CZ328697A3

CZ328697A3 - Alfa-podjednotka beta-2-integrinu člověka

Info

Publication number: CZ328697A3
Application number: CZ973286A
Authority: CZ
Inventors: Michael W. Gallatin; Der Vieren Monica Van
Original assignee: Icos Corporation
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 1998-07-15
Also published as: NO974852D0; JP2001526524A; HU223977B1; SK283135B6; WO1997031099A1; US5817515A; HUP9901579A3; SK140997A3; CN1189851A; CA2218755A1; PL187013B1; EP0835301A1; PL323195A1; AU723110B2; EP0835301B1; ATE293685T1; BR9702101A; NO974852L; AU2133397A; NO318764B1

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje klonování a expresi polynukleotidů kódujících novou a podjednotku lidského integrinu β₂, označovanou jako a_d, která je strukturně podobná známým a podjednotkám lidského integrinu β₂, označovaným CDlla, CDllb a CDllc. Vynález se rovněž týká polynukleotidů, které vykazují homologii k sekvenci kódující lidský a_d, izolovaných z jiných živočišných druhů.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou třídou molekul asociovaných s membránou, které se aktivně účastní procesu buněčné adheze. Integriny jsou transmembránové heterodimery skládající se z podjednotky a, která je nekovalentně asociována s podjednotkou β. V současné době je známo přinejmenším čtrnáct podjednotek a a osm podjednotek β [shrnuto v Springer, Nátuře 346:425 až 434 (1990)]. Podjednotky β jsou obvykle schopny asociace s více něž jednou podjednotkou a a heterodimery sdílející společnou podjednotku β vytvářejí v populaci integrinů jednotlivé podtřídy.

Jedna podtřída lidských integrinů, která je exprimována pouze na povrchu bílých krvinek, je charakterizována přítomností společné podjednotky β₂. Výsledkem této buněčně specifické exprese je skutečnost, že tyto integriny jsou obvykle označovány jako leukocytární integriny, Leu-CAM nebo leukointegriny. Vzhledem k přítomnosti společné podjednotky β₂, je jinou alternativou označovat tyto integriny • ·

• · ···· · jako integriny β₂. Podjednotka β₂ (CD18) byla již dříve izolována ve spojení s jednou ze tří rozdílných podjednotek a, označovaných CDlla, CDllb a CDllc. Izolace cDNA kódující lidský CD18 je popsána v publikaci Kishimoto a další, Cell 48:681 až 690 (1987). Podle oficiální nomenklatury WHO (Světová zdravotnická organizace) jsou tyto heterodimerní proteiny označovány jako CDlla/CDl8, CDllb/CD18 a

CDllc/CD18; v obecně používané nomenklatuře jsou tyto označovány jako LFA-1 (CDlla/CD18), Mac-1 nebo Mol (CDllb/CD18) a pl5095 nebo LeuM5 (CDllc/CD18) [Cobbold a další, v Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, strana 788 (1987)]. Bylo prokázáno, že a podjednotky CDlla, CDllb a CDllc lidského integrinu β₂ migrují při elektroforéze prováděné v redukujících podmínkách se zdánlivými molekulovými hmotnostmi přibližně 180 kD (CDlla), 155 kD (CDllb) a 150 kD (CDllc). DNA kódující tyto podjednotky již byly klonovány [CDlla, Larson a další, J. Cell Biol. 108:703 až 712 (1989); CDllb, Corbi a další, J. Biol. Chem. 263:12403 až 12411 (1988) a CDllc, Corbi a další, EMBO J. 6:4023 až 4028 (1987)]. Domnělé homology a a β řetězců lidského integrinu β₂, definované podle přibližné podobnosti molekulových hmotností, byly pomocí nejrůznějšleh metod identifikovány u jiných živočišných druhů, včetně opic a primátů [Letvin a další, Blood 61:408 až 410 (1983)], myší [Sanchez-Madrid a další, J. Exp. Med.154:1517 (1981)] a psů [Moore a další, Tissue Antigens 36:211 až 220 (1990)].

Ukázalo se, že absolutní molekulové hmotnosti předpokládaných homolog a a β řetězců lidského integrinu β₂, získaných z jiných živočišných druhů, se podstatně liší [viz. například Danilenko a další, Tissue Antigens 40:13 až 21 (1992)], a vzhledem k absenci informací týkajících se sekvence těchto homolog není možné s určitostí definovat vztah mezi podjednotkami lidského integrinu a podjednotkami identifikovanými u jiných druhů. Mezi různými druhy byly navíc pozorovány rozdíly v počtu zástupců u jednotlivých rodin proteinů. Uvažme například, že z králíků bylo izolováno více izotypů IgA než jich existuje u lidí [Burnett a další, EMBO J. 8:4041 až 4047 (1989) a Schneiderman a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:7561 až 7565 (1989)]. Obdobně, u lidí bylo dosud identifikováno přinejmenším šest variant metalothioneinů [Karin a Richards, Nátuře 299:797 až 802 (1982) a Varshney a další, Mol. Cell. Biol. 6:26 až 37, (1986)], zatímco u myší existují důkazy o přítomnosti pouze dvou takových variant [Searle a další, Mol. Cell. Biol. 4:1221 až 1230 (1984)]. Z existence více zástupců nějaké rodiny proteinů u jednoho druhu se tudíž nedá jednoznačně odvodit, že by odpovídající zástupci rodiny proteinů museli existovat i u jiných druhů.

Co se týká integrinů β₂, bylo u psů pozorováno, že předpokládaný psí protějšek (β₂) lidského CD18 je schopen vytvářet dimery až se čtyřmi rozdílnými podjednotkami a [Danilenko a další, viz. výše]. Výsledkem imunizace myší pomocí splenocytů získaných z organizmu psů bylo vytvoření monoklonálních protilátek, které imunoprecipitovaly s proteiny experimentálně označenými jako psí homologa k lidským CD18, CDlla, CDllb a CDllc; tato homologie byla především založena na zjištění podobných, ale ne identických, molekulových hmotností. Další protilátka namířená proti splenocytům získaným z organizmu psů, označená Call.8H2, rozpoznávala a imunoprecipitovala se čtvrtou podjednotkou (psí) podobnou podjednotce a. Tato čtvrtá psí podjednotka je rovněž schopna asociace s podjednotkou β₂, ale má jedinečnou molekulovou hmotnost a je exprimována pouze na subpopulaci diferencovaných tkáňových makrofágů.

Výsledkem imunizace křečků pomocí dendritických buněk získaných z organizmu myší bylo vytvoření dvou monoklonálních protilátek namířených proti integrinům [Metlay a další, J. Exp. Med. 171:1753 až 1771 (1990)]. Jedna z těchto · · · · · • · · ·· ·» protilátek, označená 2E6, imunoprecipitovala převážně s heterodimerem tvořeným podjednotkami o zdánlivých molekulových hmotnostech 180 kD a 90 kD, a v menši míře pak s proteiny o zdánlivých molekulových hmotnostech v rozmez! 150 až 160 kD. Druhá z těchto protilátek, označená N418, imunoprecipitovala s dalším zdánlivým heterodimerem tvořeným podjednotkami o zdánlivých molekulových hmotnostech 150 kD a 90 kD. Z výsledků studii, při kterých byla blokována buněčná adheze, bylo usouzeno, že protilátka 2E6 rozpoznává myši protějšek lidského CD18, zatímco molekulová hmotnost zjištěná u antigenu N418 naznačovala, že se jedná o myši homolog lidského CDllc/CDl8, další analýzy ukazuji, že tento myši antigen vykazuje distribuci ve tkáních, která neodpovídá distribuci pozorované u lidského CDllc/CD18.

Antigeny rozpoznávané prostřednictvím psí protilátky Call.8H2 a myší protilátky N418 mohou reprezentovat různé varianty (například s různým stupněm glykosylace nebo produkty různě sestřižených mRNA) již dříve identifikované psí nebo myší podjednotky a. Jinou možností je, že tyto antigeny mohou reprezentovat unikátní podjednotky α psích nebo myších integrinů. V momentě, kdy nejsou dostupné informace týkající se primární struktury, není možné tyto dvě alternativy odlišit.

U lidí je heterodimer CDlla/CDl8 exprimován na povrchu všech lymfocytů. Heterodimery CDllb/CD18 a CDllc/CD18 jsou v podstatě exprimovány pouze na povrchu monocytů, granulocytů, makrofágů a NK buněk (natural killer cells), nicméně CDllc/CDl8 byl rovněž detekován u některých typů Bbuněk. Obecně je možné říci, že CDlla/CD18 převažuje u lymfocytů, CDllb/CD18 u granulocytů a CDllc/CD18 na povrchu makrofágů [viz. souhrnný článek, Arnaout, Blood 75:1037 až 1050 (1990)]. Exprese řetězců α se nicméně různí v závislosti na stupni aktivace a diferenciace jednotlivých typů • · · φ • · • · · · • · · · · · « ···· · • · · · · · ··· <··· φ ·· ·· φφ *· buněk [viz. souhrnný článek, Larson a Springer, Immunol.

Rev. 114:181 až 217 (1990)].

Za použiti protilátek, které jsou schopny blokovat buněčnou adhezi zprostředkovanou pomoci integrinů β2, bylo prokázáno, že tyto integriny β₂ se v organizmu člověka účastni imunitní a zánětlivé reakce. Například heterodimery CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18 se aktivně účastní vazby NK buněk na buňky lymfomu a adenokarcinomu [Patarroyo a další, Immunol. Rev. 114:67 až 108 (1990)], akumulace granulocytů [Nourshargh a další, J. Immunol. 142:3193 až 3198 (1989)], úniku plazmy nezávislému na činnosti granulocytů [Arfors a další, Blood 69:338 až 340 (1987)], chemotaktické odpovědi stimulovaných leukocytů [Arfors a další, viz. výše] a adheze leukocytů k vaskulárnímu endothelu [Price a další, J. Immunol. 139:4174 až 4177 (1987) a Smith a další,

J. Clin. Invest. 83:2008 až 2017 (1989)]. Hlavní role integrinů β₂ při imunitních a zánětlivých reakcích je zřejmá z klinického syndromu označovaného jako nedostatečnost adheze leukocytů (LAD - leukocyte adhesion deficiency), mezi jehož klinické projevy patří neustále se opakující bakteriální infekce často ohrožující život. LAD je zapříčiněna různorodými mutacemi v podjednotce β₂ [Kishimoto a další, Cell 50:193 až 202 (1987)] a závažnost onemocnění koreluje se stupněm deficience v expresi podjednotky β₂. Vytvoření kompletního heterodimeru integrinů je mutací v podjednotce β₂znesnadněno [Kishimoto a další, Cell 50:193 až 202 (1987)].

Je zajímavé, že přinejmenším u jedné protilátky specificky namířené proti CD18 bylo prokázáno, že in vitro inhibuje tvorbu syncytií způsobenou virem lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1), ačkoliv přesný mechamizmus této inhibice je nejasný [Hildreth a Orentas, Science 244:1075 až 1078 (1989)]. Toto pozorování je v souladu s objevem, že hlavní receptor pro CDlla/CD18, kterým je ICAM-I, je rovněž • · • · · · a · • ·

povrchovým receptorem pro velkou skupinu rhinovirů [Greve a další, Cell 56:839 (1989)].

Význam vazebné aktivity integrinu β₂ při imunitní a zánětlivé reakci u lidí podtrhuje nezbytnost dosažení dokonalejšího poznání této třídy povrchových proteinů. Identifikace dosud neznámých členů této subpopulace, jakož i jejich odpovídajících receptorů, a produkce monoklonálních protilátek nebo jiných rozpustných látek, které mohou pozměnit biologickou aktivitu integrinů β₂, poskytnou prostředky (využitelné v praxi) pro terapeutickou intervenci při imunitních a zánětlivých odpovědích svázaných s integriny β₂.

Podstata vynálezu

Jedna stránka vynálezu popisuje nově purifikované a izolované polynukleotidy (například DNA a RNA transkripty, jak kódující tak antikódující vlákna) kódující novou a podjednotku lidského integrinu β₂, označovanou a_d, a její varianty (například deleční, adiční nebo substituční analoga), které mají vazebné a/nebo imunologické vlastnosti vlastní podjednotce a_d. Ve výhodném provedení vynálezu patří mezi tyto molekuly DNA, genomová DNA, cDNA a úplně nebo částečně syntetizované molekuly DNA. V současné době se jako nejvýhodnější polynukleotid jeví molekula DNA, jak je zobrazená v SEK. ID. Č.: 1, kódující polypeptid o sekvenci SEK. ID. Č.: 2. Vynález rovněž popisuje konstrukci rekombinatních plazmidových a virových konstruktů DNA (expresivní konstrukty), které obsahují kódující sekvenci pro a_d, přičemž tato sekvence kódující a_d je funkčně připojena k homolognímu nebo heterolognímu regulačnímu prvku/prvkům transkripce .

Vynález rovněž popisuje polynukleotidy izolované z myší a laboratorních potkanů, které vykazují homologií k polynukleotidům kódujícím lidský a_d. Ve výhodném provedení se • · jedná o polynukleotid získaný z myší, zobrazený v SEK. ID. Č.: 52; a o polynukleotid získaný z laboratorních potkanů zobrazený v SEK. ID. Č.: 54.

Jiná stránka vynálezu se týká prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných sekvencemi DNA podle vynálezu, které na svém povrchu exprimují polypeptid oc_d nebo nějaké jeho varianty. Hostitelské buňky podle vynálezu jsou zvláště užitečné pro produkci velkých množství polypeptidů a_d, který může být izolován buď ze samotné hostitelské buňky nebo z média, v němž jsou tyto buňky kultivovány. Hostitelské buňky exprimuj ící polypeptid a_d na extracelulární straně membrány mohou být rovněž použity jako imunogeny při produkci protilátek specificky namířených proti a_d. Ve výhodném provedení vynálezu budou hostitelské buňky transfekované DNA kódující a_d kotransfekovány DNA kódující podjednotku β₂, aby byla na jejich povrchu umožněna exprese tohoto heterodimeru.

Vynález se rovněž týká purifikovaných a izolovaných polypeptidů, jejich fragmentů a různých variant. Ve výhodném provedení vynálezu jsou polypeptidy a_d polypeptidy o sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č.: 2. Nové produkty a_d podle vynálezu mohou být izolovány z přirozených zdrojů, ale ve výhodném provedení jsou, spolu s produkty různých variant <x_d, produkovány s využitím rekombinatních postupů, ve kterých jsou využity hostitelské buňky podle vynálezu. Za použití různých hostitelských buněk a/nebo specifickým zpracováním po izolaci, mohou být připraveny úplně glykosylované, částečně glykosylované a úplně deglykosylované formy polypeptidů a_d. Mezi varianty polypeptidů a_d podle vynálezu patří ve vodě rozpustné a ve vodě nerozpustné polypeptidy a_d, včetně jejich analog, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin odstraněno nebo nahrazeno: (1) beze ztráty, a ve výhodném provedení, s posílením jedné nebo více biolo7

9 99

gických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro a_d; nebo (2) za specifického zablokováni určitého druhu vazby ligand/receptor nebo za zablokování signalizační funkce. Vynález rovněž popisuje fúzní polypeptidy, ve kterých jsou aminokyselinové sekvence z polypeptidu a_dexprimovány v návaznosti na aminokyselinové sekvence z jiných polypeptidu. Takové fúzní polypetidy mohou mít, ve srovnání s polypeptidem a_d divokého typu, pozměněné biologické, biochemické a/nebo imunologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu spadají analoga polypeptidu obsahující navíc aminokyselinový zbytek (například lysin nebo cystein), který usnadňuje tvorbu multimerů.

Vynález se rovněž týká polypeptidu a molekul nepeptidové povahy, které specificky vážou a_d. Mezi výhodné molekuly, které vážou a_d, patří protilátky (například monoklonální a polyklonální protilátky), receptory (například jejich rozpustné formy nebo formy asociované s membránou) a jiné ligandy (například přirozeně se vyskytující nebo uměle připravené molekuly) včetně těch molekul, které se za přítomnosti monoklonálních protilátek namířených proti a_da/nebo specifických receptorů pro a_d, kompetitivně váží na a_d. Molekuly, které se vážou na a_d, mohou být použity při purifikaci polypeptidů a_d a identifikaci typů buněk exprimujících polypeptid a_d. Molekuly, které se vážou na a_d, mohou být rovněž použity za účelem modulace (tj. inhibice, blokování nebo stimulace) vazebných aktivit polypeptidů a_d(in vivo) a/nebo za účelem modulace přenosu signálů uskutečňovaných prostřednictvím a_d.

Vynález rovněž popisuje stanovení sloužící k identifikaci molekul vážících a_d, včetně stanovení využívajících vazbu imobilizovaného ligandu, stanovení, při kterých je vazba sledována v roztoku, SPA (scintillation proximity assay - stanovení využívající přiblížení radioaktivní znač8

ky ke fluoroforu a následné monitorování světla emitovaného fluoroforem), stanovení, při kterých jsou použity dvě hybridní molekuly a podobně.

Mezi in vitro stanovení sloužící k identifikaci protilátek nebo jiných sloučenin, které modulují aktivitu polypeptidu aj, mohou patřit, například, imobilizace polypeptidu a_d nebo imobilizace přirozeného ligandu, ke kterému se ad váže, detekovatelné značení neimobilizovaného vazebného partnera, společná inkubace vazebných partnerů a stanovení vlivu testované sloučeniny na množství navázané značky, přičemž snížení množství navázané značky za přítomnosti testované sloučeniny (ve srovnání s množstvím značky navázané bez přítomnosti testované sloučeniny) naznačuje, že testovaná látka je inhibitorem vazby na a_d.

Jiným typem stanovení použitelným k identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi a_d a jeho ligandem, je stanovení, při němž je polypeptid a_d nebo jeho fragment imobilizován na povrchu pevného nosiče povlečeného (nebo napuštěného) fluorescenčním agens a ligand je označen sloučeninou schopnou excitovat zmíněné fluorescenční agens. Při tomto stanovení dojde, za přítomnosti nebo v nepřítomnosti domnělého modulátoru, ke kontaktu imobilizovaného polypeptidu a_d se značeným ligandem a následně je detekováno světlo emitované prostřednictvím fluorescenčního agens a jsou identifikovány sloučeniny s modulačními vlastnostmi. Jako sloučeniny s modulačními vlastnostmi jsou uvažovány ty sloučeniny, které ovlivňují emisi světla zprostředkovanou fluorescenčním agens ve srovnání s emisí světla zprostředkovanou fluorescenčním agens v nepřítomnosti modulační sloučeniny. Jinou možností je imobilizace ligandu pro a_d a označení polypeptidu ad.

Další metodou spadající do rozsahu vynálezu a sloužící k identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi a_d • · a jeho ligandem, je transformace nebo transfekce vhodných hostitelských buněk nějakým konstruktem DNA nesoucím reportérový gen pod kontrolou promotoru, regulovaný transkripčním faktorem skládajícím se z domény vážící DNA a aktivační domény, následná exprese (v hostitelské buňce) první sekvence hybridní DNA kódující první fúzní protein obsahující část nebo celý polypeptid a_d spolu s doménou vážící DNA nebo aktivační doménou a exprese druhé hybridní DNA kódující druhý fúzní protein obsahující část nebo celý ligand pro a_da spolu s doménou vážící DNA nebo aktivační doménou transkripčního faktoru, které nejsou inkorporovány v prvním fúzním proteinu. Dále je pak vyhodnocen vliv domnělé modulační sloučeniny na interakci mezi oc_d a jeho ligandem. Tento vliv je sledován detekcí vazby ligandu na a_d v dané hostitelské buňce, tak, že je v dané hostitelské buňce stanovována tvorba produktu reportérového genu za přítomnosti nebo v nepřítomnosti domnělého modulátoru, a jako modulační sloučeniny jsou identifikovány ty sloučeniny, které pozměňují tvorbu produktu reportérového genu ve srovnání s tvorbou produktu reportérového genu v nepřítomnosti modulační sloučeniny. U tohoto stanovení jsou v dnešní době s výhodou používány promotor lexA, doména vážící DNA se sekvencí odpovídající lexA, transaktivační doména GAL4, reportérový gen lacZ a jako hostitelské buňky kvasinky.

Při izolaci polynukleotidu kódujícího protein, který se váže na oc_d, může být použita upravená verze výše zmíněného stanovení. Při této modifikované verzi jsou vhodné hostitelské buňky transformovány nebo transfekovány konstruktem DNA nesoucím reportérový gen pod kontrolou promotoru regulovaného transkripčním faktorem skládajícím se z domény vážící DNA a aktivační domény. Následuje exprese (v hostitelské buňce) první sekvence hybridní DNA kódující první fúzní protein obsahující část nebo celý polypeptid a_d spolu s doménou vážící DNA nebo nějakou aktivační doménou zmíněného • · • · · · • · · · * • · · transkripčního faktoru a exprese knihovny druhé hybridní DNA kódující druhý fúzní protein obsahující část nebo celý polypeptid, u kterého existuje předpoklad vazby na a_d, a doménu vážící DNA nebo aktivační doménu transkripčního faktoru, které nejsou inkorporovány v prvním fúzním proteinu. Dále je pak vyhodnocen vliv domnělé modulační sloučeniny na interakci mezi a_d a jeho ligandem. Tento vliv je sledován detekcí vazby proteinu vážícího a_d na a_d v dané hostitelské buňce, tak, že je v dané hostitelské buňce detekována tvorba produktu reportérového genu. Nakonec je z příslušné hostitelské buňky izolována druhá hybridní sekvence DNA kódující protein vážící a_d.

Vynález se rovněž týká hybridomů produkujících protilátky specificky namířené proti a_d. V současnosti jsou velmi dobře známy techniky sloužící k produkci hybridomů, které sekretují monoklonální protilátky. Buněčné linie hybridomů mohou být vytvořeny imunizací nějakého živočicha prostřednictvím purifikovaného a_d, variant polypeptidú a_d nebo buněk, které na svém extracelulárním povrchu exprimují polypeptid a_d nebo jeho varianty. Mezi imunogenní buněčné typy patří buňky, které exprimují a_d in vivo, nebo transfekované buněčné linie eukaryotických nebo prokaryotických buněk, které za normálních okolností in vivo polypeptid a_dneexprimují. Ve výhodném provedení vynálezu jsou upřednostňovány protilátky sekretované hybridomy označovanými 169A,

169B, 170D, 170F, 170E, 170X. 170H, 188A, 188B, 188C, 188E,

I88F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R,

188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3,

197A-4, 199A, 199H a 199M.

Hodnota informací poskytnutých odhalením sekvencí DNA kódujících ct_d a aminokyselinových sekvencí a_d je zřejmá.

Sekvence cDNA kódující a_d, uvedená v jedné sérii příkladů umožňuje izolaci sekvence genomové DNA kódující a_d, včetně • · • * ···· ··· ····· ·♦ ·· ·· ·· prvků řídících transkripci této genové sekvence. Vynález se rovněž týká možností identifikace alelických variant DNA kódujících a_d a DNA kódující oc_d z jiných druhů (například myší nebo potkanů). Izolace lidské genomové DNA kódujících a_d a DNA pro oc_d z jiných druhů, může být uskutečněna pomocí standardních technik hybridizace DNA/RNA, prováděné za vhodných podmínek, za použití části nebo celé sekvence cDNA pro a_d (tato sekvence cDNA pro a_d je použita jako sonda pro testování (screening) vhodné knihovny). Jinou možností použitelnou k amplifikaci a identifikaci sekvencí genomové DNA kódující a_d je využití polymerázové řetězcové reakce (PCR), při které jsou jako primery použity oligonukleotidy vytvořené na základě známé sekvence cDNA. Pomocí konvenčních metod syntézy může být připravena syntetická DNA kódující polypeptid a_d, včetně jeho fragmentů a různých variant .

Informace o sekvenci DNA podle vynálezu rovněž umožňují vytvořit, prostřednictvím přístupu využívajícího rekombinatní techniky nebo strategie knockoutování genů [viz. například Kapecchi, Science 244:1288 až 1292 (1989)], hlodavce, kteří nejsou schopni exprimovat funkční polypeptid a_d, nebo kteří exprimují nějakou z variant polypeptidu a_d.

Tito hlodavci mohou sloužit jako vhodný model pro studium aktivit polypeptidu a_d a modulátorů polypeptidu a_d in vivo.

Sekvence DNA a aminokyselinové sekvence podle vynálezu rovněž umožňují provést analýzu těch epitopů a_d, které se aktivně účastní vazby na receptor, a rovněž epitopů, které mohou tuto vazbu nějakým způsobem regulovat, spíše než se jí aktivně účastnit. Vynález rovněž zahrnuje možnost identifikace epitopů, které se mohou účastnit přenosu signálů přes membránu.

DNA podle vynálezu je rovněž použitelná k detekci těch typů buněk, které exprimují polypeptid a_d. Ke stanovení • · • · · · • · · · · · • · • ·

hladiny konstitutivní transkripce a_d v buňkách, jakož i ke stanovení změn v transkripci v závislosti na přítomnosti interních nebo externích látek, mohou být využity standardní techniky hybridizace DNA/RNA, které k detekci RNA kódující polypeptid a_d využívají DNA pro a_d. Identifikace látek modifikujících transkripci a/nebo translaci polypeptidů a_dmůže být zase využita pro stanovení potenciálních terapeutických nebo preventivních účinků těchto látek. DNA podle vynálezu rovněž umožňuje hybridizací DNA pro a_d a buněčné RNA in šitu, čímž je možné určit lokalizaci RNA pro a_d v populacích buněk obsahujících více buněčných typů a ve tkáních .

DNA podle vynálezu může být rovněž použita k identifikaci polynukleotidových sekvencí z jiných organizmů než ze člověka, které vykazují homologii k sekvencím lidského a_d. Znalost sekvencí DNA pro a_d u jiných organizmů než u lidí umožňuje vytvoření živočišných modelů (včetně například transgenních modelů) k lidskému systému.

Jiná stránka vynálezu se týká monoklonálních a polyklonálních protilátek specificky namířených proti a_d, které mohou být využity při imunohistochemických analýzách k lokalizaci polypeptidů a_d v buněčných kompartmentech nebo v jednotlivých buňkách tkání. Tento typ imunohistochemických stanovení je zvláště výhodně používán v kombinaci s hybridizací in šitu, přičemž jsou lokalizovány jak mRNA pro a_d, tak polypeptidový produkt genu pro a_d.

Identifikace typů buněk, které exprimují polypeptid a_d, může výrazně pomoci při vývoji látek s terapeutických nebo preventivním účinkem. Předpokládá se, že produkty podle vynálezu, které jsou příbuzné a_d, mohou být využity při léčbě onemocnění, u kterých v procesu onemocnění hrají důležitou roli makrofágy. V současnosti je popsáno množství živočiš13 ···· • · · · • · · • 9 · · ných modelů pro patologické stavy spojené s pozměněnou aktivitou makrofágů. Například v publikaci Jutila a další, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993) je u myší popsáno hromadění makrofágů v místech jak chronických, tak akutních zánětů. U laboratorních potkanů popisuje Adams a další, [Transplantation 53:1115 až 1119 (1992) a Transplantation 56:794 až 799 (1993)] model pro arteriosklerózu štěpu vznikající po transplantaci heterotropních abdominálních srdečních alloštěpů. Rosenfeld a další, [Arteriosclerosis 7:9 až 23 (1987) a Arteriosclerosis 7:24 až 34 (1987)] popisuje indukci arteriosklerózy u králíků krmených dietou s přídavkem cholesterolu. Hanenberg a další, [Diabetologia 32:126 až 134 (1989)] zmiňuje spontánní rozvinutí inzulíndependentního diabetů u laboratorních potkanů BB. Yamada a další, [Gastroenterology 104:759 až 771 (1993)] popisuje u laboratorních potkanů injikovaných polymery peptidoglykanpolysacharid z baktérie Streptococcus výskyt zánětlivého onemocnění střev a chronické granulomatózní kolitidy. Cromartie a další, [J. Exp. Med. 146:1585 až 1602 (1977)] a Schwab a další, [Infection and Immunity 59:4436 až 4442 (1991)] zmiňují, že injekce proteinů buněčné stěny z baktérie Streptococcus do organizmu laboratorních potkanů má za následek artritický stav charakterizovaný zánětem periferních kloubů a následným poškozením těchto kloubů. A konečně Huitinga a další, [Eur. J. Immunol 23:709 až 715 (1993)] popisuje u laboratorních potkanů Lewis výskyt encefalomyelitidy (ložiskový zánět mozku a míchy), která je modelem pro roztroušenou sklerózu. U každého z těchto modelů jsou ke zmírnění průběhu nemoci využívány protilátky proti a_dnebo jiné proteiny vážící polypeptid a_d nebo rozpustné formy polypeptidu a_d. Cílem tohoto působení je pravděpodobně zamezit aktivaci makrofágů.

Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic použitelných při léčbě těchto a jiných onemocnění. Farmaceutické • · · · • · · · · • · · · · • · · · · • · · · · ···· · ·· ·· ·· ·· kompozice jsou navrhovány tak, aby inhibovaly interakce mezi oc_d a jeho ligandem (-dy) . Mezi tyto farmaceutické kompozice patři nej různější rozpustné formy polypeptidu a_d a formy polypeptidu a_d asociované s membránou (obsahující celý polypeptid a_d nebo jeho fragmenty, které se aktivně účastní při vazbě polypeptidu a_d) , nej různější rozpustné formy proteinů vážících a_d a formy proteinů vážících oc_dasociované s membránou (včetně protilátek, ligandů a podobně) , intracelulární a extracelulární modulátor vazebné aktivity polypeptidu a_d a/nebo modulátor exprese polypeptidu a_d a/nebo polypeptidu a_d-ligand, včetně modulátorů transkripce, translace, posttranslačních úprav a/nebo intracelulárního transportu.

Vynález se rovněž týká metod sloužících k léčbě onemocnění, u kterých svou roli hraje vazba polypeptidu a_d nebo lokalizovaná akumulace buněk exprimující polypeptid a_d. V těchto metodách je pacientovi postiženému zmíněným onemocněním podávána farmaceutická kompozice podle vynálezu v množství dostačujícím k ovlivnění úrovně vazby polypeptidu a_d nebo v množství dostačujícím k ovlivnění akumulace buněk exprimujících polypeptid a_d. Tyto metody léčby podle vynálezu jsou použitelné při onemocněních jakými jsou například, ale nejenom, diabetes I. typu, atheroskleróza, roztroušená skleróza, astma, lupénka, záněty plic, syndrom akutní respirační tísně a revmatická arthritida.

Přehled obrázků na výkresech

Množství dalších aspektů a výhod vynálezu bude zřejmější, jestliže se vezme v potaz následující popis vynálezu, kde jsou zmíněny i následující obrázky, kde:

• ·

Na Obrázcích IA až ID jsou znázorněny aminokyselinové sekvence lidských CDllb (SEK. ID. Č.: 3), CDllc (SEK. ID. Č. : 4) a oc_d (SEK. ID. Č. : 2) .

Příklady provedení vynálezu

Vynález je ilustrován následujícími příklady týkajícími se izolace klonu DNA kódující polypeptid a_d z knihovny cDNA z lidské sleziny. Přesněji řečeno, Příklad 1 ilustruje použití protilátky proti psímu a_TMi při pokusu detekovat homologní lidský protein. Příklad 2 detailně popisuje purifikaci psího polypeptidů cc_Tmi a sekvenaci N-koncové části tohoto polypeptidů, aby bylo možné vytvořit oligonukleotidové primery použitelné k amplifikaci psího genu pro a_TMi pomocí PCR. Příklad 3 se týká purifikace velkého množství polypeptidu a_TMi z organizmu psa, aby bylo možné určit vnitřní sekvence tohoto polypeptidů a poté připravit další primery pro PCR. Příklad 4 popisuje použití primerů komplementárních ke vnitřní sekvenci genu pro a_TMi při amplifikaci fragmentu genu kódujícího psí α_ΤΜχ pomocí PCR. Příklad 5 se týká klonování sekvence cDNA kódující lidský a_d. Příklad 6 popisuje analýzu exprese mRNA kódující a_d v lidských tkáních a buňkách, prováděnou metodou Northern blot. Příklad 7 detailně popisuje konstrukci expresívních plazmidů obsahujících sekvenci kódující lidský a_d a transfekci buněk COS těmito plazmidy. Příklad 8 se týká analýzy exprese polypeptidu a_d v transfekovaných buňkách COS prováděné metodou ELISA. Příklad 9 popisuje analýzu buněk COS transfekovaných expresívními plazmidy obsahujícími sekvenci kódující lidský a_d prováděnou pomocí FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). Příklad 10 se týká imunoprecipitace polypeptidů CD18 asociovaného s a_d v kotransfekovaných buňkách COS. Příklad 11 popisuje stabilní transfekci buněk ovárií čín16 • » ··· · ského křečka (CHO buňky) pomocí expresívního konstruktu obsahujícího sekvenci kódující a_d. Příklad 12 se týká vazby polypeptidu a_d (závlislé na přítomnosti polypeptidu CD18) na intercelulární adhezivní molekulu ICAM-R, mutantní protein ICAM-R a molekulu komplementu iC3b. Příklad 13 popisuje techniku SPA sloužící k identifikaci inhibitorů nebo posilovačů (tj. modulátorů) vazebných interakcí ligand pro a_d/anti-ligand pro a_d. Příklad 14 popisuje konstrukci expresívních plazmidů, které kódují rozpustné formy polypeptidu a_d a vazebné analýzy produktů exprese. Příklad 15 se týká produkce polyklonálních sér a monoklonálních protilátek specificky namířených proti a_d. Příklad 16 popisuje použití polyklonálního séra namířeného proti a_d při analýze tkáňové distribuce polypeptidu a_d, exprese a_d na povrchu leukocytů periferního krevního oběhu a exprese polypeptidu a_d v zánětlivé a nezánětlivé synovii (kloubní nitroblána). Příklad 17 popisuje izolaci sekvencí cDNA, které vykazují homologii k sekvencím lidského genu pro a_d, z organizmu laboratorních potkanů. Příklad 18 se týká konstrukce expresívních plazmidů kódujících celý polypeptid a_d, expresívních plazmidů kódujících doménu I polypeptidu a_d, včetně fúzních proteinů domény I/IgG, a produkce monoklonálních protilátek proti celému polypeptidu a fúzním proteinům obsahujícím doménu I. Příklad 19 se týká izolace sekvencí cDNA, které vykazují homologii k sekvencím lidského genu pro a_d, z organizmu myší. Příklad 20 popisuje další izolaci klonů cDNA kódujících a_d použitých k potvrzení výsledků sekvenční analýzy. Příklad 21 se týká hybridizačních analýz prováděných in sítu v různých myších tkáních, které slouží ke stanovení specifity tkáňové a buněčné exprese předpokládaného myšího homologu lidského a_d. Příklad 22 popisuje konstrukci expresívních konstruktů, které kódují předpoklá17 ·« ··«· ·· »··· ·· • · · · · · · · · • · · · · · · • · ·· · · · · · · · • · ···· ·· • as· · ·· ·· ·· daný myší homolog lidského oc_d. Příklad 23 se týká vytvoření „knockoutované myši, u které je rozrušen gen kódují předpokládaný myší homolog lidského a_d. Příklad 24 se týká izolace sekvencí cDNA, které vykazují homologii ke kódujícím sekvencím lidského genu pro a_d, z organizmu králíků. Příklad 25 popisuje živočišný model onemocnění člověka, ve kterém jsou stanovovány možnosti modulace a_d. Příklad 26 popisuje expresi polypeptidu a_d u živočišného modelu onemocnění .

Příklad 1

Pokus detekovat lidský homolog psího polypeptidu cc_Tmi

Za účelem pokusit se identifikovat lidský homolog psího polypeptidu a_TMi byla na lidských leukocytech periferního krevního oběhu testována křížová reaktivita monoklonálni protilátky Call.8H2 specificky namířené proti psímu a_TMi [Moore a další, viz. výše]. Buňky (obvykle 1 x 10⁶ buněk) byly na ledu za přítomnosti 0,1% azidu sodného inkubovány s neředěným supernatantem získaným po kultivaci hybridomů nebo s purifikovanou kontrolní myší protilátkou IgG-negativní (10 pg/ml). Vazba monoklonálni protilátky byla detekována následnou inkubací koňskou protilátkou (o koncentraci 6 pg/ml) namířenou proti myším IgG konjugovanou s FITC (Vector 10 Laboratories, Burlingame, CA). Označené buňky byly ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem (PBS) fixovány pomocí 2 % w/v paraformaldehydu a poté analyzovány za použití přístroje FACS Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Při obvyklém provedení bylo s využitím logaritmického zesílení intenzity fluorescence analyzováno 10000 buněk .

Získané výsledky naznačují, že protilátka Call.8H2 nereaguje křížově s povrchovými proteiny exprimovanými na po18 • 0 0000 »0 «000

00*0 0

0 0 vrchu lidských leukocytů periferního krevního oběhu, zatímco v podstatě všechny kontrolní buňky, kterými jsou neoplastické psí lymfocyty periferního krevního oběhu, polypeptid α_ΤΜχ na svém povrchu exprimovaly.

Protože monoklonální protilátka Call.8H2 specificky namířená proti psí podjednotce α nereagovala křížově s nějakým lidským homologem této podjednotky, byla nezbytným předpokladem izolace odpovídajícího lidského protějšku DNA kódující psí octmi (jestli ovšem tento lidský protějšek existuje) izolace zmíněné DNA kódující psí a_TMi.

Příklad 2

Afinitní purifikace psího polypeptidů α_ΤΜχ použitého k sekvenaci N-koncové oblasti

Za účelem stanovení N-koncové sekvence byl afinitně purifikován psí polypeptid a_TMi a získaná aminokyselinová sekvence byla použita při návrhu oligonukleotidové sondy nebo primeru. Stručně řečeno, monoklonální protilátka Call.8H2 namířená proti polypeptidů a_TMi, byla navázána na chromatografický nosič Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) a požadovaný protein byl izolován pomocí specifické interakce protilátka-protein. Protilátka byla na nosič konjugována postupem doporučeným firmou BioRad a výsledná koncentrace byla 5 mg protilátky na ml nosiče. Po konjugaci byl přebytek protilátky odstraněn a nosič byl zablokován pomocí trojnásobného objemu O,1M ethanolaminu. Nosič byl následně promyt fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem (PBS) o objemu odpovídajícímu třiceti objemům kolony.

Ve 250 ml pufru obsahujícího 0,32 M sacharózu ve 25 mM

Tris-HCl, pH 8,0, s inhibitory proteáz, bylo homogenizováno gramů sleziny získané z jednoho psa. Buněčná jádra a celé buňky byly odstraněny centifugací prováděnou při lOOOxg ·· ···· ·· ···· ·· ·· ·· · · · · · · · · • · ··· «··· • · · · · · · ··· · · • · >··· · · · ···· · ·· ·· ·* *· po dobu 15 minut. Membrány byly od supernatantu odděleny centifugaci prováděnou při lOOOOOxg po dobu 30 minut. Takto získaná peleta tvořená membránami byla rozsuspendována ve 200 ml lyzačního pufru (50 mM NaCl, 50 mM sůl kyseliny borité, pH 8,0, spolu s 2 % NP-40) a po dobu 1 hodiny inkubována na ledu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centifugací prováděnou při lOOOOOxg po dobu 60 minut. Deset mililitrů čirého lyzátu bylo spolu s 0,5 ml nosiče Affigel 10 s konjugovanou protilátkou Call.8H2 (viz. výše) přeneseno do polypropylénové zkumavky o objemu 15 ml. Tato zkumavka byla za stálého míchání inkubována přes noc při 4°C a nosič byl následně promyt padesátinásobným množstvím D-PBS. Poté byl tento nosič přenesen do mikrocentrifugační zkumavky a po dobu 10 minut vařen za přítomnosti 1 ml Laemmliho vzorkového pufru (neredukující) o složení 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, % SDS, 20 % glycerol a 0,002 % bromfenolová modř. Nosič byl následně odstraněn centrifugaci; k supernatantu byla přidána 1/15 objemu β-merkaptoethanolu (Sigma, St. Louis,

MO) a vzorek byl podroben elektroforéze na 7% polyakrylamidovém gelu. Rozdělené proteiny byly přeneseny na membránu Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) následujícím způsobem.

Gely byly jednou promyty deionizovanou vodou filtrovanou přes membránu Millipore a poté po dobu 15 až 30 minut ekvilibrovány v transferovém pufru o složení 10 mM kyselina 3-[cyklohexylamino]-1-propansulfonová (CAPS), pH 10,5 s 10 % methanolem. Membrány Immobilon byly navlhčeny methanolem, promyty filtrovanou vodou a po dobu 15 až 30 minut ekvilibrovány v transferovém pufru CAPS. Počáteční přenos byl prováděn za použití přístroje pro Western Blot firmy BioRad při 70 voltech po dobu 3 hodin.

Membrány Immobilon byly poté z přístroje vyjmuty a po dobu 10 minut barveny 0,1% roztokem Coomassie R250. Následně byly membrány ve třech cyklech po deseti minutách odbar20 • · · · ·

·· ·· vény směsí 50 % methanol/10 % kyselina octová. Po odbarvení byly membrány promyty filtrovanou vodou a vysušeny na vzduchu .

Byly detekovány proužky proteinů o zdánlivých molekulových hmotnostech 150 kD, 95 kD, 50 kD a 30 kD. Proužky o zdánlivých molekulových hmotnostech 50 kD a 30 kD vznikly pravděpodobně v důsledku kontaminace protilátkou. Jak u proužku odpovídajícímu proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 kD, tak u proužku odpovídajícímu proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 95 kD byl učiněn pokus určit N-koncovou sekvenci, nicméně protein o zdánlivé molekulové hmotnosti 95 kD byl blokován, takže tuto sekvenci nebylo možné určit. Proužek proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 kD byl z membrány vystřižen a pomocí proteinového sekvenátoru Applied Biosystems (Foster City, CA) model 473A přímo sekvenován postupem podle výrobce. Získaná aminokyselinová sekvence je za použití jednopísmenného aminokyselinového kódu znázorněna jako SEK. ID. Č.: 5:

FNLDVEEPMVFQ (SEK. ID. Č.: 5)

Tato identifikovaná sekvence obsahuje sekvenci FLDN charakteristickou pro podjednotky a rodiny integrinů [Tamura a další, J. Cell. Biol. 111:1593 až 1604 (1990)].

Vytvoření primerů a pokus o amplifikaci sekvencí kódujících psí CCtmi

S využitím získané informace o N-koncové sekvenci byly za účelem hybridizace navrženy tři oligonukleotidové sondy: a) „Tommer - plně degenerovaný oligonukleotid; b) „Patmer - částečně degenerovaný oligonukleotid; a c) „Guessmer nedegenerovaný oligonukleotid se sekvencí založenou na ko21

·· · · · · donech používaných u savců. Tyto sondy jsou znázorněny níže jako SEK. ID. Č.: 6, 7 a 8. Symboly v sekvencích nukleových kyselin použité ve všech nukleotidových sekvencích vynálezu odpovídají §1,882 37 C. R. F.

5'-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3' (SEK. ID. Č.: 6)

5'-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3' (SEK. ID. Č.: 7)

5'-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3' (SEK. ID. Č.: 8)

Za použití těchto oligonukleotidů (vytvořených na základě dat získaných sekvenací polypeptidu) nebyly při několika hybridizačních analýzách, za podmínek umožňujících hybridizaci nedokonale komplementárních sekvencí, v knihovně cDNA získané ze psích makrofágů periferního krevního oběhu/slezinných buněk zaklonované do λΖΑΡ (Stratagene, La Jolla, CA), detekovány odpovídající klony.

Následně byly na základě odhadnuté sekvence N-konce polypeptidu vytvořeny čtyři oligonukleotidové primery označované 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec (jak jsou zobrazeny v SEK. ID. Č.: 9, 10, 11 a 12, kde Deg označuje degenerovanou sekvenci a Spec nedegenerovanou sekvenci). S těmito oligonukleotidovými primery byl proveden pokus o amplifikaci (pomocí PCR) sekvencí kódujících psí α_ΤΜχ z DNA fágové knihovny purifikované z lyzátů knihovny firmy Stratagene popsané výše.

5’-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3 (SEK. ID. Č. : 9) • · · · • · · · • ·

5'	-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3'	(SEK.	ID.	Č. : 10)
5'	-TGRAANACCATNGGYTC-3'	(SEK.	ID.	Č. : 11)
5'	-TTGGAAGACCATNGGYTC-3'	(SEK.	ID.	Č. : 12)

Oligonukleotidové primery pro amplifikaci α_ΤΜχ byly použity ve dvojicích s primery komplementárními k sekvenci vektoru označenými T3 a T7 znázorněnými v SEK. ID. Č.: 13 (T3) a 14 (T7), které hybridizují se sekvencemi ohraničujícími oblast polylinkeru fágmidu Bluescript nacházejícím se v λΖΑΡ.

5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3' (SEK. ID. Č.: 13)

5'-AATACGACTCACTATAG-3' (SEK. ID. Č.: 14)

Amplifikace metodou PCR byla prováděna v pufru Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) obsahujícím hořečnaté ionty, za použití 150 ng knihovny DNA, 1 pg jednotlivého primerů, 200 μΜ každého z dNTP a 2,5 jednotek polymerázy Taq (Boehringer Mannheim). Produkty PCR reakce byly separovány elektroforézou na 1% agarózovém gelu v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE) s přídavkem ethidium bromidu o koncentraci 0,25 pg/ml. DNA byla metodou kapilárního přenosu přenesena na membránu Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Transfer byl prováděn přes noc v lOx SSPE. Po přenesení na membránu byla imobilizovaná DNA denaturována působením 0,5 M NaOH s 0,6 M NaCl, neutralizována 1,0 M TrisHCl, pH 8,0, v 1,5 M NaCl a před zesíťováním pomocí UV záření prováděným na přístroji Stratalinker (Stratagene) promyta 2x SSPE. Za stálého třepání byla membrána při 50°C inkubována po dobu 2 hodin v prehybridizačním pufru (5x SSPE, 4x Denhardts, 0,8 % SDS, 30 % formamid).

Za použití pufru pro kinázu firmy Boehringer Mannheim s 100 až 300 pCi yP³²-dATP a 1 až 3 jednotek polynukleotid kinázy byly oligonukleotidové sondy 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec (SEK. ID. Č.: 9, 10, 11 a 12) radioaktivně označeny. Značení probíhalo 1 až 3 hodiny při 37°C. Nezainkorporovaná radioaktivní značka byla odstraněna chromatografií na koloně Sephadexu G-25 fine (Pharmacia, Piscataway, NJ) za použití pufru o složení 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE), a proteklá frakce byla přímo přidána k prehybridizačnímu roztoku. Hybridizace s radioaktivní sondou probíhala při 42°C po dobu 16 hodin za stálého třepání. Nakonec byly membrány promývány při 50°C po dobu 15 minut roztokem lx SSPE/0,1 % SDS. Membrány byly poté při -80°C po dobu 1 až 4 hodin exponovány na film Kodak X-Omat AR.

Oligonukleotidy 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec hybridizovaly pouze s produkty těch PCR reakcí, při kterých byly použity jako primery, a nehybridizovaly, jak se očekávalo, s produkty PCR reakcí, u nichž jako primery použity nebyly. Bylo tudíž usouzeno, že žádný z produktů reakce PCR není specifický pro a_TMi, protože ani jeden z produktů nehybridizoval se všemi použitými sondami.

Příklad 3

Purifikace velkého množství polypeptidů oc_Tmi z organizmu psa prováděná za účelem určení vnitřní sekvence polypeptidu

Aby bylo možné získat další aminokyselinovou sekvenci použitelnou k vytvoření primerů, byl za účelem určení vnitřní sekvence polypeptidů purifikován psí polypeptid octmi· K purifikaci proteinu použitelného k určení vnitřní sekvence byly použity tři kusy zmrazené sleziny (každá o hmotnosti přibližně 50 g) a zmrazené buňky získané ze dvou slezin dospělých psů. Ve 200 až 300 ml borátového pufru by24 ·· · β · · ···· • · · · · · · · · • · « · · · · ··· · · • · ···· · · · ···· · η *· ·· ·· lo v míchacím zařízení Waring homogenizováno 50 g sleziny. Homogenizovaný materiál byl zředěn stejným objemem pufru obsahujícím 4% NP-40 a směs byla lehce třepána přinejmenším jednu hodinu. Větší kusy byly z lyzátu odstraněny centrifugací prováděnou při 2000xg po dobu 20 minut a supernatant byl přefiltrován buď přes filtr Corning (Corning, NY) nebo přes filtrační systém Corning s membránou o velikosti pórů 0,8 mikronů. Lyzát byl následně přečištěn filtrací přes filtrační systém Corning s membránou o velikosti pórů 0,4 mikronů.

Lyzát ze sleziny a nosič Affigel 10 s konjugovanou protilátkou (popsaný v Příkladu 2) byly smíchány v poměru 150:1 v alikvotech o objemu 100 ml a za stálého třepání inkubovány přes noc při 4°C. Lyzát byl následně odstraněn centrifugací prováděnou při lOOOxg po dobu 10 minut, smíchán s dalším alikvotem nosiče Affigel 10 s konjugovanou protilátkou a inkubován přes noc za podmínek zmíněných výše. Alikvoty nosiče s navázaným proteinem byly poté spojeny a promyty 50-ti násobným objemem pufru D-PBS/0,1 % Tween 20, a nosič byl umístěn na kolonu BioRad o objemu 50 ml. Navázaný protein byl z nosiče eluován 3 až 5 násobným objemem 0,1 M glycinu (pH 2,5); byly sbírány frakce o objemech 900 μΐ a tyto frakce byly neutralizovány pomocí 100 μΐ pufru 1M Tris, pH 8,0. Z každé frakce byl odebrán alikvot o objemu 15μ1 a tento alikvot byl povařen se stejným objemem 2x Laemmliho vzorkového pufru s 1/15 objemu 1M dithiothreitolu (DTT). Tyto vzorky byly analyzovány elektroforézou na 8% polyakrylamidovém gelu Novex (San Diego, CA) a vizualizovány barvením Coomassie nebo stříbrem za použití Daiichiho kitu (Enprotech, Natick, MA), postupem popsaným výrobcem. Frakce obsahující největší množství proteinu byly smíchány a zakoncentrovány ve vakuu. Zbylý roztok byl zředěn na polovinu redukujícím Laemmliho vzorkovým pufrem a elektroforeticky rozdělen na 7% polyakrylamidovém gelu o tloušťce 1,5 mm v pufru Tris-glycin/SDS. Po elektroforéze

I · · · ♦ * • · · · «

I · · · · • · ···· « ···· ·· byly proteiny za použití přístroje pro Western Blot firmy Hoefer přeneseny z gelu na membránu Immobilon postupem popsaným v Příkladu 2.

Proužky proteinů o velikosti odpovídající psímu a_TMi byly z 10 membrán PVDF vyříznuty; celkový obsah proteinu byl přibližně 47 pg. Tyto vyříznuté proužky byly odbarveny ve 4 ml 50% methanolu (5 minut), vysušeny na vzduchu a rozřezány na kousky o velikosti 1x2 mm. Tyto kousky membrán byly při 4°C na 30 minut ponořeny do 2 ml 95% acetonu, občas vortexovány a nakonec vysušeny na vzduchu.

Před vlastním proteolytickým štěpením proteinu navázaného na membránu byly v 1,5 ml 70% kyseliny mravenčí rozpuštěny 3 mg bromkyanu (CNBr) (Pierce, Rockford, IL). Tento roztok byl přidán do zkumavky obsahující kousky membrány PVDF a zkumavka byla inkubována po dobu 24 hodin při pokojové teplotě ve tmě. Supernatant (Sl) byl následně přenesen do jiné zkumavky a kousky membrány byly promyty 0,25 ml 70% kyseliny mravenčí. Tento supernatant (S2) byl poté přidán k supernatantu Sl. Ke spojeným supernatantům (Sl a S2) byly přidány 2 ml vody Mílii Q a vzniklý roztok byl lyofilizován. Kousky membrán PVDF byly vysušeny pod proudem dusíku a při 42°C po dobu 17 hodin znovu extrahovány 1,25 ml roztoku o složení 60 % acetonitril, 0,1% kyselina tetrafluorooctová (TFA). Tento supernatant (S3) byl odebrán a kousky membrán PVDF byly při 42°C po dobu 1 hodiny znovu extrahovány 1,0 ml roztoku o složení 80 % acetonitril, 0,08% kyselina tetraf luorooctová . Tento supernatant (S4) byl smíchán s předchozími supernatanty (Sl, S2 a S3) a směs supernatantů byla vysušena ve vakuu.

Vysušené fragmenty proteinu získané štěpením pomocí CNBr byly následně rozpuštěny v 83 μΐ roztoku o složení 8M močovina, 0,4 M NH4HCO3. Tyto fragmenty byly redukovány přidáním 5 μΐ 45 mM dithiothreitolu (DTT) a následnou inkubací při 50°C po dobu 15 minut. Vzniklý roztok byl poté • ·

I I • · *··· · • · · · « • · ·· ·· ochlazen na pokojovou teplotu a fragmenty byly alkylovány přidáním 5 μΐ 100 mM jodacetamidu (Sigma, St. Louis, MO).

Po 15-ti minutové inkubaci při pokojové teplotě byl vzorek zředěn 187 μΐ vody Milli Q na výslednou koncentraci močoviny odpovídající 2,0 M. Následně byl ke vzorku přidán trypsin (Worthington, Freehold, NJ) v poměru enzym:protein 1:25 (w/w) a štěpení probíhalo při 37°C po dobu 24 hodin. Štěpení bylo ukončeno přídavkem 30 μΐ TFA. Proteinové fragmenty byly poté separovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na přístroji Waters 625 LC (Millipore, Milford , MA) za použití kolony Vydac C-18 (5 mikronů) o rozměrech 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) ekvilibrované v roztoku 0,05 % TFA ve vodě pro HPLC (pufr A). Peptidy byly eluovány zvyšující se koncentrací 80 % acetonitrilu v 0,04 % TFA (pufr B) s gradientem 38% až 75% pufr B po dobu 65 až 95 minut a 75% až 98 % pufr B po dobu 95 až 105 minut. Peptidy byly děleny při průtoku 0,2 ml/minuta a detekovány při vlnové délce 210 nm.

Po frakcionaci byla u peptidů stanovována aminokyselinová sekvence. Stanovení aminokyselinové sekvence bylo prováděno automaticky Edmanovým odbouráváním na proteinovém sekvenátoru Biosystems Model 437A za použití standardních cyklů doporučených výrobcem. Analýza získaných dat byla provedena softwarovým programem Data Analysis Model 610A, verze 1.2.1. Všechny sekvenační reagencie byly dodány firmou Applied Biosystems. Aminokyselinové sekvence sedmi z celkových osmi vnitřních fragmentů jsou znázorněny níže, přičemž „X označuje aminokyseliny, u kterých nelze s jistotou určit o jakou aminokyselinu se vlastně jedná.

VFQEXGAGFGQ	(SEK.	ID.	Č. :	15)
LYDXVAATGLXQPI	(SEK.	ID.	Č. :	16)
PLEYXDVIPQAE	(SEK.	ID.	Č. :	17)

FQEGFSXVLX	(SEK.	ID.	C. :	: 18)
TSPTFIXMSQENVD	(SEK.	ID.	Č. :	: 19)
LVVGAPLEVVAVXQTGR	(SEK.	ID.	Č. :	: 20)
LDXKPXDTA	(SEK.	ID.	Č. :	: 21)

Vytvoření primeru

Jedna ze získaných aminokyselinových sekvencí (zobrazená jako SEK. ID. Č.: 22) byla použita k vytvoření úplně degenerovaného oligonukleotidového primeru označeného p4(R) a zobrazeného jako SEK. ID. Č.: 23.

FGEQFSE (SEK. ID. Č.: 22)

5'-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3' (SEK. ID. Č.: 23)

Příklad 4

Klonování fragmentu psího oc_Tmi metodou PCR

S využitím PCR byla ze dvojvláknové cDNA ze psí sleziny amplifikována část na 5' konci genu kódujícího psí polypeptid a_TMi .

A. Vytvoření dvojvláknové cDNA ze psí sleziny

Jeden gram zmrazeného materiálu získaného ze sleziny mladého psa byl ve směsi kapalného dusíku a suchého ledu rozdrcen a homogenizován ve 20 ml pufru RNA-Stat 60 (TelTest B, lne, Friendswood, TX). Poté byly přidány 4 ml chloroformu a roztok byl oddělen centrifugací prováděnou při 12000xg po dobu 15 minut. Z vodné vrstvy byla RNA precipitována přídavkem 10 ml ethanolu. RNA obsahující poly-A sekvenci byla poté oddělena s využitím kuličkového nosiče Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Oslo, Norsko). Pět alikvotů • · · · • · · · · · · • « ·· · ·· ··· · • · · · · · · · ····· ·· ·· ··

RNA o celkové hmotnosti 100 pg bylo smícháno a zředěno stejným objemem 2x vazebného pufru (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS). RNA byla následně po dobu 5 minut inkubována s nosičem Oligo dT Dynabeads (1,0 ml nebo 5 mg nosiče na všechny vzorky). Před vlastní elucí polyA mRNA prováděné roztokem o složení 2 mM EDTA, pH 7,5, byly kuličky nosiče promyty pufrem o složení 10 mM Tris-HCI, pH

7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA a 0,1% SDS podle postupu popsaného výrobcem. Následně byla, postupem podle výrobce a za použití eluované mRNA s poly-A sekvencí a kitu pro syntézu cDNA firmy Boehringer Mannheim, syntetizována dvojvláknová cDNA.

