SK283135B6 - Hybridóm označený 199M a monoklonálna protilátka proti integrínu beta2 produkovaná týmto hybridómom - Google Patents
Hybridóm označený 199M a monoklonálna protilátka proti integrínu beta2 produkovaná týmto hybridómom Download PDFInfo
- Publication number
- SK283135B6 SK283135B6 SK1409-97A SK140997A SK283135B6 SK 283135 B6 SK283135 B6 SK 283135B6 SK 140997 A SK140997 A SK 140997A SK 283135 B6 SK283135 B6 SK 283135B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cells
- leu
- ser
- seq
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 title abstract 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 71
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 70
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 33
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 claims description 9
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims description 9
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 claims description 6
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims description 6
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 claims description 4
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 claims description 4
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 claims description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 claims description 4
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 3
- UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N Cys-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 3
- IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 3
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 3
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 3
- WCBVQNZTOKJWJS-ACZMJKKPSA-N Ala-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WCBVQNZTOKJWJS-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 2
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 2
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- CYHWWHKRCKHYGQ-GUBZILKMSA-N His-Cys-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N CYHWWHKRCKHYGQ-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 claims description 2
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 2
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 2
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 claims description 2
- IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N Thr-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N 0.000 claims description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 claims description 2
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 2
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N Arg-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- RWHHSFSWKFBTCF-KKUMJFAQSA-N Asp-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RWHHSFSWKFBTCF-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- KOWYNSKRPUWSFG-IHPCNDPISA-N Asp-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KOWYNSKRPUWSFG-IHPCNDPISA-N 0.000 claims 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N Glu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 claims 1
- HDOYNXLPTRQLAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N HDOYNXLPTRQLAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 claims 1
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 claims 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims 1
- FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N Leu-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- IAOZOFPONWDXNT-IXOXFDKPSA-N Phe-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IAOZOFPONWDXNT-IXOXFDKPSA-N 0.000 claims 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 claims 1
- GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- PXQUBKWZENPDGE-CIQUZCHMSA-N Thr-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N PXQUBKWZENPDGE-CIQUZCHMSA-N 0.000 claims 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims 1
- UTSWGQNAQRIHAI-UNQGMJICSA-N Thr-Arg-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 UTSWGQNAQRIHAI-UNQGMJICSA-N 0.000 claims 1
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 claims 1
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 claims 1
- OHDXOXIZXSFCDN-RCWTZXSCSA-N Thr-Met-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OHDXOXIZXSFCDN-RCWTZXSCSA-N 0.000 claims 1
- WKGAAMOJPMBBMC-IXOXFDKPSA-N Thr-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WKGAAMOJPMBBMC-IXOXFDKPSA-N 0.000 claims 1
- KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims 1
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 claims 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 claims 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 abstract description 147
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 284
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 195
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 193
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 189
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 142
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 116
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 99
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 94
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 92
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 82
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 79
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 description 76
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 75
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 73
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 71
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 71
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 71
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 63
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 63
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 62
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 58
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 56
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 56
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 54
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 51
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 45
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 44
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 42
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 42
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 42
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 41
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 40
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 38
- 101000599862 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 37
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 37
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 35
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 33
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 33
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 32
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 32
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 32
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 32
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 32
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 31
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 29
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 28
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 27
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 23
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 23
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 23
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 23
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 20
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 19
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 19
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 19
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 16
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 16
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 15
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 15
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 15
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 15
- 201000008752 progressive muscular atrophy Diseases 0.000 description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 14
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 12
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 12
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 12
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 11
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 11
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 9
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 101000716149 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1b Proteins 0.000 description 9
- 102100035982 T-cell surface glycoprotein CD1b Human genes 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 CD11a Proteins 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 7
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 7
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 7
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 7
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 7
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 6
- 102220469872 Protein argonaute-3_E37A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 6
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 5
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- 101100019412 Homo sapiens ITGB2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 5
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 5
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 5
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 5
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 5
- OXZOLXJZTSUDOM-UHFFFAOYSA-N fluoro 2,2,2-trifluoroacetate Chemical compound FOC(=O)C(F)(F)F OXZOLXJZTSUDOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 5
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 5
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 5
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N Asp-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 201000001779 Leukocyte adhesion deficiency Diseases 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000497 foam cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N Ala-Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 3
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 3
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 3
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 3
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N Tyr-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 3
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 3
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 3
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 3
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 3
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 3
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 3
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 3
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitrogen oxide Inorganic materials O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000585703 Adelphia <angiosperm> Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N Arg-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NXDXECQFKHXHAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- AQPVUEJJARLJHB-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N AQPVUEJJARLJHB-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- QMQZYILAWUOLPV-JYJNAYRXSA-N Arg-Tyr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QMQZYILAWUOLPV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N Asp-Leu-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000699679 Cricetulus migratorius Species 0.000 description 2
- TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N Cys-Asp Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- WVLZTXGTNGHPBO-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WVLZTXGTNGHPBO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000004860 Dipeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090001081 Dipeptidases Proteins 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 206010014824 Endotoxic shock Diseases 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N Glu-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- ZWMYUDZLXAQHCK-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZWMYUDZLXAQHCK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- QLQDIJBYJZKQPR-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN QLQDIJBYJZKQPR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MDOBWSFNSNPENN-PMVVWTBXSA-N His-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O MDOBWSFNSNPENN-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- CWJQMCPYXNVMBS-STECZYCISA-N Ile-Arg-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N CWJQMCPYXNVMBS-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 2
- JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- KVRKAGGMEWNURO-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KVRKAGGMEWNURO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N Leu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- GAHJXEMYXKLZRQ-AJNGGQMLSA-N Lys-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O GAHJXEMYXKLZRQ-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WINFHLHJTRGLCV-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WINFHLHJTRGLCV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 241000252067 Megalops atlanticus Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- DLAFCQWUMFMZSN-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CCCN=C(N)N DLAFCQWUMFMZSN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- LBNFTWKGISQVEE-AVGNSLFASA-N Met-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC LBNFTWKGISQVEE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N Met-Ser-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 2
- FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N Phe-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N Phe-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 2
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=C(O)C=C1 HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N Thr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 2
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N Thr-Leu-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 2
- MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N Thr-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WYLAVUAWOUVUCA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- HSQXHRIRJSFDOH-URLPEUOOSA-N Thr-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HSQXHRIRJSFDOH-URLPEUOOSA-N 0.000 description 2
- MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N Thr-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 2
- PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- MVHHTXAUJCIOMZ-WDSOQIARSA-N Trp-Arg-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N MVHHTXAUJCIOMZ-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- HQJOVVWAPQPYDS-ZFWWWQNUSA-N Trp-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQJOVVWAPQPYDS-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- SEFNTZYRPGBDCY-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O SEFNTZYRPGBDCY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N Tyr-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- XFEMMSGONWQACR-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O XFEMMSGONWQACR-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 2
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108700027921 interferon tau Proteins 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 108010045397 lysyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 210000003456 pulmonary alveoli Anatomy 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 2
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108700004896 tripeptide FEG Proteins 0.000 description 2
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b,9,9a-tetrahydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-1,1a,1b,4,4a,7a,7b,8,9,9a-decahydro-5H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-5-one Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(O)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N 0.000 description 1
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108010031110 1-Sarcosine-8-Isoleucine Angiotensin II Proteins 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 4-(4-diazonio-3-methoxyphenyl)-2-methoxybenzenediazonium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C([N+]#N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C([N+]#N)=CC=2)=C1 LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- DLQPMEMYCIGJIM-UHFFFAOYSA-N Adjuvant peptide Natural products CC(NC(=O)CCOC1C(O)C(CO)OC(O)C1NC(=O)C)C(=O)NC(CCC(=O)O)C(=O)N DLQPMEMYCIGJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQPPBQRUBVTIF-JBDRJPRFSA-N Ala-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LGQPPBQRUBVTIF-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N Ala-Cys-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N Ala-Glu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- UWIQWPWWZUHBAO-ZLIFDBKOSA-N Ala-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 UWIQWPWWZUHBAO-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 1
- GFEDXKNBZMPEDM-KZVJFYERSA-N Ala-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFEDXKNBZMPEDM-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- VQAVBBCZFQAAED-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N VQAVBBCZFQAAED-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JTWOBPNAVBESFW-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Asp Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)CN=C(N)N JTWOBPNAVBESFW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JVMKBJNSRZWDBO-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JVMKBJNSRZWDBO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ITHMWNNUDPJJER-ULQDDVLXSA-N Arg-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ITHMWNNUDPJJER-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- UBCPNBUIQNMDNH-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UBCPNBUIQNMDNH-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- JEXPNDORFYHJTM-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JEXPNDORFYHJTM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N Arg-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N Asn-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NURJSGZGBVJFAD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)C(=O)O NURJSGZGBVJFAD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LTXGDRFJRZSZAV-CIUDSAMLSA-N Asp-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N LTXGDRFJRZSZAV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N Asp-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N Asp-Leu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- YTXCCDCOHIYQFC-GUBZILKMSA-N Asp-Met-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O YTXCCDCOHIYQFC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LIJXJYGRSRWLCJ-IHRRRGAJSA-N Asp-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LIJXJYGRSRWLCJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RPUYTJJZXQBWDT-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RPUYTJJZXQBWDT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100015199 Caenorhabditis elegans gly-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241001429175 Colitis phage Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 208000014997 Crohn colitis Diseases 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- VNLYIYOYUNGURO-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VNLYIYOYUNGURO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XRTISHJEPHMBJG-SRVKXCTJSA-N Cys-Asp-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XRTISHJEPHMBJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SBDVXRYCOIEYNV-YUMQZZPRSA-N Cys-His-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N SBDVXRYCOIEYNV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XZKJEOMFLDVXJG-KATARQTJSA-N Cys-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)N)O XZKJEOMFLDVXJG-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- RESAHOSBQHMOKH-KKUMJFAQSA-N Cys-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CS)N RESAHOSBQHMOKH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OJGLIOXAKGFFDW-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N OJGLIOXAKGFFDW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- ZCOJVESMNGBGLF-GRLWGSQLSA-N Glu-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZCOJVESMNGBGLF-GRLWGSQLSA-N 0.000 description 1
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- MTBIKIMYHUWBRX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN MTBIKIMYHUWBRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FKYQEVBRZSFAMJ-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FKYQEVBRZSFAMJ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010017480 Hemosiderin Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N His-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- WGVPDSNCHDEDBP-KKUMJFAQSA-N His-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WGVPDSNCHDEDBP-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZYDYEPDFFVCUBI-SRVKXCTJSA-N His-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N ZYDYEPDFFVCUBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N His-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- RNVUQLOKVIPNEM-BZSNNMDCSA-N His-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O RNVUQLOKVIPNEM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HIJIJPFILYPTFR-ACRUOGEOSA-N His-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HIJIJPFILYPTFR-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 101100005686 Homo sapiens CD1B gene Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101100017008 Homo sapiens HHAT gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N Ile-Arg-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- VQUCKIAECLVLAD-SVSWQMSJSA-N Ile-Cys-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VQUCKIAECLVLAD-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- CMNMPCTVCWWYHY-MXAVVETBSA-N Ile-His-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N CMNMPCTVCWWYHY-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- CCYGNFBYUNHFSC-MGHWNKPDSA-N Ile-His-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O CCYGNFBYUNHFSC-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 1
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- USXAYNCLFSUSBA-MGHWNKPDSA-N Ile-Phe-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N USXAYNCLFSUSBA-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010017642 Integrin alpha2beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- YUGVQABRIJXYNQ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YUGVQABRIJXYNQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YUGVQABRIJXYNQ-UHFFFAOYSA-N Leu-Ala-Ala Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(O)=O YUGVQABRIJXYNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- XQXGNBFMAXWIGI-MXAVVETBSA-N Leu-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 XQXGNBFMAXWIGI-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N Leu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N Leu-Phe-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ZGGVHTQAPHVMKM-IHPCNDPISA-N Leu-Trp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZGGVHTQAPHVMKM-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ARNIBBOXIAWUOP-MGHWNKPDSA-N Leu-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ARNIBBOXIAWUOP-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- XREQQOATSMMAJP-MGHWNKPDSA-N Lys-Ile-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XREQQOATSMMAJP-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- MTBLFIQZECOEBY-IHRRRGAJSA-N Lys-Met-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O MTBLFIQZECOEBY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N Lys-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101150084626 Mbtps1 gene Proteins 0.000 description 1
- QEVRUYFHWJJUHZ-DCAQKATOSA-N Met-Ala-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QEVRUYFHWJJUHZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UYAKZHGIPRCGPF-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N UYAKZHGIPRCGPF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N Met-Glu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RAAVFTFEAUAVIY-DCAQKATOSA-N Met-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N RAAVFTFEAUAVIY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N Met-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCSC FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- WPTHAGXMYDRPFD-SRVKXCTJSA-N Met-Lys-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WPTHAGXMYDRPFD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N Met-Lys-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100341513 Mus musculus Itgam gene Proteins 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N Phe-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- ZWJKVFAYPLPCQB-UNQGMJICSA-N Phe-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(O)=O ZWJKVFAYPLPCQB-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ISYSEOWLRQKQEQ-JYJNAYRXSA-N Phe-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISYSEOWLRQKQEQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N Phe-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- KNYPNEYICHHLQL-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KNYPNEYICHHLQL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N Phe-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- BPIMVBKDLSBKIJ-FCLVOEFKSA-N Phe-Thr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BPIMVBKDLSBKIJ-FCLVOEFKSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- AHXPYZRZRMQOAU-QXEWZRGKSA-N Pro-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O AHXPYZRZRMQOAU-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 102100030616 Protein-cysteine N-palmitoyltransferase HHAT Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100411643 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RAD5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100264226 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) XRN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 101100391171 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) for3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QWZIOCFPXMAXET-CIUDSAMLSA-N Ser-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QWZIOCFPXMAXET-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N Ser-Arg-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- SWIQQMYVHIXPEK-FXQIFTODSA-N Ser-Cys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SWIQQMYVHIXPEK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PVDTYLHUWAEYGY-CIUDSAMLSA-N Ser-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PVDTYLHUWAEYGY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N Ser-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CAOYHZOWXFFAIR-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CAOYHZOWXFFAIR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- KKKVOZNCLALMPV-XKBZYTNZSA-N Ser-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KKKVOZNCLALMPV-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 108050007496 Shikimate kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- LIXBDERDAGNVAV-XKBZYTNZSA-N Thr-Gln-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LIXBDERDAGNVAV-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- KKPOGALELPLJTL-MEYUZBJRSA-N Thr-Lys-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKPOGALELPLJTL-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N Thr-Ser-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- QJIODPFLAASXJC-JHYOHUSXSA-N Thr-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O QJIODPFLAASXJC-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 1
- VYVBSMCZNHOZGD-RCWTZXSCSA-N Thr-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VYVBSMCZNHOZGD-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- HGEHWFGAKHSIDY-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O HGEHWFGAKHSIDY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MVYRJYISVJWKSX-KBPBESRZSA-N Tyr-His-Gly Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)NCC(=O)O)N)O MVYRJYISVJWKSX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- LUMQYLVYUIRHHU-YJRXYDGGSA-N Tyr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LUMQYLVYUIRHHU-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- JQOMHZMWQHXALX-FHWLQOOXSA-N Tyr-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JQOMHZMWQHXALX-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- NWDOPHYLSORNEX-QXEWZRGKSA-N Val-Asn-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N NWDOPHYLSORNEX-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- PDDJTOSAVNRJRH-UNQGMJICSA-N Val-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O PDDJTOSAVNRJRH-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- FKNHDDTXBWMZIR-GEMLJDPKSA-N acetic acid;(2s)-1-[(2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(O)=O.SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FKNHDDTXBWMZIR-GEMLJDPKSA-N 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- GZGREZWGCWVAEE-UHFFFAOYSA-N chloro-dimethyl-octadecylsilane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[Si](C)(C)Cl GZGREZWGCWVAEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 210000004921 distal colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 201000007192 granulomatous hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000003547 hepatic macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 150000004680 hydrogen peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 102000017776 integrin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108060004057 integrin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000023404 leukocyte cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108010063431 methionyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000009854 mucosal lesion Effects 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-QAQREVAFSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-QAQREVAFSA-N 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N phenyl n-[4-[4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl]phenyl]carbamate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1CCN(C=2C=CC(NC(=O)OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)CC1 NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N phorbol Natural products C[C@@H]1[C@@H](O)[C@]2(O)[C@H]([C@H]3C=C(CO)C[C@@]4(O)[C@H](C=C(C)C4=O)[C@@]13O)C2(C)C QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 101150037064 rpoA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DREOJRVDBCALEG-MJKYAOJXSA-M sodium;1-[5-[(3as,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCC1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 DREOJRVDBCALEG-MJKYAOJXSA-M 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012301 transgenic model Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 108010000998 wheylin-2 peptide Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/70553—Integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Hybridóm označený 199M, uložený v zbierke ATCC pod depozitným číslom HB 12058, a monoklonálna protilátka proti a podjednotke integrínu beta2 sekretovaná týmto hybridómom.ŕ
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka hybridómu označeného 199M a monoklonálnej protilátky sekretovanej týmto hybridómom. Všeobecne vynález opisuje klonovanie a expresiu polynukleotidov kódujúcich novú a podjednotku ľudského integrínu β2, označovanú ako ud, ktorá je štruktúrne podobná známym a podjednotkám ľudského integrínu β2, označovaným CDlla, CDllb a CDllc. Vynález sa takisto týka polynukleotidov, ktoré majú homológiu k sekvencií kódujúcej ľudský ad, izolovaných z iných živočíšnych druhov.
Doterajší stav techniky
Integriny sú triedou molekúl asociovaných s membránou, ktoré sa aktívne zúčastňujú na procese bunkovej adhézie. Integriny sú transmembránové heterodiméry zložené z podjednotky a, ktorá je nekonvalentne asociovaná s podjednotkou β. V súčasnosti je známych prinajmenšom štrnásť podjednotiek a a osem podjednotiek (zhrnuté vSpringer, Náture 346 : 425 až 434 (1990)). Podjednotky sú obvykle schopné asociácie s viac ako jednou podjednotkou a a heterodiméry majúce spoločnú podjednotku β vytvárajú v populácii integrínov jednotlivé podtriedy.
Jedna podtrieda ľudských integrínov, ktorá je exprimovaná len na povrchu bielych krviniek, je charakterizovaná prítomnosťou spoločnej podjednotky β2. Výsledkom tejto bunkovej špecifickej expresie je skutočnosť, že tieto integríny sú obvykle označované ako leukocytové integriny, Leu-CAM alebo leukointegríny. Vzhľadom na prítomnosť spoločnej podjednotky β2, je inou alternatívou označovať tieto integriny ako integriny β2. Podjednotka β2 (CD18) bola už predtým izolovaná v spojení s jednou z troch rozdielnych podjednotiek a, označovaných CDlla, CDllb a CD1 lc. Izolácia cDNA kódujúcej ľudský CD18 je opísaná v publikácii Kishimoto a ďalší. Celí 48 : 681 až 690 (1987). Podľa oficiálnej nomenklatúry WHO (Svetová zdravotnícka organizácia) sú tieto heterodimérne proteíny označované ako CDlla/CD18. CDllb/CD18 a CDllc/CD18; vo všeobecne používanej nomenklatúre sú tieto označované ako LFA-1 (CDlla/CD18). Mac-1 alebo Mol (CD1 lb/CD18) a P15095 alebo LeuM5 (CDllc/CD18) [Cobbold a ďalší, v Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, strana 788 C 1987)]. Bolo dokázané, že a podjednotky CD1 la, CD1 lb a CD1 lc ľudského integrínu β2 migrujú pri elektroforéze uskutočňovanej v redukujúcich podmienkach so zdanlivými molekulovými hmotnosťami približne 180 kD (CDlla), 155 kD (CDllb) a 150 kD (CDllc). DNA kódujúca tieto podjednotky už boli klonovanc [CDlla, Larson a ďalší. J. Celí Biol. 180 : 703 až 712 (1989); CDllb, Corbi a ďalší. J. Biol. Chem. 263 : 12403 až 12411 (1988) a CD1 lc, Corbi a ďalší. EMBO J. 6 : 4023 až 4028 (1987)]. Domnelé homológy a a β reťazcov ľudského integrínu β2, definované podľa približnej podobnosti molekulových hmotností, boli pomocou najrôznejších metód identifikované u iných živočíšnych druhov, vrátane opíc a primátov [Letvin a ďalší, Blood 61 : 408 až 410 (1983),], myší [Sanchez-Madrid a ďalší, J. Exp. Med. 154 : 1517 (1981)] a psov [Moare a ďalší, Tissue Antigens 36:211 až 220 (1990)].
Ukázalo sa, že absolútne molekulové hmotnosti predpokladaných homológov a a B reťazcov ľudského integrínu β2 získaných z iných živočíšnych druhov, sa podstatne líšia [pozri napríklad Danilenko a ďalší, Tissue Antigens 40 : 13 až 21 (1992)] a vzhľadom na absenciu informácii týkajúcich sa sekvencie týchto homológov nie je možné s určitos ťou definovať vzťah medzi podjednotkami ľudského integrínu a podjednotkami identifikovanými u iných druhov. Medzi rôznymi druhmi boli navyše pozorované rozdiely v počte zástupcov jednotlivých rodín proteínov. Uvážme napríklad, že z králikov bolo izolovaných viac izotypov IgA ako ich existuje u ľudí [Bumctt a ďalší. EMBO J. 8 : 4041 až 4047 (1989) a Schneiderman a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86 : 7561 až 7565 (1989)]. Obdobne, u ľudí bolo doteraz identifikovaných prinajmenšom šesť variantov metalotioneínov [Karin a Richards, Náture 299.797 až 802 (1982) a Varshney a ďalší, Mol. Celí. Biol. 6 : 26 až 37. (1986)], zatiaľ čo u myší existujú dôkazy o prítomnosti len dvoch takýchto variantov [Searle a ďalší, Mol. Celí. Biol. 4 : 1221 až 1230 (1984)]. Z existencie viacerých zástupcov proteínov u jedného druhu sa teda nedá jednoznačne odvodiť, žeby príslušný zástupcovia rodiny proteínov museli existovať aj u iných druhov.
Pokiaľ ide o integriny fi2, bolo u psov pozorované, že predpokladaný psí náprotivok (β2) ľudského CD 18 je schopný vytvárať diméry až so štyrmi rozdielnymi podjednotkami a [Danilenko a ďalší, pozri skôr]. Výsledkom imunizácie myší pomocou splenocytov získaných z organizmov psov bolo vytvorenie monoklonálnych protilátok, ktoré imunoprecipitovali s proteínmi experimentálne označenými ako psie homológy k ľudským CD 18, CDlla, CDllb a CDllc; táto homológia bola predovšetkým založená na zistení podobných, ale nie identických, molekulových hmotností. Ďalšia protilátka namierená proti splenocytom získaným z organizmu psov, označené Call.8H2, rozpoznávala a imunoprecipitovala so štvrtou podjednotkou (psou) podobnou podjednotke a. Táto štvrtá psia podjednotka je takisto schopná asociácie s podjednotkou β2, ale má jedinečnú molekulovú hmotnosť a je exprimovaná len na subpopulácii diferencovaných tkanivových makrofágov.
Výsledkom imunizácie chrčkov pomocou dendritických buniek získaných z organizmov myší bolo vytvorenie dvoch monoklonálnych protilátok namierených proti integrínom [Metlay a ďalší, J. Exp. Med. 171 : 1753 až 1771 (1990)]. Jedna z týchto protilátok, označená 2E6, imunoprecipitovala prevažne s heterodimérom tvoreným podjednotkami so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 180 kD a 90 kD a v menšej miere potom s proteínmi so zdanlivými molekulovými hmotnosťami v rozmedzí 150 až 160 kD. Druhá z týchto protilátok, označená N418, imunoprecipitovala s ďalším zdanlivým heterodimérom tvoreným podjednotkami so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 150 kD a 90 kD. Z výsledkov štúdií, pri ktorých bola blokovaná bunková adhézia, bolo usúdené, že protilátka 2E6 rozpoznáva myšací náprotivok ľudského CD 18, zatiaľ čo molekulová hmotnosť zistená pri antigéne N418 naznačovala, že ide o myšací homológ ľudského CD1 lc/CD18, ďalšie analýzy ukazujú, že tento myšací antigén má distribúciu v tkanivách, ktorá nezodpovedá distribúcii pozorovanej u ľudského CD1 lc/CD18.
Antigény rozpoznávané prostredníctvom psej protilátky Call.8H2 a myšacej protilátky N418 môžu reprezentovať rôzne varianty (napríklad s rôznym stupňom glykozylácie alebo produkty rôzne zostrihnutých mRNA) už predtým identifikovanej psej alebo myšacej podjednotky a. Inou možnosťou je, že tieto antigény môžu reprezentovať unikátne podjednotky a psích alebo myšacích integrínov. V momente, keď nie sú dostupné informácie týkajúce sa primárnej štruktúry, nie je možné tieto dve alternatívy odlíšiť.
U ľudí je heterodimér CDlla/CD18 exprimovaný na povrchu všetkých lymfocytov. Heterodimér CD1 lb/CD18 a CDllc/CD18 sú v podstate exprimované len na povrchu monocytov, granulocytov, makrofágov a NK buniek („na tural killer celí“), ale CDllc/CD18 bol takisto delegovaný u niektorých typov B-buniek. Všeobecne je možné povedať, že CDI la/CD18 prevažuje u lymfocytov, CDI lb/CD18 u granulocytov a CDllc/CD18 na povrchu makrofágov [pozri súhrnný článok Amaout; Blood 75 : 1037 až 1050 (1990)]. Expresia reťazcov a sa však líšila v závislosti od stupňa aktivácie a diferenciácie jednotlivých typov buniek [pozri súhrnný článok, Larson a Springer, Immunol. Rev. 114: 181 až 217 (1990)].
Pri použití protilátok, ktoré sú schopné blokovať bunkovú adhéziu sprostredkovanú pomocou íntegrínov β2, bolo dokázané, že tieto integríny β2 sa v organizme človeka zúčastňujú na imunitnej a zápalovej reakcii. Napríklad heterodiméry CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18 sa aktívne zúčastňujú na väzbe NK buniek na bunky lymfómu a adenokarcinómu [Patarroyo a ďalší, Immunol. Rev: 114 : 67 až 108 (1990)], akumulácii granulocytov [Nourshargh a ďalší. J. Immunol. 142 : 3193 až 3198 (1989)], úniku plazmy nezávislému od činnosti granulocytov [Arfors a ďalší, Blood 69 : 338 až 340 (1987)], chemotaktickej odpovede stimulovaných leukocytov [Arfors a ďalší, pozri skôr] a adhézii leukocytov k vaskulámemu endotelu [Price a ďalší, J. Immunol. 139 : 4174 až 4177 a Smith a ďalší, J. Clin. Invest. 83 : 2008 až 2017 (1989)]. Hlavná úloha integrínov β2 pri imunitných a zápalových reakciách je zrejmá z klinického syndrómu označovaného ako nedostatočnosť adhézie leukocytov (LAD - leukocyte adhesion deficiency); medzi ktorého klinické prejavy patria neustále sa opakujúce bakteriálne infekcie ohrozujúce život. LAD je zapríčinená rôznorodými mutáciami v podjednotke β2 [Kishimoto a ďalší, Celí 50 : 193 až 202 (1987)] a závažnosť chorôb koreluje so stupňom deftciencie v expresii podjednotky [L. Vytvorenie kompletného heterodiméru integrínu je mutáciou v podjednotke β2 sťažené [Kishimoto a ďalší, Celí 50; 193 až 202 (1987)].
Je zaujímavé, že prinajmenšom pri jednej protilátke špecificky namierenej proti Dl8 bolo dokázané, že in vitro inhibuje tvorbu syncýcií spôsobenou vírusom ľudskej imunodeficiencie typu 1 (HIV-1), aj keď presný mechanizmus tejto inhibície je nejasný (Hildreth a Orentas, Science 244 : 1075 až 1078 (1989)]. Toto pozorovanie je v súlade s objavom, že hlavný receptor pre CDlla/CD18, ktorým je ICAM-1, je takisto povrchovým receptorom pre veľkú skupinu rinovírusov [Greve a ďalší, Celí 56 : 839 (1989)].
Význam väzbovej aktivity integrínu β2 pri imunitnej a zápalovej reakcii u ľudí podčiarkuje nevyhnutnosť dosiahnutia dokonalejšieho poznania tejto triedy povrchových proteínov. Identifikácia doteraz neznámych členov tejto subpopulácie, ako aj ich zodpovedajúcich receptorov a produkcia monoklonálnych protilátok alebo iných rozpustných látok, ktoré môžu pozmeniť biologickú aktivitu integrínov β2, poskytnú prostriedky (využiteľné v praxi) na terapeutickú intervenciu pri imunitných a zápalových odpovediach zviazaných s integrínmi β2.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je hybridóm označený 199M, uložený v zbierke ATCC pod depozitným číslom HB 12058 a monoklonálna protilátka sekretovaná týmto hybridómom.
Jedna stránka vynálezu opisuje novopurifikované a izolované polynukleotidy (napríklad DNA a RNA transkripty, tak kódujúce, ako aj antikódujúce vlákna) kódujúce novú a podjednotku ľudského integrínu fi2, označovanú ad a jej varianty (napríklad delečné, adičné alebo substitučné analógy), ktoré majú väzbové a/alebo imunologické vlast nosti vlastné podjednotke ad. Vo výhodnej realizácii vynálezu patria medzi tieto molekuly DNA, genómová DNA, cDNA a úplne alebo čiastočne syntetizované molekuly DNA. V súčasnosti sa ako najvýhodnejší polynukleotid javí molekula DNA, ako je zobrazená v SEK. ID. č.: 1, kódujúca polypeptid so sekvenciou SEK. ID. č.: 2. Vynález takisto opisuje konštrukciu rekombinantných plazmidových a vírusových konštruktov DNA (expresívne konštrukty), ktoré obsahujú kódujúcu sekvenciu pre ad, pričom táto sekvencia kódujúca ad je funkčne pripojená k homológnemu alebo heterológnemu regulačnému prvku/prvkom transkripcie.
Vynález takisto opisuje polynukleotidy izolované z myší a laboratórnych potkanov, ktoré majú homológiu k polynukleotidom kódujúcim ľudský ad. Vo výhodnej realizácii ide o polynukleotid získaný z myší, zobrazený v SEK. ID. č.: 52 a o polynukleotid získaný z laboratórnych potkanov zobrazený v SEK. ID. č.: 54.
Iná stránka vynálezu sa týka prokaryotických a eukaryotických hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných sekvenciami DNA podľa vynálezu, ktoré na svojom povrchu exprimujú polypeptid ad alebo nejaké jeho varianty. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú veľmi užitočné pre produkciu veľkých množstiev polypeptidu 5d, ktorý môže byť izolovaný buď zo samostatnej hostiteľskej bunky alebo z média, v ktorom sú tieto bunky kultivované. Hostiteľské bunky exprimujúce polypeptid ad na extracelulámej strane membrány môžu byť takisto použité ako imunogény pri produkcii protilátok špecificky namierených proti ad. Vo výhodnej realizácii vynálezu budú hostiteľské bunky transfekované DNA kódujúcou ad kotransfekované DNA kódujúcou podjednotku β2, aby boli na ich povrchu umožnené expresie tohto heterodiméru.
Vynález sa takisto týka purifikovaných a izolovaných polypeptidov, ich fragmentov a rôznych variantov. Vo výhodnej realizácii vynálezu sú polypeptidy ad polypeptidy so sekvenciou znázornenou ako SEK. ID. č.: 2. Nové produkty ad podľa vynálezu môžu byť izolované z prirodzených zdrojov, ale vo výhodnej realizácii sú spolu s produktmi rôznych variantov ad produkované s využitím rekombinantných postupov, v ktorých sú využité hostiteľské bunky podľa vynálezu. Pri použití rôznych hostiteľských buniek a/alebo špecifickým spracovaním po izolácii, môžu byť pripravené úplne glykozylované, čiastočne glykozylované a úplne deglykozylované formy polypeptidu aá. Medzi varianty polypeptidov ad podľa vynálezu patria vo vode rozpustné a vo vode nerozpustné polypeptidy ad, vrátane ich analógov, v ktorých je jedna alebo viac aminokyselín odstránená alebo nahradená: (1) bez straty, a vo výhodnej realizácii, s posilnením jednej alebo viacerých biologických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre ad; alebo (2) pri Špecifickom zablokovaní určitého druhu väzby ligand/receptor alebo pri zablokovaní signalizačnej funkcie. Vynález takisto opisuje íúzne polypeptidy, v ktorých sú aminokyselinové sekvencie z polypeptidu ad exprimované v nadväznosti na aminokyselinové sekvencie z iných polypeptidov. Takéto íúzne polypeptidy môžu mať v porovnaní s polypeptidom ad divokého typu pozmenené biologické, biochemické a/alebo imunologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu patria analógy polypeptidov obsahujúce navyše aminokyselinový zvyšok (napríklad lyzín alebo cysteín), ktorý uľahčuje tvorbu multimérov.
Vynález sa takisto týka polypeptidov a molekúl s nepeptidovou povahou, ktoré špecificky viažu ud. Medzi výhodné molekuly, ktoré viažu ad, patria protilátky (napríklad monoklonálne a polyklonálne protilátky), receptory (napríklad ich rozpustné formy alebo formy asociované s membránou) a iné ligandy (napríklad prirodzene sa vyskytujúce alebo umelo pripravené molekuly) vrátane molekúl, ktoré sa za prítomnosti monoklonálnych protilátok namierených proti aj a/alebo špecifických receptorov pre ad, kompetitívne viažu na ad. Molekuly, ktoré sa viažu na ctd, môžu byť použité pri purifikácii polypeptidov ctd a identifikácii typov buniek exprimujúcich ad. Molekuly, ktoré sa viažu na ad, môžu byť takisto použité s cieľom modulácie (to znamená inhibície, blokovania alebo stimulácie) väzbových aktivít polypeptidov ad (in vivo) a/alebo s cieľom modulácie prenosu signálov uskutočňovaných prostredníctvom ad.
Vynález takisto opisuje stanovenie slúžiace na identifikáciu molekúl viažucich <Xd, vrátane stanovení využívajúcich väzbu imobilizovaného ligandu, stanovení, pri ktorých je väzba sledovaná v roztoku. SPA (scintillation proximity assay - stanovení využívajúcich priblíženie rádioaktívnej značky k fluorofóru a potom monitorovanie svetla cmitovaného flurofórom), stanovení, pri ktorých sú použité dve hybridné molekuly a podobne.
Medzi in vitro stanovenia slúžiace na identifikáciu protilátok alebo iných zlúčenín, ktoré modulujú aktivitu polypeptidu ad, môže patriť napríklad imobilizácia polypeptidu ad alebo imobilizácia prirodzeného ligandu, ku ktorému sa otd viaže, detegovateľné značenie neimobilizovaného väzbového partnera, spoločná inkubácia väzbových partnerov a stanovenie vplyvu testovanej zlúčeniny na množstvo naviazanej značky, pričom zníženie množstva naviazanej značky za prítomnosti testovanej zlúčeniny (v porovnaní s množstvom značky naviazanej bez prítomnosti testovanej zlúčeniny) naznačuje, že testovaná látka je inhibítorom väzby na ad.
Iným typom stanovenia použiteľným na identifikáciu zlúčení, ktoré modulujú interakciu medzi ad a jeho ligandom, je stanovenie, pri ktorom je polypeptid ad alebo jeho fragment imobilizovaný na povrchu pevného nosiča potiahnutého (alebo napusteného) fluorescenčným agens a ligand je označený zlúčeninou schopnou excitovať uvedené fluorescenčné agens. Pri tomto stanovení dôjde, za prítomnosti alebo neprítomnosti domnelého modulátora, ku kontaktu imobilizovaného polypeptidu ad so značeným ligandom a potom je detegované svetlo emitované prostredníctvom fluorescenčného agens a sú identifikované zlúčeniny s modulačnými vlastnosťami. Ako zlúčeniny s modulačnými vlastnosťami sú uvažované tie zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú emisiu svetla sprostredkovanú fluorescenčným agens v porovnaní s emisiou svetla sprostredkovanou fluorescenčným agens v neprítomnosti modulačnej zlúčeniny. Inou možnosťou je imobilizácia ligandu pre ad a označenie polypeptidu ctd.
Ďalšou metódou patriacou do rozsahu vynálezu a slúžiacou na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú interakciu medzi Od a jeho ligandom, je transformácia alebo transfekcia vhodných hostiteľských buniek nejakým konštruktom DNA nesúcim reportérový gén pod kontrolou promótora, regulovaný transkripčným faktorom skladajúcim sa z domény viažucej DNA a aktivačnej domény, následná expresia (v hostiteľskej bunke) prvej sekvencie DNA kódujúcej prvý fúzny protein obsahujúci časť alebo celý polypeptid ad spolu s doménou viažucou DNA alebo aktivačnú doménu a expresia druhej hybridnej DNA kódujúcej druhý fúzny protein s obsahom časti alebo celého ligandu pre ad a spolu s doménou viažucou DNA alebo aktivačnou doménou transkripčného faktora, ktoré nie sú inkorporované v prvom fúznom proteíne. Ďalej je potom vyhodnotený vplyv domnelej modulačnej zlúčeniny na interakciu medzi ad a jeho ligandom. Tento vplyv je sledovaný detekciou väzby ligandu na ad v danej hostiteľskej bunke tak, že je v danej hostiteľskej bunke stanovovaná tvorba produktu reportérového génu za prítomnosti alebo neprítomnosti domnelého modulátora, a ako modulačné zlúčeniny sú identifikované tie zlúčeniny, ktoré pozmeňujú tvorbu produktu reportérového génu v porovnaní s tvorbou produktu reportérového génu v neprítomnosti modulačnej zlúčeniny. Pri tomto stanovení sú dnes výhodne používané promótor lexA, doména viažuca DNA so sekvenciou zodpovedajúcou lexA, transaktivačná doména GAL4, reportérový gén lacZ a ako hostiteľské bunky kvasinky.
Pri izolácii polynukleotidu kódujúceho protein, ktorý sa viaže na ad, môže byť použitá upravená verzia uvedeného stanovenia. Pri tejto modifikovanej verzii sú vhodné hostiteľské bunky transformované alebo transfekované konštruktom DNA nesúcim reportérový gén pod kontrolou promótora regulovaného transkripčným faktorom zloženým z domény viažucej DNA a aktivačnej domény. Nasleduje expresia (v hostiteľskej bunke) prvej sekvencie DNA kódujúcej prvý fúzny protein obsahujúci časť alebo celý polypeptid ctd spolu s doménou viažucou DNA alebo nejakou aktivačnou doménou uvedeného transkripčného faktora a expresia faktora knižnice druhej hybridnej DNA kódujúcej druhý fúzny protein obsahujúci časť alebo celý polypeptid, pri ktorom existuje predpoklad väzby na ad a spolu s doménou viažucou DNA alebo aktivačnou doménou transkripčného faktora, ktoré nie sú inkorporované v prvom fúznom proteíne. Ďalej je potom vyhodnotený vplyv domnelej modulačnej zlúčeniny na interakciu medzi ad a jeho ligandom. Tento vplyv je sledovaný detekciou väzby proteínu viažuceho ad na ad v danej hostiteľskej bunke, že je v danej hostiteľskej bunke detegovaná tvorba produktu reportérového génu. Nakoniec je z príslušnej hostiteľskej bunky izolovaná druhá hybridná sekvencia DNA kódujúca protein viažuci ad.
Vynález sa takisto týka hybridómov produkujúcich protilátky špecificky namierené proti ad. V súčasnosti sú veľmi dobre známe techniky slúžiace na produkciu hybridómov, ktoré sekretujú monoklonálne protilátky. Bunkové línie hybridómov môžu byť vytvorené imunizáciou nejakého živočícha prostredníctvom purifikovaného ad, variantov polypeptidu ad alebo buniek, ktoré na svojom extracelulárnom povrchu exprimujú polypeptid ad alebo jeho varianty. Medzi imunogénne bunkové typy patria bunky, ktoré exprimujú ud in vivo, alebo transfekované bunkové línie eukaryotických alebo prokaryotických buniek, ktoré pri normálnych okolnostiach in vivo polypeptid ad neexprimujú. Vo výhodnej realizácii sú uprednostňované sekretované hybridómami označovanými 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 18L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3, 197A-4, 199A, 199H a 199M.
Hodnota informácií poskytnutých odhalením sekvencií DNA kódujúcich ad a aminokyselinových sekvencií ad je zrejmá. Sekvencia cDNA kódujúca Od, uvedená v jednej sérii príkladov umožňuje izoláciu sekvencie genómovej DNA kódujúcej otd, vrátane prvkov riadiacich transkripciu tejto génovej sekvencie. Vynález sa takisto týka možnosti identifikácie alelických variantov DNA kódujúcich ad a DNA kódujúcej ad z iných druhov (napríklad myši alebo potkanov). Izolácia ľudskej genómovej DNA kódujúcej ad a DNA pre ad z iných druhov, môže byť uskutočnená pomocou štandardných techník hybridizácie DNA/RNA, uskutočňovanej pri vhodných podmienkach, pri použití časti alebo celej sekvencie cDNA pre ad (táto sekvencia cDNA pre ad je použitá ako sonda na testovanie („sereening“) vhodnej knižnice). Inou možnosťou použiteľnou na amplifikáciu a identifikáciu sekvencií genómovej DNA kódujú
SK 283135 Β6 cej ad, je využitie polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR), pri ktorej sú ako priméry použité oligonukleotidy vytvorené na základe známej sekvencie cDNA. Pomocou konvenčných metód syntézy môže byť pripravená syntetická DNA kódujúca polypeptid ad, vrátane jeho fragmentov a rôznych variantov.
Informácie o sekvencií DNA podľa vynálezu takisto umožňujú vytvoriť, prostredníctvom prístupu využívajúceho rekombinantné techniky alebo stratégie „knockoutovania“ génov [pozri napríklad Kapecchi, Science 244 : 1288 až 1292 (2989)], hlodavce, ktoré nie sú schopné exprimovať funkčný polypeptid ad, alebo ktoré exprimujú nejaké z variantov polypeptidu ad. Tieto hlodavce môžu slúžiť ako vhodný model na štúdium aktivít polypeptidu ad a modulátorov polypeptidu otd in vivo.
Sekvencie DNA a aminokyselinové sekvencie podľa vynálezu takisto umožňujú uskutočniť analýzu tých epitopov ad, ktoré sa aktívne zúčastňujú na väzbe na receptor, a takisto epitopov, ktoré môžu túto väzbu nejakým spôsobom regulovať, skôr ako sa na nej aktívne zúčastňovať. Vynález takisto zahrnuje možnosť identifikácie epitopov, ktoré sa môžu zúčastňovať na prenose signálov cez membránu.
DNA podľa vynálezu je takisto použiteľná na detekciu tých typov buniek, ktoré exprimujú polypeptid ad. Na stanovenie hladiny konštitutívnej transkripcie ad v bunkách, ako aj na stanovenie zmien v transkripcii v závislosti od prítomnosti interných alebo externých látok, môžu byť využité štandardné techniky hybridizácie DNA/RNA, ktoré na detekciu RNA kódujúcej polypeptid ad využívajú DNA pre ad. Identifikácia látok modifikujúcich transkripciu a/alebo transláciu polypeptidu ad môže byť zasa využitá na stanovenie potenciálnych terapeutických alebo preventívnych účinkov týchto látok. DNA podľa vynálezu takisto umožňuje hybridizáciu DNA pre ad a bunkovej RNA in situ, čím je možné určiť lokalizáciu RNA pre ad v populácii buniek obsahujúcich viac bunkových typov a v tkanivách.
DNA podľa vynálezu môže byť takisto použitá na identifikáciu polynukleotidových sekvencií z iných organizmov ako z človeka, ktoré majú homológiu k sekvenciám ľudského ad. Znalosť sekvencií DNA pre ad u iných organizmov ako u ľudí umožňuje vytvorenie živočíšnych modelov (vrátane napríklad transgénnych modelov) k ľudskému systému.
Iná stránka vynálezu sa týka monoklonálnych a polygonálnych protilátok špecificky namierených proti ad, ktoré môžu byť využité pri imunohistochemických analýzach na lokalizáciu polypeptidu ad v bunkových kompartmentoch alebo v jednotlivých bunkách tkanív. Tento typ imunohistochemických stanovení je veľmi výhodne používaný v kombinácii s hybridizáciou in situ, pričom sú lokalizované ako mRMA pre ad, tak aj polypeptidový produkt génu pre ad.
Identifikácia typov buniek, ktoré exprimujú polypeptid ad, môže výrazne pomôcť pri vývoji látok s terapeutickým alebo preventívnym účinkom. Predpokladá sa, že produkty podľa vynálezu, ktoré sú príbuzné ad, môžu byť využité pri liečení chorôb, pri ktorých v procese chorôb hrajú dôležitú úlohu makrofágy. V súčasnosti je opísané množstvo živočíšnych modelov pre patologické stavy spojené s pozmenenou aktivitou makrofágov. Napríklad v publikácii Jutila a ďalší, J. Leukocyte Biol. 54 : 30 až 39 (1993) je u myší opísané hromadenie makrofágov v miestach tak chronických, ako aj akútnych zápalov. U laboratórnych potkanov opisujú Adams a ďalší [Transplantation 53 : 1115 až 1119 (1992) a Transplantation 56 : 794 až 799 (1993)] model pre artériosklerózu štepu vznikajúcu po transplantácii heterotropných abdominálnych srdcových aloŠtepov. Rosenfeld a ďalší [Arteriosclerosis 7 : 9 až 23 (1987) a Arteriosclerosis 7 : 24 až 34 (1987)] opisujú indukciu artériosklerózy u králikov kŕmených diétou s prídavkom cholesterolu. Hanenberg a ďalší [Diabetológia 32 : 126 až 134 (1989)] uvádzajú spontánne rozvinutie inzulíndependentného diabetu u laboratórnych potkanov BB. Yamada a ďalší [Gastroenterology 104 : 759 až 771 (1993)] opisujú u laboratórnych potkanov injikovaných polymérmi peptidoglykánpolysacharid z baktérie Streptococcus výskyt zápalovej choroby čriev a chronickej granulomatóznej kolitídy. Cromartie a ďalší [J. Exp. Med. 146 : 1585 až 1602 (1977)] a Schwab a ďalší [Infection and Immunity 59 : 4436 až 4442 (1991)] uvádzajú, že injekcie proteínov bunkovej steny z baktérie Streptococcus do organizmu laboratórnych potkanov má za následok artritický stav charakterizovaný zápalom periférnych kĺbov a následným poškodením týchto kĺbov. A nakoniec Huitinga a ďalší [Eur. J. Immunol 23 : 709 až 715 (1993)] opisujú u laboratórnych potkanov Lewis výskyt encefalomyelitídy (ložiskový zápal mozgu a miechy), ktorá je modelom pre roztrúsenú sklerózu. Pri každom z týchto modelov sú na zmiernenie priebehu chorôb využívané protilátky proti ad alebo iné proteíny viažuce polypeptid ad, alebo rozpustné formy polypeptidu ad. Cieľom tohto pôsobenia je pravdepodobne zamedziť aktivácii makrofágov.
Vynález sa takisto týka farmaceutických kompozícií použiteľných pri liečení týchto a iných chorôb. Farmaceutické kompozície sú navrhované tak, aby inhibovali interakcie medzi ad a jeho ligandom(dmi). Medzi tieto farmaceutické kompozície patria najrôznejšie rozpustné formy polypeptidu ad a formy polypeptidu ad asociované s membránou (s obsahom celého polypeptidu ad alebo jeho fragmentov, ktoré sa aktívne zúčastňujú pri väzbe polypeptidu Od), najrôznejšie rozpustné formy proteínov viažucich ad a formy proteínov viažucich ad asociované s membránou (vrátane protilátok, ligandov a podobne), intracelulámy a extracelulámy modulátor väzbovej aktivity ctd a/alebo modulátor expresie polypeptidu ad a/alebo polypeptidu ríd-ligand, vrátane modulátorov transkripcie, translácie, posttranslačných úprav a/alebo intracelulámeho transportu.
Vynález sa takisto týka metód slúžiacich na liečenie chorôb, pri ktorých svoju úlohu hrá väzba polypeptidu ad alebo lokalizovaná akumulácia buniek exprimujúcich polypeptid ad. V týchto metódach je pacientovi postihnutému uvedenou chorobou podávaná farmaceutická kompozícia podľa vynálezu v množstve dostačujúcom na ovplyvnenie úrovne väzby polypeptidu ad alebo v množstve dostačujúcom na ovplyvnenie akumulácie buniek exprimujúcich polypeptid ad. Tieto metódy liečenia podľa vynálezu sú použiteľné pri chorobách, akými sú napríklad, ale nielen, diabetes I. typu, ateroskleróza, roztrúsená skleróza, astma, lupienka, zápal pľúc, syndróm akútnej respiračnej tiesne a reumatická artritída.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Množstvo ďalších aspektov a výhod vynálezu bude zrejmejšie, ak sa zoberie do úvahy nasledujúci opis vynálezu, kde sú uvedené aj nasledujúce obrázky, kde:
Na obrázkoch 1A až 1D sú znázornené aminokyselinové sekvencie ľudských CDllb (SEK. ID. č.: 3), CD11 c (SEK. ID. č.: 4) a ad (SEK: ID. č.: 2).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi týkajúcimi sa izolácie klonu DNA kódujúcej polypeptid ad z knižnice cDNA z ľudskej sleziny. Presnejšie povedané, príklad 1 ilustruje použitie protilátky proti psiemu aTMI pri pokuse detegovať homológny ľudský proteín. Príklad 2 detailnej opisuje purifikáciu psieho polypeptidu aTMI a sekvenáciu N-koncovej časti tohto polypeptidu, aby bolo možné vytvoriť oligonukleotidové primery použiteľné na amplifikáciu psieho génu pre aTM1 pomocou PCR. Príklad 3 sa týka purifikácie veľkého množstva polypeptidu aTM1 z organizmu psa, aby bolo možné určiť vnútorné sekvencie tohto polypeptidu a potom pripraviť ďalšie priméry pre PCR. Príklad 4 opisuje použitie primárov komplementárnych k vnútornej sekvencii génu pre aTM1 pri amplifikácii fragmentu génu kódujúceho psí aTM1 pomocou PCR. Príklad 5 sa týka klonovania sekvencie cDNA kódujúcej ľudský ad. Príklad 6 opisuje analýzu expresie mRNA kódujúcej ad v ľudských tkanivách a bunkách, uskutočňovanú metódou Northem blot. Príklad 7 detailne opisuje konštrukciu expresívnych plazmidov obsahujúcich sekvenciu kódujúcu ľudský ad a transfekciu buniek COS týmito plazmidmi. Príklad 8 sa týka analýzy expresie polypeptidu ad v transfekovaných bunkách COS uskutočňovanej metódou ELISA. Príklad 9 opisuje analýzu buniek COS transfekovaných expresívnymi plazmidmi obsahujúcimi sekvenciu kódujúcu ľudský ad uskutočňovanú pomocou FACS (Fluorescence Activated Celí Sorter). Príklad 10 sa týka imunoprecipitácie polypeptidu CD 18 asociovaného s ac v kotransfekovaných bunkách COS.
Príklad 11 opisuje stabilnú transfekciu buniek ovárií čínskeho chrčka (CHO bunky) pomocou expresívneho konštruktu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu ad. Príklad 12 sa týka väzby polypeptidu ad (závislej od prítomnosti polypeptidu CD 18) na intercelulárnu adhezívnu molekulu ICAM-R, mutantný proteín ICAM-R a molekulu komplementu iC3b. Príklad 13 opisuje techniku SPA slúžiacu na identifikáciu inhibítorov alebo posilňovačov (to znamená modulátorov) väzbových interakcií ligandov pre ad/anti-ligand pre ad. Príklad 14 opisuje konštrukciu expresívnych plazmidov, ktoré kódujú rozpustné farmy polypeptidu ad a väzbové analýzy produktov expresie. Príklad 15 sa týka produkcie polyklonálnych sér a monoklonálnych protilátok špecificky namierených proti ad. Príklad 16 opisuje použitie polyklonálneho séra namiereného prot ad pri analýze tkanivovej distribúcie polypeptidu ad, expresie ad na povrchu leukocytov periférneho krvného obehu a expresie polypeptidu ctd v zápalovej a nezápalovej synovii (klbna mazotvorná blana). Príklad 17 opisuje izoláciu sekvencii cDNA, ktoré majú homológiu k sekvenciám ľudského génu pre ad, z organizmu laboratórnych potkanov. Príklad 18 sa týka konštrukcie expresívnych plazmidov kódujúcich celý polypeptid ad, expresívnych plazmidov kódujúcich doménu I polypeptidu ad, vrátane fúznych proteínov domény i/IgG a produkcie monoklonálnych protilátok proti celému polypeptidu a fúznym proteínom obsahujúcim doménu I. Príklad 19 sa týka izolácie sekvencii cDNA, ktoré majú homológiu k sekvenciám ľudského génu pre ad, z organizmu myší. Príklad 20 opisuje ďalšiu izoláciu klonov cDNA kódujúcich ad použitých na potvrdenie výsledkov sekvenčnej analýzy. Príklad 21 sa týka hybridizačných analýz uskutočňovaných in situ v rôznych myšacích tkanivách, ktoré slúžia na stanovenie špecificity a bunkovej expresie predpokladaného myšacieho homológu ľudského ad. Príklad 22 opisuje konštrukciu expresívnych konštruktov, ktoré kódujú predpokladaný myšací homológ ľudského ad. Príklad 23 sa týka vytvorenia „knockoutovanej“ myši, pri ktorej je rozrušený gén kódujúci predpokladaný myšací homológ ľudského ad. Príklad 24 sa týka izolácie sekvencii cDNA, ktoré majú homológiu ku kódujúcim sekvenciám ľudského génu pre ad, z organizmu králikov. Príklad 25 opisuje živočíšny model choroby človeka, v ktorom sú stanovované možnosti modulácie ad. Príklad 26 opisuje expresiu polypeptidu ad pri živočíšnom modeli choroby.
Príklad 1
Pokus detegovať ľudský homológ psieho polypeptidu aTM1
S cieľom pokúsiť sa identifikovať ľudský homológ psieho polypeptidu aTM] bola na ľudských leukocytoch periférneho krvného obehu testovaná krížová reaktivita monoklonálnej protilátky Call.8H2 špecificky namierenej proti psiemu aTM| [Moore a ďalší, pozri skôr]. Bunky (obvykle 1 x 106 buniek) boli na ľade za prítomnosti 0,1 % azidu sodného inkubované s nariedeným supernatantom získaným po kultivácii hybridómov alebo s purifikovanou kontrolnou myšacou protilátkou IgG-negatívnou (10 pg/ml). Väzba monoklonálnej protilátky bola detegovaná následnou inkubáciou konskou protilátkou (s koncentráciou 6 pg/ml) namierenou proti myšacím IgG konjugovanou s FITC (Vector 10 Laboratories, Burlingame, CA). Označené bunky boli vo ľyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom (PBS) fixované pomocou 2 % w/v paraformaldehydu a potom analyzované pri použití prístroja FACS Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Pri obvyklej realizácii bolo s využitím logaritmického zosilnenia intenzity fluorescencie analyzovaných 10 000 buniek.
Získané výsledky naznačujú, že protilátka Call.8H2 nereaguje krížovo s povrchovými proteínmi exprimovanými na povrchu ľudských leukocytov periférneho krvného obehu, zatiaľ čo v podstate všetky kontrolné bunky, ktorými sú neoplastické psie lymfocyty periférneho krvného obehu, polypeptid aTM| na svojom povrchu exprimovali.
Pretože monoklonálna protilátka Cal 1.8H2 špecificky namierená proti psej podjednotke a nereagovala krížovo s nejakým ľudským homológom tejto podjednotky, bola nevyhnutným predpokladom izolácia príslušného ľudského náprotivku DNA kódujúcej psi aTM1 (ak však tento ľudský náprotivok existuje) izolácia uvedenej DNA kódujúcej psí αΤΜ1·
Príklad 2
Afinitná purifikácia psieho polypeptidu ctTM1 použitého na sekvenovanie N-koncovej oblasti
S cieľom stanovenia N-koncovej sekvencie bol afinitne purifikovaný psí polypeptid αΤΜι a získaná aminokyselinová sekvencia bola použitá pri návrhu oligonukleotidovej sondy alebo priméru. Stručne povedané, monoklonálna protilátka Call.8H2 namierená proti polypeptidu aTMh bola naviazaná na chromatografický nosič Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) a požadovaný proteín bol izolovaný pomocou špecifickej interakcie protilátka-proteín. Protilátka bola na nosič konjugovaná postupom odporúčaným firmou BioRad a výsledná koncentrácia bola 5 mg protilátka na ml nosiča. Po konjugácii bal prebytok protilátky odstránený a nosič bol zablokovaný pomocou trojnásobného objemu 0,1 M etanolamínu. Nosič bol potom premytý fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátovým pufrom (PBS) s objemom zodpovedajúcim tridsiatim objemom kolóny.
V 250 ml pufra obsahujúceho 0,32 M sacharózu v 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, s inhibítormi proteáz, bolo homogenizovaných 25 gramov sleziny získanej z jedného psa. Bunkové jadrá a celé bunky boli odstránené centrifúgáciou uskutočňovanou pri 1000 x g počas 15 minút. Membrány boli od supematantu oddelené centrifugáciou pri 100 000 x g počas 30 minút. Takto získaná peleta tvorená membránami bola rozsuspendovaná v 200 ml lyzačného pufra (50 mM NaCl, 50 mM soľ kyseliny boritej, pH 8,0, spolu s 2 % NP-40) a počas 1 hodiny inkubovaná na ľade. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 100 000 x g počas 60 minút. Desať mililitrov číreho lyzátu bolo spolu s 0,5 ml nosiča Affigel 10 s konjugovanou protilátkou Cal 1.8H2 (pozri skôr) prenesených do polypropylénovej skúmavky s objemom 15 ml. Táto skúmavka bola pri stálom miešaní inkubovaná cez noc pri 4 °C a nosič bol potom premytý päťdesiatnásobným množstvom D-PBS. Potom bol tento nosič prenesený do mikroccntrifúgačnej skúmavky a počas 10 minút varený za prítomnosti 1 ml Laemliovho vzorkového pufra (neredukujúci) so zložením 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 2 % SDS, 20 % glycerol a 0,002 % brómfenolová meď. Nosič bol potom odstránený centrifugáciou; k supematantu bola pridaná 1/15 objemu β-merkaptoetanolu (Sigma, St. Louis, MO) a vzorka bola podrobená elektroforéze na 7 % polyakrylamidovom géli. Rozdelené proteíny boli prenesené na membránu Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) nasledujúcim spôsobom.
Gély boli raz premyté deionizovanou vodou filtrovanou cez membránu Millipore a potom počas 15 až 30 minút ekvilibrované v transferovom pufri so zložením 10 mM kyselina 3-[cyklohexylamino]-l-propánsulfónová (CAPS), pH 10,5 s 10 % metanolom. Membrány Immobilon boli navlhčené metanolom, premyté filtrovanou vodou a počas 15 až 30 minút ekvilibrované v transferovom pufri CAPS. Začiatočný prenos bol uskutočňovaný pri použití prístroja pre Westem Blot firmy BioRad pri 70 voltoch počas 3 hodín.
Membrány Immobilon boli potom z prístroja vybrané a počas 10 minút zafarbené 0,1 % roztokom Coomasie R250. Potom boli membrány v troch cykloch po desiatich minútach odfarbené zmesou 50 % metanol/10 % kyselina octová. Po odfarbení boli membrány premyté filtrovanou vodou a vysušené na vzduchu.
Boli detegované prúžky proteínov so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 150 kD, 95 kD, 50 kD a 30 kD. Prúžky so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 50 kD a 30 kD vznikli pravdepodobne v dôsledku kontaminácie protilátkou. Ako pre prúžok zodpovedajúceho proteínu s molekulovou hmotnosťou 150 kD, tak aj pre prúžok zodpovedajúci proteínu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 95 kD bol uskutočnený pokus určiť N-koncovú sekvenciu, ale proteín so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 95 kD bol blokovaný, takže túto sekvenciu nebolo možné určiť. Prúžok proteínu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150 kD bol z membrány vystrihnutý a pomocou proteínového sekvenátora Applied Biosystems (Foster City, CA) model 472A priamo sekvenovaný postupom podľa vynálezu. Získaná aminokyselinovú sekvencia je pri použití jednopísmenového aminokyselinového kódu znázornená ako SEK. ID. č.: 5:
FNLDVEEPMVFQ (SEK. ID. č.: 5)
Táto identifikovaná sekvencia obsahuje sekvenciu FLDN charakteristickú pre podjednotky a rodiny integrínov [Tamura a ďalší, J. Celí. Biol. 111 : 1593 až 1604 (1990)].
Vytvorenie primérov a pokus o amplifikáciu sekvencií kódujúcich psí aTM,
S využitím získanej informácie o N-koncovej sekvencií boli s cieľom hybridizácie navrhnuté tri oligonukleotidové sondy: a) „Tommer“ - úplne degenerovaný oligonukleotid; b) „Patmer“ - čiastočne degenerovaný oligonukleotid; a c) „Guessmer“ - nedegenerovaný aligonukleotid so sekvenciou založenou na kodónoch používaných u cicavcov. Tieto sondy sú znázornené ďalej ako SEK. ID. č.: 6, 7 a 8. Symboly v sekvenciách nukleových kyselín použité vo všetkých nukleotidových sekvenciách vynálezu zodpovedajú § 1, 882 37 C. R. F.
5’-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3'
5'-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3'
5-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3' (SEK. ID. č.: 6) (SEK. ID. č.: 7) (SEK. ID. č.: 8)
Pri použití týchto oligonukleotidov (vytvorených na základe dát získaných sekvenáciou polypeptidu) neboli pri niekoľkých hybridizačných analýzach, pri podmienkach umožňujúcich hybridizáciu nedokonale komplementárnych sekvencií, v knižnici cDNA získanej z psích makrofágov periférneho krvného obehu/slezinných buniek zaklonovanej do lambdaZAP (Stratagene, La Jolla, CA), detegované príslušné klony.
