CZ328697A3 - Alfa-podjednotka beta-2-integrinu člověka - Google Patents
Alfa-podjednotka beta-2-integrinu člověka Download PDFInfo
- Publication number
- CZ328697A3 CZ328697A3 CZ973286A CZ328697A CZ328697A3 CZ 328697 A3 CZ328697 A3 CZ 328697A3 CZ 973286 A CZ973286 A CZ 973286A CZ 328697 A CZ328697 A CZ 328697A CZ 328697 A3 CZ328697 A3 CZ 328697A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ooo
- cells
- zzz
- human
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 title 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 29
- CBGUOGMQLZIXBE-XGQKBEPLSA-N clobetasol propionate Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CCl)(OC(=O)CC)[C@@]1(C)C[C@@H]2O CBGUOGMQLZIXBE-XGQKBEPLSA-N 0.000 claims 2
- 229940112877 olux Drugs 0.000 claims 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims 1
- 125000001874 trioxidanyl group Chemical group [*]OOO[H] 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 199
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 197
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 194
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 142
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 115
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 95
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 abstract description 75
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 abstract description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 45
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 40
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 23
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 13
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 abstract 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 280
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 183
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 178
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 108
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 101
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 97
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 97
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 78
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 75
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 75
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 72
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 72
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 72
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 71
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 64
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 63
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 63
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 62
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 59
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 57
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 54
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 52
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 51
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 44
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 43
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 42
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 42
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 40
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 37
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 37
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 37
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 36
- 101000599862 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 35
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 34
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 32
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 32
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 31
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 31
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 31
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 30
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 28
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 25
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 25
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 24
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 22
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 21
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 20
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 19
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 19
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 19
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 18
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 15
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 15
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 14
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 14
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 14
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 12
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 12
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 12
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 12
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 11
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 11
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 10
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 10
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 9
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 101100019412 Homo sapiens ITGB2 gene Proteins 0.000 description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 8
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- -1 designated CD11a Proteins 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 8
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 7
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 6
- 102220469872 Protein argonaute-3_E37A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 6
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 5
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 5
- OXZOLXJZTSUDOM-UHFFFAOYSA-N fluoro 2,2,2-trifluoroacetate Chemical compound FOC(=O)C(F)(F)F OXZOLXJZTSUDOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000497 foam cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 5
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 5
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 5
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KEUNWIXNKVWCFL-FXQIFTODSA-N Asn-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KEUNWIXNKVWCFL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N Asp-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 4
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 4
- KVRKAGGMEWNURO-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KVRKAGGMEWNURO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 4
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 4
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 4
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 3
- JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- 201000001779 Leukocyte adhesion deficiency Diseases 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N Phe-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 108050007496 Shikimate kinase 2 Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 3
- OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N Tyr-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 3
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 3
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 3
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 3
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitrogen oxide Inorganic materials O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 241000585703 Adelphia <angiosperm> Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N Ala-Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N Arg-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- UBCPNBUIQNMDNH-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UBCPNBUIQNMDNH-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QMQZYILAWUOLPV-JYJNAYRXSA-N Arg-Tyr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QMQZYILAWUOLPV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- JZRLLSOWDYUKOK-SRVKXCTJSA-N Asn-Asp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JZRLLSOWDYUKOK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N Asn-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N Asp-Leu-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- YTXCCDCOHIYQFC-GUBZILKMSA-N Asp-Met-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O YTXCCDCOHIYQFC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 2
- 241000699679 Cricetulus migratorius Species 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N Cys-Asp Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SRZZZTMJARUVPI-JBDRJPRFSA-N Cys-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N SRZZZTMJARUVPI-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004860 Dipeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090001081 Dipeptidases Proteins 0.000 description 2
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 2
- 206010014824 Endotoxic shock Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FLLRAEJOLZPSMN-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FLLRAEJOLZPSMN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- ZWMYUDZLXAQHCK-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZWMYUDZLXAQHCK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- QLQDIJBYJZKQPR-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN QLQDIJBYJZKQPR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 2
- ZYDYEPDFFVCUBI-SRVKXCTJSA-N His-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N ZYDYEPDFFVCUBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- JSQIXEHORHLQEE-MEYUZBJRSA-N His-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JSQIXEHORHLQEE-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MDOBWSFNSNPENN-PMVVWTBXSA-N His-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O MDOBWSFNSNPENN-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- CWJQMCPYXNVMBS-STECZYCISA-N Ile-Arg-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N CWJQMCPYXNVMBS-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- USXAYNCLFSUSBA-MGHWNKPDSA-N Ile-Phe-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N USXAYNCLFSUSBA-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 2
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 2
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N Leu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N Leu-Phe-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N Lys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N Lys-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- 241000252067 Megalops atlanticus Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N Met-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- UROWNMBTQGGTHB-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UROWNMBTQGGTHB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- LBNFTWKGISQVEE-AVGNSLFASA-N Met-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC LBNFTWKGISQVEE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100341513 Mus musculus Itgam gene Proteins 0.000 description 2
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- ZWJKVFAYPLPCQB-UNQGMJICSA-N Phe-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(O)=O ZWJKVFAYPLPCQB-UNQGMJICSA-N 0.000 description 2
- FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N Phe-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 101100235354 Pseudomonas putida (strain ATCC 47054 / DSM 6125 / CFBP 8728 / NCIMB 11950 / KT2440) lexA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- DSSOYPJWSWFOLK-CIUDSAMLSA-N Ser-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DSSOYPJWSWFOLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CAOYHZOWXFFAIR-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CAOYHZOWXFFAIR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N Ser-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N Ser-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PLQWGQUNUPMNOD-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PLQWGQUNUPMNOD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=C(O)C=C1 HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 2
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N Thr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 2
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N Thr-Leu-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 2
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N Thr-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- HSQXHRIRJSFDOH-URLPEUOOSA-N Thr-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HSQXHRIRJSFDOH-URLPEUOOSA-N 0.000 description 2
- PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- MVHHTXAUJCIOMZ-WDSOQIARSA-N Trp-Arg-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N MVHHTXAUJCIOMZ-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- HQJOVVWAPQPYDS-ZFWWWQNUSA-N Trp-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQJOVVWAPQPYDS-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- SEFNTZYRPGBDCY-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O SEFNTZYRPGBDCY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- DKKHULUSOSWGHS-UWJYBYFXSA-N Tyr-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N DKKHULUSOSWGHS-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N Tyr-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- XFEMMSGONWQACR-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O XFEMMSGONWQACR-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 2
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 230000023404 leukocyte cell-cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 101150047523 lexA gene Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 2
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108700004896 tripeptide FEG Proteins 0.000 description 2
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXUVTXPOZRFMOY-NSHDSACASA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HXUVTXPOZRFMOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 4-(4-diazonio-3-methoxyphenyl)-2-methoxybenzenediazonium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C([N+]#N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C([N+]#N)=CC=2)=C1 LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- DLQPMEMYCIGJIM-UHFFFAOYSA-N Adjuvant peptide Natural products CC(NC(=O)CCOC1C(O)C(CO)OC(O)C1NC(=O)C)C(=O)NC(CCC(=O)O)C(=O)N DLQPMEMYCIGJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Lys Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N Ala-Glu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- UWIQWPWWZUHBAO-ZLIFDBKOSA-N Ala-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 UWIQWPWWZUHBAO-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- RNHKOQHGYMTHFR-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 RNHKOQHGYMTHFR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- KTXKIYXZQFWJKB-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KTXKIYXZQFWJKB-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- 101100161471 Arabidopsis thaliana ABCB24 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459319 Arabidopsis thaliana VIII-2 gene Proteins 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JVMKBJNSRZWDBO-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JVMKBJNSRZWDBO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N Arg-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PPPXVIBMLFWNSK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N PPPXVIBMLFWNSK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ITHMWNNUDPJJER-ULQDDVLXSA-N Arg-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ITHMWNNUDPJJER-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- ZDBWKBCKYJGKGP-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZDBWKBCKYJGKGP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NYDIVDKTULRINZ-AVGNSLFASA-N Arg-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NYDIVDKTULRINZ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- NVPHRWNWTKYIST-BPNCWPANSA-N Arg-Tyr-Ala Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NVPHRWNWTKYIST-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ORXCYAFUCSTQGY-FXQIFTODSA-N Asn-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ORXCYAFUCSTQGY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DAPLJWATMAXPPZ-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DAPLJWATMAXPPZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- FFMIYIMKQIMDPK-BQBZGAKWSA-N Asn-His Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 FFMIYIMKQIMDPK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IQTUDDBANZYMAR-WDSKDSINSA-N Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O IQTUDDBANZYMAR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N Asn-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N Asn-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N Asn-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N Asp-Ala-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- HOQGTAIGQSDCHR-SRVKXCTJSA-N Asp-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HOQGTAIGQSDCHR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KHBLRHKVXICFMY-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Lys Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O KHBLRHKVXICFMY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KTTCQQNRRLCIBC-GHCJXIJMSA-N Asp-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KTTCQQNRRLCIBC-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N Asp-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N Asp-Leu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- RPUYTJJZXQBWDT-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RPUYTJJZXQBWDT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N Asp-Thr-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241001429175 Colitis phage Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000014997 Crohn colitis Diseases 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- VNLYIYOYUNGURO-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VNLYIYOYUNGURO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XRTISHJEPHMBJG-SRVKXCTJSA-N Cys-Asp-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XRTISHJEPHMBJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N Cys-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BDWIZLQVVWQMTB-XKBZYTNZSA-N Cys-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O BDWIZLQVVWQMTB-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- XZKJEOMFLDVXJG-KATARQTJSA-N Cys-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)N)O XZKJEOMFLDVXJG-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- RESAHOSBQHMOKH-KKUMJFAQSA-N Cys-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CS)N RESAHOSBQHMOKH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102220522384 EZH inhibitory protein_I88F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N Glu-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- OJGLIOXAKGFFDW-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N OJGLIOXAKGFFDW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AKJRHDMTEJXTPV-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AKJRHDMTEJXTPV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GLWXKFRTOHKGIT-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GLWXKFRTOHKGIT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- WATXSTJXNBOHKD-LAEOZQHASA-N Glu-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WATXSTJXNBOHKD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ZCOJVESMNGBGLF-GRLWGSQLSA-N Glu-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZCOJVESMNGBGLF-GRLWGSQLSA-N 0.000 description 1
- PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- VXEFAWJTFAUDJK-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O VXEFAWJTFAUDJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FIQQRCFQXGLOSZ-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FIQQRCFQXGLOSZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DENRBIYENOKSEX-PEXQALLHSA-N Gly-Ile-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 DENRBIYENOKSEX-PEXQALLHSA-N 0.000 description 1
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- MTBIKIMYHUWBRX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN MTBIKIMYHUWBRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010017480 Hemosiderin Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N His-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N His-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WGVPDSNCHDEDBP-KKUMJFAQSA-N His-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WGVPDSNCHDEDBP-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CYHWWHKRCKHYGQ-GUBZILKMSA-N His-Cys-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N CYHWWHKRCKHYGQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N His-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- JENKOCSDMSVWPY-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JENKOCSDMSVWPY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HIJIJPFILYPTFR-ACRUOGEOSA-N His-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HIJIJPFILYPTFR-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599858 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N Ile-Arg-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- YOTNPRLPIPHQSB-XUXIUFHCSA-N Ile-Arg-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YOTNPRLPIPHQSB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- ZZHGKECPZXPXJF-PCBIJLKTSA-N Ile-Asn-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZZHGKECPZXPXJF-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- NZOCIWKZUVUNDW-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NZOCIWKZUVUNDW-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N Ile-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N Ile-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- FJWALBCCVIHZBS-QXEWZRGKSA-N Ile-Met-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)O)N FJWALBCCVIHZBS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- OTSVBELRDMSPKY-PCBIJLKTSA-N Ile-Phe-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N OTSVBELRDMSPKY-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- AGGIYSLVUKVOPT-HTFCKZLJSA-N Ile-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N AGGIYSLVUKVOPT-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- SAEWJTCJQVZQNZ-IUKAMOBKSA-N Ile-Thr-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N SAEWJTCJQVZQNZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N Ile-Thr-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010017642 Integrin alpha2beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N Leu-Asn-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LJKJVTCIRDCITR-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N LJKJVTCIRDCITR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- XQXGNBFMAXWIGI-MXAVVETBSA-N Leu-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 XQXGNBFMAXWIGI-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N Leu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N Leu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ZGGVHTQAPHVMKM-IHPCNDPISA-N Leu-Trp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZGGVHTQAPHVMKM-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DGAAQRAUOFHBFJ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DGAAQRAUOFHBFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- YWJQHDDBFAXNIR-MXAVVETBSA-N Lys-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YWJQHDDBFAXNIR-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- ZXFRGTAIIZHNHG-AJNGGQMLSA-N Lys-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ZXFRGTAIIZHNHG-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- XBZOQGHZGQLEQO-IUCAKERBSA-N Lys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XBZOQGHZGQLEQO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- MSSJJDVQTFTLIF-KBPBESRZSA-N Lys-Phe-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(O)=O MSSJJDVQTFTLIF-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- WINFHLHJTRGLCV-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WINFHLHJTRGLCV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- QEVRUYFHWJJUHZ-DCAQKATOSA-N Met-Ala-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QEVRUYFHWJJUHZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DLAFCQWUMFMZSN-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CCCN=C(N)N DLAFCQWUMFMZSN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OBVHKUFUDCPZDW-JYJNAYRXSA-N Met-Arg-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OBVHKUFUDCPZDW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UYAKZHGIPRCGPF-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N UYAKZHGIPRCGPF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RAAVFTFEAUAVIY-DCAQKATOSA-N Met-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N RAAVFTFEAUAVIY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WPTHAGXMYDRPFD-SRVKXCTJSA-N Met-Lys-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WPTHAGXMYDRPFD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N Met-Lys-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- YMORXCKTSSGYIG-IHRRRGAJSA-N Phe-Arg-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YMORXCKTSSGYIG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LGBVMDMZZFYSFW-HJWJTTGWSA-N Phe-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N LGBVMDMZZFYSFW-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- AWAYOWOUGVZXOB-BZSNNMDCSA-N Phe-Asn-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AWAYOWOUGVZXOB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N Phe-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- KNYPNEYICHHLQL-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KNYPNEYICHHLQL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZUQACJLOHYRVPJ-DKIMLUQUSA-N Phe-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ZUQACJLOHYRVPJ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N Phe-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- BPIMVBKDLSBKIJ-FCLVOEFKSA-N Phe-Thr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BPIMVBKDLSBKIJ-FCLVOEFKSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N Ser-Arg-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N Ser-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WTPKKLMBNBCCNL-ACZMJKKPSA-N Ser-Cys-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N WTPKKLMBNBCCNL-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PVDTYLHUWAEYGY-CIUDSAMLSA-N Ser-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PVDTYLHUWAEYGY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UOLGINIHBRIECN-FXQIFTODSA-N Ser-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UOLGINIHBRIECN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N Ser-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N Ser-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KQNDIKOYWZTZIX-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KQNDIKOYWZTZIX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WUXCHQZLUHBSDJ-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WUXCHQZLUHBSDJ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- KKKVOZNCLALMPV-XKBZYTNZSA-N Ser-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KKKVOZNCLALMPV-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- TZKPNGDGUVREEB-FOHZUACHSA-N Thr-Asn-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O TZKPNGDGUVREEB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- LHEZGZQRLDBSRR-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LHEZGZQRLDBSRR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- UYTYTDMCDBPDSC-URLPEUOOSA-N Thr-Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N UYTYTDMCDBPDSC-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N Thr-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KKPOGALELPLJTL-MEYUZBJRSA-N Thr-Lys-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKPOGALELPLJTL-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N Thr-Met-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- RNFZZCMCRDFNAE-WFBYXXMGSA-N Trp-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RNFZZCMCRDFNAE-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- HGEHWFGAKHSIDY-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O HGEHWFGAKHSIDY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- HSBZWINKRYZCSQ-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HSBZWINKRYZCSQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N Tyr-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JQOMHZMWQHXALX-FHWLQOOXSA-N Tyr-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JQOMHZMWQHXALX-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- XTEOJPUYZWEXFI-UHFFFAOYSA-N butyl n-[3-[4-(imidazol-1-ylmethyl)phenyl]-5-(2-methylpropyl)thiophen-2-yl]sulfonylcarbamate Chemical compound S1C(CC(C)C)=CC(C=2C=CC(CN3C=NC=C3)=CC=2)=C1S(=O)(=O)NC(=O)OCCCC XTEOJPUYZWEXFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000011509 clonal analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007120 differential activation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 210000004921 distal colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010002108 glycopeptide gp432 Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 201000007192 granulomatous hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 150000004680 hydrogen peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002621 immunoprecipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 102000017776 integrin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108060004057 integrin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108010045397 lysyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108010063431 methionyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 230000009854 mucosal lesion Effects 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-QAQREVAFSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-QAQREVAFSA-N 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000024121 nodulation Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N phenyl n-[4-[4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl]phenyl]carbamate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1CCN(C=2C=CC(NC(=O)OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)CC1 NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DREOJRVDBCALEG-MJKYAOJXSA-M sodium;1-[5-[(3as,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCC1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 DREOJRVDBCALEG-MJKYAOJXSA-M 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012301 transgenic model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 108010000998 wheylin-2 peptide Proteins 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/70553—Integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález popisuje klonování a expresi polynukleotidů kódujících novou a podjednotku lidského integrinu β2, označovanou jako ad, která je strukturně podobná známým a podjednotkám lidského integrinu β2, označovaným CDlla, CDllb a CDllc. Vynález se rovněž týká polynukleotidů, které vykazují homologii k sekvenci kódující lidský ad, izolovaných z jiných živočišných druhů.
Dosavadní stav techniky
Integriny jsou třídou molekul asociovaných s membránou, které se aktivně účastní procesu buněčné adheze. Integriny jsou transmembránové heterodimery skládající se z podjednotky a, která je nekovalentně asociována s podjednotkou β. V současné době je známo přinejmenším čtrnáct podjednotek a a osm podjednotek β [shrnuto v Springer, Nátuře 346:425 až 434 (1990)]. Podjednotky β jsou obvykle schopny asociace s více něž jednou podjednotkou a a heterodimery sdílející společnou podjednotku β vytvářejí v populaci integrinů jednotlivé podtřídy.
Jedna podtřída lidských integrinů, která je exprimována pouze na povrchu bílých krvinek, je charakterizována přítomností společné podjednotky β2. Výsledkem této buněčně specifické exprese je skutečnost, že tyto integriny jsou obvykle označovány jako leukocytární integriny, Leu-CAM nebo leukointegriny. Vzhledem k přítomnosti společné podjednotky β2, je jinou alternativou označovat tyto integriny • ·
• · ···· · jako integriny β2. Podjednotka β2 (CD18) byla již dříve izolována ve spojení s jednou ze tří rozdílných podjednotek a, označovaných CDlla, CDllb a CDllc. Izolace cDNA kódující lidský CD18 je popsána v publikaci Kishimoto a další, Cell 48:681 až 690 (1987). Podle oficiální nomenklatury WHO (Světová zdravotnická organizace) jsou tyto heterodimerní proteiny označovány jako CDlla/CDl8, CDllb/CD18 a
CDllc/CD18; v obecně používané nomenklatuře jsou tyto označovány jako LFA-1 (CDlla/CD18), Mac-1 nebo Mol (CDllb/CD18) a pl5095 nebo LeuM5 (CDllc/CD18) [Cobbold a další, v Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, strana 788 (1987)]. Bylo prokázáno, že a podjednotky CDlla, CDllb a CDllc lidského integrinu β2 migrují při elektroforéze prováděné v redukujících podmínkách se zdánlivými molekulovými hmotnostmi přibližně 180 kD (CDlla), 155 kD (CDllb) a 150 kD (CDllc). DNA kódující tyto podjednotky již byly klonovány [CDlla, Larson a další, J. Cell Biol. 108:703 až 712 (1989); CDllb, Corbi a další, J. Biol. Chem. 263:12403 až 12411 (1988) a CDllc, Corbi a další, EMBO J. 6:4023 až 4028 (1987)]. Domnělé homology a a β řetězců lidského integrinu β2, definované podle přibližné podobnosti molekulových hmotností, byly pomocí nejrůznějšleh metod identifikovány u jiných živočišných druhů, včetně opic a primátů [Letvin a další, Blood 61:408 až 410 (1983)], myší [Sanchez-Madrid a další, J. Exp. Med.154:1517 (1981)] a psů [Moore a další, Tissue Antigens 36:211 až 220 (1990)].
Ukázalo se, že absolutní molekulové hmotnosti předpokládaných homolog a a β řetězců lidského integrinu β2, získaných z jiných živočišných druhů, se podstatně liší [viz. například Danilenko a další, Tissue Antigens 40:13 až 21 (1992)], a vzhledem k absenci informací týkajících se sekvence těchto homolog není možné s určitostí definovat vztah mezi podjednotkami lidského integrinu a podjednotkami identifikovanými u jiných druhů. Mezi různými druhy byly navíc pozorovány rozdíly v počtu zástupců u jednotlivých rodin proteinů. Uvažme například, že z králíků bylo izolováno více izotypů IgA než jich existuje u lidí [Burnett a další, EMBO J. 8:4041 až 4047 (1989) a Schneiderman a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:7561 až 7565 (1989)]. Obdobně, u lidí bylo dosud identifikováno přinejmenším šest variant metalothioneinů [Karin a Richards, Nátuře 299:797 až 802 (1982) a Varshney a další, Mol. Cell. Biol. 6:26 až 37, (1986)], zatímco u myší existují důkazy o přítomnosti pouze dvou takových variant [Searle a další, Mol. Cell. Biol. 4:1221 až 1230 (1984)]. Z existence více zástupců nějaké rodiny proteinů u jednoho druhu se tudíž nedá jednoznačně odvodit, že by odpovídající zástupci rodiny proteinů museli existovat i u jiných druhů.
Co se týká integrinů β2, bylo u psů pozorováno, že předpokládaný psí protějšek (β2) lidského CD18 je schopen vytvářet dimery až se čtyřmi rozdílnými podjednotkami a [Danilenko a další, viz. výše]. Výsledkem imunizace myší pomocí splenocytů získaných z organizmu psů bylo vytvoření monoklonálních protilátek, které imunoprecipitovaly s proteiny experimentálně označenými jako psí homologa k lidským CD18, CDlla, CDllb a CDllc; tato homologie byla především založena na zjištění podobných, ale ne identických, molekulových hmotností. Další protilátka namířená proti splenocytům získaným z organizmu psů, označená Call.8H2, rozpoznávala a imunoprecipitovala se čtvrtou podjednotkou (psí) podobnou podjednotce a. Tato čtvrtá psí podjednotka je rovněž schopna asociace s podjednotkou β2, ale má jedinečnou molekulovou hmotnost a je exprimována pouze na subpopulaci diferencovaných tkáňových makrofágů.
Výsledkem imunizace křečků pomocí dendritických buněk získaných z organizmu myší bylo vytvoření dvou monoklonálních protilátek namířených proti integrinům [Metlay a další, J. Exp. Med. 171:1753 až 1771 (1990)]. Jedna z těchto · · · · · • · · ·· ·» protilátek, označená 2E6, imunoprecipitovala převážně s heterodimerem tvořeným podjednotkami o zdánlivých molekulových hmotnostech 180 kD a 90 kD, a v menši míře pak s proteiny o zdánlivých molekulových hmotnostech v rozmez! 150 až 160 kD. Druhá z těchto protilátek, označená N418, imunoprecipitovala s dalším zdánlivým heterodimerem tvořeným podjednotkami o zdánlivých molekulových hmotnostech 150 kD a 90 kD. Z výsledků studii, při kterých byla blokována buněčná adheze, bylo usouzeno, že protilátka 2E6 rozpoznává myši protějšek lidského CD18, zatímco molekulová hmotnost zjištěná u antigenu N418 naznačovala, že se jedná o myši homolog lidského CDllc/CDl8, další analýzy ukazuji, že tento myši antigen vykazuje distribuci ve tkáních, která neodpovídá distribuci pozorované u lidského CDllc/CD18.
Antigeny rozpoznávané prostřednictvím psí protilátky Call.8H2 a myší protilátky N418 mohou reprezentovat různé varianty (například s různým stupněm glykosylace nebo produkty různě sestřižených mRNA) již dříve identifikované psí nebo myší podjednotky a. Jinou možností je, že tyto antigeny mohou reprezentovat unikátní podjednotky α psích nebo myších integrinů. V momentě, kdy nejsou dostupné informace týkající se primární struktury, není možné tyto dvě alternativy odlišit.
U lidí je heterodimer CDlla/CDl8 exprimován na povrchu všech lymfocytů. Heterodimery CDllb/CD18 a CDllc/CD18 jsou v podstatě exprimovány pouze na povrchu monocytů, granulocytů, makrofágů a NK buněk (natural killer cells), nicméně CDllc/CDl8 byl rovněž detekován u některých typů Bbuněk. Obecně je možné říci, že CDlla/CD18 převažuje u lymfocytů, CDllb/CD18 u granulocytů a CDllc/CD18 na povrchu makrofágů [viz. souhrnný článek, Arnaout, Blood 75:1037 až 1050 (1990)]. Exprese řetězců α se nicméně různí v závislosti na stupni aktivace a diferenciace jednotlivých typů • · · φ • · • · · · • · · · · · « ···· · • · · · · · ··· <··· φ ·· ·· φφ *· buněk [viz. souhrnný článek, Larson a Springer, Immunol.
Rev. 114:181 až 217 (1990)].
Za použiti protilátek, které jsou schopny blokovat buněčnou adhezi zprostředkovanou pomoci integrinů β2, bylo prokázáno, že tyto integriny β2 se v organizmu člověka účastni imunitní a zánětlivé reakce. Například heterodimery CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18 se aktivně účastní vazby NK buněk na buňky lymfomu a adenokarcinomu [Patarroyo a další, Immunol. Rev. 114:67 až 108 (1990)], akumulace granulocytů [Nourshargh a další, J. Immunol. 142:3193 až 3198 (1989)], úniku plazmy nezávislému na činnosti granulocytů [Arfors a další, Blood 69:338 až 340 (1987)], chemotaktické odpovědi stimulovaných leukocytů [Arfors a další, viz. výše] a adheze leukocytů k vaskulárnímu endothelu [Price a další, J. Immunol. 139:4174 až 4177 (1987) a Smith a další,
J. Clin. Invest. 83:2008 až 2017 (1989)]. Hlavní role integrinů β2 při imunitních a zánětlivých reakcích je zřejmá z klinického syndromu označovaného jako nedostatečnost adheze leukocytů (LAD - leukocyte adhesion deficiency), mezi jehož klinické projevy patří neustále se opakující bakteriální infekce často ohrožující život. LAD je zapříčiněna různorodými mutacemi v podjednotce β2 [Kishimoto a další, Cell 50:193 až 202 (1987)] a závažnost onemocnění koreluje se stupněm deficience v expresi podjednotky β2. Vytvoření kompletního heterodimeru integrinů je mutací v podjednotce β2 znesnadněno [Kishimoto a další, Cell 50:193 až 202 (1987)].
Je zajímavé, že přinejmenším u jedné protilátky specificky namířené proti CD18 bylo prokázáno, že in vitro inhibuje tvorbu syncytií způsobenou virem lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1), ačkoliv přesný mechamizmus této inhibice je nejasný [Hildreth a Orentas, Science 244:1075 až 1078 (1989)]. Toto pozorování je v souladu s objevem, že hlavní receptor pro CDlla/CD18, kterým je ICAM-I, je rovněž • · • · · · a · • ·
povrchovým receptorem pro velkou skupinu rhinovirů [Greve a další, Cell 56:839 (1989)].
Význam vazebné aktivity integrinu β2 při imunitní a zánětlivé reakci u lidí podtrhuje nezbytnost dosažení dokonalejšího poznání této třídy povrchových proteinů. Identifikace dosud neznámých členů této subpopulace, jakož i jejich odpovídajících receptorů, a produkce monoklonálních protilátek nebo jiných rozpustných látek, které mohou pozměnit biologickou aktivitu integrinů β2, poskytnou prostředky (využitelné v praxi) pro terapeutickou intervenci při imunitních a zánětlivých odpovědích svázaných s integriny β2.
Podstata vynálezu
Jedna stránka vynálezu popisuje nově purifikované a izolované polynukleotidy (například DNA a RNA transkripty, jak kódující tak antikódující vlákna) kódující novou a podjednotku lidského integrinu β2, označovanou ad, a její varianty (například deleční, adiční nebo substituční analoga), které mají vazebné a/nebo imunologické vlastnosti vlastní podjednotce ad. Ve výhodném provedení vynálezu patří mezi tyto molekuly DNA, genomová DNA, cDNA a úplně nebo částečně syntetizované molekuly DNA. V současné době se jako nejvýhodnější polynukleotid jeví molekula DNA, jak je zobrazená v SEK. ID. Č.: 1, kódující polypeptid o sekvenci SEK. ID. Č.: 2. Vynález rovněž popisuje konstrukci rekombinatních plazmidových a virových konstruktů DNA (expresivní konstrukty), které obsahují kódující sekvenci pro ad, přičemž tato sekvence kódující ad je funkčně připojena k homolognímu nebo heterolognímu regulačnímu prvku/prvkům transkripce .
Vynález rovněž popisuje polynukleotidy izolované z myší a laboratorních potkanů, které vykazují homologií k polynukleotidům kódujícím lidský ad. Ve výhodném provedení se • · jedná o polynukleotid získaný z myší, zobrazený v SEK. ID. Č.: 52; a o polynukleotid získaný z laboratorních potkanů zobrazený v SEK. ID. Č.: 54.
Jiná stránka vynálezu se týká prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných sekvencemi DNA podle vynálezu, které na svém povrchu exprimují polypeptid ocd nebo nějaké jeho varianty. Hostitelské buňky podle vynálezu jsou zvláště užitečné pro produkci velkých množství polypeptidů ad, který může být izolován buď ze samotné hostitelské buňky nebo z média, v němž jsou tyto buňky kultivovány. Hostitelské buňky exprimuj ící polypeptid ad na extracelulární straně membrány mohou být rovněž použity jako imunogeny při produkci protilátek specificky namířených proti ad. Ve výhodném provedení vynálezu budou hostitelské buňky transfekované DNA kódující ad kotransfekovány DNA kódující podjednotku β2, aby byla na jejich povrchu umožněna exprese tohoto heterodimeru.
Vynález se rovněž týká purifikovaných a izolovaných polypeptidů, jejich fragmentů a různých variant. Ve výhodném provedení vynálezu jsou polypeptidy ad polypeptidy o sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č.: 2. Nové produkty ad podle vynálezu mohou být izolovány z přirozených zdrojů, ale ve výhodném provedení jsou, spolu s produkty různých variant <xd, produkovány s využitím rekombinatních postupů, ve kterých jsou využity hostitelské buňky podle vynálezu. Za použití různých hostitelských buněk a/nebo specifickým zpracováním po izolaci, mohou být připraveny úplně glykosylované, částečně glykosylované a úplně deglykosylované formy polypeptidů ad. Mezi varianty polypeptidů ad podle vynálezu patří ve vodě rozpustné a ve vodě nerozpustné polypeptidy ad, včetně jejich analog, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin odstraněno nebo nahrazeno: (1) beze ztráty, a ve výhodném provedení, s posílením jedné nebo více biolo7
9 99
gických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro ad; nebo (2) za specifického zablokováni určitého druhu vazby ligand/receptor nebo za zablokování signalizační funkce. Vynález rovněž popisuje fúzní polypeptidy, ve kterých jsou aminokyselinové sekvence z polypeptidu ad exprimovány v návaznosti na aminokyselinové sekvence z jiných polypeptidu. Takové fúzní polypetidy mohou mít, ve srovnání s polypeptidem ad divokého typu, pozměněné biologické, biochemické a/nebo imunologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu spadají analoga polypeptidu obsahující navíc aminokyselinový zbytek (například lysin nebo cystein), který usnadňuje tvorbu multimerů.
Vynález se rovněž týká polypeptidu a molekul nepeptidové povahy, které specificky vážou ad. Mezi výhodné molekuly, které vážou ad, patří protilátky (například monoklonální a polyklonální protilátky), receptory (například jejich rozpustné formy nebo formy asociované s membránou) a jiné ligandy (například přirozeně se vyskytující nebo uměle připravené molekuly) včetně těch molekul, které se za přítomnosti monoklonálních protilátek namířených proti ad a/nebo specifických receptorů pro ad, kompetitivně váží na ad. Molekuly, které se vážou na ad, mohou být použity při purifikaci polypeptidů ad a identifikaci typů buněk exprimujících polypeptid ad. Molekuly, které se vážou na ad, mohou být rovněž použity za účelem modulace (tj. inhibice, blokování nebo stimulace) vazebných aktivit polypeptidů ad (in vivo) a/nebo za účelem modulace přenosu signálů uskutečňovaných prostřednictvím ad.
Vynález rovněž popisuje stanovení sloužící k identifikaci molekul vážících ad, včetně stanovení využívajících vazbu imobilizovaného ligandu, stanovení, při kterých je vazba sledována v roztoku, SPA (scintillation proximity assay - stanovení využívající přiblížení radioaktivní znač8
ky ke fluoroforu a následné monitorování světla emitovaného fluoroforem), stanovení, při kterých jsou použity dvě hybridní molekuly a podobně.
Mezi in vitro stanovení sloužící k identifikaci protilátek nebo jiných sloučenin, které modulují aktivitu polypeptidu aj, mohou patřit, například, imobilizace polypeptidu ad nebo imobilizace přirozeného ligandu, ke kterému se ad váže, detekovatelné značení neimobilizovaného vazebného partnera, společná inkubace vazebných partnerů a stanovení vlivu testované sloučeniny na množství navázané značky, přičemž snížení množství navázané značky za přítomnosti testované sloučeniny (ve srovnání s množstvím značky navázané bez přítomnosti testované sloučeniny) naznačuje, že testovaná látka je inhibitorem vazby na ad.
Jiným typem stanovení použitelným k identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi ad a jeho ligandem, je stanovení, při němž je polypeptid ad nebo jeho fragment imobilizován na povrchu pevného nosiče povlečeného (nebo napuštěného) fluorescenčním agens a ligand je označen sloučeninou schopnou excitovat zmíněné fluorescenční agens. Při tomto stanovení dojde, za přítomnosti nebo v nepřítomnosti domnělého modulátoru, ke kontaktu imobilizovaného polypeptidu ad se značeným ligandem a následně je detekováno světlo emitované prostřednictvím fluorescenčního agens a jsou identifikovány sloučeniny s modulačními vlastnostmi. Jako sloučeniny s modulačními vlastnostmi jsou uvažovány ty sloučeniny, které ovlivňují emisi světla zprostředkovanou fluorescenčním agens ve srovnání s emisí světla zprostředkovanou fluorescenčním agens v nepřítomnosti modulační sloučeniny. Jinou možností je imobilizace ligandu pro ad a označení polypeptidu ad.
Další metodou spadající do rozsahu vynálezu a sloužící k identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi ad • · a jeho ligandem, je transformace nebo transfekce vhodných hostitelských buněk nějakým konstruktem DNA nesoucím reportérový gen pod kontrolou promotoru, regulovaný transkripčním faktorem skládajícím se z domény vážící DNA a aktivační domény, následná exprese (v hostitelské buňce) první sekvence hybridní DNA kódující první fúzní protein obsahující část nebo celý polypeptid ad spolu s doménou vážící DNA nebo aktivační doménou a exprese druhé hybridní DNA kódující druhý fúzní protein obsahující část nebo celý ligand pro ad a spolu s doménou vážící DNA nebo aktivační doménou transkripčního faktoru, které nejsou inkorporovány v prvním fúzním proteinu. Dále je pak vyhodnocen vliv domnělé modulační sloučeniny na interakci mezi ocd a jeho ligandem. Tento vliv je sledován detekcí vazby ligandu na ad v dané hostitelské buňce, tak, že je v dané hostitelské buňce stanovována tvorba produktu reportérového genu za přítomnosti nebo v nepřítomnosti domnělého modulátoru, a jako modulační sloučeniny jsou identifikovány ty sloučeniny, které pozměňují tvorbu produktu reportérového genu ve srovnání s tvorbou produktu reportérového genu v nepřítomnosti modulační sloučeniny. U tohoto stanovení jsou v dnešní době s výhodou používány promotor lexA, doména vážící DNA se sekvencí odpovídající lexA, transaktivační doména GAL4, reportérový gen lacZ a jako hostitelské buňky kvasinky.
Při izolaci polynukleotidu kódujícího protein, který se váže na ocd, může být použita upravená verze výše zmíněného stanovení. Při této modifikované verzi jsou vhodné hostitelské buňky transformovány nebo transfekovány konstruktem DNA nesoucím reportérový gen pod kontrolou promotoru regulovaného transkripčním faktorem skládajícím se z domény vážící DNA a aktivační domény. Následuje exprese (v hostitelské buňce) první sekvence hybridní DNA kódující první fúzní protein obsahující část nebo celý polypeptid ad spolu s doménou vážící DNA nebo nějakou aktivační doménou zmíněného • · • · · · • · · · * • · · transkripčního faktoru a exprese knihovny druhé hybridní DNA kódující druhý fúzní protein obsahující část nebo celý polypeptid, u kterého existuje předpoklad vazby na ad, a doménu vážící DNA nebo aktivační doménu transkripčního faktoru, které nejsou inkorporovány v prvním fúzním proteinu. Dále je pak vyhodnocen vliv domnělé modulační sloučeniny na interakci mezi ad a jeho ligandem. Tento vliv je sledován detekcí vazby proteinu vážícího ad na ad v dané hostitelské buňce, tak, že je v dané hostitelské buňce detekována tvorba produktu reportérového genu. Nakonec je z příslušné hostitelské buňky izolována druhá hybridní sekvence DNA kódující protein vážící ad.
Vynález se rovněž týká hybridomů produkujících protilátky specificky namířené proti ad. V současnosti jsou velmi dobře známy techniky sloužící k produkci hybridomů, které sekretují monoklonální protilátky. Buněčné linie hybridomů mohou být vytvořeny imunizací nějakého živočicha prostřednictvím purifikovaného ad, variant polypeptidú ad nebo buněk, které na svém extracelulárním povrchu exprimují polypeptid ad nebo jeho varianty. Mezi imunogenní buněčné typy patří buňky, které exprimují ad in vivo, nebo transfekované buněčné linie eukaryotických nebo prokaryotických buněk, které za normálních okolností in vivo polypeptid ad neexprimují. Ve výhodném provedení vynálezu jsou upřednostňovány protilátky sekretované hybridomy označovanými 169A,
169B, 170D, 170F, 170E, 170X. 170H, 188A, 188B, 188C, 188E,
I88F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R,
188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3,
197A-4, 199A, 199H a 199M.
Hodnota informací poskytnutých odhalením sekvencí DNA kódujících ctd a aminokyselinových sekvencí ad je zřejmá.
Sekvence cDNA kódující ad, uvedená v jedné sérii příkladů umožňuje izolaci sekvence genomové DNA kódující ad, včetně • · • * ···· ··· ····· ·♦ ·· ·· ·· prvků řídících transkripci této genové sekvence. Vynález se rovněž týká možností identifikace alelických variant DNA kódujících ad a DNA kódující ocd z jiných druhů (například myší nebo potkanů). Izolace lidské genomové DNA kódujících ad a DNA pro ocd z jiných druhů, může být uskutečněna pomocí standardních technik hybridizace DNA/RNA, prováděné za vhodných podmínek, za použití části nebo celé sekvence cDNA pro ad (tato sekvence cDNA pro ad je použita jako sonda pro testování (screening) vhodné knihovny). Jinou možností použitelnou k amplifikaci a identifikaci sekvencí genomové DNA kódující ad je využití polymerázové řetězcové reakce (PCR), při které jsou jako primery použity oligonukleotidy vytvořené na základě známé sekvence cDNA. Pomocí konvenčních metod syntézy může být připravena syntetická DNA kódující polypeptid ad, včetně jeho fragmentů a různých variant .
Informace o sekvenci DNA podle vynálezu rovněž umožňují vytvořit, prostřednictvím přístupu využívajícího rekombinatní techniky nebo strategie knockoutování genů [viz. například Kapecchi, Science 244:1288 až 1292 (1989)], hlodavce, kteří nejsou schopni exprimovat funkční polypeptid ad, nebo kteří exprimují nějakou z variant polypeptidu ad.
Tito hlodavci mohou sloužit jako vhodný model pro studium aktivit polypeptidu ad a modulátorů polypeptidu ad in vivo.
Sekvence DNA a aminokyselinové sekvence podle vynálezu rovněž umožňují provést analýzu těch epitopů ad, které se aktivně účastní vazby na receptor, a rovněž epitopů, které mohou tuto vazbu nějakým způsobem regulovat, spíše než se jí aktivně účastnit. Vynález rovněž zahrnuje možnost identifikace epitopů, které se mohou účastnit přenosu signálů přes membránu.
DNA podle vynálezu je rovněž použitelná k detekci těch typů buněk, které exprimují polypeptid ad. Ke stanovení • · • · · · • · · · · · • · • ·
hladiny konstitutivní transkripce ad v buňkách, jakož i ke stanovení změn v transkripci v závislosti na přítomnosti interních nebo externích látek, mohou být využity standardní techniky hybridizace DNA/RNA, které k detekci RNA kódující polypeptid ad využívají DNA pro ad. Identifikace látek modifikujících transkripci a/nebo translaci polypeptidů ad může být zase využita pro stanovení potenciálních terapeutických nebo preventivních účinků těchto látek. DNA podle vynálezu rovněž umožňuje hybridizací DNA pro ad a buněčné RNA in šitu, čímž je možné určit lokalizaci RNA pro ad v populacích buněk obsahujících více buněčných typů a ve tkáních .
DNA podle vynálezu může být rovněž použita k identifikaci polynukleotidových sekvencí z jiných organizmů než ze člověka, které vykazují homologii k sekvencím lidského ad. Znalost sekvencí DNA pro ad u jiných organizmů než u lidí umožňuje vytvoření živočišných modelů (včetně například transgenních modelů) k lidskému systému.
Jiná stránka vynálezu se týká monoklonálních a polyklonálních protilátek specificky namířených proti ad, které mohou být využity při imunohistochemických analýzách k lokalizaci polypeptidů ad v buněčných kompartmentech nebo v jednotlivých buňkách tkání. Tento typ imunohistochemických stanovení je zvláště výhodně používán v kombinaci s hybridizací in šitu, přičemž jsou lokalizovány jak mRNA pro ad, tak polypeptidový produkt genu pro ad.
Identifikace typů buněk, které exprimují polypeptid ad, může výrazně pomoci při vývoji látek s terapeutických nebo preventivním účinkem. Předpokládá se, že produkty podle vynálezu, které jsou příbuzné ad, mohou být využity při léčbě onemocnění, u kterých v procesu onemocnění hrají důležitou roli makrofágy. V současnosti je popsáno množství živočiš13 ···· • · · · • · · • 9 · · ných modelů pro patologické stavy spojené s pozměněnou aktivitou makrofágů. Například v publikaci Jutila a další, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993) je u myší popsáno hromadění makrofágů v místech jak chronických, tak akutních zánětů. U laboratorních potkanů popisuje Adams a další, [Transplantation 53:1115 až 1119 (1992) a Transplantation 56:794 až 799 (1993)] model pro arteriosklerózu štěpu vznikající po transplantaci heterotropních abdominálních srdečních alloštěpů. Rosenfeld a další, [Arteriosclerosis 7:9 až 23 (1987) a Arteriosclerosis 7:24 až 34 (1987)] popisuje indukci arteriosklerózy u králíků krmených dietou s přídavkem cholesterolu. Hanenberg a další, [Diabetologia 32:126 až 134 (1989)] zmiňuje spontánní rozvinutí inzulíndependentního diabetů u laboratorních potkanů BB. Yamada a další, [Gastroenterology 104:759 až 771 (1993)] popisuje u laboratorních potkanů injikovaných polymery peptidoglykanpolysacharid z baktérie Streptococcus výskyt zánětlivého onemocnění střev a chronické granulomatózní kolitidy. Cromartie a další, [J. Exp. Med. 146:1585 až 1602 (1977)] a Schwab a další, [Infection and Immunity 59:4436 až 4442 (1991)] zmiňují, že injekce proteinů buněčné stěny z baktérie Streptococcus do organizmu laboratorních potkanů má za následek artritický stav charakterizovaný zánětem periferních kloubů a následným poškozením těchto kloubů. A konečně Huitinga a další, [Eur. J. Immunol 23:709 až 715 (1993)] popisuje u laboratorních potkanů Lewis výskyt encefalomyelitidy (ložiskový zánět mozku a míchy), která je modelem pro roztroušenou sklerózu. U každého z těchto modelů jsou ke zmírnění průběhu nemoci využívány protilátky proti ad nebo jiné proteiny vážící polypeptid ad nebo rozpustné formy polypeptidu ad. Cílem tohoto působení je pravděpodobně zamezit aktivaci makrofágů.
Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic použitelných při léčbě těchto a jiných onemocnění. Farmaceutické • · · · • · · · · • · · · · • · · · · • · · · · ···· · ·· ·· ·· ·· kompozice jsou navrhovány tak, aby inhibovaly interakce mezi ocd a jeho ligandem (-dy) . Mezi tyto farmaceutické kompozice patři nej různější rozpustné formy polypeptidu ad a formy polypeptidu ad asociované s membránou (obsahující celý polypeptid ad nebo jeho fragmenty, které se aktivně účastní při vazbě polypeptidu ad) , nej různější rozpustné formy proteinů vážících ad a formy proteinů vážících ocd asociované s membránou (včetně protilátek, ligandů a podobně) , intracelulární a extracelulární modulátor vazebné aktivity polypeptidu ad a/nebo modulátor exprese polypeptidu ad a/nebo polypeptidu ad-ligand, včetně modulátorů transkripce, translace, posttranslačních úprav a/nebo intracelulárního transportu.
Vynález se rovněž týká metod sloužících k léčbě onemocnění, u kterých svou roli hraje vazba polypeptidu ad nebo lokalizovaná akumulace buněk exprimující polypeptid ad. V těchto metodách je pacientovi postiženému zmíněným onemocněním podávána farmaceutická kompozice podle vynálezu v množství dostačujícím k ovlivnění úrovně vazby polypeptidu ad nebo v množství dostačujícím k ovlivnění akumulace buněk exprimujících polypeptid ad. Tyto metody léčby podle vynálezu jsou použitelné při onemocněních jakými jsou například, ale nejenom, diabetes I. typu, atheroskleróza, roztroušená skleróza, astma, lupénka, záněty plic, syndrom akutní respirační tísně a revmatická arthritida.
Přehled obrázků na výkresech
Množství dalších aspektů a výhod vynálezu bude zřejmější, jestliže se vezme v potaz následující popis vynálezu, kde jsou zmíněny i následující obrázky, kde:
• ·
Na Obrázcích IA až ID jsou znázorněny aminokyselinové sekvence lidských CDllb (SEK. ID. Č.: 3), CDllc (SEK. ID. Č. : 4) a ocd (SEK. ID. Č. : 2) .
Příklady provedení vynálezu
Vynález je ilustrován následujícími příklady týkajícími se izolace klonu DNA kódující polypeptid ad z knihovny cDNA z lidské sleziny. Přesněji řečeno, Příklad 1 ilustruje použití protilátky proti psímu aTMi při pokusu detekovat homologní lidský protein. Příklad 2 detailně popisuje purifikaci psího polypeptidů ccTmi a sekvenaci N-koncové části tohoto polypeptidů, aby bylo možné vytvořit oligonukleotidové primery použitelné k amplifikaci psího genu pro aTMi pomocí PCR. Příklad 3 se týká purifikace velkého množství polypeptidu aTMi z organizmu psa, aby bylo možné určit vnitřní sekvence tohoto polypeptidů a poté připravit další primery pro PCR. Příklad 4 popisuje použití primerů komplementárních ke vnitřní sekvenci genu pro aTMi při amplifikaci fragmentu genu kódujícího psí αΤΜχ pomocí PCR. Příklad 5 se týká klonování sekvence cDNA kódující lidský ad. Příklad 6 popisuje analýzu exprese mRNA kódující ad v lidských tkáních a buňkách, prováděnou metodou Northern blot. Příklad 7 detailně popisuje konstrukci expresívních plazmidů obsahujících sekvenci kódující lidský ad a transfekci buněk COS těmito plazmidy. Příklad 8 se týká analýzy exprese polypeptidu ad v transfekovaných buňkách COS prováděné metodou ELISA. Příklad 9 popisuje analýzu buněk COS transfekovaných expresívními plazmidy obsahujícími sekvenci kódující lidský ad prováděnou pomocí FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). Příklad 10 se týká imunoprecipitace polypeptidů CD18 asociovaného s ad v kotransfekovaných buňkách COS. Příklad 11 popisuje stabilní transfekci buněk ovárií čín16 • » ··· · ského křečka (CHO buňky) pomocí expresívního konstruktu obsahujícího sekvenci kódující ad. Příklad 12 se týká vazby polypeptidu ad (závlislé na přítomnosti polypeptidu CD18) na intercelulární adhezivní molekulu ICAM-R, mutantní protein ICAM-R a molekulu komplementu iC3b. Příklad 13 popisuje techniku SPA sloužící k identifikaci inhibitorů nebo posilovačů (tj. modulátorů) vazebných interakcí ligand pro ad/anti-ligand pro ad. Příklad 14 popisuje konstrukci expresívních plazmidů, které kódují rozpustné formy polypeptidu ad a vazebné analýzy produktů exprese. Příklad 15 se týká produkce polyklonálních sér a monoklonálních protilátek specificky namířených proti ad. Příklad 16 popisuje použití polyklonálního séra namířeného proti ad při analýze tkáňové distribuce polypeptidu ad, exprese ad na povrchu leukocytů periferního krevního oběhu a exprese polypeptidu ad v zánětlivé a nezánětlivé synovii (kloubní nitroblána). Příklad 17 popisuje izolaci sekvencí cDNA, které vykazují homologii k sekvencím lidského genu pro ad, z organizmu laboratorních potkanů. Příklad 18 se týká konstrukce expresívních plazmidů kódujících celý polypeptid ad, expresívních plazmidů kódujících doménu I polypeptidu ad, včetně fúzních proteinů domény I/IgG, a produkce monoklonálních protilátek proti celému polypeptidu a fúzním proteinům obsahujícím doménu I. Příklad 19 se týká izolace sekvencí cDNA, které vykazují homologii k sekvencím lidského genu pro ad, z organizmu myší. Příklad 20 popisuje další izolaci klonů cDNA kódujících ad použitých k potvrzení výsledků sekvenční analýzy. Příklad 21 se týká hybridizačních analýz prováděných in sítu v různých myších tkáních, které slouží ke stanovení specifity tkáňové a buněčné exprese předpokládaného myšího homologu lidského ad. Příklad 22 popisuje konstrukci expresívních konstruktů, které kódují předpoklá17 ·« ··«· ·· »··· ·· • · · · · · · · · • · · · · · · • · ·· · · · · · · · • · ···· ·· • as· · ·· ·· ·· daný myší homolog lidského ocd. Příklad 23 se týká vytvoření „knockoutované myši, u které je rozrušen gen kódují předpokládaný myší homolog lidského ad. Příklad 24 se týká izolace sekvencí cDNA, které vykazují homologii ke kódujícím sekvencím lidského genu pro ad, z organizmu králíků. Příklad 25 popisuje živočišný model onemocnění člověka, ve kterém jsou stanovovány možnosti modulace ad. Příklad 26 popisuje expresi polypeptidu ad u živočišného modelu onemocnění .
Příklad 1
Pokus detekovat lidský homolog psího polypeptidu ccTmi
Za účelem pokusit se identifikovat lidský homolog psího polypeptidu aTMi byla na lidských leukocytech periferního krevního oběhu testována křížová reaktivita monoklonálni protilátky Call.8H2 specificky namířené proti psímu aTMi [Moore a další, viz. výše]. Buňky (obvykle 1 x 106 buněk) byly na ledu za přítomnosti 0,1% azidu sodného inkubovány s neředěným supernatantem získaným po kultivaci hybridomů nebo s purifikovanou kontrolní myší protilátkou IgG-negativní (10 pg/ml). Vazba monoklonálni protilátky byla detekována následnou inkubací koňskou protilátkou (o koncentraci 6 pg/ml) namířenou proti myším IgG konjugovanou s FITC (Vector 10 Laboratories, Burlingame, CA). Označené buňky byly ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem (PBS) fixovány pomocí 2 % w/v paraformaldehydu a poté analyzovány za použití přístroje FACS Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Při obvyklém provedení bylo s využitím logaritmického zesílení intenzity fluorescence analyzováno 10000 buněk .
Získané výsledky naznačují, že protilátka Call.8H2 nereaguje křížově s povrchovými proteiny exprimovanými na po18 • 0 0000 »0 «000
00*0 0
0 0 vrchu lidských leukocytů periferního krevního oběhu, zatímco v podstatě všechny kontrolní buňky, kterými jsou neoplastické psí lymfocyty periferního krevního oběhu, polypeptid αΤΜχ na svém povrchu exprimovaly.
Protože monoklonální protilátka Call.8H2 specificky namířená proti psí podjednotce α nereagovala křížově s nějakým lidským homologem této podjednotky, byla nezbytným předpokladem izolace odpovídajícího lidského protějšku DNA kódující psí octmi (jestli ovšem tento lidský protějšek existuje) izolace zmíněné DNA kódující psí aTMi.
Příklad 2
Afinitní purifikace psího polypeptidů αΤΜχ použitého k sekvenaci N-koncové oblasti
Za účelem stanovení N-koncové sekvence byl afinitně purifikován psí polypeptid aTMi a získaná aminokyselinová sekvence byla použita při návrhu oligonukleotidové sondy nebo primeru. Stručně řečeno, monoklonální protilátka Call.8H2 namířená proti polypeptidů aTMi, byla navázána na chromatografický nosič Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) a požadovaný protein byl izolován pomocí specifické interakce protilátka-protein. Protilátka byla na nosič konjugována postupem doporučeným firmou BioRad a výsledná koncentrace byla 5 mg protilátky na ml nosiče. Po konjugaci byl přebytek protilátky odstraněn a nosič byl zablokován pomocí trojnásobného objemu O,1M ethanolaminu. Nosič byl následně promyt fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem (PBS) o objemu odpovídajícímu třiceti objemům kolony.
Ve 250 ml pufru obsahujícího 0,32 M sacharózu ve 25 mM
Tris-HCl, pH 8,0, s inhibitory proteáz, bylo homogenizováno gramů sleziny získané z jednoho psa. Buněčná jádra a celé buňky byly odstraněny centifugací prováděnou při lOOOxg ·· ···· ·· ···· ·· ·· ·· · · · · · · · · • · ··· «··· • · · · · · · ··· · · • · >··· · · · ···· · ·· ·· ·* *· po dobu 15 minut. Membrány byly od supernatantu odděleny centifugaci prováděnou při lOOOOOxg po dobu 30 minut. Takto získaná peleta tvořená membránami byla rozsuspendována ve 200 ml lyzačního pufru (50 mM NaCl, 50 mM sůl kyseliny borité, pH 8,0, spolu s 2 % NP-40) a po dobu 1 hodiny inkubována na ledu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centifugací prováděnou při lOOOOOxg po dobu 60 minut. Deset mililitrů čirého lyzátu bylo spolu s 0,5 ml nosiče Affigel 10 s konjugovanou protilátkou Call.8H2 (viz. výše) přeneseno do polypropylénové zkumavky o objemu 15 ml. Tato zkumavka byla za stálého míchání inkubována přes noc při 4°C a nosič byl následně promyt padesátinásobným množstvím D-PBS. Poté byl tento nosič přenesen do mikrocentrifugační zkumavky a po dobu 10 minut vařen za přítomnosti 1 ml Laemmliho vzorkového pufru (neredukující) o složení 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, % SDS, 20 % glycerol a 0,002 % bromfenolová modř. Nosič byl následně odstraněn centrifugaci; k supernatantu byla přidána 1/15 objemu β-merkaptoethanolu (Sigma, St. Louis,
MO) a vzorek byl podroben elektroforéze na 7% polyakrylamidovém gelu. Rozdělené proteiny byly přeneseny na membránu Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) následujícím způsobem.
Gely byly jednou promyty deionizovanou vodou filtrovanou přes membránu Millipore a poté po dobu 15 až 30 minut ekvilibrovány v transferovém pufru o složení 10 mM kyselina 3-[cyklohexylamino]-1-propansulfonová (CAPS), pH 10,5 s 10 % methanolem. Membrány Immobilon byly navlhčeny methanolem, promyty filtrovanou vodou a po dobu 15 až 30 minut ekvilibrovány v transferovém pufru CAPS. Počáteční přenos byl prováděn za použití přístroje pro Western Blot firmy BioRad při 70 voltech po dobu 3 hodin.
Membrány Immobilon byly poté z přístroje vyjmuty a po dobu 10 minut barveny 0,1% roztokem Coomassie R250. Následně byly membrány ve třech cyklech po deseti minutách odbar20 • · · · ·
·· ·· vény směsí 50 % methanol/10 % kyselina octová. Po odbarvení byly membrány promyty filtrovanou vodou a vysušeny na vzduchu .
Byly detekovány proužky proteinů o zdánlivých molekulových hmotnostech 150 kD, 95 kD, 50 kD a 30 kD. Proužky o zdánlivých molekulových hmotnostech 50 kD a 30 kD vznikly pravděpodobně v důsledku kontaminace protilátkou. Jak u proužku odpovídajícímu proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 kD, tak u proužku odpovídajícímu proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 95 kD byl učiněn pokus určit N-koncovou sekvenci, nicméně protein o zdánlivé molekulové hmotnosti 95 kD byl blokován, takže tuto sekvenci nebylo možné určit. Proužek proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 kD byl z membrány vystřižen a pomocí proteinového sekvenátoru Applied Biosystems (Foster City, CA) model 473A přímo sekvenován postupem podle výrobce. Získaná aminokyselinová sekvence je za použití jednopísmenného aminokyselinového kódu znázorněna jako SEK. ID. Č.: 5:
FNLDVEEPMVFQ (SEK. ID. Č.: 5)
Tato identifikovaná sekvence obsahuje sekvenci FLDN charakteristickou pro podjednotky a rodiny integrinů [Tamura a další, J. Cell. Biol. 111:1593 až 1604 (1990)].
Vytvoření primerů a pokus o amplifikaci sekvencí kódujících psí CCtmi
S využitím získané informace o N-koncové sekvenci byly za účelem hybridizace navrženy tři oligonukleotidové sondy: a) „Tommer - plně degenerovaný oligonukleotid; b) „Patmer - částečně degenerovaný oligonukleotid; a c) „Guessmer nedegenerovaný oligonukleotid se sekvencí založenou na ko21
·· · · · · donech používaných u savců. Tyto sondy jsou znázorněny níže jako SEK. ID. Č.: 6, 7 a 8. Symboly v sekvencích nukleových kyselin použité ve všech nukleotidových sekvencích vynálezu odpovídají §1,882 37 C. R. F.
5'-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3' (SEK. ID. Č.: 6)
5'-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3' (SEK. ID. Č.: 7)
5'-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3' (SEK. ID. Č.: 8)
Za použití těchto oligonukleotidů (vytvořených na základě dat získaných sekvenací polypeptidu) nebyly při několika hybridizačních analýzách, za podmínek umožňujících hybridizaci nedokonale komplementárních sekvencí, v knihovně cDNA získané ze psích makrofágů periferního krevního oběhu/slezinných buněk zaklonované do λΖΑΡ (Stratagene, La Jolla, CA), detekovány odpovídající klony.
Následně byly na základě odhadnuté sekvence N-konce polypeptidu vytvořeny čtyři oligonukleotidové primery označované 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec (jak jsou zobrazeny v SEK. ID. Č.: 9, 10, 11 a 12, kde Deg označuje degenerovanou sekvenci a Spec nedegenerovanou sekvenci). S těmito oligonukleotidovými primery byl proveden pokus o amplifikaci (pomocí PCR) sekvencí kódujících psí αΤΜχ z DNA fágové knihovny purifikované z lyzátů knihovny firmy Stratagene popsané výše.
5’-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3 (SEK. ID. Č. : 9) • · · · • · · · • ·
5' | -TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3' | (SEK. | ID. | Č. : 10) |
5' | -TGRAANACCATNGGYTC-3' | (SEK. | ID. | Č. : 11) |
5' | -TTGGAAGACCATNGGYTC-3' | (SEK. | ID. | Č. : 12) |
Oligonukleotidové primery pro amplifikaci αΤΜχ byly použity ve dvojicích s primery komplementárními k sekvenci vektoru označenými T3 a T7 znázorněnými v SEK. ID. Č.: 13 (T3) a 14 (T7), které hybridizují se sekvencemi ohraničujícími oblast polylinkeru fágmidu Bluescript nacházejícím se v λΖΑΡ.
5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3' (SEK. ID. Č.: 13)
5'-AATACGACTCACTATAG-3' (SEK. ID. Č.: 14)
Amplifikace metodou PCR byla prováděna v pufru Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) obsahujícím hořečnaté ionty, za použití 150 ng knihovny DNA, 1 pg jednotlivého primerů, 200 μΜ každého z dNTP a 2,5 jednotek polymerázy Taq (Boehringer Mannheim). Produkty PCR reakce byly separovány elektroforézou na 1% agarózovém gelu v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE) s přídavkem ethidium bromidu o koncentraci 0,25 pg/ml. DNA byla metodou kapilárního přenosu přenesena na membránu Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Transfer byl prováděn přes noc v lOx SSPE. Po přenesení na membránu byla imobilizovaná DNA denaturována působením 0,5 M NaOH s 0,6 M NaCl, neutralizována 1,0 M TrisHCl, pH 8,0, v 1,5 M NaCl a před zesíťováním pomocí UV záření prováděným na přístroji Stratalinker (Stratagene) promyta 2x SSPE. Za stálého třepání byla membrána při 50°C inkubována po dobu 2 hodin v prehybridizačním pufru (5x SSPE, 4x Denhardts, 0,8 % SDS, 30 % formamid).
Za použití pufru pro kinázu firmy Boehringer Mannheim s 100 až 300 pCi yP32-dATP a 1 až 3 jednotek polynukleotid kinázy byly oligonukleotidové sondy 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec (SEK. ID. Č.: 9, 10, 11 a 12) radioaktivně označeny. Značení probíhalo 1 až 3 hodiny při 37°C. Nezainkorporovaná radioaktivní značka byla odstraněna chromatografií na koloně Sephadexu G-25 fine (Pharmacia, Piscataway, NJ) za použití pufru o složení 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE), a proteklá frakce byla přímo přidána k prehybridizačnímu roztoku. Hybridizace s radioaktivní sondou probíhala při 42°C po dobu 16 hodin za stálého třepání. Nakonec byly membrány promývány při 50°C po dobu 15 minut roztokem lx SSPE/0,1 % SDS. Membrány byly poté při -80°C po dobu 1 až 4 hodin exponovány na film Kodak X-Omat AR.
Oligonukleotidy 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec hybridizovaly pouze s produkty těch PCR reakcí, při kterých byly použity jako primery, a nehybridizovaly, jak se očekávalo, s produkty PCR reakcí, u nichž jako primery použity nebyly. Bylo tudíž usouzeno, že žádný z produktů reakce PCR není specifický pro aTMi, protože ani jeden z produktů nehybridizoval se všemi použitými sondami.
Příklad 3
Purifikace velkého množství polypeptidů ocTmi z organizmu psa prováděná za účelem určení vnitřní sekvence polypeptidu
Aby bylo možné získat další aminokyselinovou sekvenci použitelnou k vytvoření primerů, byl za účelem určení vnitřní sekvence polypeptidů purifikován psí polypeptid octmi· K purifikaci proteinu použitelného k určení vnitřní sekvence byly použity tři kusy zmrazené sleziny (každá o hmotnosti přibližně 50 g) a zmrazené buňky získané ze dvou slezin dospělých psů. Ve 200 až 300 ml borátového pufru by24 ·· · β · · ···· • · · · · · · · · • · « · · · · ··· · · • · ···· · · · ···· · η *· ·· ·· lo v míchacím zařízení Waring homogenizováno 50 g sleziny. Homogenizovaný materiál byl zředěn stejným objemem pufru obsahujícím 4% NP-40 a směs byla lehce třepána přinejmenším jednu hodinu. Větší kusy byly z lyzátu odstraněny centrifugací prováděnou při 2000xg po dobu 20 minut a supernatant byl přefiltrován buď přes filtr Corning (Corning, NY) nebo přes filtrační systém Corning s membránou o velikosti pórů 0,8 mikronů. Lyzát byl následně přečištěn filtrací přes filtrační systém Corning s membránou o velikosti pórů 0,4 mikronů.
Lyzát ze sleziny a nosič Affigel 10 s konjugovanou protilátkou (popsaný v Příkladu 2) byly smíchány v poměru 150:1 v alikvotech o objemu 100 ml a za stálého třepání inkubovány přes noc při 4°C. Lyzát byl následně odstraněn centrifugací prováděnou při lOOOxg po dobu 10 minut, smíchán s dalším alikvotem nosiče Affigel 10 s konjugovanou protilátkou a inkubován přes noc za podmínek zmíněných výše. Alikvoty nosiče s navázaným proteinem byly poté spojeny a promyty 50-ti násobným objemem pufru D-PBS/0,1 % Tween 20, a nosič byl umístěn na kolonu BioRad o objemu 50 ml. Navázaný protein byl z nosiče eluován 3 až 5 násobným objemem 0,1 M glycinu (pH 2,5); byly sbírány frakce o objemech 900 μΐ a tyto frakce byly neutralizovány pomocí 100 μΐ pufru 1M Tris, pH 8,0. Z každé frakce byl odebrán alikvot o objemu 15μ1 a tento alikvot byl povařen se stejným objemem 2x Laemmliho vzorkového pufru s 1/15 objemu 1M dithiothreitolu (DTT). Tyto vzorky byly analyzovány elektroforézou na 8% polyakrylamidovém gelu Novex (San Diego, CA) a vizualizovány barvením Coomassie nebo stříbrem za použití Daiichiho kitu (Enprotech, Natick, MA), postupem popsaným výrobcem. Frakce obsahující největší množství proteinu byly smíchány a zakoncentrovány ve vakuu. Zbylý roztok byl zředěn na polovinu redukujícím Laemmliho vzorkovým pufrem a elektroforeticky rozdělen na 7% polyakrylamidovém gelu o tloušťce 1,5 mm v pufru Tris-glycin/SDS. Po elektroforéze
I · · · ♦ * • · · · «
I · · · · • · ···· « ···· ·· byly proteiny za použití přístroje pro Western Blot firmy Hoefer přeneseny z gelu na membránu Immobilon postupem popsaným v Příkladu 2.
Proužky proteinů o velikosti odpovídající psímu aTMi byly z 10 membrán PVDF vyříznuty; celkový obsah proteinu byl přibližně 47 pg. Tyto vyříznuté proužky byly odbarveny ve 4 ml 50% methanolu (5 minut), vysušeny na vzduchu a rozřezány na kousky o velikosti 1x2 mm. Tyto kousky membrán byly při 4°C na 30 minut ponořeny do 2 ml 95% acetonu, občas vortexovány a nakonec vysušeny na vzduchu.
Před vlastním proteolytickým štěpením proteinu navázaného na membránu byly v 1,5 ml 70% kyseliny mravenčí rozpuštěny 3 mg bromkyanu (CNBr) (Pierce, Rockford, IL). Tento roztok byl přidán do zkumavky obsahující kousky membrány PVDF a zkumavka byla inkubována po dobu 24 hodin při pokojové teplotě ve tmě. Supernatant (Sl) byl následně přenesen do jiné zkumavky a kousky membrány byly promyty 0,25 ml 70% kyseliny mravenčí. Tento supernatant (S2) byl poté přidán k supernatantu Sl. Ke spojeným supernatantům (Sl a S2) byly přidány 2 ml vody Mílii Q a vzniklý roztok byl lyofilizován. Kousky membrán PVDF byly vysušeny pod proudem dusíku a při 42°C po dobu 17 hodin znovu extrahovány 1,25 ml roztoku o složení 60 % acetonitril, 0,1% kyselina tetrafluorooctová (TFA). Tento supernatant (S3) byl odebrán a kousky membrán PVDF byly při 42°C po dobu 1 hodiny znovu extrahovány 1,0 ml roztoku o složení 80 % acetonitril, 0,08% kyselina tetraf luorooctová . Tento supernatant (S4) byl smíchán s předchozími supernatanty (Sl, S2 a S3) a směs supernatantů byla vysušena ve vakuu.
Vysušené fragmenty proteinu získané štěpením pomocí CNBr byly následně rozpuštěny v 83 μΐ roztoku o složení 8M močovina, 0,4 M NH4HCO3. Tyto fragmenty byly redukovány přidáním 5 μΐ 45 mM dithiothreitolu (DTT) a následnou inkubací při 50°C po dobu 15 minut. Vzniklý roztok byl poté • ·
I I • · *··· · • · · · « • · ·· ·· ochlazen na pokojovou teplotu a fragmenty byly alkylovány přidáním 5 μΐ 100 mM jodacetamidu (Sigma, St. Louis, MO).
Po 15-ti minutové inkubaci při pokojové teplotě byl vzorek zředěn 187 μΐ vody Milli Q na výslednou koncentraci močoviny odpovídající 2,0 M. Následně byl ke vzorku přidán trypsin (Worthington, Freehold, NJ) v poměru enzym:protein 1:25 (w/w) a štěpení probíhalo při 37°C po dobu 24 hodin. Štěpení bylo ukončeno přídavkem 30 μΐ TFA. Proteinové fragmenty byly poté separovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na přístroji Waters 625 LC (Millipore, Milford , MA) za použití kolony Vydac C-18 (5 mikronů) o rozměrech 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) ekvilibrované v roztoku 0,05 % TFA ve vodě pro HPLC (pufr A). Peptidy byly eluovány zvyšující se koncentrací 80 % acetonitrilu v 0,04 % TFA (pufr B) s gradientem 38% až 75% pufr B po dobu 65 až 95 minut a 75% až 98 % pufr B po dobu 95 až 105 minut. Peptidy byly děleny při průtoku 0,2 ml/minuta a detekovány při vlnové délce 210 nm.
Po frakcionaci byla u peptidů stanovována aminokyselinová sekvence. Stanovení aminokyselinové sekvence bylo prováděno automaticky Edmanovým odbouráváním na proteinovém sekvenátoru Biosystems Model 437A za použití standardních cyklů doporučených výrobcem. Analýza získaných dat byla provedena softwarovým programem Data Analysis Model 610A, verze 1.2.1. Všechny sekvenační reagencie byly dodány firmou Applied Biosystems. Aminokyselinové sekvence sedmi z celkových osmi vnitřních fragmentů jsou znázorněny níže, přičemž „X označuje aminokyseliny, u kterých nelze s jistotou určit o jakou aminokyselinu se vlastně jedná.