B. Izolace cDNA kódující část psího polypeptidů a_TMi

Při standardní reakci PCR prováděné za použití 150 ng dvojvláknové cDNA, 500 ng každého z primeru, 200 μΜ každého dNTP a 1,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim) v pufru Taq (Boehringer Mannheim) s přídavkem hořečnatých iontů, byly použity oligonukleotidové primery 5^zDeg (SEK. ID. Č.: 9) a p4 (R) (SEK. ID. Č.: 23). Vzniklé produkty (1 μΐ původní reakce) byly, za účelem dosažení vyšších výtěžků, použity v další reakci PCR se stejnými primery. Tyto proužky byly při 60°C v pufru o složení 10 mM Tris-HCI, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl eluovány z 1% agarózového gelu na papír Schleicher & Schuell (Keene, NH) NA4S, precipitovány a za použití klonovacího kitu TA (Invitrogen) zaligovány do vektoru pCR^tmII (Invitrogen, San Diego, CA) (postupem doporučeným výrobcem). Ligační směsí byly elektroporačně transformovány baktérie XL-1 Blue (Stratagene). Jeden klon, označený 2.7, obsahoval sekvence odpovídající sekvencím DNA pro polypeptid a_TMi, které nebyly využity při návrhu primerů.

Sekvenace byla provedena pomocí sekvenátoru DNA Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) za použití sekvenačního kitu využívajícího k terminaci reakce deoxynukleotidy s navázanou značkou (ABI). Při této sekvenaci byly asymetrickou reakcí PCR [McCabe, Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a další (eds.), strany 76 až 83, Academie Press: New York (1990)] inkorporovány fluorescenčně značené dNTP následujícím postupem. Vzorky byly inkubovány po dobu 4 minut při 96°C a poté podrobeny 25 cyklům: : 96°C, po dobu 15 sekund; 50°C po dobu 1 sekundy; 60°C po dobu 4 minut. Získaná data (včetně chromatogramu a textových souborů) byla automaticky načtena do referenčních souborů. Celá sekvence inzertu v klonu 2.7 je znázorněna jako SEK. ID. Č.: 24.

Pokusy o izolaci cDNA (z knihovny firmy Stratagene; jak je popsána v Příkladu 2), kódující celý psí polypeptid a_TMi byly neúspěšné. Za použití klonu 2.7 jako sondy, bylo v podmínkách umožňujících hybridizaci sekvencí s nižším stupněm komplementarity (použití 30% formamidu) otestováno přibližně 1 χ 10⁶ fágových plaků, ale nebyly identifikovány žádné pozitivní klony. Rovněž neúspěšné byly pokusy o amplifikaci odpovídajících sekvencí nacházejících se po směru transkripce od sekvencí reprezentovaných v klonu 2.7. Pokusy o amplifikaci těchto sekvencí nacházejících se po směru transkripce od sekvencí reprezentovaných v klonu 2.7 byly prováděny za použití specifických oligonukleotidu odvozených z klonu 2.7 nebo degenerovaných primerů se sekvencí vycházející z aminokyselinové sekvence jiných peptidových fragmentů, a jako druhý primer byl použit degenerovaný oligonukleotid se sekvencí vycházející z konzervativního aminokyselinového motivu GFFKR podjednotky α [Tamura a další, viz. výše].

Příklad 5

Klonování předpokládaného lidského homologu ke psímu

CÍTMl

Při pokusu o izolaci lidské sekvence homologní ke psí sekvenci kódující cctmi byl jako sonda použit fragment psího octmi o velikosti přibližně 1 kb z klonu 2.7. Tato sonda byla vytvořena reakcí PCR za podmínek popsaných v Příkladu 2 a za použití primerů NT2 (viz. SEK. ID. Č.: 25) a p4(R) (SEK. ID. Č.: 23).

5'-GTNTTYCARGARGAYGG-3' (SEK. ID. Č.: 25)

Produkt reakce PCR byl purifikován za použití kitu Quick Spin firmy Qiagen (Chatsworth, GA) postupem doporučeným výrobcem. Takto purifikovaná DNA byla za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označena 200 pCi a³²-PdCTP. Nezainkorporovaný izotop byl odstraněn chromatografií na koloně Sephadexu G25 (fine). Před vlastním použitím byla sonda denaturována působením 0,2 M NaOH a neutralizována roztokem 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0.

Na filtračních papírech Hybond (Amersham) byly připraveny kolonie knihovny cDNA z lidské sleziny zaklonované do vektoru pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Filtry byly nejprve vystaveny působení denaturačních činidel a následně neutralizovány postupem popsaným v Příkladu 2 a poté za mírného třepání po dobu 2 hodin inkubovány při 50°C v prehybridizačním roztoku (8 ml/filtr) se 30% formamidem. K tomuto roztoku byla přidána radioaktivně značená sonda (viz. výše) a spolu s filtry byl tento roztok inkubován při 42°C po dobu 14 hodin. Filtry byly dvakrát promyty roztokem 2x SSC/0,1 % SDS o teplotě 37°C a dvakrát roztokem 2x SSC/0,1 • ·· · • · 4 4 4 4 • 4 4 4 4

4 4 · 44 44

44 % SDS o teplotě 50°C. Nakonec byly filtry promyty dvakrát roztokem lx SSC/0,1 % SDS o teplotě 65°C (lx SSC má složení 150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný, pH 7,0). Po dobu 6 hodin byly filtry v kazetě s kontrastním filtrem exponovány na film Kodak X-Omat AR. Kolonie poskytující signál byly z duplikátu filtračního papíru natřeny na plotny s LB médiem obohaceným hořečnatými ionty (LBM)/karbenicilin a inkubovány přes noc při 37°C. Vyrostlé kolonie byly přeneseny na filtry Hybond a tyto filtry byly zpracovány postupem popsaným výše. Tyto filtry byly, za použití sondy o velikosti 1 kb z klonu 2.7, radioaktivně označené postupem popsaným výše, hybridizovány v podmínkách, při kterých je k dosažení pozitivního signálu nezbytná vyšší komplementarita mezi sondou a testovanou DNA než tomu bylo v předchozím případě; podmínky hybridizace byly 50% roztok formamidu, 50°C po dobu 3 hodin. Filtry byly nakonec promyty dvakrát roztokem lx SSC/0,1 % SDS o teplotě 65°C a po dobu 2,5 hodin byly filtry při -80°C v kazetě s kontrastním filtrem exponovány na film Kodak X-Omat AR. Byly identifikovány pozitivní kolonie a tyto kolonie byly přes noc kultivovány v

LBM/karbenicilin. Z jednotlivých kultur byla pomocí kitu Promega Wizard pro minipreparaci DNA, postupem doporučovaným výrobcem, izolována DNA a tato DNA byla následně sekvenována.

Prvním screeningem bylo jako pozitivních vybráno 18 klonů, zatímco výsledkem druhého screeningu prováděného za podmínek, při kterých je k dosažení pozitivního signálu nezbytná vyšší komplementarita mezi sondou a testovanou DNA, byla identifikace jednoho pozitivního klonu označeného 19A2. Sekvence DNA a odhadnutá aminokyselinová sekvence klonu 19A2 lidského oc_d jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 1 a 2.

·· · · · ·· flfl

Charakteristiky cDNA pro lidský a_d a predikovaného polypeptidu

Klon 19A2 obsahuje celou kódující oblast pro maturovaný protein a navíc ještě 48 bází (16 aminokyselinových zbytků) signální sekvence nacházející se na 5' konci proti směru transkripce od kódující oblasti, a 241 bází nepřekládané sekvence na 3' konci, která není ukončena polyadenylační sekvencí. Předpokládá se, že molekulová hmotnost maturovaného proteinu bude přibližně 125 kD. Předpokládaná extracelulární doména zahrnuje přibližně aminokyselinové zbytky 17 až 1108 (v SEK. ID. Č.: 2). Na tuto extracelulární oblast navazuje sekvence asi 20 aminokyselin, která je homologní k transmembránové oblasti lidského CDllc (aminokyselinové zbytky 1109 až 1128 v SEK. ID. Č.: 2). Cytoplazmatická doména je tvořena přibližně 30 aminokyselinami (aminokyselinové zbytky 1129 až 1161 v SEK. ID. Č.: 2). Protein rovněž obsahuje oblast (přibližně aminokyselinové zbytky 150 až 352) tvořenou asi 202 aminokyselinami, která je homologní k doméně I (inzerční) společné pro polypeptidy CDlla, CDllb a CDllc [Larson a Springer, viz. výše], polypeptid a_E [Shaw a další, J. Biol. Chem. 269:6016 až 6025 (1994)] a proteiny VLA-1 a VLA-2 [Tamura a další, viz. výše] . Bylo prokázáno, že doména I u jiných integrinů participuje na vazbě s ICAM [Landis a další, J. Cell. Biol. 120:1519 až 1527 (1993); Diamond a další, J. Cell. Biol. 120:1031 až 1043 (1993)], což naznačuje, že polypeptid a_dmůže rovněž vázat zástupce povrchových molekul proteinové rodiny ICAM. Bylo prokázáno, že tato oblast neexistuje v žádné jiné podjednotce integrinů.

Odhadnutá aminokyselinová sekvence polypeptidu a_d je z přibližně 36% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDlla, z přibližně 60% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDllb a z přibližně 66% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDllc. Na Obrázku 1

4 44 4 44 4444 4

4 4444 444

4·4· 4 44 44 ·· 44 jsou zobrazeny srovnané aminokyselinové sekvence polypeptidů CDllb (SEK. ID. Č. : 3), CDllc (SEK. ID. Č.: 4) a a_d(SEK. ID. Č.: 2) .

U organizmů jednoho druhu se obvykle cytoplazmatické domény podjednotek a v integrinech β₂ podstatně liší, zatímco jednotlivé typy podjednotek a vykazují mezi jednotlivými druhy vysoký stupeň homologie. V souladu s těmito pozorováními, se cytoplazmatická oblast polypeptidu a_d podstatně liší od cytoplazmatických oblastí polypeptidů CDlla, CDllb a CDllc, ovšem s výjimkou aminokyselinové sekvence GFFKR (nacházející se v těsné blízkosti membrány), která je konzervována mezi všemi podjednotkami a [Rojiani a další, Biochemistry 30: 9859 až 9866 (1991)]. Protože oblast cytoplazmatického konce integrinů se účastní inside out signalizace a regulace avidity [Landis a další, viz. výše], je možné, že polypeptid a_d interaguje s molekulami cytosolu, které jsou odlišné od molekul interagujících s CDlla, CDllb a CDllc, a výsledkem toho může být skutečnost, že polypeptid a_d se účastní signálních drah odlišných od signálních drah, ve kterých participují jiné integriny β₂.

Extracelulární doména polypeptidu a_d obsahuje, v pozici vedle domény I, konzervovanou aminokyselinovou sekvenci DGSGS; u polypeptidu CDllb je sekvence DGSGS oblastí vážící kovy, a je nezbytná pro interakci s ligandem [Michishita a další. Cell 72:857 až 867 (1993)]. V aminokyselinové sekvenci polypeptidu a_d klonu 19A2 (SEK. ID. Č.: 1) jsou na pozicích 465 až 474, 518 až 527 a 592 až 600 konzervovány další tři místa, která jsou v polypeptidech CDllb a CDllc pravděpodobně odpovědná za vazbu kationtů. Doména I polypeptidu a_d vykazuje 36%, 62% a 57% homologii k odpovídajícím oblastem polypeptidů CDlla, CDllb resp. CDllc. Tento relativně nízký stupeň sekvenční homologie naznačuje, že ·· ··· · ·· · ·· · · · · · • · ··· · · · · • · ·· · ·· ···· · • · · · · · » · · ····· · · ·· · · · · podjednotka a_d může interagovat se skupinou extracelulárních proteinů, které jsou odlišné od proteinů, se kterými reagují jiné známé integriny β₂. Rovněž afinita polypeptidú a_d ke známým ligandům integrinů β₂, jakými jsou například ICAM-1, ICAM-2 a/nebo ICAM-R, může být odlišná od afinity demonstrované u interakcí integrin β₂/ΙΟΑΜ (viz. Příklad 12) .

Izolace dalších klonů cDNA pro lidský oc_d, použitých k ověření sekvence

Aby bylo možné potvrdit sekvenci DNA kódující lidský oc_d, byly z knihovny cDNA z lidské sleziny (Invitrogen) zaklonované do vektoru pcDNA/Amp (popsané v Příkladu 5), pomocí hybridizace, izolovány další molekuly cDNA. Elektroforézou na agarózovém gelu byly vybrány pouze cDNA s délkou převyšující 3 kb. Sonda použitá při hybridizaci byla odvozena od 5' koncové oblasti a_d (jak je popsáno níže). Hybridizační podmínky byly totožné s podmínkami při izolaci prvního klonu lidského a_d, pouze s tou výjimkou, že po hybridizaci byly filtry při pokojové teplotě dvakrát promyty v roztoku 2x SSC/0,1% SDS a jednou roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C. Filtry byly přes noc exponovány na film Kodak X-Omat AR.

Hybridizační sonda 5' a_d byla vytvořena pomocí reakce PCR z klonu 19A2 za použití primerů CDllc 5' For (SEK. ID. Č.: 94) a CDllc 5' Rev (SEK. ID. Č.: 95). Reakce byla prováděna následovně. Vzorky byly po dobu 4 minut udržovány při 94°C a poté vystaveny, v cykleru Perkin-Elmer 9600, 30 cyklům změn teplot: i) 94°C, po dobu 15 sekund; ii) 5°C, po dobu 30 sekund; a iii) 72°C, po dobu 1 minuty.

·· *··· ·* ···« ·· ·· ·· · · · · · · · · ·· ··· ···· • · · · · ·· · · · · • · ···· ·«· ··»·· ·· ·· · · ··

CDllc 5' For: (5')CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3') (SEK. ID. Č. : 94)

CDllc 5' Rev: (5')CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3') (SEK. ID. Č.: 95)

Produkt amplifikační reakce byl purifikován za použití kitu Prep-A-Gene firmy BioRad (Hercules, CA) postupem doporučeným výrobcem. Získaná sonda 5' a_d byla dlouhá přibližně 720 bází, což odpovídá oblasti začínající oligonukleotidem 1121 a končící oligonukleotidem 1839 v SEK. ID. Č.: 1. Purifikovaná DNA (přibližně 50 ng) byla, postupem doporučeným výrobcem, za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana) radioaktivně označena izotopem ³²P-dCTP. Nezainkorporovaný izotop byl odstraněn za použití sloupců „Centrisep Spin Columns (Princeton Separations, Adelphia, NJ) postupem doporučeným výrobcem. Radioaktivně označená sonda byla přidána k filtrům namočeným v prehybridizačním roztoku obsahujícím 45% formamid a inkubace probíhala přes noc při 50°C. Po této inkubaci byly filtry promyty postupem popsaným výše.

Třináct kolonií poskytlo na obou duplikátech filtrů pozitivní signál. Pozitivní kolonie byly sebrány se zásobní plotny, zředěny pomocí LBM s karbenicilinem (100 pg/ml) a v různých ředěních vysety na filtry Hybond (Amersham). Duplikáty těchto filtrů byly hybridizovány v roztoku o stejném složení jako při první hybridizaci a po hybridizaci byly filtry promyty roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C a poté exponovány na film.

Při druhém testu bylo potvrzeno deset z původně identifikovaných třinácti pozitivních kolonií. Dva z těchto deseti klonů (označené A7.Q a A8.Q) byly sekvenovány a bylo stanoveno, že kódují lidský a_d. U klonu A7.Q bylo zjištěno,

4444

ΦΦ ···· ·· ·· ·· 4 ·· Φ 4 4 4 4 • Φ φ Φ Φ ΦΦΦΦ φ Φ ΦΦΦ Φ * ΦΦΦ Φ Φ φ φ ΦΦΦΦ ΦΦΦ

ΦΦΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·· že je přibližně 2,5 kb dlouhý, obsahuje vedoucí sekvenci na 5' konci, část kódující oblasti a dalších 60 bází nepřekládané sekvence na 5' konci. Bylo zjištěno, že nekompletní kódující oblast je výsledkem nesprávně sestřižené oblasti intronu v místě odpovídajícím oligonukleotidu 2152 v SEK.

ID. Č.: 1. U klonu A8.Q bylo zjištěno, že je přibližně 4 kb dlouhý, obsahuje celou kódující oblast pro polypeptid a_d a rovněž obsahuje sekvenci intronu v místě odpovídajícím bázi 305 v SEK. ID. Č.: 1. Ve srovnání s původně izolovaným klonem a_d (SEK. ID. Č.: 1) byl u obou klonů, jak A7.Q tak A8.Q, pozorován jeden rozdíl. Tímto rozdílem byla skutečnost, že klony A7.Q a A8.Q mají v místě báze 1495 vložen kodon tvořený třemi bázemi CAG. Sekvence klonů A7.Q a A8.Q jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 96 a 97, a složené lidské sekvence odvozené od klonů A7.Q a A8.Q spolu s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi jsou zobrazeny jako SEK.

ID. Č.: 98 a 99.

Příklad 6

Analýza exprese lidského a_d ve tkáních, prováděná metodou Northern Blot

Za účelem stanovení relativní hladiny a tkáňové specifity exprese a_d, byla za použití fragmentů z klonu 19A2 jako sondy, provedena analýza metodou Northern Blot. Na agarózový gel s formaldehydem a 1 pg ethidium bromidu bylo z každého vzorku, získaného z několika lidských tkání a kultivovaných buněčných linií, naneseno přibližně 10 pg RNA.

Po elektroforéze prováděné po dobu 4 hodin při napětí 100 V byla RNA přenesena na nitrocelulózovou membránu (Schleicher & Schuell) metodou kapilárního přenosu prováděnou v lOx SSC přes noc. Membrána byla „zapečena ve vakuu při 80°C po dobu 1,5 hodin. K blokování membrány byl použit prehybridizační roztok obsahující 50% formamid v pufru kyseliny 3-(N37 • · · · ·

morfolino)propansulfonové (MOPS). Prehybridizace probíhala 3 hodiny při 42 °C. Fragmenty klonu 19A2 byly, postupem doporučeným výrobcem, za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim radioaktivně označena izotopem a³²P-dCTP a a³²P-dTTP. Nezainkorporovaná značka byla odstraněna na koloně Sephadexu G25 v pufru TE. K hybridizací byl použit hybridizační pufr o aktivitě 1,5 x 10⁶ c. p.

m./ml. Následně byl blot při pokojové teplotě promyt roztokem 2x SSC/0,1% SDS, dále pak roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C, roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C, roztokem lx SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C, roztokem 0,5x SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C a nakonec roztokem 0,lx SSC/0,1% SDS o teplotě 50°C. Poté byl blot po dobu 19 hodin exponován na film.

Hybridizace za použití fragmentu vyštěpeného z klonu 19A2 restrikčním enzymem BstXI (odpovídajícímu nukleotidům 2011 až 3388 v SEK. ID. Č.: 1) poskytla slabé signály u RNA, o velikosti přibližně 5 kb, z jater, placenty, thymu a mandlí (tonzil). Ve vzorcích z ledvin, mozku a srdce nebyl detekován žádný signál. Množství RNA přítomné ve vzorku z ledvin bylo minimální (jak ukázalo barvení ethidium bromidem) .

Při použití druhého fragmentu z klonu 19A2 (zahrnujícího oblast bází 500 až 2100 v SEK. ID. Č.: 1) byly v lidských tkáních, metodou Northern Blot využívající RNA s poly-A sekvencí (Clontech), detekovány RNA transkripty dvou rozdílných velikostí. Ve slezině a kosterních svalech byl detekován proužek o velikosti 6,5 kb, zatímco v plicích a leukocytech periferního krevního oběhu byl detekován proužek o velikosti 4,5 kb. Rozdíly v pozorovaných velikostech mohou být způsobeny tkáňově specifickou polyadenylací, křížovou reaktivitou zmíněné sondy s jinými zástupci rodiny integrinů nebo hybridizací sondy s alternativně sestřiženými RNA.

·· ···♦

Analýza prováděná metodou Northern Blot a využívající třetí fragment z klonu 19A2, zahrnující nukleotidy 2000 až 3100 v SEK. ID. Č.: 1, poskytla obdobné výsledky jako analýzy využívající jiné fragmenty klonu 19A2.

Za použití fragmentů odpovídajících nukleotidům 500 až 2100 a 2000 až 3100 v SEK. ID. Č.: 1 byla rovněž testován RNA získaná ze tří linií myeloidních buněk. Buněčná linie THP-1, stimulovaná prostřednictvím PMA, poskytla neostrý signál v té samé oblasti (přibližně 5,0 kb), jak tomu bylo u signálů z jiných tkání; tento signál byl nicméně poněkud silnější. RNA získaná z nestimulovaných buněk HL-60 a z buněk HL-60 stimulovaných prostřednictvím DMSO, poskytla při hybridizací se sondou aa signál o intenzitě odpovídající intenzitě signálu u vzorků tkáně, nicméně zdálo se, že vystavení buněk působení PMA zvyšuje intenzitu tohoto signálu. Jelikož jak PMA, tak DMSO směrují diferenciaci buněk HL-60 po dráze monocyty/makrofágy (PMA) resp. granulocyty (DMSO), naznačuje tento výsledek existenci zvýšené exprese polypeptidů a_d u buněčného typu monocyty/makrofágy. V buňkách U937 je přítomna mRNA pro a_d a stimulací prostřednictvím PMA nedochází k zesílení signálu. Žádná pozitivní odezva nebyla detekována u buněk Molt, Daudi, H9, JY nebo Jurkat .

Příklad 7

Přechodná exprese konstruktů kódujících lidský oc_d

A. Vytvoření expresívních konstruktů

Lidský klon 19A2 postrádá iniciační kodon pro methionin a pravděpodobně také část signální sekvence na 5' konci. K vytvoření expresivního plazmidů obsahujícího sekvence lidského klonu 19A2 byly tudíž použity dva odlišné přístupy. Při prvním přístupu byly zkonstruovány dva plazmidy, ve • · · · • · · · kterých byly k vytvoření chimérické sekvence kódující a_dpoužity sekvence kódující signální peptid odvozené od genů kódujících polypeptidy CDllb nebo CDllc, které byly připojeny k sekvenci pro oc_d. Při druhém přístupu byl zkonstruován třetí plazmid, ve kterém byl na pozici 0 v klonu 19A2 přidán adenosin a tím byl vytvořen kodon pro iniciační methionin.

Zmíněné tři plazmidy obsahovaly rozdílné oblasti, které se liší na 5' konci sekvence kódující polypeptid oc_d nebo chimérický polypeptid a_d. Oblast kódující oc_d byla pomocí PCR (viz. podmínky v Příkladu 2) amplifikována za použití specifického primeru BamRev vymezujícího 3' konec kódujícího vlákna (dále jen 3' primer nebo reverzní primer) (viz. SEK. ID. Č.: 26) a jednoho ze tří primerů vymezujících k 5' konec kódujícího vlákna (dále jen 5' primer nebo přímý primer) . Zmíněné tři 5' primery v sekvenci obsahovaly: (1) na pozicích 1 až 6 identické nespecifické báze umožňující restrikční štěpení, na pozicích 7 až 12 restrikční místo EcoRI a na pozicích 13 až 18 konvenční Kozákovu sekvenci; (2) část signální sekvence odvozené od CDllb (primer ER1B) nebo CDllc (primer ER1C) nebo adenosin (primer ER1D); a (3) dalších 15 až 17 bází komplementárních k sekvencím na 5' konci klonu 19A2, aby bylo umožněno „nasednutí primeru na DNA. Primery ER1B, ER1C nebo ERlD jsou zobrazeny v SEK. ID. Č.: 27, 28 nebo 29, kde je iniciační kodon pro methionin vyznačen tučně a restrikční místo EcoRI je podtrženo.

'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3' (SEK. ID. Č.: 26) '-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3' (SEK. ID. Č. : 27)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3' (SEK. ID. Č.: 28) • · · · • · • « • · · · · ···· * * · · · ·· ···· · • * · · · · ··· ····' · · »· e· » · ^z-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (SEK. ID. Č. : 29)

Produkty získané reakcí PCR byly rozštěpeny restrikčními enzymy EcoRI a BamHI.

Všechny tři plazmidy obsahovaly totožnou druhou část kódující a_d (byla vložena po směru transkripce ihned za 5' oblast popsanou v předchozím odstavci), včetně 3' konce klonu oc_d. Tato druhá část kódující a_d, která zasahuje od nukleotidu 625 až do restrikčního místa Xbal nacházejícího se na 3' konci polylinkeru vektoru klonu 19A2, byla izolována štěpením klonu 19A2 restrikčními enzymy BamHI/Xbal.

Byly připraveny tři ligační reakce, při kterých byl fragment 3' a_d rozštěpený restrikčními enzymy BamHI/Xbal zaligován, za použití pufru pro ligázu a ligázy T4 (1 jednotka na 20 reakcí) firmy Boehringer Mannheim, do jednoho ze tří klonů 5' a_d rozštěpených restrikčními enzymy EcoRI/BamHI. Po čtyřhodinové inkubaci při 14°C bylo ke každé ligační reakci, spolu s jednou jednotkou ligázy, přidáno odpovídající množství vektoru pcDNA.3 (Invitrogen) rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. Reakce probíhaly dalších 14 hodin. Jednou desetinou reakční směsi byly následně transformovány kompetentní buňky XL-1 Blue. Vyrostlé kolonie byly dále kultivovány a byla z nich izolována DNA (viz. Příklad 5). Štěpením pomocí EcoRI byly identifikovány tři klony, které obsahovaly restrikční místo EcoRI a tudíž i uměle vytvořené signální sekvence. Tyto klony byly označeny pATM.Bl (CDllb/a_d, primer ER1B), pATM.ClO (CDllc/a_d, primer ER1C) a pATM.D12 (adenosin/a_d, primer ERld). Přítomnost odpovídajících signálních sekvencí byla u každého klonu potvrzena sekvenováním příslušné nukleové kyseliny.

• ·

B. Transfekce buněk COS

Exprese z plazmidů kódujících a_d (zmíněných výše) bylo dosaženo kotransfekcí buněk COS vždy jedním z těchto plazmidů, spolu s expresívním plazmidem pro CD18, označeným pRC.CD18. Jako pozitivní kontroly byly použity buňky COS kotransfekované plazmidem pRC.CD18 a expresívním plazmidem pro CDlla, označeným pDC.CDlla.

hodin před vlastní transfekci byly, při 50% konfluenci, buňky v kultivačním médiu (DMEM/10%FBS/penicilinstreptomycin) přepasážovány do Petriho misek pro tkáňové kultury firmy Corning o průměru 10 cm. Při všech pasážováních byly buňky z kultivačních misek odstraněny pomocí Verseneho pufru (0,5 mM NaEDTA v PBS). Před vlastní transfekci byly misky jednou promyty médiem DMEM bez přídavku séra. Do každé misky bylo přidáno 15 pg jednotlivého plazmidu v 5 ml transfekčního pufru (DMEM s 20 pg/ml DEAE-Dextranu a 0,5 mM chlorochinem). Po 1,5 hodinové inkubaci při 37 °C byly buňky vystaveny šoku přidáním 5 ml DMEM/10% DMSO. Tento roztok DMSO byl poté nahrazen kultivačním médiem o objemu 10 ml/miska.

Vzniklé transfektanty byly analyzovány metodami ELISA, FACS a imunoprecipitací, jak je popsáno v Příkladech 8, 9 a 10.

Příklad 8

Analýza transfekovaných buněk COS metodou ELISA

Za účelem zjištění, jestli buňky COS kotransfekované expresívním plazmidem pRC.CD18 a plazmidem a_d exprimovaly na svém povrchu polypeptid a_d asociovaný s polypeptidem CD18, byla, za použití primárních protilátek proti CD18 (například TS1/18 purifikovaná z ATCC HB203), provedena analýza metodou ELISA. Jako pozitivní kontrola byly použity • · · · • · · « • · • · · ·· a · buňky kotransfekované expresívním plazmidem pro CD18 a expresívním plazmidem pro CDlla, označeným pDC.CDlla. U této kontroly byly jako primární protilátky použity protilátky proti CD18 a protilátky proti CDlla (například TS 1/22 purifikované z ATCC HB202).

Za účelem provedení analýzy metodou ELISA byly buňky z každé misky odstraněny pomocí Verseneho pufru a přeneseny na jednu 96-tí jamkovou destičku pro kultivaci tkáňových kultur firmy Corning. Buňky byly před vlastní analýzou ponechány v kultivačním médiu po dobu 2 dnů. Poté byly destičky dvakrát promyty roztokem D-PBS/0,5% želatina z kůže ryb (nadřádu Kostnatí) (Sigma) v objemu 150 μΐ/jamka. Tento pufr byl používán při všech krocích vyjma barvení. Veškeré promývání a inkubace byly prováděny při pokojové teplotě. Následně byly jamky po dobu jedné hodiny blokovány roztokem želatiny. Primární protilátky byly roztokem želatiny zředěny na koncentraci 10 pg/ml a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ tohoto roztoku. Po jednohodinové inkubaci byly destičky 3x promyty roztokem želatiny v objemu 150 μΐ/jamka. Ve zředění 1:3500 byla přidána sekundární protilátka (kozí protilátka specificky namířená proti myší Ig/HRP-Fc [Jackson, West Grove, PA]) v objemu 50 μΐ/jamka a destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny. Po třech promytích byly destičky, před přidáním 15% kyseliny sírové v objemu 50 μΐ/jamka, po dobu 20 minut barveny v roztoku o-fenyldiaminu (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD v citrátovém pufru).

Analýza transfekovaných buněk, prováděná metodou ELISA za použití protilátek specificky namířených proti CD18, neodhalila u buněk transfekovaných pouze plazmidem kódujícím CD18 žádnou výrazně vyšší hladinu exprese, než jaké bylo pozadí. Buňky kotransfekované plazmidy kódujícími CDlla a CD18 vykazovaly při analýzách, při kterých byly použity protilátky specificky namířené proti CD18 nebo protilátky specificky namířené proti CDlla, vyšší hladiny exprese, než • · · ·

• · ·

I · « • · · · • · • · a jaké bylo pozadí. Další analýzy buněk transfekovaných plazmidem kódujícím CD18 a jedním z expresívních konstruktů kódujících a_d (pATM. CIO nebo pATM.D12) odhalily, že exprese CD18 na povrchu buněk je zvýšena souběžnou expresí polypeptidu oc_d. Zvýšení exprese polypeptidu CD18, detekované u buněk COS transfekovaných plazmidy pATM. CIO nebo pATM.Dl2, bylo srovnatelné se zvýšením pozorovaným u kontrolních buněk kotransfekovaných plazmidy kódujícími CDlla/CDl8.

Příklad 9

Analýza transfekovaných buněk COS prováděná s využitím

FACS

Buňkám v Petriho miskách bylo jeden den před transfekcí vyměněno kultivačním médium za čerstvé a před vlastní analýzou prováděnou s využitím FACS byly buňky inkubovány po dobu 2 dnů. Transfekované buňky byly pomocí 3 ml Verseneho pufru odstraněny z misek, jednou promyty 5 ml pufru pro FACS (DMEM/2% FBS/0,2% azid sodný) a zředěny 0,1 ml pufru pro FACS na koncentraci 500000 buněk/vzorek. Ke každému vzorku bylo přidáno bud’ 10 μΐ protilátek specificky namířených proti CD18, CDlla nebo CDllb o koncentraci lmg/ml konjugovaných s FITC (Becton Dickinson) nebo 10 μΐ myší protilátky 23F2G (proti CD18) (ATCC HB11081) o koncentraci 800 pg/ml konjugované s CFSE. Poté byly vzorky inkubovány 45 minut na ledu, 3x promyty pufrem pro FACS o objemu 5 ml/promytí a rozsuspendovány v 0,2 ml pufru pro FACS. Vzorky byly měřeny na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson a získaná data byla analyzována za použití programu Lysys II (Becton Dickinson).

Buňky COS, transfekované pouze plazmidem kódujícím

CD18, nebyly značeny protilátkami (s konjugovaným markérem) namířenými proti CD18, CDlla nebo CDllb. Jestliže byly buňky kotransfekovány sekvencemi kódujícími CDlla/CDl8, bylo • · • · · · • · · · · · • · · • · • ·· · · protilátkami namířenými proti CDlla nebo CD18 označeno přibližně 15% buněk. Žádná z buněk transfekovaných plazmidem kódujícím CD18 spolu s jakýmkoliv konstruktem kódujícím a_dnebyla značena protilátkou namířenou proti polypeptidům CDlla a CDllb. 4%, 13% a 8% buněk ze skupin transfekovaných plazmidy pATM.Bl, pATM.ClO resp. pATM.Dl2 reagovalo ze pozitivně na barvení protilátkou proti CD18. Intenzita fluorescence pozitivních populací ze skupiny CDlla/CD18 byla čtyřnásobně vyšší než pozadí. Pro srovnání, kotransfekce buněk konstruktem kódujícím a_d a konstruktem pro CD18 vedla k vytvoření pozitivní populace buněk, které vykazovala čtyř až sedmi násobné zvýšení intenzity fluorescence oproti hodnotám pozadí.

Příklad 10

Imunoprecipitace komplexů lidský a_d/CDl8 z kotransfekovaných buněk COS značených biotinem

Za účelem zjištění, jestli může být polýpeptid a_d izolován jako část heterodimerního komplexu αβ s charakteristikou integrinů, byl u buněk kotransfekovaných expresívním plazmidem kódujícím CD18 a každým z expresívních plazmidu kódujících polýpeptid a_d (popsaných v Příkladu 7), proveden pokus o imunoprecipitaci komplexu a_d/CD18.

Transfekované buňky (1 až 3 χ 10⁸ buněk/skupina) byly z Petriho misek odstraněny pomocí Verseneho pufru a třikrát promyty roztokem D-PBS v objemu 50 ml/skupina. Každý vzorek byl označen pomocí 2 mg Sulpho-NHS Biotin (Pierce, Rockford, IL). Značení probíhalo 15 minut při pokojové teplotě a bylo ukončeno promytím (třikrát) chladným roztokem D-PBS v objemu 50 ml/vzorek. Promyté buňky byly rozsuspendovány v 1 ml lyzačního pufru (1% NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM Ca⁺⁺, 2 mM Mg⁺⁺ a inhibitory proteáz) a inkubo45 • · · · • ·

vány po dobu 15 minut na ledu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací prováděnou při lOOOOxg po dobu 5 minut a supernatant byl přenesen do prázdných zkumavek. Aby byl odstraněn materiál nespecificky reagující s myším imunoglobulinem, bylo na počátku provedeno předčištění vzorku. Při 4°C bylo se supernatanty inkubováno 25 pg myšího imunoglobulinu (Cappel, West Chester, PA). Po 2,5 hodinách bylo ke každému vzorku přidáno 100 pl (25 pg) Sepharózy konjugované s králičí protilátkou namířenou proti myším Ig (připraveno z Proteinu A-Sepharózy 4B a králičí protilátky namířené proti myšímu IgG, obojí od firmy Zymed, San Francisco, CA); inkubace probíhala za stálého třepání při 4°C po dobu 16 hodin. Částice Sepharózy byly od supernatantu odstraněny centrifugací. Po tomto předčištění byly supernatanty při 4°C po dobu 2 hodin inkubovány s 20 pg protilátky namířené proti CD18 (TS1.18). Od supernatantu byly komplexy protilátka/antigen izolovány inkubací s přípravkem králičí protilátka proti myším Ig/Protein A-Sepharóza o objemu 100 pl/vzorek, postupem popsaným výše. Částice nosiče byly čtyřikrát promyty roztokem 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl a 1 % Triton-X 100. Promyté částice byly zcentrifugovány a po dobu 10 minut vařeny ve 20 pl 2x Laemmliho vzorkového pufru s 2% β-merkaptoethanolem. Vzorky byly zcentrifugovány a rozděleny elektoforézou na polyakrylamidovém gelu Novex (Novex) prováděnou po dobu 30 minut při napětí 100V. Proteiny byly poté v pufru TBS-T přeneseny na nitrocelulózové membrány (Schleicher & Schuell); 100 mA po dobu 1 hodiny. Membrány byly 2 hodiny blokovány pomocí 3% BSA v TBS-T. Po dobu 1 hodiny byly membrány inkubovány s křenovou peroxidázou se strepavidinem (POD) (Boehringer Mannheim) ve zředění 1:6000 a poté třikrát promyty v TBS-T. K obarvení blotu byl použit (postupem popsaným výrobcem) „Enhanced Chemiluminescence kit firmy Amersham. Membrány byly na 0,5 až 2 minuty exponovány na Hyperfilm MP (Amersham).

• · · ·

Imunoprecipitace komplexů CD18 z buněk transfekovaných plazmidem pRC.CD18 spolu s jedním z plazmidů pATM.Bl, pATM.ClO nebo pATM.Dl2 odhalila povrchovou expresi heterodimerů skládajících se z řetězce β o molekulové hmotnosti přibližně 100 kD, která odpovídá předpokládané velikosti CD18, a řetězce α o molekulové hmotnosti přibližně 150 kD, která odpovídá molekulové hmotnosti polypeptidů a_d.

Příklad 11

Stabilní transfekce lidského a_d do buněk ovárií čínského křečka

Za účelem zjištění, jestli je polypeptid a_d exprimován na povrchu buněk ve formě heterodimeru spolu s CD18, byly buněčné linie postrádající jak a_d, tak CD18, přechodně a stabilně transfekovány molekulami cDNA kódujícími tyto jednotlivé řetězce.

Pro tyto experimenty byla, způsobem popsaným v Příkladu 7, k cDNA kódující a_d přidána další vedoucí sekvence a Kozákova konvenční sekvence, a celý tento konstrukt byl zaklonován do expresívního vektoru pcDNA3. Výsledným konstruktem, označeným pATM.Dl2, společně s modifikovaným komerčně dostupným vektorem pDCl.CD18 kódujícím lidský CD18, byly kotransfekovány buňky ovárií čínského křečka (CHO) deficientní v aktivitě dihydrofolát reduktázy (DHFR)^-. Plazmid pDCl.CDl8 kóduje markér DHFR⁺ a transfekované buňky mohou být selektovány za použití vhodného média neobsahujícího příslušný nukleosid. K vytvoření plazmidu pDCl.CDl8 byly použity následující modifikace.

Plazmid pRC/CMV (Invitrogen) je savčí expresívní vektor s promotorem cytomegaloviru a jako selekční markér obsahuje gen pro rezistenci vůči ampicilinu. Gen kódující DHFR z plazmidu pSC1190-DHFR byl vložen na 5' konec počátku repli47 • · · · • 9 • · ·· · ···· • · * · · ·· ···· · • · ··«· · · e ···· * ·· ·· ·· 99 kace SV40 ve vektoru pRC/CMV. Navíc byl do plazmidového konstruktu pRC/CMV/DHFR zaligován, na 3' konec genu pro DHFR, polylinker z 5' oblasti plazmidu pHF2G-DHF. Následně byly do vzniklého plazmidu zaklonovány, mezi oblast polylinkeru na 5' konci a oblast poly-A sekvence bovinního růstového hormonu, kódující sekvence pro CD18.

Povrchová exprese polypeptidu CD18 byla analyzována průtokovou cytometrií za použití monoklonální protilátky TS1/18. Tvorba heterodimerů mezi a_d a CD18 u této buněčné linie byla v souladu s údaji získanými imunoprecipitací popsanou v Příkladu 10 při přechodné expresi buněk COS.

Příklad 12

Lidský a_d se váže na molekulu ICAM-R a tato vazba je závislá na přítomnosti CD18

Vzhledem k publikovaným údajům, které prokazují interakce mezi integriny leukocytů a mezibuněčnými adhezivními molekulami (ICAM), které zprostředkovávají kontakt buňkabuňka [Hyneš, Cell 69:11 až 25 (1992)], byla schopnost buněk CHO exprimujících a_d/CDl8 vázat ICAM-1, ICAM-R nebo VCAM analyzována dvěma metodami.

V opakovaných stanoveních byly rozpustné fúzní proteiny ICAM-1, ICAM-R nebo VCAM s IgGl imobilizovány na povrchu plastu, a byla stanovována schopnost buněk COS transfekovaných plazmidy kódujícími a_d/CD18 vázat se k těmto imobilizovaným ligandům. Transfekované buňky byly intracelulárně označeny pomocí kalceinu, promyty vazebným pufrem (RPMI s 1% BSA) a inkubovány buď v samotném pufru (s nebo bez přítomnosti 10 ng/ml PMA) nebo v pufru s monoklonálními protilátkami namířenými proti CD18 v koncentracích 10 pg/ml.

Transfekované buňky byly umístěny do čtyř 96-ti jamkových mikrotitračních destiček Immulon s jamkami předem potažený48 • · · · • · · · · · · · · • · · · » · · · · · 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 99 9 9 99 mi rozpustnými fúzními proteiny ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM-1/IgGl nebo hovězím sérovým albuminem (BSA) jako negativní kontrolou. Rozpustné formy těchto adhezivních molekul jsou dokonale popsány v dosud nevyřízené Patentové přihlášce US č. 08/102852 (stejného vlastníka) podané 5. srpna 1993. Před přidáním značených buněk byly jamky blokovány roztokem 1% BSA v PBS. Po promytí destiček, prováděným ponořením destiček na 20 minut do roztoku 0,1% BSA v PBS, byla za použití přístroje Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA) měřena celková fluorescence v každé jamce.

V experimentech s imobilizovanými molekulami ICAM vykazovaly buňky kotransfekované plazmidy kódujícími a_d/CD18 v jamkách s ICAM-R/IgGl, ve srovnání s jamkami potaženými BSA, 3 až 5 násobně vyšší intenzitu vazby. Specifita této vazby a její závislost na přítomnosti CD18 byla prokázána inhibičními účinky protilátky TS1/18 namířené proti CD18. Buňky transfekované plazmidy kódujícími CDlla/CDl8 vykazovaly 2 až 3 násobně vyšší intenzitu vazby v jamkách s ICAM1/IgGl pouze když byly tyto buňky předem vystaveny působení PMA. Působení PMA na buňky transfekované a_d/CD18 nemělo na intenzitu fluorescence v jamkách potažených ICAM-1/IgGl nebo ICAM-R/IgGl žádný vliv. Nebyla detekována žádná vazba buněk transfekovaných a_d/CD18 na jamky potažené VCAM1/IgGl.

Vazba buněk, transfekovaných a_d/CD18, k rozpustným fúzním proteinům ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM-1/IgGl byla stanovována průtokovou cytometrií. Na každé měření byl ve 100 μΐ vazebného pufru (RPMI a 1% BSA), s nebo bez přítomnosti protilátky namířené proti CD18 v koncentraci 10 pg/ml, rozsuspendován přibližně 1 milion buněk CHO transfekovaných a_d/CD18 (kultivovaných za účelem vyšší exprese v lahvích s míchadlem - spinner flask). Po 20 minutové inkubaci při pokojové teplotě byly buňky promyty vazebným

pufrem a byly k nim přidány fúzní proteiny ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl na výslednou koncentraci 5 pg/ml. Navazování probíhalo 30 minut při 37 °C a poté byly buňky třikrát promyty a rozsuspendovány ve 100 μΐ vazebného pufru obsahujícího ve zředění 1:100 ovčí protilátku namířenou proti lidskému IgGl konjugovanou s FITC. Po 30 minutové inkubaci byly vzorky třikrát promyty a rozsuspendovány ve 200 μΐ vazebného pufru a analyzovány na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson.

Přibližně 40 až 50% buněk transfekovaných a_d/CD18 vázalo ICAM-R/IgGl, ale nebyla pozorována žádná vazba na proteiny ICAM-1/IgGl a VCAM-1/IgGl. Vystavení transfekovaných buněk předběžnému působení PMA nemělo žádný vliv na vazbu a_d/CD18 k proteinům ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM1/IgGl, což odpovídá stanovením prováděným s imobilizovanými proteiny. Při vystavení buněk transfekovaných a_d/CD18 působení protilátky TS1/18 namířené proti CD18, byla intenzita vazby k ICAM-R/IgGl snížena na hodnoty pozadí.

Data získaná z obou těchto stanovení ilustrují skutečnost, že oc_d/CDl8 se přednostně váže k molekule ICAM-R (ve srovnání s vazbou k ICAM-1 nebo VCAM-1). Upřednostňování vazby a_d/CD18 k ICAM-R oproti vazbě k ICAM-1 je v protikladu ke skutečnostem zjištěným pro CDlla/CDl8 a CDllb/CDl8. Můžeme tudíž očekávat, že modulace vazby a_d/CD18 může selektivně ovlivnit normální a patologické funkce imunitního systému, v nichž hraje molekula ICAM-R prominentní roli. Navíc výsledky podobných stanovení, při kterých byla testována schopnost protilátek, specificky namířených proti různým extracelulárním doménám proteinu ICAM-R, inhibovat vazbu na buňky transfekované a_d/CD18, naznačují, že heterodimery a_d/CD18 a CDlla/CD18 interagují s odlišnými doménami polypeptidu ICAM-R.

• ·

Nemožnost detekovat v roztoku vazbu CDlla/CD18 k fúzním proteinům ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl naznačuje, že afinita vazby mezi heterodimerem CDlla/CDl8 a ICAM-1 nebo ICAM-R je příliš nízká na to, aby umožnila vazbu těchto molekul v roztoku. Detekce vazby heterodimeru a_d/CDl8 k fúznímu proteinu ICAM-R/IgGl nicméně naznačuje neobvykle vysokou hodnotu afinity.

K testování vazby mutantu proteinu ICAM-R, označeného E37A/Ig, na buňky CHO exprimující heterodimer a_d/CD18 byla adheze analyzována s využitím FACS, postupem popsaným výše. Bylo prokázáno, že E37A/Ig se neváže k chimérickému proteinu LFA-l/Ig [Sadhu a další, Cell Adhesion a Communication 2: 429 až 440 (1994)]. Tento mutantní protein byl ve své rozpustné formě produkován stabilně transfekovanou buněčnou linií CHO a byl purifikován na koloně ProsepA postupem popsaným v publikaci Sadhu a další, viz. výše.

V opakovaných pokusech nebyla detekována vazba proteinu E37A/Ig na buňky transfekované a_d/CD18. Intenzita fluorescence v hlavním píku (MFI - mean fluorescence intensity) chimérického proteinu E37A/Ig, detekovaná s využitím protilátky namířené proti lidskému IgGl konjugované s FITC, byla totožná s MFI naměřenou u samotné protilátky, což naznačuje, že při použití mutantního proteinu E37A/Ig není v tomto experimentu detekován žádný signál převyšující hodnoty pozadí. Podobně při analýze prováděné metodou ELISA, postupem popsaným v Příkladu 14, se mutantní E37A/Ig nejspíš nevázal na imobilizovaný a_d/CD18.

Vazba polypeptidu a_d k proteinu iCb3

Komponenta komplementu označovaná C3 může být proteolyticky štěpena, čímž dojde k vytvoření komplexu iC3b, který iniciuje aktivaci alternativní cesty aktivace komplementu, jejíž výsledkem je buněčně zprostředkované zničení cíle.

·· ··· · • · · · · · ···· • · ·· · ···· • · ·· · ·· ···· · • · ···· ··· ·· ·» · · · · · «· ··

Jak CDllb tak CDllc se mohou účastnit vazby k iCb3 a následné fagocytózy částic obalených komplexem iCb3. Jako místo interakce s komplexem iCb3 byl nedávno identifikován peptidový fragment domény I v polypeptidu CDllb [Ueda a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 91:10680 až 10684 (1994)]. Oblast odpovědná za vazbu iCb3 je v polypeptidech CDllb, CDllc a a_d velmi konzervativní, což naznačuje existenci vazebné interakce a_d/iCb3.

Vazba polypeptidu a_d k iCb3 byla analyzována „růžicovým testem [Dana a další, J. Clin. Invest. 73:153 až 159 (1984)] za použití transfekovaných buněk nebo buněčných linií přirozeně exprimujících polypeptid a_d (například buňky HL60 stimulované pomocí PMA). Za přítomnosti nebo v nepřítomnosti monoklonální protilátky namířené proti CD18 (například protilátky TS1/18.1) byla srovnávána schopnost buněk CHO transfekovaných a_d/CD18, buněk CHO transfekovaných VLA-4 (negativní kontrola) a buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA (pozitivní kontrola), vytvářet „růžice.

Příklad 13

Testování prováděné technikami SPA

Inhibitory specificky inhibující vazbu mezi ligandy a_dpodle vynálezu a jejich vazebnými partnery (páru ligand a_d/anti-ligand) mohou být analyzovány nejrůznějšími způsoby, například technikami SPA popsanými v Patentové přihlášce US č. 4271139, publikacích Hart a Greenwald, Mol. Immunol. 12:265 až 267 (1979) a Hart a Greenwald, J. Nuc.

Med. 20:1062 až 1065 (1979).

Stručně řečeno, jeden člen z dvojice ligand a_d/antiligand je přímo nebo nepřímo navázán na pevný nosič. Nepřímá vazba může být zprostředkována monoklonální protilát52 kou přímo navázanou na pevnou podložku, přičemž tato protilátka rozpoznává specifický epitop na C-konci rozpustného β řetězce integrinů. Tímto epitopem by mohl být buď hemaglutinin nebo mykobakteriální epitop IIIE9 [Anderson a další, J. Immunol. 141:607 až 613 (1988)]. Na nosič je přímo navázána také fluorescenční látka. Jinou možností může být inkorporace fluorescenční látky přímo v pevném nosiči, jak je popsáno v Patentové přihlášce US č. 4568649. Ten člen dvojice ligand oc_d/anti-ligand, který není navázán na nosič, je označen radioaktivní sloučeninou, která emituje záření schopné excitovat fluorescenční agens. V případě, kdy ligand váže radioaktivně značený anti-ligand, se radioaktivní značka dostane dostatečně blízko k fluoroforu navázanému na nosič a může tento fluorofor excitovat a vyvolat tím světelnou emisi. Jestliže nedochází k vazbě, je radioaktivní značka obvykle příliš vzdálená od pevného nosiče, aby byla schopna excitovat fluorescenční agens a intenzita emitovaného světla je nízká. Emitované světlo je měřeno a korelováno s vazbou mezi ligandem a anti-ligandem. Přidání inhibitoru vazby ke vzorku způsobí snížení emise světla fluoroforem tím, že zabrání navázání radioaktivní značky v blízkosti pevného nosiče. Inhibitory vazby mohou být tudíž identifikovány měřením jejich vlivu na emisi světla fluoroforem ve vzorcích. Podobně mohou být rovněž identifikovány anti-ligandy polypeptidu a_d.

Při testování modulátorů vazby CAM prováděnými postupem zmíněným níže je při SPA použit rozpustný rekombinatní konstrukt a_d/CD18 s leucinovým zipem (viz. Příklad 14). Tento rekombinatní integrin je pomocí neblokující protilátky namířené proti podjednotce a nebo proti podjednotce β imobilizován na destičce předem pokryté fluorescenční látkou. Sloučeniny chemické knihovny a biotinylovaný chimérický protein CAM/Ig jsou na destičku přidány současně. Vazba chimérického proteinu CAM/Ig je detekována pomocí radioak53 • · · · · · • · • · « • · • · • · · · » · ·· ·· tivně značeného streptavidinu. V tomto stanovení jsou chimérické proteiny ICAM-l/Ig a ICAM-3/Ig biotinylovány pomocí kitu NHS-Sulfo-biotin LC (dlouhý řetězec, Pierce) postupem doporučeným výrobcem. Takto označené proteiny stále reagují s protilátkami specificky namířenými proti CAM a s využitím metody ELISA může být ukázáno, že reagují s imobilizovaným proteinem LFA-1. Detekce je prováděna s využitím konjugátu Strepavidin-HRP a následným obarvením s využitím OPD.

Jinou možností je přímé navázání purifikovaňého nebo částečně purifikovaňého rekombinatního leucinového zipu na destičku předem pokrytou fluorescenční látkou. Sloučeniny chemické knihovny a neznačený chimérický protein CAM/Ig jsou na destičku přidány současně. Navázaný CAM/Ig je detekován protilátkou namířenou proti lidskému Ig označenou » 125 izotopem I.

Ještě jinou možností je imobilizovat na scintilační destičku purifikovaný protein CAM/Ig. Poté jsou na destičku přidány sloučeniny chemické knihovny a koncentrovaný supernatant z buněk exprimujících rekombinatní integrin typu leucinového zipu. Vazba tohoto rekombinatního integrinů je detekována pomocí značené neblokující protilátky namířené proti podjednotce α nebo proti podjednotce β.

Příklad 14

Expresivní konstrukty rozpustného lidského polypeptidů aa

Exprese nezkráceného rozpustného lidského heterodimeru oc_d/CD18 poskytuje lehce purifikovatelný materiál, použitelný k imunizaci a vazebným studiím. Výhodou vytvoření rozpustného proteinu je skutečnost, že tento protein může být purifikován ze supernatantů a nemusí se purifikovat z lyzátů buněk (jako nezkrácený heterodimer a_d/CD18 vázaný na ·· »· • · · · • · ·♦ membránu); tento protein je tedy získán snadněji a s menším zastoupením nečistot.

Expresivní plazmid kódující rozpustný a_d byl vytvořen následovně. Štěpením restrikčními enzymy HindlII a AatlI byl z plazmidu pATM.D12 izolován nukleotidový fragment odpovídající oblasti bází 0 až 3161 v SEK. ID. Č.: 1. S využitím primerů sHAD.5 a sHAD.3, zobrazených jako SEK. ID.

Č.: 30 a 31, byl z plazmidu pATM.D12 reakcí PCR amplifikován fragment odpovídající oblasti bází 3130 až 3390 v SEK. ID. Č.: 1. Sekvence tohoto fragmentu se překrývá se sekvencí fragmentu získanou štěpením restrikčními enzymy HindlII/AatlI a na 3' konci obsahuje navíc restrikční místo Mlul.

5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (SEK. ID. Č.: 30)

5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3' (SEK. ID. Č.: 31 )

Produkt získaný amplifikaci prováděnou PCR byl rozštěpen restrikčními enzymy Aatl a Mlul a zaligován s fragmentem získaným štěpením restrikčními enzymy HindlII/AatlI. Získaný produkt byl zaligován do plazmidu pDC.l.s rozštěpeného restrikčními enzymy HindlII/MluI.

Tento konstrukt byl ve stabilně transfekovaných buňkách CHO exprimován společně s rozpustným proteinem CD18 a exprese byla detekována autoradiografickou vizulizací imunoprecipitovaných komplexů CD18 získaných z buněk označených ³⁵S-methioninem. Tento konstrukt byl rovněž spolu s CD18 exprimován v buňkách 293 [Berman a další, J. Cell. Biochem. 52:183 až 195 (1993)].

·· ····

Rozpustný nezkrácený konstrukt a_d

Vynález se rovněž týká alternativních expresívních konstruktů pro a_d. K usnadnění exprese a purifikace intaktního heterodimeru oc_d/CD18 budou zkonstruovány expresivní plazmidy kódující rozpustný oc_d a CD18. Polypeptidy kódované těmito plazmidy budou obsahovat fúzní sekvenci leucinového zipu, která bude v průběhu purifikace tento heterodimer stabilizovat [Chang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 91: 11408 až 11412 (1994)]. Stručně řečeno, DNA kódující aminokyselinové řetězce tvořené kyselými a zásaditými aminokyselinami tvořícími leucinový zip byly vytvořeny připojením promerů za použití oligonukleotidů popsaných v publikaci Chang a další. Sekvence DNA byly dále modifikovány tak, že do nich byly na 5' a 3' koncích zavedeny restrikční místa Mlul (5' konec) a Xbal (3' konec). Tato modifikace slouží k usnadnění zaklonování těchto sekvencí do expresívních konstruktů pro CD18 nebo a_d popsaných dříve. Ke zmíněným sekvencím DNA byly rovněž připojeny sekvence kódující hemaglutinin nebo polyhistidin a za restrikční místo Xbal byl vložen stop kodon. Sekvence kódující hemaglutinin nebo polyhistidin byly vloženy za účelem usnadnění afinitní purifikace exprimovaného proteinu. Do expresívního vektoru kódujícího CD18 jsou vloženy sekvence kódující řetězec leucinového zipu tvořený bazickými aminokyselinami; do konstruktu kódujícího řetězec oc_d je vložena sekvence kódující řetězec leucinového zipu tvořený kyselými aminokyselinami. Předpokládá se, že po expresi modifikovaných proteinů a_d a CD18 v hostitelských buňkách, bude interakce mezi řetězcem tvořeným bazickými aminokyselinami a řetězcem tvořeným kyselými aminokyselinami stabilizovat tento heterodimer a umožní izolaci intaktní molekuly a_d/CD18 metodou afinitní purifikace popsanou výše.

φφ φφφφ

Φ· ···· φφ φ» • * · ΦΦ Φ ΦΦΦΦ • · ΦΦΦ Φ · ·· • · ·· · ΦΦ ΦΦ·· Φ • · Φ··· Φ·· »··· · Φ » ΦΦ ΦΦ ΦΦ

Byly zkonstruovány plazmidy pro expresi rozpustného a_da CD18 s „leucinovým zipem tvořeným sekvencemi kódujícími kyselé a bazické aminokyseliny, a těmito plazmidy byly, metodou využívající DEAE/Dextran popsanou v Příkladu 7, transfekovány buňky COS. Vzniklý protein byl označen jako a_d/CD18LZ. Transfekované buňky byly po dobu 14 dnů kultivovány v médiu se sníženým obsahem séra (2%). Supernatanty z transfekovaných buněk byly sbírány každý pátý den, a metodou ELISA popsanou v Příkladu 8, v nich byla analyzována produkce proteinů. Stručně řečeno, heterodimer a_d/CD18LZ byl imobilizován na destičkách povlečených monoklonální protilátkou 169B namířenou proti a_d (viz. Příklad 15). Komplex a_d/CD18LZ byly detekován přidáním biotinylované monoklonální protilátky namířené proti CD18 (TS1/18.1, viz.

Příklad 8) s následným přidáním konjugátu streptavidin/křenová peroxidáza (HRP) a o-fenyldiaminu (OPD). V supernatantech byla detekována přítomnost těchto proteinů.