Potom boli na základe odhadnutej sekvencie N-konca polypeptidu vytvorené štyri oligonukleotidové priméry označované 5' Deg, 5' Spec, 3' Deg a 3' Spec (ako sú zobrazené v SEK. ID. č.: 9, 10, 11 a 12, kde Deg označuje degenerovanú sekvenciu a Spec nedegenerovanú sekvenciu). S týmito oligonukleotidovými primármi bol uskutočnený pokus a amplifikáciu (pomocou PCR) sekvencií kódujúcich psí ctTM1 z DNA fágovej knižnice puriftkovanej z lyzátov knižnice firmy Stratagene opísanej skôr.
5'-TTYAA YYTNGAYGTNGARGARCC-3'
5'-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3' (SEK. ID. ¢.: 9) (SEK. TD. č.: 10)
5'-TGRAANACCATNGGYTC-3' (SEK. ID. č.: 11)
5'-TTGGAAGACCATNGGYTC-3' (SEK. ID. č.: 12)
Oligonukleotidové priméry na amplifikáciu aTM] boli použité v dvojiciach s primármi komplementárnymi k sekvencii vektora označenými T3 a T7 znázornenými v SEK. ID. č.: 13 (T3) a 14 (T7), ktoré hybridizujú so sekvenciami ohraničujúcimi oblasť polylinkéra fágmidu Bluescript nachádzajúcom sa v lambdaZAP.
5'-ATTAACCCTCAGTAAAG-3' (SEK. ID. i.: 13)
5'-AATACGACTCACTATAG-3' (SEK. ID. ¢.: 14)
Amplifikácia metódou PCR bola uskutočnená v pufri Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) obsahujúcom horečnaté ióny, pri použití 150 ng knižnice DNA, 1 pg jednotlivého priméru, 200 μΜ každého z dNTP a 2,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim). Produkty PCR reakcie boli separované elektroforézou na 1 % agarózovom géli v pufri Tris-acetát-EDTA (TAE) s prídavkom etidium bromidu s koncentráciou 0,25 pg/ml. DNA bola metódou kapilárneho prenosu prenesená na membránu Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Transfer bol uskutočnený cez noc v 10 x SSPE. Po prenesení na membránu bola imobilizovaná DNA denaturovaná pôsobením
0,5 M NaOH s 0,6 M NaCl, neutralizovaná 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0, v 1,5 M NaCl a pred zosieťovaním pomocou UV žiarenia uskutočňovaným na prístroji Stratalinker (Stratagene) premytá 2 x SPE. Pri stálom trepaní bola membrána pri 50 °C inkubovaná počas 2 hodín v prehybridizačnom pufri (5 x SSPE, 4 x Denhardts, 0,8 % SDS, 30 % formamid).
Pri použití pufra na kinázu firmy Boehringer Mannheim so 100 až 300 pCi rP32-dATP a 1 až 3 jednotiek polynukleotid kinázy boli oligonukleotidové sondy 5'Deg, 5'Spes, 3'Deg a 3'Spec (SEK. ID. č.: 9, 10, 11 a 12) rádioaktívne označené. Značenie prebiehalo í až 3 hodiny pri 37 °C. Nezainkorporovaná rádioaktívna značka bola odstránená chromatagrafiou na kolóne Sephadexu G-25 fme (Pharmacia, Piscataway, NJ) pri použití pufra so zložením 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) a pretečená frakcia bola priamo pridaná k prehybridizačnému roztoku. Hybridizácia s rádioaktívnou sondou prebiehala pri 42 °C počas 16 hodín pri stálom trepaní. Nakoniec boli membrány premývané pri 50 °C počas 15 minút roztokom 1 x SSPE/0,1 % SDS. Membrány boli potom pri -80 °C počas 1 až 4 hodín exponované na film Kodak X-Omat AR.
Oligonukleotid 5' Deg, 5' Spec, 3' Deg a 3' Spec hybridizovali len s produktmi tých PCR reakcií, pri ktorých boli použité ako priméry, a nehybridizovali, ako sa očakávalo s produktmi PCR reakcií, pri ktorých ako priméry použité neboli. Usúdilo sa teda, že žiadny z produktov reakcie PCR nie je špecifický pre aTMI, pretože ani jeden z produktov nehybiridizoval so všetkými použitými sondami.
Príklad 3
Purifikácia veľkého množstva polypeptidu aTM1 z organizmu psa uskutočňovaná s cieľom určiť vnútornú sekvenciu polypeptidu
Aby bolo možné získať ďalšiu aminokyselinovú sekvenciu použiteľnú na vytvorenie primárov, bol s cieľom určenia vnútornej sekvencie polypeptidu purifikovaný psí polypeptid αΤΜι· Na purifikáciu proteínu použiteľného na určenie vnútornej sekvencie boli použité tri kusy zmrazenej sleziny (každá s hmotnosťou približne 50 g) a zmrazené bunky získané z dvoch slezín dospelých psov. V 200 až 300 ml borátového pufra bolo v miešacom zariadení Waring homogenizovaných 50 g sleziny. Homogenizovaný materiál bol zriedený rovnakým objemom pufra obsahujúcim 4 % NP-40 a zmes bola ľahko trepaná prinajmenšom jednu hodinu. Väčšie kusy boli z lyzátu odstránené centrifugáciou pri 2000 x g počas 20 minút a supematant bol prefiltrovaný buď cez filter Coming (Corning, NY) alebo cez filtračný systém Corning s membránou s veľkosťou pórov 0,8 mikrónov. Lyzát bol potom prečistený filtráciou cez filtračný systém Coming s membránou s veľkosťou pórov 0,4 mikrónov.
Lyzát za sleziny a nosič Affigel 10 s konjugovanou protilátkou (opísaný v príklade 2) boli zmiešané v pomere 150 : 1 v alikvótach s objemom 100 ml a pri stálom trepaní inkubované cez noc pri 4 °C. Lyzát bol potom odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 1000 x g počas 10 minút, zmiešaný s ďalším alikvótom nosiča Affigel 10 s konjugovanou protilátkou a inkubovaný cez noc pri uvedených podmienkach. Alikvóty nosiča s naviazaným proteínom boli potom spojené a premyté 50-násobným objemom pufra D-PBS/0,1 % Tween 20 a nosič bol umiestený na kolónu BioRad s objemom 50 ml. Naviazaný proteín bol z nosiča eluovaný 3 až 5 násobným objemom 0,1 M glycínu (pH 2,5); boli zozbierané frakcie s objemami 900 μΐ a tieto frakcie boli neutralizované pomocou 100 μΐ pufra IM Tris, pH 8,0: Z každej frakcie bol odobraný alikvót s objemom μΐ a tento alikvót bol povarený s rovnakým objemom 2 x Laemmliovho vzorkového pufra s 1/15 objemu IM ditiotreitolu (DTT). Tieto vzorky boli analyzované elektroforézou na 8 % polyakrylamidovom géli Novex (San Diego, CA) a vizualizované farbením Coamasie alebo striebrom pri použití Daiichiovho kitu (Enprotech. Natick. MA), postupom opísaným výrobcom. Frakcie obsahujúce najväčšie množstvo proteínu boli zmiešané a skoncentrované vo vákuu. Zvyšný roztok bol zriedený na polovicu redukujúcim Laemmliovým vzorkovým pufrom a elektroforeticky rozdelený na 7 % polyakrylamidovom géli s hrúbkou 1,5 mm v pufri Tris-glycín/SDS. Po elektroforéze boli proteíny pri použití pristroja pre Westem Blot firmy Hoefer prenesený z gélu na membránu Immobilom postupom opísaným v príklade 2.
Prúžky proteínov s veľkosťou zodpovedajúcou aTMi boli z 10 membrán PVDF vyrezané; celkový obsah proteínu bol približne 47 pg. Tieto vyrezané prúžky boli odfarbené v 4 ml 50 % metanolu (5 minút), vysušené na vzduchu a rozrezená na kúsky s veľkosťou 1x2 mm. Tieto kúsky membrán boli pri 4 °C na 30 minút ponorené do 2 ml 95 % acetónu, občas vortexované nakoniec vysušené na vzduchu.
Pred vlastným proteolytickým štiepením proteínu naviazaného na membránu boli v 1,5 ml 70 % kyseliny mravčej rozpustené 3 mg brómkyánu (CNBr) (Pierce, Rockford, IL). Tento roztok bol pridaný do skúmavky obsahujúcej kúsky membrány PVDF a skúmavka bola inkubovaná počas 24 hodín pri izbovej teplote v tme. Supematant (SI) bol potom prenesený do inej skúmavky a kúsky membrány boli premyté 0,25 ml 70 % kyseliny mravčej. Tento supematant (S2) bol potom pridaný k supernatantu SI. K spojeným supernatantom (SI a S2) boli pridané 2 ml vody Milli Q a vzniknutý roztok bol lyofilizovaný. Kúsky membrán PVDF boli vysušené pod prúdom dusíka a pri 42 °C počas 17 hodín opäť extrahované 1,25 ml roztoku so zložením 60 % acetonitril, 0,1 % kyselina tetrafluóroctová (TFA). Tento supematant (S3) bol odobraný a kúsky membrán PVDF boli pri 42 °C počas 1 hodiny opäť extrahované 1,0 ml roztoku so zložením 80 % acetonitril, 0,08 % kyselina tetrafluóroctová. Tento supematant (S4) bol zmiešaný s predchádzajúcimi supematantmi (SI, S2 a S3) a zmes supernatantov bola vysušená vo vákuu.
Vysušené fragmenty proteínu získané štiepením pomocou CN-Br boli potom rozpustené v 83 μΐ roztoku so zložením 8M močovina, 0,4 M NH4HCO3. Tieto fragmenty boli redukované pridaním 5 μΐ 45 mM ditiotreitolu (DTT) a následnou inkubáciou pri 50 počas 15 minút. Vzniknutý roztok bol potom ochladený na izbovú teplotu a fragmenty boli alkylované pridaním 5 μΐ 100 mM jódacetamidu (Sigma, St. Louis, MO). Po 15-minútovej inkubácii pri izbovej teplote bola vzorka zriedená 187 μΐ vody Milli Q na výslednú koncentráciu močoviny zodpovedajúcu 2,0 M. Potom bol k vzorke pridaný trypsín (Worthington, Freehold, NJ) v pomere enzým : proteín 1 : 25 (w/w) a štiepenie prebiehalo pri 37 počas 24 hodín. Štiepenie bolo skončené prídavkom 30 μΐ TFA. Proteínové fragmenty boli potom separované pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) na prístroji Waters 625 LC (Millipore, Milford, MA) pri použití kolóny Vydac C-18 (5 mikrónov) s rozmermi 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) ekvilibrovanej v roztoku 0,05 % TFA vo vode pre HPLC (pufer A). Peptidy boli eluované zvyšujúcou sa koncentráciou 80 % acetonitrilu v 0,04 % TFA (pufer B) s gradientom 38 % až 75 % pufer B počas 65 až 95 minút a 75 % až 98 % pufer B počas 95 až 105 minút. Peptidy boli delené pri prietoku 0,2 ml/minúta a detegované pri vlnovej dĺžke 210 nm.
Po frakcionizácii bola u peptidov stanovovaná aminokyselinová sekvencia. Stanovenie aminokyselinovej sekvencie bolo uskutočnené automaticky Edmanovým odburávaním na proteínovom sekvenátore Biosystems Model 473A pri použití štandardných cyklov odporúčaných výrobcom. Analýza získaných dát bola uskutočnená softvérovým programom Data Analysis Model 610A, verzia 1.2.1. Všetky sekvenačné reagencie boli dodané firmou Applied Biosystems. Aminokyselinové sekvencie siedmich z celkových ôsmich vnútorných fragmentov sú znázornené ďalej, pričom „X“ označuje aminokyseliny, pri ktorých nie je možné s istotou určiť o akú aminokyselinu vlastne ide.
VFQEXGAGFGQ | (SEK. ID. č.: 15) |
LYDXVAATGLXQPI | (SEK. ID. č.: 16) |
PLEYXDV1PQAE | (SEK:ID. č.: 17) |
FQEGFSXVLX | (SEK. ID. č.: 18) |
TSPTFIXMSQNVD | (SEK. ID. č.: 19) |
LVVGAPLEWAVXQTGR | (SEK. ID. č.: 20) |
LDXKPXDTA | (SEK. ID. C.: 21) |
Vytvorenie priméru
Jedna zo získaných aminokyselinových sekvencií (zobrazené ako SEK. ID. č.: 22) bola použitá na vytvorenie úplne degenerovaného oligonukleotidového priméru označeného p4(R) a zobrazeného ako SEK. ID. č.: 23.
FGEQFSE (SEK. ID. č.: 22)
5-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3' (SEK. ID. č.: 23)
Príklad 4
Klonovanie fragmentu psieho uTmi metódou PCR
S využitím PCR bola z dvojvláknovej cDNA z psej sleziny amplifikovaná časť na 5' konci génu kódujúceho psí polypeptid a™,.
A. Vytvorenie dvojvláknovej cDNA z psej sleziny
Jeden gram zmrazeného materiálu získaného zo sleziny mladého psa bol v zmesi kvapalného dusíka a suchého ľadu rozdrvený a homogenizovaný v 20 ml pufri RNA-Stat 60 (TelTest B, Inc, Friendswood, TX). Potom boli pridané ml chloroformu a roztok bol oddelený centrifúgáciou uskutočňovanou pri 12 000 x g počas 15 minút. Z vodnej vrstvy bola RNA precipitovaná prídavkom 10 ml etanolu. RNA obsahujúca poly-A sekvenciu bola potom oddelená s využitím nosiča Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Osla, Norsko). Päť alikvótov RNA s celkovou hmotnosťou 100 pg bolo zmiešaných a zriedených rovnakým objemom 2 x väzbového pufra (20 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) . RNA bola potom počas minút inkubovaná nosičom Oligo dT Dynabeads (1,0 ml alebo 5 mg nosiča na všetky vzorky). Pred vlastnou elúciou poly-A mRNA uskutočňovanou roztokom sa zložením 2 mM EDTA, pH 7,5, boli gulôčky nosiča premyté pufrom sa zložením 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA a 0,1 % SDS podľa postupu opísaného výrobcom. Potom bola, postupom podľa výrobcu a pri použití eluovanej mRNA s poly-A sekvenciou a kitu na syntézu cDNA firmy Boehringer Mannheim, syntetizovaná dvojvláknová cDNA.
B. Izolácia cDNA kódujúcej časť psieho polypeptidu aTM1
Pri štandardnej reakcii PCR uskutočňovanej pri použití 150 ng dvojvláknovej cDNA, 500 ng každého z primérov, 200 μΜ každého dNTP a 1,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim) v pufri Taq (Baehringer Mannheim) s prídavkom horečnatých iónov, boli použité aligonukleotidové priméry 5' Deg (SEK. ID. č.: 9) a p4(R) (SEK. ID. č.: 23). Vzniknuté produkty (1 μΐ pôvodnej reakcie) boli, s cieľom dosiahnuť vyššie výťažky, použité v ďalšej reakcii PCR s rovnakými primármi. Tieto prúžky boli pri 60 °C v pufri so zložením 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl eluované z 1 % agarózového gélu na papier Schleider & Shuell (Keene, NH) NA4S, precipitované a pri použití klonovacieho kitu TA (Invitrogen) zaligované do vektora pCRtmII (Invitrogen, San Diego, CA) (postupom odporúčaným výrobcom). Ligačné zmesi boli elektroporačne transformované baktérie XL-1 Blue (Stratagene). Jeden kloň, označený 2.7, obsahoval sekvencie zodpovedajúce sekvenciám DNA pre polypeptid aTMi, ktoré neboli využité pri návrhu primérov.
Sekvenácia bola uskutočnená pomocou sekvenátora DNA Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) pri použití sekvenačného kitu využívajúceho na termináciu reakcie deoxynukleotidy s naviazanou značkou (ABI). Pri tejto sekvenácii boli asymetrickou reakciou PCR [McCabe, „Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR“, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a ďalší (eds.), strany 76 až 83, Academic Press: New York (1990)] inkorporované fluorescenčné značené dNTP nasledujúcim postupom. Vzorky boli inkubované počas 4 minút pri 96 °C a potom podrobené 25 cyklom: 96 °C počas 15 sekúnd; 50 °C počas 1 sekundy; 60 °C počas 4 minút. Získané dáta (vrátane chromatografii a textových súborov) boli automaticky načítané do referenčných súborov. Celá sekvencia inzertu v klone 2.7 je znázornená ako SEK. ID. č.: 24.
Pokusy o izoláciu cDNA (z knižnice firmy Stratagene; ako je opísaná v príklade 2), kódujúcej celý psí polypeptid aTM1, boli neúspešné. Pri použití klonu 2.7 ako sondy, bolo v podmienkach umožňujúcich hybridizáciu sekvencií s nižším stupňom komplementarity (použitie 30 % formamidu) otestovaných približne 1 x 106 fágových plakov, ale neboli identifikované žiadne pozitívne klony. Takisto neúspešné boli pokusy o amplifikáciu príslušných sekvencií nachádzajúcich sa v smere transkripcie od sekvencií reprezentovaných v klone 2.7. Pokusy o amplifikáciu týchto sekvencií nachádzajúcich sa v smere transkripcie od sekvencií reprezentovaných v klone 2.7 boli uskutočňované pri použití špecifických oligonukleotidov odvodených z klonu 2.7 alebo degenerovaných primérov so sekvenciou vychádzajúcou z aminokyselinovej sekvencie iných peptidových fragmentov, a ako druhý primér bol použitý degenerovaný oligonukleotid so sekvenciou vychádzajúcou z konzervatívneho aminokyselinového motívu GFFKR podjednotky α [Tamura a ďalší, pozri skôr].
Príklad 5
Klonovanie predpokladaného ľudského homológa k psiemu aTMl
Pri pokuse o izoláciu ľudskej sekvencie homológnej k psej sekvencií kódujúcej aTM1 bol ako sonda použitý fragment psieho aTM1 s veľkosťou približne 1 kb z klonu 2.7. Táto sonda bola vytvorená reakciou PCR pri podmienkach opísaných v príklade 2 a pri použití primérov NT2 (pozri SEK. ID. č.: 25) a p4(R) (SEK. ID. č.: 23).
5'-GTNTTYCARGARGAYGG-3' (SEK. ID. č.: 25)
Produkt reakcie PCR bol purifikovaný pri použití kitu Quick Spin firmy Qiagen (Chatsworth, GA) postupom odporúčaným výrobcom. Takto purifikovaná DNA bola pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označená 200 pCi a32-PdCTP. Nezainkorporovaný izotop bol odstránený chromatografiou na kolóne Sephadexu G25 (fine). Pred vlastným použitím bola sonda denaturovaná pôsobením 0,2 M NaOH a neutralizovaná roztokom 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0.
Na filtračných papieroch Hybond (Amersham) boli pripravené kolónie knižnice cDNA z ľudskej sleziny zaklonované do vektora pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Filtre boli najprv vystavené pôsobeniu denaturačných činidiel a potom ncutralizované postupom opísaným v príklade 2 a potom pri miernom trepaní počas 2 hodín najprv inkubované pri 50 °C v prehybridizačnom roztoku (8 ml/fílter) s 30 % formamidom. K tomuto roztoku bola pridaná rádioaktívne značená sonda (pozri skôr) a spolu s filtrami bol tento roztok inkubovaný pri 42 °C počas 14 hodín. Filtre boli dvakrát premyté roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 37 °C a dvakrát roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 °C. Nakoniec boli filtre premyté dvakrát roztokom 1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 65 °C (1 x SSC má zloženie 150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný, pH 7,0). Počas 6 hodín boli filtre v kazete s kontrastným filtrom exponované na film Rodák X-Omat AR. Kolónie poskytujúce signál boli z duplikátu filtračného papiera natrené na platne s LB médiom obohateným horečnatými iónmi (LBM)/karbenicilín a inkubované cez noc pri 37 °C. Vyrastené kolónie boli prenesené na filtre Hybond a tieto filtre boli spracované opísaným postupom. Tieto filtre boli, pri použití sondy s veľkosťou 1 kb z klonu 2.7, rádioaktívne označené opísaným postupom, hybridizované v podmienkach, pri ktorých je na dosiahnutie pozitívneho signálu nevyhnutná vyššia komplementarita medzi sondou a testovanou DNA než v predchádzajúcom prípade; podmienky hybridizácie boli 50 % roztok formamidu, 50 °C počas 3 hodín. Filtre boli nakoniec premyté dvakrát roztokom 1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 65 °C a počas 2,5 hodiny boli filtre pri -80 °C v kazete s kontraktným filtrom exponované na film Rodák X-Omat AR. Boli identifikované pozitívne kolónie a tieto kolónie boli cez noc kultivované v LBM/karbenicilín. Z jednotlivých kultúr bola pomocou kitu Promega Wizard na minipreparáciu DNA, postupom odporúčaným výrobcom, izolovaná DNA a táto DNA bola potom sekvenovaná.
Prvým screeningom bola ako pozitívnych vybraných 18 klonov, zatiaľ čo výsledkom druhého screeningu uskutočňovaného pri podmienkach, pri ktorých je na dosiahnutie pozitívneho signálu nevyhnutná vyššia komplementarita medzi sondou a testovanou DNA, bola identifikácia jedného pozitívneho klonu označeného 19A2. Sekvencia DNA a odhadnutá aminokyselinová sekvencia klonu 19A2 ľudského aj sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 1 a2.
Charakteristiky cDNA pre ľudský ctd a predikovaného polypeptidu
Kloň 19A2 obsahuje celú kódujúcu oblasť pre maturovaný protein a navyše ešte 48 báz (16 aminokyselinových zvyškov) signálnej sekvencie nachádzajúcej sa na 5' konci proti smeru transkripcie od kódujúcej oblasti a 241 báz neprekladanej sekvencie na 3' konci, ktorá nie je ukončená polyadenylačnou sekvenciou. Predpokladá sa, že molekulová hmotnosť maturovaného proteínu bude približne 125 kD. Predpokladaná extraceluláma doména zahrnuje približne aminokyselinové zvyšky 17 až 1108 (v SEK. ID.
č.: 2). Na túto extracelulámu oblasť nadväzuje sekvencia asi 20 aminokyselín, ktorá je homológna k transmembránovej oblasti ľudského CD1 lc (aminokyselinové zvyšky 1109 až 1128 v SEK. ID. č.: 2). Cytoplazmatická doména je tvorená približne 30 aminokyselinami (aminokyselinové zvyšky 1129 až 1161 v SEK. ID č.: 2). Protein takisto obsahuje oblasť (približne aminokyselinové zvyšky 150 až 352) tvorenú asi 202 aminokyselinami, ktorá je homológna k doméne I (inzerčnej) spoločnej pre polypeptidy CD 11 a, CDllb a CDllc [Larson a Springer, pozri skôr], polypeptid aE [Shaw a ďalší, J. Biol. Chem. 269 : 6016 až 6025 (1994)] a proteíny VLA-1 a VLA-2 [Tamura a ďalší, pozri skôr]. Bolo dokázané, že doména I u iných integrínov participuje s ICAM [Landis a ďalší, J. Celí. Biol. 120 : : 1519 až 1527 (1993); Diamond a ďalší, J. Celí. Biol. 120 : 1031 až 1043 (1993)], čo ukazuje, žc polypeptid aD môže takisto viazať zástupcu povrchových molekúl proteínovej rodiny ICAM. Bola dokázané, že táto oblasť neexistuje v žiadnej inej podjednotke integrínov.
Odhadnutá aminokyselinová sekvencia polypeptidu aD je z približne 36 % homológna k aminokyselinovej sekvencii polypeptidu CD1 la, z približne 60 % homológna k aminokyselinovej sekvencii polypeptidu CDllb a z približne 66 % homológna k aminokyselinovej sekvencii polypeptidu CDllc. Na obrázku 1 sú zobrazené porovnané aminokyselinové sekvencie polypeptidov CDllb (SEK. ID. č.: 3), CD 11 c (SEK. ID. č.: 4) a aD (SEK. ID. č.: 2).
Pri organizmoch jedného druhu sa obvykle cytoplazmatické domény podjednotiek a v integrínoch β podstatne líšia, zatiaľ čo jednotlivé typy podjednotiek a majú medzi jednotlivými druhmi vysoký stupeň homológie. V súlade s týmito pozorovaniami sa cytoplazmatická oblasť polypeptidu ctD, podstatne líši od cytoplazmatických oblastí polypeptidov CDlla, CDllb a CD1 lc, ale s výnimkou aminokyselinovej sekvencie GFFKR (nachádzajúcej sa v tesnej blízkosti membrány), ktorá je konzervovaná medzi všetkými podjednotkami a [Rojiani a ďalší, Biochemistry 30: 9859 až 9866 (1991)]. Pretože oblasť cytoplazmatického konca integrínov sa zúčastňuje na „inside out“ signalizácii a regulácii avidity [Landis a ďalší, pozri skôr], je možné, že polypeptid aD interaguje s molekulami cytozolu, ktoré sú odlišné od molekúl interagujúcich s CDlla, CDllb a CDllc a výsledkom toho môže byť skutočnosť, že polypeptid aD sa zúčastňuje na signálnych dráhach odlišných od signálnych dráh, v ktorých participujú iné integríny β2.
Extraceluláma doména polypeptidu aD obsahuje, v pozícii vedľa domény I, konzervovanú aminokyselinovú sekvenciu DGSGS; pokiaľ ide o polypeptid CDllb, je sekvencia DGSGS oblasťou viažucou kovy a je nevyhnutná na interakciu s ligandom [Michishita a ďalší, Celí 72 : 857 až 867 (1993)]. V aminokyselinovej sekvencii polypeptidu aD klonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1) sú na pozíciách 465 až 474, 518 až 527 a 592 až 600 konzervované ďalšie tri miesta, ktoré sú v polypeptidoch CDllb a CDllc pravdepodobne zodpovedné za väzbu katiónov. Doména I polypeptidu aD má 36 %, 62 % a 57 % homológiu k príslušným oblastiam polypeptidov CD1 la, CD1 lb, resp. CD1 lc. Tento relatívne nízky stupeň sekvenčnej homológie naznačuje, že podjednotka ctD môže interagovať so skupinou extracelulámych proteínov, ktoré sú odlišné od proteínov; s ktorými reagujú iné známe integríny fl2. Takisto afinita polypeptidu aD k známym ligandom integrínov β2, akými sú napríklad ICAM-1, ICAM-2 a/alebo ICAM-R, môže byť odlišná od afinity demonštrovanej pri interakcii [L/ICAM (pozri príklad 12).
Izolácia ďalších klonov cDNA pre ľudský aD, použitých na otvorenie sekvencie
Aby bolo možné potvrdiť sekvenciu DNA kódujúcu ľudský aD, boli z knižnice cDNA z ľudskej sleziny (Invitrogen) zaklonovanej do vektora pcDNA/Amp (opísanej v príklade 5), pomocou hybridizácie, izolované ďalšie molekuly cDNA. Elektroforézou na agarózovom gél i boli vybrané len cDNA s dĺžkou prevyšujúcou 3 kb. Sonda použitá pri hybridizácii bola odvodená od 5' koncovej oblasti aD (ako je opísané ďalej). Hybridizačné podmienky boli totožné s podmienkami pri izolácii prvého klonu ľudského aD, len s tou výnimkou, že po hybridizácii boli filtre pri izbovej teplote dvakrát premyté v roztoku 2 x SSC/0,1 % SDS a raz roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 °C. Filtre boli exponované na film Kodak X-Omat AR.
Hybridizačná sonda 5' aD bola vytvorená pomocou reakcie PCR z klonu 19A2 pri použití primérov CD1 lc 5' For (SEK. ID. č.: 94) a CDllc 5' Rev (SEK. ID. č.: 95). Reakcia bola uskutočňovaná nasledujúcim postupom. Vzorky boli počas 4 minút udržiavané pri 94 °C a potom vystavené, v cykléri Perkin-Elmer 9600, 30 cyklom zmien teploty; i) 94 °C počas 15 sekúnd; ii) 5 °C počas 30 sekúnd; a iii) 72 °C počas 1 minúty.
CD1 lc 5’ For: (5')CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3') (SEK. ID. č.: 94)
CD1 lc 5’ Rev: (5')CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3') (SEK: ID. č.: 95)
Produkt amplifikačnej reakcie bol purifikovaný pri použití kitu Prep-A-Gene firmy BioRad (Hercules, CA) postupom odporúčaným výrobcom. Získaná sonda 5' aD bola dlhá približné 720 báz, čo zodpovedá oblasti začínajúcej oligonukleotidom 1121 a končiacej oligonukleotidom 1839 v SEK. ID. č.: 1. Purifikovaná DNA (približne 50 ng) bola, postupom odporúčaným výrobcom, pri použití kitu „Rondom Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim (Indianopolis, Indiana) rádioaktívne označená izotopom 32P-dCTP. Nezainkorporovaný izotop bol odstránený pri použití stĺpcov „Centrisep Spin Columns“ (Princeton Separations, Adelphia, NJ) postupom odporúčaným výrobcom. Rádioaktívne označená sonda bola pridaná k filtrom namočeným v prehybridizačnom roztoku obsahujúcom 45 % formamid a inkubácia prebiehala cez noc pri 50 °C. Po tejto inkubácii boli filtre premyté opísaným postupom.
Trinásť kolónií poskytlo na obidvoch duplikátoch filtrov pozitívny signál. Pozitívne kolónie boli zozbierané zo zásobnej platne, zriedené pomocou LBM s karbenicilínom (100 pg/ml) a v rôznych riedeniach vysiate na filtre Hyband (Amersham). Duplikáty týchto filtrov boli hybridizované v roztoku s rovnakým zložením ako pri prvej hybridizácii a po hybridizácii boli filtre premyté roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 ’C a potom exponované na film.
Pri druhom teste bolo potvrdených desať z pôvodne identifikovaných trinástich pozitívnych kolónií. Dva z týchto desiatich klonov (označené A7.Q a A8.Q) boli sekvenované a bolo stanovené, že kódujú ľudský aD. Pre kloň A7.Q bolo zistené, že je približne 2,5 kb dlhý, obsahuje vedúcu sekvenciu na 5' konci, časť kódujúcej oblasti a ďalších 60 báz neprekladanej sekvencie na 5' konci. Bolo zistené, že nekompletná kódujúca oblasť je výsledkom nesprávne zastrihnutej oblasti intrónu v mieste zodpovedajúcom oligonukleotidu 2152 v SEK. ID. č.: 1. Pre kloň A8.Q bolo zistené, že je približne 4 kb dlhý, obsahuje celú kódujúcu oblasť pre polypeptíd aD a takisto obsahuje sekvenciu intrónu v mieste zodpovedajúcom báze šesť v SEK. ID. č.: 1. V porovnaní s pôvodne izolovaným klonom aD (SEK.
ID. č.: 1) bol pri obidvoch klonoch, tak A7.Q, ako aj AB.Q, pozorovaný jeden rozdiel. Týmto rozdielom bola skutočnosť, že klony A7.Q a AB.Q majú v mieste bázy 1495 vložený kodón tvorený troma bázami CAG. Sekvencie klonov A7.Q a AB.Q sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 96 a 97 a zložené ľudské sekvencie odvodené od klonov A7.Q a AB.Q spolu sa zodpovedajúcimi aminokyselinovými sekvenciami sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 98 a 99.
Príklad 6
Analýza expresie ľudského aD v tkanivách, uskutočňovaná metódou Northern Blot
S cieľom stanoviť relatívnu hladinu a tkanivovú špecifitu expresie aD bola pri použití fragmentov z klonu 19A2 ako sondy uskutočnená analýza metódou Northern Blot. Na agarózový gél s formaldehydom a 1 pg etídium bromidu bolo z každej vzorky získanej z niekoľkých ľudských tkanív a kultivovaných bunkových línií nanesených približne 10 pg RNA. Po elektroforéze uskutočňovanej počas 4 hodín pri napätí 100 V bola RNA prenesená na nitrocelulózovú membránu (Schleicher & Schuell) metódou kapilárneho prenosu uskutočňovanou v 10 x SSC cez noc. Membrána bola „zapečená“ vo vákuu pri 80 °C počas 1,5 hodiny. Na blokovanie membrány bol použitý prehybridizačný roztok obsahujúci 50 % formamid v pufri kyseliny 3-(N-morfolino)propánsulfónovej (MOPS). Prehybridizácia prebiehala 3 hodiny pri 42 °C. Fragmenty klonu 19A2 boli, postupom odporúčaným výrobcom, pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim rádioaktívne označené izotopom a32P-dCTP a a32P-dTTP. Nezainkorporovaná značka bola odstránená na kolóne Sephadexu G25 v pufri TE. Na hybridizáciu bol použitý hybridizačný pufer s aktivitou 1,5 x 106 c.p.m./ml. Potom bol blot pri izbovej teplote premytý roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS, ďalej potom roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 ’C, roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 ’C, roztokom 1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 ’C, roztokom 0,5 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 ’C, a nakoniec roztokom 0,1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 °C. Potom bol blot počas 19 hodín exponovaný na film.
Hybridizácia pri použití fragmentu vyštiepeného z klonu 19A2 reštrikčným enzýmom BstXI (zodpovedajúcim nukleotidom 2011 až 3388 v SEK. ID. č.: 1) poskytla slabo signály u RNA, s veľkosťou približne 5 kb, z pečene, placenty, týmusu a mandlí (tonzíl). Vo vzorkách z obličiek, mozgu a srdca nebol detegovaný žiadny signál. Množstvo RNA prítomné vo vzorke z obličiek bolo minimálne (ako ukázalo farbenie etídium bromidom).
Pri použití druhého fragmentu z klonu 19A2 (zahrnujúceho oblasť báz 500 až 2100 v SEK. ID. č.: 1) boli v ľudských tkanivách, metódou Northern Blot využívajúcou RNA s poly-A Sekvenciou (Clontech), detegované RNA transkripty s dvoma rozdielnymi veľkosťami. V slezine a kostrových svaloch bol detegovaný prúžok s veľkosťou 6,5 kb, zatiaľ čo v pľúcach a leukocytoch periférneho krvného obehu bol detegovaný prúžok s veľkosťou 4,5 kb. Rozdiely v pozorovaných veľkostiach môžu byť spôsobené tkanivovo špecifickou polyadenyláciou, krížovou reaktivitou uvedenej sondy s inými zástupcami rodiny integrínov alebo hybridizáciou sondy s alternatívne zostrihnutými RNA.
Analýza uskutočňovaná metódou Northern Blot a využívajúca tretí fragment z klonu 19A2, zahrnujúci nukleotidy 2000 až 3100 v SEK. ID. č.: 1, poskytla obdobné výsledky ako analýzy využívajúce iné fragmenty klonu 19A2.
Pri použití fragmentov zodpovedajúcich nukleotidom 500 až 2100 a 2000 až 3100 v SEK. ID. č.: 1 bola takisto testovaná RNA získaná z troch línií myeloidných buniek. Bunková línia THP-1, stimulovaná prostredníctvom PMA, poskytla neostrý signál v tej istej oblasti (približne 5,0 kb), ako to bolo pri signáloch z iných tkanív; tento signál bol však trocha silnejší. RNA získaná z nestimulovaných buniek HL-60 a z buniek HL-60 stimulovaných prostredníctvom DMSO, poskytla pri hybridizácii so sondou aD signál s intenzitou zodpovedajúcou intenzite signálu pre vzorku tkaniva, ale zdalo sa, že vystavenie buniek pôsobeniu PMA zvyšuje intenzitu tohto signálu. Keďže tak PMA, ako aj DMSO, smerujú diferenciáciu buniek HL-60 po dráhe monocyty/makrofágy (PMA), resp. granulocyty (DMSO), naznačuje tento výsledok existenciu zvýšenej expresie polypeptidu aD pri bunkovom type monocyty/makrofágy. V bunkách U937 je prítomná mRNA pre aD a stimuláciou prostredníctvom PMA nedochádza k zosilneniu signálu. Žiadna pozitívna odpoveď nebola detegovaná pri bunkách Molt, Daudi, H9, JY alebo Jurkat.
Príklad 7
Prechodná expresia konštruktov kódujúcich ľudský aD A. Vytvorenie expresných konštruktov
Ľudskému klonu 19A2 chýba iniciačný kodón pre metionín a pravdepodobne tiež časť signálnej sekvencie na 5’ konci. Na vytvorenie expresívneho plazmidu obsahujúceho sekvencie ľudského klonu 19A2 boli teda použité dva odlišné prístupy. Pri prvom prístupe boli skonštruované dva plazmidy, v ktorých boli na vytvorenie chimerickej sekvencie kódujúcej použité sekvencie kódujúce signálny peptid odvodené od génov kódujúcich polypeptidy CDllb alebo CD1 lc, ktoré boli pripojené k sekvencii pre aD. Pri druhom prístupe bol skonštruovaný tretí plazmid, v ktorom bol na pozícii 0 v klonc 19A2 pridaný adenozín a tým bol vytvorený kodón pre iniciačný metionín.
Uvedené tri plazmidy obsahovali rôzne oblasti, ktoré sa líšia na 5' konci sekvencie kódujúcej polypeptid aD alebo chimérický polypeptid aD. Oblasť kódujúca aD bola pomocou PCR (pozri podmienky v príklade 2) amplifikovaná pri použití špecifického priméru BamRev vymedzujúceho 3' koniec kódujúceho vlákna (ďalej len 3' primér alebo reverzný primér) (pozri SEK. ID. č.: 26) a jedného z troch primárov vymedzujúcich k 5' koniec kódujúceho vlákna (ďalej len 5' primér alebo priamy primér). Uvedené tri 5' priméry v sekvencii obsahovali: (1) na pozíciách + až 6 identické nešpecifické bázy umožňujúce reštrikčné štiepenie, na pozíciách 7 až 12 reštrikčné miesto EcoRI a na pozíciách 13 až 18 konvenčnú Kozákovu sekvenciu; (2) časť signálnej sekvencie odvodenej od CDllb (primér ER1B) alebo CDllc (primér ER1C) alebo adenozín (primér ER1D); a (3) ďalších 15 až 17 báz komplementárnych k sekvenciám na 5' konci klonu 19A2, aby bolo umožnené „nasadnutie“ priméru na DNA. Priméry ER1B, ER1C alebo ER1D sú zobrazené v SEK. ID. č.: 27, 28 alebo 29, kde je iniciačný kodón pre metionín vyznačený hrubo a reštrikčné miesto EcoRI je podčiarknuté.
5'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3' 5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3’
5'AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTC TG-3' (SEK. ID. i.: 28)
5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (SEK. ID. č.: 29) (SEK. ID. ¢::26) (SEK ID. č,: 27)
Produkty získané reakciou PCR boli rozštiepené reštrikčnými enzýmami EcoRI a BamHI.
Všetky tri plazmidy obsahovali totožnú druhú časť kódujúcu aD (bola vložená v smere transkripcie hneď za 5' oblasť opísanú v predchádzajúcom odseku), vrátane 3' konca klonu aD. Táto druhá časť kódujúca aD, ktorá zasahuje od nukleotidu 625 až do reštrikčného miesta Xbal nachádzajúceho sa na 3' konci polylinkéra vektora klonu 19A2, bola izolovaná štiepením klonu 19A2 reštrikčnými enzýmami BamHI/Xbal.
Boli pripravené tri ligačné reakcie, pri ktorých bol fragment 3' aD rozštiepený enzýmami BamHI/Xbal zaligovaný, pri použití pufra pre ligázu a ligázy T4 (1 jednotka na 20 reakcií) firmy Boehringer Mannheim, do jedného z troch klonov 5' aD rozštiepených reštrikčnými enzýmami EcoRI/BamHI. Po štvorhodinovej inkubácii pri 14 °C bolo ku každej ligačnej reakcii, spolu s jednou jednotkou ligázy, pridané zodpovedajúce množstvo vektora pcDNA.3 (Invitrogen) rozštiepeného reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xbal. Reakcie prebiehali ďalších 14 hodín. Jednou desatinou reakčnej zmesi boli potom transformované kompetentné bunky XL-1 Blue. Vyrastené kolónie boli ďalej kultivované a bola z nich izolovaná DNA (pozri príklad 5). Štiepením pomocou EcoRI boli identifikované tri klony, ktoré obsahovali reštrikčné miesto EcaRI a teda aj umelo vytvorené signálne sekvencie. Tieto klony boli označené pATM.Bl (CDllb/aD, primér ER1B), pATM.ClO (CDUc/aD, primér ER1C) a pATM.D12 (adenozín/aD, primér ERld). Prítomnosť zodpovedajúcich signálnych sekvencii bola pri každom klone potvrdená sekvenovaním príslušnej nukleovej kyseliny.
B. Transfekcia buniek COS
Expresia z plazmidov kódujúcich aD (uvedených skôr) bola dosiahnutá kotransfekciou buniek COS vždy jedným z týchto plazmidov, spolu s expresívnym plazmidom pre CD18, označeným pCR.CD18. Ako pozitívne kontroly boli použité bunky COS kotransfekované plazmidom pCR.CD18 a expresívnym plazmidom pre CDlla, označeným pDC.CDl la.
hodín pred vlastnou transfekciou boli pri 50 % konfluencii bunky v kultivačnom médiu (DMEM/10 % FBS/penicilín-streptomycín) prepasážované do Petriho misiek na tkanivové kultúry firmy Corning s priemerom 10 cm. Pri všetkých pasážovaniach boli bunky z kultivačných misiek odstránené pomocou Versenovho pufra (0,5 mM NaEDTA v PBS). Pred vlastnou transfekciou boli misky raz premyté médiom DMEM bez prídavku séra. Do každej misky bolo pridaných 15 pg jednotlivého plazmidu v 5 ml transfekčného pufra (DMEM s 20 pg/ml DEAE-Dextranu a 0,5 mM chlorochínom). Po 1,5-hodinovcj inkubácii pri 37 °C boli bunky vystavené šoku pridaním 5 ml DMEM/10 % DMSO. Tento roztok DMSO bol potom nahradený kultivačným médiom s objemom 10 ml/miska.
Vzniknuté transfektanty boli analyzované metódami ELISA, FACS a imunoprecipitáciou, ako je opísané v príkladoch 8, 9 a 10.
Príklad 8
Analýza transfekovaných buniek COS metódou ELISA
S cieľom zistiť, či bunky COS transfekované expresívnym plazmidom pCR.CDlS a plazmidom aD exprimovali na svojom povrchu polypeptid aD asociovaný s polypeptidom CD 18, bola pri použití primárnych protilátok proti CD18 (napríklad TS1/18 purifikovaná z ATCC HB203) uskutočnená analýza metódou ELISA. Ako pozitívna kon
SK 283135 Β6 trola boli použité bunky kotransfekované expresívnym plazmidom pre CD 18 a expresívnym plazmidom pre CDI la, označeným PDC.CD1 la. Pri tejto kontrole boli ako primárne protilátky použité protilátky proti CD 18 a protilátky proti CDI la (napríklad TS 1/22 puriíikované z ATCC HB202).
S cieľom uskutočniť analýzu metódou ELISA boli bunky z každej misky odstránené pomocou Versenovho pufra a prenesené na jednu 96-jamkovú doštičku na kultiváciu tkanivových kultúr firmy Coming. Bunky boli pred vlastnou analýzou ponechané v kultivačnom médiu počas 2 dní. Potom boli doštičky dvakrát premyté roztokom D-PBS/0,5 % želatína z kože rýb (nadradu kostnaté) (Sigma) v objeme 150 μΐ/jamka. Tento pufer bol používaný pri všetkých krokoch okrem farbenia. Všetky premývania a inkubácie boli uskutočňované pri izbovej teplote. Potom boli jamky počas jednej hodiny blokované roztokom želatíny. Primáme protilátky boli roztokom želatíny zriedené na koncentráciu 10 p g/ml a do každej jamky bolo pridaných 50 μΐ tohto roztoku. Po jednohodinovej inkubácii boli doštičky 3 x premyté roztokom želatíny v objeme 150 μΐ/jamka. V zriedení 1 : 3500 bola pridaná sekundárna protilátka (kozia protilátka namierená proti myšacej Ig/HRP-Fc [Jackson, West Grove, PA] v objeme 50 μΐ/jamka a doštičky boli inkubované počas 1 hodiny. Po troch premytiach boli doštičky, pred pridaním 15 % kyseliny sírovej v objeme 50 μΐ/jamka, počas 20 minút farbené v roztoku o-fenyldiamínu (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD v citrátovom pufri).
Analýza transfekovaných buniek, uskutočňovaná metódou ELISA pri použití protilátok špecificky namierených proti CD 18, neodhalila pri bunkách transfekovaných len plazmidom kódujúcim CD 18 žiadnu výrazne vyššiu hladinu expresie, než aké bolo pozadie. Bunky kotransfekované plazmidmi kódujúcimi CDI la a CD18 mali pri analýzach, pri ktorých boli použité protilátky špecificky namierené proti CD 18 alebo protilátky špecificky namierené proti CDI la, vyššie hladiny expresie, než aké bolo pozadie. Ďalšie analýzy buniek transfekovaných plazmidom kódujúcim CD 18 a jedným z expresných konštruktov kódujúcich aD, (pATM. C10 alebo pATM.D12) odhalili, že expresia CD18 na povrchu buniek je zvýšená súbežnou expresiou polypeptidu aD. Zvýšenie expresie polypeptidu CD 18, detegované pri bunkách transfekovaných plazmidmi pATM.ClO alebo pATM.D12, bolo porovnateľné so zvýšením pozorovaným pri kontrolných bunkách kotransfekovaných plazmidmi kódujúcimi CDI la/CD18.
Príklad 9
Analýza transfekovaných buniek COS uskutočňovaná s využitím FACS
Bunkám v Petriho miskách bolo jeden deň pred transfekciou vymenené kultivačné médium za čerstvé a pred vlastnou analýzou uskutočňovanou s využitím FACS boli bunky inkubované počas 2 dní. Transfekované bunky boli pomocou 3 ml Versenovho pufra odstránené z misiek, raz premyté 5 ml pufra pre FACS (DMEM/2 % FBS/0,2 % azid sodný) a zriedené 0,1 ml pufra pre FACS na koncentráciu 500 000 buniek/vzorka. Ku každej vzorke bolo pridaných 10 μΐ protilátok špecificky namierených proti CD 18, CDIla a CDllb s koncentráciou lmg/ml konjugovaných s FITC (Becton Dickinson) alebo 10 μΐ myšacej protilátky 23F2G (proti CD18) (ATCC HB11081) s koncentráciou 800 pg/ml konjugovanej s CFSE. Potom boli vzorky inkubované 45 minút na ľade, 3 x premyté pufrom pre FACS s objemom 5 ml/premytie a rozsuspendované v 0,2 ml pufri pre FACS. Vzorky boli merané na prístroji FACScan firmy
Becton Dickinson a získané dáta boli analyzované pri použití programu Lysys II (Becton Dickinson).
Bunky COS, transfekované len plazmidom kódujúcim CD 18, neboli značené protilátkami (s konjugovaným markérom) namierenými proti CD18, CDI la alebo CDI lb. Ak boli bunky kotransfekované sekvenciami kódujúcimi CDlla/CD18, bolo protilátkami namierenými proti CDIla alebo CD18 označených približne 15 % buniek. Žiadna z buniek transfekovaných plazmidom kódujúcim CD 18 spolu s akýmkoľvek konštruktom kódujúcim aD nebola značená protilátkou namierenou proti polypeptidom CDI la a CDI lb. 4 %, 13 % a 8 % buniek zo skupín transfekovaných plazmidmi pATM.Bl, pATM.ClO a resp. pATM.D12 reagovalo tu pozitívne na farbenie protilátkou proti CDI8. Intenzita fluorescencie pozitívnych populácií zo skupiny CDI la/CD18 bola štvornásobne vyššia než pozadie. Na porovnanie, kotransfekcia buniek konštruktom kódujúcim aD a konštruktom pre CD 18 viedla k vytvoreniu pozitívnej populácie buniek, ktorá vykazovala štvor- až sedemnásobné zvýšenie intenzity fluorescencie oproti hodnotám pozadia.
Príklad 10
Imunoprecipitácia komplexov ľudský a[>/CD18 z kotransfekovaných buniek COS značených biotínom
S cieľom zistiť, či môže byť polypeptid aD izolovaný ako časť heterodimémeho komplexu αβ s charakteristikou integrínov, bol pri bunkách kotransfekovaných expresívnym plazmidom kódujúcim CD 18 a každým z expresívnych plazmidov kódujúcich polypeptid aD (opísaných v príklade 7), uskutočnený pokus o imunoprecipitáciu UD/CD18.
Transfekované bunky (1 až 3 x 108 buniek/skupina) boli z Petriho misiek odstránené pomocou Versenovho pufra a trikrát premyté roztokom D-PBS v objeme 50 ml/skupina. Každá vzorka bola označená pomocou 2 mg Sulpho-NHS Biotín (Pierce, Rockford, IL). Značenie prebiehalo 15 minút pri izbovej teplote a bolo ukončené premytím (trikrát) chladným roztokom D-PBS v objeme 50 ml/vzorka. Premyté bunky boli rozsuspendované v 1 ml lyzačnéha pufra (1 % NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM C++, 2 mM Mg++ a inhibítory proteáz) a inkubované počas 15 minút na ľade. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 10 000 x g počas 5 minút a supematant bol prenesený do prázdnych skúmaviek. Aby bol odstránený materiál nešpecifický reagujúci s myšacím imunoglobulinom, bolo na začiatku uskutočnené predčistenie vzorky. Pri 4 °C bolo sa supernatantmi inkubovaných 25 pg myšacieho imunoglobulinu (Cappel, West Chester, PA). Po 2,5 hodinách bolo ku každej vzorke pridaných 100 μΐ (25 pg) Sepharózy konjugovanej s králičou protilátkou namierenou proti myšacím Ig (pripravené z Proteínu A-Sepharózy 4B a králičej protilátky namierenej proti myšaciemu IgG, obidva od firmy Zymed, San Francisco, CA); inkubácia prebiehala pri stálom trepaní pri 4 °C počas 16 hodín. Častice Sepharózy boli od supernatantu odstránené centrifugáciou. Po tomto predčistení boli supematanty pri 4 °C počas 2 hodín inkubované s 20 pg protilátky namierenej proti CD 18 (TS1.18). Od supematantov boli komplexy protilátka/antigén izolované inkubáciou s prípravkom králičej protilátky proti myšacím Ig/Proteín A-Sepharóza s objemom 100 pl/vzorka, opísaným postupom. Častice nosiča boli štyrikrát premyté roztokom 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl a 1 Triton-X 100. Premyté častice boli scentrifugované a počas 10 minút varené v 20 pl 2 x Laemmliovho vzorkového pufra s 2 % B-merkaptoetanolom. Vzorky boli scentrifugované a rozdelené elektroforézou na polyakrylamidovom géli Novex (Novex) uskutočňovanou počas 30 minút pri napätí 100 V. Proteíny boli potom v pufri TBS-T prenesené na nitrocelulózové membrány (Schleicher & Schuell); 100 mA počas 1 hodiny. Membrány boli 2 hodiny blokované pomocou 3 % BSA v TBS-T. Počas 1 hodiny boli membrány inkubované s chrenovou peroxidázou so strepavidínom (POD) (Boehringcr Mannheim) v zriedení 1 : 6 000 a potom trikrát premyté v TBS-T. Na ofarbenie blotu bol použitý (postupom opísaným výrobcom) „Enhanced Chemiluminescence kit“ firmy Amersham. Membrány boli na 0,5 až 2 minúty exponované na Hyperfilm MP (Amersham).
Imunoprecipitácia komplexov CD 18 z buniek transfekovaných plazmidom pRC-CD18 spolu s jedným z plazmidov pATM.Bl, pATM.ClO alebo pATM.D12 odhalila povrchovú expresiu heterodimérov zložených z reťazca β s molekulovou hmotnosťou približne 100 kD, ktorá zodpovedá predpokladanej veľkosti CD 18 a reťazca a s molekulovou hmotnosťou približne 150 kD, ktorá zodpovedá molekulovej hmotnosti polypeptidu aD,
Príklad 11
Stabilná transfekcia ľudského aD do buniek ovárií čínskeho chrčka
S cieľom zistiť, či je polypeptid aD exprimovaný na povrchu buniek vo forme heterodiméru spolu s CD 18, boli bunkové línie, ktorým chýba tak aD, ako aj CD18, prechodne a stabilne tmasfekované molekulami cDNA kódujúcimi tieto jednotlivé reťazce.
Pre tieto experimenty bola, spôsobom opísaným v príklade 7, k cDNA kódujúcej aD, pridaná ďalšia vedúca sekvencia a Kozákova konvenčná sekvencia a celý tento konštrukt bol zaklonovaný do expresívneho vektora pcDNA3. Výsledným konštruktom, označeným pATM.D12, spoločne s modifikovaným komerčne dostupným vektorom pDCl.CD18 kódujúcim ľudský CD18, boli kotransfekované bunky ovárií čínskeho chrčka (CHO) deficientné v aktivite dihydrofolát reduktázy (DHFR)’. Plazmid pDCl.CDlS kóduje markér DHFR+ a transfekované bunky môžu byť selektované pri použití vhodného média neobsahujúceho príslušný nukleozid. Na vytvorenie plazmidu pDCl.CD18 boli použité nasledujúce modifikácie.
Plazmid pRC/CMV (Invitrogen) je cicavčí expresívny vektor s promótorom cytomegalovírusu a ako selekčný markér obsahuje gén na rezistenciu proti ampicilínu. Gén kódujúci DHFR z plazmidu PSC1190-DHFR bol vložený na 5' koniec začiatku replikácie SV40 vo vektore pRC/CMV. Navyše bol do plazmidového konštruktu pRC/CMV/DHFR zaligovaný, na 3' koniec génu pre DHFR, polylinkér z 5' oblasti plazmidu pHF2G-DHF. Potom boli do vzniknutého plazmidu zaklonované, medzi oblasť polylinkéra na 5' konci a oblasť poly-A sekvencie bovinného rastového hormónu, kódujúce sekvencie pre CD 18.
Povrchová expresia polypeptidu CD 18 bola analyzovaná prietokovou cytometriou pri použití monoklonálnej protilátky TS1/18. Tvorba heterodimérov medzi aD a CD 18 pri tejto bunkovej línii bola v súlade s údajmi získanými imunoprecipitáciou opísanou v príklade 10 pri prechodnej expresii buniek COS.
Príklad 12
Ľudský aD sa viaže na molekulu ICAM-R a táto väzba je závislá od prítomnosti CD 18
Vzhľadom na publikované údaje, ktoré dokazujú interakcie medzi integrínmi leukocytov a medzibunkovými adhezívnymi molekulami (ICAM), ktoré sprostredkúvajú kontakt bunka-bunka [Hynes, Celí 69 : 11 až 25 (1992)], bola schopnosť buniek CHO exprimujúcich ao/CD18 via zať ICAM-1, ICAM-R alebo VCAM analyzovaná dvoma metódami.
V opakovaných stanoveniach boli rozpustné fúzne proteíny ICAM-1, ICAM-R alebo VCAM s IgGl imobilizované na povrchu plastu a bola stanovovaná schopnosť buniek COS transfekovaných plazmidmi kódujúcimi (VCD18 viazať sa k týmto imobilizovaným ligandom. Transfekované bunky boli intraceluláme označené pomocou kalceínu, premyté väzbovým pufrom (RPMI s 1 % BSA) a inkubované buď v samotnom pufri (s alebo bez prítomnosti 10 ng/ml PMA) alebo v pufri s monoklonálnymi protilátkami namierenými proti CD18 v koncentráciách 10 pg/ml. Transfekované bunky boli umiestené do štyroch 96-jamkových mikrotitračných doštičiek Immulon s jamkami dopredu potiahnutými rozpustnými fúznymi proteínmi ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl alebo VCAM-1/IgGl alebo hovädzím sérovým albumínom (BSA) ako negatívnou kontrolou. Rozpustné formy týchto adhezívnych molekúl sú dokonale opísané v doteraz nevybavenej patentovej prihláške US č. 08/102852 (s rovnakým vlastníkom) podanej 5. augusta 1993. Pred pridaním značených buniek boli jamky blokované roztokom 1 % BSA v PBS. Po premytí doštičiek, uskutočňovaným ponorením doštičiek na 20 minút do roztoku 0,1 % BSA v PBS, bola pri použití pristroja Cytoíluor 2300 (Millipore, Milford, MA) meraná celková fluorescencia v každej jamke.
V experimentoch s imobilizovanými molekulami ICAM mali bunky kotransfekované plazmidmi kódujúcimi ao/CD18 v jamkách s ICAM-R/IgGl, v porovnaní s jamkami potiahnutými BSA, 3- až 5-násobne vyššiu intenzitu väzby. Špecifita tejto väzby a jej závislosť od prítomnosti CD 18 bola dokázaná inhibičnými účinkami protilátky TS1/18 namierenej proti CD18. Bunky transfekované plazmidmi kódujúcimi CDlla/CD18 mali 2- až 3-násobne vyššiu intenzitu väzby v jamkách s ICAM-1/IgGl, len keď boli tieto bunky dopredu vystavené pôsobeniu PMA. Pôsobenie PMA na bunky transfekované Ql/CDU nemala na intenzitu fluorescencie v jamkách potiahnutých ICAM-1/IgGl alebo ICAM-R/IgGl žiadny vplyv. Nebola detegovaná žiadna väzba buniek transfekovaných a^/CDIS na jamky potiahnuté VCAM-1/IgGl.
Väzba buniek, transfekovaných ar)/CD18, k rozpustným fúznym proteínom ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl alebo VCAM-1/lgGl bola stanovovaná prietokovou cytometriou. Na každé meranie bol v 100 pl väzbového pufra (RPMI a 1 % BSA), s protilátkou alebo bez prítomnosti protilátky namierenej proti CD 18 v koncentrácii 10 pg/ml, rozsuspendovaný približne 1 milión buniek CHO transfekovaných at>/CD18 (kultivovaných s cieľom vyššej expresie vo fľašiach s miešadlom - „Spinner flask“). Po 20minútovej inkubácii pri izbovej teplote boli bunky premyté väzbovým pufrom a boli k nim pridané fúzne proteíny ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl na výslednú koncentráciu 5 pg/ml. Nadväzovanie prebiehalo 30 minút pri 37 °C a potom boli bunky trikrát premyté a rozsuspendované v 100 pl väzbového pufra obsahujúceho v zriedení 1 : 100 ovčiu protilátku namierenú proti ľudskému IgGl konjugovanú s FITC. Po 30-minútovej inkubácii boli vzorky trikrát premyté a rozsuspendované v 200 pl väzbového pufra a analyzované na prístroji FACScan firmy Becton Dickinson.
Približne 40 až 50 % buniek transfekovaných Uq/CDIS viazalo ICAM-R/IgGl, ale nebola pozorovaná žiadna väzba na proteíny ICAM-1/IgGl a VCAM-1/IgGl. Vystavenie transfekovaných buniek predbežnému pôsobeniu PMA nemalo žiadny vplyv na väzbu «q/CDIS k proteínom ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl alebo VCAM-1/IgGl, čo zodpovedá stanoveniam uskutočňovaným s imobilizova nými proteínmi. Pri vystavení buniek transfekovaných cto/CDie pôsobeniu protilátky TSI/18 namierenej proti CD 18, bola intenzita väzby k ICAM-R/IgGl znížená na hodnoty pozadia.
Dáta získané z obidvoch týchto stanovení ilustrujú skutočnosť, že απ/CD 18 sa prednostne viaž k molekule ICAM-R (v porovnaní s väzbou k ICAM-1 alebo VCAM-1). Uprednostňovanie väzby an/CD18 k ICAM-R oproti väzbe k ICAM-1 je v protiklade k skutočnostiam zisteným pre CDlla/CD18 a CDllb/CD18. Môžeme teda očakávať, že modulácia väzby απ/CD 18 môže selektívne ovplyvniť normálne a patologické funkcie imunitného systému, v ktorých hrá molekula ICAM-R prominentnú úlohu. Navyše výsledky podobných stanovení, pri ktorých bola testovaná schopnosť protilátok, špecificky namierených proti rôznym extracelulámym doménam proteínu ICAM-R, inhibovať väzbu na bunky transfekované απ/CD 18, naznačujú, že heterodiméry ap/CD18 a CD1 la/CD18 interagujú s odlišnými doménami polypeptidu ICAM-R.
Nemožnosť detegovať v roztoku väzbu CD1 la/CD18 k fúznym proteínom ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl naznačuje, že afinita väzby medzi heterodimérom CDlla/CD18 a ICAM-1 alebo ICAM-R je príliš nízka na to, aby umožnila väzbu týchto molekúl v roztoku. Detekcia väzby heterodiméru an/CD18 k fúznemu proteínu ICAM-R/IgGl však naznačuje neobvykle vysokú hodnotu afinity.
Na testovanie väzby mutantu proteínu ICAM-R, označeného E37A/Ig, na bunky CHO exprimujúce heteradimcr ao/CD18 bola adhézia analyzovaná s využitím FACS, opísaným postupom. Bolo dokázané, že E37A/Ig sa neviaže k chimerickému proteínu LFA-l/Ig [Sadhu a ďalší, Celí Adhesion a Communication 2 : 429 až 440 (1994)]. Tento mutantný proteín bol vo svojej rozpustnej forme produkovaný stabilne transfekovanou bunkovou líniou CHO a bol purifikovaný na kolóne ProsepA postupom opísaným v publikácii Sadhu a ďalší, pozri skôr.
V opakovaných pokusoch nebola detegovaná väzba proteínu E37A/Ig na bunky transfekované an/CD18. Intenzita fluorescencie v hlavnom piku (MFI - mean fluorescence intensity) chimerického proteínu E37A/Ig, detegovaná s využitím protilátky namierenej proti ľudskému IgGl konjugovanej s FITC, bola totožná s MFI nameranou pre samotnú protilátku, čo naznačuje, že pri použití mutantného proteínu E37A/Ig nie je v tomto experimente detegovaný žiadny signál prevyšujúci hodnoty pozadia. Podobne pri analýze uskutočňovanej metódou ELISA, postupom opísaným v príklade 14, sa mutantný E37A/Ig najskôr neviazal na imobilizovaný απ/CD 18.