VFQEXGAGFGQ | (SEK. | ID. | Č. : | 15) |
LYDXVAATGLXQPI | (SEK. | ID. | Č. : | 16) |
PLEYXDVIPQAE | (SEK. | ID. | Č. : | 17) |
FQEGFSXVLX | (SEK. | ID. | C. : | : 18) |
TSPTFIXMSQENVD | (SEK. | ID. | Č. : | : 19) |
LVVGAPLEVVAVXQTGR | (SEK. | ID. | Č. : | : 20) |
LDXKPXDTA | (SEK. | ID. | Č. : | : 21) |
Vytvoření primeru
Jedna ze získaných aminokyselinových sekvencí (zobrazená jako SEK. ID. Č.: 22) byla použita k vytvoření úplně degenerovaného oligonukleotidového primeru označeného p4(R) a zobrazeného jako SEK. ID. Č.: 23.
FGEQFSE (SEK. ID. Č.: 22)
5'-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3' (SEK. ID. Č.: 23)
Příklad 4
Klonování fragmentu psího ocTmi metodou PCR
S využitím PCR byla ze dvojvláknové cDNA ze psí sleziny amplifikována část na 5' konci genu kódujícího psí polypeptid aTMi .
A. Vytvoření dvojvláknové cDNA ze psí sleziny
Jeden gram zmrazeného materiálu získaného ze sleziny mladého psa byl ve směsi kapalného dusíku a suchého ledu rozdrcen a homogenizován ve 20 ml pufru RNA-Stat 60 (TelTest B, lne, Friendswood, TX). Poté byly přidány 4 ml chloroformu a roztok byl oddělen centrifugací prováděnou při 12000xg po dobu 15 minut. Z vodné vrstvy byla RNA precipitována přídavkem 10 ml ethanolu. RNA obsahující poly-A sekvenci byla poté oddělena s využitím kuličkového nosiče Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Oslo, Norsko). Pět alikvotů • · · · • · · · · · · • « ·· · ·· ··· · • · · · · · · · ····· ·· ·· ··
RNA o celkové hmotnosti 100 pg bylo smícháno a zředěno stejným objemem 2x vazebného pufru (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS). RNA byla následně po dobu 5 minut inkubována s nosičem Oligo dT Dynabeads (1,0 ml nebo 5 mg nosiče na všechny vzorky). Před vlastní elucí polyA mRNA prováděné roztokem o složení 2 mM EDTA, pH 7,5, byly kuličky nosiče promyty pufrem o složení 10 mM Tris-HCI, pH
7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA a 0,1% SDS podle postupu popsaného výrobcem. Následně byla, postupem podle výrobce a za použití eluované mRNA s poly-A sekvencí a kitu pro syntézu cDNA firmy Boehringer Mannheim, syntetizována dvojvláknová cDNA.
B. Izolace cDNA kódující část psího polypeptidů aTMi
Při standardní reakci PCR prováděné za použití 150 ng dvojvláknové cDNA, 500 ng každého z primeru, 200 μΜ každého dNTP a 1,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim) v pufru Taq (Boehringer Mannheim) s přídavkem hořečnatých iontů, byly použity oligonukleotidové primery 5zDeg (SEK. ID. Č.: 9) a p4 (R) (SEK. ID. Č.: 23). Vzniklé produkty (1 μΐ původní reakce) byly, za účelem dosažení vyšších výtěžků, použity v další reakci PCR se stejnými primery. Tyto proužky byly při 60°C v pufru o složení 10 mM Tris-HCI, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl eluovány z 1% agarózového gelu na papír Schleicher & Schuell (Keene, NH) NA4S, precipitovány a za použití klonovacího kitu TA (Invitrogen) zaligovány do vektoru pCRtmII (Invitrogen, San Diego, CA) (postupem doporučeným výrobcem). Ligační směsí byly elektroporačně transformovány baktérie XL-1 Blue (Stratagene). Jeden klon, označený 2.7, obsahoval sekvence odpovídající sekvencím DNA pro polypeptid aTMi, které nebyly využity při návrhu primerů.
Sekvenace byla provedena pomocí sekvenátoru DNA Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) za použití sekvenačního kitu využívajícího k terminaci reakce deoxynukleotidy s navázanou značkou (ABI). Při této sekvenaci byly asymetrickou reakcí PCR [McCabe, Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a další (eds.), strany 76 až 83, Academie Press: New York (1990)] inkorporovány fluorescenčně značené dNTP následujícím postupem. Vzorky byly inkubovány po dobu 4 minut při 96°C a poté podrobeny 25 cyklům: : 96°C, po dobu 15 sekund; 50°C po dobu 1 sekundy; 60°C po dobu 4 minut. Získaná data (včetně chromatogramu a textových souborů) byla automaticky načtena do referenčních souborů. Celá sekvence inzertu v klonu 2.7 je znázorněna jako SEK. ID. Č.: 24.
Pokusy o izolaci cDNA (z knihovny firmy Stratagene; jak je popsána v Příkladu 2), kódující celý psí polypeptid aTMi byly neúspěšné. Za použití klonu 2.7 jako sondy, bylo v podmínkách umožňujících hybridizaci sekvencí s nižším stupněm komplementarity (použití 30% formamidu) otestováno přibližně 1 χ 106 fágových plaků, ale nebyly identifikovány žádné pozitivní klony. Rovněž neúspěšné byly pokusy o amplifikaci odpovídajících sekvencí nacházejících se po směru transkripce od sekvencí reprezentovaných v klonu 2.7. Pokusy o amplifikaci těchto sekvencí nacházejících se po směru transkripce od sekvencí reprezentovaných v klonu 2.7 byly prováděny za použití specifických oligonukleotidu odvozených z klonu 2.7 nebo degenerovaných primerů se sekvencí vycházející z aminokyselinové sekvence jiných peptidových fragmentů, a jako druhý primer byl použit degenerovaný oligonukleotid se sekvencí vycházející z konzervativního aminokyselinového motivu GFFKR podjednotky α [Tamura a další, viz. výše].
Příklad 5
Klonování předpokládaného lidského homologu ke psímu
CÍTMl
Při pokusu o izolaci lidské sekvence homologní ke psí sekvenci kódující cctmi byl jako sonda použit fragment psího octmi o velikosti přibližně 1 kb z klonu 2.7. Tato sonda byla vytvořena reakcí PCR za podmínek popsaných v Příkladu 2 a za použití primerů NT2 (viz. SEK. ID. Č.: 25) a p4(R) (SEK. ID. Č.: 23).
5'-GTNTTYCARGARGAYGG-3' (SEK. ID. Č.: 25)
Produkt reakce PCR byl purifikován za použití kitu Quick Spin firmy Qiagen (Chatsworth, GA) postupem doporučeným výrobcem. Takto purifikovaná DNA byla za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označena 200 pCi a32-PdCTP. Nezainkorporovaný izotop byl odstraněn chromatografií na koloně Sephadexu G25 (fine). Před vlastním použitím byla sonda denaturována působením 0,2 M NaOH a neutralizována roztokem 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0.
Na filtračních papírech Hybond (Amersham) byly připraveny kolonie knihovny cDNA z lidské sleziny zaklonované do vektoru pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Filtry byly nejprve vystaveny působení denaturačních činidel a následně neutralizovány postupem popsaným v Příkladu 2 a poté za mírného třepání po dobu 2 hodin inkubovány při 50°C v prehybridizačním roztoku (8 ml/filtr) se 30% formamidem. K tomuto roztoku byla přidána radioaktivně značená sonda (viz. výše) a spolu s filtry byl tento roztok inkubován při 42°C po dobu 14 hodin. Filtry byly dvakrát promyty roztokem 2x SSC/0,1 % SDS o teplotě 37°C a dvakrát roztokem 2x SSC/0,1 • ·· · • · 4 4 4 4 • 4 4 4 4
4 4 · 44 44
44 % SDS o teplotě 50°C. Nakonec byly filtry promyty dvakrát roztokem lx SSC/0,1 % SDS o teplotě 65°C (lx SSC má složení 150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný, pH 7,0). Po dobu 6 hodin byly filtry v kazetě s kontrastním filtrem exponovány na film Kodak X-Omat AR. Kolonie poskytující signál byly z duplikátu filtračního papíru natřeny na plotny s LB médiem obohaceným hořečnatými ionty (LBM)/karbenicilin a inkubovány přes noc při 37°C. Vyrostlé kolonie byly přeneseny na filtry Hybond a tyto filtry byly zpracovány postupem popsaným výše. Tyto filtry byly, za použití sondy o velikosti 1 kb z klonu 2.7, radioaktivně označené postupem popsaným výše, hybridizovány v podmínkách, při kterých je k dosažení pozitivního signálu nezbytná vyšší komplementarita mezi sondou a testovanou DNA než tomu bylo v předchozím případě; podmínky hybridizace byly 50% roztok formamidu, 50°C po dobu 3 hodin. Filtry byly nakonec promyty dvakrát roztokem lx SSC/0,1 % SDS o teplotě 65°C a po dobu 2,5 hodin byly filtry při -80°C v kazetě s kontrastním filtrem exponovány na film Kodak X-Omat AR. Byly identifikovány pozitivní kolonie a tyto kolonie byly přes noc kultivovány v
LBM/karbenicilin. Z jednotlivých kultur byla pomocí kitu Promega Wizard pro minipreparaci DNA, postupem doporučovaným výrobcem, izolována DNA a tato DNA byla následně sekvenována.
Prvním screeningem bylo jako pozitivních vybráno 18 klonů, zatímco výsledkem druhého screeningu prováděného za podmínek, při kterých je k dosažení pozitivního signálu nezbytná vyšší komplementarita mezi sondou a testovanou DNA, byla identifikace jednoho pozitivního klonu označeného 19A2. Sekvence DNA a odhadnutá aminokyselinová sekvence klonu 19A2 lidského ocd jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 1 a 2.
·· · · · ·· flfl
Charakteristiky cDNA pro lidský ad a predikovaného polypeptidu
Klon 19A2 obsahuje celou kódující oblast pro maturovaný protein a navíc ještě 48 bází (16 aminokyselinových zbytků) signální sekvence nacházející se na 5' konci proti směru transkripce od kódující oblasti, a 241 bází nepřekládané sekvence na 3' konci, která není ukončena polyadenylační sekvencí. Předpokládá se, že molekulová hmotnost maturovaného proteinu bude přibližně 125 kD. Předpokládaná extracelulární doména zahrnuje přibližně aminokyselinové zbytky 17 až 1108 (v SEK. ID. Č.: 2). Na tuto extracelulární oblast navazuje sekvence asi 20 aminokyselin, která je homologní k transmembránové oblasti lidského CDllc (aminokyselinové zbytky 1109 až 1128 v SEK. ID. Č.: 2). Cytoplazmatická doména je tvořena přibližně 30 aminokyselinami (aminokyselinové zbytky 1129 až 1161 v SEK. ID. Č.: 2). Protein rovněž obsahuje oblast (přibližně aminokyselinové zbytky 150 až 352) tvořenou asi 202 aminokyselinami, která je homologní k doméně I (inzerční) společné pro polypeptidy CDlla, CDllb a CDllc [Larson a Springer, viz. výše], polypeptid aE [Shaw a další, J. Biol. Chem. 269:6016 až 6025 (1994)] a proteiny VLA-1 a VLA-2 [Tamura a další, viz. výše] . Bylo prokázáno, že doména I u jiných integrinů participuje na vazbě s ICAM [Landis a další, J. Cell. Biol. 120:1519 až 1527 (1993); Diamond a další, J. Cell. Biol. 120:1031 až 1043 (1993)], což naznačuje, že polypeptid ad může rovněž vázat zástupce povrchových molekul proteinové rodiny ICAM. Bylo prokázáno, že tato oblast neexistuje v žádné jiné podjednotce integrinů.
Odhadnutá aminokyselinová sekvence polypeptidu ad je z přibližně 36% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDlla, z přibližně 60% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDllb a z přibližně 66% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDllc. Na Obrázku 1
4 44 4 44 4444 4
4 4444 444
4·4· 4 44 44 ·· 44 jsou zobrazeny srovnané aminokyselinové sekvence polypeptidů CDllb (SEK. ID. Č. : 3), CDllc (SEK. ID. Č.: 4) a ad (SEK. ID. Č.: 2) .
U organizmů jednoho druhu se obvykle cytoplazmatické domény podjednotek a v integrinech β2 podstatně liší, zatímco jednotlivé typy podjednotek a vykazují mezi jednotlivými druhy vysoký stupeň homologie. V souladu s těmito pozorováními, se cytoplazmatická oblast polypeptidu ad podstatně liší od cytoplazmatických oblastí polypeptidů CDlla, CDllb a CDllc, ovšem s výjimkou aminokyselinové sekvence GFFKR (nacházející se v těsné blízkosti membrány), která je konzervována mezi všemi podjednotkami a [Rojiani a další, Biochemistry 30: 9859 až 9866 (1991)]. Protože oblast cytoplazmatického konce integrinů se účastní inside out signalizace a regulace avidity [Landis a další, viz. výše], je možné, že polypeptid ad interaguje s molekulami cytosolu, které jsou odlišné od molekul interagujících s CDlla, CDllb a CDllc, a výsledkem toho může být skutečnost, že polypeptid ad se účastní signálních drah odlišných od signálních drah, ve kterých participují jiné integriny β2.
Extracelulární doména polypeptidu ad obsahuje, v pozici vedle domény I, konzervovanou aminokyselinovou sekvenci DGSGS; u polypeptidu CDllb je sekvence DGSGS oblastí vážící kovy, a je nezbytná pro interakci s ligandem [Michishita a další. Cell 72:857 až 867 (1993)]. V aminokyselinové sekvenci polypeptidu ad klonu 19A2 (SEK. ID. Č.: 1) jsou na pozicích 465 až 474, 518 až 527 a 592 až 600 konzervovány další tři místa, která jsou v polypeptidech CDllb a CDllc pravděpodobně odpovědná za vazbu kationtů. Doména I polypeptidu ad vykazuje 36%, 62% a 57% homologii k odpovídajícím oblastem polypeptidů CDlla, CDllb resp. CDllc. Tento relativně nízký stupeň sekvenční homologie naznačuje, že ·· ··· · ·· · ·· · · · · · • · ··· · · · · • · ·· · ·· ···· · • · · · · · » · · ····· · · ·· · · · · podjednotka ad může interagovat se skupinou extracelulárních proteinů, které jsou odlišné od proteinů, se kterými reagují jiné známé integriny β2. Rovněž afinita polypeptidú ad ke známým ligandům integrinů β2, jakými jsou například ICAM-1, ICAM-2 a/nebo ICAM-R, může být odlišná od afinity demonstrované u interakcí integrin β2/ΙΟΑΜ (viz. Příklad 12) .
Izolace dalších klonů cDNA pro lidský ocd, použitých k ověření sekvence
Aby bylo možné potvrdit sekvenci DNA kódující lidský ocd, byly z knihovny cDNA z lidské sleziny (Invitrogen) zaklonované do vektoru pcDNA/Amp (popsané v Příkladu 5), pomocí hybridizace, izolovány další molekuly cDNA. Elektroforézou na agarózovém gelu byly vybrány pouze cDNA s délkou převyšující 3 kb. Sonda použitá při hybridizaci byla odvozena od 5' koncové oblasti ad (jak je popsáno níže). Hybridizační podmínky byly totožné s podmínkami při izolaci prvního klonu lidského ad, pouze s tou výjimkou, že po hybridizaci byly filtry při pokojové teplotě dvakrát promyty v roztoku 2x SSC/0,1% SDS a jednou roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C. Filtry byly přes noc exponovány na film Kodak X-Omat AR.
Hybridizační sonda 5' ad byla vytvořena pomocí reakce PCR z klonu 19A2 za použití primerů CDllc 5' For (SEK. ID. Č.: 94) a CDllc 5' Rev (SEK. ID. Č.: 95). Reakce byla prováděna následovně. Vzorky byly po dobu 4 minut udržovány při 94°C a poté vystaveny, v cykleru Perkin-Elmer 9600, 30 cyklům změn teplot: i) 94°C, po dobu 15 sekund; ii) 5°C, po dobu 30 sekund; a iii) 72°C, po dobu 1 minuty.
·· *··· ·* ···« ·· ·· ·· · · · · · · · · ·· ··· ···· • · · · · ·· · · · · • · ···· ·«· ··»·· ·· ·· · · ··
CDllc 5' For: (5')CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3') (SEK. ID. Č. : 94)
CDllc 5' Rev: (5')CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3') (SEK. ID. Č.: 95)
Produkt amplifikační reakce byl purifikován za použití kitu Prep-A-Gene firmy BioRad (Hercules, CA) postupem doporučeným výrobcem. Získaná sonda 5' ad byla dlouhá přibližně 720 bází, což odpovídá oblasti začínající oligonukleotidem 1121 a končící oligonukleotidem 1839 v SEK. ID. Č.: 1. Purifikovaná DNA (přibližně 50 ng) byla, postupem doporučeným výrobcem, za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana) radioaktivně označena izotopem 32P-dCTP. Nezainkorporovaný izotop byl odstraněn za použití sloupců „Centrisep Spin Columns (Princeton Separations, Adelphia, NJ) postupem doporučeným výrobcem. Radioaktivně označená sonda byla přidána k filtrům namočeným v prehybridizačním roztoku obsahujícím 45% formamid a inkubace probíhala přes noc při 50°C. Po této inkubaci byly filtry promyty postupem popsaným výše.
Třináct kolonií poskytlo na obou duplikátech filtrů pozitivní signál. Pozitivní kolonie byly sebrány se zásobní plotny, zředěny pomocí LBM s karbenicilinem (100 pg/ml) a v různých ředěních vysety na filtry Hybond (Amersham). Duplikáty těchto filtrů byly hybridizovány v roztoku o stejném složení jako při první hybridizaci a po hybridizaci byly filtry promyty roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C a poté exponovány na film.
Při druhém testu bylo potvrzeno deset z původně identifikovaných třinácti pozitivních kolonií. Dva z těchto deseti klonů (označené A7.Q a A8.Q) byly sekvenovány a bylo stanoveno, že kódují lidský ad. U klonu A7.Q bylo zjištěno,
4444
ΦΦ ···· ·· ·· ·· 4 ·· Φ 4 4 4 4 • Φ φ Φ Φ ΦΦΦΦ φ Φ ΦΦΦ Φ * ΦΦΦ Φ Φ φ φ ΦΦΦΦ ΦΦΦ
ΦΦΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·· že je přibližně 2,5 kb dlouhý, obsahuje vedoucí sekvenci na 5' konci, část kódující oblasti a dalších 60 bází nepřekládané sekvence na 5' konci. Bylo zjištěno, že nekompletní kódující oblast je výsledkem nesprávně sestřižené oblasti intronu v místě odpovídajícím oligonukleotidu 2152 v SEK.
ID. Č.: 1. U klonu A8.Q bylo zjištěno, že je přibližně 4 kb dlouhý, obsahuje celou kódující oblast pro polypeptid ad a rovněž obsahuje sekvenci intronu v místě odpovídajícím bázi 305 v SEK. ID. Č.: 1. Ve srovnání s původně izolovaným klonem ad (SEK. ID. Č.: 1) byl u obou klonů, jak A7.Q tak A8.Q, pozorován jeden rozdíl. Tímto rozdílem byla skutečnost, že klony A7.Q a A8.Q mají v místě báze 1495 vložen kodon tvořený třemi bázemi CAG. Sekvence klonů A7.Q a A8.Q jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 96 a 97, a složené lidské sekvence odvozené od klonů A7.Q a A8.Q spolu s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi jsou zobrazeny jako SEK.
ID. Č.: 98 a 99.
Příklad 6
Analýza exprese lidského ad ve tkáních, prováděná metodou Northern Blot
Za účelem stanovení relativní hladiny a tkáňové specifity exprese ad, byla za použití fragmentů z klonu 19A2 jako sondy, provedena analýza metodou Northern Blot. Na agarózový gel s formaldehydem a 1 pg ethidium bromidu bylo z každého vzorku, získaného z několika lidských tkání a kultivovaných buněčných linií, naneseno přibližně 10 pg RNA.
Po elektroforéze prováděné po dobu 4 hodin při napětí 100 V byla RNA přenesena na nitrocelulózovou membránu (Schleicher & Schuell) metodou kapilárního přenosu prováděnou v lOx SSC přes noc. Membrána byla „zapečena ve vakuu při 80°C po dobu 1,5 hodin. K blokování membrány byl použit prehybridizační roztok obsahující 50% formamid v pufru kyseliny 3-(N37 • · · · ·
morfolino)propansulfonové (MOPS). Prehybridizace probíhala 3 hodiny při 42 °C. Fragmenty klonu 19A2 byly, postupem doporučeným výrobcem, za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim radioaktivně označena izotopem a32P-dCTP a a32P-dTTP. Nezainkorporovaná značka byla odstraněna na koloně Sephadexu G25 v pufru TE. K hybridizací byl použit hybridizační pufr o aktivitě 1,5 x 106 c. p.
m./ml. Následně byl blot při pokojové teplotě promyt roztokem 2x SSC/0,1% SDS, dále pak roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C, roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C, roztokem lx SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C, roztokem 0,5x SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C a nakonec roztokem 0,lx SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C. Poté byl blot po dobu 19 hodin exponován na film.
Hybridizace za použití fragmentu vyštěpeného z klonu 19A2 restrikčním enzymem BstXI (odpovídajícímu nukleotidům 2011 až 3388 v SEK. ID. Č.: 1) poskytla slabé signály u RNA, o velikosti přibližně 5 kb, z jater, placenty, thymu a mandlí (tonzil). Ve vzorcích z ledvin, mozku a srdce nebyl detekován žádný signál. Množství RNA přítomné ve vzorku z ledvin bylo minimální (jak ukázalo barvení ethidium bromidem) .
Při použití druhého fragmentu z klonu 19A2 (zahrnujícího oblast bází 500 až 2100 v SEK. ID. Č.: 1) byly v lidských tkáních, metodou Northern Blot využívající RNA s poly-A sekvencí (Clontech), detekovány RNA transkripty dvou rozdílných velikostí. Ve slezině a kosterních svalech byl detekován proužek o velikosti 6,5 kb, zatímco v plicích a leukocytech periferního krevního oběhu byl detekován proužek o velikosti 4,5 kb. Rozdíly v pozorovaných velikostech mohou být způsobeny tkáňově specifickou polyadenylací, křížovou reaktivitou zmíněné sondy s jinými zástupci rodiny integrinů nebo hybridizací sondy s alternativně sestřiženými RNA.
·· ···♦
Analýza prováděná metodou Northern Blot a využívající třetí fragment z klonu 19A2, zahrnující nukleotidy 2000 až 3100 v SEK. ID. Č.: 1, poskytla obdobné výsledky jako analýzy využívající jiné fragmenty klonu 19A2.
Za použití fragmentů odpovídajících nukleotidům 500 až 2100 a 2000 až 3100 v SEK. ID. Č.: 1 byla rovněž testován RNA získaná ze tří linií myeloidních buněk. Buněčná linie THP-1, stimulovaná prostřednictvím PMA, poskytla neostrý signál v té samé oblasti (přibližně 5,0 kb), jak tomu bylo u signálů z jiných tkání; tento signál byl nicméně poněkud silnější. RNA získaná z nestimulovaných buněk HL-60 a z buněk HL-60 stimulovaných prostřednictvím DMSO, poskytla při hybridizací se sondou aa signál o intenzitě odpovídající intenzitě signálu u vzorků tkáně, nicméně zdálo se, že vystavení buněk působení PMA zvyšuje intenzitu tohoto signálu. Jelikož jak PMA, tak DMSO směrují diferenciaci buněk HL-60 po dráze monocyty/makrofágy (PMA) resp. granulocyty (DMSO), naznačuje tento výsledek existenci zvýšené exprese polypeptidů ad u buněčného typu monocyty/makrofágy. V buňkách U937 je přítomna mRNA pro ad a stimulací prostřednictvím PMA nedochází k zesílení signálu. Žádná pozitivní odezva nebyla detekována u buněk Molt, Daudi, H9, JY nebo Jurkat .
Příklad 7
Přechodná exprese konstruktů kódujících lidský ocd
A. Vytvoření expresívních konstruktů
Lidský klon 19A2 postrádá iniciační kodon pro methionin a pravděpodobně také část signální sekvence na 5' konci. K vytvoření expresivního plazmidů obsahujícího sekvence lidského klonu 19A2 byly tudíž použity dva odlišné přístupy. Při prvním přístupu byly zkonstruovány dva plazmidy, ve • · · · • · · · kterých byly k vytvoření chimérické sekvence kódující ad použity sekvence kódující signální peptid odvozené od genů kódujících polypeptidy CDllb nebo CDllc, které byly připojeny k sekvenci pro ocd. Při druhém přístupu byl zkonstruován třetí plazmid, ve kterém byl na pozici 0 v klonu 19A2 přidán adenosin a tím byl vytvořen kodon pro iniciační methionin.
Zmíněné tři plazmidy obsahovaly rozdílné oblasti, které se liší na 5' konci sekvence kódující polypeptid ocd nebo chimérický polypeptid ad. Oblast kódující ocd byla pomocí PCR (viz. podmínky v Příkladu 2) amplifikována za použití specifického primeru BamRev vymezujícího 3' konec kódujícího vlákna (dále jen 3' primer nebo reverzní primer) (viz. SEK. ID. Č.: 26) a jednoho ze tří primerů vymezujících k 5' konec kódujícího vlákna (dále jen 5' primer nebo přímý primer) . Zmíněné tři 5' primery v sekvenci obsahovaly: (1) na pozicích 1 až 6 identické nespecifické báze umožňující restrikční štěpení, na pozicích 7 až 12 restrikční místo EcoRI a na pozicích 13 až 18 konvenční Kozákovu sekvenci; (2) část signální sekvence odvozené od CDllb (primer ER1B) nebo CDllc (primer ER1C) nebo adenosin (primer ER1D); a (3) dalších 15 až 17 bází komplementárních k sekvencím na 5' konci klonu 19A2, aby bylo umožněno „nasednutí primeru na DNA. Primery ER1B, ER1C nebo ERlD jsou zobrazeny v SEK. ID. Č.: 27, 28 nebo 29, kde je iniciační kodon pro methionin vyznačen tučně a restrikční místo EcoRI je podtrženo.
'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3' (SEK. ID. Č.: 26) '-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3' (SEK. ID. Č. : 27)
5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3' (SEK. ID. Č.: 28) • · · · • · • « • · · · · ···· * * · · · ·· ···· · • * · · · · ··· ····' · · »· e· » · z-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (SEK. ID. Č. : 29)
Produkty získané reakcí PCR byly rozštěpeny restrikčními enzymy EcoRI a BamHI.
Všechny tři plazmidy obsahovaly totožnou druhou část kódující ad (byla vložena po směru transkripce ihned za 5' oblast popsanou v předchozím odstavci), včetně 3' konce klonu ocd. Tato druhá část kódující ad, která zasahuje od nukleotidu 625 až do restrikčního místa Xbal nacházejícího se na 3' konci polylinkeru vektoru klonu 19A2, byla izolována štěpením klonu 19A2 restrikčními enzymy BamHI/Xbal.
Byly připraveny tři ligační reakce, při kterých byl fragment 3' ad rozštěpený restrikčními enzymy BamHI/Xbal zaligován, za použití pufru pro ligázu a ligázy T4 (1 jednotka na 20 reakcí) firmy Boehringer Mannheim, do jednoho ze tří klonů 5' ad rozštěpených restrikčními enzymy EcoRI/BamHI. Po čtyřhodinové inkubaci při 14°C bylo ke každé ligační reakci, spolu s jednou jednotkou ligázy, přidáno odpovídající množství vektoru pcDNA.3 (Invitrogen) rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. Reakce probíhaly dalších 14 hodin. Jednou desetinou reakční směsi byly následně transformovány kompetentní buňky XL-1 Blue. Vyrostlé kolonie byly dále kultivovány a byla z nich izolována DNA (viz. Příklad 5). Štěpením pomocí EcoRI byly identifikovány tři klony, které obsahovaly restrikční místo EcoRI a tudíž i uměle vytvořené signální sekvence. Tyto klony byly označeny pATM.Bl (CDllb/ad, primer ER1B), pATM.ClO (CDllc/ad, primer ER1C) a pATM.D12 (adenosin/ad, primer ERld). Přítomnost odpovídajících signálních sekvencí byla u každého klonu potvrzena sekvenováním příslušné nukleové kyseliny.
• ·
B. Transfekce buněk COS
Exprese z plazmidů kódujících ad (zmíněných výše) bylo dosaženo kotransfekcí buněk COS vždy jedním z těchto plazmidů, spolu s expresívním plazmidem pro CD18, označeným pRC.CD18. Jako pozitivní kontroly byly použity buňky COS kotransfekované plazmidem pRC.CD18 a expresívním plazmidem pro CDlla, označeným pDC.CDlla.
hodin před vlastní transfekci byly, při 50% konfluenci, buňky v kultivačním médiu (DMEM/10%FBS/penicilinstreptomycin) přepasážovány do Petriho misek pro tkáňové kultury firmy Corning o průměru 10 cm. Při všech pasážováních byly buňky z kultivačních misek odstraněny pomocí Verseneho pufru (0,5 mM NaEDTA v PBS). Před vlastní transfekci byly misky jednou promyty médiem DMEM bez přídavku séra. Do každé misky bylo přidáno 15 pg jednotlivého plazmidu v 5 ml transfekčního pufru (DMEM s 20 pg/ml DEAE-Dextranu a 0,5 mM chlorochinem). Po 1,5 hodinové inkubaci při 37 °C byly buňky vystaveny šoku přidáním 5 ml DMEM/10% DMSO. Tento roztok DMSO byl poté nahrazen kultivačním médiem o objemu 10 ml/miska.
Vzniklé transfektanty byly analyzovány metodami ELISA, FACS a imunoprecipitací, jak je popsáno v Příkladech 8, 9 a 10.
Příklad 8
Analýza transfekovaných buněk COS metodou ELISA
Za účelem zjištění, jestli buňky COS kotransfekované expresívním plazmidem pRC.CD18 a plazmidem ad exprimovaly na svém povrchu polypeptid ad asociovaný s polypeptidem CD18, byla, za použití primárních protilátek proti CD18 (například TS1/18 purifikovaná z ATCC HB203), provedena analýza metodou ELISA. Jako pozitivní kontrola byly použity • · · · • · · « • · • · · ·· a · buňky kotransfekované expresívním plazmidem pro CD18 a expresívním plazmidem pro CDlla, označeným pDC.CDlla. U této kontroly byly jako primární protilátky použity protilátky proti CD18 a protilátky proti CDlla (například TS 1/22 purifikované z ATCC HB202).
Za účelem provedení analýzy metodou ELISA byly buňky z každé misky odstraněny pomocí Verseneho pufru a přeneseny na jednu 96-tí jamkovou destičku pro kultivaci tkáňových kultur firmy Corning. Buňky byly před vlastní analýzou ponechány v kultivačním médiu po dobu 2 dnů. Poté byly destičky dvakrát promyty roztokem D-PBS/0,5% želatina z kůže ryb (nadřádu Kostnatí) (Sigma) v objemu 150 μΐ/jamka. Tento pufr byl používán při všech krocích vyjma barvení. Veškeré promývání a inkubace byly prováděny při pokojové teplotě. Následně byly jamky po dobu jedné hodiny blokovány roztokem želatiny. Primární protilátky byly roztokem želatiny zředěny na koncentraci 10 pg/ml a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ tohoto roztoku. Po jednohodinové inkubaci byly destičky 3x promyty roztokem želatiny v objemu 150 μΐ/jamka. Ve zředění 1:3500 byla přidána sekundární protilátka (kozí protilátka specificky namířená proti myší Ig/HRP-Fc [Jackson, West Grove, PA]) v objemu 50 μΐ/jamka a destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny. Po třech promytích byly destičky, před přidáním 15% kyseliny sírové v objemu 50 μΐ/jamka, po dobu 20 minut barveny v roztoku o-fenyldiaminu (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD v citrátovém pufru).
Analýza transfekovaných buněk, prováděná metodou ELISA za použití protilátek specificky namířených proti CD18, neodhalila u buněk transfekovaných pouze plazmidem kódujícím CD18 žádnou výrazně vyšší hladinu exprese, než jaké bylo pozadí. Buňky kotransfekované plazmidy kódujícími CDlla a CD18 vykazovaly při analýzách, při kterých byly použity protilátky specificky namířené proti CD18 nebo protilátky specificky namířené proti CDlla, vyšší hladiny exprese, než • · · ·
• · ·
I · « • · · · • · • · a jaké bylo pozadí. Další analýzy buněk transfekovaných plazmidem kódujícím CD18 a jedním z expresívních konstruktů kódujících ad (pATM. CIO nebo pATM.D12) odhalily, že exprese CD18 na povrchu buněk je zvýšena souběžnou expresí polypeptidu ocd. Zvýšení exprese polypeptidu CD18, detekované u buněk COS transfekovaných plazmidy pATM. CIO nebo pATM.Dl2, bylo srovnatelné se zvýšením pozorovaným u kontrolních buněk kotransfekovaných plazmidy kódujícími CDlla/CDl8.
Příklad 9
Analýza transfekovaných buněk COS prováděná s využitím
FACS
Buňkám v Petriho miskách bylo jeden den před transfekcí vyměněno kultivačním médium za čerstvé a před vlastní analýzou prováděnou s využitím FACS byly buňky inkubovány po dobu 2 dnů. Transfekované buňky byly pomocí 3 ml Verseneho pufru odstraněny z misek, jednou promyty 5 ml pufru pro FACS (DMEM/2% FBS/0,2% azid sodný) a zředěny 0,1 ml pufru pro FACS na koncentraci 500000 buněk/vzorek. Ke každému vzorku bylo přidáno bud’ 10 μΐ protilátek specificky namířených proti CD18, CDlla nebo CDllb o koncentraci lmg/ml konjugovaných s FITC (Becton Dickinson) nebo 10 μΐ myší protilátky 23F2G (proti CD18) (ATCC HB11081) o koncentraci 800 pg/ml konjugované s CFSE. Poté byly vzorky inkubovány 45 minut na ledu, 3x promyty pufrem pro FACS o objemu 5 ml/promytí a rozsuspendovány v 0,2 ml pufru pro FACS. Vzorky byly měřeny na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson a získaná data byla analyzována za použití programu Lysys II (Becton Dickinson).
Buňky COS, transfekované pouze plazmidem kódujícím
CD18, nebyly značeny protilátkami (s konjugovaným markérem) namířenými proti CD18, CDlla nebo CDllb. Jestliže byly buňky kotransfekovány sekvencemi kódujícími CDlla/CDl8, bylo • · • · · · • · · · · · • · · • · • ·· · · protilátkami namířenými proti CDlla nebo CD18 označeno přibližně 15% buněk. Žádná z buněk transfekovaných plazmidem kódujícím CD18 spolu s jakýmkoliv konstruktem kódujícím ad nebyla značena protilátkou namířenou proti polypeptidům CDlla a CDllb. 4%, 13% a 8% buněk ze skupin transfekovaných plazmidy pATM.Bl, pATM.ClO resp. pATM.Dl2 reagovalo ze pozitivně na barvení protilátkou proti CD18. Intenzita fluorescence pozitivních populací ze skupiny CDlla/CD18 byla čtyřnásobně vyšší než pozadí. Pro srovnání, kotransfekce buněk konstruktem kódujícím ad a konstruktem pro CD18 vedla k vytvoření pozitivní populace buněk, které vykazovala čtyř až sedmi násobné zvýšení intenzity fluorescence oproti hodnotám pozadí.
Příklad 10
Imunoprecipitace komplexů lidský ad/CDl8 z kotransfekovaných buněk COS značených biotinem
Za účelem zjištění, jestli může být polýpeptid ad izolován jako část heterodimerního komplexu αβ s charakteristikou integrinů, byl u buněk kotransfekovaných expresívním plazmidem kódujícím CD18 a každým z expresívních plazmidu kódujících polýpeptid ad (popsaných v Příkladu 7), proveden pokus o imunoprecipitaci komplexu ad/CD18.
Transfekované buňky (1 až 3 χ 108 buněk/skupina) byly z Petriho misek odstraněny pomocí Verseneho pufru a třikrát promyty roztokem D-PBS v objemu 50 ml/skupina. Každý vzorek byl označen pomocí 2 mg Sulpho-NHS Biotin (Pierce, Rockford, IL). Značení probíhalo 15 minut při pokojové teplotě a bylo ukončeno promytím (třikrát) chladným roztokem D-PBS v objemu 50 ml/vzorek. Promyté buňky byly rozsuspendovány v 1 ml lyzačního pufru (1% NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM Ca++, 2 mM Mg++ a inhibitory proteáz) a inkubo45 • · · · • ·
vány po dobu 15 minut na ledu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací prováděnou při lOOOOxg po dobu 5 minut a supernatant byl přenesen do prázdných zkumavek. Aby byl odstraněn materiál nespecificky reagující s myším imunoglobulinem, bylo na počátku provedeno předčištění vzorku. Při 4°C bylo se supernatanty inkubováno 25 pg myšího imunoglobulinu (Cappel, West Chester, PA). Po 2,5 hodinách bylo ke každému vzorku přidáno 100 pl (25 pg) Sepharózy konjugované s králičí protilátkou namířenou proti myším Ig (připraveno z Proteinu A-Sepharózy 4B a králičí protilátky namířené proti myšímu IgG, obojí od firmy Zymed, San Francisco, CA); inkubace probíhala za stálého třepání při 4°C po dobu 16 hodin. Částice Sepharózy byly od supernatantu odstraněny centrifugací. Po tomto předčištění byly supernatanty při 4°C po dobu 2 hodin inkubovány s 20 pg protilátky namířené proti CD18 (TS1.18). Od supernatantu byly komplexy protilátka/antigen izolovány inkubací s přípravkem králičí protilátka proti myším Ig/Protein A-Sepharóza o objemu 100 pl/vzorek, postupem popsaným výše. Částice nosiče byly čtyřikrát promyty roztokem 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl a 1 % Triton-X 100. Promyté částice byly zcentrifugovány a po dobu 10 minut vařeny ve 20 pl 2x Laemmliho vzorkového pufru s 2% β-merkaptoethanolem. Vzorky byly zcentrifugovány a rozděleny elektoforézou na polyakrylamidovém gelu Novex (Novex) prováděnou po dobu 30 minut při napětí 100V. Proteiny byly poté v pufru TBS-T přeneseny na nitrocelulózové membrány (Schleicher & Schuell); 100 mA po dobu 1 hodiny. Membrány byly 2 hodiny blokovány pomocí 3% BSA v TBS-T. Po dobu 1 hodiny byly membrány inkubovány s křenovou peroxidázou se strepavidinem (POD) (Boehringer Mannheim) ve zředění 1:6000 a poté třikrát promyty v TBS-T. K obarvení blotu byl použit (postupem popsaným výrobcem) „Enhanced Chemiluminescence kit firmy Amersham. Membrány byly na 0,5 až 2 minuty exponovány na Hyperfilm MP (Amersham).
• · · ·
Imunoprecipitace komplexů CD18 z buněk transfekovaných plazmidem pRC.CD18 spolu s jedním z plazmidů pATM.Bl, pATM.ClO nebo pATM.Dl2 odhalila povrchovou expresi heterodimerů skládajících se z řetězce β o molekulové hmotnosti přibližně 100 kD, která odpovídá předpokládané velikosti CD18, a řetězce α o molekulové hmotnosti přibližně 150 kD, která odpovídá molekulové hmotnosti polypeptidů ad.
Příklad 11
Stabilní transfekce lidského ad do buněk ovárií čínského křečka
Za účelem zjištění, jestli je polypeptid ad exprimován na povrchu buněk ve formě heterodimeru spolu s CD18, byly buněčné linie postrádající jak ad, tak CD18, přechodně a stabilně transfekovány molekulami cDNA kódujícími tyto jednotlivé řetězce.
Pro tyto experimenty byla, způsobem popsaným v Příkladu 7, k cDNA kódující ad přidána další vedoucí sekvence a Kozákova konvenční sekvence, a celý tento konstrukt byl zaklonován do expresívního vektoru pcDNA3. Výsledným konstruktem, označeným pATM.Dl2, společně s modifikovaným komerčně dostupným vektorem pDCl.CD18 kódujícím lidský CD18, byly kotransfekovány buňky ovárií čínského křečka (CHO) deficientní v aktivitě dihydrofolát reduktázy (DHFR)-. Plazmid pDCl.CDl8 kóduje markér DHFR+ a transfekované buňky mohou být selektovány za použití vhodného média neobsahujícího příslušný nukleosid. K vytvoření plazmidu pDCl.CDl8 byly použity následující modifikace.
Plazmid pRC/CMV (Invitrogen) je savčí expresívní vektor s promotorem cytomegaloviru a jako selekční markér obsahuje gen pro rezistenci vůči ampicilinu. Gen kódující DHFR z plazmidu pSC1190-DHFR byl vložen na 5' konec počátku repli47 • · · · • 9 • · ·· · ···· • · * · · ·· ···· · • · ··«· · · e ···· * ·· ·· ·· 99 kace SV40 ve vektoru pRC/CMV. Navíc byl do plazmidového konstruktu pRC/CMV/DHFR zaligován, na 3' konec genu pro DHFR, polylinker z 5' oblasti plazmidu pHF2G-DHF. Následně byly do vzniklého plazmidu zaklonovány, mezi oblast polylinkeru na 5' konci a oblast poly-A sekvence bovinního růstového hormonu, kódující sekvence pro CD18.
Povrchová exprese polypeptidu CD18 byla analyzována průtokovou cytometrií za použití monoklonální protilátky TS1/18. Tvorba heterodimerů mezi ad a CD18 u této buněčné linie byla v souladu s údaji získanými imunoprecipitací popsanou v Příkladu 10 při přechodné expresi buněk COS.
Příklad 12
Lidský ad se váže na molekulu ICAM-R a tato vazba je závislá na přítomnosti CD18
Vzhledem k publikovaným údajům, které prokazují interakce mezi integriny leukocytů a mezibuněčnými adhezivními molekulami (ICAM), které zprostředkovávají kontakt buňkabuňka [Hyneš, Cell 69:11 až 25 (1992)], byla schopnost buněk CHO exprimujících ad/CDl8 vázat ICAM-1, ICAM-R nebo VCAM analyzována dvěma metodami.
V opakovaných stanoveních byly rozpustné fúzní proteiny ICAM-1, ICAM-R nebo VCAM s IgGl imobilizovány na povrchu plastu, a byla stanovována schopnost buněk COS transfekovaných plazmidy kódujícími ad/CD18 vázat se k těmto imobilizovaným ligandům. Transfekované buňky byly intracelulárně označeny pomocí kalceinu, promyty vazebným pufrem (RPMI s 1% BSA) a inkubovány buď v samotném pufru (s nebo bez přítomnosti 10 ng/ml PMA) nebo v pufru s monoklonálními protilátkami namířenými proti CD18 v koncentracích 10 pg/ml.
Transfekované buňky byly umístěny do čtyř 96-ti jamkových mikrotitračních destiček Immulon s jamkami předem potažený48 • · · · • · · · · · · · · • · · · » · · · · · 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 99 9 9 99 mi rozpustnými fúzními proteiny ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM-1/IgGl nebo hovězím sérovým albuminem (BSA) jako negativní kontrolou. Rozpustné formy těchto adhezivních molekul jsou dokonale popsány v dosud nevyřízené Patentové přihlášce US č. 08/102852 (stejného vlastníka) podané 5. srpna 1993. Před přidáním značených buněk byly jamky blokovány roztokem 1% BSA v PBS. Po promytí destiček, prováděným ponořením destiček na 20 minut do roztoku 0,1% BSA v PBS, byla za použití přístroje Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA) měřena celková fluorescence v každé jamce.
V experimentech s imobilizovanými molekulami ICAM vykazovaly buňky kotransfekované plazmidy kódujícími ad/CD18 v jamkách s ICAM-R/IgGl, ve srovnání s jamkami potaženými BSA, 3 až 5 násobně vyšší intenzitu vazby. Specifita této vazby a její závislost na přítomnosti CD18 byla prokázána inhibičními účinky protilátky TS1/18 namířené proti CD18. Buňky transfekované plazmidy kódujícími CDlla/CDl8 vykazovaly 2 až 3 násobně vyšší intenzitu vazby v jamkách s ICAM1/IgGl pouze když byly tyto buňky předem vystaveny působení PMA. Působení PMA na buňky transfekované ad/CD18 nemělo na intenzitu fluorescence v jamkách potažených ICAM-1/IgGl nebo ICAM-R/IgGl žádný vliv. Nebyla detekována žádná vazba buněk transfekovaných ad/CD18 na jamky potažené VCAM1/IgGl.
Vazba buněk, transfekovaných ad/CD18, k rozpustným fúzním proteinům ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM-1/IgGl byla stanovována průtokovou cytometrií. Na každé měření byl ve 100 μΐ vazebného pufru (RPMI a 1% BSA), s nebo bez přítomnosti protilátky namířené proti CD18 v koncentraci 10 pg/ml, rozsuspendován přibližně 1 milion buněk CHO transfekovaných ad/CD18 (kultivovaných za účelem vyšší exprese v lahvích s míchadlem - spinner flask). Po 20 minutové inkubaci při pokojové teplotě byly buňky promyty vazebným
pufrem a byly k nim přidány fúzní proteiny ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl na výslednou koncentraci 5 pg/ml. Navazování probíhalo 30 minut při 37 °C a poté byly buňky třikrát promyty a rozsuspendovány ve 100 μΐ vazebného pufru obsahujícího ve zředění 1:100 ovčí protilátku namířenou proti lidskému IgGl konjugovanou s FITC. Po 30 minutové inkubaci byly vzorky třikrát promyty a rozsuspendovány ve 200 μΐ vazebného pufru a analyzovány na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson.
Přibližně 40 až 50% buněk transfekovaných ad/CD18 vázalo ICAM-R/IgGl, ale nebyla pozorována žádná vazba na proteiny ICAM-1/IgGl a VCAM-1/IgGl. Vystavení transfekovaných buněk předběžnému působení PMA nemělo žádný vliv na vazbu ad/CD18 k proteinům ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM1/IgGl, což odpovídá stanovením prováděným s imobilizovanými proteiny. Při vystavení buněk transfekovaných ad/CD18 působení protilátky TS1/18 namířené proti CD18, byla intenzita vazby k ICAM-R/IgGl snížena na hodnoty pozadí.
Data získaná z obou těchto stanovení ilustrují skutečnost, že ocd/CDl8 se přednostně váže k molekule ICAM-R (ve srovnání s vazbou k ICAM-1 nebo VCAM-1). Upřednostňování vazby ad/CD18 k ICAM-R oproti vazbě k ICAM-1 je v protikladu ke skutečnostem zjištěným pro CDlla/CDl8 a CDllb/CDl8. Můžeme tudíž očekávat, že modulace vazby ad/CD18 může selektivně ovlivnit normální a patologické funkce imunitního systému, v nichž hraje molekula ICAM-R prominentní roli. Navíc výsledky podobných stanovení, při kterých byla testována schopnost protilátek, specificky namířených proti různým extracelulárním doménám proteinu ICAM-R, inhibovat vazbu na buňky transfekované ad/CD18, naznačují, že heterodimery ad/CD18 a CDlla/CD18 interagují s odlišnými doménami polypeptidu ICAM-R.
• ·
Nemožnost detekovat v roztoku vazbu CDlla/CD18 k fúzním proteinům ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl naznačuje, že afinita vazby mezi heterodimerem CDlla/CDl8 a ICAM-1 nebo ICAM-R je příliš nízká na to, aby umožnila vazbu těchto molekul v roztoku. Detekce vazby heterodimeru ad/CDl8 k fúznímu proteinu ICAM-R/IgGl nicméně naznačuje neobvykle vysokou hodnotu afinity.
K testování vazby mutantu proteinu ICAM-R, označeného E37A/Ig, na buňky CHO exprimující heterodimer ad/CD18 byla adheze analyzována s využitím FACS, postupem popsaným výše. Bylo prokázáno, že E37A/Ig se neváže k chimérickému proteinu LFA-l/Ig [Sadhu a další, Cell Adhesion a Communication 2: 429 až 440 (1994)]. Tento mutantní protein byl ve své rozpustné formě produkován stabilně transfekovanou buněčnou linií CHO a byl purifikován na koloně ProsepA postupem popsaným v publikaci Sadhu a další, viz. výše.
V opakovaných pokusech nebyla detekována vazba proteinu E37A/Ig na buňky transfekované ad/CD18. Intenzita fluorescence v hlavním píku (MFI - mean fluorescence intensity) chimérického proteinu E37A/Ig, detekovaná s využitím protilátky namířené proti lidskému IgGl konjugované s FITC, byla totožná s MFI naměřenou u samotné protilátky, což naznačuje, že při použití mutantního proteinu E37A/Ig není v tomto experimentu detekován žádný signál převyšující hodnoty pozadí. Podobně při analýze prováděné metodou ELISA, postupem popsaným v Příkladu 14, se mutantní E37A/Ig nejspíš nevázal na imobilizovaný ad/CD18.
Vazba polypeptidu ad k proteinu iCb3
Komponenta komplementu označovaná C3 může být proteolyticky štěpena, čímž dojde k vytvoření komplexu iC3b, který iniciuje aktivaci alternativní cesty aktivace komplementu, jejíž výsledkem je buněčně zprostředkované zničení cíle.
·· ··· · • · · · · · ···· • · ·· · ···· • · ·· · ·· ···· · • · ···· ··· ·· ·» · · · · · «· ··
Jak CDllb tak CDllc se mohou účastnit vazby k iCb3 a následné fagocytózy částic obalených komplexem iCb3. Jako místo interakce s komplexem iCb3 byl nedávno identifikován peptidový fragment domény I v polypeptidu CDllb [Ueda a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 91:10680 až 10684 (1994)]. Oblast odpovědná za vazbu iCb3 je v polypeptidech CDllb, CDllc a ad velmi konzervativní, což naznačuje existenci vazebné interakce ad/iCb3.
Vazba polypeptidu ad k iCb3 byla analyzována „růžicovým testem [Dana a další, J. Clin. Invest. 73:153 až 159 (1984)] za použití transfekovaných buněk nebo buněčných linií přirozeně exprimujících polypeptid ad (například buňky HL60 stimulované pomocí PMA). Za přítomnosti nebo v nepřítomnosti monoklonální protilátky namířené proti CD18 (například protilátky TS1/18.1) byla srovnávána schopnost buněk CHO transfekovaných ad/CD18, buněk CHO transfekovaných VLA-4 (negativní kontrola) a buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA (pozitivní kontrola), vytvářet „růžice.
Příklad 13
Testování prováděné technikami SPA
Inhibitory specificky inhibující vazbu mezi ligandy ad podle vynálezu a jejich vazebnými partnery (páru ligand ad/anti-ligand) mohou být analyzovány nejrůznějšími způsoby, například technikami SPA popsanými v Patentové přihlášce US č. 4271139, publikacích Hart a Greenwald, Mol. Immunol. 12:265 až 267 (1979) a Hart a Greenwald, J. Nuc.
Med. 20:1062 až 1065 (1979).
Stručně řečeno, jeden člen z dvojice ligand ad/antiligand je přímo nebo nepřímo navázán na pevný nosič. Nepřímá vazba může být zprostředkována monoklonální protilát52 kou přímo navázanou na pevnou podložku, přičemž tato protilátka rozpoznává specifický epitop na C-konci rozpustného β řetězce integrinů. Tímto epitopem by mohl být buď hemaglutinin nebo mykobakteriální epitop IIIE9 [Anderson a další, J. Immunol. 141:607 až 613 (1988)]. Na nosič je přímo navázána také fluorescenční látka. Jinou možností může být inkorporace fluorescenční látky přímo v pevném nosiči, jak je popsáno v Patentové přihlášce US č. 4568649. Ten člen dvojice ligand ocd/anti-ligand, který není navázán na nosič, je označen radioaktivní sloučeninou, která emituje záření schopné excitovat fluorescenční agens. V případě, kdy ligand váže radioaktivně značený anti-ligand, se radioaktivní značka dostane dostatečně blízko k fluoroforu navázanému na nosič a může tento fluorofor excitovat a vyvolat tím světelnou emisi. Jestliže nedochází k vazbě, je radioaktivní značka obvykle příliš vzdálená od pevného nosiče, aby byla schopna excitovat fluorescenční agens a intenzita emitovaného světla je nízká. Emitované světlo je měřeno a korelováno s vazbou mezi ligandem a anti-ligandem. Přidání inhibitoru vazby ke vzorku způsobí snížení emise světla fluoroforem tím, že zabrání navázání radioaktivní značky v blízkosti pevného nosiče. Inhibitory vazby mohou být tudíž identifikovány měřením jejich vlivu na emisi světla fluoroforem ve vzorcích. Podobně mohou být rovněž identifikovány anti-ligandy polypeptidu ad.
Při testování modulátorů vazby CAM prováděnými postupem zmíněným níže je při SPA použit rozpustný rekombinatní konstrukt ad/CD18 s leucinovým zipem (viz. Příklad 14). Tento rekombinatní integrin je pomocí neblokující protilátky namířené proti podjednotce a nebo proti podjednotce β imobilizován na destičce předem pokryté fluorescenční látkou. Sloučeniny chemické knihovny a biotinylovaný chimérický protein CAM/Ig jsou na destičku přidány současně. Vazba chimérického proteinu CAM/Ig je detekována pomocí radioak53 • · · · · · • · • · « • · • · • · · · » · ·· ·· tivně značeného streptavidinu. V tomto stanovení jsou chimérické proteiny ICAM-l/Ig a ICAM-3/Ig biotinylovány pomocí kitu NHS-Sulfo-biotin LC (dlouhý řetězec, Pierce) postupem doporučeným výrobcem. Takto označené proteiny stále reagují s protilátkami specificky namířenými proti CAM a s využitím metody ELISA může být ukázáno, že reagují s imobilizovaným proteinem LFA-1. Detekce je prováděna s využitím konjugátu Strepavidin-HRP a následným obarvením s využitím OPD.
Jinou možností je přímé navázání purifikovaňého nebo částečně purifikovaňého rekombinatního leucinového zipu na destičku předem pokrytou fluorescenční látkou. Sloučeniny chemické knihovny a neznačený chimérický protein CAM/Ig jsou na destičku přidány současně. Navázaný CAM/Ig je detekován protilátkou namířenou proti lidskému Ig označenou » 125 izotopem I.
Ještě jinou možností je imobilizovat na scintilační destičku purifikovaný protein CAM/Ig. Poté jsou na destičku přidány sloučeniny chemické knihovny a koncentrovaný supernatant z buněk exprimujících rekombinatní integrin typu leucinového zipu. Vazba tohoto rekombinatního integrinů je detekována pomocí značené neblokující protilátky namířené proti podjednotce α nebo proti podjednotce β.
Příklad 14
Expresivní konstrukty rozpustného lidského polypeptidů aa
Exprese nezkráceného rozpustného lidského heterodimeru ocd/CD18 poskytuje lehce purifikovatelný materiál, použitelný k imunizaci a vazebným studiím. Výhodou vytvoření rozpustného proteinu je skutečnost, že tento protein může být purifikován ze supernatantů a nemusí se purifikovat z lyzátů buněk (jako nezkrácený heterodimer ad/CD18 vázaný na ·· »· • · · · • · ·♦ membránu); tento protein je tedy získán snadněji a s menším zastoupením nečistot.
Expresivní plazmid kódující rozpustný ad byl vytvořen následovně. Štěpením restrikčními enzymy HindlII a AatlI byl z plazmidu pATM.D12 izolován nukleotidový fragment odpovídající oblasti bází 0 až 3161 v SEK. ID. Č.: 1. S využitím primerů sHAD.5 a sHAD.3, zobrazených jako SEK. ID.
Č.: 30 a 31, byl z plazmidu pATM.D12 reakcí PCR amplifikován fragment odpovídající oblasti bází 3130 až 3390 v SEK. ID. Č.: 1. Sekvence tohoto fragmentu se překrývá se sekvencí fragmentu získanou štěpením restrikčními enzymy HindlII/AatlI a na 3' konci obsahuje navíc restrikční místo Mlul.
5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (SEK. ID. Č.: 30)
5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3' (SEK. ID. Č.: 31 )
Produkt získaný amplifikaci prováděnou PCR byl rozštěpen restrikčními enzymy Aatl a Mlul a zaligován s fragmentem získaným štěpením restrikčními enzymy HindlII/AatlI. Získaný produkt byl zaligován do plazmidu pDC.l.s rozštěpeného restrikčními enzymy HindlII/MluI.
Tento konstrukt byl ve stabilně transfekovaných buňkách CHO exprimován společně s rozpustným proteinem CD18 a exprese byla detekována autoradiografickou vizulizací imunoprecipitovaných komplexů CD18 získaných z buněk označených 35S-methioninem. Tento konstrukt byl rovněž spolu s CD18 exprimován v buňkách 293 [Berman a další, J. Cell. Biochem. 52:183 až 195 (1993)].
·· ····
Rozpustný nezkrácený konstrukt ad
Vynález se rovněž týká alternativních expresívních konstruktů pro ad. K usnadnění exprese a purifikace intaktního heterodimeru ocd/CD18 budou zkonstruovány expresivní plazmidy kódující rozpustný ocd a CD18. Polypeptidy kódované těmito plazmidy budou obsahovat fúzní sekvenci leucinového zipu, která bude v průběhu purifikace tento heterodimer stabilizovat [Chang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 91: 11408 až 11412 (1994)]. Stručně řečeno, DNA kódující aminokyselinové řetězce tvořené kyselými a zásaditými aminokyselinami tvořícími leucinový zip byly vytvořeny připojením promerů za použití oligonukleotidů popsaných v publikaci Chang a další. Sekvence DNA byly dále modifikovány tak, že do nich byly na 5' a 3' koncích zavedeny restrikční místa Mlul (5' konec) a Xbal (3' konec). Tato modifikace slouží k usnadnění zaklonování těchto sekvencí do expresívních konstruktů pro CD18 nebo ad popsaných dříve. Ke zmíněným sekvencím DNA byly rovněž připojeny sekvence kódující hemaglutinin nebo polyhistidin a za restrikční místo Xbal byl vložen stop kodon. Sekvence kódující hemaglutinin nebo polyhistidin byly vloženy za účelem usnadnění afinitní purifikace exprimovaného proteinu. Do expresívního vektoru kódujícího CD18 jsou vloženy sekvence kódující řetězec leucinového zipu tvořený bazickými aminokyselinami; do konstruktu kódujícího řetězec ocd je vložena sekvence kódující řetězec leucinového zipu tvořený kyselými aminokyselinami. Předpokládá se, že po expresi modifikovaných proteinů ad a CD18 v hostitelských buňkách, bude interakce mezi řetězcem tvořeným bazickými aminokyselinami a řetězcem tvořeným kyselými aminokyselinami stabilizovat tento heterodimer a umožní izolaci intaktní molekuly ad/CD18 metodou afinitní purifikace popsanou výše.
φφ φφφφ
Φ· ···· φφ φ» • * · ΦΦ Φ ΦΦΦΦ • · ΦΦΦ Φ · ·· • · ·· · ΦΦ ΦΦ·· Φ • · Φ··· Φ·· »··· · Φ » ΦΦ ΦΦ ΦΦ
Byly zkonstruovány plazmidy pro expresi rozpustného ad a CD18 s „leucinovým zipem tvořeným sekvencemi kódujícími kyselé a bazické aminokyseliny, a těmito plazmidy byly, metodou využívající DEAE/Dextran popsanou v Příkladu 7, transfekovány buňky COS. Vzniklý protein byl označen jako ad/CD18LZ. Transfekované buňky byly po dobu 14 dnů kultivovány v médiu se sníženým obsahem séra (2%). Supernatanty z transfekovaných buněk byly sbírány každý pátý den, a metodou ELISA popsanou v Příkladu 8, v nich byla analyzována produkce proteinů. Stručně řečeno, heterodimer ad/CD18LZ byl imobilizován na destičkách povlečených monoklonální protilátkou 169B namířenou proti ad (viz. Příklad 15). Komplex ad/CD18LZ byly detekován přidáním biotinylované monoklonální protilátky namířené proti CD18 (TS1/18.1, viz.
Příklad 8) s následným přidáním konjugátu streptavidin/křenová peroxidáza (HRP) a o-fenyldiaminu (OPD). V supernatantech byla detekována přítomnost těchto proteinů.
Vazebné studie prováděné za použití nezkráceného expresívního produktu ad
Funkční vazebné analýzy s rozpustným nezkráceným heterodimerem ad/CD18LZ, popsaným výše, byly prováděny při imobilizaci heterodimeru na destičky potažené monoklonální protilátkou 169B nebo neblokující monoklonální protilátkou namířenou proti CD18 (viz. Příklad 15). K zamezení nespecifických vazeb byly jamky, před přidáním chimérických proteinů CAM/Ig (viz. Příklad 12) v počáteční koncentraci 10 pg/ml, blokovány pomocí želatiny získané z rybí kůže. Vazba zmíněných chimérických proteinů k heterodimeru ad/CDl8LZ byla detekována prostřednictvím konjugátu HRP s kozí protilátkou namířenou proti lidskému Ig (Jackson Labs) a následným obarvením pomocí OPD.
φφ ···· φφ φ
φφφφ φ φ φ φ φ φ
Φ· ···· ·· φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ
Bylo pozorováno, že VCAM-l/Ig se k imobilizovanému heterodimeru ad/CD18LZ váže 3 až 5-krát intenzivněji než k imobilizovanému heterodimeru CDlla/CDl8. Molekuly ICAM-l/Ig a ICAM-2/Ig poskytují při vazbě na rozpustný heterodimer CDlla/CDl8 15-krát resp. 10-krát intenzivnější signál (ve srovnání s pozadím), ale nevážou se na heterodimer ad/CD18LZ. Vazba VCAM-1 byla, za přítomnosti kombinace protilátek 130K a 130P specificky namířených proti VCAM-1, snížena přibližně o 50%.
Vazebné studie byly rovněž prováděny na 96-ti jamkových destičkách s imobilizovaným proteinem ICAM/Ig a následným přidáním rozpustného rekombinatního integrinů přítomného v buněčném supernatantu. Vazba rozpustných integrinů byla detekována pomocí neznačené neblokující myší protilátky namířené proti řetězci a nebo β, a následnou inkubací s kozí protilátkou specificky namířenou proti myším Ig konjugovanou s HRP a obarvením s využitím OPD.
Získané výsledky naznačují, že naměřená hodnota při vazbě ocd/CD18LZ k ICAM-R/Ig, detekované pomocí neblokující protilátky, byla 10-krát vyšší než tomu bylo v kontrolních jamkách neobsahujících žádnou protilátku. Nebyla detekována vazba rozpustného heterodimeru ad/CD18 k imobilizovanému ICAM-l/Ig, ale naproti tomu byla detekována vazba mezi ad/CD18LZ a imobilizovanými heterodimery CDllb/CD18 a CDlla/CD18 15-krát (CDllb/CDl8) a 5-krát (CDlla/CDl8) vyšší než byly hodnoty pozadí.
Jelikož předchozí studie prokázaly, že molekuly CDllb a CDllc vážou lipopolysacharid (LPS) [Wright, Curr. Opin. Immunol. 3:83 až 90 (1991); Ingalls a Golenbock, J. Exp. Med. 181:1473 až 1479 (1995)], byla, pomocí průtokové cytometrie a stanovení prováděných na titračních destičkách, rovněž analyzována vazba LPS na heterodimer ad/CD18. Získané výsledky ukazují, že LSP, značený FITC, izolovaný z mikroor58 • fl · · · ·
ganizmů S. Minnesota a S. typhosa (oba získány od firmy Sigma) se v koncentraci 20 pg/ml slabě vázal na buňky CHO transfekované ad/CD18. U netransfekovaných buněk CHO nebyla detekována žádná vazba. Při stanoveních prováděných metodou ELISA se biotinylovaný LPS [Luk a další, Alan. Biochem. 232:217 až 224 (1995)] v množství 0,5 až 3,0 pg vázal k imobilizovanému heterodimeru ocd/CD18 a poskytoval čtyřikrát větší signál, než tomu bylo v jamkách se samotnou protilátkou a blokujícím agens. Zdánlivá vazba LPS na CDlla/CD18 byla, po odečtení hodnot pozadí (vazba protilátky TS2/4 namířené proti CDlla), nevýznamná.
Aby bylo možné identifikovat další ligandy pro ad/CDl8, je rekombinatní protein ad/CD18LZ použit ve dvou provázaných studiích. Za účelem stanovení, které buňky na svém povrchu exprimují ligandy pro ad, je analyzována vazba různých typů buněk na imobilizovaný protein. Následně je využita inhibice vazby s využitím protilátek, s jejichž pomocí je možné stanovit, které známé povrchové adhezivní molekuly jsou odpovědné za pozorovanou vazbu buněk. Jestliže není pozorována žádná inhibice, je při pokusu o identifikaci ligandu využita koimunoprecipitace heterodimeru ad/CD18LZ navázaného na proteiny(které budou vázat ad) z lyžovaných buněk.
Expresívní konstrukty kódující doménu I rozpustného lidského polypeptidu ad
Již dříve bylo publikováno, že doména I v molekule CDlla může být exprimována jako nezávlislá strukturní jednotka, která si udržuje schopnost vázat ligandy a schopnost být rozpoznávána protilátkami [Randi a Hogg, J. Biol. Chem. 269:12395 až 12398 (1994); Zhout a další, J. Biol. Chem. 269:17075 až 17079 (1994); Michishita a další, Cell 72:857 ···· ·· · · • · · · · · • · · · · · • ·· ···· · až 867 (1993)]. Za účelem vytvoření rozpustného fúzního proteinu skládajícího se z domény I polypeptidů ad a lidského IgG4, byla pomocí PCR amplifikována sekvence kódující doménu I polypeptidů ad. K této PCR reakci byly použity primery, které, kvůli usnadnění klonování, přidávají na konce sekvence restrikční místa BamHI a Xhol. Tyto primery jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 32 a 33 a restrikční místa jsou zde podtržena.
5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3' (SEK. ID. Č. : 32)
5'-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3' (SEK. ID. Č.: 33)
Nukleotid C nacházející se v SEK. ID. Č.: 32 na 3' konci vedle restrikčního místa BamHI odpovídá nukleotidu 435 v SEK. ID. Č.: 1; nukleotid G nacházející se v SEK. ID. Č.:
na 3 konci vedle restrikčního místa Xhol odpovídá nukleotidu 1067 v SEK. ID. Č.: 1. Amplifikovaná doména I je rozštěpena odpovídajícími restrikčním! enzymy a purifikovaný fragment je zaligován do savčího expresívního vektoru pDCs a prokaryotického expresívního vektoru pGEX-4T-3 (Pharmacia) a fragment domény I je sekvenován. Fúzní protein je následně exprimován v buňkách COS, CHO nebo E. coli transfekovaných nebo transformovaných odpovídajícím expresívním konstruktem.
Vzhledem k afinitě polypeptidů ad k ICAM-R, může mít exprimovaná doména I polypeptidů ad dostatečnou afinitu, aby mohla být použita jako inhibitor buněčné adheze, při níž aktivně participuje polypeptid ad.
• · ···· • * · »
c · · »
Analýza fúzního proteinu tvořeného doménou I lidského ad/IgG4
Protein byl rozdělen pomocí SDS-PAGE v redukujících a neredukujících podmínkách a vizualizován barvením stříbrem nebo barvením Coomassie. Následně byl protein přenesen na membrány Immobilon PVDF a analyzován pomocí monoklonálních protilátek namířených proti lidskému IgG nebo monoklonálních protilátek namířených proti bovinnímu IgG.
U detekovaných proteinů bylo stanoveno, že v neredukujících podmínkách migrují se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 120 kD a redukujících podmínkách migrují se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 45 kD. Na gelu z elektroforézy prováděné v neredukujících podmínkách byly rovněž detekovány méně intenzivní proužky se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 40 až 50 kD, které reagovaly s protilátkami namířenými proti lidskému IgG, ale nereagovaly s protilátkami namířenými proti bovinnímu IgG. Méně intenzivní proužek o zdánlivé molekulové hmotnosti 200 kD byl metodou Western Blot detekován jako bovinní Ig.
Vazebné studie prováděné za použití expresívních produktů domény I
Metodou ELISA byla testována schopnost domény I specificky rozpoznávat chimérický protein ICAM-R/IgG. Jednotlivá sériová ředění fúzního proteinu IgG4 a domény I polypeptidu ad (Iad/IgG4) v TBS byla inkubována s ICAM-l/IgG, ICAMR/IgG, VCAM-l/IgG nebo IgGl proteinem (produkovaným buňkami myelomu) imobilizovanými na destičkách Immulon IV pro RIA/EIA. Jako negativní kontroly byly použity chimérický protein domény I CDlla/IgG a lidský myelomový protein IgG4/kappa. Navázaný IgG4 byl detekován prostřednictvím biotinylované monoklonální protilátky HP6023 namířené proti • 4 4 4 ·4 *4 4444
IgG4 s následným přidáním konjugátu streptavidin-peroxidáza a barvením za použití substrátu o-fenyldiaminu.
V opakovaných stanoveních nebyla detekována vazba mezi proteinem CDlla/IgG4 nebo myelomovým proteinem IgG4 a kterýmkoliv z imobilizovaných proteinů. Protein Iad/IgG4 se nevázal na lidský IgGl, ICAM-1/IgGl nebo blokující agens, jako želatinu z rybí kůže nebo bovinní sérový albumin. Za použití proteinu Iad/IgG4 v koncentracích 1 až 5 pg/ml byla v jamkách povlečených ICAM-R/IgG detekována, ve srovnání s pozadím, dvoj- až třínásobně vyšší intenzita signálu. Intenzita signálu v jamkách povlečených VCAM-I/IgG byla 7 až 10 vyšší než pozadí. V předchozích stanoveních se buňky CHO transfekované ad/CD18 nevázaly na VCAM-I/IgG, což naznačuje, že vazba VCAM-I může být charakteristická pro aminokyselinovou sekvenci izolované domény I.
Další konstrukty domény I polypeptidů ad
Další konstrukty domény I polypeptidů ad byly vytvořeny stejným způsobem jako předchozí konstrukt s výjimkou toho, že zde bylo, kolem domény I polypeptidů ad, začleněno více aminokyselin. Tyto specifické konstrukty obsahují: i) sekvence z exonu 5 (aminokyseliny 127 až 353 v SEK. ID. Č.:
2), umístěné před doménou I; ii) opakování motivu EF-hand (motiv v oblastech odpovědných za vazbu vápennatých iontů) (aminokyseliny 17 až 603 v SEK. ID. Č.: 2) umístěné za doménou I; iii) řetězec alfa ukončený v transmembránové oblasti (aminokyseliny 17 až 1029 v SEK. ID. Č.: 2) spolu s IgG4 použitým pro purifikaci a detekci. Tyto konstrukty jsou zaligovány jak do savčího expresívního vektoru pDCSl, tak do prokaryotického expresívního vektoru pGEX-4T-3 (Pharmacia) a doména I je sekvenována. Fúzní proteiny jsou následně exprimovány v buňkách COS, CHO nebo E. coli transformovaných nebo transfekovaných příslušnými expresívními • 41 β ·
4 9 9 konstrukty. Proteiny jsou purifikovány na koloně ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, England) a je testována jejich reaktivita s monoklonální protilátkou HP6023 namířenou proti IgG4. Tyto proteiny jsou na polyakryalmidovém gelu obarveny pomocí Coomassie.
