe Sur Xaa VaI Lru Xaa 15 10 (2) INFORRMSCJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 19:
(iJCCUSRAKTERYSTYKS SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17nmraokwnsy (B) GYP:nmraokwno (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: puptyd tyi-OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:19:
Thr Ser Pro Thr Phe Ilu Xaa MetSer Gln Glu Asn lud Asp 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:20:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) GYP:amraokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: puptyd (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR: 20:
Lru Val VaI Giy Ala Pro Leu Hu Val Val Ala Val Xaa dn Shr GLs 15 10 15
Arg (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR^:.
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: puptyd (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:21:
Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr SUa 1 5 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:22:
(l) CfHARSKTERYSTYKS SEKWENCJI :
(S) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów
187 013 (B) lYOzarainokwis (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Uiniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:22:
Phe GUy GUu GUn Phe Seo GUu 1 5 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:23:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP5: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedinczG (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:23:
RAANCCYTCY TGRAAACTYT C 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:24:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1006 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:24:
TTCAgCCTGG ACGTGGAllA GCCCATGGTG TTC^AGAGGA TllAGCTlGC TTTllACAlA 60
GCGTGGCCCA GCTTGlCGJg TCTAGACTCG TlGTGGlAGC CCCCCTUAG GTGlTlGCGG 120
τcggccggAC AGGAAGGTTG TATlACTGTG TlGCTGCCgC tggccttgtc gACCcATACC 180
CCUCACACA CCCCCAGATG CTGTGAACAT gtccctgggt CTGTCCCTGT CAGCCGCCGC 240
cglτclcccc TGlCTGCTlG CCTlTlGCCC gACCATlCAC gGglccτGTG GGGgGgATAT 300
lTATGCoglgg lGCTTTTlCC τccτlττlGg CTCCCATCTG CAGACCATTT GGACAGTACC 360
TGCTGCCCTA CCAGAGTlTC CgAlTCAAGA GgτGGgcgττ GTCTTCCTGA TTGATGGTTC 420
TGGCAGTATG AlCAgAGTlA cτττAgACAg gτGggllATτ TGTGAGAGCT GTGATGGGAC 480
glTTTlAllG CAC^A^CC CTlTTCTCAC TlATACAlTA TCCCACCTCC CTlgAGATCC 540
187 013
ACTTCACCTT CACGCAATTC CAGAGCAGCT GGSACCCTCT GAGCCTGGTG GATCCCATTG 6.00
TCCSACTGGA CGGCCGGACA TATACAGCCA CGGGCATCCG GSAAGTGGTG GAGGSACTGT 660
TTCATAGTSA GAATGGGGCC CGGAASAGTG CCAAGAAGAG CCTCATGGTC AGCACAGATG 720
GCASSSAGAC ASAGACCCCC GGGAGTACGA GGACGGAGCC CCAGGCAGAG AGAGCGGATC 780
ATCCGCTATG CCAGTGGGGT GGGAGATGCT TTCGGGAAAC CCAGTGCCAA GCAGGAGCTG 840
GACSACATTG GCTCAGAGCC GGCGCAGGAC CATGGGTGCA GGGGGGACAA CGTTGCAGCA 900
CTCAGCAGCA TCCAGGAGCA GCTGCAGGAG AAGAGCGGTG CACGCGAAGG AACCCAGGCG 960
ACGACAAGTA GCGCGTTCCA ACATGAGATG TTCCAAGAAG GGGTCA 1006
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 25:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZSJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:25:
GGNTTYCARG ARGAYGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:26:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZSJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:26:
CCACTGTCAG GAGGCCCGTG 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:27:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlCIOWOŚĆ:Gojsdyaczn (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
187 013 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:27:
S\GCCAGGAAS CGTGGCCCCC GGGCCCCCGG GCGCSCCCCC CG 42 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:28:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ:pojećlyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:28:
AGCTACGAAC CGTGGACGAC GAGCGTTA.CS GCGCSSCCCG CG 4 I (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:29:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:29:
CGSCCCTACS CGTGGACCCC TAGGCCGGGG ACCTCG 36 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:30:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukLeinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedrlczl (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:30:
CCGCCGACSG CGCTCAGCCC 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:31:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
187 013 (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:n:
lThOTGAOGO GhSAhGlOAT hGhAlSOOhO GTOTTO 33 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:32:
(i)OiARAKTERYehYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasid (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA (xś) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:32:
AOGTShGOAl GAhOOOAhOA AlAGATGlAO STODOT 31 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:33:
(i) OHARSKTERYSTYKA SEKWENOJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasid (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:H:
AOTGCAhlhO TOGAlGOTlA SΛ.lOOTTOThl lGAOAhO 37 (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:34:
(i) O^^^SRAKTERYSTYKS SEKWENOJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zisid (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ-.pojedynczi (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:H:
TATAGSOhlO TGGlhAlTOO OOAO 24 (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:35:
( i ) O^S^SKTERYSTYKS SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ:pojedyncza
187 013 (D) TOPOLOGIA: Liniewa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:35:
CGAAGACCTG nTTTAAATAA CAGA 2 4 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 36:
(i)CIHARSKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3528 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:eejAdyecza (D) TOPOLOGIA: liniowa (is) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KUUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..3456 (ri) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:36:
TTC TUy 1 CTT Top TTT Ala CTT Ueu CCT AUa 5 TCC Seo TTT Cys CAT His CTC Tly TTC Srr 10 AAC Asn CTT Lru TAT Asp TTT Val TAC Glu 15 CAA CUu 48
TCT ACC TCT TTC ATA TAC CAT CCA CTC AGT TTT CTA CAT ATT TTG CCT 96
Pas ILa VaU hhe 20 Aog CLu Asp SALa TALa 25 Sro hhe CUy Cln TAr 30 VaU VaU
TAT CCC TTC TCA TCT CTA CTC CCC TCC CTA TCC CCC CTC TAC CTC TTT 144
TLn PAa Tly 35 Tly Seo Aog Lru VaU 40 ViL Cly SALa hre Lru 45 Tlu Ala Van
TCA TCT AAC CAA ACA TTA CTT TCC TAT TAC TCT CCA CCT CCC ACT CCC 192
ALa ViL 50 Asn Cln TAo CUy Aog 55 Uru Tyr Asp Cys AUa 60 hro Ala Thr Tly
ACT CTT TAT CCC ATC CTA CCC CCC ATT CTT CTA TAC TCA CCC AAT ATT 240
Mrt 65 Tys TLn Pro Ilr VaL 70 Leu Arg Sro Pas Leu 75 CUu AUa Val Asn Met 80
CCT CCT TTC CTC TCT TTT CTC ATT CTC ATT AAT AAC CCC CAC TTT CTC 211
Sfer Lru TUy Uru Seo 85 Lru Val TAo ALa TAo 90 SCsn Asn AUa TUn Lru 95 Ueu
TCT CTC TTT CCA ACC TCA CAC ATA TTT TTC TTC AAC AAC ACC TAT CCT 336
ALa Tys Tly hoo 100 TAo Ala CUn Aog ALa 105 Cys VaL Lys Asn Mrt 110 Tyo Ala
AAA TTC CTC TTC CTC TCC TTC CTC CTC ATT TTC CAT TTC ACC CAT CCA 384 Uys Tly Sal Cys Lru Lru Lru Cly Sal Sal Lru CUn hAr Ilr Tln AUa
115 120 125
187 013
GTC VaI CCT Pro 130 GCC Ala TCC Ser ATG Met CCA Pro GAG Glu 135 TGT Cys CCA AGA CAA GAG Glu 140 ATG Met GAC Asp ATT lle GCT Ala 432
Pro Arg Gln
yyc CTG Ayy GAT GGT TCT GGC AGC ATT AAC CAA AGG GAC TTT GCC CAG 480
Phe 145 Leu lle Asp Gly Ser 150 Gly Ser lle Asn Gln 155 Arg Asp Phe Ala Gln 160
ATG AAG GAC TTT GTC AAA GCT TTG ATG GGA GAG TTT GCG AGC ACC AGC 528
Met Lys Asp Phe VaI 080 Lys Ala Leu Met Gly 170 Glu Phe Ala Ser Thr 175 Ser
ACC ttg TTC TCC CTG ATG CAA TAC TCG AAC ATC CTG AAG ACC CAT TTT 071
Thr Leu Phe Ser 180 Leu Met Gln Tyr Ser 185 Asn lle Leu Lys Thr 190 His Phe
ACC TTC ACT GAA TTC AAG AAC ATC CTG GAC CCT CAG AGC CTG GTG GAT 624
yrr Phe Thr 195 Glu Phe Lys Asn lle 200 Leu Asp Pro Gln Ser 205 Leu VaI Asp
CCC ATT GTC CAG CTG CAA GGC CTG ACC TAC ACA GCC ACA GGC ATC CGG 672
Pro lle 210 VaI Gln Leu Gln Gly 215 Leu Thr Tyr Thr Ala 220 Thr Gly lle Arg
ACA GTG ATG GAA GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGG TCC CGT AAA AGT 720
yrr 225 Val Met Glu GIu Leu 230 Phe His Ser Lys Asn 235 Gly Ssr Arg Lys Ssr 240
GCC AAG AAG ATC CTC CTT GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TAC AGA GAC 582
Ala Lys Lys lle Leu 245 Leu VaI lle Thr Asp 250 Gly Gln Lys Tyr Arg 255 Asp
CCC CTG GAG TAT AGT GAT GTC ATT CCC GCC GCA GAC AAA GCT GGC ATC 816
Pro Lsu Glu Tyr 260 Ser Asp VaI lle Pro 265 Ala Ala Asp Lys Ala 270 Gly lle
Ayy CGT TAT GCT ATT GGG GTG GGA GAT GCC TTC CAG GAG CCC ACT GCC 460
lle Arg Tyr 275 Ala lle Gly Val Gly 280 Asp Ala Phe Gln Glu 285 Pro Thr Ala
CTG AAG GAG CTG AAC ACC ATT GGC TCA GCT CCC CCA CAG GAC CAC GTG 912
Leu Lys Glu Leu Asn Thr lle Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val
290 295 300
TTC AAG GTA VaI GGC AAC TTT Phe 310 GCA GCA CTT Leu CGC AGC ATC lle CAG Gln AGG Arg CAA GIn CTT Leu 320 960
Phe 305 Lys Gly Asn Ala Ala Arg Ser 315
CAG GAG AAA ATC TTC GCC ATT GAG GGA ACT CAA TCA AGG TCA AGT AGT 1008
Gln Glu Lys lle Phe 325 Ala IIs Glu Gly Thr 330 Gln Ssr Arg Ser Ser 335 Ssr
187 013
CCC Sur CCC Phe CAG GLi CAC His 340 Gd Glu ACG Met CCA Suo CAA GLi TCA Gnu 345 GGC Gly CTC Phr AGC Suo CCA Suo GCT ALa 350 CCC Lei aca Thr 1056
CCG GAC TTC CCC GCC CCG GCC GIG GGA AGC CTC AGC CGG CCC TTA 0054
Ser Asp GLy 355 Pro ViL Leu GLy AUi 360 Xaa GLy Sur Phr Suo 365 Trp Suo GLy
GGC GCC CCC CCA TAC CCC CCA AAC Ad AGA CCC ACC CCC ACC AAC CCT 0092
GLy ALa 370 Phr Lru Tyr Pro Pro 375 Asn Thr Arg Pro Thr 380 Phr ILr Asi Mrt
CCC Ser 385 CAG GUi TCT GLu AAC Asn TCT ViL GAC ATG AGA GAC Asp Met Arg Asp 390 CCC Ser TAC Tyr 395 CCG Lri GGC GLy CAC Tyr CCC Srr ACC Thr 400 0255
GCA Gre GCC CCC CG,G AAG GCC CAC AGC CCG ACC CCG GCC CCG 0248
ALa ViL ALa Phr Trp Lys Gly ViL His Ser Lri ILr Lri GLy AUi Pro
4 05 410 415
CGC CAC CAG CAC Ad Ad GCC GCC ACC CTC ACC . CAG TAC GCC dG 1296
Arg His GLi His Thr GLy Lys ViL VaL Ile Phr Thr GUi GLu ALa Arg
420 425 430
CAC CGG AGG CCC AAG CCC TCC GCC AGA ACA CAG ACC TTC TCC TAC 0304
His Trp Arg Pro Lys Suo Gli VaL Arg GLy Thr GUi ILr GLy Ser Tyr
435 440 445
CCC GCC CCC CCC CGC CCC GAC GCG GAC AGA GAT TTC AGC ACY 0092
Phr Gly ALa Suo Leu Cys Ser VaL Asp Val Asp Arg Asp GLy Srr Xii
450 455 460
GAC CCG GCC CCG ACC TTC GCC CCC CAC TAC CAC GAG CAG ACC CGA GGG 1440
Asp Leu VaL Lru ILr GLy ALa Pro His Tyr Tyr GLu GUi Thr Arg GLy
465 470 475 480
CAG GTC CCA GCG CKC CCC CCC GGC dG GGC dG CGG CAG 0082
GLy Gln ViL Suo Val Xii Pro VaL Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln
485 490 495
CGC TCT GCC ACC CCC CAC TCT CAG GRC CAC CCC CGG TTC CGC TCC 1536
Cys Glu ALa Thr Leu His GLy Gli Gln Xaa His Pro Trp GLy Arg Phr
500 505 510
GCG GCC CCG ACA TCT CCG GAC GCA AAC GGG GAC AAC CCG GCA 0924
GLy VaL AUi Lru Thr VaL Lei GLy Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu AUi
515 520 525
GAC TCT GCT ATT GG/S GCC CCC TTC Gd GAG TCT AGC CTC GGT GCT GCC 1632
Asp Val Ala ILr Gly ALa Pro Gly Glu Glu GLu Ser Arg GLy ALa VaL
530 535 540
187 013
GAC AGA ggg Phr CAG His GGA GCC GCG Ser AGA Arg CTG Lru GAG AGC AGG Met CCC Poo GCA Seo CCC Pro AGC Srr 560 1680
Gyo 555 IIe GIy ALa 000 GIu IIu 000
CAG CGG GGC ACT GGC GCC CAG CGC GCC CGG AGA CGG CAG GAG ggg GGG
GIn Aog VaI Gho GIy 000 Sro GIn Lru Sro Lru 570 Arg Luu GIn Gyo Phr 000 GIy
CAG GCA nG AGG GGG GCT CAG GAC CGG ACA CAG GAG GGC CTG CTG GAC 1776
GIn Srr Lru Sro 580 Gly GIy GIn Asp Lru 585 ΊΙ.ο GIn Asp GIy Luu 590 VaI Asp
CGG GCC CTG GGA GCC CAG GGG CAC CTA CGG CGG CGC AGG ACT CTG CCT 0810
Lru Ala VaI 595 GIy AIa GIn GIy His 600 VaI Lru Luu Lru Aog 605 Sro Lru Poo
CGG CGG AAA CTG GAG CTC GCC AGA - AGA CTC GCC CCC AGG GAG CTG GCA 1801
Lru Leu 610 Lys VaI Glu Lru Sro 615 IIr Arg Phr Ala Pro 620 Met Glu VaI Ala
AAG Lys 610 GCG Ala CTG VaI GAC Gyr CAG Gln GGC Cys 630 GGG Grp GAA AGG ACG Gho CCC Poo 020 ACG Gho GGC VaI CGC Luu GAA Glu GCG AIa 650 1920
GIu Aog
GGA GAG GCC ACG GGC GiG CGC ACG GGC CAC AAA GGC GCA CCG GAC CGG 1968
GIy Glu Ala Geo ViI 655 Cys Lru Gho VaI His 650 Lys GIy Ser Pro Asp 655 Luu
CTA GGG AAG GGC CAA GGC GCG GGC AGG GAG GAG CGG GCG GGA GAG CCG 2016
Lru Gly Asn VaI 660 GIn GIy Sro VaI Aog 665 Gyo Asp Leu Ala Leu 670 Asp Pro
GGC CGC CGG ACT GCG CGG GCC AGG GGG GAG GAG ACG AAG AAC GGC ACG 2500
GIy Aog Leu 675 IIu Ser Aog AIa IIe 680 Phr Asp Glu Gho Lys 685 Asn Cys Gho
CTG ACG GGA AGG AAG ACG CGG GGG CGG GGG GAG CAC GGC GAA ACA GGG 2112
Lru Gho 690 GIy Aog Lys Ghr Leu 695 GIy Leu Gly Asp His 700 Cys GIu Ghr ViI
AAG CGG CGG CTG CCG GAC GCT GGG GAA GAG GCA GGG AGC CCG AGC AGC 2160
Lys 705 Leu Luu Luu Poo Asp 710 Cys VaI Glu Asp AIa 715 VaI Ser Poo IIe IIr 720
CTG CGC CGC AAC CTG GCC CGG GGG AGA GAC GCG GCG GCA CCC AGG AAC 2208
Leu Aog Leu Asn Phr 725 Ser Lru VaI Aog Asp 730 Srr AIa Srr Poo Arg 735 Asn
CGG CAG CCT GGG CGG GCT GGG GGC GCA CAA GAC CAC AGA ACG GCG GCG 2256
Leu His Poo VaI 750 Luu AIa VaI GIy Ser 700 GIn Asp His Ile Ghr 750 AIa Srr
187 013
CGG Leu CCG Pro TGG Phs 700 GAG Giu AAG Lys AAC Asn TGT Cys AAG Lys 76(0 CCSS Gln GAA Glu CTC Leu CTG Leu TGT Cys 765 (AG Glu GGG Gly (AC Asp 2357
CGG GGC AGC AGC GGT AAC TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GTG GTG GGS 2352
Lsu Gly Uis Ssr PIu Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly
770 7775 7i3O
GGC TCC CCT GAG CGC ACT GTG ACA GTC ACT GTG TGG AAT <GS3 GGT GAG 2755
Giy Sur Pro Cłu Lsu G1o Val Thr Val Thr Val Tir> Asn Glu Gly Glu
785 790 795 800
GAC AGC TAG GGA ACT GGA GTC CAG TTC TAC TAC CCA GCA GGG CTA TCT 0775
Asp Sur Gyr Giy Thr Lsu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Giez Leu Ser
805 810 815
GAC CGA CGG GGA ACA GGG ACT CAG (CS1. CCT CAT CAG TAC CCA CTA CGC 2496
Gyr Arg Arg VnU Thr Giy Thr Gln Gln Pro Hi.s Gln Tyr Pro Leu Arg
820 500 830
GGG GCC GGG GAG GCT GAG CCC GCT GCC CAG GAG (AC CTG AGG AGC AGC 2047
Lsu TUn Cys Giu AUa Giu Prt) Ale SAL a Gln Gln Asp Leu Arg Ser Ser
835 8 80 884
AGC GGT AGC AGT AAG CAC CCC ATC TTC CC-CS (CTS GGT GCA GTSG ACC ACC 2592
Sur Cys Ssr ais Asn His Pro Ile PPi SSrg Glu Gly Ala Lyr Thr Thr
850 855 880