Väzba polypeptidu aD, k proteínu iCb3
Komponent komplemcntu označovaný C3 môže byť proteolyticky štiepený, čím dôjde k vytvoreniu komplexu iC3b, ktorý iniciuje aktiváciu alternatívnej cesty aktivácie komplementu, ktorej výsledkom je bunkovo sprostredkované zničenie cieľa. Ako CD 11 b, tak aj CD 11 c, sa môžu zúčastňovať na väzbe k iCb3 a následnej fragmatóze častíc obalených komplexom ÍCb3. Ako miesto interakcie s komplexom iCb3 bol nedávno identifikovaný peptidový fragment domény I v polypeptide CD1 lb [Ueda a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91 : 10680 až 10684 (1994)]. Oblasť zodpovedná za väzbu iCb3 je v polypeptidoch CDllb, CD11 c a aD veľmi konzervatívna, čo naznačuje existenciu väzbovej interakcie ao/iCb3.
Väzba polypeptidu aD k iCb3 bola analyzovaná „ružicovým testom“ [Dana a ďalší, J. Clin. Invest. 73 : 153 až 159 (1984)] pri použití transfekovaných buniek alebo bun kových línií prirodzene exprimujúcich polypeptid aD (na: príklad bunky HL60 stimulované pomocou PMA). Za prítomnosti alebo neprítomnosti monoklonálnej protilátky namierenej proti CD18 (napríklad protilátky TS1/18.1) bola porovnávaná schopnosť buniek CHO transfekovaných ct[/CD18, buniek CHO transfekovaných VLA-4 (negatívna kontrola) a buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PMA (pozitívna kontrola), vytvárať „ružice“.
Príklad 13
Testovanie uskutočňované technikami SPA
Inhibítory špecificky inhibujúce väzbu medzi ligandmi aD podľa vynálezu a ich väzbovými partnermi (páru ligand ao/„anti-lingand“) môžu byť analyzované najrôznejšími spôsobmi, napríklad technikami SPA opísanými v patentovej prihláške US č. 4271139, publikáciách Hart a Greenwald, Mol. Immunol. 12 : 265 až 267 (1979) a Hart a Greenwald, J. Nuc. Med. 20 : 1062 až 1065 (1979).
Stručne povedané, jeden člen z dvojice ligand an/„antiligand“ jc priamo alebo nepriamo naviazaný na pevný nosič. Nepriama väzba môže byť sprostredkovaná monoklonálnou protilátkou priamo naviazanou na pevnú podložku, pričom táto protilátka rozpoznáva špecifický epitop na C-konci rozpustného reťazca integrinu. Týmto epitopom by mohol byť buď hemaglutinín alebo mykobakteriálny epitop IIIE9 [Anderson a ďalší, J. Immuno. 141 : 607 až 613 (1988)]. Na nosič je priamo naviazaná tiež fluorescenčná látka. Inou možnosťou môže byť inkorporácia fluorescenčnej látky priamo v pevnom nosiči, ako je opísané v patentovej prihláške US č: 4568649. Ten člen dvojice ligandov ao/„anti-ligand“, ktorý nie je naviazaný na nosič, je označený rádioaktívnou zlúčeninou, ktorá emituje žiarenie schopné excitovať fluorescenčné agens. V prípade, keď ligand viaže rádioaktívne značený „anti-ligand“, sa rádioaktívna značka dostane dostatočne blízko k fluorofóru naviazanému na nosič a môže tento fluorofór excitovať a vyvolať tým svetelnú emisiu. Ak nedochádza k väzbe, je rádioaktívna značka obvykle príliš vzdialená od pevného nosiča, aby bola schopná excitovať fluorescenčné agens a intenzita emitovaného svetla je nízka. Emitované svetlo je merané a korelované medzi ligandom a „anti-ligandom“. Pridanie inhibítora väzby k vzorke spôsobí zníženie emisie svetla flurofórom tým, že zabráni naviazaniu rádioaktívnej značky v blízkosti pevného nosiča. Inhibítory väzby môžu byť teda identifikované meraním ich vplyvu na emisiu svetla fluorofórom vo vzorcoch. Podobne môžu byť takisto identifikované „anti-ligandy“ polypeptidu aD.
Pri testovaní modulátorov väzby CAM uskutočňovaným postupom uvedeným ďalej je pri SPA použitý rozpustný rekombinantný konštrukt απ/CD 18 s leucinovým zipsom (pozri príklad 14). Tento rekombinantný integrín je pomocou neblokujúcej protilátky namierenej proti podjednotke a alebo proti podjednotke β imobilizovaný na doštičke dopredu pokrytej fluorescenčnou látkou. Zlúčeniny chemickej knižnice a biotinylovaný chimerický protein CAM/Ig sú na doštičku pridané súčasne. Väzba chimérického proteínu CAM/Ig je detegovaná pomocou rádioaktívne značeného streptavidínu. V tomto stanovení sú chimérické proteíny ICAM-l/Ig a ICAM-3(Ig biotinylované pomocou kitu NHS-Sulfo-biotin LC (dlhý reťazec, Pierce) postupom odporúčaným výrobcom. Takto označené proteíny stále reagujú s protilátkami špecificky namierenými proti CAM a s využitím metódy ELISA môže byť ukázané, že reagujú s imobilizovaným proteínom LFA-1. Detekcia je uskutočňovaná s využitím konjugátu Strepavidin-HRP a následným ofarbením s využitím OPD.
Inou možnosťou je priame naviazanie purifikovaného alebo čiastočne purifikovaného rekombinantného leucíno
SK 283135 Β6 vého zipsu na doštičku dopredu pokrytú fluorescenčnou látkou. Zlúčeniny chemickej knižnice a neznačený chimérický proteín CAM/Ig sú na doštičku pridané súčasne. Naviazaný CAM/Ig je detegovaný protilátkou namierenou proti ľudskému Ig označenou izotopom 123I.
Ešte inou možnosťou je imobilizovať na scintilačnú doštičku purifikovaný proteín CAM/Ig. Potom sú na doštičku pridané zlúčeniny chemickej knižnice a koncentrovaný supernatant z buniek exprimujúcich rekombinantný integrín typu leucinového zipsu. Väzba tohto rekombinantného integrínu je detegovaná pomocou značenej neblokujúcej protilátky namierenej proti podjednotke a alebo proti podjednotke β.
Príklad 14
Expresívne konštrukty rozpustného ľudského poiypeptidu aD
Exprcsia neskráteného rozpustného ľudského heterodiméru a^/CDlS poskytuje ľahko purifikovateľný materiál, použiteľný na imunizáciu a väzbové štúdie. Výhodou vytvorenia rozpustného proteínu je skutočnosť, že tento proteín môže byť puriflkovaný zo supematantov a nemusí sa purifikovať z lyzátov buniek (ako neskrátený heterodimér aýCDlS viazaný na membránu); tento proteín je teda získaný ľahšie a s menším zastúpením nečistôt.
Expresívny plazmid kódujúci rozpustný aD bol vytvorený nasledujúcim postupom Štiepenie reštrikčnými enzýmami HindlII a AatlI bol z plazmidu pATM.D12 izolovaný nukleotidový fragment zodpovedajúci oblasti báz 0 až 3161 v SEK. ID. č.: 1. S využitím primárov sHAD.S a sHAD.3, zobrazených ako SEK. ID. č.: 30 a 31, bol z plazmidu pATM.D12 reakciou PCR amplifikovaný fragment zodpovedajúci oblasti báz 3130 až 3390 v SEK. ID. č.: 1. Sekvencia tohto fragmentu sa prekrýva so sekvenciou fragmentu získanou štiepením reštrikčnými enzýmami HindIII/AatlI a na 3' konci obsahuje navyše reštrikčné miesto Mlul.
5’-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (SEK: ID. č.: 30)
5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3' (SEK. ID. č.: 31)
Produkt získaný amplifikáciou uskutočňovanou PCR bol rozštiepený enzýmami AatI a Mlul a zaligovaný s fragmentom získaným štiepením reštrikčnými enzýmami HindlII/AatlI. Získaný produkt bol zaligovaný do plazmidu pDC.l.s rozštiepeného reštrikčnými enzýmami HindIII/MluI.
Tento konštrukt bol v stabilne transfekovaných bunkách CHO exprimovaný spoločne s rozpustným proteínom CD 18 a expresia bola detegovaná autorádiografickou vizualizáciou imunoprecipitovaných komplexov CD 18 získaných z buniek označených 35S-metionínom. Tento konštrukt bol takisto spolu s CD18 exprimovaný v bunkách 293 [Berman a ďalší, .1. Celí. Biochem. 52 : 183 až 195 (1993)].
Rozpustný neskrátený konštrukt ctD
Vynález sa takisto týka alternatívnych expresívnych konštruktov pre aD. Na uľahčenie expresie a purifikácie intaktného heterodiméru ao/CD18 budú skonštruované expresívne plazmidy kódujúce rozpustný aD a CD18. Polypeptidy kódované týmito plazmidmi budú obsahovať fúznu sekvenciu „leucinového zipsu“, ktorá bude počas purifikácie tento heterodimér stabilizovať [Chang a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 91 : 11408 až 11412 (1994)]. Stručne povedané, DNA kódujúce aminokyselinové reťazce tvorené kyslými a zásaditými aminokyselinami tvoria cimi leucínový zips boli vytvorené pripojením primárov pri použití oligonukleotidov opísaných v publikácii Chang a ďalší. Sekvencie DNA boli ďalej modifikované tak, že do nich boli na 5' a 3' koncoch zavádzané reštrikčné miesta Mlul (5' koniec) a Xbal (3' koniec). Táto modifikácia slúži na uľahčenie zaklonovania týchto sekvencií do expresívnych konštruktov pre CD18 alebo aD opísaných predtým. K uvedeným sekvenciám DNA boli tiež pripojené sekvencie kódujúce hemaglutinín alebo polyhistidín a za reštrikčné miesto Xbal bol vložený stup kodón. Sekvencie kódujúce hemaglutinín alebo polyhistidín boli vložené s cieľom uľahčiť afínitnú purifikáciu exprimovaného proteínu. Do expresívneho vektora kódujúceho CD18 sú vložené sekvencie kódujúce reťazec leucinového zipsu tvorený bázickými aminokyselinami; do konštruktu kódujúceho reťazec aD je vložená sekvencia kódujúca reťazec leucinového zipsu tvorený kyslými aminokyselinami. Predpokladá sa, že po expresii modifikovaných proteínov aD a CD18 v hostiteľských bunkách, bude interakcia medzi reťazcom tvoreným bázickými aminokyselinami a reťazcom tvoreným kyslými aminokyselinami stabilizovať tento heterodimér a umožní izoláciu intaktnej molekuly «O/CDI8 opísanou metódou afinitnej purifikácie.
Boli skonštruované plazmidy na expresiu rozpustného aD a CD 18 s „leucínovým zipsom“ tvoreným sekvenciami kódujúcimi kyslé a bázické aminokyseliny a týmito plazmidmi boli metódou využívajúcou DEAE/Dextran opísanou v príklade 7 transfekované bunky COS. Vzniknutý proteín bol označený ako a[>/CD18LZ. Transfekované bunky boli počas 14 dni kultivované v médiu so zníženým obsahom séra (2 %). Supematanty z transfekovaných buniek boli zozbierané každý piaty deň a metódou ELISA opísanou v príklade 8, v nich bola analyzovaná produkcia proteínov. Stručne povedané, heterodimér (VCD18LZ bol imobilizovaný na doštičkách potiahnutých monoklonálnou protilátkou 169B namierenou proti aD (pozri príklad 15). Komplex ar)/CD18LZ bol detegovaný pridaním biotinylovanej monoklonálnej protilátky namierenej proti CD 18 (TS1/18.1, pozri príklad 8) s následným pridaním konjugátu streptavidín/chrenová peroxidáza (IIRP) a o-fenyldiamínu (OPD). V supematantoch bola detegovaná prítomnosť týchto proteínov.
Väzbové štúdie uskutočňované pri použití neskráteného expresívneho produktu aD
Funkčné väzbové analýzy s rozpustným neskráteným heterodimérom arýCD18I.Z. opísaným skôr, boli uskutočňované pri imobilizácii heterodiméru na doštičky potiahnuté monoklonálnou protilátkou 169B alebo neblokujúcou monoklonálnou protilátkou namierenou proti CD 18 (pozri príklad 15). S cieľom zamedziť nešpecifickým väzbám boli jamky pred pridaním chimerických proteínov CAM/Ig (pozri príklad 12) v začiatočnej koncentrácii 10 μg/ml blokované pomocou želatíny získanej z rybacej kože. Väzba uvedených chimerických proteínov k heterodiméru «[ý'CDlSLZ bola detegovaná prostredníctvom konjugátov HRP s kozou protilátkou namierenou proti ľudskému Ig (Jackson Labs) a následným ofarbením pomocou OPD.
Bolo pozorované, že VCAM-l/Ig sa k imobilizovanému heterodiméru Uq/CDISLZ viaže 3- až 5-krát intenzívnejšie ako k imobilizovanému heterodiméru CDlla/CD18. Molekuly ICAM-l/Ig a ICAM-2/Ig poskytujúce pri väzbe na rozpustný heterodimér CDlla/CD18 15-krát, resp. 10-krát intenzívnejší signál (v porovnaní s pozadím), ale neviažu sa na heterodimér (ip/CDlSLZ. Väzba VCAM-1 bola, za prítomnosti kombinácie protilátok 130K a 130P
SK 283135 Bé špecificky namierených proti VCAM-1, znížená približne o 50 %.
Väzbové štúdie boli takisto uskutočňované na 96-jamkových doštičkách s imobilizovaným proteínom ICAM/Ig a následným pridaním rozpustného rekombinantného integrínu prítomného v bunkovom supematante. Väzba rozpustných integrínov bola detegovaná pomocou neznačnej neblokujúcej myšacej protilátky namierenej proti reťazcu a alebo B a následnou inkubáciou s kozou protilátkou špecificky namierenou proti myšacím Ig konjugovanou s HRP a ofarbením s využitím OPD.
Získané výsledky naznačujú, že nameraná hodnota pri väzbe (1D/CD18LZ k ICAM-R/Ig, detegovanej pomocou neblokujúcej protilátky, bola 10-krát vyššia ako to bolo v kontrolných jamkách neobsahujúcich žiadnu protilátku. Nebola detegovaná väzba rozpustného heterodiméru cip/CDIS k imobilizovanému ICAM-l/Ig, ale oproti tomu bola detegovaná väzba medzi cin/CDlSLZ a imobilizovanými heterodimérmi CDllb/CD18 a CDlla/CD18 15-krát (CD1 lb/CD18) a 5-krát (CDlla/CD18) vyššia ako boli hodnoty pozadia.
Keďže predchádzajúce štúdie ukázali, že molekuly CDllb a CDllc viažu lipopolysacharid (LPS) [Wright; Curr. Opin. Immunol. 3 : 83 až 90 (1991); Ingalls a Golenbock. J. Exp. Med. 181 : 1473 až 1479 (1995)], bola pomocou prietokovej cytometrie a stanovení uskutočňovaných na titračných doštičkách, takisto analyzovaná väzba LPS na heterodimér ao/CD18. Získané výsledky ukazujú, že LPS, značený FITC, izolovaný z mikroorganizmov S. Minnesota a S. typhosa (obidva získané od firmy Sigma) sa v koncentrácii 20 pg/ml slabo viazal na bunky CHO transfekované ao/CD18. Pri netransfekovaných bunkách CHO nebola detegovaná žiadna väzba. Pri stanoveniach uskutočňovaných metódou ELISA sa biotinylovaný LPS [Luk a ďalší, Alan. Biochem. 232 : 217 až 224 (1995)] v množstve 0,5 až 3,0 pg viazal k imobilizovanému heterodiméru afyCDlS a poskytoval štyrikrát väčší signál, ako to bolo v jamkách so samotnou protilátkou a blokujúcim agens. Zdanlivá väzba LPS na CDlla/CD18 bola po odčítaní hodnôt pozadia (väzba protilátky TS2/4 namierenej proti CD 11 a) nevýznamná.
Aby bolo možné identifikovať ďalšie ligandy pre ao/CD18, je rekombinantný proteín u^CDlSLZ použitý v dvoch prevádzkových štúdiách. S cieľom stanovení, ktoré bunky na svojom povrchu exprimujú ligandy pre aD, je analyzovaná väzba rôznych typov buniek na imobilizovaný proteín. Potom je využitá inhibícia väzby s využitím protilátok, pomocou ktorých j c možné stanoviť, ktoré známe povrchové adhezívne molekuly sú zodpovedné za pozorovanú väzbu buniek. Ak nie je pozorovaná žiadna inhibícia, je pri pokuse o identifikáciu ligandu využitá koimunoprecipitácia heterodiméru αρ/CD 18LZ naviazaného na proteiny (ktoré budú viazať aD) z lyzovaných buniek.
Expresívne konštrukty kódujúce doménu I rozpustného ľudského polypeptidu aD
Už predtým bolo publikované, že doména 1 v molekule CDlla môže byť exprimovaná ako nezávislá štruktúrna jednotka, ktorá si udržiava schopnosť viazať ligandy a schopnosť byť rozpoznaná protilátkami [Randi a Hogg, J. Biol. Chem. 269 : 12395 až 12398 (1994); Zhout a ďalší, J. Biol. Chem. 269 : 17075 až 17079 (1994); Michishita a ďalší, Celí 72 : 857 až 867 (1993)]. S cieľom vytvoriť rozpustný fúzny proteín zložený z domény I polypeptidu aD, a ľudského IgG4, bola pomocou PCR amplifikovaná sekvencia kódujúca doménu I polypeptidu aD. Na túto PCR reakciu boli použité priméry, ktoré kvôli uľahčeniu klonovania pridávajú na konce sekvencie reštrikčné miesta BamHI a Xhol. Tieto priméry sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 32 až 33 a reštrikčné miesta sú tu podčiarknuté.
5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3' (SEK. ID. č.: 32)
5’-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3' (SEK. ID. č.: 33)
Nukleotid C nachádzajúci sa v SEK. ID. č.: 32 na 3' konci vedľa reštrikčného miesta BamHI zodpovedá nukleotidu 435 v SEK. ID. č.: 1; nukleotid G nachádzajúci sa v SEK. ID. č.. 33 na 3' konci vedľa reštrikčného miesta Xhol zodpovedá nukleotidu 1067 v SEK. ID. č.: L Amplifikovaná doména I je rozštiepená zodpovedajúcimi reštrikčnými enzýmami a purifikovaný fragment je zaligovaný do cicavčieho expresívneho vektora pDCs a prokaryotického expresívneho vektora pGEX-4T-3 (Pharmacia) a fragment domény I je sekvenovaný. Fúzny proteín je potom exprimovaný v bunkách COS, CHO alebo E. coli transfekovaných alebo transformovaných zodpovedajúcimi expresívnym konštruktom.
Vzhľadom na afinitu polypeptidu aD k ICAM-R, môže mať exprimovaná doména I polypeptidu otD dostatočnú afinitu, aby mohla byť použitá ako inhibítor bunkovej adhézie, pri ktorej aktívne participuje polypeptid aD.
Analýza fúzneho proteínu tvoreného doménou 1 ľudského 0,7^04 Proteín bol rozdelený pomocou SDS-PAGE v redukujúcich a neredukujúcich podmienkach a vizualizovaný farbením striebrom alebo farbením Coomasie. Potom bol proteín prenesený na membrány Immobilon PVDF a analyzovaný pomocou monoklonálnych protilátok namierených proti ľudskému IgG alebo monoklonálnych protilátok namierených proti bo vinnému IgG.
Pre detegovaná proteiny bolo stanovené, že v neredukujúcich podmienkach migrujú so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 120 kD a redukujúcich podmienkach migrujú so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 45 kD. Na géli z elektroforézy uskutočňovanej v neredukujúcich podmienkach boli takisto detegované menej intenzívne prúžky so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 40 až 50 kD, ktoré reagovali s protilátkami namierenými proti ľudskému IgG, ale nereagovali s protilátkami namierenými proti bovinnému IgG. Menej intenzívny prúžok so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 200 kD bol metódou Westem Blot detegovaný ako bovinný Ig.
Väzbové štúdie uskutočňované pri použití expresívnych produktov domény I
Metódou ELISA bola testovaná schopnosť domény I špecificky rozpoznávať chimerický proteín ICAM-R/IgG. Jednotlivé sériové riedenia fúzneho proteínu IgG4 a domény I polypeptidu aD (IaD/IgG4) v TBS boli inkubované s ICAM-l/IgG, ICAM-R(IgG, VCAM-l/IgG alebo IgGl proteínom (produkovaným bunkami myelómu) imobilizovanými na doštičkách Immulon IV pre RIA/EIA. Ako negatívna kontrola boli použité chimerický proteín domény I CDlla/IgG a ľudský myelómový proteín IgG4/kappa. Naviazaný IgG4 bol detegovaný prostredníctvom biotinylovanej monoklonálnej protilátky HP6023 namierenej proti lgG4 s následným pridaním konjugátu streptavidín-peroxidáza a farbením pri použití substrátu o-fenyldiamínu.
V opakovaných stanoveniach nebola detegovaná väzba medzi proteínom CDlla/IgG4 alebo myelómovým proteínom IgG4 a ktorýmkoľvek z imobilizovaných proteínov. Proteín IaD/IgG4 sa neviazal na ľudský IgGl, ICAM-1/IgGl alebo blokujúce agens, ako je želatína z rybacej kože alebo bovinný sérový albumín. Pri použití proteínu Iut>/IgG4 v koncentráciách 1 až 5 ug/ml bola v jamkách potiahnutých ICAM-R/IgG detegovaná, v porovnaní s pozadím; dvoj- až trojnásobne vyššia intenzita signálu. Intenzita signálu v jamkách potiahnutých VCAM-I/IgG bola 7- až 10-krát vyššia ako pozadie. V predchádzajúcich stanoveniach sa bunky CHO transfekované aw'CD18 neviazali na VCAM-I/IgG, čo naznačuje, že väzba VCAM-I môže byť charakteristická pre aminokyselinovú sekvenciu izolovanej domény I.
Ďalšie konštrukty domény I polypeptidu aD
Ďalšie konštrukty domény I polypeptidu aD boli vytvorené rovnakým spôsobom ako predchádzajúci konštrukt s výnimkou toho, že tu bolo okolo domény I polypeptidu aD začlenených viac aminokyselín. Tieto špecifické konštrukty obsahujú: i) sekvencie z exónu 5 (aminokyseliny 127 až 353 v SEK. ID. č.: 2), umiestené pred doménou I; ii) opakovania motívu „EF-hand“ (motív v oblastiach zodpovedných na väzbu vápenatých iónov) (aminokyseliny 17 až 603 v SEK. ID. č.: 2) umiestené za doménou I; iii) reťazec alfa ukončený v transmembránovej oblasti (aminokyseliny 17 až 1029 v SEK. ID. č.: 2) spolu s IgG4 použitým na purifikáciu a detekciu. Tieto konštrukty sú zaligované tak do cicavčieho expresívneho vektora pDCSl, ako aj do prokaryotického expresívneho vektora pGEX-4T-3 (Pharmacia) a doména I je sekvenovaná. Fúzne proteíny sú potom exprimované v bunkách COS, CHO alebo E. coli transformovaných alebo transfekovaných príslušnými expresívnymi konštruktmi. Proteíny sú purifikované na kolóne ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, England) a je testovaná ich reaktivita s monoklonálnou protilátkou HP6023 namierenou proti IgG4. Tieto proteíny sú na polyakrylamidovom géli ofarbené pomocou Coomassie.
Aby bolo možné skonštruovať expresívnym plazmid kódujúci kompletný polypeptid aD, je plazmid pATM.D12 (opísaný skôr) modifikovaný nasledujúcim spôsobom tak, aby z neho bolo možné exprimovať fúzny proteín a»'IgG4. DNA kódujúca IgG4 je pomocou PCR pri použití primárov, ktoré zavádzajú na 5' koniec reštrikčné miesto AatlI (SEL. ID. č.: 89) a na 3' koniec reštrikčné miesto Xbal (SEK. ID. č.; 90), izolovaná z vektora pDCS 1.
5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3' (SEK. ID. č.: 89)
5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK. ID. č.: 90)
Plazmid pATM.D12 je rozštiepený reštrikčnými enzýmami AatlI a Xbal a rozštiepený a purifikovaný produkt PCR reakcie, IgG4, je zaligovaný do linearizovaného vektora.
Príklad 15
Produkcia protilátok špecificky namierených proti ľudskému aD
A. Produkcia monoklonálnych protilátok
1. Prechodne transfekované bunky z príkladu 7 boli trikrát premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátovým pufrom podľa Dulbecca (D-PBS) a v PBS indikované, v množstve 5 x 106 buniek/myš spolu s 50 pg/myš muramyl dipeptidázy (Sigma), do myší Balb/c. Myši boli indikované rovnakým spôsobom dvakrát v dvojtýždennom intervale. Preimunizačné séra a séra z imunizovaných myší boli testované s využitím FACS, ako je opísané v príklade 9, a slezinné bunky z myší s najvyššou reaktivitou proti bunkám transfekovaným (ttýCDlS boli použité na fuziu. Supema tanty z kultúr hybridómov boli jednotlivo testované s cieľom zistiť, či nereagujú s bunkami COS transfekovanými pomocou CDlla/CD18 a takisto, či reagujú s bunkami kotransfekovanými expresívnymi plazmidmi kódujúcimi polypeptidy aD a CD18.
Týmto postupom sa nepodarilo pripraviť žiadne monoklonálne protilátky.
2. Ako alternatíva pre produkciu monoklonálnych protilátok bol použitý postup, pri ktorom bol rozpustný fúzny proteín domény I polypeptidu ct[>/IgG4 afinitne purifikovaný zo supernatantu stabilne transfekovaných buniek COS a bol použitý na imunizáciu myší Balb/c, ako je opísané. Boli vytvorené hybridómy a supernatanty získané pri kultivácii týchto hybridómov boli metódou ELISA testované s cieľom zistiť reaktivitu proti fúznemu proteínu domény I polypeptidu aD. Pozitívne kultúry boli potom analyzované s cieľom zistiť, či reagujú s neskrátenými komplexmi αβ/CD 18 exprimovanými na povrchu transfekovaných buniek CHO.
Myš bola najprv trikrát imunizovaná bunkami CHO transfekovanými ao/CD18 a potom dvoma posilňovacími dávkami obsahujúcimi rozpustný heterodimér αβ/CD 18. Dávky na posledné dve imunizácie obsahovali takisto fúzny proteín doména I polypeptidu αβ/IgGd v množstve 50 pg/myš. Výsledkom týchto imunizácii bolo 270 jamiek, v ktorých hybridómy produkovali protilátky proti IgG. Pomocou metódy ELISA bolo stanovené, že supernatanty zo 45 jamiek mali prinajmenšom 7-krát silnejšiu väzbu k fúznemu proteínu Iar>/IgG4 než k samotnému ľudskému IgG. Analýzou s využitím FACS bolo zistené, že žiadny z týchto supernatantov nereaguje s bunkami CHO transfekovanými OD/CD18.
S cieľom zistiť, či sú protilátky v týchto supernatantoch schopné rozpoznávať alfa podjednotku integrínu v inom kontexte, boli pomocou supernatantov (z 24 z celkového počtu 45 jamiek) označené čerstvo zmrazené rezy sleziny. Tri supernatanty poskytli pozitívnu reakciu: jeden ofarbil veľké bunky červenej pulpy, zatiaľ čo ďalšie dva ofarbili bunky roztrúsené v červenej pulpe a takisto v trabekule.
Pri týchto supernatantoch bola ďalej analyzovaná ich schopnosť imunoprecipitovať biotinylované komplexy CD 18 buď z buniek CHO transfekovaných αβ/CDlS alebo buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PMA. Na ďalšie pasážovanie boli vybrané jamky, v ktorých boli prítomné supernatanty reagujúce z lyzátov získaných pôsobením detergentov (tieto proteíny by nemali mať tak definované štruktúry, ako pokiaľ ide o proteíny exprimované ako heterodiméry). Monoklonálne protilátky, ktoré rozpoznávajú proteíny v dctcrgcntc, môžu byť užitočnejšie pri imunoprecipitácii heterodimérnych komplexov z transfekovaných buniek, tkanív a bunkových línií.
3. Ako ďalšia alternatívna na produkciu monoklonálnych protilátok bol použitý postup, pri ktorom boli z lyzátov ľudskej sleziny, pomocou monoklonálnej protilátky 23F2G namierenej proti CD 18, imunoprecipitované komplexy CD 18; tejto imunoprecipitácii predchádzalo odstránenie komplexu CDlla/CD18 (pomocou monoklonálnej protilátky TS2/4) a komplexu CDllb/CD18 (pomocou monoklonálnej protilátky Mo-1). Päť myší Balb/c, starých 10 až 12 týždňov, bolo imunizovaných subkutánnou injikáciou približne 30 pg proteínu, pripraveného opísaným postupom, v kompletnom Freundovom adjuvans. Táto imunizácia bola uskutočnená 0. deň a potom nasledovali imunizácie dvoma dávkami obsahujúcimi 30 pg imunogénu/myš v nekompletnom Freundovom adjuvans, ktoré boli uskutoč ňované 28. a 43. deň. Desať dní po poslednej imunizácii bola myšiam odobraná krv a pre získané séra zriedené v pomere 1 : 500 bola metódou Western Blot stanovovaná reaktivita proti imunogénom v množstve 1 pg/dráha. Séra z troch myší detegovali prúžky zodpovedajúce proteínom s molekulovou hmotnosťou približne 95 a 150 kD; v dráhach, v ktorých boli na detekciu použité séra z neimunizovaných myší v zriedení 1 : 50, nebol detegovaný žiadny signál. Predpokladalo sa, že prúžok s veľkosťou 150 kD reprezentuje in vivo glykozylovaný polypeptid aD. Všetky séra získané z imunizovaných myší navyše imunoprecipitovali s proteínom z lyzátov biotinylovaných buniek CHO transfekovaných ao/CD18, ktorý pri SDS elektroforéze na polyakrylamidovom géli migroval s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou heterodiméru. Na základe týchto výsledkov bola vybraná myš #2212 a táto myš bola ďalej imunizovaná intraperitoneálnou injekciou obsahujúcou 30 pg imunogénu v PBS (uskutočňovaná 64. deň). Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená a z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina.
Suspenzia jednotlivých slezinných buniek bola vytvorená rozmelením tkaniva medzi dvoma namrazcnými podložnými sklíčkami ponorenými do média RPMI 1640 bez prítomnosti séra s prídavkom 2 mM L-glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilínu v koncentrácii 100 jednotiek/ml a streptomycínu v koncentrácii 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilné bunkové sitko Nitex s veľkosťou ôk 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola potom rozsuspendovaná v 20 ml média RPMI bez prítomnosti séra. Tymocyty z troch myší Balb/c (neimunizovaných) boli pripravené podobným spôsobom.
Myelómy NS-1, udržiavané tri dni pred fúziou v log fáze v médiu RPMI s obsahom 10 % fetálneho séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc. Logan, Utah), boli centrifugované pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá opísaným postupom, a bunky boli spočítané. Približne 1,15 x 10B slezinných buniek bolo zmietaných s 5,8 x 107 buniek NS-1 scentrifugovaných a supematant bol odstránený. Peleta bola poklepom uvoľnená odo dna kyvety. K bunkovej pelete boli pri stálom miešaní počas jednej minúty pridávané 2 ml PEG 1500 (Boehrimger Mannheim) (50 % roztok v pufri 75 mM HEPES s pH = 8,0) zahriateho na teplotu 37 °C. Potom bolo k bunkovej suspenzii pridaných 14 ml média RPMI bez prítomnosti séra a suspenzia bola miešaná počas 7 minút. Nasledoval prídavok 16 ml média RPMI a bunky boli centrifugované počas 10 minút pri 200 x g. Supernatant bol odstránený a peleta bola resuspendovaná v 200 ml média RPMI obsahujúceho 15 % FBS, 100 mM hypoxantin sodný, é, 4 mM aminopterín, 16 mM tymidín (HAT) (Gibco), IL-6 s koncentráciou 25 jednotiek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 106 tymocytov/ml. Suspenzia bola rozdelená do 10-tich 95-jamkových (s plochým dnom) doštičiek na tkanivové kultúry (Coming, Veľká Británia) v objeme 200 μΐ/jamka a bunky boli vyživované 4., 5., 6. a 7. deň odohraním μΐ média z každej jamky 18G-ihlou (Becton Dickinson) a pridaním 100 μΐ čerstvého média, opísaného skôr, ale s IL-6 v koncentrácii 10 jednotiek/ml a neobsahujúceho tymocyty.
až 10 dní po fúzii boli supematanty z každej jamky testované metódou ELISA na prítomnosť myšacích IgG. Štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) boli pri teplote 4 °C potiahnuté kozou protilátkou namierenou proti myšacím imunoglobulínom IgA, IgG alebo IgM (Organon Teknika) v množstve 50 μΐ/jamku, zriedenú v pomere 1 : 5000 v uhličitanovom pufri s pH = 9,6.
Doštičky boli trikrát premyté pufrom PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBST) a bolo do nich pridaných 50 μΐ supematantu získaného z bunkových kultúr. Po inkubácii prebiehajúcej 30 minút pri teplote 37 °C a premytí, opísaným postupom, bola pridaná kozia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou namierená proti myšaciemu IgG(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove. Pennsylvania) zriedené v pomere 1 : 3500 v roztoku PBST. Doštičky boli inkubované, opísaným postupom, a štyri razy premyté roztokom PBST. Hneď potom bolo pridaných 100 μΐ substrátu, ktorý obsahoval o-fenyléndiamín v koncentrácii 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30 % H2O2 v 100 mM citrátovom pufri s pH = 4,5. Farebná reakcia bola po 5 minútach zastavená prídavkom 50 μΐ 15 % H2SO4. Absorbancia bola stanovovaná pri vlnovej dĺžke 490 nm na čítačke doštičiek firmy Dynatech.
Hybridómy boli ďalej charakterizované nasledujúcim postupom. Supematanty získané kultiváciou klonov produkujúcich IgG boli analyzované prietokovou cytometriou, či sú reaktívne proti bunkám CHO transformovaným ap/CDlS a pritom nie sú imunoreaktívne proti bunkám JY (línie B-buniek exprimujúca LFA-1, ale nie iné integríny β2). Táto skutočnosť bola pozorovaná v predchádzajúcich experimentoch). Stručne povedané, 5 x 105 buniek CHO transformovaných aJCDlS alebo Ud/CDIK buniek JY bolo rozsuspendovaných v 50 μΐ média RPMI obsahujúceho 2 % FBS a 10 mM NaN3 (pufer pre FACS). Do jamiek na 96-jamkových doštičkách (s jamkami s guľatým dnom) (Coming) boli k 50 μΐ supematantov, získaných z klonov hybridómov produkujúcich IgG, pridané jednotlivé suspenzie buniek. Po 30-minútovej inkubácii na ľade boli bunky dvakrát scentrifugované (a premyté), jednotlivé supematanty boli odstránené a pelety boli rozsuspendované v 200 až 300 μΐ pufri pre FACS. Posledný premývací roztok bol nahradený konjugátom fragmentu F(ab')2 ovčej protilátky namiereným proti myšaciemu IgG (H+L)-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) v objeme 50 μΐ/jarnka zriedeného v pomere 1 : 100 v pufri pre FACS. Po inkubácii, uskutočňovanej opísaným postupom, boli bunky dvakrát premyté PBS modifikovaným podľa Dulbacca (D-PBS) doplneným 10 mM NaNj a nakoniec rozsuspendované v B-PBS obsahujúcom 1 % paraformaldehyd. Potom boli vzorky prenesené do polystyrénových skúmaviek na analýzu prietokovou cytometriou (FACS) a analyzované na analyzátore FACscan firmy Becton Dickinson.
Výsledkom fúzie bolo vytvorenie štyroch bunkových kultúr, ktoré spĺňali obidve kritériá. Keď bol približne po štyroch dňoch uskutočňovaný pri supematantoch sekundárny sereening, tri zo štyroch kultúr zostali pozitívne. Kultúry' z týchto troch jamiek, označené 169A, 169B a 169D, boli dvakrát až trikrát úspešne pasážované vždy dvojnásobným zriedením v médiu RPMI obsahujúcom 15 % FBS, 100 mM hypoxantin sodný, 16 mM tymidín a IL-6 s koncentráciou 10 jednotiek/ml. Po štyroch dňoch boli jamky na doštičkách vizuálne zhodnotené a v jamkách s najmenším počtom kolónií bol určený počet týchto kolónií. Po 7 až 10 dňoch boli kultúry vo vybraných jamkách z každého pasážovania analyzované s využitím FACS. Pri dvoch týchto kultúrach, 169A a 169B, bola detegovaná aktivita. Pri poslednom pasážovaní boli kolónie z pozitívne reagujúcich jamiek (prítomná vždy jedna v jamke) rozrastené v médiu RPMI s 11 % FBS. Pri protilátkach zo supematantov klonov 169A a 169B bol pri použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupom odporúčaným výrobcom, stanovovaný ich izotyp. Bolo zistené, že ide o protilátky izotypu IgGl.
Pri terciálnom testovaní špecifity týchto protilátok bola využitá precipitácia s komplexmi a^/CDlS získanými z transfekovaných buniek CHO a buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PMA. Protilátky produkované hybridómami 169A a 169B precipitovali s prúžkami s príslušnou veľkosťou (proteíny z línií CHO) a precipitovali takisto s jedným typom reťazca a so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150 až 160 kD z buniek HL60. Táto skutočnosť bola stanovená pomocou SDS-PAGE. Hybridómy 169A a 169B boli 31. mája 1995 uložené v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 a bolo im pridelené prístupové číslo HB11907 (169A) aHB11906 (169B).
Aby bolo možné lepšie charakterizovať väzbové vlastnosti protilátok 169A a 169B, bola pri každej z týchto protilátok testovaná ich schopnosť inhibovať väzbu druhej protilátky alebo protilátky TS1/18.1 namierenej proti CD18 k rozpustnému heterodiméru ao/CDie. Rozpustný neskrátený heterodimér aD/CD18 bol pomocou každej z týchto protilátok (neznačených) jednotlivo imobilizovaný na 96-jamkovej doštičke a na detekciu proteínu, naviazaného prostredníctvom rovnakej alebo odlišnej neznačenej protilátky, boli použité protilátky označené biotínom. Väzba bola detegovaná pri použití konjugátu kozia protilátka namierená proti myšacím Ig/HRP s následným farbením substrátom OPD. Získané výsledky naznačujú, že protilátka 169A bola schopná blokovať väzbu biotinylovaných protilátok 169A a TS 1/18.1, zatiaľ čo protilátka 169B blokovala len väzbu seba samej.
4. Iná z myší (#2214), imunizovaná rovnakým postupom ako myš #2212, bola 70. deň ďalej imunizovaná pomocou 30 pg purifikovaného polypeptidu aD, získaného z lyzátu sleziny, v PBS. Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená a z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina.
Fúzia a selekcia pozitívne reagujúcich buniek bola uskutočňovaná opísaným postupom. Výsledkom fúzie bol vznik piatich hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky proti aD, ktoré boli označené 170D, 170F, 170E, 170X a 170H. Pri použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupom odporúčaným výrobcom, bol stanovený izotyp týchto protilátok a bolo zistené, že ide o protilátky izotypu IgGl.
5. Iná z myší (#2211), imunizovaná rovnakým postupom ako myši #2212 a #2214, bola 88. deň ďalej imunizovaná pomocou 30 pg imunogénu a 203. deň prebehla, s využitím 30 pg imunogénu, ďalšia imunizácia. Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená, z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina a fúzia buniek prebehla opísaným postupom. Supematant získaný pri kultivácii hybridómov bol testovaný metódami ELISA a prietokovou cytometriou, ako je detailne opísané v predchádzajúcich odsekoch.
Pomocou metódy ELISA bolo identifikovaných 15 pozitívne reagujúcich hybridómov označených 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R a 188T. Pri týchto klonoch bol takisto stanovený izotyp produkovaných protilátok. Stručne povedané, štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusctts) boli pri 4 °C potiahnuté kozou protilátkou namierenou proti myšacím IgA, G, M (Organon Teknika) zriedenou v pomere 1 : 5000 v 50 mM uhličitanovom pufri, pH 9,6, v objeme 50 pl/jamka. Doštičky boli počas 80 minút pri 37 °C blokované pomocou 1 % BSA v PBS, trikrát premyté v PBS/0,05 Tween 20 (PBST) a do jamiek bolo pridaných 50 μΐ supematantu získaného pri kultivácii hybridómov (zriedeného v pomere 1 : 10 v PBS). Po inkubácii a premytí, uskutočňovanom opísaným postupom, bolo do každej jamky pridaných 50 μΐ králičej protilátky (konjugovanej s chrenovou peroxidázou) namierenej proti myšacím IgGb IgG2a, alebo IgG3 (Zymed, San Francisco, California), zriedenej v pomere 1 : 1000 v PBST s 1 % normálnym kozím sérom. Doštičky boli inkubované opísaným postupom, štyri razy premyté pomocou PBST a potom bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ substrátu obsahujúceho 1 mg/ml o-fenyldiamínu (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30 % H2O2 v 100 mM citrátovom pufri, pH 4, 5. Farbenie bolo zastavené po 5 minútach prídavkom 50 μΐ 15 % H2SO4. Na čítačke doštičiek (Dynatech) bola pri vlnovej dĺžke 490 nm odčítaná intenzita a bolo zistené, že všetkých 15 protilátok je izotypu IgGl.
Zvyšné slezinné bunky z myši #2211 boli zmrazené v kryoskúmavke a skladované v kvapalnom dusíku. Obsah tejto kryoskúmavky bol rozmrazený umiestením kryoskúmavky do vodného kúpeľa s teplotou 37 °C a trepaním do chvíle, keď sa bunky práve roztopili. Bunky boli prenesené do centrifugačnej skúmavky s objemom 15 ml a po jednom mililitri k nim bolo pridávané teplé médium RPMI obsahujúce 11 % FBS. Medzi jednotlivými prídavkami média boli tri až päťminútové intervaly. Bolo pridaných ďalších 5 ml teplého média RPMI a po päťminútovom státí bola skúmavka centrifugovaná počas 5 minút pri 200 x g a supematant bol odstránený. Bunky boli rozsuspendované v RPMI a fúzia bola uskutočnená opísaným postupom. Supematant získaný pri kultivácii hybridómov bol testovaný metódami ELISA a prietokovou cytometriou, opísaným postupom.
Výsledkom fúzie bol vznik piatich klonov označených 195A, 195C, 195D, 195E a 195H. Pri týchto klonoch bol metódou ELISA, opísaným postupom, stanovený ich izotyp; bolo zistené, že monoklonálne protilátky 195A, 195C, 195D a 195E sú protilátky izotypu IgGi a monoklonálna protilátka 195H je protilátka izotypu IgG2a.
6. Aby boli získané protilátky schopné inhibovať funkčnú väzbu polypeptidu do, bol na imunizáciu použitý rozpustný ctn/CDlSLZ (pozri príklad 14). Tento proteín bol izolovaný zo supematantu získaného pri kultivácii prechodne transfekovaných buniek COS na nosiči na afmitnú chromatografiu a ako imunogén bol použitý polypeptid aD naviazaný na nosič. Vybraná myš bola imunizovaná opísaným postupom a posledná posilňovacia dávka jej bola podaná dva týždne po prvej imunizácii. Imunizácia uskutočňovaná týmto postupom zamedzuje mocným zmenám v konformácii proteínu, ktoré sú často spojené s dýzou buniek uskutočňovanou prostredníctvom detergentu. Ďalšie myši boli imunizovaná pomocou rekombinantného proteínu, takisto naviazaného na nosič, ale tieto myši neboli na začiatku imunizované proteínom purifikovaným z lyzátu buniek.
Hybridómy, získané opísaným postupom, ktoré sú výsledkom imunizácie, boli testované metódou ELISA na rekombinantných proteínoch izolovaných z bunkových supernatantov pri použití Fab fragmentov neblokujúcej protilátky. Inou možnosťou testovania je využitie prietokovej cytometrie na stanovenie reaktivity proti bunkám JY, ktoré boli dopredu transformované cDNA kódujúcou aD.
7. Inou možnosťou je produkcia monoklonálnych protilátok nasledujúcim spôsobom. Na imunizáciu myši Balb/c, uskutočňovanú opísaným postupom, bol použitý heterodimémy proteín a[j/CD18, purifikovaný afinitnou chromatografiou z lyzátov stabilne transfekovaných buniek CHO, spolu s muramyl dipeptidázou v koncentrácii 50 pg/ml. Predtým, ako bola imunoprecipitáciou biotinylovaných komplexov z transfekovaných buniek CHO stanovovaná reaktivita séra proti Oq/CDIS, boli myši, z ktorých bolo toto sérum získané, trikrát imunizované. Z pozitívne reagujúcich zvierat boli pomocou štandardných techník získané línie hybridómov. Potom boli tieto hybridómy kultivované a potom selektované pomocou prietokovej cytometrie, pri použití buniek transfekovaných ao/CDlS. Bunky transfekované CD1 la/CD18 boli využité ako kontrola na identifikáciu protilátok reagujúcich len s CD 18.
8. Ako ďalšia alternatíva na produkciu monoklonálnych protilátok bol využitý postup, pri ktorom bol pre myši Balb/c použitý protokol imunizácie/imunosupresie, ktorý bol navrhnutý tak, aby bola znížená reaktivita proti imunogénnym determinantom transfekovaných buniek CHO, použitých na imunizáciu. Tento protokol využíva imunizáciu uskutočňovanú pomocou netransfekovaných buniek CHO a potom následne zničenie B-buniek (v štádiu blastov) reaktívnych proti CHO bunkám, čo je dosahované pôsobením cyklafosfamidu. Po troch kolách imunizácie a následného zničenia reaktívnych B-buniek prídavkom cyklofosfamidu sú myši imunizované pomocou buniek transfekovaných Oq/CDI 8 opísaným postupom.
9. Inou alternatívou je postup, pri ktorom sú, opísaným postupom, lyzáty buniek HL60 stimulovaných pomocou PMA (získalo sa pôsobením detergentu) obohatené o frakciu komplexov CD18. Na rovnakých stĺpcom sú odstránené iné integriny β2. Imunizácie pomocou získaných komplexov, produkcia hybridómov a ich testovania sú uskutočňované opísanými postupmi.
B. Produkcia polyklonálneho séra
S cieľom vytvoriť polyklonálne antisérum v organizme králikov bol použitý purifikovaný chimerický proteín doména 1 polypeptidu aďlgGT (príklad 14). Na začiatku bol antigén doména I polypeptidu cqý'IgGd injikovaný do organizmu králikov v kompletnom Freundovom adjuvans v množstve 100 pg/králik a potom nasledovali tri posilňovacie dávky, obsahujúce rovnaké množstvo proteínu v nekompletnom Freundovom adjuvans. Po tretej a štvrtej imunizácii boli analyzované vzorky krvi. Králičí imunoglobulín (Ig) bol zo séra purifikovaný na kolóne Sepharoza-proteín A a na kolóne ľudský IgG/Affigel 10 bol zbavený frakcie namierenej proti ľudskému IgG. Na potvrdenie dokonalého odstránenia frakcie namierenej proti ľudskému IgG bola využitá metóda ELISA, pri ktorej bolo testované, že sérum nereaguje s ľudským IgG, ale len s časťou chimerického proteínu zodpovedajúcou doméne I.
Takto predčistené polyklonálne sérum bolo použité na imunoprecipitáciu proteínov z lyzátov buniek CHO, ktoré boli na povrchu biotinylované, a ktoré boli dopredu transfekované expresívnymi vektormi kódujúcimi aD a CD18. Imunoprecipitácia bola uskutočňovaná postupom opísaným v príklade 10. Toto predčistené sérum rozpoznávalo proteínový komplex s rovnakou molekulovou hmotnosťou akú mal komplex precipitovaný pomocou monoklonálnej protilátky TS1.18 namierenej proti CD 18. Pri analýze komplexov CD 18 získaných z buniek CHO transfekovaných pomocou an/CD18, uskutočňovanej metódou Westem Blot, rozpoznávalo toto sérum jeden prúžok s príslušnou veľkosťou. Králičie polyklonálne sérum nerozpoznávalo afinitne purifikované integriny CDlla/CD18, CDllb/CD18 a proteín VLA4 z ľudskej sleziny. Ako bolo stanovené prietokovou cytometriou, toto sérum takisto v roztoku nereagovalo s bunkami CHO transfekovanými aD. Bolo teda usúdené, že polyklonálne králičie sérum je schopné rozpoznávať len denaturované proteíny domény I polypeptidu a[:>/IgG4.
Pri pokuse o izoláciu polyklonálneho séra proti 0[>/CD18 bola myš trikrát imunizovaná pomocou buniek CHO transfekovaných aD (D6.CHO, «[/CD 18) spolu s adjuvantným peptidom a raz bola imunizovaná purifikovaným heterodimérom (1d/CD18. Posledná posilňovacia dávka obsahovala len heterodimér a!>/CD18. Prídavkom asi 108 buniek-CHO transfekovaných LFA-1 (na 2 hodiny pri °C) bolo približne 100 μΐ séra získaného z imunizovanej myši predčistených. Pri takto upravenom sére bola, v riedeniach 1/5000, 1/10 000, 1/20 000 a 1/40 000, analyzovaná, na bunkách ľudskej sleziny, reaktivita proti polypeptidu aD. Táto polyklonálna protilátka bola reaktívna v riedení 1/20 000, zatiaľ čo pri riedení 1/40 000 boli bunky farbené veľmi slabo.
Príklad 16
Analýza distribúcie polypeptidu aD
Pomocou polyklonálneho séra, vytvoreného postupom opísaným v príklade 15, bola stanovovaná tkanivová distribúcia komplexu aiýCDlS.
Na imunocytochemické analýzy zmrazených rezov ľudskej sleziny bola purifikovaná králičia polyklonálna protilátka použitá v koncentráciách v intervale 120 ng/ml až 60 pg/ml. Rezy s hrúbkou 6 mikrometrov boli umiestené na podložné sklíčka Superľrost Plus (VWR) a skladované pri -70 °C. Pred použitím boli sklíčka vybrané z -70 °C a na minút umiestené do teploty 55 °C. Potom boli rezy počas 2 minút fixované acetónom a vysušené na vzduchu. Rezy boli počas 30 minút pri izbovej teplote blokované v roztoku obsahujúcom 1 % BSA, 30 % normálne ľudské sérum a 5 % králičie sérum. Na každý rez bola aplikovaná primárna protilátka pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Nenaviazaná protilátka bola odstránená trojnásobným premytím sklíčok v TBS (počas 5 minút). Ďalej bola na každý rez nanesená králičia protilátka namierená proti myšaciemu IgG v rovnakom pufri TBS. Na detekciu sekundárnej protilátky bola použitá 30-minútovú inkubácia (pri izbovej teplote) s myšacou protilátkou namierenou proti alkalickej fosfatáze značenou alkalickou fosfatázou (APAAP). Potom boli sklíčka trikrát premyté v pufri TBS. Potom bol pridaný substrát Fast Blue (Vector Labs) a farbenie bolo zastavené ponorením sklíčka do vody. Sklíčka boli dofarbené pomocou Nuclear Fast Red (Sigma) a pred ukotvením pomocou Aqua Mount (Baxter) premyté vodou. V červenej pulpe sleziny bolo detegované farbenie pri požití tejto protilátky, ale nie pri použití králičieho polyklonálneho Ig (proti iným proteínom) alebo pri použití nepurifikovaného séra získaného z rovnakého jedinca pred imunizáciou.
Hneď ako bola raz pre myšacie sérum stanovená špecifická reaktivita proti aD, bolo toto sérum použité na zničenie rôznych lymfoidných a nelymfoidných tkanív. V totožných experimentoch boli ako kontroly využité monoklonálne protilátky rozoznávajúce polypeptidy CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Značením rezov z normálnej sleziny uskutočňovaným pomocou polyklonálneho séra proti aD a pomocou monoklonálnych protilátok proti CD18, CDlla, CDllb a CDllc, boli získané tieto výsledky. Distribúcia markéra pozorovaná pri použití polyklonálneho séra proti aD bola odlišná od distribúcie značky namierenej proti polypeptidom CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Existuje odlišná distribúcia značky pri niektorých bunkách umiestených v hraničnej zóne bielej pulpy a odlišná distribúcia značky pri periférnych bunkách hraničnej zóny. Takáto distribúcia nebola pozorovaná pri použití iných protilátok. Jednotlivé bunky roztrúsené v červenej pulpe boli takisto označené. Tieto bunky môžu, ale nemusia, byť z rovnakej populácie alebo podskupiny ako bunky označené pomocou protilátok proti CDI la a CD18.
Značenie protilátkou proti CDllc ofarbilo nejaké bunky v hraničnej zóne, ale nebol pozorovaný, v porovnaní s použitím polyklonálneho séra proti aD, zreteľný kruh okolo bielej pulpy. Takisto distribúcia značky v červenej pulpe nezodpovedala distribúcii značky pri použití polyklonálneho séra proti aD.
Distribúcia značky pozorovaná pri použití polyklonálneho séra proti aD bola teda jedinečná v porovnaní s distribúciou pozorovanou pri použití protilátok proti iným integrínom β2 CDIla, CD11 b, CDllc a CDI8. Tieto výsledky naznačujú, že in vivo distribúcia polypeptidu (iD v organizme človeka je odlišná od distribúcie iných integrínov β2.
Charakterizácia expresie ľudského polypeptidu aD uskutočňovaná pomocou monoklonálnych protilátok
Pri analýze expresie ľudského polypeptidu aD uskutočňovanej imunocytochemicky na zmrazených tkanivových rezoch a pomocou prietokovej cytometrie na bunkových líniách a leukocytoch periférneho krvného obehu boli použité protilátky sekretované hybridómami 169A a 169B. V obidvoch experimentoch boli supematanty získané kultiváciou hybridómov použité v nezriedenej forme .
Značenie tkanív
Všetky značenia, okrem značenia rezov pečene uskutočňovaného podľa protokolu opísaného ďalej, boli uskutočňované opísaným postupom. Po fixácii acetánom boli rezy počas 15 minút pri izbovej teplote premyté v roztoku 1 % H2O2 a 1 % azidu sodného v TBS. Po označení primárnou protilátkou bola na rezy na 30 minút pri izbovej teplote aplikovaná králičia protilátka namierená proti myšaciemu IgG konjugovaná s peroxidázou. Rezy boli trikrát premyté v pufri TBS. S cieľom detekcie sekundárnej protilátky bola použitá inkubácia s prasacou protilátkou (konjugovanou s peroxidázou) namierenou proti králičej protilátke, uskutočňovaná pri izbovej teplote počas 30 minút. Rezy boli potom trikrát premyté v pufri TBS, bol k nim pridaný substrát AEC (Vector Labs) a reakcia bola ponechaná prebiehať. Rezy boli dofarbené Hematoxylínom Gill č. 2 (Sigma) a potom, pred vysušením a ukotvením, boli premyté vodou.
V rezoch zo sleziny bola väčšia expresia lokalizovaná v červenej pulpe a to na bunkách morfologicky zodpovedajúcich granulocytom a makrofágom. Označené bolo veľké množstvo granulocytov, zatiaľ čo signál poskytla len časť z makrofágov. Pomocou protilátok proti aD bolo slabo ofarbené malé množstvo folikulárnych dendritických buniek prítomných v bielej pulpe. Farbenie pomocou protilátok proti CDI la a CD 18 poskytlo signál tak v červenej, ako aj v bielej pulpe. Farbenie pomocou protilátok proti CDllc bolo výraznejšie pri veľkých bunkách prítomných v bielej pulpe sleziny (predpokladá sa, že ide o makrofágy) a v hraničnej zóne obklopujúcej bielu pulpu; bola tiež pozorovaná difúzne rozptýlená značka v červenej pulpe. Zdá sa, že distribúcia polypeptidu CD11 b v červenej pulpe sa prekrýva, ale nie je identická, s distribúciou aD, ale nie je pozorovaná distribúcia CDI lb v bielej pulpe.
Bola porovnávaná expresia integrínov v normálnom a (reumatodnom) artritickom tkanive synovia. V zdravom (normálnom) tkanive bola, pri značení akoukoľvek protilátkou namierenou proti integrínu (vrátane protilátok špecificky imunoreaktívnych proti CDIla, CD11 b, CDllc, CD 18 a tiež aD), pozorovaná minimálna odpoveď s distribúciou značky na rezidentných bunkách, prevažne makrofágoch. Pri zapálenom tkanive bola expresia všetkých in tegrínov viac lokalizovaná, a to na bunkách nazhlukovaných okolo lymfatických ciev. Zatiaľ čo distribúcie expresie aD CDllb boli podobné, ukázalo sa. že polypeptid CDllc nie je exprimovaný v takej veľkej miere a jeho expresia je obmedzená len na podskupinu leukocytov.
Na tkanivových rezoch z pečene psa bola na pečeňových makrofágoch, čiže Kuppferových bunkách, pozorovaná expresia CDllb, ale nie expresia polypeptidu aD. Značenie rezov z pečene „zdravých“ ľudí (uskutočňované postupom opísaným pre značenie rezov z psej pečene, pozri skôr) potvrdilo konzervovanosť distribúcie tejto značky u človeka. Navyše tu bola detegovaná nízka hladina expresie CDI lc. V rezoch z pečene pacientov postihnutých hepatitídou bola intenzita značky pre všetky leukointegríny vyššia, ako to bolo pri „normálnych“ pečeniach, zatiaľ čo na povrchu granulocytov a makrofágov bola v týchto vzorkách detegovaná expresia polypeptidu aD.
Pri farbení pomocou protilátok proti aD bolo na rezoch z hrubého čreva zdravých ľudí pozorované len nevýrazné farbenie; bola pozorovaná slabá intenzita značky na bunkách hladkého svalstva a leukocytoch. Na rezoch získaných od pacientov postihnutých Crohnovou chorobou bola detegovaná zvýšená hladina expresie všetkých leukointegrínov.
Na rezoch z pľúc zdravých jedincov bolo pozorované obmedzené množstvo buniek pozitívnych na prítomnosť aD; tieto bunky zodpovedali morfologicky makrofágom a neutrofilom. Na tkanivových rezoch z pľúc postihnutých rozdutím bol výskyt značky proti aD pozorovaný pri neutrofiloch a makrofágoch obsahujúcich hemosiderín, čo je pigment obsahujúci železo. Táto skutočnosť naznačuje pohltenie červených krviniek týmito bunkami.
Expresia integrínov bola takisto analyzovaná na tkanivových rezoch mozgu zdravých jedincov a tkanivových rezoch z lézií od pacientov postihnutých roztrúsenou sklerózou (MS - multiple sclerosis). V tkanivových rezoch zo zdravých jedincov bolo farbenie aD menej intenzívne ako farbenie CDI la, CDI lb a CDI lc a toto farbenie bolo obmedzené na bunky, morfologicky a prítomnosťou CD68, zodpovedajúce mikrogliálnym bunkám. Bunky exprimujúce CDllb boli sitované v miestach obklopujúcich cievy a rozptýlené v tkanive. CDllc+ bunky boli situované vnútri cievy, zatiaľ čo aD+ bunky obklopovali tieto cievy. V tkanivových rezoch z mozgu pacientov postihnutých MS bola expresia polypeptidu aD zistená tak na mikrogliálnych bunkách, ako aj na časti leukocytov iných ako makrofágov; aD + bunky boli situované vnútri lézií a takisto v kortexe týchto lézií. Signál pre uD mal rovnakú intenzitu ako signál pre CDllc, ale jeho intenzita bola nižšia, ako keď ide o signál pre CDI lb.
Pomocou protilátok proti leukointegrínom a CAM boli analyzované vzorky tkanivových rezov tak hrudnej aorty, ako aj brušnej aorty z PDAY (Patobiologické Determinanty Aterosklerózy u mladých ľudí; LSU Medical Center). Skúmané lézie zodpovedali aterosklerotickým platom, ktoré pod intimou obsahovali agregáty veľkých penových buniek (prevažne makrofágov „napchatých“ lipidmi) a boli infiltrované menšie leukocyty. Štúdie, pri ktorých boli samostatne použité protilátky špecificky namierené proti aD alebo iným a reťazcom integrínov β2 (CDIla, CDllb a CDllc) spolu s protilátkou proti markéru makrofágov (CD68) odhalili, že väčšina makrofágov „napchaných“ lipidmi exprimovala aD a CD18 v priemernej hladine, zatiaľ čo expresia CDIla bola slabá a expresia CDllc bola v rozmedzí slabá až stredná. CDllb bol exprimovaný veľmi slabo, a to len na časti makrofágov.
S cieľom zistiť relatívnu lokalizáciu antigénu uD a ICAM-R, boli na rezoch aorty uskutočnené štúdie, pri kto
SK 283135 Β6 rých bolo použité súčasné značenie dvoma značkami. Keďže penové bunky v týchto rezoch boli značené protilátkou Ham 56, špecificky namierenou proti markéru makrofágov, ale neboli značené protilátkami proti aktívnu buniek hladkej svaloviny, bolo stanovené, že penové bunky neboli odvodené od subintimálnych buniek hladkej svaloviny. CD68+ makrofágy exprimujúce aD boli obklopené malými leukocytmi exprimujúcimi ICAM-R; tieto leukocyty boli takisto prítomné medzi CD68+ makrofágmi exprimujúcimi aD. Zdalo sa, že existuje obmedzené množstvo malých leukocytov, ktoré neexprimujú CD68, ale sú značené tak protilátkami proti aD, ako aj protilátkami proti ICAM-R.