Aby bylo možné zkonstruovat expresívní plazmid kódující kompletní polypeptid ad, je plazmid pATM.Dl2 (popsaný výše) modifikován následujícím způsobem tak, aby z něj bylo možné exprimovat fúzní protein ad/IgG4. DNA kódující IgG4 je pomocí PCR za použití primerů, které závádějí na 5' konec restrikční místo AatlI (SEK. ID. Č.: 89) a na 3' konec restrikční místo Xbal (SEK. ID. Č.: 90), izolována z vektoru pDCSl.
5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3' (SEK. ID. Č.: 89) 5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK. ID. Č.: 90)
Plazmid pATM.D12 je rozštěpen restrikčními enzymy AatlI a Xbal a rozštěpený a purifikovaný produkt PCR reakce,
IgG4, je zaligován do linearizovaného vektoru.
Příklad 15
Produkce protilátek specificky namířených proti lidskému ad
A. Produkce monoklonálních protilátek
1. Přechodně transfekované buňky z Příkladu 7 byly třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem podle Dulbecca (D-PBS) a v PBS injikovány, v množství 5 χ 106 buněk/myš spolu s 50 pg/myš muramyl dipeptidázy (Sigma), do myší Balb/c. Myši byly injikovány stejným způsobem dvakrát ve dvoutýdením intervalu. Preimunizační séra a séra z imunizovaných myší byly testovány s využitím FACS, jak je popsáno v Příkladu 9, a slezinné buňky z myší s nejvyšší reaktivitou proti buňkám transfekovaým ad/CD18, • · « · • · · · • · • · · » · ·»·· • · ·· · · · ···· · • · · · · · · · · ····!> ·· · · * · · * byly použity k fúzi. Supernatanty z kultur hybridomů byly jednotlivě testovány za účelem zjištění, jestli nereagují s buňkami COS transfekovanými pomocí CDlla/CD18 a rovněž, jestli reagují s buňkami kotransfekovanými expresívními plazmidy kódujícími polypeptidy ad a CD18.
Tímto postupem se nepodařilo připravit žádné monoklonální protilátky.
2. Jako alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl použit postup, při kterém byl rozpustný fúzní protein domény I polypeptidů ad/IgG4 afinitně purifikován ze supernatantu stabilně transfekovaných buněk COS, a byl použit k imunizaci myší Balb/c, jak je popsáno výše. Byly vytvořeny hybridomy a supernatanty získané při kultivaci těchto hybridomů byly metodou ELISA testovány za účelem zjištění reaktivity proti fúznímu proteinu domény I polypeptidu ad. Pozitivní kultury byly následně analyzovány za účelem zjištění, jestli reagují s nezkrácenými komplexy ad/CD18 exprimovanými na povrchu transfekovaných buněk CHO.
Myš 1908 byla nejprve třikrát imunizována buňkami CHO transfekovanými ad/CD18 a následně pak dvěma posilovacími dávkami, obsahujícími rozpustný heterodimer ad/CD18. Dávky pro poslední dvě imunizace obsahovaly rovněž fúzní protein doména I polypeptidů ad/IgG4 v množství 50 pg/myš. Výsledkem těchto imunizací bylo 270 jamek, ve kterých hybridomy produkovaly protilátky proti IgG. Pomocí metody ELISA bylo stanoveno, že supernatanty ze 45 jamek vykazovaly přinejmenším 7-krát silnější vazbu k fúznímu proteinu Iad/IgG4 než k samotnému lidskému IgG. Analýzou s využitím FACS bylo zjištěno, že žádný z těchto supernatantů nereaguje s buňkami CHO transfekovanými ocd/CD18.
Za účelem zjištění, jestli jsou protilátky v těchto supernatantech schopny rozpoznávat alfa podjednotku integrinu v jiném kontextu, byly pomocí supernatantů (ze 24 z celko64 ·· ··
vého počtu 45 jamek) označeny čerstvě zmrazené řezy sleziny. Tři supernatanty poskytly pozitivní reakci: jeden obarvil velké buňky červené pulpy, zatímco další dva obarvily buňky roztroušené v červené pulpě a rovněž v trabekule.
U těchto supernatantu byla dále analyzována jejich schopnost imunoprecipitovat biotinylované komplexy CD18 buď z buněk CHO transfekovaných ad/CDl8 nebo buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA. K dalšímu pasážování byly vybrány jamky, ve kterých byly přítomny supernatanty reagující s proteiny z lyzátů získaných působením detergentů (tyto proteiny by neměly mít tak definované struktury jak je tomu u proteinů exprimovaných jako heterodimery). Monoklonální protilátky, které rozpoznávají proteiny v detergentů, mohou být užitečnější při imunoprecipitaci heterodimerních komplexů z transfekovaných buněk, tkání a buněčných linií.
3. Jako další alternativa pro produkci monokionálních protilátek byl použit postup, při kterém byly z lyzátů lidské sleziny, pomocí monoklonální protilátky 23F2G namířené proti CD18, imunoprecipitovány komplexy CD18; této imunoprecipitaci předcházelo odstranění komplexu CDlla/CD18 (pomocí monoklonální protilátky TS2/4) a komplexu
CDllb/CD18 (pomocí monoklonální protilátky Mo-1). Pět myší Balb/c, starých 10 až 12 týdnů, bylo imunizováno subkutánní injikaci přibližně 30 pg proteinu, připraveného postupem popsaným výše, v kompletním Freundově adjuvans. Tato imunizace byla provedena v 0. dni a poté následovaly imunizace dvěma posilovacími dávkami obsahujícími 30 pg imunogenu/myš v nekompletním Freundově adjuvans, které byly prováděny 28. a 43. den. Deset dní po poslední imunizaci byla myším odebrána krev a u získaných sér zředěných v poměru 1:500 byla metodou Western Blot stanovována reaktivita vůči imunogenům, v množstvích 1 pg/dráha. Séra ze tří myší detekovala proužky odpovídající proteinům o molekulové hmotnosti přibližně 95 a 150 kD; ve drahách, ve kterých byla k detekci použita séra ve z neimunizovaných myší zředění 1:50, nebyl • · • · detekován žádný signál. Předpokládalo se, že proužek o velikosti 150 kD reprezentuje in vivo glykosylovaný polypeptid ad. Všechna séra získaná z imunizovaných myší navíc imunoprecipitovala s proteinem z lyzátů biotinylovaných buněk CHO transfekovaných ocd/CDl8, který při SDS elektroforéze na polyakrylamidovém gelu migroval s molekulovou hmotností odpovídající heterodimeru. Na základě těchto výsledků byla vybrána myš #2212 a tato myš byla dále imunizována intraperitoneální injekcí obsahující 30 pg imunogenu v PBS (prováděná ve dni 64). Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena a z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina.
Suspenze jednotlivých slezinných buněk byla vytvořena rozmělněním tkáně mezi dvěmi namraženými podložními sklíčky ponořenými do média RPMI 1640 bez přítomnosti séra s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilinu v koncentraci 100 jednotek/ml a streptomycinu v koncentraci 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčné sítko Nitex o velikosti ok 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát promyta centrifugaci při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla následně rozsuspendována ve 20 ml média RPMI bez přítomnosti séra. Thymocyty ze tří myší Balb/c (neimunizovaných) byly připraveny obdobným způsobem.
Myelomy NS-1, udržované po tři dny před fúzí v log fázi v médiu RPMI s obsahem 10% fetálního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne. Logan, Utah), byly centrifugovány při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla dvakrát promyta, postupem popsaným výše, a buňky byly spočítány. Přibližně 1,15 x 108 slezinných buněk bylo smícháno s 5,8 χ 107 buněk NS-1, zcentrifugováno a supernatant byl odstraněn. Peleta byla poklepem uvolněna ode dna kyvety. K buněčné peletě byly, za stálého míchání po dobu jedné minuty, přidávány 2 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufru 75mM HEPES o pH=8,0) zahřátého na teplotu 37°C. Následně bylo k buněčné • · · · suspenzi přidáno 14 ml média RPMI bez přítomnosti séra a suspenze byla míchána po dobu 7 minut. Následoval přídavek 16 ml média RPMI a buňky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 200xg. Supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve 200 ml média RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 0,4 mM aminopterin, 16 mM thymidin (HAT) (Gibco), IL-6 o koncentraci 25 jednotek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 χ 106 thymocytů/ml. Suspenze byla rozdělena do 10-ti 96-jamkových (s plochým dnem) destiček pro tkáňové kultury (Corning, Velká Británie) v objemu 200 μΐ/jamka a buňky byly vyživovány 4., 5., 6. a 7. den odebráním 100 μΐ média z každé jamky 18G-jehlou (Becton Dickinson) a přidáním 100 μΐ čerstvého média, popsaného výše, ale s IL-6 v koncentraci 10 jednotek/ml a neobsahujícího thymocyty.
až 10 dní po fúzi byly supernatanty z každé jamky testovány metodou ELISA, na přítomnost myších IgG. Čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při teplotě 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším imunoglobulinům IgA, IgG nebo IgM (Organon Teknika) v množství 50 μΐ/jamku, zředěnou v poměru 1:5000 v uhličitanovém pufru o pH=9,6. Destičky byly třikrát promyty pufrem PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a bylo do nich přidáno 50 μΐ supernatantu získaného z buněčných kultur. Po inkubaci probíhající 30 minut při teplotě 37°C a promytí, postupem popsaným výše, byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou namířená proti myšímu IgG(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěná v poměru 1:3500 v roztoku PBST. Destičky byly inkubovány, postupem popsaným výše, a čtyřikrát promyty roztokem PBST. Ihned potom bylo přidáno 100 μΐ substrátu, který obsahoval o-fenylendiamin v koncentraci 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 ve 100 mM citrátovém pufru o pH=4,5. Barevná reakce byla po 5 minutách zastavena přídavkem 50 μΐ 15% H2SO4.
• · · ·
Absorbance byla stanovována při vlnové délce 490 nm na čtečce destiček firmy Dynatech.
Hybridomy byly dále charakterizovány následovně. Supernatanty získané kultivací klonů produkujících IgG byly analyzovány průtokovou cytometrií, zda-li jsou reaktivní vůči buňkám CHO transformovaným ad/CD18 a přitom nejsou imunoreaktivní vůči buňkám JY (linie B-buněk exprimující LFA-1, ale ne jiné integriny β2) . Tato skutečnost byla pozorována v předchozích experimentech). Stručně řečeno, 5 x 105 buněk CHO transformovaným ad/CD18 nebo ad/CD18“ buněk JY bylo rozsuspendováno v 50 μί média RPMI obsahujícího 2% FBS a 10 mM NaN3 (pufr pro FACS). Do jamek na 96-ti jamkových destičkách (s jamkami s kulatým dnem) (Corning) byly k 50 μί supernatantů, získaných z klonů hybridomů produkujících IgG, přidány jednotlivé suspenze buněk. Po 30 minutové inkubaci na ledu byly buňky dvakrát zcentrifugovány (a promyty), jednotlivé supernatanty byly odstraněny a pelety byly rozsuspendovány ve 200 až 300 μί pufru pro FACS. Poslední promývací roztok byl nahrazen konjugátem fragmentu F(ab')2 ovčí protilátky namířeným proti myšímu IgG (H+L)-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) v objemu 50 μί/jamka zředěného v poměru 1:100 v pufru pro FACS. Po inkubaci, prováděné postupem popsaným výše, byly buňky dvakrát promyty PBS modifikovaným podle Dulbacca (D-PBS) doplněným 10 mM NaN3, a nakonec rozsuspendovány v B-PBS obsahujícím 1% paraformaldehyd. Následně byly vzorky přeneseny do polystyrénových zkumavek pro analýzu průtokovou cytometrií (FACS) a analyzovány na analyzátoru FACscan firmy Becton Dickinson.
Výsledkem fúze bylo vytvoření čtyř buněčných kultur, které splňovaly obě kritéria. Když byl přibližně po čtyřech dnech prováděn u supernatantů sekundární screening, tři ze čtyř kultur zůstaly pozitivní. Kultury z těchto tří jamek, označené 169A, 169B a 169D byly dvakrát až třikrát úspěšně pasážovány vždy dvojnásobným zředěním v médiu RPMI obsahu68 • · · · ·· ··· · * « · · · · · · · · • · ··· · · ·· • · · · · · · ♦··· · • · · · · · ··· « · · · · ·· ·· ·· ·♦ jícím 15 % FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 16 mM thymidin a IL-6 o koncentraci 10 jednotek/ml. Po čtyřech dnech byly jamky na destičkách vizuálně zhodnoceny a v jamkách s nejmenším počtem kolonií byl určen počet těchto kolonií. Po 7 až 10 dnech byly kultury ve vybraných jamkách z každého pasážování analyzovány s využitím FACS. U dvou těchto kultur, 169A a 169B, byla detekována aktivita. Při posledním pasážování byly kolonie z pozitivně reagujících jamek (přítomna vždy jedna v jamce) rozrosteny v médiu RPMI s 11% FBS. U protilátek ze supernatantu klonů 169A a 169B byl za použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupem doporučeným výrobcem, stanovován jejich izotyp. Bylo zjištěno, že se jedná o protilátky izotypu IgGl.
Při terciálním testování specifity těchto protilátek bylo využito precipitace s komplexy ad/CDl8 získanými z transfekovaných buněk CHO a buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA. Protilátky produkované hybridomy 169A a 169B precipitovaly s proužky o odpovídající velikosti (u proteinů z linií CHO) a precipitovaly rovněž s jedním typem řetězce a o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 až 160 kD z buněk HL60. Tato skutečnost byla stanovena pomocí SDS-PAGE. Hybridomy 169A a 169B byly 31. května 1995 uloženy v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 a bylo jim přiděleno přístupové číslo HB11907 (169A) a HB11906 (169B).
Aby bylo možné lépe charakterizovat vazebné vlastnosti protilátek 169A a 169B, byla u každé z těchto protilátek testována jejich schopnost inhibovat vazbu druhé protilátky nebo protilátky TS1/18.1 namířené proti CD18 k rozpustnému heterodimerů ad/CD18. Rozpustný nezkrácený heterodimer ad/CD18 byl pomocí každé z těchto protilátek (neznačených) jednotlivě imobilizován na 96-ti jamkové destičce a k detekci proteinu, navázaného prostřednictvím stejné nebo odlišné neznačené protilátky, byly použity protilátky označe69 · · ·
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 ·· ··· · • · · · · · · · ···· · ·· 99 99 99 né biotinem. Vazba byla detekována za použití konjugátu kozí protilátka namířená proti myším Ig/HRP s následným barvením substrátem OPD. Získané výsledky naznačují, že protilátka 169A byla schopna blokovat vazbu biotinylovaných protilátek 169A a TS1/18.1, zatímco protilátka 169B blokovala pouze vazbu sebe samotné.
4. Jiná z myší (#2214), imunizovaná stejným postupem jako myš #2212, byla 70. den dále imunizována pomocí 30 pg purifikovaného polypeptidu ad, získaného z lyzátu sleziny, v PBS. Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena a z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina.
Fúze a selekce pozitivně reagujících buněk byla prováděna postupem popsaným výše. Výsledkem fúze byl vznik pěti hybridomů produkujících monoklonální protilátky proti ad, které byly označeny 170D, 170F, 170E, 170X a 170H. Za použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupem doporučeným výrobcem, byl stanoven izotyp těchto protilátek a bylo zjištěno, že se jedná o protilátky izotypu IgGl.
5. Jiná z myší (#2211), imunizovaná stejným postupem jako myši #2212 a #2212, byla 88. den dále imunizována pomocí 30 pg imunogenu a 203. den proběhla, s využitím 30 pg imunogenu, další imunizace. Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena, z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina a fúze buněk proběhla postupem popsaným výše. Supernatant získaný při kultivaci hybridomů byl testován metodami ELISA a průtokovou cytometrií, jak je detailně popsáno v předchozích odstavcích.
Pomocí metody ELISA bylo identifikováno 15 potitivně reagujících klonů hybridomů označených 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R a 188T. U těchto klonů byl rovněž stanoven izotyp produkovaných protilátek. Stručně řečeno, čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším IgA, G, M (Organon Teknika) zředěnou v poměru 1:5000 v 50 mM uhliči70 • · tanovém pufru, pH 9,6, v objemu 50 μΐ/jamka. Destičky byly po dobu 30 minut při 37°C blokovány pomocí 1% BSA v PBS, třikrát promyty v PBS/0,05 % Tween 20 (PBST) a do jamek bylo přidáno 50 μΐ supernatantu získaného při kultivaci hybridomů (zředěného v poměru 1:10 v PBS). Po inkubaci a promytí, prováděném postupem popsaným výše, bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ králičí protilátky (konjugované s křenovou peroxidázou) namířené proti myším IgGi, IgG2a nebo IgG3 (Zymed, San Francisco, California), zředěné v poměru 1:1000 v PBST s 1% normálním kozích sérem. Destičky byly inkubovány postupem popsaným výše, čtyřikrát promyty pomocí PBST a poté bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ substrátu obsahujícího 1 mg/ml o-fenyldiaminu (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 ve 100 mM citrátovém pufru, pH 4,5. Barvení bylo zastaveno po 5 minutách přídavkem 50 μΐ 15% H2SO4. Na čtečce destiček (Dynatech) byla při vlnové délce 490 nm odečítána intenzita a bylo zjištěno, že všech 15 protilátek jsou protilátky izotypu IgGl.
Zbylé slezinné buňky z myši #2211 byly zmrazený v kryozkumavce a skladovány v kapalném dusíku. Obsah této kryozkumavky byl rozmražen umístěním kryozkumavky do vodní lázně o teplotě 37°C a třepáním do chvíle, kdy buňky právě roztály. Buňky byly přeneseny do centrifugační zkumavky o objemu 15 ml a po jednom mililitru k nim bylo přidáváno teplé médium RPMI obsahující 11% FBS. Mezi jednotlivými přídavky média byly tří až pětiminutové intervaly. Bylo přidáno dalších 5 ml teplého média RPMI a po pětiminutovém stání byla zkumavka centrifugována po dobu 5 minut při 200xg, a supernatant byl odstraněn. Buňky byly rozsuspendovány v RPMI a fúze byla provedena postupem popsaným výše. Supernatant získaný při kultivaci hybridomů byl testován metodami ELISA a průtokovou cytometrií, postupem popsaným výše.
Výsledkem fúze byl vznik pěti klonů označených 195A,
195C, 195D, 195E a 195H. U těchto klonů byl metodou ELISA, postupem popsaným výše, stanoven jejich izotyp; bylo zjiš71 « · • · · · · ·
těno, že monoklonální protilátky 195A, 195C, 195D a 195E jsou protilátky izotypu IgGi a monoklonální protilátka 195H je protilátka izotypu IgG2a.
6. Aby byly získány protilátky schopné inhibovat funkční vazbu polypeptidu ad, byl k imunizaci použit rozpustný ad/CDl8LZ (viz. Příklad 14). Tento protein byl izolován ze supernatantu získaného při kultivaci přechodně transfekovaných buněk COS na nosiči pro afinitní chromatografii, a jako imunogen byl použit polypeptid ad navázaný na nosič. Vybraná myš byla imunizována postupem popsaným výše a poslední posilovači dávka jí byla podána dva týdny po první imunizaci. Imunizace prováděná tímto postupem zamezuje možným změnám v konformaci proteinu, které jsou často spojeny s lýzou buněk prováděnou prostřednictvím detergentu. Další myši byly imunizovány pomocí rekombinatního proteinu, rovněž navázaného na nosič, ale tyto myši nebyly na počátku imunizovány proteinem purifikovaným z lyzátu buněk.
Hybridomy, získané postupem popsaným výše, které jsou výsledkem imunizace, byly testovány metodou ELISA na rekombinatních proteinech izolovaných z buněčných supernatantu za použití Fab fragmentů neblokující protilátky. Jinou možností testování je využití průtokové cytometrie pro stanovení reaktivity proti buňkám JY, které byly předem transformovány cDNA kódující ad.
7. Jinou možností je produkce monoklonálních protilátek následujícím způsobem. K imunizaci myší Balb/c, prováděné postupem popsaným výše, byl použit heterodimerní protein ocd/CD18, purifikovaný afinitní chromatografii z lyzátů stabilně transfekovaných buněk CHO, spolu s muramyl dipeptidázou v koncentraci 50 pg/ml. Předtím, než byla imunoprecipitací biotinylovaných komplexů z transfekovaných buněk CHO stanovována reaktivita séra proti ad/CD18, byly myši, ze kterých bylo toto sérum získáno, třikrát imunizovány. Z pozitivně reagujících zvířat byly, pomocí standardních tech72 • « · · •· 4 4 44 ·· 44
4 · · · · · ·· 4 4 4 4 4 44 · 44 4 4 4 44 4 4 4
4 4 4 4 4 4 4 4
444 4 4 44 4 4 44 4 4 nik, získány linie hybridomů. Následně byly tyto hybridomy kultivovány a pak selektovány pomocí průtokové cytometrie, za použití buněk transfekovaných ad/CD18. Buňky transfekované CDlla/CD18 byly využity jako kontrola pro identifikaci protilátek reagujících pouze s CD18.
8. Jako další alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl využit postup, při kterém byl u myší Balb/c použit protokol imunizace/imunosuprese, který byl navržen tak, aby byla snížena reaktivita vůči imunogenním determinantům transfekovaných buněk CHO, použitých k imunizaci.
Tento protokol využívá imunizaci prováděnou pomocí netransfekovaných buněk CHO a následné zničení B-buněk (ve stadiu blastů) reaktivních vůči CHO buňkám, kterého je dosaženo působením cyklofosfamidu. Po třech kolech imunizace a následného zničení reaktivních B-buněk přídavkem cyklofosfamidu jsou myši imunizovány pomocí buněk transfekovaných ad/CD18, postupem popsaným výše.
9. Jinou alternativou je postup, při němž jsou, postupem popsaným výše, lyzáty buněk HL60 stimulovaných pomocí PMA (získané působením detergentu) obohaceny o frakci komplexů CD18. Na stejných sloupcích jsou odstraněny jiné integriny β2. Imunizace pomocí získaných komplexů, produkce hybridomů a jejich testování jsou prováděny postupy popsanými výše.
B. Produkce polyklonálního séra
K vytvoření polyklonálního antiséra v organizmu králíků byl použit purifikovaný chimérický protein doména I polypeptidu ad/IgG4 (Příklad 14). Na počátku byl antigen doména I polypeptidu ad/IgG4 injikován do organizmu králíků v kompletním Freundově adjuvans v množství 100 pg/králík, a poté následovaly tři posilovači dávky, obsahující stejné množství proteinu v nekompletním Freundově adjuvans. Po třetí a čtvrté imunizaci byly analyzovány vzorky krve. Krá73 ··»* •0 0000 • 0 0 0 0 •000 0 00 liči imunoglobulin (Ig) byl ze séra purifikován na koloně Sepharóza-protein A a na koloně lidský IgG/Affigel 10 byl zbaven frakce namířené proti lidskému IgG. K potvrzení dokonalého odstranění frakce namířené proti lidskému IgG byla využita metoda ELISA, při které bylo testováno, že sérum nereaguje s lidským IgG, ale pouze s částí chimérického proteinu odpovídající doméně I.
Takto předčištěné polyklonální sérum bylo použito k imunoprecipitaci proteinů z lyzátů buněk CHO, které byly na povrchu biotinylovány, a které byly předem transfekovány expresívními vektory kódujícími ad a CD18. Imunoprecipitace byla prováděna postupem popsaným v Příkladu 10. Toto předčištěné sérum rozpoznávalo proteinový komplex o stejné molekulové hmotnosti jakou měl komplex precipitovaný pomocí monoklonální protilátky TS1.18 namířené proti CD18. Při analýze komplexů CD18 získaných z buněk CHO transfekovaných pomocí ad/CD18, prováděné metodou Western Blot, rozpoznávalo toto sérum jeden proužek odpovídající velikosti. Králičí polyklonální sérum nerozpoznávalo afinitně purifikované integriny CDlla/CD18, CDllb/CD18 a protein VLA4 z lidské sleziny. Jak bylo stanoveno průtokovou cytometrií, toto sérum rovněž v roztoku nereagovalo s buňkami CHO transfekovanými ad. Bylo tudíž usouzeno, že polyklonální králičí sérum je schopno rozpoznávat pouze denaturované proteiny domény I polypeptidů ad/IgG4.
Při pokusu o izolaci polyklonálního séra proti ad/CD18 byla myš třikrát imunizována pomocí buněk CHO transfekovaných ad (D6.CHO, ad/CD18) spolu s adjuvantním peptidem, a jednou byla imunizována purifikovaným heterodimerem ad/CD18. Poslední posilovači dávka obsahovala pouze heterodimer ccd/CD18. Přídavkem asi 108 buněk CHO transfekovaných LFA-1 (na dobu 2 hodin při 4°C) bylo přibližně 100 μΐ séra získaného z imunizované myši předčištěno. U takto upravené74 * · · · ·· ·· ·· ·· ho séra byla, v ředěních 1/5000, 1/10000, 1/20000 a 1/40000, analyzována, na buňkách lidské sleziny, reaktivita vůči polypeptidú ocd. Tato polyklonální protilátka byla reaktivní v ředění 1/20000, zatímco při ředění 1/40000 byly buňky barveny velmi slabě.
Příklad 16
Analýza distribuce polypeptidú ad
Pomocí polyklonálního séra, vytvořeného postupem popsaným v Příkladu 15, byla stanovována tkáňová distribuce komplexu ad/CD18.
K imunocytochemickým analýzám zmrazených řezů lidské sleziny byla purifikovaná králičí polyklonální protilátka použita v koncentracích v intervalu 120 ng/ml až 60 pg/ml. Řezy o tloušťce 6 mikrometrů byly umístěny na podložní sklíčka Superfrost Plus (VWR) a skladovány při -70°C. Před použitím byla sklíčka vyjmuta z -70°C a na 5 minut umístěna do teploty 55°C. Následně byly řezy po dobu 2 minut fixovány acetonem a vysušeny na vzduchu. Řezy byly po dobu 30 minut při pokojové teplotě blokovány v roztoku obsahujícím 1% BSA, 30% normální lidské sérum a 5% normální králičí sérum. Na každý řez byla aplikována primární protilátka při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Nenavázaná protilátka byla odstraněna trojnásobným promytím sklíček v TBS (po dobu 5 minut). Dále byla na každý řez nanesena králičí protilátka namířená proti myšímu IgG ve stejném pufru TBS. K detekci sekundární protilátky byla použita 30 minutová inkubace (při pokojové teplotě) s myší protilátkou namířenou proti alkalické fosfatáze značenou alkalickou fosfatázou (APAAP). Následně byly sklíčka třikrát promyty v pufru TBS. Poté byl přidán substrát Fast Blue (Vector Labs) a barvení bylo zastaveno ponořením sklíčka do vody. Sklíčka byla dobarvena pomocí Nuclear Fast Red (Sigma) a před ukotvením pomocí • fl fl··· flfl flflflfl • · flfl · · · · · • · · · · flfl · · · · · • fl · · · · ··· flflflfl · flflflfl flflflfl
Aqua Mount (Baxter) promyta vodou. V červené pulpě sleziny bylo detekováno barvení při použití této protilátky, ale ne při použití králičího polyklonálního Ig (proti jiným proteinům) nebo při použití nepurifikovaného séra získaného ze stejného jedince před imunizací.
Jakmile byla jednou u myšího séra stanovena specifická reaktivita vůči ad, byl toto sérum použito ke značení různých lymfoidních a nelymfoidních tkání. V totožných experimentech byly jako kontroly využity monoklonální protilátky rozpoznávající polypeptidy CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Značením řezů z normální sleziny prováděným pomocí polyklonálního séra proti ad, a pomocí monoklonálních protilátek proti CD18, CDlla, CDllb a CDllc, byly získány tyto výsledky. Distribuce markéru pozorovaná při použití polyklonálního séra proti ad byla odlišná od distribuce značky namířené proti polypeptidům CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Existuje odlišná distribuce značky u některých buněk umístěných v hraniční zóně bílé pulpy a odlišná distribuce značky u periferních buněk hraniční zóny. Taková distribuce nebyla pozorována při použití jiných protilátek. Jednotlivé buňky roztroušené v červené pulpě byly rovněž označeny. Tyto buňky mohou, ale nemusí, být ze stejné populace nebo podskupiny jako buňky označené pomocí protilátek proti CDlla a CD18.
Značení protilátkou proti CDllc obarvilo nějaké buňky v hraniční zóně, ale nebyl pozorován, ve srovnání s použitím polyklonálního séra proti ad, zřetelný kruh kolem bílé pulpy. Rovněž distribuce značky v červené pulpě neodpovídala distribuci značky při použití polyklonálního séra proti ad.
Distribuce značky pozorovaná při použití polyklonálního séra proti ad byla tudíž jediněčná ve srovnání s distribucí pozorovanou při použití protilátek proti jiným integrinům β2 CDlla, CDllb, CDllc a CD18). Tyto výsledky naznačují, že • · · · ·· · ·· · ···· • · ··· · · · · • · · · »4 * · · · · • · · · · · ··»
999 9 9 99 99 9 9 9 9 in vivo distribuce polypeptidů ad v organizmu člověka, je odlišná od distribuce jiných integrinů β2.
Charakterizace exprese lidského polypeptidů ad prováděná pomocí monoklonálních protilátek
Při analýze exprese lidského polypeptidů ocd prováděné imunocytochemicky na zmrazených tkáňových řezech a pomocí průtokové cytometrie na buněčných liniích a leukocytech periferního krevního oběhu, byly použity protilátky sekretované hybridomy 169A a 169B. V obou experimentech byly supernatanty získané kultivací hybridomů použity v nezředěné formě.
Značení tkání
Veškeré značení, kromě značení řezů jater prováděné podle protokolu popsaného dále, bylo prováděno postupem popsaným výše. Po fixaci acetonem byly řezy po dobu 15 minut při pokojové teplotě promyty v roztoku 1% H2O2 a 1% azidu sodného v TBS. Po označení primární protilátkou byla nářezy na 30 minut při pokojové teplotě aplikována králičí protilátka namířená proti myšímu IgG konjugovaná s peroxidázou. Řezy byly třikrát promyty v pufru TBS. Za účelem detekce sekundární protilátky byla použita inkubace s prasečí protilátkou (konjugovanou s peroxidázou) namířenou proti králičí protilátce, prováděná při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Řezy byly následně třikrát promyty v pufru TBS, byl k nim přidán substrát AEC (Vector Labs) a reakce byla ponechána probíhat. Řezy byly dobarveny Hematoxylinem Gill č. 2 (Sigma) a následně, před vysušením a ukotvením, byly promyty vodou.
V řezech ze sleziny byla většina exprese lokalizována v červené pulpě sleziny, a to na buňkách morfologicky odpoví77
4 • 4 •
• 4 4 4
4 4 4
4 4 «4 44
4444 dajících granulocytům a makrofágům. Označeno bylo velké množství granulocytů, zatímco signál poskytla jenom část z makrofágů. Pomocí protilátek proti ad bylo slabě obarveno malé množství folikulárních dendritických buněk přítomných v bílé pulpě. Barvení pomocí protilátek proti CDlla a CD18 poskytlo signál jak v červené, tak v bílé pulpě. Barvení pomocí protilátek proti CDllc bylo výraznější u velkých buněk přítomných v bílé pulpě sleziny (předpokládá se, že jde o makrofágy) a v hraniční zóně obklopující bílou pulpu; byla rovněž pozorována difúzně rozptýlená značka v červené pulpě. Zdá se, že distribuce polypeptidu CDllb v červené pulpě se překrývá, ale není identická, s distribuci ad, ale není pozorována distribuce CDllb v bílé pulpě.
Byla srovnávána exprese integrinů v normální a (revmatoidní) arthritické tkáni synovia. Ve zdravé (normální) tkáni byla, při značení jakoukoliv protilátkou namířenou proti integrinů (včetně protilátek specificky imunoreaktivních vůči CDlla, CDllb, CDllc, CD18 a také ad) , pozorována minimální odezva s distribucí značky na rezidentních buňkách, převážně makrofázích. U zanícené tkáně byla exprese všech integrinů více lokalizovaná, a to na buňkách nahloučených kolem lymfatických cév. Zatímco distribuce exprese ad a CDllb byly podobné, ukázalo se, že polypeptid CDllc není exprimován v tak velké míře, a jeho exprese je omezena pouze na podskupinu leukocytů.
U tkáňových řezů z jater psa byla na jaterních makrofázích, neboli Kuppferových buňkách, pozorována exprese CDllb, ale ne exprese polypeptidu ad. Značení řezů z jater „zdravých lidí (prováděné postupem popsaným pro značení řezů ze psích jater, viz. výše) potvrdilo konzervovanost distribuce této značky u člověka. Navíc zde byla detekována nízká hladina exprese CDllc. V řezech z jater pacientů postižených hepatitidou byla intenzita značky pro všechny ·· ···· ·· ···· ·· ♦ · • · · ·· · ···· ·· ··· ···· • · · · · ······· • · ···· ··· ···· · ·· ·· ·· ·· leukointegriny vyšší, než tomu bylo u „normálních jater, zatímco na povrchu granulocytů a makrofágů byla v těchto vzorcích detekována exprese polypeptidu ad.
Při barvení pomocí protilátek proti ad bylo u řezů z tlustého střeva zdravích lidí pozorováno jen nevýrazné barvení; byla pozorována slabá intenzita značky na buňkách hladkého svalstva a leukocytech. U řezů získých z pacientů postižených Crohnovou chorobou byla detekována zvýšená hladina exprese všech leukointegrinů.
Na řezech z plic zdravých jedinců bylo pozorováno omezené množství buněk pozitivních na přítomnost ad; tyto buňky odpovídaly morfologicky makrofágům a neutrofilům. U tkáňových řezů z plic pacietů postižených rozedmou byl výskyt značky proti ad pozorován u neutrofilů a makrofágů obsahujících hemosiderin, což je pigment obsahující železo. Tato skutečnost naznačuje pohlcení červených krvinek těmito buňkami .
Exprese integrinů byla rovněž analyzována na tkáňových řezech mozku zdravých jedinců a tkáňových řezech z lézi z pacientů postižených roztroušenou sklerózou (MS - multiple sclerosis). Ve tkáňových řezech ze zdravých jedinců bylo barvení ad méně intenzivní než barvení CDlla, CDllb a CDllc, a toto barvení bylo omezeno na buňky, morfologicky a přítomností CD68, odpovídající mikrogliálním buňkám. Buňky exprimující CDllb byly situovány v místech obklopujících cévy a rozptýleny ve tkáni. CDllc+ buňky byly situovány uvnitř cév, zatímco ad+ buňky obklopovaly tyto cévy. Ve tkáňových řezech z mozku pacientů postižených MS byla exprese polypeptidu ad nalezena jak na mikrogliálních buňkách, tak na části leukocytů jiných než makrofágů; ad + buňky byly situovány uvnitř lézi a rovněž v kortexu těchto lézí. Signál pro ad měl stejnou intenzitu jako signál pro • ·
CDllc, ale jeho intenzita byla nižší než u signálu pro CDllb.
Pomocí protilátek proti leukointergrinů a CAM byly analyzovány vzorky tkáňových řezů jak hrudní aorty tak břišní aorty z PDAY (Pathobiologické Determinanty Atherosklerózy u mladých lidí; LSU Medical Center). Zkoumané léze odpovídaly atherosklerotickým plátům, které pod intimou obsahovaly agregáty velkých pěnových buněk (převážně makrofágů nacpaných lipidy) a infiltrované menší leukocyty. Studie, při kterých byly samostatně použity protilátky specificky namířené proti ccd nebo jiným a řetězcům integrinů β2 (CDlla, CDllb a CDllc) spolu s protilátkou proti markéru makrofágů (CD68), odhalily, že většina makrofágů „nacpaných lipidy exprimovala ad a CD18v průměrné hladině, zatímco exprese CDlla byla slabá a exprese CDllc byla v rozmezí slabá až střední. CDllb byl exprimován velmi slabě, a to pouze na části makrofágů.
Za účelem zjištění relativní lokalizace antigenu ad a ICAM-R, byly na řezech aorty provedeny studie, při kterých bylo použito současného značení dvěmi značkami. Jelikož pěnové buňky v těchto řezech byly značeny protilátkou Ham 56, specificky namířenou proti markéru makrofágů, ale nebyly značeny protilátkami proti aktinu buněk hladké svaloviny, byly stanoveno, že pěnové buňky nebyly odvozeny od subintimálních buněk hladké svaloviny. CD68+ makrofágy exprimující ad byly obklopeny malými leukocyty exprimujícími ICAM-R; tyto leukocyty byly rovněž přítomny mezi CD68+ makrofágy exprimujícími ad. Zdálo se, že existuje omezené množství malých leukocytů, které neexprimují CD68, ale jsou značeny jak protilátkami proti ad, tak protilátkami proti ICAM-R.
Distribuce polypeptidů ad na leukocytech přítomných ve tkáních zdravých jedinců se překrývala, ale nebyla identická, s distribucí CDllb a CDllc, dvěma dalšími a řetězci leukointegrinů, které byly již dříve charakterizovány jako řetězce, jejichž exprese je omezena na leukocyty. Buněčná morfologie naznačila, že značkou namířenou proti ad jsou barveny především makrofágy a granulocyty, a v omezené míře lymfocyty. Obecně lze říci, že zánět ve tkáni zvyšuje, spolu s výskytem vyšší intenzity značení leukointegrinů, množství i počet typů leukocytú pozorovaných v příslušné tkáni. Jelikož buněčná a prostorová distribuce leukointegrinů nebyla v patologických tkáních identická, bylo odvozeno, že každý člen rodiny integrinů, včetně ocd, má, v daném kontextu, odlišné funkce a ligandy.
Zajímavé je, že exprese polypeptidů ad v atherosklerotických lézích byla výraznější než exprese CDlla, CDllb a CDllc, což naznačuje, že ocd může hrát klíčovou úlohu ve vytváření těchto lézí. Společná distribuce ad + a ICAM-R+ buněk, podpořená důkazy naznačujícími možnost interakce mezi ad a ICAM-R naznačuje, že polypeptid ocd může, v časných stádiích těchto lézí, hrát úlohu při infiltraci leukocytú nebo při jejich aktivaci.
Značení buněčných linií a leukocytú periferní krve
Buněčná linie promyeloidních monocytů HL60 značená protilátkami 169A a 169B byla analyzována s využitím FACS. Exprese ocd na povrchu těchto buněk je negativně ovlivněna stimulací pomocí PMA, který indukuje diferenciaci po makrofágové dráze, ale není ovlivněna stimulací DMSO, který indukuje diferenciaci po dráze granulocytů [Collins a další, Blood 70:1233 až 1244 (1987)]. Distribuce značky byla (v analýze s využitím FACS) za použití protilátek 169A a 169B při stimulaci buněk pomocí PMA odlišná od distribuce značky získané při použití monoklonálních protilátek namířených proti proti CDllb a CDllc. Buněčná linie monocytů THP-1 je rovněž slabě značena protilátkami 169A a 169B. Navíc část z ·· leukocytů periferní krve spadajících do oblasti (gate) lymfocytů a monocytů se při analýze s využitím FACS jevila jen slabě pozitivní. Část monocytů periferní krve byla slabě značena protilátkami 169A a 169B, zatímco na povrchu Blymfocytů nebyla zjištěna žádná exprese ad. Část CD8 pozitivních T-lymfocytů byl také ad pozitivní. Dále se nepodařilo protilátkami 169A a 169B detekovat antigen na liniích B-buněk JY, Ramos, na linii bazofilů KU812, a na liniích Tbuněk Jurkat, SKW a Molt 16.
Na základě výsledků analýz s buňkami HL60 byly, pomocí gradientově centrifugace s nosičem Ficoll/Hypaque a následnou lýzou červených krvinek, z periferní krve izolovány granulocyty. Všechny izolované preparáty obsahovaly více než 90% PMN (polymorfonukleárních leukocytů), jak bylo zjištěno vizualizací morfologie jader v kyselině octové. Jednotlivé populace byly vystaveny na 30 minut působení 50 ng/ml PMA nebo 108 M formyl peptidu (fMLP) , aby se uvolnily potencionální zásoby integrinů. Nestimulované populace vykazovaly v porovnání s IgGl kontrolou sice nízkou, ale statisticky významnou expresi antigenů 169A a 169B, která po stimulaci rostla. Hladiny exprese ad a CDllc na povrchu polymorfonukleárních leukocytů si odpovídaly více, než tyto hladiny pozorované u buněk HL60. Protilátka 169B byla následně použita k precipitaci heterodimerní molekuly z biotinylovaných PMN lyžovaných detergentem. Podjednotky o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 resp. 95 kD odpovídaly velikosti ad resp. CD18.
Výskyt ocd na PMN nemohl být předpovězen na základě znalosti exprese ccd u psů. Psí neutrofily, na rozdíl od lidských protějšků, exprimují na pomocných T-buňkách markér CD4 a také integrin VLA-4, a tudíž mohou mít v organizmu psů jiné ligandy a funkce, než je tomu u člověka.
• 0 ··· 0 <
Značení subpopulací PBL
Tato studie posloužila k určení distribuce integrinu β2 v leukocytech lidské periferní krve. Kromě toho byla porovnána povrchová hustota ad ve srovnání s jinými integriny β2. Nakonec byla také vyhodnocena okamžitá regulace exprese ocd v purifikovaných lidských eozinofilech.
Leukocyty lidské periferní krve byly izolovány centrifugací v hustotním gradientu a rozděleny do frakce mononukleárních buněk (obsahující monocyty, lymfocyty a bazofily) a do frakce granulocytů (neutrofily a eozinofily) [Warner a další, J. Immunol. Meth. 105:107-110 (1987)]. Pro některé experimenty byly eozinofily purifikovány imunomagneticky na čistotu větší než 95% použitím CD16 [Hansel a další, J. Immunol. Meth. 122:97-103 (1989)]. Kožní žírné buňky byly enzymaticky odděleny z lidské kůže a namnoženy, jak bylo popsáno dříve [Lawrence a další, J. Immunol. 139:3062-3069 (1987)].
Buňky byly značeny vhodnými ředěními monoklonálních protilátek specificky namířených proti CDlla (MHM24), CDllb (H5A4), CDllc (BU-15) nebo proti ad (169A). Jako kontrola byl zařazen myší IgGl. Buňky byly promyty a pak inkubovány s kozí protilátkou namířenou proti myším IgG konjugovanou s fykoerythrinem. V některých pokusech byly buňky inkubovány v nadbytku myšího IgG a myší monoklonální protilátky nebo kozí polyklonální protilátky, které byly značeny FITC, specifické pro antigen konkrétní buňky (například CD3, CD4 nebo CD8 pro T-buňky; CD16+ lymfocyty pro NK buňky; anti-IgE pro bazofily) [Bochner a další, J. Immunol. Meth. 125:265271 (1989)]. Pak byly tyto vzorky zkoumány průtokovou cytometrií (Coulter EPICS profil) za použití vhodného gatingu, aby mohly být identifikovány podskupiny buněk.
V experimentech s lidskými eozinofily byla zkoumána okamžitá aktivace exprese ocd. Buňky byly stimulovány 15 minut při 37°C esterem forbolu (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) • · · φ
[Schall, Cytokine 3:165-183 20 (1991)] nebo interleukinem IL-5 (10 ng/ml), a potom byly značeny různými monoklonálními protilátkami, jak je popsáno výše.
Výsledky ukázaly, že polypeptid ad byl přítomen na všech eozinofilech, bazofilech, neutrofilech, monocytech a NK-buňkách periferní krve. Také malý podíl (přibližně 30%) CD8+ lymfocytů vykazoval expresi ad. Kožní žírné buňky a CD4+ Íymfocyty podjednotku ad neexprimovaly. Obecně jsou CDlla a CDllb přítomny na leukocytech ve vyšší hustotě než ocd. Podjednotka ad je exprimována na relativně nízké hladině podobné hladině exprese CDllc. U leukocytů je polypeptid ccd s největší hustotou exprimován na monocytech a CD8+ buňkách, zatímco eozinofily mají úroveň exprese ocd nejnižší. Hladina exprese na neutrofilech, bazofilech a NK-buňkách je střední.
Aktivace eozinofilů periferní krve vyvolaná působením CC-chemokinu RANTES nezpůsobuje změnu v expresi žádného z integrinů β2. Působení esteru forbolu mělo nicméně za následek dvoj- až trojnásobné zvýšení exprese CDllb a ad, avšak neovlivnilo expresi CDlla nebo CDllc. Působením interleukinu IL-5 se selektivně aktivovala exprese podjednotky CDllb, přičemž nebyla ovlivněna hladina exprese jiných integrinových podjednotek.
Získané výsledky ukázaly, že podjednotka ad je u leukocytů periferní krve exprimována v přibližně stejném množství jako podjednotka CDllc. Nejvyšší hladina exprese byla zjištěna na monocytech a populaci CD8+ lymfocytů. Žírné buňky lidské kůže polypeptid ocd neexprimovaly. U purifikovaných eozinofilů byly uvnitř cytoplazmy objeveny předvytvořené zásoby podjednotek CDllb a ad. Z pozorované rozdílné aktivace interleukinem IL-5 oproti PMA se usuzuje, že tyto zásoby podjednotek jsou od sebe odděleny.
• · · · · · • ··· · ·· »· · ·
Distribuce značky u subpopulací leukocytů periferní krve (PBL) byla také určována metodou průtokové cytometrie za použití kombinace gatingu (definování jednotlivých buněčných typů na základě hodnot rozptylu světla měřených v přímém směru a v úhlu 90°) a povrchových značek, jak bylo popsáno výše. Tato metoda byla použita při pokusu přesněji definovat populaci lymfocytů, která neexprimuje 169 A/B.
PBL byly izolovány pomocí Ficollu, postupem popsaným výše, a jednotlivě označeny protilátkami 169A, 169B a monoklonálními protilátkami proti CD14 (značka monocytů a makrofágů), CD20 (B-buňky), CD56 (NK-buňky), receptoru α/β T-buněk (Tbuňky) , CD16 (neutrofily a NK-buňky) a oc4 (negativní markér neutrofilů). Jednotlivé oblasti (gates) byly definovány na základě velikosti buněk a distribuce značek.
Získané výsledky naznačují, že buňky v oblasti (gate) CD14+ monocytů vykazují nízkou hladinu značení protilátkami 169A a 169B. Bimodální distribuce značky pozorovaná v dřívějších experimentech v oblasti (gate) lymfocytů byla rozlišena při zvýšeném rozptylu měřeném v přímém směru. Smíšená populace TCR+/CD20+ buněk vykazovala nízkou, ale homogenní hladinu exprese antigenů pro 169A/B. Populace mapovaná při mírně zvýšeném bočním rozptylu (buněčná komplexita) , která byla pro CD56 z 50% pozitivně označena, se ukázala jasně 169A/B negativní populací. Negativní populace nebyla rovněž rozpoznána pomocí protilátek namířených proti TCR, CD20, CD14 nebo CD16.
Distribuce ad v synoviu
K určení buněčné distribuce polypeptidu ad, dalších integrinů β2 a jejich příslušných receptorů u zánětlivé a nezánětlivé synovie byly použity imunohistologická studie využívající monoklonálni protilátky namířené proti různým integrinům β2 a supergenovým rodinám imunoglobulinů. Exprese • · · · • » « · proteinů byla stanovována v normálních, osteoartritidických a revmatoidních tkáňových kulturách synovií.
Získané výsledky naznačují, že vrstva epitheliálních buněk synovia má vysokou úroveň exprese VCAM-1, CDllb/CD18 a ad/CDl8. V těchto buňkách je omezena exprese CDllc/CD18 a exprese CDlla/CD18 není většinou detekována. Při revmatoidním artritickém zánětu synoviální blány vzrůstá exprese integrinu β2 na synoviálních buňkách úměrně stupni hyperplazie. Mnoství buněk exprimujících CDllc se podstatně zvětšuje, čímž se blíží množství buněk exprimujících CDllb a ad, ale není pozorováno zvýšení exprese CDlla.
V subepitheliálních oblastech tkáně jsou CD3/CDlla/ICAM-R+ lymfocyty, ve formě agregátů a difúzních infiltrátů, roztroušeny mezi CD68/CDllb/ad+ makrofágy. Na vysoký počet agregátů poukazuje intenzivní značení ad, a to hlavně v oblastech bohatých na T-buňky.
Synoviální endotel proměnlivě exprimuje ICAM-1 a ICAM2, s minimálními stopami exprese ICAM-R.
Tyto výsledky dokazují, že synoviální makrofágy a makrofágům podobné synoviální buňky konstitutivně exprimují vysoké množství podjednotek CDllb a ad integrinů β2. Při zánětu synoviální blány dochází, jak v epitheliální tak subepitheliální oblasti, k velkému pomnožení těchto populací buněk, současně s patrným nárůstem v expresi CDllc. Specifické populace revmatoidních synoviálních T-lymfocytů exprimují nejen CDlla a ICAM-R, ale také velké množství ad. Tato molekula, jak bylo ukázáno výše, je exprimována v nízké úrovni na lymfocytech periferní krve.
Příklad 17
Izolace klonů potkaní cDNA
Vzhledem k existenci psích a lidských podjednotek ad byly prováděny pokusy izolovat homologní geny z jiných dru86 • · · · • « · · hů, včetně laboratorních potkanů (tento příklad) a myší (Příklad 17, viz níže).
Částečná sekvence potkaní cDNA vykazující homologii k lidskému genu pro ad, byla získána využitím XgtlO knihovny z potkaní sleziny (Clontech). Knihovna byla vyseta v koncentraci 2 x 104 pfu/miska na LBM/agarových miskách o průměru 150 mm. Knihovna byla přenesena na membránu Hybond (Amersham), denaturována 3 minuty, 3 minuty neutralizována a 5 minut promývána pufry popsanými ve standardním protokolu [Sambrook a další, Molecular Cloning: a laboratory manual, strana 2.110]. Membrány byly okamžitě přeneseny do Stratalinkeru (Stratagene) a DNA zesítěna pomocí autozesíťovacího nastavení. Za účelem dosažení podmínek, při kterých je pro hybridizaci potřebná nízký, resp. vysoký stupeň komplemntarity mezi sondou testovanou sekvencí byly membrány prehybridizovány a hybridizovány v 30% resp. 50% formamidu. Membrány byly na počátku testovány pomocí sondy značené 32P získané z cDNA kódující lidský ccd, odpovídající oblasti od báze 500 do 2100 v klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1). Sonda byla za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označena. Filtry byly promyty v 2x SSC při teplotě 55°C.
Byly identifikovány dva klony, označené 648.3 a 705.1, které vykazovaly sekvenční homologii k sekvenci lidského ctd, lidského CDllb a lidského CDllc. Oba klony odpovídají 3'-oblasti genu pro lidský ad, a začínají od báze 1871 a pokračují až k bázi 3012 u klonu 648.3, resp. od báze 1551 až k 3367 u klonu 705.1.
Pro získání úplnější potkaní sekvence, zahrnující i oblast odpovídající 5' konci, byla, postupem stejným jako u prvního testování, znovu testována stejná knihovna, ale při tomto testování byly použity myší sondy získané z klonu A1160 (viz Příklad 17, viz níže). Pomocí druhého testování
4 4 4 byly vyselektovány jednotlivé izolované plaky, které byly uchovány jako jednotlivé klony na miskách s LBM/agar. K vytvoření DNA použitelné pro sekvenování byly ve standardní PCR reakci použity sekvenační primery 434FL a 434FR (SEK. ID. Č: 34 resp. 35).
5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3' (SEK. ID. Č: 34)
5z-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3z (SEK. ID. Č: 35)
DNA získaná metodou PCR byla purifikována za použití kolony Quick Spin (Qiagen) dle protokolu doporučeného výrobcem.
Byly identifikovány dva klony, označené 741.4 a 741.11, jejichž sekvence se překrývaly se sekvencemi klonů 684.3 a 705.1; v překrývajících se oblastech byly klony 741.4 a 741.11 100% homologní s klony 684.3 a 705.1. Složená potkaní cDNA homologní k lidskému genu pro ad, je zobrazena v SEK. ID. Č: 36; předpovězená aminokyselinová sekvence je uvedena v SEK. ID. Č: 37.
Klonování 5Z konce sekvence kódující potkaní ad
Fragment 5Z konce cDNA pro gen kódující potkaní ad byl získán z potkaní sleziny s využitím klonovacího kitu RACE (Clonetech) postupem doporučeným výrobcem. Použité oligonukleotidy specifické pro tento gen byly označeny 741.11#2R a 741.2#1R (SEK. ID. Č: 59 resp. 58).
5'-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3z (SEK. ID. Č: 59)
5z-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3z (SEK. ID. Č: 58)
Oligonukleotid 741.11#2R zahrnuje báze 131 až 152 v
SEK. ID. Č: 36 v opačné orientaci a oligonukleotid 741.2#1R zahrnuje báze 696 až 715 v SEK. ID. Č: 36 také v opačné orientaci. Primární reakce PCR byla provedena za použití • · · ·
oligonukleotidu 741.2#1R vymezujícího 3' konec kódujícího vlákna (nejblíže 3'-konci). Následná druhá reakce PCR byla provedena za použití oligonukleotidu 741.11#2R a DNA získané z první reakce. Na 1% agarózovém gelu byl detekován proužek o velikosti přibližně 300 párů bází.
Produkt druhé reakce PCR byl, podle protokolu doporučeného výrobcem, zaklonován do plazmidu pCRTAII (Invitrogen). Do každé z 96 jamek (s kulatým dnem) na destičce pro tkáňové kultury byly, do 100 μΐ LBM média obsahujícího 1 μΐ zásobního roztoku karbenicilinu o koncentraci 50mg/ml a 1 μΐ kultury fága M13 K07, přidány bílé (pozitivní) kolonie.
Směs byla inkubována 30 minut až jednu hodinu při teplotě 37°C. Po této inkubaci bylo přidáno 100 μΐ LBM média (obsahující 1 μΐ zásobního roztoku karbenicilinu o koncentraci 50mg/ml a zásobní roztok kanamycinu o koncentraci 10 mg/ml v ředění 1:250) a inkubace pokračovala při teplotě 37°C přes noc.
Sterilní kovovou transferovou vidlicí byl supernatant z 96 jamkové destičky přenesen na čtyři nylonové filtry Hybond (Amersham). Filtry byly denaturovány, neutralizovány a DNA zesítěna podle standardních protokolů. Filtry byly prehybridizovány za stálého třepání ve 20 ml prehybridizačního pufru (5x SSPE; 5x Denhardts; 1% SDS; 50 pg/ml denaturované DNA z lososích spermií) při teplotě 50°C po dobu několika hodin.
Oligonukleotidové sondy 741.11#1 a 741.11#1R (SEK. ID. Č: 56 a 57), zahrnující páry baží 86 až 105 (SEK. ID. Č:
36) v přímé a reverzní orientaci, byly radioaktivně označeny následovně.
5'-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3' (SEK. ID. Č: 56)
5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3' (SEK. ID. Č: 57) • · · · ·
Přibližně 65 ng oligonukleotidové DNA bylo dvě minuty při teplotě 65°C zahříváno ve 12 μΐ dH2O. Do zkumavky byly přidány 3 μΐ 10 mCi/ml γ-32Ρ-ΑΤΡ spolu s 4 μΐ 5x pufru pro kinázu (Gibco) a 1 μΐ DNA kinázy T4 (Gibco). Směs byla inkubována 30 minut při teplotě 37°C. Po skončení inkubace bylo 16 μΐ každé ze značených oligonukleotidových sond přidáno k filtrům v prehybridizačním pufru a inkubace pokračovala při 42°C přes noc. Filtry byly třikrát, po dobu 5 minut při pokojové teplotě, promývány v roztoku 5x SSPE s 0,1% SDS a 6 hodin autoradiografovány. Pozitivní klony byly namnoženy a DNA byla purifikována křtem pro minipreparaci DNA Magie Mini (Promega) podle výrobcem doporučeného protokolu. K sekvenování byl vybrán klon 2F7 a tento klon vykázal, v překrývající se oblasti, 100% homologii ke klonu 741.11. Kompletní potkaní nukleotidová sekvence genu pro ad je zobrazena v SEK. ID. Č: 54; aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 55.
Charakteristiky potkaní cDNA a aminokyselinové sekvence
Nukleotidová ani aminokyselinová sekvence potkaní a podjednotky integrinu β2 nebyly dříve publikovány. Srovnání těchto sekvencí s publikovanými sekvencemi kódujícími podjednotky a lidských integrinů β2 naznačuje, že izolovaný potkaní klon podjednotky ad má velmi podobnou nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci.
Na úrovni sekvence nukleotidů vykazuje izolovaný klon potkaní cDNA 80% shodu ve srovnání s cDNA pro lidský ocd;
68% shodu s cDNA pro lidský CDllb; 70% shodu s cDNA pro lidský CDllc a 65% shodu s cDNA pro myší CDlla.
Na úrovni sekvence aminokyselin vykazuje předpokládaný potkaní polypeptid, kódovaný izolovanou cDNA, 70% shodu v porovnání s lidským polypeptidem ad; 28% shodu s lidskou • · · · · · podjednotkou CDlla; 58% shodu s lidskou podjednotkou CDllb; 61% shodu s lidskou podjednotkou CDllc; 28% shodu s myší podjednotkou CDlla a 55% shodu s myší podjednotkou CDllb.
Příklad 18
Produkce a charakterizace protilátek specificky namířených proti podjednotce ad hlodavců
A. Protilátky namířené proti fúzním proteinům doména I potkaního polypeptidů ocd/HuIgG4
Jelikož bylo dokázáno, že doména I lidského integrinu β2 se účastní vazby ligandů, předpokládalo se totéž pro potkaní protein ad. Imunospecifické monoklonální protilátky proti otd by proto měly být užitečné u potkaních modelů lidských nemocí, při nichž hraje úlohu vazba podjednotky ad.
Oligonukleotidy alfa-DI5 (SEK. ID. Č: 87) a alfa-Dl3 (SEK. ID. Č: 88) byly vytvořeny ze sekvence potkaní ad odpovídají oblasti bází 469 až 493 resp. 1101 až 1125 (v reverzní orientaci) v SEK. ID. Č: 54. Oligonukleotidy byly použity ve standardní PCR reakci k vytvoření fragmentu DNA kódujícího potkaní ad obsahující doménu I v oblasti bází 459 až 1125 v SEK. ID. Č: 54. Produkt PCR byl vklonován do vektoru pCRTAII (Invitrogen) podle výrobcem doporučeného protokolu. Byla vybrána pozitivní kolonie a z její rozrostlé kultury byla, za použití kitu pro izolaci DNA Midi Prep firmy Qiagen (Chatswoth, GA) podle protokolu výrobce, izolována DNA. DNA byla klasicky naštěpena restrikčními enzymy Xhol a BglII. Vzniklý fragment o velikosti 600 bází byl izolován z gelu a následně zaklonován do expresívního vektoru pDCSl/HuIgG4. Pozitivní kolonie byly selektovány a namnoženy, a za použití kitu pro izolaci DNA Maxi firmy Quiagen z nich byla purifikována DNA.
·· ····
Buňky COS byly v poloviční konfluenci vysety na misky o průměru 100 mm a kultivovány přes noc při teplotě 37°C v 7% CO2. Buňky byly lx propláchnuty 5 ml média DMEM. K 5 ml DMEM bylo přidáno 50 μΐ DEAE-Dextranu, 2 μΐ chlorokinu a 15 pg potkaní DNA kódující fúzní protein doména I polypeptidu GCd/Hu IgG4 popsaný výše. Tato směs byla přidána k buňkám COS a buňky byly inkubovány tři hodiny při teplotě 37°C. Médium bylo odstraněno a buňky byly přesně jednu minutu inkubovány v 5 ml 10% DMSO v CMF-PBS. Buňky byly jedenkrát mírně propláchnuty v DMEM. K těmto buňkám bylo přidáno deset mililitrů DMEM obsahujícího 10% FBS a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 37°C v 7% CO2. Následující den bylo médium nahrazeno čerstvým médiem a inkubace probíhala po následující tři dny. Toto médium bylo odebráno a do misky bylo přidáno čerstvé médium. Po třech dnech bylo médium opět odebráno a misky byly vyhozeny. Postup byl opakován, dokud nebyly z kultury získány 2 litry supernatantu.
Supernatant získaný výše popsanou metodou byl nanesen na kolonu Prosep-A (Bioprocessing Limited) a protein byl purifikován postupem popsaným níže.
Kolona byla nejdříve promyta 15-ti násobným objemem promývacího pufru obsahujícího 35 mM Tris a 150mM NaCl o pH=7,5. Supernatant byl nanášen při rychlosti menší než přibližně 60 objemů kolony za hodinu. Následně byla kolona promyta 15-ti násobným objemem promývacího pufru, 15-ti násobným objemem roztoku 0,55 M diethanolaminu o pH=8,5 a 15ti násobným objemem roztoku 50 mM kyseliny citrónové o pH=5,0. Protein by eluován roztokem 50 mM citrónové kyseliny o pH=3,0 a dále neutralizován roztokem 1,0 M Tris a dialyzován do sterilního roztoku PBS.
Doména I potkaního proteinu ccd byla analyzována postupem popsaným v Příkladu 14. Detekovaný protein putoval stejným způsobem jako protein lidské domény I.
• · · · • · ··♦♦
B. Produkce monoklonálních protilátek namířených proti fúznímu proteinu doména I potkaního polypeptidů ccd/HuIgG4
Myši byly jednotlivě imunizovány 50 pg purifikovaňého fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidů ad/HuIgG4, který byl nejdříve emulgován stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Sigma). Přibližně 200 pl tohoto preparátu bylo na čtyřech místech vstříknuto do hřbetu a boku myši. O dva týdny později byla myš podruhé injikována 100 pl antigenu doména I potkaního polypeptidů ad/HuIgG4 (ve množství 50 pg/myš), který byl předtím emulgován stejným objemem Freundova nekompletního adjuvans. Za následující dva týdny bylo myším intravenózně aplikováno 50 pg antigenu ve 200 pl roztoku PBS.
Pro zjištění titru krevního séra imunizovaných myší byl deset dní po třetí imunizaci proveden retro-orbitální odběr krve. Krev se nechala srazit, sérum bylo izolováno centrifugací a použito k imunoprecipitaci proteinů ze slezinných buněk potkanů značených biotinem (BIP). Sérum získané z každé myši imunoprecipitovalo proteinové proužky o molekulové hmotnosti předpokládané pro potkaní ocd a CD18. Jedna z myší byla vybrána pro fúzi a počtvrté injikována, postupem popsaným výše (pro třetí injekci).
Protilátky v supernatantech získaných kultivací hybridomů byly testovány následujícím způsobem. Čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při teplotě 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším imunoglobulinům IgA, IgG nebo IgM (Organon Teknika) v množství 50 pl/jamku, zředěnou v poměru 1:5000 v uhličitanovém pufru o pH=9,6. Destičky byly třikrát promyty pufrem PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a bylo do nich přidáno 50 pl supernatantu získaného z buněčných kultur. Po inkubaci probíhající 30 minut při teplotě 37°C a promytí, postupem ··♦· • · ·· ·· ·· popsaným výše, byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou namířená proti myšímu IgG9(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěná v poměru 1:3500 v roztoku PBST. Misky byly inkubovány, postupem popsaným výše, a čtyřikrát promyty roztokem PBST. Ihned potom bylo přidáno 100 μΐ substrátu, který obsahoval o-fenylendiamin v koncentraci 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 v 100 mM citrátu o pH=4,5. Barevná reakce byla po 5 minutách zastavena přídavkem 50 μΐ 15% H2SO4. Absorbance byla stanovována při vlnové délce 490 nm na čtečce destiček firmy Dynatech.
Supernatant z jamek obsahujících protilátku byl dále analyzován metodou ELISA za použití imobilizovaného fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidu ad/HuIgG4. Jako kontrola reaktivity proti fúznímu partneru IgG byla použita metoda ELISA, při níž byly destičky povlečeny protilátkou HuIgG4. Pro další testování metodou BIP s potkaním slezinným lyzátem byly, technikami popsanými níže, selektovány pozitivně reagující jamky.
C. Produkce polyklonálního séra namířeného proti fúznímu proteinu doména I potkaního polypeptidu ad/HuIgG4
Dvěma králíkům byla před imunizací, prováděnou s využitím 100 pg purifikovaného fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidu ad/HuIgG4 ve Freundovu kompletním adjuvans, odebrána krev. Každé tři týdny byli králíci injikováni stejnou dávkou, tentokrát ovšem ve Freundově nekompletním adjuvans. Po třech injekcích byla králíkům odebrána krev a získané sérum použito ke standardní imunoprecipitaci s lyzátem potkaních splenocytů. Sérum z obou králíků bylo imunoreaktivní vůči potkanímu polypeptidu ad. Králíci byli znovu injikováni 100 pg antigenu ve Freundovu nekompletním adjuvans a získané sérum bylo, za účelem detekce rostoucí ·· ·· • · · · • · · · • · · · 9
·· ···· ti ···· imunoreaktivity, testováno imunoprecipitací s potkaním ad. Po deseti dnech od aplikace poslední posilovači dávky byla králíkům odebrána krev a získáno sérum.
Histologie potkaního ad
Králičí polyklonální sérum namířené proti doméně I potkaního polypeptidu ocd bylo použito při imunohistochemickém značení potkaních tkáňových řezů. Toto značení bylo prováděno technikami popsanými v Příkladu 16. Distribuce značky, zjištěná na zmrazených nebo do parafinu zapuštěných řezech potkaních slezin, byla v podstatě identická s distribucí pozorovanou při značení jednotlivých buněk uvnitř červené pulpy protilátkami proti lidskému ad. Distribuce značky se lišila od distribuce značky při značení prováděném pomocí monoklonálních protilátkek namířených proti potkanímu CDlla, CDllb a CD18. Kromě toho byl pozitivní signál detekován u jednotlivých buněk v kůře brzlíku. Ani jedna z těchto tkání neposkytla pozitivní signál při značení králičím sérem odebraným před imunizací.
D. Analýza specificity protilátek
Potkani byli usmrceni asfyxií oxidem uhličitým a jejich sleziny byly odebrány standardními technikami. Slezinné buňky byly získány jemným protlačením sleziny pomocí pístu injekční stříkačky přes drátěné sítko do 20 ml RPMI média. Buňky byly posbírány do kónické baňky o objemu 50 ml a promyty vhodným pufrem.
Buňky byly třikrát promyty roztokem studeného D-PBS a rozsuspendovány na hustotu 108 až 109 buněk ve 40 ml PBS. K suspenzi buněk byly přidány čtyři mg NHS-Biotinu (Pierce) a reakce probíhala při pokojové teplotě přesně 15 minut. Buňky byly zcentrifugovány a třikrát promyty studeným D-PBS.
44
4 ·
9· ··4 4 • · · · · · • · 4 4 4 4 • ••4 4 44 44
Buňky byly ve studeném lyzačním pufru (složení:1% NP40; 50 mM Tris-HCl o pH=8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCl2; 2 mM MgCl; roztok pepstatinu, leupeptinu a aprotinu v ředění 1:100 přidaný do pufru před přidáním buněk; a 0,0001 g krystalického PMSF přidaného do pufru těsně před přidáním buněk) rozsuspendovány na hustotu 108 buněk/ml. Lyzáty byly protřepávány po dobu 30 vteřin, pak inkubovány 5 minut při pokojové teplotě a dále 15 minut na ledu. Následně byly centrifugovány 10 minut při 10 OOOxg, aby se odstranil nerozpustný materiál. Supernatant byl převeden do nové zkumavky a uchován při teplotách v rozmezí 4°C až -20°C.
Jeden mililitr buněčného lyzátu byl částečně přečištěn inkubací s 200 μΐ suspenze proteinu A-Sepharozy (Zymed) prováděné přes noc při teplotě 4°C. Takto přečištěný lyzát byl pro každou testovanou protilátku rozdělen do mikrozkumavek v objemu 50 μΐ/zkumavka. K lyzátu bylo přidáno 25 μΐ polyklonálního séra nebo 100 až 500 μΐ supernatantu obsahujícího monoklonální protilátku a tato směs byla za stálého třepání inkubována 2 hodiny při 4°C. Následně bylo přidáno 100 μΐ králičí protilátky namířené proti myšímu IgG (Jackson) vázané na kuličky Sepharózy s proteinem A v PBS a inkubace pokračovala za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě. Po mírné centrifugací byly kuličky třikrát promyty studeným promývacím pufrem (složení: 10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1% Triton X-100). Supernatant byl odstraněn odsátím a ke kuličkám bylo přidáno 20 μΐ 2x SDS vzorkového pufru obsahujícího 10% β-merkaptoethanolu. Vzorek byl povařen 2 minuty ve vodní lázni a nanesen na 5% SDSpolyakryamidový gel pro elektroforézu. Po rozdělení byly proteiny přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Tento přenos probíhal přes noc za konstantního proudu. Membrána byla blokována 1 hodinu při pokojové teplotě ve 3% BSA v pufru TBS-T. Po odstranění blokovacího pufru byl k nitrocelulózové membráně přidán konjugát streptavidin-HRP (Jackson) v ·· «··· «4 ··ve
0,1% BSA v pufru TBS-T a inkubace pokračovala dalších 30 minut při pokojové teplotě. Membrána byla třikrát po dobu 15 minut promývána pufrem TBS-T. Následná autoradiografie byla provedena kitem ECL (Amersham) postupem doporučeným výrobcem.
E. Produkce monoklonálních protilátek namířených proti nezkrácenému potkanímu proteinu ocd
Purifikace potkaního proteinu ad
Za účelem přípravy imunogenu použitelného k produkci monoklonálních protilátkek namířených proti potkanímu polypeptidu ad, byl potkaní protein ocd purifikován z potkaních slezinných buněk. Sleziny byly izolovány z přibližně 50 normálních samic potkanů Lewis starých 12 až 20 týdnů. Jednolitá buněčná suspenze byla získána pasírováním tkáně přes jemné drátěné sítko. Červené krvinky byly odstraněny lyží v pufru o pH=7,4 obsahujícím 150 mM NH4C1, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA a zbylé leukocyty byly dvakrát promyty pufrem PBS. Slezinné buňky byly odstředěny a lyžovány v pufru obsahujícím 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM PMSF, leupeptin, pepstatin a 1% Triton X-100. Lýza slezinných buněk probíhala na ledu po dobu 30 minut v jednom mililitru lyzačního pufru na 5 χ 108 slezinných buněk. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací.