GTC PIu 865 AGG Mst ATC Ile ACCS Thr TTC Phe GAT Asp 870 GTC Val TCC Ser TAC Tyr GAG Lys GCC da 800 TTC Phe CTA Leu GICA Gly (CSC Asp AGG Arg 880 2070
TTG CGT CTG GSGG GCC GTAA GCC AGC AGT GAG GAT GAT GAG CCT CAT ACC 2688
Lsu Lsu Leu Arg Ala Lys da Ser Ser Glu GSsn Asn Lys Pro Asp Thr
555 890 895
AAC AAG ACT GCC TTC CAG CTG (CSC CTC CCA GTG SAG TAC ACC GTC TAT 0016
Asn Lys Thr da Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr
900 000 910
ACC CGG ATC AGT AGG CCA CCSS (AT TCC ACC GAC CAT GTC GAC ttt TCA 0757
Thr Lsu Ile; ust Arg Gln GCu Asp Ssu Thr Asn (Hi G/aL Asn Phe S^r
915 920 925
TCT GCC CAC GGG GGG AGA AGG SCTS SCA GCC GGA GAT GGC TAT CGT GTG 2810
Suo Sur HiH Gly Gly dg dg Gln Glu Ala d_a Ηίε dg Ter GTrg Val
930 935 940
AAT AAC CTG AGT CCA CTG SAG C TG GCC GTC AGA CTG TAC TCC GGG GGC 28G 0
Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu da Val dg Val Asn rhe r;p wn
945 990 995 996
187 013
CCT Poo GTC VaU CTT Leu CTG Leu AAC Asn 965 UT GIy GTG VaU GCT Ala GTG VaU TGG Top 970 GAC Asp GTG VgU ACT Thr CTG Leu AGC Seo 975 AGC Seo 2928
CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGC GTG TCC CAG ATG AAA CCT CCT CAG AAT 2976
Pro AUa GUn GUy 980 VgI Seo Cys VgI Ser 985 GUn Met Lys Pro Poo 990 GUn Asn
CCC GAC TTT CTG ACC CAG ATT CAG AGA CGT TCT GTG CTG GAC TGC TCC 3024
Poo Asp Phe 995 Leu Thr GUn UUe GUn Arg 1000 Arg Suo VaU Leu Asp 1005 Cys Ser
ATT GCT GAC TGC CTG CAC TCC CGC TGT GAC ATC CCC TCC TTG GAC ATC 3072
UUe AUa Asp 1010 Cys Leu His Ser Arg 5050 Cys Asp IUe Poo Ser 1020 Leu Asp IUe
CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC CTC AGC TTC GGC TGG 3120
GUn Asp 1025 GUu Leu Asp Phe IUe 1030 Leu Arg GIy Asn Leu 1035 Seo Phe GUy Trp 1040
GTC AGT CAG ACA TTG CAG GAA AAG GTG TTG CTT GTG AGT GAG GCT GAA 3168
VaU Ser GUn Tho Leu GUn 1045 GUu Lys VaU Leu Leu 1050 VaU Seo GUu Ala GUu 1055
ATC ACT TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG CTG CCA GGA CAG GAG GCA 3216
IUe Tho Phe Asp Thr 1060 Seo ViI Tyr Ser 1065 GUn t Leu Pro GIy GUn GUu 5010 AUg
TTT CTG AGA GCC CAG GTG GAG ACA ACG TTA GAA GAA TAC GTG GTC TAT 3264
Phe Leu Aog AUg GUn VaU GUu Tho Tho 1080 Leu GUu GUu Tyo 1085 VaU 1 VaU Tyr
GAG CCC ATC TTC CTC GTG GCG GGC AGC TCG GTG GGA GGT CTG CTG TTA 3312
GUu Poo 109C UUe 1 Phe Leu VgU AUa 1095 GUy 1 Ser Seo VgU GIy 1100 GIy 1 Leu Leu Leu
CTG GCT Leu AUa 1105 CTC ATC ACA Tho GTG GTA VaI ViI 1110 CTG Leu TAC AAG CTT GGC Leu GIy 1115 TYC Xia TYC AAA CGT 3360
Leu IUe Tyr Lys Xaa Lys Arg 1120
CAG TAC AAA GAA ATG CTG GAC GGC AAG GCT GCA GAT CCT GTC ACA GCC 3408
GUn Tyo Lys GUu Met Leu Asp GIy Lys AUl Ala Asp Poo ViI Tho AUa
1125 1130 1135
GGC CAG i SCA GAT TTC GGC TGT GAG ACT CCT CCA TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA 3463
GIy Gln AUa Asp Phe GUy Cys GUu Thr Poo Pro Tyo Leu VgU Seo
1140 1145 55O0
CTCTCCTGCC TATCTCUNA ATlgAGATTl lTCCTlCCTA TlAlTCTACT lGCATllGgA 3 523
C(3AGT 3 528 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:37:
187 013 (x)OiARSKhERYehYKS SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 0011 aminokwasów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR: 37:
Giy 1 Trp SUa Leu SUa Ser Oys 5 His Gly Ser Asn Leu Asp 10 Val Glu Glu 15
Pro Ile Vil Phe 20 Arg Glu Ssp Ali AUi Ser Phe Gly Gin 25 Thr 30 Vai Vil
Gin Phe Gly 35 Giy Ser Arg Leu Vii Val Giy SUa Pro Leu 40 45 Glu SUi Val
Ali Vii Asn 50 Gln Thr Gly Arg 55 Leu Tyr Asp Oys AUa Pro 60 SUi Thr Gly
Met 65 Oys Gln Pro Ile Vil Leu 70 Arg Ser Pro Leu Glu SUi 75 Vai Asn Met 80
Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val 85 Thr SUi Thr Ssn Asn Ali 90 Gin Leu Leu 95
Aii Oys Gly Pro 100 Thr SUa Gin Arg SUi Oys Vil Lys Asn 105 Met 110 Tyr SUi
Lys Giy Ser 115 Oys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe 120 125 Iie Gln SUa
Vii Pro Ala 130 Ser Met Pro Giu 135 Oys Pro Arg Gin Glu Met 140 Asp Iie Ala
Phe 145 Leu Iie Asp Giy Ser Giy 150 Ser Iie Asn Gln Arg Asp 155 Phe Ali Gin 006
Met Lys Ssp Phe Vil Lys Ali 165 Leu Met Giy Giu Phe SUa 170 Ser Thr Ser 175
Thr Leu Phe Ser 180 Leu Met Gin Tyr Ser Asn Ile Leu Lys 185 Thr 190 His Phe
Thr Phe Thr 195 Glu Phe Lys Asn Iie Leu Asp Pro Gln Ser 200 205 Leu Vai Asp
Pro Iie Vii 210 Gin Leu Gin Giy 215 Leu Thr Tyr Thr Ala Thr 220 Giy Iie Srg
Thr 225 Vii Met Glu Giu Leu Phe 230 His Ser Lys Asn Gly Ser 235 Arg Lys Ser 240
187 013
Ala Uys Lys Ilr Lru 245 Uru Val Ilr TAo Asp 250 Tly Tln Lys Tyo Aog 255 Asp
hoo Lru CUu Tyo 260 Seo Asp Val Ilr hoe 265 Ala Ala Asp Uys Ala 270 Cly Ilr
ILa Aog Tyo 275 Ala Ilr CUy Val Tly 280 Asp AUa Phr Cln Tlu 285 hoe Thr Ala
Lru Uys 290 Glu Uru Asn TAr Ile 295 Tly Sro AUi Pre Pro 300 Cln Asp His Val
hAr 305 Lys ViI Tly Asn PAr 310 Ala AUa Lru Aog Ser 315 Ile Tln Aog Cln Lru 320
Tln Glu Lys Ilr PAr 325 Ala ILa Glu CUy TAo 330 Tln Sro Aog Sao Srr 335 Sro
Sal hAr Cln His 340 Tlu Mrt Seo Cln Tlu 345 CUy PAr Ser Seo Ala 350 Ueu TAo
Saa Asp Tly 355 hro VaU Lru Tly Ala 360 Xaa CUy Sro PAr Sro 365 Top Seo TUy
Cly Ala 370 hAe Lru Tyr hoe Pre 375 Asn Thr Aog Pre Tho 380 PAr Ilr Asn Mrt
Sal 385 Cln Tlu Asn VaU Asp 390 Mrt Aog Asp Sro Tyo 395 Lru Cly Tyr Sro CAa 400
Ala ViI AUa hhe Trp 405 Lys Tly Val His Seo 410 Lru Ile Leu Cly AUi 415 Pro
Arg His Tln His 420 Thr Cly Uys Val Val 425 Ilr Phr Tho Cln Tlu 430 Ala Aog
His Top Aog 435 Pas Uys Srr Glu VaU 440 Aog Tly CAr Tln Ile 445 Cly Sro Tyo
hAr Tly 450 Ala Sao Uru Cys Ser 455 Val Asp aan Asp Arg 460 Asp Cly Seo Xii
Asp 465 Lru ViI Uru Ilr Cly 470 Ala hoo His Tyo Tyo 475 Tlu Cln Tho Aog Tly 480
Tly Cln Val Srr ViI 485 Xaa hro VaL Pre TUy 490 Val Aog CUy Aog Top 495 Tln
Cys CUu Ala TAo 500 Lru His Cly Glu Cln 505 Xaa His Poe Trp Cly 510 Aog PAr
Tly VaU Ala Lru TAo VaU Lru Cly Asp Val Asn Tly Asp Asn Lru Ala 515 520 525
187 013
Asp Val 530 Ala Ile Gly Ala Pro 535 Gly Glu Glu Glu Ser 540 Arg Gly Ala Val
Tyr 545 Ile Phe His Gly Ala 550 Ser Arg Leu Glu Ile 555 Met Pro Ser Pro Ser 560
Gln Arg Val Thr Gly 565 Ser Gln Leu Ser Leu 570 Arg Leu Gln Tyr Phe 575 Gly
Gln Ser Leu Ser 580 Gly Gly Gln Asp Leu 585 Thr Gln Asp Gly Leu 590 Val Asp
Leu Ala Val 595 Gly Ala Gln Gly His 600 Val Leu Leu Leu Arg 605 Ser Leu Pro
Leu Leu 610 Lys Val Glu Leu Ser 615 Ile Arg Phe Ala Pro 620 Met Glu Val Ala
Lys 625 Ala Val Tyr •Gln Cys 6-30 Trp Glu Arg Thr Pro 635 Thr Val Leu Glu Ala 640
Gly Glu Ala Thr Val 645 Cys Leu Thr Val His 650 Lys Gly Ser Pro Asp 655 Leu
Leu Gly Asn Val 660 Gln Gly Ser Val Arg 665 Tyr Asp Leu Ala Leu 670 Asp Pro
Gly Arg Leu 675 Ile Ser Arg Ala Ile 680 Phe Asp Glu Thr Lys 685 Asn Cys Thr
Leu Thr 690 Gly Arg Lys Thr Leu 695 Gly Leu Gly Asp His 700 Cys Glu Thr Val
Lys 705 Leu Leu Leu Pro Asp 710 Cys Val Glu Asp Ala 715 Val Ser Pro Ile Ile 720
Leu Arg Leu Asn Phe 725 Ser Leu Val Arg Asp 730 Ser Ala Ser Pro Arg 735 Asn
Leu His Pro Val 740 Leu Ala Val Gly Ser 745 Gln Asp His Ile Thr 750 Ala Ser
Leu Pro Phe 755 Glu Lys Asn Cys Lys 760 Gln Glu Leu Leu Cys 765 Glu Gly Asp
Leu Gly 770 Ile Ser Phe Asn Phe 775 Ser Gly Leu Gln Val 780 Leu Val Val Gly
Gly 785 Ser Pro Glu Leu Thr 790 Val Thr Val Thr Val 795 Trp Asn Glu Gly Glu 800
Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser
805 810 815
187 013
Tyr Arg Arg Val 820 Thr Gly Thr GIn Gln 828 Pro His Gln Tyr Pro 830 Lsu Arg
Lsu Ala Cys 400 Glu Ala GIu Pro Ala 40 A Ala Gln GIu Asp Lsu 845 Arg Ssr Ssr
Ser Cys 850 Ser lie Asn His Pro 855 lie Phe Arg GIu Gly 860 Ala Lys TTr Thr
Phs 815 Met IIs Thr Phs Asp 870 VaL Ser Tyr Lys Ala 875 Phe Leu Gly Asp Arg 440
Leu Leu Lsu Arg Ala 885 Lys Ala Ser Ssr Glu 90 A Asn Asn Lys Pro Asp 895 Thr
Asn Lys Thr Ala 900 Phs Gln Leu GIu Lsu 909 Pro VaL Lys Tyr Thr 910 VaI Tyy
Thr Leu Iie 915 Srr rg/ Gln Glu Asp 22 A Ssr Thr Asn His Val 925 Asn Phe Sss
Ser Ser 930 His Gly Gly Arg Arg 935 lls lls Ala Ha His 940 Arg Tyr Arg VaI
Asn 945 Asn Lsu Ser Pro Lsu 950 Lys Leu Ala VaL Arg 955 VaI Asn PTs Trp Val 960
Pro VaI Lsu Leu Asn 965 Gly VaL Ala VaI Trp 70 A Asp VaL Thr Leu Ser 975 Ser
Pro Ala Gln Gly 980 VuS Ser Cys VaL Ser 989 Gln Mst Lys Pro Pro 990 Gln Ass
Pro Asp Phe 995 Leu ITr Gln lie Gln Arg 100/ Arg Ssr Val Lsu Asp 1005 Cys Ser
lis Ala /Asp 1010 Cys Lsu His Ser Arg 1015 Cys Asp lie Pro Ser 1020 Leu Asp lle;
Gln 1025 Asp Glu Leu Asp PTs 103C lie 1 Leu Arg Gly Asn 0000 Lsu 1 Ssr PTe Gly Trp 1040
VaI Ser Gln Thr Lsu 1045 Gln Glu Lys VaI Lsu Leu 1 VaI Ssr GIu Ala 10C0 Glu
Lis Thr Phe Asp 1060 Thr 1 Ser svi Tyr Ser 1010 Gln 1 Leu Ppo Gly GIls 107C G2.u 1 ΑΣη
Phs Leu /Arg 1075 /ALa 1 Gln Vv1 Glu Thr Thr 1 Leu GIu C,iu Tyr 1020 VaL Val Tyr
Glu Pro Lie Phe Lsu Val Ala Gly Ssr Ssr Val Gly Gly Lsu Lsu Lsu 1090 1095 1100
187 013
Leu SUi Leu Ile Thr Vai Vai Leu Tyr Lys Leu Giy Xaa Xaa Lyy Tsr
0001 1110 n15 1120
Gin Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala SUa Ssp Pro Vai Thr ASu
1125 1130 nu
Gly Gin Ali Asp Phe Gly Oys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Vii Ser n40 nu n50 (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR: 38:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zisid (B) TYP: kwas nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ^ojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ OZĄSTEOZK^I: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:38:
lhOOAAGOTG TOAhGGGOOA G 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR: 39:
(i) CiLARAKTERYSTYKA SEKWENOJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pir zasid (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ^ojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJ] NR:39:
GhOOAGOAlA 0hlAAGAGOS OGG 23 (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:40:
(i)OiSRAKhERYShYKS SEKWENOJI:
(S) DŁUGOŚĆ: 18 pir zasad (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ:pojedynczi (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:40:
TGTAAAAOGA 0lGO0AlT 18 (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:41:
187 013 (i) THARAJKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 pa- zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:eojedyecza (D) TOPOLOGIA: Liniewa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:41:
CTAAATACCT ATTACCATC 19 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:42:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pa- zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ^ojAdyncza (D) TOPOLOGIA: Liniewa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:42:
TCACACCTCC ACTCCCTTTA CT 22 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:43:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ^ojAdyncza (D) TOPOLOGIA: Liniewa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:43:
CCCCTACACT CACACTACTC TCCTT 25 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:44:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 38 pa- zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniewa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:44:
CTCCCCCTTT CCACCTTTTA ACCTTCCACA ATCTATAT
187 013 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI ^:45:
(i)CHTRTKCERYeCYKT SEKWENCJI:
(T) DŁUGOŚĆ: 3519 pnr zasad (B) GYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojsdyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 52..3519 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:45:
GCGTGCTCSA GGTGCCAGSA TCCAGAGGCA Ά'Π’ΑΚΌΙΙΑ ACTGCGCAGA T ATG GTC 57 Mrt Vnl
CGT CCT GTT GTC ATC CTC CTC GGG GGC GGG GCC CGG GCT TCC TGT CAG 10
Arg Giy Vai 5 VaI Iir Leu Lsu Cys 10 Gly Gop SUa Lsu TUn 15 Ssr Cys His
GGG TCT TAC CTC CAT GTC CAG AAC CCC CGC GGG TGC ATA GAG GTT GCA 153
Cly Ssr 20 Asn Lsu Asp VaI Clu 25 Lys Pro VaU aal PIu 30 Lys Giu Asp AUa
GCC AGC TTC GCA CAG ACT CTG GGG CTG CCC GGG GGA TCT CGA CTC GTC 201
Aia 35 Ssr PIu Giy Gin dr 40 Vai VaI Gin Phr Gly 45 Giy Ser Arg Leu VaI 50
GTC GCT GCC CCT CTG GAG CCG GGC CCA GGC TAC CAA ACA CCA CAG TCC 249
Val Gly TUn Pro Leu 55 Giu AUa Val TUn Val 60 Asn Gin Thr Giy Gin 65 Sur
TCT CAC CGC CCC CCT GCC ACT GGC GTG GGC CAC CCC ATC TTA CTG CAC 297
Ser Asp Cys Pro 70 Pro Aia G1o Cly VnU 75 Cys Gln Pro Iie Leu 80 Lru His
ATT CCC CTA GAC GCA GTG TAC ATC TCC CGG GGC CTG TCG CGG GGG GCT 345
Iie Pro Lru 85 Giu AUa Val Asn Met 90 Sur Lsu Gly Leu Ser 95 Leu VaU Ala
CTC ACC TAT TAC GCC CAG GTG CTG GCT GCT GGG CCA ACT GCA CAG AGA 393
Asp Ghr 100 Asn Asn Ser Gin Leu 105 Lru TUn Cys Giy Poo 110 TIo Ain Gln Arg
CCT TGT GCA TAC ATC ATC TAT GCA AST GCT TCC TGC CTC CTT CGG GGC 44 1
Aia 115 Cys Ain Lys Asn Met 120 Gyr AUa Lys Ciy Ser 125 Cys Leu Lsu Lsu GUy 130
TCC AGC GTC CAC TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC AGG CCA GAG TGT 48 9
Suo Ser Lru Gin PIu 135 Iie Gin Ala Iie Pro 140 AUa TIo Mrt Poo Giu 145 Cys
187 013
CCA dA Cd GAG ATG Met TAG Asp AST lir GCC ALa CSC Phe 155 CCG Leu ATT lie GAC Asp GGC Gly CCC Ser 110 GGC Gly AGC Ser 537
hro GLy GLn GLu 150
ATS GAC CAA AGC TAG Ττψ. ACC CAG ATG AAG GAC CCC GCC CCA GCC CCG 585
Lie Asp Gln 165 Ser Asp Phe Thr Gln 110 Met- Lys Asp hhe Val 115 Lys ALa Leu
CTT GGC CAG CCG GCG AGC ACC AGC ACC CCG CCC CCC CCG ATG CAJ TAC 633
Met GLy 180 GLn Lru AUi Ser Thr 185 Ser Thr Ser Phr Ser 110 Leu Met GLn Syr
CCA CCG ATC CCG CCT ACC CAC CSC ACC CCC Ad G.AA CSC AAG AGC 681
Ser 195 Asn Lie Lru Lys hhr 200 His Phe Thr Phe Thr 220 Glu Phe Lys Ser Ser 210
CCG AGC CCS CAG AGC CCG GCG GAC GCC ACC GCC CAG CCC C.AA GGC CCG 729
Lei Ser hro GUi Ser 209 Leu VaL Asp AUi lie 220 VaL Gln Leu Gln Gly 225 Leu
Ad TAC ACA GCC CCG GGC ACC CAG ACA GCG GCG AAA GAG CCA CSC CAC 777
Thr Syr hhr ALa 230 Ser Gly Lie GUi Lys 235 VaL VaL Lys GLu Leu 240 Phe His
AGC CCT AAC Gd GCC CGA CCA AGC GCC AAG AAG ACA CCA AST GCC ACC 209
Ser Lys Asn 245 GLy Ala Arg Lys Ser 225 AUi Lys Lys lie Leu 225 Lie VaL Lie
ACA GAS CAG CCA CSC AGA GAC CCC CCG GAG SAS AGA CAC GCC ACC 873
hhr Asp 260 Gly GUi Lys Phe Arg 265 Asp hro Lei Glu Syr 227 Arg His Val Lie
CCS TAC GCA TCT CAC GCC Gd ACC ACC CGC SAS GCC ASA GGG TST GGA 920
hro 275 Glu ALa Glu Lys ALa 2130 Gly Lie lie Arg Syr 228 ALa Lie Gly VaL GLy 290
GAC GCC CCC CGG GCC CCC ACC GCC CCA CAG GAG CCG AAC ACC ATS GGC 969
Asp AUi Phe Arg GLu 295 Pro Thr ALa Leu Gln 330 Glu Lei Asi hhr lie 305 Gly
CCA GCC CCC CCG CAG TCG CAC GCG CCC AAG GCG GGC AAC CCS GCA GCA 101!