Distribúcia polypeptidu aD na leukocytoch prítomných v tkanivách zdravých jedincov sa prekrývala, ale nebola identická s distribúciou CDllb a CDllc, dvoma ďalšími a reťazcami leukointegrínov, ktoré boli už predtým charakterizované ako reťazce, ktorých expresia je omedzená na leukocyt. Bunková morfológia naznačila, že značkou namierenou proti aD sú farbené predovšetkým makrofágy a granulocyty a obmedzene lymfocyty. Všeobecne je možné povedať, že zápal v tkanive zvyšuje, spolu s výskytom vyššej intenzity značenia leukointegrínov, množstvo aj počet typov leukocytov pozorovaných v príslušnom tkanive. Keďže bunková a priestorová distribúcia leukointegrínov nebola v patologických tkanivách identická, bolo odvodené, že každý člen rodiny integrínov, vrátane aD, má, v danom kontexte, odlišné funkcie a ligandy.
Zaujímavé je, že expresia polypeptidu aD v aterosklerotických léziách bola výraznejšia ako expresia CDlla, CDllb a CDllc, čo naznačuje, že aD môže hrať kľúčovú úlohu vo vytváraní týchto lézií. Spoločná distribúcia aD + a ICAM-R+ buniek, podporené dôkazmi naznačujúcimi možnosť interakcie medzi aD a ICAM-R naznačuje, že polypeptid aD môže, v skorých štádiách, týchto lézií, hrať úlohu pri infiltrácii leukocytov alebo pri ich aktivácii.
Značenie bunkových línii a leukocytov periférnej krvi
Bunková línia promyeloidných monocytov HL60 značená protilátkami 169A a 169B bola analyzovaná s využitím FACS. Expresia aD na povrchu týchto buniek je negatívne ovplyvnená stimuláciou pomocou PMA, ktorý indukuje difereciáciu po makrofágovej dráhe, ale nie ovplyvnená stimuláciou DMSO, ktorý indukuje difereciáciu po dráhe granulocytov [Collins a ďalší, Blood 70 : 1233 až 1244 (1987)]. Distribúcia značky bola (v analýze s využitím FACS) pri použití protilátok 169A a 1698 pri stimulácii buniek pomocou PMA odlišná od distribúcie značky získanej pri použití monoklonálnych protilátok namierených proti CD1 lb a CD1 lc. Bunková línia monocytov THP-1 je takisto slabo značená protilátkami 169A a 169B. Navyše časť z leukocytov periférnej krvi patriacich do oblasti („gate“) lymfocytov a monocytov sa pri analýze s využitím FACS javila len slabo pozitívna. Časť monocytov periférnej krvi bola slabo značená protilátkami 169A a 169B, zatiaľ čo na povrch B-lymfocytov nebola zistená žiadna expresia aD. Časť CD8 pozitívnych T-lymfocytov bola tiež aD pozitívna. Ďalej sa nepodarilo protilátkami 169A a 169B detegovať antigén na líniách B-buniek JY, Ramos, na línii bazofilov KU812 a na líniách T-buniek Jurkat, SKW a Molt 16.
Na základe výsledkov analýz s bunkami HL60 boli, pomocou gradientovej centrifugácie s nosičom Ficoll/Hypaque a následnou analýzou červených krviniek, z periférnej krvi izolované granulocyty. Všetky izolované preparáty obsahovali viac ako 90 % PMN (polymorfonukleárnych leukocytov), ako bolo zistené vizualizáciou morfológie jadier v kyseline octovej. Jednotlivé populácie boli vystavené na 30 minút pôsobeniu 50 ng/ml alebo 10'8 M formyl peptidu (fMLP), aby sa uvoľnili potencionálne spôsoby integrínov. Nestimulované populácie mali v porovnaní s IgGl kontrolou síce nízku, ale štatisticky významnú expresiu antigénov 169A a 169B, ktorá po stimulácii rástla. Hladiny expresie aD a CD1 lc na povrchu polymorfonukleámych leukocytov si zodpovedali viac, ako tieto hladiny pozorované pre bunky HL60. Protilátka 169B bola potom použitá na precipitáciu heterodimémej molekuly z biotinylovaných PMN lyzovaných detergentom. Podjednotky so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150, resp. 95 kD zodpovedali veľkosti aD, resp. CD 18.
Výskyt aD na PMN nemohol byť predpovedaný na základe znalosti aD u psov. Psie neutrofily, na rozdiel od ľudských náprotivkov, exprimujú na pomocných T-bunkách marker CD4 a tiež integrín VLA-4 a teda môžu byť v organizme psov iné ligandy a funkcie, ako je to u človeka.
Značenie subpopulácií PBL
Táto štúdia poslúžila na určenie distribúcie integrínov β2 v leukocytoch ľudskej periférnej krvi. Okrem toho bola porovnávaná hustota aD v porovnaní s inými integrínmi β2. Nakoniec bola tiež vyhodnotená okamžitá regulácia expresie aD v purifikovaných ľudských eozinofiloch.
Leukocyty ľudskej periférnej krvi boli izolované centrifugáciou v hustotnom gradiente a rozdeleného do frakcie mononukleárnych buniek (s obsahom monocytov, lymfocytov a bazofilov) a do frakcie granulocytov (neutrofily a eozinofily) [Wamer a ďalší, J. Immunol. Meth. 105 :107 -110 (1987)]. Pre niektoré experimenty boli eozinofily purifikované imunomagneticky na čistotu väčšiu ako 95 % použitím CD16 [Hansel a ďalší, J. Immunol. Meth. 122 : 97-103 (1989)]. Kožné žime bunky boli enzymaticky oddelené z ľudskej kože a namnožené, ako to bolo opísané [Lawrence a ďalší, J. Immunol. 139 : 3062 - 3069 (1987)].
Bunky boli značené vhodnými riedeniami monoklonálnych protilátok špecificky namierených proti CDlla (MHM24), CD11B (H5A4), CD1 lc (BU-15) alebo proti aD (169A). Ako kontrola bol zaradený myšací IgGl. Bunky boli premyté a potom inkubované s kozou protilátkou namierenou proti myšacím IgG konjugovanou s fykoerytrínom. V niektorých pokusoch boli bunky inkubované v nadbytku myšacieho IgG a myšacej monoklonálnej protilátky alebo kozej polyklonálnej protilátky, ktoré boli značené FITC (špecifické pre antigén konkrétnej bunky) (napríklad CD3, CD4 alebo CD8 pre T-bunky; CD16+ lymfocyty pre NK bunky; anti-IgE pre bazofily) [Bochner a ďalší, J. Immunol. Meth. 125 : 265 - 271 (1989)]. Potom boli tieto vzorky skúmané prietokovou cytometriou (Coulter EPICS profil) pri použití vhodného „gatingu“, aby mohli byť identifikované podskupiny buniek.
V experimentoch s ľudskými eozinofilmi bola skúmaná okamžitá aktivácia expresie aD. Bunky boli stimulované 15 minút pri 37 °C esterom forbolu (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) [Schall, Cytokine 3 : 165 - 183 20 (1991)] alebo interleukínom (10 ng/ml) a potom boli značené rôznymi monoklonálnymi protilátkami, ako je to opísané.
Výsledky ukázali, že polypeptid bol prítomný na všetkých eozinofiloch, bazofiloch, neutrofiloch, monocytoch a NK-bunkách periférnej krvi. Tiež malý podiel (približne 30 %) CD8+ lymfocytov vykazoval expresiu aD. Kožné žime bunky a CD4+ lymfocyty podjednotku aD neexprimovali. Všeobecne sú CDlla a CDllb prítomné na leukocytoch vo vyššej hustote ako aD. Podjednotka aD je exprimovaná na relatívne nízkej hladine expresie CDllc. Pokiaľ ide o leukocyty, je polypeptid aD s najväčšou hustotou exprimovaný na monocytoch a CD8+ bunkách, zatiaľ čo eozinofily majú úroveň expresie aD najnižšiu. Hladina expresie na neutrofiloch, bazofiloch a NK-bunkách je stredná.
Aktivácia eozinofilov periférnej krvi vyvolaná pôsobením CC-chemokinu RANTES nespôsobuje zmenu v expresii žiadneho z integrinov β2. Pôsobenie esteru forbolu malo však za následok dvoj- až trojnásobné zvýšenie expresie CDllb a aD, ale neovplyvnilo expresiu CDlla alebo CD 11 c. Pôsobením interleukínu IL-5 sa selektívne aktivovala expresia podjednotky CDllb, pričom nebola ovplyvnená hladina expresie iných integrínových podjednotiek.
Získané výsledky ukázali, že podjednotka aD je pri leukocytoch periférnej krvi exprimovaná v približne rovnakom množstve ako podjednotka CD 11 c. Najvyššia hladina expresie bola zistená na monocytoch a populácii CD8+ lymfocytov. Žírne bunky ľudskej kože polypeptid aD neexprimovali. Pokiaľ ide o purifikované eozinofily, boli vnútri cytoplazmy objavené predvytvorené zásoby podjednotiek CD 11 b a ctD. Z pozorovanej rozdielnej aktivácie interleukínom IL-5 oproti PMA sa usudzuje, že tieto zásoby podjednotiek sú od seba oddelené.
Distribúcia značky pri subpopulácii leukocytov periférnej krvi (PBL) bola tiež určovaná metódou prietokovej cytometrie pri použití kombinácie „gatingu“ (definovanie jednotlivých bunkových typov na základe hodnôt rozptylu svetla meraných v priamom smere a v uhle 90 °C) a povrchových značiek, ako to bolo opísané. Táto metóda bola použitá pri pokuse presnejšie definovať populáciu lymfocytov, ktorá exprimuje 169 A/B. PBL boli izolované pomocou Ficollu, opísaným postupom, a jednotlivo označené protilátkami 169A, 169B a monoklonálnymi protilátkami proti CD 14 (značka monocytov a makrofágov), CD20 (B-bunky), CD56 (NK-bunky), receptora α/β T-buniek (T-bunky), CD 16 (neutrofily a NK-bunky) a a4 (negatívny markér neutrofilov). Jednotlivé oblasti („gates“) boli definované na základe buniek a distribúcie značiek.
Získané výsledky naznačujú, že bunky v oblasti („gate“) CD14+ monocytov majú nízku hladinu značenia protilátkami 169A a 169B. Bimodálna distribúcia značky pozorovaná v predchádzajúcich experimentoch v oblastiach („gate“) lymfocytov bola rozlíšená pri zvýšenom rozptyle meranom v priamom smere. Zmiešaná TCR+/CD20+ buniek mala nízku, ale homogénnu hladinu expresie antigénov pre 169A/B. Populácia mapovaná pri mierne zvýšenom bočnom rozptyle (bunková komplexita), ktorá bola pre CD56 z 50 % pozitívne označená, sa ukázala jasne 169A/B negatívnou populáciou. Negatívna populácia nebola takisto rozpoznaná pomocou protilátok namierených proti TCR, CD20, CD 14 alebo CD 16.
Distribúcia aD v synoviu
S cieľom určiť distribúciu polypeptidu aD, ďalších integrínov β2 a ich príslušných receptorov pri zápalovej a nezápalovej synovii boli použité imunohistologické štúdie využívajúce monoklonálne protilátky namierené proti rôznym integrínom a supergénovým rodinám imunoglobulínov. Expresia proteínov bola stanovovaná v normálnych, osteoartritidických a reumatoidných tkanivových kultúrach synovii.
Získané výsledky naznačujú, že vrstva epiteliálnych buniek synovia má vysokú úroveň expresie VCAM-1, CDllb/CD18 a a^CDIS. V týchto bunkách je obmedzená expresia CDllc/CD18 a expresia CDlla/CD18 nie je väčšinou detegovaná. Pri reumatoidnom artritickom zápale synoviálnej blany vzrastá expresia integrinu β2 na synoviálnych bunkách úmerne stupňu hyperplázie. Množstvo buniek exprimujúcich CD1 lc sa podstatne zväčšuje, čím sa blíži množstvo buniek exprimujúcich CDllb a aD, ale nie je pozorované zvýšenie expresie CD1 la.
V subepiteliálnych oblastiach tkanív sú CD3/CD1 la/ICAM-R+ lymfocyty, vo forme agregátov a difúznych infiltrátov, rozstrúsené medzi CD68/CD1 lb/aD+ makrofágmi. Na vysoký počet agregátov poukazuje intenzívne značenie aD, a to hlavne v oblastiach bohatých na T-bunky.
Synoviálny endotel premenlivo exprimuje ICAM-1 a ICAM-2, s minimálnymi stopami expresie ICAM-R.
Tieto výsledky dokazujú, že synoviálne makrofágy a makrofágom podobné synoviálne bunky konštitutívne exprimujú vysoké množstvo podjednotiek CDllb a aD integrínov β2. Pri zápale synoviálnej blany dochádza, tak v epiteliálnych, ako aj v subepiteliálnych oblastiach, k veľkému pomnoženiu týchto populácií buniek, súčasne so zrejmým nárastom v expresii CD 11 c. Špecifické populácie reumatoidných synoviálnych T-lymfocytov exprimujú nielen CD1 la a ICAM-R, ale tiež veľké množstvo aD. Táto molekula, ako bolo ukázané, je exprimovaná v nízkej úrovni na lymfocytoch periférnej krvi.
Príklad 17
Izolácia klonov potkanej cDNA
Vzhľadom na existenciu psích a ľudských podjednotiek aD boli uskutočňované pokusy izolovať homológne gény z iných druhov, vrátane laboratórnych potkanov (tento príklad) a myší (príklad 17, pozri skôr).
Čiastočná sekvencia potkanej cDNA majúca homológiu k ľudskému génu pre aD bola získaná využitím lambdadtlO knižnice z potkanej sleziny (Clontech). Knižnica bola vysiata v koncentrácii 2 x 104 pfu/miska na LBM/agarových miskách s priemerom 150 mm. Knižnica bola prenesená na membránu Hybond (Amersham), denaturovaná 3 minúty, 3 minúty neutralizovaná a 5 minút premývaná puframi opísanými v štandardnom protokole [Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: a laboratory manual, strana 2.110], Membrány boli okamžite prenesené do Stratalinkéra (Stratagene) a DNA zosieťovaná pomocou autozosieťovacieho nastavenia. S cieľom dosiahnuť podmienky, pri ktorých je pre hybridizáciu potrebný nízky, resp. vysoký stupeň komplementárny medzi sondou testovanou sekvenciou, boli membrány prchybridizované a hybridizované v 30 %, resp. 50 % formamide. Membrány boli na začiatku testované pomocou sondy značenej 32P získanej z cDNA kódujúcej ľudský aD, zodpovedajúcej oblasti od bázy 500 do 2100 v klone 19A2 (SEK. ID. č.: 1). Sonda bola pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označená. Filtre boli premyté v 2 x SSC pri teplote 55 °C.
Boli identifikované dva klony, označené 648.3 a 705.1, ktoré mali sekvenčnú homológiu k sekvencií ľudského aD, ľudského CDllb a ľudského CD 11 c. Obidva klony zodpovedajú 3'-oblasti génu pre ľudský aD a začínajú od bázy 1871 a pokračujú až k báze 3012 pre kloň 648.3, resp. od bázy 1551 až k 3367 pre kloň 705.1.
S cieľom získať úplnejšiu potkaniu sekvenciu, zahrnujúcu aj oblasť zodpovedajúcu 5' koncu, bola, postupom rovnakým ako pre prvé testovanie, opäť testovaná rovnaká knižnica, ale pri tomto testovaní boli použité myšacie sondy získané z klonu A1160 (pozri príklad 17, pozri ďalej). Pomocou druhého testovania boli vyselektované jednotlivé izolované plaky, ktoré boli uchované ako jednotlivé klony na miskách s LBM/agar. S cieľom vytvoriť DNA použiteľnú na sekvenovanie, boli v štandardnej PLR reakcii použité sekvenačné priméry 434FL a 434FR (SEK. ID. č.: 34, resp. 35).
5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3 ’ (SEK. ID. č.: 34)
5'-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3' (SEK. ID: í.: 35)
DNA získaná metódou PCR bola purifikovaná pri použití kolóny Quick Spin (Qiagen) podľa protokolu odporúčaného výrobcom. Boli identifikované dva klony, označené 741.4 a 741.11, ktorých sekvencie sa prekrývali so sekvenciami klonov 684.3 a 705.1; v prekrývajúcich sa oblastiach boli klony 741.4 a 741.11 100 % homológne s klonmi 684.3 a 705.1. Zložená potkania cDNA homológna k ľudskému génu pre aD, je zobrazená v SEK. ID. č.: 36; predpovedaná aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEK. ID: č.: 37.
Klonovanie 5' konca sekvencie kódujúcej potkaní aD
Fragment 5' konca cDNA pre gén kódujúci potkaní aD bol získaný z potkanej sleziny s využitím klonovacieho kitu RAČE (Clontech) postupom odporúčaným výrobcom. Použité oligonukleotidy špecifické pre tento gén boli označené 741.11 #2R a 741.2# 1R (SEK. ID. č.: 59, resp. 58).
5'-CCAAAGCTGGXTGCATCCTCTC-3' (SEK. Dl. č.: 59)
5'-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3' (SEK. ID. č.: 58)
Oligonukleotid 741.11#2R zahrnuje bázy 131 až 152 v SEK. ID. č.: 36 v opačnej orientácii a oligonukleotid 741.2&1R zahrnuje bázy 696 až 715 v SEK. ID. č.: 36 tiež v opačnej orientácii. Primárna reakcia PCR bola uskutočnená pri použití oligonukleotidu 741.2#1R vymedzujúceho 3' koniec kódujúceho vlákna (najbližšie 3'-koncu). Následná druhá reakcia PCR bola uskutočnená pri použití oligonukleotidu 741.11#2R a DNA získanej z prvej reakcie. Na 1 % agarózovom géli bol detegovaný prúžok s veľkosťou približne 300 párov báz.
Produkt druhej reakcie PCR bol, podľa protokolu odporúčaného výrobcom, zaklonovaný do plazmidu pGRTAII (Invitrogen). Do každej z 96 jamiek (s guľatým dnom) na doštičke na tkanivové kultúry boli do 100 μΐ LBM média obsahujúceho 1 μΐ zásobného roztoku karbenicilínu s koncentráciou 50 mg/ml a 1 μΐ kultúry fágu Ml3 K07 pridané biele (pozitívne) kolónie. Zmes bola inkubovaná 30 minút až jednu hodinu pri teplote 37 °C. Po tejto inkubácii bolo pridaných 100 μΐ LBM média (obsahujúceho 1 μΐ zásobného roztoku karbenicilínu s koncentráciou 50mg/ml a zásobný roztok kanamycínu s koncentráciou 10 mg/ml v riedení 1.250) a inkubácia pokračovala pri teplote 37 °C cez noc.
Sterilnou kovovou transferovou vidlicou bol supematant z 96-jamkovej doštičky prenesený na štyri nylonové filtre Hybond (Amersham). Filtre boli denaturované, neutralizované a DNA zosieťovaná podľa štandardných protokolov. Filtre boli prehybridizované pri stálom trepaní v 20 ml prehybridizačného pufra (5 x SSPE; 5 x Denhardts; 1 % SDS; 50 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií) pri teplote 50 °C počas niekoľkých hodín.
Oligonukleotidové sondy 741.11#1 a 741.11#1R (SEK. ID. č.: 56 a 57), zahrnujúce páry báz 86 až 105 (SEK. ID. č.: 36) v priamej a reverznej orientácii, boli rádioaktívne označené nasledujúcim spôsobom.
5-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3' (SEK. ID. č.: 56)
5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3' (SEK. ID. č.: 57)
Približne 66 ng oligonukleotidovej DNA bolo dve minúty pri teplote 65 °C zahrievaných v 12 μΐ dH2O. Do skúmavky boli pridané 3 μΐ 10 mCi/ml τ-32Ρ-ΑΤΡ spolu so μΐ 5 x pufra na kinázu (Gibco) a 1 μΐ DNA kinázy T4 (Gibco). Zmes bola inkubovaná 30 minút pri teplote 37 °C. Po skončení inkubácie bolo 16 μΐ každej zo značených oligonukleotidových sond pridaných k filtrom v prehybridizačnom pufri a inkubácia pokračovala pri 42 °C cez noc. Filtre boli trikrát, počas 5 minút pri izbovej teplote, premývané roztokom 5 x SSPE s 0,1 % SDS a 6 hodín autorádiografované. Pozitívne klony boli namnožené a DNA bola purifikovaná kitom na minipreparáciu DNA „Mágie Mini“ (Promega) podľa výrobcom odporúčaného protokolu. Pre sekvenovanie bol vybraný kloň 2F7 a tento kloň mal, v prekrývajúcej sa oblasti, 100 % homológiu ku klonu 741.11. Kompletná potkania nukleotidová sekvencia génu pre aD je zobrazená v SEK. ID. č.: 54; aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 55.
Charakteristiky potkanej cDNA a aminokyselinovej sekvencie
Nukleotidová ani aminokyselinová sekvencia potkanej aD podjednotky integrínu β2 neboli predtým publikované. Porovnanie týchto sekvencií s publikovanými sekvenciami kódujúcimi podjednotky a ľudských integrínov fi2 naznačuje, že izolovaný potkaní kloň podjednotky aD má veľmi podobnú nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu.
Na úrovni sekvencie nukleotidov má izolovaný kloň potkanej cDNA 80 % zhodu v porovnaní s cDNA pre ľudský aD; 68 % zhodu s cDNA pre ľudský CD1 lb; 70 % zhodu s cDNA pre ľudské CDllc a 65 % zhodu s cDNA pre myšací CD1 la.
Na úrovni sekvencie aminokyselín má predpokladaný potkaní polypeptid, kódovaný izolovanou cDNA, 70 % zhodu v porovnaní s ľudským polypeptidom aD; 28 % zhodu s ľudskou podjednotkou CD 11a; 58 % zhodu s ľudskou podjednotkou CDllb; 61 % zhodu s ľudskou podjednotkou CDllc; 28 % zhodu s myšacou podjednotkou CDlla a 55 % zhodu s myšacou podjednotkou CD1 lb.
Príklad 18
Produkcia a charakterizácia protilátok špecificky namierených proti podjednotke aD hlodavcov
A. Protilátky namierené proti fúznym proteínom doména I potkanieho polypeptidu aD/HuIgG4
Keďže bolo dokázané, že doména I ľudského integrínu β2 sa zúčastňuje na väzbe ligandu, predpokladalo sa to isté pre potkaní proteín aD. Imunošpecifické monoklonálne protilátky proti aD by preto mali byť užitočné pri potkaních modeloch ľudských chorôb, pri ktorých hrá úlohu väzba podjednotky aD.
Oligonukleotidy alfa-DI5 (SEK. ID. č.: 87) a alfa-DI3 (SEK. ID. č.: 88) boli vytvorené zo sekvencie potkanej aD zodpovedajúcej oblasti bázy 469 až 493, resp. 1101 až 1125 (v reverznej orientácii) v SEK. ID. č.: 54. Oligonukleotidy boli použité v štandardnej PCR reakcii na vytvorenie fragmentu DNA kódujúceho potkaní aD s obsahom domény I oblasti báz 459 až 1125 v SEK. ID. č.: 54. Produkt PCR bol vyklonovaný do vektora pCRTAII (Invitrogen) podľa výrobcom odporúčaného protokolu. Bola vybraná pozitívna kolónia a z jej rozrastenej kultúry bola, pri použití kitu na izoláciu DNA „Midi Prep“ firmy Qiagen (Chatswoth, GA) podľa protokolu výrobcu izolovaná DNA. DNA bola klasicky naštiepená reštrikčnými enzýmami Xhol a BglII. Vzniknutý fragment s veľkosťou 600 báz bol izolovaný z gélu a potom zaklonovaný do expresívneho vektora pDCSl/HuIgG4. Pozitívne kolónie boli selektované a namnožené a pri použití kitu na izoláciu DNA „Maxi“ firmy Quiagen z nich bola purifikovaná DNA.
Bunky COS boli v polovičnej konfluencii vysiate na misky s priemerom 100 mm a kultivované cez noc pri teplote 37 °C v 7 % CO2. Bunky boli 1 x prepláchnuté 5 ml média DMEM. K 5 ml DMEM bolo pridaných 50 pl DEAE-Dextánu, 2 pl chlorokinu a 15 pg potkanej DNA kódujúcej fúzny proteín doména I polypeptidu απ/Hu IgG4 opísaný skôr. Táto zmes bola pridaná k bunkám COS a bunky boli inkubované tri hodiny pri teplote 37 °C. Médium bolo odstránené a bunky boli presne jednu minútu inkubované v 5 ml 10 % DMSO v CMF-PBS. Bunky boli raz mierne prepláchnuté v DMEM. K týmto bunkám bolo pridaných desať mililitrov DMEM obsahujúceho 10 % FBS a inkubácia pokračovala cez noc pri teplote 37 °C v 7 % CO2. Ďalší deň bolo médium nahradené čerstvým médiom a inkubácia prebiehala nasledujúce tri dni. Toto médium bolo odobrané a do misky bolo pridané čerstvé médium. Po troch dňoch bolo médium opäť odobrané a misky boli vyhodené. Postup bol opakovaný, dokiaľ neboli z kultúry získané 2 litre supematantu.
Supernatant získaný opísanou metódou bol nanesený na kolónu Prosep-A (Bioprocessing Limited) a proteín bol purifikovaný opísaným postupom.
Kolóna bola najprv premytá 15-násobným objemom premyvacieho pufra obsahujúceho 35 mM Tris a 150 mM NaCl s pH - 7,5. Supernatant bol nanášaný pri rýchlosti menšej ako približne 60 objemov kolóny za hodinu. Potom bola kolóna premytá 15-násobným objemom premývacieho pufra, 15-násobným objemom roztoku 0,55 M dietanolamínu s pH = 8,5 a 15-násobným objemom roztoku 50 mM kyseliny citrónovej s pH = 5,0. Proteín bol eluovaný roztokom 50 mM citrónovej kyseliny s pH = 3,0 a ďalej neutralizovaný roztokom 1,0 M Tris a dialyzovaný do sterilného roztoku PBS.
Doména I potkanieho proteínu uD bola analyzovaná postupom opísaným v príklade 14. Detegovaný proteín putoval rovnakým spôsobom ako proteín ľudskej domény I.
B. Produkcia monoklonálnych protilátok namierených proti fúznemu proteínu doména I potkanieho polypeptidu aD/HuIgG4
Myši boli jednotlivo imunizované 50 pg purifikovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu afrHulgGd, ktorý bol najprv emulgovaný rovnakým objemom Freundovho kompletného adjuvans (Sigma). Približne 200 pl tohto preparátu bolo na štyroch miestach vstreknutých do chrbta a boku myši. O dva týždne neskôr bola mys druhý raz injikovaná 100 pl antigénu doména I potkanieho polypeptidu a[/HuIgG4 (v množstve 50 pg/ml), ktorý bol predtým emulgovaný rovnakým objemom Freundovho nekompletného adjuvans. Počas nasledujúcich dvoch týždňov bolo myšiam intravenózne aplikovaných 50 pg antigénu v 200 pl roztoku PBS.
S cieľom zistiť titer krvného séra imunizovaných myší bol desať dní po tretej imunizácii uskutočnený retroorbitálny odber krvi. Krv sa nechala zraziť, sérum bolo izolované centrifugáciou a použité na imunoprecipitáciu proteínov zo slezinných buniek potkanov značených biotínom (BIP). Sérum získané z každej myši imunoprecipitovalo proteínové prúžky s molekulovou hmotnosťou predpokladanou pre potkaní aD a CD18. Jedna z myší bola vybraná na fúziu a štvrtý raz injikovaná, opísaným postupom (pre tretiu injekciu).
Protilátky v supematantoch získaných kultiváciou hybridómov boli testované nasledujúcim spôsobom. Štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) boli pri teplote 4 °C potiahnuté kozou protilátkou namierenou proti myšacím imunoglobulínom lgA, IgG alebo IgM (Or ganon Teknika) v množstve 50 μΐ/jamka, zriedenou v pomere 1 : 5000 v uhličitanovom pufri s pH = 9,6. Doštičky boli trikrát premyté pufrom PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBST) a bolo do nich pridaných 50 pl supematantu získaného z bunkových kultúr. Po inkubácii prebiehajúcej 30 minút pri teplote 37 °C a premytí, opísaným postupom, bola pridaná kozia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou namierená proti myšaciemu IgG9(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zriedená v pomere 1 : 3500 v roztoku PBST. Misky boli inkubované, opísaným postupom, a štyri razy premyté roztokom PBST. Hneď potom bolo pridaných 100 pl substrátu, ktorý obsahoval o-fenyléndiamín v koncentrácii 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 pl/ml 30 % H2O2 v 100 mM citrátu s pH = = 4,5. Farebná reakcia bola po 5 minútach zastavená prídavkom 50 pl 15 % II2SO4. Absorbancia bola stanovovaná pri vlnovej dĺžke 490 nm na čítačke doštičiek Dynatech.
Supernatant z jamiek obsahujúcich protilátku bol ďalej analyzovaný metódou ELISA pri použití imobilizovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu <XD/HuIgG4. Ako kontrola reaktivity proti fúznemu partnerovi IgG bola použitá metóda ELISA, pri ktorej boli doštičky potiahnuté protilátkou HuIgG4. Na ďalšie testovanie metódou BIP s potkaním slezinným lyzátom boli, opísanými technikami, selektované pozitívne reagujúce jamky.
C. Produkcia polyklonálneho séra namiereného proti fúznemu proteínu doména I potkanieho polypeptidu do/HuIgCá
Dvom králikom bola pred imunizáciou, uskutočňovanou s využitím 100 pg purifikovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu «D/HuIgG4 vo Freundovom kompletnom adjuvans, odobraná krv. Každé tri týždne boli králiky injikované rovnakou dávkou, tentokrát však vo Freundovom nekompletnom adjuvans. Po troch injekciách bola králikom odobraná krv a získané sérum bolo použité na štandardnú imunoprecipitáciu s lyzátom potkaních splenocytov. Sérum z obidvoch králikov bolo imunoreaktívne proti potkaniemu polypeptidu aD. Králiky boli opäť injikované 100 pg antigénu vo Freundovom nekompletnom adjuvans a získané sérum bolo, s cieľom detekcie rastúcej imunoreaktivity, testované imunoprecipitáciou s potkaním aD. Po desiatich dňoch od aplikácie poslednej posilňovacej dávky bola králikom odobraná krv a získané sérum.
Histológia potkanieho aD
Králičie polyklonálne sérum namierené proti doméne I potkanieho polypeptidu aD bolo použité pri imunohistochemickom značení potkaních tkanivových rezov. Toto značenie bolo uskutočňované technikami opísanými v príklade 16. Distribúcia značky, zistená na zmrazených alebo do parafínu zapustených rezoch potkaních slezín, bola v podstate identická s distribúciou pozorovanou pri značení jednotlivých buniek vnútri červenej pulpy protilátkami proti ľudskému aD. Distribúcia značky sa líšila od distribúcie značky pri značení uskutočňovanom pomocou monoklonálnych protilátok namierených proti potkaniemu CDlla, CDllb a CD18. Okrem toho bol pozitívny signál detegovaný pri jednotlivých bunkách v kôre týmusu. Ani jedno z týchto tkanív neposkytlo pozitívny signál pri značení králičím sérom odobraným pred imunizáciou.
D. Analýza špecificity protilátok
Potkany boli usmrtené asfyxiou oxidom uhličitým a ich sleziny boli odobrané štandardnými technikami. Slezinné bunky boli získané jemným pretlačením sleziny pomocou piesta injekčnej striekačky cez drôtené sitko do 20 ml
RPMI média. Bunky boli zozbierané do kónickej banky s objemom 50 ml a premyté vhodným pufŕom.
Bunky boli trikrát premyté roztokom studeného D-PBS a rozsuspendované na hustotu 108 až 109 buniek v 40 ml PBS. K suspenzii buniek boli pridané štyri mg NHS-Biotinu (Pierce) a reakcia prebiehala pri izbovej teplote presne 15 minút. Bunky boli scentrifugované a trikrát premyté studeným D-PBS.
Bunky boli v studenom lyzačnom pufri (zloženie: 1 % NP40; 50 mM Tris-HCl s pH = 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCl2; 2 mM MgCl; roztok pepstatinu, leupeptinu a aprotinu v riedení 1 : 100 pridaný do pufra pred pridaním buniek; a 0,0001 g kryštalického PMSF pridaného do pufra tesne pred pridaním buniek) rozsuspendované na hustotu 108 buniek/ml. Lyzáty boli pretrepávané 30 sekúnd, potom inkubované 5 minút pri izbovej teplote a ďalej 15 minút na ľade. Potom boli centrifúgované 10 minút pri 10 000 x g, aby sa odstránil nerozpustný materiál. Supernatant bol prevedený do novej skúmavky a uchovaný pri teplotách v rozmedzí 4 °C až -20 °C.
Jeden mililiter bunkového lyzátu bol čiastočne prečistený inkubáciou s 200 μΐ suspenzie proteínu A-Sepharózy (Zymed) uskutočňovanou cez noc pri teplote 4 °C. Takto prečistený lyzát bol pre každú testovanú protilátku rozdelený do mikroskúmaviek v objeme 50 μΐ/skúmavka. K lyzátu bolo pridaných 25 μΐ polyklonálneho séra alebo 100 až 500 μΐ supernatantu obsahujúceho monoklonálnu protilátku a táto zmes bola pri stálom trepaní inkubovaná 2 hodiny pri 4 °C. Potom bolo pridaných 100 μΐ králičej protilátky namierenej proti myšaciemu IgG (Jackson) viazanej na gulôčky Sepharózy s proteínom A v PBS a inkubácia pokračovala pri stálom trepaní 30 minút pri izbovej teplote. Po miernej centrifugácii boli guľôčky trikrát premyté studeným premývacím pufŕom (zloženie: 10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1 % Triton X-100). Supernatant bol odstránený odsatím a ku guľôčkam bolo pridaných 20 μΐ 2 x SDS vzorkového pufra obsahujúceho 10 % β-merkaptoetanolu. Vzorka bola ponorená 2 minúty vo vodnom kúpeli a nanesená na 5 % SDS-polyakrylamidový gél pre elektroforézu. Po rozdelení boli proteíny prenesené na nitrocelulózovú membránu. Tento prenos prebiehal cez noc pri konštantnom prúde. Membrána bola blokovaná 1 hodinu pri izbovej teplote v 3 % BSA v pufri TBS-T. Po odstránení blokovacieho pufra bol k vnútrocelulózovej membráne pridaný konjugát streptavidin-HRP (Jackson) v 0,1 % BSA v pufri TBS-T a inkubácia pokračovala ďalších 30 minút pri izbovej teplote. Membrána bola trikrát počas 15 minút premývaná pufŕom TBS-T. Následná autorádiografia bola uskutočnená kitom ECL (Amersham) postupom odporúčaným výrobcom.
E. Produkcia monoklonálnych protilátok namierených proti neskrátenému potkaniemu proteínu aD
Purifikácia potkanieho proteínu aD
S cieľom prípravy imunogénu použiteľného na produkciu monoklonálnych protilátok namierených proti potkaniemu polypeptidu aD bol potkaní protein aD purifikovaný z potkaních slezinných buniek. Sleziny boli izolované z približne 50 normálnych samíc potkanov Lewis starých 12 až 20 týždňov. Jednotlivá bunková suspenzia bola získaná pasírovaním tkaniva cez jemné drôtené sitko. Červené krvinky boli odstránené lýzou v pufri s pH = 7,4 obsahujúcom 150 mM NH4C1, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA a zvyšné leukocyty boli dvakrát premyté pufŕom PBS. Slezinné bunky boli odstredené a lyzované v pufri obsahujúcom 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM PMSF, leupeptín, pepstatin a 1 % Triton X-100. Lyža slezinných buniek prebiehala na ľade počas minút v jednom mililitri lyzačného pufra na 5 x 108 slezinných buniek. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou.
Polypcptidy CD1 la, CD1 lb a CD1 lc boli zo slezinného lyzátu odstránené imunoprecipitáciou uskutočňovanou postupom opísaným ďalej. Počas 30 minút bolo pri teplote 4 °C 750 μΐ suspenzie protein A-Sepharózy inkubovaných s mg králičej protilátky namierenej proti myšaciemu imunoglobulínu. Vzniknutý komplex bol trikrát premytý pufrom a nakoniec rozsuspendovaný v 1,5 ml lyzačného pufra. K 50 ml potkanieho slezinného lyzátu bolo pridaných približne 200 pg každej zo špecifických monoklonálnych protilátok, 515F (špecificky namierená proti potkaniemu CDlla), OX-42 (špecificky namierená proti potkaniemu CDllb) a 100 g (špecificky namierená proti potkaniemu CDllc). Po 30-minútovej inkubácii pri teplote 4 °C bolo k lyzátu pridaných 500 μΐ komplexu králičej protilátky s protein A-Sepharózou a táto zmes bola trepaná pri teplote 4 “C počas 30 minút na trepačke. Lyzát bol centrifiigovaný pri 2500 x g počas 10 minút, aby sa oddelili CDlla, CD1 lb a CD11 c naviazané na komplex králičej protilátky s protein A-Sepharózou. Supernatant bol prevedený do novej centrifugačnej kyvety. Táto imunoprecipitácia s protilátkami 515F, OX-42 a 100 g bola opakovaná ešte dvakrát, aby bolo zaistené kompletné odstránenie CDlla, CDllb a CDllc.
Zvyšné integríny β2 boli z lyzátu izolované pomocou afinitnej chromatografie. K lyzátu bolo pridaných približne 250 μΐ suspenzie obsahujúcej monoklonálnu protilátku 20C5B namierenú proti myšaciemu CD 18 naviazanému na CNBr-Sepharózu a vzniknutý roztok bol pri teplote 4 °C trepaný počas 30 minút na trepačke. Komplex protilátka/antigén bol centrifiigovaný pri 2500 x g počas 10 minút, peleta bola trikrát premytá lyzačným pufŕom a skladovaná pri teplote 4 °C.
Imunizácia arménskych chrčkov
Arménske chrčky, staré šesť až osem týždňov, boli prvý raz imunizované pomocou približne 50 pg rekombinantného proteínu zloženého z domény I potkanieho polypeptidu aD pripojenej k ťažkému reťazcu ľudského IgG4. Tento protein bol pred imunizáciou emulgovaný Freundovým kompletným adjuvans. Následné imunizácie prebehli s rovnakým proteínom emulgovaným vo Freundovom nekompletnom adjuvans 14. deň, 33. deň a 95. deň po prvej imunizácii. Boli uskutočnené dve oddelené fúzie, označené 197 a 199.
Štyri dni pred fuziou 197 (306. deň) bola jednému chrčkovi aplikovaná zmes potkanieho proteínu aD purifikovaného zo slezinných buniek a buniek CHO transfekovaných potkaním aD. Tri dni pred fuziou (307. deň) bola chrčkovi aplikovaná posilňovacia dávka obsahujúca purifikovaný potkaní protein aD a CHO bunky transfekované aD. Transfekcia buniek CHO potkaním aD bola uskutočnená nasledujúcim postupom.
Segment génu kódujúci neskrátený potkaní protein aD bol vložený do vektora pDCl, ktorým boli, spolu s ľudským konštruktom CD18-pRC, elektroporáciou transfekované bunky CHO. Transfekované bunky boli kultivované v prítomnosti hypoxantínu a g418, aby sa vyselektovali bunky úspešne transfekované konštruktom pDCl. Po troch týždňoch boli bunky značené špecifickým polyklonálnym sérom namiereným proti potkaniemu aD a rozdelené s využitím FACS. Malý podiel buniek, ktoré na svojom povrchu mali najvyššiu hladinu expresie polypeptidu aD (približne % populácie), bol separovaný a bunky boli ďalej množené. Tento postup bol niekoľkokrát opakovaný, aby bola
SK 283135 Β6 získaná populácia buniek s najvyššou povrchovou expresiou aD.
Transfekované bunky boli tiež charakterizované prietokovou cytometriou pri použití polyklonálneho séra špecificky namiereného proti potkaniemu polypeptidu aD a monoklonálnej protilátky TS 1.18.1 špecificky namierenej proti ľudskému CDI8. Získané výsledky potvrdili vysokú hladinu expresie obidvoch antigénov na povrchu transfekovaných buniek CHO.
Expresia aD a CD 18 v bunkách bola nakoniec analyzovaná imunoprecipitáciou. Králičie polyklonálne sérum špecificky namierené proti potkaniemu polypeptidu aD imunoprecipitovalo s dvoma proteínmi s rozdielnou molekulovou hmotnosťou. Molekulové hmotnosti boli 170 kDa pre väčší proteín a 95 kDa pre menší proteín. Tieto výsledky boli v súlade s expresiou heterodimérneho komplexu potkanieho ctD/ľudský CD 18 na povrchu transfekovaných buniek CHO.
Deň, keď prebiehala fúzia, bola vybraná slezina. Suspenzia jednotlivých slezinných buniek bola vytvorená rozmelením tkaniva medzi dvoma namrazenými podložnými sklíčkami ponorenými do média RPMI bez prítomnosti séra s prídavkom 2 mM L-glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilínu v koncentrácii 100 jednotiek/ml a streptomycínu v koncentrácii 100 gg/ml (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilné bunkové sitko Nitex s veľkosťou ôk 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola potom rozsuspendovaná v 20 ml média RPMI bez prítomnosti séra. Tymocyty z troch myší Balb/c (neimunizovaných) boli pripravené obdobným spôsobom. Myelómy NS-1, udržiavané počas troch dní pred fúziou v log fáze v médiu RPMI s obsahom 10 % fetálneho séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc. Logan, Utah), boli centrifugované pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá, opísaným postupom.
Približne 1,15 x 108 slezinných buniek bolo zmiešaných s 5,8 x 107 buniek NS-1, scentrifugovaných a supernatant odstránený odsatím. Peleta bola poklepom uvoľnená odo dna kyvety. K bunkovej pelete bolo, pri stálom miešaní počas jednej minúty, pridávaných 7 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50 % roztok v pufri 75 mM HEPES s pH = 8,0) zahriateho na teplotu 37 °C. Potom bolo k bunkovej suspenzii pridaných 14 ml média RPMI bez prítomnosti séra a suspenzia bola miešaná 7 minút. Bolo pridaných ďalších 8 ml média RPMI a bunky boli centrifugované počas 10 minút pri 200 x g. Supematant bol odstránený a peleta bola resuspendovaná v 200 ml média RPMI obsahujúceho 15 % FBS, 100 mM hypoxantín sodný, 0,4 mM aminopterín, 16 mM tymidín (HAT) (Gibco), IL-6 s koncentráciou 25 jednotiek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 106 tymocytov/ml. Suspenzia hala rozdelená do 10-tich 96-jamkových (s plochým dnom) doštičiek na tkanivové kultúry (Corning, Veľká Británia) v objeme 200 μΐ/jamka a bunky boli vyživované 4., 5., 6. a 7. deň odohraním 100 μΐ média z každej jamky 18G-ihlou (Becton Dickinson) a pridaním 100 μΐ čerstvého média, opísaného, ale neobsahujúceho tymocyty.
Desiaty deň bol supematant z jamiek testovaný prietokovou cytometriou, či reaguje s bunkami CHO transfekovanými heterodimérom potkaní aq'ľudský CD1B. Približne 5 x 103 buniek CHO transfekovaných potkaním aD bolo rozsuspendovaných v 50 gl média RPMI obsahujúceho 2,0 % FBS a 0,05 % azid sodný a na 96-jamkových doštičkách s jamkami s guľatým dnom pridaných k 100 gl supernatantu získaného pri kultivácii hybridómov. Pozitívnou kontrolou bolo značenie pomocou králičieho polyklonálne ho séra namiereného proti aD a protilátky TS 1/18 namierenej proti ľudskému CD 18. Bunky boli inkubované 30 minút na ľade, trikrát premyté v pufri FACS (RPMI, 2,0 % FBS, 0,05 % azid sodný) a inkubované 30 minút na ľade s koziou protilátkou značenou FITC namierenou proti chrčím Ig (Jackson Immunol Research Labs) zriedenou v pomere 1 : 200 v pufri FACS. Bunky boli trikrát premyté v pufri FACS a resuspendované v 200 ml tohto pufra. Vzorky boli analyzované na analyzátore FACscan firmy Becton Dickinson. S cieľom potvrdiť, že klony z pozitívne reagujúcich jamiek sú špecifické proti potkaniemu aD, bol celý pokus opakovaný s netransfekovanými bunkami CHO. Klony, ktoré splnili podmienky a reagovali s bunkami CHO transfekovanými potkaním aD, ale nereagovali s netransfekovanými bunkami, boli ďalej pomnožené.
Po primárnom sereeningu boli bunky z pozitívne reagujúcich jamiek pasážované najprv dvojnásobným zriedením a potom medzným zriedením v médiu RPMI obsahujúcom 15 % FBS, 100 mM hypoxantín sodný, 16 mM tymidín a IL-6 v koncentrácii 10 jednotiek/ml. V tomto kroku bolo určené percento jamiek majúcich rast a s využitím Poissonovej distribučnej analýzy bola predpovedaná klonalita. Po 10 až 12 dňoch boli jamky obsahujúce množiace sa populácie analyzované s využitím FACS. Po poslednom pasážovaní boli bunky z pozitívnych jamiek namnožené v médiu RPMI s 11 % FBS. Bola získaná jedna kultúra, ktorá sa podľa týchto kritérií javila ako pozitívna. Z tejto kultúry boli rozrastené subklony označené 197A-1, 197A-2, 197A-3 a 197A-4.
Druhému chrčkovi bolo 307. deň aplikovaných 2,3 x 106 buniek CHO transfekovaných potkaním aD. Dve zavárečné imunizácie boli uskutočnené 4 dni pred fúziou 199 (334. deň) a opäť 3 dni pred fúziou (335. deň). Injekcia zo dňa 334, aplikovaná intraperitoneálne, obsahovala 2 x 10s buniek CHO transfekovaných potkaním aD a 200 gl purifikovanej potkanej podjednotky aD naviazanej k Sepharóze (opísané predtým). Injekcia z 335. dňa, aplikovaná takisto intraperitoneálne, obsahovala 5 x 106 buniek CHO transfekovaných potkaním aD. Postup fúzie a protokol testovania bol rovnaký ako pri fúzii 197. Boli identifikované a pomnožené tri hybridómy označené 199A, 199H a 199M. Hybridom 199M bol 1. marca 1996 uložený v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod prístupovým číslom HB-12058.
Charakterizácia monoklonálnych protilátok proti potkaniemu polypeptidu aD
Aby bola možné charakterizovať protilátky namierené proti potkaniemu aD, boli, postupom opísaným v príklade 18, oddiel D, pripravené biotínom značené slezinné lyzáty. Pred vlastnou imunoprecipitáciou boli lyzáty predčistené. Na začiatku bol k lyzátu pridaný normálny myšací imunoglobulín v koncentrácii 50 gg/ml a výsledná zmes bola počas 30 minút pri teplote 4 °C trepaná na rotačnej trepačke. K tejto zmesi bolo pridaných 75 gl suspenzie proteín A-Sepharózy potiahnutej králičou protilátkou namierenou proti myšacím Ig a trepanie pokračovalo ďalších 30 minút. Guľôčky s naviazanou protilátkou boli odstredené pri 15 000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge. Centrifugácia prebiehala počas 5 minút pri teplote 4 °C. Supematant bol odobraný a peleta odstránená.
Z každého klonu hybridómu bolo do mikroskúmaviek odobraných približne 300 gl supernatantu. K tomuto supernatantu bolo pridaných 30 gl 10 % Tritonu X-100, 30 gl zo 100 x zásobného roztoku pepstatínu, leupeptínu a aprotín, ďalej 100 gg kryštalického PMSF a 50 gl predčisteného biotinylovaného lyzátu z potkanej sleziny. Obsah mikro28 skúmaviek bol mierne pretrepaný a na 30 minút pri teplote 4 °C umiestený na rotačku. Kontrolná vzorka bola pripravená pridaním králičej polyklonálnej protilátky špecificky namierenej proti potkaniemu polypeptidu cm s koncentráciou 10 mg/ml k 50 μΐ potkanieho slezinného lyzátu.
Po 30 minútach inkubácie bolo ku každej vzorke pridaných 75 μΙ suspenzie guľôčok proteín A-Sepharózy v PBS pufri a vzorka bola inkubovaná na rotačke ďalších 30 minút pri teplote 4 °C. Guľôčky Sepharózy boli centrifugované počas 5 minút pri teplote 4 °C pri 15 000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge a supernatant bol odobraný. Guľôčky boli postupne premyté jedným mililitrom z každej z nasledujúcich detergentných vzoriek: pufer #1 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100, pH 8,0; pufer #2 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 % Triton X-100, pH 8,0; pufer #3 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100, 0,1 % deoxycholát, pH 8,0; a pufer #4 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCl, pH 8,0. Posledné premytie bolo uskutočnené pufrom #1. Medzi jednotlivými premytiami boli guľôčky mierne pretrepané na vortexe a odstredené v stolnej centrifúge. Supernatant bol vždy odstránený pipetou a po poslednom premytí bol zvyšný pufer od guľôčok odstránený striekačkou (Hamilton). Ku každej pelete guľôčok bol pridaný alikvót (50 μΐ) SDS vzorkového pufra obsahujúceho brómfenolovú modrú, farbivo Pyronín Y a β-merkaptoetanol s výslednou koncentráciou 10 %. Zmes bola prudko 1 až 2 minúty trepaná a inkubovaná 5 až 10 minút pri izbovej teplote. Vzorky boli centrifugované počas 5 minút pri 15 000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge pri teplote 4 °C a uvoľnený proteín bol prenesený do novej mikroskúmavky. Vzorky boli povarené 4 minúty na vodnom kúpeli a nanesené na 7,5 % SDS polyakrylamidový gél. Po ukončení delenia boli proteíny prenesené na nitrocelulózové fdtre. Transfer prebiehal pri 200 mA počas 1 hodiny. Filtre boli blokované v roztoku 3,0 % BSA v pufri TBS-T cez noc pri teplote 4 °C. Ku každému filtru bol pridaný roztok 0,1 % BSA v pufri TBS-T s obsahom streptavidínu-OPD v riedení 1 : 6000, v ktorom bol ponechaný jednu hodinu pri izbovej teplote. Filtre boli premývané päťkrát vždy 10 minút v pufri TBS-T a ofarbené použitím kitu ECL (Amersham) postupom odporúčaným výrobcom.
Bolo dokázané, že kloň 199M imunoprecipituje heterodimérny proteín. Väčšia proteínová podjednotka mala približnú molekulovú hmotnosť 170 až 175 kDa, čo zodpovedalo veľkosti imunoprecipitovaného kontrolnou králičou protilátkou namierenou proti potkaniemu aD. Druhá imunoprecipitovaná podjednotka mala zdanlivú molekulovú hmotnosť 95 kDa, zhodnú s veľkosťou CD 18.
Príklad 19
Izolácia klonov myšacej cDNA
Bol uskutočnený pokus a izoláciu myšacieho homológu aD·
Pomocou dvoch sond vytvorených metódou PCR bola uskutočnená medzidruhová hybridizácia. Prvou sondou bol fragment s veľkosťou 1 : 5 kb zodpovedajúci bázam 522 až 2047 z ľudského klonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1), druhou sondou bol potkaní fragment s veľkosťou 1,0 kb zodpovedajúci bázam 1900 až 2900 z ľudského klonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1). Ľudská sonda bola vytvorená polymerázovou reťazovou reakciou primárov označených ΛΤΜ-2 a 9-10.1 (SEK. ID. č.: 38, resp. 39). Potkania sonda bola vytvorená s využitím primérov 434L a 434R (SEK. ID. č.: 34, resp. 35), Vzorky boli inkubovaná 4 minúty pri teplote 94 °C a podrobené 30 cyklom s nasledujúcim teplotným režimom: 94 °C, 2 minúty pri 50 °C; 4 minúty pri 72 °C.
5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3' (SEK. ID. č.: 38)
5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3' SEK. ID. č.: 39)
Produkt reakcie PCR bol purifikovaný pomocou kitu Quick Spin firmy Qiagen, postupom odporúčaným výrobcom a približne 180 ng DNA bola pri použití kitu „Random Prime Labeling kiť firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označených 200 pCi [32P]-dCTP. Nenaviazaný izotop bol odstránený pomocou kolóny Centri-sep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Sondy boli pred použitím denaturované 0,2 N NaOH a neutralizované roztokom 0,4 M Tris-HCl s pH = 8,0.
Knižnica cDNA získaná z buniek týmusu s využitím sekvencie oligo-dT ako priméru zabudovaná v lambda ZAP II (Stratagene) bola vysiata v koncentrácii približne 30 000 plakov na 1 misku s priemerom 15 cm. Plaky prenesené na nitrocelulózové filtre (Schleicher & Schuell, Keene, NH) boli pri stálom miešaní inkubované pri teplote 50 °C počas jednej hodiny v prehybridizačnom roztoku (8 ml/prenos) obsahujúcom 30 % formamid. K prehybridizačnému roztoku boli pridané značené ľudské a potkanie sondy a inkubácia pokračovala cez noc pri teplote 50 °C. Filtre boli dvakrát premyté v 2X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote, raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 37 °C a raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 °C. Expozícia filtrov na film Kodak X-Omat AR prebiehala pri teplote -80 °C počas 27 hodín pri použití kontrastného filtra.
Štyri plaky, ktoré poskytli pozitívny signál pri dvakrát opakovanom prenose, boli opäť vysiate na misky s LB médiom s prídavkom horčíka a karbenicilínu v koncentrácii 100 mg/ml a inkubované cez noc pri 37 °C. Fágové plaky boli prenesené na filtre Hybond (Amersham), označené ako v prvom pokuse a exponované na film Kodak X-Omat AR pri teplote -80 °C počas 24 hodín pri použití kontrastného filtra.
Dvanásť pozitívnych plakov bolo prenesených do riediaceho roztoku s nízkym obsahom Mg2+ iónov (10 mM Tris-HCl a 1 mM MgCl2). Veľkosť inzerčného fragmentu bola určená pomocou PCR reakcie s T3 a T7 primérmi (SEK. ID. č.: 13 a 14) pri nasledujúcich reakčných podmienkach. Vzorky boli inkubované pri 94 °C počas 4 minút a vystavené 30 cyklom s týmto teplotným režimom: 15 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 50 °C a 1 minútu pri 72 °C.
Šesť vzoriek poskytlo rozdielne prúžky DNA s veľkosťou od 300 báz do 1 kb. Fágmidy boli uvoľnené pomocou koinfekcie pomocným fágom a prevedením do cyklickej formy bol vytvorený Bluescript SK‘ (Stratagene). Vzniknuté kolónie rástli v LBM médiu s karbenicilínom (lOOmg/ml) cez noc. DNA bola izolovaná pomocou kitu na minipreparáciu DNA „Wizard“ firmy Promega (Madison, WI) podľa návodu výrobcu. Reštrikčná analýza izolovanej DNA enzýmom EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti zodpovedajúce molekulovým hmotnostiam zisteným z PCR. Fragment DNA bol sekvenovaný pri použití priméru M13 a reverzného priméru.l M13, ktorých sekvencie sú zobrazené v SEK. ID. č.: 40, resp. 41.
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEK. ID. i.: 40)
5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3’ (SEK. ID. t.: 41)
Sekvenovanie bolo uskutočňované postupom opísaným v príklade 4.
Len dva zo šiestich klonov, označené 10.3-1 a 10.5-2, poskytli identickú sekvenciu s veľkosťou 600 párov báz. Táto sekvencia bola zo 68 % identická s príslušnou oblas ťou ľudského aD, zo 40 % identická s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, z 58 % identická s príslušnou oblasťou ľudského CD11 c a z 54 % identická s príslušnou oblasťou myšacieho CD1 lb. Tento fragment s veľkosťou 600 bp bol potom využitý na získanie úplnejšej cDNA kódujúcej predpokladaný myšací homológ aD.
Knižnica cDNA z myšacej sleziny (vytvorená s využitím aligo-dT primárov a primérov s náhodnými sekvenciami), zaklonované do fágu lambda Zap II (Stratagene), bola vysiata v koncentrácii 2,5 x 104 fágov na LBM misku s priemerom 15 cm. Plaky boli prenesené na nylonovú membránu Hybond (Amersham), denaturované 0,5 M NaOH s 1,5 M NaCl, neutralizované 0,5 M Tris-HCl s 1,5 M NaCl a premyté v 2X SSC. DNA bola na membráne zosieťovaná ultrafialovým žiarením.
Pomocou sond 10.3-1 a 10.5-2, značených opísaným postupom, bolo testovaných približne 500 000 plakov. Sondy boli pridané do prehybridizačného roztoku a inkubované cez noc pri teplote 50 °C. Filtre boli dvakrát premyté v 2X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote, raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 37 °C a raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 °C. Expozícia filtrov na film Kodak XOmat AR prebiehala pri teplote -80 °C počas 13 hodín pri použití kontrastného filtra.
Osemnásť pozitívnych plakov bolo prenesených do roztoku s nízkym obsahom Mg2+ iónov a veľkosť fragmentu bola určená PCR metódou, opísaným postupom. Každá zo siedmich vzoriek poskytla jediný prúžok DNA s veľkosťou od 600 párov báz do 4 kb. Reštrikčná analýza purifikovanej DNA enzýmom EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, zodpovedajúce molekulovým hmotnostiam zisteným z PCR. Fragment DNA bol sekvenovaný pri použití priméru M13 a reverzného priméru.l M13 (SEK. ID. č.: 40, resp. 41).
Kloň označený B3800 obsahoval inzert s veľkosťou 4kb, ktorý zodpovedal oblasti nachádzajúcej sa 200 báz v smere transkripcie od 5’ konca klonu 19A2 ľudského aD a obsahoval 553 báz 3' neprekladanej oblasti. Kloň B3800 bol zo 77 % identický s príslušnou oblasťou ľudského aD, 44 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, 59 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CDllc a 51 % identický s príslušnou oblasťou myšacieho CDllb. Druhý kloň A1160 mal veľkosť 1,2 kb a zodpovedal 5' koncu kódujúcej oblasti ľudského aD, približne 12 báz v smere transkripcie od iniciačného kodónu pre metionín. Kloň A1160 bol zo 75 % identický s príslušnou oblasťou ľudského aD, 46 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, 62 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CD1 lc a 66 % identický s príslušnou oblasťou myšacieho CDllb.
Kloň Al 160, fragment bližšie k 5' koncu ľudského klonu 19A2, sa prekrýva s klonom B3800 od bázy 205 až k báze 1134. Kloň Al 160 má vložený úsek 110 báz (báza 704 až 814), ktorý nie je v prekrývajúcej sa oblasti klonu B3800. Tento vložený úsek DNA sa najskôr vyskytuje na hranici exónu a intrónu [Fleming a ďalší, J. Immunol. 150 : : 480 až 490 (1993)] a bol pred následným spojením klonov Al 160 a B3800 odstránený.
Rýchla amplifikácia 5' konca cDNA predpokladaného klonu myšacieho aD
S cieľom získať chýbajúcich 5' úsekov predpokladaných klonov myšacieho aD, vrátane 5’ neprekladanej sekvencie a iniciačného metionínu, bola použitá RAČE PCR (Frohman, „RAČE: Rapid Amlification oť cDNA Ends“, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Amplifications, Innis a ďalší, (editori) 28 až 38, Academic Press: NEW
York (1990)]. Myšací slezinný kit „RACE-Ready“ (Clontech, Palo Alto, CA) bol použitý podľa návodu výrobcu. Na uskutočnenie prvej a vnorenej PCR boli vybrané dva Xantisense špecifické priméry (A 1160 RAČE 1-primárny primér a A1160 RACE2-vnorený primér, SF.K. ID. č.: 42, resp. 43).
5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3' (SEK. ID. č.: 42) 5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (SEK. ID. č.: 43)
Priméry, SEK. ID. č.: 42 a 43, zodpovedajú oblastiam začínajúcim 302, resp. 247 bázou ad 5' konca. Pri použití 5' priméru (SEK. ID. č.: 44) a myšacej slezinnej cDNA dodanej v kite bola, opísaným postupom, uskutočnená PCR.
5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3' (SEK. ID. č.: 44)
Elektroforéza produktu PCR reakcie odhalila prúžok s veľkosťou 280 báz, ktorý bol zaklonovaný pomocou klonovacieho kitu TA (Invitrogen), postupom odporúčaným výrobcom. Desať získaných kolónií bolo pomnožených, DNA izolovaná a zistená jej sekvencia. Touto metódou bola identifikovaných ďalších 60 báz 5' sekvencie, ktoré zodpovedajú bázam 1 až 60 v SEK. ID. č.: 45.
Charakteristiky myšacej cDNA a predpokladanej aminokyselinovej sekvencie
Zložená sekvencia myšacej cDNA kódujúcej predpokladaný homológ ľudskej aD je zobrazená v SEK. ID. č.: 45. Aj keď homológia medzi vonkajšími doménami ľudských a myšacích klonov je vysoká, homológia medzi cytoplazmatickými doménami je len 30 %. Pozorované odchýlky môžu naznačovať rozdiel vo funkcii C-koncovej domény medzi ľudskými a myšacími proteínmi. Odlišnosti v cytoplazmatických doménach môžu byť takisto výsledkom rozdielneho zostrihu RNA alebo môžu naznačovať existenciu ďalších génov pre integríny β2.
Aminokyselinová sekvencia proteínu, predpovedaná na základe sekvencie myšacej cDNA, je z 28 % identická s myšacou CD1 la, z 53 % s myšacou CD1 lb, z 28 % s ľudskou CD1 la, z 55 % s ľudskou CD1 lb, z 59 % s ľudskou CD1 lc a zo 70 % s ľudskou aD. Z porovnaní aminokyselinových sekvencií cytoplazmatických domén ľudského polypeptidu aD a predpokladaného myšacieho homológu vyplýva, že síce obsahujú oblasti s rovnakou dĺžkou, ale s odlišnou primárnou štruktúrou. Podobné veľkosti sekvencií v týchto oblastiach predpokladajú skôr druhovú odlišnosť než možnosť vzniku rozdielnych variantov zostrihom. Keď porovnáme myšaciu sekvenciu s predpokladaným potkaním polypeptidom (príklad 16 uvedený skôr), dostávame väčšiu ako 60 % zhodu myšacej a potkanej cytoplazmatickej domény.