Polypeptidy CDlla, CDllb a CDllc byly ze slezinného lyzátu odstraněny imunoprecipitací provedenou postupem popsaným dále. Po dobu 30 minut bylo, při teplotě 4°C, 750 μΐ suspenze protein A-Sepharózy inkubováno s 2 mg králičí protilátky namířené proti myšímu imunoglobulinů. Vzniklý komplex byl třikrát promyt lyzačním pufrem a nakonec rozsuspendován v 1,5 ml lyzačního pufru. K 50 ml potkaního slezinného lyzátu bylo přidáno přibližně 200 pg každé ze specifických monoklonálních protilátek, 515F (specificky namí97 ···· • 4 ····
444<
• · · • · ·
4 4 · • 4 4 4
44
4«
4 4 4
4 44
444 4 4
4 4
44 řená proti potkaní CDlla), OX-42 (specificky namířená proti potkaní CDllb) a lOOg (specificky namířená proti potkaní CDllc). Po 30 minutové inkubaci při teplotě 4°C bylo k lyzátu přidáno 500 μΐ komplexu králičí protilátky s protein A-Sepharozou a tato směs byla třepána při teplotě 4°C třepáno po dobu 30 minut na třepačce. Lyzát byl centrifugován při 2500xg po dobu 10 minut, aby se oddělily CDlla, CDllb a CDllc navázané na komplex králičí protilátky s protein ASepharozou. Supernatant byl převeden do nové centrifugační kyvety. Tato imunoprecipitace s protilátkami 515F, OX-42 a lOOg byla opakována ještě dvakrát, aby bylo zajištěno kompletní odstranění CDlla, CDllb a CDllc.
Zbylé integriny β2 byly z lyzátu izolovány pomocí afinitní chromatografie. K lyzátu bylo přidáno přibližně 250 μΐ suspenze obsahující monoklonální protilátku 20C5B namířenou proti myší CD18 navázanou na CNBr-Sepharózu a vzniklý roztok byl při teplotě 4°C třepán po dobu 30 minut na třepačce. Komplex protilátka/antigen byl centrifugován při 2500xg po dobu 10 minut, peleta byla třikrát promyta lyzačním pufrem a skladována při teplotě 4°C.
Imunizace arménských křečků
Arménští křečkové, staří šest až osm týdnů, byli poprvé imunizováni pomocí přibližně 50 pg rekombinantního proteinu sestávajícího z domény I potkaního polypeptidů ad připojené k těžkému řetězci lidského IgG4. Tento protein byl před imunizací emulgován Freundovým kompletním adjuvans. Následné imunizace proběhly se stejným proteinem emulgovaným ve Freundově nekompletním adjuvans 14. den, 33. den a 95. den po první imunizaci. Byly provedeny dvě oddělené fúze, označené 197 a 199.
····« ·· ·· ·· ··
Čtyři dny před fúzí 197 (306. den) byla jednomu křečkovi aplikována směs potkaního proteinu ad purifikovaného ze slezinných buněk a buněk CHO transfekovaných potkaním ocd. Tři dny před fúzí (307. den) byla křečkovi aplikována posilovači dávka obsahující purifikovaný potkaní protein ocd a CHO buňky transf ekované ocd. Transfekce buněk CHO potkaním ocd byla provedena následovně.
Segment genu kódující nezkrácený potkaní protein ad byl vložen do vektoru pDCl, kterým byly, spolu s lidským konstruktem CDl8-pRC, elektroporací transfekovány buňky CHO. Transfekované buňky byly kultivovány v přítomnosti hypoxanthinu a g418, aby se vyselektovaly buňky úspěšně transfekované konstruktem pRC resp. konstruktem pDCl. Po třech týdnech byly buňky značeny specifickým polyklonálním sérem namířeným proti potkaní ad a rozděleny s využitím FACS. Malý podíl buněk, který na svém povrchu vykazoval nejvyšší hladinu exprese polypeptidu ocd (přibližně 3% populace) , byl separován a buňky byly dále pomnoženy. Tento postup byl několikrát opakován, aby byla získána populace buněk s nejvyšší povrchovou expresí ad.
Transfekované buňky byly také charakterizovány průtokovou cytometrií za použití polyklonálního séra specificky namířeného proti potkanímu polypeptidu ad a monoklonální protilátky TSI.18.1 specificky namířené proti lidské CD18. Získané výsledky potvrdily vysokou hladinu exprese obou antigenů na povrchu transfekovaných buněk CHO.
Exprese ad a CD18 v buňkách byla nakonec analyzována imunoprecipitací. Králičí polyklonální sérum specificky namířené proti potkanímu polypeptidu ad imunoprecipitovalo se dvěma proteiny o rozdílné molekulové hmotnosti. Molekulové hmotnosti byly 170 kDa u většího proteinu a 95 kDa u menšího proteinu. Tyto výsledky byly v souladu s expresí hetero99 • · · · • · · » dimerního komplexu potkaní ad/lidský CD18 na povrchu transfekovaných buněk CHO.
V den fúze byla vyjmuta slezina. Suspenze jednotlivých slezinných buněk byla vytvořena rozmělněním tkáně mezi dvěmi namraženými podložními sklíčky ponořenými do média RPMI bez přítomnosti séra s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilinu v koncentraci 100 jednotek/ml a streptomycinu v koncentraci 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčné sítko Nitex o velikosti ok 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany,
New Jersey), dvakrát promyta centrifugaci při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla následně rozsuspendována ve 20 ml média RPMI bez přítomnosti séra. Thymocyty ze tří myší Balb/c (neimunizovaných) byly připraveny obdobným způsobem. Myelomy NS-1, udržované po tři dny před fúzí v log fázi v médiu RPMI s obsahem 10% fetálního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne. Logan, Utah), byly centrifugovány při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla dvakrát promyta, postupem popsaným výše.
Přibližně 1,15 χ 108 slezinných buněk bylo smícháno s 5,8 χ 107 buněk NS-1, zcentrifugováno a supernatant byl odstraněn odsátím. Peleta byla poklepem uvolněna ode dna kyvety. K buněčné peletě bylo, za stálého míchání po dobu jedné minuty, přidáváno 7 ml PEG 1500(Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufru 75mM HEPES o pH=8,0) zahřátého na teplotu 37°C. Následně bylo k buněčné suspenzi přidáno 14 ml média RPMI bez přítomnosti séra a suspenze byla míchána po dobu 7 minut. Bylo přidáno dalších 8 ml média RPMI a buňky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 200xg. Supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve 200 ml média RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 0,4 mM aminopterin, 16 mM thymidin (HAT) (Gibco), IL-6 o koncentraci 25 jednotek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 χ 106 thymocytů/ml. Suspenze byla rozdělena do 10-ti 96-jamkových (s
100 • · · · • · • · · · 9 · · ···· · • · ···· ··· ····· · · · · · · · · plochým dnem) destiček pro tkáňové kultury (Corning, Velká Británie) v objemu 200 μΐ/jamka a buňky byly vyživovány 4., 5., 6. a 7. den odebráním 100 μΐ média z každé jamky 18Gjehlou (Becton Dickinson) a přidáním 100 μΐ čerstvého média, popsaného výše, avšak neobsahujícího thymocyty.
Desátý den byl supernatant z jamek testován průtokovou cytometrií, zda-li reaguje s buňkami CHO transfekovanými heterodimerem potkaní ocd/lidská CD18. Přibližně 5 χ 105 buněk CHO transfekovaných potkaní ad bylo rozsuspendováno v 50 μΐ média RPMI obsahujícího 2,0% FBS a 0,05% azid sodný a na 96-jamkových destičkách s jamkami s kulatým dnem přidáno ke 100 μΐ supernatantu získaného při kultivaci hybridomů. Pozitivní kontrolou bylo značení pomocí králičího polyklonálního séra namířeného proti ad a protilátky TS1/18 namířené proti lidskému CD18. Buňky byly inkubovány 30 minut na ledu, třikrát promyty v pufru FACS (RPMI, 2,0% FBS, 0,05% azid sodný) a inkubovány 30 minut na ledu s kozí protilátkou značenou FITC namířenou proti křeččím Ig (Jackson Immunol Research Labs) zředěnou v poměru 1:200 v pufru FACS. Buňky byly třikrát promyty v pufru FACS a resuspendovány ve 200 ml tohoto pufru. Vzorky byly analyzovány na analyzátoru FACscan firmy Becton Dickinson. Za účelem potvrzení, že klony z pozitivně reagujících jamek jsou specifické proti potkaní ad, byl· celý pokus opakován s netransfekovanými buňkami CHO. Klony, které splnily podmínky a reagovaly s buňkami CHO transfekovanými potkaní ad, ale nereagovaly s netransfekovanými buňkami, byly dále pomnoženy.
Po primárním screeningu byly buňky z pozitivně reagujících jamek pasážovány nejprve dvojnásobným zředěním a následně mezním zředěním v médiu RPMI obsahujícím 15 % FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 16 mM thymidin a IL-6 v koncentraci 10 jednotek/ml. V tomto kroku bylo určeno procento jamek vykazující růst a s využitím Poissonovy distribuční
101 • · • fl • fl flfl • · flfl analýzy byla předpovězena klonalita. Po 10 až 12 dnech byly jamky obsahující množící se populace analyzovány s využitím FACS. Po posledním pasážování byly buňky z pozitivních jamek namnoženy v médiu RPMI s 11% FBS. Byla získána jedna kultura, která se podle těchto kritérií jevila jako pozitivní. Z této kultury byly rozrostlé 4 separátní subklony označené 197A-1, 197A-2, 197A-3 a 197A-4.
Druhému křečkovi bylo 307. den aplikováno 2,3 x 106 buněk CHO transfekovaných potkaní ad. Dvě závěrečné imunizace byly provedeny 4 dny před fúzí 199 (334. den) a opět tři dny před fúzí (335. den). Injekce ze dne 334, aplikovaná intraperitoneálně, obsahovala 2 x 10s buněk CHO transfekovaných potkaní ad a 200 μΐ purifikované potkaní podjednotky ad navázané k Sepharóze (popsáno dříve). Injekce ze 335.dne, aplikovaná rovněž intraperitoneálně, obsahovala 5 x 106 buněk CHO transfekovaných potkaní ad. Postup fúze a protokol testování byl stejný jako u fúze 197. Byly identifikovány a pomnoženy tři hybridomy označené 199A, 199H a 199M. Hybridom 199M byl 1. března 1996 uložen u American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod přístupovým číslem HB-12058.
Charakterizace monoklonálních protilátek proti potkanímu polypeptidu ad
Aby bylo možno charakterizovat protilátky namířené proti potkanímu ad, byly, postupem popsaným v Příkladu 18, oddíl D, připraveny biotinem značené slezinné lyzáty. Před vlastní imunoprecipitací byly lyzáty předčištěny. Na počátku byl k lyzátu přidán normální myší imunoglobulin v koncentraci 50 pg/ml a výsledná směs byla po dobu 30 minut při teplotě 4°C třepána na rotační třepačce. K této směsi bylo přidáno 75 μΐ suspenze protein A-Sepharozy potažené králičí protilátkou namířenou proti myším Ig a třepání pokračovalo
102 • · • ·
dalších 30 minut. Kuličky s navázanou protilátkou byly odstředěny při 15000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze. Centrifugace probíhala po dobu 5 minut při teplotě 4°C. Supernatant byl odebrán a peleta odstraněna.
Z každého klonu hybridomů bylo do mikrozkumavky odebráno přibližně 300 μΐ supernatantu. K tomuto supernatantu bylo přidáno 30 μΐ 10% Tritonu X-100, 30 μΐ ze lOOx zásobního roztoku pepstatinu, leupeptinu a aprotinu, dále 100 pg krystalického PMSF a 50 μΐ předčištěného biotinylovaného lyzátu z potkaní sleziny. Obsah mikrozkumavek byl mírně protřepán a na dobu 30 minut při teplotě 4°C umístěn na rotačku. Kontrolní vzorek byl připraven přidáním králičí polyklonální protilátky specificky namířené proti potkanímu polypeptidů ocd o koncentraci 10 mg/ml k 50 μΐ potkaního slezinného lyzátu.
Po 30 minutové inkubaci bylo ke každému vzorku přidáno 75 μΐ suspenze kuliček protein A-Sepharózy v PBS pufru a vzorek byl inkubován na rotačce dalších 30 minut při teplotě 4°C. Kuličky Sepharózy byly centrifugovány po dobu 5 minut při teplotě 4°C při 15000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze a supernatant byl odebrán. Kuličky byly postupně promyty jedním mililitrem z každého z následujících detergentních roztoků: pufr #1 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, pH 8,0; pufr #2 obsahující lOmM Tris, 400 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 8,0; pufr #3 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, 0,1% deoxycholát, pH 8,0; a pufr #4 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCl, pH 8,0. Poslední promytí bylo provedeno pufrem #1. Mezi jednotlivými promytími byly kuličky mírně protřepány na vortexu a odstředěny ve stolní centrifuze. Supernatant byl vždy odstraněn pipetou a po posledním promytí byl zbylý pufr od kuliček odstraněn stříkačkou (Hamilton). Ke každé peletě kuliček byl přidán alikvot (50 μΐ) SDS vzorkového pufru obsahujícího bromfenolovou modř,
103 • « · · · · • · · • · · barvivo Pyronin Y a β-merkaptoethanol o výsledné koncentraci 10%. Směs byla prudce 1 až 2 minuty třepána a inkubována 5 až 10 minut při pokojové teplotě. Vzorky byly centrifugovány po dobu 5 minut při 15000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze při teplotě 4°C a uvolněný protein byl přenesen do nové mikrozkumavky. Vzorky byly povařeny 4 minuty na vodní lázni a naneseny na 7,5% SDS polyakrylamidový gel. Po ukončení dělení byly proteiny přeneseny na nitrocelulozové filtry. Transfer probíhal při200 mA po dobu 1 hodiny. Filtry byly blokovány v roztoku 3,0% BSA v pufru TBS-T přes noc při teplotě 4°C. Ke každému filtru byl přidán roztok 0,1% BSA v pufru TBS-T obsahující streptavidin-OPD v ředění 1:6000, ve kterém byl ponechán jednu hodinu za pokojové teploty. Filtry byly promývány pětkrát vždy po dobu 10 minut v pufru TBS-T a obarveny použitím kitu ECL (Amersham) postupem doporučeným výrobcem.
Bylo prokázáno, že klon 199M imunoprecipituje heterodimerní protein. Větší proteinová podjednotka měla přibližnou molekulovou hmotnost 170 až 175 kDa, což odpovídalo velikosti proteinu imunoprecipitovaného kontrolní králičí polyklonální protilátkou namířenou proti potkaní ad. Druhá imunoprecipitovaná podjednotka měla zdánlivou molekulovou hmotnost 95 kDa, shodnou s velikostí CD18.
Příklad 19
Izolace klonů myší cDNA
Byl učiněn pokus o izolaci myšího homologu ad.
Pomocí dvou sond vytvořených metodou PCR byla provedena mezidruhová hybridizace. První sondou byl fragmet o velikosti 1,5 kb odpovídající bázím 522 až 2047 z lidského klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1), druhou sondou byl potkaní fragment o velikosti 1,0 kb odpovídající bázím 1900 až 2900 z lid104 • · · ·
ského klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1). Lidská sonda byla vytvořena polymerázovou řetězovou reakcí primeru označených ATM2 a 9-10.1 (SEK. ID. Č: 38 resp. 39). Potkaní sonda byla vytvořena s využitím primeru 434L a 434R (SEK. ID. Č: 34 resp. 35). Vzorky byly inkubovány 4 minuty při teplotě 94°C a podrobeny 30 cyklům s následujícím teplotním režimem:
94°C, 2 minuty při 50°C; 4 minuty při 72°C.
5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3' (SEK. ID. Č: 38)
5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3' (SEK. ID. Č: 39)
Produkt reakce PCR byl purifikován pomocí kitu Quick Spin firmy Qiagen, postupem doporučeným výrobcem, a přibližně 180 ng DNA bylo za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označeno 200 pCi [32P]-dCTP. Nenavázaný izotop byl odstraněn pomocí kolony Centri-sep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Sondy byly před použitím denaturovány 0,2 N NaOH a neutralizovány roztokem 0,4 M Tris-HCl o pH=8,0.
Knihovna cDNA získaná z buněk myšího thymu s využitím sekvence oligo-dT jako primeru zabudovaná v lambda ZAP II (Stratagene) byla vyseta v koncentraci přibližně 30000 plaků na 1 misku o průměru 15 cm. Plaky přenesené na nitrocelulózové filtry (Schleicher & Schuell, Keene, NH) byly za stálého míchání inkubovány při teplotě 50°C po dobu jedné hodiny v prehybridizačním roztoku (8 ml/přenos) obsahujícím 30% formamid. K prehybridizačnímu roztoku byly přidány značené lidské a potkaní sondy a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 50°C. Filtry byly dvakrát promyty v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 37°C a jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C. Expozice
105 • · · · • · · · filtrů na film Kodak X-Omat AR probíhala při teplotě -80°C po dobu 27 hodin za použití kontrastního filtru.
Čtyři plaky, které poskytly pozitivní signál při dvakrát opakovaném přenosu, byly znovu vysety na misky s LB médiem s přídavkem hořčíku a karbenicilinu v koncentraci lOOmg/ml a inkubovány přes noc při 37°C. Fágové plaky byly přeneseny na filtry Hybond (Amersham), označeny jako v prvním pokusu a exponovány na film Kodak X-Omat AR při teplotě -80°C po dobu 24 hodin za použití kontrastního filtru.
Dvanáct pozitivních plaků bylo přeneseno do ředícího roztoku s nízkým obsahem Mg2+ iontů (10 mM Tris-HCl a lmM MgCl2) . Velikost inzerčního fragmentu byla určena pomocí PCR reakce s T3 a T7 primery (SEK. ID. Č:13 a 14) za následujících reakčních podmínek. Vzorky byly inkubovány při 94°C po dobu 4 minut a vystaveny 30 cyklům s tímto teplotním režimem: 15 vteřin při 94°C, 30 vteřin při 50°C a 1 minutu při 72°C.
Šest vzorků poskytlo rozdílné proužky DNA o velikosti od 300 bází do 1 kb. Fágmidy byly uvolněny pomocí koinfekce pomocným fágem a převedením do cyklické formy byl vytvořen Bluescript SK- (Stratagene). Vzniklé kolonie rostly v LBM médiu s karbenicilinem (lOOmg/ml) přes noc. DNA byla izolována pomocí kitu pro minipreparaci DNA Wizard firmy Promega (Madison, Wl) podle návodu výrobce. Restrikční analýza izolované DNA enzymem EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, odpovídající molekulovým hmotnostem zjištěným z PCR. Fragment DNA byl sekvenován za použití primerů M13 a reverzního primerů.1 M13, jejichž sekvence jsou zobrazené v SEK. ID.
Č: 40 resp. 41.
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEK. ID. Č: 40)
5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEK. ID. Č: 41)
106 • · ···· ·· · · · ·
• · · · · ·
Sekvenování bylo provedeno postupem popsaným v Příkladu 4.
Jen dva ze šesti klonů, označené 10.3-1 a 10.5-2, poskytly identickou sekvenci o velikosti 600 párů bází. Tato sekvence byla ze 68% identická s odpovídající oblastí lidského ad, ze 40% identická s odpovídající oblastí lidského CDlla, z 58% identická s odpovídající oblastí lidského CDllc a z 54% identická s odpovídající oblastí myšího CDllb. Tento fragment o velikosti 600 bp byl následně využit k získání úplnější cDNA kódující předpokládaný myší homolog ocd.
Knihovna cDNA z myší sleziny (vytvořená s využitím oligo-dT primerů a primerů o náhodných sekvencích), zaklonovaná do fága lambda Zap II (Stratagene), byla vyseta v koncentraci 2,5 x 104 fágů na LBM misku o průměru 15 cm. Plaky byly přeneseny na nylonovou membránu Hybond (Amersham) denaturovány 0,5 M NaOH s 1,5 M NaCl, neutralizovány 0,5M Tris-HCl s 1,5M NaCl a promyty v 2X SSC. DNA byla na membráně zesítěna ultrafialovým zářením.
Pomocí sond 10.3-1 a 10.5-2, značených postupem popsaným výše, bylo testováno přibližně 500000 plaků. Sondy byly přidány do prehybridizačního roztoku a inkubovány přes noc při teplotě 50°C. Filtry byly dvakrát promyty v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 37°C a jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C. Expozice filtrů na film Kodak X-Omat AR probíhala při teplotě -80°C po dobu 13 hodin za použití kontrastního filtru.
Osmnáct pozitivních plaků bylo přeneseno do roztoku s nízkým obsahem Mg2+ iontů a velikost fragmentu byla určena
PCR metodou, postupem popsaným výše. Každý ze sedmi vzorků poskytl jediný proužek DNA o velikostech od 600 párů bází do 4 kb. Restrikční analýza purifikované DNA enzymem EcoRI
107 • · · ·
potvrdila molekulové hmotnosti, odpovídající molekulovým hmotnostem zjištěným z PCR. Fragment DNA byl sekvenován za použití primerů M13 a reverzního primerů.1 M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41).
Klon označený B3800 obsahoval inzert o velikosti 4kb, který odpovídal· oblasti nacházející se 200 bází po směru transkripce od 5' konce klonu 19A2 lidské ad a obsahoval 553 bází 3' nepřekládané oblasti. Klon B3800 byl ze 77% identický s odpovídající oblastí lidské ad, 44% identický s odpovídající oblastí lidské CDlla, 59% identický s odpovídající oblastí lidské CDllc a 51% identický s odpovídající oblastí myší CDllb. Druhý klon A1160 měl velikost 1,2 kb a odpovídal 5' konci kódující oblasti lidské ad, přibližně 12 bází po směru transkripce od iniciačního kodonu pro methionin. Klon A1160 byl ze 75% identický s odpovídající oblastí lidské ocd, 46% identický s odpovídající oblastí lidské CDlla, 62% identický s odpovídající oblastí lidské CDllc a 66% identický s odpovídající oblastí myší CDllb.
Klon A1160, fragment blíže 5' konci lidského klonu 19A2, se překrývá s klonem B3800 od báze 205 až k bázi 1134. Klon A1160 má vložen úsek 110 bází (báze 704 až 814), který není v překrývající se oblasti klonu B3800. Tento vložený úsek DNA se nejspíše vyskytuje na hranici exonu a intronu [Fleming a další, J. Immunol. 150:480 až 490 (1993)] a byl před následným spojením klonů A1160 a B3800 odstraněn.
Rychlá amplifikace 5' konce cDNA předpokládaného klonu myšího ad
K získání chybějících 5' úseků předpokládaných klonů myší ad, včetně 5' nepřekládané sekvence a iniciačního methioninu, byla použita RACE PCR [Frohman, RACE: Rapid Am108
0 0 0
0 0 0 • · ··· ·♦·· • 0 ·· · 0000 0 • 0 0000 000
0000 0 ·· ·· ·· ·* plification of cDNA Ends, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a další, (editoři) 28 až 38, Academie Press:New York (1990)]. Myší slezinný kit RACEReady (Clontech, Palo Alto, CA) byl použit podle návodu výrobce. Pro uskutečnění první a vnořené PCR byly vybrány dva xantisense specifické primery (A1160 RACE1-primární primer a A1160 RACE2-vnořený primer, SEK. ID. Č: 42 resp.
43) .
5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3' (SEK. ID. Č: 42)
5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (SEK. ID. Č: 43)
Primery, SEK. ID. Č: 42 a 43, odpovídají oblastem začínajících 302 resp. 247 bází od 5' konce. Za použití 5' primeru (SEK. ID. Č: 44) a myší slezinné cDNA dodané v kitu byla, postupem popsaným výše, provedena PCR.
5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3' (SEK. ID. Č: 44)
Elektroforéza produktu PCR reakce odhalila proužek o velikosti 280 bází, který byl zaklonován pomocí klonovacího kitu TA (Invitrigen), postupem doporučeným výrobcem. Deset získaných kolonií bylo pomnoženo, DNA izolována a zjištěna její sekvence. Touto metodou bylo identifikováno dalších 60 bází 5' sekvence, které odpovídají bázím 1 až 60 v SEK. ID. Č: 45.
Charakteristiky myší cDNA a předpokládané aminokyselinové sekvence
Složená sekvence myší cDNA kódující předpokládaný homolog lidské ad je zobrazena v SEK. ID. Č: 45. Ačkoli homolo109 • · · • · gie mezi vnějšími doménami lidských a myších klonů je vysoká, homologie mezi cytoplazmatickými doménami je jen 30%. Pozorované odchylky mohou nazačovat rozdíl ve funkci Ckoncové domény mezi lidskými a myšími proteiny. Odlišnosti v cytoplazmatických doménách mohou být rovněž výsledkem rozdílného sestřihu RNA nebo mohou naznačovat existenci dalšíchgenů pro integriny β2.
Aminokyselinová sekvence proteinu, předpovězěná na základě sekvence myší cDNA je z 28% identická s myší CDlla, z 53% s myší CDllb, z 28% s lidskou CDlla, z 55% s lidskou CDllb, z 59% s lidskou CDllc a z 70% s lidskou ad. Ze srovnání aminokyselinových sekvencí cytoplazmatických domén lidského polypeptidu ad a předpokládaného myšího homologu vyplývá, že sice obsahují oblasti stejné délky,ale s odlišnou primární strukturou. Podobné velikosti sekvencí v těchto oblastech předpokládají spíše druhovou odlišnost než možnost vzniku rozdílných variant sestřihem. Když porovnáváme myší sekvenci s předpokládaným potkaním polypeptidem (příklad 16 zmíněný výše), dostáváme větší než 60% shodu myší a potkaní cytoplazmatické domény.
Příklad 20
Izolace dalších klonů myší cDNA ad prováděná za účelem potvrzení sekvence
Aby byla potvrzena nukleotidová a aminokyselinová sekvence myší ad popsané v Příkladu 19, byly izolovány další myší sekvence.
Hybridizací se dvěmi homologními ocd sondami (od 3' konce a od 5' konce) byla, s využitím jak myší slezinné knihovny vytvořené pomocí náhodných primerů, tak knihovny cDNA vytvořené pomocí primerů oligo-dT, zaklonovaných do fága lambda ZAP II (Stratagene), provedena izolace myší cD110 ·· · · · ·· ·· · · · ·
NA. Knihovna byla nanesena v koncentraci 5 x 105 fágů/miska na misky s LBM o průměru 15 cm. Plaky byly přeneseny na nylonové membrány Hybond (Amersham). Membrány byly denaturovány (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), neutralizovány (0,5 M Tris/1,5 M NaCl/11,6 M HCl) a promyty (2X SSC). DNA byla na membránách zesitěna pomoci ultrafialového záření.
Sondy byly vytvořeny pomocí primerů popsaných níže v PCR reakci prováděné za následujících podmínek. Vzorky byly vystaveny 4 minuty teplotě 94°C, a potom následovalo 30 cyklů s tímto teplotním režimem: 15 vteřin při 94°C, 30 vteřin při 50°C a 1 minutu při 72°C v cykléru Perkin-Elmer 9600.
3'-sonda, která byla přibližně 900 bází dlouhá, překrývala oblast nukleotidů 2752 až 3651 (v SEK. ID. Č: 1, ve směru od 5' k 3') a byla vytvořena pomocí primerů 11. b1/2FOR11 a ll.b-l/2REV2 zobrazených v SEK. ID. Č: 69 resp. 74. Tato sonda byla použita v první sérii přenosů.
5'-sonda, která byla přibližně 800 bází dlouhá, zahrnovala oblast nukleotidů 145 do 946 (v SEK. ID. Č: 1, ve směru od 5' k 3') a byla vytvořena pomocí primerů ll.b-l/2FORl a ll.a-l/IREVI zobrazených v SEK. ID. Č: 50 resp. 85). Tato sonda byla použita v druhé sérii přenosů.
Ve třetí sérii přenosů byly použity obě sondy společně na stejných miskách.
Pomocí obou sond, popsaných výše, značených způsobem popsaným v Příkladu 17, bylo testováno přibližně 500000 plaků. Značené sondy byly přidány k prehybridizačnímu roztoku s 45% formamidem a inkubovány přes noc při teplotě 50°C. Membrány byly promyty dvakrát v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě (22°C). Poslední promytí bylo provedeno v 2X SSC/0,1% SDS při teplotě 50°C. Autoradiografie byla prováděna po dobu 19 hodin při teplotě -80°C na film Kodak XOmat AR za použití kontrastního filtru.
111 •4 4444
4 4 44 4 4444
4 44 4 4444
4 44 4 44 ··♦· 4
4 4444 444
4444 4 44 44 44 44
Třináct plaků pozitivních nejméně při dvou přenosech bylo podrobeno druhému testování, které bylo provedeno stejně jako první testování, až na dvě výjimky. K hybridizaci byly použity obě značené sondy 3' a 5' a bylo přidáno závěrečné promytí v 2X SSC/0,1% SDS při teplotě 65°C. Autoradiografie byla provedena stejným postupem popsaným výše, ale probíhala pouze po dobu 2,5 hodiny.
Třináct pozitivních plaků (označených MS2P1 až MS2P13) bylo přeneseno do ředícího roztoku s nízkým obsahem hořečnatých iontů. Velikost inzertu byla stanovena metodou PCR (cykler Perkin-Elmer 9600) za použití primerů T3 a T7, které přisedají k fágmidu Bluescript zabudovanému ve vektoru ZAP II (sekvence již dříve popsaná). Podmínky PCR byly stejné, jak bylo popsáno výše. Velikosti proužků DNA se pohybovaly od 500 párů bází do 4kb. Fágmidy byly izolovány a sekvenovány s využitím primerů M13 a reverzního primerů.1 M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41). Pět ze třinácti klonů (MS2P3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12, a MS2P-13) bylo sekvenováno a po složení reprezentovalo přibližně oblast od báze 200 na 5' konci až k 300. bázi za prvním stop kodonem na 3' konci.
Za účelem zjištění sekvencí konců všech klonů a určení jejich relativní pozice vůči konstruktu #17(SEK. ID. Č: 45) bylo, postupem stejným jako v Příkladu 4, provedeno automatické sekvenování s využitím primerů M13 a reverzního primeru.l M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41). Každý klon byl pak úplně sekvenován použitím vhodných primerů (uvedených níže) pro konkrétní oblasti.
ll.b-l/2FORl | 5' | -GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3' | (SEK. | ID. | Č: | 50) |
Il.a-1/1FOR2 | 5' | -CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3 z | (SEK. | ID. | Č: | 60) |
Il.a-1/1FOR3 | 5Z | -CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3z | (SEK. | ID. | Č: | 61) |
ll.b-l/2FOR4 | 5Z | -GCTGGGATCATTCGCTATGC-3 z | (SEK. | ID. | Č: | 62) |
112 ·· 4··· • 4 ··44 ·· · · 4 · » · · 4 • · ·· · · 4 · · • · · · · ·· 4 4 4 4 · • · 4 4 4 4 · · 4 • ·4· 4 44 44 44 44
ll.b-l/2FOR5 | 5'-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3' | (SEK. | ID. Č: | 63) |
11.b-l/2FOR6 | 5'-CAGATCGGCTCCTACTITGG-3' | (SEK. | ID. Č: | 64) |
ll.b-l/2FOR7 | 5'-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3' | (SEK. | ID. Č: | 65) |
ll.b-l/2FOR8 | 5'-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 66) |
ll.b-l/2FOR9 | 5'-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3' | |||
(SEK. | ID. Č: | 67) | ||
11.b-l/2FORlO | 5'-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 68) |
ll.b-l/2F0Rll | 5'-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 69) |
11.b-l/2FORl2 | 5'-GTCACAGAGGGAACCTCC-3' | (SEK. | ID. Č: | 70) |
11.b-l/2FORl3 | 5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA- | 3' | ||
(SEK. | ID. Č: | 71) | ||
ll.b-l/2FOR14 | 5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC- | 3' | ||
(SEK. | ID. Č: | 72) | ||
11.b-l/2FOR15 | 5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3 | '(SEK. | ID. Č: | 73) |
ll.b-l/2REV2 | 5'-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3' | (SEK. | ID. Č: | 74) |
ll.b-l/2REV3 | 5'-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3' | (SEK. | ID. Č: | 75) |
ll.b-l/2REV4 | 5'-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 76) |
ll.b-l/2REV5 | 5'-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3' | (SEK. | ID. Č: | 77) |
ll.b-l/2REV6 | 5'-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3' | (SEK. | ID. Č: | 78) |
11.b-l/2REV7 | 5'-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3' | (SEK. | ID. Č: | 79) |
ll.b-l/2REV8 | 5'-GATCCAACGCCAGATCATACC-3' | (SEK. | ID. Č: | 80) |
ll.b-l/2REV9 | 5'-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3' | (SEK. | ID. Č: | 81) |
ll.b-l/2REV10 | 5'-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 82) |
11.b-l/2REVll | 5'-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 51) |
ll.b-l/2REV12 | 5'-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3 | '(SEK. | ID. Č: | 83) |
ll.b-l/2REV13 | 5'-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3' | (SEK. | ID. Č: | 84) |
ll.a-l/IREVI | 5'-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3' | (SEK. | ID. Č: | 85) |
113 • a ···· ·· ·«·· ·· ·· • a « · · · · · · · ·· »·· · a aa © a e · · · · ··· a · • · a··· aa· ···· a a· ·* a· ··
Il.a-1/1REV2 5'-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3' (SEK. ID. Č: 86)
Sekvence byly upraveny, přiřazeny a porovnány s dříve izolovanými sekvencemi myší ad (konstrukt #17, SEK. ID. Č:
45) .
Přiřazení nových sekvencí odhalilo v konstruktu #17 deleci 18 bází, která začínala od nukleotidu 2308. Tato delece nezapříčinila posun čtecího rámce. Klon MS2P-9 obsahoval stejnou deleci o délce 18 bází. Výskyt této delece byl pozorován u 50% myších klonů obsahujících tuto oblast, avšak tato delece nebyla zjištěna v potkaních ani lidských klonech podjednotky ad. Delece 18 bází je charakterizována palindromovou sekvencí 12 bází AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEK. ID.
Č: 91). Tato inverzní repetice je komplementární sama k sobě a může vytvořit smyčku, která způsobuje štěpení během reverzní transkripce. Sekvence myší ad, která obsahuje navíc 18 bází je zobrazena v SEK. ID. Č: 52; odvozená aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 53.
Příklad 21
In šitu hybridizace u myší
Distribuce myší ocd v tkáních byla určena proto, aby mohlo být provedeno její srovnání s distribucí lidské ad, popsané v Příkladu 6.
Pomocí transkripce RNA prováděné in vitro s použitím 35S-UTP (Amersham) byla z templátu DNA získána jednovláknová sonda mRNA o velikosti 200 bp, odpovídající nukleotidům 3460 až 3707 v cytoplazmatické oblasti myší cDNA,
Celá myší embrya (odebrána 11 až 18 dní po oplození) a různé myší tkáně (slezina, ledvina, játra, střevo a thymus)
114 • · · · ·
byly in šitu hybridizovány s radioaktivně značenou jednovláknovou sondou mRNA.
Z tkání byly připraveny řezy o tloušťce 6 pm, které byly adherovány na sklíčka potažená přípravkem Vectabond (Vector Laboratories, lne., Burlingame, CA) a uloženy při teplotě -70°C. Před použitím byla sklíčka vystavena 5 minut teplotě 50°C. Řezy byly po dobu 20 minut při teplotě 4°C fixovány v 4% paraformaldehydu, dehydratovány zvyšující se koncentrací ethanolu (70-95-100%) (1 minutu při teplotě 4°C pro každou koncentraci) a vysušeny na vzduchu (30 minut při pokojové teplotě). Řezy byly denaturovány 2 minuty při teplotě 70°C v roztoku 70% formamid/2X SSC, dvakrát propláchnuty v 2X SSC a dehydratovány ethanolem (postupem popsaným výše) a 30 minut vysoušeny na vzduchu. Hybridizace byla provedena přes noc (12 až 16 hodin) při teplotě 55°C v roztoku obsahujícím sondu značenou izotopem 35S v koncentraci β χ 105 cpm na řez a vodu (vystavenou účinkům diethylpyrokarbonátu - DEPC) tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace 50% formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH=7,5), 10% dextran sulfát, IX Denhardtův roztok, 100 mM dithiothreitol (DTT) a 5 mM EDTA. Po hybridizací byly řezy promývány 1 hodinu při pokojové teplotě v 4X SSC/10 mM DTT, 40 minut při 60°C v 50% formamidu/2X SSC/10 mM DTT, 30 minut při pokojové teplotě v 2X SSC a 30 minut při pokojové teplotě v 0,lX SSC. Řezy byly dehydratovány, po dobu 2 hodin vysoušeny na vzduchu, potaženy fotografickou emulzí Kodak NTB2 , vysoušeny 2 hodiny na vzduchu, vyvolány (uchování při 4°C v úplné tmě) a dobarveny hematoxylinem/eosinem.
Slezinná tkáň vykázala silný signál hlavně v červené pulpě. Tato distribuce signálu odpovídá distribuci tkáňových makrofágů ve slezině, ale nevylučuje přítomnost jiných typů buněk.
115 • · · · • ·
Příklad 22
Příprava myších expresívních konstruktů
Aby mohl být vytvořen expresívní plazmid obsahující sekvenci myší cDNA vykazující homologii k lidské ad, byly spojeny inzerty klonů A1160 a B3800. Před ligaei byla k inzertu z klonu A1160 přidána vedoucí (leader) sekvence obsahující na 5' konci kodon pro iniciační methionin. Primer označený 5-PCR leader (SEK. ID. Č: 47) byl navržen tak, aby obsahoval: (1) identické nespecifické báze na pozicích 1 až 6 umožňující štěpení; (2) restrikční místo BamHI od pozice 7 až 12 umožňující zaklonování do expresního vektoru; (3) konzervativní Kozákovu sekvenci od pozice 13 až 18; (4) signální sekvenci obsahující kodon pro iniciační methionin (tučně v SEK. ID. Č: 47) a dalších 31 bází specificky překrývajících sekvenci na 5' konci klonu A1160, aby bylo umožněno přisednutí primerů. K amplifikaci inzertu z klonu A1160 byl spolu s primerem 5-PCR leader použit druhý primer nazvaný 3'-end frag (SEK. ID. Č: 48).
5'-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3 (SEK. ID. Č: 47)
5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3 (SEK. ID. Č: 48)
Vzniklý PCR produkt nebyl štěpen restrikčním enzymem BamHI nejspíše proto, že před restrikčním místem byl nedostatečný počet bází, což znemožnilo rozpoznání místa enzymem. U 5-primerů byla prodloužena délka sekvence předcházející místo pro BamHI (SEK. ID. Č: 47) a s amplifikovaným produktem první reakce byla opakována PCR reakce. 5-primer označený mAD.5.2 (SEK. ID. Č: 49) byl vytvořen přidáním nespecifických bází na pozici 1 až 4 a dalších 20 bází spe116 cificky překrývajících dříve použitý 5'-PCR leader primer .
5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3' (SEK. ID. Č: 49)
Primery mAD.5z.2 a 3'-end frag byly společně použity v PCR reakci, kde byl templátem produkt z první amplifikační reakce. Vzniklý druhý PCR produkt byl zaklonován do plazmidu pCRtmII (Invitrogen), podle návodu doporučeného výrobcem, a vzniklým plazmidem byly transformovány kompetentní buňky One shot (Invitrogen). Analýzou restrikčními emzymy BamHI a EcoRI byl identifikován jeden klon, který obsahoval PCR produkt, a tento klon byl sekvenován. Po ověření sekvence byl inzert vyštěpen restrikčními enzymy BamHI a EcoRI a izolován z gelu.
Inzert z klonu B3800 byl získán restrikčním štěpením enzymy EcoRI a Notl a následnou izolací z gelu. Tento inzert byl, spolu s fragmentem A1160 rozštěpeným restrikčními enzymy BamHI/EcoRI, přidán do ligační reakce, která probíhala 14 hodin při teplotě 14°C. K ligační reakci byl přidán vektor pcDNA.3 (Invitrogen), štěpený enzymy BamHI a Notl, a reakce pokračovala dalších 12 hodin. Z reakční směsi byl odebrán alikvot, kterým byly transformovány kompetentní buňky E. coli. Vzniklé kolonie byly namnoženy a s využitím primerů ll.b-l/2FORl a 11.b-l/2REVll (SEK. ID. Č: 50 resp. 51) byl analýzou PCR identifikován jeden pozitivní klon. Primery ll.b-l/2FORl a 11.b-l/2REVll přemosťují fragmenty A1160 a B3800, a tudíž slouží k detekci úspěšné ligace obou fragmentů (vznik PCR produktu). Sekvence pozitivního klonu byla ověřena pomocí primerů (zobrazené v SEK. ID. Č: 50 a 51), které amplifikují od báze 100 do 1405 za kodonem pro startovní methionin.
117 • · ·· · · · · · • · · · · fl· ···· « • fl ···· ··· fl · · · « · · fl* fl ♦
Příklad 23
Konstrukce knockoutovaných myší
Aby bylo možno přesněji určit imunologickou roli proteinu kódovaného předpokládanou myší cDNA ad, byla vytvořena knockoutovaná myš, v jejíž organizmu je sekvence genomové DNA kódující homolog ad přerušena pomocí homologní rekombinace. Na význam proteinu kódovaného porušeným genem je usuzováno z jeho nepřítomnosti. Produkce knockoutovaných myší je popsána v publikaci Deng a další, Mol. Cell. Biol. 13:2134 až 2140 (1993).
Prvním krokem při produkci takových myší je konstrukce plazmidu, který v sobě obsahuje sekvence, které budou vyřazeny (knockoutovány) homologní rekombinací. K identifikaci myší genomové sekvence kódující předpokládaný myší homolog ad z genomové knihovny λΠΧΙΙ byl použit fragment myší cDNA o velikosti 750 bází (odpovídající nukleotidům 1985 až 2733 v SEK. ID. Č: 45). Výsledkem prvního testování bylo 14 pozitivních plaků, z nichž sedm bylo potvrzeno druhým testováním. Ze dvou plaků byly získány lyzáty dávajících nejsilnější signál a λ DNA byla izolována pomocí konvenčních metod. Restrikční mapování a Southernova analýza potvrdila hodnověrnost jednoho z klonů (označený 14-1). Inzert DNA byl restrikčně štěpen enzymem Notl a zaklonován do vektoru Bluescript SKII+.
K identifikaci restrikčního fragmentu o velikosti přibližně o velikosti 9 až 14 kb, což je délka udávaná jako optimální pro uskutečnění homologní rekombinace, byla s cDNA sondou o velikosti 750 bp provedena Southernova hybridizace. Před hybridizaci byla pro klon 14-1 vytvořena restrikční mapa. Jako možný kandidát byl identifikován fragment o velikosti 12 kb, který byl zaklonován do vektoru pBluescript SKII+ do pozice, kde je myší DNA ohraničena kazetami kódujícími thymidin kinázu. Další analýza tohoto
118 • ·
klonu pomocí sondy domény I (odpovídající nukleotidům 454 až 1064 v SEK. ID. Č: 45) prokázala, že tento klon neobsahuje sekvenci kódující doménu I.
Genomová knihovna lambdaFIXII byla znovu testována použitím stejné sondy domény I. Ze šesti pozitivních klonů zůstal jeden pozitivní i po druhém testování. DNA izolovaná z tohoto klonu silně reagovala při Southernově analýze se sondou domény I. Při použití původní sondy o velikosti 750 bp nebyla detekována žádná odezva, avšak bylo zjištěno, že tento klon zahrnuje nukleotidy 1985 až 2773 v 5' oblasti ze SEK. ID. Č: 45.
Neexistence hybridizace se sondou o velikosti 750 bp může také naznačovat, že tento klon je dalším členem z rodiny integrinových proteinů. Z důvodu ověření věrohodnosti tohoto vysvětlení byl inzert o velikosti 13 kb zaklonován do vektoru pBluescript SKII+. Při použití primerů odpovídajících nukleotidovým sekvencím 441 až 461, 591 až 612, 717 až 739 a nukleotidové sekvenci 898 až 918 v reverzní orientaci v doméně I ad (SEK. ID. Č: 52) byla zjištěna sekvence purifikované DNA. Sekvence DNA byla získána jen při použití prvního primerů (441 až 461), a účinně amplifikován byl byl pouze exon nacházející se nejblíže 5' konci sekvence domény I. Amplifikace zbytku domény I neproběhla. Výsledný klon tedy obsahuje exon šest genu myšího ad a sekvence intronů přilehlých ke 3' a 5' konci tohoto exonu. Exon 7 nebyl v tomto klonu přítomen. Po sekvenování byl vytvořen konstrukt obsahující gen pro rezistenci na neomycin a gen pro thymidin kinázu.
Gen pro rezistenci na neomycin (neor) byl vnesen do plazmidu způsobem, který přerušil sekvenci genomové myší DNA kódující protein. Vzniklý plazmid tedy obsahuje gen neor uvnitř sekvencí myší genomové DNA, a to vše je uvnitř oblasti kódující thymidin kinázu. Takto zkonstruovaný plazmid je vyžadován proto, aby byla upřednostněna homologní
119 • ·
rekombinace před náhodnou rekombinací [Chisaka a další, Nátuře 355:516 až 520 (1992)].
Příklad 24
Klonování králičí ad - Vytvoření a testování králičí cDNA knihovny
Nalezení lidských homolog ad v organizmu potkanů a myší vedlo k výzkumům existence králičího homologu, který by mohl být užitečný v králičích modelech lidských nemocí popsaných níže.
Pomocí kitu FastTrack firmy Invitrogen (San Diego, CA), podle návodu uvedeného výrobcem, a reakčňích činidel dodaných v kitu byla z celé králičí sleziny připravena poly-A+ RNA. Z 1,65 g tkáně bylo izolováno 73 pg poly-A+ RNA. Tato RNA z králičí sleziny byla použita ke konstrukci cDNA knihovny ZAP Express s využitím kitu od firmy Stratagene (La Jolla, CA). Získaná cDNA byla směrově zaklonována do restrikčních míst EcoRI a Xhol v lambda ramenech fágmidového vektoru pBK-CMV. K zabalení lambda ramen do fágových částic byl použit kit Gigapack II Gold (Stratagene). Titr vzniklé knihovny byl odhadnut na přibližně 8 x 105 částic, s inzertem o průměrné velikosti 1,2 kb.
Knihovna byla jedenkrát amplifikována tak, aby narostlé plaky byly konfluentní a buněčný lyzát byl sebrán. Namnožená knihovna transformovaná do E. coli byla vyseta v koncentraci 30000 pfu/miska (průměr 150 mm) a vzniklá směs byla inkubována 12 až 16 hodin při teplotě 37°C, aby došlo k vytvoření plaků. Fágové DNA byly přeneseny na nylonové membrány Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights, Illinois). Membrány byly hybridizovány se směsí dvou radioaktivně značených sond myší ad PCR DNA připravených pomocí primerů o náhodné sekvenci. První sonda byla získána z PCR produktu,
120 • · · · fefefefe • fe ί» · · · · · · · · · • · · · · · ··· «···· fefe ·· «· fefe který zahrnuje nukleotidy 149 až 946 v SEK. ID. Č: 52. Druhá sonda byla získána z PCR produktu, který zahrnuje nukleotidy 2752 až 3651 v SEK. ID. Č: 52. Sondy byly za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označeny, a reakční směs byla nanesena na kolonu Sephadex G-50, aby byly odstraněny nezainkorporované nukleotidy. Hybridizační roztok se skládal z 5X SSPE, 5X Denhardtsova činidla, 1%
SDS, 40% formamidu a ze značených sond v koncentraci 1 x 106 dpm/ml. Hybridizace probíhala po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 42°C. Membrány byly intenzívně promyty v 2X SSPE/0,1% SDS při pokojové teplotě a exponovány na rentgenový film, aby došlo k vizualizaci všech hybridizovaných plaků.
Byly identifikovány dva klony, které vykázaly vysoký stupeň sekvenční homologie se sekvencí lidské ad. Klon #2 byl přibližně 800 bp dlouhý a mapoval 5' konec lidské ad.
Klon #2 obsahuje kodon pro startovní methionin a kompletní vedoucí sekvenci. Klon #7 byl přibližně 1,5 kb dlouhý a zahrnuje kodon pro startovní methionin. 5' konec klonu #7 překrýval klon #2, zatímco sekvence na 3' koncích končily v místech za sekvencemi domény I.Klon #7 byl kompletně osekvenován pomocí sekvenační metody primer-walking. Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence klonu #7 jsou zobrazeny v SEK. ID. Č: 100 resp. 101.
Předpovězená N-koncová aminokyselinová sekvence pro králičí ccd, jak byla určena z klonů #2 a #7, naznačila, že tento protein je ze 73% identický s lidským ad, ze 65% identický s myší ad a z 58% identický s myší CDllb, lidským CDllb a lidským CDllc. Nukleotidová sekvence klonu #2 je zobrazena v SEK. ID. Č: 92; předpovězená aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 93.
121
S využitím radioaktivně značeného králičího klonu #7 a opětného testování cDNA knihovny, ze které tento fragment pocházel, byl proveden pokus o získání nezkrácené cDNA kódující králičí ad. Bylo identifikováno dalších 25 klonů a nejdelší byl klon označený jako #49. S využitím techniky síťových delecí byla zjištěna kompletní sekvence klonu #49. Nukleotidové a aminokyselinová sekvence klonu #49 jsou zobrazeny v SEK. ID. Č: 102 resp. 103. Jelikož se klony #7 a #49 nepřekrývají, byly navrženy oligonukleotidy, které by mohly být použity jako primery při PCR s prvním řetězcem králičí slezinné cDNA; cílem tohoto postupu je izolace chybějící sekvence.
Vztah mezi předpokládanými aminokyselinovými sekvencemi těchto dvou neúplných klonů a ostatních leukointegrinů je popsán v Tabulce 1.
Tabulka 1.
Procento shody v aminokyselinové sekvenci u členů rodiny integrinů β2
Lidská ad | Králičí #7 | Králičí #49 | |
Lidská ad | 100 | 74 | 80 |
Myší ad | 70 | 67 | 74 |
Potkaní otd | 70 | 66 | 73 |
Myší CDlla | náhodná* | 28 | 28 |
Myší CDllb | 55 | 59 | 53 |
Lidská CDlla | 36 | 28 | 28 |
Lidská CDllb | 60 | 58 | 55 |
Lidská CDllc | 66 | 59 | 62 |
* je-li shoda < 25%, považuje se tato shoda za náhodnou
122 ···· · · · · · · «· kft «· ·· ·0
Izolace klonu králičí ad umožňuje expresi proteinu, a to buď na povrchu transfekovaných buněk nebo ve formě rozpustného nezkráceného nebo zkráceného proteinu. Získaný protein je následně použit jako immunogen pro produkci monoklonálních protilátek, které najdou uplatnění v králičích modelech lidských chorob.
Příklad 25
Živočišné modely pro určení terapeutické využitelnosti ad
Imunohistologická data získaná u psů a in šitu hybridizace u potkanů a myší určila, že ad je exprimován hlavně makrofágy přítomnými v červené pulpě sleziny. V mízních uzlinách byl ad nalezen v kapilárách a dutinách ve dřeni. Distribuce polypeptidu ad je značně podobná distribuci, která byla získána pro dva myší antigeny rozpoznávané monoklonálními protilátkami F4/80 a SK39. Zatímco biochemická charakterizace těchto myších antigenu ukázala jejich odlišnost od ocd, je velmi pravděpodobné, že ad určuje stejnou subpopulací makrofágů jako myší antigeny F4/80 a SK39.
U myší byl zjištěn výskyt SK39+ makrofágů v červené pulpě sleziny, kde se nejspíše účastní odstraňování cizorodého materiálu z oběhu, a v dřeni mízních uzlin [Jutila a další, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993)]. SK39+ makrofágy byly pozorovány také v místech akutního a chronického zánětu. Navíc monocyty infiltrované v dutinách peritonea, ve kterých byl zánět vyvolán působením thioglykolátu, také exprimují antigen SK39. Souhrnem tyto výsledky naznačují, že jestliže jsou SK39+ buňky také ad pozitivní, pak jsou tyto buňky odpovědné za odstranění cizorodého materiálu ve
123 • · · · • · · · • » « · * · · · · a··· « * · ♦ » · · ···· · • « ···· ··· «·««« · · · · « » · · slezině a účastní se při zánětech, kde hrají makrofágy důležitou roli.
Zatímco funkce ad zůstává neznámá, jiné mnohem lépe charakterizované integriny β2 se účastní celé řady adhezních dějů, které usnadňují migraci buněk, posilují fagocytózu a podporují mezibuněčné interakce. Všechny tyto události vedou k urychlení zánětlivých dějů. Proto je velmi pravděpodobné, že ovlivnění normální funkce ad může současně narušit průběh zánětu, kde hrají makrofágy důležitou roli. Takový protizánětlivý účinek by mohl být výsledkem: a) zamezení infiltrace makrofágů do míst zánětů; b) zamezení aktivace makrofágů v místě zánětu nebo c) rušení účinku efektorových funkcí makrofágů, které poškozují zdravou hostitelskou tkáň buď specifickou autoimunitní reakcí nebo následkem poškozování okolních buněk.
Mezi nemoce, u kterých existují důkazy o tom, že zde makrofágy hrají důležitou roli, patří roztroušená skleróza, artritida, arterioskleróza štěpu, některé formy diabetů a zánětlivé střevní onemocnění. U živočišných modelů, diskutovaných níže, bylo prokázáno, že tyto modely reprodukují mnoho rysů zmíněných lidských poruch. Aby bylo možno určit, zda-li existuje možnost léčby odpovídajících nemocí u lidí, byly na těchto modelových systémech testovány inhibitory funkce ad.
A. Arterioskleróza štěpu
Transplantace srdce je nyní, u některých typů srdečních chorob v konečném stádiu, přijímanou formou lékařského zákroku. Používání cyklosporinu A zvýšilo počet přeživších první rok po transplantaci na 80%, avšak rozvoj progresivní formy arteriosklerózy štěpu se projevil jako nejčastější příčina smrti u osob po prvním roce po transplantaci srdce. Nedávné studie prokázaly u 36 až 44% případů výskyt arteri124 • · • · · · • · • *
osklerózy štěpu v období tří let po transplantaci srdce [Adams a další, Transplantation 53:1115 až 1119 (1992); Adams a další, Transplantation 56:794 až 799 (1993)].
U arteriosklerózy štěpu se typicky vyskytují difúzní, okluzní a intimální léze, které postihují celou stěnu věnčitých cév. V těchto lézích dochází často k ukládání lipidů. Patogeneze arteriosklerózy štěpu zůstává neznámá, avšak pravděpodobně je spojená s histokompatibilitní odlišností mezi dárcem a příjemcem, a je ve své podstatě vyvolaná činností imunitního systému. Z histologického hlediska jsou oblasti, ve kterých dochází ke ztlušťování vnitřní cévní stěny, tvořeny především makrofágy, i když je zde občas pozorována i přítomnost T-buněk. Je proto možné, že makrofágy exprimující ad, hrají při indukci a/nebo rozvoji arteriosklerózy štěpu důležitou roli. V takových případech by osobám s transplantovaným srdcem, u nichž existuje riziko rozvinutí arteriosklerózy štěpu, mohly být preventivně podávány monoklonální protilátky nebo nízkomolekulární inhibitory funkce ad (například rozpustný ICAM-R).
Ačkoliv arterioskleróza štěpu představuje největší ohrožení života pro pacienty s transplantovaným srdcem, byl výskyt arteriosklerózy štěpu pozorován rovněž u pacientů s jinými transplantovanými orgány včetně jater a ledvin. Terapeutické použití látek blokujících funkci ad by mohlo zabránit vzniku arteriosklerózy štěpu u osob s jinými transplantovanými orgány a snížit komplikace vyplývající ze selhání transplantovaného orgánu.
Jeden model pro arteriosklerózu štěpu u potkanů zahrnuje heterotypické srdeční alloštěpy transplantované přes menší histokompatibilní bariéry. Když jsou srdeční alloštěpy z potkanů Lewis transplantovány do organizmu příjemců F344, vyznačujících se vzhledem k dárcům kompatibilitou MHC glykoproteinů I. a II. třídy, 80% alloštěpů přežívá alespoň
125 • · • · · · ·
• · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · «· · · · · · • · · · · · · · · • · « » · ·· · · · · 4 * týdny a 25% alloštěpů přežívá neomezeně dlouhou dobu. Při tomto velmi nízkém počtu odmítnutých štěpů se v srdci dárce vytvářejí arteriosklerotické léze. Arteriální léze v alloštěpech starých 120 dní obvykle vykazují typické difúzní fibrotické ztluštění vnitřní stěny cévy, které je na pohled nerozlišitelné od lézí v arteriosklerotických štěpech pozorovaných u odmítnutých lidských srdečních alloštěpů.
Potkanům jsou transplantovány srdce, která se v méně důležitých histokompatibilních antigenech liší od genotypu příjemce. Takovým příkladem jsou transplantace z potkanů Lewis do potkanů F-344. Příjemcům transplantátů jsou pravidelně podávány monoklonální protilátky specifické proti potkanímu ad nebo nízkomolekulární inhibitory ocd. Očekává se, že tato léčba sníží incidenci arteriosklerózy štěpu v neodvržených srdcích dárců. Léčba potkanů pomocí monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulárních inhibitorů nemusí být omezena pouze na prevenci. Očekává se rovněž, že zablokování funkce ad povede ke zmírnění zánětu zprostředkovaného makrofágy a umožní zvrat požkození artérií v transplantátu.
B. Arterioskleróza u králíků krmených cholesterolem
U králíků, kteří byli, po dobu přibližně 12 až 16 týdnů, krmeni aterogenní dietou s přídavkem cholesterolu, došlo ke vzniku lézí na vnitřní straně cév, a tyto léze pokrývaly většinu lumenálního povrchu vzestupného úseku aorty [Rosenfeld a další, Arteriosclerosis 7:9 až 23 (1987); Rosenfeld a další, Arteriosclerosis 7:24 až 34 (1987)]. Aterosklerotické léze pozorované u těchto králíků jsou mírnější než tytéž u lidí. V těchto lézích je přítomen velký počet T-buněk, z nichž většina exprimuje CD45RO, který je markérem paměťových T-lymfocytů. Přibližně polovina z infiltrovaných T-buněk exprimuje antigen MHC II. třídy a ně126 • · · · • * · · · · · ·· * · » · · « · · · · 4 ·
44 4 4 44 4 4 4 4 44 které exprimují receptor pro IL-2, což naznačuje, že mnohé z těchto buněk se nacházejí v aktivovaném stavu.
Jedním z rysů aterosklerotických lézí pozorovaných u králíků krmených cholesterolem, který se ale zřejmě nevyskytuje u hlodavčích modelů, je akumulace lézí bohatých na přítomnost pěnových buněk. Předpokládá se, že vznik pěnových buněk (makrofágy) je důsledkem příjmu oxidovaných lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) prostřednictvím specifických receptorů. Bylo zjištěno, že oxidované částice LDL jsou toxické pro některé typy buněk včetně endotheliálních buněk a buněk hladké svaloviny. Příjem těchto potenciálně toxických oxidovaných částic LDL makrofágy slouží jako iritant a pomáhá aktivovat makrofágy, což přispívá k vytvoření zánětů doprovázejících výskyt aterosklerotických lézí.
Jakmile byly připraveny monoklonální protilátky proti králičí ocd, začala léčba králíků krmených cholesterolem. Léčba zahrnovala podávání monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulárních inhibitorů, aby bylo prokázáno, že ad + makrofágy se účastní těchto procesů během onemocnění. Dodatečné studie by ukázaly, že monoklonální protilátky proti ad nebo nízkomolekulární inhibitory mohou zvrátit cévní poškození detekované u králíků během aterogenní diety.
C. Inzulin-dependetní diabetes
U potkanů BB se inzulin-dependetní diabetes samovolně vyvinul v období mezi 70. až 150. dnem života. Pomocí imunohistochemických analýz byla již v ranném stádiu nemoci pozorována v Langerhansových ostrůvcích přítomnost infiltrovaných MHC II+ a ED1+ makrofágů. Mnoho makrofágů se zdá být zaměstnáno fagocytózou buněčných trosek nebo normálních buněk. S postupem nemoci je pozorován stále se zvětšující počet makrofágů infiltrujících Langerhansovy ostrůvky, a rovněž se zdá, že se do tohoto místa soustředí velké množ127 • · · • 0 0· ství T-buněk a později také B-buněk [Hanenberg a další, Diabetologia 32:126 až 134 (1989)].
Rozvoj cukrovky u potkanů BB se zdá být závislý, jak na časné infiltraci makrofágů, tak na následném soustřeďování T-buněk. Léčba potkanů BB pomocí částic oxidu křemičitého, které jsou pro makrofágy toxické, byla účinná tím, že zabránila infiltraci makrofágů do Langerhansových ostrůvků v časném stádiu nemoci. Bez časné infiltrace makrofágů nenastává následné poškození tkáně autoagresivní populací lymfocytů. Podávání monoklonální protilátky OX-19 (specifické proti potkanímu CD5) nebo monoklonální protilátky OX-8 (specifické proti potkanímu CD8), které blokují fázi nemoce spojenou s T-buňkami, je rovněž účinné při potlačení rozvoje diabetů.
Centrální role kterou mají makrofágy v patologii tohoto modelu, činí tento model atraktivní pro testování inhibitorů funkce ad. Potkani geneticky predisponovaní k rozvinutí inzulin-dependetního diabetů jsou léčeni monoklonálními protilátkami proti ad nebo nízkomolekulárními inhibitory, a je u nich vyhodnocován vývoj onemocnění. Zabránění nebo oddálení nástupu nemoci je důkazem, že ad hraje klíčovou roli v poškození buněk ostrůvků způsobeném makrofágy.
D. Zánětlivé střevní onemocnění (Crohnova choroba, vředovitá kolitida)
Živočišné modely, použité při studiu zánětlivého střevního onemocnění (IBD - inflammatory bowel disease), jsou zpravidla vystaveny intrarektálnímu podávání škodlivých dráždidel (například kyselina octová nebo kyselina trinitrobenzensulfonová/ethanol). Zánět tračníku vyvolaný těmito látkami je výsledkem chemického nebo metabolického poškození a postrádá chronický a spontánně recidivní charakter, doprovázející lidské zánětlivé střevní onemocnění. Nicméně se zdá, že nedávno popsaný model využívající subserózní in128 • · · · jekce purifikovaného polymeru peptidoglykan-polysacharid (PG-PS) získaného ze streptokoků skupiny A nebo skupiny D, poskytuje lepší, fyziologicky relevantní model pro lidské IBD [Yamada a další, Gastroenterology 104:759 až 771 (1993)].
V tomto modelu je PG-PS aplikován do subserózní vrstvy distálního tračníku. Vyvolaná zánětlivá odezva má dvě fáze, první akutní fázi tři dny po injekci, která je následována spontánní chronickou fází o tři až čtyři týdny později. Odezva pozdní fáze je ve své podstatě granulomatózní a vede ke ztluštění tračníku, adhezím, ke vzniku uzlíků a mukózních lézí. Kromě poškození sliznice vede kolitida (vyvolaná PG-PS) často k artritidě, anémii a granulomatózní hepatitidě. Extraintestinální projevy nemoci činí model atraktivní pro studium Crohnovy kolitidy, proto, že velké množství pacientů s rozvinutou Crohnovou chorobou trpící záněty kloubů a hepatobiliárními záněty.
Vznik granulomatózních lézí je důsledkem chronického zánětu, který vede k infiltraci a následné aktivaci buněk z linie monocyty/makrofágy. Výskyt granulomatózních lézí u Crohnovy choroby a u výše zmíněného živočišného modelu, činí z tohoto modelu atraktivní klinický cíl pro monoklonálni protilátky namířené proti ad a pro jiné inhibitory funkce ad. U inhibitorů funkce ad se očekává zamezení tvorby lézí doprovázejících IBD či dokonce zvrat v tkáňových poškozeních vyskytujících se u této nemoci.
E. Artritida
Zdá se, že artritida je multifaktoriální onemocnění, kterého se účastní různé typy buněk zánětu, včetně neutrofilů, T-lymfocytů a fagocytárních makrofágů. Ačkoli existuje celá řada modelů artritidy, aplikace proteoglykanu zís129 • · • · kaného z buněčné stěny streptokoků způsobuje poruchu nejvíce podobnou lidskému onemocnění.
V organizmu potkanů vyvolává buněčná stěna streptokoků zánět periferních kloubů, který je charakterizován opakovanými záchvaty postupujícího onemocnění následovanými remisemi a nakonec, během několika měsíců, končí destrukcí kloubu [Cromartie a další, J. Exp. Med. 146:1585 až 1602 (1977); Schwab a další, Infection and Immunity 59:4436 až 4442 (1991)]. Předpokládá se, že největší roli v destrukci synovie hrají během chronické fáze onemocnění mononukleární fagocyty a makrofágy. Mimoto látky potlačující infiltraci makrofágů do synovie účinně snižují zánětlivé a patologické charakteristiky artritidy.
Centrální role makrofágů při destrukci synovie vedoucí k artritidě naznačuje, že monoklonální protilátky proti ad a inhibitory funkce ad mohou být při léčbě tohoto onemocnění terapeuticky účinné. Stejně jako u výše popsaných modelů se předpokládá, že tyto monoklonální protilátky a nízkomolekulární inhibitory podávané preventivně zablokují nebo zmírní kloubní zánět a zabrání zničení synovie. Látky mající rušivý vliv na funkci ad mohou rovněž zmírnit probíhající zánět tím, že zabrání infiltraci dalších makrofágů ke kloubu a zablokují aktivaci makrofágů. Výsledným efektem by byl zvrat postupující destrukce kloubu a usnadnění uzdravení tkáně.
F. Roztroušená skleróza
Ačkoli patogeneze roztroušené sklerózy (MS) zůstává nejasná, je všeobecně přijímáno, že onemocnění je zprostředkováno CD4+ T-buňkami, které rozpoznávají autoantigeny přítomné v centrálním nervovém systému a zahajují tak zánětlivou kaskádu. Vzniklá imunitní odezva má za následek infiltraci dalších buněk zánětu, včetně aktivovaných makrofágů,
130 ·· ···· ·· ···· ·· ·· ·· « · · · · · · · • · ··· *··« • · ·· · · · · · · · · • · · · · · ··· ····· ·· · · ·· ·· které přispívají k rozvoji onemocnění. Živočišný model experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) reprodukuje některé aspekty onemocnění MS. Nedávno bylo prokázáno, že monoklonální protilátky reagující s CDllb/CDl8 přítomnými na makrofázích způsobujících zánět [Huitinga a další, Eur. J. Immunol. 23:709 až 715 (1993)] blokují jak klinické, tak histologické příznaky onemocnění. Výsledky napovídají, že monoklonální protilátky nebo nízkomolekulární inhibitory polypeptidu ocd jsou pravděpodobně u onemocnění EAE účinné v blokování zánětlivé reakce. Tyto látky mají tedy důležité terapeutické uplatnění při léčbě MS.
G. Alveolitida vyvolaná imunitním komplexem (Immune Complex Alveolitis)
Alveolární makrofágy lokalizované v alveolárních sklípcích, kanálcích, pojivové tkáni a pohrudničních dutinách plic, představují první obrannou linii plic proti látkám vdechovaným z okolního prostředí. Jako odezvu na stimulaci látkami (bakteriální lipopolysacharid, interferon IFN-γ a imunitní komplex) produkují alveolární makrofágy celou řadu silných mediátorů zánětu, včetně velmi reaktivních kyslíkových radikálů a dusíkatých meziproduktů. Zatímco hyperoxidové anionty, peroxidy vodíku a oxidy dusíku (NO·) mají důležitou funkci při ničení patogenů a lýzi nádorů, mohou tyto látky ve zdravých tkáních způsobit jejich poškození.
U potkaního modelu alveolitidy vyvolané imunitním komplexem bylo prokázáno, že produkce NO· alveolárními makrofágy způsobuje mnoho z poškození plic [Mulligan a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88:638 až 6342 (1991)]. Radikály NO· vykonávají funkci mediátorů i u jiných poškození spojených s imunitním komplexem, včetně dermální vaskulitidy [Mulligan a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88:638
131
až 6342 (1991)], a mohly by potenciálně hrát roli u nemocí jako je například glomerulonefritida.
Poškození způsobená NO· nejsou omezena jen na záněty s účastí imunitního komplexu. Například mikrogliální buňky stimulované látkami jako je PMA, LPS nebo IFN-γ, produkují NO· v množství schopném usmrtit oligodendrocyty [Merrill a další, Immunol.151:2132 (1993)]. Bylo zjištěno, že pankreatické ostrůvky jsou citlivé k radikálům NO· a uvolňování tohoto mediátoru makrofágy způsobilo poškozování tkání, které vedlo k diabetů [Kroncke a další, BBRC 175:752 až 758 (1991)]. Nedávno bylo přesvědčivě dokázáno, že produkce NO· hraje roli u endotoxického šoku [MacMicking a další, Cell 81:641 až 650 (1995)]. Když byl aplikován lipopolysacharid (LPS) zdravým myším divokého typu, byl pozorován vážný progresivní pokles tepenného tlaku končící smrtí. U myší, u nichž nelze indukovat tvorbu NO·, byl, v reakci na přítomnost LPS, pozorován mnohem menší pokles tepenného tlaku a všechny myši tento experiment přežily.
Pokusy prováděné in vitro prokázaly, že zablokování ocd je účinné při potlačení některých aspektů aktivace makrofágů (nebo obecně leukocytů exprimujících ad) , včetně uvolňování NO·. Alveolární makrofágy stimulované za přítomnosti polyklonálního séra proti ad (proti potkaní doméně I polypeptidu ad, připravené v králících) produkovaly podstatně méně dusitan/dusičnanových produktů při odbourávání NO·, než makrofágy vystavené působení kontrolního séra. Tato zjištění dokazují, že monoklonální protilátky namířené proti ad, konkrétně proti I-doméně, mohou být účinnými protizánětlivými činidly s možným využitím u MS, diabetů, zánětu plic a endotoxického šoku. Navíc, v protikladu k CD18 podjednotce, která ovlivňuje funkci celé řady typů leukocytů, omezená distribuce ad činí z této podjednotky mnohem atrak132 ··· · •fl ···· ·· » · · · · · ···· • · fl · fl flfl ·· ·· flfl tivnější cíl (než je tomu u CD18) pro blokování aktivace makrofágů (nebo obecně leukocytů exprimujících ad) .
Alveolitida vyvolaná potkaním IgG imunitním komplexem je obecně používaný experimentální model důležitý pro porozumění akutnímu poranění plic. Toto poranění je vyvoláno nakapáním protilátek namířených proti hovězímu sérovému albuminu (BSA) do plic pomocí tracheální kanyly, následovaným intravenozní injekcí BSA. Zformování imunitních komplexů v plicních kapilárách vede k aktivaci komplementu a infiltraci neutrofilů do plic. Podle všeho, po zformování imunitních komplexů v plicích, dojde k extravazaci leukocytů z krve a následnému pohybu leukocytů přes plicním epitel. Následné uvolnění mediátorů včetně radikálů, TNF-α a NO· z aktivovaných endoteliálních buněk, neutrofilů a makrofágů, přispívá k postupu onemocnění. Patologické rysy onemocnění zahrnují zvětšení vaskulární permeability vedoucí k otokům a přítomnosti velkého počtu erytrocytů a polymorfonukleárních buněk v alveolárních dutinách.