Vazebné studie prováděné za použití nezkráceného expresívního produktu a_d

Funkční vazebné analýzy s rozpustným nezkráceným heterodimerem a_d/CD18LZ, popsaným výše, byly prováděny při imobilizaci heterodimeru na destičky potažené monoklonální protilátkou 169B nebo neblokující monoklonální protilátkou namířenou proti CD18 (viz. Příklad 15). K zamezení nespecifických vazeb byly jamky, před přidáním chimérických proteinů CAM/Ig (viz. Příklad 12) v počáteční koncentraci 10 pg/ml, blokovány pomocí želatiny získané z rybí kůže. Vazba zmíněných chimérických proteinů k heterodimeru a_d/CDl8LZ byla detekována prostřednictvím konjugátu HRP s kozí protilátkou namířenou proti lidskému Ig (Jackson Labs) a následným obarvením pomocí OPD.

φφ ···· φφ φ

φφφφ φ φ φ φ φ φ

Φ· ···· ·· φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ

Bylo pozorováno, že VCAM-l/Ig se k imobilizovanému heterodimeru a_d/CD18LZ váže 3 až 5-krát intenzivněji než k imobilizovanému heterodimeru CDlla/CDl8. Molekuly ICAM-l/Ig a ICAM-2/Ig poskytují při vazbě na rozpustný heterodimer CDlla/CDl8 15-krát resp. 10-krát intenzivnější signál (ve srovnání s pozadím), ale nevážou se na heterodimer a_d/CD18LZ. Vazba VCAM-1 byla, za přítomnosti kombinace protilátek 130K a 130P specificky namířených proti VCAM-1, snížena přibližně o 50%.

Vazebné studie byly rovněž prováděny na 96-ti jamkových destičkách s imobilizovaným proteinem ICAM/Ig a následným přidáním rozpustného rekombinatního integrinů přítomného v buněčném supernatantu. Vazba rozpustných integrinů byla detekována pomocí neznačené neblokující myší protilátky namířené proti řetězci a nebo β, a následnou inkubací s kozí protilátkou specificky namířenou proti myším Ig konjugovanou s HRP a obarvením s využitím OPD.

Získané výsledky naznačují, že naměřená hodnota při vazbě oc_d/CD18LZ k ICAM-R/Ig, detekované pomocí neblokující protilátky, byla 10-krát vyšší než tomu bylo v kontrolních jamkách neobsahujících žádnou protilátku. Nebyla detekována vazba rozpustného heterodimeru a_d/CD18 k imobilizovanému ICAM-l/Ig, ale naproti tomu byla detekována vazba mezi a_d/CD18LZ a imobilizovanými heterodimery CDllb/CD18 a CDlla/CD18 15-krát (CDllb/CDl8) a 5-krát (CDlla/CDl8) vyšší než byly hodnoty pozadí.

Jelikož předchozí studie prokázaly, že molekuly CDllb a CDllc vážou lipopolysacharid (LPS) [Wright, Curr. Opin. Immunol. 3:83 až 90 (1991); Ingalls a Golenbock, J. Exp. Med. 181:1473 až 1479 (1995)], byla, pomocí průtokové cytometrie a stanovení prováděných na titračních destičkách, rovněž analyzována vazba LPS na heterodimer a_d/CD18. Získané výsledky ukazují, že LSP, značený FITC, izolovaný z mikroor58 • fl · · · ·

ganizmů S. Minnesota a S. typhosa (oba získány od firmy Sigma) se v koncentraci 20 pg/ml slabě vázal na buňky CHO transfekované a_d/CD18. U netransfekovaných buněk CHO nebyla detekována žádná vazba. Při stanoveních prováděných metodou ELISA se biotinylovaný LPS [Luk a další, Alan. Biochem. 232:217 až 224 (1995)] v množství 0,5 až 3,0 pg vázal k imobilizovanému heterodimeru oc_d/CD18 a poskytoval čtyřikrát větší signál, než tomu bylo v jamkách se samotnou protilátkou a blokujícím agens. Zdánlivá vazba LPS na CDlla/CD18 byla, po odečtení hodnot pozadí (vazba protilátky TS2/4 namířené proti CDlla), nevýznamná.

Aby bylo možné identifikovat další ligandy pro a_d/CDl8, je rekombinatní protein a_d/CD18LZ použit ve dvou provázaných studiích. Za účelem stanovení, které buňky na svém povrchu exprimují ligandy pro a_d, je analyzována vazba různých typů buněk na imobilizovaný protein. Následně je využita inhibice vazby s využitím protilátek, s jejichž pomocí je možné stanovit, které známé povrchové adhezivní molekuly jsou odpovědné za pozorovanou vazbu buněk. Jestliže není pozorována žádná inhibice, je při pokusu o identifikaci ligandu využita koimunoprecipitace heterodimeru a_d/CD18LZ navázaného na proteiny(které budou vázat a_d) z lyžovaných buněk.

Expresívní konstrukty kódující doménu I rozpustného lidského polypeptidu a_d

Již dříve bylo publikováno, že doména I v molekule CDlla může být exprimována jako nezávlislá strukturní jednotka, která si udržuje schopnost vázat ligandy a schopnost být rozpoznávána protilátkami [Randi a Hogg, J. Biol. Chem. 269:12395 až 12398 (1994); Zhout a další, J. Biol. Chem. 269:17075 až 17079 (1994); Michishita a další, Cell 72:857 ···· ·· · · • · · · · · • · · · · · • ·· ···· · až 867 (1993)]. Za účelem vytvoření rozpustného fúzního proteinu skládajícího se z domény I polypeptidů a_d a lidského IgG4, byla pomocí PCR amplifikována sekvence kódující doménu I polypeptidů a_d. K této PCR reakci byly použity primery, které, kvůli usnadnění klonování, přidávají na konce sekvence restrikční místa BamHI a Xhol. Tyto primery jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 32 a 33 a restrikční místa jsou zde podtržena.

5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3' (SEK. ID. Č. : 32)

5'-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3' (SEK. ID. Č.: 33)

Nukleotid C nacházející se v SEK. ID. Č.: 32 na 3' konci vedle restrikčního místa BamHI odpovídá nukleotidu 435 v SEK. ID. Č.: 1; nukleotid G nacházející se v SEK. ID. Č.:

na 3 konci vedle restrikčního místa Xhol odpovídá nukleotidu 1067 v SEK. ID. Č.: 1. Amplifikovaná doména I je rozštěpena odpovídajícími restrikčním! enzymy a purifikovaný fragment je zaligován do savčího expresívního vektoru pDCs a prokaryotického expresívního vektoru pGEX-4T-3 (Pharmacia) a fragment domény I je sekvenován. Fúzní protein je následně exprimován v buňkách COS, CHO nebo E. coli transfekovaných nebo transformovaných odpovídajícím expresívním konstruktem.

Vzhledem k afinitě polypeptidů a_d k ICAM-R, může mít exprimovaná doména I polypeptidů a_d dostatečnou afinitu, aby mohla být použita jako inhibitor buněčné adheze, při níž aktivně participuje polypeptid a_d.

• · ···· • * · »

c · · »

Analýza fúzního proteinu tvořeného doménou I lidského a_d/IgG4

Protein byl rozdělen pomocí SDS-PAGE v redukujících a neredukujících podmínkách a vizualizován barvením stříbrem nebo barvením Coomassie. Následně byl protein přenesen na membrány Immobilon PVDF a analyzován pomocí monoklonálních protilátek namířených proti lidskému IgG nebo monoklonálních protilátek namířených proti bovinnímu IgG.

U detekovaných proteinů bylo stanoveno, že v neredukujících podmínkách migrují se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 120 kD a redukujících podmínkách migrují se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 45 kD. Na gelu z elektroforézy prováděné v neredukujících podmínkách byly rovněž detekovány méně intenzivní proužky se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 40 až 50 kD, které reagovaly s protilátkami namířenými proti lidskému IgG, ale nereagovaly s protilátkami namířenými proti bovinnímu IgG. Méně intenzivní proužek o zdánlivé molekulové hmotnosti 200 kD byl metodou Western Blot detekován jako bovinní Ig.

Vazebné studie prováděné za použití expresívních produktů domény I

Metodou ELISA byla testována schopnost domény I specificky rozpoznávat chimérický protein ICAM-R/IgG. Jednotlivá sériová ředění fúzního proteinu IgG4 a domény I polypeptidu a_d (Ia_d/IgG4) v TBS byla inkubována s ICAM-l/IgG, ICAMR/IgG, VCAM-l/IgG nebo IgGl proteinem (produkovaným buňkami myelomu) imobilizovanými na destičkách Immulon IV pro RIA/EIA. Jako negativní kontroly byly použity chimérický protein domény I CDlla/IgG a lidský myelomový protein IgG4/kappa. Navázaný IgG4 byl detekován prostřednictvím biotinylované monoklonální protilátky HP6023 namířené proti • 4 4 4 ·4 *4 4444

IgG4 s následným přidáním konjugátu streptavidin-peroxidáza a barvením za použití substrátu o-fenyldiaminu.

V opakovaných stanoveních nebyla detekována vazba mezi proteinem CDlla/IgG4 nebo myelomovým proteinem IgG4 a kterýmkoliv z imobilizovaných proteinů. Protein Ia_d/IgG4 se nevázal na lidský IgGl, ICAM-1/IgGl nebo blokující agens, jako želatinu z rybí kůže nebo bovinní sérový albumin. Za použití proteinu Ia_d/IgG4 v koncentracích 1 až 5 pg/ml byla v jamkách povlečených ICAM-R/IgG detekována, ve srovnání s pozadím, dvoj- až třínásobně vyšší intenzita signálu. Intenzita signálu v jamkách povlečených VCAM-I/IgG byla 7 až 10 vyšší než pozadí. V předchozích stanoveních se buňky CHO transfekované a_d/CD18 nevázaly na VCAM-I/IgG, což naznačuje, že vazba VCAM-I může být charakteristická pro aminokyselinovou sekvenci izolované domény I.

Další konstrukty domény I polypeptidů a_d

Další konstrukty domény I polypeptidů a_d byly vytvořeny stejným způsobem jako předchozí konstrukt s výjimkou toho, že zde bylo, kolem domény I polypeptidů a_d, začleněno více aminokyselin. Tyto specifické konstrukty obsahují: i) sekvence z exonu 5 (aminokyseliny 127 až 353 v SEK. ID. Č.:

2), umístěné před doménou I; ii) opakování motivu EF-hand (motiv v oblastech odpovědných za vazbu vápennatých iontů) (aminokyseliny 17 až 603 v SEK. ID. Č.: 2) umístěné za doménou I; iii) řetězec alfa ukončený v transmembránové oblasti (aminokyseliny 17 až 1029 v SEK. ID. Č.: 2) spolu s IgG4 použitým pro purifikaci a detekci. Tyto konstrukty jsou zaligovány jak do savčího expresívního vektoru pDCSl, tak do prokaryotického expresívního vektoru pGEX-4T-3 (Pharmacia) a doména I je sekvenována. Fúzní proteiny jsou následně exprimovány v buňkách COS, CHO nebo E. coli transformovaných nebo transfekovaných příslušnými expresívními • 41 β ·

4 9 9 konstrukty. Proteiny jsou purifikovány na koloně ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, England) a je testována jejich reaktivita s monoklonální protilátkou HP6023 namířenou proti IgG4. Tyto proteiny jsou na polyakryalmidovém gelu obarveny pomocí Coomassie.

Aby bylo možné zkonstruovat expresívní plazmid kódující kompletní polypeptid a_d, je plazmid pATM.Dl2 (popsaný výše) modifikován následujícím způsobem tak, aby z něj bylo možné exprimovat fúzní protein a_d/IgG4. DNA kódující IgG4 je pomocí PCR za použití primerů, které závádějí na 5' konec restrikční místo AatlI (SEK. ID. Č.: 89) a na 3' konec restrikční místo Xbal (SEK. ID. Č.: 90), izolována z vektoru pDCSl.

5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3' (SEK. ID. Č.: 89) 5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK. ID. Č.: 90)

Plazmid pATM.D12 je rozštěpen restrikčními enzymy AatlI a Xbal a rozštěpený a purifikovaný produkt PCR reakce,

IgG4, je zaligován do linearizovaného vektoru.

Příklad 15

Produkce protilátek specificky namířených proti lidskému a_d

A. Produkce monoklonálních protilátek

1. Přechodně transfekované buňky z Příkladu 7 byly třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem podle Dulbecca (D-PBS) a v PBS injikovány, v množství 5 χ 10⁶ buněk/myš spolu s 50 pg/myš muramyl dipeptidázy (Sigma), do myší Balb/c. Myši byly injikovány stejným způsobem dvakrát ve dvoutýdením intervalu. Preimunizační séra a séra z imunizovaných myší byly testovány s využitím FACS, jak je popsáno v Příkladu 9, a slezinné buňky z myší s nejvyšší reaktivitou proti buňkám transfekovaým a_d/CD18, • · « · • · · · • · • · · » · ·»·· • · ·· · · · ···· · • · · · · · · · · ····!> ·· · · * · · * byly použity k fúzi. Supernatanty z kultur hybridomů byly jednotlivě testovány za účelem zjištění, jestli nereagují s buňkami COS transfekovanými pomocí CDlla/CD18 a rovněž, jestli reagují s buňkami kotransfekovanými expresívními plazmidy kódujícími polypeptidy a_d a CD18.

Tímto postupem se nepodařilo připravit žádné monoklonální protilátky.

2. Jako alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl použit postup, při kterém byl rozpustný fúzní protein domény I polypeptidů a_d/IgG4 afinitně purifikován ze supernatantu stabilně transfekovaných buněk COS, a byl použit k imunizaci myší Balb/c, jak je popsáno výše. Byly vytvořeny hybridomy a supernatanty získané při kultivaci těchto hybridomů byly metodou ELISA testovány za účelem zjištění reaktivity proti fúznímu proteinu domény I polypeptidu a_d. Pozitivní kultury byly následně analyzovány za účelem zjištění, jestli reagují s nezkrácenými komplexy a_d/CD18 exprimovanými na povrchu transfekovaných buněk CHO.

Myš 1908 byla nejprve třikrát imunizována buňkami CHO transfekovanými a_d/CD18 a následně pak dvěma posilovacími dávkami, obsahujícími rozpustný heterodimer a_d/CD18. Dávky pro poslední dvě imunizace obsahovaly rovněž fúzní protein doména I polypeptidů a_d/IgG4 v množství 50 pg/myš. Výsledkem těchto imunizací bylo 270 jamek, ve kterých hybridomy produkovaly protilátky proti IgG. Pomocí metody ELISA bylo stanoveno, že supernatanty ze 45 jamek vykazovaly přinejmenším 7-krát silnější vazbu k fúznímu proteinu Ia_d/IgG4 než k samotnému lidskému IgG. Analýzou s využitím FACS bylo zjištěno, že žádný z těchto supernatantů nereaguje s buňkami CHO transfekovanými oc_d/CD18.

Za účelem zjištění, jestli jsou protilátky v těchto supernatantech schopny rozpoznávat alfa podjednotku integrinu v jiném kontextu, byly pomocí supernatantů (ze 24 z celko64 ·· ··

vého počtu 45 jamek) označeny čerstvě zmrazené řezy sleziny. Tři supernatanty poskytly pozitivní reakci: jeden obarvil velké buňky červené pulpy, zatímco další dva obarvily buňky roztroušené v červené pulpě a rovněž v trabekule.

U těchto supernatantu byla dále analyzována jejich schopnost imunoprecipitovat biotinylované komplexy CD18 buď z buněk CHO transfekovaných a_d/CDl8 nebo buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA. K dalšímu pasážování byly vybrány jamky, ve kterých byly přítomny supernatanty reagující s proteiny z lyzátů získaných působením detergentů (tyto proteiny by neměly mít tak definované struktury jak je tomu u proteinů exprimovaných jako heterodimery). Monoklonální protilátky, které rozpoznávají proteiny v detergentů, mohou být užitečnější při imunoprecipitaci heterodimerních komplexů z transfekovaných buněk, tkání a buněčných linií.

3. Jako další alternativa pro produkci monokionálních protilátek byl použit postup, při kterém byly z lyzátů lidské sleziny, pomocí monoklonální protilátky 23F2G namířené proti CD18, imunoprecipitovány komplexy CD18; této imunoprecipitaci předcházelo odstranění komplexu CDlla/CD18 (pomocí monoklonální protilátky TS2/4) a komplexu

CDllb/CD18 (pomocí monoklonální protilátky Mo-1). Pět myší Balb/c, starých 10 až 12 týdnů, bylo imunizováno subkutánní injikaci přibližně 30 pg proteinu, připraveného postupem popsaným výše, v kompletním Freundově adjuvans. Tato imunizace byla provedena v 0. dni a poté následovaly imunizace dvěma posilovacími dávkami obsahujícími 30 pg imunogenu/myš v nekompletním Freundově adjuvans, které byly prováděny 28. a 43. den. Deset dní po poslední imunizaci byla myším odebrána krev a u získaných sér zředěných v poměru 1:500 byla metodou Western Blot stanovována reaktivita vůči imunogenům, v množstvích 1 pg/dráha. Séra ze tří myší detekovala proužky odpovídající proteinům o molekulové hmotnosti přibližně 95 a 150 kD; ve drahách, ve kterých byla k detekci použita séra ve z neimunizovaných myší zředění 1:50, nebyl • · • · detekován žádný signál. Předpokládalo se, že proužek o velikosti 150 kD reprezentuje in vivo glykosylovaný polypeptid a_d. Všechna séra získaná z imunizovaných myší navíc imunoprecipitovala s proteinem z lyzátů biotinylovaných buněk CHO transfekovaných oc_d/CDl8, který při SDS elektroforéze na polyakrylamidovém gelu migroval s molekulovou hmotností odpovídající heterodimeru. Na základě těchto výsledků byla vybrána myš #2212 a tato myš byla dále imunizována intraperitoneální injekcí obsahující 30 pg imunogenu v PBS (prováděná ve dni 64). Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena a z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina.

Suspenze jednotlivých slezinných buněk byla vytvořena rozmělněním tkáně mezi dvěmi namraženými podložními sklíčky ponořenými do média RPMI 1640 bez přítomnosti séra s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilinu v koncentraci 100 jednotek/ml a streptomycinu v koncentraci 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčné sítko Nitex o velikosti ok 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát promyta centrifugaci při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla následně rozsuspendována ve 20 ml média RPMI bez přítomnosti séra. Thymocyty ze tří myší Balb/c (neimunizovaných) byly připraveny obdobným způsobem.

Myelomy NS-1, udržované po tři dny před fúzí v log fázi v médiu RPMI s obsahem 10% fetálního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne. Logan, Utah), byly centrifugovány při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla dvakrát promyta, postupem popsaným výše, a buňky byly spočítány. Přibližně 1,15 x 10⁸ slezinných buněk bylo smícháno s 5,8 χ 10⁷ buněk NS-1, zcentrifugováno a supernatant byl odstraněn. Peleta byla poklepem uvolněna ode dna kyvety. K buněčné peletě byly, za stálého míchání po dobu jedné minuty, přidávány 2 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufru 75mM HEPES o pH=8,0) zahřátého na teplotu 37°C. Následně bylo k buněčné • · · · suspenzi přidáno 14 ml média RPMI bez přítomnosti séra a suspenze byla míchána po dobu 7 minut. Následoval přídavek 16 ml média RPMI a buňky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 200xg. Supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve 200 ml média RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 0,4 mM aminopterin, 16 mM thymidin (HAT) (Gibco), IL-6 o koncentraci 25 jednotek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 χ 10⁶ thymocytů/ml. Suspenze byla rozdělena do 10-ti 96-jamkových (s plochým dnem) destiček pro tkáňové kultury (Corning, Velká Británie) v objemu 200 μΐ/jamka a buňky byly vyživovány 4., 5., 6. a 7. den odebráním 100 μΐ média z každé jamky 18G-jehlou (Becton Dickinson) a přidáním 100 μΐ čerstvého média, popsaného výše, ale s IL-6 v koncentraci 10 jednotek/ml a neobsahujícího thymocyty.

až 10 dní po fúzi byly supernatanty z každé jamky testovány metodou ELISA, na přítomnost myších IgG. Čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při teplotě 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším imunoglobulinům IgA, IgG nebo IgM (Organon Teknika) v množství 50 μΐ/jamku, zředěnou v poměru 1:5000 v uhličitanovém pufru o pH=9,6. Destičky byly třikrát promyty pufrem PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a bylo do nich přidáno 50 μΐ supernatantu získaného z buněčných kultur. Po inkubaci probíhající 30 minut při teplotě 37°C a promytí, postupem popsaným výše, byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou namířená proti myšímu IgG(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěná v poměru 1:3500 v roztoku PBST. Destičky byly inkubovány, postupem popsaným výše, a čtyřikrát promyty roztokem PBST. Ihned potom bylo přidáno 100 μΐ substrátu, který obsahoval o-fenylendiamin v koncentraci 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H₂O₂ ve 100 mM citrátovém pufru o pH=4,5. Barevná reakce byla po 5 minutách zastavena přídavkem 50 μΐ 15% H₂SO₄.

• · · ·

Absorbance byla stanovována při vlnové délce 490 nm na čtečce destiček firmy Dynatech.

Hybridomy byly dále charakterizovány následovně. Supernatanty získané kultivací klonů produkujících IgG byly analyzovány průtokovou cytometrií, zda-li jsou reaktivní vůči buňkám CHO transformovaným a_d/CD18 a přitom nejsou imunoreaktivní vůči buňkám JY (linie B-buněk exprimující LFA-1, ale ne jiné integriny β₂) . Tato skutečnost byla pozorována v předchozích experimentech). Stručně řečeno, 5 x 10⁵ buněk CHO transformovaným a_d/CD18 nebo a_d/CD18“ buněk JY bylo rozsuspendováno v 50 μί média RPMI obsahujícího 2% FBS a 10 mM NaN₃ (pufr pro FACS). Do jamek na 96-ti jamkových destičkách (s jamkami s kulatým dnem) (Corning) byly k 50 μί supernatantů, získaných z klonů hybridomů produkujících IgG, přidány jednotlivé suspenze buněk. Po 30 minutové inkubaci na ledu byly buňky dvakrát zcentrifugovány (a promyty), jednotlivé supernatanty byly odstraněny a pelety byly rozsuspendovány ve 200 až 300 μί pufru pro FACS. Poslední promývací roztok byl nahrazen konjugátem fragmentu F(ab')₂ ovčí protilátky namířeným proti myšímu IgG (H+L)-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) v objemu 50 μί/jamka zředěného v poměru 1:100 v pufru pro FACS. Po inkubaci, prováděné postupem popsaným výše, byly buňky dvakrát promyty PBS modifikovaným podle Dulbacca (D-PBS) doplněným 10 mM NaN₃, a nakonec rozsuspendovány v B-PBS obsahujícím 1% paraformaldehyd. Následně byly vzorky přeneseny do polystyrénových zkumavek pro analýzu průtokovou cytometrií (FACS) a analyzovány na analyzátoru FACscan firmy Becton Dickinson.

Výsledkem fúze bylo vytvoření čtyř buněčných kultur, které splňovaly obě kritéria. Když byl přibližně po čtyřech dnech prováděn u supernatantů sekundární screening, tři ze čtyř kultur zůstaly pozitivní. Kultury z těchto tří jamek, označené 169A, 169B a 169D byly dvakrát až třikrát úspěšně pasážovány vždy dvojnásobným zředěním v médiu RPMI obsahu68 • · · · ·· ··· · * « · · · · · · · · • · ··· · · ·· • · · · · · · ♦··· · • · · · · · ··· « · · · · ·· ·· ·· ·♦ jícím 15 % FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 16 mM thymidin a IL-6 o koncentraci 10 jednotek/ml. Po čtyřech dnech byly jamky na destičkách vizuálně zhodnoceny a v jamkách s nejmenším počtem kolonií byl určen počet těchto kolonií. Po 7 až 10 dnech byly kultury ve vybraných jamkách z každého pasážování analyzovány s využitím FACS. U dvou těchto kultur, 169A a 169B, byla detekována aktivita. Při posledním pasážování byly kolonie z pozitivně reagujících jamek (přítomna vždy jedna v jamce) rozrosteny v médiu RPMI s 11% FBS. U protilátek ze supernatantu klonů 169A a 169B byl za použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupem doporučeným výrobcem, stanovován jejich izotyp. Bylo zjištěno, že se jedná o protilátky izotypu IgGl.

Při terciálním testování specifity těchto protilátek bylo využito precipitace s komplexy a_d/CDl8 získanými z transfekovaných buněk CHO a buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA. Protilátky produkované hybridomy 169A a 169B precipitovaly s proužky o odpovídající velikosti (u proteinů z linií CHO) a precipitovaly rovněž s jedním typem řetězce a o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 až 160 kD z buněk HL60. Tato skutečnost byla stanovena pomocí SDS-PAGE. Hybridomy 169A a 169B byly 31. května 1995 uloženy v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 a bylo jim přiděleno přístupové číslo HB11907 (169A) a HB11906 (169B).

Aby bylo možné lépe charakterizovat vazebné vlastnosti protilátek 169A a 169B, byla u každé z těchto protilátek testována jejich schopnost inhibovat vazbu druhé protilátky nebo protilátky TS1/18.1 namířené proti CD18 k rozpustnému heterodimerů a_d/CD18. Rozpustný nezkrácený heterodimer a_d/CD18 byl pomocí každé z těchto protilátek (neznačených) jednotlivě imobilizován na 96-ti jamkové destičce a k detekci proteinu, navázaného prostřednictvím stejné nebo odlišné neznačené protilátky, byly použity protilátky označe69 · · ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 ·· ··· · • · · · · · · · ···· · ·· 99 99 99 né biotinem. Vazba byla detekována za použití konjugátu kozí protilátka namířená proti myším Ig/HRP s následným barvením substrátem OPD. Získané výsledky naznačují, že protilátka 169A byla schopna blokovat vazbu biotinylovaných protilátek 169A a TS1/18.1, zatímco protilátka 169B blokovala pouze vazbu sebe samotné.

4. Jiná z myší (#2214), imunizovaná stejným postupem jako myš #2212, byla 70. den dále imunizována pomocí 30 pg purifikovaného polypeptidu a_d, získaného z lyzátu sleziny, v PBS. Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena a z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina.

Fúze a selekce pozitivně reagujících buněk byla prováděna postupem popsaným výše. Výsledkem fúze byl vznik pěti hybridomů produkujících monoklonální protilátky proti a_d, které byly označeny 170D, 170F, 170E, 170X a 170H. Za použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupem doporučeným výrobcem, byl stanoven izotyp těchto protilátek a bylo zjištěno, že se jedná o protilátky izotypu IgGl.

5. Jiná z myší (#2211), imunizovaná stejným postupem jako myši #2212 a #2212, byla 88. den dále imunizována pomocí 30 pg imunogenu a 203. den proběhla, s využitím 30 pg imunogenu, další imunizace. Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena, z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina a fúze buněk proběhla postupem popsaným výše. Supernatant získaný při kultivaci hybridomů byl testován metodami ELISA a průtokovou cytometrií, jak je detailně popsáno v předchozích odstavcích.

Pomocí metody ELISA bylo identifikováno 15 potitivně reagujících klonů hybridomů označených 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R a 188T. U těchto klonů byl rovněž stanoven izotyp produkovaných protilátek. Stručně řečeno, čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším IgA, G, M (Organon Teknika) zředěnou v poměru 1:5000 v 50 mM uhliči70 • · tanovém pufru, pH 9,6, v objemu 50 μΐ/jamka. Destičky byly po dobu 30 minut při 37°C blokovány pomocí 1% BSA v PBS, třikrát promyty v PBS/0,05 % Tween 20 (PBST) a do jamek bylo přidáno 50 μΐ supernatantu získaného při kultivaci hybridomů (zředěného v poměru 1:10 v PBS). Po inkubaci a promytí, prováděném postupem popsaným výše, bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ králičí protilátky (konjugované s křenovou peroxidázou) namířené proti myším IgGi, IgG_2a nebo IgG₃(Zymed, San Francisco, California), zředěné v poměru 1:1000 v PBST s 1% normálním kozích sérem. Destičky byly inkubovány postupem popsaným výše, čtyřikrát promyty pomocí PBST a poté bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ substrátu obsahujícího 1 mg/ml o-fenyldiaminu (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H₂O₂ ve 100 mM citrátovém pufru, pH 4,5. Barvení bylo zastaveno po 5 minutách přídavkem 50 μΐ 15% H₂SO₄. Na čtečce destiček (Dynatech) byla při vlnové délce 490 nm odečítána intenzita a bylo zjištěno, že všech 15 protilátek jsou protilátky izotypu IgGl.

Zbylé slezinné buňky z myši #2211 byly zmrazený v kryozkumavce a skladovány v kapalném dusíku. Obsah této kryozkumavky byl rozmražen umístěním kryozkumavky do vodní lázně o teplotě 37°C a třepáním do chvíle, kdy buňky právě roztály. Buňky byly přeneseny do centrifugační zkumavky o objemu 15 ml a po jednom mililitru k nim bylo přidáváno teplé médium RPMI obsahující 11% FBS. Mezi jednotlivými přídavky média byly tří až pětiminutové intervaly. Bylo přidáno dalších 5 ml teplého média RPMI a po pětiminutovém stání byla zkumavka centrifugována po dobu 5 minut při 200xg, a supernatant byl odstraněn. Buňky byly rozsuspendovány v RPMI a fúze byla provedena postupem popsaným výše. Supernatant získaný při kultivaci hybridomů byl testován metodami ELISA a průtokovou cytometrií, postupem popsaným výše.

Výsledkem fúze byl vznik pěti klonů označených 195A,

195C, 195D, 195E a 195H. U těchto klonů byl metodou ELISA, postupem popsaným výše, stanoven jejich izotyp; bylo zjiš71 « · • · · · · ·

těno, že monoklonální protilátky 195A, 195C, 195D a 195E jsou protilátky izotypu IgGi a monoklonální protilátka 195H je protilátka izotypu IgG_2a.

6. Aby byly získány protilátky schopné inhibovat funkční vazbu polypeptidu a_d, byl k imunizaci použit rozpustný a_d/CDl8LZ (viz. Příklad 14). Tento protein byl izolován ze supernatantu získaného při kultivaci přechodně transfekovaných buněk COS na nosiči pro afinitní chromatografii, a jako imunogen byl použit polypeptid a_d navázaný na nosič. Vybraná myš byla imunizována postupem popsaným výše a poslední posilovači dávka jí byla podána dva týdny po první imunizaci. Imunizace prováděná tímto postupem zamezuje možným změnám v konformaci proteinu, které jsou často spojeny s lýzou buněk prováděnou prostřednictvím detergentu. Další myši byly imunizovány pomocí rekombinatního proteinu, rovněž navázaného na nosič, ale tyto myši nebyly na počátku imunizovány proteinem purifikovaným z lyzátu buněk.

Hybridomy, získané postupem popsaným výše, které jsou výsledkem imunizace, byly testovány metodou ELISA na rekombinatních proteinech izolovaných z buněčných supernatantu za použití Fab fragmentů neblokující protilátky. Jinou možností testování je využití průtokové cytometrie pro stanovení reaktivity proti buňkám JY, které byly předem transformovány cDNA kódující a_d.

7. Jinou možností je produkce monoklonálních protilátek následujícím způsobem. K imunizaci myší Balb/c, prováděné postupem popsaným výše, byl použit heterodimerní protein oc_d/CD18, purifikovaný afinitní chromatografii z lyzátů stabilně transfekovaných buněk CHO, spolu s muramyl dipeptidázou v koncentraci 50 pg/ml. Předtím, než byla imunoprecipitací biotinylovaných komplexů z transfekovaných buněk CHO stanovována reaktivita séra proti a_d/CD18, byly myši, ze kterých bylo toto sérum získáno, třikrát imunizovány. Z pozitivně reagujících zvířat byly, pomocí standardních tech72 • « · · •· 4 4 44 ·· 44

4 · · · · · ·· 4 4 4 4 4 44 · 44 4 4 4 44 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

444 4 4 44 4 4 44 4 4 nik, získány linie hybridomů. Následně byly tyto hybridomy kultivovány a pak selektovány pomocí průtokové cytometrie, za použití buněk transfekovaných a_d/CD18. Buňky transfekované CDlla/CD18 byly využity jako kontrola pro identifikaci protilátek reagujících pouze s CD18.

8. Jako další alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl využit postup, při kterém byl u myší Balb/c použit protokol imunizace/imunosuprese, který byl navržen tak, aby byla snížena reaktivita vůči imunogenním determinantům transfekovaných buněk CHO, použitých k imunizaci.

Tento protokol využívá imunizaci prováděnou pomocí netransfekovaných buněk CHO a následné zničení B-buněk (ve stadiu blastů) reaktivních vůči CHO buňkám, kterého je dosaženo působením cyklofosfamidu. Po třech kolech imunizace a následného zničení reaktivních B-buněk přídavkem cyklofosfamidu jsou myši imunizovány pomocí buněk transfekovaných a_d/CD18, postupem popsaným výše.

9. Jinou alternativou je postup, při němž jsou, postupem popsaným výše, lyzáty buněk HL60 stimulovaných pomocí PMA (získané působením detergentu) obohaceny o frakci komplexů CD18. Na stejných sloupcích jsou odstraněny jiné integriny β₂. Imunizace pomocí získaných komplexů, produkce hybridomů a jejich testování jsou prováděny postupy popsanými výše.

B. Produkce polyklonálního séra

K vytvoření polyklonálního antiséra v organizmu králíků byl použit purifikovaný chimérický protein doména I polypeptidu a_d/IgG4 (Příklad 14). Na počátku byl antigen doména I polypeptidu a_d/IgG4 injikován do organizmu králíků v kompletním Freundově adjuvans v množství 100 pg/králík, a poté následovaly tři posilovači dávky, obsahující stejné množství proteinu v nekompletním Freundově adjuvans. Po třetí a čtvrté imunizaci byly analyzovány vzorky krve. Krá73 ··»* •0 0000 • 0 0 0 0 •000 0 00 liči imunoglobulin (Ig) byl ze séra purifikován na koloně Sepharóza-protein A a na koloně lidský IgG/Affigel 10 byl zbaven frakce namířené proti lidskému IgG. K potvrzení dokonalého odstranění frakce namířené proti lidskému IgG byla využita metoda ELISA, při které bylo testováno, že sérum nereaguje s lidským IgG, ale pouze s částí chimérického proteinu odpovídající doméně I.

Takto předčištěné polyklonální sérum bylo použito k imunoprecipitaci proteinů z lyzátů buněk CHO, které byly na povrchu biotinylovány, a které byly předem transfekovány expresívními vektory kódujícími a_d a CD18. Imunoprecipitace byla prováděna postupem popsaným v Příkladu 10. Toto předčištěné sérum rozpoznávalo proteinový komplex o stejné molekulové hmotnosti jakou měl komplex precipitovaný pomocí monoklonální protilátky TS1.18 namířené proti CD18. Při analýze komplexů CD18 získaných z buněk CHO transfekovaných pomocí a_d/CD18, prováděné metodou Western Blot, rozpoznávalo toto sérum jeden proužek odpovídající velikosti. Králičí polyklonální sérum nerozpoznávalo afinitně purifikované integriny CDlla/CD18, CDllb/CD18 a protein VLA4 z lidské sleziny. Jak bylo stanoveno průtokovou cytometrií, toto sérum rovněž v roztoku nereagovalo s buňkami CHO transfekovanými a_d. Bylo tudíž usouzeno, že polyklonální králičí sérum je schopno rozpoznávat pouze denaturované proteiny domény I polypeptidů a_d/IgG4.

Při pokusu o izolaci polyklonálního séra proti a_d/CD18 byla myš třikrát imunizována pomocí buněk CHO transfekovaných a_d (D6.CHO, a_d/CD18) spolu s adjuvantním peptidem, a jednou byla imunizována purifikovaným heterodimerem a_d/CD18. Poslední posilovači dávka obsahovala pouze heterodimer cc_d/CD18. Přídavkem asi 10⁸ buněk CHO transfekovaných LFA-1 (na dobu 2 hodin při 4°C) bylo přibližně 100 μΐ séra získaného z imunizované myši předčištěno. U takto upravené74 * · · · ·· ·· ·· ·· ho séra byla, v ředěních 1/5000, 1/10000, 1/20000 a 1/40000, analyzována, na buňkách lidské sleziny, reaktivita vůči polypeptidú oc_d. Tato polyklonální protilátka byla reaktivní v ředění 1/20000, zatímco při ředění 1/40000 byly buňky barveny velmi slabě.

Příklad 16

Analýza distribuce polypeptidú a_d

Pomocí polyklonálního séra, vytvořeného postupem popsaným v Příkladu 15, byla stanovována tkáňová distribuce komplexu a_d/CD18.

K imunocytochemickým analýzám zmrazených řezů lidské sleziny byla purifikovaná králičí polyklonální protilátka použita v koncentracích v intervalu 120 ng/ml až 60 pg/ml. Řezy o tloušťce 6 mikrometrů byly umístěny na podložní sklíčka Superfrost Plus (VWR) a skladovány při -70°C. Před použitím byla sklíčka vyjmuta z -70°C a na 5 minut umístěna do teploty 55°C. Následně byly řezy po dobu 2 minut fixovány acetonem a vysušeny na vzduchu. Řezy byly po dobu 30 minut při pokojové teplotě blokovány v roztoku obsahujícím 1% BSA, 30% normální lidské sérum a 5% normální králičí sérum. Na každý řez byla aplikována primární protilátka při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Nenavázaná protilátka byla odstraněna trojnásobným promytím sklíček v TBS (po dobu 5 minut). Dále byla na každý řez nanesena králičí protilátka namířená proti myšímu IgG ve stejném pufru TBS. K detekci sekundární protilátky byla použita 30 minutová inkubace (při pokojové teplotě) s myší protilátkou namířenou proti alkalické fosfatáze značenou alkalickou fosfatázou (APAAP). Následně byly sklíčka třikrát promyty v pufru TBS. Poté byl přidán substrát Fast Blue (Vector Labs) a barvení bylo zastaveno ponořením sklíčka do vody. Sklíčka byla dobarvena pomocí Nuclear Fast Red (Sigma) a před ukotvením pomocí • fl fl··· flfl flflflfl • · flfl · · · · · • · · · · flfl · · · · · • fl · · · · ··· flflflfl · flflflfl flflflfl

Aqua Mount (Baxter) promyta vodou. V červené pulpě sleziny bylo detekováno barvení při použití této protilátky, ale ne při použití králičího polyklonálního Ig (proti jiným proteinům) nebo při použití nepurifikovaného séra získaného ze stejného jedince před imunizací.

Jakmile byla jednou u myšího séra stanovena specifická reaktivita vůči a_d, byl toto sérum použito ke značení různých lymfoidních a nelymfoidních tkání. V totožných experimentech byly jako kontroly využity monoklonální protilátky rozpoznávající polypeptidy CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Značením řezů z normální sleziny prováděným pomocí polyklonálního séra proti a_d, a pomocí monoklonálních protilátek proti CD18, CDlla, CDllb a CDllc, byly získány tyto výsledky. Distribuce markéru pozorovaná při použití polyklonálního séra proti a_d byla odlišná od distribuce značky namířené proti polypeptidům CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Existuje odlišná distribuce značky u některých buněk umístěných v hraniční zóně bílé pulpy a odlišná distribuce značky u periferních buněk hraniční zóny. Taková distribuce nebyla pozorována při použití jiných protilátek. Jednotlivé buňky roztroušené v červené pulpě byly rovněž označeny. Tyto buňky mohou, ale nemusí, být ze stejné populace nebo podskupiny jako buňky označené pomocí protilátek proti CDlla a CD18.

Značení protilátkou proti CDllc obarvilo nějaké buňky v hraniční zóně, ale nebyl pozorován, ve srovnání s použitím polyklonálního séra proti a_d, zřetelný kruh kolem bílé pulpy. Rovněž distribuce značky v červené pulpě neodpovídala distribuci značky při použití polyklonálního séra proti a_d.

Distribuce značky pozorovaná při použití polyklonálního séra proti a_d byla tudíž jediněčná ve srovnání s distribucí pozorovanou při použití protilátek proti jiným integrinům β₂ CDlla, CDllb, CDllc a CD18). Tyto výsledky naznačují, že • · · · ·· · ·· · ···· • · ··· · · · · • · · · »4 * · · · · • · · · · · ··»

999 9 9 99 99 9 9 9 9 in vivo distribuce polypeptidů a_d v organizmu člověka, je odlišná od distribuce jiných integrinů β₂.

Charakterizace exprese lidského polypeptidů a_d prováděná pomocí monoklonálních protilátek

Při analýze exprese lidského polypeptidů oc_d prováděné imunocytochemicky na zmrazených tkáňových řezech a pomocí průtokové cytometrie na buněčných liniích a leukocytech periferního krevního oběhu, byly použity protilátky sekretované hybridomy 169A a 169B. V obou experimentech byly supernatanty získané kultivací hybridomů použity v nezředěné formě.

Značení tkání

Veškeré značení, kromě značení řezů jater prováděné podle protokolu popsaného dále, bylo prováděno postupem popsaným výše. Po fixaci acetonem byly řezy po dobu 15 minut při pokojové teplotě promyty v roztoku 1% H₂O₂ a 1% azidu sodného v TBS. Po označení primární protilátkou byla nářezy na 30 minut při pokojové teplotě aplikována králičí protilátka namířená proti myšímu IgG konjugovaná s peroxidázou. Řezy byly třikrát promyty v pufru TBS. Za účelem detekce sekundární protilátky byla použita inkubace s prasečí protilátkou (konjugovanou s peroxidázou) namířenou proti králičí protilátce, prováděná při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Řezy byly následně třikrát promyty v pufru TBS, byl k nim přidán substrát AEC (Vector Labs) a reakce byla ponechána probíhat. Řezy byly dobarveny Hematoxylinem Gill č. 2 (Sigma) a následně, před vysušením a ukotvením, byly promyty vodou.

V řezech ze sleziny byla většina exprese lokalizována v červené pulpě sleziny, a to na buňkách morfologicky odpoví77

4 • 4 •

• 4 4 4

4 4 4

4 4 «4 44

4444 dajících granulocytům a makrofágům. Označeno bylo velké množství granulocytů, zatímco signál poskytla jenom část z makrofágů. Pomocí protilátek proti a_d bylo slabě obarveno malé množství folikulárních dendritických buněk přítomných v bílé pulpě. Barvení pomocí protilátek proti CDlla a CD18 poskytlo signál jak v červené, tak v bílé pulpě. Barvení pomocí protilátek proti CDllc bylo výraznější u velkých buněk přítomných v bílé pulpě sleziny (předpokládá se, že jde o makrofágy) a v hraniční zóně obklopující bílou pulpu; byla rovněž pozorována difúzně rozptýlená značka v červené pulpě. Zdá se, že distribuce polypeptidu CDllb v červené pulpě se překrývá, ale není identická, s distribuci a_d, ale není pozorována distribuce CDllb v bílé pulpě.

Byla srovnávána exprese integrinů v normální a (revmatoidní) arthritické tkáni synovia. Ve zdravé (normální) tkáni byla, při značení jakoukoliv protilátkou namířenou proti integrinů (včetně protilátek specificky imunoreaktivních vůči CDlla, CDllb, CDllc, CD18 a také a_d) , pozorována minimální odezva s distribucí značky na rezidentních buňkách, převážně makrofázích. U zanícené tkáně byla exprese všech integrinů více lokalizovaná, a to na buňkách nahloučených kolem lymfatických cév. Zatímco distribuce exprese a_d a CDllb byly podobné, ukázalo se, že polypeptid CDllc není exprimován v tak velké míře, a jeho exprese je omezena pouze na podskupinu leukocytů.

U tkáňových řezů z jater psa byla na jaterních makrofázích, neboli Kuppferových buňkách, pozorována exprese CDllb, ale ne exprese polypeptidu a_d. Značení řezů z jater „zdravých lidí (prováděné postupem popsaným pro značení řezů ze psích jater, viz. výše) potvrdilo konzervovanost distribuce této značky u člověka. Navíc zde byla detekována nízká hladina exprese CDllc. V řezech z jater pacientů postižených hepatitidou byla intenzita značky pro všechny ·· ···· ·· ···· ·· ♦ · • · · ·· · ···· ·· ··· ···· • · · · · ······· • · ···· ··· ···· · ·· ·· ·· ·· leukointegriny vyšší, než tomu bylo u „normálních jater, zatímco na povrchu granulocytů a makrofágů byla v těchto vzorcích detekována exprese polypeptidu a_d.

Při barvení pomocí protilátek proti a_d bylo u řezů z tlustého střeva zdravích lidí pozorováno jen nevýrazné barvení; byla pozorována slabá intenzita značky na buňkách hladkého svalstva a leukocytech. U řezů získých z pacientů postižených Crohnovou chorobou byla detekována zvýšená hladina exprese všech leukointegrinů.

Na řezech z plic zdravých jedinců bylo pozorováno omezené množství buněk pozitivních na přítomnost a_d; tyto buňky odpovídaly morfologicky makrofágům a neutrofilům. U tkáňových řezů z plic pacietů postižených rozedmou byl výskyt značky proti a_d pozorován u neutrofilů a makrofágů obsahujících hemosiderin, což je pigment obsahující železo. Tato skutečnost naznačuje pohlcení červených krvinek těmito buňkami .

Exprese integrinů byla rovněž analyzována na tkáňových řezech mozku zdravých jedinců a tkáňových řezech z lézi z pacientů postižených roztroušenou sklerózou (MS - multiple sclerosis). Ve tkáňových řezech ze zdravých jedinců bylo barvení a_d méně intenzivní než barvení CDlla, CDllb a CDllc, a toto barvení bylo omezeno na buňky, morfologicky a přítomností CD68, odpovídající mikrogliálním buňkám. Buňky exprimující CDllb byly situovány v místech obklopujících cévy a rozptýleny ve tkáni. CDllc⁺ buňky byly situovány uvnitř cév, zatímco ad⁺ buňky obklopovaly tyto cévy. Ve tkáňových řezech z mozku pacientů postižených MS byla exprese polypeptidu ad nalezena jak na mikrogliálních buňkách, tak na části leukocytů jiných než makrofágů; a_d ⁺ buňky byly situovány uvnitř lézi a rovněž v kortexu těchto lézí. Signál pro a_d měl stejnou intenzitu jako signál pro • ·

CDllc, ale jeho intenzita byla nižší než u signálu pro CDllb.

Pomocí protilátek proti leukointergrinů a CAM byly analyzovány vzorky tkáňových řezů jak hrudní aorty tak břišní aorty z PDAY (Pathobiologické Determinanty Atherosklerózy u mladých lidí; LSU Medical Center). Zkoumané léze odpovídaly atherosklerotickým plátům, které pod intimou obsahovaly agregáty velkých pěnových buněk (převážně makrofágů nacpaných lipidy) a infiltrované menší leukocyty. Studie, při kterých byly samostatně použity protilátky specificky namířené proti cc_d nebo jiným a řetězcům integrinů β₂(CDlla, CDllb a CDllc) spolu s protilátkou proti markéru makrofágů (CD68), odhalily, že většina makrofágů „nacpaných lipidy exprimovala a_d a CD18v průměrné hladině, zatímco exprese CDlla byla slabá a exprese CDllc byla v rozmezí slabá až střední. CDllb byl exprimován velmi slabě, a to pouze na části makrofágů.

Za účelem zjištění relativní lokalizace antigenu a_d a ICAM-R, byly na řezech aorty provedeny studie, při kterých bylo použito současného značení dvěmi značkami. Jelikož pěnové buňky v těchto řezech byly značeny protilátkou Ham 56, specificky namířenou proti markéru makrofágů, ale nebyly značeny protilátkami proti aktinu buněk hladké svaloviny, byly stanoveno, že pěnové buňky nebyly odvozeny od subintimálních buněk hladké svaloviny. CD68⁺ makrofágy exprimující ad byly obklopeny malými leukocyty exprimujícími ICAM-R; tyto leukocyty byly rovněž přítomny mezi CD68⁺ makrofágy exprimujícími ad. Zdálo se, že existuje omezené množství malých leukocytů, které neexprimují CD68, ale jsou značeny jak protilátkami proti a_d, tak protilátkami proti ICAM-R.

Distribuce polypeptidů a_d na leukocytech přítomných ve tkáních zdravých jedinců se překrývala, ale nebyla identická, s distribucí CDllb a CDllc, dvěma dalšími a řetězci leukointegrinů, které byly již dříve charakterizovány jako řetězce, jejichž exprese je omezena na leukocyty. Buněčná morfologie naznačila, že značkou namířenou proti a_d jsou barveny především makrofágy a granulocyty, a v omezené míře lymfocyty. Obecně lze říci, že zánět ve tkáni zvyšuje, spolu s výskytem vyšší intenzity značení leukointegrinů, množství i počet typů leukocytú pozorovaných v příslušné tkáni. Jelikož buněčná a prostorová distribuce leukointegrinů nebyla v patologických tkáních identická, bylo odvozeno, že každý člen rodiny integrinů, včetně oc_d, má, v daném kontextu, odlišné funkce a ligandy.

Zajímavé je, že exprese polypeptidů a_d v atherosklerotických lézích byla výraznější než exprese CDlla, CDllb a CDllc, což naznačuje, že oc_d může hrát klíčovou úlohu ve vytváření těchto lézí. Společná distribuce a_d ⁺ a ICAM-R⁺ buněk, podpořená důkazy naznačujícími možnost interakce mezi a_d a ICAM-R naznačuje, že polypeptid oc_d může, v časných stádiích těchto lézí, hrát úlohu při infiltraci leukocytú nebo při jejich aktivaci.

Značení buněčných linií a leukocytú periferní krve

Buněčná linie promyeloidních monocytů HL60 značená protilátkami 169A a 169B byla analyzována s využitím FACS. Exprese oc_d na povrchu těchto buněk je negativně ovlivněna stimulací pomocí PMA, který indukuje diferenciaci po makrofágové dráze, ale není ovlivněna stimulací DMSO, který indukuje diferenciaci po dráze granulocytů [Collins a další, Blood 70:1233 až 1244 (1987)]. Distribuce značky byla (v analýze s využitím FACS) za použití protilátek 169A a 169B při stimulaci buněk pomocí PMA odlišná od distribuce značky získané při použití monoklonálních protilátek namířených proti proti CDllb a CDllc. Buněčná linie monocytů THP-1 je rovněž slabě značena protilátkami 169A a 169B. Navíc část z ·· leukocytů periferní krve spadajících do oblasti (gate) lymfocytů a monocytů se při analýze s využitím FACS jevila jen slabě pozitivní. Část monocytů periferní krve byla slabě značena protilátkami 169A a 169B, zatímco na povrchu Blymfocytů nebyla zjištěna žádná exprese a_d. Část CD8 pozitivních T-lymfocytů byl také a_d pozitivní. Dále se nepodařilo protilátkami 169A a 169B detekovat antigen na liniích B-buněk JY, Ramos, na linii bazofilů KU812, a na liniích Tbuněk Jurkat, SKW a Molt 16.

Na základě výsledků analýz s buňkami HL60 byly, pomocí gradientově centrifugace s nosičem Ficoll/Hypaque a následnou lýzou červených krvinek, z periferní krve izolovány granulocyty. Všechny izolované preparáty obsahovaly více než 90% PMN (polymorfonukleárních leukocytů), jak bylo zjištěno vizualizací morfologie jader v kyselině octové. Jednotlivé populace byly vystaveny na 30 minut působení 50 ng/ml PMA nebo 10⁸ M formyl peptidu (fMLP) , aby se uvolnily potencionální zásoby integrinů. Nestimulované populace vykazovaly v porovnání s IgGl kontrolou sice nízkou, ale statisticky významnou expresi antigenů 169A a 169B, která po stimulaci rostla. Hladiny exprese a_d a CDllc na povrchu polymorfonukleárních leukocytů si odpovídaly více, než tyto hladiny pozorované u buněk HL60. Protilátka 169B byla následně použita k precipitaci heterodimerní molekuly z biotinylovaných PMN lyžovaných detergentem. Podjednotky o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 resp. 95 kD odpovídaly velikosti a_d resp. CD18.

Výskyt oc_d na PMN nemohl být předpovězen na základě znalosti exprese cc_d u psů. Psí neutrofily, na rozdíl od lidských protějšků, exprimují na pomocných T-buňkách markér CD4 a také integrin VLA-4, a tudíž mohou mít v organizmu psů jiné ligandy a funkce, než je tomu u člověka.

• 0 ··· 0 <

Značení subpopulací PBL

Tato studie posloužila k určení distribuce integrinu β₂v leukocytech lidské periferní krve. Kromě toho byla porovnána povrchová hustota a_d ve srovnání s jinými integriny β₂. Nakonec byla také vyhodnocena okamžitá regulace exprese oc_d v purifikovaných lidských eozinofilech.

Leukocyty lidské periferní krve byly izolovány centrifugací v hustotním gradientu a rozděleny do frakce mononukleárních buněk (obsahující monocyty, lymfocyty a bazofily) a do frakce granulocytů (neutrofily a eozinofily) [Warner a další, J. Immunol. Meth. 105:107-110 (1987)]. Pro některé experimenty byly eozinofily purifikovány imunomagneticky na čistotu větší než 95% použitím CD16 [Hansel a další, J. Immunol. Meth. 122:97-103 (1989)]. Kožní žírné buňky byly enzymaticky odděleny z lidské kůže a namnoženy, jak bylo popsáno dříve [Lawrence a další, J. Immunol. 139:3062-3069 (1987)].

Buňky byly značeny vhodnými ředěními monoklonálních protilátek specificky namířených proti CDlla (MHM24), CDllb (H5A4), CDllc (BU-15) nebo proti a_d (169A). Jako kontrola byl zařazen myší IgGl. Buňky byly promyty a pak inkubovány s kozí protilátkou namířenou proti myším IgG konjugovanou s fykoerythrinem. V některých pokusech byly buňky inkubovány v nadbytku myšího IgG a myší monoklonální protilátky nebo kozí polyklonální protilátky, které byly značeny FITC, specifické pro antigen konkrétní buňky (například CD3, CD4 nebo CD8 pro T-buňky; CD16⁺ lymfocyty pro NK buňky; anti-IgE pro bazofily) [Bochner a další, J. Immunol. Meth. 125:265271 (1989)]. Pak byly tyto vzorky zkoumány průtokovou cytometrií (Coulter EPICS profil) za použití vhodného gatingu, aby mohly být identifikovány podskupiny buněk.

V experimentech s lidskými eozinofily byla zkoumána okamžitá aktivace exprese oc_d. Buňky byly stimulovány 15 minut při 37°C esterem forbolu (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) • · · φ

[Schall, Cytokine 3:165-183 20 (1991)] nebo interleukinem IL-5 (10 ng/ml), a potom byly značeny různými monoklonálními protilátkami, jak je popsáno výše.

Výsledky ukázaly, že polypeptid a_d byl přítomen na všech eozinofilech, bazofilech, neutrofilech, monocytech a NK-buňkách periferní krve. Také malý podíl (přibližně 30%) CD8⁺ lymfocytů vykazoval expresi ad. Kožní žírné buňky a CD4⁺ Íymfocyty podjednotku ad neexprimovaly. Obecně jsou CDlla a CDllb přítomny na leukocytech ve vyšší hustotě než oc_d. Podjednotka a_d je exprimována na relativně nízké hladině podobné hladině exprese CDllc. U leukocytů je polypeptid cc_d s největší hustotou exprimován na monocytech a CD8⁺ buňkách, zatímco eozinofily mají úroveň exprese oc_d nejnižší. Hladina exprese na neutrofilech, bazofilech a NK-buňkách je střední.

Aktivace eozinofilů periferní krve vyvolaná působením CC-chemokinu RANTES nezpůsobuje změnu v expresi žádného z integrinů β₂. Působení esteru forbolu mělo nicméně za následek dvoj- až trojnásobné zvýšení exprese CDllb a a_d, avšak neovlivnilo expresi CDlla nebo CDllc. Působením interleukinu IL-5 se selektivně aktivovala exprese podjednotky CDllb, přičemž nebyla ovlivněna hladina exprese jiných integrinových podjednotek.

Získané výsledky ukázaly, že podjednotka a_d je u leukocytů periferní krve exprimována v přibližně stejném množství jako podjednotka CDllc. Nejvyšší hladina exprese byla zjištěna na monocytech a populaci CD8⁺ lymfocytů. Žírné buňky lidské kůže polypeptid oc_d neexprimovaly. U purifikovaných eozinofilů byly uvnitř cytoplazmy objeveny předvytvořené zásoby podjednotek CDllb a a_d. Z pozorované rozdílné aktivace interleukinem IL-5 oproti PMA se usuzuje, že tyto zásoby podjednotek jsou od sebe odděleny.

• · · · · · • ··· · ·· »· · ·

Distribuce značky u subpopulací leukocytů periferní krve (PBL) byla také určována metodou průtokové cytometrie za použití kombinace gatingu (definování jednotlivých buněčných typů na základě hodnot rozptylu světla měřených v přímém směru a v úhlu 90°) a povrchových značek, jak bylo popsáno výše. Tato metoda byla použita při pokusu přesněji definovat populaci lymfocytů, která neexprimuje 169 A/B.

PBL byly izolovány pomocí Ficollu, postupem popsaným výše, a jednotlivě označeny protilátkami 169A, 169B a monoklonálními protilátkami proti CD14 (značka monocytů a makrofágů), CD20 (B-buňky), CD56 (NK-buňky), receptoru α/β T-buněk (Tbuňky) , CD16 (neutrofily a NK-buňky) a oc4 (negativní markér neutrofilů). Jednotlivé oblasti (gates) byly definovány na základě velikosti buněk a distribuce značek.

Získané výsledky naznačují, že buňky v oblasti (gate) CD14⁺ monocytů vykazují nízkou hladinu značení protilátkami 169A a 169B. Bimodální distribuce značky pozorovaná v dřívějších experimentech v oblasti (gate) lymfocytů byla rozlišena při zvýšeném rozptylu měřeném v přímém směru. Smíšená populace TCR⁺/CD20⁺ buněk vykazovala nízkou, ale homogenní hladinu exprese antigenů pro 169A/B. Populace mapovaná při mírně zvýšeném bočním rozptylu (buněčná komplexita) , která byla pro CD56 z 50% pozitivně označena, se ukázala jasně 169A/B negativní populací. Negativní populace nebyla rovněž rozpoznána pomocí protilátek namířených proti TCR, CD20, CD14 nebo CD16.