Príklad 20
Izolácia ďalších klonov myšacej cDNA aD uskutočňovaná s cieľom potvrdiť sekvencie
Aby bola potvrdená nukleotidová sekvencia a aminokyselinová sekvencia myšacieho aD opísaného v príklade 19, boli izolované ďalšie myšacie sekvencie.
Hybridizácia s dvoma homológnymi aD sondami (od 3' konca a od 5' konca) bola, s využitím tak myšacej slezinnej knižnice vytvorenej pomocou náhodných primérov, ako aj knižnice cDNA vytvorenej pomocou primérov oligo-dT, zaklonovaných do fágu lambda ZAP II (Stratagene), uskutočnená izolácia myšacej cDNA. Knižnica bola nanesená v koncentrácii 5 x 105 fágov/miska na misky s LBM s priemerom 15 cm. Plaky boli prenesené na nylonové membrány Hybond (Amersham). Membrány boli denaturované (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), neutralizované (0,5 M Tris/1,5 M NaCl/11,6 M HCI) a premyté (2X SSC). DNA bola na membránach zosieťovaná pomocou ultrafialového žiarenia.
Sondy boli vytvorené pomocou primérov opísaných v PCR reakcii uskutočňovanej pri nasledujúcich podmienkach. Vzorky boli vystavené 4 minúty teplote 94 °C a potom nasledovalo 30 cyklov s týmto teplotným režimom: 15 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 50 °C a 1 minútu pri 72 °C v cykléri Perkin-Elmer 9600.
3'-Sonda, ktorá bola približne 900 báz dlhá, prekrývala oblasť nukleotidov 2752 a 3651 (v SEK. ID. č.: 1, v smere od 5' k 3') a bola vytvorená pomocou primérov ll.b-l/2FORll a ll.b-l/2REV2 zobrazených v SEK. ID. č.: 69, resp. 74). Táto sonda bola použitá v prvej sérii prenosov.
5'-Sonda, ktorá bola približne 800 báz dlhá, zahrnovala oblasť nukleotidov 145 do 946 (v SEK. ID. č.: 1, v smere ad 5' k 3') a bola bola vytvorená pomocou primérov 11. b1/2FOR1 a Il.a-1/1REV1 zobrazených v SEK. ID. č.: 50, resp. 85). Táto sonda bola použitá v druhej sérii prenosov.
V tretej sérii prenosov boli použité obidve sondy spoločne na rovnakých miskách.
Pomocou obidvoch opísaných sond, značených spôsobom opísaným v príklade 17, bolo testovaných približne 500 000 plakov. Značené sondy boli pridané k prehybridizačnému roztoku 45 % formamidom a inkubované cez noc pri teplote 50 °C. Membrány boli premyté dvakrát v 2X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote (22 °C). Posledné premytie bolo uskutočnené v 2X SSC/0,1 % SDS pri teplote 50 °C. Autorádiografia bola uskutočňovaná 19 hodín pri teplote -80 °C na film Kodak X-Omat AR pri použití kontrastného filtra.
Trinásť plakov pozitívnych najmenej pri dvoch prenosoch bolo podrobených druhému testovaniu, ktoré bolo uskutočnené rovnako ako prvé testovanie, až na dve výnimky. Na hybridizáciu boli použité obidve značené sondy 3' a 5' a bolo pridané záverečné premytie v 2X SSC/0,1 % SDS pri teplote 65 °C . Autorádiografia bola uskutočnená rovnakým opísaným postupom, ale prebiehala len počas 2,5 hodiny.
Trinásť pozitívnych plakov (označených MS2P1 až MS2P13) bolo prenesených do riediaceho roztoku s nízkym obsahom horečnatých iónov. Veľkosť inzertu bola stanovená metódou PCR (cyklér Perkin-Elmer 9600) pri použití primérov T3 a T7, ktoré prisadajú k fágmidu Bluescript zabudovanému vo vektore ZAP II (sekvencia už predtým opísaná). Podmienky PCR boli rovnaké, ako bolo opísané skôr. Veľkosti prúžkov DNA sa pohybovali ad 500 párov báz do 4 kb. Fágmidy boli izolované a sekvenované s využitím priméru M13 a reverzného priméru.l M13 (SEK. ID. č.: 40, resp. 41). Päť z trinástich klonov (MS2P-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12 a MS2P-13) bolo sekvenovaných a po zložení reprezentovali oblasť od bázy 200 na 5' konci až k 300. báze za prvým stop kordónom na 3' konci.
S cieľom zistiť sekvencie koncov všetkých klonov a určiť ich relatívnu pozíciu proti konštruktu #17 (SEK. ID. č.: 45) bolo, postupom rovnakým ako v príklade 4, uskutočnené automatické sekvenovanie s využitím priméru M13 a reverzného priméru.l M13 (SEK. ID. č.: 40, resp. 41). Každý kloň bol potom úplne sekvenovaný použitím vhodných primérov (uvedených ďalej) pre konkrétne oblasti.
11.b-1Z2FOR1 5'-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3' (SEK. ID. Č: 50) .a-1/1 FOR2 5’-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3’ (SEK. ID. Č: 60)
11.a-1/1 FOR3 5'-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3' (SEK. ID. Č: 61)
I l.b-l/2FOR4 5'-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3' (SEK. ID. Č: 62)
II ,b-l/2FOR5 5'-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3' (SEK ID. Č: 63) ,b-lZ2FOR6 5'-CAGATCGGCTCCTACTITGG-3' (SEK. ID: Č: 64)
l.b-l/2FOR7 5'-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3' (SEK. ID. Č: 65)
I l.b-l/2FOR8 5'-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3' (SEK. ID. Č: 66)
II ,b-l/2FOR9 5'-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3' (SEK. ID.Č: 67) .b-l/2FOR10 5'-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3' (SEK. ID. Č: 68) .b-l/2FORl 1 5'-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3' (SEK. ID. Č: 69) b-1Z2FOR12 5’-GTCACAGAGGGAACCTCC-3' (SEK. ID. Č: 70)
I l.b-l/2FOR13 5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3' (SEK. ID.Č: 71)
II b-l/2FOR14 5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3' (SEK. ID.Č: 72) .M/2FOR15 5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3' (SEK. ID.Č: 73)
I l.b-l/2REV2 5'-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3' (SEK. ID. Č: 74) ll.b-l/2REV3 5'-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3' (SEK. ID. Č: 75)
II .M/2REV4 5'-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3' (SEK ID. Č: 76) ,b-l/2REV5 5'-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3' (SEK. ID. Č: 77) ll .b-l/2REV6 5'-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3' (SEK. ID. Č: 78) ,b-l/2REV7 5’-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3' (SEK. ID. Č: 79) .b-l /2REV8 5'-GATCCAACGCCAGATCATACC-3' (SEK. ID. Č: 80)
l.b-l/2REV9 5'-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3'(SEK. ID. Č: 81)
l.b-l/2REV10 5'-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3' (SEK. ID. Č: 82) .b-l/2REVl 1 5'-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3' (SEKID. Č: 51) ,b-l/2REV12 5'-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3' (SEK. ID. Č: 83)
l.b-l/2REV13 5’-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3' (SEK. ID. Č: 84)
Il.a-1/1REV1 5’-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3' (SEK. ID. Č: 85)
11. a-1/1 REV2 5'-GCC1TGGAGCTGGACGATGGC-3' (SEK. ID. Č: 86)
Sekvencie boli upravené, priradené a porovnané s predtým izolovanými sekvenciami myšacieho aD (konštrukt# 17, SEK. ID. č.: 45).
Priradenie nových sekvencii odhalilo v konštrukte # deléciu 18 báz, ktorá začínala od nukleotidu 2308. Táto delécia nezapríčinila posun čítacieho rámca. Kloň MS2P-9 obsahoval rovnakú deléciu s dĺžkou 18 báz. Výskyt tejto delécie bol pozorovaný pri 50 % myšacích klonov obsahujúcich túto oblasť, ale táto delécia nebola zistená v potkaních ani ľudských klenoch podjednotky tiD. Delécia 18 báz je charakterizovaná palindrómovou sekvenciou 12 báz AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEK. ID. č.: 91). Táto inverzná repetícia je komplementárna sama k sebe a môže vytvoriť slučku, ktorá spôsobuje štiepenie počas reverznej transkripcie. Sekvencia myšacieho aD, ktorá obsahuje navyše 18 báz, je zobrazená v SEK. ID. č.: 52; odvodená aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 53.
Príklad 21
In situ hybridizácia u myší
Distribúcia myšacích aD v tkanivách bola určená preto, aby mohlo byť uskutočnené jej porovnanie s distribúciou ľudského aD, opísaného v príklade 6.
Pomocou transkripcie RNA uskutočňovanej in vitro s použitím 35S-UTP (Amersham) bola z templátu DNA získaná jednovláknová sonda mRNA s veľkosťou 200 bp, zodpovedajúca nukleotidom 3480 až 3707 v cytoplazmatickej oblasti myšacej cDNA.
Celé myšacie embryá (odobrané 11 až dní 18 dní po oplodnení) a rôzne myšacie tkanivá (slezina, oblička, pečeň, črevo a týmus) boli in situ hybridizované s rádioaktívne značenou jednovláknovou sondou mRNA.
Z tkanív boli pripravené rezy s hrúbkou 6 pm, ktoré boli adherované na sklíčka potiahnuté prípravkom Vectabond (Vector Laboratories. Inc., Burlingame, CA) a uložené pri teplote -70 °C. Pred použitím boli sklíčka vystavené 5 minút teplote 50 °C. Rezy boli počas 20 minút pri teplote °C fixované v 4 % paraformaldehyde, dehydratované zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu (70-95-100 %) (1 minútu pri teplote 4 °C pre každú koncentráciu) a vysušené na vzduchu (30 minút pri izbovej teplote). Rezy boli denaturované 2 minúty pri teplote 70 °C v roztoku 70 % formamid/2X SSC, dvakrát prepláchnuté v 2X SSC a dehydratované etanolom (opísaným postupom) a 30 minút vysúšané na vzduchu. Hybridizácia bola uskutočnená cez noc (12 až 16 hodín, pri teplote 55 °C v roztoku obsahujúcom sondu značenú izotopom 35S v koncentrácii 6 x 105 cpm na rez a vodu (vystavenú účinkom dietylpyrokarbonátu - DEPC) tak, aby bola dosiahnutá koncentrácia 50 % formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 10 % dextrán sulfát, IX Denhardtov roztok, 100 mM ditiotreitol (DTT) a mM EDTA. Po hybridizácii boli rezy premývané 1 hodinu pri izbovej teplote v 4X SSC/10 mM DTT, 40 minút pri 60 °C v 50 % formamidu/2X SSC/10 mM DTT, 30 minút pri izbovej teplote v 2X SSC a 30 minút pri izbovej teplote v 0,lX SSC. Rezy boli dehydratované, počas 2 hodín vysúšané na vzduchu, potiahnuté fotografickou emulziou Kodak NTB2, vysúšané 2 hodiny na vzduchu, vyvolané (uchovanie pri 4 °C v úplnej tme) a dofarbené hematoxylínom/eozínom.
Slezinné tkanivové malo silný signál hlavne v červenej pulpe. Táto distribúcia signálu zodpovedá distribúcii tkanivových makrofágov v slezine, ale nevylučuje prítomnosť iných typov buniek.
Príklad 22 Príprava myšacích expresívnych konštruktov
Aby mohol byť vytvorený expresívny plazmid obsahujúci sekvenciu myšacej cDNA majúcu homológiu k ľudskej uD, aby boli spojené inzerty klonov Al 160 a B3800. Pred ligáciou bola k inzertu z klonov Al 160 pridaná vedúca („leader“) sekvencia obsahujúca na 5' konci kodón pre iniciačný metionín. Primér označený ,,5'-PCR leader“ (SEK. ID. č.: 47) bol navrhnutý tak, aby obsahoval: (1) identické nešpecifické bázy na pozíciách 1 až 6 umožňujúce štiepenie; (2) reštrikčné miesto BamHI od pozície 7 až 12 umožňujúce zaklonovanie do expresného vektora; (3) konzervatívnu Kozákovu sekvenciu od pozície 13 do 18; (4) signálnu sekvenciu obsahujúcu kodón pre iniciačný metionín (hrubo v SEK. ID. č.: 47) a ďalších 31 báz špecificky prekrývajúcich sekvenciu na 5' konci klonu A1160, aby bolo umožnené prisadnutie priméru. Na amplifikáciu inzertu z klonu Al 160 bol spolu s primérom ,,5'-PCR leader“ použitý druhý primér nazvaný ,,3'-end frag“ (SEK. ID. č.: 48).
5'-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3' (SEK. ID. í.: 47)
5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3' (SEK. ID. č.: 48)
Vzniknutý PCR produkt nebol štiepený reštrikčným enzýmom BanHI pravdepodobne preto, že pred reštrikčným miestom bol nedostatočný počet báz, čo znemožnilo rozpoznanie miesta enzýmom. Pokiaľ ide o 5'-primér, bola predĺžená dĺžka sekvencie predchádzajúcej miesto pre BamHI (SEK. ID. č.: 47) a s amplifikovaným produktom prvej sekvencie bola opakovaná PCR reakcia. 5'-Primér označený mAD.5'.2 (SEK. ID. č.: 49) bol vytvorený pridaním nešpecifických báz na pozícii 1 až 4 a ďalších 20 báz špecificky prekrývajúcich predtým použitý „5-PCR leader“ primér.
5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3' (SEK. ID. č.: 49)
Priméry „mAD.5'.2“ a ,,3'-end frag“ boli spoločne použité v PCR reakcii, kde bol templátom produkt z prvej amplifikačnej reakcie. Vzniknutý druhý PCR produkt bol zaklonovaný do plazmidu pCRtmII (Invitrogen), podľa návodu odporúčaného výrobcom a vzniknutým plazmidom boli transformované kompetentné bunky „One shot“ (Invitrogen). Analýzou reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI bol identifikovaný jeden kloň, ktorý obsahoval PCR produkt a tento kloň bol sekvenovaný. Po overení bol inzert vyštiepený reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI a izolovaný z gélu.
Inzert z klonu B3800 bol získaný reštrikčným štiepením enzýmami EcaRI a Nôti a následnou izoláciou z gélu. Tento inzert bol, spolu s fragmentom Al 160 rozštiepeným reštrikčnými enzýmami BamHI/EcoRI, pridaný do ligačnej reakcie, ktorá prebiehala 14 hodín pri teplote 14 °C. K ligačnej reakcii bol pridaný vektor pcDNA.3 (Invitrogen), štiepený enzýmami BamHI a Nôti a reakcia pokračovala ďalších 12 hodín. Z reakčnej zmesi bol odobraný alikvót, ktorým boli transformované kompetentné bunky E. coli. Vzniknuté kolónie boli namnožené a s využitím primérov 1 l.b-l/2FORl a ll.b-l/2REVll (SEK. ID. č.: 50, resp. 51) bol analýzou PCR identifikovaný jeden pozitívny kloň. Priméry ll.b-l/2FORl a 1 l.b-l/2REVl 1 premosťujú fragmenty A1160 a B3800 a teda slúžia na detekciu úspešnej ligácie obidvoch fragmentov (vznik PCR produktov). Sekvencia pozitívneho klonu bola overená pomocou primérov (zobrazené v SEK. ID. č.: 50 a 51), ktoré amplifikujú od bázy 100 do 1405 za kodónom pre štartovný metionín.
SK 283135 Β6
Príklad 23
Konštrukcia „knockoutovaných“ myší
Aby bolo možné presnejšie určiť imunologickú úlohu proteínu kódovaného predpokladanou myšacou cDNA, bola vytvorená „knockoutovaná“ myš, v ktorej organizme je sekvencia genómovej DNA kódujúcej homológ aD prerušená pomocou homológnej rekombinácie. Na význam proteínu kódovaného porušeným génom je usudzované z jeho neprítomnosti. Produkcia „knockoutovaných“ myší je opísaná v publikácii Deng a ďalší, Mol. Celí. Biol. 13 : :2134 až 2140 (1993).
Prvým krokom pri produkcii takýchto myší je konštrukcia plazmidu, ktorý v sebe obsahuje sekvencie, ktoré budú vyradené („knockoutované“) homológne rekombinácie. Na identifikáciu myšacej genómovej sekvencie kódujúcej predpokladaný myšací homológ aD genómovej knižnice lambdaFIXII bol použitý fragment myšacej cDNA s veľkosťou 750 báz (zodpovedajúci nukleotidom 1985 až 2733 v SEK. ID. č.: 45). Výsledkom prvého testovania bolo 14 pozitívnych plakov, z ktorých sedem bolo potvrdených druhým testovaním. Z dvoch plakov boli získané lyzáty dávajúce najsilnejší signál a lambda DNA bola izolovaná pomocou konvenčných metód. Reštrikčné mapovanie a Southernova analýza potvrdili hodnovernosť jedného z klonov (označený 14-1). Inzert DNA bol reštrikčné štiepený enzýmom Nôti a zaklonovaný do vektora Bluescript SKII+.
Na identifikáciu reštrikčného enzýmu s veľkosťou približne 9 až 14 kb, čo je dĺžka udávaná ako optimálna na uskutočnenie homológnej rekombinácie, bola s cDNA sondou s veľkosťou 750 bp uskutočnená Southemova hybridizácia. Pred hybridizáciou bola pre kloň 14-1 vytvorený fragment s veľkosťou 12 kb, ktorý bol zaklonovaný do vektora pBluescript SK ΙΓ do pozície, kde je myšacia DNA ohraničená kazetami kódujúcimi tymidín kinázu. Ďalšia analýza tohto klonu pomocou sondy domény I (zodpovedajúcej nukleotidom 454 až 1064 v SEK. ID. č.: 45) ukázala, že tento kloň neobsahuje kódujúcu doménu I.
Genómová knižnica lambdaFIXII bola opäť testovaná použitím rovnakej sondy domény I. Zo šiestich pozitívnych klonov zostal jeden pozitívny aj po druhom testovaní. DNA izolovaná z tohto klonu silne reagovala pri Southemovej analýze so sondou domény I. Pri použití pôvodnej sondy s veľkosťou 750 bp nebola delegovaná žiadna odpoveď, ale bolo zistené, že tento kloň zahrnuje nukleotidy 1985 až 2773 v 5' oblasti zo SEK. ID. č.: 45.
Neexistencia hybridizácie so sondou s veľkosťou 750 bp môže tiež naznačovať, že tento kloň je ďalším členom z rodiny integrínových proteínov. Z dôvodu overenia vierohodnosti tohto vysvetlenia bol inzert s veľkosťou 13 kb zaklonovaný do vektora pBluescript SKI1+. Pri použití primárov zodpovedajúcich nukleotidovým sekvenciám 441 až 461, 591 až 612, 717 až 739 a nukleotidovej sekvencii 898 až 918 v reverznej orientácii v doméne I aD (SEK. ID. č.: 52) bola zistená sekvencia purifikovanej DNA. Sekvencia DNA bola získaná len pri použití prvého priméru (441 až 461) a účinne amplifikovaný bol len exón nachádzajúci sa najbližšie 5' koncu sekvencie domény I. Amplifikácia zvyšku domény I neprebehla. Výsledný kloň teda obsahuje exón šesť génu myšacieho aD a sekvencie intrónov priľahlých k 3' a 5' koncu tohto exónu. Exón 7 nebol v tomto klone prítomný. Po sekvenovaní bol vytvorený konštrukt obsahujúci gén pre rezistenciu na neomycín a gén pre tymidín kinázu.
Gén pre rezistenciu na neomycín (ncor) bol vnesený do plazmidu spôsobom, ktorý prerušil sekvenciu genómovej myšacej DNA kódujúcej proteín. Vzniknutý plazmid teda obsahuje gén neor vnútri sekvencie myšacej genómovej
DNA a to všetko je vnútri oblasti kódujúcej tymidín kinázu. Takto skonštruovaný plazmid je vyžadovaný preto, aby bola uprednostnená homológna rekombinácia pred náhodnou rekombináciou [Chisaka a ďalší, Náture 355 : 516 až 520(1992)].
Príklad 24
Klonovanie králičieho aD - vytvorenie a testovanie králičej cDNA knižnice
Nájdenie ľudských homológ aD v organizme potkanov a myší viedlo k výskumu existencie králičieho homológu, ktorý by mohol byť užitočný v králičích modeloch opísaných ľudských chorôb.
Pomocou kitu FastTrack firmy Invitrogen (San Diego, CA), podľa návodu uvedeného výrobcom a reakčných činidiel dodaných v kite bola z celej králičej sleziny pripravená poly-A+ RNA. Z 1,65 g tkaniva bolo izolovaných 73 pg poly-A+ RNA. Táto RNA z králičej sleziny bola použitá na konštrukciu cDNA knižnice ZAP Express s využitím kitu od firmy Stratagene (La Jolla, CA). Získaná cDNA bola smerovo zaklonovaná do reštrikčných miest EcoRI a Xhol v lambda ramenách fágmidového vektora pBK-CMV. Na zabalenie lambda ramien do fágových častíc bol použitý kit „Gigapack II Gold“ (Stratagene). Titer vzniknutej knižnice bol odhadnutý na približne 8 x 105 častíc, s inzertom s priemernou veľkosťou 1,2 kb.
Knižnica bola raz amplifikovaná tak, aby narastené plaky boli konfluentné a bunkový lyzát bol zozbieraný. Namnožená knižnica transformovaná do E. coli bola vysiata v koncentrácii 30 000 pfu/miska (priemer 150 mm) a vzniknutá zmes bola inkubovaná 12 až 16 hodín pri teplote 37, aby došlo k vytvoreniu plakov. Fágové DNA boli prenesené na nylonové membrány Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights, Ilinois). Membrány boli hybridizované so zmesou dvoch rádioaktívne značených sond myšacieho aD PCR DNA pripravených pomocou primárov s náhodnou sekvenciou. Prvá sonda bola získaná z PGR produktu, ktorý zahrnuje nukleotidy 149 až 94B v SEK. ID. č.: 52. Druhá sonda bola získaná z PCR produktu, ktorý zahrnuje nukleotidy 2752 až 3651 v SEK. ID. č.: 52. Sondy boli pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označené a reakčná zmes bola nanesená na kolónu Sephadex G-50, aby boli odstránená nezainkorporované nukleotidy. Hybridizačný roztok sa skladal z 5X SSPE, 5X Denhardtovho činidla, 1 % SDS, 40 % formamidu a zo zničených sond v koncentrácii 1 x 106 dpm/ml. Hybridizácia prebiehala počas 16 až 18 hodín pri teplote 42 °C. Membrány boli intenzívne premyté v 2X SSPE/0,1 % SDS pri izbovej teplote a exponované na rôntgenový film, aby došlo k vizualizácii všetkých hybridizovaných plakov.
Boli identifikované dva klony, ktoré mali vysoký stupeň sekvenčnej homológie so sekvenciou ľudského aD. Kloň #2 bol približne 800 bp dlhý a mapoval 5' koniec ľudského aD. Kloň #2 obsahuje kodón pre štartovný metionín a kompletnú vedúcu sekvenciu. Kloň #7 bol približne 1,5 kb dlhý a zahrnuje kodón pre štartovný metionín. 5' koniec klonu #7 prekrýval kloň #2, zatiaľ čo sekvencie na 3' koncoch končili v miestach za sekvenciami domény I. Kloň #7 bol kompletne osekvenovaný pomocou sekvenačnej metódy „primer-walking“ Nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia klonu #7 sú zobrazené v SEK. ID. č.: 100, resp. 101.
Predpovedaná N-koncová aminokyselinová sekvencia pre králičí aD, ako bola určená z klonov #2 a #7, naznačila, že tento protein je zo 73 % identický s ľudským aD> z 65 % identický s myšacím aD a z 58 % identický s myšacím
CD1 lb, ľudským CD1 lb a ľudským CD11c. Nukleotidová sekvencia klonu #2 je zobrazená v SEK. ID. č.: 92; predpovedaná aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 93.
S využitím rádioaktívne značeného králičieho klonu #7 a opätovného testovania cDNA knižnice, z ktorej tento fragment pochádzal, bol uskutočnený pokus o získanie neskrátenej cDNA kódujúcej králičí aD. Bolo identifikovaných ďalších 25 klonov a najdlhší bol kloň označený ako #49. S využitím techniky sieťových delécií bola zistená kompletná sekvencia klonu #49. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia klonu #49 sú zobrazené v SEK. ID. č.: 102, resp. 103. Keďže sa klony #7 a #49 neprekrývajú, boli oligonukleotidy, ktoré by mohli byť použité ako priméry pri PCR s prvým reťazcom slezinnej cDNA; cieľom tohto postupuje izolácia chýbajúcej sekvencie.
Vzťah medzi predpokladanými aminokyselinovými sekvenciami týchto dvoch neúplných klonov a ostatných leukointegrínov je opísaný v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Percento zhody v aminokyselinovej sekvencií u členov rodiny integrinov β2
ľudská | králičia #7 králičia #49 | ||
ľudská «d | 100 | 74 | ΘΟ |
myšacia | 70 | 67 | 74 |
potkania | 70 | 66 | 73 |
myšacia CDlla | náhodná* | 2Θ | 29 |
myšacia | 55 | 59 | 53 |
ľudská CDlla | 36 | 28 | 28 |
ľudská CDllb | 60 | 58 | 55 |
ľudská CDllc | 66 | 59 | 62 |
* ak je zhoda < 25 %, považuje sa táto zhoda za náhodnú
Izolácia klonov králičej aD umožňuje expresiu proteinu, a to buď na povrchu transfekovaných buniek, alebo vo forme rozpustného neskráteného alebo skráteného proteinu. Získaný proteín je potom použitý ako imunogén na produkciu monoklonálnych protilátok, ktoré nájdu uplatnenie v králičích modeloch ľudských chorôb.
Príklad 25
Živočíšne modely na určenie terapeutickej využiteľnosti aD Imunohistologickc dáta získané u psov a in situ hybridizácia u potkanov a myší určili, že aD je exprimovaný hlavne makrofágmi prítomnými v červenej pulpe sleziny. V miazgových uzlinách bol aD nájdený v kapilárach a dutinách v dreni. Distribúcia polypeptidu otD je značne podobná distribúcii, ktorá bola získaná pre dva myšacie antigény rozpoznávané monoklonálnymi protilátkami F4/80 a SK39. Zatiaľ čo biochemická charakterizácia týchto myšacích antigénov ukázala ich odlišnosť od aD, je veľmi pravdepodobné, že aD určuje rovnakú subpopuláciu makrofágov ako myšacie antigény F4/80 a SK39.
U myší bol zistený výskyt SK39+ makrofágov v červenej pulpe sleziny, kde sa najskôr zúčastňujú odstraňovania cudzorodých materiálov z obehu, a v dreni miazgových uzlín [Jutila a ďalší, J. Leukocyte Biol. 54 : 30 až 39 (1993)]. SK39+ makrofágy boli pozorované tiež v miestach akútneho a chronického zápalu. Navyše monocyty infiltrované v dutinách peritonea, v ktorých bol zápal vyvolaný pôsobením tioglykolátu, tiež exprimujú antigén SK39. Súhrnom tieto výsledky naznačujú, že ak sú SK39+ bunky tiež do pozitívne, potom sú tieto bunky zodpovedné za odstránenie cudzorodého materiálu v slezine a zúčastňujú sa pri zápaloch, kde hrajú makrofágy dôležitú úlohu.
Zatiaľ čo funkcia aD zostáva neznáma, iné oveľa lepšie charakterizované integríny β2 sa zúčastňujú mnohých adhéznych dejov, ktoré uľahčujú migráciu buniek, posilňujú fagocytózu a podporujú medzibunkové interakcie. Všetky tieto udalosti vedú k urýchleniu zápalových dejov. Preto je veľmi pravdepodobné, že ovplyvnenie normálnej funkcie aD môže súčasne narušiť priebeh zápalu, kde hrajú makrofágy dôležitú úlohu. Takýto protizápalový účinok by mohol byť výsledkom: a) zamedzenia infiltrácie makrofágov do miest zápalu; b) zamedzenia aktivácie makrofágov v mieste zápalu alebo c) rušenia účinku efektorových funkcií makrofágov, ktoré poškodzujú zdravé hostiteľské tkanivo buď špecifickou autoimunitnou reakciou alebo následkom poškodzovania okolitých buniek.
Medzi choroby, pre ktoré existujú dôkazy o tom, že tu makrofágy hrajú dôležitú úlohu, patrí roztrúsená skleróza, artritída, artérioskleróza štepu, niektoré formy diabetu a zápalové črevné choroby. Pokiaľ ide o živočíšne modely, diskutované ďalej, bolo dokázané, že tieto modely reprodukujú mnoho črt uvedených ľudských porúch. Aby bolo možné určiť, či existuje možnosť liečby príslušných chorôb u ľudí, boli na týchto modelových systémoch testované inhibítory funkcie aD.
A. Artérioskleróza štepu
Transplantácia srdca je teraz, pokiaľ ide o niektoré typy srdcových chorôb v konečnom štádiu, prijímanou formou lekárskeho zákroku. Používanie cyklosporínu A zvýšilo počet preživších prvý rok po transplantácii na 80 %, ale rozvoj progresívnej formy artériosklerózy štepu sa prejavil ako najčastejšia príčina smrti u osôb po prvom roku po transplantácii srdca. Nedávne štúdie ukázali v 36 až 44 % prípadov výskyt artériosklerózy štepu v období troch rokov po transplantácii srdca [Adams a ďalší, Transplantation 53 : 1115 až 1119 (1992); Adams a ďalší, Transplantation 56 : 794 at 799 (1993)].
Pri artérioskleróze štepu sa typicky vyskytujú difúzne, oklúzne a intimálne lézie, ktoré postihujú stenu vencových ciev. V týchto léziách dochádza často k ukladaniu lipidov. Patogenéza artériosklerózy štepu zostáva neznáma, ale pravdepodobne je spojená s histokompatibilitnou odlišnosťou medzi darcom a príjemcom, aje vo svojej podstate vyvolaná činnosťou imunitného systému. Z histologického hľadiska sú oblasti, v ktorých dochádza k zhrubovaniu vnútornej cievnej steny, tvorené predovšetkým makrofágmi, aj keď je tu občas pozorovaná aj prítomnosť T-buniek. Je preto možné, že makrofágy exprimujúce aD, hrajú pri indukcii a/alebo rozvoji artériosklerózy štepu dôležitú úlohu. V takýchto prípadoch by osobám s transplantovaným srdcom, u ktorých existuje riziko rozvinutia artériosklerózy štepu, mohli byť preventívne podávané monoklonálne protilátky alebo nízkomolekuláme inhibítory funkcie aD (napríklad rozpustný ICAM-R).
Aj keď artérioskleróza štepu predstavuje najväčšie ohrozenie života pre pacientov s transplantovaným srdcom, bol výskyt artériosklerózy štepu pozorovaný takisto u pacientov s inými transplantovanými orgánmi vrátane pečene a obličiek. Terapeutické použitie látok blokujúcich funkciu aD by mohlo zabrániť vzniku artériosklerózy štepu u osôb s inými transplantovanými orgánmi a znížiť komplikácie vyplývajúce zo zlyhania transplantovaného orgánu.
Jeden model pre artériosklerózu štepu u potkanov zahrnuje heterotypické srdcové aloštepy transplantované cez menšie histokompatibilné bariéry. Aj keď sú srdcové aloštepy z potkanov Lewis transplantované do organizmu prí jemcov F-344, vyznačujúcich sa vzhľadom na darcov kompatibilitou MHC glykoproteínov I. a II. triedy, 80 % aloštepov prežíva aspoň 3 týždne a 25 % aloštepov prežíva neobmedzene dlhý čas. Pri tomto veľmi nízkom počte odmietnutých štepov sa v srdci darcu vytvárajú artériosklerotické lézie. Arteriálne lézie v aloštepoch starých 120 dní obvykle majú difúzne fibrotické zhrubnutie vnútornej steny cievy, ktoré je na pohľad nerozlíšiteľné od lézií v artériosklerotických štepoch pozorovaných pri odmietnutých ľudských srdcových aloštepoch.
Potkanom sú transplantované srdcia, ktoré sa v menej dôležitých histokompatibilných antigénoch líšia od genotypu príjemcu. Takýmto príkladom sú transplantácie z potkanov Lewis do potkanov F-344. Príjemcom transplantátov sú pravidelne podávané monoklonálne protilátky špecifické proti potkaniemu aD alebo nizkomolekuláme inhibítory aD. Očakáva sa, že táto liečba zníži incidenciu artériosklerózy štepu v neodvrhnutých srdciach darcov. Liečba potkanov pomocou monoklonálnych protilátok alebo nízkomolekulámych inhibítorov nemusí byť obmedzená len na prevenciu. Očakáva sa, že zablokovanie funkcie aD povedie k zmierneniu zápalu sprostredkovaného makrofágmi a umožní zvrat poškodzovania artérií v transplantáte.
B. Artérioskleróza u králikov kŕmených cholesterolom
U králikov, ktoré boli počas približne 12 až 16 týždňov kŕmené diétou s prídavkom cholesterolu, došlo k vzniku lézií na vnútornej strane ciev a tieto lézie pokrývali väčšinu lumenálneho povrchu vzostupného úseku aorty [Rosenfeld a ďalší, Arterioscelrosis 7 : 9 až 29 (1987); Rasenfeld a ďalší, Arteriosclerosis 7 : 24 až 34 (1987)]. Aterosklerotické lézie pozorované u týchto králikov sú miernejšie ako tie isté u ľudí. V týchto léziách je prítomný veľký počet Tbuniek, z ktorých väčšina exprimuje CD45RO, ktorý je markérom pamäťových T-lymfocytov. Približne polovica z infiltrovaných T-buniek exprimuje antigén MHC II. triedy a niektoré exprimujú receptor pre IL-2, čo naznačuje, že mnohé z týchto buniek sa nachádzajú v aktivovanom stave.
Jednou z črt aterosklerotických lézií pozorovaných u králikov kŕmených cholesterolom, ktorá sa ale nevyskytuje v hlodavčích modeloch, je akumulácia lézií bohatých na prítomnosť penových buniek. Predpokladá sa, že vznik penových buniek (makrofágy) je dôsledkom príjmu oxidovaných lipoproteínov s nízkou hustotou (LDL) prostredníctvom špecifických receptorov. Bolo zistené, že oxidované častice LDL sú toxické pre niektoré typy buniek vrátane endoteliálnych buniek a buniek hladkej svaloviny. Príjem týchto potenciálne toxických oxidovaných častíc LDL makrofágmi slúži ako iritant a pomáha aktivovať makrofágy, čo prispieva k vytvoreniu zápalov sprevádzajúcich výskyt aterosklerotických lézií.
Hneď ako boli pripravené monoklonálne protilátky proti králičiemu aD, začala liečba králikov kŕmených cholesterolom. Liečba zahrnovala podávania monoklonálnych protilátok alebo nízkomolekulámych inhibítorov, aby bolo dokázané, že aD + makrofágy sa zúčastňujú na týchto procesoch počas choroby. Dodatočné štúdie by ukázali, že monoklonálne protilátky proti aD alebo nizkomolekuláme inhibítory môžu zvrátiť cievne poškodenia detegované u králikov počas aterogénnej diéty.
C. Inzulín-dependentný diabetes
U potkanov BB sa inzulín-dependentný diabetes samovoľne vyvinul v období medzi 70. až 150. dňom života. Pomocou imunohistochemických analýz bola už v ranom štádiu choroby pozorovaná v Langerhansových ostrovčekoch prítomnosť infiltrovaných MHC II+ a ED1+ makrofá gov. Mnoho makrofágov sa zdá byť zamestnaných fagocytózou bunkových trosiek alebo normálnych buniek. S postupom choroby je pozorovaný stále sa zväčšujúci počet makrofágov infiltrujúcich Langerhansove ostrovčeky a takisto sa zdá, že sa do tohto miesta sústredí veľké množstvo T-buniek a neskôr tiež B-buniek [Hanenberg a ďalší, Diabetológia 32 : 126 až 134 (1989)].
Rozvoj cukrovky u potkanov BB sa zdá byť závislý tak od včasnej infiltrácie makrofágov, ako aj od následného sústreďovania T-buniek. Liečba potkanov BB pomocou častíc oxidu kremičitého, ktoré sú pre makrofágy toxické, bola účinná tým, že zabránila infiltrácii makrofágov do Langerhansových ostrovčekov v skorom štádiu choroby. Bez včasnej infiltrácie makrofágov nenastáva následné poškodenie tkaniva autoagresívnou populáciou lymfocytov. Podávanie monoklonálnej protilátky OX-19 (špecifickej proti potkaniemu CD5) alebo monoklonálnej protilátky OX-8 (špecifickej proti potkaniemu CD8), ktoré blokujú fázu choroby spojenú s T-bunkami, je takisto účinné pri potláčaní rozvoja diabetu.
Centrálna úloha, ktorú majú makrofágy v patológii tohto modelu, robí tento model atraktívnym na testovanie inhibítorov funkcie aD. Potkany geneticky predisponované na rozvinutie inzulín-dependentného diabetu sú liečené monoklonálnymi protilátkami proti aD alebo nizkomolekulámymi inhibítormi a je u nich vyhodnocovaný vývoj choroby. Zabránenie alebo oddialenie nástupu choroby je dôkazom, že aD hrá kľúčovú úlohu v poškodení buniek ostrovčekov spôsobenom makrofágmi.
D. Zápalové črevné choroby (Crohnova choroba, vredovitá kolitída)
Živočíšne modely, použité pri štúdiu zápalovej črevnej choroby (IBD - inflammatory bowel disease), sú zvyčajne vystavené intrarektálnemu podávaniu škodlivých dráždidiel (napríklad kyselina octová alebo kyselina trinitrobenzénsulfónová/etanol). Zápal hrubého čreva vyvolaný týmito látkami je výsledkom chemického alebo metabolického poškodenia a nemá chronický a spontánne recidívny charakter, sprevádzajúci ľudské zápalové črevné choroby. Zdá sa však, že nedávno opísaný model využívajúci subserózne injekcie purifikovaného polyméru peptidoglykánpolysacharid (PG-PS) získaného zo streptokokov skupiny A alebo skupiny D, poskytuje lepší, fyziologicky relevantný model pre ľudské IBD [Yamada a ďalší, Gastroenterology 104: 759 až 771 (1993)].
V tomto modeli je PG-PS aplikovaný do subseróznej vrstvy distálneho hrubého čreva. Vyvolaná zápalová choroba má dve fázy, prvú akútnu fázu tri dni po injekcii, ktorá je nasledovaná spontánnou chronickou fázou o tri až štyri týždne neskôr. Odpoveď neskorej fázy je vo svojej podstate granulomatózna a vedie k zhrubnutiu hrubého čreva, adhéziám, k vzniku uzlíkov a mukóznych lézií. Okrem poškodenia sliznice vedie kolitída (vyvolaná PG-PS) často k artritíde, anémii a granulomatóznej hepatitíde. Extraintestinálne prejavy choroby robia model atraktívnym na štúdium Crohnovej kolitídy, pretože veľké množstvo pacientov s rozvinutou Crohnovou chorobou trpí zápalmi kĺbov a hepatobiliárnymi zápalmi.
Vznik granulomatóznych lézií je dôsledkom chronického zápalu, ktorý vedie k infiltrácii a potom aktivácii buniek z línie monocyty/makrofágy. Výskyt granulomatóznych lézií pri Crohnovej chorobe a pri uvedenom živočíšnom modeli, robí z tohto modelu atraktívny klinický cieľ pre monoklonálne protilátky namierené proti aD a pre iné inhibítory funkcie aD. Pokiaľ ide o inhibítory funkcie aD, očakáva sa zamedzenie tvorby lézií sprevádzajúcich IBD či dokonca zvrat v tkanivových poškodeniach vyskytujúcich sa pri tejto chorobe.
E. Artritída
Zdá sa, že artritída je multifaktoriálna choroba, na ktorej sa zúčastňujú rôzne typy buniek zápalu, vrátane neutrofilov, T-lymfocytov a fagocytárnych makrofágov. Aj keď existuje množstvo modelov artritídy, aplikácia proteglykánu získaného z bunkovej steny streptokokov spôsobuje poruchu najviac podobnú ľudskej chorobe.
V organizme potkanov vyvoláva bunková stena streptokokov zápal periférnych kĺbov, ktorý je charakterizovaný opakovanými záchvatmi postupujúcej choroby nasledovanými remisiami a nakoniec, počas niekoľkých mesiacov, končí deštrukciou kĺbov [Cromartie a ďalší, J. Exp. Med. 146 : 1585 až 1602 (1977); Schwab a ďalší, Infection and Immunity 59 : 4436 až 4442 (1991)]. Predpokladá sa, že najväčšiu úlohu v deštrukcii synovie hrajú počas chronickej fázy choroby mononukleárne fagocyty a makrofágy. 0krem toho látky potláčajúce infiltráciu makrofágov do synovie účinne znižujú zápalové a patologické charakteristiky artritídy.
Centrálna úloha makrofágov pri deštrukcii synovie vedúcej k artritíde naznačuje, že monoklonálne protilátky proti aD a inhibítory funkcie aD môžu byť pri liečbe tejto choroby terapeuticky účinné. Rovnako ako pri opísaných modeloch sa predpokladá, že tieto monoklonálne protilátky a nízkomolekuláme inhibítory podávané preventívne zablokujú alebo zmiernia kĺbny zápal a zabránia zničeniu synovie. Látky majúce rušivý vplyv na funkciu aD môžu takisto zmierniť prebiehajúci zápal tým, že zabránia infiltrácii ďalších makrofágov ku kĺbu a zablokujú aktiváciu makrofágov. Výsledným efektom by bol zvrat postupujúcej deštrukcie kĺbu a uľahčenie uzdravenia tkaniva.
F. Roztrúsená skleróza
Aj keď patogenéza roztrúsenej sklerózy (MS) zostáva nejasná, je všeobecne prijímané, že choroba je sprostredkovaná CD4+ T-bunkami, ktoré rozpoznávajú autoantigény prítomné v centrálnom nervovom systéme a začínajú tak zápalovú kaskádu. Vzniknutá imunitná odpoveď má za následok infiltráciu ďalších buniek zápalu, vrátane aktivovaných makrofágov, ktoré prispievajú k rozvoju choroby. Živočíšny model experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE) reprodukuje niektoré aspekty choroby MS. Nedávno bolo dokázané, že monoklonálne protilátky reagujúce s CD1 lb/CD18 prítomnými na makrofágoch spôsobujúcich zápal [Huitinga a ďalší, Eur. J. Immunol. 23 : 709 až 715 (1993)] blokujú tak klinické, ako aj histologické príznaky choroby. Výsledky napovedajú, že monoklonálne protilátky alebo nízkomolekuláme inhibítory polypeptidu aD sú pravdepodobne Pri chorobe EAE účinné v blokovaní zápalovej reakcie. Tieto látky majú teda dôležité terapeutické uplatnenie pri liečbe MS.
G. Alveolitida vyvolaná imunitným komplexom (Immune Complex Alveolitis)
Alveolárne makrofágy lokalizované v alveolách, kanálikoch, spojivovom tkanive a pohrudničných dutinách pľúc, predstavujú prvú obrannú líniu pľúc proti látkam vdychovaným z okolitého prostredia. Ako odpoveď na simuláciu látkami (bakteriálny liposacharid, intergerón IFN-τ a imunitný komplex) produkujú alveolárne makrofágy mnohé silné mediátory zápalu, vrátane veľmi reaktívnych kyslíkových radikálov a dusíkatých medziproduktov. Zatiaľ čo hyperoxidové anióny, peroxidy vodíka a oxidy dusíka (NO’) majú dôležitú funkciu pri ničení patogénov a lýze nádorov, môžu tieto látky v zdravých tkanivách spôsobiť ich poškodenie.
Pre potkaní model alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom bolo dokázané, že produkcia NO' alveolárnymi makrofágmi spôsobuje mnohé z poškodení pľúc [Mulligan a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 : 638 až 6342 (1991)]. Radikály NO' vykonávajú funkciu mediátorov aj pri iných poškodeniach spojených s imunitným komplexom, vrátane dermálnej vaskulitídy [Mulligan a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 : 638 až 6342 (1991)] a mohli by potenciálne hrať úlohu pri chorobách, ako je napríklad glomerulonefritída.
Poškodenia spôsobené NO nie sú obmedzené len na zápaly s účasťou imunitného komplexu. Napríklad mikrogliálne bunky stimulované látkami, ako je PMA, LPS alebo IFN-τ, produkujú NO v množstve schopnom usmrtiť oligodendrocyty [Merrill a ďalší, Immunol. 151 : 2132 (1993)]. Bolo zistené, že pankreatické ostrovčeky sú citlivé k radikálom N0‘ a uvoľňovanie tohto mediátora makrofágu spôsobilo poškodzovanie tkanív, ktoré viedlo k diabetu [Kroncke a ďalší, BBRC 175 : 752 až 758 (1991)]. Nedávno bolo presvedčivo dokázané, že produkcia NO' hrá dôležitú úlohu pri endotoxickom šoku [MacMicking a ďalší, Celí 81 : 641 až 650 (1995)]. Keď bol aplikovaný lipopolysacharid (LPS) zdravým myšiam divokého typu, bol pozorovaný vážny progresívny pokles tepnového tlaku končiaci smrťou. Pokiaľ ide o myši, u ktorých nie je možné indukovať tvorbu NO’, bol v reakcii na prítomnosť LPS pozorovaný oveľa menší pokles tepnového tlaku a všetky myši tento experiment prežili.
Pokusy uskutočňované in vitro ukázali, že zablokovanie aD je účinné pri potlačení niektorých aspektov aktivácie makrofágov (alebo všeobecne leukocytov exprimujúcich aD), vrátane uvoľňovania N0‘. Alveolárne makrofágy stimulované za prítomnosti polyklonálneho séra proti aD (proti potkanej doméne I polypeptidu aD1 pripravenej v králikoch) produkovali podstatne menej dusitan/dusičnanových produktov pri odbúravaní NO’, než makrofágy vystavené pôsobeniu kontrolného séra. Tieto zistenia dokazujú, že monoklonálne protilátky namierené proti aD, konkrétne proti I-doméne, môžu byť účinnými protizápalovými činidlami s možným využitím pri MS, diabete, zápale pľúc a endotoxickom šoku. Navyše, v protiklade k CD18 podjednotke, ktorá ovplyvňuje funkciu mnohých typov leukocytov, obmedzená distribúcia aD robí z tejto podjednotky oveľa atraktívnejší cieľ (ako je to pri CD 18) pre blokovanie aktivácie makrofágov (alebo všeobecne leukocytov exprimujúcich aD).
Alveolitida vyvolaná potkaním IgG imunitným komplexom je všeobecne používaný experimentálny model dôležitý pre porozumenie akútnemu poraneniu pľúc. Toto poranenie je vyvolané nakvapkaním protilátok namierených proti hovädziemu sérovému albumínu (B SA) do pľúc pomocou tracheálnej kanyly, nasledovaným intravenóznou injekciou BSA. Sformovanie imunitných komplexov v pľúcnych kapilárach vedie k aktivácii komplementu a infiltrácii neutrofilov do pľúc. Podľa všetkého, po sformovaní imunitných komplexov v pľúcach, dôjde k extravazácii leukocytov z krvi a následnému pohybu leukocytov cez pľúcny epitel. Následné uvoľnenie mediátorov vrátane radikálov, TNF-α a NO’ z aktivovaných endoteliálnych buniek neutrofilov a makrofágov, prispieva k postupu choroby. Patologické črty choroby zahrnujú zväčšenie vaskulárnej permeability vedúce k opuchom a prítomnosti veľkého počtu erytrocytov a polymorfonukleámych buniek v alveolárnych dutinách.
SK 283135 Β6
Polyklonálne sérum špecifické proti doméne I polypeptidu aD bolo testované na potkaňom modeli alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom. Toto polyklonálne sérum bolo aplikované do pľúc tracheálnou kanylou spolu s protilátkami proti BSA. Poranenie pľúc bolo potom vyvolané intravenózne alikáciou BSA so stopovým množstvom BSA značeného izotopom 1251 (približne 800 000 cpm), aby mohol byť kvantifikovaný opuch vzniknutý poranením pľúc. Pľúcne poranenie prebiehalo ďalšie 4 hodiny a veľkosť poranenia bola vyhodnotená z hodnoty pľúcnej permeability, ktorá je definovaná ako pomer BSA značeného izotopom 125I v pľúcach k jeho množstvu prítomnom v krvi. Typické hodnoty pľúcnej permeability pre pozitívnu kontrolu leží medzi 0,6 až 0,8, zatiaľ čo negatívne kontroly (potkany, ktoré nedostali BSA) majú hodnotu pľúcnej permeability v rozsahu 0,1 až 0,2.
Prvé štúdie dokázali, že pri liečbe pomocou polyklonálneho séra proti aD sa znižuje permeabilita pľúc o viac ako 50 %, čo predstavuje dramatické zmiernenie pľúcneho poranenia. Z histórie je známe zníženie permeability pľúc o 60 %, ktoré bolo dosiahnuté podávaním protilátok proti CD18. Tieto zistenia dokazujú, že aD môže byť najdôležitejší integrín fi2 počas akútneho poranenia pľúc, aj keď nemôže byť presne určené, či účinok protilátok zabraňuje extravazácii leukocytov z krvi alebo pohybu leukocytov cez pľúcny epitel.
Ďalším dôkazom skutočnosti, že polypeptid aD zmierňuje priebeh poranenia pľúc, bolo stanovenie hladiny TNF-α v kvapaline získanej výplachom ich bronchoalveolámej časti. Pri podávaní protilátok proti aD bol zistený štvornásobný pokles hladiny TNF-α. TNF-alfa bol už dlho považovaný za dôležitý mediátor pri akútnom zápale pľúc a látku zodpovednú za infiltráciu buniek zápalu do miest zápalu, aktiváciu buniek a poškodenie tkanív. Sérum namierené proti aD pravdepodobne blokuje aktiváciu rezidentných alveolárnych makrofágov počas vzniku alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom a tým zmierňuje uvoľňovanie TNF-alfa a NO' a znižuje následné poškodenie tkanív spôsobené týmito látkami a infiltráciou neutrofilov.
Príklad 26
Expresia aD v preklinických modeloch
Aby mohla byť stanovená rozdielna expresia aD v rôznych štádiách choroby, boli rezy tkanív zo živočíšnych modelov choroby značené polyklonálnym sérom proti aD získaným opísaným postupom (pozri príklad 18). Tkanivá zo zdravých a chorých potkanov boli rozrezané na hrúbku 6 pm a vysušené na vzduchu na podložných sklíčkach Supcrfrost Plus (VWR Scientific) cez noc pri izbovej teplote. Po vysušení boli rezy až do použitia skladované pri teplote -70 °C. Pred použitím boli sklíčka preložené z -70 °C na približne 5 minút od 50 °C. Rezy boli počas 10 minút pri izbovej teplote fixované studeným acetónom (4 °C) (Stephens Scientific) a ponechané schnúť pri izbovej teplote. Každý rez bol počas 30 minút pri izbovej teplote blokovaný 150 pl roztoku so zložením 30 % normálne potkanie sérum (Harlan Bioproducts), 5 % normálne kozie sérum (Vector Laboratories) a 1 % hovädzie sérum (BSA) (Sigma Chemical Company) v IX TBS a potom bol roztok z rezov jemne odsatý. Králičie polyklonálne sérum (koncentrácia proteínu 34 pg/ml) a sérum z rovnakého králika (získané pred imunizáciou) (koncentrácia proteínu 38,5 pg/ml) bolo zriedené v blokovacom roztoku. Ku každému rezu bolo potom, na čas 30 minút pri teplote 37 °C, pridaných 100 pl jednotlivého séra. Roztok protilátok bol potom odsatý a nenaviazané protilátky odstránené trojnásobným premytím v IX TBS vždy počas 5 minút. Po poslednom premytí bol nadbytok
TBS odstránený odsatím. Biotinylovaná kozia protilátka namierená proti králičím Ig bola pripravená s využitím kitu „Elite Rabbit IgG Vectastain ABC“ (Vector), podľa návodu odporúčaného výrobcom a 100 pl výsledného roztoku bolo nanesených na každý rez na 15 minút pri teplote 37 °C. Sklíčka boli dvakrát premývané v IX TBS, vždy počas 5 minút. Potom bolo na tkanivové rezy nanesených 100 pl konjugátu streptavidín-zlato (Goldmark Biologicals) riedeného v pomere 1 : 100 v 5 % normálnom potkaňom sére a 1 % BSA a tento roztok bol ponechaný pôsobiť 1 hodinu pri izbovej teplote. Sklíčka boli trikrát premývané pufrom TBS, vždy počas 5 minút a potom na ne bolo na 5 minút pri izbovej teplote nanesených 100 pl 1 % glutaraldehydu (Sigma) v TBS pufri. Sklíčka boli opäť trikrát premývané v TBS, vždy počas 5 minút a päťkrát v sterilnej deionizovanej vode, vždy počas 3 minút. Prebytok kvapalín bol odsatý a na každý rez boli nanesené dve kvapky strieborného zosilňujúceho roztoku a dve kvapky iniciačného roztoku (Goldmark Niologicals). Reakcia bola ponechaná prebiehať 20 až 30 minút pri izbovej teplote. Potom boli rezy dôkladne opláchnuté sterilnou deionizovanou vodou, vysušené cez noc pri izbovej teplote na vzduchu a prekryté Cytoseal 60 (VWR). Ako kontrola boli, pri rovnakých pokusoch a podľa rovnakého protokolu, použité rezy tkanív značené monoklonálnymi protilátkami rozpoznávajúcimi CDlla,CDllb, CDllcaCD18.
Značenie polyklonálnym sérom proti aD a značenie monoklonálnymi protilátkami proti CD1 la, CD1 lb, CD1 lc a CD 18 odhalila pre aD, v porovnaní s distribúciou pozorovanou pre iné podjednotky a, odlišnú distribúciu značky.
V normálnom pľúcnom tkanive bola expresia aD detegovaná na respiračnom epiteli priedušiek (ale nie na epiteli pľúcnych alveol) a na jednotlivých bunkách, čo by mohli byť alveolárne makrofágy vo vzduchových kanálikoch. Signál pozorovaný pri značení pomocou polyklonálneho séra bol podstatne silnejší než signál pozadia, pozorovaný pri kontrole uskutočňovanej so sérom získaným pred imunizáciou. V pľúcnom granulomatóznom tkanive bol 24 a 96 hodín po aplikácii glykánu detegovaný odlišný signál, keď sa aD značenie objavilo v respiračnom epiteli vnútri pľúcnych alveol a silnejší signál bol zaznamenaný na alveolárnych makrofágoch vnútri vzduchových kanálikov. V pľúcnom tkanive živočíchov podľa všetkého zotavených z choroby (usmrtených 16 dní po aplikácii glykánu), nebol pozorovaný žiadny signál pri značení protilátkou proti aD. V každom z týchto tkanív bol detegovaný, pri značení pomocou séra získaného pred imunizáciou, veľmi slabý signál pozadia.
Pri použití potkanieho pľúcneho tkaniva v modeli astmy vyvolanej antigénom bol v respiračnom epiteli tak priedušiek, ako aj pľúcnych alveol detegovaný veľmi silný signál protilátky namierenej proti aD. Intenzita tohto signálu bola podstatne vyššia ako úroveň signálu pozadia získaná pri použití kontrolného séra z neimunizovaného živočícha.
Je možné predpokladať, že odborníkov napadnú ďalšie modifikácie a variácie vynálezu vysvetleného v uvedených ilustratívnych príkladoch. Preto by pre vynález mali platiť len tie obmedzenia, ktoré sú uvedené v pripojených patentových nárokoch.
ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:
(i) PRIHLASOVATEĽ: Gallatin, W. Michael Van de Vieren, Monica
SK 283135 Β6 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Nová alfa podjednotka ľudského integrínu β2 (iii) POČET SEKVENCIÍ: 103 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:
(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŔEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelár (B) ULICA: Národní 32 (C) MESTO: Praha 1 (D) ŠTÁT: Česká republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppydisk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verzia č. 1.25 (vi) DÁTA O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:
(B) DÁTUM PODANIA:
(C) ZATRIEDENIE:
(vii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/173497 (B) DÁTUM PODANIA: 23. decembra 1993 (vii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/286889 (B) DÁTUM PODANIA: 5. októbra 1994 (vii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/362652 (B) DÁTUM PODANIA: 21. decembra 1994 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:
(A) MENO: GOWSHALL, Jonathan Vallance (B) ČÍSLO SPISU: PI 1779SK-JVG/smt (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:
(A) TELEFÓN:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 3726 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 3 . .3485 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 1:
TG ACC TTC GGC ACT CTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47
Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His 15 10 15
GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT | ACG ATC | TTC CAG GAG GAT GCA | 95 | |||||||||||||
Gly Phe Asn Leu Asp | Val | Glu | Glu | Pro | Thr 25 | íle | Phe | Gin | Glu Asp Ala 30 | |||||||
20 | ||||||||||||||||
GGC | GGC | TTT | GGG | CAG | AGC | GTG | GTG | CAG | TTC | GGT | GGA | TCT | CGÄ | CTC | GTG | 143 |
Gly | Gly | Ph· | Gly | Gin | Ser | Val | Val | Gin | Ph· | Gly Gly | Ser | Arg | Leu | Val | ||
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GTG | GGA | GCA | CCC | CTG | GAG GTG | GTG | GCG | GCC | AAC | CAG | ACG | GGA | CGG | CTG | 191 | |
Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val | Val | Ala | Ala | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
TAT | GAC | TGC | GCA | GCT | GCC | ACC | GGC | ATG | TGC | CAG | CCC | ATC | CCG | CTG | CAC | 239 |
Tyr | Asp | Cys | Ale | Ala | Ala | Thr | Gly | Met | Cys | Gin | Pro | íle | Pro | Leu | HĹs | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
ATC | CGC | CCT | GAG | GCC | GTG AAC | ATG | TCC | TTG | GGC | CTG | ACC | CTG | GCA | GCC | 287 | |
tie | Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala | |
80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
TCC | ACC | AAC | GGC | TCC | CGG | CTC | CTG | GCC | TGT | GGC | CCG | ACC | CTG | CAC | AGA | 335 |
Ser | Thr | Asn | Gly | S«r | Arg | Leu | L«u | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Leu | HÍS | Arg | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GTC | TGT | GGG | GAG | AAC | TCA | TAC | TCA | AAG | GGT | TCC | TGC | CTC | CTG | CTG | GGC | 383 |
Val | Cys | Gly | Glu | Asn | Ser | Tyr | Ser | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TCG | CGC | TGG | GAG | ATC | ATC | CAG | ACA | GTC | CCC | GAC | GCC | ACG | CCA | GAG | TGT | 431 |
Ser | Arg | Trp | Glu | íle | íle | Gin | Thr | Val | Pro | Asp | Ala | Thr | Pro | Glu | Cys | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
CCA CAT | CAA | GAG | ATG GAC ATC | GTC | TTC | CTG ATT | GAC | GGC | TCT | GGA | AGC | <79 | ||||
Pro | His | Gin | Glu | Met | Asp | íle | Val | Phe | Leu | íle | Asp Gly | Ser | Gly | Ser | ||
145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
ATT | GAC | CAA | AAT | GAC | TTT | AAC | CAG | ATG | AAG | GGC | TTT | GTC | CAA | GCT | GTC | 527 |
íle | Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin | Het | Lys | Gly | Phe | Val | Gin | Ala | Val | |
160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
ATG | GGC | CAG | TTT | GAG | GGC | ACT | GAC | ACC | CTG | TTT | GCA | CTG | ATG | CAG | TAC | 57S |
Met | Gly | Gin | Phe | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr | Leu | Phe | Ala | Leu | Met | Gin | Tyr | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TCA | AAC | CTC | CTG | AAG | ATC | CAC | TTC | ACC | TTC | ACC | CAA | TTC | CGG | ACC | AGC | 623 |
Ser | Asn | Leu | Leu | Lys | íle | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Gin | Ph· | Arg | Thr | Ser | |
195 | 200 | 205 |
CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG | 671 | |||||||||||||||
Pro Ser Gin Gin Ser | Leu VaL | Asp 215 | Pro | íle | Val | Gin Leu Lys 220 | Gly Leu | |||||||||
210 | ||||||||||||||||
ACG | TTC | ACG | GCC | ACG | GGC | ATC | CTG | ACA | GTG | GTG | ACA | CAG | CTA | TTT | CAT | 719 |
Thr | Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | íle | Leu | Thr | Val | Val | Thr | Gin | Leu | Phe | HÍS | |
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
CAT | AAG | AAT | GCG | GCC | CCA | AAA | AGT | GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | ATT | GTC | ATC | 767 |
His | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | íle | Leu | íle | val | íle | |
240 | 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
ACA | GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GAC | CCC | CTG | GAA | TAC | AGT | GAT | GTC | ATC | 815 |
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | íle | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
CCC | CAG | GCA | GAG | AAG | GCT | GGC | ATC | ATC | CGC | TAC | GCT | ATC | GGG | GTG | GGA | 863 |
Pro | Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | Íle | íle | Arg | Tyr | Ala | íle | Gly | VaL | Gly | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
CAC | GCT | TTC | CAG | GGA | CCC | ACT | GCC | AGG | CAG | GAG | CTG | AAT | ACC | ATC | AGC | 911 |
His | Ala | Phe | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | íle | Ser | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
TCA | GCG | CCT | CCG | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC | AAG | GTG | GAC | AAC | TTT | GCA | GCC | 959 |
Ser | Ale | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Asp | Asn | Phe | Ala | Ala | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
CTT | GGC | AGC | ATC | CAG | AAG | CAG | CTG | CAG | GAG | AAG | ATC | TAT | GCA | GTT | GAG | 1007 |
Leu | Gly | Ser | íle | Gin | Lys | Gin | Leu | Gin | Clu | Lys | íle | Tyr | Ala | Val | Glu | |
320 | 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
GGA | ACC | CAG | TCC | AGG | GCA | AGC | AGC | TCC | TTC | CAG | CAC | GAG | ATG | TCC | CAA | 1055 |
Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ala | Ser | Ser | Ser | Ph· | Gin | His | Glu | Het | Ser | Gin | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GAA GGC | TTC | AGC | ACA | GCC | CTC | ACA | ATG | GAT | GGC | CTC | TTC | CTG | GGG | GCT | 1103 | |
Glu | Gly | Phe | Ser | Thr | Ala | Leu | Thr | Met | Asp | Gly | Leu | Phe | Leu | Gly | Ale | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
GTG | GGG | AGC | TTT | AGC | TGG | TCT | GGA | GGT | GCC | TTC | CTG | TAT | CCC | CCA | AAT | 1151 |
Val | Gly | Ser | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
ATG | AGC | CCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAT | GTG | GAC | ATG | AGG | 1199 |
Het | Ser | Pro | Thr | Phe | íle | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Het | Arg | |
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
GAC | TCT | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GAG | CTA | GCC | CTG | TGG | AAG | GGG | GTA | 1247 |
ASp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lys | Gly | Val | |
400 | 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
CAG | AAC | CTG | GTC | CTG | GGG | GCC | CCC | CGC | TAC | CAG | CAT | ACC | GGG | AAG | GCT | 1295 |
Gin | Asn | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Ala | |
420 | 425 | 4 30 | ||||||||||||||
GTC | ATC | TTC | ACC | CAG | GTG | TCC | AGG | CAA | TGG | AGG | AAG | AAG | GCC | GAA | GTC | 1343 |
Val | íle | Phe | Thr | Gin | Val | Ser | Arg | Gin | Trp | Arg | Lys | Lys | Ale | Glu | Val | |
435 | 440 | 445 |
ACA GGG ACG CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC | TGC TCC GTG Cys Ser Val | 1391 | ||||||||||||||
Thr Gly Thr Gin íle | Gly Ser | Tyr 455 | Phe | Gly | Ala | Ser Leu 460 | ||||||||||
450 | ||||||||||||||||
GAT | GTG | GAC | AGC | GAT | GGC | AGC | ACC | GAC | CTG | ATC | CTC | ATT | GGG | GCC | ccc | 1439 |
Asp | Val | Asp | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Zle | Leu | Zle | Gly | Ala | Pro | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
CAT | TAC | TAT | GAG | CAG | ACC | CGA | GGG | GGC | CAG | GTG | TCC | GTG | TGT | CCC | TTG | 1487 |
His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pxo | Leu | ||
480 | 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
CCT | AGG | GGG | CAG | AGG | GTG | CAG | TGG | CAG | TGT | GAC | GCT | GTT | CTC | CGT | GGT | 1535 |
Pro | Arg | Gly | Gin | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Asp | Ale | Val | Leu | Arg Gly | ||
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
GAG | CAG | GGC | CAC | CCC | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCA | GCC | CTG | ACA | GTG | TTG | 1583 |
Glu | Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | ||
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
GGG | GAT | GTG | AAT | GAG | GAC | AAG | CTG | ATA | GAC | GTG | GCC | ATT | GGG | GCC | CCG | 1631 |
Gly Asp | Val | Asn | Glu | Asp | Lys | Leu | Zle | Asp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pro | ||
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
GGA | GAG | CAG | GAG | AAC | CGG | GGT | GCT | GTC | TAC | CTG | TTT | CAC | GGA | GCC | TCA | 1679 |
Gly | Glu | Gin | Glu | Asn | Arg Gly Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | Hla | Gly Ale | Ser | ||||
545 | 550 | 555 | ||||||||||||||
GAA | TCC | GGC | ATC | AGC | CCC | TCC | CAC | AGC | CAG | CGG | ATT | GCC | AGC | TCC | CAG | 1727 |
Glu | Ser | Gly | 11« | Ser | Pro | Ser | Hla | Ser | Gin | Arg | Zle | Ale | Ser | Ser | Gin | |
560 | 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
CTC | TCC | ccc | AGG | CTG | CAG | TAT | TTT | GGG | CAG | CCG | CTG | AGT | GGG | GGT | CAG | 1775 |
L«U | Ser | Pro | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | |
SBO | 595 | 590 | ||||||||||||||
GAC | CTC | ACC | CAG | GAT | GGA | CTG | ATG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGG | GCC | CGG | GGC | 1823 |
Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Met | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly | |
595 | 600 | 60S | ||||||||||||||
CAG | GTG | CTC | CTG | CTC | ACG | AGT | CTG | CCG | GTG | CTG | AAA GTG | GGG | GTG | GCC | 1871 | |
Gin | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Vel | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Ala | |
610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
ATG | AGA | TTC | AGC | CCT | GTG | GAG | GTG | GCC | AAG | GCT | GTG | TAC | CGG | TGC | TGG | 1919 |
Nst | Arg | Ph· | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Ala | Lys | Ala | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | |
625 | 630 | 635 | ||||||||||||||
GAA | GAG | AAG | CCC | AGT | GCC | CTG | GAA | GCT | GGG | GAC | GCC | ACC | GTC | TGT | CTC | 1967 |
Glu | Glu | Lys | Pro | Ser | Ala | Leu | Glu | Ala | Gly | Asp | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | |
640 | 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
ACC | ATC | CAG | AAA | AGC | TCA | CTG | GAC | CAG | CTA | GGT | GAC | ATC | CAA | AGC | TCT | 2015 |
Thr | 11« | Gin | Lys | Ser | Ser | Leu | Asp | Gin | Leu | Gly | Asp | 11« | Gin | Ser | Ser | |
660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
GTC | AGG | TTT | GAT | CTG | GCA | CTG | GAC | CCA | GGT | CCT | CTG | ACT | TCT | CGT | GCC | 2063 |
Val | Arg | Ph· | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly Arg | Leu | Thr | Ser | Arg | Ala | ||
675 | 680 | 685 |
CAG GAA GAA | TCC ACC | AAG Lys | TAC TTC Tyr Phs 935 | AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG | 2831 | |||||||||||
Gin | Glu | Glu 930 | Ser | Thr | Asn Phe | Ala | Thr Ser Asp 940 | Glu Lys | ||||||||
AAA | ATG | AAA | GAG | GCT | GAG | CAT | CGA | TAC | CGT | GTG | AAT | AAC | CTC | AGC | CAG | 2679 |
Lys | Met | Lys | Glu | Ala | Glu | Kla | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Gin | |
945 | 950 | 955 | ||||||||||||||
CGA | GAT | CTG | GCC | ATC | AGC | ATT | AAC | TTC | TGG | GTT | CCT | GTC | CTG | CTG | AAC | 2927 |
Arg Asp | Leu | Ala | íle | Ser | 11« | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | ||
960 | 965 | 970 | 975 | |||||||||||||
GGG | GTG | GCT | GTG | TGG | GAT | GTG | GTC | ATG | GAG | GCC | CCA | TCT | CAG | AGT | CTC | 2975 |
Gly | Val | Ala | Val | Trp | Α«Ρ | Vel | Val | Met | Glu | Ala | Pro | Ser | Gin | Ser | Leu | |
980 | 965 | 990 | ||||||||||||||
CCC | TGT | GTT | TCA | GAG | AGA | AAA | CCT | CCC | CAG | CAT | TCT | GAC | TTC | CTG | ACC | 3023 |
Pro | Cys | Val | Ser | Glu | Arg | Lys | Pro | Pxo | Gin | His | Ser | Asp | Ph· | Leu | Thr | |
995 | 1000 | 1005 | ||||||||||||||
CAG | ATT | TCA | AGA | AGT | CCC | ATG | CTG | GAC | TGC | TCC | ATT | GCT | GAC | TK | CTG | 3071 |
Gin | Zle | Ser | Arg | Ser | Pro | Met | L«u | Asp | Cys | Ser | 11· | Ala | A*p | Cys | Leu | |
1010 | 1015 | 1020 | ||||||||||||||
CAG | TTC | CGC | TGT | GAC | GTC | CCC | TCC | TTC | AGC | GTC | CAG | GAG | CAG | CTG | GAT | 3119 |
Gin | Phs | Arg | Cys | Asp | Val | Pro | Ser | Phe | Ser | Vsi | Gin | Glu | Glu | Leu | Asp | |
1025 | 1030 | 1035 | ||||||||||||||
TTC | ACC | CTG | AAG | GGC | AAT | CTC | AGT | TTC | GGC | TGG | GTC | CGC | CAG | ACA | TTG | 3167 |
Phs | Thr | Leu | Lya | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | Val | Arg | Glu | Thr | Leu | |
1040 | 1045 | 1050 | 1C5S | |||||||||||||
CAG | AAG | AAG | GTG | TTG | GTC | GTG | AGT | GTG | GCT | GAA | ATT | ACG | TTC | GAC ACA | 3215 | |
Gin | Lys | Lys | Val | Leu | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Asp Thr | ||
1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||||||
TCC | GTG | TAC | TCC | CAG | CTT | CCA | GGA | CAG | GAG | GCA | TTT | ATG | AGA | GCT | CAG | 3263 |
Ser | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Met | Arg | Ala | Gin | |
1075 | 1080 | 1085 | ||||||||||||||
ATG | GAG | ATG | GTG | CTA | GAA | GAA | GAC | GAG | GTC | TAC | AKT | GCC | A7T | CCC | ATC | 3311 |
Met | Glu | Met | Val | Leu | Glu | Glu | Asp | Glu | Val | Tyr | Asn | Ala | n· | Pro | íle | |
1090 | 1095 | 1100 | ||||||||||||||
ATC | ATG | GGC | AGC | TCT | GTG | GGG | GCT | CTG | CTA | CTG | CTG | GCG | CTC | ATC | ACA | 3359 |
n· | Met | Gly | Ser | Ser | Val | Gly | Ala | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr |
1105 1110 1115
GCC ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AM GAA ATG3407
Ala The Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Axg His Tyr Lys GluMet
1120 1125 11301135
CTG GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC3455
Leu Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Pht Ser Gly Asp AspPhe
1140 11451150
AGC TGT GTG GCC CCA AAT CTG CCT TTG TČC TAATAATCCA CTTTCCTGTT3505
Ser Cys val Ale Pro Asn Val Pro Leu Ser
11551160
ATT TTC AAT | GAA ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG | ||||||||||||||
íle | Phs | Asn 690 | G1U Thr | Lys | Asn | Pzo Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu | |||||||||
695 | 700 | ||||||||||||||
GGA | CTG | GGG | ATT | CAC | TGT | GAA | ACC | CTG | AAG | CTG | CTT | TTG | CCA | GAT | TGT |
Gly | Leu | Gly | Zle | His | Cys | Glu | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys |
705 | 710 | 715 | |||||||||||||
GTG | GAG | GAT | GTG | GTG | AGC | CCC | ATC | ATT | CTG | CAC | CTC | AAC | TTC | TCA | CTG |
Val | Glu | Asp | Val | Val | Ser | Pro | íle | Xle | Leu | His | Leu | Asn | Phe | Ssr | Leu |
720 | 725 | 730 | 735 | ||||||||||||
GTG | AGA | GAG | CCC | ATC | CCC | TCC | CCC | CAG | AAC | CTG | CGT | CCT | GTG | CTG | GCC |
Val | Arg | Glu | Pro | Zle | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | CTC | TTC | ACT | GCT | TCT | CTC | CCC | TTC | GAG | AAG | AAC |
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
TGT | GGG | CAA | GAT | GGC | CTC | TGT | GAA | GGG | GAC | CTG | GCT | GTC | ACC | CTC | AGC |
Cys | Gly | Gin | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu | Gly Asp | Leu | Gly | Val | Thr | Leu | Ser | |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | ACC | CTG | ACC | GTG | GGG | AGC | TCC | CTG | GAG | CTC | AAC |
Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Leu | Asn |
785 | 790 | 795 | |||||||||||||
GTG | ATT | GTG | ACT | GTG | TGG | AAC | GCA | GGT | GAG | GAT | TCC | TAC | GGA | ACC | GTG |
Val | XI· | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Ala | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | val |
900 | 805 | 810 | 815 | ||||||||||||
GTC | AGC | CTC | TAC | TAT | CCA | GCA | GGG | CTG | TCG | CAC | CGA | CGG | GTG | TCA | GGA |
Val | Ser | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | His | Arg | Arg | Val | Ser | Gly |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
GCC | CAG | AAG | CAG | CCC | CAT | CAG | AGT | GCC | CTG | CGC | CTG | GCA | TGT | GAG | ACA |
Ala | Gin | Lys | Gin | Pro | His | Gin | Ser | Ala | Leu | Arg | Lau | Ala | Cys | Glu | Thr |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
GTG | CCC | ACT | GAG | GAT | GAG | GGC | CTA | AGA | AGC | AGC | CGC | TGC | AGT | GTC | AAC |
Val | Pro | Thr | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Ser | Arg | Cys | Ser | Val | Asn |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
CAC | CCC | ATC | TTC | CAT | GAG | GGC | TCT | AAC | GGC | ACC | TTC | ATA | GTC | ACA | TTC |
His | Pro | íle | Phe | His | Glu | Gly | Ser | Asn | Gly | Thr | Phe | íle | Val | Thr | Phe |
665 | 870 | 875 | |||||||||||||
GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | ACC | CTG | GGA | GAC | AGG | ATG | CTT | ATG | AGG | GCC |
Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Thr | Leu | Gly | Asp | Arg | Met | Leu | Met | Arg | Ala |
880 | 885 | 890 | 895 | ||||||||||||
AGT | GCA | AGC | AGT | GAG | AAC | AAT | AAG | GCT | TCA | AGC | AGC | AAG | GCC | ACC | TTC |
Ssr | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Ala | Ser | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr | Phe |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
CAS | CTG | GAG | CTC | CCG | GTG | AAG | TAT | GCA | GTC | TAC | ACC | ATG | ATC | AGC | AGG |
GLn | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lye | Tyr | Ala | Val | Tyr | Thr | Met | íle | Ser | Arg |
915 920 925
2111
2159
2207
2255
2303
2351
2399
2447
2495
2543
2S91
2639
2687
2735
2783
TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA AGATAGAGAT TGTAATGTTT T7ACATATCT TACAGAAGCA GGCATGGTGC CAGCATAAAT
GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA3566
ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG3625
GTCCATCTTT TTCÄGCAATG ACCCACTTTT3695
TTTCATATGC T3726 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 2 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 2:
Thr | Phe | Gly | Thr | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Val | Leu | Ala | Ser | Tyr | His | Gly |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Phe | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu | Pro | Thr | Zle | Phe | Gin | Glu | Asp | Ala | Gly |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Phe | Gly | Gin | Ser | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val | Val | Ala | Ala | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu | Tyr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asp | Cys | Ala | Ala | Ala | Thr | Gly | Met | Cys | Gin | Pro | Zle | Pro | Leu | His | íle |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala | ALa | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Asn | Gly | Ser | Arg | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Leu | His | Arg | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Cys | Gly | Glu | Asn | Ser | Tyr | Ser | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | Ser |
lis | 120 | 125 | |||||||||||||
Arg | Trp | Glu | íle | íle | Gin | Thr | Val | Pro | Asp | Ala | Thr | Pro | Glu | cys | Pro |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
His | Gin | Glu | Met | Asp | Zle | Val | Phe | Leu | íle | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | íle |
145 | 150 | 15S | 160 | ||||||||||||
Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin | Met | Lys | Gly | Phe | Val | Gin | Ala | Val | Het |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Gly | Gin | Phe | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr | Leu | Phe | Ala | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser |
180 | 165 | 190 | |||||||||||||
Asn | Leu | Leu | Lys | íle | K18 | Phe | Thr | Phe | Thr | Gin | Phe | Arg | Thr | Ser | Pro |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ser | Gin | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Pro | íle | Val | Gin | Leu | Ly» | Gly | Leu | Thr |
210 | 215 | 220 |
Phe 22S | Thr Ala Thr Gly íle Lea Thr Val Val 230 | Thr 235 | Gin Leu | Phe | Kls | His 240 | Pro 865 | íle Phe His Glu | Gly Ser Asn Gly Thr Phe íle Val Thr Phe Asp | ||||||||||||||||||||||
870 | 875 | B80 | |||||||||||||||||||||||||||||
Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | íle | Leu | íle | Val | íle | Thr | ||||||||||||||||
245 | 250 | 255 | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Thr | Leu | Gly | Asp Arg | Met | Leu | Met | Arg | Ala | Ser | ||||||||||||||
885 | 890 | 895 | |||||||||||||||||||||||||||||
Äsp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | íle | Pro | ||||||||||||||||
260 | 265 | 270 | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Ala | Ser | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr | Phe | Gin | |||||||||||||
900 | 905 | »10 | |||||||||||||||||||||||||||||
Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | íle | íle | Arg Tyr | Al* | Ilt | Gly | Val | Gly | His | |||||||||||||||||
275 | 280 | 285 | Leu | Glu | Leu | Pro | val | Lys | Tyr | Ala | Val | Tyr | Thr | Met | íle | Ser | Arg | Gin | |||||||||||||
915 | 920 | 925 | |||||||||||||||||||||||||||||
Ala | Phe | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | íle | Ser | Ser | ||||||||||||||||
290 | 295 | 300 | Glu | Glu | Ser | Thr | Lys | Tyr | Phe | Aan | Phe | Ala | Thr | Ser | Asp | GlU | Lys | Lys | |||||||||||||
930 | 935 | 940 | |||||||||||||||||||||||||||||
Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Asp | Asn | Phe | Ala | Ala | Leu | ||||||||||||||||
305 | 310 | 315 | 320 | Met | Lys | Glu | Ala | Glu | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Gin | Arg | ||||||||||||
94S | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||||||||||||||||||
Gly | Ser | íle | Gin | Lys | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | íle | Tyr | Ala | Val | Glu | Gly | 11* | |||||||||||||||
325 | 330 | 335 | Asp | Leu | Ala | Ser | Zle | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Lau | Aan | Gly | ||||||||||||||
965 | 970 | 975 | |||||||||||||||||||||||||||||
Thr | GLn | Ser | Arg 340 | Ala | Ser | Ser | Ser | Phe 345 | Gin | His | Glu | Met | Ser 350 | GlnGlu | Val | Al* | Val | Trp 980 | A»P | Val | Val | Met | G1U 985 | Al* | Pro | Ser | Gin | Ser 990 | Leu | Pro | |
Gly | Phe | Str 355 | Thr | Ala | Leu | Thr | Ket 360 | Asp Gly | Leu. | Phe | Leu 365 | Gly | Ala | Val | Cys | Val | Ser 995 | Glu | Arg | Lys | Pro | Pro Gin 1000 | His | Ser | Asp | Phe Leu 1005 | Thr | Gin | |||
Gly | Ser 370 | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly Gly 375 | Ala | Phe | Leu | Tyr 380 | Pro | Pro | Asn | Met | íle | Ser Arg 1010 | Ser | Pro | Met | Lau Aap 1015 | Cys | Sar | íle | Ala Aap 1020 | Cys | Leu | Gin | ||||
Ser | Pro | Thr | Phe | íle | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met | Arg | Asp | Phe | Arg 5 | Cys | Asp | Val | Pro | Ser | Phe | Ser | Val | Gin | Glu | Glu | Leu | Asp | Phe |
385 | 390 | 395 | 400 | 102! | 1030 | 1035 | 1040 | ||||||||||||||||||||||||
Sar | Tyr | Leu | Gly Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lys | Gly | Val | Gin | Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | Val | Arg | Glu | Thr | Leu | Gin | |
405 | 410 | 415 | 1045 | 1050 | 1055 | ||||||||||||||||||||||||||
Asn | Leu | Val | Leu | Gly Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Ala | Val | Lys | Lys | Val | Leu | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser | |
420 | 425 | 4 30 | 1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||||||||||||||||||
íle | Phe | Thr | Gin | Val | Ser | Arg | GLn | Trp | Arg | Lys | Lys | Ala | Glu | Val | Thr | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Met | Arg | Ala | Gin | Met |
435 | 440 | 445 | 1075 | 1080 | 1085 | ||||||||||||||||||||||||||
Gly | Thr | Gin | íle | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | Asp | Glu | Met | Val | Leu | Glu | Glu | Asp | Glu | Val | Tyr | Asn | Ala | íle | Pro | íle | íle |
450 | 455 | 460 | 1090 | 1095 | 1100 | ||||||||||||||||||||||||||
Val | Asp | Ser | Asp Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | íle | Leu | íle | Gly | Ala | Pro | HiS | Het | Gly | Ser | Ser | Val | Gly | Al* | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Ala | |
465 | 470 | 475 | 480 | 1105 | 1110 | 1115 | 1120 | ||||||||||||||||||||||||
Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu | Pro | Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | His Tyr Lys | Glu | Met | Leu | |||
485 | 490 | 495 | 1125 | 1130 | 1135 | ||||||||||||||||||||||||||
Arg | Gly | Gin | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | Glu | Glu | Asp | Lys | Pro | Glu Asp | Thr | Ala | Thr | Phe Ser Gly Asp Asp | Phe | Ser | |||||
500 | 505 | 510 | 1140 | 1145 | 1150 | ||||||||||||||||||||||||||
Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | Cys | Val | Ala | Pro Asn | Val | Pro | Lys | Ser | ||||||||
515 | 520 | 525 | 1155 | 116Q | |||||||||||||||||||||||||||
Aap | Val | Asn | Glu | Asp | Lys | Leu | íle | Asp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pro | Gly | ||||||||||||||||
530 | S35 | 540 | (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: | 3: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
Glu | Gin | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Ala | Ser | Glu | (A) DĹŽKA: 1153 aminokyselín | |||||||
545 | SSO | 555 | 560 | (B) TYP: aminokyselina | |||||||||||||||||||
Sar | Gly | íle | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | íle | Ala | Ser | Ser | Gin | Leu | (C) POČET REŤAZCOV: jeden | |||||||
565 | 570 | 575 | (D) TOPOLOGIA: lineárna | ||||||||||||||||||||
Ser | Pro | Arg | Leu 580 | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin 585 | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly 590 | Gin | Asp | (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: | : 3: | ||||||
Leu | Thr | Gin | Aap | Gly | Lau | Met | Asp | Leu | Ala | Val | Gly Al* | Arg | Gly | Gin | |||||||||
595 | 600 | 605 | Met Ala Leu Arg Val Leu Leu Leu Thr | Ala | Leu | Thr | Leu | Cys | His | Gly | |||||||||||||
Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Ala | Met | 1 5 | 10 | 15 | |||||
610 | 615 | 620 | |||||||||||||||||||||
Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met | Thr | Phe | Gin | Glu | Asn | Al* | Arg | ||||||||||||||||
Arg | Phe | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Ala | Lys | Ala | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | Glu | 20 25 | 30 | ||||||
625 | 630 | 635 | 640 | Gly Phe Gly Gin Sar Val Val Gin Leu | Gin | Gly | Ser | Arg | Val | Val | Val | ||||||||||||
Glu | Lys | Pro | Ser | Ala | Leu | Glu | Ala | Gly Asp | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr | 35 40 | 45 | |||||||
645 | 650 | 655 | |||||||||||||||||||||
Gly Ala Pro Gin Glu íle Val Ala Ala | Asn | Gin | Arg | Gly | Ser | Leu | Tyr | ||||||||||||||||
íle | Gin | Lys | Ser | Ser | Leu | Asp | Gin | Leu Gly | Asp | 11* | Gin | Ser | Ser | Val | 50 55 | 60 | |||||||
660 | 665 | 670 | |||||||||||||||||||||
Ala | Ala | íle | Gin Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys | Glu | Pro | íle | Arg | Leu | GLn | Val | |||||||||||||
Arg | Phe | Asp | Leu | Leu | Asp | Pro | Gly Arg | Leu | Thr | Ser | Arg | 65 70 | 75 | 80 | |||||||||
675 | 680 | 685 | |||||||||||||||||||||
Gly | Pro Val Glu Ala Val Asn Met Ser Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Ala | Al* | Thr | |||||||||||||||
Phe | Asn | Glu | Thr | Lys | Asn | Pro | Thr | Leu | Thr | Arg Arg | Lys | Thr | Leu | 85 | 90 | 95 | |||||||
690 | 695 | 700 | |||||||||||||||||||||
His | Glu | Val | Thr Ser Pro Pro Gin Leu Leu Ala Cys | Gly | Pro | Thr | Val | His | Gin | Thr | |||||||||||||
Leu | Gly | íle | Cys | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys | 100 105 | 110 | |||||||||
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||||||||||
íle | His | Leu | Val | Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly | Leu | Cys | Phe | Leu | Phe | Gly | Ser | ||||||||||||
Glu | Asp | Val | Val | Ser | Pro | íle | Leu | Leu | Asn | Phe | Ser | 115 120 | 125 | ||||||||||
725 | 730 | 735 | |||||||||||||||||||||
Arg | Glu | Pro | íle | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Val | Asn Leu Arg Gin Gin Pro Gin Lys Phe 130 135 | Pro | GLu | Ala 140 | Leu | Arg | Gly Cys | |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||||||||||
Gly | Ser | Gin 755 | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala 760 | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu 765 | Lys | Asn | Cys | Pro Gin Glu Asp Ser Asp íle Ala Phe 145 150 | Leu | íle 155 | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser 160 |
Gly | Gin | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu | Gly Asp | Leu | Gly | Val | Thr | Leu | Ser | Phe | íle íle Pro His Asp Phe Arg Arg Met 16S | Lys 170 | Glu | Phe | Val | Ser | Thr 175 | Val | |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||||||||||
Ser | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Leu | Asn | Val | Met Glu Gin Leu Lys Lys Ser Lys Thr 180 185 | Leu | Phe | Ser | Leu | Het 190 | Gin | Tyr |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||||||||||
íle | Val | Thr | Val | Trp 805 | Asn | Ala | Gly | Glu | Asp 810 | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val 815 | Val | Ser Glu Glu Phe Arg íle His Phe Thr 195 200 | Phe | Lys | Glu | Phe 205 | Gin | Asn | Asn |
Ser | Leu | Tyr | Tyr 820 | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser 825 | His | Arg | Arg | Val | Ser 830 | Gly | Ala | Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro 210 215 | íle | Thr | Gin 220 | Leu | Leu | Gly | Arg |
Gin | Lys | Gin 835 | Pro | HiS | Gin | Sex | Ala 840 | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys 845 | Glu | Thr | val | Thr His Thr Ala Thr Gly 11* Arg Lys 225 230 | Val | Val 235 | Arg | Glu | Leu | Phe | Asn 240 |
Pro | Thr 850 | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu 855 | Arg | Ser | Ser | Arg | Cys 860 | Ser | Val | Asn | His | íle Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn Ala 245 | Phe 250 | Lys | íle | Leu | Val | Val 255 | íle |
The Asp | Gly | Glu | Lys | Phe | Gly . | Aap | Pro | Leu | Gly | Tyr | Glu | ASp | Val | íle | |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Pro | Glu | Ala | Asp | Arg | Glu | Gly | Val | íle | Arg | Tyr | Val | Zle | Gly | Val | Gly |
275 | 260 | 285 | |||||||||||||
Mp | Ala | Ph· | Arg | Ser | Glu | Ly· | Sex | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | Zle | Ala |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ser | Ly· | Pro | Pro | Arg | Aep | HL· | Val | Phe | Gin | Val | Asn | Asn | Phe | Glu | Ala |
305 | 310 | 31S | 320 | ||||||||||||
Leu | Ly· | Thr | íle | Gin | Asn | Gin | Leu | Arg | Glu | Lys | íle | Phe | Ala | Zle | Glu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gly | Thr | Gin | Thr | Gly | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Glu | His | Glu | Met | Ser | Gin |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Glu | Gly | Ph· | Sar | Ala | Ala | Ho | Thr | Sar | Asn | Gly | Pro | Leu | Leu | Ser | Thr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Val | Gly | Sir | Tyr | Asp | Trp | Ala | Gly | Gly | Val | Phe | Leu | Tyr | Thr | Sar | Lys |
370 | 375 | 390 | |||||||||||||
Glu | Lys | Ser | Thr | Phe | íle | Asn | Met | Thr | Arg | Val | Asp | Ser | Asp | Met | Asn |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Mp | Ala | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ala | Ala | Ala | Zle | íle | Leu | Arg | Asn | Arg | Val |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gin | Ser | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | íle | Gly | Leu | val |
'420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ala | Met | Phe | Arg | Gin | Asn | Thr | Gly | Met | Trp | Glu | Ser | Asn | Ala | Asn | Val |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Lya | Gly | Thr | Gin | íle | Gly | Ala | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | val |
450 | 455 | 4 60 | |||||||||||||
Asp | Val | Asp | Ser | Asn | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | íle | Gly | Ala | Pro |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Hla | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Arg | Gly | Gin | Arg | Ala | Arg | Trp | Gin | cy. | Asp | Ala | val | Leu | Tyr | Gly |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Glu | Gin | Gly | Gin | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Lys | Leu | Thr | Asp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pro |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gly | Glu | Glu | Asp | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Thr | Ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gly | Sar | Gly | Zle | Sex | Pro | Sex | Hla | i Sex | Gin | i Ara | 1 Zle | i Ali | i Gly Sex | • Lys | |
565 | 570 | 575 |
Leu Sar Pro Arg Leu Gin Tyr Ph· Gly Gin Sar Leu Sar Gly Gly Gin
580 595 590
ASp | Lau | Thr Met Asp 595 | Gly Leu Val Asp Leu Thr Val Gly Ala Gin Gly | ||||||||||||
600 | 605 | ||||||||||||||
His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Gin | Pro | Val | Leu | Arg | Val | Lys | Ale | íle |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
M«t | Glu | Phe | Asn | Pro | Arg | Glu | Val | Ala | Arg | Asn | Val | Phe | Glu | Cys | Asn |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Asp | Gin | Val | Val | Lys | Gly | Lys | Glu | ALa | Gly | Glu | Val | Arg | Val | Cys | Leu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
His | Val | Gin | Ly· | Ser | Thr | Arg Asp | Arg | Leu | Arg | Glu | Gly | Gin | íle | Gin | |
660 | 655 | 670 | |||||||||||||
Ser | Val | Val | Thr | Tyr Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Ser | Gly Arg | Pro | His | Ser | ||
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Arg | Ala | Val | Phe | Asn | Glu | Thr | Lys | Asn | Ser | Thr | Arg | Arg | Gin | Thr | Gin |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Val | Leu | Gly | Leu | Thr | Gin | Thr | Cys | Glu | Thr | Leu | Lys | Lau | Gin | Leu | Pro |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Asn | Cys | íle | Glu | Asp | Pro | Val | Ser | Pro | íle | Val | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Ser | Leu | Val | Gly | Thr | Pro | Leu | Ser | Ala | Phe | Gly | Asn | Leu | Arg | Pro | Val |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Leu | Ala | Glu | Asp | Ala | Gin | Arg | Leu | Phe | Thr | Ala | Leu | Phe | Pro | Phe | Glu |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Lys | Asn | Cys | Gly | Asn | Asp | Asn | íle | Cys | Gin | Asp Asp | Leu | Ser | íle | Thr | |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Phe | Ser | Phe | Kat | Ser | Leu | Asp Cys | Leu | Val | Val | Gly Gly | Pro | Arg | Glu | ||
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Phe | Asn | Val | Thr | Val | Thr | Val | Arg | Asn | Asp Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Arg | |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Thr | Gin | Val | Thr | Phe | Phe | Phe | Pro | Leu | Asp Leu | Ser | Tyr Arg | Lys | Val | ||
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ser | Thr | Leu | Gin | Asn | Gin | Arg | Ser | Gin | Arg Ser | Trp Arg | Leu | Ala | Cys | ||
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Glu | Ser | Ala | Sar | Ser | Thr | Glu | Val | Ser | Gly Ala | Leu | Lys | Ser | Thr | Ser | |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Cys | Ser | 11· | Asn | His | Pro | íle | Phe | Pro | Glu | Asn | Ser | Glu | Val | Thr | Phe |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Asn | 11« | Thr | Phe | Asp | Val | Asp | Ser | Ly. | Ala | Ser | Leu | Gly | Asn | Lys | Leu |
885 | 890 | 895 |
Leu | Leu | Ly. | Ala | Asn | val | Thr | ser | Glu | Asn | Asn | Met | Pro | Arg | Thr | Asn |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Ly· | Thr | Glu | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pzo | Val | Ly» | Tyr | Ala | val | Tyr | Met |
915 | 920 | »25 | |||||||||||||
Val | Val | Thr | Sex | Kla | Gly | Val | Sex | Thr | Ly. | Tyr | Leu | Asn | Phe | Thr | Ala |
930 | »35 | 940 | |||||||||||||
Ser | Glu | Asn | Thr | Sex | Arg | Val | Met | Gin | Hl. | Gin | Tyr | Gin | Val | Ser | Asn |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Leu | Gly | Gin | Arg | Sex | Leu | Pro | íle | Ser | Leu | Val | Phe | Leu | Val | Pro | Val |
965 | »70 | 975 | |||||||||||||
Arg | Leu | Asn | Gin | Thr | Val | Zle | Trp | Asp | Arg | Pro | Gin | Val | Thr | Phe | Ser |
»80 | 985 | »90 | |||||||||||||
Glu | Asn | Leu | Sex | Ser | Thr | Cy. | Hla | Thr | Lys | Glu | Arg | Leu | Pro | Ser | His |
995 | 1000 | 1005 | |||||||||||||
Ser | Asp | Phe | Leu | Ala | Glu | Leu | Arg | Ly. | Ala | Pro | Val | Val | Asn | Cys | Ser |
1010 | 1015 | 1021 | ) | ||||||||||||
íle | Ala | Val | Cys | Gin | Arg | íle | Gin | Cys | Aap | íle | Pro | Phe | Phe | GLy | íle |
1021 | 5 | 1031 | ) | 103! | 5 | 1040 | |||||||||
Gin | G1U | Glu | Phe | Asn | Ala | Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | ASp | Trp |
104! | 5 | 1051 | D | 105! | 5 | ||||||||||
Tyr | íle | Lys | Thr | Ser | His | Asn | His | Leu | Leu | íle | Val | Ser | Thr | Ala | Glu |
1061 | 9 | 106: | 5 | 107i | 0 | ||||||||||
Zle | Leu | Phe | Asn | Asp | Ser | Val | Phe | Thr | Leu | Leu | Pro | Gly | Gin | Gly | Ala |
1071 | 5 | 108 i | 0 | 108! | 5 | ||||||||||
Phe | Val | Arg | Ser | Gin | Thr | Glu | Thr | Lys | Val | Glu | Pro | Phe | Glu | Val | Pro |
109 | 0 | 109 | 5 | 110 | 0 | ||||||||||
Asn | Pro | Leu | Pro | Leu | íle | Val | Gly | Ser | Ser | Val | Gly | Gly | Leu | Leu | Leu |
110 | 5 | 111 | 0 | 111 | 5 | 1120 | |||||||||
Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Ala | Ala | Leu | Tyr | Ly. | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg |
1L2 | 5 | 113 | 0 | 113 | 5 | ||||||||||
Gin | Tyr | Lys | Asp | Met | Het | Ser | Glu | Gly | Gly | Pro | pro | Gly | Ala | Glu | Pro |
1140 1145 1150
Gin (2) INFORMÁCIE O SEK.. ID. č.: 4 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1163 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 4:
Met | Thr | Arg | Thr | Arg | Ala | Ale | Leu | Leu | Leu | Phe | Thr | AL* | Leu | Ala | Thx |
1 | $ | 10 | 15 | ||||||||||||
Ser | Leu | Gly | Phe | Asn | Leu | Asp | Thr | Glu | Glu | Leu | Thx | Al* | Phe | Arg | Val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Aap | Ser | Ala | Gly | Phe | Gly | Asp | Sar | Val | Val | Gin | Tyr | Ala | Asn | Ser | Trp |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Val | Val | Gly | Ala | Pro | Gin | Ly. | íle | 11. | Ala | Ala | Asn | Gin | íle | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Leu | Tyr | Gin | Cy. | Gly | Tyr | Ser | Thr | Gly | Ala | Cys | Glu | Pro | lla | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Leu | Gin | Val | Pro | Pxo | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu |
15 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Ser | Thr | Thr | Sex | Pro | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Hl. | His | Glu | Cy. | Gly | Arg | Asn | Met | Tyr | Leu | Thr | GLy | Leu | Cy. | Phe | Leu |
115 | 120 | 12S | |||||||||||||
Leu | Gly | Pro | Thr | Gin | Leu | Thr | Gin | Arg | Leu | Pro | Val | Ser | Arg | Gin | Glu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Cys | Pro | Arg | Gin | Glu | Gin | Asp | íle | Val | Phe | Leu | íle | Asp | Gly | Ser | Gly |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | íle | Ser | Ser | Arg | Asn | Phe | Ala | Thr | Met | Met | Asn | Phe | Val | Arg | Ala |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | íle | Ser | Gin | Phe | Gin | Arg | Pro | Ser | Thr | Gin | Phe | Ser | Leu | Met | Gin |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Phe | Ser | Asn | ly. | Phe | Gin | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Glu | Glu | Phe | Arg | Arg |
195 | 200 | 20$ | |||||||||||||
Thr | Ser | Asn | Pro | Leu | Ser | Leu | Leu | Ala | Ser | Val | H1S | Gin | Leu | Gin | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Thr | Tyr | Thr | Ala | Thr | AL* | íle | Gin | Asn | Val | Val | His | Arg | Leu | Phe |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
His | Ala | Ser | Tyr | Gly | Ala | Arg | Arg | Asp | Ala | Zle | Ly. | íle | Leu | Zle | Val |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Zle | Thr | Asp | Gly | Ly. | Ly. | Glu | Gly | Asp | Ser | Leu | Aap | Tyr | Ly. | Asp | Val |
260 | 26S | 270 | |||||||||||||
Zle | Pro | Met | Ale | Asp | Ala | Ale | Gly | íle | íle | Arg | Tyx | Ala | íle | Gly | Val |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gly | Leu | Ala | Fha | Gin | Asn | Arg | Asn | Ser | Trp | Lys | Glu | Leu | Asn | Asp | Zle |
290 | 29S | 300 | |||||||||||||
Ale | Ser | Ly. | Pro | Ser | Gin | Glu | Kle | íle | Phe | Lys | Val | Glu | Aap | Phe | Aap |
305 | 310 | 31$ | 320 |
SK 283135 Β6
Ala Leu Glu Gly | Lys Thr Glý 355 | Asp 11« Gin Asn Gin L«u | Lys Glu Lys íle Phe 330 Ser Phe Glu Leu Glu 350 | Ala 11« 335 Met Ala Leu Gly | |||||||||||
Glu 340 Phe | 325 Thr íle Ser Ser Ser 345 | ||||||||||||||
Gin | Glu | ||||||||||||||
Ser | Ala | Val | Phe 360 | Thr | Pro | Asp | Gly | Pro 365 | Val | ||||||
Ala | Val | Gly | Ser | Phe | Thr | Trp | Ser | Gly Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | |
370 | 375 | 360 | |||||||||||||
Asn | Met | Ser | Pro | Thr | Phe | Zle | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met |
365 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Arg | Asp | Sar | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lya | Gly |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Val | Gin | Ser | Leu | Val | Leu | Gly | Ale | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | íle | Gly | Lys |
420 | 42S | 430 | |||||||||||||
Ala | Val | 11« | Phe | íle | Gin | Val | Ser | Arg | Gin | Trp | Arg | Met | Lys | Ale | Glu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Val | 11« | Gly | Thr | Gin | íle | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Alt | Ser | Leu | Cys | Ser |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Val | Asp | Val | Asp | Thr | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | íle | Gly | Ala |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Pro | His | Tyr Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | ||
465 | 490 | 495 | |||||||||||||
Leu | Pro | Arg Gly Trp Arg Arg Trp Trp Cys Asp | Ala | Val | Leu | Tyr Gly | |||||||||
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Glu | Gin | Gly | His | Pro Trp | Gly Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | ||
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gly | Asp | Val | Asn | GLy Asp | Lys | Leu | Thr | Asp | Val | Val | íle | Gly | Ala | Pro | |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gly | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | val | Tyr | Leu | Phe | HiS | Gly | Val | Leu |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gly | Pro | Ser | íle | Ser | Pro | Ser | His | Ser | Gin | Arg | 11« | Ala | Gly | Ser | Gin |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Leu | Ser | Ser | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin |
580 | S85 | 590 | |||||||||||||
Asp | Leu | Thr | Glh | Asp Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly | |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gin | val | Leu | Leu | Leu Arg | Thr | Arg | Pro | Val | Leu | Trp | Val | Gly | Val | Ser | |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Met | Gin | Phe | íle | Pro | Ala | Glu | íle | Pro | Arg | Ser | Ala | Phe | Glu | Cys | Arg |
625 | 630 | 635 | 640 |
Glu Gin Tyr íle | Val Asp Val 675 | Val Ser Glu Gin Thr Leu | Val Gin Ser Asn Zle Cys Leu | ||||||||||||
Lys 660 Thr | 645 | 650 | 655 Leu Gin | ||||||||||||
Arg Ser Leu Asp | Lys Asn Leu 665 | Leu Gly | Ser Arg Asp 670 | ||||||||||||
Ser | Ser | ||||||||||||||
Leu | Ala 680 | Leu | Ala | Pro | Gly | Arg Leu 685 | Ser | Pro | |||||||
Arg | Ala | íle | Phe | Gin | Glu | Thr | Lys | Asn | Arg | Ser | Leu | Ser | Arg | Val | Arg |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Val | Leu | Gly | Leu | Lys | Ala | His | Cys | Glu | Asn | Phe | Asn | Leu | Leu | Leu | Pro |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Ser | Cys | Val | Glu | Asp | Ser | Val | íle | Pro | íle | íle | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Thr | Leu | Val | Gly | Lys | Pro | Leu | Leu | Ala | Phe | Arg | Asn | Leu | Arg | Pro | Met |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Leu | Ala | Ala | Leu | Ala | Gin | Arg | Tyr | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Lys | Asn | Cys Gly | Ale | Asp | His | íle | Cys | Gin | Asp | Asn | Leu | Gly | íle | Ser | |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Phe | Ser | Phe | Pro | Gly | Leu | Lys | Sar | Leu | Leu | Val | Gly | Ser | Asn | Leu | GlU |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Leu | Asn | Ala | Glu | Val | Met | Val | Trp | Asn | Asp | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Thr | Thr | íle | Thr | Phe | Ser | His | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr Arg | Tyr | Val | |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ala | Glu | Gly | Gin | Lys | Gin | Gly | Gin | Leu | Arg | Ser | Leu | His | Leu | Thr | Cys |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Cys | Ser | Ala | Pro | Val | Gly | Ser | Gin | Gly | Thr | Trp | Ser | Thr | Ser | Cy. | Arg |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
íle | Asn | His | Leu | íle | Phe | Arg | Gly | Gly | Ala | Gin | íle | Thr | Phe | Leu | Ala |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Pro | Lys | Ala | Val | Gly | Leu | Asp | Arg | Leu | Leu | Leu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
íle | Ala | Asn | Val | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | íle | Pro | Arg | Thr | Ser | Lys | Thr |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
íle | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala | Val | Tyr | íle | Val | Val |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Ser | Ser | HiS | Glu | Gin | Phe | Thr | Lys | Tyr | Leu | Asn | Phe | Ser | Glu | Ser | Glu |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Glu | Lys | Glu | Ser | His | Val | Ala | Met | His | Arg | Tyr | Gin | Val | Asn | Asn | Leu |
945 | 950 | 955 | 960 |
Gly Gin Arg | Asp Leu 965 Glu Ala 980 Leu Arg | Pro Val Ser íle Aan Phe Trp Val Pro 970 | Val Glu 975 Pro Gin | ||||||||||||
Leu Asn | Asn Gin Pro Ser 995 | ||||||||||||||
Val Trp Met Asp Val Glu | Val Ser His | ||||||||||||||
Cys | 985 | Ala | 990 Pro Pro 1005 | ||||||||||||
Ser | Ser Glu Lys 1000 | 11« | Ala | Ser | |||||||||||
Asp | Phe | Leu | Ala | His | íle | Gin | Lys | Asn | Pro | Val | Leu | Asp ) | Cys | Ser | íle |
1010 | 1015 | 102( | |||||||||||||
Ala | Gly Cys | Leu | Arg | Phe | Arg | Cys | Asp | Val | Pro | Sar | Phe | Ser | Val | Gin | |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | ||||||||||||
Glu | Glu | Leu | Asp | Phe | Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly Trp | Val | |
1045 | 1OS0 | 1055 | |||||||||||||
Arg | Gin | íle | Leu | Gin | Lys | Lys | Val | Ser | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | íle |
1060 | 1065 | 1070 | |||||||||||||
íle | Phe | Asp | Thr | Ser | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe |
1075 | 1080 | 1085 | |||||||||||||
Met | Arg | Ala | Gin | Thr | íle | Thr | Val | Leu | Glu | Lya | Tyr | Lys 3 | Val | His | Asn |
1090 | 1095 | 110< | |||||||||||||
Pro | Zle | Pro | Leu | íle | Val | Gly | Ser | Ser | 11« | Gly Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | |
1105 | 1110 | 1115 | 1120 | ||||||||||||
Ala | Leu | íle | Thr | Ala | Val | Leu | Tyr | Lys | Val | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | Gin |
1125 | 1130 | 1135 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Glu | Met | Met | Glu | Glu | Ala | Asn | Gly Gin | íle | Ala | Pro | Glu Asn | ||
1140 | 1145 | 1150 | |||||||||||||
Gly | Thr | Gin | Thr | Pro | Ser | Pro | Pro | Ser Glu Lys | |||||||
1155 | 1160 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 5 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 12 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 5:
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gin 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 6:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 6:
TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA 35 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 7:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 7:
TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. i.: 8:
TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. ¢.: 9:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 9:
TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 10:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 10
TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 11:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 11:
TGRAANACCA TNGGYTC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 12:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 12:
TTGGAAGACC ATNGGYTC (2) INFORMÁCIE O SEK ID. č.: 13:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 13:
ATTAACCCTC ACTAAAG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 14:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 14:
AATACGACTC ACTATAG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. í.: 15:
Val Phe Gin Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin
5 10 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi)OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 16:
Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gin Pro íle 1 5 10 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 12 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 17:
Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val íle Pro Gin Ala Glu
5 10 17 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID: č.: 18:
Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa
5 10 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 19 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 19:
Thr Ser Pro Thr Phe íle Xaa Met Ser Gin Glu Asn Val Asp 1 5 10 17 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. ¢.: 20:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 20:
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gin Thr Gly
10 15
Arg (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 21:
Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala
5 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. t.: 22:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 22:
Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu
5 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 23:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 23:
RAANCCYTCY TGRAAACTYT C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1006 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 24:
TTCAXCCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCAAGAGGA TGGAGCT&GC TTTGGACAGA60
GCGTGGCCCA GCTTGGCGGA TCTAGACTCG TGGTGGGAGC CCCCCTGGÄG GTGGTGGCGG120
TCAÄCCAAAC AGGAASGTTG TATGACTGTG TGGCTGCCAC TGGCCTTGTC AACCCATACC180
CCTGCACACA CCCCCAGATG CTGTGÄACAT GTCCCTGGGT CTGTCCCTGT CAGCCGCCGC240
CAGTCGCCCC TGGCTGCTGG CCTGTGGCCC AACCATGCAC AGAGCCTGTG GGGAGAATAT300
GTATGCAGAA GGC1TTTGCC TCCTGTTGGA CTCCCATCTG CAGACCATTT GGACAGTACC360
TGCTGCCCTA CCAGAGTGTC CAAGTCAAGA GATGGACATT GTCTTCCTGA TTGATGGTTC420
TGGCAGTATG AGCAAAGTGA CTTTAAACAA ATGAAGGATT TGTGAGAGCt GTGATGGGAC480
AGTTTGAGGG CACCCAAACC CTGTTCTCAC TGATACAGTA TCCCACCTCC CTGAAGATCC540
ACTTCACCTT CACGCAATTC CAGAGCAGCT GGAACCCTCT GAGCCTGGTG GATCCCATTG600
TCCAACTGGA CGGCCTGACA TATACAGCCA CGGGCATCCG GAAAGTGGTG GAGGAACTGT660
TTCATAGTAA GAATGGGGCC CGIAAAAGTG CCAAGAAGAT CCTCATIGTC ATCACAGATG720
GCAAAAATAC AAAGACCCCC TGGAGTACGA GGACGTATCC CCAGGCAGAG AGAGCGGATC780
ATCCGCTATG CCATTGGGGT GGGAGATGCT TTCTGGAAAC CCAGTGCCAA GCAGGAGCTG840
GACAÄCATTG gctcagagcc GGCTCAGGAC CATGTGTTCA GGGTGGACAA CTTTGCAGCA900
CTCAGCAGCA TCCAGGAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTTTG CACTCGAAGG AACCCAGTCG960
ACGACAAGTA GCTCTTTCCA ACATGAGATG TTCCAAGAAG GGTTCA1006 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV; jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 25:
GTNTTYCARG ARGAYGG 17 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 26 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 26:
CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 27:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 27:
AGTTACGAATTCGCCACCATGGCrCTACGGGTGCTTCITCTG 42 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 28:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 28:
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTICTIC TG 42 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 29:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 29:
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 30:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 30:
TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 31:
GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 32:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 32:
ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 33:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 37 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 33:
ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. í.: 34:
TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24
ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA GAG CCA GTG AAC ATG | 240 | |||||||||||||||
Mat Cys Gin Pro 11· Val | Leu | Arg | Ser | Pro Uu Glu Ala Val Asn Mat | ||||||||||||
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | GTG | ACT | GCC | ACC | AAT | AAC | GCC | CAG | TTG | CTG | 299 |
Ser | Uu | Gly | Leu | Ser | Uu | Val | Thr | Ala | Thr | Asn | Aan | Ala | Gin | Leu | Uu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | CAG | AGA | GCT | TGT | GTG | AAG | AAC | ATG | TAT | GCG | 336 |
Ala | Cye | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | Ala | Cys | Val | Lys | Asn | Met | Tyr | Ala | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT | CTC | GGC | TCC | AGC | TTG | CAG | TTC | ATC | CAG | GCA | 384 |
Lys | Gly | Ser | Cye | Leu | Uu | Leu | Gly | Ser | Ser | U u | Gin | Phe | Zle | Gin | Ala | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
GTC | CCT | GCC | TCC | ATG | CCA | GAG | TGT | CCA | AGA | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GCT | 432 |
Val | Pro | Ala | Ser | Met | Pro | Glu | Cye | Pro | Arg | Gin | G1U | Het | Asp | íle | Ala | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
TTC | CTG | ATT | GAT | GGT | TCT | GGC | AGC | ATT | AAC | CAA | AGG | GAC | TTT | GCC | CAG | 480 |
Ph· | Uu | 11« | Asp | Gly | Ser | Cly | Ser | 11· | Asn | Gin | Arg Asp | Phe | Ala | Gin | ||
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AAA | GCT | TTG | ATG | GGA | GAG | TTT | GCG | AGC | ACC | AGC | 529 |
Het | Lye | Asp | Ph· | Val | Ly· | Ala | Leu | Met | Gly | Glu | Phe | Ale | Ser | Thr | Ser | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
ACC | TTG | TTC | TCC | CTG | ATG | CAA | TAC | TCG | AAC | ATC | CTG | AAG | ACC | CAT | TTT | 576 |
Thr | Uu | Ph· | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | Asn | íle | Leu | Lye | Thr | Hls | Phe | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
ACC | TTC | ACT | GAA | TTC | AAG | AAC | ATC | CTG | GAC | CCT | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | 624 |
Thr | Ph· | Thr | Glu | Ph· | Lye | Asn | XI· | Leu | Asp | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
CCC | ATT | GTC | CAG | CTG | CAA | GGC | CTG | ACC | TAC | ACA | GCC | ACA | GGC | ATC | CGG | 672 |
Pro | 11· | Val | Gin | Leu | Gin | Gly | Uu | Thr | Tyr | Thr | Ala | Thr | Gly | íle | Arg | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
ACA | GTG | ATG | GAA | GAG | CTA | TTT | CAT | AGC | AAG | AAT | GGG | TCC | CGT | AAA | AGT | 720 |
Thr | Vel | Met | Glu | Glu | Uu | Ph· | Hla | Ser | Lys | Asn | Gly | Ser | Arg | Lys | Ser | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | CTT | GTC | ATC | ACA | GAT | GGG | CAG | AAA | TAC | AGA | GAC | 768 |
AL* | Lys | Ly· | 11« | Leu | Uu | Val | IL« | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Arg | Asp | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
CCC | CTG | GAG | TAT | AGT | GAT | GTC | ATT | CCC | GCC | GCA | GAC | AAA | GCT | GGC | ATC | 916 |
Pro | Uu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | 11« | Pro | Ala | Ala | Asp | Lys | Ala | Gly | íle | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
ATT | CGT | TAT | GCT | ATT | GGG | GTG | GGA | GAT | GCC | TTC | CAG | GAG | CCC | ACT | GCC | 864 |
XI· | Arg | Tyr | Ala | 11« | Gly | Val | Gly Asp | Ala | Phe | Gin | G1U | Pr© | Thr | Ala | ||
275 | 290 | 285 | ||||||||||||||
CTG | AAG | GAG | CTG | AAC | ACC | ATT | GGC | TCA | GCT | CCC | CCA | CAG | GAC | CAC | GTG | 912 |
Leu | Lys | G1U | Leu | Asn | Thr | 11« | Gly | Ser | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | |
290 | 295 | 300 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 35:
TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24
TTC | AAG | GTA | GGC | AAC | TTT | GCA | GCA | CTT | CGC | AGC | ATC | CAG | AGG | CAA | CTT | 960 |
Phe | Ly· | Val | Gly | Aan | Phe | Ala | Ala | Uu | Arg | Ser | íle | Gin | Arg | Gin | Leu | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
CAG | GAG | AAA | ATC | TTC | GCC | ATT | GAG | GGA | ACT | CAA | TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | 1008 |
Gin | G1U | Ly* | íle | Phe | Al* | íle | Glu | Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG | TCA | CAA | GAA | GGT | TTC | AGT | TCA | GCT | CTC | ACA | 1056 |
Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | Clu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Thr | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
TCG | GAT | GGA | CCC | GTT | CTG | GGG | GCC | GYG | GGA | AGC | TTC | AGC | TGG | TCC | GGA | 1104 |
Ser | A»P | Gly | Pro | Val | Uu | Gly | Ala | Xaa | Gly | Set | Phe | Ser | Trp | Sex | Gly | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
GGT | GCC | TTC | TTA | TAT | CCC | CCA | AAT | ACG | AGA | CCC | ACC | TTT | ATC | AAC | ATG | 1152 |
Gly | Ala | Ph· | Uu | Tyr | Pro | Pro | Asn | Thr | Arg | Pro | Thr | Phe | Xle | Asn | Met | |
370 | 375 | 380 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 3528 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..3456
(xi) | OP | IS SEKVENCIE: | SE | K. 1 | ID. | č.:. | 36: | |||||||||
GGC | TGG | GCC | CTG | GCT | TCC | TGT | CAT | GGG | TCT | AAC | CTG | GAT | GTG | GAG | GAA | 48 |
Gly | Trp | Al* | L«u | Ala | Ser | Cys | Hla | Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu | |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
CCC | ATC | GTG | TTC | AGA | GAG | GAT | GCA | GCC | AGC | TTT | QGA | CAG | ACT | GTG | GTG | 9í |
Pro | 11· | Val | Phe | Arg | Glu | Asp | Ala | Ale | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | Val | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