Ser AUi Pro Srr 310 Gln Asp His Val hhe 315 Lys Val Gly Asi Phe 332 Val ALa
CSC CGC AGC ACC CAG CGG CAA AST CAG GAG AAA ACC CSC GCC ATS G,AA 0559
Lei Arg Ser 325 lie GIi Arg GLn Lie 333 Gln GLu Lys Lie Phe 333 ALa Lie Glu
TTC ACC TCC CCA CTT CCA AGC AGC CCC CCS CAG CAC TAT ATG CCA GCA mó
Gly Thr 340 Gli Ser Arg Ser Ser 334 Ser Ser hhe GLn His 335 Gli Met Ser Gln
GCC GGC CSC AGC CCA GCC CSC CCA ACG GAC GGA CCA GCC CCG Gd GCC llcL
GLu 355 GLy Phe Ser Ser Ala 336 Leu Ser Met Asp GLy 335 Pro Val Lei Gly Ala 330
187 013
GTG VaL GGA Gly GGC Gly TTC PTs AGC Srr 055 TGG Trp TCT Srr GGA GLy GGT GLy GCC Ala 330 TTC Phe TTG Leu TAC Tyr CCC Pro TCA AAT 1209
Ser 338 Asn
ATG AGA TTC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CCAG CGAG /AAC GAG dAT ATG AGG 0205
Met Arg Ser Thr 390 PTe Iie Asn Met Ser 395 Gln Glu Asn Glu Asp 400 Met Arg
GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG GGG GTC 1025
Asp ALa Tyr 405 Leu Gly Tyr Srr TTr 410 ALa Leu ALa PTe Trp 441 Lys Gly VaL
CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT 1353
His Ser 420 Lru Lir Iru Gly ALa 445 Pro Arg His Gin His 4^0 TTr GLy Lys VaI
GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CCAC TGG AGG CCC /AAG TCT /GAA GTC 1401
VaI 435 Iie Phr TTr Gin GIu 440 Ser Arg Ηϊι Trp /Arg 445 Phr Lii Ser G2Lu Val 445)
AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT TCT GTG 1449
Arg Gly TTr Gin Iie 455 Gly Srr Tyr PTe Gly 446 ALa Ser Leu Cys Ser 446 VaL
GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA GTC CCC 1497
Asp Met Asp Arg 470 Asp Gly Srr TTr Asp 447 Lsu VaL Leu Iie GLy 448 VaL Pro
CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC CCC ATG 1545
His Tyr Tyr 485 Glu His TTr Arg Gly 440 GLy Gin VaL Ser VaI 449 Cys Pro Met
CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT GGG GAG 1000
Pro Gly 500 VaL Arg Ser Arg Trp 550 His Cys Gly TTr Thr 551 Leu His Gly GLu
CAG GGC CAT CCT TGG GGC CGC TTT GGG GCG GCT CTG ACA GTG CTA GGG 014l
Gin 515 Gly His Pro Trp Gly 520 Arg PTr GLy ALa ALa 555 Lru TTr VaL Leu Gly 553
GAC GTG AAT GGG GAC AGT CTG GCG GAT GTG GCT ATT GGT GCA CCC GGA 1129
Asp VaL Asn Gly Asp 535 Srr Iru Ala Asp VaL 544 ALa lie GLy ALa Pro 544 GLy
GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA 1737
Glu GIu GIu Asn 550 Arg Gly ALa VaL Tyr 555 Lie Phr His GLy Ala 556 Ser Arg
CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC 1735
Gin Asp Lie 565 ALa Pro Ser Pro Srr 577 Gin Arg VaL Thr GLy 577 Ser Gin Leu
187 013
TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT UG GGT CAG GAC 1833
Phe Leu Arg Leu GUn Tyr Phe GUy GUn Ser Leu Suo GIy GUy GUn Asp
580 558 590
1881
CTT ACA CAG GAT GGC CTG -GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC
Leu 595 Thr GUn Asp GUy Leu 660 VaU Asp Leu Ala VaU 605 Gly AUg GUn Gly His 660
GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC TCC ATT
VgU Leu Leu Leu Arg 615 Ser Leu Pro Leu Leu 660 Lys VaI GIy Uie Seo 662 Uie
AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC TU GGA
Arg Phe AUa Poo 630 Ser GUu VaU AUg Lys 635 Tho VaU Tyo GUn Cys 660 Top Gly
AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT CTC ACT
Arg Thr Pro 645 Thr VaI Leu GUu AUa 660 GUy GUu AUg Tho VaU 665 Cys Leu Tho
GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC TCT GTC
VgU Arg 660 Lys GUi Seo Poo Asp 666 Leu Leu GUy Asp VaU 660 GUn Ser Seo Val
AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT GCC ATT
Arg 675 Tyr Asp Leu AUa Leu 660 Asp Pro GUy Arg Leu 685 Uie Ser Arg Ala Ile 660
TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT CTG GGG
Phe Asp GUu Tho Lys 695 Asn Cys Thr Leu Thr 770 Aog Arg Lys Tho Leu 720 GUy
CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC TGT GTG
Leu GUy Asp His 710 Cys GUu Tho Met Lys 715 Leu Leu Leu Poo Asp 772 Cys Val
GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC CTG GCA
GUu Asp AUl 725 VgU Tho Poo He He 770 Leu Arg Leu Asn Leu 773 Ser Leu AUl
GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT GTG GGC
GUy Asp 740 Seo AUa Pro Seo Arg 775 Asn Leu Arg Poo VaI 775 Leu AUa Val Gly
TCA CAA GAC CAT GTA ACA GCT TCT TTC CCG TTT GAG AAG AAC TGT GAG
Ser 700 Gln Asp His VaU Thr 776 AUa Seo Phe Poo Phe 765 GUu Lys Asn Cys Glu 777
GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG
GUy Asn Leu GIy VaI 775 Seo Phe Asn Phe Ser 778 GIy Leu GUn Vil Leu 778 GUu
GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG
VaU GIy Seo Seo 790 Poo GUu Leu Tho VaI 795 Tho VaU Tho VaU Top 880 Asn GUu
1929
1977
2025
2073
2121
2169
2217
2265
2313
236
2409
57
187 013
TTT Tly AAA AAC AAC TAT Tyo AAA Tly ACC TAo TTA Leu 810 ATC Ilr AAA Uys TTC PAu TAC Tyr TAC Tyr 815 CCA Poo ACA AAT 2505
Alu Asp 805 Seo Ala Alu
CTA TCT TAC CAA CAA ATA ACA AAA CCC CAC CAA CCT CAT CCA TAC CCA 2553
Uru Sal 820 Tyo Aog Aog Val Tho 825 Aog AUa Tln Tln Poo OO0 His Poo Tyr Poe
CTA CAC CTA ACA TTT TAT ACT AAT CCC ACC AGC CAT TAT AAC CTA AAT 2601
Uuu 005 Aog Uuu AUa Cys Alu 880 AUa Alu Poe TAo Tly 845 Tln Tlu Sal Leu Aog 880
ATC AAC AAC TAT ATC ATC AAT CAC CCC ATC TTC CTA GAA AAT ACC AAT 5809
Sal Sur Sal Cys Sal 855 Ilu Asn His Poe Ile 860 PAe Aog Tlu Tly AUa 886 Uys
TCC ACC TTC ATA ATC ACA TTT AAT ATC TCC TAC AAA TCC TTC CTA AAA 5800
AUa TAr PAe Met 870 Ile TAr PAu Asp VaU 875 Sur Tyr Uys Ala PAe 880 Ueu Tly
TAC ATT TTA CTT CTA AAA ACC AAC ACA ATC AAT TAT AAT AAT AAA CCT 2700
Asp Aog Uuu 885 Ueu Uru Aog AUa Ser 890 Ala Ser Ser Alu Asn 895 Asn Lys Pro
AAA ACC AAC AAT ACT ACC TTC CAA CTC AAC CTT CCA ATA AAA TAC ACT 5700
Tlu TAo 900 Seo Uys TAr AUa Phe 905 Tln Leu Alu Ueu Poo 910 Val Uys Tyo TAr
ATC TAT ACC CTA ATC AAT ACA CAA AAA AAT TCT ACC AAA CAT TTC AAC 5800
Val 915 Tyr TAr Val Ilu Seo 992 Aog Tln Alu Asp Sal 9^^ TAo Uys His Phr Asn 993
TTC TCA TCT TCC CAC CAA TAT AAA CAC AAA AAA ACC TAA CAT CAA TAT 2880
PAr Sal Ser Seo His 935 Cly Alu Aog Tln Uys 940 Alu Ala Alu His Aog 994 Tyr
CAT ATA AAT AAC CTA AAT CCA TTA ACC CTC ACC ATC AAC ATT AAC TTC 2935
Aog Val Asn Asn 950 Uuu Sur Poo Leu TAr 995 Ueu Ala IIa Ser Val 996 Asn PAe
TAC ATC CCC ATC CTT CTA AAT CCT ATA ACC ATA TAT AAT ATA ACT CTT 5080
Top VaU Poo 965 Ile Uru Luu Asn Tly 990 Val Ala Val Trp Asp 995 Val Tho Ueu
AAC AAC CCA CCA CAC CAT ATC TCC TAT ATA TCA CAA ATA AAA CCT CCT 3033
Aog Sro 980 Pro AUa Tln Tly Val 99^ Seo Cys Va| Sal Tln 990 Aog Tlu Pre Pro
CAA CAT TCC GATT CTT CTG ACC CAG AGA CAA ATA CAC TCT GTG CTG TATA 3081
Tln 995 His Ser Asp Leu Leu 1000 Thr Gln Ile Gln Tly 1005 AAg Ser Val Leu Asp 1010
100
187 013
TGO Oys GOO Ali ATC IlIi GCC Ala (GGC TGC Asp Cys 0015 COG Lse TOG Tj^£5 COC Lsu Cd TTG TCg Gos 1020 TAC Asp ATC I In CCC Pito) TCC TGG Ser Lse 1001 3129
GGO AOO CTG UST HAG CTT GAC TTG ATT COG TSAG GGC TSSC CTC AGC TTT 1077
Gly Thr Leu Asp Glu Leu 1030 ICp Phe IIn Tse Tys 1035 dy TCsn Lsu Ser Phr 1030
GGO TGG ATC AGT CAG ACA TGG CAG TASS tas tgg TTG CTC COG AGT GGA nn
Gly Trp I1i Ser 0641 Gln Thr iLe da Tys 1050 Tys Tal Leu Leu Lsu 1105 S^e? du
GOC GAA ATC ACA TTC TCSC ASA GGO TGC TAG TCC TAG CTG CCG GGA TAG 3273
Ali Glu IlI 0606 Thr Phe Asn Thr Tce 1065 Tal Thr TSe Gln Leu 1107 Ppo da da
GAG GOA TTT? CTG AGA GCC CAA GGG TCOA TCG TGG CTA TGAA TGAA TAC GGG 3321
Glu Aia 0055 Phe Leu Arg Ala GGn 0006 nvi TSe TT.r TM^e Lsu 1081 Glu Glu Tyr Tal 1090
GTO TAT GAG CCC GTC TTC COC AGG GTC ΤΑ TAG TCOA GGG GGA Gd CCT 3369
Val Cyo Glu Pro Val Phe 0691 LLe TMe Gal Thr TSe 1100 TSe Val dy da Lse η10
OGG TTA CTG GCT CTC ATC ACT AGh Gd tot; TTA TCAG CCT Gd TTT TCC 1407
Leu Leu Leu ALa Leu IIn 1110 Thr Tal TAa Tse Tts 1115 Tyr Leu da Phr Phr mo
ASA OGT CAG TAT TACS TAG AGG GO^ GGA? GOC. TOA TCC GCA uat CCC TAG 1461
Lys Arg Gln nu Tyr 1 Lys Glu TMe Tse TAs 1130 Tse TPr 'See TSLa im Asp 1 Ppo TAs
OOA GOO GGC CAG GCA OAT TGC TAG TOA? TGA TAO TCC CCA CAG CCC Ad nn
Pro GGC Ali η^ TAG Gly 1 Gln TALa TSsp SSe 114S Ass Ths Πη Thr TPr Tpo mo TUs Lse Thr 1500
Ser nu (2) INFORMAOJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI mó:
( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: nu aminokwasów (B) TYP:amSnokwap (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ OZĄSTEOZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:46:
Met Vii Arg Giy Vii Vii Ile Leu Leu Oys Giy Trp Ali Leu Ali Ser 15 10 15
187 013
101
Cys Ηί-S Gly SOI 20 Asn Luu Aep Val Glu 25 Lys Pro VaI VaT Phe 30 Lys Glu
Asp AIa Ala Ser Phe GIy GIn Thr Val Hal dn Phe Gly Gly Ser AArg
35 40 45
Lru VaI Val Gly Aa Pro Lru Glu Aa Val Aa Val Asn Gln Thr Gly
50 55 60
GIn Ser Ser Asp Cys Pro Pro Aa Thr GIy Val Cys Glrn Pro Ile Leu
65 70 75 80
Lru His liu Poo Lru GIu AIa VaI Ann Mrt Ser Lru GIy Lru Suu Lru
85 90 95
VaI AAl Asp Thr Asn Asn Ser GSn Sru lny Ae Ala Gly Pse Thr Aa
100 10f5 110
GIn Arg ALa Cys Aa Lye Ann Met Tyr AIi Lys Gln Tss Ccs Leu Llu
115 110 102
Lru Gly Ser Ser Llu GIn Phe Iie Gln AIa Ile Pro Aa Thr Met Pro
130 105 115)
Glu Cys Pro Gly Gln G lu MeS Asn Ile Ala Phe Leu Ile Asp GIy Sne
155 150 155 100
GIy Sur Lie Asj;) Gln n er OTsn TPe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys
165 170 175
AIa Llu Met Gly Gin Leu As Ass Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met
080 185 190
Gln Tgs Ser Asn Ile Leu Lys Ths Ais Shr Phi OPe Ghu Ihe Lys
195 200 205
Seo Sne Leu Lrr Pro Gln Ilt Lnu hru Aip Ae Ile Val Gln Llu Gln
210 2H 222
Gly Leu Gho Tyr OAr As a er Tie Tle Gln Lys Val Val Lys Glu Llu
H5 232 225 2^
Phr His Sro Lyy Ata n-u Aa Aso Ays Ser Aa Lys Lys Ile Leu Ili
255 220 255
VaI Ili Thr Aep Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg Ηίβ
260 265 220
VaI Ili Pro Glu Aa Glu Lys Ae Aly Sie I( es Are Spr GSu l Ii Sil
170 220 2H>
VaI GIy Asp AIa Phe Arg GIu Poo Ghr AIa Lru GIn GIu Luu Asn Gho 290 295 300
102
187 013
Iis 305 Gly Ser Ala Pro Ser GUn Asp 310 His VaU Phe 315 Lys VaU GUy Asn Phe 3220
VaU Aia Leu Arg Ser Ile Gln dg Gln Ile GUn Glu Lys Ile Phe Ala
325 330 335
Ilu Giu Gly TTi Glu Ser dg Ser Ser Ser Sur Phe Gin His CUu Met
340 33 5 3 750
Ser Gin Glu G Cy Phe Ser Ser TUa Leu Ser Met Asp Gly Pro VaU Leu
355 360 365
Ciy Aia VaI Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Cly Aia Phe Leu Tyo Pro
370 33 5 380
Ssr Asn Met dg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp.