Polyklonální sérum specifické proti doméně I polypeptidu ad bylo testováno na potkaním modelu alveolitidy vyvolané imunitním komplexem. Toto polyklonální sérum bylo aplikováno do plic tracheální kanylou spolu s protilátkami proti BSA. Poranění plic bylo následně vyvoláno intravenozní aplikací BSA se stopovým množstvím BSA značeného izotopem 125I (přibližně 800000 cpm) , aby mohl být kvantifikován otok vzniklý poraněním plic. Plicní poranění probíhalo další 4 hodiny a velikost poranění byla vyhodnocena z hodnoty plicní permeability, která je definována jako poměr BSA značeného izotopem 125I v plicích ku jeho množství přítomném v krvi. Typické hodnoty plicní permeability pro pozitivní kontrolu leží mezi 0,6 až 0,8, zatímco negativní kontroly (potkany, které nedostaly BSA) mají hodnoty plicní permeability v rozsahu 0,1 až 0,2.
133 ·· ··*· ·· ·· • · · · · · ·· ··
První studie dokázaly, že při léčbě pomocí polyklonálního séra proti ocd se snižuje permeabilita plic o více než 50%, což představuje dramatické zmírnění plicního poranění. Z historie je známé snížení permeability plic o 60%, kterého bylo dosaženo podáváním protilátek proti CD18. Tato zjištění dokazují, že ad může být nejdůležitšjší integrin β2 během akutního poranění plic, ačkoli nemůže být přesně určeno, jestli účinek protilátek zabraňuje extravazaci leukocytů z krve nebo pohybu leukocytů přes plicním epitel.
Dalším důkazem skutečnosti, že polypeptid ad zmírňuje průběh poranění plic, bylo stanovení hladiny TNF-α v kapalině získané výplachem jejich bronchoalveolární části. Při podáváním protilátek proti ad byl zjištěn čtyřnásobný pokles hladiny TNF-α. TNF-alfa byl již dlouho považován za důležitý mediátor u akutního zánětu plic a látku odpovědnou za infiltraci buněk zánětu do míst zánětu, aktivaci buněk a poškození tkání. Sérum namířené proti ad pravděpodobně blokuje aktivaci rezidentních alveolárních makrofágů během vzniku alveolitidy vyvolané imunitním komplexem, a tím zmírňuje uvolňování TNF-alfa a NO· a snižuje následné poškození tkání způsobené těmito látkami a infiltrací neutrofilů.
Příklad 26
Exprese ad v preklinických modelech
Aby mohla být stanovena rozdílná exprese ad v různých stádiích onemocnění, byly řezy tkání z živočišných modelů onemocnění značeny polyklonálním sérem proti ad získaným, postupem popsaným výše (viz Příklad 18). Tkáně ze zdravých a nemocných potkanů byly rozřezány na tloušťku 6 pm a vysušeny na vzduchu na podložních sklíčkách Superfrost Plus
134 ·· ·«·· • · · · ·· · · · « · · · » » · ··· « · · · • · ·· · · · · · · · · • · · · · · ··· ····· · · ·· ·· · · (VWR Scientific) přes noc při pokojové teplotě. Po vysušení byly řezy až do použití skladovány při teplotě -70°C. Před použitím byla sklíčka přeložena z -70°C na přibližně 5 minut do 50°C. Řezy byly po dobu 10 minut při pokojové teplotě fixovány studeným acetonem (4°C) (Stephens Scientific) a ponechány schnout při pokojové teplotě. Každý řez byl, po dobu 30 minut při pokojové teplotě, blokován 150 μΐ roztoku o složení 30% normální potkaní sérum (Harlan Bioproducts), 5% normální kozí sérum (Vector Laboratories) a 1% hovězí sérum (BSA) (Sigma Chemical Company) v IX TBS, a následně byl roztok z řezů jemně odsát. Králičí polyklonální sérum (koncentrace proteinu 34 pg/ml) a sérum ze stejného králíka (získané před imunizací) (koncentrace proteinu 38,5 pg/ml) bylo zředěno v blokovacím roztoku. Ke každému řezu bylo poté, na dobu 30 minut při teplotě 37°C, přidáno 100 μΐ jednotlivého séra. Roztok protilátek byl poté odsán a nenavázané protilátky odstraněny trojnásobným promytím v IX TBS vždy po dobu 5 minut. Po posledním promytí byl nadbytek TBS odstraněn odsátím. Biotinylovaná kozí protilátka namířená proti králičím Ig byla připravena s využitím kitu Elitě Rabbit IgG Vectastain ABC (Vector), podle návodu doporučeného výrobcem, a 100 μΐ výsledného roztoku bylo naneseno na každý řez na 15 minut při teplotě 37°C. Sklíčka byla dvakrát promývána v IX TBS, vždy po dobu 5 minut. Potom bylo na tkáňové řezy naneseno 100 μΐ konjugátu streptavidinzlato (Goldmark Biologicals) ředěného v poměru 1:100 v 5% normálním potkaním séru a 1% BSA, a tento roztok byl ponechán působit 1 hodinu při pokojové teplotě. Sklíčka byla třikrát promývána pufrem TBS, vždy po dobu 5 minut, a následně na ně bylo, na 5 minut při pokojové teplotě, naneseno 100 μΐ 1% glutaraldehydu (Sigma) v TBS pufru. Sklíčka byla opět třikrát promývána v TBS, vždy po dobu 5 minut, a pětkrát ve sterilní deionizované vodě, vždy po dobu 3 minut. Přebytek kapalin byl odsát a na každý řez byly nanese135 • a ···· aa · ·« « ·· ·· • · a a · a a a a a • · » a · a a aa • a a a a aa ·· · a a • a » · · · aaa • a a a a a· a a a· aa ny dvě kapky stříbrného zesilujícího roztoku a dvě kapky iniciačního roztoku (Goldmark Biologicals). Reakce byla ponechána probíhat 20 až 30 minut při pokojové teplotě. Poté byly řezy důkladně opláchnuty sterilní deionizovanou vodou, vysušeny přes noc při pokojové teplotě na vzduchu a překryty Cytoseal 60 (VWR). Jako kontrola byly, při stejných pokusech a podle stejného protokolu, použity řezy tkání značené monoklonálními protilátkami rozpoznávajícími CDlla,
CDllb, CDllc a CD18.
Značení polyklonálním sérem proti ad a značení monoklonálními protilátkami proti CDlla, CDllb, CDllc a CD18 odhalilo u ad, ve srovnání s distribucí pozorovanou u jiných podjednotek a, odlišnou distribuci značky.
V normální plicní tkáni byla exprese ad detekována na respiračním epitelu průdušek (avšak ne na epitelu plicních sklípků) a na jednotlivých buňkách, což by mohly být alveolární makrofágy ve vzduchových kanálcích. Signál pozorovaný při značení pomocí polyklonálního séra byl podstatně silnější než signál pozadí, pozorovaný při kontrole prováděné se sérem získaným před imunizací. V plicní granulomatózní tkáni, byl, 24 a 96 hodin po aplikaci glykanu, detekován odlišný signál, kdy se ad značení objevilo v respiračním epitelu uvnitř plicních sklípků a silnější signál byl zaznamenán na alveolárních makrofázích uvnitř vzduchových kanálků. V plicní tkáni živočichů podle všeho zotavených z onemocnění (usmrcených 16 dní po aplikaci glykanu), nebyl pozorován žádný signál při značení protilátkou proti ad. U každé z těchto tkání byl detekován, při značení pomocí séra získaného před imunizací, velmi slabý signál pozadí.
Při použití potkaní plicní tkáně v modelu astma vyvolaného antigenem byl, v respiračním epitelu jak průdušek, tak plicních sklípků, detekován velmi silný signál protilátky namířené proti ad. Intenzita tohoto signálu byla podstatně
136 ·· ·«·· ·· ··♦· • « ···· ·· ·· • · · · ···· • · · · · · ·* • · · · · · ··· · · • ···· ··· • ·· ·· ·· ·· vyšší než úroveň signálu pozadí získaná při použití kontrolního séra z neimunizovaného živočicha.
Je možné předpokládat, že odborníky napadnou další četné modifikace a variace vynálezu vysvětleného ve výše uvedených ilustrativních příkladech. Proto by pro vynález měla platit pouze ta omezení, která jsou uvedena v připojených patentových nárocích.
137
SEZNAM SEKVENCÍ ·· ·· (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) | PŘIHLAŠOVATEL: Gallatin, W. Michael | |||
Van der Vieren, Monica | ||||
(ii) | NÁZEV VYNÁLEZU: Nová alfa podjedentka lidského | i integrinu | β2 | |
iii) | POČE1 | ’ SEKVENCÍ: 103 | ||
(iv) | ADRESA PRO KORESPONDENCI: | |||
(A) | ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a | patentová | kancelář | |
(B) | ULICE: Národní 32 | |||
(C) | MĚSTO: Praha 1 | |||
(D) | STÁT: Česká Republika | |||
(E) | PSČ: 116 66 |
(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.25 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) ZATŘÍDĚNÍ:
(vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/173497 (B) DATUM PODÁNÍ: 23. Prosince 1993 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/286889 (B) DATUM PODÁNÍ: 5. Října 1994 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/362652 (B) DATUM PODÁNÍ: 21. Prosince 1994 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: GOWSHALL, Jonathan Vallance (B) ČÍSLO SPISU: P11779SK-JVG/smt (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3726 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
138 • · · · · · • · ·· · · · *··· • · · · · ·· · · · · · • · ···· ··· ····· ·· «4» · · ·· (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 3..3485 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:l:
TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47
Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His
10 15
GGA Gly | TTC Phe | AAC Asn | CTG Leu | GAT Asp 20 | GTG Val | GAG Glu | GAG Glu | CCT Pro | ACG Thr 25 | ATC Ile | TTC Phe | CAG Gin | GAG Glu | GAT Asp 30 | GCA Ala | 95 |
GGC | GGC | TTT | GGG | CAG | AGC | GTG | GTG | CAG | TTC | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | 143 |
Gly | Gly | Phe | Gly | Gin | Ser | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GTG | GGA | GCA | CCC | CTG | GAG | GTG | GTG | GCG | GCC | AAC | CAG | ACG | GGA | CGG | CTG | 191 |
Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val | Val | Ala | Ala | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
TAT | GAC | TGC | GCA | GCT | GCC | ACC | GGC | ATG | TGC | CAG | CCC | ATC | CCG | CTG | CAC | 239 |
Tyr | Asp | Cys | Ala | Ala | Ala | Thr | Gly | Met | Cys | Gin | Pro | Ile | Pro | Leu | His | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
ATC | CGC | CCT | GAG | GCC | GTG | AAC | ATG | TCC | TTG | GGC | CTG | ACC | CTG | GCA | GCC | 287 |
Ile | Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala | |
80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
TCC | ACC | AAC | GGC | TCC | CGG | CTC | CTG | GCC | TGT | GGC | CCG | ACC | CTG | CAC | AGA | 335 |
Ser | Thr | Asn | Gly | Ser | Arg | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Leu | His | Arg | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GTC | TGT | GGG | GAG | AAC | TCA | TAC | TCA | AAG | GGT | TCC | TGC | CTC | CTG | CTG | GGC | 383 |
Val | Cys | Gly | Glu | Asn | Ser | Tyr | Ser | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TCG | CGC | TGG | GAG | ATC | ATC | CAG | ACA | GTC | CCC | GAC | GCC | ACG | CCA | GAG | TGT | 431 |
Ser | Arg | Trp | Glu | Ile | Ile | Gin | Thr | Val | Pro | Asp | Ala | Thr | Pro | Glu | Cys | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
CCA | CAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATC | GTC | TTC | CTG | ATT | GAC | GGC | TCT | GGA | AGC | 479 |
Pro | His | Gin | Glu | Met | Asp | Ile | Val | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | |
145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
ATT | GAC | CAA | AAT | GAC | TTT | AAC | CAG | ATG | AAG | GGC | TTT | GTC | CAA | GCT | GTC | 527 |
Ile | Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin | Met | Lys | Gly | Phe | Val | Gin | Ala | Val | |
160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
ATG | GGC | CAG | TTT | GAG | GGC | ACT | GAC | ACC | CTG | TTT | GCA | CTG | ATG | CAG | TAC | 575 |
Met | Gly | Gin | Phe | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr | Leu | Phe | Ala | Leu | Met | Gin | Tyr | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TCA | AAC | CTC | CTG | AAG | ATC | CAC | TTC | ACC | TTC | ACC | CAA | TTC | CGG | ACC | AGC | 623 |
Ser | Asn | Leu | Leu | Lys | Ile | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Gin | Phe | Arg | Thr | Ser |
195 200 205
139 • · · · • · · · · ·
CCG | AGC | CAG | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | CCC |
Pro | Ser | Gin 210 | Gin | Ser | Leu | Val | Asp 215 | Pro |
ACG | TTC | ACG | GCC | ACG | GGC | ATC | CTG | ACA |
Thr | Phe 225 | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile 230 | Leu | Thr |
CAT | AAG | AAT | GGG | GCC | CGA | AAA | AGT | GCC |
His 240 | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg 245 | Lys | Ser | Ala |
ACA | GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GAC | CCC |
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys 260 | Tyr | Lys | Asp | Pro |
ccc | CAG | GCA | GAG | AAG | GCT | GGC | ATC | ATC |
Pro | Gin | Ala | Glu 275 | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile 280 |
CAC | GCT | TTC | CAG | GGA | CCC | ACT | GCC | AGG |
His | Ala | Phe 290 | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala 295 | Arg |
TCA | GCG | CCT | CCG | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC |
Ser | Ala 305 | Pro | Pro | Gin | Asp | His 310 | Val | Phe |
CTT | GGC | AGC | ATC | CAG | AAG | CAG | CTG | CAG |
Leu 320 | Gly | Ser | Ile | Gin | Lys 325 | Gin | Leu | Gin |
GGA | ACC | CAG | TCC | AGG | GCA | AGC | AGC | TCC |
Gly | Thr | Gin | Ser | Arg 340 | Ala | Ser | Ser | Ser |
GAA | GGC | TTC | AGC | ACA | GCC | CTC | ACA | ATG |
Glu | Gly | Phe | Ser 355 | Thr | Ala | Leu | Thr | Met 360 |
GTG | GGG | AGC | TTT | AGC | TGG | TCT | GGA | GGT |
Val | Gly | Ser 370 | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly 375 | Gly |
ATG | AGC | CCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT |
Met | Ser 385 | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn 390 | Met | Ser |
GAC | TCT | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GAG |
Asp 400 | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr 405 | Ser | Thr | Glu |
CAG | AAC | CTG | GTC | CTG | GGG | GCC | CCC | CGC |
Gin | Asn | Leu | Val | Leu 420 | Gly | Ala | Pro | Arg |
GTC | ATC | TTC | ACC | CAG | GTG | TCC | AGG | CAA |
Val | Ile | Phe | Thr 435 | Gin | Val | Ser | Arg | Gin 440 |
• · • • • ··· · | • • • • • | • • • · • • · | • · • · • · « • · · 4 · | • · · · • · · · • · · · * • · · • · ·· | |||
ATC | GTC | CAA | CTG | AAA | GGC | CTG | 671 |
Ile | Val | Gin | Leu 220 | Lys | Gly | Leu | |
GTG | GTG | ACA | CAG | CTA | TTT | CAT | 719 |
Val | Val | Thr 235 | Gin | Leu | Phe | His | |
AAG | AAG | ATC | CTC | ATT | GTC | ATC | 767 |
Lys | Lys 250 | Ile | Leu | Ile | Val | Ile 255 | |
CTG | GAA | TAC | AGT | GAT | GTC | ATC | 815 |
Leu 265 | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val 270 | Ile | |
CGC | TAC | GCT | ATC | GGG | GTG | GGA | 863 |
Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly 285 | Val | Gly | |
CAG | GAG | CTG | AAT | ACC | ATC | AGC | 911 |
Gin | Glu | Leu | Asn 300 | Thr | Ile | Ser | |
AAG | GTG | GAC | AAC | TTT | GCA | GCC | 959 |
Lys | Val | Asp 315 | Asn | Phe | Ala | Ala | |
GAG | AAG | ATC | TAT | GCA | GTT | GAG | 1007 |
Glu | Lys 330 | Ile | Tyr | Ala | Val | Glu 335 | |
TTC | CAG | CAC | GAG | ATG | TCC | CAA | 1055 |
Phe 345 | Gin | His | Glu | Met | Ser 350 | Gin | |
GAT | GGC | CTC | TTC | CTG | GGG | GCT | 1103 |
Asp | Gly | Leu | Phe | Leu 365 | Gly | Ala | |
GCC | TTC | CTG | TAT | CCC | CCA | AAT | 1151 |
Ala | Phe | Leu | Tyr 380 | Pro | Pro | Asn | |
CAG | GAG | AAT | GTG | GAC | ATG | AGG | 1199 |
Gin | Glu | Asn 395 | Val | Asp | Met | Arg | |
CTA | GCC | CTG | TGG | AAG | GGG | GTA | 1247 |
Leu | Ala 410 | Leu | Trp | Lys | Gly | Val 415 | |
TAC | CAG | CAT | ACC | GGG | AAG | GCT | 1295 |
Tyr 425 | Gin | His | Thr | Gly | Lys 430 | Ala | |
TGG | AGG | AAG | AAG | GCC | GAA | GTC | 1343 |
Trp | Arg | Lys | Lys | Ala 445 | Glu | Val |
140 • · » · 4 · • · 4 4 4 4 ···» · 4 4 4 4 • ·
4
4 4 4
ACA Thr | GGG ACG Gly Thr 450 | CAG Gin | ATC Ile | GGC Gly | TCC Ser | TAC Tyr 455 | TTC Phe | GGG Gly | GCC Ala | TCC Ser | CTC Leu 460 | TGC Cys | TCC Ser | GTG Val | 1391 | |
GAT | GTG | GAC | AGC | GAT | GGC | AGC | ACC | GAC | CTG | ATC | CTC | ATT | GGG | GCC | CCC | 1439 |
Asp | Val | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Ile | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
CAT | TAC | TAT | GAG | CAG | ACC | CGA | GGG | GGC | CAG | GTG | TCC | GTG | TGT | CCC | TTG | 1487 |
His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu | |
480 | 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
CCT | AGG | GGG | CAG | AGG | GTG | CAG | TGG | CAG | TGT | GAC | GCT | GTT | CTC | CGT | GGT | 1535 |
Pro | Arg | Gly | Gin | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
GAG | CAG | GGC | CAC | CCC | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCA | GCC | CTG | ACA | GTG | TTG | 1583 |
Glu | Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
GGG | GAT | GTG | AAT | GAG | GAC | AAG | CTG | ATA | GAC | GTG | GCC | ATT | GGG | GCC | CCG | 1631 |
Gly | Asp | Val | Asn | Glu | Asp | Lys | Leu | Ile | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro | |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
GGA | GAG | CAG | GAG | AAC | CGG | GGT | GCT | GTC | TAC | CTG | TTT | CAC | GGA | GCC | TCA | 1679 |
Gly | Glu | Gin | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Ala | Ser | |
545 | 550 | 555 | ||||||||||||||
GAA | TCC | GGC | ATC | AGC | CCC | TCC | CAC | AGC | CAG | CGG | ATT | GCC | AGC | TCC | CAG | 1727 |
Glu | Ser | Gly | Ile | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | Ile | Ala | Ser | Ser | Gin | |
560 | 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
CTC | TCC | CCC | AGG | CTG | CAG | TAT | TTT | GGG | CAG | GCG | CTG | AGT | GGG | GGT | CAG | 1775 |
Leu | Ser | Pro | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | |
580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
GAC | CTC | ACC | CAG | GAT | GGA | CTG | ATG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGG | GCC | CGG | GGC | 1823 |
Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Met | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly | |
595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
CAG | GTG | CTC | CTG | CTC | AGG | AGT | CTG | CCG | GTG | CTG | AAA | GTG | GGG | GTG | GCC | 1871 |
Gin | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Ala | |
610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
ATG | AGA | TTC | AGC | CCT | GTG | GAG | GTG | GCC | AAG | GCT | GTG | TAC | CGG | TGC | TGG | 1919 |
Met | Arg | Phe | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Ala | Lys | Ala | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | |
625 | 630 | 635 | ||||||||||||||
GAA | GAG | AAG | CCC | AGT | GCC | CTG | GAA | GCT | GGG | GAC | GCC | ACC | GTC | TGT | CTC | 1967 |
Glu | Glu | Lys | Pro | Ser | Ala | Leu | Glu | Ala | Gly | Asp | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | |
640 | 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
ACC | ATC | CAG | AAA | AGC | TCA | CTG | GAC | CAG | CTA | GGT | GAC | ATC | CAA | AGC | TCT | 2015 |
Thr | Ile | Gin | Lys | Ser | Ser | Leu | Asp | Gin | Leu | Gly | Asp | Ile | Gin | Ser | Ser | |
660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
GTC | AGG | TTT | GAT | CTG | GCA | CTG | GAC | CCA | GGT | CGT | CTG | ACT | TCT | CGT | GCC | 2063 |
Val | Arg | Phe | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | Thr | Ser | Arg | Ala | |
675 | 680 | 685 |
141
ATT | TTC | AAT | GAA | ACC | AAG | AAC | CCC | ACT |
Ile | Phe | Asn 690 | Glu | Thr | Lys | Asn | Pro 695 | Thr |
GGA | CTG | GGG | ATT | CAC | TGT | GAA | ACC | CTG |
Gly | Leu 705 | Gly | Ile | His | Cys | Glu 710 | Thr | Leu |
GTG | GAG | GAT | GTG | GTG | AGC | CCC | ATC | ATT |
Val 720 | Glu | Asp | Val | Val | Ser 725 | Pro | Ile | Ile |
GTG | AGA | GAG | CCC | ATC | CCC | TCC | CCC | CAG |
Val | Arg | Glu | Pro | Ile 740 | Pro | Ser | Pro | Gin |
GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | CTC | TTC | ACT | GCT |
Val | Gly | Ser | Gin 755 | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala 760 |
TGT | GGG | CAA | GAT | GGC | CTC | TGT | GAA | GGG |
Cys | Gly | Gin 770 | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu 775 | Gly |
TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | ACC | CTG | ACC | GTG |
Phe | Ser 785 | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu 790 | Thr | Val |
GTG | ATT | GTG | ACT | GTG | TGG | AAC | GCA | GGT |
Val 800 | Ile | Val | Thr | Val | Trp 805 | Asn | Ala | Gly |
GTC | AGC | CTC | TAC | TAT | CCA | GCA | GGG | CTG |
Val | Ser | Leu | Tyr | Tyr 820 | Pro | Ala | Gly | Leu |
GCC | CAG | AAG | CAG | CCC | CAT | CAG | AGT | GCC |
Ala | Gin | Lys | Gin 835 | Pro | His | Gin | Ser | Ala 840 |
GTG | CCC | ACT | GAG | GAT | GAG | GGC | CTA | AGA |
Val | Pro | Thr 850 | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu 855 | Arg |
CAC | CCC | ATC | TTC | CAT | GAG | GGC | TCT | AAC |
His | Pro 865 | Ile | Phe | His | Glu | Gly 870 | Ser | Asn |
GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | ACC | CTG | GGA |
Asp 880 | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala 885 | Thr | Leu | Gly |
AGT | GCA | AGC | AGT | GAG | AAC | AAT | AAG | GCT |
Ser | Ala | Ser | Ser | Glu 900 | Asn | Asn | Lys | Ala |
CAG | CTG | GAG | CTC | CCG | GTG | AAG | TAT | GCA |
Gin | Leu | Glu | Leu 915 | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala 920 |
• · • · · » • · · ·
• · • • • ··· · | • • • • • | • • • · • • · | • · • · • · • · · • · | • · · · • · · · • · · · · · • · · 9 9 · · | |||
TTG | ACT | CGA | AGA | AAA | ACC | CTG | 2111 |
Leu | Thr | Arg | Arg 700 | Lys | Thr | Leu | |
AAG | CTG | CTT | TTG | CCA | GAT | TGT | 2159 |
Lys | Leu | Leu 715 | Leu | Pro | Asp | Cys | |
CTG | CAC | CTC | AAC | TTC | TCA | CTG | 2207 |
Leu | His 730 | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu 735 | |
AAC | CTG | CGT | CCT | GTG | CTG | GCC | 2255 |
Asn 745 | Leu | Arg | Pro | Val | Leu 750 | Ala | |
TCT | CTC | CCC | TTC | GAG | AAG | AAC | 2303 |
Ser | Leu | Pro | Phe | Glu 765 | Lys | Asn | |
GAC | CTG | GGT | GTC | ACC | CTC | AGC | 2351 |
Asp | Leu | Gly | Val 780 | Thr | Leu | Ser | |
GGG | AGC | TCC | CTG | GAG | CTC | AAC | 2399 |
Gly | Ser | Ser 795 | Leu | Glu | Leu | Asn | |
GAG | GAT | TCC | TAC | GGA | ACC | GTG | 2447 |
Glu | Asp 810 | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val 815 | |
TCG | CAC | CGA | CGG | GTG | TCA | GGA | 2495 |
Ser 825 | His | Arg | Arg | Val | Ser 830 | Gly | |
CTG | CGC | CTG | GCA | TGT | GAG | ACA | 2543 |
Leu | Arg | Leu | Ala | Cys 845 | Glu | Thr | |
AGC | AGC | CGC | TGC | AGT | GTC | AAC | 2591 |
Ser | Ser | Arg | Cys 860 | Ser | Val | Asn | |
GGC | ACC | TTC | ATA | GTC | ACA | TTC | 2639 |
Gly | Thr | Phe 875 | Ile | Val | Thr | Phe | |
GAC | AGG | ATG | CTT | ATG | AGG | GCC | 2687 |
Asp | Arg 890 | Met | Leu | Met | Arg | Ala 895 | |
TCA | AGC | AGC | AAG | GCC | ACC | TTC | 2735 |
Ser 905 | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr 910 | Phe | |
GTC | TAC | ACC | ATG | ATC | AGC | AGG | 2783 |
Val | Tyr | Thr | Met | Ile 925 | Ser | Arg |
142 • · · ·
CAG Gin | GAA Glu | GAA TCC ACC AAG | TAC Tyr | TTC Phe 935 | AAC Asn | TTT Phe | GCA Ala | ACC Thr | TCC Ser 940 | GAT Asp | GAG Glu | AAG Lys | 2831 | |||
Glu 930 | Ser | Thr | Lys | |||||||||||||
AAA | ATG | AAA | GAG | GCT | GAG | CAT | CGA | TAC | CGT | GTG | AAT | AAC | CTC | AGC | CAG | 2879 |
Lys | Met 945 | Lys | Glu | Ala | Glu | His 950 | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn 955 | Asn | Leu | Ser | Gin | |
CGA | GAT | CTG | GCC | ATC | AGC | ATT | AAC | TTC | TGG | GTT | CCT | GTC | CTG | CTG | AAC | 2927 |
Arg 960 | Asp | Leu | Ala | Ile | Ser 965 | Ile | Asn | Phe | Trp | Val 970 | Pro | Val | Leu | Leu | Asn 975 | |
GGG | GTG | GCT | GTG | TGG | GAT | GTG | GTC | ATG | GAG | GCC | CCA | TCT | CAG | AGT | CTC | 2975 |
Gly | Val | Ala | Val | Trp 980 | Asp | Val | Val | Met | Glu 985 | Ala | Pro | Ser | Gin | Ser 990 | Leu | |
CCC | TGT | GTT | TCA | GAG | AGA | AAA | CCT | CCC | CAG | CAT | TCT | GAC | TTC | CTG | ACC | 3023 |
Pro | Cys | Val | Ser 995 | Glu | Arg | Lys | Pro | Pro Gin 1000 | His | Ser | Asp | Phe Leu 1005 | Thr | |||
CAG | ATT | TCA | AGA | AGT | CCC | ATG | CTG | GAC | TGC | TCC | ATT | GCT | GAC | TGC | CTG | 3071 |
Gin | Ile | Ser Arg 1010 | Ser | Pro | Met | Leu Asp 1015 | Cys | Ser | Ile | Ala Asp 1020 | Cys | Leu | ||||
CAG | TTC | CGC | TGT | GAC | GTC | CCC | TCC | TTC | AGC | GTC | CAG | GAG | GAG | CTG | GAT | 3119 |
Gin | Phe Arg 1025 | Cys | Asp | Val | Pro Ser 1030 | Phe | Ser | Val | Gin Glu 1035 | Glu | Leu | Asp | ||||
TTC | ACC | CTG | AAG | GGC | AAT | CTC | AGT | TTC | GGC | TGG | GTC | CGC | GAG | ACA | TTG | 3167 |
Phe Thr 1040 | Leu | Lys | Gly | Asn Leu 1045 | Ser | Phe | Gly | Trp Val 1050 | Arg | Glu | Thr | Leu 1055 | ||||
CAG | AAG | AAG | GTG | TTG | GTC | GTG | AGT | GTG | GCT | GAA | ATT | ACG | TTC | GAC | ACA | 3215 |
Gin | Lys | Lys | Val | Leu Val 1060 | Val | Ser | Val | Ala Glu 1065 | Ile | Thr | Phe | Asp 107C | Thr 1 | |||
TCC | GTG | TAC | TCC | CAG | CTT | CCA | GGA | CAG | GAG | GCA | TTT | ATG | AGA | GCT | CAG | 3263 |
Ser | Val | Tyr | Ser 1075 | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin 108C | Glu ) | Ala | Phe | Met | Arg Ala 1085 | Gin | ||
ATG | GAG | ATG | GTG | CTA | GAA | GAA | GAC | GAG | GTC | TAC | AAT | GCC | ATT | CCC | ATC | 3311 |
Met | Glu | Met Val 1090 | Leu | Glu | Glu | Asp Glu 1095 | Val | Tyr | Asn | Ala Ile 1100 | Pro | Ile | ||||
ATC | ATG | GGC | AGC | TCT | GTG | GGG | GCT | CTG | CTA | CTG | CTG | GCG | CTC | ATC | ACA | 3359 |
Ile | Met Gly 1105 | Ser | Ser | Val | Gly nic | Ala ) | Leu | Leu | Leu | Leu 1115 | Ala | Leu | Ile | Thr | ||
GCC | ACA | CTG | TAC | AAG | CTT | GGC | TTC | TTC | AAA | CGC | CAC | TAC | AAG | GAA | ATG | 3407 |
Ala 112C | Thr 1 | Leu | Tyr | Lys | Leu 1125 | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg 113C | His 1 | Tyr | Lys | Glu | Met 1135 | |
CTG | GAG | GAC | AAG | CCT | GAA | GAC | ACT | GCC | ACA | TTC | AGT | GGG | GAC | GAT | TTC | 3455 |
Leu | Glu | Asp | Lys | Pro 114C | Glu 1 | Asp | Thr | Ala | Thr 1145 | Phe | Ser | Gly | Asp | Asp 1150 | Phe 1 | |
AGC Ser | TGT Cys | GTG Val | GCC Ala 1155 | CCA Pro | AAT Asn | GTG Val | CCT Pro | TTG Leu 1160 | TCC Ser | TAATAATCCA CTTTCCTGTT | 3505 |
143 • · • · · ·
• · · · · · • · · • · • 4 • · • 4 4 4 4 | •4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 «44 «4 4 4 « 4 4 4 4 4 | • 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 | ||||
TATCTCTACC | ACTGTGGGCT | GGACTTGCTT | GCAACCATAA | ATCAACTTAC | ATGGAAACAA | 3566 |
CTTCTGCATA | GATCTGCACT | GGCCTAAGCA | ACCTACCAGG | TGCTAAGCAC | CTTCTCGGAG | 3625 |
AGATAGAGAT | TGTAATGTTT | TTACATATCT | GTCCATCTTT | TTCAGCAATG | ACCCACTTTT | 3685 |
TACAGAAGCA | GGCATGGTGC | CAGCATAAAT | TTTCATATGC | T | 3726 |
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:2:
Thr 1 | Phe | Gly Thr Val 5 | Leu | Leu | Leu | Ser | Val 10 | Leu | Ala | Ser | Tyr | His 15 | Gly | ||
Phe | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu | Pro | Thr | Ile | Phe | Gin | Glu | Asp | Ala | Gly |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Phe | Gly | Gin | Ser | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val | Val | Ala | Ala | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu | Tyr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asp | Cys | Ala | Ala | Ala | Thr | Gly | Met | Cys | Gin | Pro | Ile | Pro | Leu | His | Ile |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Asn | Gly | Ser | Arg | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Leu | His | Arg | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Cys | Gly | Glu | Asn | Ser | Tyr | Ser | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Arg | Trp | Glu | Ile | Ile | Gin | Thr | Val | Pro | Asp | Ala | Thr | Pro | Glu | Cys | Pro |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
His | Gin | Glu | Met | Asp | Ile | Val | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | Ile |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin | Met | Lys | Gly | Phe | Val | Gin | Ala | Val | Met |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Gly | Gin | Phe | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr | Leu | Phe | Ala | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asn | Leu | Leu | Lys | Ile | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Gin | Phe | Arg | Thr | Ser | Pro |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ser | Gin | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Pro | Ile | Val | Gin | Leu | Lys | Gly | Leu | Thr |
210 215 220
144 • · k I
Phe 225 | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile 230 | Leu | Thr | Val | Val | Thr 235 | Gin | Leu | Phe | His | His 240 |
Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile | Val | Ile | Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | Ile | Pro |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val | Gly | His |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ala | Phe | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Ser | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Asp | Asn | Phe | Ala | Ala | Leu |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gly | Ser | Ile | Gin | Lys | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | Ile | Tyr | Ala | Val | Glu | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Thr | Gin | Ser | Arg | Ala | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | Glu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Gly | Phe | Ser | Thr | Ala | Leu | Thr | Met | Asp | Gly | Leu | Phe | Leu | Gly | Ala | Val |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | Ser | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | Met |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ser | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met | Arg | Asp |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lys | Gly | Val | Gin |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Asn | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Ala | Val |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ile | Phe | Thr | Gin | Val | Ser | Arg | Gin | Trp | Arg | Lys | Lys | Ala | Glu | Val | Thr |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | Asp |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Val | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Ile | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro | His |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu | Pro |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Arg | Gly | Gin | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | Glu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Asp | Val | Asn | Glu | Asp | Lys | Leu | Ile | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro | Gly |
530 535 540
145 • · · · • 9 99
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 ·
999 9 9 99 9 9 99 9 9
Glu Gin Glu Asn Arg Gly Ala Val | Tyr | Leu | Phe 555 | His | Gly | Ala | Ser | Glu 560 | |||||||
545 | 550 | ||||||||||||||
Ser | Gly | Ile | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | Ile | Ala | Ser | Ser | Gin | Leu |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ser | Pro | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Met | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Ala | Met |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Arg | Phe | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Ala | Lys | Ala | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | Glu |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Glu | Lys | Pro | Ser | Ala | Leu | Glu | Ala | Gly | Asp | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Ile | Gin | Lys | Ser | Ser | Leu | Asp | Gin | Leu | Gly | Asp | Ile | Gin | Ser | Ser | Val |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Arg | Phe | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | Thr | Ser | Arg | Ala | Ile |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Phe | Asn | Glu | Thr | Lys | Asn | Pro | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lys | Thr | Leu | Gly |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Ile | His | Cys | Glu | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys | Val |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Glu | Asp | Val | Val | Ser | Pro | Ile | Ile | Leu | His | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu | Val |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Arg | Glu | Pro | Ile | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Val |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Gly | Ser | Gin | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Gly | Gin | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | Val | Thr | Leu | Ser | Phe |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Ser | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Leu | Asn | Val |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Ile | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Ala | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val | Val |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ser | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | His | Arg | Arg | Val | Ser | Gly | Ala |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Gin | Lys | Gin | Pro | His | Gin | Ser | Ala | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys | Glu | Thr | Val |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Pro | Thr | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Ser | Arg | Cys | Ser | Val | Asn | His |
850 | 855 | 860 |
146 • · · · · • · · 4 « 1 k « 4 · · « » 4 » · · · 4 * ► 4 · · · 4 4 ·
4 4
4 4 4
Pro | Ile | Phe | His | Glu | Gly | Ser | Asn | Gly | Thr | Phe | Ile | Val | Thr | Phe | Asp |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Thr | Leu | Gly | Asp | Arg | Met | Leu | Met | Arg | Ala | Ser |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Ala | Ser | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala | Val | Tyr | Thr | Met | Ile | Ser | Arg | Gin |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Glu | Glu | Ser | Thr | Lys | Tyr | Phe | Asn | Phe | Ala | Thr | Ser | Asp | Glu | Lys | Lys |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Met | Lys | Glu | Ala | Glu | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Gin | Arg |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Asp | Leu | Ala | Ile | Ser | Ile | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | Val | Met | Glu | Ala | Pro | Ser | Gin | Ser | Leu | Pro |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Cys | Val | Ser | Glu | Arg | Lys | Pro | Pro | Gin | His | Ser | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin |
995 | 1000 | 1005 | |||||||||||||
Ile | Ser | Arg | Ser | Pro | Met | Leu | Asp | Cys | Ser | Ile | Ala | Asp | Cys | Leu | Gin |
1010 | 1015 | 1020 | |||||||||||||
Phe | Arg | Cys | Asp | Val | Pro | Ser | Phe | Ser | Val | Gin | Glu | Glu | Leu | Asp | Phe |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | ||||||||||||
Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | Val | Arg | Glu | Thr | Leu | Gin |
1045 | 1050 | 1055 | |||||||||||||
Lys | Lys | Val | Leu | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | Ile | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser |
1060 | 1065 | 1070 | |||||||||||||
Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Met | Arg | Ala | Gin | Met |
1075 | 1080 | 1085 | |||||||||||||
Glu | Met | Val | Leu | Glu | Glu | Asp | Glu | Val | Tyr | Asn | Ala | Ile | Pro | Ile | Ile |
1090 | 1095 | 1100 | |||||||||||||
Met | Gly | Ser | Ser | Val | Gly | Ala | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | Ile | Thr | Ala |
1105 | 1110 | 1115 | 1120 | ||||||||||||
Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | His | Tyr | Lys | Glu | Met | Leu |
1125 | 1130 | 1135 | |||||||||||||
Glu | Asp | Lys | Pro | Glu | Asp | Thr | Ala | Thr | Phe | Ser | Gly | Asp | Asp | Phe | Ser |
1140 | 1145 | 1150 | |||||||||||||
Cys | Val | Ala | Pro | Asn | Val | Pro | Lys | Ser |
1155
1160
147 • · 0 · · · · 0 0 • · ·· • 0 • 0
(2) INFORMACE | ; 0 SEK. | ID. | Č. : 3: | ||||||||||||
(i) | CHARAKTERISTIKA | SEKVENCE: | |||||||||||||
(A) | DÉLKA: | 1153 | í aminokyselin | ||||||||||||
(B) | TYP: aminokyselina | ||||||||||||||
(C) | POČET ŘETĚZCŮ: | j eden | |||||||||||||
(D) | TOPOLOGIE: | lineární | |||||||||||||
(ii) | TYP | MOLEKULY: protein | |||||||||||||
(xi) | POPIS SEKVENCE: | SEK. | ID. | Č. : | :3: | ||||||||||
Met | Ala | Leu | Arg | Val | Leu | Leu | Leu | Thr | Ala | Leu | Thr | Leu | Cys | His | Gly |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Phe | Asn | Leu | Asp | Thr | Glu | Asn | Ala | Met | Thr | Phe | Gin | Glu | Asn | Ala | Arg |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Phe | Gly | Gin | Ser | Val | Val | Gin | Leu | Gin | Gly | Ser | Arg | Val | Val | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Ala | Pro | Gin | Glu | Ile | Val | Ala | Ala | Asn | Gin | Arg | Gly | Ser | Leu | Tyr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gin | Cys | Asp | Tyr | Ser | Thr | Gly | Ser | Cys | Glu | Pro | Ile | Arg | Leu | Gin | Val |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Pro | Val | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Ala | Ala | Thr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Ser | Pro | Pro | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Val | His | Gin | Thr |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Cys | Ser | Glu | Asn | Thr | Tyr | Val | Lys | Gly | Leu | Cys | Phe | Leu | Phe | Gly | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Asn | Leu | Arg | Gin | Gin | Pro | Gin | Lys | Phe | Pro | Glu | Ala | Leu | Arg | Gly | Cys |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Pro | Gin | Glu | Asp | Ser | Asp | Ile | Ala | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ile | Ile | Pro | His | Asp | Phe | Arg | Arg | Met | Lys | Glu | Phe | Val | Ser | Thr | Val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Met | Glu | Gin | Leu | Lys | Lys | Ser | Lys | Thr | Leu | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Glu | Glu | Phe | Arg | Ile | His | Phe | Thr | Phe | Lys | Glu | Phe | Gin | Asn | Asn |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Pro | Asn | Pro | Arg | Ser | Leu | Val | Lys | Pro | Ile | Thr | Gin | Leu | Leu | Gly | Arg |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | His | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile | Arg | Lys | Val | Val | Arg | Glu | Leu | Phe | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ile | Thr | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Asn | Ala | Phe | Lys | Ile | Leu | Val | Val | Ile |
245 | 250 | 255 |
148 • · · · • · • · · · • · • · · · · · · ···· · • · ·*·· · · » ···* · ·· ·· ·· ··
Asp Gly Glu Lys | Phe | Gly | Asp | Pro | Leu Gly Tyr Glu Asp Val | Tle | |||||||||
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Pro | Glu | Ala | Asp | Arg | Glu | Gly | Val | Ile | Arg | Tyr | Val | Ile | Gly | Val | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asp | Ala | Phe | Arg | Ser | Glu | Lys | Ser | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Ala |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ser | Lys | Pro | Pro | Arg | Asp | His | Val | Phe | Gin | Val | Asn | Asn | Phe | Glu | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Lys | Thr | Ile | Gin | Asn | Gin | Leu | Arg | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala | Ile | Glu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gly | Thr | Gin | Thr | Gly | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Glu | His | Glu | Met | Ser | Gin |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Glu | Gly | Phe | Ser | Ala | Ala | Ile | Thr | Ser | Asn | Gly | Pro | Leu | Leu | Ser | Thr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Tyr | Asp | Trp | Ala | Gly | Gly | Val | Phe | Leu | Tyr | Thr | Ser | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Glu | Lys | Ser | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Thr | Arg | Val | Asp | Ser | Asp | Met | Asn |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Asp | Ala | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ala | Ala | Ala | Ile | Ile | Leu | Arg | Asn | Arg | Val |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gin | Ser | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Ile | Gly | Leu | Val |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ala | Met | Phe | Arg | Gin | Asn | Thr | Gly | Met | Trp | Glu | Ser | Asn | Ala | Asn | Val |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Lys | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ala | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Val | Asp | Ser | Asn | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Arg | Gly | Gin | Arg | Ala | Arg | Trp | Gin | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Tyr | Gly |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Glu | Gin | Gly | Gin | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Lys | Leu | Thr | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gly | Glu | Glu | Asp | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Thr | Ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gly | Ser | Gly | Ile | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | Ile | Ala | Gly | Ser | Lys |
565 | 570 | 575 |
149 • tu • · to to to to
Leu Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin
580 585 590 • · ···· ··· ····· ·· · · ·· «to
Asp | Leu | Thr 595 | Met | Asp | Gly | Leu | Val 600 | Asp | Leu | Thr | Val | Gly 605 | Ala | Gin | Gly |
His | Val 610 | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser 615 | Gin | Pro | Val | Leu | Arg 620 | Val | Lys | Ala | Ile |
Met 625 | Glu | Phe | Asn | Pro | Arg 630 | Glu | Val | Ala | Arg | Asn 635 | Val | Phe | Glu | Cys | Asn 640 |
Asp | Gin | Val | Val | Lys 645 | Gly | Lys | Glu | Ala | Gly 650 | Glu | Val | Arg | Val | Cys 655 | Leu |
His | Val | Gin | Lys 660 | Ser | Thr | Arg | Asp | Arg 665 | Leu | Arg | Glu | Gly | Gin 670 | Ile | Gin |
Ser | Val | Val 675 | Thr | Tyr | Asp | Leu | Ala 680 | Leu | Asp | Ser | Gly | Arg 685 | Pro | His | Ser |
Arg | Ala 690 | Val | Phe | Asn | Glu | Thr 695 | Lys | Asn | Ser | Thr | Arg 700 | Arg | Gin | Thr | Gin |
Val 705 | Leu | Gly | Leu | Thr | Gin 710 | Thr | Cys | Glu | Thr | Leu 715 | Lys | Leu | Gin | Leu | Pro 720 |
Asn | Cys | Ile | Glu | Asp 725 | Pro | Val | Ser | Pro | Ile 730 | Val | Leu | Arg | Leu | Asn 735 | Phe |
Ser | Leu | Val | Gly 740 | Thr | Pro | Leu | Ser | Ala 745 | Phe | Gly | Asn | Leu | Arg 750 | Pro | Val |
Leu | Ala | Glu 755 | Asp | Ala | Gin | Arg | Leu 760 | Phe | Thr | Ala | Leu | Phe 765 | Pro | Phe | Glu |
Lys | Asn 770 | Cys | Gly | Asn | Asp | Asn 775 | Ile | Cys | Gin | Asp | Asp 780 | Leu | Ser | Ile | Thr |
Phe 785 | Ser | Phe | Met | Ser | Leu 790 | Asp | Cys | Leu | Val | Val 795 | Gly | Gly | Pro | Arg | Glu 800 |
Phe | Asn | Val | Thr | Val 805 | Thr | Val | Arg | Asn | Asp 810 | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr 815 | Arg |
Thr | Gin | Val | Thr 820 | Phe | Phe | Phe | Pro | Leu 825 | Asp | Leu | Ser | Tyr | Arg 830 | Lys | Val |
Ser | Thr | Leu 835 | Gin | Asn | Gin | Arg | Ser 840 | Gin | Arg | Ser | Trp | Arg 845 | Leu | Ala | Cys |
Glu | Ser 850 | Ala | Ser | Ser | Thr | Glu 855 | Val | Ser | Gly | Ala | Leu 860 | Lys | Ser | Thr | Ser |
Cys 865 | Ser | Ile | Asn | His | Pro 870 | Ile | Phe | Pro | Glu | Asn 875 | Ser | Glu | Val | Thr | Phe 880 |
Asn | Ile | Thr | Phe | Asp 885 | Val | Asp | Ser | Lys | Ala 890 | Ser | Leu | Gly | Asn | Lys 895 | Leu |
150
Leu | Leu | Lys | Ala 900 | Asn Val | Thr | Ser | Glu 905 | Asn | Asn Met | Pro | Arg 910 | Thr | Asn |
Lys | Thr | Glu 915 | Phe | Gin Leu | Glu | Leu 920 | Pro | Val | Lys Tyr | Ala 925 | Val | Tyr | Met |
Val | Val 930 | Thr | Ser | His Gly | Val 935 | Ser | Thr | Lys | Tyr Leu 940 | Asn | Phe | Thr | Ala |
Ser 945 | Glu | Asn | Thr | Ser Arg 950 | Val | Met | Gin | His | Gin Tyr 955 | Gin | Val | Ser | Asn 960 |
Leu | Gly | Gin | Arg | Ser Leu 965 | Pro | Ile | Ser | Leu 970 | Val Phe | Leu | Val | Pro 975 | Val |
Arg | Leu | Asn | Gin 980 | Thr Val | Ile | Trp | Asp 985 | Arg | Pro Gin | Val | Thr 990 | Phe | Ser |
Glu | Asn | Leu 995 | Ser | Ser Thr | Cys | His 100C | Thr 1 | Lys | Glu Arg | Leu 1005 | Pro | Ser | His |
Ser | Asp Phe 1010 | Leu | Ala Glu | Leu 1015 | Arg | Lys | Ala | Pro Val 102C | Val ) | Asn | Cys | Ser | |
Ile 1025 | Ala | Val | Cys | Gin Arg 103C | Ile ) | Gin | Cys | Asp | Ile Pro 1035 | Phe | Phe | Gly | Ile 1040 |
Gin | Glu | Glu | Phe | Asn Ala 1045 | Thr | Leu | Lys | Gly 105C | Asn Leu 1 | Ser | Phe | Asp 1055 | Trp |
Tyr | Ile | Lys | Thr Ser His 1060 | Asn | His | Leu Leu 1065 | Ile Val | Ser | Thr Ala 1070 | Glu | |||
Ile | Leu | Phe 1075 | Asn | Asp Ser | Val | Phe 108C | Thr 1 | Leu | Leu Pro | Gly 1085 | Gin 1 | Gly | Ala |
Phe | Val 109C | Arg 1 | Ser | Gin Thr | Glu 1095 | Thr | Lys | Val | Glu Pro noc | Phe 1 | Glu | Val | Pro |
Asn 1105 | Pro | Leu | Pro | Leu Ile nic | Val ) | Gly | Ser | Ser | Val Gly 1115 | Gly | Leu | Leu | Leu 1120 |
Leu | Ala | Leu | Ile | Thr Ala 1125 | Ala | Leu | Tyr | Lys 113C | Leu Gly 1 | Phe | Phe | Lys 1135 | Arg 1 |
Gin | Tyr | Lys | Asp | Met Met | Ser | Glu | Gly | Gly | Pro Pro | Gly | Ala | Glu | Pro |
1140 1145 1150
Gin (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1163 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
151 ·· ·«·· ♦· ···· • · · 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 · · · · · · · · ····· · · · · · · ··
(xi) | POPIS SEKVENCE: | SEK. | ID. | Č. : | 4 : | ||||||||||
Met | Thr | Arg | Thr | Arg | Ala | Ala | Leu | Leu | Leu | Phe | Thr | Ala | Leu | Ala | Thr |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ser | Leu | Gly | Phe | Asn | Leu | Asp | Thr | Glu | Glu | Leu | Thr | Ala | Phe | Arg | Val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asp | Ser | Ala | Gly | Phe | Gly | Asp | Ser | Val | Val | Gin | Tyr | Ala | Asn | Ser | Trp |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Val | Val | Gly | Ala | Pro | Gin | Lys | Ile | Ile | Ala | Ala | Asn | Gin | Ile | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Leu | Tyr | Gin | Cys | Gly | Tyr | Ser | Thr | Gly | Ala | Cys | Glu | Pro | Ile | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Leu | Gin | Val | Pro | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Ser | Thr | Thr | Ser | Pro | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
His | His | Glu | Cys | Gly | Arg | Asn | Met | Tyr | Leu | Thr | Gly | Leu | Cys | Phe | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Gly | Pro | Thr | Gin | Leu | Thr | Gin | Arg | Leu | Pro | Val | Ser | Arg | Gin | Glu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Cys | Pro | Arg | Gin | Glu | Gin | Asp | Ile | Val | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | Ile | Ser | Ser | Arg | Asn | Phe | Ala | Thr | Met | Met | Asn | Phe | Val | Arg | Ala |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Ile | Ser | Gin | Phe | Gin | Arg | Pro | Ser | Thr | Gin | Phe | Ser | Leu | Met | Gin |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Phe | Ser | Asn | Lys | Phe | Gin | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Glu | Glu | Phe | Arg | Arg |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Thr | Ser | Asn | Pro | Leu | Ser | Leu | Leu | Ala | Ser | Val | His | Gin | Leu | Gin | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Thr | Tyr | Thr | Ala | Thr | Ala | Ile | Gin | Asn | Val | Val | His | Arg | Leu | Phe |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
His | Ala | Ser | Tyr | Gly | Ala | Arg | Arg | Asp | Ala | Ile | Lys | Ile | Leu | Ile | Val |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ile | Thr | Asp | Gly | Lys | Lys | Glu | Gly | Asp | Ser | Leu | Asp | Tyr | Lys | Asp | Val |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ile | Pro | Met | Ala | Asp | Ala | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gly | Leu | Ala | Phe | Gin | Asn | Arg | Asn | Ser | Trp | Lys | Glu | Leu | Asn | Asp | Ile |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ala | Ser | Lys | Pro | Ser | Gin | Glu | His | Ile | Phe | Lys | Val | Glu | Asp | Phe | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 |
152 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9999 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 99 ·· ·· ··
Ala | Leu | Lys | Asp | Ile | Gin | Asn | Gin | Leu | Lys | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala | Ile |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Glu | Gly | Thr | Glu | Thr | Ile | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Glu | Leu | Glu | Met | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ala | Val | Phe | Thr | Pro | Asp | Gly | Pro | Val | Leu | Gly |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ala | Val | Gly | Ser | Phe | Thr | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Asn | Met | Ser | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Arg | Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lys | Gly |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Val | Gin | Ser | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Ile | Gly | Lys |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ala | Val | Ile | Phe | Ile | Gin | Val | Ser | Arg | Gin | Trp | Arg | Met | Lys | Ala | Glu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Val | Ile | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Val | Asp | Val | Asp | Thr | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly | Ala |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Leu | Pro | Arg | Gly | Trp | Arg | Arg | Trp | Trp | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Tyr | Gly |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Glu | Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Lys | Leu | Thr | Asp | Val | Val | Ile | Gly | Ala | Pro |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gly | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Val | Leu |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gly | Pro | Ser | Ile | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | Ile | Ala | Gly | Ser | Gin |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Leu | Ser | Ser | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gin | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Thr | Arg | Pro | Val | Leu | Trp | Val | Gly | Val | Ser |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Met | Gin | Phe | Ile | Pro | Ala | Glu | Ile | Pro | Arg | Ser | Ala | Phe | Glu | Cys | Arg |
625 | 630 | 635 | 640 |
153 • 4 ···· •4 44·· • · ·
Glu Gin Val | Val | Ser 645 | Glu | Gin | Thr | Leu | Val 650 | Gin | Ser | Asn | Ile | Cys 655 | Leu | ||
Tyr | Ile | Asp | Lys | Arg | Ser | Lys | Asn | Leu | Leu | Gly | Ser | Arg | Asp | Leu | Gin |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Ser | Val | Thr | Leu | Asp | Leu | Ala | Leu | Ala | Pro | Gly | Arg | Leu | Ser | Pro |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Arg | Ala | Ile | Phe | Gin | Glu | Thr | Lys | Asn | Arg | Ser | Leu | Ser | Arg | Val | Arg |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Val | Leu | Gly | Leu | Lys | Ala | His | Cys | Glu | Asn | Phe | Asn | Leu | Leu | Leu | Pro |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Ser | Cys | Val | Glu | Asp | Ser | Val | Ile | Pro | Ile | Ile | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Thr | Leu | Val | Gly | Lys | Pro | Leu | Leu | Ala | Phe | Arg | Asn | Leu | Arg | Pro | Met |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Leu | Ala | Ala | Leu | Ala | Gin | Arg | Tyr | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Lys | Asn | Cys | Gly | Ala | Asp | His | Ile | Cys | Gin | Asp | Asn | Leu | Gly | Ile | Ser |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Phe | Ser | Phe | Pro | Gly | Leu | Lys | Ser | Leu | Leu | Val | Gly | Ser | Asn | Leu | Glu |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Leu | Asn | Ala | Glu | Val | Met | Val | Trp | Asn | Asp | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Thr | Thr | Ile | Thr | Phe | Ser | His | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Tyr | Val |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ala | Glu | Gly | Gin | Lys | Gin | Gly | Gin | Leu | Arg | Ser | Leu | His | Leu | Thr | Cys |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Cys | Ser | Ala | Pro | Val | Gly | Ser | Gin | Gly | Thr | Trp | Ser | Thr | Ser | Cys | Arg |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Ile | Asn | His | Leu | Ile | Phe | Arg | Gly | Gly | Ala | Gin | Ile | Thr | Phe | Leu | Ala |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Pro | Lys | Ala | Val | Gly | Leu | Asp | Arg | Leu | Leu | Leu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ile | Ala | Asn | Val | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Ile | Pro | Arg | Thr | Ser | Lys | Thr |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Ile | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala | Val | Tyr | Ile | Val | Val |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Ser | Ser | His | Glu | Gin | Phe | Thr | Lys | Tyr | Leu | Asn | Phe | Ser | Glu | Ser | Glu |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Glu | Lys | Glu | Ser | His | Val | Ala | Met | His | Arg | Tyr | Gin | Val | Asn | Asn | Leu |
945
950
955
960
154 *· ···· • a · · · · • a ·· a a · ·· · · · · · • a aaa aaaa
• aaa a | a a | a a | aa | |
Gly Gin Arg Asp Leu Pro Val | Ser Ile Asn Phe Trp | Val Pro | Val | Glu |
965 | 970 | 975 | ||
Leu Asn Gin Glu Ala Val Trp | Met Asp Val Glu Val | Ser His | Pro | Gin |
980 | 985 | 990 | ||
Asn Pro Ser Leu Arg Cys Ser | Ser Glu Lys Ile Ala | Pro Pro | Ala | Ser |
995 | 1000 | 1005 | ||
Asp Phe Leu Ala His Ile Gin | Lys Asn Pro Val Leu | Asp Cys | Ser | Ile |
1010 1015 | , 1020 | |||
Ala Gly Cys Leu Arg Phe Arg | Cys Asp Val Pro Ser | Phe Ser | Val | Gin |
1025 1030 | 1035 | 1040 | ||
Glu Glu Leu Asp Phe Thr Leu | Lys Gly Asn Leu Ser | Phe Gly | Trp | Val |
1045 | 1050 | 1055 | ||
Arg Gin Ile Leu Gin Lys Lys | Val Ser Val Val Ser | Val Ala | Glu | Ile |
1060 | 1065 | 1070 | ||
Ile Phe Asp Thr Ser Val Tyr | Ser Gin Leu Pro Gly | Gin Glu | Ala | Phe |
1075 | 1080 | 1085 | ||
Met Arg Ala Gin Thr Ile Thr | Val Leu Glu Lys Tyr | Lys Val | His | Asn |
1090 1095 | , 1100 | |||
Pro Ile Pro Leu Ile Val Gly | Ser Ser Ile Gly Gly | Leu Leu | Leu | Leu |
1105 1110 | 1115 | 1120 | ||
Ala Leu Ile Thr Ala Val Leu | Tyr Lys Val Gly Phe | Phe Lys | Arg | Gin |
1125 | 1130 | 1135 | ||
Tyr Lys Glu Met Met Glu Glu | Ala Asn Gly Gin Ile | Ala Pro | Glu | Asn |
1140 | 1145 | 1150 | ||
Gly Thr Gin Thr Pro Ser Pro | Pro Ser Glu Lys |
1155 1160 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:5:
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gin 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden
155 ·* ···· ·· ·»1» ·· ·· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · 9 9 9999 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 9 99 9 9 9 9 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:6:
TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA 35 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:7:
TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:8:
TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:9:
TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA
156 ·· ··»· ·· ··»·
999 ·
99
9 9 9 9 • · · · « • · ·· · · · • 9 · · *· ·· ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:10:
TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:ll:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:ll:
TGRAANACCA TNGGYTC 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:12:
TTGGAAGACC ATNGGYTC 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:13:
ATTAACCCTC ACTAAAG 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:14:
AATACGACTC ACTATAG 17
157 «· ···· ·· ···· ···· ·· ·· • · · · « · ·» ·«· · · • · · ·· ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:15:
Val Phe Gin Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:16:
Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gin Pro Ile 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:17:
Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gin Ala Glu 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:18:
Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina
158 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:19:
Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gin Glu Asn Val Asp 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:20:
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gin Thr Gly 15 10 15
Arg (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:21:
Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala 1 5 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:22:
Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu 1 5 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
159 ·· ··· ···· • · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:23:
RAANCCYTCY TGRAAACTYT C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1006 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:24:
TTCAACCTGG | ACGTGGAGGA | GCCCATGGTG | TTCAAGAGGA | TGGAGCTGGC | TTTGGACAGA | 60 |
GCGTGGCCCA | GCTTGGCGGA | TCTAGACTCG | TGGTGGGAGC | CCCCCTGGAG | GTGGTGGCGG | 120 |
TCAACCAAAC | AGGAAGGTTG | TATGACTGTG | TGGCTGCCAC | TGGCCTTGTC | AACCCATACC | 180 |
CCTGCACACA | CCCCCAGATG | CTGTGAACAT | GTCCCTGGGT | CTGTCCCTGT | CAGCCGCCGC | 240 |
CAGTCGCCCC | TGGCTGCTGG | CCTGTGGCCC | AACCATGCAC | AGAGCCTGTG | GGGAGAATAT | 300 |
GTATGCAGAA | GGCTTTTGCC | TCCTGTTGGA | CTCCCATCTG | CAGACCATTT | GGACAGTACC | 360 |
TGCTGCCCTA | CCAGAGTGTC | CAAGTCAAGA | GATGGACATT | GTCTTCCTGA | TTGATGGTTC | 420 |
TGGCAGTATG | AGCAAAGTGA | CTTTAAACAA | ATGAAGGATT | TGTGAGAGCT | GTGATGGGAC | 480 |
AGTTTGAGGG | CACCCAAACC | CTGTTCTCAC | TGATACAGTA | TCCCACCTCC | CTGAAGATCC | 540 |
ACTTCACCTT | CACGCAATTC | CAGAGCAGCT | GGAACCCTCT | GAGCCTGGTG | GATCCCATTG | 600 |
TCCAACTGGA | CGGCCTGACA | TATACAGCCA | CGGGCATCCG | GAAAGTGGTG | GAGGAACTGT | 660 |
TTCATAGTAA | GAATGGGGCC | CGTAAAAGTG | CCAAGAAGAT | CCTCATTGTC | ATCACAGATG | 720 |
GCAAAAATAC | AAAGACCCCC | TGGAGTACGA | GGACGTATCC | CCAGGCAGAG | AGAGCGGATC | 780 |
ATCCGCTATG | CCATTGGGGT | GGGAGATGCT | TTCTGGAAAC | CCAGTGCCAA | GCAGGAGCTG | 840 |
GACAACATTG | GCTCAGAGCC | GGCTCAGGAC | CATGTGTTCA | GGGTGGACAA | CTTTGCAGCA | 900 |
CTCAGCAGCA | TCCAGGAGCA | GCTGCAGGAG | AAGATCTTTG | CACTCGAAGG | AACCCAGTCG | 960 |
ACGACAAGTA | GCTCTTTCCA | ACATGAGATG | TTCCAAGAAG | GGTTCA | 1006 |
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
160 • 0 0·· 0000
0 00 0 00 0000 0 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:25:
GTNTTYCARG ARGAYGG 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:26:
CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:27:
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:28:
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA
161 • · · · · · • · 0 0 0 0 ·· ··
0 · ·· · ···· • 0 0 0 · 0 0 0 0 • 0 0 · 0 · · 0000 0 0 0 0000 000 00000 00 00 0 fl 00 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:29:
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:30:
TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:31:
GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:32:
ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:33:
ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37
162 • · (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:34:
TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:35:
TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3528 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3456 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:36:
GGC Gly 1 | TGG Trp | GCC Ala | CTG Leu | GCT Ala 5 | TCC Ser | TGT Cys | CAT His | GGG Gly | TCT Ser 10 | AAC Asn | CTG Leu | GAT Asp | GTG Val | GAG Glu 15 | GAA Glu | 48 |
CCC | ATC | GTG | TTC | AGA | GAG | GAT | GCA | GCC | AGC | TTT | GGA | CAG | ACT | GTG | GTG | 96 |
Pro | Ile | Val | Phe 20 | Arg | Glu | Asp | Ala | Ala 25 | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr 30 | Val | Val | |
CAG | TTT | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | GTG | GGA | GCC | CCT | CTG | GAG | GCG | GTG | 144 |
Gin | Phe | Gly 35 | Gly | Ser | Arg | Leu | Val 40 | Val | Gly | Ala | Pro | Leu 45 | Glu | Ala | Val | |
GCA | GTC | AAC | CAA | ACA | GGA | CGG | TTG | TAT | GAC | TGT | GCA | CCT | GCC | ACT | GGC | 192 |
Ala | Val 50 | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg 55 | Leu | Tyr | Asp | Cys | Ala 60 | Pro | Ala | Thr | Gly |
163 • · · · « · · · · · • « • · • · · · • · · · · • · · · · »···· · · 4 » · · · • · · · · • · · • · « ·
ATG | TGC | CAG | CCC | ATC | GTA | CTG | CGC | AGT | CCC |
Met 65 | Cys | Gin | Pro | Ile | Val 70 | Leu | Arg | Ser | Pro |
TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | GTG | ACT | GCC | ACC |
Ser | Leu | Gly | Leu | Ser 85 | Leu | Val | Thr | Ala | Thr 90 |
GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | CAG | AGA | GCT | TGT |
Ala | Cys | Gly | Pro 100 | Thr | Ala | Gin | Arg | Ala 105 | Cys |
AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT | CTC | GGC | TCC | AGC |
Lys | Gly | Ser 115 | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly 120 | Ser | Ser |
GTC | CCT | GCC | TCC | ATG | CCA | GAG | TGT | CCA | AGA |
Val | Pro 130 | Ala | Ser | Met | Pro | Glu 135 | Cys | Pro | Arg |
TTC | CTG | ATT | GAT | GGT | TCT | GGC | AGC | ATT | AAC |
Phe 145 | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser 150 | Gly | Ser | Ile | Asn |
ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AAA | GCT | TTG | ATG | GGA |
Met | Lys | Asp | Phe | Val 165 | Lys | Ala | Leu | Met | Gly 170 |
ACC | TTG | TTC | TCC | CTG | ATG | CAA | TAC | TCG | AAC |
Thr | Leu | Phe | Ser 180 | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser 185 | Asn |