CAG | TTT | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | GTG | GGA | GCC | CCT | CTG | GAG | GCG | GTG | 144 |
Gin | Ph· | Gly | Gly | Ser | Arg | Uu | Val | val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | |
3$ | 40 | 45 | ||||||||||||||
GCA | GTC | AAC | CAA | ACA | GGA | CGG | TTG | TAT | GAC | TGT | GCA | CCT | GCC | ACT | GGC | 192 |
Ala | Val | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu | Tyr | Asp | Cys | Ala | Pro | Ala | Thr | Gly |
SS 60
TCT | CAG | GAG | AAT | GTG | GAC | ATG | AGA | GAC | TCC | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC |
Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp | Met | Arg | Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
GCA | GTG | GCC | TTT | TGG | AAG | GGG | GTT | CAC | AGC | CTG | ATC | CTG | GGG | GGC | CCG |
Ala | Val | Ala | Phe | Trp | Lys | Gly | Val | Hl* | Ser | Uu | íle | Uu | Gly | Ala | Pro |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
CGT | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG | AAG | GTT | GTC | ATC | TTT | ACC | CAG | GAA | GCC | AGG |
Arg | Hla | Gin | H18 | Thr | Gly | Lys | Val | Val | íle | Phe | Thr | Gin | Glu | Ala | Arg |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
CAT | TGG | AGG | CCC | AAG | TCT | GAA | GTC | AGA | GGG | ACA | CAG | ATC | GGC | TCC | TAC |
Kla | Trp | Arg | Pro | Lya | Ser | Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | Xle | Gly | Ser | Tyr |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
TTC | GGG | GCC | TCT | CTC | TGT | TCT | GTG | GAC | GTG | GAT | AGA | GAT | GGC | AGC | ACY |
Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | Asp | Val | Asp | Arg | Asp | Gly | Ser | Xaa |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
GAC | CTG | GTC | CTG | ATC | GGA | GCC | CCC | CAT | TAC | TAT | GAG | CAG | ACC | CGA | GGG |
Asp | Leu | Val | Leu | Xle | Gly | Ala | Pro | K13 | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly |
465 | 470 | 475 | 490 | ||||||||||||
GGG | CAG | GTC | TCA | GTG | TKC | CCC | GTG | CCC | GGT | GTG | AGG | GGC | AGG | TGG | CAG |
Gly | Gin | Val | Ser | Val | Xaa | Pro | Val | Pro | Gly | Val | Arg | Gly | Arg | Trp | Gin |
405 | 490 | 495 | |||||||||||||
TGT | GAG | GCC | ACC | CTC | CAC | GGG | GAG | CAG | GRC | CAT | CCT | TGG | GGC | CGC | TTT |
Cys | Glu | Ala | Thr | Leu | His | Gly | Glu | Gin | Xaa | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Ph· |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
GGG | GTG | GCT | CTG | ACA | GTG | CTG | GGG | GAC | GTA | AAC | GGG | GAC | AAT | CTG | GCA |
Gly | Val | Ala | Leu | Thr | Val | Uu | Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Asn | Leu | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
GAC | GTG | GCT | ATT | GGT | GCC | CCT | GGA | GAG | GAG | GAG | AGC | AGA | GGT | GCT | GTC |
Asp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Sar | Arg | Gly | Ala | Val |
530 | 535 | 540 |
1200
124 9
1296
1344
1392
1440
148B
1536
1594
1632
TAC ΑΤΑ TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC ATG CCC TCA CCC AGC | |||||||||||||||
Tyr 11· Ph· 545 | Hla | Gly | Ala Ser 550 | Arg Leu | Glu | íle Met Pro Ser Pro Ser | |||||||||
555 | 560 | ||||||||||||||
CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC | CAG | CTC | TCC | CTG | AGA | CTG | CAG | TAT | TTT | GGG |
Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser | Gin | Leu | Ser | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
CAG | TCA | TTG | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC | CTT | ACA | CAG | GAT | GGC | CTG | GTG | GAC |
Gin | 8«r | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp |
580 | 595 | 590 | |||||||||||||
CTG | GCC | GTG | GGA | GCC | CAG | GGG | CAC | GTA | CTG | CTG | CTC | AGG | AGT | CTG | CCT |
Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin | Gly | His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro |
59S | 600 | 605 | |||||||||||||
CTG | CTG | AAA | GTG | GAG | CTC | TCC | ATA | AGA | TTC | GCC | CCC | ATG | GAG | GTG | GCA |
Leu | Leu | Lye | Val | Clu | Leu | Ser | íle | Arg | Phe | Ale | Pro | Het | Glu | Val | Ala |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
MG | GCT | GTG | TAC | CAG | TGC | TGG | GM | AGG | ACT | CCC | ACT | GTC | CTC | GM | GCT |
Lys | Ala | Val | Tyr | Gin | Cy» | Trp | Glu | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala |
625 | 630 | <35 | 640 | ||||||||||||
GGA | GAG | GCC | ACT | GTC | TGT | CTC | ACT | CTC | CAC | AAA | GGC | TCA | CCT | GAC | CTG |
Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cya | Leu | Thr | Val | Hla | Lya | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
TTA | GGT | AAT | GTC | CAA | GGC | TCT | GTC | AGG | TAT | GAT | CTG | GCG | TTA | GAT | CCG |
Leu | Gly | Asn | Val | Gin | Gly | Ser | Val | Arg | Tyr Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | |
660 | 665 | .670 | |||||||||||||
GGC | CGC | CTG | ATT | TCT | CGT | GCC | ATT | TTT | GAT | GAG | ACT | AAG | AAC | TGC | ACT |
Gly Arg | Lau | 11· | Ser | Arg | Ala | íle | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr | |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
TTG | ACG | GSA | AGG | AAG | ACT | CTG | GGG | CTT | GGT | GAT | CAC | TGC | GAA | ACA | GTG |
Leu | Thr | Gly Arg | Lys | Thr | Leu | Gly | Leu | Gly Asp | His | Cys | Glu | Thr | Val | ||
690 | 69S | 700 | |||||||||||||
AAG | CTG | CTT | TTG | CCG | GAC | TGT | CTG | GAA | GAT | CCA | GTG | AGC | CCT | ATC | ATC |
Lys | Leu | Leu | L«u | Pre | Aap | Cya | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Ser | Pro | íle | íle |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
CTG | CGC | CTC | AAC | TTT | TCC | CTG | GTG | AGA | GAC | TCT | GCT | TCA | CCC | AGG | AAC |
Leu | Arg | Leu | Aan | Phe | Ser | Leu | Val | Arg | Aap | Ser | Ale | Ser | Pro | Arg | Asn |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
CTG | CAT | CCT | GTG | CTG | GCT | GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | CAC | ATA | ACT | GCT | TCT |
Leu | Hla | Pro | Val | Leu | Ale | Val | Gly | Ser | Gin | Asp | Hla | íle | Thr | Ala | Ser |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
CTG | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | TGT | AAG | CM | GM | CTC | CTG | TGT | GAG | GGG | GAC |
Leu | Pro | Phe | Glu | Lya | Aan | Cya | Lys | Gin | Glu | Leu | Leu | Cys | Glu | Gly Asp | |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
CTG | GGC | ATC | AGC | TTT | AAC | TTC | TCA | . GGC | CTG | CAG | GTC | TTG | GTG | GTG | : GGA |
Leu | Gly | 11· | Ser | Phe | Aan | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | Val | Val Gly | |
770 | 775 | 790 |
16B0 | CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC CTC AGC TTC GGC TGG | 3120 | |||||||||||||||
Gin Asp 1025 | Glu | Leu | Asp Phe íle Leu 1030 | Arg Gly | Asn Leu Ser Phe Gly Trp | ||||||||||||
1035 | 1040 | ||||||||||||||||
1728 | GTC | AGT | CAG | ACA | TTG | CAG | GAA | AAG | GTG | TTG | CTT | CTG | AGT | GAG | GCT | GAA | 3168 |
Val | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin | Glu | Lys | Val | Leu | Leu | Val | Ser | Glu | Ala | Glu | ||
1045 | 1050 | 1055 | |||||||||||||||
1776 | ATC | ACT | TTC | GAC | ACA | TCT | GTG | TAC | TCC | CAC | CTG | CCA | GGA | CAG | GAG | GCA | 3216 |
íle | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Cln | Clu | Ale | ||
1060 | 1065 | 1070 | |||||||||||||||
1824 | TTT | CTG | AGA | GCC | CAG | GTG | GAG | ACA | ACG | TTA | GAA | GAA | TAC | GTG | GTC | TAT | 3264 |
Phe | Leu | Arg | Ala | Gin | Val | Clu | Thr | Thr | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val | Val Tyr | |||
1075 | 1080 | 10B5 | |||||||||||||||
1872 | GAG | CCC | ATC | TTC | CTC | GTG | GCG | GGC | AGC | TCG | GTG | GGA | GGT | CTG | CTG | TTA | 3312 |
Glu | Pro | íle | Phe | Leu | Val | Ala | Gly | Ser | Ser | Val | Gly Gly | Leu | Leu | Leu | |||
1090 | 1095 | 1100 | |||||||||||||||
1920 | CTG | GCT | CTC | ATC | ACA | GTG | GTA | CTG | TAC | AAC | CTT | GGC | TXC | TXC | AM | CCT | 3360 |
Leu | Ma | Leu | íle | Thr | Val | Val | Leu | Tyr | Lya | Leu | Gly | Xaa | Xaa | Lys | Arg | ||
1105 | 1110 | 1115 | 1120 | ||||||||||||||
1968 | CAG | TAC | AM | GM | ATG | CTG | GAC | GGC | AAG | GCT | GCA | GAT | CCT | GTC | ACA | GCC | 3408 |
Gin | Tyr | Lya | Glu | Met | Leu | Asp | Gly | Lya | Ma | Ma | Aap | Pro | Val | Thr | Ma | ||
1125 | 1130 | 1135 | |||||||||||||||
2016 | GGC CAG 3163 | GCA | GAT | TTC | GGC | TGT | GAG | ACT | CCT | CCA | TAT | CTC | GTG | AGC | TAGGAATCCA | ||
Giy Gin | Ma | Asp | Phe Giy Cys | Glu | Thr | Pro | Pro | Tyr | Leu | Val | Ser | ||||||
1140 | 1145 | 1150 |
CTCTCCTGCC TATCTCTSNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA 3523
CGAGT
3528
GGC | TCC | CCA | GAG | CTC | ACT | GTG | ACA | GTC | ACT | GTG | TGG | AAT | GAG | GGT | GAG |
Gly | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu |
785 | 790 | 79S | 800 | ||||||||||||
GAC | AGC | TAT | GGA | ACT | TTA | GTC | AAG | TTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GGG | CTA | TCT |
Aap | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Val | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
TAC | CGA | CGG | GTA | ACA | GGG | ACT | CAG | CM | CCT | CAT | CAG | TAC | CCA | CTA | CGC |
Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Gly | Thr | Gin | Gin | Pro | Hla | Gin | Tyr | Pro | Leu | Arg |
B20 | 825 | 830 | |||||||||||||
TTG | GCC | TGT | GAG | GCT | GAG | CCC | GCT | GCC | CAG | GAG | GAC | CTG | AGG | AGC | AGC |
Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu | Pro | Ma | Ma | Gin | Glu | Asp | Leu | Arg | Ser | Ser |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
AGC | TGT | AGC | ATT | AAT | CAC | CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | GGT | GCA | AAG | ACC | ACC |
Ser | Cys | Ser | IL· | Asn | His | Pro | íle | Phe | Arg | Glu | Gly | Ma | Lys | Thr | Thr |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
TTC | ATG | ATC | ACA | TTC | GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | TTC | CTA | GGA | GAC | AGG |
Phe | Met | íle | Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ma | Phe | Leu | Gly | Asp | Arg |
665 | 870 | 875 | B80 | ||||||||||||
TTG | CTT | CTG | AGG | GCC | AAA | GCC | AGC | AGT | GAG | AAT | AAT | AAG | CCT | GAT | ACC |
Leu | Leu | Leu | Arg | Ale | Lya | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Pro | Aap | Thr |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
AAC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | CTG | GAG | CTC | CCA | GTG | AAG | TAC | ACC | GTC | TAT |
Asn | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin | Leu | GLu | Leu | Pro | val | Lys | Tyr | Thr | Val | Tyr |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
ACC | CTG | ATC | AGT | AGG | CAA | GAA | GAT | TCC | ACC | AAC | CAT | GTC | AAC | TTT | TCA |
Thr | Leu | íle | Ser | Arg | Gin | Glu | Asp | Ser | Thr | Asn | His | Val | Asn | Phe | Ser |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
TCT | TCC | CAC | GGG | GGG | AGA | AGG | CAA | GAA | GCC | GCA | CAT | CGC | TAT | CGT | GTG |
Ser | Ser | His | Gly | Gly | Arg | Arg | Gin | Glu | Ala | Ala | HÍS | Arg | Tyr | Arg | Val |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
AAT | AAC | CTG | AGT | CCA | CTG | AAG | CTG | GCC | GTC | AGA | GTT | AAC | TTC | TGG | GTC |
Asn | Aan | Leu | Ser | Pro | Leu | Lys | Leu | Ala | Val | Arg | Val | Asn | Phe | Trp | Val |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
CCT | GTC | CTT | CTG | AAC | GGT | GTG | GCT | GTG | TGG | GAC | GTG | ACT | CTG | AGC | AGC |
Pro | val | Leu | Leu | Asn | Gly | Val | Ala | Val | Trp | Aap | Val | rhf | Leu | Ser | Ser |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
CCA | GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | TGC | GTG | TCC | CAG | ATG | AAA | CCT | CCT | CAG | AAT |
Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser | Cya | Val | Ser | Gin | Het | Lya | Pro | Pro | Gin | Aan |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
CCC | GAC | TTT | CTG | ACC | CAG | ATT | CAG | AGA | . CGT | TCT | GTG | CTG | GAC | TGC | TCC |
Pro | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin | íle | Gin | Arg | Arg | Ser | Val | Leu | Asp | Cys | Ser |
995 | 100 | 0 | 100 | 5 | |||||||||||
ATT | GCT | GAC | .TGC | : CTG | CAC | TCC | CGC | : TCT | 1 GAC | ATC | : CCC | : Tce | : TTC | ! GAC | ! ATC |
íle | Ala | Asp | Cys | Leu | His | Ser | Arg | Cya | Aap | íle | Pro | i Ser | ' Leu | t Asp | ' íle |
101 | 0 | 101 | 5 | 102 | 0 |
2112
2160
220Θ
2256
2304
23S2
2400
2448
2496
2544
2592
2640
26BB
2736
2784
2832
2880
2928
2976
3C24
3072 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 37 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1151 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 37:
Gly | Trp | Ma | Leu | Ma | Ser | Cys | His | Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Pro | íle | Val | Phe | Arg | Glu | Asp | ALa | Ma | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | Val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ma | Val |
35 | <0 | 65 | |||||||||||||
hla | Val | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu | Tyr | Aap | Cya | Ala | Pro | Ma | Thr | Gly |
55 60
Het | Cys | Gin | Pro | íle | Val | Leu | Arg | Ser | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Asn | Met |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Val | Thr | Ala | Thr | Asn | Asn | ALa | Gin | Leu | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | Ma | Cys | Val | Lys | Asn | Het | Tyr | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Lya | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | Ser | Ser | Leu | Gin | Phe | íle | Gin | Ala |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
VaL | Pro | Ma | Ser | Met | Pro | Glu | Cys | Pro | Arg | Gin | Glu | Met | Asp | Zle | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Phe | Leu | íle | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | lle | Asn | Gin | Arg | Asp | Phe | Ma | Gin |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | Lys | Asp | Phe | Val | Lys | Ala | Leu | Het | Gly | Glu | Phe | Ala | Ser | Thr | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Leu | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | Asn | Zle | Leu | Lys | Thr | His | Phe |
180 | 1B5 | 190 | |||||||||||||
Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | lys | Asn | íle | Leu | Asp | Pro | Gin | Ser | Leu | VaL | Asp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Pro | íle | VaL | Gin | Leu | Gin | Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr | Ma | Thr | Gly | íle | Arg |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Val | Met | Glu | Glu | Leu | Phe | His | Ser | Lys | Aen | Gly | Ser | Arg | Lys | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ma | Lys | Lys | íle | Leu | Leu | Val | Zle | Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Arg | Asp |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | Zle | Pre | Ala | Ala | Asp | Lys | Ma | Gly | íle |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
íle | Arg | Tyr | Ala | Zle | Gly | Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Gin | Glu | Pro | Thr | Ma |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Leu | Lys | Glu | Leu | Asn | Thr | íle | Gly | Ser | Ma | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe | Ala | Ala | Leu | Arg | Ser | íle | Gin | Arg | Gin | Leu |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gin | Glu | Lys | íle | Phe | Ma | íle | Glu | Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ser | Phe | Gin | His | Glu | Met | Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Thr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ser | Asp | Gly | Pro | Val | Leu | Gly | Ma | Xaa | Gly | Ser | Phe | Ser | Trp | Ser | Gly |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | Thr | Arg | Pro | Thr | Phe | íle | Asn | Met |
370 | 375 | 380 |
SK 283135 Β6
Ser | Gin | Glu | Asn | val | Asp | Met | Arg | Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ala | Val | Ale | Phe | Trp | Lys | Gly | Val | H18 | Ser | Leu | íle | Leu | Gly | Ala | Pro |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Arg | NÍS | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Val | Val | íle | Phe | Thr | Gin | Glu | Ala | Arg |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
His | Trp | Arg | Pro | Lys | Ser | Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | íle | Gly | Ser | Tyr |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Phe | Gly | Ale | Ser | Leu | Cys | Ser | Val | Asp | Val | Aep | Arg | Asp | Gly | Ser | Xaa |
4S0 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Leu | Val | Leu | íle | Gly | Ala | Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Gly | Gin | Val | Ser | Val | Xaa | Pro | V<1 | Pro | Gly | Val | Arg | Gly | Arg | Trp | Gin |
4Θ5 | 490 | 495 | |||||||||||||
Cys | Glu | Ale | Thr | Leu | His | Gly | Glu | Gin | xaa | Kla | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gly | Val | Ale | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | Asp | val | Asn | Gly | Asp | Asn | Leu | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
ASp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pro | Gly | Clu | Glu | Glu | Ser | Arg | Gly | Ala | Vel |
530 | S35 | 540 | |||||||||||||
Tyr | íle | Phe | HÍS | Gly | Ala | Ser | Arg | Leu | Glu | íle | Met | Pro | Ser | Pro | Ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser | Gin | Leu | Ser | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin | Gly | His | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Leu | Leu | Lys | Val | Glu | Leu | Ser | íle | Arg | Phe | Ala | Pro | Met | Glu | Val | Ala |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Lys | Al· | Val | Tyr | Gin | Cys | Trp | Glu | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr | Val | His | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asn | Val | Gin | Gly | Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Gly | Arg | Leu | íle | Ser | Arg | Ala | íle | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Leu | Thr | Gly | Lys | Thr | Leu | Gly | Leu | Gly | His | Cys | Glu | Thr | Val | ||
«50 | 695 | 700 |
Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys | Val | Glu | Asp | Ala | val | Ser | Pro | íle | íle |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Leu | Arg | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu | Vel | Arg | Asp | Sar | Ala | Ser | Pro | Arg | Asn |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | His | Pro | Val | Leu | Ala | Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | íle | Thr | Ala | Ser |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
L· u | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | Lya | Gin | Glu | L«u | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Leu | Gly | íle | Ser | Phe | Asn | Ph· | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | L«u | Val | Vsi | Gly |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Gly | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Val | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Gly | Thr | Gin | Gin | Pro | His | Gin | Tyr | Pro | Leu | Arg |
020 | 625 | 830 | |||||||||||||
Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu | Pro | Ala | Ala | Gin | Glu | Asp | Leu | Arg | Ser | Ser |
835 | 840 | 849 | |||||||||||||
Ser | Cys | Ser | 11· | Asn | Hla | Pro | íle | Phe | Arg | Glu | Gly | Ale | Lys | Thr | Thr |
650 | 055 | 860 | |||||||||||||
Ph· | Met | íle | Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe | Leu | Gly | Asp | Arg |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
L«U | Leu | Leu | Arg | Ala | Lys | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Pro | Asp | Thr |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Asn | Lys | Thr | Al· | Phe | Gin | L«u | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr | Val | Tyr |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Thr | Leu | íle | Ser | Axg | Gin | Glu | Asp | Ser | Thr | Asn | His | Val | Asn | Phe | Ser |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
S«x | Ser | His | Gly | Gly | Arg | Arg | Gin | Glu | Ala | Ala | His | Arg | Tyr | Arg | Val |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Asn | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu | Lys | Leu | Ala | val | Arg | Val | Asn | Phe | Trp | Val |
945 | 950 | 9S5 | 960 | ||||||||||||
Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly | Val | Ala | val | Trp | Asp | Val | Thr | Leu | ser | Ser |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Pro | Ala | Gin | Oly | Val | Ser | Cys | val | Ser | Gin | Het | Lys | Pro | Pro | Gin | Asn |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Pro | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin | 11· | Gin | Arg | Arg | Ser | Vsi | Leu | Asp | cys | Ser |
995 | 100 | 0 | 100 | 5 | |||||||||||
11« | Kla | Asp | Cys | Leu | His | 'Ser | Arg | Cys | Asp | 11· | Pro | Ser | Leu | Asp | 11· |
1010 1015 1020
Gin | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | íle | Leu | Arg | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | ||||||||||||
val | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin | Glu | Lys | Val | Leu | Leu | Val | Ser | Glu | Ala | Glu |
1045 | 1050 | 1055 | |||||||||||||
íle | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala |
1060 | 1065 | 1070 | |||||||||||||
Phe | Leu | Arg | Ala | Gin | Val | Glu | Thr | Thr | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val | Val | Tyr |
1075 | 1080 | 1085 | |||||||||||||
Glu | Pro | íle | Phe | Leu | Val | Ala | Gly | Ser | Ser | Val | Gly | Gly | Leu | Leu | Leu |
1090 | 109! | i | 1100 | ||||||||||||
Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Val | Val | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Xaa | Xaa | Lya | Arg |
1105 | Hli | J | 1115 | 1120 | |||||||||||
Gin | Tyr | Lys | Glu | Met | Leu | Asp | Gly | Lys | Ala | Ala | Asp | Pro | Val | Thr | Ala |
1125 | 1130 | 1135 | |||||||||||||
Gly | Gin | Ala | Asp | Ehe | Gly | Cys | Glu | Thr | Pro | Pro | Tyr | Leu | Val | Ser |
1140 114S nwn (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 38:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 38:
GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 39:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK, ID. č.: 39:
GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 40:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 40:
TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 41:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 41:
GGAAACAGCTATGACCATG 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 42:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 42:
GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 43 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 25 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 43:
GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25
ATT GAT CAA 11« Asp Gin | AGT Ser | GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA GCT TTG | 585 | |||||||||||||
Asp | Phe Thr | Gin 170 | Met | Lys | Asp | Phe | Val 175 | Lys Ala Leu | ||||||||
165 | ||||||||||||||||
ATG | GGC | CAG | TTG | GCG | AGC | ACC | AGC | ACC | TCG | TTC | TCC | CTG | ATG | CAA | TAC | 633 |
Met | Gly | Gin | Leu | Ala | Ser | Thr | Ser | Thr | Ser | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TCA | AAC | ATC | CTG | AAG | ACT | CAT | TTT | ACC | TTC | ACG | GAA | TTC | AAG | AGC | AGC | 681 |
Ser | Asn | íle | Leu | Lys | Thr | Kla | Phe | Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys | Ssr | Ser | |
195 | 200 | 205 | 210 | |||||||||||||
CTG | AGC | CCT | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | GCC | ATC | GTC | CAG | CTC | CAA | GGC | CTG | 729 |
Leu | Ser | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Aap | Ala | íle | Val | Gin | Leu | Gin | Gly | Leu | |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||||
ACG | TAC | ACA | GCC | TCG | GGC | ATC | CAG | AAA | GTG | GTG | AAA | GAG | CTA | TTT | CAT | 777 |
Thr | Tyr | Thr | Ala | Ser | Gly | lis | Gin | Lys | Val | Val | Lys | G1U | L«U | Phe | Hla | |
230 | 235 | 240 |
825
ACC AAC AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CŤA ATT GTC ATC
Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys 11« Leu II· Vil íle
245 230 255 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 44:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 38 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 44:
CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 45:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 3519 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 5..3519 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 45:
ACA Thr | GA7 Aap 260 | GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CM GTC ATC | 873 | |||||||||||||
Gly | Gin Lys Phe Arg 265 | Asp | Pro | Leu | Glu Tyr Arg 270 | Hla | Val | íle | ||||||||
CCT | GAA | GCA | GAG | AAA | GCT | GGG | ATC | ATT | CGC | TAT | GCT | ATA | GGG | GTG | GGA | 921 |
Pro | GLU | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | íle | íle | Arg | Tyr | Ala | íle | Gly | Val | Gly | |
275 | 280 | 285 | 290 | |||||||||||||
GAT | GCC | TTC | CGG | GAA | CCC | ACT | GCC | CTA | CAG | GAG | CTG | AAC | ACC | ATT | GGC | 969 |
Asp | Ala | Phe | Arg | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | íle | Gly | |
295 | 300 | 305 | ||||||||||||||
TCA | GCT | CCC | TCG | CAG | GAC | CAC | GTG | TTC | AAG | GTG | GGC | AAT | TTT | GTA | GCA | 1017 |
Ser | Ala | Pro | Ser | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe | Val | Ala | |
310 | 315 | 320 | ||||||||||||||
CTT | CGC | AGC | ATC | CAG | CGG | CAA | ATT | CAG | GAG | AAA | ATC | TTT | GCC | ATT | GAA | 1065 |
Leu | Arg | Ser | íle | Gin | Arg | Gin | íle | Gin | Glu | Lys | íle | Phe | Ala | Íle | Glu | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
GGA | ACC | GAA | TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG | TCA | CAA | 1113 |
Gly | Thr | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | Ser | Ser | Phe | Gin | H1S | Glu | Met | Ser | Cln | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GAA | GGT | TTC | AGC | TCA | GCT | CTC | TCA | ATG | GAT | GGA | CCA | GTT | CTG | GGG | GCT | 1161 |
Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Ser | Mat | Asp | Cly | Pro | Val | Leu | Cly | Ala | |
355 | 360 | 365 | 370 | |||||||||||||
GTG | GGA | GGC | TTC | AGC | TGG | TCT | GGA | GGT | GCC | TTC | TTG | TAC | CCC | TCA | AAT | 120» |
Val | Gly | Gly | Phe | Ssr | Trp | Ser | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Ser | Asn | |
375 | 390 | 395 | ||||||||||||||
ATG | AGA | TCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAC | GAG | GAT | ATG | AGG | 1257 |
Mat | Arg | Ser | Thr | Phe | íle | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Glu | Asp | Het | Arg | |
390 | 395 | 400 | ||||||||||||||
GAC | GCT | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GCA | CTG | GCC | TTT | TGG | AAG | GGG | GTC | 1305 |
Asp | Ala | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Ala | Leu | Ala | Phe | Trp | Lys | Gly | Val | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
CAC | AGC | CTG | ATC | CTG | GGG | GCC | CCT | CGC | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG | AAG | : GTT | 1353 |
His | Ser | Leu | íle | Leu | Gly Ala | Pro | Arg | His | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Val | ||
420 | 425 | 430 |
GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC1401
Val II· Ph· Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lya Ser GluVal
435 440 445450
GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC 57
Met Val 1 | AGA Arg | GGG Gly | ACA Thr | CAG Gin | ATC íle 455 | GGC Gly | TCC Ser | TAC Tyr | TTT Phe | GGG Gly 460 | GCA Ala | TCT Ser | CTC Leu | TGT Cys | TCT Sex 465 | GTG Val | 1449 | ||||||||||||||||
CGT | GGA | GTT | GTG | ATC | CTC | CTG | TGT | GGC | TGG | GCC | CTG | GCT | TCC | TGT | CAT | 105 | GAC | ATG | GAT | AGA | GAT | GGC | AGC | ACT | GAC | CTG | GTC | CTG | ATT | GGA | GTC | CCC | 1497 |
Arg | Gly | Val | Val | íle | Leu | Leu | Cys | Gly | Trp | Ala | Leu | Ala | 8er | Cys | His | Aap | Met | Asp | Arg | Aap | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | íle | Gly | Val | Pro | ||
5 | 10 | 15 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||||||||||||||||||
GGG | TCT | AAC | CTG | GAT | GTG | GAG | AAG | CCC | GTC | GTG | TTC | AAA | GAG | GAT | GCA | 153 | |||||||||||||||||
Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | G1U | Lys | Pro | Val | Val | Phe | Lys | G1U | Asp | Ala | CAT | TAC | TAT | GAG | CAC | ACC | CGA | GGG | GGG | CAG | GTG | TCG | GTG | TGC | CCC | ATG | 1545 | |
20 | 25 | 30 | His | Tyr | Tyr | Glu | His | Thr | Arg | Gly Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Frc | Mat | ||||||||||||||||
485 | 490 | 495 | |||||||||||||||||||||||||||||||
GCC | AGC | TTC | GGA | CAG | ACT | GTG | GTG | CAG | TTT | GGT | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | 201 | |||||||||||||||||
Ala | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | CCT | GGT | GTG | AGG | AGC | AGG | TGG | CAT | TGT | GGG | ACC | ACC | CTC | CAT | GGG | GAG | 1593 | |
35 | 40 | 45 | 50 | Pro | Gly | Val | Arg | Ser | Arg | Trp | His | Cys | Gly | Thr | Thr | Leu | His | Gly | Glu | ||||||||||||||
500 | 505 | 510 | |||||||||||||||||||||||||||||||
GTG | GGA | GCC | CCT | CTG | GAG | GCG | GTG | GCA | GTC | AAC | CAA | ACA | GGA | CAG | TCG | 249 | |||||||||||||||||
vsi | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Ala | Val | Asn | Gin | Thr | Gly | Gin | Ser | CAG | GGC | CAT | CCT | ŤGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCG | GCT | CTG | ACA | GTG | CTA | GGG | 1641 | |
55 | 60 | 65 | Gin | Gly | HiS | pro | Trp | Gly Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | val | Leu | Gly | ||||||||||||||||
51S | 520 | 525 | 530 | ||||||||||||||||||||||||||||||
TCT | GAC | TGT | CCG | CCT | CCC | ACT | GGC | GTG | TGC | CAG | CCC | ATC | TTA | CTG | CAC | 297 | |||||||||||||||||
Ser | Asp | Cys | Pro | Pro | Ala | Thr | Gly | val | cys | Gin | Pro | íle | Leu | Leu | His | GAC | GTG | AAT | GGG | GAC | AGT | CTG | GCG | GAT | GTG | GCT | ATT | GGT | GCA | CCC | GGA | 1689 | |
70 | 75 | 80 | Asp | Val | Asn | Gly Asp | Ser | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pre | Gly | ||||||||||||||||
535 | 540 | 545 | |||||||||||||||||||||||||||||||
ATT | CCC | CTA | GAG | GCA | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | GTG | GCT | 345 | |||||||||||||||||
íle | Pro | Leu | G1U | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Val | Ala | GAG | GAG | GAG | AAC | AGA | GGT | GCT | GTC | TAC | ATA | TTT | CAT | GGA | GCC | TCG | AGA | 1737 | |
85 | 90 | 95 | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | 11· | Phe | His | Gly | Ala | Sex | Arg | |||||||||||||||
S 50 | 555 | 560 | |||||||||||||||||||||||||||||||
GAC | ACC | AAT | AAC | TCC | CAG | TTG | CTG | GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | CAG | AGA | 393 | |||||||||||||||||
Asp | Thr | Asn | Asn | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | CAG | GAC | ATC | GCT | CCC | TCG | CCT | AGC | CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC | CAG | CTC | 1785 | |
100 | 105 | 110 | Gin | Asp | íle | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser | Gin | Leu | |||||||||||||||
565 | S70 | 575 | |||||||||||||||||||||||||||||||
GCT | TGT | GCA | AAG | AAC | ATG | TAT | GCA | AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT | CTG | GGC | 441 | |||||||||||||||||
Ala | Cys | Ala | Lys | Asn | Met | Tyr | Ale | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | TTC | CTG | AGG | CTC | CAA | TAT | TTT | GGG | CAG | TCA | TTA | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC | 1833 | |
115 | 120 | 125 | 130 | Phe | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly Gly | Gin | Asp | |||||||||||||||
580 | 585 | 590 | |||||||||||||||||||||||||||||||
TCC | AGC | TTG | CAG | TTC | ATC | CAG | GCA | ATC | CCT | GCT | ACC | ATG | CCA | GAG | TGT | 43» | |||||||||||||||||
Ser | Ser | Leu | Gin | Phe | íle | Gin | Ale | íle | Pro | Ala | Thr | Met | Pro | Glu | Cys | CTT | ACA | CAG | GAT | GGC | CTG | GTG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGA | GCC | CAG | GGG | CAC | 1881 | |
135 | 140 | 145 | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Aap | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin | Gly | His | |||||||||||||||
595 | 600 | 605 | 610 | ||||||||||||||||||||||||||||||
CCA | GGA | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GCT | TTC | CTG | ATT | GAT | GGC | TCC | GGC | AGC | 537 | |||||||||||||||||
Pro | Gly | Gin | Glu | Met | Asp | íle | Ala | Phe | Leu | íle | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | GTG | CTG | CTG | CTT | AGG | AGT | CTG | CCT | TTG | CTG | AAA | GTG | GGG | ATC | TCC | ATT | 1929 | |
150 | 195 | 160 | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ssr | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | GLy | íle | Ser | íle | |||||||||||||||
615 | 620 | 625 | |||||||||||||||||||||||||||||||
AGA | ťtt | GCC | CCC | TCA | GAG | GTG | GCA | AAG | ACT | GTG | TAC | CAG | TGC | TGG | GGA | 1977 | |||||||||||||||||
Arg | Phe | Ala | Pro | Ser | Glu | Val | Ala | Lys | Thr | Val | Tyr | GLn | cys | Trp | Gly | ||||||||||||||||||
630 | 635 | 640 |
AGG | ACT | CCC | ACT | GTC | CTC | GAA | GCT | GGA | GAG | GCC | ACC | GTC | TGT | CTC | ACT | 202S |
Ar? | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr | |
445 | 650 | 655 | ||||||||||||||
GTC | CGC | AAA | GGT | TCA | CCT | GAC | CTG | TTA | GGT | GAT | GTC | CAA | AGC | TCT | GTC | 2073 |
Val | Ar? | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Asp | Val | Gin | Ser | Ser | Val | |
660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
AGG | TAT | GAT | CTG | GCG | TTG | GAT | CCG | GGC | CGT | CTG | ATT | TCT | CGT | GCC | ATT | 2121 |
Ar? | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | íle | Ser | Ar? | Ala | íle | |
67S | 680 | 685 | 690 | |||||||||||||
TTT | GAT | GAG | ACG | AAG | AAC | TGC | ACT | TTG | ACC | CGA | AGG | AAG | ACT | CTG | GGG | 2169 |
Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr | Arg | Ar? | Lys | Thr | Leu | Gly | |
695 | 700 | 705 | ||||||||||||||
CTT | GGT | GAT | CAC | TGC | GAA | ACA | ATG | AAG | CTG | CTT | TTG | CCA | GAC | TGT | GTG | 2217 |
Leu | Gly | Asp | His | Cys | Glu | Thr | Met | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys | Val | |
710 | 715 | 720 | ||||||||||||||
GAG | GAT | GCA | GTG | ACC | CCT | ATC | ATC | CTG | CGC | CTT | AAC | TTA | TCC | CTG | GCA | 2265 |
Glu | Asp | Ala | Val | Thr | Pro | íle | íle | Leu | Arg | Leu | Asn | Leu | Ser | Leu | Ala | |
725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
GGG | GAC | TCT | GCT | CCA | TCC | AGG | AAC | CTT | CGT | CCT | GTG | CTG | GCT | GTG | GGC | 2313 |
Gly | Asp | Ser | Ale | Pre | Ser | Ar? | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | lau | Ala | Vil | Gly | |
740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
TCA | CAA | GAC | CAT | GTA | ACA | GCT | TCT | TTC | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | TGT | GAG | 2361 |
Ser | Gin | Asp | H1S | Val | Thr | Ala | Ser | Phe | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | Glu | |
755 | 760 | 765 | 770 | |||||||||||||
GGG | AAC | CTG | GGC | GTC | AGC | TTC | AAC | TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | GTC | TTG | GAG | 2409 |
Gly | Asn | Leu | Gly | Val | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | val | Leu | Glu | |
775 | 780 | 785 | ||||||||||||||
GTA | GGA | AGC | TCC | CCA | GAG | CTC | ACT | GTG | ACA | GTA | ACA | GTT | TGG | AAT | GAG | 2457 |
Val | Gly | Ser | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | |
790 | 795 | 800 | ||||||||||||||
GGT | GAG | GAC | AGC | TAT | GGA | ACC | TTA | ATC | AAG | TTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GAG | 2505 |
Gly | Glu | Asp | ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | íle | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Glu | |
805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
CTA | TCT | TAC | CGA | CGG | GTG | ACA | AGA | GCC | CAG | CAA | CCT | CAT | CCG | TAC | CCA | 2553 |
Leu | Ser | Tyr | Ar? | Arg | Val | Thr | Arg | Ala | Gin | Gin | Pro | His | Pro | Tyr | Pro | |
820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
CTA | CGC | CTG | GCA | TGT | GAG | GCT | GAG | CCC | ACG | GGC | CAG | GAG | AGC | CTG | AGG | 2601 |
Leu | Ar? | Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu | Pro | Thr | Gly | Gin | Glu | Ser | Leu | Arg | |
835 | 840 | 845 | 850 | |||||||||||||
ASC | AGC | AGC | TGT | AGC | ATC | AAT | CAC | CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | GGT | GCC | AAG | 2649 |
Ser | Ser | Ser | Cys | Ssr | íle | Asn | Kls | Pro | íle | Phe | Arg | Glu | Gly | Ala | Lys | |
855 | 860 | 865 | ||||||||||||||
GCC | ACC | TTC | ATG | ATC | ACA | TTT | GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | TTC | CTG | GGA | 2697 |
Ala | Thr | Phe | Met | íle | Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ma | Phe | Leu | Gly | |
870 | 875 | 880 |
GAC MQ TTG CIT CTG AGG GCC AGC GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT2745
Aap Ar? Leu Leu Leu Arg Ala Ser Al· S«r Ser Glu Asn Asn Lys Pro
885 890895
GAA ACC AGC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTT CCG GTG AAG TAC ACG2793
Glu Thr Ssr Lys Thr Ala Ph· Gin L«u Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr
900 905910
GTC TAT ACC GTG ATC AGT AGG CAG GAA GAT TCT ACC AAG CAT TTC AAC2841
Val Tyr Thr Val IL· Ser Ar? Gin Glu Asp Ser Thr Lys Hit Phe Asn
915 920 925930
TTC TCA TCT TCC CAC GGG GAG AGA CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT2889
Phe Ser Ser $«r His Gly Glu Arg Gin Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr
935 940945
CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC2937
Ar? Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Thr Leu Al· íle Ser Val Asn Phe
950 955960
TGG GTC CCC Trp Val Pro | ATC íle | CTT CTG Leu Leu | AAT GGT GTG GCC GTG TGG | GAT GTG ACT CTG | 2985 | |||||||||||
Asn | Gly 970 | Val | Ala Val Trp | Asp 975 | Val Thr | Leu | ||||||||||
965 | ||||||||||||||||
AGG | AGC | CCA | GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | TGT | GTG | TCA | CAG | MG | GAA | CCT | CCT | 3033 |
Ar? | Ser | Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser | Cys | Val | Ser | Gin | Arg | Glu | Pro | Pro | |
980 | 985 | 990 | ||||||||||||||
CAA | CAT | TCC | GAC | CTT | CTG | ACC | CAG | ATC | CAA | GGA | CGC | TCT | GTG | CTG | GAC | 3081 |
Gin | H1S | Ser | Asp | Leu | Leu | Thr | Gin | íle | Gin | Gly Ar? | Ser | Val | Leu | Asp | ||
995 | 1000 | 1005 | 1010 | |||||||||||||
TGC | GCC | ATC | GCC | GAC | TGC | CTG | CAC | CTC | CGC | TGT | GAC | ATC | CCC | TCC | TTG | 3129 |
Cys | Ala | íle | Ale | Asp | Cys | Leu | His | Leu | Arg | Cys | Asp | íle | Pro | Ser | Leu | |
1015 | 1020 | 1025 | ||||||||||||||
GGC | ACC | CTG | GAT | GAG | CTT | GAC | TTC | ATT | CTG | AAG | GGC | AAC | CTC | AGC | TTC | 3177 |
Gly | Thr | Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | íle | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | |
1030 | 1035 | 1040 | ||||||||||||||
GGC | TGG | ATC | AGT | CAG | ACA | TTG | CAG | AAA | AAG | GTG | TTG | CTC | CIG | AGT | GAG | 3225 |
Gly | Trp | íle | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin | Lys | Lys | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Glu | |
1045 | 1050 | 1055 | ||||||||||||||
GCT | GAA | ATC | ACA | TTC | AAC | ACA | TCT | GTG | TAT | TCC | CAG | CTG | CCG | GGA | CAG | 3273 |
Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Asn | Thr | Ser | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | |
1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||||||
GAG | GCA | TTT | CTG | AGA | GCC | CAG | GTG | TCA | ACG | ATG | CTA | GAA | GAA | TAC | GTG | 3321 |
Glu | Ala | Phe | Leu | Ar? | Ala | Gin | Val | Ser | Thr | Met | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val | |
1075 | 1080 | 1085 | 1090 | |||||||||||||
GTC | TAT | GAG | CCC | GTC | TTC | CTC | ATG | GTG | TTC | AGC | TCA | GTG | GGA | GGT | CTG | 3369 |
Val | Tyr | Glu | Pro | Val | Ph· | Leu | Met | Val | Phe | Sex | Ser | Val | Gly | Gly Leu | ||
1095 | 1100 | 1105 | ||||||||||||||
CTG | TTA | CTG | GCT | CTC | ATC | ACT | GTG | GCG | CTG | TAC | AAG | CTT | GCC | TTC TTC | 3417 | |
Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr | val | Ala | Leu Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | ||
1110 | 1115 | 1120 |
AAA CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG GAT CTA CCA TCT GCA GAT CCT GAC 3465
Lys Ar? Gin Tyr Lys Glu H·t Leu Asp Leu Pre Ser Ala Asp Pro Asp
1125 1130 1135
CCA GCC GGC CAG GCA GAT TCC AAC CAT GAG ACT CCT CCA CAT CTC ACG3513
Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn Nís Glu Thr Pro Pro His LeuThr
1140 11451150
TCC TAG3519
Ser
1155 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 46 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1151 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 46:
Met Val Arg Gly Val Val íle Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser 15 1015
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
2530
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly GLy Ser Ar?
4045
Leu Val Val Gly Ala Pro Lau Glu Ala Val Ala Val Asn Gin Thr Gly 50 5560
Gin Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gin Pro íle Leu ?0 7580
Leu His íle Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
9095
Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gin Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala 100 105110
Gin Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu.
115 120125
Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe íle Gin Ala íle Pro Ala Thr Met Pro 130 135140
Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Asp íle Ala Phe Leu íle Asp GlySer
145 150 155160
Gly Ser íle Asp Gin Ser Asp Phe Thr Gin Met Lys Asp Phe ValLys
165 170175
Ala Leu Met Gly Gin Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met
180 185190
Gin Tyr Ser Asn íle Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys
195 200205
Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Asp Als íle Val Gin Leu Gin 210 215220
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly íle Gin Lys Val Val Lys GluLeu
225 230 235240
Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys íle Leuíle
24S 25025S
Val íle Thr Asp Gly Gin Lys Phe Ar? Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His
260 265270
Vil íle Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly íle íle Arg Tyr Ala Íle Gly
275 280285
Val Gly Asp Ala Phe Ar? Glu Pro Thr Ala Leu Gin Glu Leu Asn Thr 290 295300 íle Gly Ser Ala Pro Ser Gin Asp His Val Phe Lys Val Gly AsnPhe
305 310 315320
Val Ala Leu Arg Sex íle Gin Ar? Gin íle Gin Glu Lys íle PheAla
325 330335
11« Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met 340 34S350
Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Als Leu Ser Het Asp Gly Pro Val Leu 355 360365
Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro 370 375380
Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe íle Asn Met Ser Gin Glu Asn Glu Asp
385 390 395400
Het Ar? Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser The Ala Leu Ala Phe Trp Lys
405 410415
Gly val His Ser Leu íle Leu Gly Ala Pro Ar? His Gin His Thr Gly
420 425430
Lys Val Val íle Phe Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser
435 440445
Glu Val Arg Gly Thr Gin íle Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys 450 455460
Ser Val Asp Met Asp Ar? Asp Gly Ser Thr Asp Leu Yal Leu ZleGly
465 470 475480
Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser ValCys
485 490495
Pro Met Pro Gly Val Ar? Ser Ar? Trp Hla Cys Gly Thr Thr Leu His
500 505510
Gly ' | ;iu i | Gin | Gly | His | Pro | Trp | GLy | Arg | Phe ' | Gly | Al· . | Al· | Leu | Thr | Val |
515 | S20 | 525 | |||||||||||||
Leu i | siy | Rsp | Val | Asn | Gly | Asp | Ser | Leu | Ala | Asp | V*1 . | Ala | íle | Gly | Ala |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Pro < | Sly | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Ila | Phe | Kis | Gly | Ala |
345 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser , | hrg | Gin | Aap | íle | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Leu | Phe | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Gin . | Asp | Leu | Thr | Gin | ASp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | His | val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | val | Gly | íle |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ser | íle | Arg | Phe | Ala | Pro | Ser | Glu | Val | Ala | Lys | Thr | Val | Tyr | Gin | Cys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Trp | Gly | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Al· | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Leu | Thr | Val | Arg | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | L* u | GLy | Asp | Val | Gin | Ser |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly | Arg | Leu | íle | Ser | Arg |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Me | íle | Phe | Asp | Glu | Thr | Lys | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lys | Thr |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Gly | Asp | His | Cys | Glu | Thr | Met | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
cys | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Thr | Pro | íle | íle | Leu | Arg | Leu | Asn | Leu | Ser |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Ala | Gly | Asp | Ser | Ala | Pro | Ser | Arg | Asn | Lau | Arg | Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | His | Val | Thr | Ala | Ser | Phe | Pro | Phe | G1U | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Cys | Glu | Gly | Asn | Leu | Gly | val | Ser | Phe | Asn | Phe | ser | Gly | Leu | Gin | Val |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Leu | Glu | Val | Gly | Ser | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp |
785 | 790 | 795 | Θ0Ο | ||||||||||||
Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Íle | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ale | Glu | Leu | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Arg | Ala | Gin | Gin | Pro | His | Pro |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Tyr | Pro | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys | Glu | Al* | Glu | Pro | Thr | Gly | Gin | Glu | Sar |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Leu | Arg | Ser | Ser | Ser | Cys | Ser | íle | Asn | His | Pro | íle | Phe | Arg | Glu | Gly |
950 | 855 | 860 | |||||||||||||
Ala | Lys | Ala | Thr | Phe | Het | íle | Thr | Ph* | Asp | V*1 | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe |
865 | B70 | 875 | 890 | ||||||||||||
Leu | Gly | Asp | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala | Ser | Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Lys | Pro | Glu | Thr | Ser | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys |
900 | 90S | 910 | |||||||||||||
Tyr | Thr | Val | Tyr | Thr | Val | íle | Ser | Arg | Gin | Glu | Asp | Ser | Thr | Lys | His |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Phe | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser | His | Gly | Glu | Arg | Gin | Lys | Glu | Ala | Glu | His |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu | Thr | Leu | Al· | íle | Ser | Val |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Asn | Phe | Trp | Val | Pro | íle | Leu | Leu | Asn | Gly | Val | Ale | V«1 | Trp | Asp | Val |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Thr | Leu | Arg | Ser | Pro | Ala | Gin | Gly | VaL | Ser | Cys | Val | Ser | Gin | Arg | Glu |
980 | SBS | 990 | |||||||||||||
Pro | Pro | Gin | His | Ser | Asp | Leu | Leu | Thr | Gin | íle | Gin | Gly | Arg | Ser | Val |
995 | 100< | 2 | 100! | 5 | |||||||||||
Leu | Asp | Cys | Ala | íle | Ala | Asp | Cys | Leu | Kis | Leu | Arg | Cys | Asp | íle | Pro |
101 | 0 | 101! | 5 | 102< | 0 | ||||||||||
Ser | Leu | Gly | Thr | Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | íle | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu |
102 | 5 | 103' | 0 | 103 | 5 | 1040 | |||||||||
Ser | Phe | Gly | Trp | íle | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin | Lys | Lys | Val | Leu | Leu | Leu |
104 | 5 | 105' | 0 | 105! | 5 | ||||||||||
Ser | Glu | Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Asn | Thr | Ser | Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro |
106 | 0 | 106 | S | 107 | 0 | ||||||||||
Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Leu | Arg | Ala | Gin | Val | Ser | Thr | Met | Leu | Glu | Glu |
107 | 5 | 108' | 0 | 108 | 5 | ||||||||||
Tyr | Val | Val | Tyr | Glu | Pro | Val | Phe | Leu | Met | Val | Phe | Ser | Ser | Val | Gly |
109 | 0 | 109 | 5 | 110 | 0 | ||||||||||
Gly | ' Leu | i Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Val | Ale | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly |
110 | 5 | 111 | 0 | 111 | 5 | 1120 | |||||||||
Phe | Phe | ! Lys | Arg | Gin | Tyr | Ly> | Glu | Met | Leu | Asp | > Leu | Pro | Ser | Ala | Asp |
112 | S | 113 | 0 | 113 | 5 |
Pro Asp Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His 1140 1145 1150
Leu Thr Ser
1155 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 47:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 49 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOEÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 47:
AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC
ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 48:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 48:
GCTGGACGAT GGCATCCAC 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 49:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 49:
GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 50:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 50:
GCAGCCAGCT TCGGACAGAC 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 51:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 51:
CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 52:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA : 3803 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKY ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..3486 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 52:
ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT TCC48
Het Val Arg Gly Val Val 11« Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser
1015
TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG96
Cys Hla Gly Str Asn Leu Aap Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lya Glu
2530
GAT GCA GCC AGC TTC GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA144
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg
4«45
CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGÁ192
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Aan Gin Thr Gly
SO 5560
CAG TCG TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA240
Gin Sar Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cya Gin Pro íleLeu
70 7580
CTG CAC ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG283
Leu Hla íle Pro Leu Glu Ala Val Aan Met Ser Leu Gly Leu SerLeu
9095
GTG GCT GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA335
Val Ala Aap Thr Asn Aan Ser Gin Leu Leu Ala Cys Gly Pro ThrAla
100 105110
CAG AGA GCT TGT GCA AAG AAC ATG TAT GCA AAA GGT TCC TGC CTC CTT384
Gin Arg Ala Cya Ala Lya Asn Met Tyr Ala Lya Gly Ser Cya LeuLeu
115 120125
CTG GGC TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC ATG CCA432
Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe íle Gin Ala íle Pro Ala Thr MetSto
130 135140
GAG TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGC TCC480
Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Aap íle Kla Pha Leu íle Asp GlySer
145 150 155160
GGC AGC ATT GAT CAA AGT GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA528
Gly Ser íle Aap Gin Ser Aap Phe Thr Gin Met Lya Aap Phe ValLya
165 170175
GCT TTG ATG GGC CAG TTG GCG AGC ACC AGC ACC TCG TTC TCC CTG ATG576
Ala Leu Het Gly Gin Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Pha Ser LeuMet
180 185190
CAA TAC TCA AAC ATC CTG AAG ACT CAT TTT ACC TTC ACG GAA TTC AAG624
Gin Tyr Ser Aan íle Leu Lys Thr Kla Phe Thr Phe Thr Glu PheLya
195 200205
AGC AGC CTG AGC CCT CAG AGC CTG GTG GAT GCC ATC GTC CAG CTC CAA672
Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Aap Ala íle Val Gin LeuGin
210 215220
GGC CTG ACG TAC ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG CTA720
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly 11« Gin Lya Val Val Ly* GluLeu
225 230 235240
TTT CAT AGC AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CTA ATT76B
Phe Kla Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lya Ser Ala Lya Lys íle Leuíle
245 250255
GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CAT816
Val íle Thr Asp Gly Gin Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr ArgHl*
260 265270
GTC ATC CCT GAA GCA GAG AAA GCT GGG ATC ATT CCC TAT GCT ATA GGG864
Val íle Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly íle íle Arg Tyr Ala íleGly
275 280285
GTG GGA GAT GCC TTC CGG GAA CCC ACT GCC CTA CAG GAG CTG AAC ACC912
Val Gly Aap Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gin Glu Leu AsnThr
290 295300
ATT GGC TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT960 íle Gly Sar Ala Pro Ser Gin Asp Kla Val Phe Lys Val Gly Aanphe
305 310 31S320
GTA GCA CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC1008
Val Ala Leu Arg Ser íle Gin Arg Gin íle Gin Glu Lys íle PheAla
325 330335
ATT GAA GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG1056 íle Glu Gly Thr Glu Sar Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin Kla GluMet
340 345350
TCA CAA GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG1104
Str Gin Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro ValLeu
355 360365
GGG GCT GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC1152
Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Lau TvxPro
370 375380
TCA AAT ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT1200
Ser Asn Het Arg Ser Thr Phe íle Asn Met Ser Gin Glu Asn GluAsp
385 390 395400
ATG Αββ GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG1248
Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Sar Thr Ala Leu ALa Ph« TrpLys
405 410415
GGG GTC CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG1296
Gly Val Hla Str Leu íle Leu Gly Ala Pro Arg Hla Gin Hla ThrGly
420 425430
AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT1344
Ly* Val Val íle Phe Thr Gin Glu Ser Arg Hl* Trp Arg Pro LysSer
435 440445
GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT1392
Glu Val Arg Gly Thr Gin íle Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser LeuCys
450 455460
TCT GTG GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA1440
Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Lau íleGly
465 470 415480
GTC CCC CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC1489
Val Pro Hla Tyr Tyr Glu Hla Thr Arg Gly Gly Gin Val Sar ValCys
485 <90495
CCC ATG CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT1536
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp Hla Cys Gly Thr Thr LeuHls
500 505510
GGG GAG CAG GGC CAT CCT TGG GGC CGC TTT GGG GCG GCT CTG ACA GTG1584
Gly Glu Gin Gly Hls Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Lau ThrVaL
515 520525
CTA GGG GAC GTG AAT GGG GAC AGT CTG GCG GAT GTG GCT ATT GGT GCA1632
Leu Gly Asp Val Aan Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala íle GlyAla
530 535 540
CCC GGA GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC1657
Pro Gly Glu Glu Glu Aan Arg Gly Ala Val Tyr íle Phe Hls GlyAla
545 SSO 555560
TCG AGA CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC172:
Ser Arg Gin Aap íle Ala Pro Ser Pro Ser Gin Arg Val Thr GlySer
569 570575
CAG CTC TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT GGG GGT177Ó
Gin Leu Phe Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser GlyGly
580 585590
CAG GAC CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG1824
Gin Asp Leu Thr Gin Aap Gly Leu Val Aap Leu Ala Val Gly Ala Gin
595 600605
GGG CAC GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC1872
Gly Hls Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glyíle
610 615620
TCC ATT AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC1920
8*r XI· Arg Pha Ala Pre S«r Glu Val AL* Ly* Thr V*L Tyr GLnCy*
625 630 635640
TGG GGA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT196B
Trp Glý Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr ValCys
645 650655
CTC ACT GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC2016
Leu Thr VaL Arg Lya Gly Ser Pro Asp Lau Lau Gly Aap Val GinSar
660 665670
TCT GTC AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT2064
Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu íle Ser Arg
675 680685
GCC ATT TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT2112
Ala íle Phe Aap Glu Thr Lya Aan Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr
690 695700
CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC2160
Lau Gly Leu Gly Asp Hls Cya Glu Thr Het Lys Leu Leu Leu Pro Aap
705 710 715720
TGT GTG GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC22OB
Cys Val Glu Aep Ala Val Thr Pre Xie Zle Leu Arg Leu Asn LeuSer
725 730735
CTG GCA GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT2256
Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Aan Leu Arg Pro Val LeuAla
740 745750
GTG GGC TCA CAA GAC CAT GTA ACA GCT TCT TTC CCG TTT GAG AAG AAC2304
VaL Gly Ser Gin Asp Hls Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu LyaAsn
755 760765
TGT AAG CAG GAG CTC CTG TGT GAG GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC2332
Cys Lys Gin Glu Leu Leu Cya Glu Gly Aan Leu Gly VaL Ser PheAsn
770 775780
TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT2400 phe Ser Gly Leu Gin Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu LeuThr
785 790 ?95Θ00
GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACC TTA2448
Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly ThrLeu
805 810815
ATC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GAG CTA TCT TAC CGA CGG GTG ACA AGA2496 íle Lya Phe Tyr Tyr Pro Ale Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val ThrArg
820 825830
GCC CAG CAA CCT CAT | CCG TAC Pro Tyr | CCA CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG | 2544 | |||||||||||||
Ala Gin | Gin 635 | Pro | Kla | Pro Leu 840 | Arg | Leu Ala | Cys Glu Ala Glu 845 | |||||||||
CCC | ACG | GGC | CAG | GAG | AGC | CTG | AGG | AGC | AGC | AGC | TGT | AGC | ATC | AAT | CAC | 2592 |
Pro | Thr | Gly | Gin | Glu | Ser | Leu | Arg | Ser | Ser | Ser | Cya | Ser | íle | Aan | Hla | |
850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | GGT | GCC | AAG | GCC | ACC | TTC | ATG | ATC | ACA | TTT | GAT | 2640 |
Pro | íle | Phe | Arg | GLU | Gly | Ala | Lya | Ala | Thr | Phe | Mat | Ila | Thr | Phe | Aap | |
865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | TTC | CTG | GGA | GAC | AGG | TTG | CTT | CTG | AGG | GCC | AGC | 2688 |
val | Ser | Tyr | Lya | Ala | Phe | Leu | Gly Aap | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala | Ser | ||
B85 | 890 | 895 | ||||||||||||||
GCA | AGC | AGT | GAG | AAT | AAT | AAG | CCT | GAA | ACC | AGC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | 2736 |
Al* | Ser | Ser | Glu | Aan | Aan | Lya | Pro | Glu | Thr | Ser | Lya | Thr | Ala | Phe | Gin | |
900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
CTG | GAG | CTT | CCG | GTG | AAG | TAC | ACG | GTC | TAT | ACC | GTG | ATC | AGT | AGG | CAG | 2784 |
Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lya | Tyr | Thr | Val | Tyr | Thr | Val | íle | Sex | Arg | Gin | |
915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
GAA | GAT | TCT | ACC | AAG | CAT | TTC | AAC | TTC | TCA | TCT | TCC | CAC | GGG | GAG | AGA | 2832 |