385 390 3 95 4 00
Mst Arg Asp SŁla Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr GSIa Leu GSla Phe Trp Lys
405 410 415
Gly Val HiH S es Geu IUe Leu Gly GTLa Pro dg His Gln His dr Gly
420 445 440
Lys Val Val I Ia Phe Thr Gln CUu Ser SSrg Hós Grp dg Pro Lys Ser
435 4 4 0 445
Glu aaa dg Gly Thr Gln He Gly Ser Tyr rhe Gly GSla Ser Leu Cys
450 445 460
Sur VaU Asp Mst Asp Arg Asp G.l.y Ser Thr Asp Leu Val Leu IIe Gly
465 4^0 445 4 4 0
Vai Pro His Tyr Tyr Glu His Thr dg Gly Gly Gln Val Ser VaL Ccs
780 440 495
Pro Met Pro G ly Gal dg Ser (Arg Trp His Cys Giy Thr Thr Leu Hm
500 550 550
Ciy Glu Gln GCu Gis Poo Trp CUy dg Phu Gly AUa da Leu dr Val
515 552 552
Lsu Giy ds Val Asn Gly GSp Ser Lsu SULa Asp Val (Aa He Ciy da
530 553 55 0
Pro GUy Glu Glu Glu Asn dg Gly GTLa Val Tyr IIe PPi: Hm Gdy AA a
075 555 55^5 556
Ssr Arg GCn Asp He da Poo Ses Sro Ser Gln dr Gd TGi Gdy Ser
565 557) 575
Gln Leu Phs Leu Arg Leu Gin Gyr Phs Giy Gin Ser Lru Sui Giy GUy 580 585 095
187 013
103
Tln Asp Ueu 595 Thr Cln Asp TUy Leu 600 ViI Asp Leu Ala VaU 605 TUy Ala Cln
TUy His 610 Val Leu Lru Luu Aog 615 Sro Lru Poe Ueu Leu 620 Lys aaU Cly Ilr
Seo 625 Ilr Aog ehr Ala Pre 630 Seo Tlu aaU Ala Uys 635 CAa VaU Tyo Tln Cys 640
Top Tly Aog TAr Poo 645 TAr ViU Lru Tlu Ala 650 Tly CLu Ala TAo Val 655 Cys
Ueu TAo Val Aog 660 Lys Cly Saa eoo Asp 665 Lru Ueu Tly Asp ViI 670 CUn Saa
Srr Val Aog 675 Tyr Asp Luu Ala Lru 680 Asp Pro Tly Aog Ueu 685 Ilr Ser Alj
Ala Ilr 690 Phr Asp Tlu TAo Lys 695 Asn Tys Tho Uru Thr 700 Aog Aog Lys Tho
Lru 705 TUy Leu TUy Asp His 710 Cys Tlu CAa Mrt Uys 715 Leu Ueu Leu Pre Asp 720
Cys Val Tlu Asp Ala 725 VaU Tho Pro Ilr Ilr 730 Ueu Aog Uru Asn Lru 735 Sro
Lru Ala Tly Asp 740 Saa Ala Poo Saa Aog 745 Asn Ueu Aog Poe VaU 005 Lru Ala
Val TUy Seo 755 Tln Asp His VaU Tho 085 Ala Srr PAe Pro PAr 765 Tlu Uys Asn
Cys Tlu 770 Tly Asn Uru Cly ViI 500 Saa PAr Asn ehr Seo 780 TUy Lru Tln ViU
Lru 785 Tlu Val CUy Sro Ser 790 eoo CLu Uru CAr ViI 090 Thr aaU TAo VaU Top 800
Asn Tlu Tly CUu Asp 805 Ser Tyo Cly TAo Uru Ile Lys Phr Tyo Tyo 815 Pre
Ala Tlu Lru Srr 820 Tyo Arg Aog ViI CAa 825 Aog AUa Tln Tln Poo 805 His Pre
Tyo Poe Lru 100 Aog Lru Ala Cys Tlu 840 Ala Tlu Pre Tho TUy 845 Tln Tlu Sro
Lru Aog Saa Saa Saa Cys Saa Ilr Asn His Poe Ilr PAr aoj Tlu Tly
850 855 860
Ala Uys Ala Tho PAr Mrt Ilr TAo PAr Asp Val Srr Tyo Lys Ala PAr 865 870 875 180
104
187 013
Lsu Gly AspAso Aeu 885 u tu Luu Ary ALa Sur 80I Ala S er Soi GSu AAsn 8 85 Aoa
Lys Poo Gir TGe 900 Ten O—s The Air Ohe 90I Gln Leu A lu 1la Pto 910 Val lu-
Gyo Gho Val Tyr 915 Thr Val IIe Ser SAug 920 Gln Glu SAp Seo 925 Thr Lys His
Phs Asn Phe Ser 930 Ser Ser His Gly Glu 993 AOrg Gln Lys 950 Glu Ala Glu His
Aug 955 Gyo Aug Vi1 Ann Asn 950 Leu Seo Poo hru Ghr 955 Teu AIi IIs Sso ViI 960
Ann Phe Top VaI Pro 965 IIr Lsu Leu Ann Gly 970 Vil Ali Vil Top Asp 975 Val
Gho Leu Arg Sur 980 Pro AUa Gln GSy Val 95I Ser Cys VaI Ser Gln 990 Arg Glu
Pro Poo Gln His 995 Ser ASsp Leu Leu Thr 100T Gln Ile Gln Gly Arg 1005 Ser Val
Leu Asp Cys ALa 1010 Ile Ala Asp Ce— Leu 1005 Hii Leu Arg Cys 1020 Asp Ile Pro
Seo Lsu Gly Thr 1025 Leu Asp Glu Leu Asp 101:^0 Phe IUt Lu— 105I Lys Gly Asn Leu 1000
Sso Phs Gly Trp Ile Seo 1055 Gln Thr Leu l^r^nl^yi 1050 Lyi Val Lsu Leu Leu 1055
Sso GIu ALa Glu Ile 0060 Th i Phi Asn Thr Ser 11051 Val Tyr Ser Gln Leu 1070 Pro
Gly GIn Gil Ala 0170 Phe Leu AOrg ALa Gln 108I Val Ser Thr Met Luu 1085 Alu ilu
Gyo ViI Val Gyr 1090 Glu Poo Hal Phe Leu 1009 Met Val Phe Seo 1000 Sso ViI Gly
Gly HO Leu Lsu Leu 1 Leu AIa 1110 Leu Ile Ghr 1 VaI ALa 1115 Leu Tyr Tys Leu Gly 0120
Phs Phe Lys Arg Gln UD Gyo Lys Glu Mrt Leu 1030 Asp 1 Leu Piso Seo AL. i 1135 Asp 1
Poo Asp Pro P1a 0150 Gly Gln Ali AAp Ser 0155 Asn Hhs Glu TGr Aro 1150 Aro 1 THi
Lsu Gho Sur 0100
187 013
105 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:47:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojsdyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:47:
AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG 4 9 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:48:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlClOWOŚĆ:pojsdyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:48:
lcyllAClAy ggcatccac 1 9 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:49:
( i ) CHARAKTERYSTYKA. SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIClOWOŚĆ:pojsdyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:49:
GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:50:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlClOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:50:
106
187 013
GCACCOAGOT TCCCAGACAO 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NRm:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pig zisid (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ^ojedynczi (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CĄSCTGCKU : DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NRm:
CGATCTCOAC ACAACACAGA G 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:52:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1861 pir zisid (B) GYP: kwis nukleinowy (G) NIGIOWOŚĆ:pojedynczi (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) IODI^:^S^J OZĄSCTOZKU : cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWC/KLUCZ: ODS (B) POŁOŻENIE: 0..1186 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:52:
ATC Met 1 GTO Vil CGT TSgg GCA GTT Gly Val 5 GTG Val ATC Ile CTC Leu CTG Leu TCT Cys 10 GGO Gly TGG Trp GCC Ala CTG Leu GCT Ala 15 TCC Ser 44
TCG GAT GGG TCT TACO CTG GAC GTG GAG TASG GGC GTC GTG TTC AAA GCG 99
Oys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
20 25 30
GAC CCA GCC AGC TTC GHA 0.^ ACT GTG GTG CAG TTT GGT GHA TCT CHS 14'
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Vvl Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg
35 40 45
CTC GTG GTG GGA GCC CCT GTC GAG GCG GTG GCC GTC TASC TAAS AOA GHA 1S
Leu Vii Val Gly TALa Pro Leu Glu TAla Val TCUa Val Asn Gln Thr Gly
50 H 60
OAG GGG TCT GGA? TGT CCG CCG GCC ACT GGC CGG TGC CAG CCC ATC TTA 240
Gin Seo Ser Asp Cos Pro Pro ZGLa Thr Gly Vii Cos Gln Pro He Leu
70 75 80
187 013
107
CCG Lri CAC His ATT ILr CCC Pro CCA Lru 85 GAG Gli GCA ALi GCG ViL AAC Asn ACG Mrt 90 CCC Srr CCG Lei dC Gly CCG Lru CCC Srr 95 CCG Lri 288
GCG GCC GAC ACC AAC AAC CCC CAG CCG CCG GCC CGC GGC CCA ACC GCA 336
VaU ALa Asp Thr 100 Asn Asn Srr GUi Lru 105 Lri ALa Cys Gly Pro 005 Thr ALa
CAG AGA GCC CGC GGA AAG AAC ACG TAC GCA AAA GGC CCC CGC CCC CCC 384
GUi Arg AUi 115 Cys ALi Lys Asn Mrt 025 Tyr ALi Lys Gly Srr 029 Cys Lri Lri
CCG GGC CCC AGC CCG CAG CCC ACC CAG GCA ACC CCC GCC ACC ATG CCA 432
Lri Gly 130 Srr Srr Lri GUi Phr 135 ILr GUi ALa IUu Pro 140 ALa Thr Mrt Pro
GAG CGC CCA GGA GAC TCT ATG GAC ATT GCC CCC CCG ACC GAC Gd CCC 480
GUi 145 Cys Pro Gly GUi GUi 150 Mrt Asp ILe ALi Phr 155 Lri ILr Asp Gly Srr 160
GGC AGC ATT GAC CAA AGC GAC CCC ACC CAG ACG AAG GAC CCC GCC AAA 528
Gly Srr Ilr Asp GUi 165 Srr Asp Phr Thr GUi 170 Mrt Lys Asp Phe VaL 175 Lys
GCC CCG ATG dC CAG CCG Gd AGC ACC AGC ACC CCG CCC CCC CCG ATG 576
ALa Lru Met Gly 180 GUi Lri ALa Srr Thr 185 Srr Thr Ser Phr Srr 190 Lru Mrt
CAA TAC CCA AAC ACC CCG AAG ACC CAC CCC ACC CCC Ad GAA CCC Ad 624
Gln Tyr Srr 195 Asn IUu Lru Lys Thr 200 His Phe Thr Phr Thr 205 Glu Phr Lys
AGC AGC CCG AGC CCC CAG AGC CCG GCG GAC GCC ACC GCC CAG CCC CAA 672
Srr Srr 205 Lei Srr Pro GUi Srr 209 Lri Val Asp AUi ILr 220 VaL Gln Lri GUi
GGC CCG Ad CAC ACA GCC CCG GGC ACC CAG AAA GCG GCG AAA GAG CCA 720
Gly 225 Lru Thr Tyr Thr ALi 230 Srr Gly Ilr GUi Lys 235 VaL VaL Lys Gli Lru 240
CCC CAC AGC AAG AAC’ GCC CGA AAA AGC GCC Ad Ad ACA CCA ATT 768
Phr His Ser Lys Asn 245 Gly ALa Arg Lys Ser 250 ALa Lys Lys Ilr Lri 255 Ilr
GCC ACC ACA GAC Gd CAG AAA CCC AGA GAC CCC CCG Gd TAC AGA CAC 816
VaL ILr Thr Asp 260 Gly GUi Lys Phr Arg 265 Asp Pro Lri Gli Tyr 270 Arg His
GCC ACC CCC TAA GCA GAG AAA GCC dG ATC ATT CGC TAC GCC ACA Gd 864
Val ILr hro 275 Glu ALi Gli Lys AUi 280 Gly Ile ILr Arg Tyr 285 ALa Ile Gly
108
187 013
GTG Val GGA Gly 290 GAT Asp GCC Ala TTC Phe CGG Arg GAA Glu 295 CCC Pro ACT Thr GCC Ala CTA Leu CAG Gln 300 GAG Glu CTG Leu AAC Asn ACC Thr 912
ATT GGC TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT 960
Ile 305 Gly Ser Ala Pro Ser 310 Gln Asp His Val Phe 315 Lys Val Gly Asn Phe 320
GTA GCA CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC 1008
Val Ala Leu Arg Ser 325 Ile Gln Arg Gln Ile 330 Gln Glu Lys Ile Phe 335 Ala
ATT GAA GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG 1056
Ile Glu Gly Thr 340 Glu Ser Arg Ser Ser 345 Ser Ser Phe Gln His 350 Glu Met
TCA CAA GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG 1104
Ser Gln Glu 355 .Gly Phe Ser Ser Ala 360 Leu Ser Met Asp Gly 365 Pro Val Leu
GGG GCT GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC 1152
Gly Ala 370 Val Gly Gly Phe Ser 375 Trp Ser Gly Gly Ala 380 Phe Leu Tyr Pro
TCA AAT ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT 1200
Ser 385 Asn Met Arg Ser Thr 390 Phe Ile Asn Met Ser 395 Gln Glu Asn Glu Asp 400
ATG AGG GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG 1248
Met Arg Asp Ala Tyr 405 Leu Gly Tyr Ser Thr 410 Ala Leu Ala Phe Trp 415 Lys
GGG GTC CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG 1296
Gly Val His Ser 420 Leu Ile Leu Gly Ala 425 Pro Arg His Gln His 430 Thr Gly
AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT 1344
Lys Val Val 435 Ile Phe Thr Gln Glu 440 Ser Arg His Trp Arg 445 Pro Lys Ser
GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT 1392
Glu Val 450 Arg Gly Thr Gln Ile 455 Gly Ser Tyr Phe Gly 460 Ala Ser Leu Cys
TCT GTG GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA 1440
Ser 465 Val Asp Met Asp Arg 470 Asp Gly Ser Thr Asp 475 Leu Val Leu Ile Gly 480
GTC CCC CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC 1488
Val Pro His Tyr Tyr 485 Glu His Thr Arg Gly 4 90 Gly Gln Val Ser Val 495 Cys
CCC ATG CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT 1536
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His
500 505 510
187 013
109
TAT Tly TAA Alu CAT Tln 515 AAC Tly CAT His CCT Poo TAA Top ATC Tly 520 CTC Aog TTT Phr ATT Tly CCA Ala ACT Ala 525 CTA Ueu ACA TAo ATA ViI 0084
CTA AAA AAC ATA AAT AAA AAC AAT CTA ACT AAT ATA ACT ATT AAT ACA 1632
Uuu Tly 530 Asp ViI Asn Tly Asp 535 Seo Ueu AUa Asp Val 540 Ala Ilu Tly Ala
CCC TAA AAA TAA TAA AAC AAA ATT TCT ATC TAC ATA TTT CAT ATA TCC 1680
Poo 545 Tly Alu Alu Alu Asn 550 Aog Tly Ala ViI Tyo 555 Ile PAu His Tly Ala 560
TCA AAA CAA TAC ATC ACT CCC TCA CCT AAC CAA CAA ATC ACT AAC TCC 0728
Seo Aog Tln Asp Ile 565 Ala Poo Seo Pro Ser 570 Tln Aog ViI TAo Tly 575 Sal
CAA CTC TTC CTT AAA CTC CAA TAT TTT AAT CAA TCA TTA AAT AAA AAT 1778
Cln Ueu PAe Uuu 005 Aog Uuu Tln Tyo PAe 585 Tly Tln Seo Ueu Seo 590 Tly Tly
CAA AAC CTT ACA CAA AAT ATC CTA ATA TAC CTA CCC ATA TCA ACC CAT 1820
Tln Asp Ueu 595 TAo Tln Asp Tly Ueu 600 Val Asp Uuu Ala Val 605 Tly Ala Tln
TAA CAC ATA CTA CTA CTT AAA AAT CTA CCT TTA CTA AAA ATA AAA ATC 1872
Cly His 610 Val Uuu Ueu Ueu Aog 615 Seo Ueu Poe UUU Lru 620 Uys Val Tly Ilu
TCC ATT ATA TTT ACC CCC TCA TAA TTA ACA AAA ACT ATA TAC CAA TTC 1920
Seo 625 Ilu Aog PAe Ala eoo 630 Sao Alu Val Ala Uys 635 TAr Val Tyr Cln Cys 640
TTA TAA AAA ACT CCC ACT ATC CTC TAA ACT AAA CAA ACC ACC ATC TAT 1981
Top Tly Aog Tho Poo 645 TAo Val Ueu Tlu Ala 650 Tly CUu Ala TAo Val 655 Cys
CTC ACT ATC CAC AAA TAT TCA CCT AAC CTT TTA CAT AAT ATC CAA AAC 2016
Ueu TAo Val Aog 660 Uys Tly Sur Poo Asp 665 Uuu Uuu Cly Asp Val 670 Tln Sal
TCT ATC ATA TAT TAT CTT ACT TTA AAT CCT AAC CAT CTA ATT TCT CTT 2064
Ser Val Aog 675 Tyo Asp Luu Ala Uuu 680 Asp Poo Tly Aog Ueu 685 Ilu Sal Aog
ACC ATT TTT AAT TAA ACA AAA AAC TAC ACT TTA ACC CAA AAA AAA ACT 2112
AUa IIa 805 PAr Asp Alu TAr Uys 695 Asn Cys TAo Uuu Thr 700 Aog Arg Uys TAo
CTT TTA CTT AAT TAT CAC TTC AAA ACA ATT AAA CTA CTT TTT CCA AAC 2 0 60
Ueu TUy Lru Tly Asp His Cys Tlu TAo Met Uys Lru Leu Ueu Poo Asp
705 710 715 720
110
187 013
GGG GGG GAG Glu GAG Asp GCA AIi 020 GGG ^I ACC Gho CCG Poo AGC Ile AGC Ile 730 CGG Leu CGC Aug CGG Lsu AGC Asn GTA Lsu 025 TCP Ssr HO
Cys VII
CGG GCA GGG GAC TPG GCG CCA GCC AGG AAC CGG CGG PPG GGG CGG GCG 2006
Lsu Ala Gly Asp 750 Seo Ala Poo Seo Aog 000 Asn Leu Aog Poo ViI 750 Lsu Ali
GGG GGC GCA CAA GAP PAG GGA ACA GCG GCG GGC CCG GGG GAG AAG AAC 2250
Vil Gly Seo 755 GIn Asp His Vil Ghr 760 Ali Seo Phe Poo Phe 765 Glu Lys Asn
GGT GAG CAG GAG PTC CGG GGG GAG GGG AAC CGG GGC GGC AGC GGC AAC 2200
Cys Tys 770 Gln GIu Lsu Leu Cys 775 Glu Gly Asn Leu Gly 780 ViI Sso Phs Asn
GGC TCA GGC CGG CAG GGC GGG GAG GGA GGA AGP GCC CCA GAG CGC ACG 2011
Phe 785 Sso GIy Leu Gln VaI 7 90 Leu Glu Va1 GIy Seo 795 Sso Poo Glu Leu Ghr 010
GGG ACA GGA ACA GGG TGG AAG GAG GGG GAG GAC GGC TAG GGA ACC GGA 2000
VaI Tho VaI Gho ViI 010 Top Asn Glu Gly Glu 800 Aep Sso Gyo Gly Gho 815 Leu
AGP GAG GTC GAC GAP CCA GCA GAG CGA GCG GAC CGA CGG GGG ACA AGA 0026
Ils Tys Phe Gyu 000 Gyo Poo Ali Glu Leu 825 Srr Gyo Arg Aog Val 820 Gho Aug
GCC PAG CAG CCG PAG PPG GAC CCA CGA CGC CGG GCA GGG GAG GCT GAG 0000
AIi Gln Gln 020 Poo His Poo Gyo Pro 850 Lsu Aog Lsu Ali Cys 000 Glu Ali Glu
CCC GCG GGC CAG GGG AGC CGG AGG AGP AGC AGC GGT AGP AGP GAT PAC 0020
Poo Tho 000 GIy Gln Glu Seo Tsu 855 Aug Sso Ser Seo Cys 860 Sso Ils Asn His
CCC GGC GGC CGA GAA GGG GCC AAG GCC ACC GGC AGG AGC ACA GGT GAG 0601
Poo 865 Ile Phs Aug Glu Gly 870 Ali Lys AIi Thr Phe 875 Met Ils Gho Phs Asp 880
GGC TPC GAP AAG GCC GGC CGG GGA GAP AGG GGG CGG CGG AGG GCC AGC 060 A
^l Sso Gyo Lys Ali 885 Phs Lsu Gly Asp Aog 890 Leu Lsu Lsu Aog Gli 895 Sso
GCA GGC AGG’ GAG GAG GAG GAG CCG GGA ACC AGC GAG ACG GCC GTC PAG 002Ć
Ali Sso Sso GIu' 900 Asn Asn Lys Poo Glu 905 Gho Seo Lys Gho Ali 910 Phs Gln
CGG GGG CGG CCG GGG GGG GAC ACG GGC GAG ACC GGG AGP AGG AGG PAG 0000