ACC | TTC | ACT | GAA | TTC | AAG | AAC | ATC | CTG | GAC |
Thr | Phe | Thr 195 | Glu | Phe | Lys | Asn | Ile 200 | Leu | Asp |
CCC | ATT | GTC | CAG | CTG | CAA | GGC | CTG | ACC | TAC |
Pro | Ile 210 | Val | Gin | Leu | Gin | Gly 215 | Leu | Thr | Tyr |
ACA | GTG | ATG | GAA | GAG | CTA | TTT | CAT | AGC | AAG |
Thr 225 | Val | Met | Glu | Glu | Leu 230 | Phe | His | Ser | Lys |
GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | CTT | GTC | ATC | ACA | GAT |
Ala | Lys | Lys | Ile | Leu 245 | Leu | Val | Ile | Thr | Asp 250 |
CCC | CTG | GAG | TAT | AGT | GAT | GTC | ATT | CCC | GCC |
Pro | Leu | Glu | Tyr 260 | Ser | Asp | Val | Ile | Pro 2 65 | Ala |
ATT | CGT | TAT | GCT | ATT | GGG | GTG | GGA | GAT | GCC |
Ile | Arg | Tyr 275 | Ala | Ile | Gly | Val | Gly 280 | Asp | Ala |
CTG | AAG | GAG | CTG | AAC | ACC | ATT | GGC | TCA | GCT |
Leu | Lys 290 | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile 295 | Gly | Ser | Ala |
CTA GAG GCA GTG AAC ATG 240
Leu Glu Ala Val Asn Met
80
AAT AAC GCC CAG TTG CTG 288
Asn Asn Ala Gin Leu Leu
GTG AAG AAC ATG TAT GCG 336
Val Lys Asn Met Tyr Ala
110
TTG CAG TTC ATC CAG GCA 384
Leu Gin Phe Ile Gin Ala
125
CAA GAG ATG GAC ATT GCT 432
Gin Glu Met Asp Ile Ala
140
CAA AGG GAC TTT GCC CAG 480
Gin Arg Asp Phe Ala Gin 155 160
GAG TTT GCG AGC ACC AGC 528
Glu Phe Ala Ser Thr Ser
175
ATC CTG AAG ACC CAT TTT 576
Ile Leu Lys Thr His Phe
190
CCT CAG AGC CTG GTG GAT 624
Pro Gin Ser Leu Val Asp
205
ACA GCC ACA GGC ATC CGG 672
Thr Ala Thr Gly Ile Arg
220
AAT GGG TCC CGT AAA AGT 720
Asn Gly Ser Arg Lys Ser 235 240
GGG CAG AAA TAC AGA GAC 768
Gly Gin Lys Tyr Arg Asp
255
GCA GAC AAA GCT GGC ATC 816
Ala Asp Lys Ala Gly Ile
270
TTC CAG GAG CCC ACT GCC 864
Phe Gin Glu Pro Thr Ala
285
CCC CCA CAG GAC CAC GTG 912
Pro Pro Gin Asp His Val
300
164 • · · · • ·
TTC Phe 305 | AAG Lys | GTA GGC AAC | TTT Phe 310 | GCA GCA CTT | CGC AGC ATC | CAG Gin | AGG Arg | CAA Gin | CTT Leu 320 | 960 | ||||||
Val | Gly | Asn | Ala | Ala | Leu | Arg | Ser 315 | Ile | ||||||||
CAG | GAG | AAA | ATC | TTC | GCC | ATT | GAG | GGA | ACT | CAA | TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | 1008 |
Gin | Glu | Lys | Ile | Phe 325 | Ala | Ile | Glu | Gly | Thr 330 | Gin | Ser | Arg | Ser | Ser 335 | Ser | |
TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG | TCA | CAA | GAA | GGT | TTC | AGT | TCA | GCT | CTC | ACA | 1056 |
Ser | Phe | Gin | His 340 | Glu | Met | Ser | Gin | Glu 345 | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala 350 | Leu | Thr | |
TCG | GAT | GGA | CCC | GTT | CTG | GGG | GCC | GYG | GGA | AGC | TTC | AGC | TGG | TCC | GGA | 1104 |
Ser | Asp | Gly 355 | Pro | Val | Leu | Gly | Ala 360 | Xaa | Gly | Ser | Phe | Ser 365 | Trp | Ser | Gly | |
GGT | GCC | TTC | TTA | TAT | CCC | CCA | AAT | ACG | AGA | CCC | ACC | TTT | ATC | AAC | ATG | 1152 |
Gly | Ala 370 | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro 375 | Asn | Thr | Arg | Pro | Thr 380 | Phe | Ile | Asn | Met |
TCT Ser 385 | CAG Gin | GAG Glu | AAT Asn | GTG Val | GAC Asp 390 | ATG Met | AGA Arg | GAC Asp | TCC Ser | TAC Tyr 395 | CTG Leu | GGT Gly | TAC Tyr | TCC Ser | ACC Thr 400 | 1200 |
GCA | GTG | GCC | TTT | TGG | AAG | GGG | GTT | CAC | AGC | CTG | ATC | CTG | GGG | GCC | CCG | 1248 |
Ala | Val | Ala | Phe | Trp 405 | Lys | Gly | Val | His | Ser 410 | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala 415 | Pro | |
CGT | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG | AAG | GTT | GTC | ATC | TTT | ACC | CAG | GAA | GCC | AGG | 1296 |
Arg | His | Gin | His 420 | Thr | Gly | Lys | Val | Val 425 | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu 430 | Ala | Arg | |
CAT | TGG | AGG | CCC | AAG | TCT | GAA | GTC | AGA | GGG | ACA | CAG | ATC | GGC | TCC | TAC | 1344 |
His | Trp | Arg 435 | Pro | Lys | Ser | Glu | Val 440 | Arg | Gly | Thr | Gin | Ile 445 | Gly | Ser | Tyr | |
TTC | GGG | GCC | TCT | CTC | TGT | TCT | GTG | GAC | GTG | GAT | AGA | GAT | GGC | AGC | ACY | 1392 |
Phe | Gly 450 | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser 455 | Val | Asp | Val | Asp | Arg 460 | Asp | Gly | Ser | Xaa | |
GAC | CTG | GTC | CTG | ATC | GGA | GCC | CCC | CAT | TAC | TAT | GAG | CAG | ACC | CGA | GGG | 1440 |
Asp 465 | Leu | Val | Leu | Ile | Gly 470 | Ala | Pro | His | Tyr | Tyr 475 | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly 480 | |
GGG | CAG | GTC | TCA | GTG | TKC | CCC | GTG | CCC | GGT | GTG | AGG | GGC | AGG | TGG | CAG | 1488 |
Gly | Gin | Val | Ser | Val 485 | Xaa | Pro | Val | Pro | Gly 490 | Val | Arg | Gly | Arg | Trp 495 | Gin | |
TGT | GAG | GCC | ACC | CTC | CAC | GGG | GAG | CAG | GRC | CAT | CCT | TGG | GGC | CGC | TTT | 1536 |
Cys | Glu | Ala | Thr 500 | Leu | His | Gly | Glu | Gin 505 | Xaa | His | Pro | Trp | Gly 510 | Arg | Phe | |
GGG | GTG | GCT | CTG | ACA | GTG | CTG | GGG | GAC | GTA | AAC | GGG | GAC | AAT | CTG | GCA | 1584 |
Gly | Val | Ala 515 | Leu | Thr | Val | Leu | Gly 520 | Asp | Val | Asn | Gly | Asp 525 | Asn | Leu | Ala | |
GAC | GTG | GCT | ATT | GGT | GCC | CCT | GGA | GAG | GAG | GAG | AGC | AGA | GGT | GCT | GTC | 1632 |
Asp | Val 530 | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro 535 | Gly | Glu | Glu | Glu | Ser 540 | Arg | Gly | Ala | Val |
165 • · · · · ·
1680
TAC | ATA | TTT | CAT | GGA | GCC | TCG | AGA | CTG | GAG | ATC | ATG | CCC | TCA | CCC | AGC |
Tyr 545 | Ile | Phe | His | Gly | Ala 550 | Ser | Arg | Leu | Glu | Ile 555 | Met | Pro | Ser | Pro | Ser 560 |
CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC | CAG | CTC | TCC | CTG | AGA | CTG | CAG | TAT | TTT | GGG |
Gin | Arg | Val | Thr | Gly 565 | Ser | Gin | Leu | Ser | Leu 570 | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe 575 | Gly |
CAG | TCA | TTG | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC | CTT | ACA | CAG | GAT | GGC | CTG | GTG | GAC |
Gin | Ser | Leu | Ser 580 | Gly | Gly | Gin | Asp | Leu 585 | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu 590 | Val | Asp |
CTG | GCC | GTG | GGA | GCC | CAG | GGG | CAC | GTA | CTG | CTG | CTC | AGG | AGT | CTG | CCT |
Leu | Ala | Val 595 | Gly | Ala | Gin | Gly | His 600 | Val | Leu | Leu | Leu | Arg 605 | Ser | Leu | Pro |
CTG | CTG | AAA | GTG | GAG | CTC | TCC | ATA | AGA | TTC | GCC | CCC | ATG | GAG | GTG | GCA |
Leu | Leu 610 | Lys | Val | Glu | Leu | Ser 615 | Tle | Arg | Phe | Ala | Pro 620 | Met | Glu | Val | Ala |
1728
1776
1824
1872
AAG | GCT | GTG | TAC | CAG | TGC | TGG | GAA | AGG | ACT | CCC | ACT | GTC | CTC | GAA | GCT |
Lys 625 | Ala | Val | Tyr | Gin | Cys 630 | Trp | Glu | Arg | Thr | Pro 635 | Thr | Val | Leu | Glu | Ala 640 |
GGA | GAG | GCC | ACT | GTC | TGT | CTC | ACT | GTC | CAC | AAA | GGC | TCA | CCT | GAC | CTG |
Gly | Glu | Ala | Thr | Val 645 | Cys | Leu | Thr | Val | His 650 | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp 655 | Leu |
TTA | GGT | AAT | GTC | CAA | GGC | TCT | GTC | AGG | TAT | GAT | CTG | GCG | TTA | GAT | CCG |
Leu | Gly | Asn | Val 660 | Gin | Gly | Ser | Val | Arg 665 | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu 670 | Asp | Pro |
GGC | CGC | CTG | ATT | TCT | CGT | GCC | ATT | TTT | GAT | GAG | ACT | AAG | AAC | TGC | ACT |
Gly | Arg | Leu 675 | Ile | Ser | Arg | Ala | Ile 680 | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys 685 | Asn | Cys | Thr |
TTG | ACG | GGA | AGG | AAG | ACT | CTG | GGG | CTT | GGT | GAT | CAC | TGC | GAA | ACA | GTG |
Leu | Thr 690 | Gly | Arg | Lys | Thr | Leu 695 | Gly | Leu | Gly | Asp | His 700 | Cys | Glu | Thr | Val |
AAG | CTG | CTT | TTG | CCG | GAC | TGT | GTG | GAA | GAT | GCA | GTG | AGC | CCT | ATC | ATC |
Lys 705 | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp 710 | Cys | Val | Glu | Asp | Ala 715 | Val | Ser | Pro | Ile | Ile 720 |
CTG | CGC | CTC | AAC | TTT | TCC | CTG | GTG | AGA | GAC | TCT | GCT | TCA | CCC | AGG | AAC |
Leu | Arg | Leu | Asn | Phe 725 | Ser | Leu | Val | Arg | Asp 730 | Ser | Ala | Ser | Pro | Arg 735 | Asn |
CTG | CAT | CCT | GTG | CTG | GCT | GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | CAC | ATA | ACT | GCT | TCT |
Leu | His | Pro | Val | Leu | Ala | Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Tle | Thr | Ala | Ser |
740 745 750
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2208
2256
CTG | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | TGT | AAG | CAA | GAA | CTC | CTG | TGT | GAG | GGG | GAC |
Leu | Pro | Phe 755 | Glu | Lys | Asn | Cys | Lys 760 | Gin | Glu | Leu | Leu | Cys 765 | Glu | Gly | Asp |
CTG | GGC | ATC | AGC | TTT | AAC | TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | GTC | TTG | GTG | GTG | GGA |
Leu | Gly 770 | Tle | Ser | Phe | Asn | Phe 775 | Ser | Gly | Leu | Gin | Val 780 | Leu | Val | Val | Gly |
2304
2352
166 • · · · • ·
GGC Gly 785 | TCC Ser | CCA Pro | GAG Glu | CTC ACT | GTG Val | ACA Thr | GTC Val | ACT Thr | GTG Val 795 | TGG Trp | AAT Asn | GAG Glu | GGT Gly | GAG Glu 800 | 2400 | |
Leu | Thr 790 | |||||||||||||||
GAC | AGC | TAT | GGA | ACT | TTA | GTC | AAG | TTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GGG | CTA | TCT | 2448 |
Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr 805 | Leu | Val | Lys | Phe | Tyr 810 | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu 815 | Ser | |
TAC | CGA | CGG | GTA | ACA | GGG | ACT | CAG | CAA | CCT | CAT | CAG | TAC | CCA | CTA | CGC | 2496 |
Tyr | Arg | Arg | Val 820 | Thr | Gly | Thr | Gin | Gin 825 | Pro | His | Gin | Tyr | Pro 830 | Leu | Arg | |
TTG | GCC | TGT | GAG | GCT | GAG | CCC | GCT | GCC | CAG | GAG | GAC | CTG | AGG | AGC | AGC | 2544 |
Leu | Ala | Cys 835 | Glu | Ala | Glu | Pro | Ala 840 | Ala | Gin | Glu | Asp | Leu 845 | Arg | Ser | Ser | |
AGC | TGT | AGC | ATT | AAT | CAC | CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | GGT | GCA | AAG | ACC | ACC | 2592 |
Ser | Cys 850 | Ser | Ile | Asn | His | Pro 855 | Ile | Phe | Arg | Glu | Gly 860 | Ala | Lys | Thr | Thr |
TTC ATG ATC ACA TTC | GAT Asp 870 | GTC Val | TCC Ser | TAC AAG | GCC Ala 875 | TTC Phe | CTA Leu | GGA Gly | GAC Asp | AGG Arg 880 | 2640 | |||||
Phe 865 | Met | Ile | Thr | Phe | Tyr | Lys | ||||||||||
TTG | CTT | CTG | AGG | GCC | AAA | GCC | AGC | AGT | GAG | AAT | AAT | AAG | CCT | GAT | ACC | 2688 |
Leu | Leu | Leu | Arg | Ala 885 | Lys | Ala | Ser | Ser | Glu 890 | Asn | Asn | Lys | Pro | Asp 895 | Thr | |
AAC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | CTG | GAG | CTC | CCA | GTG | AAG | TAC | ACC | GTC | TAT | 2736 |
Asn | Lys | Thr | Ala 900 | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu 905 | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr 910 | Val | Tyr | |
ACC | CTG | ATC | AGT | AGG | CAA | GAA | GAT | TCC | ACC | AAC | CAT | GTC | AAC | TTT | TCA | 2784 |
Thr | Leu | Ile 915 | Ser | Arg | Gin | Glu | Asp 920 | Ser | Thr | Asn | His | Val 925 | Asn | Phe | Ser | |
TCT | TCC | CAC | GGG | GGG | AGA | AGG | CAA | GAA | GCC | GCA | CAT | CGC | TAT | CGT | GTG | 2832 |
Ser | Ser 930 | His | Gly | Gly | Arg | Arg 935 | Gin | Glu | Ala | Ala | His 940 | Arg | Tyr | Arg | Val | |
AAT | AAC | CTG | AGT | CCA | CTG | AAG | CTG | GCC | GTC | AGA | GTT | AAC | TTC | TGG | GTC | 2880 |
Asn 945 | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu 950 | Lys | Leu | Ala | Val | Arg 955 | Val | Asn | Phe | Trp | Val 960 | |
CCT | GTC | CTT | CTG | AAC | GGT | GTG | GCT | GTG | TGG | GAC | GTG | ACT | CTG | AGC | AGC | 2928 |
Pro | Val | Leu | Leu | Asn 965 | Gly | Val | Ala | Val | Trp 970 | Asp | Val | Thr | Leu | Ser 975 | Ser | |
CCA | GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | TGC | GTG | TCC | CAG | ATG | AAA | CCT | CCT | CAG | AAT | 2976 |
Pro | Ala | Gin | Gly 980 | Val | Ser | Cys | Val | Ser 985 | Gin | Met | Lys | Pro | Pro 990 | Gin | Asn | |
CCC | GAC | TTT | CTG | ACC | CAG | ATT | CAG | AGA | CGT | TCT | GTG | CTG | GAC | TGC | TCC | 3024 |
Pro | Asp | Phe 995 | Leu | Thr | Gin | Ile | Gin Arg 1000 | Arg | Ser | Val | Leu Asp 1005 | Cys | Ser | |||
ATT | GCT | GAC | TGC | CTG | CAC | TCC | CGC | TGT | GAC | ATC | CCC | TCC | TTG | GAC | ATC | 3072 |
Tle | Ala Asp 1010 | Cys | Leu | His | Ser Arg 1015 | Cys | Asp | Ile | Pro Ser 1020 | Leu | Asp | Ile |
167 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · ···· • · · · · ···· • · · · · · · ···· · • · ···· ··· ···· · ·· ·· ·« ··
CAG GAT Gin Asp 1025 | GAA Glu | CTT Leu | GAC Asp | TTC ATT Phe Ile 1030 | CTG Leu | AGG Arg | GGC Gly | AAC CTC Asn Leu 1035 | AGC Ser | TTC Phe | GGC Gly | TGG Trp 1040 | 3120 |
GTC AGT | CAG | ACA | TTG | CAG GAA | AAG | GTG | TTG | CTT GTG | AGT | GAG | GCT | GAA | 3168 |
Val Ser | Gin | Thr | Leu | Gin Glu | Lys | Val | Leu | Leu Val | Ser | Glu | Ala | Glu | |
1045 | 1050 | 1055 | |||||||||||
ATC ACT | TTC | GAC | ACA | TCT GTG | TAC | TCC | CAG | CTG CCA | GGA | CAG | GAG | GCA | 3216 |
Ile Thr | Phe | Asp | Thr | Ser Val | Tyr | Ser | Gin | Leu Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | |
1060 | 1065 | 1070 | |||||||||||
TTT CTG | AGA | GCC | CAG | GTG GAG | ACA | ACG | TTA | GAA GAA | TAC | GTG | GTC | TAT | 3264 |
Phe Leu | Arg | Ala | Gin | Val Glu | Thr | Thr | Leu | Glu Glu | Tyr | Val | Val | Tyr | |
1075 | 1080 | 1085 | |||||||||||
GAG CCC | ATC | TTC | CTC | GTG GCG | GGC | AGC | TCG | GTG GGA | GGT | CTG | CTG | TTA | 3312 |
Glu Pro | Ile | Phe | Leu | Val Ala | Gly | Ser | Ser | Val Gly | Gly | Leu | Leu | Leu | |
1090 | 1095 | 1100 | |||||||||||
CTG GCT | CTC | ATC | ACA | GTG GTA | CTG | TAC | AAG | CTT GGC | TYC | TYC | AAA | CGT | 3360 |
Leu Ala | Leu | Ile | Thr | Val Val | Leu | Tyr | Lys | Leu Gly | Xaa | Xaa | Lys | Arg | |
1105 | 1110 | 1115 | 1120 | ||||||||||
CAG TAC | AAA | GAA | ATG | CTG GAC | GGC | AAG | GCT | GCA GAT | CCT | GTC | ACA | GCC | 3408 |
Gin Tyr | Lys | Glu | Met | Leu Asp | Gly | Lys | Ala | Ala Asp | Pro | Val | Thr | Ala | |
1125 | 1130 | 1135 | |||||||||||
GGC CAG | GCA | GAT | TTC | GGC TGT | GAG | ACT | CCT | CCA TAT | CTC | GTG | AGC | TAGGAATCCA | |
3463 | |||||||||||||
Gly Gin | Ala | Asp | Phe | Gly Cys | Glu | Thr | Pro | Pro Tyr | Leu | Val | Ser | ||
1140 | 1145 | 1150 | |||||||||||
CTCTCCTGCC TATCTCTGNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA | 3523 | ||||||||||||
CGAGT | 3528 |
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:37:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1151 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) | TYP MOLEKULY: | : protein | ||||||||
(xi) | POPIS SEKVENCE: SEK. ID. | Č. : | 37: | |||||||
Gly 1 | Trp Ala | Leu Ala Ser 5 | Cys His Gly | Ser 10 | Asn | Leu | Asp | Val | Glu 15 | Glu |
Pro | Ile Val | Phe Arg Glu 20 | Asp Ala Ala 25 | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr 30 | Val | Val |
Gin | Phe Gly 35 | Gly Ser Arg | Leu Val Val 40 | Gly | Ala | Pro | Leu 45 | Glu | Ala | Val |
Ala | Val Asn 50 | Gin Thr Gly | Arg Leu Tyr 55 | Asp | Cys | Ala 60 | Pro | Ala | Thr | Gly |
168 ·« ···· ·· ···· ·· ·· « · · · · · · · ·
Met 65 | Cys | Gin | Pro | Ile Val 70 | Leu | Arg | Ser | Pro | Leu Glu Ala Val Asn Met | ||||||
75 | 80 | ||||||||||||||
Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Val | Thr | Ala | Thr | Asn | Asn | Ala | Gin | Leu | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | Ala | Cys | Val | Lys | Asn | Met | Tyr | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | Ser | Ser | Leu | Gin | Phe | Ile | Gin | Ala |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Val | Pro | Ala | Ser | Met | Pro | Glu | Cys | Pro | Arg | Gin | Glu | Met | Asp | Ile | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | Ile | Asn | Gin | Arg | Asp | Phe | Ala | Gin |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | Lys | Asp | Phe | Val | Lys | Ala | Leu | Met | Gly | Glu | Phe | Ala | Ser | Thr | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Leu | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | Asn | Ile | Leu | Lys | Thr | His | Phe |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys | Asn | Ile | Leu | Asp | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Asp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Pro | Ile | Val | Gin | Leu | Gin | Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile | Arg |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Val | Met | Glu | Glu | Leu | Phe | His | Ser | Lys | Asn | Gly | Ser | Arg | Lys | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Leu | Val | Ile | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Arg | Asp |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | Ile | Pro | Ala | Ala | Asp | Lys | Ala | Gly | Ile |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Gin | Glu | Pro | Thr | Ala |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Leu | Lys | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Gly | Ser | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe | Ala | Ala | Leu | Arg | Ser | Ile | Gin | Arg | Gin | Leu |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gin | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala | Ile | Glu | Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Thr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ser | Asp | Gly | Pro | Val | Leu | Gly | Ala | Xaa | Gly | Ser | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | Thr | Arg | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn | Met |
370 | 375 | 380 |
169 • · · · · · • · · · · ·
Ser Gin Glu Asn Val Asp | Met Arg Asp | Ser | Tyr 395 | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr 400 | |||||||
385 | 390 | ||||||||||||||
Ala | Val | Ala | Phe | Trp | Lys | Gly | Val | His | Ser | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala | Pro |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Arg | His | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Val | Val | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu | Ala | Arg |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
His | Trp | Arg | Pro | Lys | Ser | Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | Asp | Val | Asp | Arg | Asp | Gly | Ser | Xaa |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Gly | Gin | Val | Ser | Val | Xaa | Pro | Val | Pro | Gly | Val | Arg | Gly | Arg | Trp | Gin |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Cys | Glu | Ala | Thr | Leu | His | Gly | Glu | Gin | Xaa | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gly | Val | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Asn | Leu | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Ser | Arg | Gly | Ala | Val |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Tyr | Ile | Phe | His | Gly | Ala | Ser | Arg | Leu | Glu | Ile | Met | Pro | Ser | Pro | Ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser | Gin | Leu | Ser | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin | Gly | His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Leu | Leu | Lys | Val | Glu | Leu | Ser | Ile | Arg | Phe | Ala | Pro | Met | Glu | Val | Ala |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Lys | Ala | Val | Tyr | Gin | Cys | Trp | Glu | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr | Val | His | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asn | Val | Gin | Gly | Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Gly | Arg | Leu | Ile | Ser | Arg | Ala | Ile | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Leu | Thr | Gly | Arg | Lys | Thr | Leu | Gly | Leu | Gly | Asp | His | Cys | Glu | Thr | Val |
690 | 695 | 700 |
170
0 ·0· 0 • 0 0 0 0 0
Lys 705 | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp 710 | Cys | Val | Glu | Asp | Ala 715 | Val | Ser | Pro | Ile | Ile 720 |
Leu | Arg | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu | Val | Arg | Asp | Ser | Ala | Ser | Pro | Arg | Asn |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | His | Pro | Val | Leu | Ala | Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Ile | Thr | Ala | Ser |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | Lys | Gin | Glu | Leu | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Leu | Gly | Ile | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | Val | Val | Gly |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Gly | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Val | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Gly | Thr | Gin | Gin | Pro | His | Gin | Tyr | Pro | Leu | Arg |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu | Pro | Ala | Ala | Gin | Glu | Asp | Leu | Arg | Ser | Ser |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Ser | Cys | Ser | Ile | Asn | His | Pro | Ile | Phe | Arg | Glu | Gly | Ala | Lys | Thr | Thr |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Phe | Met | Ile | Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe | Leu | Gly | Asp | Arg |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Leu | Leu | Leu | Arg | Ala | Lys | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Pro | Asp | Thr |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Asn | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr | Val | Tyr |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Thr | Leu | Ile | Ser | Arg | Gin | Glu | Asp | Ser | Thr | Asn | His | Val | Asn | Phe | Ser |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Ser | Ser | His | Gly | Gly | Arg | Arg | Gin | Glu | Ala | Ala | His | Arg | Tyr | Arg | Val |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Asn | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu | Lys | Leu | Ala | Val | Arg | Val | Asn | Phe | Trp | Val |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly | Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | Thr | Leu | Ser | Ser |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser | Cys | Val | Ser | Gin | Met | Lys | Pro | Pro | Gin | Asn |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Pro | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin | Ile | Gin | Arg | Arg | Ser | Val | Leu | Asp | Cys | Ser |
995 | 1000 | 1005 | |||||||||||||
Ile | Ala | Asp | Cys | Leu | His | Ser | Arg | Cys | Asp | Ile | Pro | Ser | Leu | Asp | Ile |
1010 | 1015 | 1020 |
171 • · · · · · ···· ·· ··· ···· • · · · · «· · · · · · • · · · · · · · · ···· · flfl ·· «· ·· ·· ·«·«
Gin 1025 | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe 103C | Ile ) | Leu | Arg | Gly Asn 1035 | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp 1040 | |
Val | Ser | Gin | Thr | Leu 1045 | Gin 1 | Glu | Lys | Val | Leu 105C | Leu 1 | Val | Ser | Glu | Ala 1055 | Glu |
Ile | Thr | Phe | Asp 106C | Thr 1 | Ser | Val | Tyr | Ser 1065 | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin 1070 | Glu 1 | Ala |
Phe | Leu | Arg 1075 | Ala | Gin | Val | Glu | Thr 108C | Thr ) | Leu | Glu | Glu | Tyr Val 1085 | Val | Tyr | |
Glu | Pro 109C | Ile ) | Phe | Leu | Val | Ala 1095 | Gly | Ser | Ser | Val | Gly 110C | Gly 1 | Leu | Leu | Leu |
Leu 1105 | Ala | Leu | Ile | Thr | Val nic | Val 1 | Leu | Tyr | Lys | Leu 1115 | Gly > | Xaa | Xaa | Lys | Arg 1120 |
Gin | Tyr | Lys | Glu | Met 1125 | Leu | Asp | Gly | Lys | Ala 1130 | Ala | Asp | Pro | Val | Thr 1135 | Ala |
Gly | Gin | Ala | Asp 1140 | Phe 1 | Gly | Cys | Glu | Thr 1145 | Pro | Pro | Tyr | Leu | Val 1150 | Ser | |
(2) | INFORMACE 0 | SEK. | ID. | Č. : | 38: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:38:
GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:39:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:39:
GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
172 ·· fefe fefe · fefe · fefefefe • · fefe · fefefefe • · fefe · fefe fefefefe · • · fefefefe fefefe • fefefefe fefe fefe ·· fefe • fe fefe·· • · fefefe· (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:40:
TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:41:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:41:
GGAAACAGCT ATGACCATG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:42:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:42:
GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:43:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:43:
GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:44:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:44:
CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38
173
4444
44 ř · · 4
Β · · ·
944 4 9
4 4
44 ·· 4444
Β ·
Β ·
Β ·
Β · ·
4 (2) INFORMACE Ο SEK. ID. Č.:45:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3519 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 52..3519 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:45:
GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC 57
Met Val
CGT Arg | GGA Gly | GTT Val 5 | GTG Val | ATC Ile | CTC Leu | CTG Leu | TGT Cys 10 | GGC Gly | TGG Trp | GCC Ala | CTG Leu | GCT Ala 15 | TCC Ser | TGT Cys | CAT His | 105 |
GGG | TCT | AAC | CTG | GAT | GTG | GAG | AAG | CCC | GTC | GTG | TTC | AAA | GAG | GAT | GCA | 153 |
Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Lys | Pro | Val | Val | Phe | Lys | Glu | Asp | Ala | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
GCC | AGC | TTC | GGA | CAG | ACT | GTG | GTG | CAG | TTT | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | 201 |
Ala | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | |
35 | 40 | 45 | 50 | |||||||||||||
GTG | GGA | GCC | CCT | CTG | GAG | GCG | GTG | GCA | GTC | AAC | CAA | ACA | GGA | CAG | TCG | 249 |
Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Ala | Val | Asn | Gin | Thr | Gly | Gin | Ser | |
55 | 60 | 65 | ||||||||||||||
TCT | GAC | TGT | CCG | CCT | GCC | ACT | GGC | GTG | TGC | CAG | CCC | ATC | TTA | CTG | CAC | 297 |
Ser | Asp | Cys | Pro | Pro | Ala | Thr | Gly | Val | Cys | Gin | Pro | Ile | Leu | Leu | His | |
70 | 75 | 80 | ||||||||||||||
ATT | CCC | CTA | GAG | GCA | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | GTG | GCT | 345 |
Ile | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Val | Ala | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
GAC | ACC | AAT | AAC | TCC | CAG | TTG | CTG | GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | CAG | AGA | 393 |
Asp | Thr | Asn | Asn | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GCT | TGT | GCA | AAG | AAC | ATG | TAT | GCA | AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT | CTG | GGC | 441 |
Ala | Cys | Ala | Lys | Asn | Met | Tyr | Ala | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | |
115 | 120 | 125 | 130 | |||||||||||||
TCC | AGC | TTG | CAG | TTC | ATC | CAG | GCA | ATC | CCT | GCT | ACC | ATG | CCA | GAG | TGT | 489 |
Ser | Ser | Leu | Gin | Phe | Ile | Gin | Ala | Ile | Pro | Ala | Thr | Met | Pro | Glu | Cys | |
135 | 140 | 145 | ||||||||||||||
CCA | GGA | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GCT | TTC | CTG | ATT | GAT | GGC | TCC | GGC | AGC | 537 |
Pro | Gly | Gin | Glu | Met | Asp | Ile | Ala | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser |
150 155 160
174
ATT Ile | GAT Asp | CAA Gin 165 | AGT Ser | GAC Asp | TTT ACC | CAG Gin 170 | ATG AAG | GAC Asp | TTC Phe | GTC Val 175 | AAA Lys | GCT Ala | TTG Leu | 585 | ||
Phe | Thr | Met | Lys | |||||||||||||
ATG | GGC | CAG | TTG | GCG | AGC | ACC | AGC | ACC | TCG | TTC | TCC | CTG | ATG | CAA | TAC | 633 |
Met | Gly | Gin | Leu | Ala | Ser | Thr | Ser | Thr | Ser | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TCA | AAC | ATC | CTG | AAG | ACT | CAT | TTT | ACC | TTC | ACG | GAA | TTC | AAG | AGC | AGC | 681 |
Ser | Asn | Ile | Leu | Lys | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys | Ser | Ser | |
195 | 200 | 205 | 210 | |||||||||||||
CTG | AGC | CCT | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | GCC | ATC | GTC | CAG | CTC | CAA | GGC | CTG | 729 |
Leu | Ser | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Ala | Ile | Val | Gin | Leu | Gin | Gly | Leu | |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||||
ACG | TAC | ACA | GCC | TCG | GGC | ATC | CAG | AAA | GTG | GTG | AAA | GAG | CTA | TTT | CAT | 777 |
Thr | Tyr | Thr | Ala | Ser | Gly | Ile | Gin | Lys | Val | Val | Lys | Glu | Leu | Phe | His | |
230 | 235 | 240 |
AGC AAG | AAT Asn 245 | GGG Gly | GCC Ala | CGA Arg | AAA AGT | GCC Ala | AAG Lys | AAG ATA CTA ATT | GTC Val | ATC Ile | 825 | |||||
Ser | Lys | Lys | Ser 250 | Lys | Ile | Leu 255 | Ile | |||||||||
ACA | GAT | GGG | CAG | AAA | TTC | AGA | GAC | CCC | CTG | GAG | TAT | AGA | CAT | GTC | ATC | 873 |
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Phe | Arg | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Arg | His | Val | Ile | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
CCT | GAA | GCA | GAG | AAA | GCT | GGG | ATC | ATT | CGC | TAT | GCT | ATA | GGG | GTG | GGA | 921 |
Pro | Glu | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val | Gly | |
275 | 280 | 285 | 290 | |||||||||||||
GAT | GCC | TTC | CGG | GAA | CCC | ACT | GCC | CTA | CAG | GAG | CTG | AAC | ACC | ATT | GGC | 969 |
Asp | Ala | Phe | Arg | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Gly | |
295 | 300 | 305 | ||||||||||||||
TCA | GCT | CCC | TCG | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC | AAG | GTG | GGC | AAT | TTT | GTA | GCA | 1017 |
Ser | Ala | Pro | Ser | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe | Val | Ala | |
310 | 315 | 320 | ||||||||||||||
CTT | CGC | AGC | ATC | CAG | CGG | CAA | ATT | CAG | GAG | AAA | ATC | TTT | GCC | ATT | GAA | 1065 |
Leu | Arg | Ser | Ile | Gin | Arg | Gin | Ile | Gin | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala | Ile | Glu | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
GGA | ACC | GAA | TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG | TCA | CAA | 1113 |
Gly | Thr | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GAA | GGT | TTC | AGC | TCA | GCT | CTC | TCA | ATG | GAT | GGA | CCA | GTT | CTG | GGG | GCT | 1161 |
Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Ser | Met | Asp | Gly | Pro | Val | Leu | Gly | Ala | |
355 | 360 | 365 | 370 | |||||||||||||
GTG | GGA | GGC | TTC | AGC | TGG | TCT | GGA | GGT | GCC | TTC | TTG | TAC | CCC | TCA | AAT | 1209 |
Val | Gly | Gly | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Ser | Asn | |
375 | 380 | 385 | ||||||||||||||
ATG | AGA | TCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAC | GAG | GAT | ATG | AGG | 1257 |
Met | Arg | Ser | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Glu | Asp | Met | Arg | |
390 | 395 | 400 |
175 • ·
GAC Asp | GCT Ala | TAC Tyr 405 | CTG Leu | GGT Gly | TAC Tyr | TCC Ser | ACC Thr 410 | GCA Ala | CTG GCC Leu Ala | TTT Phe | TGG Trp 415 | AAG Lys | GGG Gly | GTC Val | 1305 | |
CAC | AGC | CTG | ATC | CTG | GGG | GCC | CCT | CGC | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG | AAG | GTT | 1353 |
His | Ser | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | His | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Val | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
GTC | ATC | TTT | ACC | CAG | GAA | TCC | AGG | CAC | TGG | AGG | CCC | AAG | TCT | GAA | GTC | 1401 |
Val | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu | Ser | Arg | His | Trp | Arg | Pro | Lys | Ser | Glu | Val | |
435 | 440 | 445 | 450 | |||||||||||||
AGA | GGG | ACA | CAG | ATC | GGC | TCC | TAC | TTT | GGG | GCA | TCT | CTC | TGT | TCT | GTG | 1449 |
Arg | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | |
455 | 460 | 465 | ||||||||||||||
GAC | ATG | GAT | AGA | GAT | GGC | AGC | ACT | GAC | CTG | GTC | CTG | ATT | GGA | GTC | CCC | 1497 |
Asp | Met | Asp | Arg | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly | Val | Pro | |
470 | 475 | 480 |
CAT His | TAC Tyr | TAT Tyr 485 | GAG Glu | CAC His | ACC Thr | CGA GGG GGG Arg Gly Gly 490 | CAG Gin | GTG Val | TCG Ser | GTG Val 495 | TGC Cys | CCC Pro | ATG Met | 1545 | ||
CCT | GGT | GTG | AGG | AGC | AGG | TGG | CAT | TGT | GGG | ACC | ACC | CTC | CAT | GGG | GAG | 1593 |
Pro | Gly | Val | Arg | Ser | Arg | Trp | His | Cys | Gly | Thr | Thr | Leu | His | Gly | Glu | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
CAG | GGC | CAT | CCT | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCG | GCT | CTG | ACA | GTG | CTA | GGG | 1641 |
Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | |
515 | 520 | 525 | 530 | |||||||||||||
GAC | GTG | AAT | GGG | GAC | AGT | CTG | GCG | GAT | GTG | GCT | ATT | GGT | GCA | CCC | GGA | 1689 |
Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Ser | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro | Gly | |
535 | 540 | 545 | ||||||||||||||
GAG | GAG | GAG | AAC | AGA | GGT | GCT | GTC | TAC | ATA | TTT | CAT | GGA | GCC | TCG | AGA | 1737 |
Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Ile | Phe | His | Gly | Ala | Ser | Arg | |
550 | 555 | 560 | ||||||||||||||
CAG | GAC | ATC | GCT | CCC | TCG | CCT | AGC | CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC | CAG | CTC | 1785 |
Gin | Asp | Ile | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser | Gin | Leu | |
565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
TTC | CTG | AGG | CTC | CAA | TAT | TTT | GGG | CAG | TCA | TTA | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC | 1833 |
Phe | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp | |
580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
CTT | ACA | CAG | GAT | GGC | CTG | GTG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGA | GCC | CAG | GGG | CAC | 1881 |
Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin | Gly | His | |
595 | 600 | 605 | 610 | |||||||||||||
GTG | CTG | CTG | CTT | AGG | AGT | CTG | CCT | TTG | CTG | AAA | GTG | GGG | ATC | TCC | ATT | 1929 |
Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | Gly | Ile | Ser | Ile | |
615 | 620 | 625 | ||||||||||||||
AGA | TTT | GCC | CCC | TCA | GAG | GTG | GCA | AAG | ACT | GTG | TAC | CAG | TGC | TGG | GGA | 1977 |
Arg | Phe | Ala | Pro | Ser | Glu | Val | Ala | Lys | Thr | Val | Tyr | Gin | Cys | Trp | Gly | |
630 | 635 | 640 |
176 • · · ·
AGG ACT | CCC Pro 645 | ACT Thr | GTC Val | CTC Leu | GAA Glu | GCT Ala 650 | GGA Gly | GAG Glu | GCC Ala | ACC Thr | GTC Val 655 | TGT Cys | CTC Leu | ACT Thr | 2025 | |
Arg | Thr | |||||||||||||||
GTC | CGC | AAA | GGT | TCA | CCT | GAC | CTG | TTA | GGT | GAT | GTC | CAA | AGC | TCT | GTC | 2073 |
Val | Arg 660 | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp 665 | Leu | Leu | Gly | Asp | Val 670 | Gin | Ser | Ser | Val | |
AGG | TAT | GAT | CTG | GCG | TTG | GAT | CCG | GGC | CGT | CTG | ATT | TCT | CGT | GCC | ATT | 2121 |
Arg 675 | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu 680 | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu 685 | Ile | Ser | Arg | Ala | Ile 690 | |
TTT | GAT | GAG | ACG | AAG | AAC | TGC | ACT | TTG | ACC | CGA | AGG | AAG | ACT | CTG | GGG | 2169 |
Phe | Asp | Glu | Thr | Lys 695 | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr 700 | Arg | Arg | Lys | Thr | Leu 705 | Gly | |
CTT | GGT | GAT | CAC | TGC | GAA | ACA | ATG | AAG | CTG | CTT | TTG | CCA | GAC | TGT | GTG | 2217 |
Leu | Gly | Asp | His 710 | Cys | Glu | Thr | Met | Lys 715 | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp 720 | Cys | Val |
GAG Glu | GAT Asp | GCA Ala 725 | GTG Val | ACC Thr | CCT Pro | ATC ATC | CTG Leu | CGC Arg | CTT Leu | AAC Asn | TTA Leu 735 | TCC Ser | CTG Leu | GCA Ala | 2265 | |
Ile | Ile 730 | |||||||||||||||
GGG | GAC | TCT | GCT | CCA | TCC | AGG | AAC | CTT | CGT | CCT | GTG | CTG | GCT | GTG | GGC | 2313 |
Gly | Asp | Ser | Ala | Pro | Ser | Arg | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Val | Gly | |
740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
TCA | CAA | GAC | CAT | GTA | ACA | GCT | TCT | TTC | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | TGT | GAG | 2361 |
Ser | Gin | Asp | His | Val | Thr | Ala | Ser | Phe | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | Glu | |
755 | 760 | 765 | 770 | |||||||||||||
GGG | AAC | CTG | GGC | GTC | AGC | TTC | AAC | TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | GTC | TTG | GAG | 2409 |
Gly | Asn | Leu | Gly | Val | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | Glu | |
775 | 780 | 785 | ||||||||||||||
GTA | GGA | AGC | TCC | CCA | GAG | CTC | ACT | GTG | ACA | GTA | ACA | GTT | TGG | AAT | GAG | 2457 |
Val | Gly | Ser | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | |
790 | 795 | 800 | ||||||||||||||
GGT | GAG | GAC | AGC | TAT | GGA | ACC | TTA | ATC | AAG | TTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GAG | 2505 |
Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Ile | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Glu | |
805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
CTA | TCT | TAC | CGA | CGG | GTG | ACA | AGA | GCC | CAG | CAA | CCT | CAT | CCG | TAC | CCA | 2553 |
Leu | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Arg | Ala | Gin | Gin | Pro | His | Pro | Tyr | Pro | |
820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
CTA | CGC | CTG | GCA | TGT | GAG | GCT | GAG | CCC | ACG | GGC | CAG | GAG | AGC | CTG | AGG | 2601 |
Leu | Arg | Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu | Pro | Thr | Gly | Gin | Glu | Ser | Leu | Arg | |
835 | 840 | 845 | 850 | |||||||||||||
AGC | AGC | AGC | TGT | AGC | ATC | AAT | CAC | CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | GGT | GCC | AAG | 2649 |
Ser | Ser | Ser | Cys | Ser | Ile | Asn | His | Pro | Ile | Phe | Arg | Glu | Gly | Ala | Lys | |
855 | 860 | 865 | ||||||||||||||
GCC | ACC | TTC | ATG | ATC | ACA | TTT | GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | TTC | CTG | GGA | 2697 |
Ala | Thr | Phe | Met | Ile | Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe | Leu | Gly | |
870 | 875 | 880 |
177 • · · ·
GAC Asp | AGG Arg | TTG Leu 885 | CTT Leu | CTG AGG Leu Arg | GCC Ala | AGC Ser 890 | GCA Ala | AGC Ser | AGT Ser | GAG AAT AAT AAG CCT | 2745 | |||||
Glu | Asn 895 | Asn | Lys | Pro | ||||||||||||
GAA | ACC | AGC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | CTG | GAG | CTT | CCG | GTG | AAG | TAC | ACG | 2793 |
Glu | Thr | Ser | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr | |
900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
GTC | TAT | ACC | GTG | ATC | AGT | AGG | CAG | GAA | GAT | TCT | ACC | AAG | CAT | TTC | AAC | 2841 |
Val | Tyr | Thr | Val | Ile | Ser | Arg | Gin | Glu | Asp | Ser | Thr | Lys | His | Phe | Asn | |
915 | 920 | 925 | 930 | |||||||||||||
TTC | TCA | TCT | TCC | CAC | GGG | GAG | AGA | CAG | AAA | GAG | GCC | GAA | CAT | CGA | TAT | 2889 |
Phe | Ser | Ser | Ser | His | Gly | Glu | Arg | Gin | Lys | Glu | Ala | Glu | His | Arg | Tyr | |
935 | 940 | 945 | ||||||||||||||
CGT | GTG | AAT | AAC | CTG | AGT | CCA | TTG | ACG | CTG | GCC | ATC | AGC | GTT | AAC | TTC | 2937 |
Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu | Thr | Leu | Ala | Ile | Ser | Val | Asn | Phe | |
950 | 955 | 960 |
TGG Trp | GTC Val | CCC Pro 965 | ATC Ile | CTT Leu | CTG Leu | AAT Asn | GGT Gly 970 | GTG Val | GCC Ala | GTG Val | TGG Trp | GAT Asp 975 | GTG Val | ACT Thr | CTG Leu | 2985 |
AGG | AGC | CCA | GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | TGT | GTG | TCA | CAG | AGG | GAA | CCT | CCT | 3033 |
Arg | Ser 980 | Pro | Ala | Gin | Gly | Val 985 | Ser | Cys | Val | Ser | Gin 990 | Arg | Glu | Pro | Pro | |
CAA | CAT | TCC | GAC | CTT | CTG | ACC | CAG | ATC | CAA | GGA | CGC | TCT | GTG | CTG | GAC | 3081 |
Gin 995 | His | Ser | Asp | Leu | Leu Thr 1000 | Gin | Ile | Gin | Gly Arg 1005 | Ser | Val | Leu | Asp 1010 | |||
TGC | GCC | ATC | GCC | GAC | TGC | CTG | CAC | CTC | CGC | TGT | GAC | ATC | CCC | TCC | TTG | 3129 |
Cys | Ala | Ile | Ala | Asp Cys 1015 | Leu | His | Leu | Arg Cys 1020 | Asp | Ile | Pro | Ser 1025 | Leu | |||
GGC | ACC | CTG | GAT | GAG | CTT | GAC | TTC | ATT | CTG | AAG | GGC | AAC | CTC | AGC | TTC | 3177 |
Gly | Thr | Leu | Asp Glu 1030 | Leu | Asp | Phe | Ile Leu 1035 | Lys | Gly | Asn | Leu 104C | Ser ) | Phe | |||
GGC | TGG | ATC | AGT | CAG | ACA | TTG | CAG | AAA | AAG | GTG | TTG | CTC | CTG | AGT | GAG | 3225 |
Gly | Trp | Ile Ser 1045 | Gin | Thr | Leu | Gin Lys 1050 | Lys | Val | Leu | Leu Leu 1055 | Ser | Glu | ||||
GCT | GAA | ATC | ACA | TTC | AAC | ACA | TCT | GTG | TAT | TCC | CAG | CTG | CCG | GGA | CAG | 3273 |
Ala | Glu Ile 1060 | Thr | Phe | Asn | Thr Ser 1065 | Val | Tyr | Ser | Gin 107C | Leu ) | Pro | Gly | Gin | |||
GAG | GCA | TTT | CTG | AGA | GCC | CAG | GTG | TCA | ACG | ATG | CTA | GAA | GAA | TAC | GTG | 3321 |
Glu 1075 | Ala | Phe | Leu | Arg | Ala Gin 1080 | Val | Ser | Thr | Met 1085 | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val 1090 | ||
GTC | TAT | GAG | CCC | GTC | TTC | CTC | ATG | GTG | TTC | AGC | TCA | GTG | GGA | GGT | CTG | 3369 |
Val | Tyr | Glu | Pro | Val 1095 | Phe 1 | Leu | Met | Val | Phe noc | Ser 1 | Ser | Val | Gly | Gly 1105 | Leu | |
CTG | TTA | CTG | GCT | CTC | ATC | ACT | GTG | GCG | CTG | TAC | AAG | CTT | GGC | TTC | TTC | 3417 |
Leu | Leu | Leu | Ala 1110 | Leu 1 | Ile | Thr | Val | Ala 1115 | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly 1120 | Phe 1 | Phe |
178 • · · · • · • * • · · · · • · · ·· ··
AAA Lys | CGT Arg | CAG TAT Gin Tyr 1125 | AAA Lys | GAG ATG CTG GAT | CTA CCA | TCT Ser | GCA GAT Ala Asp 1135 | CCT Pro | GAC Asp | ||
Glu Met | Leu Asp 1130 | Leu | Pro | ||||||||
CCA | GCC | GGC CAG | GCA | GAT TCC | AAC CAT | GAG | ACT | CCT | CCA CAT | CTC | ACG |
Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr 1140 1145 TCC TAG Ser 1155 (2) INFORMACE 0 SEK. ID. Č.:46: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1155 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:46: | Pro Pro His 1150 | Leu | Thr | ||||||||
Met 1 | Val | Arg Gly | Val 5 | Val Ile | Leu Leu | Cys 10 | Gly | Trp | Ala Leu | Ala 15 | Ser |
Cys | His | Gly Ser 20 | Asn | Leu Asp | Val Glu 25 | Lys | Pro | Val | Val Phe 30 | Lys | Glu |
Asp | Ala | Ala Ser 35 | Phe | Gly Gin | Thr Val 40 | Val | Gin | Phe | Gly Gly 45 | Ser | Arg |
Leu | Val 50 | Val Gly | Ala | Pro Leu 55 | Glu Ala | Val | Ala | Val 60 | Asn Gin | Thr | Gly |
Gin 65 | Ser | Ser Asp | Cys | Pro Pro 70 | Ala Thr | Gly | Val 75 | Cys | Gin Pro | Ile | Leu 80 |
Leu | His | Ile Pro | Leu 85 | Glu Ala | Val Asn | Met 90 | Ser | Leu | Gly Leu | Ser 95 | Leu |
Val | Ala | Asp Thr 100 | Asn | Asn Ser | Gin Leu 105 | Leu | Ala | Cys | Gly Pro 110 | Thr | Ala |
Gin | Arg | Ala Cys 115 | Ala | Lys Asn | Met Tyr 120 | Ala | Lys | Gly | Ser Cys 125 | Leu | Leu |
Leu | Gly 130 | Ser Ser | Leu | Gin Phe 135 | Ile Gin | Ala | Ile | Pro 140 | Ala Thr | Met | Pro |
Glu 145 | Cys | Pro Gly | Gin | Glu Met 150 | Asp Ile | Ala | Phe 155 | Leu | Ile Asp | Gly | Ser 160 |
Gly | Ser | Ile Asp | Gin 165 | Ser Asp | Phe Thr | Gin 170 | Met | Lys | Asp Phe | Val 175 | Lys |
Ala | Leu | Met Gly 180 | Gin | Leu Ala | Ser Thr 185 | Ser | Thr | Ser | Phe Ser 190 | Leu | Met |
3465
3513
3519
179 • · · · · · · · · ····· ·· ·· ·· · *
Gin | Tyr | Ser 195 | Asn | Ile | Leu | Lys | Thr 200 | His | Phe | Thr | Phe | Thr 205 | Glu | Phe | Lys |
Ser | Ser | Leu | Ser | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Ala | Ile | Val | Gin | Leu | Gin |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr | Ala | Ser | Gly | Ile | Gin | Lys | Val | Val | Lys | Glu | Leu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Phe | His | Ser | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Ile | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Phe | Arg | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Arg | His |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Val | Ile | Pro | Glu | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Arg | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ile | Gly | Ser | Ala | Pro | Ser | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Val | Ala | Leu | Arg | Ser | Ile | Gin | Arg | Gin | Ile | Gin | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ile | Glu | Gly | Thr | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Ser | Met | Asp | Gly | Pro | Val | Leu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | Ala | Val | Gly | Gly | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ser | Asn | Met | Arg | Ser | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Glu | Asp |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Met | Arg | Asp | Ala | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Ala | Leu | Ala | Phe | Trp | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gly | Val | His | Ser | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | His | Gin | His | Thr | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Lys | Val | Val | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu | Ser | Arg | His | Trp | Arg | Pro | Lys | Ser |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ser | Val | Asp | Met | Asp | Arg | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Val | Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | His | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Met | Pro | Gly | Val | Arg | Ser | Arg | Trp | His | Cys | Gly | Thr | Thr | Leu | His |
500 | 505 | 510 |
180 • · ·· · · · · · • » ·· · · · ···· · • · · · » · ··· ····· · · · · · · ··
Gly Glu Gin 515 | Gly His | Pro | Trp Gly Arg 520 | Phe | Gly | Ala | Ala 525 | Leu | Thr | Val | |||||
Leu | Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Ser | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Ile | Phe | His | Gly | Ala |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Arg | Gin | Asp | Ile | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Leu | Phe | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | Gly | Ile |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ser | Ile | Arg | Phe | Ala | Pro | Ser | Glu | Val | Ala | Lys | Thr | Val | Tyr | Gin | Cys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Trp | Gly | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Thr | Val | Arg | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Asp | Val | Gin | Ser |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | Ile | Ser | Arg |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Ala | Ile | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lys | Thr |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Gly | Asp | His | Cys | Glu | Thr | Met | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Cys | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Thr | Pro | Ile | Ile | Leu | Arg | Leu | Asn | Leu | Ser |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Ala | Gly | Asp | Ser | Ala | Pro | Ser | Arg | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Val | Thr | Ala | Ser | Phe | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Cys | Glu | Gly | Asn | Leu | Gly | Val | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Leu | Glu | Val | Gly | Ser | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Ile | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ala | Glu | Leu | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Arg | Ala | Gin | Gin | Pro | His | Pro |
820 | 825 | 830 |
181 • · · • · ···· · · · ····« ·· · · ·· ··
Tyr | Pro | Leu Arg 835 | Leu | Ala Cys | Glu 840 | Ala | Glu | Pro | Thr | Gly 845 | Gin | Glu | Ser |
Leu | Arg 850 | Ser Ser | Ser | Cys Ser 855 | Ile | Asn | His | Pro | Ile 860 | Phe | Arg | Glu | Gly |
Ala 865 | Lys | Ala Thr | Phe | Met Ile 870 | Thr | Phe | Asp | Val 875 | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe 880 |
Leu | Gly | Asp Arg | Leu 885 | Leu Leu | Arg | Ala | Ser 890 | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn 895 | Asn |
Lys | Pro | Glu Thr 900 | Ser | Lys Thr | Ala | Phe 905 | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro 910 | Val | Lys |
Tyr | Thr | Val Tyr 915 | Thr | Val Ile | Ser 920 | Arg | Gin | Glu | Asp | Ser 925 | Thr | Lys | His |
Phe | Asn 930 | Phe Ser | Ser | Ser His 935 | Gly | Glu | Arg | Gin | Lys 940 | Glu | Ala | Glu | His |
Arg 945 | Tyr | Arg Val | Asn | Asn Leu 950 | Ser | Pro | Leu | Thr 955 | Leu | Ala | Ile | Ser | Val 960 |
Asn | Phe | Trp Val | Pro 965 | Ile Leu | Leu | Asn | Gly 970 | Val | Ala | Val | Trp | Asp 975 | Val |
Thr | Leu | Arg Ser 980 | Pro | Ala Gin | Gly | Val 985 | Ser | Cys | Val | Ser | Gin 990 | Arg | Glu |
Pro | Pro | Gin His 995 | Ser | Asp Leu | Leu Thr 1000 | Gin | Ile | Gin | Gly 1005 | Arg | Ser | Val | |
Leu | Asp Cys Ala 1010 | Ile | Ala Asp Cys 1015 | Leu | His | Leu | Arg 102C | Cys 1 | Asp | Ile | Pro | ||
Ser 1025 | Leu | Gly Thr | Leu | Asp Glu 1030 | Leu | Asp | Phe | Ile Leu 1035 | Lys | Gly | Asn | Leu 1040 | |
Ser | Phe | Gly Trp | Ile Ser Gin 1045 | Thr | Leu | Gin Lys 1050 | Lys | Val | Leu | Leu Leu 1055 | |||
Ser | Glu | Ala Glu 106C | Ile 1 | Thr Phe | Asn | Thr Ser 1065 | Val | Tyr | Ser | Gin Leu 1070 | Pro | ||
Gly | Gin | Glu Ala 1075 | Phe | Leu Arg | Ala Gin 1080 | Val | Ser | Thr | Met 1085 | Leu | Glu | Glu | |
Tyr | Val Val Tyr 1090 | Glu | Pro Val 1095 | Phe | Leu | Met | Val | Phe noc | Ser 1 | Ser | Val | Gly | |
Gly 1105 | Leu | Leu Leu | Leu | Ala Leu 1110 | Ile | Thr | Val | Ala Leu 1115 | Tyr | Lys | Leu | Gly 1120 | |
Phe | Phe | Lys Arg | Gin | Tyr Lys | Glu | Met | Leu | Asp | Leu | Pro | Ser | Ala | Asp |
1125 1130 1135
182 ··
Pro Asp Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His
1140 1145 1150
Leu Thr Ser 1155 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:47:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 49 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:47:
AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:48:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:48:
GCTGGACGAT GGCATCCAC 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:49:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:49:
GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:50:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:50:
GCAGCCAGCT TCGGACAGAC 20
183 • ·· · • · ···· · · · • · · · · ·· · · ·· ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:51:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:51:
CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:52:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3803 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3486 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:52:
ATG Met 1 | GTC Val | CGT Arg | GGA Gly | GTT Val 5 | GTG Val | ATC Ile | CTC Leu | CTG Leu | TGT Cys 10 | GGC Gly | TGG Trp | GCC Ala | CTG Leu | GCT Ala 15 | TCC Ser | 48 |
TGT | CAT | GGG | TCT | AAC | CTG | GAT | GTG | GAG | AAG | CCC | GTC | GTG | TTC | AAA | GAG | 96 |
Cys | His | Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Lys | Pro | Val | Val | Phe | Lys | Glu | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
GAT | GCA | GCC | AGC | TTC | GGA | CAG | ACT | GTG | GTG | CAG | TTT | GGT | GGA | TCT | CGA | 144 |
Asp | Ala | Ala | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
CTC | GTG | GTG | GGA | GCC | CCT | CTG | GAG | GCG | GTG | GCA | GTC | AAC | CAA | ACA | GGA | 192 |
Leu | Val | Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Ala | Val | Asn | Gin | Thr | Gly | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
CAG | TCG | TCT | GAC | TGT | CCG | CCT | GCC | ACT | GGC | GTG | TGC | CAG | CCC | ATC | TTA | 240 |
Gin | Ser | Ser | Asp | Cys | Pro | Pro | Ala | Thr | Gly | Val | Cys | Gin | Pro | Ile | Leu | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
CTG | CAC | ATT | CCC | CTA | GAG | GCA | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | 288 |
Leu | His | Ile | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
GTG | GCT | GAC | ACC | AAT | AAC | TCC | CAG | TTG | CTG | GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | 336 |
Val | Ala | Asp | Thr | Asn | Asn | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala |
100 105 110
184 ·· ··
CAG | AGA | GCT | TGT | GCA | AAG | AAC | ATG | TAT | GCA | AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT |
Gin | Arg | Ala 115 | Cys | Ala | Lys | Asn | Met 120 | Tyr | Ala | Lys | Gly | Ser 125 | Cys | Leu | Leu |
CTG | GGC | TCC | AGC | TTG | CAG | TTC | ATC | CAG | GCA | ATC | CCT | GCT | ACC | ATG | CCA |
Leu | Gly 130 | Ser | Ser | Leu | Gin | Phe 135 | Ile | Gin | Ala | Ile | Pro 140 | Ala | Thr | Met | Pro |
GAG | TGT | CCA | GGA | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GCT | TTC | CTG | ATT | GAT | GGC | TCC |
Glu 145 | Cys | Pro | Gly | Gin | Glu 150 | Met | Asp | Ile | Ala | Phe 155 | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser 160 |
GGC | AGC | ATT | GAT | CAA | AGT | GAC | TTT | ACC | CAG | ATG | AAG | GAC | TTC | GTC | AAA |
Gly | Ser | Ile | Asp | Gin 165 | Ser | Asp | Phe | Thr | Gin 170 | Met | Lys | Asp | Phe | Val 175 | Lys |
GCT | TTG | ATG | GGC | CAG | TTG | GCG | AGC | ACC | AGC | ACC | TCG | TTC | TCC | CTG | ATG |
Ala | Leu | Met | Gly 180 | Gin | Leu | Ala | Ser | Thr 185 | Ser | Thr | Ser | Phe | Ser 190 | Leu | Met |
CAA | TAC | TCA | AAC | ATC | CTG | AAG | ACT | CAT | TTT | ACC | TTC | ACG | GAA | TTC | AAG |
Gin | Tyr | Ser 195 | Asn | Ile | Leu | Lys | Thr 200 | His | Phe | Thr | Phe | Thr 205 | Glu | Phe | Lys |
AGC | AGC | CTG | AGC | CCT | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | GCC | ATC | GTC | CAG | CTC | CAA |
Ser | Ser 210 | Leu | Ser | Pro | Gin | Ser 215 | Leu | Val | Asp | Ala | Ile 220 | Val | Gin | Leu | Gin |
384
432
480
528
576
624
672
GGC Gly 225 | CTG ACG | TAC Tyr | ACA GCC | TCG Ser | GGC Gly | ATC Ile | CAG Gin | AAA Lys 235 | GTG Val | GTG Val | AAA Lys | GAG Glu | CTA Leu 240 | ||
Leu | Thr | Thr | Ala 230 | ||||||||||||
TTT | CAT | AGC | AAG | AAT | GGG | GCC | CGA | AAA | AGT | GCC | AAG | AAG | ATA | CTA | ATT |
Phe | His | Ser | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
GTC | ATC | ACA | GAT | GGG | CAG | AAA | TTC | AGA | GAC | CCC | CTG | GAG | TAT | AGA | CAT |
Val | Ile | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Phe | Arg | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Arg | His |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
GTC | ATC | CCT | GAA | GCA | GAG | AAA | GCT | GGG | ATC | ATT | CGC | TAT | GCT | ATA | GGG |
Val | Ile | Pro | Glu | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
GTG | GGA | GAT | GCC | TTC | CGG | GAA | CCC | ACT | GCC | CTA | CAG | GAG | CTG | AAC | ACC |
Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Arg | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
ATT | GGC | TCA | GCT | CCC | TCG | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC | AAG | GTG | GGC | AAT | TTT |
Ile | Gly | Ser | Ala | Pro | Ser | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
GTA | GCA | CTT | CGC | AGC | ATC | CAG | CGG | CAA | ATT | CAG | GAG | AAA | ATC | TTT | GCC |
Val | Ala | Leu | Arg | Ser | Ile | Gin | Arg | Gin | Ile | Gin | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
ATT | GAA | GGA | ACC | GAA | TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG |
Ile | Glu | Gly | Thr | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met |
340 | 345 | 350 |
720
768
816
864
912
960
1008
1056
185 * · ···· ·· ··
TCA CAA | GAA GGT | TTC Phe | AGC Ser | TCA Ser | GCT Ala 360 | CTC Leu | TCA ATG Ser Met | GAT Asp | GGA Gly 365 | CCA Pro | GTT Val | CTG Leu | |||
Ser | Gin | Glu 355 | Gly | ||||||||||||
GGG | GCT | GTG | GGA | GGC | TTC | AGC | TGG | TCT | GGA | GGT | GCC | TTC | TTG | TAC | CCC |
Gly | Ala | Val | Gly | Gly | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
TCA | AAT | ATG | AGA | TCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAC | GAG | GAT |
Ser | Asn | Met | Arg | Ser | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Glu | Asp |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
ATG | AGG | GAC | GCT | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GCA | CTG | GCC | TTT | TGG | AAG |
Met | Arg | Asp | Ala | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Ala | Leu | Ala | Phe | Trp | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
GGG | GTC | CAC | AGC | CTG | ATC | CTG | GGG | GCC | CCT | CGC | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG |
Gly | Val | His | Ser | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | His | Gin | His | Thr | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
AAG | GTT | GTC | ATC | TTT | ACC | CAG | GAA | TCC | AGG | CAC | TGG | AGG | CCC | AAG | TCT |
Lys | Val | Val | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu | Ser | Arg | His | Trp | Arg | Pro | Lys | Ser |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
GAA | GTC | AGA | GGG | ACA | CAG | ATC | GGC | TCC | TAC | TTT | GGG | GCA | TCT | CTC | TGT |
Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys |
450 | 455 | 460 |
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
TCT | GTG | GAC | ATG | GAT | AGA | GAT | GGC | AGC | ACT | GAC | CTG | GTC | CTG | ATT | GGA |
Ser 465 | Val | Asp | Met | Asp | Arg 470 | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp 475 | Leu | Val | Leu | Ile | Gly 480 |
GTC | CCC | CAT | TAC | TAT | GAG | CAC | ACC | CGA | GGG | GGG | CAG | GTG | TCG | GTG | TGC |
Val | Pro | His | Tyr | Tyr 485 | Glu | His | Thr | Arg | Gly 490 | Gly | Gin | Val | Ser | Val 495 | Cys |
CCC | ATG | CCT | GGT | GTG | AGG | AGC | AGG | TGG | CAT | TGT | GGG | ACC | ACC | CTC | CAT |
Pro | Met | Pro | Gly 500 | Val | Arg | Ser | Arg | Trp 505 | His | Cys | Gly | Thr | Thr 510 | Leu | His |
GGG | GAG | CAG | GGC | CAT | CCT | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCG | GCT | CTG | ACA | GTG |
Gly | Glu | Gin 515 | Gly | His | Pro | Trp | Gly 520 | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala 525 | Leu | Thr | Val |
CTA | GGG | GAC | GTG | AAT | GGG | GAC | AGT | CTG | GCG | GAT | GTG | GCT | ATT | GGT | GCA |
Leu | Gly 530 | Asp | Val | Asn | Gly | Asp 535 | Ser | Leu | Ala | Asp | Val 540 | Ala | Ile | Gly | Ala |
CCC | GGA | GAG | GAG | GAG | AAC | AGA | GGT | GCT | GTC | TAC | ATA | TTT | CAT | GGA | GCC |
Pro 545 | Gly | Glu | Glu | Glu | Asn 550 | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr 555 | Ile | Phe | His | Gly | Ala 560 |
TCG | AGA | CAG | GAC | ATC | GCT | CCC | TCG | CCT | AGC | CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC |
Ser | Arg | Gin | Asp | Ile 565 | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser 570 | Gin | Arg | Val | Thr | Gly 575 | Ser |
CAG | CTC | TTC | CTG | AGG | CTC | CAA | TAT | TTT | GGG | CAG | TCA | TTA | AGT | GGG | GGT |
Gin | Leu | Phe | Leu 580 | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe 585 | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser 590 | Gly | Gly |
1440
1488
1536
1584
1632
1680
1728
1776
186 ·· «··· «» ···· ·· ·· ©β · · · · ···· • · · · · · · · · • · · · ♦ · · · · · · · • · ···· ··· ·«·©· ·· · · ·· · ·
CAG Gin | GAC Asp | CTT ACA CAG | GAT Asp | GGC Gly | CTG Leu 600 | GTG Val | GAC Asp | CTG Leu | GCC Ala | GTG Val 605 | GGA Gly | GCC Ala | CAG Gin | 1824 | ||
Leu 595 | Thr | Gin | ||||||||||||||
GGG | CAC | GTG | CTG | CTG | CTT | AGG | AGT | CTG | CCT | TTG | CTG | AAA | GTG | GGG | ATC | 1872 |
Gly | His 610 | Val | Leu | Leu | Leu | Arg 615 | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu 620 | Lys | Val | Gly | Ile | |
TCC | ATT | AGA | TTT | GCC | CCC | TCA | GAG | GTG | GCA | AAG | ACT | GTG | TAC | CAG | TGC | 1920 |
Ser 625 | Ile | Arg | Phe | Ala | Pro 630 | Ser | Glu | Val | Ala | Lys 635 | Thr | Val | Tyr | Gin | Cys 640 | |
TGG | GGA | AGG | ACT | CCC | ACT | GTC | CTC | GAA | GCT | GGA | GAG | GCC | ACC | GTC | TGT | 1968 |
Trp | Gly | Arg | Thr | Pro 645 | Thr | Val | Leu | Glu | Ala 650 | Gly | Glu | Ala | Thr | Val 655 | Cys | |
CTC | ACT | GTC | CGC | AAA | GGT | TCA | CCT | GAC | CTG | TTA | GGT | GAT | GTC | CAA | AGC | 2016 |
Leu | Thr | Val | Arg 660 | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp 665 | Leu | Leu | Gly | Asp | Val 670 | Gin | Ser | |
TCT | GTC | AGG | TAT | GAT | CTG | GCG | TTG | GAT | CCG | GGC | CGT | CTG | ATT | TCT | CGT | 2064 |
Ser | Val | Arg 675 | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu 680 | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu 685 | Ile | Ser | Arg | |
GCC | ATT | TTT | GAT | GAG | ACG | AAG | AAC | TGC | ACT | TTG | ACC | CGA | AGG | AAG | ACT | 2112 |
Ala | Ile 690 | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys 695 | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr 700 | Arg | Arg | Lys | Thr |
CTG Leu 705 | GGG Gly | CTT Leu | GGT Gly | GAT Asp | CAC His 710 | TGC Cys | GAA ACA ATG | AAG Lys 715 | CTG Leu | CTT Leu | TTG Leu | CCA Pro | GAC Asp 720 | 2160 | ||
Glu | Thr | Met | ||||||||||||||
TGT | GTG | GAG | GAT | GCA | GTG | ACC | CCT | ATC | ATC | CTG | CGC | CTT | AAC | TTA | TCC | 2208 |
Cys | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Thr | Pro | Ile | Ile | Leu | Arg | Leu | Asn | Leu | Ser | |
725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
CTG | GCA | GGG | GAC | TCT | GCT | CCA | TCC | AGG | AAC | CTT | CGT | CCT | GTG | CTG | GCT | 2256 |
Leu | Ala | Gly | Asp | Ser | Ala | Pro | Ser | Arg | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala | |
740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | CAT | GTA | ACA | GCT | TCT | TTC | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | 2304 |
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Val | Thr | Ala | Ser | Phe | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | |
755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