Distribuce a_d v synoviu

K určení buněčné distribuce polypeptidu a_d, dalších integrinů β₂ a jejich příslušných receptorů u zánětlivé a nezánětlivé synovie byly použity imunohistologická studie využívající monoklonálni protilátky namířené proti různým integrinům β₂ a supergenovým rodinám imunoglobulinů. Exprese • · · · • » « · proteinů byla stanovována v normálních, osteoartritidických a revmatoidních tkáňových kulturách synovií.

Získané výsledky naznačují, že vrstva epitheliálních buněk synovia má vysokou úroveň exprese VCAM-1, CDllb/CD18 a a_d/CDl8. V těchto buňkách je omezena exprese CDllc/CD18 a exprese CDlla/CD18 není většinou detekována. Při revmatoidním artritickém zánětu synoviální blány vzrůstá exprese integrinu β₂ na synoviálních buňkách úměrně stupni hyperplazie. Mnoství buněk exprimujících CDllc se podstatně zvětšuje, čímž se blíží množství buněk exprimujících CDllb a a_d, ale není pozorováno zvýšení exprese CDlla.

V subepitheliálních oblastech tkáně jsou CD3/CDlla/ICAM-R⁺ lymfocyty, ve formě agregátů a difúzních infiltrátů, roztroušeny mezi CD68/CDllb/ad⁺ makrofágy. Na vysoký počet agregátů poukazuje intenzivní značení ad, a to hlavně v oblastech bohatých na T-buňky.

Synoviální endotel proměnlivě exprimuje ICAM-1 a ICAM2, s minimálními stopami exprese ICAM-R.

Tyto výsledky dokazují, že synoviální makrofágy a makrofágům podobné synoviální buňky konstitutivně exprimují vysoké množství podjednotek CDllb a a_d integrinů β₂. Při zánětu synoviální blány dochází, jak v epitheliální tak subepitheliální oblasti, k velkému pomnožení těchto populací buněk, současně s patrným nárůstem v expresi CDllc. Specifické populace revmatoidních synoviálních T-lymfocytů exprimují nejen CDlla a ICAM-R, ale také velké množství a_d. Tato molekula, jak bylo ukázáno výše, je exprimována v nízké úrovni na lymfocytech periferní krve.

Příklad 17

Izolace klonů potkaní cDNA

Vzhledem k existenci psích a lidských podjednotek a_d byly prováděny pokusy izolovat homologní geny z jiných dru86 • · · · • « · · hů, včetně laboratorních potkanů (tento příklad) a myší (Příklad 17, viz níže).

Částečná sekvence potkaní cDNA vykazující homologii k lidskému genu pro a_d, byla získána využitím XgtlO knihovny z potkaní sleziny (Clontech). Knihovna byla vyseta v koncentraci 2 x 10⁴ pfu/miska na LBM/agarových miskách o průměru 150 mm. Knihovna byla přenesena na membránu Hybond (Amersham), denaturována 3 minuty, 3 minuty neutralizována a 5 minut promývána pufry popsanými ve standardním protokolu [Sambrook a další, Molecular Cloning: a laboratory manual, strana 2.110]. Membrány byly okamžitě přeneseny do Stratalinkeru (Stratagene) a DNA zesítěna pomocí autozesíťovacího nastavení. Za účelem dosažení podmínek, při kterých je pro hybridizaci potřebná nízký, resp. vysoký stupeň komplemntarity mezi sondou testovanou sekvencí byly membrány prehybridizovány a hybridizovány v 30% resp. 50% formamidu. Membrány byly na počátku testovány pomocí sondy značené ³²P získané z cDNA kódující lidský cc_d, odpovídající oblasti od báze 500 do 2100 v klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1). Sonda byla za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označena. Filtry byly promyty v 2x SSC při teplotě 55°C.

Byly identifikovány dva klony, označené 648.3 a 705.1, které vykazovaly sekvenční homologii k sekvenci lidského ct_d, lidského CDllb a lidského CDllc. Oba klony odpovídají 3'-oblasti genu pro lidský a_d, a začínají od báze 1871 a pokračují až k bázi 3012 u klonu 648.3, resp. od báze 1551 až k 3367 u klonu 705.1.

Pro získání úplnější potkaní sekvence, zahrnující i oblast odpovídající 5' konci, byla, postupem stejným jako u prvního testování, znovu testována stejná knihovna, ale při tomto testování byly použity myší sondy získané z klonu A1160 (viz Příklad 17, viz níže). Pomocí druhého testování

4 4 4 byly vyselektovány jednotlivé izolované plaky, které byly uchovány jako jednotlivé klony na miskách s LBM/agar. K vytvoření DNA použitelné pro sekvenování byly ve standardní PCR reakci použity sekvenační primery 434FL a 434FR (SEK. ID. Č: 34 resp. 35).

5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3' (SEK. ID. Č: 34)

5^z-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3^z (SEK. ID. Č: 35)

DNA získaná metodou PCR byla purifikována za použití kolony Quick Spin (Qiagen) dle protokolu doporučeného výrobcem.

Byly identifikovány dva klony, označené 741.4 a 741.11, jejichž sekvence se překrývaly se sekvencemi klonů 684.3 a 705.1; v překrývajících se oblastech byly klony 741.4 a 741.11 100% homologní s klony 684.3 a 705.1. Složená potkaní cDNA homologní k lidskému genu pro a_d, je zobrazena v SEK. ID. Č: 36; předpovězená aminokyselinová sekvence je uvedena v SEK. ID. Č: 37.

Klonování 5^Z konce sekvence kódující potkaní a_d

Fragment 5^Z konce cDNA pro gen kódující potkaní a_d byl získán z potkaní sleziny s využitím klonovacího kitu RACE (Clonetech) postupem doporučeným výrobcem. Použité oligonukleotidy specifické pro tento gen byly označeny 741.11#2R a 741.2#1R (SEK. ID. Č: 59 resp. 58).

5'-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3^z (SEK. ID. Č: 59)

5^z-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3^z (SEK. ID. Č: 58)

Oligonukleotid 741.11#2R zahrnuje báze 131 až 152 v

SEK. ID. Č: 36 v opačné orientaci a oligonukleotid 741.2#1R zahrnuje báze 696 až 715 v SEK. ID. Č: 36 také v opačné orientaci. Primární reakce PCR byla provedena za použití • · · ·

oligonukleotidu 741.2#1R vymezujícího 3' konec kódujícího vlákna (nejblíže 3'-konci). Následná druhá reakce PCR byla provedena za použití oligonukleotidu 741.11#2R a DNA získané z první reakce. Na 1% agarózovém gelu byl detekován proužek o velikosti přibližně 300 párů bází.

Produkt druhé reakce PCR byl, podle protokolu doporučeného výrobcem, zaklonován do plazmidu pCRTAII (Invitrogen). Do každé z 96 jamek (s kulatým dnem) na destičce pro tkáňové kultury byly, do 100 μΐ LBM média obsahujícího 1 μΐ zásobního roztoku karbenicilinu o koncentraci 50mg/ml a 1 μΐ kultury fága M13 K07, přidány bílé (pozitivní) kolonie.

Směs byla inkubována 30 minut až jednu hodinu při teplotě 37°C. Po této inkubaci bylo přidáno 100 μΐ LBM média (obsahující 1 μΐ zásobního roztoku karbenicilinu o koncentraci 50mg/ml a zásobní roztok kanamycinu o koncentraci 10 mg/ml v ředění 1:250) a inkubace pokračovala při teplotě 37°C přes noc.

Sterilní kovovou transferovou vidlicí byl supernatant z 96 jamkové destičky přenesen na čtyři nylonové filtry Hybond (Amersham). Filtry byly denaturovány, neutralizovány a DNA zesítěna podle standardních protokolů. Filtry byly prehybridizovány za stálého třepání ve 20 ml prehybridizačního pufru (5x SSPE; 5x Denhardts; 1% SDS; 50 pg/ml denaturované DNA z lososích spermií) při teplotě 50°C po dobu několika hodin.

Oligonukleotidové sondy 741.11#1 a 741.11#1R (SEK. ID. Č: 56 a 57), zahrnující páry baží 86 až 105 (SEK. ID. Č:

36) v přímé a reverzní orientaci, byly radioaktivně označeny následovně.

5'-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3' (SEK. ID. Č: 56)

5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3' (SEK. ID. Č: 57) • · · · ·

Přibližně 65 ng oligonukleotidové DNA bylo dvě minuty při teplotě 65°C zahříváno ve 12 μΐ dH₂O. Do zkumavky byly přidány 3 μΐ 10 mCi/ml γ-³²Ρ-ΑΤΡ spolu s 4 μΐ 5x pufru pro kinázu (Gibco) a 1 μΐ DNA kinázy T4 (Gibco). Směs byla inkubována 30 minut při teplotě 37°C. Po skončení inkubace bylo 16 μΐ každé ze značených oligonukleotidových sond přidáno k filtrům v prehybridizačním pufru a inkubace pokračovala při 42°C přes noc. Filtry byly třikrát, po dobu 5 minut při pokojové teplotě, promývány v roztoku 5x SSPE s 0,1% SDS a 6 hodin autoradiografovány. Pozitivní klony byly namnoženy a DNA byla purifikována křtem pro minipreparaci DNA Magie Mini (Promega) podle výrobcem doporučeného protokolu. K sekvenování byl vybrán klon 2F7 a tento klon vykázal, v překrývající se oblasti, 100% homologii ke klonu 741.11. Kompletní potkaní nukleotidová sekvence genu pro a_dje zobrazena v SEK. ID. Č: 54; aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 55.

Charakteristiky potkaní cDNA a aminokyselinové sekvence

Nukleotidová ani aminokyselinová sekvence potkaní a podjednotky integrinu β₂ nebyly dříve publikovány. Srovnání těchto sekvencí s publikovanými sekvencemi kódujícími podjednotky a lidských integrinů β₂ naznačuje, že izolovaný potkaní klon podjednotky a_d má velmi podobnou nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci.

Na úrovni sekvence nukleotidů vykazuje izolovaný klon potkaní cDNA 80% shodu ve srovnání s cDNA pro lidský oc_d;

68% shodu s cDNA pro lidský CDllb; 70% shodu s cDNA pro lidský CDllc a 65% shodu s cDNA pro myší CDlla.

Na úrovni sekvence aminokyselin vykazuje předpokládaný potkaní polypeptid, kódovaný izolovanou cDNA, 70% shodu v porovnání s lidským polypeptidem a_d; 28% shodu s lidskou • · · · · · podjednotkou CDlla; 58% shodu s lidskou podjednotkou CDllb; 61% shodu s lidskou podjednotkou CDllc; 28% shodu s myší podjednotkou CDlla a 55% shodu s myší podjednotkou CDllb.

Příklad 18

Produkce a charakterizace protilátek specificky namířených proti podjednotce a_d hlodavců

A. Protilátky namířené proti fúzním proteinům doména I potkaního polypeptidů oc_d/HuIgG4

Jelikož bylo dokázáno, že doména I lidského integrinu β₂ se účastní vazby ligandů, předpokládalo se totéž pro potkaní protein a_d. Imunospecifické monoklonální protilátky proti ot_d by proto měly být užitečné u potkaních modelů lidských nemocí, při nichž hraje úlohu vazba podjednotky a_d.

Oligonukleotidy alfa-DI5 (SEK. ID. Č: 87) a alfa-Dl3 (SEK. ID. Č: 88) byly vytvořeny ze sekvence potkaní a_d odpovídají oblasti bází 469 až 493 resp. 1101 až 1125 (v reverzní orientaci) v SEK. ID. Č: 54. Oligonukleotidy byly použity ve standardní PCR reakci k vytvoření fragmentu DNA kódujícího potkaní a_d obsahující doménu I v oblasti bází 459 až 1125 v SEK. ID. Č: 54. Produkt PCR byl vklonován do vektoru pCRTAII (Invitrogen) podle výrobcem doporučeného protokolu. Byla vybrána pozitivní kolonie a z její rozrostlé kultury byla, za použití kitu pro izolaci DNA Midi Prep firmy Qiagen (Chatswoth, GA) podle protokolu výrobce, izolována DNA. DNA byla klasicky naštěpena restrikčními enzymy Xhol a BglII. Vzniklý fragment o velikosti 600 bází byl izolován z gelu a následně zaklonován do expresívního vektoru pDCSl/HuIgG4. Pozitivní kolonie byly selektovány a namnoženy, a za použití kitu pro izolaci DNA Maxi firmy Quiagen z nich byla purifikována DNA.

·· ····

Buňky COS byly v poloviční konfluenci vysety na misky o průměru 100 mm a kultivovány přes noc při teplotě 37°C v 7% CO₂. Buňky byly lx propláchnuty 5 ml média DMEM. K 5 ml DMEM bylo přidáno 50 μΐ DEAE-Dextranu, 2 μΐ chlorokinu a 15 pg potkaní DNA kódující fúzní protein doména I polypeptidu GCd/Hu IgG4 popsaný výše. Tato směs byla přidána k buňkám COS a buňky byly inkubovány tři hodiny při teplotě 37°C. Médium bylo odstraněno a buňky byly přesně jednu minutu inkubovány v 5 ml 10% DMSO v CMF-PBS. Buňky byly jedenkrát mírně propláchnuty v DMEM. K těmto buňkám bylo přidáno deset mililitrů DMEM obsahujícího 10% FBS a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 37°C v 7% CO₂. Následující den bylo médium nahrazeno čerstvým médiem a inkubace probíhala po následující tři dny. Toto médium bylo odebráno a do misky bylo přidáno čerstvé médium. Po třech dnech bylo médium opět odebráno a misky byly vyhozeny. Postup byl opakován, dokud nebyly z kultury získány 2 litry supernatantu.

Supernatant získaný výše popsanou metodou byl nanesen na kolonu Prosep-A (Bioprocessing Limited) a protein byl purifikován postupem popsaným níže.

Kolona byla nejdříve promyta 15-ti násobným objemem promývacího pufru obsahujícího 35 mM Tris a 150mM NaCl o pH=7,5. Supernatant byl nanášen při rychlosti menší než přibližně 60 objemů kolony za hodinu. Následně byla kolona promyta 15-ti násobným objemem promývacího pufru, 15-ti násobným objemem roztoku 0,55 M diethanolaminu o pH=8,5 a 15ti násobným objemem roztoku 50 mM kyseliny citrónové o pH=5,0. Protein by eluován roztokem 50 mM citrónové kyseliny o pH=3,0 a dále neutralizován roztokem 1,0 M Tris a dialyzován do sterilního roztoku PBS.

Doména I potkaního proteinu cc_d byla analyzována postupem popsaným v Příkladu 14. Detekovaný protein putoval stejným způsobem jako protein lidské domény I.

• · · · • · ··♦♦

B. Produkce monoklonálních protilátek namířených proti fúznímu proteinu doména I potkaního polypeptidů cc_d/HuIgG4

Myši byly jednotlivě imunizovány 50 pg purifikovaňého fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidů a_d/HuIgG4, který byl nejdříve emulgován stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Sigma). Přibližně 200 pl tohoto preparátu bylo na čtyřech místech vstříknuto do hřbetu a boku myši. O dva týdny později byla myš podruhé injikována 100 pl antigenu doména I potkaního polypeptidů a_d/HuIgG4 (ve množství 50 pg/myš), který byl předtím emulgován stejným objemem Freundova nekompletního adjuvans. Za následující dva týdny bylo myším intravenózně aplikováno 50 pg antigenu ve 200 pl roztoku PBS.

Pro zjištění titru krevního séra imunizovaných myší byl deset dní po třetí imunizaci proveden retro-orbitální odběr krve. Krev se nechala srazit, sérum bylo izolováno centrifugací a použito k imunoprecipitaci proteinů ze slezinných buněk potkanů značených biotinem (BIP). Sérum získané z každé myši imunoprecipitovalo proteinové proužky o molekulové hmotnosti předpokládané pro potkaní oc_d a CD18. Jedna z myší byla vybrána pro fúzi a počtvrté injikována, postupem popsaným výše (pro třetí injekci).

Protilátky v supernatantech získaných kultivací hybridomů byly testovány následujícím způsobem. Čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při teplotě 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším imunoglobulinům IgA, IgG nebo IgM (Organon Teknika) v množství 50 pl/jamku, zředěnou v poměru 1:5000 v uhličitanovém pufru o pH=9,6. Destičky byly třikrát promyty pufrem PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a bylo do nich přidáno 50 pl supernatantu získaného z buněčných kultur. Po inkubaci probíhající 30 minut při teplotě 37°C a promytí, postupem ··♦· • · ·· ·· ·· popsaným výše, byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou namířená proti myšímu IgG9(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěná v poměru 1:3500 v roztoku PBST. Misky byly inkubovány, postupem popsaným výše, a čtyřikrát promyty roztokem PBST. Ihned potom bylo přidáno 100 μΐ substrátu, který obsahoval o-fenylendiamin v koncentraci 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 v 100 mM citrátu o pH=4,5. Barevná reakce byla po 5 minutách zastavena přídavkem 50 μΐ 15% H₂SO₄. Absorbance byla stanovována při vlnové délce 490 nm na čtečce destiček firmy Dynatech.

Supernatant z jamek obsahujících protilátku byl dále analyzován metodou ELISA za použití imobilizovaného fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidu a_d/HuIgG4. Jako kontrola reaktivity proti fúznímu partneru IgG byla použita metoda ELISA, při níž byly destičky povlečeny protilátkou HuIgG4. Pro další testování metodou BIP s potkaním slezinným lyzátem byly, technikami popsanými níže, selektovány pozitivně reagující jamky.

C. Produkce polyklonálního séra namířeného proti fúznímu proteinu doména I potkaního polypeptidu a_d/HuIgG4

Dvěma králíkům byla před imunizací, prováděnou s využitím 100 pg purifikovaného fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidu a_d/HuIgG4 ve Freundovu kompletním adjuvans, odebrána krev. Každé tři týdny byli králíci injikováni stejnou dávkou, tentokrát ovšem ve Freundově nekompletním adjuvans. Po třech injekcích byla králíkům odebrána krev a získané sérum použito ke standardní imunoprecipitaci s lyzátem potkaních splenocytů. Sérum z obou králíků bylo imunoreaktivní vůči potkanímu polypeptidu a_d. Králíci byli znovu injikováni 100 pg antigenu ve Freundovu nekompletním adjuvans a získané sérum bylo, za účelem detekce rostoucí ·· ·· • · · · • · · · • · · · 9

·· ···· ti ···· imunoreaktivity, testováno imunoprecipitací s potkaním a_d. Po deseti dnech od aplikace poslední posilovači dávky byla králíkům odebrána krev a získáno sérum.

Histologie potkaního a_d

Králičí polyklonální sérum namířené proti doméně I potkaního polypeptidu oc_d bylo použito při imunohistochemickém značení potkaních tkáňových řezů. Toto značení bylo prováděno technikami popsanými v Příkladu 16. Distribuce značky, zjištěná na zmrazených nebo do parafinu zapuštěných řezech potkaních slezin, byla v podstatě identická s distribucí pozorovanou při značení jednotlivých buněk uvnitř červené pulpy protilátkami proti lidskému a_d. Distribuce značky se lišila od distribuce značky při značení prováděném pomocí monoklonálních protilátkek namířených proti potkanímu CDlla, CDllb a CD18. Kromě toho byl pozitivní signál detekován u jednotlivých buněk v kůře brzlíku. Ani jedna z těchto tkání neposkytla pozitivní signál při značení králičím sérem odebraným před imunizací.

D. Analýza specificity protilátek

Potkani byli usmrceni asfyxií oxidem uhličitým a jejich sleziny byly odebrány standardními technikami. Slezinné buňky byly získány jemným protlačením sleziny pomocí pístu injekční stříkačky přes drátěné sítko do 20 ml RPMI média. Buňky byly posbírány do kónické baňky o objemu 50 ml a promyty vhodným pufrem.

Buňky byly třikrát promyty roztokem studeného D-PBS a rozsuspendovány na hustotu 10⁸ až 10⁹ buněk ve 40 ml PBS. K suspenzi buněk byly přidány čtyři mg NHS-Biotinu (Pierce) a reakce probíhala při pokojové teplotě přesně 15 minut. Buňky byly zcentrifugovány a třikrát promyty studeným D-PBS.

44

4 ·

9· ··4 4 • · · · · · • · 4 4 4 4 • ••4 4 44 44

Buňky byly ve studeném lyzačním pufru (složení:1% NP40; 50 mM Tris-HCl o pH=8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCl2; 2 mM MgCl; roztok pepstatinu, leupeptinu a aprotinu v ředění 1:100 přidaný do pufru před přidáním buněk; a 0,0001 g krystalického PMSF přidaného do pufru těsně před přidáním buněk) rozsuspendovány na hustotu 10⁸ buněk/ml. Lyzáty byly protřepávány po dobu 30 vteřin, pak inkubovány 5 minut při pokojové teplotě a dále 15 minut na ledu. Následně byly centrifugovány 10 minut při 10 OOOxg, aby se odstranil nerozpustný materiál. Supernatant byl převeden do nové zkumavky a uchován při teplotách v rozmezí 4°C až -20°C.

Jeden mililitr buněčného lyzátu byl částečně přečištěn inkubací s 200 μΐ suspenze proteinu A-Sepharozy (Zymed) prováděné přes noc při teplotě 4°C. Takto přečištěný lyzát byl pro každou testovanou protilátku rozdělen do mikrozkumavek v objemu 50 μΐ/zkumavka. K lyzátu bylo přidáno 25 μΐ polyklonálního séra nebo 100 až 500 μΐ supernatantu obsahujícího monoklonální protilátku a tato směs byla za stálého třepání inkubována 2 hodiny při 4°C. Následně bylo přidáno 100 μΐ králičí protilátky namířené proti myšímu IgG (Jackson) vázané na kuličky Sepharózy s proteinem A v PBS a inkubace pokračovala za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě. Po mírné centrifugací byly kuličky třikrát promyty studeným promývacím pufrem (složení: 10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1% Triton X-100). Supernatant byl odstraněn odsátím a ke kuličkám bylo přidáno 20 μΐ 2x SDS vzorkového pufru obsahujícího 10% β-merkaptoethanolu. Vzorek byl povařen 2 minuty ve vodní lázni a nanesen na 5% SDSpolyakryamidový gel pro elektroforézu. Po rozdělení byly proteiny přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Tento přenos probíhal přes noc za konstantního proudu. Membrána byla blokována 1 hodinu při pokojové teplotě ve 3% BSA v pufru TBS-T. Po odstranění blokovacího pufru byl k nitrocelulózové membráně přidán konjugát streptavidin-HRP (Jackson) v ·· «··· «4 ··ve

0,1% BSA v pufru TBS-T a inkubace pokračovala dalších 30 minut při pokojové teplotě. Membrána byla třikrát po dobu 15 minut promývána pufrem TBS-T. Následná autoradiografie byla provedena kitem ECL (Amersham) postupem doporučeným výrobcem.

E. Produkce monoklonálních protilátek namířených proti nezkrácenému potkanímu proteinu oc_d

Purifikace potkaního proteinu a_d

Za účelem přípravy imunogenu použitelného k produkci monoklonálních protilátkek namířených proti potkanímu polypeptidu a_d, byl potkaní protein oc_d purifikován z potkaních slezinných buněk. Sleziny byly izolovány z přibližně 50 normálních samic potkanů Lewis starých 12 až 20 týdnů. Jednolitá buněčná suspenze byla získána pasírováním tkáně přes jemné drátěné sítko. Červené krvinky byly odstraněny lyží v pufru o pH=7,4 obsahujícím 150 mM NH₄C1, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA a zbylé leukocyty byly dvakrát promyty pufrem PBS. Slezinné buňky byly odstředěny a lyžovány v pufru obsahujícím 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM PMSF, leupeptin, pepstatin a 1% Triton X-100. Lýza slezinných buněk probíhala na ledu po dobu 30 minut v jednom mililitru lyzačního pufru na 5 χ 10⁸ slezinných buněk. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací.

Polypeptidy CDlla, CDllb a CDllc byly ze slezinného lyzátu odstraněny imunoprecipitací provedenou postupem popsaným dále. Po dobu 30 minut bylo, při teplotě 4°C, 750 μΐ suspenze protein A-Sepharózy inkubováno s 2 mg králičí protilátky namířené proti myšímu imunoglobulinů. Vzniklý komplex byl třikrát promyt lyzačním pufrem a nakonec rozsuspendován v 1,5 ml lyzačního pufru. K 50 ml potkaního slezinného lyzátu bylo přidáno přibližně 200 pg každé ze specifických monoklonálních protilátek, 515F (specificky namí97 ···· • 4 ····

444<

• · · • · ·

4 4 · • 4 4 4

44

4«

4 4 4

4 44

444 4 4

4 4

44 řená proti potkaní CDlla), OX-42 (specificky namířená proti potkaní CDllb) a lOOg (specificky namířená proti potkaní CDllc). Po 30 minutové inkubaci při teplotě 4°C bylo k lyzátu přidáno 500 μΐ komplexu králičí protilátky s protein A-Sepharozou a tato směs byla třepána při teplotě 4°C třepáno po dobu 30 minut na třepačce. Lyzát byl centrifugován při 2500xg po dobu 10 minut, aby se oddělily CDlla, CDllb a CDllc navázané na komplex králičí protilátky s protein ASepharozou. Supernatant byl převeden do nové centrifugační kyvety. Tato imunoprecipitace s protilátkami 515F, OX-42 a lOOg byla opakována ještě dvakrát, aby bylo zajištěno kompletní odstranění CDlla, CDllb a CDllc.

Zbylé integriny β₂ byly z lyzátu izolovány pomocí afinitní chromatografie. K lyzátu bylo přidáno přibližně 250 μΐ suspenze obsahující monoklonální protilátku 20C5B namířenou proti myší CD18 navázanou na CNBr-Sepharózu a vzniklý roztok byl při teplotě 4°C třepán po dobu 30 minut na třepačce. Komplex protilátka/antigen byl centrifugován při 2500xg po dobu 10 minut, peleta byla třikrát promyta lyzačním pufrem a skladována při teplotě 4°C.

Imunizace arménských křečků

Arménští křečkové, staří šest až osm týdnů, byli poprvé imunizováni pomocí přibližně 50 pg rekombinantního proteinu sestávajícího z domény I potkaního polypeptidů a_d připojené k těžkému řetězci lidského IgG₄. Tento protein byl před imunizací emulgován Freundovým kompletním adjuvans. Následné imunizace proběhly se stejným proteinem emulgovaným ve Freundově nekompletním adjuvans 14. den, 33. den a 95. den po první imunizaci. Byly provedeny dvě oddělené fúze, označené 197 a 199.

····« ·· ·· ·· ··

Čtyři dny před fúzí 197 (306. den) byla jednomu křečkovi aplikována směs potkaního proteinu a_d purifikovaného ze slezinných buněk a buněk CHO transfekovaných potkaním oc_d. Tři dny před fúzí (307. den) byla křečkovi aplikována posilovači dávka obsahující purifikovaný potkaní protein oc_d a CHO buňky transf ekované oc_d. Transfekce buněk CHO potkaním oc_d byla provedena následovně.

Segment genu kódující nezkrácený potkaní protein a_d byl vložen do vektoru pDCl, kterým byly, spolu s lidským konstruktem CDl8-pRC, elektroporací transfekovány buňky CHO. Transfekované buňky byly kultivovány v přítomnosti hypoxanthinu a g418, aby se vyselektovaly buňky úspěšně transfekované konstruktem pRC resp. konstruktem pDCl. Po třech týdnech byly buňky značeny specifickým polyklonálním sérem namířeným proti potkaní a_d a rozděleny s využitím FACS. Malý podíl buněk, který na svém povrchu vykazoval nejvyšší hladinu exprese polypeptidu oc_d (přibližně 3% populace) , byl separován a buňky byly dále pomnoženy. Tento postup byl několikrát opakován, aby byla získána populace buněk s nejvyšší povrchovou expresí a_d.

Transfekované buňky byly také charakterizovány průtokovou cytometrií za použití polyklonálního séra specificky namířeného proti potkanímu polypeptidu a_d a monoklonální protilátky TSI.18.1 specificky namířené proti lidské CD18. Získané výsledky potvrdily vysokou hladinu exprese obou antigenů na povrchu transfekovaných buněk CHO.

Exprese a_d a CD18 v buňkách byla nakonec analyzována imunoprecipitací. Králičí polyklonální sérum specificky namířené proti potkanímu polypeptidu a_d imunoprecipitovalo se dvěma proteiny o rozdílné molekulové hmotnosti. Molekulové hmotnosti byly 170 kDa u většího proteinu a 95 kDa u menšího proteinu. Tyto výsledky byly v souladu s expresí hetero99 • · · · • · · » dimerního komplexu potkaní a_d/lidský CD18 na povrchu transfekovaných buněk CHO.

V den fúze byla vyjmuta slezina. Suspenze jednotlivých slezinných buněk byla vytvořena rozmělněním tkáně mezi dvěmi namraženými podložními sklíčky ponořenými do média RPMI bez přítomnosti séra s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilinu v koncentraci 100 jednotek/ml a streptomycinu v koncentraci 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčné sítko Nitex o velikosti ok 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany,

New Jersey), dvakrát promyta centrifugaci při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla následně rozsuspendována ve 20 ml média RPMI bez přítomnosti séra. Thymocyty ze tří myší Balb/c (neimunizovaných) byly připraveny obdobným způsobem. Myelomy NS-1, udržované po tři dny před fúzí v log fázi v médiu RPMI s obsahem 10% fetálního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne. Logan, Utah), byly centrifugovány při 200xg po dobu 5 minut a peleta byla dvakrát promyta, postupem popsaným výše.

Přibližně 1,15 χ 10⁸ slezinných buněk bylo smícháno s 5,8 χ 10⁷ buněk NS-1, zcentrifugováno a supernatant byl odstraněn odsátím. Peleta byla poklepem uvolněna ode dna kyvety. K buněčné peletě bylo, za stálého míchání po dobu jedné minuty, přidáváno 7 ml PEG 1500(Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufru 75mM HEPES o pH=8,0) zahřátého na teplotu 37°C. Následně bylo k buněčné suspenzi přidáno 14 ml média RPMI bez přítomnosti séra a suspenze byla míchána po dobu 7 minut. Bylo přidáno dalších 8 ml média RPMI a buňky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 200xg. Supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve 200 ml média RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 0,4 mM aminopterin, 16 mM thymidin (HAT) (Gibco), IL-6 o koncentraci 25 jednotek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 χ 10⁶ thymocytů/ml. Suspenze byla rozdělena do 10-ti 96-jamkových (s

100 • · · · • · • · · · 9 · · ···· · • · ···· ··· ····· · · · · · · · · plochým dnem) destiček pro tkáňové kultury (Corning, Velká Británie) v objemu 200 μΐ/jamka a buňky byly vyživovány 4., 5., 6. a 7. den odebráním 100 μΐ média z každé jamky 18Gjehlou (Becton Dickinson) a přidáním 100 μΐ čerstvého média, popsaného výše, avšak neobsahujícího thymocyty.

Desátý den byl supernatant z jamek testován průtokovou cytometrií, zda-li reaguje s buňkami CHO transfekovanými heterodimerem potkaní oc_d/lidská CD18. Přibližně 5 χ 10⁵ buněk CHO transfekovaných potkaní a_d bylo rozsuspendováno v 50 μΐ média RPMI obsahujícího 2,0% FBS a 0,05% azid sodný a na 96-jamkových destičkách s jamkami s kulatým dnem přidáno ke 100 μΐ supernatantu získaného při kultivaci hybridomů. Pozitivní kontrolou bylo značení pomocí králičího polyklonálního séra namířeného proti a_d a protilátky TS1/18 namířené proti lidskému CD18. Buňky byly inkubovány 30 minut na ledu, třikrát promyty v pufru FACS (RPMI, 2,0% FBS, 0,05% azid sodný) a inkubovány 30 minut na ledu s kozí protilátkou značenou FITC namířenou proti křeččím Ig (Jackson Immunol Research Labs) zředěnou v poměru 1:200 v pufru FACS. Buňky byly třikrát promyty v pufru FACS a resuspendovány ve 200 ml tohoto pufru. Vzorky byly analyzovány na analyzátoru FACscan firmy Becton Dickinson. Za účelem potvrzení, že klony z pozitivně reagujících jamek jsou specifické proti potkaní a_d, byl· celý pokus opakován s netransfekovanými buňkami CHO. Klony, které splnily podmínky a reagovaly s buňkami CHO transfekovanými potkaní a_d, ale nereagovaly s netransfekovanými buňkami, byly dále pomnoženy.

Po primárním screeningu byly buňky z pozitivně reagujících jamek pasážovány nejprve dvojnásobným zředěním a následně mezním zředěním v médiu RPMI obsahujícím 15 % FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 16 mM thymidin a IL-6 v koncentraci 10 jednotek/ml. V tomto kroku bylo určeno procento jamek vykazující růst a s využitím Poissonovy distribuční

101 • · • fl • fl flfl • · flfl analýzy byla předpovězena klonalita. Po 10 až 12 dnech byly jamky obsahující množící se populace analyzovány s využitím FACS. Po posledním pasážování byly buňky z pozitivních jamek namnoženy v médiu RPMI s 11% FBS. Byla získána jedna kultura, která se podle těchto kritérií jevila jako pozitivní. Z této kultury byly rozrostlé 4 separátní subklony označené 197A-1, 197A-2, 197A-3 a 197A-4.

Druhému křečkovi bylo 307. den aplikováno 2,3 x 10⁶ buněk CHO transfekovaných potkaní ad. Dvě závěrečné imunizace byly provedeny 4 dny před fúzí 199 (334. den) a opět tři dny před fúzí (335. den). Injekce ze dne 334, aplikovaná intraperitoneálně, obsahovala 2 x 10^s buněk CHO transfekovaných potkaní ad a 200 μΐ purifikované potkaní podjednotky a_d navázané k Sepharóze (popsáno dříve). Injekce ze 335.dne, aplikovaná rovněž intraperitoneálně, obsahovala 5 x 10⁶ buněk CHO transfekovaných potkaní a_d. Postup fúze a protokol testování byl stejný jako u fúze 197. Byly identifikovány a pomnoženy tři hybridomy označené 199A, 199H a 199M. Hybridom 199M byl 1. března 1996 uložen u American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod přístupovým číslem HB-12058.

Charakterizace monoklonálních protilátek proti potkanímu polypeptidu a_d

Aby bylo možno charakterizovat protilátky namířené proti potkanímu a_d, byly, postupem popsaným v Příkladu 18, oddíl D, připraveny biotinem značené slezinné lyzáty. Před vlastní imunoprecipitací byly lyzáty předčištěny. Na počátku byl k lyzátu přidán normální myší imunoglobulin v koncentraci 50 pg/ml a výsledná směs byla po dobu 30 minut při teplotě 4°C třepána na rotační třepačce. K této směsi bylo přidáno 75 μΐ suspenze protein A-Sepharozy potažené králičí protilátkou namířenou proti myším Ig a třepání pokračovalo

102 • · • ·

dalších 30 minut. Kuličky s navázanou protilátkou byly odstředěny při 15000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze. Centrifugace probíhala po dobu 5 minut při teplotě 4°C. Supernatant byl odebrán a peleta odstraněna.

Z každého klonu hybridomů bylo do mikrozkumavky odebráno přibližně 300 μΐ supernatantu. K tomuto supernatantu bylo přidáno 30 μΐ 10% Tritonu X-100, 30 μΐ ze lOOx zásobního roztoku pepstatinu, leupeptinu a aprotinu, dále 100 pg krystalického PMSF a 50 μΐ předčištěného biotinylovaného lyzátu z potkaní sleziny. Obsah mikrozkumavek byl mírně protřepán a na dobu 30 minut při teplotě 4°C umístěn na rotačku. Kontrolní vzorek byl připraven přidáním králičí polyklonální protilátky specificky namířené proti potkanímu polypeptidů oc_d o koncentraci 10 mg/ml k 50 μΐ potkaního slezinného lyzátu.

Po 30 minutové inkubaci bylo ke každému vzorku přidáno 75 μΐ suspenze kuliček protein A-Sepharózy v PBS pufru a vzorek byl inkubován na rotačce dalších 30 minut při teplotě 4°C. Kuličky Sepharózy byly centrifugovány po dobu 5 minut při teplotě 4°C při 15000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze a supernatant byl odebrán. Kuličky byly postupně promyty jedním mililitrem z každého z následujících detergentních roztoků: pufr #1 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, pH 8,0; pufr #2 obsahující lOmM Tris, 400 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 8,0; pufr #3 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, 0,1% deoxycholát, pH 8,0; a pufr #4 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCl, pH 8,0. Poslední promytí bylo provedeno pufrem #1. Mezi jednotlivými promytími byly kuličky mírně protřepány na vortexu a odstředěny ve stolní centrifuze. Supernatant byl vždy odstraněn pipetou a po posledním promytí byl zbylý pufr od kuliček odstraněn stříkačkou (Hamilton). Ke každé peletě kuliček byl přidán alikvot (50 μΐ) SDS vzorkového pufru obsahujícího bromfenolovou modř,

103 • « · · · · • · · • · · barvivo Pyronin Y a β-merkaptoethanol o výsledné koncentraci 10%. Směs byla prudce 1 až 2 minuty třepána a inkubována 5 až 10 minut při pokojové teplotě. Vzorky byly centrifugovány po dobu 5 minut při 15000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze při teplotě 4°C a uvolněný protein byl přenesen do nové mikrozkumavky. Vzorky byly povařeny 4 minuty na vodní lázni a naneseny na 7,5% SDS polyakrylamidový gel. Po ukončení dělení byly proteiny přeneseny na nitrocelulozové filtry. Transfer probíhal při200 mA po dobu 1 hodiny. Filtry byly blokovány v roztoku 3,0% BSA v pufru TBS-T přes noc při teplotě 4°C. Ke každému filtru byl přidán roztok 0,1% BSA v pufru TBS-T obsahující streptavidin-OPD v ředění 1:6000, ve kterém byl ponechán jednu hodinu za pokojové teploty. Filtry byly promývány pětkrát vždy po dobu 10 minut v pufru TBS-T a obarveny použitím kitu ECL (Amersham) postupem doporučeným výrobcem.

Bylo prokázáno, že klon 199M imunoprecipituje heterodimerní protein. Větší proteinová podjednotka měla přibližnou molekulovou hmotnost 170 až 175 kDa, což odpovídalo velikosti proteinu imunoprecipitovaného kontrolní králičí polyklonální protilátkou namířenou proti potkaní a_d. Druhá imunoprecipitovaná podjednotka měla zdánlivou molekulovou hmotnost 95 kDa, shodnou s velikostí CD18.

Příklad 19

Izolace klonů myší cDNA

Byl učiněn pokus o izolaci myšího homologu a_d.

Pomocí dvou sond vytvořených metodou PCR byla provedena mezidruhová hybridizace. První sondou byl fragmet o velikosti 1,5 kb odpovídající bázím 522 až 2047 z lidského klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1), druhou sondou byl potkaní fragment o velikosti 1,0 kb odpovídající bázím 1900 až 2900 z lid104 • · · ·

ského klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1). Lidská sonda byla vytvořena polymerázovou řetězovou reakcí primeru označených ATM2 a 9-10.1 (SEK. ID. Č: 38 resp. 39). Potkaní sonda byla vytvořena s využitím primeru 434L a 434R (SEK. ID. Č: 34 resp. 35). Vzorky byly inkubovány 4 minuty při teplotě 94°C a podrobeny 30 cyklům s následujícím teplotním režimem:

94°C, 2 minuty při 50°C; 4 minuty při 72°C.

5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3' (SEK. ID. Č: 38)

5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3' (SEK. ID. Č: 39)

Produkt reakce PCR byl purifikován pomocí kitu Quick Spin firmy Qiagen, postupem doporučeným výrobcem, a přibližně 180 ng DNA bylo za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označeno 200 pCi [³²P]-dCTP. Nenavázaný izotop byl odstraněn pomocí kolony Centri-sep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Sondy byly před použitím denaturovány 0,2 N NaOH a neutralizovány roztokem 0,4 M Tris-HCl o pH=8,0.

Knihovna cDNA získaná z buněk myšího thymu s využitím sekvence oligo-dT jako primeru zabudovaná v lambda ZAP II (Stratagene) byla vyseta v koncentraci přibližně 30000 plaků na 1 misku o průměru 15 cm. Plaky přenesené na nitrocelulózové filtry (Schleicher & Schuell, Keene, NH) byly za stálého míchání inkubovány při teplotě 50°C po dobu jedné hodiny v prehybridizačním roztoku (8 ml/přenos) obsahujícím 30% formamid. K prehybridizačnímu roztoku byly přidány značené lidské a potkaní sondy a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 50°C. Filtry byly dvakrát promyty v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 37°C a jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C. Expozice

105 • · · · • · · · filtrů na film Kodak X-Omat AR probíhala při teplotě -80°C po dobu 27 hodin za použití kontrastního filtru.

Čtyři plaky, které poskytly pozitivní signál při dvakrát opakovaném přenosu, byly znovu vysety na misky s LB médiem s přídavkem hořčíku a karbenicilinu v koncentraci lOOmg/ml a inkubovány přes noc při 37°C. Fágové plaky byly přeneseny na filtry Hybond (Amersham), označeny jako v prvním pokusu a exponovány na film Kodak X-Omat AR při teplotě -80°C po dobu 24 hodin za použití kontrastního filtru.

Dvanáct pozitivních plaků bylo přeneseno do ředícího roztoku s nízkým obsahem Mg²⁺ iontů (10 mM Tris-HCl a lmM MgCl₂) . Velikost inzerčního fragmentu byla určena pomocí PCR reakce s T3 a T7 primery (SEK. ID. Č:13 a 14) za následujících reakčních podmínek. Vzorky byly inkubovány při 94°C po dobu 4 minut a vystaveny 30 cyklům s tímto teplotním režimem: 15 vteřin při 94°C, 30 vteřin při 50°C a 1 minutu při 72°C.

Šest vzorků poskytlo rozdílné proužky DNA o velikosti od 300 bází do 1 kb. Fágmidy byly uvolněny pomocí koinfekce pomocným fágem a převedením do cyklické formy byl vytvořen Bluescript SK^- (Stratagene). Vzniklé kolonie rostly v LBM médiu s karbenicilinem (lOOmg/ml) přes noc. DNA byla izolována pomocí kitu pro minipreparaci DNA Wizard firmy Promega (Madison, Wl) podle návodu výrobce. Restrikční analýza izolované DNA enzymem EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, odpovídající molekulovým hmotnostem zjištěným z PCR. Fragment DNA byl sekvenován za použití primerů M13 a reverzního primerů.1 M13, jejichž sekvence jsou zobrazené v SEK. ID.

Č: 40 resp. 41.

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEK. ID. Č: 40)

5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEK. ID. Č: 41)

106 • · ···· ·· · · · ·

• · · · · ·

Sekvenování bylo provedeno postupem popsaným v Příkladu 4.

Jen dva ze šesti klonů, označené 10.3-1 a 10.5-2, poskytly identickou sekvenci o velikosti 600 párů bází. Tato sekvence byla ze 68% identická s odpovídající oblastí lidského a_d, ze 40% identická s odpovídající oblastí lidského CDlla, z 58% identická s odpovídající oblastí lidského CDllc a z 54% identická s odpovídající oblastí myšího CDllb. Tento fragment o velikosti 600 bp byl následně využit k získání úplnější cDNA kódující předpokládaný myší homolog oc_d.

Knihovna cDNA z myší sleziny (vytvořená s využitím oligo-dT primerů a primerů o náhodných sekvencích), zaklonovaná do fága lambda Zap II (Stratagene), byla vyseta v koncentraci 2,5 x 10⁴ fágů na LBM misku o průměru 15 cm. Plaky byly přeneseny na nylonovou membránu Hybond (Amersham) denaturovány 0,5 M NaOH s 1,5 M NaCl, neutralizovány 0,5M Tris-HCl s 1,5M NaCl a promyty v 2X SSC. DNA byla na membráně zesítěna ultrafialovým zářením.

Pomocí sond 10.3-1 a 10.5-2, značených postupem popsaným výše, bylo testováno přibližně 500000 plaků. Sondy byly přidány do prehybridizačního roztoku a inkubovány přes noc při teplotě 50°C. Filtry byly dvakrát promyty v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 37°C a jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 42°C. Expozice filtrů na film Kodak X-Omat AR probíhala při teplotě -80°C po dobu 13 hodin za použití kontrastního filtru.

Osmnáct pozitivních plaků bylo přeneseno do roztoku s nízkým obsahem Mg²⁺ iontů a velikost fragmentu byla určena

PCR metodou, postupem popsaným výše. Každý ze sedmi vzorků poskytl jediný proužek DNA o velikostech od 600 párů bází do 4 kb. Restrikční analýza purifikované DNA enzymem EcoRI

107 • · · ·

potvrdila molekulové hmotnosti, odpovídající molekulovým hmotnostem zjištěným z PCR. Fragment DNA byl sekvenován za použití primerů M13 a reverzního primerů.1 M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41).

Klon označený B3800 obsahoval inzert o velikosti 4kb, který odpovídal· oblasti nacházející se 200 bází po směru transkripce od 5' konce klonu 19A2 lidské a_d a obsahoval 553 bází 3' nepřekládané oblasti. Klon B3800 byl ze 77% identický s odpovídající oblastí lidské a_d, 44% identický s odpovídající oblastí lidské CDlla, 59% identický s odpovídající oblastí lidské CDllc a 51% identický s odpovídající oblastí myší CDllb. Druhý klon A1160 měl velikost 1,2 kb a odpovídal 5' konci kódující oblasti lidské a_d, přibližně 12 bází po směru transkripce od iniciačního kodonu pro methionin. Klon A1160 byl ze 75% identický s odpovídající oblastí lidské oc_d, 46% identický s odpovídající oblastí lidské CDlla, 62% identický s odpovídající oblastí lidské CDllc a 66% identický s odpovídající oblastí myší CDllb.

Klon A1160, fragment blíže 5' konci lidského klonu 19A2, se překrývá s klonem B3800 od báze 205 až k bázi 1134. Klon A1160 má vložen úsek 110 bází (báze 704 až 814), který není v překrývající se oblasti klonu B3800. Tento vložený úsek DNA se nejspíše vyskytuje na hranici exonu a intronu [Fleming a další, J. Immunol. 150:480 až 490 (1993)] a byl před následným spojením klonů A1160 a B3800 odstraněn.

Rychlá amplifikace 5' konce cDNA předpokládaného klonu myšího a_d

K získání chybějících 5' úseků předpokládaných klonů myší a_d, včetně 5' nepřekládané sekvence a iniciačního methioninu, byla použita RACE PCR [Frohman, RACE: Rapid Am108

0 0 0

0 0 0 • · ··· ·♦·· • 0 ·· · 0000 0 • 0 0000 000

0000 0 ·· ·· ·· ·* plification of cDNA Ends, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a další, (editoři) 28 až 38, Academie Press:New York (1990)]. Myší slezinný kit RACEReady (Clontech, Palo Alto, CA) byl použit podle návodu výrobce. Pro uskutečnění první a vnořené PCR byly vybrány dva xantisense specifické primery (A1160 RACE1-primární primer a A1160 RACE2-vnořený primer, SEK. ID. Č: 42 resp.

43) .

5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3' (SEK. ID. Č: 42)

5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (SEK. ID. Č: 43)

Primery, SEK. ID. Č: 42 a 43, odpovídají oblastem začínajících 302 resp. 247 bází od 5' konce. Za použití 5' primeru (SEK. ID. Č: 44) a myší slezinné cDNA dodané v kitu byla, postupem popsaným výše, provedena PCR.

5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3' (SEK. ID. Č: 44)

Elektroforéza produktu PCR reakce odhalila proužek o velikosti 280 bází, který byl zaklonován pomocí klonovacího kitu TA (Invitrigen), postupem doporučeným výrobcem. Deset získaných kolonií bylo pomnoženo, DNA izolována a zjištěna její sekvence. Touto metodou bylo identifikováno dalších 60 bází 5' sekvence, které odpovídají bázím 1 až 60 v SEK. ID. Č: 45.

Charakteristiky myší cDNA a předpokládané aminokyselinové sekvence

Složená sekvence myší cDNA kódující předpokládaný homolog lidské a_d je zobrazena v SEK. ID. Č: 45. Ačkoli homolo109 • · · • · gie mezi vnějšími doménami lidských a myších klonů je vysoká, homologie mezi cytoplazmatickými doménami je jen 30%. Pozorované odchylky mohou nazačovat rozdíl ve funkci Ckoncové domény mezi lidskými a myšími proteiny. Odlišnosti v cytoplazmatických doménách mohou být rovněž výsledkem rozdílného sestřihu RNA nebo mohou naznačovat existenci dalšíchgenů pro integriny β₂.

Aminokyselinová sekvence proteinu, předpovězěná na základě sekvence myší cDNA je z 28% identická s myší CDlla, z 53% s myší CDllb, z 28% s lidskou CDlla, z 55% s lidskou CDllb, z 59% s lidskou CDllc a z 70% s lidskou a_d. Ze srovnání aminokyselinových sekvencí cytoplazmatických domén lidského polypeptidu a_d a předpokládaného myšího homologu vyplývá, že sice obsahují oblasti stejné délky,ale s odlišnou primární strukturou. Podobné velikosti sekvencí v těchto oblastech předpokládají spíše druhovou odlišnost než možnost vzniku rozdílných variant sestřihem. Když porovnáváme myší sekvenci s předpokládaným potkaním polypeptidem (příklad 16 zmíněný výše), dostáváme větší než 60% shodu myší a potkaní cytoplazmatické domény.

Příklad 20

Izolace dalších klonů myší cDNA a_d prováděná za účelem potvrzení sekvence

Aby byla potvrzena nukleotidová a aminokyselinová sekvence myší a_d popsané v Příkladu 19, byly izolovány další myší sekvence.

Hybridizací se dvěmi homologními oc_d sondami (od 3' konce a od 5' konce) byla, s využitím jak myší slezinné knihovny vytvořené pomocí náhodných primerů, tak knihovny cDNA vytvořené pomocí primerů oligo-dT, zaklonovaných do fága lambda ZAP II (Stratagene), provedena izolace myší cD110 ·· · · · ·· ·· · · · ·

NA. Knihovna byla nanesena v koncentraci 5 x 10⁵ fágů/miska na misky s LBM o průměru 15 cm. Plaky byly přeneseny na nylonové membrány Hybond (Amersham). Membrány byly denaturovány (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), neutralizovány (0,5 M Tris/1,5 M NaCl/11,6 M HCl) a promyty (2X SSC). DNA byla na membránách zesitěna pomoci ultrafialového záření.

Sondy byly vytvořeny pomocí primerů popsaných níže v PCR reakci prováděné za následujících podmínek. Vzorky byly vystaveny 4 minuty teplotě 94°C, a potom následovalo 30 cyklů s tímto teplotním režimem: 15 vteřin při 94°C, 30 vteřin při 50°C a 1 minutu při 72°C v cykléru Perkin-Elmer 9600.

3'-sonda, která byla přibližně 900 bází dlouhá, překrývala oblast nukleotidů 2752 až 3651 (v SEK. ID. Č: 1, ve směru od 5' k 3') a byla vytvořena pomocí primerů 11. b1/2FOR11 a ll.b-l/2REV2 zobrazených v SEK. ID. Č: 69 resp. 74. Tato sonda byla použita v první sérii přenosů.

5'-sonda, která byla přibližně 800 bází dlouhá, zahrnovala oblast nukleotidů 145 do 946 (v SEK. ID. Č: 1, ve směru od 5' k 3') a byla vytvořena pomocí primerů ll.b-l/2FORl a ll.a-l/IREVI zobrazených v SEK. ID. Č: 50 resp. 85). Tato sonda byla použita v druhé sérii přenosů.

Ve třetí sérii přenosů byly použity obě sondy společně na stejných miskách.

Pomocí obou sond, popsaných výše, značených způsobem popsaným v Příkladu 17, bylo testováno přibližně 500000 plaků. Značené sondy byly přidány k prehybridizačnímu roztoku s 45% formamidem a inkubovány přes noc při teplotě 50°C. Membrány byly promyty dvakrát v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě (22°C). Poslední promytí bylo provedeno v 2X SSC/0,1% SDS při teplotě 50°C. Autoradiografie byla prováděna po dobu 19 hodin při teplotě -80°C na film Kodak XOmat AR za použití kontrastního filtru.

111 •4 4444

4 4 44 4 4444

4 44 4 4444

4 44 4 44 ··♦· 4

4 4444 444

4444 4 44 44 44 44

Třináct plaků pozitivních nejméně při dvou přenosech bylo podrobeno druhému testování, které bylo provedeno stejně jako první testování, až na dvě výjimky. K hybridizaci byly použity obě značené sondy 3' a 5' a bylo přidáno závěrečné promytí v 2X SSC/0,1% SDS při teplotě 65°C. Autoradiografie byla provedena stejným postupem popsaným výše, ale probíhala pouze po dobu 2,5 hodiny.

Třináct pozitivních plaků (označených MS2P1 až MS2P13) bylo přeneseno do ředícího roztoku s nízkým obsahem hořečnatých iontů. Velikost inzertu byla stanovena metodou PCR (cykler Perkin-Elmer 9600) za použití primerů T3 a T7, které přisedají k fágmidu Bluescript zabudovanému ve vektoru ZAP II (sekvence již dříve popsaná). Podmínky PCR byly stejné, jak bylo popsáno výše. Velikosti proužků DNA se pohybovaly od 500 párů bází do 4kb. Fágmidy byly izolovány a sekvenovány s využitím primerů M13 a reverzního primerů.1 M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41). Pět ze třinácti klonů (MS2P3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12, a MS2P-13) bylo sekvenováno a po složení reprezentovalo přibližně oblast od báze 200 na 5' konci až k 300. bázi za prvním stop kodonem na 3' konci.

Za účelem zjištění sekvencí konců všech klonů a určení jejich relativní pozice vůči konstruktu #17(SEK. ID. Č: 45) bylo, postupem stejným jako v Příkladu 4, provedeno automatické sekvenování s využitím primerů M13 a reverzního primeru.l M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41). Každý klon byl pak úplně sekvenován použitím vhodných primerů (uvedených níže) pro konkrétní oblasti.

ll.b-l/2FORl	5'	-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3'	(SEK.	ID.	Č:	50)
Il.a-1/1FOR2	5'	-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3 ^z	(SEK.	ID.	Č:	60)
Il.a-1/1FOR3	5^Z	-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3^z	(SEK.	ID.	Č:	61)
ll.b-l/2FOR4	5^Z	-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3 ^z	(SEK.	ID.	Č:	62)

112 ·· 4··· • 4 ··44 ·· · · 4 · » · · 4 • · ·· · · 4 · · • · · · · ·· 4 4 4 4 · • · 4 4 4 4 · · 4 • ·4· 4 44 44 44 44

ll.b-l/2FOR5	5'-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3'	(SEK.	ID. Č:	63)
11.b-l/2FOR6	5'-CAGATCGGCTCCTACTITGG-3'	(SEK.	ID. Č:	64)
ll.b-l/2FOR7	5'-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3'	(SEK.	ID. Č:	65)
ll.b-l/2FOR8	5'-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3'	(SEK.	ID. Č:	66)
ll.b-l/2FOR9	5'-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3'
		(SEK.	ID. Č:	67)
11.b-l/2FORlO	5'-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3'	(SEK.	ID. Č:	68)
ll.b-l/2F0Rll	5'-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3'	(SEK.	ID. Č:	69)
11.b-l/2FORl2	5'-GTCACAGAGGGAACCTCC-3'	(SEK.	ID. Č:	70)
11.b-l/2FORl3	5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-	3'
		(SEK.	ID. Č:	71)
ll.b-l/2FOR14	5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-	3'
		(SEK.	ID. Č:	72)
11.b-l/2FOR15	5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3	'(SEK.	ID. Č:	73)
ll.b-l/2REV2	5'-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3'	(SEK.	ID. Č:	74)
ll.b-l/2REV3	5'-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3'	(SEK.	ID. Č:	75)
ll.b-l/2REV4	5'-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3'	(SEK.	ID. Č:	76)
ll.b-l/2REV5	5'-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3'	(SEK.	ID. Č:	77)
ll.b-l/2REV6	5'-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3'	(SEK.	ID. Č:	78)
11.b-l/2REV7	5'-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3'	(SEK.	ID. Č:	79)
ll.b-l/2REV8	5'-GATCCAACGCCAGATCATACC-3'	(SEK.	ID. Č:	80)
ll.b-l/2REV9	5'-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3'	(SEK.	ID. Č:	81)
ll.b-l/2REV10	5'-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3'	(SEK.	ID. Č:	82)
11.b-l/2REVll	5'-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3'	(SEK.	ID. Č:	51)
ll.b-l/2REV12	5'-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3	'(SEK.	ID. Č:	83)
ll.b-l/2REV13	5'-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3'	(SEK.	ID. Č:	84)
ll.a-l/IREVI	5'-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3'	(SEK.	ID. Č:	85)

113 • a ···· ·· ·«·· ·· ·· • a « · · · · · · · ·· »·· · a aa © a e · · · · ··· a · • · a··· aa· ···· a a· ·* a· ··

Il.a-1/1REV2 5'-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3' (SEK. ID. Č: 86)

Sekvence byly upraveny, přiřazeny a porovnány s dříve izolovanými sekvencemi myší a_d (konstrukt #17, SEK. ID. Č:

45) .

Přiřazení nových sekvencí odhalilo v konstruktu #17 deleci 18 bází, která začínala od nukleotidu 2308. Tato delece nezapříčinila posun čtecího rámce. Klon MS2P-9 obsahoval stejnou deleci o délce 18 bází. Výskyt této delece byl pozorován u 50% myších klonů obsahujících tuto oblast, avšak tato delece nebyla zjištěna v potkaních ani lidských klonech podjednotky a_d. Delece 18 bází je charakterizována palindromovou sekvencí 12 bází AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEK. ID.