Lsu Glu Lsu 915 Poo Vil Tys Gyo Gho 221 Wil Gyo Gho Vil Ils 220 Sso Aog Gln
GGA GAG GCG ACC GAG CAG GTC AAC GGC GCA GCG TCP PAC GGG GAG AGA 0020
Glu Asp 200 Sso Gho Tys His res 220 Asn Phs Sso Seo Seo 205 His Gly Glu Aog
187 013
111
CAG Gln 945 AAA GAG GCC AALa GAA Glu CAT His 9595 CGA lrg TAT Tyr CGT Arg GTG Val /AAT Asn 995 AJAC Asn CTG Leu AGT Ser CCA Pro TTG Leu 996 1282
Lys Glu
ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC TGG GTC CCC ATC CTT CTG AAT GGT 1S22
Thr Lsi AALa lle Ser 015 Val Asn PTe Trp Val 977 Pro Ile Leu Leu Asn 9795 Gly
GTG GCC GTG TGG (GAT GTG AAT CTG AGG AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC 2S51
VaL Ala Val Trp 980 Asp Val TTr Leu Arg 95/ See Pro GALa Gln Gly 990 Val Ser
TGT GTG TCA CAG AGG (GAl AAT CAT AAA CAT TCC (GAC CTT CTG ACC CAG 3024
Cys VaI Ser 995 Gln Arg Glu Pro Pro Gln 1000 Ηϊι Ser Asp Leu Leu Thr Gln
ATC CAA GGA CGC TCT GTG ATG GAC TGA GAC ATA GCC GAC TGC CTG CCGC 3072
Ile GIn Gly 1010 Arg Ser VaL Leu Asp Cys ALa IUr ALa Asp 11)20 Cys Leu His
CTC CGC TGT GAC ATC CCA TAC TTG GGC AAC CTG GAT GAG CTT CGCC TTC 3120
Leu Arg 1025 Cys Asp lle Pro Ser 11)00 Leu Gly Thr Leu Asp 1035 Glu Leu Asp Phe 1242
ATT CTG AAG GGC AAC ATC AGC TTC GGA TGG ATC AGT CAG ACA TTG (ACG 0118
lle Lsi Lys Gly Asn Leu 1200 Ser PTs Gly Trp Ile 1050 Ser Gln Thr Leu Gln H05
AAA AAG GTG TTG CTC CTG AGT GAG GAT GAT ATA AAA TTC AAC ACA TCT 0218
Lys Lys VaL Lru Lei Leu Ser GIl ALa Glu 1065 Ile TTr Pho Asn Thr 11)00 Ser
GTG TAT TCC CAG CTG ACG GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCC CAG GTG 0214
Val Tyr Ser GLn 1255 Leu Pro GLy Gln Glu 1080 ALa PTr Lei Arg gGu 1022 GGn Val
TCA ACG ATG CTA GAA GAA TAC GTG GTC TAT GAG ACA GTG TGG CAC ATG 3312
Ser Thr Met 1090 Lei Glu GIu Tyr 1095 VaL 1 VaL Tyr GLi Pro VaV hk Phr Llu MeS
GTG TTC AGC TCA GTG GGA GGT ATG CTG GGA CTG GCT CTC ATT GCT GGG 3062
VaL 1105 Phe Ser Ser VaL Gly 1111 GLy 1 Leu Leu Leu Leu 1115 Ala Leu llu GTr Vv1 1120
GCG CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA AGT CAG TAT AAA GGG GTT GCG 3408
ALa Lei Tyr Lys Leu 1125 Gly Phe Phs Lys Arg 1113 Gln 1 Tyr Lyu sin AeS 1113 Glu
GAT CTA CCCT TTC AGA AAT ACT (GAC CAA GCC GGC CAG GCA GAT TCT AAC 34 / /
Asp Lsu Pro S ee 1140 Alu Asp Pro Asp Pro 1145 Ala Gly GLn Ala Asp 1150 Ser 1 Asn
112
187 013
CAT GAG ACT CCT CCA CAT AACACG TCC TAGGAATCTA CTTTCCTGTA 33150
His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr Ser
1155 1160
TATCTACACA ATTACGAGAT TGGTTTTGCT lT^T^^^CCC^^A^^ AATCTACTGG CATGUAACA 3563
AdTOTATTA AlATCTGlGA TAG CC AA; GCA gggA^^TT^T:(^AAgJ IggAT(lgTGCC CTACATAATJ 3623
AGATlllAGg TTTTTATGGT TTGCCCAAAGT GGTAgAgTTT AGTGCTCGATC AAATTTTTTT 3683
GCAAGglCAG GAATllGGTA AGCGAATAArT L^T^CC^A^T^A^C^C^ T7VgClAgCΊTgg AAAAAlAATl 37I I
AGTAgTgTlA TCAATATTCA ATGTATAGCT TTlTA’TggA'T TTTTAAgAggT gAgATGgAgN 3803
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:53:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1161 aminokwasów (B) TYP:Gminokwas (D) TOPLOGGAA. : linóoaa (ii) ROOZAA CCZĄTTCCKI: biilkk (xi) OOPI STKKWZNCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:53:
Met 1 VGl Arg GUy Wl 5 VaU IIn Leu Leu Cys 10 GU y Trp AULg Leu Ala 11 Ue c
Cys His Gly S Sr Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro VgU VaU POr Lys du
20 25 33
Asp Ala Ala S r Plr te Gly Gln Tho Val Val Gln Phe Gly dn -Se Crę
35 40 45
Leu Vil Val Gly AUla Pro Leu Glu Ala VuC Ala VaU Asn GUn Tho Gly
50 515 60
GUn Suo Ser A\sp Cyc Pro Pro Ala Thr GIy Val Cys Gln Pro Ile Leu
65 70 75 80
Leu His Ile Pro Leu Glu Ala VaU Asn Met S<nę Leu Gly Leu Ser Leu
85 90 99
Val AUg Asp TTr Asn CAsn Ser Gln Leu Leu CALa Ays Gly Por CTr AAu
100 115 111
Gln Aog Ala CCs CAL a Lys Asn Met Tyr CALa Lys Gly Seo CCi Clu Ceu
115 120 115
Leu GUy Ser Ser Leu dn POe Ile Gln AULa Ile Pro Ala Thr Met Pito
130 113 140
GUu Cys Pro GUy Gln Gł.u Mee Asp IIe AUl POr Leu IUe Asp GUs Ssr
145 110 115 116
187 013
113
Cly Sro Ile Sssp Gln 165 Sur Asp Phe Cho GLn 170 Met Lys dp Phs Vll1 175 Lys
Tin Leu Met Gly Gln Leu SULa Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Mst
180 1.81 110
GUn Tyr Ser dn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu ΡΡθ Lys
195 200 205
Ser Sur Leu Ser Pro GLn Ser Leu Val Asp SUn Ile Val GCu Leu Gin
210 215 220
nuy Leu Thr Tyr TTh GSla Sur G.ly Ilu GUn Lys VaU VnU Lys Glu Lsu
225 230 235 240
Phe His Ser Lys dn Gly SULa dg Lys Ssr SUa Lys Lys Ile Leu lis
270 0S 0 255
VaU Iis Thr dp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His
260 265 270
VaU IIi U or Glu Ala udu Lyn Ala Gly Ile lde de iUG ATs Sla UUy
275 2130 21375
VnU Gln Asp da Phs: Asg Glu Pro Thr Ala Lti Gla Ula nae Arn sne
290 295 300
Ile gus Ser Aia Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305 310 31.5 320
VaU Ain Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala
325 30 0 335
IUe GUu Gly Ths Giu Ser dg Ser Ser Ser Ser Phs Gln His GUu Met
375 345 330
Sur GUn Glu Gly Phe Ser Ser AUa Leu Ser Met Asp Gly Pro VaI Leu
100 330 336
GUr Ulo au o Gir CUr PIu Sur Trp Ser G.ly UL es Ala PPh Leu Tyr Pro
370 337 330
ero Asn Met Arg Ser Thr PPh Ile Asn Mm U Ser Gln Glu Asn Glu Asp
385 330 3 99 44)0
Mrt Arg Asp da Ser Leu Gly Tyr Ser ITi Alei Llu GGe Pd Ser Lys
700 10 0 441
gus aaU His Ser Leu IIa Leu Gly SAa Pro dg His GL.n Hm Cho Gly
420 442 479
Lys anU VaI IUe PIu Cho GUn GUu Sro Arg His Top Arg Pro Lys Ser
795 440 770
114
187 013
Tlu Val 450 SSrg Tly Thr Gin Ile 4 45 TUy Ser Tyr Phe Gly 4 60 SALa Ser Leu Cys
Saa Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Lru VaS Leu Ile Gly
465 47 7 4-7 7) 440
VaU Pro His Tyr Tyr Glu His Thr CArg Gly Gly Glu VaS Ser Wl Cys
485 000 005
Poo Mrt Pro GTy AaV Ipg Aor Are L sp Aor Lp s Gly Thr Tha Teu Hat
500 50 5 5 50
Tly Tlu Gln G Ty P iH s TO Trp Gic pArg Phe G1 y Ala JALa Leu Thr VaS
515 520 828
Uru GTy Asp Val Assn Gly Asp Sro Leu Ala Asp Val SAla Ile Gly SALa
530 553 550
Poo Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr USa Phe His Gly SALa
545 550 555 550
Saa Aog Tln Asp IUe Ali Top Seo Too Ser Cle Aog VaU TAo Gly Ser
565 550 557
Tle Lsu PAe Lru Aog Lru Tlu Tyr Phe Cly Gln Ser Leu Ssr Gly Gly
O10 58fj 550
Tle Asp Leu Tho Gln Asp TUy Luu Val Asp Leu Ala Val Cly Ala Gln
595 660 660
Tly His VaU Luu Lru Lru Arg Sro Leu Pro Leu Leu Lys ViU Cly Ile:
610 615 662
Saa lie Arg Phe Ala Pro Saa Glu Val Clla Lys Tho Val Tyr llu Cys
625 630 663 664
Top Tly TAog Thr Pro Thr Val Lru Glu Ala GTy Tlu CULa Thr Val Cys
645 665 665
Uuu TTr aaU Aog Lys Cly Seo Tro JAp Lru Leu Gly Asp Wl TTn Ssa
660 666 667
Saa aαU Arg Tyo Asp Luu Ala Lue Asp Tro Gly caj Lsu Ile Ssa SA-
675 668 668
Ala lir Phe Asp Tlu TAo Lys Asn Cys TAo Lru TTr SCaj Aog Lys TTr
690 669 770
SU3 TUy Leu Gly Asp His Cys Tlu Tho Mrt Lls Lru Uuu Luu Toe Ass
058
7.1.0
771
772
Tys VII Glu Asp Ala Vil CAa Poe Ilr ISe Luu Aog Uuu Asn Luu Saa 725 730 735
187 013
115
Leu Ala Gly Asp 740 Ser Ala Pro Ser Arg 745 Asn Leu AOrg PLO •Val 770 Leu Ala
Vai Ser dn in t His ssał Thr Ala Ser Phe Pre OLr da Lys Asn
751 7^0 776
Oys Sys Gln Giu Leu Leu Cys Glu Gly ASsn Leu Gly Val Ser Phe Asn
770 775 770
Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr
785 7 90 7 £95 800
Vil Thr Val Thr Val Tag Asn Glu dy Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu
801 810 811
iie Sys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu Leu Seg Tyr COrg AOrg Val Thr TCrg
OO0 821 880
AUa du Gln Gin His Pro Tyg Paro Seu AOrg Leu Ala Cer Glu TALa du
835 880 884
Pro Chr Gly Gln Glu Ser Leu TCrg Ser Ser Ser Cos SSe Ile Asn HaLia
850 885 8 80
Pro iie Phe TCrg G’u Gly Aii Lys Ali Thr PPr Met Ile Thr Phe Asp
865 880 887 88 0
Vil Ser Tyr Tys Sil Phe Leu Gly Asp Arg Leu Seu Leu Arg sii Ser
821 890 895
AUa SSe Seg guu Asn Asn Lys Pro Giu Tiar Ser Lys Thr Aia Phe Gin
900 905 910
Leu du Leu Seu VaP Lys Tyr Thr Val Tyr Tiar Val iie Ser Agg Gin
915 920 915
Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Giu Arg
930 935 940
Gin Lys Glu ACn Glu ΗΪ s Agg Tyg Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945 990 995 960
Thr Leu Ala I ii Seg Val Asn Phe Trp Val Pico Iie Leu Leu Csn Giy
965 990 975
Val ACn Val Vin Asp VAs Vlr Leu.Arg Ser Pro TCIa ΤΩη Gly Val Ser
980 998 990
Oys Vvl Ser do Arg OSo Ho Pro Gln Ηί £3 Ser Asp Seu Leu Thr Gln
995 10(00 1005
Iie Gin Gly Arg SSe Vvl Seu Asp Cys TCa Iii Ali Asp Cys Leu His
0616 1015 0316
116
187 013
Lri Arg Cys 1529 Asp Ile Pro Ser 0005 Lru Gly Thr Lei Asp 0505 Gli Leu Asp hhe 104 0
Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln hhr Lei GIi
1505 0050 0595
Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu ALa Glu Ile Thr hhe Asn Thr Ser
1060 1555 1500
Val Syr Srr Gln Leu hro GLy GIi Gli Ala Phe Leu Arg ALa Gln Val
1075 1080 0089
Ser hhr Met Leu Glu Gli Tyr Val Val Tyr Glu hro Val hhe Leu Met
0595 0595 1055
Val hhe Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Lei Lei Ala Leu Ile Thr Val
0159 0105 UW 1000
Ala Leu Syr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg GIi Tyr Lys Glu Met Leu
1025 1135 0035
Asp Leu Pro Ser Ala Asp hro Asp hro Ala Gly GIi Ala Asp Ser Asn
0105 1045 0150
His Gli Thr Pro hro His Lei Thr Ser
0199 0055 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:54:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 0900 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) GECiC^:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 45..3905 (Xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:54:
AGCSSCCCCT GCGCCCACCS GSCATSGGAG STCTCCTTG ATG GCG GGC TTA GCC 54 Met Ala Gly Gly Val
5
GCG ACC CSC CCG ΤΆΤ hc ΤΑ GCC GCG GGC CCC ΤΊΤ CAC CGC A^AG 0 5o
Val Ile Leu Lei Cys 10 Gly Trp Val Lei ALa 15 Ser Cys His Gly Ser 20 Asi
GCG GAC GCG TAT G,AA GGG ATG GCG CCC AGA GAG GAC GGA GCG AGC CCS 15 0
Leu Asp Val Gli 25 Gli Pro ILe Val Phe 30 Arg Gli Asp Ala ALa 35 Ser hhe
187 013
117
GGA Gly CAG ACG Gln Gho 50 GGG Vil GGG Vil CAG Gln GGG Phs GGG Gly 55 GGA Gly GCT Sso CGA Aog CGC Lsu GGG Vil 50 GGG VaI GGA Gly GCC AIi 198
CCG crG GAG GCG GGG GCA GTC GAC CAA ACA GGA CGG GGG GAG GAC GGG 006
Poo Lsu Glu Ala Vil Ala Val Asn Gln Gho GIy Aog Teu Gyr Aep Cys
55 60 65
GCA CCG GCC ACG GGC AGG GGC CAG CCC AGC GGA CGG CGC AGG CCC CGA 020
Ali Poo Gla Ghr Gly Met Cys GIn Poo Ile VaI Teu Aog Ssr Poo Lsu
70 75 80 85
GAG GCA GGG AAC AGG GCC CGG GGC crG GCG CGG GGG ACG GCC ACC AAG 200
GIu Gli VaI Asn Met Srr Leu GIy Tsu Sso hru Vil Gho AIa Gho Gnn
90 95 100
AAC GCC CAG GGG CGG GCG GGG GGG CCA ACT GCA CAG AGA GCG GGG GGG 025
Asn Gli Gln Teu Teu Ali Cys Gly Poo Gho AIi Gln Aug GIi Cys Val
105 110 115
AAG GAP AGG GAG GCG AAA GGG GCC GGC CGC CGG CGC GGC GCC AGC GGG 020
Tys Asn Mst Gyo GIi Lys Gly Sso Cys Tsu Leu Tsu Gly Ssr Sso Tsu
m 125 m
CAG rrc AGP CAG GCA GGC CCG GCC GCC ATG CCA GAG GGG CCA AGA CAA 586
Gln Phs Ils Gln AIi Va1 Poo AIi Sso Mst Poo Glu Cys Poo Gog Gln
035 050 155
GAG ATG GAC AGG GCG GGC CGG ATG GAG GGG GCG GGC AGC AGG AGC CAA 000
Glu Mst Asp IIr Gli Phe Leu Ils Asp Gly Seo Gly Seo Ile Asn Gln
150 055 160 165
AGG GAC rrr GCC CAG AGG AAG GGC GGG GTC AAA GCG GGG AGG GGA GAG 000
Arg Gsp Phs AIi Gln Mut Lys Asp res Vil Lys Ali Leu Mst Gly Glu
070 075 080
GGT GCG AGC ACC AGP ACC GGG GGC TCP CGG AGG CAA GAC GCG AGP AGP 605
Phe Ali Seo Gho Seo Ghr Teu Phe Sso Tsu Met GIn Gyo Sso Asn Ils
185 090 0 95
CGG GAG ACC CAG rrr ACC GGC ACG GAA GGC AAG AAC AGC CGG GAC PPG 678
Leu Tys Gho His Phs Gho Phs reo Glu Phs Tys Asn IIr Lsu Asp Poo
m 250 m
CAG AGP CGG GGG GAG CCC AGG GGC CAG CGG CAA GGC CGG ACC GAC ACA 726
Gln Sso Teu ViI Asp Pro Ile Vil Gln Tsu GIn Gly Lsu Gho Gyo Tho
215 m 200
GCC ACA GGC AGC CGG ACA GGG ATG GGA GAG CTA GTG CAG AGC AAG GAG 775
Ali reo Gly Ile Gog Gho VII Mst Glu Glu Lsu res His Sso Tys Asn
220 025 200 000
GGG TCC CGr AAA AGG GCC AAG GAG ATC CGC CGG GGC ATC ACA GAG GGG 0o0
Gly Sso Aog Lys Seo Gla Tys Tys Ils Tsu Teu Vil Ils reo Asp Gly
205 000 260
118
187 013
CAC Gin ATA Lys TAC Tyr ACA GAC Arg Asp 265 CCC Pro CTG Leu GAG TAT ACT GAT Asp GTC Vli ATT Iis CCC Pro 000 CCC TUi CCA TUa 870
neu Tyr 270 Ser
GAC AGA CCT CCC AT.C ATT CCT TAT CCT ATT GCC ητη GGA CAT CCC TTC 918
Asp Lys AUl Gis Ilu Iis Arg Tsr AIi Iis Gis Vli nas Asp AUi PIu
280 050 290
CAC GGC CCC ACT GCC CTG AAG GAG CTC AAC ACC ATT nnc TCA CCT CCC 966
Gin Giu Pro dr AUa Lsu Lys neu Leu Asn Thr Iie nas Ser AUa Pro
295 300 90O
CCA CAC GAC CAC GTC TTC AAC GTA CCC AAC TTT gca gca CTT CGC AGC 1014
Pro Gin Asp His Vil PIu Lys Vii Cis Asn Phe AUl AUl Lsu Arg Ser
310 910 905 325
ATC CAG AGG CAA CTT CAG GAG AAA ATC TTC nyy ATT GAC CGA ACT CAA 1062
Iie Gin Arg Gin Leu Gin niu Lys Iie Phe AUl Ile nau Gis dr Gin
990 390 970
TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAC ATG TCA CAA GAA GGT TTC 1110
Sur Arg Sur esr Ser Ser PIu Gin His Cłu Met Ser Gin Gau Giy PIu
370 350 355
AGT TCA CCT CTC ACA TCC GAT GGA CCC GTT CTG nnn gcc CTG CGA ACC 1158
Sur Sso AUl Lsu Thr Ser Asp Gis Pro ViI Lsu nis AUi Val Cis Ssr
360 900 9O0
TTC AGC TCC TCC GGA CCT GCC TTC TTA TAT CCC CCA AAT ACC AGA CCC 1206
PIu Seo Trp Ser Giy Cis Aia PIu Lsu Tyr Pro Pro Asn dr Arg Pro
375 950 980
ACC TTT ATC GAC ATC TCT CAC GAC AAT GTC GAC ATG ACA GAC TCC TAC 1257
Thr Phe Iis Asn Mst Ser Gin nau Asn VaI Asp Met Arg Asp Ssr Tyr
390 990 O05 700
CTC CGT TAC TCC ACC CCA GTC GCC TTT TCC AAG nnn GTT CAC AGC CTC 130o
Luu CUs Tyr Sur Tho AUl Vil AUl PIu Top Lys nas Vil His Ser Lsu
410 710 7O0
ATC CCG GCG GCC CCG CGT CAC CAC CAC ACC nnn AAG GTT GTC ATC TTT 13o0
Iis Leu CUs Ali Pro Arg His Gin His TIo nis Lys Vil Val Iie PIu
425 495 795
ACC CAG GAA GCC AGC CAT TGG AGC CCC AAC TCT GAA GTC ACA GCC ACA 1398
TIo GUn Giu AUl Arg His Top Arg Pro Lys Ser Cłu ViI Arg Cis TIo
440 700 7O0
CAG ATC GGC TCC TAC TTC CCG GCC TCT CTC TCT TCT GTC CAC GTG CAT 1740
GUn IUr CUs Ssr Tyr Phs Giy AUa Ssr Leu Cys Ser ViU Asp ViU Asp
750 460 760
187 013
119