TGT | AAG | CAG | GAG | CTC | CTG | TGT | GAG | GGG | AAC | CTG | GGC | GTC | AGC | TTC | AAC | 2352 |
Cys | Lys | Gin | Glu | Leu | Leu | Cys | Glu | Gly | Asn | Leu | Gly | Val | Ser | Phe | Asn | |
770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | GTC | TTG | GAG | GTA | GGA | AGC | TCC | CCA | GAG | CTC | ACT | 2400 |
Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | Glu | Val | Gly | Ser | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | |
785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
GTG | ACA | GTA | ACA | GTT | TGG | AAT | GAG | GGT | GAG | GAC | AGC | TAT | GGA | ACC | TTA | 2448 |
Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | |
805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
ATC | AAG | TTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GAG | CTA | TCT | TAC | CGA | CGG | GTG | ACA | AGA | 2496 |
Ile | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Glu | Leu | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Arg | |
820 | 825 | 830 |
187
99
9 9
99
999 9 · • · 9
99 ·· ·*·· • · · • · • · • · • fe·· · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · ·
99
GCC Ala | CAG Gin | CAA Gin 835 | CCT Pro | CAT His | CCG Pro | TAC Tyr | CCA CTA CGC | CTG Leu | GCA Ala | TGT Cys 845 | GAG Glu | GCT Ala | GAG Glu | 2544 | ||
Pro 840 | Leu | Arg | ||||||||||||||
CCC | ACG | GGC | CAG | GAG | AGC | CTG | AGG | AGC | AGC | AGC | TGT | AGC | ATC | AAT | CAC | 2592 |
Pro | Thr 850 | Gly | Gin | Glu | Ser | Leu 855 | Arg | Ser | Ser | Ser | Cys 860 | Ser | Ile | Asn | His | |
CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | GGT | GCC | AAG | GCC | ACC | TTC | ATG | ATC | ACA | TTT | GAT | 2640 |
Pro 865 | Ile | Phe | Arg | Glu | Gly 870 | Ala | Lys | Ala | Thr | Phe 875 | Met | Ile | Thr | Phe | Asp 880 | |
GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | TTC | CTG | GGA | GAC | AGG | TTG | CTT | CTG | AGG | GCC | AGC | 2688 |
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala 885 | Phe | Leu | Gly | Asp | Arg 890 | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala 895 | Ser | |
GCA | AGC | AGT | GAG | AAT | AAT | AAG | CCT | GAA | ACC | AGC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | 2736 |
Ala | Ser | Ser | Glu 900 | Asn | Asn | Lys | Pro | Glu 905 | Thr | Ser | Lys | Thr | Ala 910 | Phe | Gin | |
CTG | GAG | CTT | CCG | GTG | AAG | TAC | ACG | GTC | TAT | ACC | GTG | ATC | AGT | AGG | CAG | 2784 |
Leu | Glu | Leu 915 | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr 920 | Val | Tyr | Thr | Val | Ile 925 | Ser | Arg | Gin | |
GAA | GAT | TCT | ACC | AAG | CAT | TTC | AAC | TTC | TCA | TCT | TCC | CAC | GGG | GAG | AGA | 2832 |
Glu | Asp 930 | Ser | Thr | Lys | His | Phe 935 | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser 940 | His | Gly | Glu | Arg |
CAG Gin 945 | AAA Lys | GAG Glu | GCC Ala | GAA CAT | CGA Arg | TAT Tyr | CGT Arg | GTG AAT AAC Val Asn Asn 955 | CTG Leu | AGT Ser | CCA Pro | TTG Leu 960 | 2880 | |
Glu | His 950 | |||||||||||||
ACG | CTG | GCC | ATC | AGC | GTT | AAC | TTC | TGG | GTC CCC ATC | CTT | CTG | AAT | GGT | 2928 |
Thr | Leu | Ala | Ile | Ser 965 | Val | Asn | Phe | Trp | Val Pro Ile 970 | Leu | Leu | Asn 975 | Gly | |
GTG | GCC | GTG | TGG | GAT | GTG | ACT | CTG | AGG | AGC CCA GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | 2976 |
Val | Ala | Val | Trp 980 | Asp | Val | Thr | Leu | Arg 985 | Ser Pro Ala | Gin | Gly 990 | Val | Ser | |
TGT | GTG | TCA | CAG | AGG | GAA | CCT | CCT | CAA | CAT TCC GAC | CTT | CTG | ACC | CAG | 3024 |
Cys | Val | Ser 995 | Gin | Arg | Glu | Pro | Pro Gin 1000 | His Ser Asp | Leu Leu 1005 | Thr | Gin | |||
ATC | CAA | GGA | CGC | TCT | GTG | CTG | GAC | TGC | GCC ATC GCC | GAC | TGC | CTG | CAC | 3072 |
Ile | Gin Gly 1010 | Arg | Ser | Val | Leu Asp 1015 | Cys | Ala Ile Ala 102C | Asp ) | Cys | Leu | His | |||
CTC | CGC | TGT | GAC | ATC | CCC | TCC | TTG | GGC | ACC CTG GAT | GAG | CTT | GAC | TTC | 3120 |
Leu Arg 1025 | Cys | Asp | Ile | Pro Ser 1030 | Leu | Gly | Thr Leu Asp 1035 | Glu | Leu | Asp | Phe 1040 | |||
ATT | CTG | AAG | GGC | AAC | CTC | AGC | TTC | GGC | TGG ATC AGT | CAG | ACA | TTG | CAG | 3168 |
Ile | Leu | Lys | Gly | Asn 1045 | Leu 1 | Ser | Phe | Gly | Trp Ile Ser 1050 | Gin | Thr | Leu 1055 | Gin | |
AAA | AAG | GTG | TTG | CTC | CTG | AGT | GAG | GCT | GAA ATC ACA | TTC | AAC | ACA | TCT | 3216 |
Lys | Lys | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Glu | Ala | Glu Ile Thr | Phe | Asn | Thr | Ser |
1060 1065 1070
188
GTG Val | TAT Tyr | TCC CAG Ser Gin 1075 | CTG Leu | CCG Pro | GGA Gly | CAG GAG Gin Glu 1080 | GCA Ala | TTT Phe | CTG AGA GCC Leu Arg Ala 1085 | CAG Gin | GTG Val |
TCA | ACG | ATG CTA | GAA | GAA | TAC | GTG GTC | TAT | GAG | CCC GTC TTC | CTC | ATG |
Ser | Thr 109C | Met Leu ) | Glu | Glu | Tyr Val Val 1095 | Tyr | Glu | Pro Val Phe 1100 | Leu | Met | |
GTG | TTC | AGC TCA | GTG | GGA | GGT | CTG CTG | TTA | CTG | GCT CTC ATC | ACT | GTG |
Val 1105 | Phe 1 | Ser Ser | Val | Gly 111C | Gly 1 | Leu Leu | Leu | Leu 1115 | Ala Leu Ile | Thr | Val 1120 |
GCG | CTG | TAC AAG | CTT | GGC | TTC | TTC AAA | CGT | CAG | TAT AAA GAG | ATG | CTG |
Ala | Leu | Tyr Lys | Leu 1125 | Gly | Phe | Phe Lys | Arg 113C | Gin 1 | Tyr Lys Glu | Met Leu 1135 | |
GAT | CTA | CCA TCT | GCA | GAT | CCT | GAC CCA | GCC | GGC | CAG GCA GAT | TCC | AAC |
Asp | Leu | Pro Ser 114C | Ala 1 | Asp | Pro | Asp Pro 1145 | Ala 1 | Gly | Gin Ala Asp 115C | Ser 1 | Asn |
3264
3312
3360
3408
3456
CAT | GAG | ACT | CCT | CCA | CAT | CTC | ACG | TCC TAGGAATCTA CTTTCCTGTA | 3503 |
His | Glu | Thr | Pro | Pro | His | Leu | Thr | Ser |
1155 | 1160 | |||||
TATCTCCACA | ATTACGAGAT | TGGTTTTGCT | TTTGCCTATG | AATCTACTGG | CATGGGAACA | 3563 |
AGTTCTCTTC | AGCTCTGGGC | TAGCCTGGGA | AACTTCCCAG | AAATGATGCC | CTACCTCCTG | 3623 |
AGCTGGGAGA | TTTTTATGGT | TTGCCCATGT | GTCAGATTTC | AGTGCTGATC | CACTTTTTTT | 3683 |
GCAAGAGCAG | GAATGGGGTC | AGCATAAATT | TACATATGGA | TAAGAACTAA | CACAAGACTG | 3743 |
AGTAATATGC | TCAATATTCA | ATGTATTGCT | TGTATAAATT | TTTAAAAAAT | AAAATGAAAN | 3803 |
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:53:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: | : protein | ||||||||
(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. | Č. : | 53: | |||||||
Met 1 | Val Arg Gly Val Val 5 | Ile Leu Leu | Cys 10 | Gly | Trp | Ala | Leu | Ala 15 | Ser |
Cys | His Gly Ser Asn Leu 20 | Asp Val Glu 25 | Lys | Pro | Val | Val | Phe 30 | Lys | Glu |
Asp | Ala Ala Ser Phe Gly 35 | Gin Thr Val 40 | Val | Gin | Phe | Gly 45 | Gly | Ser | Arg |
Leu | Val Val Gly Ala Pro 50 | Leu Glu Ala 55 | Val | Ala | Val 60 | Asn | Gin | Thr | Gly |
Gin 65 | Ser Ser Asp Cys Pro 70 | Pro Ala Thr | Gly | Val 75 | Cys | Gin | Pro | Tle | Leu 80 |
189 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · • · · 4 · ···· • · ·· · 4 · ···· · • · ···· · · · ····< 4 4 · · ·· 4 ·
Leu | His | Ile | Pro | Leu Glu Ala Val Asn Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser 95 | Leu | |||||
85 | 90 | ||||||||||||||
Val | Ala | Asp | Thr | Asn | Asn | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gin | Arg | Ala | Cys | Ala | Lys | Asn | Met | Tyr | Ala | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Gly | Ser | Ser | Leu | Gin | Phe | Ile | Gin | Ala | Ile | Pro | Ala | Thr | Met | Pro |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Glu | Cys | Pro | Gly | Gin | Glu | Met | Asp | Ile | Ala | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Gly | Ser | Ile | Asp | Gin | Ser | Asp | Phe | Thr | Gin | Met | Lys | Asp | Phe | Val | Lys |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ala | Leu | Met | Gly | Gin | Leu | Ala | Ser | Thr | Ser | Thr | Ser | Phe | Ser | Leu | Met |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Gin | Tyr | Ser | Asn | Ile | Leu | Lys | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ser | Ser | Leu | Ser | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Ala | Ile | Val | Gin | Leu | Gin |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr | Ala | Ser | Gly | Ile | Gin | Lys | Val | Val | Lys | Glu | Leu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Phe | His | Ser | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Ile | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Phe | Arg | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Arg | His |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Val | Ile | Pro | Glu | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Arg | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ile | Gly | Ser | Ala | Pro | Ser | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Val | Ala | Leu | Arg | Ser | Ile | Gin | Arg | Gin | Ile | Gin | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ile | Glu | Gly | Thr | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Ser | Met | Asp | Gly | Pro | Val | Leu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | Ala | Val | Gly | Gly | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ser | Asn | Met | Arg | Ser | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Glu | Asp |
385 390 395 400
190 •9 9 999
9 9 9 9 9 9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 • · « ·· 9 9 9 9 99
Met Arg | Asp Ala | Tyr 405 | Leu | Gly Tyr | Ser Thr 410 | Ala | Leu | Ala | Phe | Trp 415 | Lys | ||||
Gly | Val | His | Ser | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | His | Gin | His | Thr | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Lys | Val | Val | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu | Ser | Arg | His | Trp | Arg | Pro | Lys | Ser |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ser | Val | Asp | Met | Asp | Arg | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Val | Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | His | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Met | Pro | Gly | Val | Arg | Ser | Arg | Trp | His | Cys | Gly | Thr | Thr | Leu | His |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gly | Glu | Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Ser | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Ile | Phe | His | Gly | Ala |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Arg | Gin | Asp | Ile | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Leu | Phe | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | Gly | Ile |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ser | Ile | Arg | Phe | Ala | Pro | Ser | Glu | Val | Ala | Lys | Thr | Val | Tyr | Gin | Cys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Trp | Gly | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Thr | Val | Arg | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Asp | Val | Gin | Ser |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | Ile | Ser | Arg |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Ala | Ile | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lys | Thr |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Gly | Asp | His | Cys | Glu | Thr | Met | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp |
705 710 715 720
191 • · • ·
• · • • • • · · · | • • • « • • | • · · · · · · • « · · · · · | ||
> · u • a • · | • · · a · · · ' a · · · · • · · · · · | |||
Cys Val Glu Asp | Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu | Asn | Leu | Ser |
725 730 | 735 | |||
Leu Ala Gly Asp | Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 745 | 750 | ||
Val Gly Ser Gin | Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe | Glu | Lys | Asn |
755 | 760 765 | |||
Cys Lys Gin Glu | Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val | Ser | Phe | Asn |
770 | 775 780 | |||
Phe Ser Gly Leu | Gin Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro | Glu | Leu | Thr |
785 | 790 795 | 800 | ||
Val Thr Val Thr | Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr | Gly | Thr | Leu |
805 810 | 815 | |||
Ile Lys Phe Tyr | Tyr Pro Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg | Val | Thr | Arg |
820 | 825 | 830 | ||
Ala Gin Gin Pro | His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys | Glu | Ala | Glu |
835 | 840 845 | |||
Pro Thr Gly Gin | Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser | Ile | Asn | His |
850 | 855 860 | |||
Pro Ile Phe Arg | Glu Gly Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile | Thr | Phe | Asp |
865 | 870 875 | 880 | ||
Val Ser Tyr Lys | Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu | Arg | Ala | Ser |
885 890 | 895 | |||
Ala Ser Ser Glu | Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr | Ala | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 | ||
Leu Glu Leu Pro | Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile | Ser | Arg | Gin |
915 | 920 925 | |||
Glu Asp Ser Thr | Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His | Gly | Glu | Arg |
930 | 935 940 | |||
Gin Lys Glu Ala | Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu | Ser | Pro | Leu |
945 | 950 955 | 960 | ||
Thr Leu Ala Ile | Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu | Leu | Asn | Gly |
965 970 | 975 | |||
Val Ala Val Trp | Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gin | Gly | Val | Ser |
980 | 985 | 990 | ||
Cys Val Ser Gin | Arg Glu Pro Pro Gin His Ser Asp Leu | Leu | Thr | Gin |
995 | 1000 1005 | |||
Ile Gin Gly Arg | Ser Val Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp | Cys | Leu | His |
1010 | 1015 1020 | |||
Leu Arg Cys Asp | Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu | Leu | Asp | Phe |
1025 | 1030 1035 | 1040 |
192 «· • · ·· · · · · · • · · · · · · ···· · • · · · · · · · · ····· ·· ·· · · ··
Ile | Leu | Lys | Gly Asn 1045 | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp 1050 | Ile | Ser | Gin | Thr | Leu 1055 | Gin | |
Lys | Lys | Val | Leu 1060 | Leu 1 | Leu | Ser | Glu | Ala 1065 | Glu » | Ile | Thr | Phe | Asn 1070 | Thr 1 | Ser |
Val | Tyr | Ser 1075 | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin 1080 | Glu | Ala | Phe | Leu | Arg 1085 | Ala | Gin | Val |
Ser | Thr 109C | Met 1 | Leu | Glu | Glu | Tyr 1095 | Val | Val | Tyr | Glu | Pro Val 1100 | Phe | Leu | Met | |
Val 1105 | Phe | Ser | Ser | Val | Gly 111C | Gly 1 | Leu | Leu | Leu | Leu 1115 | Ala | Leu | Ile | Thr | Val 1120 |
Ala | Leu | Tyr | Lys | Leu 1125 | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg 1130 | Gin 1 | Tyr | Lys | Glu | Met 1135 | Leu |
Asp | Leu | Pro | Ser 1140 | Ala 1 | Asp | Pro | Asp | Pro 1145 | Ala » | Gly | Gin | Ala | Asp 1150 | Ser | Asn |
His | Glu | Thr 1155 | Pro | Pro | His | Leu | Thr 116C | Ser 1 | |||||||
(2) | INFORMACE 0 | SEK. | ID. | Č. : | 54 : |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3597 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 40..3525 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:54:
AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCAGTG ATG GCC GGT GGA GTT 54
Met Ala Gly Gly Val
5
GTG Val | ATC Ile | CTC Leu | CTG Leu | TGT Cys 10 | GGC Gly | TGG Trp | GTC Val | CTG Leu | GCT Ala 15 | TCC Ser | TGT Cys | CAT His | GGG Gly | TCT Ser 20 | AAC Asn | 102 |
CTG | GAT | GTG | GAG | GAA | CCC | ATC | GTG | TTC | AGA | GAG | GAT | GCA | GCC | AGC | TTT | 150 |
Leu | Asp | Val | Glu 25 | Glu | Pro | Ile | Val | Phe 30 | Arg | Glu | Asp | Ala | Ala 35 | Ser | Phe | |
GGA | CAG | ACT | GTG | GTG | CAG | TTT | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | GTG | GGA | GCC | 198 |
Gly | Gin | Thr 40 | Val | Val | Gin | Phe | Gly 45 | Gly | Ser | Arg | Leu | Val 50 | Val | Gly | Ala | |
CCT | CTG | GAG | GCG | GTG | GCA | GTC | AAC | CAA | ACA | GGA | CGG | TTG | TAT | GAC | TGT | 246 |
Pro | Leu 55 | Glu | Ala | Val | Ala | Val 60 | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg 65 | Leu | Tyr | Asp | Cys |
193 • · · · · · ·· ·· ·· ··
GCA Ala 70 | CCT Pro | GCC ACT | GGC Gly | ATG Met 75 | TGC Cys | CAG Gin | CCC Pro | ATC Ile | GTA Val 80 | CTG Leu | CGC Arg | AGT Ser | CCC Pro | CTA Leu 85 | 294 | |
Ala | Thr | |||||||||||||||
GAG | GCA | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | GTG | ACT | GCC | ACC | AAT | 342 |
Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Val | Thr | Ala | Thr | Asn | |
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
AAC | GCC | CAG | TTG | CTG | GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | CAG | AGA | GCT | TGT | GTG | 390 |
Asn | Ala | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | Ala | Cys | Val | |
105 | 110 | 115 | ||||||||||||||
AAG | AAC | ATG | TAT | GCG | AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT | CTC | GGC | TCC | AGC | TTG | 438 |
Lys | Asn | Met | Tyr | Ala | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | Ser | Ser | Leu | |
120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
CAG | TTC | ATC | CAG | GCA | GTC | CCT | GCC | TCC | ATG | CCA | GAG | TGT | CCA | AGA | CAA | 486 |
Gin | Phe | Ile | Gin | Ala | Val | Pro | Ala | Ser | Met | Pro | Glu | Cys | Pro | Arg | Gin | |
135 | 140 | 145 | ||||||||||||||
GAG | ATG | GAC | ATT | GCT | TTC | CTG | ATT | GAT | GGT | TCT | GGC | AGC | ATT | AAC | CAA | 534 |
Glu | Met | Asp | Ile | Ala | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | Ile | Asn | Gin | |
150 | 155 | 160 | 165 | |||||||||||||
AGG | GAC | TTT | GCC | CAG | ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AAA | GCT | TTG | ATG | GGA | GAG | 582 |
Arg | Asp | Phe | Ala | Gin | Met | Lys | Asp | Phe | Val | Lys | Ala | Leu | Met | Gly | Glu | |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
TTT | GCG | AGC | ACC | AGC | ACC | TTG | TTC | TCC | CTG | ATG | CAA | TAC | TCG | AAC | ATC | 630 |
Phe | Ala | Ser | Thr | Ser | Thr | Leu | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | Asn | Ile | |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||||
CTG | AAG | ACC | CAT | TTT | ACC | TTC | ACT | GAA | TTC | AAG | AAC | ATC | CTG | GAC | CCT | 678 |
Leu | Lys | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys | Asn | Ile | Leu | Asp | Pro | |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||||
CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | CCC | ATT | GTC | CAG | CTG | CAA | GGC | CTG | ACC | TAC | ACA | 726 |
Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Pro | Ile | Val | Gin | Leu | Gin | Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr | |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||||
GCC | ACA | GGC | ATC | CGG | ACA | GTG | ATG | GAA | GAG | CTA | TTT | CAT | AGC | AAG | AAT | 774 |
Ala | Thr | Gly | Ile | Arg | Thr | Val | Met | Glu | Glu | Leu | Phe | His | Ser | Lys | Asn | |
230 | 235 | 240 | 245 | |||||||||||||
GGG | TCC | CGT | AAA | AGT | GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | CTT | GTC | ATC | ACA | GAT | GGG | 822 |
Gly | Ser | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Leu | Val | Ile | Thr | Asp | Gly | |
250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
CAG | AAA | TAC | AGA | GAC | CCC | CTG | GAG | TAT | AGT | GAT | GTC | ATT | CCC | GCC | GCA | 870 |
Gin | Lys | Tyr | Arg | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | Ile | Pro | Ala | Ala | |
265 | 270 | 275 | ||||||||||||||
GAC | AAA | GCT | GGC | ATC | ATT | CGT | TAT | GCT | ATT | GGG | GTG | GGA | GAT | GCC | TTC | 918 |
Asp | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val | Gly | Asp | Ala | Phe | |
280 | 285 | 290 | ||||||||||||||
CAG | GAG | CCC | ACT | GCC | CTG | AAG | GAG | CTG | AAC | ACC | ATT | GGC | TCA | GCT | CCC | 966 |
Gin | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Lys | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Gly | Ser | Ala | Pro |
295 300 305
194 • ·
• • | • • • • | 0 0 0 0 0 0 | 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 | • 0 0 0 • 0 0 0 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0« | |||||||||||
CCA | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC | AAG | GTA | GGC | AAC | TTT | GCA | GCA | CTT | CGC | AGC | 1014 |
Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe | Ala | Ala | Leu | Arg | Ser | |
310 | 315 | 320 | 325 | |||||||||||||
ATC | CAG | AGG | CAA | CTT | CAG | GAG | AAA | ATC | TTC | GCC | ATT | GAG | GGA | ACT | CAA | 1062 |
Ile | Gin | Arg | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | Ile | Phe | Ala | Ile | Glu | Gly | Thr | Gin | |
330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG | TCA | CAA | GAA | GGT | TTC | 1110 |
Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | |
345 | 350 | 355 | ||||||||||||||
AGT | TCA | GCT | CTC | ACA | TCG | GAT | GGA | CCC | GTT | CTG | GGG | GCC | GTG | GGA | AGC | 1158 |
Ser | Ser | Ala | Leu | Thr | Ser | Asp | Gly | Pro | Val | Leu | Gly | Ala | Val | Gly | Ser | |
360 | 365 | 370 | ||||||||||||||
TTC | AGC | TGG | TCC | GGA | GGT | GCC | TTC | TTA | TAT | CCC | CCA | AAT | ACG | AGA | CCC | 1206 |
Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | Thr | Arg | Pro | |
375 | 380 | 385 | ||||||||||||||
ACC | TTT | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAT | GTG | GAC | ATG | AGA | GAC | TCC | TAC | 1254 |
Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met | Arg | Asp | Ser | Tyr | |
390 | 395 | 400 | 405 | |||||||||||||
CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GCA | GTG | GCC | TTT | TGG | AAG | GGG | GTT | CAC | AGC | CTG | 1302 |
Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Ala | Val | Ala | Phe | Trp | Lys | Gly | Val | His | Ser | Leu | |
410 | 415 | 420 | ||||||||||||||
ATC | CTG | GGG | GCC | CCG | CGT | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG | AAG | GTT | GTC | ATC | TTT | 1350 |
Ile | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | His | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Val | Val | Ile | Phe | |
425 | 430 | 435 |
ACC Thr | CAG Gin | GAA GCC AGG | CAT His | TGG AGG Trp Arg 445 | CCC Pro | AAG Lys | TCT Ser | GAA GTC AGA GGG ACA | 1398 | |||||||
Glu Ala 440 | Arg | Glu | Val 450 | Arg | Gly | Thr | ||||||||||
CAG | ATC | GGC | TCC | TAC | TTC | GGG | GCC | TCT | CTC | TGT | TCT | GTG | GAC | GTG | GAT | 1446 |
Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | Asp | Val | Asp | |
455 | 460 | 465 | ||||||||||||||
AGA | GAT | GGC | AGC | ACY | GAC | CTG | GTC | CTG | ATC | GGA | GCC | CCC | CAT | TAC | TAT | 1494 |
Arg | Asp | Gly | Ser | Xaa | Asp | Leu | Val | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro | His | Tyr | Tyr | |
470 | 475 | 480 | 485 | |||||||||||||
GAG | CAG | ACC | CGA | GGG | GGG | CAG | GTC | TCA | GTG | TTC | CCC | GTG | CCC | GGT | GTG | 1542 |
Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Phe | Pro | Val | Pro | Gly | Val | |
490 | 495 | 500 | ||||||||||||||
AGG | GGC | AGG | TGG | CAG | TGT | GAG | GCC | ACC | CTC | CAC | GGG | GAG | CAG | GGC | CAT | 1590 |
Arg | Gly | Arg | Trp | Gin | Cys | Glu | Ala | Thr | Leu | His | Gly | Glu | Gin | Gly | His | |
505 | 510 | 515 | ||||||||||||||
CCT | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GTG | GCT | CTG | ACA | GTG | CTG | GGG | GAC | GTA | AAC | 1638 |
Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Val | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | Asp | Val | Asn | |
520 | 525 | 530 | ||||||||||||||
GGG | GAC | AAT | CTG | GCA | GAC | GTG | GCT | ATT | GGT | GCC | CCT | GGA | GAG | GAG | GAG | 1686 |
Gly | Asp | Asn | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | |
535 | 540 | 545 |
195
AGC Ser 550 | AGA GGT | GCT Ala | GTC Val | TAC ATA TTT | CAT His | GGA Gly | GCC Ala 560 | TCG Ser | AGA Arg | CTG Leu | GAG Glu | ATC Ile 565 | 1734 | |||
Arg | Gly | Tyr 555 | Ile | Phe | ||||||||||||
ATG | CCC | TCA | CCC | AGC | CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC | CAG | CTC | TCC | CTG | AGA | 1782 |
Met | Pro | Ser | Pro | Ser 570 | Gin | Arg | Val | Thr | Gly 575 | Ser | Gin | Leu | Ser | Leu 580 | Arg | |
CTG | CAG | TAT | TTT | GGG | CAG | TCA | TTG | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC | CTT | ACA | CAG | 1830 |
Leu | Gin | Tyr | Phe 585 | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser 590 | Gly | Gly | Gin | Asp | Leu 595 | Thr | Gin | |
GAT | GGC | CTG | GTG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGA | GCC | CAG | GGG | CAC | GTA | CTG | CTG | 1878 |
Asp | Gly | Leu 600 | Val | Asp | Leu | Ala | Val 605 | Gly | Ala | Gin | Gly | His 610 | Val | Leu | Leu | |
CTC | AGG | AGT | CTG | CCT | CTG | CTG | AAA | GTG | GAG | CTC | TCC | ATA | AGA | TTC | GCC | 1926 |
Leu | Arg 615 | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu 620 | Lys | Val | Glu | Leu | Ser 625 | Ile | Arg | Phe | Ala | |
CCC | ATG | GAG | GTG | GCA | AAG | GCT | GTG | TAC | CAG | TGC | TGG | GAA | AGG | ACT | CCC | 1974 |
Pro 630 | Met | Glu | Val | Ala | Lys 635 | Ala | Val | Tyr | Gin | Cys 640 | Trp | Glu | Arg | Thr | Pro 645 | |
ACT | GTC | CTC | GAA | GCT | GGA | GAG | GCC | ACT | GTC | TGT | CTC | ACT | GTC | CAC | AAA | 2022 |
Thr | Val | Leu | Glu | Ala 650 | Gly | Glu | Ala | Thr | Val 655 | Cys | Leu | Thr | Val | His 660 | Lys | |
GGC | TCA | CCT | GAC | CTG | TTA | GGT | AAT | GTC | CAA | GGC | TCT | GTC | AGG | TAT | GAT | 2070 |
Gly | Ser | Pro | Asp 665 | Leu | Leu | Gly | Asn | Val 670 | Gin | Gly | Ser | Val | Arg 675 | Tyr | Asp |
CTG Leu | GCG Ala | TTA Leu 680 | GAT Asp | CCG Pro | GGC Gly | CGC Arg | CTG Leu 685 | ATT Ile | TCT Ser | CGT Arg | GCC Ala | ATT Ile 690 | TTT Phe | GAT Asp | GAG Glu | 2118 |
ACT | AAG | AAC | TGC | ACT | TTG | ACG | GGA | AGG | AAG | ACT | CTG | GGG | CTT | GGT | GAT | 2166 |
Thr | Lys 695 | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr 700 | Gly | Arg | Lys | Thr | Leu 705 | Gly | Leu | Gly | Asp | |
CAC | TGC | GAA | ACA | GTG | AAG | CTG | CTT | TTG | CCG | GAC | TGT | GTG | GAA | GAT | GCA | 2214 |
His 710 | Cys | Glu | Thr | Val | Lys 715 | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp 720 | Cys | Val | Glu | Asp | Ala 725 | |
GTG | AGC | CCT | ATC | ATC | CTG | CGC | CTC | AAC | TTT | TCC | CTG | GTG | AGA | GAC | TCT | 2262 |
Val | Ser | Pro | Ile | Ile 730 | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe 735 | Ser | Leu | Val | Arg | Asp 740 | Ser | |
GCT | TCA | CCC | AGG | AAC | CTG | CAT | CCT | GTG | CTG | GCT | GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | 2310 |
Ala | Ser | Pro | Arg 745 | Asn | Leu | His | Pro | Val 750 | Leu | Ala | Val | Gly | Ser 755 | Gin | Asp | |
CAC | ATA | ACT | GCT | TCT | CTG | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | TGT | AAG | CAA | GAA | CTC | 2358 |
His | Ile | Thr 760 | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe 765 | Glu | Lys | Asn | Cys | Lys 770 | Gin | Glu | Leu | |
CTG | TGT | GAG | GGG | GAC | CTG | GGC | ATC | AGC | TTT | AAC | TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | 2406 |
Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | Tle | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin |
775 780 785
196 • ·
GTC Val 790 | TTG Leu | GTG Val | GTG Val | GGA Gly | GGC Gly 795 | TCC Ser | CCA GAG | CTC Leu | ACT Thr 800 | GTG Val | ACA Thr | GTC Val | ACT Thr | GTG Val 805 | 2454 | |
Pro | Glu | |||||||||||||||
TGG | AAT | GAG | GGT | GAG | GAC | AGC | TAT | GGA | ACT | TTA | GTC | AAG | TTC | TAC | TAC | 2502 |
Trp | Asn | Glu | Gly | Glu 810 | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr 815 | Leu | Val | Lys | Phe | Tyr 820 | Tyr | |
CCA | GCA | GGG | CTA | TCT | TAC | CGA | CGG | GTA | ACA | GGG | ACT | CAG | CAA | CCT | CAT | 2550 |
Pro | Ala | Gly | Leu 825 | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val 830 | Thr | Gly | Thr | Gin | Gin 835 | Pro | His | |
CAG | TAC | CCA | CTA | CGC | TTG | GCC | TGT | GAG | GCT | GAG | CCC | GCT | GCC | CAG | GAG | 2598 |
Gin | Tyr | Pro 840 | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys 845 | Glu | Ala | Glu | Pro | Ala 850 | Ala | Gin | Glu | |
GAC | CTG | AGG | AGC | AGC | AGC | TGT | AGC | ATT | AAT | CAC | CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | 2646 |
Asp | Leu 855 | Arg | Ser | Ser | Ser | Cys 860 | Ser | Ile | Asn | His | Pro 865 | Ile | Phe | Arg | Glu | |
GGT | GCA | AAG | ACC | ACC | TTC | ATG | ATC | ACA | TTC | GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | 2694 |
Gly 870 | Ala | Lys | Thr | Thr | Phe 875 | Met | Ile | Thr | Phe | Asp 880 | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala 885 | |
TTC | CTA | GGA | GAC | AGG | TTG | CTT | CTG | AGG | GCC | AAA | GCC | AGC | AGT | GAG | AAT | 2742 |
Phe | Leu | Gly | Asp | Arg 890 | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala 895 | Lys | Ala | Ser | Ser | Glu 900 | Asn | |
AAT | AAG | CCT | GAT | ACC | AAC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | CTG | GAG | CTC | CCA | GTG | 2790 |
Asn | Lys | Pro | Asp 905 | Thr | Asn | Lys | Thr | Ala 910 | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu 915 | Pro | Val |
AAG Lys | TAC ACC | GTC Val | TAT Tyr | ACC Thr | CTG ATC | AGT Ser | AGG Arg | CAA GAA GAT | TCC ACC AAC | 2838 | ||||||
Tyr | Thr 920 | Leu | Ile 925 | Gin | Glu | Asp 930 | Ser | Thr | Asn | |||||||
CAT | GTC | AAC | TTT | TCA | TCT | TCC | CAC | GGG | GGG | AGA | AGG | CAA | GAA | GCC | GCA | 2886 |
His | Val 935 | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser 940 | His | Gly | Gly | Arg | Arg 945 | Gin | Glu | Ala | Ala | |
CAT | CGC | TAT | CGT | GTG | TKÁT | AAC | CTG | AGT | CCA | CTG | AAG | CTG | GCC | GTC | AGA | 2934 |
His 950 | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn 955 | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu 960 | Lys | Leu | Ala | Val | Arg 965 | |
GTT | AAC | TTC | TGG | GTC | CCT | GTC | CTT | CTG | AAC | GGT | GTG | GCT | GTG | TGG | GAC | 2982 |
Val | Asn | Phe | Trp | Val 970 | Pro | Val | Leu | Leu | Asn 975 | Gly | Val | Ala | Val | Trp 980 | Asp | |
GTG | ACT | CTG | AGC | AGC | CCA | GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | TGC | GTG | TCC | CAG | ATG | 3030 |
Val | Thr | Leu | Ser 985 | Ser | Pro | Ala | Gin | Gly 990 | Val | Ser | Cys | Val | Ser 995 | Gin | Met | |
AAA | CCT | CCT | CAG | AAT | CCC | GAC | TTT | CTG | ACC | CAG | ATT | CAG | AGA | CGT | TCT | 3078 |
Lys | Pro | Pro 100C | Gin 1 | Asn | Pro | Asp | Phe 1005 | Leu | Thr | Gin | Ile | Gin Arg 1010 | Arg | Ser | ||
GTG | CTG | GAC | TGC | TCC | ATT | GCT | GAC | TGC | CTG | CAC | TTC | CGC | TGT | GAC | ATC | 3126 |
Val | Leu 1015 | Asp | Cys | Ser | Ile | Ala 102C | Asp 1 | Cys | Leu | His | Phe 1025 | Arg 1 | Cys | Asp | Ile |
197 • · • · · · · ···· · · · ··
CCC TCC Pro Ser 1030 | TTG GAC Leu Asp | ATC Ile | CAG GAT Gin Asp 1035 | GAA Glu | CTT Leu | GAC Asp | TTC ATT Phe Ile 1040 | CTG AGG | GGC Gly | AAC Asn 1045 | |
Leu | Arg | ||||||||||
CTC AGC | TTC GGC | TGG | GTC AGT | CAG | ACA | TTG | CAG GAA | AAG | GTG | TTG | CTT |
Leu Ser | Phe Gly | Trp 105C | Val Ser ) | Gin | Thr | Leu 1055 | Gin Glu | Lys | Val | Leu Leu 1060 | |
GTG AGT | GAG GCT | GAA | ATC ACT | TTC | GAC | ACA | TCT GTG | TAC | TCC | CAG | CTG |
Val Ser | Glu Ala 1065 | Glu | Ile Thr | Phe | Asp 107C | Thr ) | Ser Val | Tyr | Ser 1075 | Gin | Leu |
CCA GGA | CAG GAG | GCA | TTT CTG | AGA | GCC | CAG | GTG GAG | ACA | ACG | TTA | GAA |
Pro Gly | Gin Glu 1080 | Ala | Phe Leu | Arg Ala 1085 | Gin | Val Glu | Thr Thr 1090 | Leu | Glu | ||
GAA TAC | GTG GTC | TAT | GAG CCC | ATC | TTC | CTC | GTG GCG | GGC | AGC | TCG | GTG |
Glu Tyr 1095 | Val Val | Tyr | Glu Pro Ile 1100 | Phe | Leu | Val Ala Gly 1105 | Ser | Ser | Val | ||
GGA GGT | CTG CTG | TTA | CTG GCT | CTC | ATC | ACA | GTG GTA | CTG | TAC | AAG | CTT |
Gly Gly 1110 | Leu Leu | Leu | Leu Ala 1115 | Leu | Ile | Thr | Val Val 1120 | Leu | Tyr | Lys | Leu 1125 |
GGC TTC | TYC AAA | CGT | CAG TAC | AAA | GAA | ATG | CTG GAC | GGC | AAG | GCT | GCA |
Gly Phe | Xaa Lys | Arg 1130 | Gin Tyr 1 | Lys | Glu | Met 1135 | Leu Asp 1 | Gly | Lys | Ala 114C | Ala 1 |
GAT CCT | GTC ACA | GCC | GGC CAG | GCA | GAT | TTC | GGC TGT | GAG | ACT | CCT | CCA |
Asp Pro | Val Thr 1145 | Ala | Gly Gin | Ala | Asp 1150 | Phe | Gly Cys | Glu | Thr 1155 | Pro | Pro |
• 4 ·· • · · • ·· • · · · · • · · ·· ··
3174
3222
3270
3318
3366
3414
3462
3510
TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATGAAGATTG 3562
Tyr Leu Val Ser
1160
GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT 3597 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:55:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) | POPIS SEKVENCE: | SEK. | ID. | Č. : | 55: | |
Met 1 | Ala Gly | Gly Val Val Ile 5 | Leu | Leu | Cys 10 | Gly Trp Val Leu Ala Ser 15 |
Cys | His Gly | Ser Asn Leu Asp 20 | Val | Glu 25 | Glu | Pro Ile Val Phe Arg Glu 30 |
Asp | Ala Ala 35 | Ser Phe Gly Gin | Thr 40 | Val | Val | Gin Phe Gly Gly Ser Arg 45 |
198 • · · · • ·
Leu | Val 50 | Val | Gly | Ala | Pro | Leu 55 | Glu |
Arg 65 | Leu | Tyr | Asp | Cys | Ala 70 | Pro | Ala |
Leu | Arg | Ser | Pro | Leu 85 | Glu | Ala | Val |
Val | Thr | Ala | Thr 100 | Asn | Asn | Ala | Gin |
Gin | Arg | Ala 115 | Cys | Val | Lys | Asn | Met 120 |
Leu | Gly 130 | Ser | Ser | Leu | Gin | Phe 135 | Ile |
Glu 145 | Cys | Pro | Arg | Gin | Glu 150 | Met | Asp |
Gly | Ser | Ile | Asn | Gin 165 | Arg | Asp | Phe |
Ala | Leu | Met | Gly 180 | Glu | Phe | Ala | Ser |
Gin | Tyr | Ser 195 | Asn | Ile | Leu | Lys | Thr 200 |
Asn | Ile 210 | Leu | Asp | Pro | Gin | Ser 215 | Leu |
Gly 225 | Leu | Thr | Tyr | Thr | Ala 230 | Thr | Gly |
Phe | His | Ser | Lys | Asn 245 | Gly | Ser | Arg |
Val | Ile | Thr | Asp 260 | Gly | Gin | Lys | Tyr |
Val | Ile | Pro 275 | Ala | Ala | Asp | Lys | Ala 280 |
Val | Gly 290 | Asp | Ala | Phe | Gin | Glu 295 | Pro |
Ile 305 | Gly | Ser | Ala | Pro | Pro 310 | Gin | Asp |
Ala | Ala | Leu | Arg | Ser 325 | Ile | Gin | Arg |
Ile | Glu | Gly | Thr 340 | Gin | Ser | Arg | Ser |
Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala |
355 360
• • • • ·· · | • • · • • | • · • · • · • · | • • • · • · | |
Ala Val Ala | Val Asn 60 | Gin | Thr | Gly |
Thr Gly Met 75 | Cys Gin | Pro | Ile | Val 80 |
Asn Met Ser 90 | Leu Gly | Leu | Ser 95 | Leu |
Leu Leu Ala 105 | Cys Gly | Pro 110 | Thr | Ala |
Tyr Ala Lys | Gly Ser 125 | Cys | Leu | Leu |
Gin Ala Val | Pro Ala 140 | Ser | Met | Pro |
Ile Ala Phe 155 | Leu Ile | Asp | Gly | Ser 160 |
Ala Gin Met 170 | Lys Asp | Phe | Val 175 | Lys |
Thr Ser Thr 185 | Leu Phe | Ser 190 | Leu | Met |
His Phe Thr | Phe Thr 205 | Glu | Phe | Lys |
Val Asp Pro | Ile Val 220 | Gin | Leu | Gin |
Ile Arg Thr 235 | Val Met | Glu | Glu | Leu 240 |
Lys Ser Ala 250 | Lys Lys | Ile | Leu 255 | Leu |
Arg Asp Pro 265 | Leu Glu | Tyr 270 | Ser | Asp |
Gly Ile Ile | Arg Tyr 285 | Ala | Ile | Gly |
Thr Ala Leu | Lys Glu 300 | Leu | Asn | Thr |
His Val Phe 315 | Lys Val | Gly | Asn | Phe 320 |
Gin Leu Gin 330 | Glu Lys | Ile | Phe 335 | Ala |
Ser Ser Ser 345 | Phe Gin | His 350 | Glu | Met |
Leu Thr Ser | Asp Gly | Pro | Val | Leu |
365
199 • · · · • · · ·
Gly | Ala 370 | Val | Gly | Ser | Phe | Ser 375 | Trp | Ser | Gly | Gly |
Pro 385 | Asn | Thr | Arg | Pro | Thr 390 | Phe | Ile | Asn | Met | Ser 395 |
Met | Arg | Asp | Ser | Tyr 405 | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr 410 | Ala |
Gly | Val | His | Ser 420 | Leu | Ile | Leu | Gly | Ala 425 | Pro | Arg |
Lys | Val | Val 435 | Ile | Phe | Thr | Gin | Glu 440 | Ala | Arg | His |
Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe |
450 455
• • • • ·· · | • • • * | « • · • • · | • · • • · • · | |
Ala 380 | Phe | Leu | Tyr | Pro |
Gin | Glu | Asn | Val | Asp 400 |
Val | Ala | Phe | Trp 415 | Lys |
His | Gin | His 430 | Thr | Gly |
Trp | Arg 445 | Pro | Lys | Ser |
Gly 460 | Ala | Ser | Leu | Cys |
Ser 465 | Val Asp Val | Asp Arg 470 | Asp | Gly | Ser | Xaa | Asp 475 | Leu | Val | Leu | Ile | Gly 480 | |||
Ala | Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Phe |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Val | Pro | Gly | Val | Arg | Gly | Arg | Trp | Gin | Cys | Glu | Ala | Thr | Leu | His |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gly | Glu | Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Val | Ala | Leu | Thr | Val |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Asn | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Ser | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Ile | Phe | His | Gly | Ala |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Arg | Leu | Glu | Ile | Met | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Leu | Ser | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | Glu | Leu |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ser | Ile | Arg | Phe | Ala | Pro | Met | Glu | Val | Ala | Lys | Ala | Val | Tyr | Gin | Cys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Trp | Glu | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Thr | Val | His | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Asn | Val | Gin | Gly |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | Ile | Ser | Arg |
675 680 685
200 • ·· · ·· · · · · ···· • · ··* ···· • · ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · ·*·· · ·· ·· ·· *·
Ala | Ile 690 | Phe | Asp Glu | Thr | Lys 695 | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr 700 | Gly | Arg | Lys | Thr | |
Leu | Gly | Leu | Gly | Asp | His | Cys | Glu | Thr | Val | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Cys | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Ser | Pro | Ile | Ile | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe | Ser |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Val | Arg | Asp | Ser | Ala | Ser | Pro | Arg | Asn | Leu | His | Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Ile | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Cys | Lys | Gin | Glu | Leu | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | Ile | Ser | Phe | Asn |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | Val | Val | Gly | Gly | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Val | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Gly |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Thr | Gin | Gin | Pro | His | Gin | Tyr | Pro | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Pro | Ala | Ala | Gin | Glu | Asp | Leu | Arg | Ser | Ser | Ser | Cys | Ser | Ile | Asn | His |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Pro | Ile | Phe | Arg | Glu | Gly | Ala | Lys | Thr | Thr | Phe | Met | Ile | Thr | Phe | Asp |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe | Leu | Gly | Asp | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala | Lys |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Pro | Asp | Thr | Asn | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr | Val | Tyr | Thr | Leu | Ile | Ser | Arg | Gin |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Glu | Asp | Ser | Thr | Asn | His | Val | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser | His | Gly | Gly | Arg |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Arg | Gin | Glu | Ala | Ala | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Lys | Leu | Ala | Val | Arg | Val | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | Thr | Leu | Ser | Ser | Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Cys | Val | Ser | Gin | Met | Lys | Pro | Pro | Gin | Asn | Pro | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin |
995 1000 1005
201 • · · · • · · ·
Ile | Gin Arg 1010 | Arg | Ser | Val | Leu Asp 1015 | Cys | Ser | Ile | Ala Asp 1020 | Cys | Leu | His |
Phe | Arg Cys | Asp | Ile | Pro | Ser Leu | Asp | Ile | Gin | Asp Glu | Leu | Asp | Phe |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | |||||||||
Ile | Leu Arg | Gly | Asn | Leu | Ser Phe | Gly | Trp | Val | Ser Gin | Thr | Leu | Gin |
1045 | 1050 | 1055 | ||||||||||
Glu | Lys Val | Leu | Leu | Val | Ser Glu | Ala | Glu | Ile | Thr Phe | Asp | Thr | Ser |
1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||
Val | Tyr Ser | Gin | Leu | Pro | Gly Gin | Glu | Ala | Phe | Leu Arg | Ala | Gin | Val |
1075 | 1080 | 1085 | ||||||||||
Glu | Thr Thr | Leu | Glu | Glu | Tyr Val | Val | Tyr | Glu | Pro Ile | Phe | Leu | Val |
1090 | 1095 | 1100 | ||||||||||
Ala | Gly Ser | Ser | Val | Gly | Gly Leu | Leu | Leu | Leu | Ala Leu | Ile | Thr | Val |
1105 | 1110 | 1115 | 1120 | |||||||||
Val | Leu Tyr | Lys | Leu | Gly | Xaa Xaa | Lys | Arg | Gin | Tyr Lys | Glu | Met | Leu |
1125 | 1130 | 1135 | ||||||||||
Asp | Gly Lys | Ala | Ala | Asp | Pro Val | Thr | Xaa | Gly | Gin Ala | Asp | Phe | Gly |
1140 | 1145 | 1150 | ||||||||||
Cys | Glu Thr | Pro | Pro | Tyr | Leu Val | Ser | ||||||
1155 | 1160 | |||||||||||
(2) | INFORMACE O | SEK. | ID. | Č. :56: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:56:
CCTGTCATGG GTCTAACCTG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:57:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:57:
AGGTTAGACC CATGACAGG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:58:
202 «· · · · 4 · · · · · · 4 4 4 4 4· • · ·· 4 44 4 · 4 · 4 • · 4444 444 ·· 44·· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:58:
GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:59:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:59:
CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:60:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:60:
CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:61:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:61:
CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:62:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
203 ·· ·««·
4 ··9 · «4 • · 4 · 4 4 4 • « 4 4 « 44
4 44 4 44 4 4
4 4 4 4 4 4
44 44 44 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. ¢.:62:
GCTGGGATCA TTCGCTATGC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:63:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:63:
CAATGGATGG ACCAGTTCTG G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:64:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:64:
CAGATCGGCT CCTACTTTGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:65:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:65:
CATGGAGCCT CGAGACAGG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:66:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA
204 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ···· · • · ···· 9 9 9 ···· · ·* ·· ·« ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:66:
CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:67:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:67:
CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:68:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:68:
CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:69:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:69:
CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:70:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:70:
GTCACAGAGG GAACCTCC 18
205 • · • · · · • · (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:71:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:71:
GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:72:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:72:
GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:73:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:73:
CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:74:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:74:
GTGGATCAGC ACTGAAATCT G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:75:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina
206 • · • · • · · · 4 • · 4 • · ·· (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:75:
CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:76:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:76:
CACAGCGGAG GTGCAGGCAG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:77:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:77:
CTCACTGCTT GCGCTGGC 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:78:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:78:
CGGTAAGATA GCTCTGCTGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:79:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA
207 • · « · · · 4 · ··· ···· · ·· ·· ·· «· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:79:
GAGCCCACAG CCAGCACAGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:80:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:80:
GATCCAACGC CAGATCATAC C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:81:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:81:
CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:82:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:82:
CACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:83:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:83:
TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:84:
208 ·· · · · ·· *· • · MM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:84:
GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:85:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:85:
CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:86:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:86:
GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:87:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:87:
GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:88:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
209 • · · · · · • · · • · · ·
(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:88:
CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:89:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:89:
CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:90:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:90:
GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:91:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:91:
AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:92:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 852 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS
210 β ·
(Β) UMÍSTĚNÍ: 61..852 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:92:
TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60
ATG Met 1 | GCC Ala | CTT Leu | GGG Gly | GCT Ala 5 | GTG Val | GTC Val | CTC Leu | CTT Leu | GGG Gly 10 | GTC Val | CTG Leu | GCT Ala | TCT Ser | TAC Tyr 15 | CAC His | 108 |
GGA | TTC | AAC | TTG | GAC | GTG | ATG | AGC | GGT | GAT | CTT | CCA | GGA | AGA | CGC | AGC | 156 |
Gly | Phe | Asn | Leu 20 | Asp | Val | Met | Ser | Gly 25 | Asp | Leu | Pro | Gly | Arg 30 | Arg | Ser | |
GGG | CTT | CGG | GCA | GAG | CGT | GAT | GCA | GTT | TGG | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | GTG | 204 |
Gly | Leu | Arg 35 | Ala | Glu | Arg | Asp | Ala 40 | Val | Trp | Gly | Ser | Arg 45 | Leu | Val | Val | |
GGA | GCC | CCC | CTG | GCG | GTG | GTG | TCG | GCC | AAC | CAC | ACA | GGA | CGG | CTG | TAC | 252 |
Gly | Ala 50 | Pro | Leu | Ala | Val | Val 55 | Ser | Ala | Asn | His | Thr 60 | Gly | Arg | Leu | Tyr | |
GAG | TGT | GCG | CCT | GCC | TCC | GGC | ACC | TGC | ACG | CCC | ATT | TTC | CCA | TTC | ATG | 300 |
Glu 65 | Cys | Ala | Pro | Ala | Ser 70 | Gly | Thr | Cys | Thr | Pro 75 | Ile | Phe | Pro | Phe | Met 80 | |
CCC | CCC | GAA | GCC | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCC | CTG | GCA | GCC | TCC | 348 |
Pro | Pro | Glu | Ala | Val 85 | Asn | Met | Ser | Leu | Gly 90 | Leu | Ser | Leu | Ala | Ala 95 | Ser | |
CCC | AAC | CAT | TCC | CAG | CTG | CTG | GCT | TGT | GGC | CCG | ACC | GTG | CAT | AGA | GCC | 396 |
Pro | Asn | His | Ser 100 | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys 105 | Gly | Pro | Thr | Val | His 110 | Arg | Ala | |
TGC | GGG | GAG | GAC | GTG | TAC | GCC | CAG | GGT | TTC | TGT | GTG | CTG | CTG | GAT | GCC | 444 |
Cys | Gly | Glu 115 | Asp | Val | Tyr | Ala | Gin 120 | Gly | Phe | Cys | Val | Leu 125 | Leu | Asp | Ala | |
CAC | GCA | CAG | CCC | ATC | GGG | ACT | GTG | CCA | GCT | GCC | CTG | CCC | GAG | TGC | CCA | 492 |
His | Ala 130 | Gin | Pro | Ile | Gly | Thr 135 | Val | Pro | Ala | Ala | Leu 140 | Pro | Glu | Cys | Pro | |
GAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GTC | TTC | CTG | ATT | GAC | GGC | TCT | GGC | AGC | ATT | 540 |
Asp 145 | Gin | Glu | Met | Asp | Ile 150 | Val | Phe | Leu | Ile | Asp 155 | Gly | Ser | Gly | Ser | Ile 160 | |
AGC | TCA | AAT | GAC | TTC | CGC | AAG | ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AGA | GCT | GTG | ATG | 588 |
Ser | Ser | Asn | Asp | Phe 165 | Arg | Lys | Met | Lys | Asp 170 | Phe | Val | Arg | Ala | Val 175 | Met | |
GAC | CAG | TTC | AAG | GAC | ACC | AAC | ACC | CAG | TTC | TCG | CTG | ATG | CAG | TAC | TCC | 636 |
Asp | Gin | Phe | Lys 180 | Asp | Thr | Asn | Thr | Gin 185 | Phe | Ser | Leu | Met | Gin 190 | Tyr | Ser | |
AAT | GTG | CTG | GTG | ACA | CAT | TTC | ACC | TTC | AGC | AGC | TTC | CGG | AAC | AGC | TCC | 684 |
Asn | Val | Leu 195 | Val | Thr | His | Phe | Thr 200 | Phe | Ser | Ser | Phe | Arg 205 | Asn | Ser | Ser | |
AAT | CCT | CAG | GGC | CTA | GTG | GAG | CCC | ATT | GTG | CAG | CTG | ACA | GGC | CTC | ACG | 732 |
Asn | Pro | Gin | Gly | Leu | Val | Glu | Pro | Ile | Val | Gin | Leu | Thr | Gly | Leu | Thr |
210 215 220
211
TTC Phe 225 | ACG GCC ACA GGG ATC | CTG AAA GTG | GTG ACA | GAG CTG Glu Leu | TTT Phe | CAA ACC Gin Thr 240 | |||||
Thr Ala | Thr | Gly | Ile 230 | Leu Lys | Val | Val | Thr 235 | ||||
AAG | AAC GGG | GCC | CGC | GAA | AGT GCC | AAG | AAG | ATC | CTC ATC | GTC | ATC ACA |
Lys | Asn Gly | Ala | Arg | Glu | Ser Ala | Lys | Lys | Ile | Leu Ile | Val | Ile Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||
GAT | GGG CAG | AAG | TAC | AAA | GCG GCA | ||||||
Asp | Gly Gin | Lys | Tyr | Lys | Ala Ala | ||||||
260 | |||||||||||
(2) | INFORMACE 0 | SEK. | . ID. | . Č.:93: | |||||||
(i) ( | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | ||||||||||
(A) | DÉLKA: | 264 aminokyselin | |||||||||
(B) | TYP: aminokyselina | ||||||||||
(D) | TOPOLOGIE: lineární | ||||||||||
(ii) ' | TYP MOLEKULY: | : protein | |||||||||
(xi) : | POPIS SEKVENCE: SEK. | ID. | Č. : | 93: | |||||||
Met | Ala Leu | Gly | Ala | Val | Val Leu | Leu | Gly | Val | Leu Ala | Ser | Tyr His |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
Gly | Phe Asn | Leu | Asp | Val | Met Ser | Gly | Asp | Leu | Pro Gly | Arg | Arg Ser |
20 | 25 | 30 | |||||||||
Gly | Leu Arg | Ala | Glu | Arg | Asp Ala | Val | Trp | Gly | Ser Arg | Leu | Val Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||
Gly | Ala Pro | Leu | Ala | Val | Val Ser | Ala | Asn | His | Thr Gly | Arg | Leu Tyr |
50 | 55 | 60 | |||||||||
Glu | Cys Ala | Pro | Ala | Ser | Gly Thr | Cys | Thr | Pro | Ile Phe | Pro | Phe Met |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||
Pro | Pro Glu | Ala | Val | Asn | Met Ser | Leu | Gly | Leu | Ser Leu | Ala | Ala Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||
Pro | Asn His | Ser | Gin | Leu | Leu Ala | Cys | Gly | Pro | Thr Val | His | Arg Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||
Cys | Gly Glu | Asp | Val | Tyr | Ala Gin | Gly | Phe | Cys | Val Leu | Leu | Asp Ala |
115 | 120 | 125 | |||||||||
His | Ala Gin | Pro | Ile | Gly | Thr Val | Pro | Ala | Ala | Leu Pro | Glu | Cys Pro |
130 | 135 | 140 | |||||||||
Asp | Gin Glu | Met | Asp | Ile | Val Phe | Leu | Ile | Asp | Gly Ser | Gly | Ser Ile |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||
Ser | Ser Asn | Asp | Phe | Arg | Lys Met | Lys | Asp | Phe | Val Arg | Ala | Val Met |
165 | 170 | 175 | |||||||||
Asp | Gin Phe | Lys | Asp | Thr | Asn Thr | Gin | Phe | Ser | Leu Met | Gin | Tyr Ser |
180 | 185 | 190 |
212
Asn | Val | Leu 195 | Val | Thr | His | Phe | Thr 200 | Phe | Ser | Ser | Phe | Arg 205 | Asn | Ser | Ser |
Asn | Pro | Gin | Gly | Leu | Val | Glu | Pro | Ile | Val | Gin | Leu | Thr | Gly | Leu | Thr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile | Leu | Lys | Val | Val | Thr | Glu | Leu | Phe | Gin | Thr |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Glu | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile | Val | Ile | Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Ala | Ala |
260 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:94:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:94:
CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:95:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:95:
CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:96:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2499 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:96:
ATGACCTTCG | GCACTGTGCT | TCTTCTGAGT | GTCCTGGCTT | CTTATCATGG | ATTCAACCTG | 60 |
GATGTGGAGG | AGCCTACGAT | CTTCCAGGAG | GATGCAGGCG | GCTTTGGGCA | GAGCGTGGTG | 120 |
CAGTTCGGTG | GATCTCGACT | CGTGGTGGGA | GCACCCCTGG | AGGTGGTGGC | GGCCAACCAG | 180 |
213 • · · · · · · • · · · · ·· • · ·· ···· · • · · · · · ·
ACGGGACGGC | TGTATGACTG | CGCAGCTGCC | ACCGGCATGT | GCCAGCCCAT | CCCGCTGCAC | 240 |
ATCCGCCCTG | AGGCCGTGAA | CATGTCCTTG | GGCCTGACCC | TGGCAGCCTC | CACCAACGGC | 300 |
TCCCGGCTCC | TGGCCTGTGG | CCCGACCCTG | CACAGAGTCT | GTGGGGAGAA | CTCATACTCA | 360 |
AAGGGTTCCT | GCCTCCTGCT | GGGCTCGCGC | TGGGAGATCA | TCCAGACAGT | CCCCGACGCC | 420 |
ACGCCAGAGT | GTCCACATCA | AGAGATGGAC | ATCGTCTTCC | TGATTGACGG | CTCTGGAAGC | 480 |
ATTGACCAAA | ATGACTTTAA | CCAGATGAAG | GGCTTTGTCC | AAGCTGTCAT | GGGCCAGTTT | 540 |
GAGGGCACTG | ACACCCTGTT | TGCACTGATG | CAGTACTCAA | ACCTCCTGAA | GATCCACTTC | 600 |
ACCTTCACCC | AATTCCGGAC | CAGCCCGAGC | CAGCAGAGCC | TGGTGGATCC | CATCGTCCAA | 660 |
CTGAAAGGCC | TGACGTTCAC | GGCCACGGGC | ATCCTGACAG | TGGTGACACA | GCTATTTCAT | 720 |
CATAAGAATG | GGGCCCGAAA | AAGTGCCAAG | AAGATCCTCA | TTGTCATCAC | AGATGGGCAG | 780 |
AAGTACAAAG | ACCCCCTGGA | ATACAGTGAT | GTCATCCCCC | AGGCAGAGAA | GGCTGGCATC | 840 |
ATCCGCTACG | CTATCGGGGT | GGGACACGCT | TTCCAGGGAC | CCACTGCCAG | GCAGGAGCTG | 900 |
AATACCATCA | GCTCAGCGCC | TCCGCAGGAC | CACGTGTTCA | AGGTGGACAA | CTTTGCAGCC | 960 |
CTTGGCAGCA | TCCAGAAGCA | GCTGCAGGAG | AAGATCTATG | CAGTTGAGGG | AACCCAGTCC | 1020 |
AGGGCAAGCA | GCTCCTTCCA | GCACGAGATG | TCCCAAGAAG | GCTTCAGCAC | AGCCCTCACA | 1080 |
ATGGATGGCC | TCTTCCTGGG | GGCTGTGGGG | AGCTTTAGCT | GGTCTGGAGG | TGCCTTCCTG | 1140 |
TATCCCCCAA | ATATGAGCCC | CACCTTCATC | AACATGTCTC | AGGAGAATGT | GGACATGAGG | 1200 |
GACTCTTACC | TGGGTTACTC | CACCGAGCTA | GCCCTGTGGA | AGGGGGTACA | GAACCTGGTC | 1260 |
CTGGGGGCCC | CCCGCTACCA | GCATACCGGG | AAGGCTGTCA | TCTTCACCCA | GGTGTCCAGG | 1320 |
CAATGGAGGA | AGAAGGCCGA | AGTCACAGGG | ACGCAGATCG | GCTCCTACTT | CGGGGCCTCC | 1380 |
CTCTGCTCCG | TGGATGTGGA | CAGCGATGGC | AGCACCGACC | TGATCCTCAT | TGGGGCCCCC | 1440 |
CATTACTATG | AGCAGACCCG | AGGGGGCCAG | GTGTCCGTGT | GTCCCTTGCC | TAGGGGGAGG | 1500 |
GTGCAGTGGC | AGTGTGACGC | TGTTCTCCGT | GGTGAGCAGG | GCCACCCCTG | GGGCCGCTTT | 1560 |
GGGGCAGCCC | TGACAGTGTT | GGGGGATGTG | AATGAGGACA | AGCTGATAGA | CGTGGCCATT | 1620 |
GGGGCCCCGG | GAGAGCAGGA | GAACCGGGGT | GCTGTCTACC | TGTTTCACGG | AGCCTCAGAA | 1680 |
TCCGGCATCA | GCCCCTCCCA | CAGCCAGCGG | ATTGCCAGCT | CCCAGCTCTC | CCCCAGGCTG | 1740 |
CAGTATTTTG | GGCAGGCGCT | GAGTGGGGGT | CAGGACCTCA | CCCAGGATGG | ACTGATGGAC | 1800 |
CTGGCCGTGG | GGGCCCGGGG | CCAGGTGCTC | CTGCTCAGGA | GTCTGCCGGT | GCTGAAAGTG | 1860 |
GGGGTGGCCA | TGAGATTCAG | CCCTGTGGAG | GTGGCCAAGG | CTGTGTACCG | GTGCTGGGAA | 1920 |
GAGAAGCCCA | GTGCCCTGGA | AGCTGGGGAC | GCCACCGTCT | GTCTCACCAT | CCAGAAAAGC | 1980 |
TCACTGGACC | AGCTAGGTGA | CATCCAAAGC | TCTGTCAGGT | TTGATCTGGC | ACTGGACCCA | 2040 |
214 • · ···· · · ·· • · · · · · · • · · · · ··
GGTCGTCTGA | CTTCTCGTGC | CATTTTCAAT | GAAACCAAGA | ACCCCACTTT | GACTCGAAGA | 2100 |
AAAACCCTGG | GACTGGGGAT | TCACTGTGAA | ACCCTGAAGC | TGCTTTTGCC | AGTGAGGACT | 2160 |
TTGGGTTCTG | GGAAGGGGGA | GAGAGGAGGA | GCCCAAGGCT | GGCCTGGAGC | ACCCCCGTTC | 2220 |
TCTGCTGAGC | GAGGTGGGAA | GGGTTAGGAT | GTTGGGGCTG | GAGAGAGGGA | CATTAGGGCA | 2280 |
GGAGAACCTG | GCTCCACGGC | TTGGAGGGAG | CACTGTCAGG | GCAGTGGGGA | GTGGATGCAG | 2340 |
TGGAGGAGGA | CTTGTGGTGG | AGCGTAGAGA | GGACAGCAGG | TTCTTGAAAG | CCTGTTCTCT | 2400 |
CTCAGGATTG | TGTGGAGGAT | GTGGTGAGCC | CCATCATTCT | GCACCTCAAC | TTCTCACTGG | 2460 |
TGAGAGAGCC | CATCCCCTCC | CCCCAGAACC | TGCGTCCTG | 2499 |
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:97:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3956 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:97:
TTTAACTGCA | CCAACTTTAA | AATACGCTAT | TGGAGCTGGA | ATTACCGCGG | CTGCTGGCAC | 60 |
CAGACTTGCC | CTCCAATGGA | TCCTCGTTAA | AGGATTTAAA | GTGGACTCAT | TCCAATTACA | 120 |
GGGCCTCGAA | AGAGTCCTGT | ATTGTTATTT | TTCGTCACTA | CCTCCCCGGG | TCGGGAGTGG | 180 |
gtaatttgcg | CGCCTGCTGC | CTTCCTTGGA | TGTGGTAGCC | GTTTCTCAGG | CTCCCTCTCC | 240 |
GGAATCGAAC | CCTGATTCCC | CGTCACCCGT | GGTCACCATG | GTAGGCACGT | GCAGTTCGGT | 300 |
GGATCTCGAC | TCGTGGTGGG | AGCACCCCTG | GAGGTGGTGG | CGGCCAACCA | GACGGGACGG | 360 |
CTGTATGACT | GCGCAGCTGC | CACCGGCATG | TGCCAGCCCA | TCCCGCTGCA | CATCCGCCCT | 420 |
GAGGCCGTGA | ACATGTCCTT | GGGCCTGACC | CTGGCAGCCT | CCACCAACGG | CTCCCGGCTC | 480 |
CTGGCCTGTG | GCCCGACCCT | GCACAGAGTC | TGTGGGGAGA | ACTCATACTC | AAAGGGTTCC | 540 |
TGCCTCCTGC | TGGGCTCGCG | CTGGGAGATC | ATCCAGACAG | TCCCCGACGC | CACGCCAGAG | 600 |
TGTCCACATC | AAGAGATGGA | CATCGTCTTC | CTGATTGACG | GCTCTGGAAG | CATTGACCAA | 660 |
AATGACTTTA | ACCAGATGAA | GGGCTTTGTC | CAAGCTGTCA | TGGGCCAGTT | TGAGGGCACT | 720 |
GACACCCTGT | TTGCACTGAT | GCAGTACTCA | AACCTCCTGA | AGATCCACTT | CACCTTCACC | 780 |
CAATTCCGGA | CCAGCCCGAG | CCAGCAGAGC | CTGGTGGATC | CCATCGTCCA | ACTGAAAGGC | 840 |
CTGACGTTCA | CGGCCACGGG | CATCCTGACA | GTGGTGACAC | AGCTATTTCA | TCATAAGAAT | 900 |
GGGGCCCGAA | AAAGTGCCAA | GAAGATCCTC | ATTGTCATCA | CAGATGGGCA | G AAGTACAAA | 960 |
215 • · ·
GACCCCCTGG | AATACAGTGA | TGTCATCCCC | CAGGCAGAGA | AGGCTGGCAT | CATCCGCTAC | 1020 |
GCTATCGGGG | TGGGACACGC | TTTCCAGGGA | CCCACTGCCA | GGCAGGAGCT | GAATACCATC | 1080 |
AGCTCAGCGC | CTCCGCAGGA | CCACGTGTTC | AAGGTGGACA | ACTTTGCAGC | CCTTGGCAGC | 1140 |
ATCCAGAAGC | AGCTGCAGGA | GAAGATCTAT | GCAGTTGAGG | GAACCCAGTC | CAGGGCAAGC | 1200 |
AGCTCCTTCC | AGCACGAGAT | GTCCCAAGAA | GGCTTCAGCA | CAGCCCTCAC | AATGGATGGC | 1260 |
CTCTTCCTGG | GGGCTGTGGG | GAGCTTTAGC | TGGTCTGGAG | GTGCCTTCCT | GTATCCCCCA | 1320 |
AATATGAGCC | CCACCTTCAT | CAACATGTCT | CAGGAGAATG | TGGACATGAG | GGACTCTTAC | 1380 |
CTGGGTTACT | CCACCGAGCT | AGCCCTGTGG | AAGGGGGTAC | AGAACCTGGT | CCTGGGGGCC | 1440 |
CCCCGCTACC | AGCATACCGG | GAAGGCTGTC | ATCTTCACCC | AGGTGTCCAG | GCAATGGAGG | 1500 |
AAGAAGGCCG | AAGTCACAGG | GACGCAGATC | GGCTCCTACT | TCGGGGCCTC | CCTCTGCTCC | 1560 |
GTGGATGTGG | ACAGCGATGG | CAGCACCGAC | CTGATCCTCA | TTGGGGCCCC | CCATTACTAT | 1620 |
GAGCAGACCC | GAGGGGGCCA | GGTGTCCGTG | TGTCCCTTGC | CTAGGGGGAG | GGTGCAGTGG | 1680 |
CAGTGTGACG | CTGTTCTCCG | TGGTGAGCAG | GGCCACCCCT | GGGGCCGCTT | TGGGGCAGCC | 1740 |
CTGACAGTGT | TGGGGGATGT | GAATGAGGAC | AAGCTGATAG | ACGTGGCCAT | TGGGGCCCCG | 1800 |
GGAGAGCAGG | AGAACCGGGG | TGCTGTCTAC | CTGTTTCACG | GAGCCTCAGA | ATCCGGCATC | 1860 |
AGCCCCTCCC | ACAGCCAGCG | GATTGCCAGC | TCCCAGCTCT | CCCCCAGGCT | GCAGTATTTT | 1920 |
GGGCAGGCGC | TGAGTGGGGG | TCAGGACCTC | ACCCAGGATG | GACTGATGGA | CCTGGCCGTG | 1980 |
GGGGCCCGGG | GCCAGGTGCT | CCTGCTCAGG | AGTCTGCCGG | TGCTGAAAGT | GGGGGTGGCC | 2040 |
ATGAGATTCA | GCCCTGTGGA | GGTGGCCAAG | GCTGTGTACC | GGTGCTGGGA | AGAGAAGCCC | 2100 |
AGTGCCCTGG | AAGCTGGGGA | CGCCACCGTC | TGTCTCACCA | TCCAGAAAAG | CTCACTGGAC | 2160 |
CAGCTAGGTG | ACATCCAAAG | CTCTGTCAGG | TTTGATCTGG | CACTGGACCC | AGGTCGTCTG | 2220 |
ACTTCTCGTG | CCATTTTCAA | TGAAACCAAG | AACCCCACTT | TGACTCGAAG | AAAAACCCTG | 2280 |
GGACTGGGGA | TTCACTGTGA | AACCCTGAAG | CTGCTTTTGC | CAGATTGTGT | GGAGGATGTG | 2340 |
GTGAGCCCCA | TCATTCTGCA | CCTCAACTTC | TCACTGGTGA | GAGAGCCCAT | CCCCTCCCCC | 2400 |
CAGAACCTGC | GTCCTGTGCT | GGCCGTGGGC | TCACAAGACC | TCTTCACTGC | TTCTCTCCCC | 2460 |
TTCGAGAAGA | ACTGTGGGCA | AGATGGCCTC | TGTGAAGGGG | ACCTGGGTGT | CACCCTCAGC | 2520 |
TTCTCAGGCC | TGCAGACCCT | GACCGTGGGG | AGCTCCCTGG | AGCTCAACGT | GATTGTGACT | 2580 |
GTGTGGAACG | CAGGTGAGGA | TTCCTACGGA | ACCGTGGTCA | GCCTCTACTA | TCCAGCAGGG | 2640 |
CTGTCGCACC | GACGGGTGTC | AGGAGCCCAG | AAGCAGCCCC | ATCAGAGTGC | CCTGCGCCTG | 2700 |
GCATGTGAGA | CAGTGCCCAC | TGAGGATGAG | GGCCTAAGAA | GCAGCCGCTG | CAGTGTCAAC | 2760 |
CACCCCATCT | TCCATGAGGG | CTCTAACGGC | ACCTTCATAG | TCACATTCGA | TGTCTCCTAC | 2820 |
216 • · • 4 · 4 •4 4444
4
AAGGCCACCC | TGGGAGACAG | GATGCTTATG | AGGGCCAGTG | CAAGCAGTGA | GAACAATAAG | 2880 |
GCTTCAAGCA | GCAAGGCCAC | CTTCCAGCTG | GAGCTCCCGG | TGAAGTATGC | AGTCTACACC | 2940 |
ATGATCAGCA | GGCAGGAAGA | ATCCACCAAG | TACTTCAACT | TTGCAACCTC | CGATGAGAAG | 3000 |
AAAATGAAAG | AGGCTGAGCA | TCGATACCGT | GTGAATAACC | TCAGCCAGCG | AGATCTGGCC | 3060 |
ATCAGCATTA | ACTTCTGGGT | TCCTGTCCTG | CTGAACGGGG | TGGCTGTGTG | GGATGTGGTC | 3120 |
ATGGAGGCCC | CATCTCAGAG | TCTCCCCTGT | GTTTCAGAGA | GAAAACCTCC | CCAGCATTCT | 3180 |
GACTTCCTGA | CCCAGATTTC | AAGAAGTCCC | ATGCTGGACT | GCTCCATTGC | TGACTGCCTG | 3240 |
CAGTTCCGCT | GTGACGTCCC | CTCCTTCAGC | GTCCAGGAGG | AGCTGGATTT | CACCCTGAAG | 3300 |
GGCAATCTCA | GTTTCGGCTG | GGTCCGCGAG | ACATTGCAGA | AGAAGGTGTT | GGTCGTGAGT | 3360 |
GTGGCTGAAA | TTACGTTCGA | CACATCCGTG | TACTCCCAGC | TTCCAGGACA | GGAGGCATTT | 3420 |
ATGAGAGCTC | AGATGGAGAT | GGTGCTAGAA | GAAGACGAGG | TCTACAATGC | CATTCCCATC | 3480 |
ATCATGGGCA | GCTCTGTGGG | GGCTCTGCTA | CTGCTGGCGC | TCATCACAGC | CACACTGTAC | 3540 |
AAGCTTGGCT | TCTTCAAACG | CCACTACAAG | GAAATGCTGG | AGGACAAGCC | TGAAGACACT | 3600 |
GCCACATTCA | GTGGGGACGA | TTTCAGCTGT | GTGGCCCCAA | ATGTGCCTTT | GTCCTAATAA | 3660 |
TCCACTTTCC | TGTTTATCTC | TACCACTGTG | GGCTGGACTT | GCTTGCAACC | ATAAATCAAC | 3720 |
TTACATGGAA | ACAACTTCTG | CATAGATCTG | CACTGGCCTA | AGCAACCTAC | CAGGTGCTAA | 3780 |