Č: 91). Tato inverzní repetice je komplementární sama k sobě a může vytvořit smyčku, která způsobuje štěpení během reverzní transkripce. Sekvence myší a_d, která obsahuje navíc 18 bází je zobrazena v SEK. ID. Č: 52; odvozená aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 53.

Příklad 21

In šitu hybridizace u myší

Distribuce myší oc_d v tkáních byla určena proto, aby mohlo být provedeno její srovnání s distribucí lidské a_d, popsané v Příkladu 6.

Pomocí transkripce RNA prováděné in vitro s použitím ³⁵S-UTP (Amersham) byla z templátu DNA získána jednovláknová sonda mRNA o velikosti 200 bp, odpovídající nukleotidům 3460 až 3707 v cytoplazmatické oblasti myší cDNA,

Celá myší embrya (odebrána 11 až 18 dní po oplození) a různé myší tkáně (slezina, ledvina, játra, střevo a thymus)

114 • · · · ·

byly in šitu hybridizovány s radioaktivně značenou jednovláknovou sondou mRNA.

Z tkání byly připraveny řezy o tloušťce 6 pm, které byly adherovány na sklíčka potažená přípravkem Vectabond (Vector Laboratories, lne., Burlingame, CA) a uloženy při teplotě -70°C. Před použitím byla sklíčka vystavena 5 minut teplotě 50°C. Řezy byly po dobu 20 minut při teplotě 4°C fixovány v 4% paraformaldehydu, dehydratovány zvyšující se koncentrací ethanolu (70-95-100%) (1 minutu při teplotě 4°C pro každou koncentraci) a vysušeny na vzduchu (30 minut při pokojové teplotě). Řezy byly denaturovány 2 minuty při teplotě 70°C v roztoku 70% formamid/2X SSC, dvakrát propláchnuty v 2X SSC a dehydratovány ethanolem (postupem popsaným výše) a 30 minut vysoušeny na vzduchu. Hybridizace byla provedena přes noc (12 až 16 hodin) při teplotě 55°C v roztoku obsahujícím sondu značenou izotopem ³⁵S v koncentraci β χ 10⁵ cpm na řez a vodu (vystavenou účinkům diethylpyrokarbonátu - DEPC) tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace 50% formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH=7,5), 10% dextran sulfát, IX Denhardtův roztok, 100 mM dithiothreitol (DTT) a 5 mM EDTA. Po hybridizací byly řezy promývány 1 hodinu při pokojové teplotě v 4X SSC/10 mM DTT, 40 minut při 60°C v 50% formamidu/2X SSC/10 mM DTT, 30 minut při pokojové teplotě v 2X SSC a 30 minut při pokojové teplotě v 0,lX SSC. Řezy byly dehydratovány, po dobu 2 hodin vysoušeny na vzduchu, potaženy fotografickou emulzí Kodak NTB2 , vysoušeny 2 hodiny na vzduchu, vyvolány (uchování při 4°C v úplné tmě) a dobarveny hematoxylinem/eosinem.

Slezinná tkáň vykázala silný signál hlavně v červené pulpě. Tato distribuce signálu odpovídá distribuci tkáňových makrofágů ve slezině, ale nevylučuje přítomnost jiných typů buněk.

115 • · · · • ·

Příklad 22

Příprava myších expresívních konstruktů

Aby mohl být vytvořen expresívní plazmid obsahující sekvenci myší cDNA vykazující homologii k lidské a_d, byly spojeny inzerty klonů A1160 a B3800. Před ligaei byla k inzertu z klonu A1160 přidána vedoucí (leader) sekvence obsahující na 5' konci kodon pro iniciační methionin. Primer označený 5-PCR leader (SEK. ID. Č: 47) byl navržen tak, aby obsahoval: (1) identické nespecifické báze na pozicích 1 až 6 umožňující štěpení; (2) restrikční místo BamHI od pozice 7 až 12 umožňující zaklonování do expresního vektoru; (3) konzervativní Kozákovu sekvenci od pozice 13 až 18; (4) signální sekvenci obsahující kodon pro iniciační methionin (tučně v SEK. ID. Č: 47) a dalších 31 bází specificky překrývajících sekvenci na 5' konci klonu A1160, aby bylo umožněno přisednutí primerů. K amplifikaci inzertu z klonu A1160 byl spolu s primerem 5-PCR leader použit druhý primer nazvaný 3'-end frag (SEK. ID. Č: 48).

5'-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3 (SEK. ID. Č: 47)

5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3 (SEK. ID. Č: 48)

Vzniklý PCR produkt nebyl štěpen restrikčním enzymem BamHI nejspíše proto, že před restrikčním místem byl nedostatečný počet bází, což znemožnilo rozpoznání místa enzymem. U 5-primerů byla prodloužena délka sekvence předcházející místo pro BamHI (SEK. ID. Č: 47) a s amplifikovaným produktem první reakce byla opakována PCR reakce. 5-primer označený mAD.5.2 (SEK. ID. Č: 49) byl vytvořen přidáním nespecifických bází na pozici 1 až 4 a dalších 20 bází spe116 cificky překrývajících dříve použitý 5'-PCR leader primer .

5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3' (SEK. ID. Č: 49)

Primery mAD.5^z.2 a 3'-end frag byly společně použity v PCR reakci, kde byl templátem produkt z první amplifikační reakce. Vzniklý druhý PCR produkt byl zaklonován do plazmidu pCRtmII (Invitrogen), podle návodu doporučeného výrobcem, a vzniklým plazmidem byly transformovány kompetentní buňky One shot (Invitrogen). Analýzou restrikčními emzymy BamHI a EcoRI byl identifikován jeden klon, který obsahoval PCR produkt, a tento klon byl sekvenován. Po ověření sekvence byl inzert vyštěpen restrikčními enzymy BamHI a EcoRI a izolován z gelu.

Inzert z klonu B3800 byl získán restrikčním štěpením enzymy EcoRI a Notl a následnou izolací z gelu. Tento inzert byl, spolu s fragmentem A1160 rozštěpeným restrikčními enzymy BamHI/EcoRI, přidán do ligační reakce, která probíhala 14 hodin při teplotě 14°C. K ligační reakci byl přidán vektor pcDNA.3 (Invitrogen), štěpený enzymy BamHI a Notl, a reakce pokračovala dalších 12 hodin. Z reakční směsi byl odebrán alikvot, kterým byly transformovány kompetentní buňky E. coli. Vzniklé kolonie byly namnoženy a s využitím primerů ll.b-l/2FORl a 11.b-l/2REVll (SEK. ID. Č: 50 resp. 51) byl analýzou PCR identifikován jeden pozitivní klon. Primery ll.b-l/2FORl a 11.b-l/2REVll přemosťují fragmenty A1160 a B3800, a tudíž slouží k detekci úspěšné ligace obou fragmentů (vznik PCR produktu). Sekvence pozitivního klonu byla ověřena pomocí primerů (zobrazené v SEK. ID. Č: 50 a 51), které amplifikují od báze 100 do 1405 za kodonem pro startovní methionin.

117 • · ·· · · · · · • · · · · fl· ···· « • fl ···· ··· fl · · · « · · fl* fl ♦

Příklad 23

Konstrukce knockoutovaných myší

Aby bylo možno přesněji určit imunologickou roli proteinu kódovaného předpokládanou myší cDNA a_d, byla vytvořena knockoutovaná myš, v jejíž organizmu je sekvence genomové DNA kódující homolog a_d přerušena pomocí homologní rekombinace. Na význam proteinu kódovaného porušeným genem je usuzováno z jeho nepřítomnosti. Produkce knockoutovaných myší je popsána v publikaci Deng a další, Mol. Cell. Biol. 13:2134 až 2140 (1993).

Prvním krokem při produkci takových myší je konstrukce plazmidu, který v sobě obsahuje sekvence, které budou vyřazeny (knockoutovány) homologní rekombinací. K identifikaci myší genomové sekvence kódující předpokládaný myší homolog a_d z genomové knihovny λΠΧΙΙ byl použit fragment myší cDNA o velikosti 750 bází (odpovídající nukleotidům 1985 až 2733 v SEK. ID. Č: 45). Výsledkem prvního testování bylo 14 pozitivních plaků, z nichž sedm bylo potvrzeno druhým testováním. Ze dvou plaků byly získány lyzáty dávajících nejsilnější signál a λ DNA byla izolována pomocí konvenčních metod. Restrikční mapování a Southernova analýza potvrdila hodnověrnost jednoho z klonů (označený 14-1). Inzert DNA byl restrikčně štěpen enzymem Notl a zaklonován do vektoru Bluescript SKII⁺.

K identifikaci restrikčního fragmentu o velikosti přibližně o velikosti 9 až 14 kb, což je délka udávaná jako optimální pro uskutečnění homologní rekombinace, byla s cDNA sondou o velikosti 750 bp provedena Southernova hybridizace. Před hybridizaci byla pro klon 14-1 vytvořena restrikční mapa. Jako možný kandidát byl identifikován fragment o velikosti 12 kb, který byl zaklonován do vektoru pBluescript SKII⁺ do pozice, kde je myší DNA ohraničena kazetami kódujícími thymidin kinázu. Další analýza tohoto

118 • ·

klonu pomocí sondy domény I (odpovídající nukleotidům 454 až 1064 v SEK. ID. Č: 45) prokázala, že tento klon neobsahuje sekvenci kódující doménu I.

Genomová knihovna lambdaFIXII byla znovu testována použitím stejné sondy domény I. Ze šesti pozitivních klonů zůstal jeden pozitivní i po druhém testování. DNA izolovaná z tohoto klonu silně reagovala při Southernově analýze se sondou domény I. Při použití původní sondy o velikosti 750 bp nebyla detekována žádná odezva, avšak bylo zjištěno, že tento klon zahrnuje nukleotidy 1985 až 2773 v 5' oblasti ze SEK. ID. Č: 45.

Neexistence hybridizace se sondou o velikosti 750 bp může také naznačovat, že tento klon je dalším členem z rodiny integrinových proteinů. Z důvodu ověření věrohodnosti tohoto vysvětlení byl inzert o velikosti 13 kb zaklonován do vektoru pBluescript SKII⁺. Při použití primerů odpovídajících nukleotidovým sekvencím 441 až 461, 591 až 612, 717 až 739 a nukleotidové sekvenci 898 až 918 v reverzní orientaci v doméně I a_d (SEK. ID. Č: 52) byla zjištěna sekvence purifikované DNA. Sekvence DNA byla získána jen při použití prvního primerů (441 až 461), a účinně amplifikován byl byl pouze exon nacházející se nejblíže 5' konci sekvence domény I. Amplifikace zbytku domény I neproběhla. Výsledný klon tedy obsahuje exon šest genu myšího a_d a sekvence intronů přilehlých ke 3' a 5' konci tohoto exonu. Exon 7 nebyl v tomto klonu přítomen. Po sekvenování byl vytvořen konstrukt obsahující gen pro rezistenci na neomycin a gen pro thymidin kinázu.

Gen pro rezistenci na neomycin (neo^r) byl vnesen do plazmidu způsobem, který přerušil sekvenci genomové myší DNA kódující protein. Vzniklý plazmid tedy obsahuje gen neo^r uvnitř sekvencí myší genomové DNA, a to vše je uvnitř oblasti kódující thymidin kinázu. Takto zkonstruovaný plazmid je vyžadován proto, aby byla upřednostněna homologní

119 • ·

rekombinace před náhodnou rekombinací [Chisaka a další, Nátuře 355:516 až 520 (1992)].

Příklad 24

Klonování králičí a_d - Vytvoření a testování králičí cDNA knihovny

Nalezení lidských homolog a_d v organizmu potkanů a myší vedlo k výzkumům existence králičího homologu, který by mohl být užitečný v králičích modelech lidských nemocí popsaných níže.

Pomocí kitu FastTrack firmy Invitrogen (San Diego, CA), podle návodu uvedeného výrobcem, a reakčňích činidel dodaných v kitu byla z celé králičí sleziny připravena poly-A⁺RNA. Z 1,65 g tkáně bylo izolováno 73 pg poly-A⁺ RNA. Tato RNA z králičí sleziny byla použita ke konstrukci cDNA knihovny ZAP Express s využitím kitu od firmy Stratagene (La Jolla, CA). Získaná cDNA byla směrově zaklonována do restrikčních míst EcoRI a Xhol v lambda ramenech fágmidového vektoru pBK-CMV. K zabalení lambda ramen do fágových částic byl použit kit Gigapack II Gold (Stratagene). Titr vzniklé knihovny byl odhadnut na přibližně 8 x 10⁵ částic, s inzertem o průměrné velikosti 1,2 kb.

Knihovna byla jedenkrát amplifikována tak, aby narostlé plaky byly konfluentní a buněčný lyzát byl sebrán. Namnožená knihovna transformovaná do E. coli byla vyseta v koncentraci 30000 pfu/miska (průměr 150 mm) a vzniklá směs byla inkubována 12 až 16 hodin při teplotě 37°C, aby došlo k vytvoření plaků. Fágové DNA byly přeneseny na nylonové membrány Hybond N⁺ (Amersham, Arlington Heights, Illinois). Membrány byly hybridizovány se směsí dvou radioaktivně značených sond myší a_d PCR DNA připravených pomocí primerů o náhodné sekvenci. První sonda byla získána z PCR produktu,

120 • · · · fefefefe • fe ί» · · · · · · · · · • · · · · · ··· «···· fefe ·· «· fefe který zahrnuje nukleotidy 149 až 946 v SEK. ID. Č: 52. Druhá sonda byla získána z PCR produktu, který zahrnuje nukleotidy 2752 až 3651 v SEK. ID. Č: 52. Sondy byly za použití kitu „Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označeny, a reakční směs byla nanesena na kolonu Sephadex G-50, aby byly odstraněny nezainkorporované nukleotidy. Hybridizační roztok se skládal z 5X SSPE, 5X Denhardtsova činidla, 1%

SDS, 40% formamidu a ze značených sond v koncentraci 1 x 10⁶ dpm/ml. Hybridizace probíhala po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 42°C. Membrány byly intenzívně promyty v 2X SSPE/0,1% SDS při pokojové teplotě a exponovány na rentgenový film, aby došlo k vizualizaci všech hybridizovaných plaků.

Byly identifikovány dva klony, které vykázaly vysoký stupeň sekvenční homologie se sekvencí lidské a_d. Klon #2 byl přibližně 800 bp dlouhý a mapoval 5' konec lidské a_d.

Klon #2 obsahuje kodon pro startovní methionin a kompletní vedoucí sekvenci. Klon #7 byl přibližně 1,5 kb dlouhý a zahrnuje kodon pro startovní methionin. 5' konec klonu #7 překrýval klon #2, zatímco sekvence na 3' koncích končily v místech za sekvencemi domény I.Klon #7 byl kompletně osekvenován pomocí sekvenační metody primer-walking. Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence klonu #7 jsou zobrazeny v SEK. ID. Č: 100 resp. 101.

Předpovězená N-koncová aminokyselinová sekvence pro králičí cc_d, jak byla určena z klonů #2 a #7, naznačila, že tento protein je ze 73% identický s lidským a_d, ze 65% identický s myší a_d a z 58% identický s myší CDllb, lidským CDllb a lidským CDllc. Nukleotidová sekvence klonu #2 je zobrazena v SEK. ID. Č: 92; předpovězená aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 93.

121

S využitím radioaktivně značeného králičího klonu #7 a opětného testování cDNA knihovny, ze které tento fragment pocházel, byl proveden pokus o získání nezkrácené cDNA kódující králičí a_d. Bylo identifikováno dalších 25 klonů a nejdelší byl klon označený jako #49. S využitím techniky síťových delecí byla zjištěna kompletní sekvence klonu #49. Nukleotidové a aminokyselinová sekvence klonu #49 jsou zobrazeny v SEK. ID. Č: 102 resp. 103. Jelikož se klony #7 a #49 nepřekrývají, byly navrženy oligonukleotidy, které by mohly být použity jako primery při PCR s prvním řetězcem králičí slezinné cDNA; cílem tohoto postupu je izolace chybějící sekvence.

Vztah mezi předpokládanými aminokyselinovými sekvencemi těchto dvou neúplných klonů a ostatních leukointegrinů je popsán v Tabulce 1.

Tabulka 1.

Procento shody v aminokyselinové sekvenci u členů rodiny integrinů β₂

	Lidská a_d	Králičí #7	Králičí #49
Lidská a_d	100	74	80
Myší a_d	70	67	74
Potkaní ot_d	70	66	73
Myší CDlla	náhodná*	28	28
Myší CDllb	55	59	53
Lidská CDlla	36	28	28
Lidská CDllb	60	58	55
Lidská CDllc	66	59	62

* je-li shoda < 25%, považuje se tato shoda za náhodnou

122 ···· · · · · · · «· kft «· ·· ·0

Izolace klonu králičí a_d umožňuje expresi proteinu, a to buď na povrchu transfekovaných buněk nebo ve formě rozpustného nezkráceného nebo zkráceného proteinu. Získaný protein je následně použit jako immunogen pro produkci monoklonálních protilátek, které najdou uplatnění v králičích modelech lidských chorob.

Příklad 25

Živočišné modely pro určení terapeutické využitelnosti a_d

Imunohistologická data získaná u psů a in šitu hybridizace u potkanů a myší určila, že a_d je exprimován hlavně makrofágy přítomnými v červené pulpě sleziny. V mízních uzlinách byl a_d nalezen v kapilárách a dutinách ve dřeni. Distribuce polypeptidu a_d je značně podobná distribuci, která byla získána pro dva myší antigeny rozpoznávané monoklonálními protilátkami F4/80 a SK39. Zatímco biochemická charakterizace těchto myších antigenu ukázala jejich odlišnost od oc_d, je velmi pravděpodobné, že a_d určuje stejnou subpopulací makrofágů jako myší antigeny F4/80 a SK39.

U myší byl zjištěn výskyt SK39⁺ makrofágů v červené pulpě sleziny, kde se nejspíše účastní odstraňování cizorodého materiálu z oběhu, a v dřeni mízních uzlin [Jutila a další, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993)]. SK39⁺ makrofágy byly pozorovány také v místech akutního a chronického zánětu. Navíc monocyty infiltrované v dutinách peritonea, ve kterých byl zánět vyvolán působením thioglykolátu, také exprimují antigen SK39. Souhrnem tyto výsledky naznačují, že jestliže jsou SK39⁺ buňky také a_d pozitivní, pak jsou tyto buňky odpovědné za odstranění cizorodého materiálu ve

123 • · · · • · · · • » « · * · · · · a··· « * · ♦ » · · ···· · • « ···· ··· «·««« · · · · « » · · slezině a účastní se při zánětech, kde hrají makrofágy důležitou roli.

Zatímco funkce a_d zůstává neznámá, jiné mnohem lépe charakterizované integriny β₂ se účastní celé řady adhezních dějů, které usnadňují migraci buněk, posilují fagocytózu a podporují mezibuněčné interakce. Všechny tyto události vedou k urychlení zánětlivých dějů. Proto je velmi pravděpodobné, že ovlivnění normální funkce a_d může současně narušit průběh zánětu, kde hrají makrofágy důležitou roli. Takový protizánětlivý účinek by mohl být výsledkem: a) zamezení infiltrace makrofágů do míst zánětů; b) zamezení aktivace makrofágů v místě zánětu nebo c) rušení účinku efektorových funkcí makrofágů, které poškozují zdravou hostitelskou tkáň buď specifickou autoimunitní reakcí nebo následkem poškozování okolních buněk.

Mezi nemoce, u kterých existují důkazy o tom, že zde makrofágy hrají důležitou roli, patří roztroušená skleróza, artritida, arterioskleróza štěpu, některé formy diabetů a zánětlivé střevní onemocnění. U živočišných modelů, diskutovaných níže, bylo prokázáno, že tyto modely reprodukují mnoho rysů zmíněných lidských poruch. Aby bylo možno určit, zda-li existuje možnost léčby odpovídajících nemocí u lidí, byly na těchto modelových systémech testovány inhibitory funkce a_d.

A. Arterioskleróza štěpu

Transplantace srdce je nyní, u některých typů srdečních chorob v konečném stádiu, přijímanou formou lékařského zákroku. Používání cyklosporinu A zvýšilo počet přeživších první rok po transplantaci na 80%, avšak rozvoj progresivní formy arteriosklerózy štěpu se projevil jako nejčastější příčina smrti u osob po prvním roce po transplantaci srdce. Nedávné studie prokázaly u 36 až 44% případů výskyt arteri124 • · • · · · • · • *

osklerózy štěpu v období tří let po transplantaci srdce [Adams a další, Transplantation 53:1115 až 1119 (1992); Adams a další, Transplantation 56:794 až 799 (1993)].

U arteriosklerózy štěpu se typicky vyskytují difúzní, okluzní a intimální léze, které postihují celou stěnu věnčitých cév. V těchto lézích dochází často k ukládání lipidů. Patogeneze arteriosklerózy štěpu zůstává neznámá, avšak pravděpodobně je spojená s histokompatibilitní odlišností mezi dárcem a příjemcem, a je ve své podstatě vyvolaná činností imunitního systému. Z histologického hlediska jsou oblasti, ve kterých dochází ke ztlušťování vnitřní cévní stěny, tvořeny především makrofágy, i když je zde občas pozorována i přítomnost T-buněk. Je proto možné, že makrofágy exprimující a_d, hrají při indukci a/nebo rozvoji arteriosklerózy štěpu důležitou roli. V takových případech by osobám s transplantovaným srdcem, u nichž existuje riziko rozvinutí arteriosklerózy štěpu, mohly být preventivně podávány monoklonální protilátky nebo nízkomolekulární inhibitory funkce a_d (například rozpustný ICAM-R).

Ačkoliv arterioskleróza štěpu představuje největší ohrožení života pro pacienty s transplantovaným srdcem, byl výskyt arteriosklerózy štěpu pozorován rovněž u pacientů s jinými transplantovanými orgány včetně jater a ledvin. Terapeutické použití látek blokujících funkci a_d by mohlo zabránit vzniku arteriosklerózy štěpu u osob s jinými transplantovanými orgány a snížit komplikace vyplývající ze selhání transplantovaného orgánu.

Jeden model pro arteriosklerózu štěpu u potkanů zahrnuje heterotypické srdeční alloštěpy transplantované přes menší histokompatibilní bariéry. Když jsou srdeční alloštěpy z potkanů Lewis transplantovány do organizmu příjemců F344, vyznačujících se vzhledem k dárcům kompatibilitou MHC glykoproteinů I. a II. třídy, 80% alloštěpů přežívá alespoň

125 • · • · · · ·

• · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · «· · · · · · • · · · · · · · · • · « » · ·· · · · · 4 * týdny a 25% alloštěpů přežívá neomezeně dlouhou dobu. Při tomto velmi nízkém počtu odmítnutých štěpů se v srdci dárce vytvářejí arteriosklerotické léze. Arteriální léze v alloštěpech starých 120 dní obvykle vykazují typické difúzní fibrotické ztluštění vnitřní stěny cévy, které je na pohled nerozlišitelné od lézí v arteriosklerotických štěpech pozorovaných u odmítnutých lidských srdečních alloštěpů.

Potkanům jsou transplantovány srdce, která se v méně důležitých histokompatibilních antigenech liší od genotypu příjemce. Takovým příkladem jsou transplantace z potkanů Lewis do potkanů F-344. Příjemcům transplantátů jsou pravidelně podávány monoklonální protilátky specifické proti potkanímu a_d nebo nízkomolekulární inhibitory oc_d. Očekává se, že tato léčba sníží incidenci arteriosklerózy štěpu v neodvržených srdcích dárců. Léčba potkanů pomocí monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulárních inhibitorů nemusí být omezena pouze na prevenci. Očekává se rovněž, že zablokování funkce a_d povede ke zmírnění zánětu zprostředkovaného makrofágy a umožní zvrat požkození artérií v transplantátu.

B. Arterioskleróza u králíků krmených cholesterolem

U králíků, kteří byli, po dobu přibližně 12 až 16 týdnů, krmeni aterogenní dietou s přídavkem cholesterolu, došlo ke vzniku lézí na vnitřní straně cév, a tyto léze pokrývaly většinu lumenálního povrchu vzestupného úseku aorty [Rosenfeld a další, Arteriosclerosis 7:9 až 23 (1987); Rosenfeld a další, Arteriosclerosis 7:24 až 34 (1987)]. Aterosklerotické léze pozorované u těchto králíků jsou mírnější než tytéž u lidí. V těchto lézích je přítomen velký počet T-buněk, z nichž většina exprimuje CD45RO, který je markérem paměťových T-lymfocytů. Přibližně polovina z infiltrovaných T-buněk exprimuje antigen MHC II. třídy a ně126 • · · · • * · · · · · ·· * · » · · « · · · · 4 ·

44 4 4 44 4 4 4 4 44 které exprimují receptor pro IL-2, což naznačuje, že mnohé z těchto buněk se nacházejí v aktivovaném stavu.

Jedním z rysů aterosklerotických lézí pozorovaných u králíků krmených cholesterolem, který se ale zřejmě nevyskytuje u hlodavčích modelů, je akumulace lézí bohatých na přítomnost pěnových buněk. Předpokládá se, že vznik pěnových buněk (makrofágy) je důsledkem příjmu oxidovaných lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) prostřednictvím specifických receptorů. Bylo zjištěno, že oxidované částice LDL jsou toxické pro některé typy buněk včetně endotheliálních buněk a buněk hladké svaloviny. Příjem těchto potenciálně toxických oxidovaných částic LDL makrofágy slouží jako iritant a pomáhá aktivovat makrofágy, což přispívá k vytvoření zánětů doprovázejících výskyt aterosklerotických lézí.

Jakmile byly připraveny monoklonální protilátky proti králičí oc_d, začala léčba králíků krmených cholesterolem. Léčba zahrnovala podávání monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulárních inhibitorů, aby bylo prokázáno, že a_d ⁺makrofágy se účastní těchto procesů během onemocnění. Dodatečné studie by ukázaly, že monoklonální protilátky proti a_d nebo nízkomolekulární inhibitory mohou zvrátit cévní poškození detekované u králíků během aterogenní diety.

C. Inzulin-dependetní diabetes

U potkanů BB se inzulin-dependetní diabetes samovolně vyvinul v období mezi 70. až 150. dnem života. Pomocí imunohistochemických analýz byla již v ranném stádiu nemoci pozorována v Langerhansových ostrůvcích přítomnost infiltrovaných MHC II⁺ a ED1⁺ makrofágů. Mnoho makrofágů se zdá být zaměstnáno fagocytózou buněčných trosek nebo normálních buněk. S postupem nemoci je pozorován stále se zvětšující počet makrofágů infiltrujících Langerhansovy ostrůvky, a rovněž se zdá, že se do tohoto místa soustředí velké množ127 • · · • 0 0· ství T-buněk a později také B-buněk [Hanenberg a další, Diabetologia 32:126 až 134 (1989)].

Rozvoj cukrovky u potkanů BB se zdá být závislý, jak na časné infiltraci makrofágů, tak na následném soustřeďování T-buněk. Léčba potkanů BB pomocí částic oxidu křemičitého, které jsou pro makrofágy toxické, byla účinná tím, že zabránila infiltraci makrofágů do Langerhansových ostrůvků v časném stádiu nemoci. Bez časné infiltrace makrofágů nenastává následné poškození tkáně autoagresivní populací lymfocytů. Podávání monoklonální protilátky OX-19 (specifické proti potkanímu CD5) nebo monoklonální protilátky OX-8 (specifické proti potkanímu CD8), které blokují fázi nemoce spojenou s T-buňkami, je rovněž účinné při potlačení rozvoje diabetů.

Centrální role kterou mají makrofágy v patologii tohoto modelu, činí tento model atraktivní pro testování inhibitorů funkce a_d. Potkani geneticky predisponovaní k rozvinutí inzulin-dependetního diabetů jsou léčeni monoklonálními protilátkami proti a_d nebo nízkomolekulárními inhibitory, a je u nich vyhodnocován vývoj onemocnění. Zabránění nebo oddálení nástupu nemoci je důkazem, že a_d hraje klíčovou roli v poškození buněk ostrůvků způsobeném makrofágy.

D. Zánětlivé střevní onemocnění (Crohnova choroba, vředovitá kolitida)

Živočišné modely, použité při studiu zánětlivého střevního onemocnění (IBD - inflammatory bowel disease), jsou zpravidla vystaveny intrarektálnímu podávání škodlivých dráždidel (například kyselina octová nebo kyselina trinitrobenzensulfonová/ethanol). Zánět tračníku vyvolaný těmito látkami je výsledkem chemického nebo metabolického poškození a postrádá chronický a spontánně recidivní charakter, doprovázející lidské zánětlivé střevní onemocnění. Nicméně se zdá, že nedávno popsaný model využívající subserózní in128 • · · · jekce purifikovaného polymeru peptidoglykan-polysacharid (PG-PS) získaného ze streptokoků skupiny A nebo skupiny D, poskytuje lepší, fyziologicky relevantní model pro lidské IBD [Yamada a další, Gastroenterology 104:759 až 771 (1993)].

V tomto modelu je PG-PS aplikován do subserózní vrstvy distálního tračníku. Vyvolaná zánětlivá odezva má dvě fáze, první akutní fázi tři dny po injekci, která je následována spontánní chronickou fází o tři až čtyři týdny později. Odezva pozdní fáze je ve své podstatě granulomatózní a vede ke ztluštění tračníku, adhezím, ke vzniku uzlíků a mukózních lézí. Kromě poškození sliznice vede kolitida (vyvolaná PG-PS) často k artritidě, anémii a granulomatózní hepatitidě. Extraintestinální projevy nemoci činí model atraktivní pro studium Crohnovy kolitidy, proto, že velké množství pacientů s rozvinutou Crohnovou chorobou trpící záněty kloubů a hepatobiliárními záněty.

Vznik granulomatózních lézí je důsledkem chronického zánětu, který vede k infiltraci a následné aktivaci buněk z linie monocyty/makrofágy. Výskyt granulomatózních lézí u Crohnovy choroby a u výše zmíněného živočišného modelu, činí z tohoto modelu atraktivní klinický cíl pro monoklonálni protilátky namířené proti a_d a pro jiné inhibitory funkce a_d. U inhibitorů funkce a_d se očekává zamezení tvorby lézí doprovázejících IBD či dokonce zvrat v tkáňových poškozeních vyskytujících se u této nemoci.

E. Artritida

Zdá se, že artritida je multifaktoriální onemocnění, kterého se účastní různé typy buněk zánětu, včetně neutrofilů, T-lymfocytů a fagocytárních makrofágů. Ačkoli existuje celá řada modelů artritidy, aplikace proteoglykanu zís129 • · • · kaného z buněčné stěny streptokoků způsobuje poruchu nejvíce podobnou lidskému onemocnění.

V organizmu potkanů vyvolává buněčná stěna streptokoků zánět periferních kloubů, který je charakterizován opakovanými záchvaty postupujícího onemocnění následovanými remisemi a nakonec, během několika měsíců, končí destrukcí kloubu [Cromartie a další, J. Exp. Med. 146:1585 až 1602 (1977); Schwab a další, Infection and Immunity 59:4436 až 4442 (1991)]. Předpokládá se, že největší roli v destrukci synovie hrají během chronické fáze onemocnění mononukleární fagocyty a makrofágy. Mimoto látky potlačující infiltraci makrofágů do synovie účinně snižují zánětlivé a patologické charakteristiky artritidy.

Centrální role makrofágů při destrukci synovie vedoucí k artritidě naznačuje, že monoklonální protilátky proti a_da inhibitory funkce a_d mohou být při léčbě tohoto onemocnění terapeuticky účinné. Stejně jako u výše popsaných modelů se předpokládá, že tyto monoklonální protilátky a nízkomolekulární inhibitory podávané preventivně zablokují nebo zmírní kloubní zánět a zabrání zničení synovie. Látky mající rušivý vliv na funkci a_d mohou rovněž zmírnit probíhající zánět tím, že zabrání infiltraci dalších makrofágů ke kloubu a zablokují aktivaci makrofágů. Výsledným efektem by byl zvrat postupující destrukce kloubu a usnadnění uzdravení tkáně.

F. Roztroušená skleróza

Ačkoli patogeneze roztroušené sklerózy (MS) zůstává nejasná, je všeobecně přijímáno, že onemocnění je zprostředkováno CD4⁺ T-buňkami, které rozpoznávají autoantigeny přítomné v centrálním nervovém systému a zahajují tak zánětlivou kaskádu. Vzniklá imunitní odezva má za následek infiltraci dalších buněk zánětu, včetně aktivovaných makrofágů,

130 ·· ···· ·· ···· ·· ·· ·· « · · · · · · · • · ··· *··« • · ·· · · · · · · · · • · · · · · ··· ····· ·· · · ·· ·· které přispívají k rozvoji onemocnění. Živočišný model experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) reprodukuje některé aspekty onemocnění MS. Nedávno bylo prokázáno, že monoklonální protilátky reagující s CDllb/CDl8 přítomnými na makrofázích způsobujících zánět [Huitinga a další, Eur. J. Immunol. 23:709 až 715 (1993)] blokují jak klinické, tak histologické příznaky onemocnění. Výsledky napovídají, že monoklonální protilátky nebo nízkomolekulární inhibitory polypeptidu oc_d jsou pravděpodobně u onemocnění EAE účinné v blokování zánětlivé reakce. Tyto látky mají tedy důležité terapeutické uplatnění při léčbě MS.

G. Alveolitida vyvolaná imunitním komplexem (Immune Complex Alveolitis)

Alveolární makrofágy lokalizované v alveolárních sklípcích, kanálcích, pojivové tkáni a pohrudničních dutinách plic, představují první obrannou linii plic proti látkám vdechovaným z okolního prostředí. Jako odezvu na stimulaci látkami (bakteriální lipopolysacharid, interferon IFN-γ a imunitní komplex) produkují alveolární makrofágy celou řadu silných mediátorů zánětu, včetně velmi reaktivních kyslíkových radikálů a dusíkatých meziproduktů. Zatímco hyperoxidové anionty, peroxidy vodíku a oxidy dusíku (NO·) mají důležitou funkci při ničení patogenů a lýzi nádorů, mohou tyto látky ve zdravých tkáních způsobit jejich poškození.

U potkaního modelu alveolitidy vyvolané imunitním komplexem bylo prokázáno, že produkce NO· alveolárními makrofágy způsobuje mnoho z poškození plic [Mulligan a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88:638 až 6342 (1991)]. Radikály NO· vykonávají funkci mediátorů i u jiných poškození spojených s imunitním komplexem, včetně dermální vaskulitidy [Mulligan a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88:638

131

až 6342 (1991)], a mohly by potenciálně hrát roli u nemocí jako je například glomerulonefritida.

Poškození způsobená NO· nejsou omezena jen na záněty s účastí imunitního komplexu. Například mikrogliální buňky stimulované látkami jako je PMA, LPS nebo IFN-γ, produkují NO· v množství schopném usmrtit oligodendrocyty [Merrill a další, Immunol.151:2132 (1993)]. Bylo zjištěno, že pankreatické ostrůvky jsou citlivé k radikálům NO· a uvolňování tohoto mediátoru makrofágy způsobilo poškozování tkání, které vedlo k diabetů [Kroncke a další, BBRC 175:752 až 758 (1991)]. Nedávno bylo přesvědčivě dokázáno, že produkce NO· hraje roli u endotoxického šoku [MacMicking a další, Cell 81:641 až 650 (1995)]. Když byl aplikován lipopolysacharid (LPS) zdravým myším divokého typu, byl pozorován vážný progresivní pokles tepenného tlaku končící smrtí. U myší, u nichž nelze indukovat tvorbu NO·, byl, v reakci na přítomnost LPS, pozorován mnohem menší pokles tepenného tlaku a všechny myši tento experiment přežily.

Pokusy prováděné in vitro prokázaly, že zablokování oc_dje účinné při potlačení některých aspektů aktivace makrofágů (nebo obecně leukocytů exprimujících a_d) , včetně uvolňování NO·. Alveolární makrofágy stimulované za přítomnosti polyklonálního séra proti a_d (proti potkaní doméně I polypeptidu a_d, připravené v králících) produkovaly podstatně méně dusitan/dusičnanových produktů při odbourávání NO·, než makrofágy vystavené působení kontrolního séra. Tato zjištění dokazují, že monoklonální protilátky namířené proti a_d, konkrétně proti I-doméně, mohou být účinnými protizánětlivými činidly s možným využitím u MS, diabetů, zánětu plic a endotoxického šoku. Navíc, v protikladu k CD18 podjednotce, která ovlivňuje funkci celé řady typů leukocytů, omezená distribuce a_d činí z této podjednotky mnohem atrak132 ··· · •fl ···· ·· » · · · · · ···· • · fl · fl flfl ·· ·· flfl tivnější cíl (než je tomu u CD18) pro blokování aktivace makrofágů (nebo obecně leukocytů exprimujících a_d) .

Alveolitida vyvolaná potkaním IgG imunitním komplexem je obecně používaný experimentální model důležitý pro porozumění akutnímu poranění plic. Toto poranění je vyvoláno nakapáním protilátek namířených proti hovězímu sérovému albuminu (BSA) do plic pomocí tracheální kanyly, následovaným intravenozní injekcí BSA. Zformování imunitních komplexů v plicních kapilárách vede k aktivaci komplementu a infiltraci neutrofilů do plic. Podle všeho, po zformování imunitních komplexů v plicích, dojde k extravazaci leukocytů z krve a následnému pohybu leukocytů přes plicním epitel. Následné uvolnění mediátorů včetně radikálů, TNF-α a NO· z aktivovaných endoteliálních buněk, neutrofilů a makrofágů, přispívá k postupu onemocnění. Patologické rysy onemocnění zahrnují zvětšení vaskulární permeability vedoucí k otokům a přítomnosti velkého počtu erytrocytů a polymorfonukleárních buněk v alveolárních dutinách.

Polyklonální sérum specifické proti doméně I polypeptidu a_d bylo testováno na potkaním modelu alveolitidy vyvolané imunitním komplexem. Toto polyklonální sérum bylo aplikováno do plic tracheální kanylou spolu s protilátkami proti BSA. Poranění plic bylo následně vyvoláno intravenozní aplikací BSA se stopovým množstvím BSA značeného izotopem ¹²⁵I (přibližně 800000 cpm) , aby mohl být kvantifikován otok vzniklý poraněním plic. Plicní poranění probíhalo další 4 hodiny a velikost poranění byla vyhodnocena z hodnoty plicní permeability, která je definována jako poměr BSA značeného izotopem ¹²⁵I v plicích ku jeho množství přítomném v krvi. Typické hodnoty plicní permeability pro pozitivní kontrolu leží mezi 0,6 až 0,8, zatímco negativní kontroly (potkany, které nedostaly BSA) mají hodnoty plicní permeability v rozsahu 0,1 až 0,2.

133 ·· ··*· ·· ·· • · · · · · ·· ··

První studie dokázaly, že při léčbě pomocí polyklonálního séra proti oc_d se snižuje permeabilita plic o více než 50%, což představuje dramatické zmírnění plicního poranění. Z historie je známé snížení permeability plic o 60%, kterého bylo dosaženo podáváním protilátek proti CD18. Tato zjištění dokazují, že a_d může být nejdůležitšjší integrin β₂ během akutního poranění plic, ačkoli nemůže být přesně určeno, jestli účinek protilátek zabraňuje extravazaci leukocytů z krve nebo pohybu leukocytů přes plicním epitel.

Dalším důkazem skutečnosti, že polypeptid a_d zmírňuje průběh poranění plic, bylo stanovení hladiny TNF-α v kapalině získané výplachem jejich bronchoalveolární části. Při podáváním protilátek proti a_d byl zjištěn čtyřnásobný pokles hladiny TNF-α. TNF-alfa byl již dlouho považován za důležitý mediátor u akutního zánětu plic a látku odpovědnou za infiltraci buněk zánětu do míst zánětu, aktivaci buněk a poškození tkání. Sérum namířené proti a_d pravděpodobně blokuje aktivaci rezidentních alveolárních makrofágů během vzniku alveolitidy vyvolané imunitním komplexem, a tím zmírňuje uvolňování TNF-alfa a NO· a snižuje následné poškození tkání způsobené těmito látkami a infiltrací neutrofilů.

Příklad 26

Exprese a_d v preklinických modelech

Aby mohla být stanovena rozdílná exprese a_d v různých stádiích onemocnění, byly řezy tkání z živočišných modelů onemocnění značeny polyklonálním sérem proti a_d získaným, postupem popsaným výše (viz Příklad 18). Tkáně ze zdravých a nemocných potkanů byly rozřezány na tloušťku 6 pm a vysušeny na vzduchu na podložních sklíčkách Superfrost Plus

134 ·· ·«·· • · · · ·· · · · « · · · » » · ··· « · · · • · ·· · · · · · · · · • · · · · · ··· ····· · · ·· ·· · · (VWR Scientific) přes noc při pokojové teplotě. Po vysušení byly řezy až do použití skladovány při teplotě -70°C. Před použitím byla sklíčka přeložena z -70°C na přibližně 5 minut do 50°C. Řezy byly po dobu 10 minut při pokojové teplotě fixovány studeným acetonem (4°C) (Stephens Scientific) a ponechány schnout při pokojové teplotě. Každý řez byl, po dobu 30 minut při pokojové teplotě, blokován 150 μΐ roztoku o složení 30% normální potkaní sérum (Harlan Bioproducts), 5% normální kozí sérum (Vector Laboratories) a 1% hovězí sérum (BSA) (Sigma Chemical Company) v IX TBS, a následně byl roztok z řezů jemně odsát. Králičí polyklonální sérum (koncentrace proteinu 34 pg/ml) a sérum ze stejného králíka (získané před imunizací) (koncentrace proteinu 38,5 pg/ml) bylo zředěno v blokovacím roztoku. Ke každému řezu bylo poté, na dobu 30 minut při teplotě 37°C, přidáno 100 μΐ jednotlivého séra. Roztok protilátek byl poté odsán a nenavázané protilátky odstraněny trojnásobným promytím v IX TBS vždy po dobu 5 minut. Po posledním promytí byl nadbytek TBS odstraněn odsátím. Biotinylovaná kozí protilátka namířená proti králičím Ig byla připravena s využitím kitu Elitě Rabbit IgG Vectastain ABC (Vector), podle návodu doporučeného výrobcem, a 100 μΐ výsledného roztoku bylo naneseno na každý řez na 15 minut při teplotě 37°C. Sklíčka byla dvakrát promývána v IX TBS, vždy po dobu 5 minut. Potom bylo na tkáňové řezy naneseno 100 μΐ konjugátu streptavidinzlato (Goldmark Biologicals) ředěného v poměru 1:100 v 5% normálním potkaním séru a 1% BSA, a tento roztok byl ponechán působit 1 hodinu při pokojové teplotě. Sklíčka byla třikrát promývána pufrem TBS, vždy po dobu 5 minut, a následně na ně bylo, na 5 minut při pokojové teplotě, naneseno 100 μΐ 1% glutaraldehydu (Sigma) v TBS pufru. Sklíčka byla opět třikrát promývána v TBS, vždy po dobu 5 minut, a pětkrát ve sterilní deionizované vodě, vždy po dobu 3 minut. Přebytek kapalin byl odsát a na každý řez byly nanese135 • a ···· aa · ·« « ·· ·· • · a a · a a a a a • · » a · a a aa • a a a a aa ·· · a a • a » · · · aaa • a a a a a· a a a· aa ny dvě kapky stříbrného zesilujícího roztoku a dvě kapky iniciačního roztoku (Goldmark Biologicals). Reakce byla ponechána probíhat 20 až 30 minut při pokojové teplotě. Poté byly řezy důkladně opláchnuty sterilní deionizovanou vodou, vysušeny přes noc při pokojové teplotě na vzduchu a překryty Cytoseal 60 (VWR). Jako kontrola byly, při stejných pokusech a podle stejného protokolu, použity řezy tkání značené monoklonálními protilátkami rozpoznávajícími CDlla,

CDllb, CDllc a CD18.

Značení polyklonálním sérem proti a_d a značení monoklonálními protilátkami proti CDlla, CDllb, CDllc a CD18 odhalilo u a_d, ve srovnání s distribucí pozorovanou u jiných podjednotek a, odlišnou distribuci značky.

V normální plicní tkáni byla exprese a_d detekována na respiračním epitelu průdušek (avšak ne na epitelu plicních sklípků) a na jednotlivých buňkách, což by mohly být alveolární makrofágy ve vzduchových kanálcích. Signál pozorovaný při značení pomocí polyklonálního séra byl podstatně silnější než signál pozadí, pozorovaný při kontrole prováděné se sérem získaným před imunizací. V plicní granulomatózní tkáni, byl, 24 a 96 hodin po aplikaci glykanu, detekován odlišný signál, kdy se a_d značení objevilo v respiračním epitelu uvnitř plicních sklípků a silnější signál byl zaznamenán na alveolárních makrofázích uvnitř vzduchových kanálků. V plicní tkáni živočichů podle všeho zotavených z onemocnění (usmrcených 16 dní po aplikaci glykanu), nebyl pozorován žádný signál při značení protilátkou proti a_d. U každé z těchto tkání byl detekován, při značení pomocí séra získaného před imunizací, velmi slabý signál pozadí.

Při použití potkaní plicní tkáně v modelu astma vyvolaného antigenem byl, v respiračním epitelu jak průdušek, tak plicních sklípků, detekován velmi silný signál protilátky namířené proti a_d. Intenzita tohoto signálu byla podstatně

136 ·· ·«·· ·· ··♦· • « ···· ·· ·· • · · · ···· • · · · · · ·* • · · · · · ··· · · • ···· ··· • ·· ·· ·· ·· vyšší než úroveň signálu pozadí získaná při použití kontrolního séra z neimunizovaného živočicha.

Je možné předpokládat, že odborníky napadnou další četné modifikace a variace vynálezu vysvětleného ve výše uvedených ilustrativních příkladech. Proto by pro vynález měla platit pouze ta omezení, která jsou uvedena v připojených patentových nárocích.

137

SEZNAM SEKVENCÍ ·· ·· (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i)	PŘIHLAŠOVATEL: Gallatin, W. Michael
		Van der Vieren, Monica
(ii)	NÁZEV VYNÁLEZU: Nová alfa podjedentka lidského	i integrinu	β₂
iii)	POČE1	’ SEKVENCÍ: 103
(iv)	ADRESA PRO KORESPONDENCI:
	(A)	ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a	patentová	kancelář
	(B)	ULICE: Národní 32
	(C)	MĚSTO: Praha 1
	(D)	STÁT: Česká Republika
	(E)	PSČ: 116 66

(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.25 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/173497 (B) DATUM PODÁNÍ: 23. Prosince 1993 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/286889 (B) DATUM PODÁNÍ: 5. Října 1994 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/362652 (B) DATUM PODÁNÍ: 21. Prosince 1994 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: GOWSHALL, Jonathan Vallance (B) ČÍSLO SPISU: P11779SK-JVG/smt (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON:

(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3726 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

138 • · · · · · • · ·· · · · *··· • · · · · ·· · · · · · • · ···· ··· ····· ·· «4» · · ·· (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 3..3485 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:l:

TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47

Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His

10 15

GGA Gly

TTC Phe

AAC Asn

CTG Leu

GAT Asp 20

GTG Val

GAG Glu

CCT Pro

ACG Thr 25

ATC Ile

TTC Phe

CAG Gin

GAG Glu

GAT Asp 30

GCA Ala

95

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC

GTG

CAG

TTC

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

143

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG

GTG

GCG

GCC

AAC

CAG

ACG

GGA

CGG

CTG

191

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC

GGC

ATG

TGC

CAG

CCC

ATC

CCG

CTG

CAC

239

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

65

70

75

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

TTG

GGC

CTG

ACC

CTG

GCA

GCC

287

Ile

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

80

85

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG

GCC

TGT

GGC

CCG

ACC

CTG

CAC

AGA

335

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA

AAG

GGT

TCC

TGC

CTC

CTG

GGC

383

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

TCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA

GTC

CCC

GAC

GCC

ACG

CCA

GAG

TGT

431

Ser

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

CCA

CAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATC

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGA

AGC

479

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

ATT

GAC

CAA

AAT

GAC

TTT

AAC

CAG

ATG

AAG

GGC

TTT

GTC

CAA

GCT

GTC

527

Ile

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

160

165

170

175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC

ACC

CTG

TTT

GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

575

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

TTC

ACC

TTC

ACC

CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

623

Ser

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195 200 205

139 • · · · • · · · · ·

CCG	AGC	CAG	CAG	AGC	CTG	GTG	GAT	CCC
Pro	Ser	Gin 210	Gin	Ser	Leu	Val	Asp 215	Pro
ACG	TTC	ACG	GCC	ACG	GGC	ATC	CTG	ACA
Thr	Phe 225	Thr	Ala	Thr	Gly	Ile 230	Leu	Thr
CAT	AAG	AAT	GGG	GCC	CGA	AAA	AGT	GCC
His 240	Lys	Asn	Gly	Ala	Arg 245	Lys	Ser	Ala
ACA	GAT	GGG	CAG	AAG	TAC	AAA	GAC	CCC
Thr	Asp	Gly	Gin	Lys 260	Tyr	Lys	Asp	Pro
ccc	CAG	GCA	GAG	AAG	GCT	GGC	ATC	ATC
Pro	Gin	Ala	Glu 275	Lys	Ala	Gly	Ile	Ile 280
CAC	GCT	TTC	CAG	GGA	CCC	ACT	GCC	AGG
His	Ala	Phe 290	Gin	Gly	Pro	Thr	Ala 295	Arg
TCA	GCG	CCT	CCG	CAG	GAC	CAC	GTG	TTC
Ser	Ala 305	Pro	Pro	Gin	Asp	His 310	Val	Phe
CTT	GGC	AGC	ATC	CAG	AAG	CAG	CTG	CAG
Leu 320	Gly	Ser	Ile	Gin	Lys 325	Gin	Leu	Gin
GGA	ACC	CAG	TCC	AGG	GCA	AGC	AGC	TCC
Gly	Thr	Gin	Ser	Arg 340	Ala	Ser	Ser	Ser
GAA	GGC	TTC	AGC	ACA	GCC	CTC	ACA	ATG
Glu	Gly	Phe	Ser 355	Thr	Ala	Leu	Thr	Met 360
GTG	GGG	AGC	TTT	AGC	TGG	TCT	GGA	GGT
Val	Gly	Ser 370	Phe	Ser	Trp	Ser	Gly 375	Gly
ATG	AGC	CCC	ACC	TTC	ATC	AAC	ATG	TCT
Met	Ser 385	Pro	Thr	Phe	Ile	Asn 390	Met	Ser
GAC	TCT	TAC	CTG	GGT	TAC	TCC	ACC	GAG
Asp 400	Ser	Tyr	Leu	Gly	Tyr 405	Ser	Thr	Glu
CAG	AAC	CTG	GTC	CTG	GGG	GCC	CCC	CGC
Gin	Asn	Leu	Val	Leu 420	Gly	Ala	Pro	Arg
GTC	ATC	TTC	ACC	CAG	GTG	TCC	AGG	CAA
Val	Ile	Phe	Thr 435	Gin	Val	Ser	Arg	Gin 440

			• · • • • ··· ·	• • • • •	• • • · • • ·	• · • · • · « • · · 4 ·	• · · · • · · · • · · · * • · · • · ··
ATC	GTC	CAA	CTG	AAA	GGC	CTG	671
Ile	Val	Gin	Leu 220	Lys	Gly	Leu
GTG	GTG	ACA	CAG	CTA	TTT	CAT	719
Val	Val	Thr 235	Gin	Leu	Phe	His
AAG	AAG	ATC	CTC	ATT	GTC	ATC	767
Lys	Lys 250	Ile	Leu	Ile	Val	Ile 255
CTG	GAA	TAC	AGT	GAT	GTC	ATC	815
Leu 265	Glu	Tyr	Ser	Asp	Val 270	Ile
CGC	TAC	GCT	ATC	GGG	GTG	GGA	863
Arg	Tyr	Ala	Ile	Gly 285	Val	Gly
CAG	GAG	CTG	AAT	ACC	ATC	AGC	911
Gin	Glu	Leu	Asn 300	Thr	Ile	Ser
AAG	GTG	GAC	AAC	TTT	GCA	GCC	959
Lys	Val	Asp 315	Asn	Phe	Ala	Ala
GAG	AAG	ATC	TAT	GCA	GTT	GAG	1007
Glu	Lys 330	Ile	Tyr	Ala	Val	Glu 335
TTC	CAG	CAC	GAG	ATG	TCC	CAA	1055
Phe 345	Gin	His	Glu	Met	Ser 350	Gin
GAT	GGC	CTC	TTC	CTG	GGG	GCT	1103
Asp	Gly	Leu	Phe	Leu 365	Gly	Ala
GCC	TTC	CTG	TAT	CCC	CCA	AAT	1151
Ala	Phe	Leu	Tyr 380	Pro	Pro	Asn
CAG	GAG	AAT	GTG	GAC	ATG	AGG	1199
Gin	Glu	Asn 395	Val	Asp	Met	Arg
CTA	GCC	CTG	TGG	AAG	GGG	GTA	1247
Leu	Ala 410	Leu	Trp	Lys	Gly	Val 415
TAC	CAG	CAT	ACC	GGG	AAG	GCT	1295
Tyr 425	Gin	His	Thr	Gly	Lys 430	Ala
TGG	AGG	AAG	AAG	GCC	GAA	GTC	1343
Trp	Arg	Lys	Lys	Ala 445	Glu	Val

140 • · » · 4 · • · 4 4 4 4 ···» · 4 4 4 4 • ·

4

4 4 4

ACA Thr

GGG ACG Gly Thr 450

CAG Gin

ATC Ile

GGC Gly

TCC Ser

TAC Tyr 455

TTC Phe

GGG Gly

GCC Ala

TCC Ser

CTC Leu 460

TGC Cys

TCC Ser

GTG Val

1391

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

CCC

1439

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

1487

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

480

485

490

495

CCT

AGG

GGG

CAG

AGG

GTG

CAG

TGG

CAG

TGT

GAC

GCT

GTT

CTC

CGT

GGT

1535

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

500

505

510

GAG

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

1583

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

GGG

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

1631

Gly

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

530

535

540

GGA

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

1679

Gly

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

545

550

555

GAA

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

1727

Glu

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

560

565

570

575

CTC

TCC

CCC

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

GCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

1775

Leu

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

580

585

590

GAC

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

1823

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

605

CAG

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

1871

Gin

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

610

615

620

ATG

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

1919

Met

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

625

630

635

GAA

GAG

AAG

CCC

AGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

1967

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

640

645

650

655

ACC

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

2015

Thr

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

Ile

Gin

Ser

660

665

670

GTC

AGG

TTT

GAT

CTG

GCA

CTG

GAC

CCA

GGT

CGT

CTG

ACT

TCT

CGT

GCC

2063

Val

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

675

680

685

141

ATT	TTC	AAT	GAA	ACC	AAG	AAC	CCC	ACT
Ile	Phe	Asn 690	Glu	Thr	Lys	Asn	Pro 695	Thr
GGA	CTG	GGG	ATT	CAC	TGT	GAA	ACC	CTG
Gly	Leu 705	Gly	Ile	His	Cys	Glu 710	Thr	Leu
GTG	GAG	GAT	GTG	GTG	AGC	CCC	ATC	ATT
Val 720	Glu	Asp	Val	Val	Ser 725	Pro	Ile	Ile
GTG	AGA	GAG	CCC	ATC	CCC	TCC	CCC	CAG
Val	Arg	Glu	Pro	Ile 740	Pro	Ser	Pro	Gin
GTG	GGC	TCA	CAA	GAC	CTC	TTC	ACT	GCT
Val	Gly	Ser	Gin 755	Asp	Leu	Phe	Thr	Ala 760
TGT	GGG	CAA	GAT	GGC	CTC	TGT	GAA	GGG
Cys	Gly	Gin 770	Asp	Gly	Leu	Cys	Glu 775	Gly
TTC	TCA	GGC	CTG	CAG	ACC	CTG	ACC	GTG
Phe	Ser 785	Gly	Leu	Gin	Thr	Leu 790	Thr	Val
GTG	ATT	GTG	ACT	GTG	TGG	AAC	GCA	GGT
Val 800	Ile	Val	Thr	Val	Trp 805	Asn	Ala	Gly
GTC	AGC	CTC	TAC	TAT	CCA	GCA	GGG	CTG
Val	Ser	Leu	Tyr	Tyr 820	Pro	Ala	Gly	Leu
GCC	CAG	AAG	CAG	CCC	CAT	CAG	AGT	GCC
Ala	Gin	Lys	Gin 835	Pro	His	Gin	Ser	Ala 840
GTG	CCC	ACT	GAG	GAT	GAG	GGC	CTA	AGA
Val	Pro	Thr 850	Glu	Asp	Glu	Gly	Leu 855	Arg
CAC	CCC	ATC	TTC	CAT	GAG	GGC	TCT	AAC
His	Pro 865	Ile	Phe	His	Glu	Gly 870	Ser	Asn
GAT	GTC	TCC	TAC	AAG	GCC	ACC	CTG	GGA
Asp 880	Val	Ser	Tyr	Lys	Ala 885	Thr	Leu	Gly
AGT	GCA	AGC	AGT	GAG	AAC	AAT	AAG	GCT
Ser	Ala	Ser	Ser	Glu 900	Asn	Asn	Lys	Ala
CAG	CTG	GAG	CTC	CCG	GTG	AAG	TAT	GCA
Gin	Leu	Glu	Leu 915	Pro	Val	Lys	Tyr	Ala 920