AGA Arg 410 GAT Asp GGC GUs AGC Seo ACY Xai GAC Asp 475 CTG Leu GTA Vil ATG Leu ATC Uiu GGA GUs 480 GCC AUa CCA Poo AAT His TAC Tyo TAT Tyo 485 1494
GAG CAG ACA CGA GGG GGG CAG GTC TAA GTG TTC CCC GTG AAC GGT gtg 1542
Glu GUn Tho Arg Gly 490 Gly GUn Vil Suo ViU 495 Phu Poo alU Poo GUs 500 Val
AGG GGA AGG TGG CAG TGT GAG GCC AAC CTA CAC GGG GAG AAG GGA AAT 1590
Arg GUs Arg Top 505 GUn Ays Glu AUl Thr 510 Leu His GUs GUu Gln 515 Gli His
ACT TH GGC CGC TTT GGG GTG GCT CTG AAA GTG CTG GGG GAC GTA AAC 1638
Poo Top GUy 520 Arg Phu GUy VaU AUa 525 Luu Tho VaU Leu Gli 530 Asp VaU Asn
ggg GAA AAT CTG GCA GAC GTG GCT ATT GGT GCC CCT GGA GAG GAG GAG 5000
GUs Asp 535 Asn Luu AUa Asp VaU 540 AUa Ule GUs AUa Pro 545 GUy GUu Glu GUu
AGA AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATA 1705
Ser 550 Aog GUi Ala Val Tyr 555 UUe Phe His GUs Ali 560 Ter Arg Leu GUu UUu 565
ATG CCC TCA CCC AGC CAG CGG GTC AAT GGA TAC CAG ATA TCC CTG AGA 1782
Mut Poo Seo Pro Seo 570 GUn Arg Vil Tho Gly 575 Seo GUn Luu Sur Luu 580 Arg
ATG AAG TAT TTT HG AAG TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAA CTT ACA CAG 1830
Luu GUn Tyo Phe 585 GUs GUn Seo Leu Seo 590 GUs Gli GUn Asp Luu 595 Tho GUn
GAT GGC ATG GTG GAA CTG GAA GTG GGA GAA CAG GGG AAA GTA ATG ATG 1870
Asp GUs Leu 600 Val Asp Luu AUl Vil 605 GUs AUl Gln Gly His 610 ViU Leu Luu
ATA AH AGT CTG AAT ATG CTG AAA GTG GAG ATC TCC ATA AGA TTC GAA 1926
Leu Aog 615 Suo Luu Poo Leu Leu 620 Lys aGU Glu Luu Ter 625 Ule Aog Phe AUl
AAA ATG GAG GTG GAA AAG GCT GTG TAA CAG TGA TGG GAA AGG ACT' CAA 1974
Poo 630 Mut GUu Val AUa Lys 635 AUg ViU Tyo GUn Ays 640 Top Glu Arg Tho Poo 645
AAT GTC CTA GAA GAT GGA GAG GCC AAT GTC TGT CTC AAT GTC CAA AAA 2022
Tho VgU Luu Glu AUl 650 GUs Glu AUg Thr Vil 655 Cys Luu Tho VaU His 660 Lys
GGA TAA ACT GAC ATG TTA GGT AAT GTC CAA GGC TCT GTA AGG TAT GAT O01O
GUs Suo Pro Asp 665 Leu Leu Gli Asn ViU 670 GUn Gli Sur Vil Arg 675 Tyo Asp
ATG GCG TTA GAT ACG GGC AGA CTG ATT TCT CGT GAC ATT TTT GAT GAG 2118
Leu Ali Leu 680 Asp Poo Gly Arg Luu 685 Uie Seo Arg Ali Uiu 690 Phe Asp GUu
120
187 013
ACC Thr AAG AAC CGC Cys ACC Thr CCG Leu ACG Thr 700 dA Gly Ad Arg Ad Lys ACC Thr CCG Lri 705 Gd Gly CCC Lru GGC Gly GAC Asp 2165
Lys 695 Asn
CAC CGC TAC ACA GCG Ad CCG CCC CCG CCG GAC CGC GCG GAA GAC GCA UW
His 710 Cys Gli Thr VaL Lys 715 Lri Lri Lri Pro Asp 720 Cys VaL Gli Asp AUi 725
GCG AGC CCC ACC ACC CCG CGC CCC AAC CCC CCC CCG GCG AGA GAC CCC 2262
VaL Ser Pro ILr ILr 730 Lri Arg Lri Asi Phr 735 Srr Lru VaL Arg Asp 740 Srr
GCC CCA CCC Ad AAC CCG CAC CCC GCG CCG GCC GCG GGC CCA CAA GAC 2310
ALa Srr Pro Arg 745 Asn Lri His Pro VaL 750 Lri Ala ViU Gly Srr 755 GUi Asp
CAC ACA ACC GCC CCC CCG CCG CCC Gd Ad AAC CGC Ad CAA HAA CCC 2398
His Ile Thr 760 ALa Srr Lri Pro Phr 765 Gli Lys Asn Cys Lys 770 GUi Glu Lru
CCG CGC GAG Gd GAC CCG GGC ACC AGC CCC AAC CCC CCA GGC CCG CAG 2005
Lri Cys 775 Glu Gly Asp Lri Gly 780 IUu Srr Phr Asn Phr 785 Ser Gly Lru GUi
GCC CCG GCG GCG dA GGC CCC CCA Gd CCC ACC GCG ACA GCC ACC GCG 2094
VaU 790 Lru VaL ViU Gly Gly 795 Srr Pro Gli Lri Thr 800 Val Thr Val Thr Val 805
Cd AAC GAG GGC GAG GAC AGC CAC dA ACC CCA GCC Ad CCC TAC TAC 2550
Trp Asn Gli Gly Gli 810 Asp Srr Tyr Gly Thr 815 Lri VaL Lys Phr Tyr 820 Tyr
CCA GCA Gd CCA CCC TAC CGA Cd GCA ACA Gd ACC CAG CAA CCC CAC 2995
Pro Ala Gly Lri 825 Srr Tyr Arg Arg ViU 830 Thr Gly Thr GIi Gln 835 Pro His
CAG TAC CCA CCA CGC CCG GCC CGC GAG GCC Gd CCC GCC GCC CAG GAG 2902
GUi Tyr Pro 840 Lri Arg Lri ALa Cys 845 Glu ALa Glu hro Ala 850 ALi GUi Gli
GAC CCG Ad AGC AGC AGC CGC AGC ATT AAC CAC CCC ATC CTC CGA TCA 2605
Asp Leu 855 Arg Srr Srr Srr Cys 860 Srr ILr Asn His Pro 865 Ilr Phr Arg Glu
GGC GCA Ad ACC ACC CCC ATG ACC ACA CCC GAC GTC CCC TAC Ad GCC 2504
Gly 870 Ala Lys Thr Thr Phr 875 Mrt Ilr Thr Phr Asp 880 Val Srr Tyr Lys ALa 885
CCC CCA GGA GAC Ad CCG CTC CCG Ad GCC AAA GCC AGC AGC GAG AAT 2002
Phe Leu Gly Asp Arg 890 Leu Leu Lri Arg ALa 8 95 Lys Ala Ser Ser Glu 900 Asn
187 013
121
AAT AAC CCT GAA AAC AAC CCSG ACT GCA TCT GGA, CCA CGG CTC CCA GTC 2790
Ase Uys Pro A. ss TGa Asn Lys Ths Alc LAa Cln Lnu UUu Leu Pro VaT
905 910 915
AAC Lys TAC Tyr ACC Thr 920 ClT^C Val TAT Tyr ACC TAr CTA Ueu ATC AGT ACT CAA Alu GTAC STS TCC Ser ACC Thr SASC SCsn 2808
Ile 925 Se a SCog GTu Asp 930
CAT ATC AAC TTT TCA TCT TCC CAA GAA GAC AGA AAG CAA (AAC GCC GOC 5808
His Vll 935 Ase PAu Sao Ser Seo 940 Ηΐι GTy GTy .Aog Aog 94 5 Gln Glu TALa Ala
CAT CAC TAT CGT GTG SCAT AAC CCG AGT CCA CTA JAG GCT GAC GAC A(AC 2904
His OO0 Aog Tyc OA- Av1 SCsu 955 Asn Luu Ser Pre Uuu 085 Lus Psu SA a szal SArg 966
ATT AAC TTC TAA ATC CCT ATC CTT CTG TSAA GGT GTG GCT GTG TGG STAT 2982
Vaa Asu PAe Top Vil 000 Poo Val Leu Geu A as 75 S Gly Val Ala Val Trp 980 SA;p
CTA ACT CTC AAC AAC CCA ACA CAG GGT GTC TCC TGC GTG TCC TAA ATG 0000
Val TAo Luu Sao 980 Sur Pre Ala Gln Gly 90 S SS al Ser Cys Val Seu 995 GTu Me A
AAA CCT CCT CAA AAT CCC AAC ttt CTG ACC (CAG ATT CAG AST PTT TCC 0078
Uys Pre Pap Alu 1000 Ase Poo Asp PheLeu 1005 Thr Gln Ile Gln SA— 1010 SA— Per
ATA CTC AAC TAC TCC ATT ACT GAC TGC CTG CCTSCT TTC CGC TTA GAA ATC 3028
Val Ueu Asp 10O5 Cys Sal lle Ala Asp 10:^0 Cys Leu His Phe SArg 1025 Cys As^s> Sle
CCC TCC TTA CAC ATC CAA AAT GJA\ CTT CSSTC TTC ATT CTG AGA GAC saa: 3170
Too Seo O0OO Uuu Asp Ule Alu Asp O0O5 Glu Leu A sp Phe Ile O5O0 Leu Aa—' GTy Aan 1045
CTC ACC TTC GAC TAA ATC AGT CAG ASAT TTG CCSG (TAC SASG GCT GTG PAT 3222
Uru Ser PAr Cly Top Vil 1050 Seo Gln Thr L eu 105S Gln 1 Glu Lus STAl Puu Puu 1060
ATA AAT AAA ACT AAA ATC ACT TTC GAC ACA TCT GTG TGC TTC TAA GCT 3200
Val Ser Alu Ali 1588 Alu 1 Ule Tho Phe: Asp Thr lOU (S Ser Phi T’r See Ud GTu 1 Puu
CCA AAA CAT AAA ACA TTT CTA AGAT AGC CAC GTG SAG ACA AAC GTG TAA 3318
Poo TUy Ale KK Alu 1 Ala PAe Ueu Arg H08 ASa 1 G ln Val GTu PGr H09 TTr 1 Glu GTu
AAA TAC ATC GTC TAT CACS CCC ATC TTC CTC GTG GCG GGC AGC TCG GTG 3 S S6
Alu Tyo 1008 Val Val Tyr Glu Pro 1100 Ile 1 Phe Leu Val Ala 1105 Gly Ser Ser Val
122
187 013
GGG GGT GLy Gly 1110 CTG Leu CTG Leu TTC Leu CTG (GCT Leu Ala 1115 CTC Leu ATC Ile; ACA Thr GTG GTA Val Val 1120 CTG Leu TAC Tyr AAG Lys CCT Llu 1125 3414
GGC TTT TYC TATA CGT /CAG TAC AAA (GGA ATG CTG (GCC GGC /TCG GCT GGA 34H
GLy PTs Xaa Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala
1130 1005 1140
GGT TTT GTC ACT! GCC GGC GCA GCAC (GAT TTC CSC TGT (GAG ACT CCT CCA 3515
Asp Pro Val Thr Ala Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Por
1145 1150 1155
GAG TGT GGG AGC TAGGGAGCCA CGCGCCGGAC GAGAGCGGCG AGGGGGAGGG 3081
Tyr Lsi VaL Ser
1160
GGAATGTCGA TGAGTCTACG GGAATGGGAA CGGGT 35 97 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:55:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1161 aminokwasów (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ci) OPIS SEIWffiNCJI : IDENTYFATARGR SEKNTNCAl NR:55:
Mst 1 ALa Gly GUy Val 5 Val Iie Leu Leu Cys 10 Gly Trp VaL Lsu /Aa 15 Ser
Tys His Gly S ee 20 Asn Leu Asp Val GUu 25 GUi Pro Cle Val Phs 30 Arg Gli
Asp GUa Ala 35 S es Phe Gly Gln Thr 40 Val Val Gln Phs Gly 45 Gly Sss Arg
Lsu VaL 50 Val Gly AUa Pro Leu 55 Glu Ala VaL Gla VaL 60 Asn Gln TTr Gly
Arg 65 Lei Tyr Asp Cys Ala 70 Pro ALa Th/ Gly Met 75 Cis Gln Pro CLs Val 80
Lsi Arg Ser Pr/ Lsi 85 Glu Ala Val Asn Met 90 Ser Lei Gly Lsi Sur 95 Leu
Val Thr Ala TTr 100 Asn /Tsn /TLa GUn Leu 105 Leu GUa Tys Gly Pro 110 TTr GALa
Gln Arg ALa 115 Cys VaU Lys Asn Mst 120 Tyr ALa Lys GLy Srr 125 Cys Lsi Lsi
187 013
123
Seu Gir 130 Ser Ser Leu Gln Phe 135 Iie dn Ali Vll Pol 140 Ali Ser Met Pol
giu Oys Pro Arg Gln UlΗ Met Asp Iie Ali Phe Leu Ile Asp Giy Ser
m 056 m 160
Giy Ser Ile Csn dn Agg Asp Phe Aii dn Met Sys Asp Phe Val Lys
001 170 175
Ali Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Phr Ser Thg Seu Phe Seg Leu Met
180 m 190
dn Tyr Ser Csn Ile Seu Sys Phr His Phe Thr Phe Thr du Phe Lys
195 203 201
Ssn Ile Leu Asp Pro dn Ser Leu Vil Asp Pol Ile Val Gln Leu dn
210 215 200
Giy Leu Phr Tyg Phr AUa Phr Giy Ile Arg Phr Vil Met Giu du Leu
m 236 235 210
Phe His Seg Lys Asn Gly Ser Agg Sys Ser Ala Sys Sys Ile Leu Leu
m 156 m
Vai Ile Phr Asp Gly dn Sys Pyg Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp
260 065 270
Vai Iie Pro AUa Ala Asp Sys Ali Giy Iie Ile Arg Pyr Ala Ile Gly
255 280 285
Vai Giy Asp Cli Phe Gln Giu Pol Thr Ali Leu Lys Giu Seu Asn Thr
296 295 O0O
Iie Giy Seg Cii Pol Pro dn Asp His VaI Phe Lys Vii Giy Csn Phe
301 m m 320
Ali Ali Seu Arg Ser Ile Gln Arg GIo Seu Gin du Lys Iie Phe Cii
325 330 335
Iie du Giy Phr Gln Seg Agg Seo Ser Ser Seg Phe Gln His Glu Met
H0 m 350
Ser GIo du Gly Phe Ser Ser Cii Leu Phr Ser Asp Gly Pol Vai Leu
m 360 361
dy Sla Val Gly Ser Phe Ser Prp Ser Gly Gly Aia Phe Leu Tyg Pgo
176 375 386
Pol Asn Pho Arg Poo Phg Phe Iie Csn Met Seg Gin du Asn Vii Asp
m 300 301 400
Met Agg Asp Ser Tyr Leu Gir Py? Seg Thr Cii Vii Ala Phe Pop Sys 465 m m
124
187 013
Gir aaU His Seo 420 Lsu Ule Leu GUr Aia 425 Pro Arg His GUn His 730 dr aiy
Lys anU VII 795 Ule PIu Tho Gin GUu 475 SUa Arg His Trp Arg 440 Pro Lys Sro
Clu anU 450 Arg Giy Thr Gln Ulr 705 Giy Sro Tyr PIu Giy 460 TUn Sen Leu Cys
eso 760 ViI Asp Vnl Asp Arg 470 Asp Gly Ser Xia Asp 475 Leu ViU Lru IUe GUs 785
AUi Pro His Tyo Tyr 450 Giu Gin Tho Arg GUy 490 Gis GUn VaU Sso anU 790 Phr
Poo Ul Pro nis 500 Vaa Arg Giy Arg Trp 505 Gin Cys Giu TUn Thr 510 Lru His
nur GUu Gin 515 Gis His Pro Top Gis 520 Arg Phe Cis ViU TUn 525 Lru Thr VnU
Leu Gir 530 Asp VaU Asn GUy Asp 535 Asn Lsu Tin Asp ViU 540 Ali IUe air Ain
Pro 040 dis nuu nUu Giu Ser 550 Arg CUs TUa aal Cyn 555 Ule Phr His Gir Ain 065
Ser Tog Leu Giu Ule 565 Met Poo Sro Pro Sen OO0 GUn Arg VaI dr aur 575 Ser
Gin Lru Srr Leu 580 Arg Leu Gin Cs? PIu 080 Giy Gln Ser Leu Ser 590 Gir air
GUn Asp Leu 595 Thr Gin Asp dis Leu 600 VaU Asp Lsu AIi ViU 605 ais AUn GUn
Giy His 610 aal Lsu Lsu Leu Arg 615 Sen Leu Pro Lsu Lsu 620 Lys anu Giu Leu
Ser 625 eur Arg PIu TUa Pro 695 tet Giu Val TUa Lys 690 Tli VaU Cyn Gin crs 675
Top diu Arg Thr Pro 645 Tho VaU Leu aiu Ain 650 Gis Giu Ain dr HU 600 Cys
Lsu Tho anl His 660 Lys Giy Seo Pro Asp 665 Lru Leu Cis Asn anI 670 Gin Giy
Ser aaU Arg 675 Cyo Asp Leu SUn Lru 655 Asp Pno ais Arg Luu 650 IUe Srr Arg
Tli ule 690 Phe Asp GUu Tho Lys 695 Asn Cys Tho Lsu Tho 700 GUr Arg Lys dr
187 013
125
Seu 705 Gir Seu Giy Asp His 710 Cys Giu Thg Vii Lys 715 Seu Seu Seu Pro Csp 720
Cys Vai Hu Asp Ali 701 Val Seg Pro iie ile 730 Leu Agg Seu Asn Phe 7H Ser
Seu Vai Arg Asp 740 Ser AUa Seg Pro Agg 7H Csn Seu His Pro Vii 710 Leu AUi
Val Giy Seg 711 Gln Asp His Ile Thr 760 AUa Ser Seu Pro Phe 765 Glu Sys Csn
Oys Lys 770 Gin Giu Seu Seu Cys 775 Hu Gly Asp Seu Gly 780 Iie Seg Phe Asn
Phe 581 Ser Giy Seu Gin Vai 790 Seu Vil Vii Gly Gly 501 Ser Pro Glu Leu Pho 800
Vai Pho VaI Phr Vai 201 Top Csn Giu Gly Giy 810 Asp Ser Tyr Giy Thr 811 Leu
Vai Lys Phe Pyr 820 Pyr Poo AUa Giy Seu 201 Ser Pyg Agg Arg Vil 200 Thr Gly
Thr Gln Gln 801 Pro His Gin Tyr Pro 840 Seu Arg Leu Ali Cys 815 Giu AUa Glu
Pro Ali 216 Ala Gin Glu Asp Seu 255 Agg Ser Ser Seo Oys 860 Ser Ile Aso His
Pro 265 Ile Phe Agg Giu Gly 870 Ali Lys Phg Tho Phe 871 Met Iie Pho Phe Csp 880
Vii Seg Tyr Sys Ali 825 Phe Leu Gly Asp Arg 890 Leu Leu Leu Agg AUi 295 Lys
Ala Ser Seg Giu O0O Asn Asn Lys Pro Asp 905 Thr Csn Lys Thr Ali 910 Phe Gln
Seu CiΗ Seu 901 Pro Vii Sys Tyr Thr 920 Vii Tyr Phr Seu iie 925 Ser Agg Gln
Giu Asp 930 Ser Phr Asn His Val 015 Csn Phe Ser Seo Ser 910 His Giy Gly Arg
Arg 915 GIo Gly AUa Ali His 910 Arg Pyr Agg ViI Csn 951 Asn Seu Ser Pgo Leu 960
Sys Seu Cii Vai Agg 965 ViI Csn Phe Trp Vii 050 Pro Val Seu Seu Csn 975 Giy
Val Aii Vai Trp 980 Asp ViI Thr Seu Ser 981 Ser Poo Ali GIo Giy 990 Vii Ser
126
187 013
Cys ViI Sso 995 Gln Mst Tys Poo Poo GIn Asn 0000 Poo Asp Phe Tsu 1105 Tho Gln
IIs GIn Arg Aug Seo VaI Teu Asp Cys Ser Ile Ali Asp Cys Teu His
0010 1100 0020
Phe Arg Cys Asp IIs Poo Ser Tsu Asp IIs GIn Aep GIu Tsu Pnp Phe
0H5 0020 102O 0001
Ile Teu Aog Gly Ann Tsu Ser Phe Gly Gop ViI Ssr GIn Gho Teu Gln
0055 1050 1055
Glu Tys VII hru Leu ViI Ssu GIu Ala GIu Ilr Gho Phe Asp Gho Seo
1OO0 1065 1OO0
Val Tyo Ser GIn hru Pro GIy GIn GIu AIi Phe Leu Aug Ali Gln Vil
1575 0080 1085
GIu Tho Thr hru Glu Glu Gyr VaI VaI Gyo Glu Poo Ile Phs Tsu VaI
1090 1020 0000
GIi Gly Sso Srr VaI Gly GIy Leu Tsu Luu Leu Ali Tsu Ils Gho Val
1105 0010 1015 1120
VaI Tsu Tyo Lys Lru Gly Xai Xaa Tys Aug Gln Gyo Tys Glu Mst Leu
1025 1030 0035
Asp Gly Tys Ali GIi Asp Pro VaI Gho Xia Gly Gln Ala Asp Phe Gly
1050 1055 1150
Cys Glu Gho Poo Poo Tyo Leu Val Sso
1100 0101 (2) lNFRϊMMSCJA DTP IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:56:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 pir zisid (B) GYP: kwis nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedsrczl (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:56:
CCGGTPATGG GGCGAPPCTG (2) UFFOMMACA ADh i IEENTYHAAGRA ISKKENCCI 12:55:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 pio zisid (B) GYP: kwis nukleinowy (P) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi
187 013
127 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:57:
AGGTGAGACA CATGACAGG 19 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:58:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(G) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas llklsinswl (C) NlTIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ci) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI ^:.58:
GGACGGGCAG CGGGATAATG 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:59:
(i)CiARAFyKRYSGYFA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP: kwas llklsilswl (C) NlTIOWOŚĆ:pojsdllcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:59:
CCATAGCGGG CGGAAGCTGC TC 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI CCR:2O:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlClOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:60:
CCGCCTGCCA CTGGCGGGGG T 22.