GCACCTTCTC | GGAGAGATAG | AGATTGTCAA | TGTTTTTACA | TATCTGTCCA | TCTTTTTCAG | 3840 |
CAATGACCCA | CTTTTTACAG | AAGCAGGCAT | GGTGCCAGCA | TAAATTTTCA | TATGCTTAAG | 3900 |
AATTGTCACA | TGAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | CTTTAG | 3956 |
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:98:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3785 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ : 1..3486 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:98:
ATG ACC | TTC | GGC | ACT | GTG | CTT | CTT | CTG | AGT | GTC | CTG | GCT | TCT | TAT | CAT | 48 | |
Met | Thr | Phe | Gly | Thr | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Val | Leu | Ala | Ser | Tyr | His | |
1 | 5 | 10 | 15 |
217 • a ··
GGA | TTC | AAC | CTG | GAT | GTG | GAG | GAG | CCT |
Gly | Phe | Asn | Leu 20 | Asp | Val | Glu | Glu | Pro 25 |
GGC | GGC | TTT | GGG | CAG | AGC | GTG | GTG | CAG |
Gly | Gly | Phe 35 | Gly | Gin | Ser | Val | Val 40 | Gin |
GTG | GGA | GCA | CCC | CTG | GAG | GTG | GTG | GCG |
Val | Gly 50 | Ala | Pro | Leu | Glu | Val 55 | Val | Ala |
TAT | GAC | TGC | GCA | GCT | GCC | ACC | GGC | ATG |
Tyr 65 | Asp | Cys | Ala | Ala | Ala 70 | Thr | Gly | Met |
ATC | CGC | CCT | GAG | GCC | GTG | AAC | ATG | TCC |
Ile | Arg | Pro | Glu | Ala 85 | Val | Asn | Met | Ser |
TCC | ACC | AAC | GGC | TCC | CGG | CTC | CTG | GCC |
Ser | Thr | Asn | Gly 100 | Ser | Arg | Leu | Leu | Ala 105 |
GTC | TGT | GGG | GAG | AAC | TCA | TAC | TCA | AAG |
Val | Cys | Gly 115 | Glu | Asn | Ser | Tyr | Ser 120 | Lys |
TCG | CGC | TGG | GAG | ATC | ATC | CAG | ACA | GTC |
Ser | Arg 130 | Trp | Glu | Ile | Ile | Gin 135 | Thr | Val |
CCA | CAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATC | GTC | TTC |
Pro 145 | His | Gin | Glu | Met | Asp 150 | Ile | Val | Phe |
ATT | GAC | CAA | AAT | GAC | TTT | AAC | CAG | ATG |
Ile | Asp | Gin | Asn | Asp 165 | Phe | Asn | Gin | Met |
ATG | GGC | CAG | TTT | GAG | GGC | ACT | GAC | ACC |
Met | Gly | Gin | Phe 180 | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr 185 |
TCA | AAC | CTC | CTG | AAG | ATC | CAC | TTC | ACC |
Ser | Asn | Leu 195 | Leu | Lys | Ile | His | Phe 200 | Thr |
CCG | AGC | CAG | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | CCC |
Pro | Ser 210 | Gin | Gin | Ser | Leu | Val 215 | Asp | Pro |
ACG | TTC | ACG | GCC | ACG | GGC | ATC | CTG | ACA |
Thr 225 | Phe | Thr | Ala | Thr | Gly 230 | Ile | Leu | Thr |
CAT | AAG | AAT | GGG | GCC | CGA | AAA | AGT | GCC |
His | Lys | Asn | Gly | Ala 245 | Arg | Lys | Ser | Ala |
• a · flfl · a · · · · ·
• • | • • • a • a a a a a | • • • | • · • · • · a · • · | a • • a • · • · | a a a · a a ·· • · · · · • a * • a ·· | ||
ACG | ATC | TTC | CAG | GAG | GAT | GCA | 96 |
Thr | Ile | Phe | Gin | Glu 30 | Asp | Ala | |
TTC | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | 144 |
Phe | Gly | Gly | Ser 45 | Arg | Leu | Val | |
GCC | AAC | CAG | ACG | GGA | CGG | CTG | 192 |
Ala | Asn | Gin 60 | Thr | Gly | Arg | Leu | |
TGC | CAG | CCC | ATC | CCG | CTG | CAC | 240 |
Cys | Gin 75 | Pro | Ile | Pro | Leu | His 80 | |
TTG | GGC | CTG | ACC | CTG | GCA | GCC | 288 |
Leu 90 | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala 95 | Ala | |
TGT | GGC | CCG | ACC | CTG | CAC | AGA | 336 |
Cys | Gly | Pro | Thr | Leu 110 | His | Arg | |
GGT | TCC | TGC | CTC | CTG | CTG | GGC | 384 |
Gly | Ser | Cys | Leu 125 | Leu | Leu | Gly | |
CCC | GAC | GCC | ACG | CCA | GAG | TGT | 432 |
Pro | Asp | Ala 140 | Thr | Pro | Glu | Cys | |
CTG | ATT | GAC | GGC | TCT | GGA | AGC | 480 |
Leu | Ile 155 | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser 160 | |
AAG | GGC | TTT | GTC | CAA | GCT | GTC | 528 |
Lys 170 | Gly | Phe | Val | Gin | Ala 175 | Val | |
CTG | TTT | GCA | CTG | ATG | CAG | TAC | 576 |
Leu | Phe | Ala | Leu | Met 190 | Gin | Tyr | |
TTC | ACC | CAA | TTC | CGG | ACC | AGC | 624 |
Phe | Thr | Gin | Phe 205 | Arg | Thr | Ser | |
ATC | GTC | CAA | CTG | AAA | GGC | CTG | 672 |
Ile | Val | Gin 220 | Leu | Lys | Gly | Leu | |
GTG | GTG | ACA | CAG | CTA | TTT | CAT | 720 |
Val | Val 235 | Thr | Gin | Leu | Phe | His 240 | |
AAG | AAG | ATC | CTC | ATT | GTC | ATC | 768 |
Lys 250 | Lys | Ile | Leu | Ile | Val 255 | Ile |
218 • 4 4· • · 4 «· · · · · 4 « · 44 4 4 4·« • · «4 4 44 4444 * • · «444 444 ·· 444· ·* 4 4 4 4
444« | 4 | « · | ·· | 4 · 4 4 | ||||||||||||
ACA | GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GAC | CCC | CTG | GAA | TAC | AGT | GAT | GTC | ATC | 816 |
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | Ile | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
CCC | CAG | GCA | GAG | AAG | GCT | GGC | ATC | ATC | CGC | TAC | GCT | ATC | GGG | GTG | GGA | 864 |
Pro | Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val | Gly | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
CAC | GCT | TTC | CAG | GGA | CCC | ACT | GCC | AGG | CAG | GAG | CTG | AAT | ACC | ATC | AGC | 912 |
His | Ala | Phe | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Ser | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
TCA | GCG | CCT | CCG | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC | AAG | GTG | GAC | AAC | TTT | GCA | GCC | 960 |
Ser | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Asp | Asn | Phe | Ala | Ala | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
CTT | GGC | AGC | ATC | CAG | AAG | CAG | CTG | CAG | GAG | AAG | ATC | TAT | GCA | GTT | GAG | 1008 |
Leu | Gly | Ser | Ile | Gin | Lys | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | Ile | Tyr | Ala | Val | Glu | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
GGA | ACC | CAG | TCC | AGG | GCA | AGC | AGC | TCC | TTC | CAG | CAC | GAG | ATG | TCC | CAA | 1056 |
Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ala | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GAA | GGC | TTC | AGC | ACA | GCC | CTC | ACA | ATG | GAT | GGC | CTC | TTC | CTG | GGG | GCT | 1104 |
Glu | Gly | Phe | Ser | Thr | Ala | Leu | Thr | Met | Asp | Gly | Leu | Phe | Leu | Gly | Ala | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
GTG | GGG | AGC | TTT | AGC | TGG | TCT | GGA | GGT | GCC | TTC | CTG | TAT | CCC | CCA | AAT | 1152 |
Val | Gly | Ser | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
ATG | AGC | CCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAT | GTG | GAC | ATG | AGG | 1200 |
Met | Ser | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met | Arg | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
GAC | TCT | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GAG | CTA | GCC | CTG | TGG | AAG | GGG | GTA | 1248 |
Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lys | Gly | Val | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
CAG | AAC | CTG | GTC | CTG | GGG | GCC | CCC | CGC | TAC | CAG | CAT | ACC | GGG | AAG | GCT | 1296 |
Gin | Asn | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Ala | |
420 | 425 | 430 |
GTC ATC | TTC ACC | CAG Gin | GTG Val | TCC AGG Ser Arg 440 | CAA Gin | TGG Trp | AGG Arg | AAG AAG | GCC Ala | GAA Glu | GTC Val | 1344 | ||||
Val | Ile | Phe 435 | Thr | Lys | Lys 445 | |||||||||||
ACA | GGG | ACG | CAG | ATC | GGC | TCC | TAC | TTC | GGG | GCC | TCC | CTC | TGC | TCC | GTG | 1392 |
Thr | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
GAT | GTG | GAC | AGC | GAT | GGC | AGC | ACC | GAC | CTG | ATC | CTC | ATT | GGG | GCC | CCC | 1440 |
Asp | Val | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Ile | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro | |
465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
CAT | TAC | TAT | GAG | CAG | ACC | CGA | GGG | GGC | CAG | GTG | TCC | GTG | TGT | CCC | TTG | 1488 |
His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu | |
485 | 490 | 495 |
219 • 4 ΦΦ • 4 Φ 4 Φ
Φ · Φ ΦΦ
Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ
Φ ΦΦΦ
ΦΦ ΦΦ ΦΦ φφ φφφφ
Φ Φ • 4 • · • · ΦΦΦΦ r
Φ Φ
Φ Φ » 4
Φ Φ
ΦΦ
ΦΦΦΦ
CCT | AGG | GGG | AGG | GTG | CAG | TGG | CAG | TGT | GAC | GCT | GTT | CTC | CGT | GGT | GAG |
Pro | Arg | Gly | Arg 500 | Val | Gin | Trp | Gin | Cys 505 | Asp | Ala | Val | Leu | Arg 510 | Gly | Glu |
CAG | GGC | CAC | CCC | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCA | GCC | CTG | ACA | GTG | TTG | GGG |
Gin | Gly | His 515 | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe 520 | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr 525 | Val | Leu | Gly |
GAT | GTG | AAT | GAG | GAC | AAG | CTG | ATA | GAC | GTG | GCC | ATT | GGG | GCC | CCG | GGA |
Asp | Val 530 | Asn | Glu | Asp | Lys | Leu 535 | Ile | Asp | Val | Ala | Ile 540 | Gly | Ala | Pro | Gly |
GAG | CAG | GAG | AAC | CGG | GGT | GCT | GTC | TAC | CTG | TTT | CAC | GGA | GCC | TCA | GAA |
Glu 545 | Gin | Glu | Asn | Arg | Gly 550 | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe 555 | His | Gly | Ala | Ser | Glu 560 |
TCC | GGC | ATC | AGC | CCC | TCC | CAC | AGC | CAG | CGG | ATT | GCC | AGC | TCC | CAG | CTC |
Ser | Gly | Ile | Ser | Pro 565 | Ser | His | Ser | Gin | Arg 570 | Ile | Ala | Ser | Ser | Gin 575 | Leu |
TCC | CCC | AGG | CTG | CAG | TAT | TTT | GGG | CAG | GCG | CTG | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC |
Ser | Pro | Arg | Leu 580 | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin 585 | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly 590 | Gin | Asp |
CTC | ACC | CAG | GAT | GGA | CTG | ATG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGG | GCC | CGG | GGC | CAG |
Leu | Thr | Gin 595 | Asp | Gly | Leu | Met | Asp 600 | Leu | Ala | Val | Gly | Ala 605 | Arg | Gly | Gin |
GTG | CTC | CTG | CTC | AGG | AGT | CTG | CCG | GTG | CTG | AAA | GTG | GGG | GTG | GCC | ATG |
Val | Leu 610 | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu 615 | Pro | Val | Leu | Lys | Val 620 | Gly | Val | Ala | Met |
AGA | TTC | AGC | CCT | GTG | GAG | GTG | GCC | AAG | GCT | GTG | TAC | CGG | TGC | TGG | GAA |
Arg 625 | Phe | Ser | Pro | Val | Glu 630 | Val | Ala | Lys | Ala | Val 635 | Tyr | Arg | Cys | Trp | Glu 640 |
GAG | AAG | CCC | AGT | GCC | CTG | GAA | GCT | GGG | GAC | GCC | ACC | GTC | TGT | CTC | ACC |
Glu | Lys | Pro | Ser | Ala 645 | Leu | Glu | Ala | Gly | Asp 650 | Ala | Thr | Val | Cys | Leu 655 | Thr |
ATC | CAG | AAA | AGC | TCA | CTG | GAC | CAG | CTA | GGT | GAC | ATC | CAA | AGC | TCT | GTC |
Ile | Gin | Lys | Ser 660 | Ser | Leu | Asp | Gin | Leu 665 | Gly | Asp | Ile | Gin | Ser 670 | Ser | Val |
1536
1584
1632
1680
1728
1776
1824
1872
1920
1968
2016
AGG | TTT | GAT | CTG | GCA | CTG | GAC | CCA | GGT | CGT | CTG | ACT | TCT | CGT | GCC | ATT |
Arg | Phe | Asp 675 | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro 680 | Gly | Arg | Leu | Thr | Ser 685 | Arg | Ala | Ile |
TTC | AAT | GAA | ACC | AAG | AAC | CCC | ACT | TTG | ACT | CGA | AGA | AAA | ACC | CTG | GGA |
Phe | Asn 690 | Glu | Thr | Lys | Asn | Pro 695 | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg 700 | Lys | Thr | Leu | Gly |
CTG | GGG | ATT | CAC | TGT | GAA | ACC | CTG | AAG | CTG | CTT | TTG | CCA | GAT | TGT | GTG |
Leu 705 | Gly | Ile | His | Cys | Glu 710 | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu 715 | Leu | Pro | Asp | Cys | Val 720 |
GAG | GAT | GTG | GTG | AGC | CCC | ATC | ATT | CTG | CAC | CTC | AAC | TTC | TCA | CTG | GTG |
Glu | Asp | Val | Val | Ser 725 | Pro | Ile | Ile | Leu | His 730 | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu 735 | Val |
2064
2112
2160
2208
220 • « · φ
AGA | GAG | CCC | ATC | CCC | TCC | CCC | CAG | AAC | CTG | CGT | CCT | GTG | CTG | GCC | GTG |
Arg | Glu | Pro | Ile 740 | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn 745 | Leu | Arg | Pro | Val | Leu 750 | Ala | Val |
GGC | TCA | CAA | GAC | CTC | TTC | ACT | GCT | TCT | CTC | CCC | TTC | GAG | AAG | AAC | TGT |
Gly | Ser | Gin 755 | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala 760 | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu 765 | Lys | Asn | Cys |
GGG | CAA | GAT | GGC | CTC | TGT | GAA | GGG | GAC | CTG | GGT | GTC | ACC | CTC | AGC | TTC |
Gly | Gin 770 | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu 775 | Gly | Asp | Leu | Gly | Val 780 | Thr | Leu | Ser | Phe |
TCA | GGC | CTG | CAG | ACC | CTG | ACC | GTG | GGG | AGC | TCC | CTG | GAG | CTC | AAC | GTG |
Ser 785 | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu 790 | Thr | Val | Gly | Ser | Ser 795 | Leu | Glu | Leu | Asn | Val 800 |
ATT | GTG | ACT | GTG | TGG | AAC | GCA | GGT | GAG | GAT | TCC | TAC | GGA | ACC | GTG | GTC |
Ile | Val | Thr | Val | Trp 805 | Asn | Ala | Gly | Glu | Asp 810 | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val 815 | Val |
AGC | CTC | TAC | TAT | CCA | GCA | GGG | CTG | TCG | CAC | CGA | CGG | GTG | TCA | GGA | GCC |
Ser | Leu | Tyr | Tyr 820 | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser 825 | His | Arg | Arg | Val | Ser 830 | Gly | Ala |
CAG | AAG | CAG | CCC | CAT | CAG | AGT | GCC | CTG | CGC | CTG | GCA | TGT | GAG | ACA | GTG |
Gin | Lys | Gin 835 | Pro | His | Gin | Ser | Ala 840 | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys 845 | Glu | Thr | Val |
CCC | ACT | GAG | GAT | GAG | GGC | CTA | AGA | AGC | AGC | CGC | TGC | AGT | GTC | AAC | CAC |
Pro | Thr 850 | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu 855 | Arg | Ser | Ser | Arg | Cys 860 | Ser | Val | Asn | His |
CCC | ATC | TTC | CAT | GAG | GGC | TCT | AAC | GGC | ACC | TTC | ATA | GTC | ACA | TTC | GAT |
Pro 865 | Ile | Phe | His | Glu | Gly 870 | Ser | Asn | Gly | Thr | Phe 875 | Ile | Val | Thr | Phe | Asp 880 |
GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | ACC | CTG | GGA | GAC | AGG | ATG | CTT | ATG | AGG | GCC | AGT |
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala 885 | Thr | Leu | Gly | Asp | Arg 890 | Met | Leu | Met | Arg | Ala 895 | Ser |
GCA | AGC | AGT | GAG | AAC | AAT | AAG | GCT | TCA | AGC | AGC | AAG | GCC | ACC | TTC | CAG |
Ala | Ser | Ser | Glu 900 | Asn | Asn | Lys | Ala | Ser 905 | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr 910 | Phe | Gin |
CTG | GAG | CTC | CCG | GTG | AAG | TAT | GCA | GTC | TAC | ACC | ATG | ATC | AGC | AGG | CAG |
Leu | Glu | Leu 915 | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala 920 | Val | Tyr | Thr | Met | Ile 925 | Ser | Arg | Gin |
GAA | GAA | TCC | ACC | AAG | TAC | TTC | AAC | TTT | GCA | ACC | TCC | GAT | GAG | AAG | AAA |
Glu | Glu 930 | Ser | Thr | Lys | Tyr | Phe 935 | Asn | Phe | Ala | Thr | Ser 940 | Asp | Glu | Lys | Lys |
ATG | AAA | GAG | GCT | GAG | CAT | CGA | TAC | CGT | GTG | AAT | AAC | CTC | AGC | CAG | CGA |
Met 945 | Lys | Glu | Ala | Glu | His 950 | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn 955 | Asn | Leu | Ser | Gin | Arg 960 |
GAT | CTG | GCC | ATC | AGC | ATT | AAC | TTC | TGG | GTT | CCT | GTC | CTG | CTG | AAC | GGG |
Asp | Leu | Ala | Tle | Ser 965 | Ile | Asn | Phe | Trp | Val 970 | Pro | Val | Leu | Leu | Asn 975 | Gly |
2256
2304
2352
2400
2448
2496
2544
2592
2640
2688
2736
2784
2832
2880
2928
221 • · • · · · • · · ·
• · · · | t | • · | • * | «· | • · | |
GTG GCT GTG TGG GAT GTG | GTC ATG GAG GCC CCA TCT | CAG | AGT | CTC | CCC | 2976 |
Val Ala Val Trp Asp Val | Val Met Glu Ala Pro Ser | Gin | Ser | Leu | Pro | |
980 | 985 | 990 | ||||
TGT GTT TCA GAG AGA AAA | CCT CCC CAG CAT TCT GAC | TTC | CTG | ACC | CAG | 3024 |
Cys Val Ser Glu Arg Lys | Pro Pro Gin His Ser Asp | Phe | Leu | Thr | Gin | |
995 | 1000 | 1005 | ||||
ATT TCA AGA AGT CCC ATG | CTG GAC TGC TCC ATT GCT | GAC | TGC | CTG | CAG | 3072 |
Ile Ser Arg Ser Pro Met | Leu Asp Cys Ser Ile Ala | Asp | Cys | Leu | Gin | |
1010 | 1015 1020 | |||||
TTC CGC TGT GAC GTC CCC | TCC TTC AGC GTC CAG GAG | GAG | CTG | GAT | TTC | 3120 |
Phe Arg Cys Asp Val Pro | Ser Phe Ser Val Gin Glu | Glu | Leu | Asp | Phe | |
1025 1030 1035 | 1040 | |||||
ACC CTG AAG GGC AAT CTC | AGT TTC GGC TGG GTC CGC | GAG | ACA | TTG | CAG | 3168 |
Thr Leu Lys Gly Asn Leu | Ser Phe Gly Trp Val Arg | Glu | Thr | Leu | Gin | |
1045 | 1050 | 1055 | ||||
AAG AAG GTG TTG GTC GTG | AGT GTG GCT GAA ATT ACG | TTC | GAC | ACA | TCC | 3216 |
Lys Lys Val Leu Val Val | Ser Val Ala Glu Ile Thr | Phe | Asp | Thr | Ser | |
1060 | 1065 | 1070 | ||||
GTG TAC TCC CAG CTT CCA | GGA CAG GAG GCA TTT ATG | AGA | GCT | CAG | ATG | 3264 |
Val Tyr Ser Gin Leu Pro | Gly Gin Glu Ala Phe Met | Arg | Ala | Gin | Met | |
1075 | 1080 | 1085 | ||||
GAG ATG GTG CTA GAA GAA | GAC GAG GTC TAC AAT GCC | ATT | CCC | ATC | ATC | 3312 |
Glu Met Val Leu Glu Glu | Asp Glu Val Tyr Asn Ala | Ile | Pro | Ile | Ile | |
1090 | 1095 1100 | |||||
ATG GGC AGC TCT GTG GGG | GCT CTG CTA CTG CTG GCG | CTC | ATC | ACA | GCC | 3360 |
Met Gly Ser Ser Val Gly | Ala Leu Leu Leu Leu Ala | Leu | Ile | Thr | Ala | |
1105 1110 1115 | 1120 | |||||
ACA CTG TAC AAG CTT GGC | TTC TTC AAA CGC CAC TAC | AAG | GAA | ATG | CTG | 3408 |
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly | Phe Phe Lys Arg His Tyr | Lys | Glu | Met | Leu | |
1125 | 1130 | 1135 | ||||
GAG GAC AAG CCT GAA GAC | ACT GCC ACA TTC AGT GGG | GAC | GAT | TTC | AGC | 3456 |
Glu Asp Lys Pro Glu Asp | Thr Ala Thr Phe Ser Gly | Asp | Asp | Phe | Ser | |
1140 | 1145 | 1150 |
TGT | GTG | GCC CCA | AAT | GTG | CCT | TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT | 3503 |
Cys | Val | Ala Pro 1155 | Asn | Val | Pro | Leu Ser 1160 |
TATCTCTACC | ACTGTGGGCT | GGACTTGCTT | GCAACCATAA | ATCAACTTAC | ATGGAAACAA | 3563 |
CTTCTGCATA | GATCTGCACT | GGCCTAAGCA | ACCTACCAGG | TGCTAAGCAC | CTTCTCGGAG | 3623 |
AGATAGAGAT | TGTCAATGTT | TTTACATATC | TGTCCATCTT | TTTCAGCAAT | GACCCACTTT | 3683 |
TTACAGAAGC | AGGCATGGTG | CCAGCATAAA | TTTTCATATG | CTTAAGAATT | GTCACATGAA | 3743 |
AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | AAAAAACTTT | AG | 3785 |
222 • · · · « · • · ·· · ···· • · · · · ·· ···· · • · ·*·· · * · ··»· 4 ♦· ·· ·· ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:99:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:99:
Met 1 | Thr | Phe | Gly Thr 5 | Val | Leu | Leu | Leu | Ser 10 | Val | Leu | Ala | Ser | Tyr 15 | His | |
Gly | Phe | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu | Pro | Thr | Ile | Phe | Gin | Glu | Asp | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Gly | Phe | Gly | Gin | Ser | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val | Val | Ala | Ala | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Tyr | Asp | Cys | Ala | Ala | Ala | Thr | Gly | Met | Cys | Gin | Pro | Ile | Pro | Leu | His |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ile | Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Thr | Asn | Gly | Ser | Arg | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Leu | His | Arg |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Val | Cys | Gly | Glu | Asn | Ser | Tyr | Ser | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Arg | Trp | Glu | Ile | Ile | Gin | Thr | Val | Pro | Asp | Ala | Thr | Pro | Glu | Cys |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Pro | His | Gin | Glu | Met | Asp | Ile | Val | Phe | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ile | Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin | Met | Lys | Gly | Phe | Val | Gin | Ala | Val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Met | Gly | Gin | Phe | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr | Leu | Phe | Ala | Leu | Met | Gin | Tyr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Asn | Leu | Leu | Lys | Ile | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Gin | Phe | Arg | Thr | Ser |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Pro | Ser | Gin | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Pro | Ile | Val | Gin | Leu | Lys | Gly | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile | Leu | Thr | Val | Val | Thr | Gin | Leu | Phe | His |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
His | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile | Val | Ile |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | Ile |
260 | 265 | 270 |
223
··* a * | ·· | • 0 | 0 | ||||||||||||
Pro | Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | Val | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
His | Ala | Phe | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | Ile | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ser | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Asp | Asn | Phe | Ala | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Gly | Ser | Ile | Gin | Lys | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | Ile | Tyr | Ala | Val | Glu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ala | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Glu | Gly | Phe | Ser | Thr | Ala | Leu | Thr | Met | Asp | Gly | Leu | Phe | Leu | Gly | Ala |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Met | Ser | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met | Arg |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lys | Gly | Val |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gin | Asn | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Ala |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Val | Ile | Phe | Thr | Gin | Val | Ser | Arg | Gin | Trp | Arg | Lys | Lys | Ala | Glu | Val |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Thr | Gly | Thr | Gin | Ile | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Val | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Ile | Leu | Ile | Gly | Ala | Pro |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Arg | Gly | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | Glu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Asp | Val | Asn | Glu | Asp | Lys | Leu | Ile | Asp | Val | Ala | Ile | Gly | Ala | Pro | Gly |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Glu | Gin | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Ala | Ser | Glu |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Gly | Ile | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | Ile | Ala | Ser | Ser | Gin | Leu |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ser | Pro | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp |
580 | 585 | 590 |
224 ··· · • · · · · ···· • · ·· · · · · · · · * • · ···· · · * ····· ·· ·· ·· ··
Leu Thr | Gin Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala | Arg Gly Gin | |||||||||||||
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Ala | Met |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Arg | Phe | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Ala | Lys | Ala | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | Glu |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Glu | Lys | Pro | Ser | Ala | Leu | Glu | Ala | Gly | Asp | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Ile | Gin | Lys | Ser | Ser | Leu | Asp | Gin | Leu | Gly | Asp | Ile | Gin | Ser | Ser | Val |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Arg | Phe | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | Thr | Ser | Arg | Ala | Ile |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Phe | Asn | Glu | Thr | Lys | Asn | Pro | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lys | Thr | Leu | Gly |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Ile | His | Cys | Glu | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys | Val |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Glu | Asp | Val | Val | Ser | Pro | Ile | Ile | Leu | His | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu | Val |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Arg | Glu | Pro | Ile | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Val |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Gly | Ser | Gin | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Gly | Gin | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | Val | Thr | Leu | Ser | Phe |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Ser | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Leu | Asn | Val |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Ile | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Ala | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val | Val |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ser | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | His | Arg | Arg | Val | Ser | Gly | Ala |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Gin | Lys | Gin | Pro | His | Gin | Ser | Ala | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys | Glu | Thr | Val |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Pro | Thr | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Ser | Arg | Cys | Ser | Val | Asn | His |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Pro | Ile | Phe | His | Glu | Gly | Ser | Asn | Gly | Thr | Phe | Ile | Val | Thr | Phe | Asp |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Thr | Leu | Gly | Asp | Arg | Met | Leu | Met | Arg | Ala | Ser |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Ala | Ser | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 |
225 ·· ···* ·. ···· «· ··
«.· · · · · ··«>
• · · · · · · · · » · ·· · · · · · · · · • »··· · · · • · · · · ·· · · · · ··
Leu | Glu Leu 915 | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala 920 | Val | Tyr | Thr | Met | Ile 925 | Ser | Arg | Gin |
Glu | Glu Ser | Thr | Lys | Tyr | Phe | Asn | Phe | Ala | Thr | Ser | Asp | Glu | Lys | Lys |
930 | 935 | 940 | ||||||||||||
Met | Lys Glu | Ala | Glu | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Gin | Arg |
945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||
Asp | Leu Ala | Ile | Ser | Ile | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly |
965 | 970 | 975 | ||||||||||||
Val | Ala Val | Trp | Asp | Val | Val | Met | Glu | Ala | Pro | Ser | Gin | Ser | Leu | Pro |
980 | 985 | 990 | ||||||||||||
Cys | Val Ser | Glu | Arg | Lys | Pro | Pro | Gin | His | Ser | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin |
995 | 1000 | 1005 | ||||||||||||
Ile | Ser Arg | Ser | Pro | Met | Leu | Asp | Cys | Ser | Ile | Ala | Asp | Cys | Leu | Gin |
1010 | 1015 | 1020 | ||||||||||||
Phe | Arg Cys | Asp | Val | Pro | Ser | Phe | Ser | Val | Gin | Glu | Glu | Leu | Asp | Phe |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | |||||||||||
Thr | Leu Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | Val | Arg | Glu | Thr | Leu | Gin |
1045 | 1050 | 1055 | ||||||||||||
Lys | Lys Val | Leu | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | Ile | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser |
1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||||
Val | Tyr Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Met | Arg | Ala | Gin | Met |
1075 | 1080 | 1085 | ||||||||||||
Glu | Met Val | Leu | Glu | Glu | Asp | Glu | Val | Tyr | Asn | Ala | Ile | Pro | Ile | Ile |
1090 | 1095 | 1100 | ||||||||||||
Met | Gly Ser | Ser | Val | Gly | Ala | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | Ile | Thr | Ala |
1105 | 1110 | 1115 | 1120 | |||||||||||
Thr | Leu Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | His | Tyr | Lys | Glu | Met | Leu |
1125 | 1130 | 1135 | ||||||||||||
Glu | Asp Lys | Pro | Glu | Asp | Thr | Ala | Thr | Phe | Ser | Gly | Asp | Asp | Phe | Ser |
1140 | 1145 | 1150 | ||||||||||||
Cys | Val Ala | Pro | Asn | Val | Pro | Leu | Ser | |||||||
1155 | 1160 | |||||||||||||
(2) | INFORMACE 0 | SEK. | ID. | Č. : | 100: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1318 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
226 « · • · • · • · · 4 · ·· · · · · · • « · 4 · 4 444 • 4444 44 «4 4 4 44 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 17..1255
(xi) POPIS SEKVENCE: | SEK. | ID. | Č. : | 100: | ||||||
AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT | GTG | GTC | CTC | CTT | GGG | GTC | CTG | GCT | TCT | 49 |
Gly Ala | Val | Val | Leu | Leu | Gly | Val | Leu | Ala | Ser | |
1 | 5 | 10 |
TAC Tyr | CAC His | GGA Gly | TTC Phe 15 | AAC Asn | TTG Leu | GAC Asp | GTG Val | GAT Asp 20 | GAG Glu | CCG Pro | GTG Val | ATC Ile | TTC Phe 25 | CAG Gin | GAA Glu | 97 |
GAC | GCA | GCG | GGC | TTC | GGG | CAG | AGC | GTG | ATG | CAG | TTT | GGA | GGA | TCT | CGA | 145 |
Asp | Ala | Ala 30 | Gly | Phe | Gly | Gin | Ser 35 | Val | Met | Gin | Phe | Gly 40 | Gly | Ser | Arg | |
CTC | GTG | GTG | GGA | GCC | CCC | CTG | GCG | GTG | GTG | TCG | GCC | AAC | CAC | ACA | GGA | 193 |
Leu | Val 45 | Val | Gly | Ala | Pro | Leu 50 | Ala | Val | Val | Ser | Ala 55 | Asn | His | Thr | Gly | |
CGG | CTG | TAC | GAG | TGT | GCG | CCT | GCC | TCC | GGC | ACC | TGC | ACG | CCC | ATT | TTC | 241 |
Arg 60 | Leu | Tyr | Glu | Cys | Ala 65 | Pro | Ala | Ser | Gly | Thr 70 | Cys | Thr | Pro | Ile | Phe 75 | |
CCA | TTC | ATG | CCC | CCC | GAA | GCC | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCC | CTG | 289 |
Pro | Phe | Met | Pro | Pro 80 | Glu | Ala | Val | Asn | Met 85 | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser 90 | Leu | |
GCA | GCC | TCC | CCC | AAC | CAT | TCC | CAG | CTG | CTG | GCT | TGT | GGC | CCG | ACC | GTG | 337 |
Ala | Ala | Ser | Pro 95 | Asn | His | Ser | Gin | Leu 100 | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro 105 | Thr | Val | |
CAT | AGA | GCC | TGC | GGG | GAG | GAC | GTG | TAC | GCC | CAG | GGT | TTC | TGT | GTG | CTG | 385 |
His | Arg | Ala 110 | Cys | Gly | Glu | Asp | Val 115 | Tyr | Ala | Gin | Gly | Phe 120 | Cys | Val | Leu | |
CTG | GAT | GCC | CAC | GCA | CAG | CCC | ATC | GGG | ACT | GTG | CCA | GCT | GCC | CTG | CCC | 433 |
Leu | Asp 125 | Ala | His | Ala | Gin | Pro 130 | Ile | Gly | Thr | Val | Pro 135 | Ala | Ala | Leu | Pro | |
GAG | TGC | CCA | GAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GTC | TTC | CTG | ATT | GAC | GGC | TCT | 481 |
Glu 140 | Cys | Pro | Asp | Gin | Glu 145 | Met | Asp | Ile | Val | Phe 150 | Leu | Ile | Asp | Gly | Ser 155 | |
GGC | AGC | ATT | AGC | TCA | AAT | GAC | TTC | CGC | AAG | ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AGA | 529 |
Gly | Ser | Ile | Ser | Ser 160 | Asn | Asp | Phe | Arg | Lys 165 | Met | Lys | Asp | Phe | Val 170 | Arg | |
GCT | GTG | ATG | GAC | CAG | TTC | AAG | GAC | ACC | AAC | ACC | CAG | TTC | TCG | CTG | ATG | 577 |
Ala | Val | Met | Asp 175 | Gin | Phe | Lys | Asp | Thr 180 | Asn | Thr | Gin | Phe | Ser 185 | Leu | Met | |
CAG | TAC | TCC | AAT | GTG | CTG | GTG | ACA | CAT | TTC | ACC | TTC | AGC | AGC | TTC | CGG | 625 |
Gin | Tyr | Ser 190 | Asn | Val | Leu | Val | Thr 195 | His | Phe | Thr | Phe | Ser 200 | Ser | Phe | Arg |
227 • fe fefefefe fefefe • fefefefe fefe fefe · · · ·
AAC Asn | AGC Ser 205 | TCC AAT Ser Asn | CCT Pro | CAG Gin | GGC Gly 210 | CTA GTG Leu Val | GAG Glu | CCC Pro | ATT Ile 215 | GTG Val | CAG Gin | CTG Leu | ACA Thr | 673 | ||
GGC | CTC | ACG | TTC | ACG | GCC | ACA | GGG | ATC | CTG | AAA | GTG | GTG | ACA | GAG | CTG | 721 |
Gly | Leu | Thr | Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | Ile | Leu | Lys | Val | Val | Thr | Glu | Leu | |
220 | 225 | 230 | 235 | |||||||||||||
TTT | CAA | ACC | AAG | AAC | GGG | GCC | CGC | GAA | AGT | GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | ATC | 769 |
Phe | Gin | Thr | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Glu | Ser | Ala | Lys | Lys | Ile | Leu | Ile | |
240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
GTC | ATC | ACA | GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GAC | CCC | CTG | CAC | TAC | AGT | GCT | 817 |
Val | Ile | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | His | Tyr | Ser | Ala | |
255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
GTC | ATC | CCA | CAG | GCA | GAG | CAG | GCG | GGC | ATC | ATC | CGC | TAC | GCC | ATC | GGG | 865 |
Val | Ile | Pro | Gin | Ala | Glu | Gin | Ala | Gly | Ile | Ile | Arg | Tyr | Ala | Ile | Gly | |
270 | 275 | 280 | ||||||||||||||
GTG | GGG | GAC | GCG | TTC | CAG | AAA | CCC | ACA | GCC | AGG | CAG | GAG | CTG | GAC | ACC | 913 |
Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Gin | Lys | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asp | Thr | |
285 | 290 | 295 | ||||||||||||||
ATC | GCC | TCC | GAG | CCG | CCC | GAC | GCC | CAC | GTG | TTC | CAG | GTG | GAC | AAT | TTC | 961 |
Ile | Ala | Ser | Glu | Pro | Pro | Asp | Ala | His | Val | Phe | Gin | Val | Asp | Asn | Phe | |
300 | 305 | 310 | 315 | |||||||||||||
TCA | GCA | CTC | AGC | AGC | ATC | CAA | AAG | CAG | CTG | TAT | GAC | AGG | ATC | TTT | GCC | 1009 |
Ser | Ala | Leu | Ser | Ser | Ile | Gin | Lys | Gin | Leu | Tyr | Asp | Arg | Ile | Phe | Ala | |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
GTC | GAG | GGA | ACC | CTG | TCA | TCG | GCA | AGC | ACC | TCC | TTC | CAG | CAT | GAG | ATG | 1057 |
Val | Glu | Gly | Thr | Leu | Ser | Ser | Ala | Ser | Thr | Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
TCC | CAA | GAG | GGC | TTC | AGC | TCA | CTT | CTC | ACC | ACG | GAA | GGA | CCG | GTG | CTG | 1105 |
Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Leu | Leu | Thr | Thr | Glu | Gly | Pro | Val | Leu | |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
GGG | GCT | GTG | GGC | AGC | TTC | GAT | TGG | TCC | GGG | GGT | GCT | TTC | CTG | TAC | CCC | 1153 |
Gly | Ala | Val | Gly | Ser | Phe | Asp | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||||
CCC | GGC | GGG | AGC | CCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | CAG | AAC | GTG | GAC | 1201 |
Pro | Gly | Gly | Ser | Pro | Thr | Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin | Gin | Asn | Val | Asp | |
380 | 385 | 390 | 395 |
ATG | AGG | GAC | TCC | TAC | CTG | GGT | GAG | GAA | GGG | GTG | GGG | GTG | GGG | ACA | GGT | 1249 |
Met | Arg | Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Glu | Glu | Gly | Val | Gly | Val | Gly | Thr | Gly |
400 405 410
GGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGGCTG GGAGGGGAGG GAAGAGGAGG 1305
Gly Ser
GGAGAGGCAA AGA 1318
228
I « • · β ·
4 9 9
(2) | INFORMACE 0 | SEK. | ID. | Č. : | 101: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |||||
(A) | DÉLKA: | 413 | aminokyselin | ||
(B) | TYF | aminokyselina | |||
(D) | TOPOLOGIE: | lineární | |||
(ii) TYP MOLEKULY: | protein | ||||
(xi) POPIS | 1 SEKVENCE: SEK. ID. Č.:101: | ||||
Gly | Ala Val Val | Leu | Leu | Gly | Val Leu Ala Ser Tyr His Gly Phe Asn |
1 | 5 | 10 15 | |||
Leu | Asp Val Asp | Glu | Pro | Val | Ile Phe Gin Glu Asp Ala Ala Gly Phe |
20 | 25 30 | ||||
Gly | Gin Ser Val | Met | Gin | Phe | Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala |
35 | 40 45 | ||||
Pro | Leu Ala Val | Val | Ser | Ala | Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Cys |
50 | 55 | 60 | |||
Ala | Pro Ala Ser | Gly | Thr | Cys | Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met Pro Pro |
65 | 70 | 75 80 | |||
Glu | Ala Val Asn | Met | Ser | Leu | Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser Pro Asn |
85 | 90 95 | ||||
His | Ser Gin Leu | Leu | Ala | Cys | Gly Pro Thr Val His Arg Ala Cys Gly |
100 | 105 110 | ||||
Glu | Asp Val Tyr | Ala | Gin | Gly | Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala His Ala |
115 | 120 125 | ||||
Gin | Pro Ile Gly | Thr | Val | Pro | Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro Asp Gin |
130 | 135 | 140 | |||
Glu | Met Asp Ile | Val | Phe | Leu | Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Ser |
145 | 150 | 155 160 | |||
Asn | Asp Phe Arg | Lys | Met | Lys | Asp Phe Val Arg Ala Val Met Asp Gin |
165 | 170 175 | ||||
Phe | Lys Asp Thr | Asn | Thr | Gin | Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser Asn Val |
180 | 185 190 | ||||
Leu | Val Thr His | Phe | Thr | Phe | Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser Asn Pro |
195 | 200 205 | ||||
Gin | Gly Leu Val | Glu | Pro | Ile | Val Gin Leu Thr Gly Leu Thr Phe Thr |
210 | 215 | 220 | |||
Ala | Thr Gly Ile | Leu | Lys | Val | Val Thr Glu Leu Phe Gin Thr Lys Asn |
225 | 230 | 235 240 | |||
Gly | Ala Arg Glu | Ser | Ala | Lys | Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr Asp Gly |
245 | 250 255 | ||||
Gin | Lys Tyr Lys | Asp | Pro | Leu | His Tyr Ser Ala Val Ile Pro Gin Ala |
260 | 265 270 |
229 • · · ·
Glu Gin Ala | Gly | Ile | Ile | Arg Tyr Ala 280 | Ile | Gly | Val | Gly 285 | Asp | Ala | Phe | |
275 | ||||||||||||
Gin Lys | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin Glu Leu | Asp | Thr | Ile | Ala | Ser | Glu | Pro |
290 | 295 | 300 | ||||||||||
Pro Asp | Ala | His | Val | Phe | Gin Val Asp | Asn | Phe | Ser | Ala | Leu | Ser | Ser |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||
Ile Gin | Lys | Gin | Leu | Tyr | Asp Arg Ile | Phe | Ala | Val | Glu | Gly | Thr | Leu |
325 | 330 | 335 | ||||||||||
Ser Ser | Ala | Ser | Thr | Ser | Phe Gin His | Glu | Met | Ser | Gin | Glu | Gly | Phe |
340 | 345 | 350 | ||||||||||
Ser Ser | Leu | Leu | Thr | Thr | Glu Gly Pro | Val | Leu | Gly | Ala | Val | Gly | Ser |
355 | 360 | 365 | ||||||||||
Phe Asp | Trp | Ser | Gly | dy | Ala Phe Leu | Tyr | Pro | Pro | Gly | Gly | Ser | Pro |
370 | 375 | 380 | ||||||||||
Thr Phe | Ile | Asn | Met | Ser | Gin Gin Asn | Val | Asp | Met | Arg | Asp | Ser | Tyr |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||
Leu Gly | Glu | Glu | Gly | Val | Gly Val Gly | Thr | Gly | Gly | Ser | |||
405 | 410 | |||||||||||
(2) INFORMACE 0 | SEK | . ID. | . Č.:102: | |||||||||
(i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | |||||||||||
(A) DÉLKA: | : 1484 párů baží | |||||||||||
(B) TYP: nukleová kyselina | ||||||||||||
(C) POČET | ŘETĚZCŮ: jeden |
(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS
(xi) | (B) UMÍSTĚNÍ: | 1..1482 | |||
popis ; | SEKVENCE: | : SEK. ID. Č. | .:102: | ||
GAT | GTC | CAG AGC | TCC ATC | AGC TAT GAT | CTG GCA CTG GAC CCA GGC CGC |
Asp 1 | Val | Gin Ser | Ser Ile 5 | Ser Tyr Asp | Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg 10 15 |
CTG | GTC | TCT CGG | GCC ATT | TTT CAA GAG | ACC CAG AAC CAG ACT TTA ACT |
Leu | Val | Ser Arg 20 | Ala Ile | Phe Gin Glu 25 | Thr Gin Asn Gin Thr Leu Thr 30 |
CGA | AGG | AAG ACC | CTG GGG | CTG GGG CGT | CAC TGT GAA ACC ATG AGG CTA |
Arg | Arg | Lys Thr 35 | Leu Gly | Leu Gly Arg 40 | His Cys Glu Thr Met Arg Leu 45 |
CTT | TTG | CCA GAC | TGC GTA | GAG GAC GTG | GTG AAC CCC ATC GTC CTG CAC |
Leu | Leu 50 | Pro Asp | Cys Val | Glu Asp Val 55 | Val Asn Pro Ile Val Leu His 60 |
230 ·· ···· ·» ···· ·» • · ···· ··· « · · · · ·· · · · · · ·
CTC AAC | TTC Phe | TCC Ser | CTG Leu | GAG Glu 70 | GGA CAG | CCA Pro | ATC Ile | CTC Leu 75 | TCA Ser | TCC Ser | CAG Gin | AAT Asn | CTG Leu 80 | 240 | ||
Leu 65 | Asn | Gly | Gin | |||||||||||||
CGC | CCT | GTG | CTG | GCC | ACG | GGC | TCG | CAG | GAC | CAC | TTC | ATT | GCC | TCC | CTC | 288 |
Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Thr | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Phe | Ile | Ala | Ser | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
CCC | TTT | GAG | AAG | AAC | TGC | GGA | CAA | GAT | CGC | CTG | TGT | GAG | GGG | GAC | CTG | 336 |
Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | Gly | Gin | Asp | Arg | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
AGC | ATC | AGC | TTC | AAC | TTC | TCG | GGC | TTG | AAT | ACC | CTG | CTG | GTG | GGG | CTC | 384 |
Ser | Ile | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Asn | Thr | Leu | Leu | Val | Gly | Leu | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TCC | CTG | GAG | CTC | ACA | GTG | ACA | GTG | ACC | GTG | CGG | AAT | GAG | GGC | GAG | GAC | 432 |
Ser | Leu | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Arg | Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
TCC | TAT | GGG | ACC | GCC | ATC | ACC | CTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GGG | CTA | TCC | TAC | 480 |
Ser | Tyr | Gly | Thr | Ala | Ile | Thr | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
AGG | CGG | GTG | TCG | GGC | CAG | ACA | CAA | CCC | TGG | CAG | CGC | CCC | CTG | CAC | CTC | 528 |
Arg | Arg | Val | Ser | Gly | Gin | Thr | Gin | Pro | Trp | Gin | Arg | Pro | Leu | His | Leu | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GCA | TGT | GAG | GCT | GTA | CCT | ACC | GAG | AGC | GAG | GGC | TTG | AGG | AGT | ACC | AGC | 576 |
Ala | Cys | Glu | Ala | Val | Pro | Thr | Glu | Ser | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Thr | Ser | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TGC | AGC | GTC | AAC | CAC | CCC | ATC | TTC | CAA | GGG | GGT | GCT | CAG | GGC | ACT | TTC | 624 |
Cys | Ser | Val | Asn | His | Pro | Ile | Phe | Gin | Gly | Gly | Ala | Gin | Gly | Thr | Phe | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
GTA | GTC | AAG | TTC | GAT | GTC | TCC | TCC | AAG | GCC | AGC | CTG | GGT | GAC | AGG | TTG | 672 |
Val | Val | Lys | Phe | Asp | Val | Ser | Ser | Lys | Ala | Ser | Leu | Gly | Asp | Arg | Leu | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
CTC | ATG | GGG | GCC | AGT | GCC | AGC | AGT | GAG | AAT | AAT | AAG | CCT | GCG | AGC | AAC | 720 |
Leu | Met | Gly | Ala | Ser | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Pro | Ala | Ser | Asn | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
AAG | ACC | TCC | TTT | GAG | CTG | GAA | CTG | CCA | GTG | AAA | TAC | GCT | GTC | TAC | ATG | 768 |
Lys | Thr | Ser | Phe | Glu | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala | Val | Tyr | Met | |
245 | 250 | 255 |
ATG ATC | ACA Thr | AGG Arg 260 | CAC His | GAA Glu | GGC Gly | TCC ACC AGG | TTC Phe | TTC Phe | AAC Asn | TTT Phe 270 | TCC Ser | ACT Thr | 816 | |||
Met | Ile | Ser | Thr 265 | Arg | ||||||||||||
TCC | GCT | GAG | AAG | AGC | AGC | AAA | GAG | GCC | GAG | CAC | CGC | TAT | CGG | GTG | AAC | 864 |
Ser | Ala | Glu | Lys | Ser | Ser | Lys | Glu | Ala | Glu | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
AAC | CTG | AGT | CTG | CGA | GAT | GTG | GCC | GTC | AGC | GTG | GAC | TTC | TGG | GCC | CCC | 912 |
Asn | Leu | Ser | Leu | Arg | Asp | Val | Ala | Val | Ser | Val | Asp | Phe | Trp | Ala | Pro | |
290 | 295 | 300 |
231
GTG Val 305 | CAG Gin | CTG AAC | GGA GCA GCT | GTG Val | TGG GAC | GTG GCG Val Ala 315 | GTG Val | GAG Glu | GCC Ala | CCT Pro 320 | 960 | |||||
Leu | Asn | Gly | Ala 310 | Ala | Trp | Asp | ||||||||||
GCC | CAG | AGC | CTG | CCC | TGT | GCG | CGG | GAG | AGG | GAA | CCT | CCG | AGG | ACC | TCT | 1008 |
Ala | Gin | Ser | Leu | Pro | Cys | Ala | Arg | Glu | Arg | Glu | Pro | Pro | Arg | Thr | Ser | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
GAC | CTG | AGC | CGG | GTC | CCG | GGG | AGT | CCC | GTG | CTG | GAC | TGC | AGC | GTT | GCG | 1056 |
Asp | Leu | Ser | Arg | Val | Pro | Gly | Ser | Pro | Val | Leu | Asp | Cys | Ser | Val | Ala | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
CAC | TGC | CTG | AGG | TTC | CGC | TGC | CAC | ATC | CCC | TCC | TTC | AGC | GCC | AAG | GAG | 1104 |
His | Cys | Leu | Arg | Phe | Arg | Cys | His | Ile | Pro | Ser | Phe | Ser | Ala | Lys | Glu | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
GAG | CTC | CAC | TTC | ACC | CTG | AAG | GGC | AAC | CTC | AGC | TTC | GCC | TGG | GTC | AGC | 1152 |
Glu | Leu | His | Phe | Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Ala | Trp | Val | Ser | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
CAG | ATG | CTG | CAA | AAG | AAG | GTG | TCG | GTG | GTG | AGT | GTG | GCC | GAG | ATC | ACC | 1200 |
Gin | Met | Leu | Gin | Lys | Lys | Val | Ser | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | Ile | Thr | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
TTC | AAC | AGG | GCC | GTG | TAC | TCC | CAA | GTT | CCG | GGC | GAG | GAG | CCC | TTT | ATG | 1248 |
Phe | Asn | Arg | Ala | Val | Tyr | Ser | Gin | Val | Pro | Gly | Glu | Glu | Pro | Phe | Met | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
AGA | GCC | CAG | GTG | GAG | ACG | GTG | CTG | GAG | GAG | TAT | GAG | GAG | CAC | GAC | CCC | 1296 |
Arg | Ala | Gin | Val | Glu | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Tyr | Glu | Glu | His | Asp | Pro | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
GTC | CCC | CTG | GTG | GTG | GGC | AGC | TGT | GTG | GGC | GGC | CTG | CTG | CTG | CTG | GCT | 1344 |
Val | Pro | Leu | Val | Val | Gly | Ser | Cys | Val | Gly | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
CTC | ATC | TCA | GCC | ACC | CTG | TAC | AAG | CTT | GGC | TTC | TTC | AAG | CGC | CGG | TAC | 1392 |
Leu | Ile | Ser | Ala | Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | Arg | Tyr | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
AAG | GAG | ATG | CTG | GGC | GAG | AAA | CCG | GGA | GAC | GCG | GCC | ACC | TTC | CCC | GGG | 1440 |
Lys | Glu | Met | Leu | Gly | Glu | Lys | Pro | Gly | Asp | Ala | Ala | Thr | Phe | Pro | Gly | |
465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
GAG | GAC | GCC | AGC | TGC | GGG | GCT | TCA | GAT | TTG | CCT | TTG | TCC | CAG | 1482 | ||
Glu | Asp | Ala | Ser | Cys | Gly | Ala | Ser | Asp | Leu | Pro | Leu | Ser | Gin | |||
485 | 490 |
TG 1484 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:103:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
232 • · « ·
• • • • · · · | • • « • • | • · • · • · • · | • • • · • · | • • · < • < | |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. | Č. :103: | ||||
Asp Val Gin Ser Ser Ile Ser Tyr | Asp Leu Ala Leu | Asp | Pro | Gly | Arg |
1 5 | 10 | 15 | |||
Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gin | Glu Thr Gin Asn | Gin | Thr | Leu | Thr |
20 | 25 | 30 | |||
Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly | Arg His Cys Glu | Thr | Met | Arg | Leu |
35 40 | 45 | ||||
Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp | Val Val Asn Pro | Ile | Val | Leu | His |
50 55 | 60 | ||||
Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gin | Pro Ile Leu Ser | Ser | Gin | Asn | Leu |
65 70 | 75 | 80 | |||
Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser | Gin Asp His Phe | Ile | Ala | Ser | Leu |
85 | 90 | 95 | |||
Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gin | Asp Arg Leu Cys | Glu | Gly | Asp | Leu |
100 | 105 | 110 | |||
Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly | Leu Asn Thr Leu | Leu | Val | Gly | Leu |
115 120 | 125 | ||||
Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val | Thr Val Arg Asn | Glu | Gly | Glu | Asp |
130 135 | 140 | ||||
Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu | Tyr Tyr Pro Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr |
145 150 | 155 | 160 | |||
Arg Arg Val Ser Gly Gin Thr Gin | Pro Trp Gin Arg | Pro | Leu | His | Leu |
165 | 170 | 175 | |||
Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu | Ser Glu Gly Leu | Arg | Ser | Thr | Ser |
180 | 185 | 190 | |||
Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe | Gin Gly Gly Ala | Gin | Gly | Thr | Phe |
195 200 | 205 | ||||
Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser | Lys Ala Ser Leu | Gly | Asp | Arg | Leu |
210 215 | 220 | ||||
Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser | Glu Asn Asn Lys | Pro | Ala | Ser | Asn |
225 230 | 235 | 240 | |||
Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu | Pro Val Lys Tyr | Ala | Val | Tyr | Met |
245 | 250 | 255 | |||
Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser | Thr Arg Phe Phe | Asn | Phe | Ser | Thr |
260 | 265 | 270 | |||
Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu | Ala Glu His Arg | Tyr | Arg | Val | Asn |
275 280 | 285 | ||||
Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala | Val Ser Val Asp | Phe | Trp | Ala | Pro |
290 295 | 300 |
233 • · ··· ···· • · · · · · · · · · · · • · ···· · · · ····· ·· ·· · · · ·
Val 305 | Gin Leu Asn | Gly Ala Ala 310 | Val | Trp Asp Val 315 | Ala | Val | Glu | Ala | Pro 320 | ||||||
Ala | Gin | Ser | Leu | Pro | Cys | Ala | Arg | Glu | Arg | Glu | Pro | Pro | Arg | Thr | Ser |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asp | Leu | Ser | Arg | Val | Pro | Gly | Ser | Pro | Val | Leu | Asp | Cys | Ser | Val | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
His | Cys | Leu | Arg | Phe | Arg | Cys | His | Ile | Pro | Ser | Phe | Ser | Ala | Lys | Glu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Glu | Leu | His | Phe | Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Ala | Trp | Val | Ser |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Gin | Met | Leu | Gin | Lys | Lys | Val | Ser | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | Ile | Thr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Phe | Asn | Arg | Ala | Val | Tyr | Ser | Gin | Val | Pro | Gly | Glu | Glu | Pro | Phe | Met |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Arg | Ala | Gin | Val | Glu | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Tyr | Glu | Glu | His | Asp | Pro |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Val | Pro | Leu | Val | Val | Gly | Ser | Cys | Val | Gly | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Leu | Ile | Ser | Ala | Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | Arg | Tyr |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Lys | Glu | Met | Leu | Gly | Glu | Lys | Pro | Gly | Asp | Ala | Ala | Thr | Phe | Pro | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Glu | Asp | Ala | Ser | Cys | Gly | Ala | Ser | Asp | Leu | Pro | Leu | Ser | Gin |
485 490
O
234
I · · · · · · · · ·· · · • · · · · · · · • ·· · ···· ···· ·· ·· ·· ·· /ř
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Hybridom označený 199M.2. Monoklonální protilátka sekretovaná hybridomem podle nároku 1.235 er < Lft ř*» r^o σι ovo uíncoHHH o r»co O> ©Y οί XXX o rxco CM CM CMI · · · • · · · • · ·» ·· or^coOY 0Y 0Y OJ 04 CM αϋ TF-GT—VLL LSVLASYHGF NLDVEEPTIF QEDAGGFGQS VVQFGGSRLV CDlln MA-LR—VLL LTALTLCHGF NLDTENAMTF QENARGFGQS VVQLQGSRVV CDllc MTRTRAALLL FTALATSLGF NLDTEELTAF RVDSAGFGDS VVQYANSMVVΧ«Λ4Ζ)OOOOOOOOOCZ)tZ)CZ)X UJ LU oso.fi.zoš oooO-fiSO www a. a. o. oxx ooo
0X0 xaso XXX XX2 zoas UL.L. XXX <00 co fi.fi.fi. O LU X <<< f—xz ooo z lu as ooo XUIX XOX <z)c/)cz) ss as >— ouoz a.aso > > X Xh-t/ϊ 0X0 F-O OS OOO ZH< XXX <<CZ) mJ wi ZZZ <<< o x> XXX zoo 0.0.0. <CZ)CZ) OOO ooo >XO XXX OLUX > > s> h-XOS ooo XQSZ ooo ooo ř—H-H www HO.)- οχσ) >>> o< XOO h-cofl. HX2S >->-> LU O 0 oxo —JXO XXX SfiS i LUXO HWW XXX 1 O 1 U.UL. OO< X>X osacH OOO HHH ooo cncoa. O LU CO <<< <X< ooo ΣΣη f— ř— ř— xx< 0X0 XZ>- XOO LU-JU.Uooo oooΣ(Ζ)< ooo unoo XXX xoo XXX ooo OXZ «u HFF XXH OZX ooo ooo cz)xS2 Sí í C/)>O >X z >->->- x x> >->-> <oo (ΛΗΣ zx< fi.fi.CZ) xoo ooo ooo LU LUX XXX ooz §g3 ooo XXCZ) >·>> OCZ)O zzx a.J ^aJ ^.J ooo zoo ooo OOO oxco cqcz)cz) zuno >H-UI □ ΗΙΛ >-xx ooo xoz KH hH FH oxx zzz X Zx CZ)CZ)CZ) cz)zz oxz ooo —J ooo xxuo ooo zzz XXI·— CZ)(Z)CZ) unzx ooo sss XXX ooo xzz X X X ooo ooo xox XXX > >X ooo XXX XXX > »-4 FH <<< ooo OLUX M>H xut *UJN co oXLUXXXXoas XXX <<< ooo ooo zoo <Z)fi.CZ) oxx ZCZXZ) XXX =®§ xox xxx tfct χ χ χ XXX zzz ZXX <<< CZ) Z O α υ BQ u CQ O a o CQ O X X X X X X X X X X X X XX XX X X XX ooo QOO QOO QOO QOO es oo esoo boo BOO 800 * ·· · ao QELNTISSAP PQDIIVFKVDN FAALGSIQKQ LQEKIYAVEG TQSRASSSFQ 346 COllB QELNTIASKP PRDHVFQVNN FEALKTIQNQ LREKIFAIEG TQTGSSSSFE 347 CDllc KELNDIASKP SQEHIFKVED FDALKDIQNQ LKEKIFAIEG TETISSSSFE 348 oso 9* ΟΎ O po po ro /ko r^-co «5Γ «3 «ΡA onoCTí 0) «3- <0 <3·«3·<ΓLOLOLO>co> LUZUJ 0.0.0. 0LUUJ zaz <<«C -J-JU UJUIUI ω>ω 0.0.0. 000 a osa *ι/>Σ 000 0.0.0. CO0 CO osujS 2> <<< ΣΣΣ CO CO CO 000 aza 0 0 0 0 p-4 PH OS 0 OS 000 U.U.U. CO 0 CO 000 ^p 0 Η- H-H- 000 ca o O.COO. 000 os os os 000 CO^CO 0 Kw 0 0 0 bJ i^J tUl SU1S LlLlLl 000 z^z 0jE0 LUUJUI 000 o. co o. >->->- LU00 0.00. 000 SES SC SC >->>- £2—iš Z sc ss 0 0 0 -J—I-J 0 0 0 o. cl o. 000 LlLlLl 0 1—4 0 <<< 000 o< sss 000 000 000 HHW 000 000 >->-> hJ «j ÍjIjj co < co 0 0 0 0.0.0.000 000 CO COíO000LlLlLl >>->αααo. o. co COCOCOCOU.0ÍL 000 0 0 Η- 000 CO CO CO —J—I—l ΟΟ CO CO LL U.U. 000 0 0 s* 000 os os os 0 0 0 —1 —10 0Z0 000 <0< zcoco coco0 223 0CO0 000 000 0.0.0. .U—1—1 ^0 ^0 ^0 Ζ0Ζ U.00 0Z0 000 000 0 0.0. ^sz^s 000 000 3. OS COCOCO lululj co sc o 000 000 000 ZCOO. <0<: 0 00 OS>0 0 0 0 000 CO CO CO Uhul <o ukclu 0<0 355 <<< oss 01 0) 0* UOLOLO0^0 cococoCO00 z os o: aaaCOCOCO cococo 0.0.0. cococo PH 0 0 00CO co co o. 000 COCO-J sss0<< co<co LlLlU. aaa «s sc sc co co to 000 ^B 000 LlLlU. 00Ll 000 co«cco 00 · 0 0 0 000 000 222 000 LU Ul LU 000 WHH 0OS3 s> 0 ^p 000 co<co 000 0<OS *5 «£«5 COCO< aaa 0 0 OSOČ OS 000 ΣΣΣ os z os 000 003 as os os LUUJUI ΣΣΣ 000 SC sc z z s 0 aaa ososcs UJQUJ o o a o a o a o a o tH rH 0 0 HH 0 0 0 0 0 «Η 0 0 0 0 0 0 0 0 oao aaa aaa aaa aaa «00 «00 «00 «00 «00 DQ *UlNDOO αο GLMDLAVGAR GQVLLLRSLP VLKVGVAMRF SPVEVAKAVY RCWEEKPSAL 646 CDUb GLVDLTVGAQ GHVLLLRSQP VLRVKAIMEF NPREVARNVF ECNDQVVKGK 647 CDllc GLVDLAVGAR GQVLLLRTRP VLWVGVSMQF IPAEIPRSAF ECREQVVSEQ 6477SS CXi (7) © ©toto ’Τ’Τ’Τ «rrxb*. CO 00 CO©©Z oo©to <«s:© ©©o ZZZ ZZZ ©©© ooo oo© b—b-b— 00«C<£ > zz2 ©oo> ZZZ zzo zoo© i—< —J —J b— >» -J —1—l-J -I3-J <c toto 2S2 ZZZ ZZZ b-OtO oozz 1 toz 1-4 > l-H Zb—Z ©az ©OO 1 ©to <<< Z©© 0 0—1 zoo© 1 zzz >1 ©00© zz© 1 ©© oo to z toxz oo© >-ZZ ©200 (OtOb— ZZZ 00©© Z z u. tototo ©o© zzz z z z —JU.LL < —1© ©zo ©©© ZOOZ 335 333 QQ© OO —1 2ZZ —IO —1 O > O h-11—( O ZZZ (OOOH © © (O i» 1—4 O ©00© OOO Q©Z ©Q © zoo ©©Z toto< žš2© ZZZ 2 >· >· (0(0(0 ZZZ b- b— © > > H-4 © 1 1 Z I 1 © ι i © 1 1 Z© —I > > > ©©© ooo ZZ© ZHH >zoo © © © ©o© tooo«c ©z© ©a© ©ZZ <©< to>to ZZZ ZZZ ZZ© (0(0(0 00© > O > §z° ©©s ©Z2 ZZZ ©o© >-Z(O ZZZ 0 1-4 0 ©zoo ©©© ©ZZ © © © ©o© ZZZ Z SC Z 00©© ZZ© ©©Z ooo ZZZ |m< 35 sz cc 1 ZOO ©o© ZZZ >Oh ZZZ 1 z© ©©© ZZZ ©©© >©© ooo zzz ZZZ ©Z© totoz ©Z —1 ©©z ©z© © © © oo© QQZ © © 2 (O ©to tototo ztoto -JZ^ ZZZ <<< ©©o (O©© (O © (O totoz ©©© 2 © 2 ttfc ZZZ ©©© 00 to to ZZ 1 ZZZ oo© w©< ©© Z oo© •CQQ ©zz sc SB »-(>»-4 OOO ©o© 3K3 z©© ©2© ©©© oo<c 5 > > > 1 00© ©©© «! mJ ©© ©©2 1 ©to ooo Soz >z ©z© >>© 33 S©z Zb-> ©ZZ Zh*> mJ >©< ©tOZ ©z<3 ©ΟΖ 1—zoo 5* 2 •Z SC 2S Z (O 1 & Z ©Z© ©©> ozo ZZ Z ZZZ ©toto <<© ©©00 ©© © ©z© zzo Z Z © zooz z z z tozz ooo o o O U a a a u a a © © ©© © © © © ©© © © © © © © © © © © Q fi © OO© o©o a©o o © © BOO BOO BOO BOO BOO o *LUNQQO ·· ··I · · II · ·· β · · · « • · « ·· ·· <· ···· od DRHLHRASAS SENNKASSSK ATFQLELPVK YAVYTHISRQ EESTKYFNFA 938 CDUb NKLLLKANVT SENNHPRTNK TEFQLELPVK YAVYMVVTSH GVSTKYLNFT 943 CDllc DRLLLIANVS SEHNIPRTSK TIFQLELPVK YAVYIVVSSH EQFTKYLNFS 941 tft 0 O 0 <WHO γη ro ro o un to 0 τ-4 0 HHH00Z <0(0ooo zzz ΣΣΣ > 0 to o co £££ 0Q0 000 <<< 000 to o. co 0O0 S00 0.0.0. ooo ZZZ > 0> OOO ooo 0.0.0 0. 0.0. ooo -U-J—l 000 qíOZ 0—10 000 000 L.WU. 00> 000 0ΖΖ 000 0O-J 0 0 000 000 OOO CO (O CO 000 0Z0 0>0 0 0 0 SS5 > <<< OZO 0 0 0 000 0 0 0 CO 1 CO (O CO H-—Jw 0 1 eJ 000 000 000 O. 1 0 O O. O OZO 000 <<< 0 1 CO z>z 0>0 <<< 000 Z0O. HJH 2E > 0 0 000 CL. O-Z co to co 000 to CO (O 000 < l 1 00> to<z 000 cozo > 000 0 1 1 200 >0> <00 000 0 1 1 00CO to 1 1 OtOO H JH SzS >> 0 0 0 1 1 zzz O0Z CO CO CO 00CO 000 tooo 533 a = § co co to 000 O<Q000 000 000 0CO0 z>> to0O zzz 000 0 0 HH 0ZO HHHHHH 0 1 1 zcoz CO CO CO 000 0 1 l 0(00 000 Ζ0Ζ 000 < Z 0 zoo 000 sss 000 <00 000 1 1 z zoz 00< 000 3S SC Z 1 1 0 3. Z SE ΖΖ0 000 0O.Z 1 1 0 Z0^ (0(0(0 S0ŠS 1 1 < 0^0 000 1 1 0 0>> CO 0 CO zzz 1 1 O ^ZZ 0ZCO 000 1 1 0 Scócó 000 000 1 1 z 1 0Z 000 oo< LU Z0UJ 1 (0—4 £S£ LUZtt 0COCO X00 0(00 000 000 0Z0 000 1 1 1 1 0 cozz 000 X00 OOO 0 1 i co co co 000 000 0 1 1 H<0 (0(00 000 <(O< 0ΧΣ 0 u a O a 0 a o a o 0 0 0 0 0 0 00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 ooa 000 ooo OOO QQQ a 00 aoo BOO BOO BOO oX.LJNCO
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/605,672 US5817515A (en) | 1993-12-23 | 1996-02-22 | Human B2 integrin alpha subunit antibodies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ328697A3 true CZ328697A3 (cs) | 1998-07-15 |
CZ287921B6 CZ287921B6 (cs) | 2001-03-14 |
Family
ID=24424704
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19973286A CZ287921B6 (cs) | 1996-02-22 | 1997-02-24 | Hybridom označený 199M a monoklonální protilátka sekretovaná tímto hybridomem |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5817515A (cs) |
EP (1) | EP0835301B1 (cs) |
JP (1) | JP2001526524A (cs) |
CN (1) | CN1103812C (cs) |
AT (1) | ATE293685T1 (cs) |
AU (1) | AU723110B2 (cs) |
BR (1) | BR9702101A (cs) |
CA (1) | CA2218755C (cs) |
CZ (1) | CZ287921B6 (cs) |
DE (1) | DE69733051D1 (cs) |
FI (1) | FI974018A (cs) |
HU (1) | HU223977B1 (cs) |
IL (1) | IL122011A (cs) |
NO (1) | NO318764B1 (cs) |
PL (1) | PL187013B1 (cs) |
RU (1) | RU2183671C2 (cs) |
SK (1) | SK283135B6 (cs) |
WO (1) | WO1997031099A1 (cs) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5837478A (en) * | 1993-12-23 | 1998-11-17 | Icos Corporation | Method of identifying modulators of binding between and VCAM-1 |
US6620915B2 (en) * | 1993-12-23 | 2003-09-16 | Icos Corporation | Monoclonal antibodies specific for integrin α-d subunit |
US20030055231A1 (en) * | 1998-10-28 | 2003-03-20 | Jian Ni | 12 human secreted proteins |
US6663863B2 (en) | 2000-03-17 | 2003-12-16 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Method of inhibiting stenosis and restenosis |
WO2023235971A1 (en) * | 2022-06-08 | 2023-12-14 | The Regents Of The University Of California | Antibodies and immunotherapies that target the active conformation of integrin beta 2 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4271139A (en) * | 1978-03-27 | 1981-06-02 | Hiram Hart | Scintillation proximity assay |
US4568649A (en) * | 1983-02-22 | 1986-02-04 | Immunex Corporation | Immediate ligand detection assay |
WO1992006697A1 (en) * | 1990-10-23 | 1992-04-30 | Repligen Corporation | Anti-inflammatory composition |
AU667487B2 (en) * | 1991-10-01 | 1996-03-28 | General Hospital Corporation, The | Preventing allograft rejection with antibodies to adhesion molecules |
WO1993006865A1 (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-15 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Treatment of ocular inflammation by blockage of cell adhesion molecules |
US5470953A (en) * | 1993-12-23 | 1995-11-28 | Icos Corporation | Human β2 integrin α subunit |
JPH09512252A (ja) * | 1994-04-12 | 1997-12-09 | ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 呼吸性ウイルス感染の処置における細胞間接着分子/受容体相互作用を遮断する薬剤の使用 |
-
1996
- 1996-02-22 US US08/605,672 patent/US5817515A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-02-24 SK SK1409-97A patent/SK283135B6/sk unknown
- 1997-02-24 PL PL97323195A patent/PL187013B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 JP JP53033797A patent/JP2001526524A/ja active Pending
- 1997-02-24 EP EP97906713A patent/EP0835301B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-24 DE DE69733051T patent/DE69733051D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-24 BR BR9702101A patent/BR9702101A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 RU RU97119175/13A patent/RU2183671C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 WO PCT/US1997/002713 patent/WO1997031099A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-24 CA CA002218755A patent/CA2218755C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-24 HU HU9901579A patent/HU223977B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 AT AT97906713T patent/ATE293685T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 CZ CZ19973286A patent/CZ287921B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 IL IL12201197A patent/IL122011A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 CN CN97190406A patent/CN1103812C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-24 AU AU21333/97A patent/AU723110B2/en not_active Ceased
- 1997-10-21 FI FI974018A patent/FI974018A/fi unknown
- 1997-10-21 NO NO19974852A patent/NO318764B1/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69733051D1 (de) | 2005-05-25 |
RU2183671C2 (ru) | 2002-06-20 |
EP0835301A1 (en) | 1998-04-15 |
NO974852D0 (no) | 1997-10-21 |
HU223977B1 (hu) | 2005-03-29 |
AU723110B2 (en) | 2000-08-17 |
AU2133397A (en) | 1997-09-10 |
IL122011A (en) | 2001-05-20 |
HUP9901579A2 (hu) | 1999-08-30 |
PL187013B1 (pl) | 2004-04-30 |
CA2218755C (en) | 1999-08-31 |
FI974018A (fi) | 1997-12-03 |
WO1997031099A1 (en) | 1997-08-28 |
PL323195A1 (en) | 1998-03-16 |
JP2001526524A (ja) | 2001-12-18 |
FI974018A0 (fi) | 1997-10-21 |
SK283135B6 (sk) | 2003-03-04 |
SK140997A3 (en) | 1998-09-09 |
HUP9901579A3 (en) | 2001-10-29 |
NO974852L (no) | 1997-12-19 |
CA2218755A1 (en) | 1997-08-28 |
IL122011A0 (en) | 1998-03-10 |
CZ287921B6 (cs) | 2001-03-14 |
CN1189851A (zh) | 1998-08-05 |
NO318764B1 (no) | 2005-05-02 |
BR9702101A (pt) | 1999-07-20 |
EP0835301B1 (en) | 2005-04-20 |
ATE293685T1 (de) | 2005-05-15 |
CN1103812C (zh) | 2003-03-26 |
US5817515A (en) | 1998-10-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6432404B1 (en) | Methods of inhibiting locomotor damage following spinal cord injury with α D-specific antibodies | |
AU740106B2 (en) | Novel human beta2 integrin alpha subunit | |
EP0686161B1 (en) | Novel human beta2 integrin alpha subunit | |
US20060280739A1 (en) | Novel human beta-2 integrin alpha subunit | |
AU2001296839A1 (en) | Use of anti-human integrin alpha D antibodies to treat spinal cord injury | |
AU775300B2 (en) | Method for inhibiting macrophage infiltration using monoclonal anti-alpha-d-antibodies | |
AU723110B2 (en) | Human beta 2 integrin alpha subunit | |
US5728533A (en) | Human β2 integrin αsubunit | |
US5831029A (en) | Human β2 integrin α subunit | |
Gallatin et al. | Human beta2 integrin alpha subunit | |
EP2182008A2 (en) | Monoclonal anti alpha-D (ITGAD) antibodies for use in the treatment of inflammation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090224 |