• · • · · » • · · ·

			• · • • • ··· ·	• • • • •	• • • · • • ·	• · • · • · • · · • ·	• · · · • · · · • · · · · · • · · 9 9 · ·
TTG	ACT	CGA	AGA	AAA	ACC	CTG	2111
Leu	Thr	Arg	Arg 700	Lys	Thr	Leu
AAG	CTG	CTT	TTG	CCA	GAT	TGT	2159
Lys	Leu	Leu 715	Leu	Pro	Asp	Cys
CTG	CAC	CTC	AAC	TTC	TCA	CTG	2207
Leu	His 730	Leu	Asn	Phe	Ser	Leu 735
AAC	CTG	CGT	CCT	GTG	CTG	GCC	2255
Asn 745	Leu	Arg	Pro	Val	Leu 750	Ala
TCT	CTC	CCC	TTC	GAG	AAG	AAC	2303
Ser	Leu	Pro	Phe	Glu 765	Lys	Asn
GAC	CTG	GGT	GTC	ACC	CTC	AGC	2351
Asp	Leu	Gly	Val 780	Thr	Leu	Ser
GGG	AGC	TCC	CTG	GAG	CTC	AAC	2399
Gly	Ser	Ser 795	Leu	Glu	Leu	Asn
GAG	GAT	TCC	TAC	GGA	ACC	GTG	2447
Glu	Asp 810	Ser	Tyr	Gly	Thr	Val 815
TCG	CAC	CGA	CGG	GTG	TCA	GGA	2495
Ser 825	His	Arg	Arg	Val	Ser 830	Gly
CTG	CGC	CTG	GCA	TGT	GAG	ACA	2543
Leu	Arg	Leu	Ala	Cys 845	Glu	Thr
AGC	AGC	CGC	TGC	AGT	GTC	AAC	2591
Ser	Ser	Arg	Cys 860	Ser	Val	Asn
GGC	ACC	TTC	ATA	GTC	ACA	TTC	2639
Gly	Thr	Phe 875	Ile	Val	Thr	Phe
GAC	AGG	ATG	CTT	ATG	AGG	GCC	2687
Asp	Arg 890	Met	Leu	Met	Arg	Ala 895
TCA	AGC	AGC	AAG	GCC	ACC	TTC	2735
Ser 905	Ser	Ser	Lys	Ala	Thr 910	Phe
GTC	TAC	ACC	ATG	ATC	AGC	AGG	2783
Val	Tyr	Thr	Met	Ile 925	Ser	Arg

142 • · · ·

CAG Gin

GAA Glu

GAA TCC ACC AAG

TAC Tyr

TTC Phe 935

AAC Asn

TTT Phe

GCA Ala

ACC Thr

TCC Ser 940

GAT Asp

GAG Glu

AAG Lys

2831

Glu 930

Ser

Thr

Lys

AAA

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

2879

Lys

Met 945

Lys

Glu

Ala

Glu

His 950

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn 955

Asn

Leu

Ser

Gin

CGA

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

2927

Arg 960

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser 965

Ile

Asn

Phe

Trp

Val 970

Pro

Val

Leu

Asn 975

GGG

GTG

GCT

GTG

TGG

GAT

GTG

GTC

ATG

GAG

GCC

CCA

TCT

CAG

AGT

CTC

2975

Gly

Val

Ala

Val

Trp 980

Asp

Val

Met

Glu 985

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser 990

Leu

CCC

TGT

GTT

TCA

GAG

AGA

AAA

CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC

TTC

CTG

ACC

3023

Pro

Cys

Val

Ser 995

Glu

Arg

Lys

Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp

Phe Leu 1005

Thr

CAG

ATT

TCA

AGA

AGT

CCC

ATG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

3071

Gin

Ile

Ser Arg 1010

Ser

Pro

Met

Leu Asp 1015

Cys

Ser

Ile

Ala Asp 1020

Cys

Leu

CAG

TTC

CGC

TGT

GAC

GTC

CCC

TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG

CTG

GAT

3119

Gin

Phe Arg 1025

Cys

Asp

Val

Pro Ser 1030

Phe

Ser

Val

Gin Glu 1035

Glu

Leu

Asp

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAT

CTC

AGT

TTC

GGC

TGG

GTC

CGC

GAG

ACA

TTG

3167

Phe Thr 1040

Leu

Lys

Gly

Asn Leu 1045

Ser

Phe

Gly

Trp Val 1050

Arg

Glu

Thr

Leu 1055

CAG

AAG

GTG

TTG

GTC

GTG

AGT

GTG

GCT

GAA

ATT

ACG

TTC

GAC

ACA

3215

Gin

Lys

Val

Leu Val 1060

Val

Ser

Val

Ala Glu 1065

Ile

Thr

Phe

Asp 107C

Thr 1

TCC

GTG

TAC

TCC

CAG

CTT

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

ATG

AGA

GCT

CAG

3263

Ser

Val

Tyr

Ser 1075

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin 108C

Glu )

Ala

Phe

Met

Arg Ala 1085

Gin

ATG

GAG

ATG

GTG

CTA

GAA

GAC

GAG

GTC

TAC

AAT

GCC

ATT

CCC

ATC

3311

Met

Glu

Met Val 1090

Leu

Glu

Asp Glu 1095

Val

Tyr

Asn

Ala Ile 1100

Pro

Ile

ATC

ATG

GGC

AGC

TCT

GTG

GGG

GCT

CTG

CTA

CTG

GCG

CTC

ATC

ACA

3359

Ile

Met Gly 1105

Ser

Val

Gly nic

Ala )

Leu

Leu 1115

Ala

Leu

Ile

Thr

GCC

ACA

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAA

CGC

CAC

TAC

AAG

GAA

ATG

3407

Ala 112C

Thr 1

Leu

Tyr

Lys

Leu 1125

Gly

Phe

Lys

Arg 113C

His 1

Tyr

Lys

Glu

Met 1135

CTG

GAG

GAC

AAG

CCT

GAA

GAC

ACT

GCC

ACA

TTC

AGT

GGG

GAC

GAT

TTC

3455

Leu

Glu

Asp

Lys

Pro 114C

Glu 1

Asp

Thr

Ala

Thr 1145

Phe

Ser

Gly

Asp

Asp 1150

Phe 1

AGC Ser

TGT Cys

GTG Val

GCC Ala 1155

CCA Pro

AAT Asn

GTG Val

CCT Pro

TTG Leu 1160

TCC Ser

TAATAATCCA CTTTCCTGTT

3505

143 • · • · · ·

	• · · · · · • · · • · • 4 • · • 4 4 4 4	•4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 «44 «4 4 4 « 4 4 4 4 4	• 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4
TATCTCTACC	ACTGTGGGCT	GGACTTGCTT	GCAACCATAA	ATCAACTTAC	ATGGAAACAA	3566
CTTCTGCATA	GATCTGCACT	GGCCTAAGCA	ACCTACCAGG	TGCTAAGCAC	CTTCTCGGAG	3625
AGATAGAGAT	TGTAATGTTT	TTACATATCT	GTCCATCTTT	TTCAGCAATG	ACCCACTTTT	3685
TACAGAAGCA	GGCATGGTGC	CAGCATAAAT	TTTCATATGC	T		3726

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:2:

Thr 1

Phe

Gly Thr Val 5

Leu

Ser

Val 10

Leu

Ala

Ser

Tyr

His 15

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

Ile

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

Gly

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

Ile

65

70

75

80

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

Ser

85

90

95

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

Val

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

115

120

125

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

145

150

155

160

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

Met

165

170

175

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

185

190

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

Pro

195

200

205

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

Thr

210 215 220

144 • · k I

Phe 225

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile 230

Leu

Thr

Val

Thr 235

Gin

Leu

Phe

His

His 240

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

Thr

245

250

255

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

Pro

260

265

270

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

His

275

280

285

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

Leu

305

310

315

320

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

Gly

325

330

335

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

340

345

350

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

Val

355

360

365

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Met

370

375

380

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

385

390

395

400

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

Gin

405

410

415

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

Val

420

425

430

Ile

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

Thr

435

440

445

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

450

455

460

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

465

470

475

480

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

Pro

485

490

495

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

530 535 540

145 • · · · • 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 ·

999 9 9 99 9 9 99 9 9

Glu Gin Glu Asn Arg Gly Ala Val

Tyr

Leu

Phe 555

His

Gly

Ala

Ser

Glu 560

545

550

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

595

600

605

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

Ile

Gin

Ser

Val

660

665

670

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

Ile

675

680

685

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

690

695

700

Leu

Gly

Ile

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

705

710

715

720

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725

730

735

Arg

Glu

Pro

Ile

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

740

745

750

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

Ile

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

146 • · · · · • · · 4 « 1 k « 4 · · « » 4 » · · · 4 * ► 4 · · · 4 4 ·

4 4

4 4 4

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

Ile

Val

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

Ile

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Glu

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

Ile

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Pro

980

985

990

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lys

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

Ile

Ser

Arg

Ser

Pro

Met

Leu

Asp

Cys

Ser

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

Gin

1010

1015

1020

Phe

Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

1070

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

Met

1075

1080

1085

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

Ile

Pro

Ile

1090

1095

1100

Met

Gly

Ser

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Ala

1105

1110

1115

1120

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

Glu

Asp

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Phe

Ser

Gly

Asp

Phe

Ser

1140

1145

1150

Cys

Val

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Lys

Ser

1155

1160

147 • · 0 · · · · 0 0 • · ·· • 0 • 0

(2) INFORMACE

; 0 SEK.

ID.

Č. : 3:

(i)

CHARAKTERISTIKA

SEKVENCE:

(A)

DÉLKA:

1153

í aminokyselin

(B)

TYP: aminokyselina

(C)

POČET ŘETĚZCŮ:

j eden

(D)

TOPOLOGIE:

lineární

(ii)

TYP

MOLEKULY: protein

(xi)

POPIS SEKVENCE:

SEK.

ID.

Č. :

:3:

Met

Ala

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Ala

Leu

Thr

Leu

Cys

His

Gly

1

5

10

15

Phe

Asn

Leu

Asp

Thr

Glu

Asn

Ala

Met

Thr

Phe

Gin

Glu

Asn

Ala

Arg

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Ser

Arg

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Gin

Glu

Ile

Val

Ala

Asn

Gin

Arg

Gly

Ser

Leu

Tyr

50

55

60

Gin

Cys

Asp

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ser

Cys

Glu

Pro

Ile

Arg

Leu

Gin

Val

65

70

75

80

Pro

Val

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

85

90

95

Thr

Ser

Pro

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Gin

Thr

100

105

110

Cys

Ser

Glu

Asn

Thr

Tyr

Val

Lys

Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

Phe

Gly

Ser

115

120

125

Asn

Leu

Arg

Gin

Pro

Gin

Lys

Phe

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly

Cys

130

135

140

Pro

Gin

Glu

Asp

Ser

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

Ile

Pro

His

Asp

Phe

Arg

Met

Lys

Glu

Phe

Val

Ser

Thr

Val

165

170

175

Met

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Lys

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Glu

Phe

Arg

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Lys

Glu

Phe

Gin

Asn

195

200

205

Pro

Asn

Pro

Arg

Ser

Leu

Val

Lys

Pro

Ile

Thr

Gin

Leu

Gly

Arg

210

215

220

Thr

His

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

Lys

Val

Arg

Glu

Leu

Phe

Asn

225

230

235

240

Ile

Thr

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Asn

Ala

Phe

Lys

Ile

Leu

Val

Ile

245

250

255

148 • · · · • · • · · · • · • · · · · · · ···· · • · ·*·· · · » ···* · ·· ·· ·· ··

Asp Gly Glu Lys

Phe

Gly

Asp

Pro

Leu Gly Tyr Glu Asp Val

Tle

260

265

270

Pro

Glu

Ala

Asp

Arg

Glu

Gly

Val

Ile

Arg

Tyr

Val

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

Asp

Ala

Phe

Arg

Ser

Glu

Lys

Ser

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ala

290

295

300

Ser

Lys

Pro

Arg

Asp

His

Val

Phe

Gin

Val

Asn

Phe

Glu

Ala

305

310

315

320

Leu

Lys

Thr

Ile

Gin

Asn

Gin

Leu

Arg

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

325

330

335

Gly

Thr

Gin

Thr

Gly

Ser

Phe

Glu

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Ile

Thr

Ser

Asn

Gly

Pro

Leu

Ser

Thr

355

360

365

Val

Gly

Ser

Tyr

Asp

Trp

Ala

Gly

Val

Phe

Leu

Tyr

Thr

Ser

Lys

370

375

380

Glu

Lys

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Thr

Arg

Val

Asp

Ser

Asp

Met

Asn

385

390

395

400

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ala

Ile

Leu

Arg

Asn

Arg

Val

405

410

415

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Ile

Gly

Leu

Val

420

425

430

Ala

Met

Phe

Arg

Gin

Asn

Thr

Gly

Met

Trp

Glu

Ser

Asn

Ala

Asn

Val

435

440

445

Lys

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ala

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

Asp

Val

Asp

Ser

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Ala

Arg

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Tyr

Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

Gin

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asp

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Thr

Ser

545

550

555

560

Gly

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Gly

Ser

Lys

565

570

575

149 • tu • · to to to to

Leu Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin

580 585 590 • · ···· ··· ····· ·· · · ·· «to

Asp

Leu

Thr 595

Met

Asp

Gly

Leu

Val 600

Asp

Leu

Thr

Val

Gly 605

Ala

Gin

Gly

His

Val 610

Leu

Arg

Ser 615

Gin

Pro

Val

Leu

Arg 620

Val

Lys

Ala

Ile

Met 625

Glu

Phe

Asn

Pro

Arg 630

Glu

Val

Ala

Arg

Asn 635

Val

Phe

Glu

Cys

Asn 640

Asp

Gin

Val

Lys 645

Gly

Lys

Glu

Ala

Gly 650

Glu

Val

Arg

Val

Cys 655

Leu

His

Val

Gin

Lys 660

Ser

Thr

Arg

Asp

Arg 665

Leu

Arg

Glu

Gly

Gin 670

Ile

Gin

Ser

Val

Val 675

Thr

Tyr

Asp

Leu

Ala 680

Leu

Asp

Ser

Gly

Arg 685

Pro

His

Ser

Arg

Ala 690

Val

Phe

Asn

Glu

Thr 695

Lys

Asn

Ser

Thr

Arg 700

Arg

Gin

Thr

Gin

Val 705

Leu

Gly

Leu

Thr

Gin 710

Thr

Cys

Glu

Thr

Leu 715

Lys

Leu

Gin

Leu

Pro 720

Asn

Cys

Ile

Glu

Asp 725

Pro

Val

Ser

Pro

Ile 730

Val

Leu

Arg

Leu

Asn 735

Phe

Ser

Leu

Val

Gly 740

Thr

Pro

Leu

Ser

Ala 745

Phe

Gly

Asn

Leu

Arg 750

Pro

Val

Leu

Ala

Glu 755

Asp

Ala

Gin

Arg

Leu 760

Phe

Thr

Ala

Leu

Phe 765

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn 770

Cys

Gly

Asn

Asp

Asn 775

Ile

Cys

Gin

Asp

Asp 780

Leu

Ser

Ile

Thr

Phe 785

Ser

Phe

Met

Ser

Leu 790

Asp

Cys

Leu

Val

Val 795

Gly

Pro

Arg

Glu 800

Phe

Asn

Val

Thr

Val 805

Thr

Val

Arg

Asn

Asp 810

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr 815

Arg

Thr

Gin

Val

Thr 820

Phe

Pro

Leu 825

Asp

Leu

Ser

Tyr

Arg 830

Lys

Val

Ser

Thr

Leu 835

Gin

Asn

Gin

Arg

Ser 840

Gin

Arg

Ser

Trp

Arg 845

Leu

Ala

Cys

Glu

Ser 850

Ala

Ser

Thr

Glu 855

Val

Ser

Gly

Ala

Leu 860

Lys

Ser

Thr

Ser

Cys 865

Ser

Ile

Asn

His

Pro 870

Ile

Phe

Pro

Glu

Asn 875

Ser

Glu

Val

Thr

Phe 880

Asn

Ile

Thr

Phe

Asp 885

Val

Asp

Ser

Lys

Ala 890

Ser

Leu

Gly

Asn

Lys 895

Leu

150

Leu

Lys

Ala 900

Asn Val

Thr

Ser

Glu 905

Asn

Asn Met

Pro

Arg 910

Thr

Asn

Lys

Thr

Glu 915

Phe

Gin Leu

Glu

Leu 920

Pro

Val

Lys Tyr

Ala 925

Val

Tyr

Met

Val

Val 930

Thr

Ser

His Gly

Val 935

Ser

Thr

Lys

Tyr Leu 940

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser 945

Glu

Asn

Thr

Ser Arg 950

Val

Met

Gin

His

Gin Tyr 955

Gin

Val

Ser

Asn 960

Leu

Gly

Gin

Arg

Ser Leu 965

Pro

Ile

Ser

Leu 970

Val Phe

Leu

Val

Pro 975

Val

Arg

Leu

Asn

Gin 980

Thr Val

Ile

Trp

Asp 985

Arg

Pro Gin

Val

Thr 990

Phe

Ser

Glu

Asn

Leu 995

Ser

Ser Thr

Cys

His 100C

Thr 1

Lys

Glu Arg

Leu 1005

Pro

Ser

His

Ser

Asp Phe 1010

Leu

Ala Glu

Leu 1015

Arg

Lys

Ala

Pro Val 102C

Val )

Asn

Cys

Ser

Ile 1025

Ala

Val

Cys

Gin Arg 103C

Ile )

Gin

Cys

Asp

Ile Pro 1035

Phe

Gly

Ile 1040

Gin

Glu

Phe

Asn Ala 1045

Thr

Leu

Lys

Gly 105C

Asn Leu 1

Ser

Phe

Asp 1055

Trp

Tyr

Ile

Lys

Thr Ser His 1060

Asn

His

Leu Leu 1065

Ile Val

Ser

Thr Ala 1070

Glu

Ile

Leu

Phe 1075

Asn

Asp Ser

Val

Phe 108C

Thr 1

Leu

Leu Pro

Gly 1085

Gin 1

Gly

Ala

Phe

Val 109C

Arg 1

Ser

Gin Thr

Glu 1095

Thr

Lys

Val

Glu Pro noc

Phe 1

Glu

Val

Pro

Asn 1105

Pro

Leu

Pro

Leu Ile nic

Val )

Gly

Ser

Val Gly 1115

Gly

Leu

Leu 1120

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr Ala 1125

Ala

Leu

Tyr

Lys 113C

Leu Gly 1

Phe

Lys 1135

Arg 1

Gin

Tyr

Lys

Asp

Met Met

Ser

Glu

Gly

Pro Pro

Gly

Ala

Glu

Pro

1140 1145 1150

Gin (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1163 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

151 ·· ·«·· ♦· ···· • · · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 · · · · · · · · ····· · · · · · · ··

(xi)

POPIS SEKVENCE:

SEK.

ID.

Č. :

4 :

Met

Thr

Arg

Thr

Arg

Ala

Leu

Phe

Thr

Ala

Leu

Ala

Thr

1

5

10

15

Ser

Leu

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Thr

Glu

Leu

Thr

Ala

Phe

Arg

Val

20

25

30

Asp

Ser

Ala

Gly

Phe

Gly

Asp

Ser

Val

Gin

Tyr

Ala

Asn

Ser

Trp

35

40

45

Val

Gly

Ala

Pro

Gin

Lys

Ile

Ala

Asn

Gin

Ile

Gly

50

55

60

Gly

Leu

Tyr

Gin

Cys

Gly

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ala

Cys

Glu

Pro

Ile

Gly

65

70

75

80

Leu

Gin

Val

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Ala

Ser

Thr

Ser

Pro

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

100

105

110

His

Glu

Cys

Gly

Arg

Asn

Met

Tyr

Leu

Thr

Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Pro

Thr

Gin

Leu

Thr

Gin

Arg

Leu

Pro

Val

Ser

Arg

Gin

Glu

130

135

140

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Gin

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

Ile

Ser

Arg

Asn

Phe

Ala

Thr

Met

Asn

Phe

Val

Arg

Ala

165

170

175

Val

Ile

Ser

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ser

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

180

185

190

Phe

Ser

Asn

Lys

Phe

Gin

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Glu

Phe

Arg

195

200

205

Thr

Ser

Asn

Pro

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Val

His

Gin

Leu

Gin

Gly

210

215

220

Phe

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Ala

Ile

Gin

Asn

Val

His

Arg

Leu

Phe

225

230

235

240

His

Ala

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

Asp

Ala

Ile

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

245

250

255

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

Glu

Gly

Asp

Ser

Leu

Asp

Tyr

Lys

Asp

Val

260

265

270

Ile

Pro

Met

Ala

Asp

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

275

280

285

Gly

Leu

Ala

Phe

Gin

Asn

Arg

Asn

Ser

Trp

Lys

Glu

Leu

Asn

Asp

Ile

290

295

300

Ala

Ser

Lys

Pro

Ser

Gin

Glu

His

Ile

Phe

Lys

Val

Glu

Asp

Phe

Asp

305

310

315

320

152 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 99 ·· ·· ··

Ala

Leu

Lys

Asp

Ile

Gin

Asn

Gin

Leu

Lys

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

325

330

335

Glu

Gly

Thr

Glu

Thr

Ile

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Met

Ala

340

345

350

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Val

Phe

Thr

Pro

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

355

360

365

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Thr

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Asn

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

385

390

395

400

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

405

410

415

Val

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Ile

Gly

Lys

420

425

430

Ala

Val

Ile

Phe

Ile

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Met

Lys

Ala

Glu

435

440

445

Val

Ile

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

450

455

460

Val

Asp

Val

Asp

Thr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

465

470

475

480

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

485

490

495

Leu

Pro

Arg

Gly

Trp

Arg

Trp

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Tyr

Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Ile

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Val

Leu

545

550

555

560

Gly

Pro

Ser

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Gly

Ser

Gin

565

570

575

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

580

585

590

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

605

Gin

Val

Leu

Arg

Thr

Arg

Pro

Val

Leu

Trp

Val

Gly

Val

Ser

610

615

620

Met

Gin

Phe

Ile

Pro

Ala

Glu

Ile

Pro

Arg

Ser

Ala

Phe

Glu

Cys

Arg

625

630

635

640

153 • 4 ···· •4 44·· • · ·

Glu Gin Val

Val

Ser 645

Glu

Gin

Thr

Leu

Val 650

Gin

Ser

Asn

Ile

Cys 655

Leu

Tyr

Ile

Asp

Lys

Arg

Ser

Lys

Asn

Leu

Gly

Ser

Arg

Asp

Leu

Gin

660

665

670

Ser

Val

Thr

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

Pro

Gly

Arg

Leu

Ser

Pro

675

680

685

Arg

Ala

Ile

Phe

Gin

Glu

Thr

Lys

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Arg

Val

Arg

690

695

700

Val

Leu

Gly

Leu

Lys

Ala

His

Cys

Glu

Asn

Phe

Asn

Leu

Pro

705

710

715

720

Ser

Cys

Val

Glu

Asp

Ser

Val

Ile

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

725

730

735

Thr

Leu

Val

Gly

Lys

Pro

Leu

Ala

Phe

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Met

740

745

750

Leu

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Tyr

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

755

760

765

Lys

Asn

Cys

Gly

Ala

Asp

His

Ile

Cys

Gin

Asp

Asn

Leu

Gly

Ile

Ser

770

775

780

Phe

Ser

Phe

Pro

Gly

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Gly

Ser

Asn

Leu

Glu

785

790

795

800

Leu

Asn

Ala

Glu

Val

Met

Val

Trp

Asn

Asp

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

805

810

815

Thr

Ile

Thr

Phe

Ser

His

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Val

820

825

830

Ala

Glu

Gly

Gin

Lys

Gin

Gly

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

His

Leu

Thr

Cys

835

840

845

Cys

Ser

Ala

Pro

Val

Gly

Ser

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Thr

Ser

Cys

Arg

850

855

860

Ile

Asn

His

Leu

Ile

Phe

Arg

Gly

Ala

Gin

Ile

Thr

Phe

Leu

Ala

865

870

875

880

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Pro

Lys

Ala

Val

Gly

Leu

Asp

Arg

Leu

885

890

895

Ile

Ala

Asn

Val

Ser

Glu

Asn

Ile

Pro

Arg

Thr

Ser

Lys

Thr

900

905

910

Ile

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Ile

Val

915

920

925

Ser

His

Glu

Gin

Phe

Thr

Lys

Tyr

Leu

Asn

Phe

Ser

Glu

Ser

Glu

930

935

940

Glu

Lys

Glu

Ser

His

Val

Ala

Met

His

Arg

Tyr

Gin

Val

Asn

Leu

945

950

955

960

154 *· ···· • a · · · · • a ·· a a · ·· · · · · · • a aaa aaaa

	• aaa a	a a	a a	aa
Gly Gin Arg Asp Leu Pro Val	Ser Ile Asn Phe Trp	Val Pro	Val	Glu
965	970		975
Leu Asn Gin Glu Ala Val Trp	Met Asp Val Glu Val	Ser His	Pro	Gin
980	985	990
Asn Pro Ser Leu Arg Cys Ser	Ser Glu Lys Ile Ala	Pro Pro	Ala	Ser
995	1000	1005
Asp Phe Leu Ala His Ile Gin	Lys Asn Pro Val Leu	Asp Cys	Ser	Ile
1010 1015	, 1020
Ala Gly Cys Leu Arg Phe Arg	Cys Asp Val Pro Ser	Phe Ser	Val	Gin
1025 1030	1035			1040
Glu Glu Leu Asp Phe Thr Leu	Lys Gly Asn Leu Ser	Phe Gly	Trp	Val
1045	1050		1055
Arg Gin Ile Leu Gin Lys Lys	Val Ser Val Val Ser	Val Ala	Glu	Ile
1060	1065	1070
Ile Phe Asp Thr Ser Val Tyr	Ser Gin Leu Pro Gly	Gin Glu	Ala	Phe
1075	1080	1085
Met Arg Ala Gin Thr Ile Thr	Val Leu Glu Lys Tyr	Lys Val	His	Asn
1090 1095	, 1100
Pro Ile Pro Leu Ile Val Gly	Ser Ser Ile Gly Gly	Leu Leu	Leu	Leu
1105 1110	1115			1120
Ala Leu Ile Thr Ala Val Leu	Tyr Lys Val Gly Phe	Phe Lys	Arg	Gin
1125	1130		1135
Tyr Lys Glu Met Met Glu Glu	Ala Asn Gly Gin Ile	Ala Pro	Glu	Asn
1140	1145	1150
Gly Thr Gin Thr Pro Ser Pro	Pro Ser Glu Lys

1155 1160 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:5:

Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gin 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden

155 ·* ···· ·· ·»1» ·· ·· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 9 99 9 9 9 9 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:6:

TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA 35 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:7:

TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:8:

TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:9:

TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

156 ·· ··»· ·· ··»·

999 ·

99

9 9 9 9 • · · · « • · ·· · · · • 9 · · *· ·· ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:10:

TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:ll:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:ll:

TGRAANACCA TNGGYTC 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:12:

TTGGAAGACC ATNGGYTC 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:13:

ATTAACCCTC ACTAAAG 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:14:

AATACGACTC ACTATAG 17

157 «· ···· ·· ···· ···· ·· ·· • · · · « · ·» ·«· · · • · · ·· ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:15:

Val Phe Gin Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:16:

Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gin Pro Ile 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:17:

Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gin Ala Glu 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:18:

Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

158 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:19:

Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gin Glu Asn Val Asp 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:20:

Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gin Thr Gly 15 10 15

Arg (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:21:

Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala 1 5 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:22:

Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu 1 5 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

159 ·· ··· ···· • · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:23:

RAANCCYTCY TGRAAACTYT C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1006 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:24:

TTCAACCTGG	ACGTGGAGGA	GCCCATGGTG	TTCAAGAGGA	TGGAGCTGGC	TTTGGACAGA	60
GCGTGGCCCA	GCTTGGCGGA	TCTAGACTCG	TGGTGGGAGC	CCCCCTGGAG	GTGGTGGCGG	120
TCAACCAAAC	AGGAAGGTTG	TATGACTGTG	TGGCTGCCAC	TGGCCTTGTC	AACCCATACC	180
CCTGCACACA	CCCCCAGATG	CTGTGAACAT	GTCCCTGGGT	CTGTCCCTGT	CAGCCGCCGC	240
CAGTCGCCCC	TGGCTGCTGG	CCTGTGGCCC	AACCATGCAC	AGAGCCTGTG	GGGAGAATAT	300
GTATGCAGAA	GGCTTTTGCC	TCCTGTTGGA	CTCCCATCTG	CAGACCATTT	GGACAGTACC	360
TGCTGCCCTA	CCAGAGTGTC	CAAGTCAAGA	GATGGACATT	GTCTTCCTGA	TTGATGGTTC	420
TGGCAGTATG	AGCAAAGTGA	CTTTAAACAA	ATGAAGGATT	TGTGAGAGCT	GTGATGGGAC	480
AGTTTGAGGG	CACCCAAACC	CTGTTCTCAC	TGATACAGTA	TCCCACCTCC	CTGAAGATCC	540
ACTTCACCTT	CACGCAATTC	CAGAGCAGCT	GGAACCCTCT	GAGCCTGGTG	GATCCCATTG	600
TCCAACTGGA	CGGCCTGACA	TATACAGCCA	CGGGCATCCG	GAAAGTGGTG	GAGGAACTGT	660
TTCATAGTAA	GAATGGGGCC	CGTAAAAGTG	CCAAGAAGAT	CCTCATTGTC	ATCACAGATG	720
GCAAAAATAC	AAAGACCCCC	TGGAGTACGA	GGACGTATCC	CCAGGCAGAG	AGAGCGGATC	780
ATCCGCTATG	CCATTGGGGT	GGGAGATGCT	TTCTGGAAAC	CCAGTGCCAA	GCAGGAGCTG	840
GACAACATTG	GCTCAGAGCC	GGCTCAGGAC	CATGTGTTCA	GGGTGGACAA	CTTTGCAGCA	900
CTCAGCAGCA	TCCAGGAGCA	GCTGCAGGAG	AAGATCTTTG	CACTCGAAGG	AACCCAGTCG	960
ACGACAAGTA	GCTCTTTCCA	ACATGAGATG	TTCCAAGAAG	GGTTCA		1006

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

160 • 0 0·· 0000

0 00 0 00 0000 0 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:25:

GTNTTYCARG ARGAYGG 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:26:

CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:27:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:28:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

161 • · · · · · • · 0 0 0 0 ·· ··

0 · ·· · ···· • 0 0 0 · 0 0 0 0 • 0 0 · 0 · · 0000 0 0 0 0000 000 00000 00 00 0 fl 00 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:29:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:30:

TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:31:

GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:32:

ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:33:

ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37

162 • · (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:34:

TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:35:

TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3528 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3456 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:36:

GGC Gly 1

TGG Trp

GCC Ala

CTG Leu

GCT Ala 5

TCC Ser

TGT Cys

CAT His

GGG Gly

TCT Ser 10

AAC Asn

CTG Leu

GAT Asp

GTG Val

GAG Glu 15

GAA Glu

48

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

GGA

CAG

ACT

GTG

96

Pro

Ile

Val

Phe 20

Arg

Glu

Asp

Ala

Ala 25

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr 30

Val

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

144

Gin

Phe

Gly 35

Gly

Ser

Arg

Leu

Val 40

Val

Gly

Ala

Pro

Leu 45

Glu

Ala

Val

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

GCA

CCT

GCC

ACT

GGC

192

Ala

Val 50

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg 55

Leu

Tyr

Asp

Cys

Ala 60

Pro

Ala

Thr

Gly

163 • · · · « · · · · · • « • · • · · · • · · · · • · · · · »···· · · 4 » · · · • · · · · • · · • · « ·

ATG	TGC	CAG	CCC	ATC	GTA	CTG	CGC	AGT	CCC
Met 65	Cys	Gin	Pro	Ile	Val 70	Leu	Arg	Ser	Pro
TCC	CTG	GGC	CTG	TCT	CTG	GTG	ACT	GCC	ACC
Ser	Leu	Gly	Leu	Ser 85	Leu	Val	Thr	Ala	Thr 90
GCT	TGT	GGT	CCA	ACT	GCA	CAG	AGA	GCT	TGT
Ala	Cys	Gly	Pro 100	Thr	Ala	Gin	Arg	Ala 105	Cys
AAA	GGT	TCC	TGC	CTC	CTT	CTC	GGC	TCC	AGC
Lys	Gly	Ser 115	Cys	Leu	Leu	Leu	Gly 120	Ser	Ser
GTC	CCT	GCC	TCC	ATG	CCA	GAG	TGT	CCA	AGA
Val	Pro 130	Ala	Ser	Met	Pro	Glu 135	Cys	Pro	Arg
TTC	CTG	ATT	GAT	GGT	TCT	GGC	AGC	ATT	AAC
Phe 145	Leu	Ile	Asp	Gly	Ser 150	Gly	Ser	Ile	Asn
ATG	AAG	GAC	TTT	GTC	AAA	GCT	TTG	ATG	GGA
Met	Lys	Asp	Phe	Val 165	Lys	Ala	Leu	Met	Gly 170
ACC	TTG	TTC	TCC	CTG	ATG	CAA	TAC	TCG	AAC
Thr	Leu	Phe	Ser 180	Leu	Met	Gin	Tyr	Ser 185	Asn
ACC	TTC	ACT	GAA	TTC	AAG	AAC	ATC	CTG	GAC
Thr	Phe	Thr 195	Glu	Phe	Lys	Asn	Ile 200	Leu	Asp
CCC	ATT	GTC	CAG	CTG	CAA	GGC	CTG	ACC	TAC
Pro	Ile 210	Val	Gin	Leu	Gin	Gly 215	Leu	Thr	Tyr
ACA	GTG	ATG	GAA	GAG	CTA	TTT	CAT	AGC	AAG
Thr 225	Val	Met	Glu	Glu	Leu 230	Phe	His	Ser	Lys
GCC	AAG	AAG	ATC	CTC	CTT	GTC	ATC	ACA	GAT
Ala	Lys	Lys	Ile	Leu 245	Leu	Val	Ile	Thr	Asp 250
CCC	CTG	GAG	TAT	AGT	GAT	GTC	ATT	CCC	GCC
Pro	Leu	Glu	Tyr 260	Ser	Asp	Val	Ile	Pro 2 65	Ala
ATT	CGT	TAT	GCT	ATT	GGG	GTG	GGA	GAT	GCC
Ile	Arg	Tyr 275	Ala	Ile	Gly	Val	Gly 280	Asp	Ala
CTG	AAG	GAG	CTG	AAC	ACC	ATT	GGC	TCA	GCT
Leu	Lys 290	Glu	Leu	Asn	Thr	Ile 295	Gly	Ser	Ala

CTA GAG GCA GTG AAC ATG 240

Leu Glu Ala Val Asn Met

80

AAT AAC GCC CAG TTG CTG 288

Asn Asn Ala Gin Leu Leu

GTG AAG AAC ATG TAT GCG 336

Val Lys Asn Met Tyr Ala

110

TTG CAG TTC ATC CAG GCA 384

Leu Gin Phe Ile Gin Ala

125

CAA GAG ATG GAC ATT GCT 432

Gin Glu Met Asp Ile Ala

140

CAA AGG GAC TTT GCC CAG 480

Gin Arg Asp Phe Ala Gin 155 160

GAG TTT GCG AGC ACC AGC 528

Glu Phe Ala Ser Thr Ser

175

ATC CTG AAG ACC CAT TTT 576

Ile Leu Lys Thr His Phe

190

CCT CAG AGC CTG GTG GAT 624

Pro Gin Ser Leu Val Asp

205

ACA GCC ACA GGC ATC CGG 672

Thr Ala Thr Gly Ile Arg

220

AAT GGG TCC CGT AAA AGT 720

Asn Gly Ser Arg Lys Ser 235 240

GGG CAG AAA TAC AGA GAC 768

Gly Gin Lys Tyr Arg Asp

255

GCA GAC AAA GCT GGC ATC 816

Ala Asp Lys Ala Gly Ile

270

TTC CAG GAG CCC ACT GCC 864

Phe Gin Glu Pro Thr Ala

285

CCC CCA CAG GAC CAC GTG 912

Pro Pro Gin Asp His Val

300

164 • · · · • ·

TTC Phe 305

AAG Lys

GTA GGC AAC

TTT Phe 310

GCA GCA CTT

CGC AGC ATC

CAG Gin

AGG Arg

CAA Gin

CTT Leu 320

960

Val

Gly

Asn

Ala

Leu

Arg

Ser 315

Ile

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

TCA

AGG

TCA

AGT

1008

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe 325

Ala

Ile

Glu

Gly

Thr 330

Gin

Ser

Arg

Ser

Ser 335

Ser

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

1056

Ser

Phe

Gin

His 340

Glu

Met

Ser

Gin

Glu 345

Gly

Phe

Ser

Ala 350

Leu

Thr

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GYG

GGA

AGC

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

1104

Ser

Asp

Gly 355

Pro

Val

Leu

Gly

Ala 360

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser 365

Trp

Ser

Gly

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

1152

Gly

Ala 370

Phe

Leu

Tyr

Pro

Pro 375

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr 380

Phe

Ile

Asn

Met

TCT Ser 385

CAG Gin

GAG Glu

AAT Asn

GTG Val

GAC Asp 390

ATG Met

AGA Arg

GAC Asp

TCC Ser

TAC Tyr 395

CTG Leu

GGT Gly

TAC Tyr

TCC Ser

ACC Thr 400

1200

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

1248

Ala

Val

Ala

Phe

Trp 405

Lys

Gly

Val

His

Ser 410

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala 415

Pro

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

GCC

AGG

1296

Arg

His

Gin

His 420

Thr

Gly

Lys

Val

Val 425

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu 430

Ala

Arg

CAT

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

1344

His

Trp

Arg 435

Pro

Lys

Ser

Glu

Val 440

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile 445

Gly

Ser

Tyr

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

1392

Phe

Gly 450

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser 455

Val

Asp

Val

Asp

Arg 460

Asp

Gly

Ser

Xaa

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

1440

Asp 465

Leu

Val

Leu

Ile

Gly 470

Ala

Pro

His

Tyr

Tyr 475

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly 480

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TKC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

1488

Gly

Gin

Val

Ser

Val 485

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly 490

Val

Arg

Gly

Arg

Trp 495

Gin

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GRC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

1536

Cys

Glu

Ala

Thr 500

Leu

His

Gly

Glu

Gin 505

Xaa

His

Pro

Trp

Gly 510

Arg

Phe

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

1584

Gly

Val

Ala 515

Leu

Thr

Val

Leu

Gly 520

Asp

Val

Asn

Gly

Asp 525

Asn

Leu

Ala

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

AGC

AGA

GGT

GCT

GTC

1632

Asp

Val 530

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro 535

Gly

Glu

Ser 540

Arg

Gly

Ala

Val

165 • · · · · ·

1680

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

TCG

AGA

CTG

GAG

ATC

ATG

CCC

TCA

CCC

AGC

Tyr 545

Ile

Phe

His

Gly

Ala 550

Ser

Arg

Leu

Glu

Ile 555

Met

Pro

Ser

Pro

Ser 560

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

Gin

Arg

Val

Thr

Gly 565

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu 570

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe 575

Gly

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

Gin

Ser

Leu

Ser 580

Gly

Gin

Asp

Leu 585

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu 590

Val

Asp

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

Leu

Ala

Val 595

Gly

Ala

Gin

Gly

His 600

Val

Leu

Arg 605

Ser

Leu

Pro

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

Leu

Leu 610

Lys

Val

Glu

Leu

Ser 615

Tle

Arg

Phe

Ala

Pro 620

Met

Glu

Val

Ala

1728

1776

1824

1872

AAG

GCT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GAA

AGG

ACT

CCC

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

Lys 625

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys 630

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro 635

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 640

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 645

Cys

Leu

Thr

Val

His 650

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp 655

Leu

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTA

GAT

CCG

Leu

Gly

Asn

Val 660

Gin

Gly

Ser

Val

Arg 665

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu 670

Asp

Pro

GGC

CGC

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

Gly

Arg

Leu 675

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile 680

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 685

Asn

Cys

Thr

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

Leu

Thr 690

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu 695

Gly

Leu

Gly

Asp

His 700

Cys

Glu

Thr

Val

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

GTG

AGC

CCT

ATC

Lys 705

Leu

Pro

Asp 710

Cys

Val

Glu

Asp

Ala 715

Val

Ser

Pro

Ile

Ile 720

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe 725

Ser

Leu

Val

Arg

Asp 730

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg 735

Asn

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Tle

Thr

Ala

Ser

740 745 750

1920

1968

2016

2064

2112

2160

2208

2256

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

Leu

Pro

Phe 755

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys 760

Gin

Glu

Leu

Cys 765

Glu

Gly

Asp

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GTG

GGA

Leu

Gly 770

Tle

Ser

Phe

Asn

Phe 775

Ser

Gly

Leu

Gin

Val 780

Leu

Val

Gly

2304

2352

166 • · · · • ·

GGC Gly 785

TCC Ser

CCA Pro

GAG Glu

CTC ACT

GTG Val

ACA Thr

GTC Val

ACT Thr

GTG Val 795

TGG Trp

AAT Asn

GAG Glu

GGT Gly

GAG Glu 800

2400

Leu

Thr 790

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

2448

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr 805

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr 810

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu 815

Ser

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

2496

Tyr

Arg

Val 820

Thr

Gly

Thr

Gin

Gin 825

Pro

His

Gin

Tyr

Pro 830

Leu

Arg

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

GAC

CTG

AGG

AGC

2544

Leu

Ala

Cys 835

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala 840

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu 845

Arg

Ser

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCA

AAG

ACC

2592

Ser

Cys 850

Ser

Ile

Asn

His

Pro 855

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly 860

Ala

Lys

Thr

TTC ATG ATC ACA TTC

GAT Asp 870

GTC Val

TCC Ser

TAC AAG

GCC Ala 875

TTC Phe

CTA Leu

GGA Gly

GAC Asp

AGG Arg 880

2640

Phe 865

Met

Ile

Thr

Phe

Tyr

Lys

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

2688

Leu

Arg

Ala 885

Lys

Ala

Ser

Glu 890

Asn

Lys

Pro

Asp 895

Thr

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

AAG

TAC

ACC

GTC

TAT

2736

Asn

Lys

Thr

Ala 900

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu 905

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr 910

Val

Tyr

ACC

CTG

ATC

AGT

AGG

CAA

GAA

GAT

TCC

ACC

AAC

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

2784

Thr

Leu

Ile 915

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp 920

Ser

Thr

Asn

His

Val 925

Asn

Phe

Ser

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

2832

Ser

Ser 930

His

Gly

Arg

Arg 935

Gin

Glu

Ala

His 940

Arg

Tyr

Arg

Val

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

2880

Asn 945

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu 950

Lys

Leu

Ala

Val

Arg 955

Val

Asn

Phe

Trp

Val 960

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

GTG

ACT

CTG

AGC

2928

Pro

Val

Leu

Asn 965

Gly

Val

Ala

Val

Trp 970

Asp

Val

Thr

Leu

Ser 975

Ser

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC

GTG

TCC

CAG

ATG

AAA

CCT

CAG

AAT

2976

Pro

Ala

Gin

Gly 980

Val

Ser

Cys

Val

Ser 985

Gin

Met

Lys

Pro

Pro 990

Gin

Asn

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

CGT

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

3024

Pro

Asp

Phe 995

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin Arg 1000

Arg

Ser

Val

Leu Asp 1005

Cys

Ser

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TCC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

GAC

ATC

3072

Tle

Ala Asp 1010

Cys

Leu

His

Ser Arg 1015

Cys

Asp

Ile

Pro Ser 1020

Leu

Asp

Ile

167 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · ···· • · · · · ···· • · · · · · · ···· · • · ···· ··· ···· · ·· ·· ·« ··

CAG GAT Gin Asp 1025

GAA Glu

CTT Leu

GAC Asp

TTC ATT Phe Ile 1030

CTG Leu

AGG Arg

GGC Gly

AAC CTC Asn Leu 1035

AGC Ser

TTC Phe

GGC Gly

TGG Trp 1040

3120

GTC AGT

CAG

ACA

TTG

CAG GAA

AAG

GTG

TTG

CTT GTG

AGT

GAG

GCT

GAA

3168

Val Ser

Gin

Thr

Leu

Gin Glu

Lys

Val

Leu

Leu Val

Ser

Glu

Ala

Glu

1045

1050

1055

ATC ACT

TTC

GAC

ACA

TCT GTG

TAC

TCC

CAG

CTG CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

3216

Ile Thr

Phe

Asp

Thr

Ser Val

Tyr

Ser

Gin

Leu Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

1060

1065

1070

TTT CTG

AGA

GCC

CAG

GTG GAG

ACA

ACG

TTA

GAA GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

3264

Phe Leu

Arg

Ala

Gin

Val Glu

Thr

Leu

Glu Glu

Tyr

Val

Tyr

1075

1080

1085

GAG CCC

ATC

TTC

CTC

GTG GCG

GGC

AGC

TCG

GTG GGA

GGT

CTG

TTA

3312

Glu Pro

Ile

Phe

Leu

Val Ala

Gly

Ser

Val Gly

Gly

Leu

1090

1095

1100

CTG GCT

CTC

ATC

ACA

GTG GTA

CTG

TAC

AAG

CTT GGC

TYC

AAA

CGT

3360

Leu Ala

Leu

Ile

Thr

Val Val

Leu

Tyr

Lys

Leu Gly

Xaa

Lys

Arg

1105

1110

1115

1120

CAG TAC

AAA

GAA

ATG

CTG GAC

GGC

AAG

GCT

GCA GAT

CCT

GTC

ACA

GCC

3408

Gin Tyr

Lys

Glu

Met

Leu Asp

Gly

Lys

Ala

Ala Asp

Pro

Val

Thr

Ala

1125

1130

1135

GGC CAG

GCA

GAT

TTC

GGC TGT

GAG

ACT

CCT

CCA TAT

CTC

GTG

AGC

TAGGAATCCA

3463

Gly Gin

Ala

Asp

Phe

Gly Cys

Glu

Thr

Pro

Pro Tyr

Leu

Val

Ser

1140

1145

1150

CTCTCCTGCC TATCTCTGNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA

3523

CGAGT

3528

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1151 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

	(ii)	TYP MOLEKULY:	: protein
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEK. ID.	Č. :	37:
Gly 1	Trp Ala	Leu Ala Ser 5	Cys His Gly	Ser 10	Asn	Leu	Asp	Val	Glu 15	Glu
Pro	Ile Val	Phe Arg Glu 20	Asp Ala Ala 25	Ser	Phe	Gly	Gin	Thr 30	Val	Val
Gin	Phe Gly 35	Gly Ser Arg	Leu Val Val 40	Gly	Ala	Pro	Leu 45	Glu	Ala	Val
Ala	Val Asn 50	Gin Thr Gly	Arg Leu Tyr 55	Asp	Cys	Ala 60	Pro	Ala	Thr	Gly

168 ·« ···· ·· ···· ·· ·· « · · · · · · · ·

Met 65

Cys

Gin

Pro

Ile Val 70

Leu

Arg

Ser

Pro

Leu Glu Ala Val Asn Met

75

80

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

85

90

95

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

115

120

125

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

130

135

140

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

145

150

155

160

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

180

185

190

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

Ile

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

195

200

205

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

210

215

220

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

Ala

Lys

Ile

Leu

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

Ile

260

265

270

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

275

280

285

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

290

295

300

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Leu

305

310

315

320

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

325

330

335

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

355

360

365

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

370

375

380

169 • · · · · · • · · · · ·

Ser Gin Glu Asn Val Asp

Met Arg Asp

Ser

Tyr 395

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr 400

385

390

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

450

455

460

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465

470

475

480

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

485

490

495

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Xaa

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

500

505

510

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

530

535

540

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

Ile

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

545

550

555

560

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

585

590

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

595

600

605

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

610

615

620

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

625

630

635

640

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

660

665

670

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

690

695

700

170

0 ·0· 0 • 0 0 0 0 0

Lys 705

Leu

Pro

Asp 710

Cys

Val

Glu

Asp

Ala 715

Val

Ser

Pro

Ile

Ile 720

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

725

730

735

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Ile

Thr

Ala

Ser

740

745

750

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

755

760

765

Leu

Gly

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Gly

770

775

780

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

785

790

795

800

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

805

810

815

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

820

825

830

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

835

840

845

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

850

855

860

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

865

870

875

880

Leu

Arg

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

885

890

895

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

900

905

910

Thr

Leu

Ile

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

915

920

925

Ser

His

Gly

Arg

Gin

Glu

Ala

His

Arg

Tyr

Arg

Val

930

935

940

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

945

950

955

960

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Ser

965

970

975

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

Cys

Val

Ser

Gin

Met

Lys

Pro

Gin

Asn

980

985

990

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin

Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

995

1000

1005

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Ser

Arg

Cys

Asp

Ile

Pro

Ser

Leu

Asp

Ile

1010

1015

1020

171 • · · · · · ···· ·· ··· ···· • · · · · «· · · · · · • · · · · · · · · ···· · flfl ·· «· ·· ·· ·«·«

Gin 1025

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe 103C

Ile )

Leu

Arg

Gly Asn 1035

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp 1040

Val

Ser

Gin

Thr

Leu 1045

Gin 1

Glu

Lys

Val

Leu 105C

Leu 1

Val

Ser

Glu

Ala 1055

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp 106C

Thr 1

Ser

Val

Tyr

Ser 1065

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin 1070

Glu 1

Ala

Phe

Leu

Arg 1075

Ala

Gin

Val

Glu

Thr 108C

Thr )

Leu

Glu

Tyr Val 1085

Val

Tyr

Glu

Pro 109C

Ile )

Phe

Leu

Val

Ala 1095

Gly

Ser

Val

Gly 110C

Gly 1

Leu

Leu 1105

Ala

Leu

Ile

Thr

Val nic

Val 1

Leu

Tyr

Lys

Leu 1115

Gly >

Xaa

Lys

Arg 1120

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met 1125

Leu

Asp

Gly

Lys

Ala 1130

Ala

Asp

Pro

Val

Thr 1135

Ala

Gly

Gin

Ala

Asp 1140

Phe 1

Gly

Cys

Glu

Thr 1145

Pro

Tyr

Leu

Val 1150

Ser

(2)

INFORMACE 0

SEK.

ID.