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:61:
(^CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (T) NlTIOWOŚĆ:pojedyncza
128
187 013 (D) TOPOLOGIA: leniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OTIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:61:
CCCAGATTAC TAACTTyTTT AA 22 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:62:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas euklrinewy (C) NIyIOWOŚĆ:pojedheczi (D) TOPOLOGIA: lieiewi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:62:
TCTTTGATyA TTCTCTATTy 22 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:63:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pi— zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OTIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:63:
yAATTTATTT AyyATTTyTT t 22 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR^:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 pi— zasad (B) TYT: kwis euklrieewy (C) NICIOWOŚĆ^ejedsucza (D) TOPOLOGIA: Ulelowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ii) OTIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:64:
yATATTTTTT CyTACTTTTT 20 (2) INFORMACJA DUA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:65:
(i) CTHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 pi— zasad
187 013
129 (B) SYh: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ:rojedylcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:65:
CASGGCTCCS CTAGAGATT 19 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:66:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:rojedrlczl (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:66:
GGCCSTTGGT CTAATCTTGC G 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 67 (i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) CYh: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ:rojedrlczl (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:67:
CSTGTSCGTT Τ^Τ^^^ ^ΗΤΤ 26 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 68:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) SYP: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ:pojedrnczl (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:68:
CTGCSTTCCT TCTATGGSGA G 22.
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:50:
(^CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
130
187 013 (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasid (B) PYP: kwas nukleinowy (O) NIOIOWOŚĆ:pojedyncza (D) POPOLOGIST: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:69:
CCGTgAGCAC TCCGeCGGAA G 21 (2) INFORMACJA DSA IDENTYFIKATORA SEKWENOJI NR:70:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 pig zasid (B) TYP: kwis nukleinowy (O) NI0IOWOŚĆ:pojedynczi (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENOJI NR:70:
GTCAeACCGC GAACCTCC 18 (2) INFORMACJA DSA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:71:
( i ) Ci.SRCKCERYeCYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zisid (B) TYP: kwis nukleinowy (C) NICIOWOŚĆgojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NRd:
GCGeeTUAGP GAGGCTGAAA GCA 23 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:72:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pig zasad (B) TYP: kwis nukleinowy (C) NIOIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNC (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:72:
GClCTCCTCC APOPCCCAPO GGC 2 2 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:73:
187 013
131 (i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYT: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: lieiewi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OTIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:73:
yTTATyTTTT aaatttttat cc 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:74:
(i)THARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pa— zasad (B) CYT: kwas nukleinowy (C) NITIOWOŚĆ:epjedsucza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OTIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR^:
CTCTACyACT ACCCAAACyT A 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: S5:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pir zasad (B) CYT: kwis nukleieowy (C) NITIOWOŚĆ^ojudyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OTIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:75:
ycCCCAAATA ATyCAATyTT A 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:76:
(i)THARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 pa— zasad (B) CYT: kwas nukleinowy (C) NITIOWOŚĆ:epjrdsecza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ri) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:76:
TATACTCCAC TTCTACCyAC 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:77:
132
187 013 (i(CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (A) NCCIOEOŚĆ:psjedynczα (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPCS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:77:
CTAGTGGCTG GAGCTGGC 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:78:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlCCOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPCS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:78:
CGGTAAGATA GATCTGCGGG 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:79:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukUsinowy (A) NlCIOWOŚĆ:pojsdlncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPCS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR^:
GAGTTCACAG ACAGCACAGG 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:80:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlClOWOŚCcpojudyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPCS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:80:
GATTTAATGT CAGAGCAGAC C
187 013
133 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:81:
(i) CIΑOgKTKOYS,TYKg SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zisid (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NGCGOWOŚĆ:pojrdlnczG (D) TOPOLOGIA: Liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR^H CAAGGCCAGG TCCACAAGGC 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR^:
( i) CIUgRgKTEOYSTYKg SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwis nukleinowy (C) NIAGOWOŚĆ:prjrdsnczG (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI ^:82:
CACGTACCCT AGCACTGTCA G 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI ^:883:
(i)CIgogKTEOYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ:: 22 par zisid (B) TYP: kwas nukleinowy (A) NGAIOWOŚĆ:pojedinczl (D) TOPOLOGIA: Uiniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI ^:83:
ττlgclggGT ccttcatcig gg 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:84:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pao zisid (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NGCIOWOŚĆ:prjrdliczG (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI ^:84:
GAgATGCAAG ATGGAGAACA G
134
187 013 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR^:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pir zisad (B) GYP: kwis nukleinowy (C) CICIRERŚĆ:pojedynczi (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:85:
CGGGGTGPTG CGPAGTGCGP P 20 (2) INFORMACJA DhG IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NM:86:
( i) CiGMAAGEMYSTYKP SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 pio zisad (B) GYP: kwas nukleinowy (C) dATOWaŚCi pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR^:
GCPTTGGPGC GGGACGATGG C 21 (2) INFORMACJA DTP IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NM:87.:
(i)PiGMAAGEMYSTYKP SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) GYP: kwis nukleinowy (C) CIPIREOŚĆ:pojedyrczi (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR^:
GGGPGPGCGC CPGAGTGTPC GAGACPAGAG AGG 33 (2) INFORMACJA DTP IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 88:
(i)PHPMPAGKRYSTYAP SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zisad (B) GYP: kwis nukleinowy (C) NIClOERŚĆ:pojrdyrczl (D) TOPOIOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNG (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR^:
CTGCTPGPGT GGGAGPGPTG PPPGGPGGCP TTC
187 013
135 (2) INFORMACJĄ DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 89:
(i)CHARAKTERYSTYKA. SEKWENCJI :
CA) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:8ó:
CGGSTTTCGG TCCTCGTSGC TSCGCCATAS GG 32 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 90:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (G) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR: 90:
GTSGCGCGCC TCTACCATTT C 21 (2) INFORMACJĄ DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 91:
(i)CtiCERSKTERYSTYKC SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (il) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR: 91:
CCCGATTCTCTGCCTTGS 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 92:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 852 par zasad (B) CYh: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS
136
187 013 (B) POŁOŻENIE: 61..852 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:92:
TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60
ATG Met 1 GCC Ala CTT Leu GGG Gly GCT Ala 5 GTG Val GTC Val CTC Leu CTT Leu GGG Gly 10 GTC Val CTG Leu GCT Ala TCT Ser TAC Tyr 15 CAC His 108
GGA TTC AAC TTG GAC GTG ATG AGC GGT GAT CTT CCA GGA AGA CGC AGC 156
Gly Phe Asn Leu 20 Asp Val Met Ser Gly 25 Asp Leu Pro Gly Arg 30 Arg Ser
GGG CTT CGG GCA GAG CGT GAT GCA GTT TGG GGA TCT CGA CTC GTG GTG 204
Gly Leu Arg 35 Ala Glu Arg Asp Ala 40 Val Trp Gly Ser Arg 45 Leu Val Val
GGA GCC CCC CTG GCG GTG GTG TCG GCC AAC CAC ACA GGA CGG CTG TAC 252
Gly Ala 50 Pro Leu Ala Val Val 55 Ser Ala Asn His Thr 60 Gly Arg Leu Tyr
GAG TGT GCG CCT GCC TCC GGC ACC TGC ACG CCC ATT TTC CCA TTC ATG 300
Glu 65 Cys Ala Pro Ala Ser 70 Gly Thr Cys Thr Pro 75 Ile Phe Pro Phe Met 80
CCC CCC GAA GCC GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCC CTG GCA GCC TCC 348
Pro Pro Glu Ala Val 85 Asn Met Ser Leu Gly 90 Leu Ser Leu Ala Ziła 95 Ser
CCC AAC CAT TCC CAG CTG CTG GCT TGT GGC CCG ACC GTG CAT AGA GCC 396
Pro Asn His Ser 100 Gin Leu Leu Ala Cys 105 Gly Pro Thr Val His 110 Zirg Ziła
TGC GGG GAG GAC GTG TAC GCC CAG GGT TTC TGT GTG CTG CTG GAT GCC 444
Cys Gly Glu 115 Asp Val Tyr Ala Gln 120 Gly Phe Cys Val Leu 125 Leu Asp Ziła
CAC GCA CAG CCC ATC GGG ACT GTG CCA GCT GCC CTG CCC GAG TGC CCA 492
His Ala 130 Gln Pro Ile Gly Thr 135 Val Pro Ala Ala Leu 140 Pro Glu Cys Pro
GAT CAA GAG ATG GAC ATT GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGC AGC ATT 540
Asp 145 Gln Glu Met Asp Ile 150 Val Phe Leu Ile Asp 155 Gly Ser Gly Ser Ile 160
AGC TCA AAT GAC TTC CGC AAG ATG AAG GAC TTT GTC AGA GCT GTG ATG 588
Ser Ser Asn Asp Phe 165 Arg Lys Met Lys Asp 170 Phe Val Arg Ala Val 175 Met
GAC CAG TTC AAG GAC ACC AAC ACC CAG TTC TCG CTG ATG CAG TAC TCC 636
Asp Gln Phe Lys 180 Asp Thr Asn Thr Gln 185 Phe Ser Leu Met Gln 190 Tyr Ser
AAT GTG CTG GTG ACA CAT TTC ACC TTC AGC AGC TTC CGG AAC AGC TCC 684
187 013
137
Csn Vil Leu 195 ViI Phr His Phe Phr 200 Phe Ser Ser Phe Arg 205 Asn Seo Ser
SAG CCG CCG uuc CTC GPU Gd GCC AGP Cd ΟΑ CCC GGC CGC CCG 732
Asn Pro Gln Gly Leu Val UIy Pro Iie Vil Gln Seu Phr Gly Seu Phr
210 215 020
PPG ΑιΆ UCC ACC GGG CCG CPU AAA UGU CCA Gd CGU PPG GAC CCC 780
Phe Thg SUa Phg Gly Ile Seu Sys Vil Vil Phg Uly Seu Phe dn Phr
m 230 m H0
Ad SAG UUG UCC CGC GGA AGP UGC Cd Ad APG GTC CGC GGC AGC CCC 828
Sys Csn Gly Sil Agg Cly Seg SUa Sys Lys Ile Seu Ile Vil Ile Phr
m 210 m
GCT GGU CAG CCG TCC AGA ucu UGC 852
Csp Gly Gln Sys Pyg Sys SUa SUa
OO0 (2) INFORMACJA DSC IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 93:
( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 061 ^nokwisy (B) TYP:aminokwas (D) TOPOLOGIA: Είπίοκι (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENOJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:93:
Met 1 Aii Seu Gly AUi 5 Val Val Leu Leu Giy 10 Vil Seu SUa Ser Pyr 15 His
Giy Phe Csn Seu 20 Asp Vil Met Ser Gly 25 Asp Leu Pro Gir Crg 30 Agg Ser
Gly Leu Agg 35 SUa du Arg Csp Ala 40 Vil Prp Gly Seg Crg 45 Seu Val Val
Gly Aii 50 Pro Seu Cia Val Vai 55 Ser SUa Aso His Phg 60 Giy Agg Seu Pyg
Giu 65 Cys SUa Pro SUi Ser 70 dy Phr Cys Pho Pol 75 Ile Phe Pro Phe Met 80
Poo Pro du Ali Vil 85 Aso Met Ser Seu Giy 90 Seu Ser Seu SUa SUa 95 Ser
Pro Asn His Ser 100 Gin Leu Seu Cli Cys 101 Giy Pro Phr VaI His 110 Arg AUi
Cys Hy Giu 115 Csp Val Pyr Cia do 120 Gly Phe Cys Val Seu m Leu Csp Aii
138
187 013
His Ain 130 Gin Pro IUr Gis Thr 135 VaU Pro Aia TUa Leu 140 Pro Glu Cys Poo
Asp 170 CUn CUu Mst Asp Ule 150 Val Phe Lsu Ule Asp 155 aiy Sen CUy Sso Ile 160
Ssr Sro Asn Asp PIu 165 Arg Lys Met Lys Asp 170 Phe VnU Arg TUa Val 175 tst
Asp CUn Phs Lys 180 Asp dr Asn Tho Gin 150 PIu Sen Leu Mst CUn 190 Cyn Sen
Asn anU Leu 195 ViI dr His Phs dr 200 PIu Sso Ser PIu Arg 205 Asn Ssr Sen
Asn Pro 210 Gin Cis Leu VaI Clu 215 Pro UIs VaU Cin Leu 220 Tho Gly Lsu Thr
Phs 225 Thr AIi dr Gly UIs 230 Leu Lys Vil Val Tho 235 CUu Lsu Phe Gin Thr 275
Lys Asn Gis AIi Arg 040 Giu Ser AUa Lys Lys 250 Ile Leu IUe VnU Ile 255 dr
Asp nur CUn Lys 260 Tyr Lys TUa Ain
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:94:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pin zasad (B) TYP: kwas nnkasiaowy (C) NlCIOWOŚĆ:Gojsdsaczn (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZSJJ CZĄSTECZKI ( cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:94:
CTddeceans cgtgccttcc tg (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:95( (i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pin zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZlI( cDIAJ (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:95:
cyedAGCAca AacAccTaac c 21
187 013
139 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 96:
( i ) CHARAKTERYSiTYKA SEKWENCJI:
(G) DŁUGOŚĆ: 2499 par zasad (B) TYP: kwas nuklsinswl (C) NCCCOWOŚĆ:psjsdynczα (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:96:
AGGACCGGCG GAAATGTGCG GCTGCGGAGT GTCCTGGCTT CGTATCATGG ATTCATCATG 60
GGTGTGGAGG AGCCTAAGAT CGGCCAGGAG GATGCAGGAG GCGTGGGGCA GAGCGGGGTG 120
CAGTTCGGTG GATATCGACT CGTGGGGGGA GCACCTTGGG AGGGGGTGGC GGACAACCAG 180
ACGGGACGGT GGTATGAAGG CGCAGCTGCC ATCGGTATGT GCCAGACAAT ACCGCGGCAC 240
AGCCGCCTGG AGGACGTGAA CAGGGCATTG GGCCTGACAA TGGAAGCCTC CACCAACGGC 3OC
TTCCGGCGCT GGGCATGGGG CCCGACCCTG TACAGGGGAG GTGGGGAGGA CTCAGACTAA 062
GAGGGTGCCG GCCTCATGCG GGGCGCGCGC TGGGAGlGCA TCCAGACAGT ACCCGACGCC 420
ACGCCAGAGT GTCCAAAGCA ACAGGTGGAC ATCGTCTGAC TGATTGACGG CGCGGGAAGC 442
AGGGACCAAA ATGACTTTAA CCAGATGGAG GGCGGGGTCC GAGCGGTAAG GGGCCAGGTT 042
GAGGGCACGG ACACCCTGGG GGCACTGATG CAGGGCTTAA ACCTCCTGGA GAGCTAATGC 622
ACCGTCACCT GATTCCGGAC CAGCCAGAGA CAGCAGAGCC TGGGGGATCC CATTGGCAAA 882
TGGAGAGGCT TGACGTGCAC GGCCACGGGC AGCCGGACAG TGGTGAAACA GCGAGTTCAT 512
TATAAGTATG GGGACCGAGA AAGGGCCAAG GAGATCTTCA TTGGTAGTAC AGAGGGGAAG 5 0 0
GAGTACAGAG ACCCCCTGGA ATACAGGGAT GTCAGCCCAC AGGCAGAGGA GGCTGGCATC 802
AGCCGCGACG TTATCGGGGG GGGTCACGCT TTCCAGGGAA CTACGGCCAG GAAGGAGCGG SCO
GATACCAGCA GCTAAGCGCT GCCGCAGGAC TACGGGTGCA AGGGGGAAAA AGGGGCAGCC S82
TGGGGCAGTA TCCAGAAGCA GCTGCAGGAG GAGAGCTATG CAGGGGAGGG AATCCAGTCC ΚΚ
AGGGCAAGCA GCTCCTTCCA GCACGAGATG TTTCAAGTAG GCTGCAGCAC AGCTTTCACA 1080
AGGGAGGGCT GCGTCCTGGG GGCGGTGGGG AGTGGGAGCT GGTCGGGAGG TGCCTTCCTG 1l02
TAGCCCCCAG ATATGAGCCT CACCGTTAGC AATATGTCGC AGGAGAAGGT GGACAGGAGG 0122
GTTGCGTATT TGGGGTACGC CACCGGGCGA GTTTGGTGGA AGGGGGTATA GAACTGGGGC
140
187 013
CTGllllCCC CCCGCTAACA GCATAACGGl AAGGCTGTAA TATTAAACAA GGTGTACAGG 1320
AAATllAGGA AGAAGGCAGA AGTAAAAGGl AAGAAGATAG GATAATAATl CGGllCCTCC 5003
CTCTlATCCG TGGATGTGGA CAGCGATGGA AGCACCGAAC TGATAATCAT TGGGGACACC 5553
CATTAATATG AGAAGACCCG AGGGGlCAAl GTGTCAGTGT GTCAATTGCA TAGGGGGAGG 1500
GTGCAlTGGC AGTGTGACGA TGTTCTCCGT GGTGAGAAGG GAAAAACCTl GGGCCGCTTT 5503
GGGGAAGACC TGAAAGTGTT GGGGGATGTG AATGAGGACA AGATGATAGA CGTGGACATT 1620
GGGGAAAAGG GAGAGCAGGA GAACAGGGGT GCTGTATACC TlTTTAACGG AGCCTAAGAA 1680
TCCGlAATCA GCCCCTCCAA CAGCCAGCGl ATTGCCAGCT CCAAGATCTA ACCCAGGATG 1740
CAGTATTTTG GGAAGGCGCl GAGTGGGGGT AAGGAACTCA CAAAGGATGl ACTGATlGAC 1800
CTGlAAlTGG GGGCACGGGl ACAGGTGCTA ATGCTAAGGA GTATGACGGT GATGAAAGTG 1860
GGGGlllCCA TGAGATTCAG CCCTGTGGAG GTGGCAAAGG CTGTlTACAG GTGCTGGGAA 1920
GAGAAlACAA GTGCCATGGA AGCTGGGGAA GCCACCGTAT GTCTAACCAT CCAGAAAAGC 5003
TCAAllGACC AGCTAGGTGA CATCCAAAGA TATGTCAGGT TTGATATGlA ACTGGAAACA O053
GGTClTCTGA CTTCTCGTGA CATTTTCAAT GAAACCAAGA AAACCACTTT GACTCGAAGA 0133
AAAAAAATGG GACTGGGGAl TCACTGTGAA AACATGAAGC TGATTTTGCA AGTGAGGAAT 0503
TTGGllTCTG GGAAGGGGGA GAGAGGAGGA GCCCAAGGCT GGACTGGAGA ACCACAGTTA 2220
TATGATGAGC GAGGTGGGAA GGGTTAGGAT GTTGGGGCTG GAGAGAGGGA AATTAGGGCA OOC Z. z_ o w
GGAGAAACTG GCTCCACGGA TTGGAGGlAG AACTGTCAGG GAAGTGGGGA GTGGATGCAG 0043
TGGAGGAGGA CTTGTGGTGG AGAGTAGAGA GGACAGCAGG TTATTGAAAl ACTGTTATCT 24 00
CTCAllATTG TGTGGAGGAl GTGGTGAGCA AAATCATTCT GCAAATAAAA TTATCACTGG O560
TGAGAGAGCC CATCCCCTCA CCAAAiAAAA TGAGTCCTG 2499
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:97:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3956 piO zisid
(B) TYP: kwis nukleinowy
(C) NICGOEPŚĆ:pojedsnczl
(D) TOPOLOGIA: Uiniowi
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI ^:97:
τττAAcτGΑg cAggcτττgA aatacgatat tggagctgga attaaagagi atgctggaac
187 013
141
CAGACGTGCP CGCCAAGGGA GPCGCGTGAA AGGAGTGAPA GCGGACCCAG GCCPATCACA 020
GrrCCGCGGP AGAGGCCGGG AGGGGGAGGG TTCGGCACGA CCGCCCCGGG GCGGGArcrr 180
GGAAGGGGCG CGCCGGCGGC PGGCCGTGGA GGGGGGAGCC GGGGCGCAGG CGCCCGCCCC 2O0
GGAGCCGPAP CCGGAGGCCC CGGCACCCGG GGGCACCAGG GCAGGPACGC GCAGGGCGGC 2O0
GGAGCGPGAP GCGGrGGGGG AGCACCCCGG GAGGGGGGGr CGGCCAPCCA GACGrrAcrr 060
CGGGAGGAPT GCGCAGCGGC CACCGGCAGG GGCAGGCCAP GCCCGCGGCA CACCCGCCCG O20
. GArrCCGGGA ACAGGGCCGT GGGCCGGACC CGGGCAGCCG CCACCAGCGG CCCCCGGCCC 580
CGGGCCGGGr GCCCGACCCG GCACAGAGGC GGGGGGGAGA ACGCAGACGC APG.GGGGCCC 550
GGCCGCCGGC GrrrcGCGcr CGGGGAGAGC ATCCAGACAG GCCCCGACGC CACGCCAGAG 600
CGCCCACAGC PAGAGAGGGA CAGCGGCGGC CGGAGGGACG GCGCGGGAGG CAGCGACCPA 660
AGGGACGGGA ACCAGAGGPA GGGCGGGGGC CAAGCGGGAP GGGGCCAGGG GGAGGGCACG 000
GACACCCGGG CGGCACCGAT GCPGCACGCP GAPCGCPGGA AGACCCACGG CACCGGCACC 780
CAAGGCCGGA CCAGCCCGAG CCAGCAGAGC CGGGGGGPGC CCAGCGGCCA ACCGAPGGGC 000
CGGACGGGPA CGGCCACGGG CAGCCGGACA GGGGGGACAC AGCCACCCCA GCAGAAGAAG 900
GGrrcccGPP PPAGGGCCAS GGAGAGCCGC PGTGTCAGCA CAGAGGGGCP GPAGGACAPA 960
GACCCCCGGG AGTACAGGGA GGGCAGCCCC CAGGCAGAGA AGGCCrrCAC CACCCGCGAC 0100
GCGAGCGGGG GGGGACACGC CTGCCPGGGA PCCGCTGCAP GGCAGGAGCC GPAGACCACC 0500
AGCGCAGCGC CGCCGCAGGA CCACGCGGGC GAGGTGGACP ACTGGGCAGC CCGCGGCAGC 0 0 50
AGCCAGGPGC AGPGGCAGGA GPPGAGCGAG GCAGGTGAGr GAACCCAGGC CAGGGCAPGC HU
GGCGCCGGPP AGCACGAGAG GTCCCAAGPA GGCGGCAGCA GAGCPCGCAC PACGGACGGC 1260
CGCGGCCGGG GGGCGGGGGG GPGCGGGAGC TGGGCGGGAG GCGCCGGCCG GGATCCCCCA 0o00
AACACGAGCP CCACCGGCAG CPACACGGCG PAGGAGPAGG CGGAPAGGAG GGACCCCCAC 0200
CGGGGGGAPC CCACCGAGCG AGCCCCGTGG PPGGGGGGAC AGAPCCCGGC CCCGGGGGCC OOO0
CCCCGCGAPP AGPAGACCGG GAAGGCGGGC PGCGGCACCC AGGTGCCCAr GCAPCGGAGr 1500
AAGAAGGPCG APG,GCACAG,G GACGCAGAGC GGCGCPTACG CCGGGGCCCC CCGCGGCGCC 0 001
GGGGAGGGGG ACAGCGAGGG CPGCACCGAC PGGGGCCGCP GCGGGGCCCC CCAGCACGAG
GPGCAGAPCP GAGGGrrCPA GGGGGCCGGG TGGPCPTTGC CGAGGGGGAG GGGGCAGGGG 1001
142
187 013
CAGTGSTCGG GTGTSCCCCT STGTGATCAG GGGGCCGCST CGGTTGCTCG 1045
CTTAGCTTTT SGGGTTATGS TACTTCTTAC CAGCTGCTCT ACGCTTCCAT CGTTTGCCCT 0855
GTAGAGGATG CTACGCTTTG SGCCTTCTCC CSGTTTCCCT TCGCCCCATA ATCCGGCATG 0855
AGCCCGTCGC CCCGCCAGCG GCTCTCCATC TCCGAGCCCT CCCCCAGGCT GCCTSCTTCS 1025
GGGCAGTCTC TTAGTGTGGT SCCTTACCCC CCCCCGGACG GACCTCSTGC CCCGGCCGCG 1025
TTTTCGCTTG TCCAGGCTCC CTCCTCCA.TT GGGTTSGGCG 2005
CCTATCSSGA TCCCTTCGGC GTTGGCCCCT GGCGCGCACC TGTGCTTGTC ATATAATCCG 2005
AGTGCGGTTG CATCTTTGTC ΗΤΤ^ΧΌΤΤ CGCCCGACCA TCCCGCCCCT CCCACCGGiAG 2055
CCGCTCTGTT ACATCCCCCT GCCTTTCAGG TSSGCTCCTG CCCTTTACCC .ATGSCTTCTT 2205
ΤΤΑΤ^ΤΤ^ TTCCCCCCAG ACCCCCCCCC TTCCTCGCCG CCCCACCCCT 2025
GTCCSTTGGC TTCACTTCGA CACCCTTCAG τ:ταττττ«:: CCGCTTTCGT TTCTGCCGTT 2005
GTTAGCGGGA TGATTCCGCA GCTCACCCTC TGACTTTT(TC TATCTCGCCT CCGGTGCCCC 2455
CCTACCGSTC TCCGTGCGCC TGCCGTTGGC TGACACTCCC CCSCGACCGC TCCSCSCGCC 2455
TTCTATCCGC AGTTTGTTCC AGiATGGCCTC CGTTCAGGGT CACCCTCAGC 2905
TCGCGATTGG SGCCGCCCCT TACCTTGTGG ATCSCCCTTT CGGTCCCCTT GATSTSTACT 2985
GTTCTTCAGT GAGGTTCGTA SCCCTACGTA AGGGTTGCCC TCCTCCACSA 2640
GACGGGCGTC CTGATCGCAT CCTCCTCCCC ACCATATTGC 0005
GCACTSTCTC CCTTGCCGAC STCTTATGAT GTCCTAA<GAA GCCGCCTCTG CATSTTCCAC 0050
CACCCCASCT TCCATTATGG GCCTACCGTC AGCTTCCTAG SCACCTTCTC TTTGSGCTCC 0200
AAGGGC/GGGC SGGTATACCG GATGGTTATT CGTGCGATCT CCCTCCGCTC TACGCACACT 2850
TGTCCCAGCA GCACGTCCCC GCSCCATCTT GATCTCCCTT STCCGTACTC AGCC/IACACC 2045
ATTCSGCGCC GTCAGTAATC ACGCCCCCCT SACCTCACCC ΤΤΗ^^'Τ CTASGATCAT 0lo5
.CCCAS’TACAG AGGCSTCTCC SCGCTACCGT TTTCCTAACC ATASGTTGCC 0555
ACCAGCCTTC CCTTCTGTTT CCCCGCCCCG CTGCCGGTTG TTGCTGTGTT TGASTSTTSC 312.0
ACGTATTCGG GATCCCCTAT SCTCCCGTGT TSTTCATA<TC TCCCAGCSGG GCCTCATTCT 3180
GACTSGGSTA CCCAGCCTTG CCTCATTCCC CSTCSTTACT TCTCGASTTG TGCGSTGCTT 3240
CAGSSCGTGS GTTACTCCCC GCGCSTCAGC TSGCATGCGG CGGS’GGAS^T CACGCSGCCT 3300
TGGACSGSGC TTTSGGGGST ACATSTCAGC ATCATTTTST TTSCTSTAGS 3360
187 013
143
CTcnCTcnssA TTAAGTTCCA CACATCCCTC TACTCCATGA TTCCAGCACA GCAGaCATTT 3420
ATGACAGCCA ACACCdAdAT aCCGCCAGAA aAACACGAGC CCTACAATGC CATTyCAACC 9750
ATCAcaancA ncTATnccnG aGccccaycA yTnccddcac TCATCACAGC CACACCCTAC 3575
GACCTTGGCC TCTTyAAACG CAACCACAAn GSAATGyTcn AaaACAAncc CCTAGAAACT 3600
CCCACACTCA ncnnccAccA TTCCAGCCnC GTcncycyss ATGTGCCCTC nccyeAATAA 3665
tccactttcc CCCCCACCCC TACAACTCTC aGCCCGACTT CCTTGCAACC ACATACCAAC 9720
TCACATGCSA AAAACCCCCG CACACATCCn AACCCaCCCA AllCAACCCAC CACGTCCTAG 3080
GCACCTTCTC nnAGACACAG ACACCGCyAA TCTTCTTAAA TACCCnCACA CCTTTCCCAC 3840
CASTGACCCA ACCCCCACAG AAGCAGGCAT GCCnCATGAA CATATTCCCA CACGyCCAAC 9900
TATTGTCACA TGASASSAGA ΑΤΤΤΤΤΤΤΑΑ ATSAASSGAA AATATGATTA CCCTAG 9906
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 98:
(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3050 pin znsid (B) TYP: kwis nukleinowy (A) NlClOWOŚĆ:Gojudsac:zn (D) TOPOLOGIA: liniowi (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..3750 (xi) OPIS SEKWENCJI : IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR:95:
ACC ACC CCA CCC AAC GTC CTT CCT CCG AGC CTC ATG GCC TCC TAC CAC 48 tet Thr Phe Cis Thr VaU Leu Lsu Leu Sso Vil Lsu Ali Ssr Cyn His
10 15
GGA TCC ATA CTC CAC GTG CAG CAC ACC AAG ATC TCC CAC CAC CAC GCA 96 aiy PIu Asn Lsu Asp Vil Glu Clu Pro Thr Iis Phe CIn GUu Asp TUn
25 30
GGC CCC CTT CGG CAG AGC GTC GCC CAG TTC GCT CCA CCC CGA CTC GTC 144
CUr Gir P1u Gis CIn Ssr Vil Vnl GUn Phr Giy CUy Srr Arg Leu Vnl
40 45
CTG CGT CCA CCC CTG CAG GTC CTC GCC CCC TAC CAG ACG CCA CGC CCG 192 ane GUr AUa Poo Leu CUu Vnl anl AUn AUn Asn Gin Thr Giy Arg Lsu
55 60

Claims (2)

1. Hybrydoma oznaczona 199 M (numer porządkowy nadany przez ATCC: HB-12058).
2. Monoklonalne przeciwciało wydzielane przez hybrydoma według zastrz. 1.
PL97323195A 1996-02-22 1997-02-24 Podjednostka alfa ludzkiej integryny beta 2 PL187013B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/605,672 US5817515A (en) 1993-12-23 1996-02-22 Human B2 integrin alpha subunit antibodies
PCT/US1997/002713 WO1997031099A1 (en) 1996-02-22 1997-02-24 Human beta 2 integrin alpha subunit

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323195A1 PL323195A1 (en) 1998-03-16
PL187013B1 true PL187013B1 (pl) 2004-04-30

Family

ID=24424704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97323195A PL187013B1 (pl) 1996-02-22 1997-02-24 Podjednostka alfa ludzkiej integryny beta 2

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5817515A (pl)
EP (1) EP0835301B1 (pl)
JP (1) JP2001526524A (pl)
CN (1) CN1103812C (pl)
AT (1) ATE293685T1 (pl)
AU (1) AU723110B2 (pl)
BR (1) BR9702101A (pl)
CA (1) CA2218755C (pl)
CZ (1) CZ287921B6 (pl)
DE (1) DE69733051D1 (pl)
FI (1) FI974018A (pl)
HU (1) HU223977B1 (pl)
IL (1) IL122011A (pl)
NO (1) NO318764B1 (pl)
PL (1) PL187013B1 (pl)
RU (1) RU2183671C2 (pl)
SK (1) SK283135B6 (pl)
WO (1) WO1997031099A1 (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837478A (en) * 1993-12-23 1998-11-17 Icos Corporation Method of identifying modulators of binding between and VCAM-1
US6620915B2 (en) * 1993-12-23 2003-09-16 Icos Corporation Monoclonal antibodies specific for integrin α-d subunit
US20030055231A1 (en) * 1998-10-28 2003-03-20 Jian Ni 12 human secreted proteins
EP1267926A2 (en) 2000-03-17 2003-01-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting stenosis and restenosis with a mixture of antibodies anti cd18 and anti ccr2
WO2023235971A1 (en) * 2022-06-08 2023-12-14 The Regents Of The University Of California Antibodies and immunotherapies that target the active conformation of integrin beta 2

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4271139A (en) * 1978-03-27 1981-06-02 Hiram Hart Scintillation proximity assay
US4568649A (en) * 1983-02-22 1986-02-04 Immunex Corporation Immediate ligand detection assay
WO1992006697A1 (en) * 1990-10-23 1992-04-30 Repligen Corporation Anti-inflammatory composition
JPH07502727A (ja) * 1991-10-01 1995-03-23 ザ・ジエネラル・ホスピタル・コーポレーシヨン 接着分子に対する抗体を用いた同種移植片拒絶の防止
JP3679112B2 (ja) * 1991-10-04 2005-08-03 アメリカ合衆国 細胞接着分子の遮断による眼の炎症の治療
US5470953A (en) * 1993-12-23 1995-11-28 Icos Corporation Human β2 integrin α subunit
EP0757697A4 (en) * 1994-04-12 2000-05-17 Boehringer Ingelheim Pharma USE OF AGENTS INHIBITING INTERCELLULAR INTERACTION IN THE TREATMENT OF VIRAL BREATH INFECTION

Also Published As

Publication number Publication date
NO974852D0 (no) 1997-10-21
JP2001526524A (ja) 2001-12-18
HU223977B1 (hu) 2005-03-29
SK283135B6 (sk) 2003-03-04
WO1997031099A1 (en) 1997-08-28
US5817515A (en) 1998-10-06
HUP9901579A3 (en) 2001-10-29
SK140997A3 (en) 1998-09-09
CN1189851A (zh) 1998-08-05
CA2218755A1 (en) 1997-08-28
EP0835301A1 (en) 1998-04-15
PL323195A1 (en) 1998-03-16
AU723110B2 (en) 2000-08-17
EP0835301B1 (en) 2005-04-20
ATE293685T1 (de) 2005-05-15
BR9702101A (pt) 1999-07-20
NO974852L (no) 1997-12-19
AU2133397A (en) 1997-09-10
NO318764B1 (no) 2005-05-02
CA2218755C (en) 1999-08-31
FI974018A (fi) 1997-12-03
HUP9901579A2 (hu) 1999-08-30
FI974018A0 (fi) 1997-10-21
IL122011A0 (en) 1998-03-10
IL122011A (en) 2001-05-20
DE69733051D1 (de) 2005-05-25
CZ328697A3 (cs) 1998-07-15
CN1103812C (zh) 2003-03-26
RU2183671C2 (ru) 2002-06-20
CZ287921B6 (cs) 2001-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2001296839B2 (en) Use of anti-human integrin alpha D antibodies to treat spinal cord injury
JP3261383B2 (ja) 新規ヒトβ２インテグリンアルファサブユニット
US5837478A (en) Method of identifying modulators of binding between and VCAM-1
AU2001296839A1 (en) Use of anti-human integrin alpha D antibodies to treat spinal cord injury
US20060280739A1 (en) Novel human beta-2 integrin alpha subunit
ES2313799T3 (es) Anticuerpo monoclonal anti alfa-d(itgad) para su uso en el tratamiento de lesiones del snc causadas por traumatismo.
PL187013B1 (pl) Podjednostka alfa ludzkiej integryny beta 2
US5728533A (en) Human β2 integrin αsubunit
US5831029A (en) Human β2 integrin α subunit
Gallatin et al. Human beta2 integrin alpha subunit
EP2182008A2 (en) Monoclonal anti alpha-D (ITGAD) antibodies for use in the treatment of inflammation

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090224