Č. :

38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:38:

GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:39:

GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

172 ·· fefe fefe · fefe · fefefefe • · fefe · fefefefe • · fefe · fefe fefefefe · • · fefefefe fefefe • fefefefe fefe fefe ·· fefe • fe fefe·· • · fefefe· (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:40:

TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:41:

GGAAACAGCT ATGACCATG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:42:

GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:43:

GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:44:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38

173

4444

44 ř · · 4

Β · · ·

944 4 9

4 4

44 ·· 4444

Β ·

Β · ·

4 (2) INFORMACE Ο SEK. ID. Č.:45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3519 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 52..3519 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:45:

GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC 57

Met Val

CGT Arg

GGA Gly

GTT Val 5

GTG Val

ATC Ile

CTC Leu

CTG Leu

TGT Cys 10

GGC Gly

TGG Trp

GCC Ala

CTG Leu

GCT Ala 15

TCC Ser

TGT Cys

CAT His

105

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

GAT

GCA

153

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

Asp

Ala

20

25

30

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

201

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

50

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CAG

TCG

249

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Gin

Ser

55

60

65

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

GCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

CTG

CAC

297

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

Ile

Leu

His

70

75

80

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

GCT

345

Ile

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

85

90

95

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

393

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

100

105

110

GCT

TGT

GCA

AAG

AAC

ATG

TAT

GCA

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTG

GGC

441

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

130

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

GAG

TGT

489

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

Glu

Cys

135

140

145

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

GGC

AGC

537

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

150 155 160

174

ATT Ile

GAT Asp

CAA Gin 165

AGT Ser

GAC Asp

TTT ACC

CAG Gin 170

ATG AAG

GAC Asp

TTC Phe

GTC Val 175

AAA Lys

GCT Ala

TTG Leu

585

Phe

Thr

Met

Lys

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

633

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

AGC

681

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Ser

195

200

205

210

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

GGC

CTG

729

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

215

220

225

ACG

TAC

ACA

GCC

TCG

GGC

ATC

CAG

AAA

GTG

AAA

GAG

CTA

TTT

CAT

777

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Phe

His

230

235

240

AGC AAG

AAT Asn 245

GGG Gly

GCC Ala

CGA Arg

AAA AGT

GCC Ala

AAG Lys

AAG ATA CTA ATT

GTC Val

ATC Ile

825

Ser

Lys

Ser 250

Lys

Ile

Leu 255

Ile

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TTC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGA

CAT

GTC

ATC

873

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

Val

Ile

260

265

270

CCT

GAA

GCA

GAG

AAA

GCT

GGG

ATC

ATT

CGC

TAT

GCT

ATA

GGG

GTG

GGA

921

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

290

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

969

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Gly

295

300

305

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

GTA

GCA

1017

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

310

315

320

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

ATT

GAA

1065

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

325

330

335

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

1113

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGT

TTC

AGC

TCA

GCT

CTC

TCA

ATG

GAT

GGA

CCA

GTT

CTG

GGG

GCT

1161

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

355

360

365

370

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

TCA

AAT

1209

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Ser

Asn

375

380

385

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

ATG

AGG

1257

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

Met

Arg

390

395

400

175 • ·

GAC Asp

GCT Ala

TAC Tyr 405

CTG Leu

GGT Gly

TAC Tyr

TCC Ser

ACC Thr 410

GCA Ala

CTG GCC Leu Ala

TTT Phe

TGG Trp 415

AAG Lys

GGG Gly

GTC Val

1305

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

1353

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

420

425

430

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

TCC

AGG

CAC

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

1401

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

435

440

445

450

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTT

GGG

GCA

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

1449

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

455

460

465

GAC

ATG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACT

GAC

CTG

GTC

CTG

ATT

GGA

GTC

CCC

1497

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Val

Pro

470

475

480

CAT His

TAC Tyr

TAT Tyr 485

GAG Glu

CAC His

ACC Thr

CGA GGG GGG Arg Gly Gly 490

CAG Gin

GTG Val

TCG Ser

GTG Val 495

TGC Cys

CCC Pro

ATG Met

1545

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

GGG

GAG

1593

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

Gly

Glu

500

505

510

CAG

GGC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTA

GGG

1641

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

530

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

CCC

GGA

1689

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

535

540

545

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

TCG

AGA

1737

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Arg

550

555

560

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

1785

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

565

570

575

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1833

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

1881

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

595

600

605

610

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

TCC

ATT

1929

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

Ser

Ile

615

620

625

AGA

TTT

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GGA

1977

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Gly

630

635

640

176 • · · ·

AGG ACT

CCC Pro 645

ACT Thr

GTC Val

CTC Leu

GAA Glu

GCT Ala 650

GGA Gly

GAG Glu

GCC Ala

ACC Thr

GTC Val 655

TGT Cys

CTC Leu

ACT Thr

2025

Arg

Thr

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

TCT

GTC

2073

Val

Arg 660

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asp

Val 670

Gin

Ser

Val

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

2121

Arg 675

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu 680

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu 685

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile 690

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

2169

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Arg

Lys

Thr

Leu 705

Gly

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

ATG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAC

TGT

GTG

2217

Leu

Gly

Asp

His 710

Cys

Glu

Thr

Met

Lys 715

Leu

Pro

Asp 720

Cys

Val

GAG Glu

GAT Asp

GCA Ala 725

GTG Val

ACC Thr

CCT Pro

ATC ATC

CTG Leu

CGC Arg

CTT Leu

AAC Asn

TTA Leu 735

TCC Ser

CTG Leu

GCA Ala

2265

Ile

Ile 730

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

2313

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

740

745

750

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

GAG

2361

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Glu

755

760

765

770

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

2409

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

775

780

785

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

2457

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

790

795

800

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

2505

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Ile

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

805

810

815

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

GCC

CAG

CAA

CCT

CAT

CCG

TAC

CCA

2553

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

Tyr

Pro

820

825

830

CTA

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

2601

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

835

840

845

850

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

2649

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

855

860

865

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

2697

Ala

Thr

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

870

875

880

177 • · · ·

GAC Asp

AGG Arg

TTG Leu 885

CTT Leu

CTG AGG Leu Arg

GCC Ala

AGC Ser 890

GCA Ala

AGC Ser

AGT Ser

GAG AAT AAT AAG CCT

2745

Glu

Asn 895

Asn

Lys

Pro

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

2793

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

900

905

910

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

2841

Val

Tyr

Thr

Val

Ile

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Lys

His

Phe

Asn

915

920

925

930

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

CAG

AAA

GAG

GCC

GAA

CAT

CGA

TAT

2889

Phe

Ser

His

Gly

Glu

Arg

Gin

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

935

940

945

CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

TTG

ACG

CTG

GCC

ATC

AGC

GTT

AAC

TTC

2937

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Thr

Leu

Ala

Ile

Ser

Val

Asn

Phe

950

955

960

TGG Trp

GTC Val

CCC Pro 965

ATC Ile

CTT Leu

CTG Leu

AAT Asn

GGT Gly 970

GTG Val

GCC Ala

GTG Val

TGG Trp

GAT Asp 975

GTG Val

ACT Thr

CTG Leu

2985

AGG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGT

GTG

TCA

CAG

AGG

GAA

CCT

3033

Arg

Ser 980

Pro

Ala

Gin

Gly

Val 985

Ser

Cys

Val

Ser

Gin 990

Arg

Glu

Pro

CAA

CAT

TCC

GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

ATC

CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC

3081

Gin 995

His

Ser

Asp

Leu

Leu Thr 1000

Gin

Ile

Gin

Gly Arg 1005

Ser

Val

Leu

Asp 1010

TGC

GCC

ATC

GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

CTC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

3129

Cys

Ala

Ile

Ala

Asp Cys 1015

Leu

His

Leu

Arg Cys 1020

Asp

Ile

Pro

Ser 1025

Leu

GGC

ACC

CTG

GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

ATT

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

3177

Gly

Thr

Leu

Asp Glu 1030

Leu

Asp

Phe

Ile Leu 1035

Lys

Gly

Asn

Leu 104C

Ser )

Phe

GGC

TGG

ATC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

AAA

AAG

GTG

TTG

CTC

CTG

AGT

GAG

3225

Gly

Trp

Ile Ser 1045

Gin

Thr

Leu

Gin Lys 1050

Lys

Val

Leu

Leu Leu 1055

Ser

Glu

GCT

GAA

ATC

ACA

TTC

AAC

ACA

TCT

GTG

TAT

TCC

CAG

CTG

CCG

GGA

CAG

3273

Ala

Glu Ile 1060

Thr

Phe

Asn

Thr Ser 1065

Val

Tyr

Ser

Gin 107C

Leu )

Pro

Gly

Gin

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

TCA

ACG

ATG

CTA

GAA

TAC

GTG

3321

Glu 1075

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala Gin 1080

Val

Ser

Thr

Met 1085

Leu

Glu

Tyr

Val 1090

GTC

TAT

GAG

CCC

GTC

TTC

CTC

ATG

GTG

TTC

AGC

TCA

GTG

GGA

GGT

CTG

3369

Val

Tyr

Glu

Pro

Val 1095

Phe 1

Leu

Met

Val

Phe noc

Ser 1

Ser

Val

Gly

Gly 1105

Leu

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACT

GTG

GCG

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

3417

Leu

Ala 1110

Leu 1

Ile

Thr

Val

Ala 1115

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly 1120

Phe 1

Phe

178 • · · · • · • * • · · · · • · · ·· ··

AAA Lys	CGT Arg	CAG TAT Gin Tyr 1125	AAA Lys	GAG ATG CTG GAT	CTA CCA	TCT Ser	GCA GAT Ala Asp 1135	CCT Pro	GAC Asp
Glu Met	Leu Asp 1130	Leu	Pro
CCA	GCC	GGC CAG	GCA	GAT TCC	AAC CAT	GAG	ACT	CCT	CCA CAT	CTC	ACG
Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr 1140 1145 TCC TAG Ser 1155 (2) INFORMACE 0 SEK. ID. Č.:46: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1155 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:46:	Pro Pro His 1150	Leu	Thr
Met 1	Val	Arg Gly	Val 5	Val Ile	Leu Leu	Cys 10	Gly	Trp	Ala Leu	Ala 15	Ser
Cys	His	Gly Ser 20	Asn	Leu Asp	Val Glu 25	Lys	Pro	Val	Val Phe 30	Lys	Glu
Asp	Ala	Ala Ser 35	Phe	Gly Gin	Thr Val 40	Val	Gin	Phe	Gly Gly 45	Ser	Arg
Leu	Val 50	Val Gly	Ala	Pro Leu 55	Glu Ala	Val	Ala	Val 60	Asn Gin	Thr	Gly
Gin 65	Ser	Ser Asp	Cys	Pro Pro 70	Ala Thr	Gly	Val 75	Cys	Gin Pro	Ile	Leu 80
Leu	His	Ile Pro	Leu 85	Glu Ala	Val Asn	Met 90	Ser	Leu	Gly Leu	Ser 95	Leu
Val	Ala	Asp Thr 100	Asn	Asn Ser	Gin Leu 105	Leu	Ala	Cys	Gly Pro 110	Thr	Ala
Gin	Arg	Ala Cys 115	Ala	Lys Asn	Met Tyr 120	Ala	Lys	Gly	Ser Cys 125	Leu	Leu
Leu	Gly 130	Ser Ser	Leu	Gin Phe 135	Ile Gin	Ala	Ile	Pro 140	Ala Thr	Met	Pro
Glu 145	Cys	Pro Gly	Gin	Glu Met 150	Asp Ile	Ala	Phe 155	Leu	Ile Asp	Gly	Ser 160
Gly	Ser	Ile Asp	Gin 165	Ser Asp	Phe Thr	Gin 170	Met	Lys	Asp Phe	Val 175	Lys
Ala	Leu	Met Gly 180	Gin	Leu Ala	Ser Thr 185	Ser	Thr	Ser	Phe Ser 190	Leu	Met

3465

3513

3519

179 • · · · · · · · · ····· ·· ·· ·· · *

Gin

Tyr

Ser 195

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr 200

His

Phe

Thr

Phe

Thr 205

Glu

Phe

Lys

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

245

250

255

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

Val

Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

325

330

335

Ile

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

Met

Arg

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

465

470

475

480

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

500

505

510

180 • · ·· · · · · · • » ·· · · · ···· · • · · · » · ··· ····· · · · · · · ··

Gly Glu Gin 515

Gly His

Pro

Trp Gly Arg 520

Phe

Gly

Ala

Ala 525

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

610

615

620

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

675

680

685

Ala

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

Leu

Ala

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

770

775

780

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

785

790

795

800

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Ile

Lys

Phe

Tyr

Pro

805

810

815

Ala

Glu

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

820

825

830

181 • · · • · ···· · · · ····« ·· · · ·· ··

Tyr

Pro

Leu Arg 835

Leu

Ala Cys

Glu 840

Ala

Glu

Pro

Thr

Gly 845

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg 850

Ser Ser

Ser

Cys Ser 855

Ile

Asn

His

Pro

Ile 860

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala 865

Lys

Ala Thr

Phe

Met Ile 870

Thr

Phe

Asp

Val 875

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe 880

Leu

Gly

Asp Arg

Leu 885

Leu Leu

Arg

Ala

Ser 890

Ala

Ser

Glu

Asn 895

Asn

Lys

Pro

Glu Thr 900

Ser

Lys Thr

Ala

Phe 905

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro 910

Val

Lys

Tyr

Thr

Val Tyr 915

Thr

Val Ile

Ser 920

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser 925

Thr

Lys

His

Phe

Asn 930

Phe Ser

Ser

Ser His 935

Gly

Glu

Arg

Gin

Lys 940

Glu

Ala

Glu

His

Arg 945

Tyr

Arg Val

Asn

Asn Leu 950

Ser

Pro

Leu

Thr 955

Leu

Ala

Ile

Ser

Val 960

Asn

Phe

Trp Val

Pro 965

Ile Leu

Leu

Asn

Gly 970

Val

Ala

Val

Trp

Asp 975

Val

Thr

Leu

Arg Ser 980

Pro

Ala Gin

Gly

Val 985

Ser

Cys

Val

Ser

Gin 990

Arg

Glu

Pro

Gin His 995

Ser

Asp Leu

Leu Thr 1000

Gin

Ile

Gin

Gly 1005

Arg

Ser

Val

Leu

Asp Cys Ala 1010

Ile

Ala Asp Cys 1015

Leu

His

Leu

Arg 102C

Cys 1

Asp

Ile

Pro

Ser 1025

Leu

Gly Thr

Leu

Asp Glu 1030

Leu

Asp

Phe

Ile Leu 1035

Lys

Gly

Asn

Leu 1040

Ser

Phe

Gly Trp

Ile Ser Gin 1045

Thr

Leu

Gin Lys 1050

Lys

Val

Leu

Leu Leu 1055

Ser

Glu

Ala Glu 106C

Ile 1

Thr Phe

Asn

Thr Ser 1065

Val

Tyr

Ser

Gin Leu 1070

Pro

Gly

Gin

Glu Ala 1075

Phe

Leu Arg

Ala Gin 1080

Val

Ser

Thr

Met 1085

Leu

Glu

Tyr

Val Val Tyr 1090

Glu

Pro Val 1095

Phe

Leu

Met

Val

Phe noc

Ser 1

Ser

Val

Gly

Gly 1105

Leu

Leu Leu

Leu

Ala Leu 1110

Ile

Thr

Val

Ala Leu 1115

Tyr

Lys

Leu

Gly 1120

Phe

Lys Arg

Gin

Tyr Lys

Glu

Met

Leu

Asp

Leu

Pro

Ser

Ala

Asp

1125 1130 1135

182 ··

Pro Asp Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His

1140 1145 1150

Leu Thr Ser 1155 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:47:

AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:48:

GCTGGACGAT GGCATCCAC 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:49:

GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:50:

GCAGCCAGCT TCGGACAGAC 20

183 • ·· · • · ···· · · · • · · · · ·· · · ·· ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:51:

CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3803 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3486 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:52:

ATG Met 1

GTC Val

CGT Arg

GGA Gly

GTT Val 5

GTG Val

ATC Ile

CTC Leu

CTG Leu

TGT Cys 10

GGC Gly

TGG Trp

GCC Ala

CTG Leu

GCT Ala 15

TCC Ser

48

TGT

CAT

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

96

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

GAT

GCA

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

144

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

35

40

45

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

192

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

CAG

TCG

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

GCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

240

Gin

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

Ile

Leu

65

70

75

80

CTG

CAC

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

288

Leu

His

Ile

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

GTG

GCT

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

336

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100 105 110

184 ·· ··

CAG

AGA

GCT

TGT

GCA

AAG

AAC

ATG

TAT

GCA

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

Gin

Arg

Ala 115

Cys

Ala

Lys

Asn

Met 120

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser 125

Cys

Leu

CTG

GGC

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

Leu

Gly 130

Ser

Leu

Gin

Phe 135

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro 140

Ala

Thr

Met

Pro

GAG

TGT

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

Glu 145

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu 150

Met

Asp

Ile

Ala

Phe 155

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser 160

GGC

AGC

ATT

GAT

CAA

AGT

GAC

TTT

ACC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTC

GTC

AAA

Gly

Ser

Ile

Asp

Gin 165

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin 170

Met

Lys

Asp

Phe

Val 175

Lys

GCT

TTG

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

Ala

Leu

Met

Gly 180

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr 185

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser 190

Leu

Met

CAA

TAC

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

Gin

Tyr

Ser 195

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr 200

His

Phe

Thr

Phe

Thr 205

Glu

Phe

Lys

AGC

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

Ser

Ser 210

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser 215

Leu

Val

Asp

Ala

Ile 220

Val

Gin

Leu

Gin

384

432

480

528

576

624

672

GGC Gly 225

CTG ACG

TAC Tyr

ACA GCC

TCG Ser

GGC Gly

ATC Ile

CAG Gin

AAA Lys 235

GTG Val

AAA Lys

GAG Glu

CTA Leu 240

Leu

Thr

Ala 230

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATA

CTA

ATT

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

245

250

255

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TTC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGA

CAT

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

GTC

ATC

CCT

GAA

GCA

GAG

AAA

GCT

GGG

ATC

ATT

CGC

TAT

GCT

ATA

GGG

Val

Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

GTA

GCA

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

325

330

335

ATT

GAA

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

Ile

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

720

768

816

864

912

960

1008

1056

185 * · ···· ·· ··

TCA CAA

GAA GGT

TTC Phe

AGC Ser

TCA Ser

GCT Ala 360

CTC Leu

TCA ATG Ser Met

GAT Asp

GGA Gly 365

CCA Pro

GTT Val

CTG Leu

Ser

Gin

Glu 355

Gly

GGG

GCT

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

TCA

AAT

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

ATG

AGG

GAC

GCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

CTG

GCC

TTT

TGG

AAG

Met

Arg

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

GGG

GTC

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

TCC

AGG

CAC

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTT

GGG

GCA

TCT

CTC

TGT

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

TCT

GTG

GAC

ATG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACT

GAC

CTG

GTC

CTG

ATT

GGA

Ser 465

Val

Asp

Met

Asp

Arg 470

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp 475

Leu

Val

Leu

Ile

Gly 480

GTC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAC

ACC

CGA

GGG

CAG

GTG

TCG

GTG

TGC

Val

Pro

His

Tyr

Tyr 485

Glu

His

Thr

Arg

Gly 490

Gly

Gin

Val

Ser

Val 495

Cys

CCC

ATG

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

Pro

Met

Pro

Gly 500

Val

Arg

Ser

Arg

Trp 505

His

Cys

Gly

Thr

Thr 510

Leu

His

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

Gly

Glu

Gin 515

Gly

His

Pro

Trp

Gly 520

Arg

Phe

Gly

Ala

Ala 525

Leu

Thr

Val

CTA

GGG

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

Leu

Gly 530

Asp

Val

Asn

Gly

Asp 535

Ser

Leu

Ala

Asp

Val 540

Ala

Ile

Gly

Ala

CCC

GGA

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

Pro 545

Gly

Glu

Asn 550

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr 555

Ile

Phe

His

Gly

Ala 560

TCG

AGA

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

Ser

Arg

Gin

Asp

Ile 565

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser 570

Gin

Arg

Val

Thr

Gly 575

Ser

CAG

CTC

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

Gin

Leu

Phe

Leu 580

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe 585

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser 590

Gly

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

186 ·· «··· «» ···· ·· ·· ©β · · · · ···· • · · · · · · · · • · · · ♦ · · · · · · · • · ···· ··· ·«·©· ·· · · ·· · ·

CAG Gin

GAC Asp

CTT ACA CAG

GAT Asp

GGC Gly

CTG Leu 600

GTG Val

GAC Asp

CTG Leu

GCC Ala

GTG Val 605

GGA Gly

GCC Ala

CAG Gin

1824

Leu 595

Thr

Gin

GGG

CAC

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

1872

Gly

His 610

Val

Leu

Arg 615

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu 620

Lys

Val

Gly

Ile

TCC

ATT

AGA

TTT

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

1920

Ser 625

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro 630

Ser

Glu

Val

Ala

Lys 635

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys 640

TGG

GGA

AGG

ACT

CCC

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACC

GTC

TGT

1968

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro 645

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

CTC

ACT

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

2016

Leu

Thr

Val

Arg 660

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asp

Val 670

Gin

Ser

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

2064

Ser

Val

Arg 675

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu 680

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu 685

Ile

Ser

Arg

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

2112

Ala

Ile 690

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Arg

Lys

Thr

CTG Leu 705

GGG Gly

CTT Leu

GGT Gly

GAT Asp

CAC His 710

TGC Cys

GAA ACA ATG

AAG Lys 715

CTG Leu

CTT Leu

TTG Leu

CCA Pro

GAC Asp 720

2160

Glu

Thr

Met

TGT

GTG

GAG

GAT

GCA

GTG

ACC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTT

AAC

TTA

TCC

2208

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

CTG

GCA

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

2256

Leu

Ala

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

2304

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

TGT

AAG

CAG

GAG

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

2352

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

770

775

780

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

2400

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

2448

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

2496

Ile

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

820

825

830

187

99

9 9

99

999 9 · • · 9

99 ·· ·*·· • · · • · • · • · • fe·· · ·· ···· • · · • · · • · · · • · · ·

99

GCC Ala

CAG Gin

CAA Gin 835

CCT Pro

CAT His

CCG Pro

TAC Tyr

CCA CTA CGC

CTG Leu

GCA Ala

TGT Cys 845

GAG Glu

GCT Ala

GAG Glu

2544

Pro 840

Leu

Arg

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

2592

Pro

Thr 850

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu 855

Arg

Ser

Cys 860

Ser

Ile

Asn

His

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

2640

Pro 865

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly 870

Ala

Lys

Ala

Thr

Phe 875

Met

Ile

Thr

Phe

Asp 880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AGC

2688

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala 885

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg 890

Leu

Arg

Ala 895

Ser

GCA

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

2736

Ala

Ser

Glu 900

Asn

Lys

Pro

Glu 905

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala 910

Phe

Gin

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

2784

Leu

Glu

Leu 915

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr 920

Val

Tyr

Thr

Val

Ile 925

Ser

Arg

Gin

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

2832

Glu

Asp 930

Ser

Thr

Lys

His

Phe 935

Asn

Phe

Ser

Ser 940

His

Gly

Glu

Arg

CAG Gin 945

AAA Lys

GAG Glu

GCC Ala

GAA CAT

CGA Arg

TAT Tyr

CGT Arg

GTG AAT AAC Val Asn Asn 955

CTG Leu

AGT Ser

CCA Pro

TTG Leu 960

2880

Glu

His 950

ACG

CTG

GCC

ATC

AGC

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC CCC ATC

CTT

CTG

AAT

GGT

2928

Thr

Leu

Ala

Ile

Ser 965

Val

Asn

Phe

Trp

Val Pro Ile 970

Leu

Asn 975

Gly

GTG

GCC

GTG

TGG

GAT

GTG

ACT

CTG

AGG

AGC CCA GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

2976

Val

Ala

Val

Trp 980

Asp

Val

Thr

Leu

Arg 985

Ser Pro Ala

Gin

Gly 990

Val

Ser

TGT

GTG

TCA

CAG

AGG

GAA

CCT

CAA

CAT TCC GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

3024

Cys

Val

Ser 995

Gin

Arg

Glu

Pro

Pro Gin 1000

His Ser Asp

Leu Leu 1005

Thr

Gin

ATC

CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

GCC ATC GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

3072

Ile

Gin Gly 1010

Arg

Ser

Val

Leu Asp 1015

Cys

Ala Ile Ala 102C

Asp )

Cys

Leu

His

CTC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

GGC

ACC CTG GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

3120

Leu Arg 1025

Cys

Asp

Ile

Pro Ser 1030

Leu

Gly

Thr Leu Asp 1035

Glu

Leu

Asp

Phe 1040

ATT

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

GGC

TGG ATC AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

3168

Ile

Leu

Lys

Gly

Asn 1045

Leu 1

Ser

Phe

Gly

Trp Ile Ser 1050

Gin

Thr

Leu 1055

Gin

AAA

AAG

GTG

TTG

CTC

CTG

AGT

GAG

GCT

GAA ATC ACA

TTC

AAC

ACA

TCT

3216

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Ala

Glu Ile Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

1060 1065 1070

188

GTG Val	TAT Tyr	TCC CAG Ser Gin 1075	CTG Leu	CCG Pro	GGA Gly	CAG GAG Gin Glu 1080	GCA Ala	TTT Phe	CTG AGA GCC Leu Arg Ala 1085	CAG Gin	GTG Val
TCA	ACG	ATG CTA	GAA	GAA	TAC	GTG GTC	TAT	GAG	CCC GTC TTC	CTC	ATG
Ser	Thr 109C	Met Leu )	Glu	Glu	Tyr Val Val 1095	Tyr	Glu	Pro Val Phe 1100	Leu	Met
GTG	TTC	AGC TCA	GTG	GGA	GGT	CTG CTG	TTA	CTG	GCT CTC ATC	ACT	GTG
Val 1105	Phe 1	Ser Ser	Val	Gly 111C	Gly 1	Leu Leu	Leu	Leu 1115	Ala Leu Ile	Thr	Val 1120
GCG	CTG	TAC AAG	CTT	GGC	TTC	TTC AAA	CGT	CAG	TAT AAA GAG	ATG	CTG
Ala	Leu	Tyr Lys	Leu 1125	Gly	Phe	Phe Lys	Arg 113C	Gin 1	Tyr Lys Glu	Met Leu 1135
GAT	CTA	CCA TCT	GCA	GAT	CCT	GAC CCA	GCC	GGC	CAG GCA GAT	TCC	AAC
Asp	Leu	Pro Ser 114C	Ala 1	Asp	Pro	Asp Pro 1145	Ala 1	Gly	Gin Ala Asp 115C	Ser 1	Asn

3264

3312

3360

3408

3456

CAT	GAG	ACT	CCT	CCA	CAT	CTC	ACG	TCC TAGGAATCTA CTTTCCTGTA	3503
His	Glu	Thr	Pro	Pro	His	Leu	Thr	Ser

1155	1160
TATCTCCACA	ATTACGAGAT	TGGTTTTGCT	TTTGCCTATG	AATCTACTGG	CATGGGAACA	3563
AGTTCTCTTC	AGCTCTGGGC	TAGCCTGGGA	AACTTCCCAG	AAATGATGCC	CTACCTCCTG	3623
AGCTGGGAGA	TTTTTATGGT	TTGCCCATGT	GTCAGATTTC	AGTGCTGATC	CACTTTTTTT	3683
GCAAGAGCAG	GAATGGGGTC	AGCATAAATT	TACATATGGA	TAAGAACTAA	CACAAGACTG	3743
AGTAATATGC	TCAATATTCA	ATGTATTGCT	TGTATAAATT	TTTAAAAAAT	AAAATGAAAN	3803

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

	(ii) TYP MOLEKULY:	: protein
	(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID.	Č. :	53:
Met 1	Val Arg Gly Val Val 5	Ile Leu Leu	Cys 10	Gly	Trp	Ala	Leu	Ala 15	Ser
Cys	His Gly Ser Asn Leu 20	Asp Val Glu 25	Lys	Pro	Val	Val	Phe 30	Lys	Glu
Asp	Ala Ala Ser Phe Gly 35	Gin Thr Val 40	Val	Gin	Phe	Gly 45	Gly	Ser	Arg
Leu	Val Val Gly Ala Pro 50	Leu Glu Ala 55	Val	Ala	Val 60	Asn	Gin	Thr	Gly
Gin 65	Ser Ser Asp Cys Pro 70	Pro Ala Thr	Gly	Val 75	Cys	Gin	Pro	Tle	Leu 80

189 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · • · · 4 · ···· • · ·· · 4 · ···· · • · ···· · · · ····< 4 4 · · ·· 4 ·

Leu

His

Ile

Pro

Leu Glu Ala Val Asn Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser 95

Leu

85

90

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

130

135

140

Glu

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

Gly

Ser

Ile

Asp

Gin

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

Ala

Leu

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

245

250

255

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

Val

Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

325

330

335

Ile

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385 390 395 400

190 •9 9 999

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • · « ·· 9 9 9 9 99

Met Arg

Asp Ala

Tyr 405

Leu

Gly Tyr

Ser Thr 410

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp 415

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

465

470

475

480

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

500

505

510

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

610

615

620

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

675

680

685

Ala

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

705 710 715 720

191 • · • ·

	• · • • • • · · ·	• • • « • •	• · · · · · · • « · · · · ·
> · u • a • ·	• · · a · · · ' a · · · · • · · · · ·
Cys Val Glu Asp	Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu	Asn	Leu	Ser
	725 730		735
Leu Ala Gly Asp	Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro	Val	Leu	Ala
740	745	750
Val Gly Ser Gin	Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe	Glu	Lys	Asn
755	760 765
Cys Lys Gin Glu	Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val	Ser	Phe	Asn
770	775 780
Phe Ser Gly Leu	Gin Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro	Glu	Leu	Thr
785	790 795			800
Val Thr Val Thr	Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr	Gly	Thr	Leu
	805 810		815
Ile Lys Phe Tyr	Tyr Pro Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg	Val	Thr	Arg
820	825	830
Ala Gin Gin Pro	His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys	Glu	Ala	Glu
835	840 845
Pro Thr Gly Gin	Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser	Ile	Asn	His
850	855 860
Pro Ile Phe Arg	Glu Gly Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile	Thr	Phe	Asp
865	870 875			880
Val Ser Tyr Lys	Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu	Arg	Ala	Ser
	885 890		895
Ala Ser Ser Glu	Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr	Ala	Phe	Gin
900	905	910
Leu Glu Leu Pro	Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile	Ser	Arg	Gin
915	920 925
Glu Asp Ser Thr	Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His	Gly	Glu	Arg
930	935 940
Gin Lys Glu Ala	Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu	Ser	Pro	Leu
945	950 955			960
Thr Leu Ala Ile	Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu	Leu	Asn	Gly
	965 970		975
Val Ala Val Trp	Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gin	Gly	Val	Ser
980	985	990
Cys Val Ser Gin	Arg Glu Pro Pro Gin His Ser Asp Leu	Leu	Thr	Gin
995	1000 1005
Ile Gin Gly Arg	Ser Val Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp	Cys	Leu	His
1010	1015 1020
Leu Arg Cys Asp	Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu	Leu	Asp	Phe
1025	1030 1035			1040

192 «· • · ·· · · · · · • · · · · · · ···· · • · · · · · · · · ····· ·· ·· · · ··

Ile

Leu

Lys

Gly Asn 1045

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp 1050

Ile

Ser

Gin

Thr

Leu 1055

Gin

Lys

Val

Leu 1060

Leu 1

Leu

Ser

Glu

Ala 1065

Glu »

Ile

Thr

Phe

Asn 1070

Thr 1

Ser

Val

Tyr

Ser 1075

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin 1080

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg 1085

Ala

Gin

Val

Ser

Thr 109C

Met 1

Leu

Glu

Tyr 1095

Val

Tyr

Glu

Pro Val 1100

Phe

Leu

Met

Val 1105

Phe

Ser

Val

Gly 111C

Gly 1

Leu

Leu 1115

Ala

Leu

Ile

Thr

Val 1120

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu 1125

Gly

Phe

Lys

Arg 1130

Gin 1

Tyr

Lys

Glu

Met 1135

Leu

Asp

Leu

Pro

Ser 1140

Ala 1

Asp

Pro

Asp

Pro 1145

Ala »

Gly

Gin

Ala

Asp 1150

Ser

Asn

His

Glu

Thr 1155

Pro

His

Leu

Thr 116C

Ser 1

(2)

INFORMACE 0

SEK.

ID.

Č. :

54 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3597 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 40..3525 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:54:

AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCAGTG ATG GCC GGT GGA GTT 54

Met Ala Gly Gly Val

5

GTG Val

ATC Ile

CTC Leu

CTG Leu

TGT Cys 10

GGC Gly

TGG Trp

GTC Val

CTG Leu

GCT Ala 15

TCC Ser

TGT Cys

CAT His

GGG Gly

TCT Ser 20

AAC Asn

102

CTG

GAT

GTG

GAG

GAA

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

150

Leu

Asp

Val

Glu 25

Glu

Pro

Ile

Val

Phe 30

Arg

Glu

Asp

Ala

Ala 35

Ser

Phe

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

198

Gly

Gin

Thr 40

Val

Gin

Phe

Gly 45

Gly

Ser

Arg

Leu

Val 50

Val

Gly

Ala

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

246

Pro

Leu 55

Glu

Ala

Val

Ala

Val 60

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg 65

Leu

Tyr

Asp

Cys

193 • · · · · · ·· ·· ·· ··

GCA Ala 70

CCT Pro

GCC ACT

GGC Gly

ATG Met 75

TGC Cys

CAG Gin

CCC Pro

ATC Ile

GTA Val 80

CTG Leu

CGC Arg

AGT Ser

CCC Pro

CTA Leu 85

294

Ala

Thr

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

342

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

90

95

100

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

390

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

105

110

115

AAG

AAC

ATG

TAT

GCG

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

438

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

120

125

130

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

486

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

135

140

145

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

534

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Gin

150

155

160

165

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

582

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

170

175

180

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TTG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

TCG

AAC

ATC

630

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

185

190

195

CTG

AAG

ACC

CAT

TTT

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

678

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

Ile

Leu

Asp

Pro

200

205

210

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

726

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

215

220

225

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

774

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

230

235

240

245

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

822

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

250

255

260

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

870

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

Pro

Ala

265

270

275

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

918

Asp

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

280

285

290

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

966

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

295 300 305

194 • ·

• •

• • • •

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 • 0 0 0 0 0

• 0 0 0 • 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0«

CCA

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTA

GGC

AAC

TTT

GCA

CTT

CGC

AGC

1014

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

310

315

320

325

ATC

CAG

AGG

CAA

CTT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

1062

Ile

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

Gly

Thr

Gin

330

335

340

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

1110

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

345

350

355

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GTG

GGA

AGC

1158

Ser

Ala

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

360

365

370

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

1206

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

375

380

385

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGA

GAC

TCC

TAC

1254

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

390

395

400

405

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

1302

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

410

415

420

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

1350

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

Ile

Phe

425

430

435

ACC Thr

CAG Gin

GAA GCC AGG

CAT His

TGG AGG Trp Arg 445

CCC Pro

AAG Lys

TCT Ser

GAA GTC AGA GGG ACA

1398

Glu Ala 440

Arg

Glu

Val 450

Arg

Gly

Thr

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

1446

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

455

460

465

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

1494

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

470

475

480

485

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TTC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

1542

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

Pro

Val

Pro

Gly

Val

490

495

500

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

1590

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Gly

His

505

510

515

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

1638

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

520

525

530

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

1686

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

535

540

545

195

AGC Ser 550

AGA GGT

GCT Ala

GTC Val

TAC ATA TTT

CAT His

GGA Gly

GCC Ala 560

TCG Ser

AGA Arg

CTG Leu

GAG Glu

ATC Ile 565

1734

Arg

Gly

Tyr 555

Ile

Phe

ATG

CCC

TCA

CCC

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

1782

Met

Pro

Ser

Pro

Ser 570

Gin

Arg

Val

Thr

Gly 575

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu 580

Arg

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

1830

Leu

Gin

Tyr

Phe 585

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser 590

Gly

Gin

Asp

Leu 595

Thr

Gin

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

1878

Asp

Gly

Leu 600

Val

Asp

Leu

Ala

Val 605

Gly

Ala

Gin

Gly

His 610

Val

Leu

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

1926

Leu

Arg 615

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu 620

Lys

Val

Glu

Leu

Ser 625

Ile

Arg

Phe

Ala

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

AAG

GCT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GAA

AGG

ACT

CCC

1974

Pro 630

Met

Glu

Val

Ala

Lys 635

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys 640

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro 645

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

2022

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

Leu

Thr

Val

His 660

Lys

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

2070

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asn

Val 670

Gin

Gly

Ser

Val

Arg 675

Tyr

Asp

CTG Leu

GCG Ala

TTA Leu 680

GAT Asp

CCG Pro

GGC Gly

CGC Arg

CTG Leu 685

ATT Ile

TCT Ser

CGT Arg

GCC Ala

ATT Ile 690

TTT Phe

GAT Asp

GAG Glu

2118

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

2166

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu 705

Gly

Leu

Gly

Asp

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

2214

His 710

Cys

Glu

Thr

Val

Lys 715

Leu

Pro

Asp 720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala 725

GTG

AGC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

2262

Val

Ser

Pro

Ile

Ile 730

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe 735

Ser

Leu

Val

Arg

Asp 740

Ser

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

2310

Ala

Ser

Pro

Arg 745

Asn

Leu

His

Pro

Val 750

Leu

Ala

Val

Gly

Ser 755

Gin

Asp

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

2358

His

Ile

Thr 760

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe 765

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys 770

Gin

Glu

Leu

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

2406

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Tle

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

775 780 785

196 • ·

GTC Val 790

TTG Leu

GTG Val

GGA Gly

GGC Gly 795

TCC Ser

CCA GAG

CTC Leu

ACT Thr 800

GTG Val

ACA Thr

GTC Val

ACT Thr

GTG Val 805

2454

Pro

Glu

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

2502

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu 810

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr 815

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr 820

Tyr

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

2550

Pro

Ala

Gly

Leu 825

Ser

Tyr

Arg

Val 830

Thr

Gly

Thr

Gin

Gin 835

Pro

His

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

2598

Gin

Tyr

Pro 840

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala 850

Ala

Gin

Glu

GAC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

2646

Asp

Leu 855

Arg

Ser

Cys 860

Ser

Ile

Asn

His

Pro 865

Ile

Phe

Arg

Glu

GGT

GCA

AAG

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTC

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

2694

Gly 870

Ala

Lys

Thr

Phe 875

Met

Ile

Thr

Phe

Asp 880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala 885

TTC

CTA

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

2742

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg 890

Leu

Arg

Ala 895

Lys

Ala

Ser

Glu 900

Asn

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

2790

Asn

Lys

Pro

Asp 905

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala 910

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu 915

Pro

Val

AAG Lys

TAC ACC

GTC Val

TAT Tyr

ACC Thr

CTG ATC

AGT Ser

AGG Arg

CAA GAA GAT

TCC ACC AAC

2838

Tyr

Thr 920

Leu

Ile 925

Gin

Glu

Asp 930

Ser

Thr

Asn

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

2886

His

Val 935

Asn

Phe

Ser

Ser 940

His

Gly

Arg

Arg 945

Gin

Glu

Ala

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

TKÁT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

2934

His 950

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn 955

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu 960

Lys

Leu

Ala

Val

Arg 965

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

2982

Val

Asn

Phe

Trp

Val 970

Pro

Val

Leu

Asn 975

Gly

Val

Ala

Val

Trp 980

Asp

GTG

ACT

CTG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC

GTG

TCC

CAG

ATG

3030

Val

Thr

Leu

Ser 985

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly 990

Val

Ser

Cys

Val

Ser 995

Gin

Met

AAA

CCT

CAG

AAT

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

CGT

TCT

3078

Lys

Pro

Pro 100C

Gin 1

Asn

Pro

Asp

Phe 1005

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin Arg 1010

Arg

Ser

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TTC

CGC

TGT

GAC

ATC

3126

Val

Leu 1015

Asp

Cys

Ser

Ile

Ala 102C

Asp 1

Cys

Leu

His

Phe 1025

Arg 1

Cys

Asp

Ile

197 • · • · · · · ···· · · · ··

CCC TCC Pro Ser 1030	TTG GAC Leu Asp	ATC Ile	CAG GAT Gin Asp 1035	GAA Glu	CTT Leu	GAC Asp	TTC ATT Phe Ile 1040	CTG AGG	GGC Gly	AAC Asn 1045
Leu	Arg
CTC AGC	TTC GGC	TGG	GTC AGT	CAG	ACA	TTG	CAG GAA	AAG	GTG	TTG	CTT
Leu Ser	Phe Gly	Trp 105C	Val Ser )	Gin	Thr	Leu 1055	Gin Glu	Lys	Val	Leu Leu 1060
GTG AGT	GAG GCT	GAA	ATC ACT	TTC	GAC	ACA	TCT GTG	TAC	TCC	CAG	CTG
Val Ser	Glu Ala 1065	Glu	Ile Thr	Phe	Asp 107C	Thr )	Ser Val	Tyr	Ser 1075	Gin	Leu
CCA GGA	CAG GAG	GCA	TTT CTG	AGA	GCC	CAG	GTG GAG	ACA	ACG	TTA	GAA
Pro Gly	Gin Glu 1080	Ala	Phe Leu	Arg Ala 1085	Gin	Val Glu	Thr Thr 1090	Leu	Glu
GAA TAC	GTG GTC	TAT	GAG CCC	ATC	TTC	CTC	GTG GCG	GGC	AGC	TCG	GTG
Glu Tyr 1095	Val Val	Tyr	Glu Pro Ile 1100	Phe	Leu	Val Ala Gly 1105	Ser	Ser	Val
GGA GGT	CTG CTG	TTA	CTG GCT	CTC	ATC	ACA	GTG GTA	CTG	TAC	AAG	CTT
Gly Gly 1110	Leu Leu	Leu	Leu Ala 1115	Leu	Ile	Thr	Val Val 1120	Leu	Tyr	Lys	Leu 1125
GGC TTC	TYC AAA	CGT	CAG TAC	AAA	GAA	ATG	CTG GAC	GGC	AAG	GCT	GCA
Gly Phe	Xaa Lys	Arg 1130	Gin Tyr 1	Lys	Glu	Met 1135	Leu Asp 1	Gly	Lys	Ala 114C	Ala 1
GAT CCT	GTC ACA	GCC	GGC CAG	GCA	GAT	TTC	GGC TGT	GAG	ACT	CCT	CCA
Asp Pro	Val Thr 1145	Ala	Gly Gin	Ala	Asp 1150	Phe	Gly Cys	Glu	Thr 1155	Pro	Pro

• 4 ·· • · · • ·· • · · · · • · · ·· ··

3174

3222

3270

3318

3366

3414

3462

3510

TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATGAAGATTG 3562

Tyr Leu Val Ser

1160

GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT 3597 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEK.	ID.	Č. :	55:
Met 1	Ala Gly	Gly Val Val Ile 5	Leu	Leu	Cys 10	Gly Trp Val Leu Ala Ser 15
Cys	His Gly	Ser Asn Leu Asp 20	Val	Glu 25	Glu	Pro Ile Val Phe Arg Glu 30
Asp	Ala Ala 35	Ser Phe Gly Gin	Thr 40	Val	Val	Gin Phe Gly Gly Ser Arg 45

198 • · · · • ·

Leu	Val 50	Val	Gly	Ala	Pro	Leu 55	Glu
Arg 65	Leu	Tyr	Asp	Cys	Ala 70	Pro	Ala
Leu	Arg	Ser	Pro	Leu 85	Glu	Ala	Val
Val	Thr	Ala	Thr 100	Asn	Asn	Ala	Gin
Gin	Arg	Ala 115	Cys	Val	Lys	Asn	Met 120
Leu	Gly 130	Ser	Ser	Leu	Gin	Phe 135	Ile
Glu 145	Cys	Pro	Arg	Gin	Glu 150	Met	Asp
Gly	Ser	Ile	Asn	Gin 165	Arg	Asp	Phe
Ala	Leu	Met	Gly 180	Glu	Phe	Ala	Ser
Gin	Tyr	Ser 195	Asn	Ile	Leu	Lys	Thr 200
Asn	Ile 210	Leu	Asp	Pro	Gin	Ser 215	Leu
Gly 225	Leu	Thr	Tyr	Thr	Ala 230	Thr	Gly
Phe	His	Ser	Lys	Asn 245	Gly	Ser	Arg
Val	Ile	Thr	Asp 260	Gly	Gin	Lys	Tyr
Val	Ile	Pro 275	Ala	Ala	Asp	Lys	Ala 280
Val	Gly 290	Asp	Ala	Phe	Gin	Glu 295	Pro
Ile 305	Gly	Ser	Ala	Pro	Pro 310	Gin	Asp
Ala	Ala	Leu	Arg	Ser 325	Ile	Gin	Arg
Ile	Glu	Gly	Thr 340	Gin	Ser	Arg	Ser
Ser	Gin	Glu	Gly	Phe	Ser	Ser	Ala

355 360

	• • • • ·· ·	• • · • •	• · • · • · • ·	• • • · • ·
Ala Val Ala	Val Asn 60	Gin	Thr	Gly
Thr Gly Met 75	Cys Gin	Pro	Ile	Val 80
Asn Met Ser 90	Leu Gly	Leu	Ser 95	Leu
Leu Leu Ala 105	Cys Gly	Pro 110	Thr	Ala
Tyr Ala Lys	Gly Ser 125	Cys	Leu	Leu
Gin Ala Val	Pro Ala 140	Ser	Met	Pro
Ile Ala Phe 155	Leu Ile	Asp	Gly	Ser 160
Ala Gin Met 170	Lys Asp	Phe	Val 175	Lys
Thr Ser Thr 185	Leu Phe	Ser 190	Leu	Met
His Phe Thr	Phe Thr 205	Glu	Phe	Lys
Val Asp Pro	Ile Val 220	Gin	Leu	Gin
Ile Arg Thr 235	Val Met	Glu	Glu	Leu 240
Lys Ser Ala 250	Lys Lys	Ile	Leu 255	Leu
Arg Asp Pro 265	Leu Glu	Tyr 270	Ser	Asp
Gly Ile Ile	Arg Tyr 285	Ala	Ile	Gly
Thr Ala Leu	Lys Glu 300	Leu	Asn	Thr
His Val Phe 315	Lys Val	Gly	Asn	Phe 320
Gin Leu Gin 330	Glu Lys	Ile	Phe 335	Ala
Ser Ser Ser 345	Phe Gin	His 350	Glu	Met
Leu Thr Ser	Asp Gly	Pro	Val	Leu

365

199 • · · · • · · ·

Gly	Ala 370	Val	Gly	Ser	Phe	Ser 375	Trp	Ser	Gly	Gly
Pro 385	Asn	Thr	Arg	Pro	Thr 390	Phe	Ile	Asn	Met	Ser 395
Met	Arg	Asp	Ser	Tyr 405	Leu	Gly	Tyr	Ser	Thr 410	Ala
Gly	Val	His	Ser 420	Leu	Ile	Leu	Gly	Ala 425	Pro	Arg
Lys	Val	Val 435	Ile	Phe	Thr	Gin	Glu 440	Ala	Arg	His
Glu	Val	Arg	Gly	Thr	Gin	Ile	Gly	Ser	Tyr	Phe

450 455

	• • • • ·· ·	• • • *	« • · • • ·	• · • • · • ·
Ala 380	Phe	Leu	Tyr	Pro
Gin	Glu	Asn	Val	Asp 400
Val	Ala	Phe	Trp 415	Lys
His	Gin	His 430	Thr	Gly
Trp	Arg 445	Pro	Lys	Ser
Gly 460	Ala	Ser	Leu	Cys

Ser 465

Val Asp Val

Asp Arg 470

Asp

Gly

Ser

Xaa

Asp 475

Leu

Val

Leu

Ile

Gly 480

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

485

490

495

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

500

505

510

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Leu

Glu

Ile

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

610

615

620

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

675 680 685

200 • ·· · ·· · · · · ···· • · ··* ···· • · ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · ·*·· · ·· ·· ·· *·

Ala

Ile 690

Phe

Asp Glu

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

725

730

735

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Ile

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Ile

Ser

Phe

Asn

770

775

780

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

820

825

830

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

835

840

845

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

850

855

860

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Lys

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Leu

Ile

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Arg

930

935

940

Arg

Gin

Glu

Ala

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

945

950

955

960

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

Cys

Val

Ser

Gin

Met

Lys

Pro

Gin

Asn

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995 1000 1005

201 • · · · • · · ·

Ile

Gin Arg 1010

Arg

Ser

Val

Leu Asp 1015

Cys

Ser

Ile

Ala Asp 1020

Cys

Leu

His

Phe

Arg Cys

Asp

Ile

Pro

Ser Leu

Asp

Ile

Gin

Asp Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

Ile

Leu Arg

Gly

Asn

Leu

Ser Phe

Gly

Trp

Val

Ser Gin

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

Glu

Lys Val

Leu

Val

Ser Glu

Ala

Glu

Ile

Thr Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

1070

Val

Tyr Ser

Gin

Leu

Pro

Gly Gin

Glu

Ala

Phe

Leu Arg

Ala

Gin

Val

1075

1080

1085

Glu

Thr Thr

Leu

Glu

Tyr Val

Val

Tyr

Glu

Pro Ile

Phe

Leu

Val

1090

1095

1100

Ala

Gly Ser

Ser

Val

Gly

Gly Leu

Leu

Ala Leu

Ile

Thr

Val

1105

1110

1115

1120

Val

Leu Tyr

Lys

Leu

Gly

Xaa Xaa

Lys

Arg

Gin

Tyr Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

Asp

Gly Lys

Ala

Asp

Pro Val

Thr

Xaa

Gly

Gin Ala

Asp

Phe

Gly

1140

1145

1150

Cys

Glu Thr

Pro

Tyr

Leu Val

Ser

1155

1160

(2)

INFORMACE O

SEK.

ID.

Č. :56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:56:

CCTGTCATGG GTCTAACCTG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:57:

AGGTTAGACC CATGACAGG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:58:

202 «· · · · 4 · · · · · · 4 4 4 4 4· • · ·· 4 44 4 · 4 · 4 • · 4444 444 ·· 44·· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:58:

GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:59:

CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:60:

CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:61:

CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

203 ·· ·««·

4 ··9 · «4 • · 4 · 4 4 4 • « 4 4 « 44

4 44 4 44 4 4

4 4 4 4 4 4

44 44 44 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. ¢.:62:

GCTGGGATCA TTCGCTATGC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:63:

CAATGGATGG ACCAGTTCTG G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:64:

CAGATCGGCT CCTACTTTGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:65:

CATGGAGCCT CGAGACAGG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

204 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ···· · • · ···· 9 9 9 ···· · ·* ·· ·« ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:66:

CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:67:

CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:68:

CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:69:

CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:70:

GTCACAGAGG GAACCTCC 18

205 • · • · · · • · (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:71:

GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:72:

GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:73:

CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:74:

GTGGATCAGC ACTGAAATCT G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina

206 • · • · • · · · 4 • · 4 • · ·· (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:75:

CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:76:

CACAGCGGAG GTGCAGGCAG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:77:

CTCACTGCTT GCGCTGGC 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:78:

CGGTAAGATA GCTCTGCTGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

207 • · « · · · 4 · ··· ···· · ·· ·· ·· «· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:79:

GAGCCCACAG CCAGCACAGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:80:

GATCCAACGC CAGATCATAC C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:81:

CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:82:

CACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:83:

TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:84:

208 ·· · · · ·· *· • · MM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:84:

GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:85:

CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:86:

GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:87:

GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

209 • · · · · · • · · • · · ·

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:88:

CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:89:

CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:90:

GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:91:

AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 852 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS

210 β ·

(Β) UMÍSTĚNÍ: 61..852 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:92:

TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60

ATG Met 1

GCC Ala

CTT Leu

GGG Gly

GCT Ala 5

GTG Val

GTC Val

CTC Leu

CTT Leu

GGG Gly 10

GTC Val

CTG Leu

GCT Ala

TCT Ser

TAC Tyr 15

CAC His

108

GGA

TTC

AAC

TTG

GAC

GTG

ATG

AGC

GGT

GAT

CTT

CCA

GGA

AGA

CGC

AGC

156

Gly

Phe

Asn

Leu 20

Asp

Val

Met

Ser

Gly 25

Asp

Leu

Pro

Gly

Arg 30

Arg

Ser

GGG

CTT

CGG

GCA

GAG

CGT

GAT

GCA

GTT

TGG

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

204

Gly

Leu

Arg 35

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala 40

Val

Trp

Gly

Ser

Arg 45

Leu

Val

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

CGG

CTG

TAC

252

Gly

Ala 50

Pro

Leu

Ala

Val

Val 55

Ser

Ala

Asn

His

Thr 60

Gly

Arg

Leu

Tyr

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

CCA

TTC

ATG

300

Glu 65

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser 70

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro 75

Ile

Phe

Pro

Phe

Met 80

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

GCA

GCC

TCC

348

Pro

Glu

Ala

Val 85

Asn

Met

Ser

Leu

Gly 90

Leu

Ser

Leu

Ala

Ala 95

Ser

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

CAT

AGA

GCC

396

Pro

Asn

His

Ser 100

Gin

Leu

Ala

Cys 105

Gly

Pro

Thr

Val

His 110

Arg

Ala

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

GAT

GCC

444

Cys

Gly

Glu 115

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin 120

Gly

Phe

Cys

Val

Leu 125

Leu

Asp

Ala

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

GAG

TGC

CCA

492

His

Ala 130

Gin

Pro

Ile

Gly

Thr 135

Val

Pro

Ala

Leu 140

Pro

Glu

Cys

Pro

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGC

AGC

ATT

540

Asp 145

Gin

Glu

Met

Asp

Ile 150

Val

Phe

Leu

Ile

Asp 155

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile 160

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

GCT

GTG

ATG

588

Ser

Asn

Asp

Phe 165

Arg

Lys

Met

Lys

Asp 170

Phe

Val

Arg

Ala

Val 175

Met

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

CAG

TAC

TCC

636

Asp

Gin

Phe

Lys 180

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin 185

Phe

Ser

Leu

Met

Gin 190

Tyr

Ser

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

AAC

AGC

TCC

684

Asn

Val

Leu 195

Val

Thr

His

Phe

Thr 200

Phe

Ser

Phe

Arg 205

Asn

Ser

AAT

CCT

CAG

GGC

CTA

GTG

GAG

CCC

ATT

GTG

CAG

CTG

ACA

GGC

CTC

ACG

732

Asn

Pro

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210 215 220

211

TTC Phe 225	ACG GCC ACA GGG ATC	CTG AAA GTG	GTG ACA	GAG CTG Glu Leu	TTT Phe	CAA ACC Gin Thr 240
Thr Ala	Thr	Gly	Ile 230	Leu Lys	Val	Val	Thr 235
AAG	AAC GGG	GCC	CGC	GAA	AGT GCC	AAG	AAG	ATC	CTC ATC	GTC	ATC ACA
Lys	Asn Gly	Ala	Arg	Glu	Ser Ala	Lys	Lys	Ile	Leu Ile	Val	Ile Thr
			245				250				255
GAT	GGG CAG	AAG	TAC	AAA	GCG GCA
Asp	Gly Gin	Lys	Tyr	Lys	Ala Ala
		260
(2)	INFORMACE 0	SEK.	. ID.	. Č.:93:
	(i) (	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA:	264 aminokyselin
		(B)	TYP: aminokyselina
		(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii) '	TYP MOLEKULY:	: protein
	(xi) :	POPIS SEKVENCE: SEK.	ID.	Č. :	93:
Met	Ala Leu	Gly	Ala	Val	Val Leu	Leu	Gly	Val	Leu Ala	Ser	Tyr His
1			5				10				15
Gly	Phe Asn	Leu	Asp	Val	Met Ser	Gly	Asp	Leu	Pro Gly	Arg	Arg Ser
		20				25				30
Gly	Leu Arg	Ala	Glu	Arg	Asp Ala	Val	Trp	Gly	Ser Arg	Leu	Val Val
	35				40				45
Gly	Ala Pro	Leu	Ala	Val	Val Ser	Ala	Asn	His	Thr Gly	Arg	Leu Tyr
	50				55				60
Glu	Cys Ala	Pro	Ala	Ser	Gly Thr	Cys	Thr	Pro	Ile Phe	Pro	Phe Met
65				70				75			80
Pro	Pro Glu	Ala	Val	Asn	Met Ser	Leu	Gly	Leu	Ser Leu	Ala	Ala Ser
			85				90				95
Pro	Asn His	Ser	Gin	Leu	Leu Ala	Cys	Gly	Pro	Thr Val	His	Arg Ala
		100				105				110
Cys	Gly Glu	Asp	Val	Tyr	Ala Gin	Gly	Phe	Cys	Val Leu	Leu	Asp Ala
	115				120				125
His	Ala Gin	Pro	Ile	Gly	Thr Val	Pro	Ala	Ala	Leu Pro	Glu	Cys Pro
	130				135				140
Asp	Gin Glu	Met	Asp	Ile	Val Phe	Leu	Ile	Asp	Gly Ser	Gly	Ser Ile
145				150				155			160
Ser	Ser Asn	Asp	Phe	Arg	Lys Met	Lys	Asp	Phe	Val Arg	Ala	Val Met
			165				170				175
Asp	Gin Phe	Lys	Asp	Thr	Asn Thr	Gin	Phe	Ser	Leu Met	Gin	Tyr Ser
		180				185				190

212

Asn

Val

Leu 195

Val

Thr

His

Phe

Thr 200

Phe

Ser

Phe

Arg 205

Asn

Ser

Asn

Pro

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210

215

220

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

Phe

Gin

Thr

225

230

235

240

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

Thr

245

250

255

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Ala

260 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:94:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:94:

CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:95:

CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2499 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:96:

ATGACCTTCG	GCACTGTGCT	TCTTCTGAGT	GTCCTGGCTT	CTTATCATGG	ATTCAACCTG	60
GATGTGGAGG	AGCCTACGAT	CTTCCAGGAG	GATGCAGGCG	GCTTTGGGCA	GAGCGTGGTG	120
CAGTTCGGTG	GATCTCGACT	CGTGGTGGGA	GCACCCCTGG	AGGTGGTGGC	GGCCAACCAG	180

213 • · · · · · · • · · · · ·· • · ·· ···· · • · · · · · ·

ACGGGACGGC	TGTATGACTG	CGCAGCTGCC	ACCGGCATGT	GCCAGCCCAT	CCCGCTGCAC	240
ATCCGCCCTG	AGGCCGTGAA	CATGTCCTTG	GGCCTGACCC	TGGCAGCCTC	CACCAACGGC	300
TCCCGGCTCC	TGGCCTGTGG	CCCGACCCTG	CACAGAGTCT	GTGGGGAGAA	CTCATACTCA	360
AAGGGTTCCT	GCCTCCTGCT	GGGCTCGCGC	TGGGAGATCA	TCCAGACAGT	CCCCGACGCC	420
ACGCCAGAGT	GTCCACATCA	AGAGATGGAC	ATCGTCTTCC	TGATTGACGG	CTCTGGAAGC	480
ATTGACCAAA	ATGACTTTAA	CCAGATGAAG	GGCTTTGTCC	AAGCTGTCAT	GGGCCAGTTT	540
GAGGGCACTG	ACACCCTGTT	TGCACTGATG	CAGTACTCAA	ACCTCCTGAA	GATCCACTTC	600
ACCTTCACCC	AATTCCGGAC	CAGCCCGAGC	CAGCAGAGCC	TGGTGGATCC	CATCGTCCAA	660
CTGAAAGGCC	TGACGTTCAC	GGCCACGGGC	ATCCTGACAG	TGGTGACACA	GCTATTTCAT	720
CATAAGAATG	GGGCCCGAAA	AAGTGCCAAG	AAGATCCTCA	TTGTCATCAC	AGATGGGCAG	780
AAGTACAAAG	ACCCCCTGGA	ATACAGTGAT	GTCATCCCCC	AGGCAGAGAA	GGCTGGCATC	840
ATCCGCTACG	CTATCGGGGT	GGGACACGCT	TTCCAGGGAC	CCACTGCCAG	GCAGGAGCTG	900
AATACCATCA	GCTCAGCGCC	TCCGCAGGAC	CACGTGTTCA	AGGTGGACAA	CTTTGCAGCC	960
CTTGGCAGCA	TCCAGAAGCA	GCTGCAGGAG	AAGATCTATG	CAGTTGAGGG	AACCCAGTCC	1020
AGGGCAAGCA	GCTCCTTCCA	GCACGAGATG	TCCCAAGAAG	GCTTCAGCAC	AGCCCTCACA	1080
ATGGATGGCC	TCTTCCTGGG	GGCTGTGGGG	AGCTTTAGCT	GGTCTGGAGG	TGCCTTCCTG	1140
TATCCCCCAA	ATATGAGCCC	CACCTTCATC	AACATGTCTC	AGGAGAATGT	GGACATGAGG	1200
GACTCTTACC	TGGGTTACTC	CACCGAGCTA	GCCCTGTGGA	AGGGGGTACA	GAACCTGGTC	1260
CTGGGGGCCC	CCCGCTACCA	GCATACCGGG	AAGGCTGTCA	TCTTCACCCA	GGTGTCCAGG	1320
CAATGGAGGA	AGAAGGCCGA	AGTCACAGGG	ACGCAGATCG	GCTCCTACTT	CGGGGCCTCC	1380
CTCTGCTCCG	TGGATGTGGA	CAGCGATGGC	AGCACCGACC	TGATCCTCAT	TGGGGCCCCC	1440
CATTACTATG	AGCAGACCCG	AGGGGGCCAG	GTGTCCGTGT	GTCCCTTGCC	TAGGGGGAGG	1500
GTGCAGTGGC	AGTGTGACGC	TGTTCTCCGT	GGTGAGCAGG	GCCACCCCTG	GGGCCGCTTT	1560
GGGGCAGCCC	TGACAGTGTT	GGGGGATGTG	AATGAGGACA	AGCTGATAGA	CGTGGCCATT	1620
GGGGCCCCGG	GAGAGCAGGA	GAACCGGGGT	GCTGTCTACC	TGTTTCACGG	AGCCTCAGAA	1680
TCCGGCATCA	GCCCCTCCCA	CAGCCAGCGG	ATTGCCAGCT	CCCAGCTCTC	CCCCAGGCTG	1740
CAGTATTTTG	GGCAGGCGCT	GAGTGGGGGT	CAGGACCTCA	CCCAGGATGG	ACTGATGGAC	1800
CTGGCCGTGG	GGGCCCGGGG	CCAGGTGCTC	CTGCTCAGGA	GTCTGCCGGT	GCTGAAAGTG	1860
GGGGTGGCCA	TGAGATTCAG	CCCTGTGGAG	GTGGCCAAGG	CTGTGTACCG	GTGCTGGGAA	1920
GAGAAGCCCA	GTGCCCTGGA	AGCTGGGGAC	GCCACCGTCT	GTCTCACCAT	CCAGAAAAGC	1980
TCACTGGACC	AGCTAGGTGA	CATCCAAAGC	TCTGTCAGGT	TTGATCTGGC	ACTGGACCCA	2040

214 • · ···· · · ·· • · · · · · · • · · · · ··

GGTCGTCTGA	CTTCTCGTGC	CATTTTCAAT	GAAACCAAGA	ACCCCACTTT	GACTCGAAGA	2100
AAAACCCTGG	GACTGGGGAT	TCACTGTGAA	ACCCTGAAGC	TGCTTTTGCC	AGTGAGGACT	2160
TTGGGTTCTG	GGAAGGGGGA	GAGAGGAGGA	GCCCAAGGCT	GGCCTGGAGC	ACCCCCGTTC	2220
TCTGCTGAGC	GAGGTGGGAA	GGGTTAGGAT	GTTGGGGCTG	GAGAGAGGGA	CATTAGGGCA	2280
GGAGAACCTG	GCTCCACGGC	TTGGAGGGAG	CACTGTCAGG	GCAGTGGGGA	GTGGATGCAG	2340
TGGAGGAGGA	CTTGTGGTGG	AGCGTAGAGA	GGACAGCAGG	TTCTTGAAAG	CCTGTTCTCT	2400
CTCAGGATTG	TGTGGAGGAT	GTGGTGAGCC	CCATCATTCT	GCACCTCAAC	TTCTCACTGG	2460
TGAGAGAGCC	CATCCCCTCC	CCCCAGAACC	TGCGTCCTG			2499

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3956 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:97:

TTTAACTGCA	CCAACTTTAA	AATACGCTAT	TGGAGCTGGA	ATTACCGCGG	CTGCTGGCAC	60
CAGACTTGCC	CTCCAATGGA	TCCTCGTTAA	AGGATTTAAA	GTGGACTCAT	TCCAATTACA	120
GGGCCTCGAA	AGAGTCCTGT	ATTGTTATTT	TTCGTCACTA	CCTCCCCGGG	TCGGGAGTGG	180
gtaatttgcg	CGCCTGCTGC	CTTCCTTGGA	TGTGGTAGCC	GTTTCTCAGG	CTCCCTCTCC	240
GGAATCGAAC	CCTGATTCCC	CGTCACCCGT	GGTCACCATG	GTAGGCACGT	GCAGTTCGGT	300
GGATCTCGAC	TCGTGGTGGG	AGCACCCCTG	GAGGTGGTGG	CGGCCAACCA	GACGGGACGG	360
CTGTATGACT	GCGCAGCTGC	CACCGGCATG	TGCCAGCCCA	TCCCGCTGCA	CATCCGCCCT	420
GAGGCCGTGA	ACATGTCCTT	GGGCCTGACC	CTGGCAGCCT	CCACCAACGG	CTCCCGGCTC	480
CTGGCCTGTG	GCCCGACCCT	GCACAGAGTC	TGTGGGGAGA	ACTCATACTC	AAAGGGTTCC	540
TGCCTCCTGC	TGGGCTCGCG	CTGGGAGATC	ATCCAGACAG	TCCCCGACGC	CACGCCAGAG	600
TGTCCACATC	AAGAGATGGA	CATCGTCTTC	CTGATTGACG	GCTCTGGAAG	CATTGACCAA	660
AATGACTTTA	ACCAGATGAA	GGGCTTTGTC	CAAGCTGTCA	TGGGCCAGTT	TGAGGGCACT	720
GACACCCTGT	TTGCACTGAT	GCAGTACTCA	AACCTCCTGA	AGATCCACTT	CACCTTCACC	780
CAATTCCGGA	CCAGCCCGAG	CCAGCAGAGC	CTGGTGGATC	CCATCGTCCA	ACTGAAAGGC	840
CTGACGTTCA	CGGCCACGGG	CATCCTGACA	GTGGTGACAC	AGCTATTTCA	TCATAAGAAT	900
GGGGCCCGAA	AAAGTGCCAA	GAAGATCCTC	ATTGTCATCA	CAGATGGGCA	G AAGTACAAA	960

215 • · ·

GACCCCCTGG	AATACAGTGA	TGTCATCCCC	CAGGCAGAGA	AGGCTGGCAT	CATCCGCTAC	1020
GCTATCGGGG	TGGGACACGC	TTTCCAGGGA	CCCACTGCCA	GGCAGGAGCT	GAATACCATC	1080
AGCTCAGCGC	CTCCGCAGGA	CCACGTGTTC	AAGGTGGACA	ACTTTGCAGC	CCTTGGCAGC	1140
ATCCAGAAGC	AGCTGCAGGA	GAAGATCTAT	GCAGTTGAGG	GAACCCAGTC	CAGGGCAAGC	1200
AGCTCCTTCC	AGCACGAGAT	GTCCCAAGAA	GGCTTCAGCA	CAGCCCTCAC	AATGGATGGC	1260
CTCTTCCTGG	GGGCTGTGGG	GAGCTTTAGC	TGGTCTGGAG	GTGCCTTCCT	GTATCCCCCA	1320
AATATGAGCC	CCACCTTCAT	CAACATGTCT	CAGGAGAATG	TGGACATGAG	GGACTCTTAC	1380
CTGGGTTACT	CCACCGAGCT	AGCCCTGTGG	AAGGGGGTAC	AGAACCTGGT	CCTGGGGGCC	1440
CCCCGCTACC	AGCATACCGG	GAAGGCTGTC	ATCTTCACCC	AGGTGTCCAG	GCAATGGAGG	1500
AAGAAGGCCG	AAGTCACAGG	GACGCAGATC	GGCTCCTACT	TCGGGGCCTC	CCTCTGCTCC	1560
GTGGATGTGG	ACAGCGATGG	CAGCACCGAC	CTGATCCTCA	TTGGGGCCCC	CCATTACTAT	1620
GAGCAGACCC	GAGGGGGCCA	GGTGTCCGTG	TGTCCCTTGC	CTAGGGGGAG	GGTGCAGTGG	1680
CAGTGTGACG	CTGTTCTCCG	TGGTGAGCAG	GGCCACCCCT	GGGGCCGCTT	TGGGGCAGCC	1740
CTGACAGTGT	TGGGGGATGT	GAATGAGGAC	AAGCTGATAG	ACGTGGCCAT	TGGGGCCCCG	1800
GGAGAGCAGG	AGAACCGGGG	TGCTGTCTAC	CTGTTTCACG	GAGCCTCAGA	ATCCGGCATC	1860
AGCCCCTCCC	ACAGCCAGCG	GATTGCCAGC	TCCCAGCTCT	CCCCCAGGCT	GCAGTATTTT	1920
GGGCAGGCGC	TGAGTGGGGG	TCAGGACCTC	ACCCAGGATG	GACTGATGGA	CCTGGCCGTG	1980
GGGGCCCGGG	GCCAGGTGCT	CCTGCTCAGG	AGTCTGCCGG	TGCTGAAAGT	GGGGGTGGCC	2040
ATGAGATTCA	GCCCTGTGGA	GGTGGCCAAG	GCTGTGTACC	GGTGCTGGGA	AGAGAAGCCC	2100
AGTGCCCTGG	AAGCTGGGGA	CGCCACCGTC	TGTCTCACCA	TCCAGAAAAG	CTCACTGGAC	2160
CAGCTAGGTG	ACATCCAAAG	CTCTGTCAGG	TTTGATCTGG	CACTGGACCC	AGGTCGTCTG	2220
ACTTCTCGTG	CCATTTTCAA	TGAAACCAAG	AACCCCACTT	TGACTCGAAG	AAAAACCCTG	2280
GGACTGGGGA	TTCACTGTGA	AACCCTGAAG	CTGCTTTTGC	CAGATTGTGT	GGAGGATGTG	2340
GTGAGCCCCA	TCATTCTGCA	CCTCAACTTC	TCACTGGTGA	GAGAGCCCAT	CCCCTCCCCC	2400
CAGAACCTGC	GTCCTGTGCT	GGCCGTGGGC	TCACAAGACC	TCTTCACTGC	TTCTCTCCCC	2460
TTCGAGAAGA	ACTGTGGGCA	AGATGGCCTC	TGTGAAGGGG	ACCTGGGTGT	CACCCTCAGC	2520
TTCTCAGGCC	TGCAGACCCT	GACCGTGGGG	AGCTCCCTGG	AGCTCAACGT	GATTGTGACT	2580
GTGTGGAACG	CAGGTGAGGA	TTCCTACGGA	ACCGTGGTCA	GCCTCTACTA	TCCAGCAGGG	2640
CTGTCGCACC	GACGGGTGTC	AGGAGCCCAG	AAGCAGCCCC	ATCAGAGTGC	CCTGCGCCTG	2700
GCATGTGAGA	CAGTGCCCAC	TGAGGATGAG	GGCCTAAGAA	GCAGCCGCTG	CAGTGTCAAC	2760
CACCCCATCT	TCCATGAGGG	CTCTAACGGC	ACCTTCATAG	TCACATTCGA	TGTCTCCTAC	2820

216 • · • 4 · 4 •4 4444

4

AAGGCCACCC	TGGGAGACAG	GATGCTTATG	AGGGCCAGTG	CAAGCAGTGA	GAACAATAAG	2880
GCTTCAAGCA	GCAAGGCCAC	CTTCCAGCTG	GAGCTCCCGG	TGAAGTATGC	AGTCTACACC	2940
ATGATCAGCA	GGCAGGAAGA	ATCCACCAAG	TACTTCAACT	TTGCAACCTC	CGATGAGAAG	3000
AAAATGAAAG	AGGCTGAGCA	TCGATACCGT	GTGAATAACC	TCAGCCAGCG	AGATCTGGCC	3060
ATCAGCATTA	ACTTCTGGGT	TCCTGTCCTG	CTGAACGGGG	TGGCTGTGTG	GGATGTGGTC	3120
ATGGAGGCCC	CATCTCAGAG	TCTCCCCTGT	GTTTCAGAGA	GAAAACCTCC	CCAGCATTCT	3180
GACTTCCTGA	CCCAGATTTC	AAGAAGTCCC	ATGCTGGACT	GCTCCATTGC	TGACTGCCTG	3240
CAGTTCCGCT	GTGACGTCCC	CTCCTTCAGC	GTCCAGGAGG	AGCTGGATTT	CACCCTGAAG	3300
GGCAATCTCA	GTTTCGGCTG	GGTCCGCGAG	ACATTGCAGA	AGAAGGTGTT	GGTCGTGAGT	3360
GTGGCTGAAA	TTACGTTCGA	CACATCCGTG	TACTCCCAGC	TTCCAGGACA	GGAGGCATTT	3420
ATGAGAGCTC	AGATGGAGAT	GGTGCTAGAA	GAAGACGAGG	TCTACAATGC	CATTCCCATC	3480
ATCATGGGCA	GCTCTGTGGG	GGCTCTGCTA	CTGCTGGCGC	TCATCACAGC	CACACTGTAC	3540
AAGCTTGGCT	TCTTCAAACG	CCACTACAAG	GAAATGCTGG	AGGACAAGCC	TGAAGACACT	3600
GCCACATTCA	GTGGGGACGA	TTTCAGCTGT	GTGGCCCCAA	ATGTGCCTTT	GTCCTAATAA	3660
TCCACTTTCC	TGTTTATCTC	TACCACTGTG	GGCTGGACTT	GCTTGCAACC	ATAAATCAAC	3720
TTACATGGAA	ACAACTTCTG	CATAGATCTG	CACTGGCCTA	AGCAACCTAC	CAGGTGCTAA	3780
GCACCTTCTC	GGAGAGATAG	AGATTGTCAA	TGTTTTTACA	TATCTGTCCA	TCTTTTTCAG	3840
CAATGACCCA	CTTTTTACAG	AAGCAGGCAT	GGTGCCAGCA	TAAATTTTCA	TATGCTTAAG	3900
AATTGTCACA	TGAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	CTTTAG	3956

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3785 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ : 1..3486 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:98:

ATG ACC

TTC

GGC

ACT

GTG

CTT

CTG

AGT

GTC

CTG

GCT

TCT

TAT

CAT

48

Met

Thr

Phe

Gly

Thr

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

Tyr

His

1

5

10

15

217 • a ··

GGA	TTC	AAC	CTG	GAT	GTG	GAG	GAG	CCT
Gly	Phe	Asn	Leu 20	Asp	Val	Glu	Glu	Pro 25
GGC	GGC	TTT	GGG	CAG	AGC	GTG	GTG	CAG
Gly	Gly	Phe 35	Gly	Gin	Ser	Val	Val 40	Gin
GTG	GGA	GCA	CCC	CTG	GAG	GTG	GTG	GCG
Val	Gly 50	Ala	Pro	Leu	Glu	Val 55	Val	Ala
TAT	GAC	TGC	GCA	GCT	GCC	ACC	GGC	ATG
Tyr 65	Asp	Cys	Ala	Ala	Ala 70	Thr	Gly	Met
ATC	CGC	CCT	GAG	GCC	GTG	AAC	ATG	TCC
Ile	Arg	Pro	Glu	Ala 85	Val	Asn	Met	Ser
TCC	ACC	AAC	GGC	TCC	CGG	CTC	CTG	GCC
Ser	Thr	Asn	Gly 100	Ser	Arg	Leu	Leu	Ala 105
GTC	TGT	GGG	GAG	AAC	TCA	TAC	TCA	AAG
Val	Cys	Gly 115	Glu	Asn	Ser	Tyr	Ser 120	Lys
TCG	CGC	TGG	GAG	ATC	ATC	CAG	ACA	GTC
Ser	Arg 130	Trp	Glu	Ile	Ile	Gin 135	Thr	Val
CCA	CAT	CAA	GAG	ATG	GAC	ATC	GTC	TTC
Pro 145	His	Gin	Glu	Met	Asp 150	Ile	Val	Phe
ATT	GAC	CAA	AAT	GAC	TTT	AAC	CAG	ATG
Ile	Asp	Gin	Asn	Asp 165	Phe	Asn	Gin	Met
ATG	GGC	CAG	TTT	GAG	GGC	ACT	GAC	ACC
Met	Gly	Gin	Phe 180	Glu	Gly	Thr	Asp	Thr 185
TCA	AAC	CTC	CTG	AAG	ATC	CAC	TTC	ACC
Ser	Asn	Leu 195	Leu	Lys	Ile	His	Phe 200	Thr
CCG	AGC	CAG	CAG	AGC	CTG	GTG	GAT	CCC
Pro	Ser 210	Gin	Gin	Ser	Leu	Val 215	Asp	Pro
ACG	TTC	ACG	GCC	ACG	GGC	ATC	CTG	ACA
Thr 225	Phe	Thr	Ala	Thr	Gly 230	Ile	Leu	Thr
CAT	AAG	AAT	GGG	GCC	CGA	AAA	AGT	GCC
His	Lys	Asn	Gly	Ala 245	Arg	Lys	Ser	Ala

• a · flfl · a · · · · ·

	• •	• • • a • a a a a a	• • •	• · • · • · a · • ·	a • • a • · • ·	a a a · a a ·· • · · · · • a * • a ··
ACG	ATC	TTC	CAG	GAG	GAT	GCA	96
Thr	Ile	Phe	Gin	Glu 30	Asp	Ala
TTC	GGT	GGA	TCT	CGA	CTC	GTG	144
Phe	Gly	Gly	Ser 45	Arg	Leu	Val
GCC	AAC	CAG	ACG	GGA	CGG	CTG	192
Ala	Asn	Gin 60	Thr	Gly	Arg	Leu
TGC	CAG	CCC	ATC	CCG	CTG	CAC	240
Cys	Gin 75	Pro	Ile	Pro	Leu	His 80
TTG	GGC	CTG	ACC	CTG	GCA	GCC	288
Leu 90	Gly	Leu	Thr	Leu	Ala 95	Ala
TGT	GGC	CCG	ACC	CTG	CAC	AGA	336
Cys	Gly	Pro	Thr	Leu 110	His	Arg
GGT	TCC	TGC	CTC	CTG	CTG	GGC	384
Gly	Ser	Cys	Leu 125	Leu	Leu	Gly
CCC	GAC	GCC	ACG	CCA	GAG	TGT	432
Pro	Asp	Ala 140	Thr	Pro	Glu	Cys
CTG	ATT	GAC	GGC	TCT	GGA	AGC	480
Leu	Ile 155	Asp	Gly	Ser	Gly	Ser 160
AAG	GGC	TTT	GTC	CAA	GCT	GTC	528
Lys 170	Gly	Phe	Val	Gin	Ala 175	Val
CTG	TTT	GCA	CTG	ATG	CAG	TAC	576
Leu	Phe	Ala	Leu	Met 190	Gin	Tyr
TTC	ACC	CAA	TTC	CGG	ACC	AGC	624
Phe	Thr	Gin	Phe 205	Arg	Thr	Ser
ATC	GTC	CAA	CTG	AAA	GGC	CTG	672
Ile	Val	Gin 220	Leu	Lys	Gly	Leu
GTG	GTG	ACA	CAG	CTA	TTT	CAT	720
Val	Val 235	Thr	Gin	Leu	Phe	His 240
AAG	AAG	ATC	CTC	ATT	GTC	ATC	768
Lys 250	Lys	Ile	Leu	Ile	Val 255	Ile

218 • 4 4· • · 4 «· · · · · 4 « · 44 4 4 4·« • · «4 4 44 4444 * • · «444 444 ·· 444· ·* 4 4 4 4

444«

4

« ·

··

4 · 4 4

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

GAA

TAC

AGT

GAT

GTC

ATC

816

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

260

265

270

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC

CGC

TAC

GCT

ATC

GGG

GTG

GGA

864

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

912

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

960

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

AAG

ATC

TAT

GCA

GTT

GAG

1008

Leu

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

GGA

ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

TCC

TTC

CAG

CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1056

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA

ATG

GAT

GGC

CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1104

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

CTG

TAT

CCC

CCA

AAT

1152

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1200

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GAG

CTA

GCC

CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1248

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC

CGC

TAC

CAG

CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1296

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

GTC ATC

TTC ACC

CAG Gin

GTG Val

TCC AGG Ser Arg 440

CAA Gin

TGG Trp

AGG Arg

AAG AAG

GCC Ala

GAA Glu

GTC Val

1344

Val

Ile

Phe 435

Thr

Lys

Lys 445

ACA

GGG

ACG

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCC

CTC

TGC

TCC

GTG

1392

Thr

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

CCC

1440

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

1488

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

219 • 4 ΦΦ • 4 Φ 4 Φ

Φ · Φ ΦΦ

Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ

Φ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ φφ φφφφ

Φ Φ • 4 • · • · ΦΦΦΦ ^r

Φ Φ

Φ Φ » 4

Φ Φ

ΦΦ

ΦΦΦΦ

CCT

AGG

GGG

AGG

GTG

CAG

TGG

CAG

TGT

GAC

GCT

GTT

CTC

CGT

GGT

GAG

Pro

Arg

Gly

Arg 500

Val

Gin

Trp

Gin

Cys 505

Asp

Ala

Val

Leu

Arg 510

Gly

Glu

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

GGG

Gin

Gly

His 515

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe 520

Gly

Ala

Leu

Thr 525

Val

Leu

Gly

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

GGA

Asp

Val 530

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu 535

Ile

Asp

Val

Ala

Ile 540

Gly

Ala

Pro

Gly

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

GAA

Glu 545

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly 550

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe 555

His

Gly

Ala

Ser

Glu 560

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

CTC

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro 565

Ser

His

Ser

Gin

Arg 570

Ile

Ala

Ser

Gin 575

Leu

TCC

CCC

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

GCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

Ser

Pro

Arg

Leu 580

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin 585

Ala

Leu

Ser

Gly

Gly 590

Gin

Asp

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

CAG

Leu

Thr

Gin 595

Asp

Gly

Leu

Met

Asp 600

Leu

Ala

Val

Gly

Ala 605

Arg

Gly

Gin

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

ATG

Val

Leu 610

Leu

Arg

Ser

Leu 615

Pro

Val

Leu

Lys

Val 620

Gly

Val

Ala

Met

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

GAA

Arg 625

Phe

Ser

Pro

Val

Glu 630

Val

Ala

Lys

Ala

Val 635

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu 640

GAG

AAG

CCC

AGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

ACC

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala 645

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp 650

Ala

Thr

Val

Cys

Leu 655

Thr

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

GTC

Ile

Gin

Lys

Ser 660

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu 665

Gly

Asp

Ile

Gin

Ser 670

Ser

Val

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

2016

AGG

TTT

GAT

CTG

GCA

CTG

GAC

CCA

GGT

CGT

CTG

ACT

TCT

CGT

GCC

ATT

Arg

Phe

Asp 675

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro 680

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser 685

Arg

Ala

Ile

TTC

AAT

GAA

ACC

AAG

AAC

CCC

ACT

TTG

ACT

CGA

AGA

AAA

ACC

CTG

GGA

Phe

Asn 690

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro 695

Thr

Leu

Thr

Arg

Arg 700

Lys

Thr

Leu

Gly

CTG

GGG

ATT

CAC

TGT

GAA

ACC

CTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAT

TGT

GTG

Leu 705

Gly

Ile

His

Cys

Glu 710

Thr

Leu

Lys

Leu

Leu 715

Leu

Pro

Asp

Cys

Val 720

GAG

GAT

GTG

AGC

CCC

ATC

ATT

CTG

CAC

CTC

AAC

TTC

TCA

CTG

GTG

Glu

Asp

Val

Ser 725

Pro

Ile

Leu

His 730

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu 735

Val

2064

2112

2160

2208

220 • « · φ

AGA

GAG

CCC

ATC

CCC

TCC

CCC

CAG

AAC

CTG

CGT

CCT

GTG

CTG

GCC

GTG

Arg

Glu

Pro

Ile 740

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn 745

Leu

Arg

Pro

Val

Leu 750

Ala

Val

GGC

TCA

CAA

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

TGT

Gly

Ser

Gin 755

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala 760

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu 765

Lys

Asn

Cys

GGG

CAA

GAT

GGC

CTC

TGT

GAA

GGG

GAC

CTG

GGT

GTC

ACC

CTC

AGC

TTC

Gly

Gin 770

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu 775

Gly

Asp

Leu

Gly

Val 780

Thr

Leu

Ser

Phe

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

GTG

Ser 785

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu 790

Thr

Val

Gly

Ser

Ser 795

Leu

Glu

Leu

Asn

Val 800

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

AAC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

GTC

Ile

Val

Thr

Val

Trp 805

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp 810

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val 815

Val

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

GCC

Ser

Leu

Tyr

Tyr 820

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser 825

His

Arg

Val

Ser 830

Gly

Ala

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA

GTG

Gin

Lys

Gin 835

Pro

His

Gin

Ser

Ala 840

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Thr

Val

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

CAC

Pro

Thr 850

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu 855

Arg

Ser

Arg

Cys 860

Ser

Val

Asn

His

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

GAT

Pro 865

Ile

Phe

His

Glu

Gly 870

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe 875

Ile

Val

Thr

Phe

Asp 880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

AGT

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala 885

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg 890

Met

Leu

Met

Arg

Ala 895

Ser

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

CAG

Ala

Ser

Glu 900

Asn

Lys

Ala

Ser 905

Ser

Lys

Ala

Thr 910

Phe

Gin

CTG

GAG

CTC

CCG

GTG

AAG

TAT

GCA

GTC

TAC

ACC

ATG

ATC

AGC

AGG

CAG

Leu

Glu

Leu 915

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala 920

Val

Tyr

Thr

Met

Ile 925

Ser

Arg

Gin

GAA

TCC

ACC

AAG

TAC

TTC

AAC

TTT

GCA

ACC

TCC

GAT

GAG

AAG

AAA

Glu

Glu 930

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe 935

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser 940

Asp

Glu

Lys

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

CGA

Met 945

Lys

Glu

Ala

Glu

His 950

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn 955

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg 960

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

GGG

Asp

Leu

Ala

Tle

Ser 965

Ile

Asn

Phe

Trp

Val 970

Pro

Val

Leu

Asn 975

Gly

2256

2304

2352

2400

2448

2496

2544

2592

2640

2688

2736

2784

2832

2880

2928

221 • · • · · · • · · ·

	• · · ·	t	• ·	• *	«·	• ·
GTG GCT GTG TGG GAT GTG	GTC ATG GAG GCC CCA TCT	CAG	AGT	CTC	CCC	2976
Val Ala Val Trp Asp Val	Val Met Glu Ala Pro Ser	Gin	Ser	Leu	Pro
980	985		990
TGT GTT TCA GAG AGA AAA	CCT CCC CAG CAT TCT GAC	TTC	CTG	ACC	CAG	3024
Cys Val Ser Glu Arg Lys	Pro Pro Gin His Ser Asp	Phe	Leu	Thr	Gin
995	1000	1005
ATT TCA AGA AGT CCC ATG	CTG GAC TGC TCC ATT GCT	GAC	TGC	CTG	CAG	3072
Ile Ser Arg Ser Pro Met	Leu Asp Cys Ser Ile Ala	Asp	Cys	Leu	Gin
1010	1015 1020
TTC CGC TGT GAC GTC CCC	TCC TTC AGC GTC CAG GAG	GAG	CTG	GAT	TTC	3120
Phe Arg Cys Asp Val Pro	Ser Phe Ser Val Gin Glu	Glu	Leu	Asp	Phe
1025 1030 1035				1040
ACC CTG AAG GGC AAT CTC	AGT TTC GGC TGG GTC CGC	GAG	ACA	TTG	CAG	3168
Thr Leu Lys Gly Asn Leu	Ser Phe Gly Trp Val Arg	Glu	Thr	Leu	Gin
1045	1050			1055
AAG AAG GTG TTG GTC GTG	AGT GTG GCT GAA ATT ACG	TTC	GAC	ACA	TCC	3216
Lys Lys Val Leu Val Val	Ser Val Ala Glu Ile Thr	Phe	Asp	Thr	Ser
1060	1065		1070
GTG TAC TCC CAG CTT CCA	GGA CAG GAG GCA TTT ATG	AGA	GCT	CAG	ATG	3264
Val Tyr Ser Gin Leu Pro	Gly Gin Glu Ala Phe Met	Arg	Ala	Gin	Met
1075	1080	1085
GAG ATG GTG CTA GAA GAA	GAC GAG GTC TAC AAT GCC	ATT	CCC	ATC	ATC	3312
Glu Met Val Leu Glu Glu	Asp Glu Val Tyr Asn Ala	Ile	Pro	Ile	Ile
1090	1095 1100
ATG GGC AGC TCT GTG GGG	GCT CTG CTA CTG CTG GCG	CTC	ATC	ACA	GCC	3360
Met Gly Ser Ser Val Gly	Ala Leu Leu Leu Leu Ala	Leu	Ile	Thr	Ala
1105 1110 1115				1120
ACA CTG TAC AAG CTT GGC	TTC TTC AAA CGC CAC TAC	AAG	GAA	ATG	CTG	3408
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly	Phe Phe Lys Arg His Tyr	Lys	Glu	Met	Leu
1125	1130			1135
GAG GAC AAG CCT GAA GAC	ACT GCC ACA TTC AGT GGG	GAC	GAT	TTC	AGC	3456
Glu Asp Lys Pro Glu Asp	Thr Ala Thr Phe Ser Gly	Asp	Asp	Phe	Ser
1140	1145		1150

TGT	GTG	GCC CCA	AAT	GTG	CCT	TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT	3503
Cys	Val	Ala Pro 1155	Asn	Val	Pro	Leu Ser 1160

TATCTCTACC	ACTGTGGGCT	GGACTTGCTT	GCAACCATAA	ATCAACTTAC	ATGGAAACAA	3563
CTTCTGCATA	GATCTGCACT	GGCCTAAGCA	ACCTACCAGG	TGCTAAGCAC	CTTCTCGGAG	3623
AGATAGAGAT	TGTCAATGTT	TTTACATATC	TGTCCATCTT	TTTCAGCAAT	GACCCACTTT	3683
TTACAGAAGC	AGGCATGGTG	CCAGCATAAA	TTTTCATATG	CTTAAGAATT	GTCACATGAA	3743
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAACTTT	AG		3785

222 • · · · « · • · ·· · ···· • · · · · ·· ···· · • · ·*·· · * · ··»· 4 ♦· ·· ·· ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:99:

Met 1

Thr

Phe

Gly Thr 5

Val

Leu

Ser 10

Val

Leu

Ala

Ser

Tyr 15

His

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

Ile

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

65

70

75

80

Ile

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

85

90

95

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

Ser

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

Ile

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

165

170

175

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

210

215

220

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

240

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

245

250

255

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

260

265

270

223

··* a *

··

• 0

0

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

Leu

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

Thr

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

224 ··· · • · · · · ···· • · ·· · · · · · · · * • · ···· · · * ····· ·· ·· ·· ··

Leu Thr

Gin Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala

Arg Gly Gin

595

600

605

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

Ile

Gin

Ser

Val

660

665

670

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

Ile

675

680

685

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

690

695

700

Leu

Gly

Ile

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

705

710

715

720

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725

730

735

Arg

Glu

Pro

Ile

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

740

745

750

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

Ile

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

Ile

Val

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

225 ·· ···* ·. ···· «· ··

«.· · · · · ··«>

• · · · · · · · · » · ·· · · · · · · · · • »··· · · · • · · · · ·· · · · · ··

Leu

Glu Leu 915

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala 920

Val

Tyr

Thr

Met

Ile 925

Ser

Arg

Gin

Glu

Glu Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

Met

Lys Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

Asp

Leu Ala

Ile

Ser

Ile

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala Val

Trp

Asp

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Pro

980

985

990

Cys

Val Ser

Glu

Arg

Lys

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

Ile

Ser Arg

Ser

Pro

Met

Leu

Asp

Cys

Ser

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

Gin

1010

1015

1020

Phe

Arg Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

Thr

Leu Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

Lys

Lys Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

1070

Val

Tyr Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

Met

1075

1080

1085

Glu

Met Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

Ile

Pro

Ile

1090

1095

1100

Met

Gly Ser

Ser

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Ala

1105

1110

1115

1120

Thr

Leu Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

Glu

Asp Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Phe

Ser

Gly

Asp

Phe

Ser

1140

1145

1150

Cys

Val Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Leu

Ser

1155

1160

(2)

INFORMACE 0

SEK.

ID.

Č. :

100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1318 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

226 « · • · • · • · · 4 · ·· · · · · · • « · 4 · 4 444 • 4444 44 «4 4 4 44 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 17..1255

(xi) POPIS SEKVENCE:	SEK.	ID.	Č. :	100:
AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT	GTG	GTC	CTC	CTT	GGG	GTC	CTG	GCT	TCT	49
Gly Ala	Val	Val	Leu	Leu	Gly	Val	Leu	Ala	Ser
1			5					10

TAC Tyr

CAC His

GGA Gly

TTC Phe 15

AAC Asn

TTG Leu

GAC Asp

GTG Val

GAT Asp 20

GAG Glu

CCG Pro

GTG Val

ATC Ile

TTC Phe 25

CAG Gin

GAA Glu

97

GAC

GCA

GCG

GGC

TTC

GGG

CAG

AGC

GTG

ATG

CAG

TTT

GGA

TCT

CGA

145

Asp

Ala

Ala 30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser 35

Val

Met

Gin

Phe

Gly 40

Gly

Ser

Arg

CTC

GTG

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

193

Leu

Val 45

Val

Gly

Ala

Pro

Leu 50

Ala

Val

Ser

Ala 55

Asn

His

Thr

Gly

CGG

CTG

TAC

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

241

Arg 60

Leu

Tyr

Glu

Cys

Ala 65

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr 70

Cys

Thr

Pro

Ile

Phe 75

CCA

TTC

ATG

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

289

Pro

Phe

Met

Pro

Pro 80

Glu

Ala

Val

Asn

Met 85

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser 90

Leu

GCA

GCC

TCC

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

337

Ala

Ser

Pro 95

Asn

His

Ser

Gin

Leu 100

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro 105

Thr

Val

CAT

AGA

GCC

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

385

His

Arg

Ala 110

Cys

Gly

Glu

Asp

Val 115

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe 120

Cys

Val

Leu

CTG

GAT

GCC

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

433

Leu

Asp 125

Ala

His

Ala

Gin

Pro 130

Ile

Gly

Thr

Val

Pro 135

Ala

Leu

Pro

GAG

TGC

CCA

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

481

Glu 140

Cys

Pro

Asp

Gin

Glu 145

Met

Asp

Ile

Val

Phe 150

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser 155

GGC

AGC

ATT

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

529

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser 160

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys 165

Met

Lys

Asp

Phe

Val 170

Arg

GCT

GTG

ATG

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

577

Ala

Val

Met

Asp 175

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr 180

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser 185

Leu

Met

CAG

TAC

TCC

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

625

Gin

Tyr

Ser 190

Asn

Val

Leu

Val

Thr 195

His

Phe

Thr

Phe

Ser 200

Ser

Phe

Arg

227 • fe fefefefe fefefe • fefefefe fefe fefe · · · ·

AAC Asn

AGC Ser 205

TCC AAT Ser Asn

CCT Pro

CAG Gin

GGC Gly 210

CTA GTG Leu Val

GAG Glu

CCC Pro

ATT Ile 215

GTG Val

CAG Gin

CTG Leu

ACA Thr

673

GGC

CTC

ACG

TTC

ACG

GCC

ACA

GGG

ATC

CTG

AAA

GTG

ACA

GAG

CTG

721

Gly

Leu

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

220

225

230

235

TTT

CAA

ACC

AAG

AAC

GGG

GCC

CGC

GAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

769

Phe

Gin

Thr

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

240

245

250

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

CAC

TAC

AGT

GCT

817

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

His

Tyr

Ser

Ala

255

260

265

GTC

ATC

CCA

CAG

GCA

GAG

CAG

GCG

GGC

ATC

CGC

TAC

GCC

ATC

GGG

865

Val

Ile

Pro

Gin

Ala

Glu

Gin

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

270

275

280

GTG

GGG

GAC

GCG

TTC

CAG

AAA

CCC

ACA

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

GAC

ACC

913

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Lys

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asp

Thr

285

290

295

ATC

GCC

TCC

GAG

CCG

CCC

GAC

GCC

CAC

GTG

TTC

CAG

GTG

GAC

AAT

TTC

961

Ile

Ala

Ser

Glu

Pro

Asp

Ala

His

Val

Phe

Gin

Val

Asp

Asn

Phe

300

305

310

315

TCA

GCA

CTC

AGC

ATC

CAA

AAG

CAG

CTG

TAT

GAC

AGG

ATC

TTT

GCC

1009

Ser

Ala

Leu

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Tyr

Asp

Arg

Ile

Phe

Ala

320

325

330

GTC

GAG

GGA

ACC

CTG

TCA

TCG

GCA

AGC

ACC

TCC

TTC

CAG

CAT

GAG

ATG

1057

Val

Glu

Gly

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

335

340

345

TCC

CAA

GAG

GGC

TTC

AGC

TCA

CTT

CTC

ACC

ACG

GAA

GGA

CCG

GTG

CTG

1105

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

350

355

360

GGG

GCT

GTG

GGC

AGC

TTC

GAT

TGG

TCC

GGG

GGT

GCT

TTC

CTG

TAC

CCC

1153

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Asp

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

365

370

375

CCC

GGC

GGG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

AAC

GTG

GAC

1201

Pro

Gly

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Asn

Val

Asp

380

385

390

395

ATG

AGG

GAC

TCC

TAC

CTG

GGT

GAG

GAA

GGG

GTG

GGG

GTG

GGG

ACA

GGT

1249

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Gly

Thr

Gly

400 405 410

GGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGGCTG GGAGGGGAGG GAAGAGGAGG 1305

Gly Ser

GGAGAGGCAA AGA 1318

228

I « • · β ·

4 9 9

(2)	INFORMACE 0	SEK.	ID.	Č. :	101:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA:	413	aminokyselin
	(B)	TYF	aminokyselina
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
	(ii) TYP MOLEKULY:	protein
	(xi) POPIS	1 SEKVENCE: SEK. ID. Č.:101:
Gly	Ala Val Val	Leu	Leu	Gly	Val Leu Ala Ser Tyr His Gly Phe Asn
1		5			10 15
Leu	Asp Val Asp	Glu	Pro	Val	Ile Phe Gin Glu Asp Ala Ala Gly Phe
	20				25 30
Gly	Gin Ser Val	Met	Gin	Phe	Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala
	35				40 45
Pro	Leu Ala Val	Val	Ser	Ala	Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Cys
	50			55	60
Ala	Pro Ala Ser	Gly	Thr	Cys	Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met Pro Pro
65			70		75 80
Glu	Ala Val Asn	Met	Ser	Leu	Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser Pro Asn
		85			90 95
His	Ser Gin Leu	Leu	Ala	Cys	Gly Pro Thr Val His Arg Ala Cys Gly
	100				105 110
Glu	Asp Val Tyr	Ala	Gin	Gly	Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala His Ala
	115				120 125
Gin	Pro Ile Gly	Thr	Val	Pro	Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro Asp Gin
	130			135	140
Glu	Met Asp Ile	Val	Phe	Leu	Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Ser
145			150		155 160
Asn	Asp Phe Arg	Lys	Met	Lys	Asp Phe Val Arg Ala Val Met Asp Gin
		165			170 175
Phe	Lys Asp Thr	Asn	Thr	Gin	Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser Asn Val
	180				185 190
Leu	Val Thr His	Phe	Thr	Phe	Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser Asn Pro
	195				200 205
Gin	Gly Leu Val	Glu	Pro	Ile	Val Gin Leu Thr Gly Leu Thr Phe Thr
	210			215	220
Ala	Thr Gly Ile	Leu	Lys	Val	Val Thr Glu Leu Phe Gin Thr Lys Asn
225			230		235 240
Gly	Ala Arg Glu	Ser	Ala	Lys	Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr Asp Gly
		245			250 255
Gin	Lys Tyr Lys	Asp	Pro	Leu	His Tyr Ser Ala Val Ile Pro Gin Ala
	260				265 270

229 • · · ·

Glu Gin Ala

Gly

Ile

Arg Tyr Ala 280

Ile

Gly

Val

Gly 285

Asp

Ala

Phe

275

Gin Lys

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin Glu Leu

Asp

Thr

Ile

Ala

Ser

Glu

Pro

290

295

300

Pro Asp

Ala

His

Val

Phe

Gin Val Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

305

310

315

320

Ile Gin

Lys

Gin

Leu

Tyr

Asp Arg Ile

Phe

Ala

Val

Glu

Gly

Thr

Leu

325

330

335

Ser Ser

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe Gin His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

340

345

350

Ser Ser

Leu

Thr

Glu Gly Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

355

360

365

Phe Asp

Trp

Ser

Gly

dy

Ala Phe Leu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Pro

370

375

380

Thr Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin Gin Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

385

390

395

400

Leu Gly

Glu

Gly

Val

Gly Val Gly

Thr

Gly

Ser

405

410

(2) INFORMACE 0

SEK

. ID.

. Č.:102:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:

: 1484 párů baží

(B) TYP: nukleová kyselina

(C) POČET

ŘETĚZCŮ: jeden

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS

	(xi)	(B) UMÍSTĚNÍ:	1..1482
popis ;	SEKVENCE:	: SEK. ID. Č.	.:102:
GAT	GTC	CAG AGC	TCC ATC	AGC TAT GAT	CTG GCA CTG GAC CCA GGC CGC
Asp 1	Val	Gin Ser	Ser Ile 5	Ser Tyr Asp	Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg 10 15
CTG	GTC	TCT CGG	GCC ATT	TTT CAA GAG	ACC CAG AAC CAG ACT TTA ACT
Leu	Val	Ser Arg 20	Ala Ile	Phe Gin Glu 25	Thr Gin Asn Gin Thr Leu Thr 30
CGA	AGG	AAG ACC	CTG GGG	CTG GGG CGT	CAC TGT GAA ACC ATG AGG CTA
Arg	Arg	Lys Thr 35	Leu Gly	Leu Gly Arg 40	His Cys Glu Thr Met Arg Leu 45
CTT	TTG	CCA GAC	TGC GTA	GAG GAC GTG	GTG AAC CCC ATC GTC CTG CAC
Leu	Leu 50	Pro Asp	Cys Val	Glu Asp Val 55	Val Asn Pro Ile Val Leu His 60

230 ·· ···· ·» ···· ·» • · ···· ··· « · · · · ·· · · · · · ·

CTC AAC

TTC Phe

TCC Ser

CTG Leu

GAG Glu 70

GGA CAG

CCA Pro

ATC Ile

CTC Leu 75

TCA Ser

TCC Ser

CAG Gin

AAT Asn

CTG Leu 80

240

Leu 65

Asn

Gly

Gin

CGC

CCT

GTG

CTG

GCC

ACG

GGC

TCG

CAG

GAC

CAC

TTC

ATT

GCC

TCC

CTC

288

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

85

90

95

CCC

TTT

GAG

AAG

AAC

TGC

GGA

CAA

GAT

CGC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

336

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Gly

Gin

Asp

Arg

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

100

105

110

AGC

ATC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCG

GGC

TTG

AAT

ACC

CTG

GTG

GGG

CTC

384

Ser

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Asn

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

115

120

125

TCC

CTG

GAG

CTC

ACA

GTG

ACA

GTG

ACC

GTG

CGG

AAT

GAG

GGC

GAG

GAC

432

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

130

135

140

TCC

TAT

GGG

ACC

GCC

ATC

ACC

CTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCC

TAC

480

Ser

Tyr

Gly

Thr

Ala

Ile

Thr

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

145

150

155

160

AGG

CGG

GTG

TCG

GGC

CAG

ACA

CAA

CCC

TGG

CAG

CGC

CCC

CTG

CAC

CTC

528

Arg

Val

Ser

Gly

Gin

Thr

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

His

Leu

165

170

175

GCA

TGT

GAG

GCT

GTA

CCT

ACC

GAG

AGC

GAG

GGC

TTG

AGG

AGT

ACC

AGC

576

Ala

Cys

Glu

Ala

Val

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Thr

Ser

180

185

190

TGC

AGC

GTC

AAC

CAC

CCC

ATC

TTC

CAA

GGG

GGT

GCT

CAG

GGC

ACT

TTC

624

Cys

Ser

Val

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Gin

Gly

Ala

Gin

Gly

Thr

Phe

195

200

205

GTA

GTC

AAG

TTC

GAT

GTC

TCC

AAG

GCC

AGC

CTG

GGT

GAC

AGG

TTG

672

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

210

215

220

CTC

ATG

GGG

GCC

AGT

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GCG

AGC

AAC

720

Leu

Met

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

AAG

ACC

TCC

TTT

GAG

CTG

GAA

CTG

CCA

GTG

AAA

TAC

GCT

GTC

TAC

ATG

768

Lys

Thr

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Met

245

250

255

ATG ATC

ACA Thr

AGG Arg 260

CAC His

GAA Glu

GGC Gly

TCC ACC AGG

TTC Phe

AAC Asn

TTT Phe 270

TCC Ser

ACT Thr

816

Met

Ile

Ser

Thr 265

Arg

TCC

GCT

GAG

AAG

AGC

AAA

GAG

GCC

GAG

CAC

CGC

TAT

CGG

GTG

AAC

864

Ser

Ala

Glu

Lys

Ser

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

275

280

285

AAC

CTG

AGT

CTG

CGA

GAT

GTG

GCC

GTC

AGC

GTG

GAC

TTC

TGG

GCC

CCC

912

Asn

Leu

Ser

Leu

Arg

Asp

Val

Ala

Val

Ser

Val

Asp

Phe

Trp

Ala

Pro

290

295

300

231

GTG Val 305

CAG Gin

CTG AAC

GGA GCA GCT

GTG Val

TGG GAC

GTG GCG Val Ala 315

GTG Val

GAG Glu

GCC Ala

CCT Pro 320

960

Leu

Asn

Gly

Ala 310

Ala

Trp

Asp

GCC

CAG

AGC

CTG

CCC

TGT

GCG

CGG

GAG

AGG

GAA

CCT

CCG

AGG

ACC

TCT

1008

Ala

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Glu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

GAC

CTG

AGC

CGG

GTC

CCG

GGG

AGT

CCC

GTG

CTG

GAC

TGC

AGC

GTT

GCG

1056

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

Val

Ala

340

345

350

CAC

TGC

CTG

AGG

TTC

CGC

TGC

CAC

ATC

CCC

TCC

TTC

AGC

GCC

AAG

GAG

1104

His

Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

His

Ile

Pro

Ser

Phe

Ser

Ala

Lys

Glu

355

360

365

GAG

CTC

CAC

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

GCC

TGG

GTC

AGC

1152

Glu

Leu

His

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Trp

Val

Ser

370

375

380

CAG

ATG

CTG

CAA

AAG

GTG

TCG

GTG

AGT

GTG

GCC

GAG

ATC

ACC

1200

Gin

Met

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

385

390

395

400

TTC

AAC

AGG

GCC

GTG

TAC

TCC

CAA

GTT

CCG

GGC

GAG

CCC

TTT

ATG

1248

Phe

Asn

Arg

Ala

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

Met

405

410

415

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACG

GTG

CTG

GAG

TAT

GAG

CAC

GAC

CCC

1296

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

His

Asp

Pro

420

425

430

GTC

CCC

CTG

GTG

GGC

AGC

TGT

GTG

GGC

CTG

GCT

1344

Val

Pro

Leu

Val

Gly

Ser

Cys

Val

Gly

Leu

Ala

435

440

445

CTC

ATC

TCA

GCC

ACC

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAG

CGC

CGG

TAC

1392

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Tyr

450

455

460

AAG

GAG

ATG

CTG

GGC

GAG

AAA

CCG

GGA

GAC

GCG

GCC

ACC

TTC

CCC

GGG

1440

Lys

Glu

Met

Leu

Gly

Glu

Lys

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

465

470

475

480

GAG

GAC

GCC

AGC

TGC

GGG

GCT

TCA

GAT

TTG

CCT

TTG

TCC

CAG

1482

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly

Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

485

490

TG 1484 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

232 • · « ·

	• • • • · · ·	• • « • •	• · • · • · • ·	• • • · • ·	• • · < • <
(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID.	Č. :103:
Asp Val Gin Ser Ser Ile Ser Tyr	Asp Leu Ala Leu	Asp	Pro	Gly	Arg
1 5	10			15
Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gin	Glu Thr Gin Asn	Gin	Thr	Leu	Thr
20	25		30
Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly	Arg His Cys Glu	Thr	Met	Arg	Leu
35 40		45
Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp	Val Val Asn Pro	Ile	Val	Leu	His
50 55	60
Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gin	Pro Ile Leu Ser	Ser	Gin	Asn	Leu
65 70	75				80
Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser	Gin Asp His Phe	Ile	Ala	Ser	Leu
85	90			95
Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gin	Asp Arg Leu Cys	Glu	Gly	Asp	Leu
100	105		110
Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly	Leu Asn Thr Leu	Leu	Val	Gly	Leu
115 120		125
Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val	Thr Val Arg Asn	Glu	Gly	Glu	Asp
130 135	140
Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu	Tyr Tyr Pro Ala	Gly	Leu	Ser	Tyr
145 150	155				160
Arg Arg Val Ser Gly Gin Thr Gin	Pro Trp Gin Arg	Pro	Leu	His	Leu
165	170			175
Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu	Ser Glu Gly Leu	Arg	Ser	Thr	Ser
180	185		190
Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe	Gin Gly Gly Ala	Gin	Gly	Thr	Phe
195 200		205
Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser	Lys Ala Ser Leu	Gly	Asp	Arg	Leu
210 215	220
Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser	Glu Asn Asn Lys	Pro	Ala	Ser	Asn
225 230	235				240
Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu	Pro Val Lys Tyr	Ala	Val	Tyr	Met
245	250			255
Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser	Thr Arg Phe Phe	Asn	Phe	Ser	Thr
260	265		270
Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu	Ala Glu His Arg	Tyr	Arg	Val	Asn
275 280		285
Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala	Val Ser Val Asp	Phe	Trp	Ala	Pro
290 295	300

233 • · ··· ···· • · · · · · · · · · · · • · ···· · · · ····· ·· ·· · · · ·

Val 305

Gin Leu Asn

Gly Ala Ala 310

Val

Trp Asp Val 315

Ala

Val

Glu

Ala

Pro 320

Ala

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Glu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

Val

Ala

340

345

350

His

Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

His

Ile

Pro

Ser

Phe

Ser

Ala

Lys

Glu

355

360

365

Glu

Leu

His

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Trp

Val

Ser

370

375

380

Gin

Met

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

385

390

395

400

Phe

Asn

Arg

Ala

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

Met

405

410

415

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

His

Asp

Pro

420

425

430

Val

Pro

Leu

Val

Gly

Ser

Cys

Val

Gly

Leu

Ala

435

440

445

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Tyr

450

455

460

Lys

Glu

Met

Leu

Gly

Glu

Lys

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

465

470

475

480

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly

Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

485 490

O

234

I · · · · · · · · ·· · · • · · · · · · · • ·· · ···· ···· ·· ·· ·· ·· /ř

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hybridom označený 199M.

2. Monoklonální protilátka sekretovaná hybridomem podle nároku 1.

235 er < Lft ř*» r^o σι ovo uínco

I · · · • · · · • · ·» ·· or^co

OY 0Y 0Y OJ 04 CM αϋ TF-GT—VLL LSVLASYHGF NLDVEEPTIF QEDAGGFGQS VVQFGGSRLV CDlln MA-LR—VLL LTALTLCHGF NLDTENAMTF QENARGFGQS VVQLQGSRVV CDllc MTRTRAALLL FTALATSLGF NLDTEELTAF RVDSAGFGDS VVQYANSMVV

Χ«Λ4Ζ)

OOO

CZ)tZ)CZ)

X UJ LU oso.fi.

zoš ooo

O-fiSO www a. a. o. oxx ooo

0X0 xaso XXX XX2 zoas UL.L. XXX <00 co fi.fi.fi. O LU X <<< f—xz ooo z lu as ooo XUIX XOX <z)c/)cz) ss as >— ouoz a.aso > > X Xh-t/ϊ 0X0 F-O OS OOO ZH< XXX <<CZ) mJ wi ZZZ <<< o x> XXX zoo 0.0.0. <CZ)CZ) OOO ooo >XO XXX OLUX > > s> h-XOS ooo XQSZ ooo ooo ř—H-H www HO.)- οχσ) >>> o< XOO h-cofl. HX2S >->-> LU O 0 oxo —JXO XXX SfiS i LUXO HWW XXX 1 O 1 U.UL. OO< X>X osacH OOO HHH ooo cncoa. O LU CO <<< <X< ooo ΣΣη f— ř— ř— xx< 0X0 XZ>- XOO

LU

-JU.Uooo ooo

Σ(Ζ)< ooo unoo XXX xoo XXX ooo OXZ «u HFF XXH OZX ooo ooo cz)xS2 Sí í C/)>O >X z >->->- x x> >->-> <oo (ΛΗΣ zx< fi.fi.CZ) xoo ooo ooo LU LUX XXX ooz §g3 ooo XXCZ) >·>> OCZ)O zzx a.J ^aJ ^.J ooo zoo ooo OOO oxco cqcz)cz) zuno >H-UI □ ΗΙΛ >-xx ooo xoz KH hH FH oxx zzz X Zx CZ)CZ)CZ) cz)zz oxz ooo —J ooo xxuo ooo zzz XXI·— CZ)(Z)CZ) unzx ooo sss XXX ooo xzz X X X ooo ooo xox XXX > >X ooo XXX XXX > »-4 FH <<< ooo OLUX M>H

xut *

UJ

N co o

XLUX

XXX

oas XXX <<< ooo ooo zoo <Z)fi.CZ) oxx ZCZXZ) XXX =®§ xox xxx tfct χ χ χ XXX zzz ZXX <<< CZ) Z O α υ BQ u CQ O a o CQ O X X X X X X X X X X X X XX XX X X XX ooo QOO QOO QOO QOO es oo esoo boo BOO 800

* ·· · ao QELNTISSAP PQDIIVFKVDN FAALGSIQKQ LQEKIYAVEG TQSRASSSFQ 346 COllB QELNTIASKP PRDHVFQVNN FEALKTIQNQ LREKIFAIEG TQTGSSSSFE 347 CDllc KELNDIASKP SQEHIFKVED FDALKDIQNQ LKEKIFAIEG TETISSSSFE 348 oso 9* ΟΎ O po po ro /

ko r^-co «5Γ «3 «Ρ

A ono

CTí 0) «3- <0 <3·«3·<Γ

LOLOLO

>co> LUZUJ 0.0.0. 0LUUJ zaz <<«C -J-JU UJUIUI ω>ω 0.0.0. 000 a osa *ι/>Σ 000 0.0.0. CO0 CO osujS 2> <<< ΣΣΣ CO CO CO 000 aza 0 0 0 0 p-4 PH OS 0 OS 000 U.U.U. CO 0 CO 000 ^p 0 Η- H-H- 000 ca o O.COO. 000 os os os 000 CO^CO 0 Kw 0 0 0 bJ i^J tUl SU1S LlLlLl 000 z^z 0jE0 LUUJUI 000 o. co o. >->->- LU00 0.00. 000 SES SC SC >->>- £2—iš Z sc ss 0 0 0 -J—I-J 0 0 0 o. cl o. 000 LlLlLl 0 1—4 0 <<< 000 o< sss 000 000 000 HHW 000 000 >->-> hJ «j ÍjIjj co < co 0 0 0

0.0.0.

000 000 CO COíO

000

LlLlLl >>->ααα

o. o. co COCOCO

CO

U.0ÍL 000 0 0 Η- 000 CO CO CO —J—I—l ΟΟ CO CO LL U.U. 000 0 0 s* 000 os os os 0 0 0 —1 —10 0Z0 000 <0< zcoco coco0 223 0CO0 000 000 0.0.0. .U—1—1 ^0 ^0 ^0 Ζ0Ζ U.00 0Z0 000 000 0 0.0. ^sz^s 000 000 3. OS COCOCO lululj co sc o 000 000 000 ZCOO. <0<: 0 00 OS>0 0 0 0 000 CO CO CO Uhul <o ukclu 0<0 355 <<<

oss 01 0) 0* UOLOLO

0^0 cococo

CO00 z os o: aaa

COCOCO cococo 0.0.0. cococo PH 0 0 00CO co co o. 000 COCO-J sss

0<< co<co LlLlU. aaa «s sc sc co co to 000 ^B 000 LlLlU. 00Ll 000 co«cco 00 · 0 0 0 000 000 222 000 LU Ul LU 000 WHH 0OS3 s> 0 ^p 000 co<co 000 0<OS *5 «£«5 COCO< aaa 0 0 OSOČ OS 000 ΣΣΣ os z os 000 003 as os os LUUJUI ΣΣΣ 000 SC sc z z s 0 aaa ososcs UJQUJ

o o a o a o a o a o tH rH 0 0 HH 0 0 0 0 0 «Η 0 0 0 0 0 0 0 0 oao aaa aaa aaa aaa «00 «00 «00 «00 «00

DQ *

Ul

N

DO

O αο GLMDLAVGAR GQVLLLRSLP VLKVGVAMRF SPVEVAKAVY RCWEEKPSAL 646 CDUb GLVDLTVGAQ GHVLLLRSQP VLRVKAIMEF NPREVARNVF ECNDQVVKGK 647 CDllc GLVDLAVGAR GQVLLLRTRP VLWVGVSMQF IPAEIPRSAF ECREQVVSEQ 647

©©Z oo©to <«s:© ©©o ZZZ ZZZ ©©© ooo oo© b—b-b— 00«C<£ > zz2 ©oo> ZZZ zzo zoo© i—< —J —J b— >» -J —1—l-J -I3-J <c toto 2S2 ZZZ ZZZ b-OtO oozz 1 toz 1-4 > l-H Zb—Z ©az ©OO 1 ©to <<< Z©© 0 0—1 zoo© 1 zzz >1 ©00© zz© 1 ©© oo to z toxz oo© >-ZZ ©200 (OtOb— ZZZ 00©© Z z u. tototo ©o© zzz z z z —JU.LL < —1© ©zo

©©© ZOOZ 335 333 QQ© OO —1 2ZZ —IO —1 O > O h-11—( O ZZZ (OOOH © © (O i» 1—4 O ©00© OOO Q©Z ©Q © zoo ©©Z toto< žš2© ZZZ 2 >· >· (0(0(0 ZZZ b- b— © > > H-4 © 1 1 Z I 1 © ι i © 1 1 Z© —I > > > ©©© ooo ZZ© ZHH >zoo © © © ©o© tooo«c ©z© ©a© ©ZZ <©< to>to ZZZ ZZZ ZZ© (0(0(0 00© > O > §z° ©©s ©Z2 ZZZ ©o© >-Z(O ZZZ 0 1-4 0 ©zoo ©©© ©ZZ © © © ©o© ZZZ Z SC Z 00©© ZZ© ©©Z ooo ZZZ |m< 35 sz cc 1 ZOO ©o© ZZZ >Oh ZZZ 1 z© ©©© ZZZ ©©© >©© ooo zzz ZZZ ©Z© totoz ©Z —1 ©©z ©z© © © © oo© QQZ © © 2 (O ©to tototo ztoto -JZ^ ZZZ <<< ©©o (O©© (O © (O totoz ©©© 2 © 2 ttfc ZZZ ©©© 00 to to ZZ 1 ZZZ oo© w©< ©© Z oo© •CQQ ©zz sc SB »-(>»-4 OOO ©o© 3K3 z©©

©2© ©©© oo<c 5 > > > 1 00© ©©© «! mJ ©© ©©2 1 ©to ooo Soz >z ©z© >>© 33 S©z Zb-> ©ZZ Zh*> mJ >©< ©tOZ ©z<3 ©ΟΖ 1—zoo 5* 2 •Z SC 2S Z (O 1 & Z ©Z© ©©> ozo ZZ Z ZZZ ©toto <<© ©©00 ©© © ©z© zzo Z Z © zooz z z z tozz ooo

o *

LU

N

QQ

O ·· ··

I · · I

I · ·· β · · · « • · « ·· ·· <· ···· od DRHLHRASAS SENNKASSSK ATFQLELPVK YAVYTHISRQ EESTKYFNFA 938 CDUb NKLLLKANVT SENNHPRTNK TEFQLELPVK YAVYMVVTSH GVSTKYLNFT 943 CDllc DRLLLIANVS SEHNIPRTSK TIFQLELPVK YAVYIVVSSH EQFTKYLNFS 941 tft 0 O 0 <

WHO γη ro ro o un to 0 τ^-4 0 HHH

00Z <0(0

ooo zzz ΣΣΣ > 0 to o co £££ 0Q0 000 <<< 000 to o. co 0O0 S00 0.0.0. ooo ZZZ > 0> OOO ooo 0.0.0 0. 0.0. ooo -U-J—l 000 qíOZ 0—10 000

000 L.WU. 00> 000 0ΖΖ 000 0O-J 0 0 000 000 OOO CO (O CO 000 0Z0 0>0 0 0 0 SS5 > <<< OZO 0 0 0 000 0 0 0 CO 1 CO (O CO H-—Jw 0 1 eJ 000 000 000 O. 1 0 O O. O OZO 000 <<< 0 1 CO z>z 0>0 <<< 000 Z0O. HJH 2E > 0 0 000 CL. O-Z co to co 000 to CO (O 000 < l 1 00> to<z 000 cozo > 000 0 1 1 200 >0> <00 000 0 1 1 00CO to 1 1 OtOO H JH SzS >> 0 0 0 1 1 zzz O0Z CO CO CO 00CO 000 tooo 533 a = § co co to 000 O<Q000

000 000 0CO0 z>> to0O zzz 000 0 0 HH 0ZO HHHHHH 0 1 1 zcoz CO CO CO 000 0 1 l 0(00 000 Ζ0Ζ 000 < Z 0 zoo 000 sss 000 <00 000 1 1 z zoz 00< 000 3S SC Z 1 1 0 3. Z SE ΖΖ0 000 0O.Z 1 1 0 Z0^ (0(0(0 S0ŠS 1 1 < 0^0 000 1 1 0 0>> CO 0 CO zzz 1 1 O ^ZZ 0ZCO 000 1 1 0 Scócó 000 000 1 1 z 1 0Z 000 oo< LU Z0UJ 1 (0—4 £S£ LUZtt 0COCO X00 0(00 000 000 0Z0 000 1 1 1 1 0 cozz 000 X00 OOO 0 1 i co co co 000 000 0 1 1 H<0 (0(00 000 <(O< 0ΧΣ

0 u a O a 0 a o a o 0 0 0 0 0 0 00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 ooa 000 ooo OOO QQQ a 00 aoo BOO BOO BOO

o

X.

LJ

N

CO