Glu | A*P | Ser | Thr | Lya | Hla | Phe | Aan | Phe | Ser | Ser | Ser | Hla | Gly | Glu | Arg | |
930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
CAG | AAA | GAG | GCC | GAA | CAT | CGA | TAT | CGT | GTG | AAT | AAC | CTG | AGT | CCA | TTG | 2880 |
Gin | Lya | Glu | Ala | Glu | Hla | Arg | tyr | Arg | Val | Aan | Aen | Lau | Ser | Pro | Leu | |
945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
ACG | CTG | GCC | ATC | AGC | GTT | AAC | TTC | TGG | GTC | CCC | ATC | CTT | CTG | AAT | GGT | 2928 |
Thr | Leu | Ala | íle | Ser | Val | Aan | Phe | Trp | Val | Pro | íle | Leu | Leu | Asn | Gly | |
965 | 970 | 975 | ||||||||||||||
GTG | GCC | GTG | TGG | GAT | GTG | ACT | CTG | AGG | AGC | CCA | GCA | CAG | GGT | GTC | TCC | 2976 |
Val | Ala | Val | Trp Aap | Val | Thr | Leu | Arg | Ser | Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser | ||
980 | 985 | 990 | ||||||||||||||
TGT | GTG | TCA | CAG | AGG | GAA | CCT | CCT | CAA | CAT | TCC | GAC | CTT | CTG | ACC | CAG | 3024 |
Cya | Val | Ser | Gin | Arg | Glu | Pro | Pro | Gin | Hla | Ser | Asp | Leu | Leu | Thr | Gin | |
99S | 1000 | 1005 | ||||||||||||||
ATC | CAA | GGA | CGC | TCT | GTG | CTG | GAC | TGC | GCC | ATC | GCC | GAC | TGC | CTG | CAC | 3072 |
íle | Gin | Gly Arg | Ser | Val | Leu | Asp | Cys | Ala | íle | Ala | Asp | Cy. | Leu | Hla | ||
1010 | 1015 | 1020 | ||||||||||||||
CTC | CGC | TGT | GAC | ATC | CCC | TCC | TTG | GGC | ACC | CTG | GAT | GAG | CTT | GAC | TTC | 3120 |
Leu | Arg 5 | Cya | Aip | íle | Pro | Ser | Leu | Gly | Thr | Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | |
102' | 1030 | 1035 | 1040 | |||||||||||||
ATT | CTG | AAG | CGC | AAC | CTC | AGC | TTC | CGC | TGG | ATC | AGT | CAG | ACA | TTG | CAG | 3168 |
íle | Leu | Lya | Gly | Aan | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | íle | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin | |
1045 | 1050 | 1053 | ||||||||||||||
AAA | AAG | GTG | TTG | CTC | CTG | AGT | GAG | GCT | GAA | ATC | ACA | TTC | AAC | ACA TCT | 3216 | |
Lya | Lya | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Glu | Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Aan | Thr | Ser | |
1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||||||
GTG | TAT | TCC | CAG | CTG | CCG | GGA | CAG | GAG | GCA | TTT | CTG | AGA | GCC | CAG | GTG | 3264 |
Val | Tyr | Ser | GLn | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Leu | Arg | Kla | Gin | Val | |
1075 | 1080 | 1083 | ||||||||||||||
TCA | ACG | ATG | CTA | GAA | GAA | TAC | GTG | GTC | TAT | GAG | CCC | GTC | TTC | CTC | ATG | 3312 |
Ser | Thr | Met | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val | Val | Tyr | Glu | Pro | Val | Phe | Leu | Het | |
1090 | 1095 | 1100 | ||||||||||||||
GTG | TTC | AGC | TCA | GTG | GGA | GGT | CTG | CTG | TTA | CTG | GCT | CTC | ATC | ACT | GTG | 3360 |
Val | Phe | Ser | Ser | Val | Gly | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Val | |
nos | 1110 | 1115 | 1120 | |||||||||||||
GCG | CTG | TAC | AAG | CTT | GGC | TTC | TTC | AAA | CGT | CAG | TAT | AAA | GAG | ATG | CTG | 3408 |
Ala | Leu | Tyr | Lya | Leu | Gly | Phe | Phe | Lya | Arg | Gin | Tyr | Lya | Glu | Met | Leu | |
1125 | 1130 | 1135 | ||||||||||||||
GAT | CTA | CCA | TCT | GCA | GAT | CCT | GAC | CCA | GCC | GGC | CAG | GCA | GAT | TCC AAC | 3456 | |
Aap | Leu | Pro | Ser | Ala | Asp | Pro | Asp | Pro | Ala Gly | Gin | Ala | Aap | Ser Aan | |||
1140 | 1145 | 1150 | ||||||||||||||
CAT | GAG | ACT | CCT | CCA | CAT | CTC | ACG | TCC | TAGGAATCTA CTTTCCTGTA | 3503 | ||||||
Hla | Glu | Thr | Pro | Pro | Hla | Leu | Thr | Sar | ||||||||
1155 | 1160 |
TATCTCCACA ATTKCGAGAT TGGTTTTGCT TTTGCCTATG AATCTACTGG CATGGGAACA 3563
AGTTCtCTTC AGCTCTGGGC TAGCCtGGGA AACTTCCCAG AÄATGATGCC CTACCTCCTG 3623
AGCTGGGAGA TTTTTATGGT TTGCCCATGT GTCAGATTTC AGTGCTGATC CACTTTTTTT 3683
GCAAGAGCAG GAATGGGGTC AGCATAAATT TACATATGGA TAAGAACTAA CACAAGACTG 3743
AGTAATATGC TCAATATTCA ATGTATTGCT TGTATAAATT TTTAAAAAAT AAAATGAAAN 3803 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 53:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 53:
Net | Val | Arg | Gly | Val | Val | íle | Leu | Leu | Cys | Gly | Trp | Ala | Leu | Ala | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Cys | His | Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Lys | Pro | Val | Val | Phe | Lys | Glu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asp | Ala | Ala | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Val | Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Ala | Val | Asn | Gin | Thr | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gin | Ser | Sar | Asp | Cys | Pro | Pro | Ala | Thr | Gly | Val | Cya | Gin | Pro | íle | Leu |
65 | 70 | 75 | 80 |
Leu Kla íle Pro Leu Glu Al* Val Aan Met Ser Leu Gly Leu Sar Leu
90 95
Val Al* Aap Thr Aan Aan Ser Gin L«u Leu Ala Cya Gly Pro Thr Al* 100 105110
Gin Arg Ala Cya Ala Lya Aan Mat Tyr Al* Lya Gly Ser Cys Leu Leu 115 120125
Leu Gly Ser Sar Leu Gin Phe íle Gin Al* íle Pro Ala Thr Met Pro 130 135140
Glu Cya Pro Gly Gin Glu Met Aap íle Ala Phe Leu íle Aap GlySer
145 150 155160
Gly Ser íle Aap Gin Ser Asp Phe Thr Gin Net Lys Asp Phe ValLys
165 170175
Ala Leu Met Gly Gin Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met 180 185190
Gin Tyr Ser Aan íle Leu Lya Thr Kla Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys 195 200205
Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Asp Ala íle Val Gin Lau Gin 210 215220
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly íle Gin Lya Val Val Lya Glu Leu
225 230 235240
Phe Hla Ser Lya Aan Gly Ala Arg Lya Ser Ala Lya Lya íle Leu íle 245 250255
Val íle Thr Aap Gly GLn Lys Phe Arg Aap Pro Leu Glu Tyr Arg Hla 260 265270
Val íle Pro Glu Ala Glu Lya Ala Gly íle íle Arg Tyr Ala íle Gly 275 280285
Val Gly Aap Ala Ph* Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gin Glu Leu Aan Thr 290 295300 íle Gly Ser Ala Pro Ser Gin Aap Hla Val Phe Lya Val Gly Aan Phe
305 310 315320
Val Ala Leu Arg Ser íle Gin Arg Gin Ila Gin Glu Lys íle Phe Ala
325 330335 íle Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Sar Phe Gin Hla Glu Met 340 345350
Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Aap Gly Pro Val Leu 355 360363
Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Kla Phe Leu Tyr Pro 370 375380
Ser Aan Met Arg Ser Thr Phe íle Aan Met Ser Gin Glu Aan Glu Asp 385 390 395400
Met Arg Kap Ala | Tyr 405 | Leu | Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys | ||||||||||||
410 | 415 | ||||||||||||||
Gly | Val | Kla | Sar | Leu | Tie | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | His | Gin | Ria | Thr | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Lya | Val | Val | íle | Phe | Thr | Gin | Glu | Ser | Arg | Kla | Trp | Arg | Pro | Ly. | Ser |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Glu | Val | Arg Gly | Thr | GLn | íle | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ser | Val | Asp | Met | Asp | Arg | Asp | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | Val | Leu | íle | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Val | Pro | His | Tyr | Tyr | Glu | His | Thr | Arg Gly Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | ||
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Met | Pro | Gly | Val | Arg | Ser | Arg | Trp | His | Cya | Gly | Thr | Thr | Leu | Ria |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gly | Glu | Gin | Gly | Hla | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | Gly Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Ser | Leu | Ala | Asp | Val | Ala | íle | Gly | Ala | |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Asn | Arg | Gly Ala | Val | Tyr | íle | Phe | His | Gly | Ala | |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Arg | Gin | Asp | íle | Ala | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Leu | Phe | Leu | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly Gly | |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | Hla | Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | Gly | íle |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ser | íle | Arg | Phe | Ala | Pro | Ser | Glu | Val | Ala | Lya | Thx | Val | Tyr | Gin | Cys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Trp Gly | Arg | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys | |
645 | 650 | 6S5 | |||||||||||||
Leu | Thr | Val | Arg | Lys | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Asp | Val | Gin | Ser |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ser | Val | Arg | Tyr Asp | Leu | Ala | Leu | Asp | Pro | Gly Arg | Leu | íle | Ser | Arg | ||
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Ala | íle | Phe | Aap Glu | Thr | Lys | Asn | Cya | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lya | Thr | |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Gly Asp | His | Cys | Glu | Thr | Met | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Aap | |
705 | 710 | 715 | 720 |
SK 283135 Β6
Cys | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Thr | Pro | íle | íle | Leu | Arg | Leu . | Asn | Lou | Ser |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Ala | Gly | Asp | Sex | Ala | Pro | Ser | Arg | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 74S | 750 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | Hla | Val | Thr | Ala | Ser | Phe | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Cys | Lys | Gin | Glu | Leu | Lou | Cys | Glu | Gly | Asn | Leu | Gly | Val | Ser | Phe | Asn |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Pha | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | Glu | Val | Gly | Ser | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr |
78$ | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ila | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Glu | Lou | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Arg |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ala | Gin | Gin | Pro | Hla | Pro | Tyr | Pro | Leu | Arg | Leu | Ale | Cys | Glu | Ala | Glu |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Pro | Thr | Gly | Gin | Glu | Ser | Leu | Arg | Ser | Ser | Ser | Cya | Ser | Zlo | Asn | Mís |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Pro | íle | Phe | Arg | Glu | Gly | Ala | Lya | Ala | Thr | Phe | Met | íle | Thr | Phe | A«p |
865 | B70 | 875 | B80 | ||||||||||||
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Phe | Leu | Gly | Asp | Arg | Lou | Leu | Leu | Arg | Ala | Ser |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Pro | Glu | Thr | Ser | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Lou | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Thr | Val | Tyr | Thr | Val | íle | Ser | Arg | Gin |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
GlU | Asp | Ser | Thr | Lys | Hls | Phe | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser | Kis | Gly | Glu | Arg |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Gin | Lys | Glu | Ala | Glu | Hls | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Sar | Pro | Leu |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Thr | Leu | Ala | íle | Ser | Val | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Ila | Leu | Leu | Asn | Gly |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | Thr | Leu | Arg | Sar | Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Cys | Val | Ser | Gin | Arg | Glu | Pro | Pro | Gin | Hla | Ser | ASP | Leu | Leu | Thr | Gin |
995 | 100 | 0 | 100 | 5 | |||||||||||
íle | Gin | Gly | Arg | Ser | Val | Leu | Asp | Cys | Ala | íle | Ala | Asp | Cys | Leu | His |
101 | 0 | 101 | 5 | 102 | 0 | ||||||||||
Leu | Arg | Cys | Asp | íle | Pro | Ser | Leu | Gly | Thr | Lou | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe |
102 | 5 | 103 | 0 | 103 | 5 | 1040 | |||||||||
íle | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | íle | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin |
1045 | 1050 | 105 | 5 | ||||||||||||
Lys | Lys | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Glu | Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Asn | Thr | Ser |
1061 | 3 | 106! | 107 | 0 | |||||||||||
val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Leu | Arg | Ala | Gin | . Val |
1075 | 1081 | 3 | 10B | 5 | |||||||||||
Ser | Thr | Met | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val | Val | Tyr | Glu | Pro | Val | Pha | Leu | i Met |
109í | 3 | 109! | 110 | 0 | |||||||||||
Val | Phe | Ser | Ser | Val | Gly | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Val |
110! | 5 | 1111 | 3 | 111. | 5 | 1120 | |||||||||
Ala | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Pha | Lys | Arg | Gin | Tyr | Lys | Glu | Met | Leu |
112! | 5 | 113i | 3 | 113 | 15 | ||||||||||
Asp | Leu | Pro | Ser | Ala | Asp | Pro | Asp | Pro | Ala | Gly | Sln | Ala | Asp | Sex | • Asn |
114i | 3 | 114 | 5 | 115 | 0 | ||||||||||
His | Glu | Thr | Pro | Pro | Kis | Leu | Thr | Ser | |||||||
115! | 5 | 116' | 0 |
GCA Ala 70 | CCT GCC ACT GGC | ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA | |||||||||||||
Pro | Ala | Thr | Gly | Met 75 | Cys | Gin | Pro Zle | Val 80 | Leu | Arg Ser Pro Leu 85 | |||||
GAG | GCA | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCT | CTG | GTG | ACT | GCC | ACC | AAT |
Glu | Ale | Val | Asn | Mat | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Val | Thr | Ala | Thr | Asn |
90 | 95 | 100 | |||||||||||||
AAC | GCC | CAG | TTG | CTG | GCT | TGT | GGT | CCA | ACT | GCA | CAG | AGA | GCT | TGT | GTG |
Asn | Ala | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala | Gin | Arg | Ala | Cya | Val |
105 | 110 | 115 | |||||||||||||
AAG | AAC | ATG | TAT | GCG | AAA | GGT | TCC | TGC | CTC | CTT | CTC | GGC | TCC | AGC | TTG |
Lya | Asn | Met | Tyr | Ala | Lys | Gly | Ser | Cya | Leu | Leu | Leu | Gly | Ser | Ser | Leu |
120 | 125 | 130 | |||||||||||||
CAG | TTC | ATC | CAG | GCA | GTC | CCT | GCC | TCC | ATG | CCA | GAG | TGT | CCA | AGA | CAA |
Gin | Phe | íle | Gin | Ala | Val | Pro | Ala | Ser | Met | Pro | G1U | Cys | Pro | Arg | Gin |
135 | 140 | 145 | |||||||||||||
GAG | ATG | GAC | ATT | GCT | TTC | CTG | ATT | GAT | GGT | TCT | GGC | AGC | ATT | AAC | CAA |
Glu | Met | Asp | Zle | Ala | Phe | Leu | íle | Asp | GLy | Sor | Gly | Sex | Zle | Asn | Gin |
150 | 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
AGG | GAC | TTT | GCC | CAG | ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AAA | GCT | TTG | ATG | GGA | GAG |
Axg Aap | Phe | Ala | Gin | Met | Lys | Asp | Phe | val | lys | Ala | Leu | Met | Gly | G1U | |
170 | 175 | 180 | |||||||||||||
TTT | GCG | AGC | ACC | AGC | ACC | TTG | TTC | TCC | CTG | ATG | CAA | TAC | TCG | AAC | ATC |
Phe | Ala | Ser | Thr | Ser | Thr | Leu | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | Asn | íle |
185 | 190 | 195 | |||||||||||||
CTG | AAG | ACC | CAT | TTT | ACC | TTC | ACT | GAA | TTC | AAG | AAC | ATC | CTG | GAC | CCT |
Leu | Lys | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys | Asn | íle | Leu | Asp | Pro |
200 | 205 | 210 | |||||||||||||
CAG | AGC | CTG | GTG | GAT | CCC | ATT | GTC | CAG | CTG | CAA | GGC | CTG | ACC | TAC | ACA |
Gin | Sar | Leu | Val | Asp | Pro | íle | Val | Gin | Lou | Gin | Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr |
215 | 220 | 225 | |||||||||||||
GCC | ACA | GGC | ATC | CGG | ACA | GTG | ATG | GAA | GAG | CTA | TTT | CAT | AGC | AAG | AAT |
Ala | Thr | Gly | íle | Arg | Thr | Val | Met | GLu | Glu | Leu | Phe | Hls | Sor | Lys | Asn |
230 | 235 | 240 | 245 | ||||||||||||
GGG | TCC | CGT | AAA | AGT | GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | CTT | GTC | ATC | ACA | GAT | GGG |
Gly | Sar | Arg | Lys | Ser | Ala | Lya | Lys | Ila | Leu | Lou | Val | Zle | Thr | Asp | Gly |
250 | 255 | 260 | |||||||||||||
CAG | AAA | TAC | AGA | GAC | CCC | CTG | GAG | TAT | AGT | GAT | GTC | ATT | CCC | GCC | GCA |
Gin | Lys | Tyr | Arg | A*P | Pro | Leu | Glu | Tyr | Sor | Asp | Val | íle | Pro | Ala | Ala |
265 | 270 | 275 | |||||||||||||
GAC | AAA | GCT | GGC | ATC | ATT | CGT | TAT | GCT | ATT | GGG | GTG | GGA | GAT | GCC | TTC |
Asp | Lys | Kla | Gly | íle | íle | Arg | Tyr | Ala | íle | Gly | Val | Gly | Asp | Ala | Phe |
280 | 285 | 290 | |||||||||||||
CAG | GAG | CCC | ACT | GCC | CTG | AAG | GAG | CTG | AAC | ACC | ATT | GGC | TCA | GCT | CCC |
Gin | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Lys | G1U | Leu | Asn | Thr | íle | Gly | Ser | Ala | Pro |
29$ 300 305
294
342
390
438
486
534
582
630
678
726
774
822
870
918
966 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 54:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 3597 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 40..3525 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 54:
AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCÄGTG ATG GCC GGT GGA GTT Met Ala Gly Gly Val 1 5
GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GTC CTG GCT TCC TGT CAT GGG TCT AAC val Ila Leu Leu Cys Gly Trp Val Leu Ala Sar Cya Hla Gly Sor Asn
1520
CTG GAT GTG GAG GAA CCC ATC GTG TTC AGA GAG GAT GCA GCC AGC TTT
Leu Asp Val Glu Glu Pro Ila Val Pha Arg Glu Asp Ala Ala Sar Phe
3035
GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG GTG GGA GCC
Gly Gin Thr Val Val Gin Pha Gly Gly Sar Arg Leu Val Val Gly Ala
4550
CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA CGG TTG TAT GAC TGT
Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys
SO65
102
150
19S
6
CCA CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC | 1014 | |||||||||||||||
Pro Gin Asp Kla Val Phe | lys | Val | Gly | Aan Phe Ala Ale Leu Arg Sor | ||||||||||||
310 | 315 | 320 | 325 | |||||||||||||
ATC | CAG | AGG | CAA | CTT | CAG | GAG | AAA | ATC | TTC | GCC | ATT | GAG | GGA | ACT | CAA | 1062 |
íle | Gin | Arg | Gin | Leu | Gin | Glu | Lya | I1O | Phe | Ala | íle | Glu | Gly | Thr | Gin | |
330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
TCA | AGG | TCA | AGT | AGT | TCC | TTT | CAG | CAC | GAG | ATG | TCA | CAA | GAA | GGT | TTC | 1110 |
Ser | Arg | Sor | Ser | Ser | Sor | Phe | Gin | Kia | Glu | Met | Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | |
345 | 350 | 355 | ||||||||||||||
AGT | TCA | GCT | CTC | ACA | TCG | GAT | GGA | CCC | GTT | CTG | GGG | GCC | GTG | GGA | AGC | 1158 |
Ser | Ser | Ala | Leu | Thr | Sor | Asp | Gly | Pro | Val | Lou | Gly | Ala | Val | Gly | Ser | |
360 | 365 | 370 | ||||||||||||||
TTC | AGC | TGG | TCC | GGA | GGT | GCC | TTC | TTA | TAT | CCC | CCA | AAT | ACG | AGA | CCC | 1206 |
Phe | Ser | Trp | Ser | Gly Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | Thr | Arg | Pro | ||
375 | 380 | 385 | ||||||||||||||
ACC | TTT | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | GAG | AAT | GTG | GAC | ATG | AGA | GAC | TCC | TAC | 1254 |
Thr | Phe | íle | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | val | Aap | Met | Arg Asp | Sex | Tyr | ||
390 | 395 | 400 | 405 | |||||||||||||
CTG | GGT | TAC | TCC | ACC | GCA | GTG | GCC | TTT | TGG | AAG | GGG | GTT | CAC | AGC | CTG | 1302 |
Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Ala | Val | Ala | Phe | Trp | Lya | Gly | Val | His | Ser | Leu | |
410 | 415 | 420 | ||||||||||||||
ATC | CTG | GGG | GCC | CCG | CGT | CAC | CAG | CAC | ACG | GGG | AAG | GTT | GTC | ATC | TTT | 1350 |
íle | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Hla | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Val | Val | íle | Phe | |
425 | 430 | 435 | ||||||||||||||
ACC | CAG | GAA | GCC | AGG | CAT | TGG | AGG | CCC | AAG | TCT | GAA | GTC | AGA | GGG | ACA | 1398 |
Thr | Gin | Glu | Ala | Arg | Kla | Trp | Arg | Pro | Lys | Sor | Glu | Val | Arg | Gly | Thr | |
440 | 445 | 4 50 | ||||||||||||||
CAG | ATC | GGC | TCC | TAC | TTC | GGG | GCC | TCT | CTC | TGT | TCT | GTG | GAC | GTG | GAT | 1446 |
Gin | íle | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Sar | Val | Asp | Val | Asp | |
455 | 460 | 46$ | ||||||||||||||
AGA | GAT | GGC | AGC | ACY | GAC | CTG | GTC | CTG | ATC | GGA GCC | CCC | CAT | TAC | TAT | 1494 | |
Arg Asp | Gly | Sor | Xaa | Aap | Leu | Val | Leu | íle | Gly | Ala | Pro | His | Tyr | Tyr | ||
470 | 475 | 480 | 485 | |||||||||||||
GAG | CAG | ACC | CGA | GGG | GGG | CAG | GTC | TCA | GTG | TTC | CCC | GTG | CCC | GGT | GTG | 1542 |
Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Phe | Pro | Val | Pro | Gly | Val | |
490 | 495 | 500 | ||||||||||||||
AGG | GGC | AGG | TGG | CAG | TGT | GAG | GCC | ACC | CTC | CAC | GGG | GAG | CAG | GGC | CAT | 1590 |
Arg | Gly Arg | Trp | Gin | Cya | Glu | Ala | Thr | Leu | His | Gly | Glu | Gin | Gly | Kla | ||
505 | 510 | 515 | ||||||||||||||
CCT | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GTG | GCT | CTG | ACA | GTG | CTG | GGG | GAC | GTA | AAC | 1633 |
Pro | Trp | Gly Arg | Phe | Gly | Val | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Gly | Aap | Val | Asn | ||
520 | 525 | 530 | ||||||||||||||
GGG | GAC | AAT | CTG | GCA | GAC | GTG | GCT | ATT | GGT | GCC | CCT | GGA | GAG | GAG | GAG | 1686 |
Gly | Aap | Asn | Leu | Ala | Aap | val | Ala | íle | GLy | Ala | Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | |
535 | 540 | 545 |
SK 283135 Β6
AGC | AGA | GGT | GCT | GTC | TAC | ATA | TTT | CAT | GGA | GCC | TCG | AGA | CTG | GAG | ATC | 1734 | CCC | TCC | TTG | GAC | ATC | CAG GAT | GAA | CTT | GAC | TTC ATT | CTG | AGC | GGC | AAC | 3174 |
Str | Arg | Gly | Ala | val | Tyr | Xle | Phe | Kis | Gly | Ala | Ser | Arg | Leu | Glu | íle | Pro | Ser | Leu | Atp | Xle | Gin Atp | Glu | Leu | Atp | Phe Xle | Leu | Arg | Gly | Arn | ||
550 | 555 | 560 | 565 | 1030 | 1035 | 1040 | 1045 | ||||||||||||||||||||||||
ATG | CCC | TCA | CCC | AGC | CAG | CGG | GTC | ACT | GGC | TCC | CAG | CTC | TCC | CTG | AGA | 1782 | CTC | AGC | TTC | GGC | TGG | GTC AGT | CAG | ACA | TTG | CAG GAA | AAG | GTG | TTG | CTT | 3222 |
Kat | Pro | Ser | Pro | Ser 570 | Gin | Arg | Val | Thr | Gly 575 | Ser | Gin | Leu | Ser | Leu 580 | Arg | Leu | ser | Phe | Gly | Trp Val Ser 1050 | Gin | Thr | Leu Gin Glu 1055 | Lye | Val | Leu Leu 1060 |
CTG CAG TAT TTT | GGG CAG | TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAC CTT ACA CAG | 1830 | |||||||||||||
Leu | Gin Tyr | Phe 585 | Gly | Gin | Ser Leu Ser 590 | Gly | Gly | Gin Asp Leu $95 | Thr Gin | |||||||
GAT | GGC | CTG | GTG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGA | GCC | CAG | GGG | CAC | GTA | CTG | CTG | 1818 |
Atp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly Ala | Gin | Gly | His | Val | Leu | Leu | ||
600 | 605 | 610 | ||||||||||||||
CTC | AGG | AGT | CTG | CCT | CTG | CTG | AAA | GTG | GAG | CTC | TCC | ATA | AGA | TTC | GCC | 1926 |
Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Lys | Val | Glu | Leu | Ser | Xle | •Arg | Phe | Ala | |
615 | 620 | 625 | ||||||||||||||
CCC | ATG | GAG | GTG | GCA | AAG | GCT | GTG | TAC | CAG | TGC | TGG | GAA | AGG | ACT | CCC | 1974 |
Pro | Mat | Glu | Val | Ala | Lya | Al* | V*1 | Tyr | Gin | Cys | Trp | Glu | Arg | Thr | Pro | |
630 | 635 | 640 | 645 | |||||||||||||
ACT | GTC | CTC | GAA | GCT | GGA | GAG | GCC | ACT | GTC | TGT | CTC | ACT | GTC | CAC | AAA | 2022 |
Thr | Val | Leu | Glu | Ala | Gly | Glu | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr | Val | Hla | Lys | |
6S0 | 655 | 660 | ||||||||||||||
GGC | TCA | CCT | GAC | CTG | TTA | GGT | AAT | GTC | CAA | GGC | TCT | GTC | AGG | TAT | GAT | 2070 |
Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Asn | Val | Gin | Gly | Ser | Val | Arg | Tyr | Asp | |
665 | 670 | 67S | ||||||||||||||
CTG | GCG | TTA | GAT | CCG | GGC | CGC | CTG | ATT | TCT | CGT | GCC | ATT | TTT | GAT | GAG | 2118 |
Leu | Al* | Leu | Asp | Pro | Gly Arg | Leu | íle | Ser | Arg | Ala | íle | Phe | Asp | Glu | ||
680 | 685 | 690 | ||||||||||||||
ACT | AAG | AAC | TGC | ACT | TTG | ACG | GGA | AGG | AAG | ACT | CTG | GGG | CTT | GGT | GAT | 2166 |
Thr | Lys | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr | Gly | Arg | Lys | Thr | Leu | Gly | Leu | Gly Asp | ||
695 | 700 | 705 |
CAC | TGC | GAA | ACA | GTG | AAG | CTG | CTT | TTG | CCG | GAC | TGT | GTG | GAA | GAT | GCA | 2214 |
His | Cys | Glu | Thr | Val | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp | Cys | Val | G1U | Asp | Ala | |
710 | 715 | 720 | 725 | |||||||||||||
GTG | AGC | CCT | ATC | ATC | CTG | CGC | CTC | AAC | TTT. | TCC | CTG | GTG | AGA | GAC | TCT | 2262 |
Val | Ser | Pro | íle | íle | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu | Val | Ar? | Asp | Ser | |
730 | 735 | 740 | ||||||||||||||
GCT | TCA | CCC | AGG | AAC | CTG | CAT | CCT | GTG | CTG | GCT | GTG | GGC | TCA | CAA | GAC | 2310 |
Ala | Ser | Pro | Arg | Asn | Leu | His | Pro | Val | Leu | Ala | Val | Gly | Ser | Gin | Asp | |
745 | 750 | 755 | ||||||||||||||
CAC | ATA | ACT | GCT | TCT | CTG | CCG | TTT | GAG | AAG | AAC | TGT | AAG | CAA | GAA | CTC | 2353 |
His | íle | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | Lys | Gin | Glu | Leu | |
760 | 765 | 770 | ||||||||||||||
CTG | TGT | GAG | GGG | GAC | CTG | GGC | ATC | AGC | TTT | AAC | TTC | TCA | GGC | CTG | CAG | 2406 |
Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | íle | Ser | Phe | Asn | Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | |
775 | 780 | 783 |
GTG AGT GAG GCT GAA ATC ACT | TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG CTG Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gin Leu | 3270 | ||||||||||||||
Val | Ser | Glu Ala Glu íle 1065 | Thr | |||||||||||||
1070 | 1075 | |||||||||||||||
CCA | GGA | CAG | GAG | GCA | TTT | CTG | AGA | GCC | CAG | GTG | GAG | ACA | ACG | TTA | GAA | 3318 |
Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Leu | Arg | Ala | Gin | Val | Glu | Thr | Thr | Leu | Glu | |
1080 | 10B5 | 1090 | ||||||||||||||
GAA | TAC | GTG | GTC | TAT | GAG | CCC | ATC | TTC | CTC | GTG | GCG | GGC AGC | TCG | GTG | 3366 | |
Glu | Tyr | Val | Val | Tyr | Glu | Pro | íle | Phe | Leu | Val | Ale | Gly Ser | Ser | Val | ||
1095 | 1100 | 1105 | ||||||||||||||
GGA | GGT | CTG | CTG | TTA | CTG | GCT | CTC | ATC | ACA | GTG | GTA | CTG | TAC | AAG | crr | 3414 |
Gly | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | Xle | Thr | Val | Val | Leu | Tyr | Lys | Leu | |
1110 | 1115 | 1120 | 1125 | |||||||||||||
GGC | TTC | TYC | AAA | CGT | CAG | TAC | AAA | GAA ATG | CTG | GAC | GGC | AAG | GCT | GCA | 3462 | |
Gly | Phe | Xaa | Lys | Arg | Gin | Tyr | Lys | Glu | Met | Leu | Asp | Gly | Lys | Ala | Ala | |
1130 | 1135 | 1140 | ||||||||||||||
GAT | CCT | GTC | ACA | GCC | GGC | CAG | GCA | GAT | TTC | GGC | TGT | GAG | ACT | CCT | CCA | 3510 |
Asp | Pro | val | Thr | Ala Gly | Gin | Ala | Asp | Phe Gly | Cys | Glu | Thr | Pro | Pro | |||
1145 | 1150 | 1155 |
TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATCAAGATTG 35É2
Tyr Leu Vil Str
1160
GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT
3597 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 55:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 55:
Met | Ala | Gly | Gly | Val | VaL | íle | Leu | Leu | Cys | Gly | Trp | Val | Leu | Ala Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Cys | His | Gly | Ser | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu | Pro | íle | Val | Phe | Arg Glu |
25 30
GTC | TTG | GTG | GTG | GGA | GGC | TCC | CCA | GAG | CTC | ACT | GTC | ACA | GTC | ACT | GTG | 2454 | Asp | Ala | Ala | Ser | Phe | Gly | Gin | Thr | Val | . Val Gin Ph | e GI | y GI | y Se | r Arg | ||
Val | Leu | Val | Val | Gly | Gly | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | VaL | 35 | 40 | 4 | 5 | |||||||||||||
790 | 795 | 800 | 805 | Leu | val | Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Ala | Val | Asn | Gin | Thr | Gly | |||||||||||||
TGG | AAT | GAG | GGT | GAG | GAC | AGC | TAT | GGA | ACT | TTA | GTC | AAG | TTC | TAC | TAC | 2502 | 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Trp | Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu | Val | Lys | Phe | Tyr | Tyr | Cys | Ala | |||||||||||||||
810 | 815 | 820 | Arg | Leu | Tyr | Asp | Pro | Ala | Thr | Gly | Met | Cys | GLn | Pro | íle | Val | ||||||||||||||||
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||||||||||||||||||
CCA | GCA | GGG | CTA | TCT | TAC | CGA | CGG | CTA | ACA | CCG | ACT | CAG | CAA | CCT | CAT | 2S50 | ||||||||||||||||
Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Arg | Val | Thr | Gly | Thr | Gin | GLn | Pro | His | Leu | Arg | Ser | Pro | Leu | Glu | Ala | Val | Aan | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | |
825 | 830 | 835 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||||||||||||||||
CAG | TAC | CCA | CTA | CGC | TTG | GCC | TGT | GAG | GCT | GAG | CCC | GCT | GCC | CAG | GAG | 2598 | Val | Thr | Ala | Thr | Asn | Asn | Ala | Gin | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Ala |
Gin | Tyr | Pro • 40 | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys 845 | Glu | Al* | G1U | Pro | Ala 850 | Ala | Gin | Glu | 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GAC | CTG | AGG | AGC | AGC | AGC | TGT | AGC | ATT | AAT | CAC | CCC | ATC | TTC | CGA | GAA | 2646 | Gin | Arg | Ala | Cys | Val | Lys | Asn | Mat | Tyr | Ala | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu |
Asp | Leu | Arg | Ser | Ser | Ser | Cys | Ser | íle | Asn | His | Pro | íle | Phe | Arg | Glu | 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
855 | 860 | 865 | ||||||||||||||||||||||||||||||
Leu | Gly | Sar | Ser | Leu | Gin | Phe | íle | Gin | Ala | Val | Pro | Ala | Ser | Met | Pro | |||||||||||||||||
GGT | GCA | AAG | ACC | ACC | TTC | ATG | ATC | ACA | TTC | GAT | GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | 2694 | 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Ale | Lys | Thr | Thr | Phe | Met | íle | Thr | Phe | Asp | Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | |||||||||||||||||
870 | 875 | 880 | 885 | Glu | Cye | Pro | Arg | Gin | Glu | Met | Asp | íle | Ala | Phe | Leu | íle | Asp | Gly | Ser | |||||||||||||
2742 | 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||||||||||||||||||
TTC | CTA | GGA | GAC | AGG | TTG | CTT | CTG | AGG | GCC | AAA | GCC | AGC | AGT | GAG | AAT | |||||||||||||||||
Phe | Leu | Gly | Asp | Arg 890 | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala 895 | Lys | Ala | Ser | Ser | Glu 900 | Asn | Gly | Ser | íle | Asn | Gin 165 | Arg | Asp | Phe | Ala | Gin 170 | Met | Lys | Asp | Phe | Vaľ 175 | Lys | |
AAT | AAG | CCT | GAT | ACC | AAC | AAG | ACT | GCC | TTC | CAG | CTG | GAG | CTC | CCA | GTG | 2790 | Gly | Glu | Phe | Ala | Thr | Phe | Ser | Leu | Met | |||||||
Asn | Lys | Pro | Asp | Thr | Asn | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin | Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Ala | Leu | Met | Ser | Thr | Sar | Leu | ||||||||||
905 | 910 | 915 | 180 | 185 | 190 | |||||||||||||||||||||||||||
Gin | Tyr | Ser | Asn | íle | Leu | Lys | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Glu | Phe | Lys | |||||||||||||||||
AAG | TAC | ACC | GTC | TAT | ACC | CTG | ATC | AGT | AGG | CAA | GAA | CAT | TCC | ACC | AAC | 2838 | 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Lys | Tyr | Thr | val | Tyr | Thr | Leu | íle | Ser | Arg | GLn | Glu | Asp | Ser | Thr | Asn | |||||||||||||||||
920 | 925 | 930 | Asn | íle | Leu | Asp | Pro | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Pro | íle | Val | Gin | Leu | Gin | ||||||||||||||
CAT | GTC | AAC | TTT | TCA | TCT | TCC | CAC | GCG | GGG | AGA | AGG | CAA | GAA | GCC | GCA | 2886 | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
His | VaL | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser | HiS | Gly | Gly | Arg | Arg | Gin | Glu | Ala | Ala | |||||||||||||||||
935 | 940 | 945 | Gly | Leu | Thr | Tyr | Thr | Ala | Thr | Gly | íle | Arg | Thr | Val | Met | Glu | Glu | Leu | ||||||||||||||
CAT | CGC | TAT | CGT | GTG | AAT | AAC | CTG | AGT | CCA | CTG | AAG | CTG | GCC | GTC | AGA | 2934 | 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Kis | Arg | Tyr | Arg | VaL | Asn | Asn | Leu | Sex | Pro | Leu | Lys | Leu | Ala | Val | Arg | |||||||||||||||||
950 | 955 | 960 | 965 | Phe | His | Ser | Lys | Asn | Gly | Ser | Arg | Lys | Ser | Ala | Lys | Lys | íle | Leu | Leu | |||||||||||||
2982 | 245 | 250 | 255 | |||||||||||||||||||||||||||||
CTT | AAC | TTC | TGG | GTC | CCT | GTC | CTT | CTG | AAC | GGT | GTG | GCT | GTG | TGG | GAC | |||||||||||||||||
Val | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly | Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | íle | Thr | ASp | Gly | Gin | Lya | Tyr | Arg | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | |
970 | 975 | 980 | 260 | 265 | 270 | |||||||||||||||||||||||||||
GTG Val | ACT Thr | CTG | AGC Ser 985 | AGC Ser | CCA Pro | GCA Ala | CAG Gin | GGT Gly 990 | GTC Val | TCC Ser | TGC Cys | GTG Val | TCC Ser 995 | CAG GLn | ATG Met | 3030 | Val | íle | Pro 275 | Ala | Ala | Asp | Lys | Ala 280 | Gly | íle | íle | Arg | Tyr 285 | Ala | íle | Gly |
AAA | CCT | CCT | CAG | AAT | CCC | GAC | TTT | CTC | ACC | CAG | ATT | CAG | AGA | CGT | TCT | 3078 | Val | Gly | Asp | Ala | Phe | Gin | Glu | Pro | Thr | Ala | Leu | Lys | Glu | Leu | Asn | Thr |
Lys | Pro | Pro | Gin | Asn | Pro | Atp | Phe | Leu | Thr | Gin | íle | Gin | Arg | Arg | Ser | 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
100 | 0 | 100 | 5 | 101 | 0 | |||||||||||||||||||||||||||
3126 | íle | Gly | Ser | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Gly | Asn | Phe | ||||||||||||||||
GTG | CTG | GAC | TGC | TCC | ATT | GCT | GAC | TGC | CTG | CAC | TTC | CGC | TGT | GAC | ATC | 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
Val | Leu | Asp | Cys | Ser | íle | Ala | Asp | Cys | Leu | His | Phe | Arg | Cys | Asp | íle | |||||||||||||||||
101 | S | 102 | 0 | 102 | 5 | Ala | AL* | Leu | Arg | Ser | íle | Gin | Arg | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | íle | Phe | Ala | |||||||||||
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||||||||||||||||||
íle | G1U | Gly | Thr | Gin | Ser | Arg | Ser | Ser | Sar | Ser | Phe | Gin | Hla | Glu | Met | |||||||||||||||||
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ser | Gin | Glu | Gly | Phe | Ser | Ser | Ala | Leu | Thr | Ser | Asp | > Gly | Pro | Val | Leu |
355 360 365
Gly | Ala | Val | Gly | Ser | Phe | Sar | Trp | Sar | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Pro | Asn | Thr | Ar? | Pro | Thr | Phe | 11« | Asn | Met | Ser | Gin | Glu | Asn | Val | Asp |
365 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Mt | Ar? | Asp | Ser | Tyr | L.u | Gly | Tyr | Sar | Thr | Ala | val | Ala | Phe | Trp | Ly. |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gly | Val | Hla | 3«r | Leu | Zla | Leu | Gly | Ala | Pro | AX? | H1S | Gin | Hla | Thr | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ly· | Val | Val | Zla | Phs | Tbr | Gin | Glu | Ala | Ar? | Bií | Trp | Arg | Pro | Lys | Sar |
«35 <<0 «5
Glu | Val | Arg | Gly | Thr | Gin | íle | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys |
450 | 4S5 | 460 | |||||||||||||
Ser | Val | Aap | Val | Asp | Arg | Aap | Gly | Ssr | Xaa | Asp | Leu | Val | Leu | Zle | Gly |
465 | 470 | 475 | 460 | ||||||||||||
Ala | Pro | Hla | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Phe |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Val | Pro | Gly | Val | Arg | Gly | Arg | Trp | Gin | Cys | Glu | Al* | Thr | Leu | Kis |
500 | 505 | 5X0 | |||||||||||||
Gly | Glu | Gin | Gly | Hla | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Val· | Ala | Leu | Thr | Val |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asp | Val | Asn | Gly | Asp | Asn | Lau | Ala | Asp | Val | Ala | 11. | Gly | Ala |
530 | 535 | $40 | |||||||||||||
Pro | Gly | Glu | Glu | Glu | Ser | Ar? | Gly | Alt | Val | Tyr | 11« | Phe | Hla | Gly | Ale |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Arg | Leu | Glu | íle | Met | Pro | Ser | Pro | Ser | Gin | Arg | Val | Thr | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gin | Leu | Ser | Leu | Arg | Lsu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ser | Leu | Ser | Gly | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Thr | Gin | ASp | Gly | Leu | Val | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Gin |
595 | 600 | 6 | 05 | ||||||||||||
Gly | Hls | Val | Leu | Leu | Lau | Ar? | Ser | Leu | Pro : | Leu Leu L | ys V | *1 Glu Li | BU | ||
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ser | íle | Ar? | Phe | Ala | Pro | Het | Glu | Val | Ala : | Lys Ala V | ’al T | yr G: | Ln C' | /· | |
625 | 630 | 635 | 6 | <0 | |||||||||||
Trp | Glu | Ar? | Thr | Pro | Thr | Val | Leu | Glu | Ala < | Gly Glu Ala Thr V | i C: | y· | |||
645 | 550 | t | 55 | ||||||||||||
Leu | Thr | Val | Kle | ty· | Gly | Ser | Pro | Asp | Leu | Leu Gly Asn V | al G | ln G | ly | ||
660 | 665 | 6 | i70 | ||||||||||||
Ser | Val | Ar? | Tyr | Asp | Leu | Ala | Leu | Aap | Pro | Gly Arg Leu 1 | la S | •r Ar? | |||
675 | 660 | 685 | |||||||||||||
Ala | íle | Phe | Asp | Glu | Thr | Ly. | Asn | Cys | Thr | Leu | Thr | Gly | Arg | Ly· | Thr |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Gly | Asp | Hls | Cya | Glu | Thr | Val | Ly* | Leu | Leu | Leu | Pro | Asp |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Cys | Val | Glu | Asp | Ala | Val | Ser | Pro | íle | íle | Leu | Arg | Leu | Asn | Phe | Ser |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Val | Ar? | Asp | Str | Ala | Ser | Pro | Arg | Asn | Leu | Hls | Pro | Val | Leu | Ala |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Val | Gly | Ser | Gin | Asp | Hl* | íle | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Cys | Lye | Gin | Glu | Lau | Leu | Cys | G1U | Gly | Asp | Leu | Gly | íle | Ser | Phe | Asn |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Phe | Ser | Gly | Leu | Gin | Val | Leu | VaL | Val | Gly | Gly | Ser | Pro | Glu | Leu | Thr |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Val | Thr | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Glu | Gly | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Leu |
805 | 610 | 815 | |||||||||||||
Val | Ly. | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Ar? | Val | Thr | Gly |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Thr | Gin | Gin | Pro | HU | Gin | Tyr | Pro | Leu | Arg | Leu | Ala | Cys | Glu | Ala | Glu |
835 | 840 | 645 | |||||||||||||
Pro | Ala | Ala | Gin | Glu | Asp | Leu | Arg | Ser | Ser | Ser | Cy. | Ser | Zle | Asn | Hls |
850 | 655 | 860 | |||||||||||||
Pro | 11a | Phe | Arg | Glu | Gly | Ala | Ly. | Thr | Thr | Phe | Het | íle | Thr | Phe | Asp |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Val | Ser | Tyr | Ly. | Ala | Phe | Lsu | Gly | Asp | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Ala | Ly. |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Ly. | Pro | Aap | Thr | Asn | Ly. | Thr | Ala | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Leu | Glu | Leu | Pro | •Val | Ly. | Tyr | Thr | Val | Tyr | Thr | Leu | íle | Ser | Ar? | Gin |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Glu | Asp | Ser | Thr | Asn | Hl. | Val | Asn | Phe | Ser | Ser | Ser | HiS | Gly | Gly | Arg |
930 | »35 | 940 | |||||||||||||
Arg | Gin | Glu | Ala | Ala | Hl. | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Pro | Leu |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Lys | Lau | AL* | Val | Ar? | Val | Asn | Pha | Trp | val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | Thr | Leu | Ser | Ser | Pro | Ala | Gin | Gly | Val | Ser |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Cys | Val | Sar | Gin | Met | Lys | Pro | Pro | Gin | A. n | Pro | Asp | Phe | Z>eu | Thr | Gin |
995 | 100 | D | 100 | 5 |
11« | Gin | Arg | Ar? | Ser | V*1 | Leu | A«P | Cys Ser | Zle | Ala | Asp I | Cys | Leu | Hls |
1010 | 1015 | 102( | ||||||||||||
Phe | Arg | Cy. | Asp | íle | Pro | Ser | Leu | Asp 11* | Gin | kap | Glu | Leu | Asp | Phe |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | |||||||||||
íle | Leu | Ar? | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly Trp | Val | Ser | Gin | Thr | Leu | Gin |
1045 | 1050 | 1055 | ||||||||||||
Glu | Lys | val | Leu | Leu | Val | Ser | Glu | Ale Glu | Zle | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser |
1060 | 1065 | 1070 | ||||||||||||
val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu Ala | Phe | Leu | Ara | Ala | Gin | Val |
1075 | 1080 | 1085 | ||||||||||||
Glu | Thr | Thr | Leu | Glu | Glu | Tyr | Val | Val Tyr | Glu | Pro | Zle | Phe | Leu | val |
1090 | 1095 | 1100 | ||||||||||||
Ala | Gly | Ser | Ser | Val | Gly | Gly | Leu | Leu Leu | Leu | Ala | Leu | 11* | Thr | Val |
110! | 5 | 1110 | 1115 | 1120 | ||||||||||
Val | Lbu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Xaa | Xaa | Lys Arg | Gin | Tyr | Lys | Glu | Met | Leu |
1125 | 1130 | 1135 | ||||||||||||
Asp | Gly | Ly. | Ala | Ala | Asp | Pro | Val | Thr Xaa | Gly | Gin | Ala | Asp | Phe | Gly |
1140 | 1145 | 1150 | ||||||||||||
Cy* | Glu | Thr | Pro | Pro | Tyr | Leu | Val | Ser | ||||||
115! | 5 | 1161 | 3 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 56:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) . TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 56:
CCTGTCATGG GTCTAACCTG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 57:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 57:
AGGTTAGACCCATGACAGG 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 58:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 58:
GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 59:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET RE ŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 59:
CCAARGCTGG CTGCATCCTC TC 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 60:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna
SK 283135 Β6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 60:
CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C (2) INFORMÁCIE O SEK ID. č.: 61:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 61:
CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 62:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 62:
GCTGGGATCA TTCGCTATGC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č: 63:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 63:
CAATGGATGG ACCAGTTCTG G (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 64:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE; SEK. ID. č.: 64:
CAGATCGGCT CCTACTTTGG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 65:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 65:
CATGGAGCCT CGAGACAGG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 66:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 66:
CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. 1D. č.: 67:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 67:
CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 68:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 68:
CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 69:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 69:
CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 70:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 70:
GTCACAGAGG GAACCTCC 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 71:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 71:
GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 72:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 72:
GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 73:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 73:
CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 74:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 74:
GTGGATCAGC ACTGAAATCT G (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 75:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 75:
CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 76:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 76:
CACAGCGGAG GTGCAGGCAG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 77:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 77:
CTCACTGCTT GCGCTGGC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 78:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 78:
CGGTAAGATA GCTCTGCTGG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 79:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 79:
GAGCCCACAG CCAGCACAGG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 80:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 80:
GATCCAACGC CAGATCATAC C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 81:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 81:
CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 82:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 82:
C ACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 83:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 83:
TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 84:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP; nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 84:
GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 85:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 85:
CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 86:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 86:
GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 87:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 87:
GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 88:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 88:
CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. ¢.: 89:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 89:
CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 90:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 90:
GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID: č.: 91:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 91:
AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 92:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 852 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 61..852 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 92:
TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG
ATG GCC Met Ala 1 | CTT GGG Leu Gly | GCT Ala 5 | GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT TAC CAC | 108 | ||||||||||||
Val | Val Leu | Leu | Gly Val 10 | Leu Ala | Ser Tyr His 15 | |||||||||||
GGA | TTC | AAC | TTG | GAC | GTG | ATG | AGC | GGT | GAT | CTT | CCA | GGA | AGA | CGC | AGC | 156 |
Gly | Phe | Asn | Leu | Asp | Val | Met | Ser | Gly Asp | Leu | Pro | Gly | Arg | Arg | Ser | ||
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
GGG | CTT | CGG | GCA | GAG | CGT | GAT | GCA | GTT | TGG | GGA | TCT | CGA | CTC | GTG | GTG | 204 |
Gly | Leu | Arg | Ala | Glu | Arg | Asp | Ala | Val | Trp Gly | Ser | Arg | Leu | Val | Val | ||
3S | 40 | 45 | ||||||||||||||
GGA | GCC | CCC | CTG | GCG | GTG | GTG | TCG | GCC | AAC | CAC | ACA | GGA | CGG | CTG | TAC | 252 |
Gly | Ala | Pro | Leu | Ala | Val | Val | Ser | Ala | Asn | His | Thr | Gly | Arg | Leu | Tyr | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
GAG | TGT | GCG | CCT | GCC | TCC | GGC | ACC | TGC | ACG | CCC | ATT | TTC | CCA | TTC | ATG | 300 |
Glu | Cys | Ala | Pro | Ala | Ser | Gly | Thr | Cys | Thr | Pro | íle | Pha | Pro | Phe | Met | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
ccc | CCC | GAA | GCC | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCC | CTG | GCA | GCC | TCC | 348 |
Pro | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Lau | Gly | Leu | Ser | Leu | Ala | Ala | Ser | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
CCC | AAC | CAT | TCC | CAG | CTG | CTG | GCT | TGT | GGC | CCC | ACC | GTG | CAT | AGA | GCC | 396 |
Pro | Asn | H1S | Ser | Gin | Lau | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Val | His | Arg | Ala | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
TGC | GGG | GAG | GAC | GTG | TAC | GCC | CAG | GGT | TTC | TGT | GTG | CTG | CTG | GAT | GCC | 444 |
Cys | Gly | Glu | Asp | Val | Tyr | Alt | Gin | Gly | Phe | Cys | Val | lau | Leu | Asp | Ala | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
CAC | GCA | CAG | CCC | ATC | GGG | ACT | GTG | CCA | GCT | GCC | CTG | CCC | GAG | TGC | CCA | 492 |
His | Ala | Gin | Pro | íle | Gly | Thr | Val | Pro | Ala | Al* | Leu | Pro | Glu | Cys | Pro | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
GAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GTC | TTC | CTG | ATT | GAC | GGC | TCT | GGC | AGC | ATT | 540 |
Asp | Gin | Glu | Met | Asp | 11· | Val | Phe | Lau | íle | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | íle | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
AGC | TCA | AAT | GAC | TTC | CGC | AAG | ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AGA | GCT | GTG | ATG | 5Θ9 |
Ser | Sar | Asn | Asp | Phe | Arg | Lys | Met | Lys | Asp | Phe | Val | Arg | Al* | Val | Met | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GAC | CAG | TTC | AAG | GAC | ACC | AAC | ACC | CAG | TTC | TCG | CTG | ATG | CAG | TAC | TCC | 636 |
Asp | Gin | Phe | Lys | Asp | Thr | Asn | Thr | Gin | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
AAT | GTG | CTG | GTG | ACA | CAT | TTC | ACC | TTC | AGC | AGC | TTC | CGG | AAC | AGC | TCC | 664 |
Asn | Val | Leu | Val | Thr | His | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Phe | Arg | Asn | Ser | Ser | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
AAT | CCT | CAG | GGC | CTA | GTG | GAG | CCC | ATT | GTG | CAG | CTG | ACA | GGC | CTC | ACG | 732 |
Asn | Pro | Gin | Gly | Lau | Val | Glu | Pro | íle | Val | Gin | Leu | Thr | Gly | Leu | Thr | |
210 | 215 | 220 |
TTC | ACG | GCC | ACA | GGG | ATC | CTG | AAA | GTG | GTG | ACA | GAG | CTG | TTT | CAA | ACC | 780 |
Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | 11« | Lau | Lya | Val | Val | Thr | G1U | Leu | Phe | Gin | Thr | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
AAG | Axe | GGG | GCC | CGC | GAA | AGT | GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | ATC | GTC | ATC | ACA | 828 |
Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Glu | Ser | Ala | Lys | Lya | ILe | Leu | íle | val | íle | Thr | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GCG | GCA | 852 | ||||||||
Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Ala | Ala |
260 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 93:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 264 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 93:
ACGGGACGGC TGTATGACTG CGCAGCTGCC ACCGGCATGT GCCAGCCCAT CCCGCTGCAC
240
Met Ala 1 | Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His | |||||||||||||
5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Phe | Asn | Leu 20 | Asp | Val | Met | Ser | Gly Asp Leu 25 | Pro | Gly Arg Arg 30 | Ser | |||
Gly | Leu | Arg 35 | Ala | Glu | Arg Asp | Ala <0 | Val | Trp Gly | Ser | Arg Leu 45 | Val | Val | ||
Gly | Ala 50 | Pro | Leu | Ala | Val | Val 55 | Ser | Ala | Asn | His | Thr 60 | Gly Arg | Leu | Tyr |
Glu 65 | Cys | Ala | Pro | Ala | Ser 70 | Gly | Thr | Cys | Thr | Pro 75 | íle | Phe Pro | Phe | Het 80 |
Pro | Pro | Glu | Ala | Val 85 | Asn | Met | Ser | Leu | Gly 90 | Leu | Ser | Leu Ala | Ala 95 | Ser |
Pro | Asn | His | Ser 100 | Gin | Leu | Leu | Ale | Cys 105 | Gly | Pro | Thr | Val His 110 | Arg | Ala |
Cys | Gly | Glu 115 | Asp | Val | Tyr | Ala | Gin 120 | Gly | Phe | Cys | val | Leu Leu 125 | Asp | Ala |
His | Ala 130 | Gin | Pro | íle | Gly | Thr 135 | Val | Pro | Ala | Ala | Leu 140 | Pro Glu | Cys | Pro |
Asp 145 | Gin | Glu | Met | Asp | íle 150 | Val | Phe | Leu | íle | Asp Gly 155 | Ser Gly | Ser | íle 160 | |
Ser | Ser | Asn | Asp | Phe 165 | Arg | Lys | Met | Lys | Asp 170 | Phe | Val | Arg Ala | Val 175 | Het |
Asp | Gin | Phe | Lys 190 | Asp | Thr | Asn | Thr | Gin 195 | Phe | Ser | Leu | Met Gin 190 | Tyr | Ser |
Asn | Val | Leu 195 | Val | Thr | His | Phe | Thr 200 | Phe | Ser | Ser | Phe | Arg Asn 205 | Ser | Ser |
Asn | Pro 210 | Gin | Gly | Leu | Val | Glu 215 | Pro | íle | Val | Gin | Leu 220 | Thr Gly | Leu | Thr |
Phe 225 | Thr | Ala | Thr | Gly | íle 230 | Leu | Lys | Val | Val | Thr 235 | Glu | Leu Phe | Gin | Thr 240 |
Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Glu | Ser | Ale | Lys | Lys | íle | Leu | íle Val | íle | Thr |
245 250 255
ATCCGCCCTG AGGCCGTGAA CATGTCCTTG GGCCTGACCC TGGCAGCCTC CACCAACGGC
TCCCGGCTCC TGGCCTGTGG CCCGACCCTG CACAGAGTCT GTGGGGAGAA CTCATACTCA
AJIGGGTTCCT GCCTCCTGCT GGGCTCGCSC TGGGAGATCA TCCAGACAGT CCCCGACGCC
ACGCCAGAGT GTCCACATCA AGASATGGAC ATCGTCTTCC TGATTGACGG CTCTGGAAGC
ATTGACCAAA ATGACTTTAA CCAGATGAAG GGCTTTGTCC AAGCTGTCAT GGGCCAGTTT
GAGGGCACTG ACACCCTGTT TGCACTGATG CAGTACTCAA ACCTCCTGAA GATCCACTTC
ACCtTCACCC AATTCCGGAC CAGCCCGAGC CAGCAGAGCC TGGTGGATCC CATCGTCCAA
CTGAAAGGCC TGACGTTCAC GGCCACGGGC ATCCTGACAG TGGTGACACA GCTATTTCAT
CATAAGAATG GGGCCCGAAA AAGTGCCAAG AAGATCCTCA TTGTCATCAC AGATGGGCAG
AAGTACAAAG ACCCCCTGGA ATACAGTGAT GTCATCCCCC AGGCAGAGAA GGCTGGCATC
ATCCGCTACG CTATCGGGGT GGGACACGCT TTCCAGGGAC CCACTGCCAG GCAGGAGCTG
AATACCATCA GCTCAGCGCC TCCGCAGGAC CACGTGTTCA AGGTGGACAÄ CTTTGCAGCC
CTTGGCAGCA TCCAGAAGCA GCTGCAGGAG AASATCTATG CAGTTGAGGG AACCCAGTCC
AGGGCAAGCA GCTCCTTCCA GCACGAGATG ICCCAAGAAC GCTTCAGCAC AGCCCTCACA
ATGGATGGCC TCTTCCTGGG GGCTGTGGGG AGCTTTAGC7 GGTCTGGAGG TGCCTTCCTG
TATCCCCCAA ATATGAGCCC CACCTTCATC AACATGTCTC AGGAGAATGT GGACATGAGG
GACTCTTACC TGGGTTACTC CACCGAGCTA GCCCTGTGGA AGGGGGTACA GAACCTGGTC
CTGGGGGCCC CCCGCTACCA GCATACCGGG AAGGCTGTCA TCTTCACCCA GGTGTCCAGG
CAATGGAGGA AGAAGGCCGA AGTCACAGGG ACGCAGATCG GCTCCTACTT CGGGGCCTCC
CTCTGCTCCG TGGATGTGGA CAGCGATGGC AGCACCGACC TGATCCTCAT IGGGGCCCCC
CATTACTATG AGCAGACCCG AGGGGGCCAG GTGTCCGTGT GTCCCTTGCC TAGGGGGAGG
GTGCAGTGGC ÄGTGTGACGC TGTTCTCCGT GGTGAGCAGG GCCACCCCTG GGGOCGCTIT
GGGGCAGCCC TGACAGTGTT GGGGGATGTG AATGAGGACA AGCTGATAGA CGTGGCCATT
GGGGCCCCGG GAGAGCAGGA GAACCGGGGT GCTGTCTACC TGTTTCACGG AGCCTCAGAA
TCCGGCATCA GCCCCTCCCA CAGCCAGCGG ATTGCCACCT CCCAGCTCTC CCCCAGGCTG
CAGTATTTTG GGCAGGCGCT GAGTGGGGGT CAGGACCTCA CCCAGGATGG ACTGATGGAC
CIGGCCGTGG GGGCCCGGGG CCAGGTGCTC CTGCTCAGGA GTCTGCCGGT GCTGAÄAGTG
GGGGTGGCCA TGASATTCAC CCCTGTGGAG GTGGCCAAGG CTGTG7ACCG GTGCTGGGAA
GAGAAGCCCA GTGCCCTGGA AGCTGGGGAC GCCACCGTCT GTCTCACCAT CCAGAAAAGC
TCACTGGACC AGCTAGGTGA CATCCAAAGC TCTGTCAGGT TTGATCTGGC ACTGGACCCA
300
360
420 <eo
540
600
720
760
640
900
96Ó
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1390
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Ala Ala
260 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 94:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 94:
CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 95:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. t.: 95:
CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 96:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 2499 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 96:
ATGACCTTCG GCACTGTGCT TCTTCTGAGT GTCCTGGCTT CTTATCATGG ATTCAACCTG
GATGTCGAGG AGCCIXCGXT CTTCCASGAG GATGCXGGCG GCTTTGGGCA GXGCGTGGTG
CXGTTCGGTG GKTCTCGACT CGTGGTGGGX CCACCCCTGG XGGTGGIGGC GGCCAACCXG
GGTCGTCTGA CTTCTCGTGC CATTTTCAAT GAAACCAAGA ACCCCACTIT GACTCGAAGA
AAAACCCTGG GACTGGGGAT TCACTGTGAA ACCCTGAAGC TGCTTTTGCC AGTGAGGACT
TTGGGTTCTG GGAAGGGGGA GAGAGGAGGA GCCCAAGGCT GGCCTGGAGC ACCCCCGTTC
TCTGCTGAGC GAGGTGGGAA GGGTTAGGAT GTTGGGGCIG GAGAGAGGGA CATTAGGGCA
GGAGAACCTG GCTCCACGGC TTGGAGGGAG CACTGTCAGG GCAGTGGGGA GTGGATGCAG
TGGAGGAGGA CTTGTGGTGG AGCGTAGAGA GGACAGCAGG TTCTTGAAAG CCTGTTCTCT
CTCAGGATTG TGTGGAGGAT GTGGTGAGCC CCATCATTCT GCACCTCAAC TTCTCACTGG
TGAGAGAGCC CATCCCCTCC CCCCAGAACC TGCGTCCTG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 97:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 3956 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 97:
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2499
TTTAACTGCA CCAACTTTAA AATACGCTAT TGGAGCTGGA ATTACCGCGG CfGCTGGCAC | 60 | |
CAGACTTGCC CTCCAATGGA TCCTCGTTAA AGGMTTAAA GTGGACTCAT TCCAATTACA | 120 | |
GGGCCTCGAA AGAGTCCTGT ATTGTTATTT TTCGTCACTA CCTCCCCGGG TCGGGAGTGG | 180 | |
CTAATTTGCG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA TGTGGTAGCC GTTTCTCAGG CTCCCTCTCC | 240 | |
GGAATCGAAC CCTGATTCCC CGTCACCCGT GGICACCATG GTAGGCACGT GCAGTTCGGT | 300 | |
GGATCTCGAC TCGTGGTGGG AGCACCCCTG GAGGTGGTGG CGGCCAACCA GACGGGACGG | 360 | |
CTGTATGACT GCGCAGCTGC CACCGGCATG TGCCAGCCCA TCCCGCTGCA CATCCGCCCT | 420 | |
GAGGCCGTGA ACATGTCCTT GGGCCTGACC CTGGCAGCCT CCACCAACGG CTCCCGGCTC | 480 | |
CTGGCCTGTG GCCCGACCCT GCACAGAGTC TGTGGGGAGA ACTCATACTC AAAGGGTTCC | 540 | |
TGCCTCCTGC TGGGCTCGCG C7GGGAGATC ATCCAGACAG TCCCCGACGC CACGCCAGAG | 600 | |
TGTCCACATC AAGAGATGGA CATCGTCTTC CTGATtGACG GCTCTGGAAG CATTGACCMs | 660 | |
AATGACTTTA ACCAGATGAA GGGCTTTGTC CAAGCTGTCA TGGGCCAGTT TGAGGGCACT | 720 | |
GACACCCTGT TTGCACTGAT GCAGTACTCA AACCTCCTGA AGATCCACTT CACCTTCACC | 780 | |
CAATTCCGGA CCAGCCCGAG CCAGCAGAGC CTGGTGGATC CCATCGTCCA ACTGAAAGGC | 840 | |
120 | CTGACGTTCA CGGCCACGGG CATCCTGACA GTGGTGACAC AGCTATTTCA TCATAAGAAT | 900 |
18C | GGGGCCCGAA AAAGTGCCAA GAAGATCCTC ATTGTCATCA CAGATGGGCA GAAGTACAAA | 96C |
SK 283135 Β6
GACCCCCTGG AATACAGTGA TGTCATCCCC CAGGCAGAGA AGGCTGGCAT CATCCGCTAC1020
GCTATCGGGG TGGGACACGC TTTCCAGGGA CCCACTGCCA GGCAGGAGCT GAATACCATC1000
AGCTCAGCGC CTCCGCAGGA CCACGTGTTC AAGGŤGGACA ACTTTGCAGC CCTTGGCAGC1140
ATCCAGAAGC AGCTGCAGGA GAAGATCTAT GCAGTTGAGG GAACCCAGTC CAGGGCAAGC1200
AGCTCCTTCC AGCACGAGAT GTCCCAAGAA GGCTTCAGCA CAGCCCTCAC AATGGATGGC1260
CTCTTCCTGG GGGCTGTGGG GAGCTTTAGC TGGTCTGGAG GTGCCTTCCT GTATCCCCCA1320
AATATGAGCC CCACCTTCAT CAACATGTCT CAGGAGAATG TGGACATGAG GGACTCTTAC1380
CTGGGTTACT CCACCGAGCT AGCCCTGTGG AAGGGGGTAC AGAACCŤGGT CCTGGGGGCC1440
CCCCCCTACC AGCATACCGG GAAGGCTGTC ATCŤTCACCC AGGTGTCCAG GCAATGGAGG1500
ÄAGAAGGCCG AAGTCACAGG GACGCAGATC GGCTCCTACT TCGGGGCCTC CCTCTGCTCC1560
GTGGATGTGG ACAGCGATGG CAGCACCGAC CTGATCCTCA TTGGGGCCCC CCATTACTAT1620
GAGCAGACCC GAGGGGGCCA GGTGTCCGTG TGTCCCTTGC CTAGGGGGAG GGTGCAGTGG1680
CAGTGTGACG CTGTTCTCCG TGGTGAGCAG GGCCACCCCT GGGGCCGCTT TGGGGCAGCC1740
CTGACAGTGT TGGGGGATGT GAATGAGGAC AAGCTGATAG ACGTGGCCAT TGGGGCCCCG1B00
GGAGAGCAGG AGAACCGGGG TGCTGTCTAC CTGTTTCACG GAGCCTCAGA ATCCGGCATC1860
AGCCCCTCCC ACAGCCAGCG GATTGCCAGC TCCCAGCTCT CCCCCAGGCT GCAGTATTTT1920
GGGCAGGCGC TGAGTGGGGG TCAGGACCTC ACCCAGGATG GACTGATGGA CCTGGCCGTG1980
CGGGCCCGGG GCCAGGTGCT CCTGCTCAGS AGTCTGCCGG TGCTGAAAGT GGGGGTGGCC2040
ATGAGATTCA GCCCTGTGGA GGTGGCCAAG GCTGTGTACC GGTGCTGGGA AGAGAAGCCC2100
AGTGCCCTGG AAGCTGGGGA CGCCACCGTC TGTCTCACCA TCCAGAAAAG CTCACTGGAC1160
CAGCTAGGTG ACATCCAAAG CTCTGTCAGG TTTGATCTGG CACTGGACCC AGGTCGTCTG222C
ACTTCTCGTG CCATTTTCAA TGAAACCAAG AACCCCACTT TGACTCGAAG AAAAACCCTG2280
GGACTGGGGA TTCACTGTGA AACCCTGAAG CTGCTTTTGC CAGATTGTGT GGAGGATGTG2340
GTGAGCCCCA TCATTCTGCA CCTCAACTTC TCACTGGTGA GAGAGCCCAT CCCCTCCCCC2400
CAGAACCTGC GTCCTGTGCT GGCCGTGGGC TCACAAGACC TCTTCACTGC TTCTCTCCCC2460
TTCGAGAAGA ACTGTGGGCA AGATGGCCTC TGTGAAGGGG ACCTGGGTGT CACCCTCAGC2520
TTCTCAGGCC TGCAGACCCT GACCGTGGGG AGCTCCCTGG AGCTCAACGT GATTGTGACT2580
GTGTGGAACG CAGGTGAGGA TTCCTACGGA ACCGTGGTCA GCCTCTACTA TCCAGCAGGG264*
CTGTCGCACC GACGGGTGTC AGGAGCCCAG AAGCAGCCCC ATCAGAGTGC CCTGCGCCTG27C0
GCATGTGA3A CAGTGCCCAC TGAGGATGAG GGCCTAAGAA GCAGCCGCTG CAGTGTCAAC2780
CACCCCATCT TCCATGAGGG CTCTAACGGC ACCTTCATAG TCACATTCGA TGTCTCCTAC2820
AAGGCCACCC TGGGAGACAG GATGCTTATG AGGGCCAGTG CAAGCAGTGA GAACAATAAG2880
GCTTCAAGCA GCAAGGCCAC CTTCCAGCTG GAGCTCCCGG TGAAGTATGC AGTCŤACACC2940
ATGATCAGCA GGCAGGAAGA ATCCACCAAG TACTTCAACT TTGCAACCTC CGATGAGAAG3000
AAAATGAAAG AGGCTGAGCA TCGATACCGT GTGAATAACC TCAGCCAGCG AGATCTGGCC3060
ATCAGCATTA ACTTCTGGGŤ TCCTGTCCTG CTGAACGGGG TGGCTGTGTG GGATGTGGTC3120
ATGGAGGCCC CATCŤCAGAG TCTCCCCTGT GTTTCAGAGA GAAAACCTCC CCAGCATTCT3180
GACTŤCCTGA CCCAGATTTC AAGAAGTCCC ATGCTGGACŤ GCTCCATTGC TGACTGCCTG3240
CAGTTCCGCŤ GTGACGTCCC CTCCTTCAGC GTCCAGGAGG AGCTGGATTT CACCCTGAAG3300
GGCAATCTCA GTTTCGGCTG GGTCCGCGAG ACAŤTGCAGA AGAAGGTGTT GGTCGTGAGT3360
GTGGCTGAAA TTACGTTCGA CACATCCGTG TACTCCCAGC TTCCAGGACA GGAGGCATTT3420
ATGAGAGCTC AGATGGAGAT GGTGCTAGAA GAAGACGAGG TCTACAATGC CATTCCCATC3400
ATCATGGGCA GCTCTGTGGG GGCTCTGCTA CTGCŤGGCGC TCATCACAGC CACACTGTAC3540
AAGCTTGGCT TCTTCAAACG CCACTACAAG GAAATGCTGG AGGACAAGCC TGAAGACACT3600
GCCACATTCA GTGGGGACGA TTTCAGCTGT GTGGCCCCAA ATGTGCCTTT GTCCTAATAA3660
TCCACTTTCC TGTTTATCTC TACCACTGTG GGCTGGACTŤ GCTTGCAACC ATAAATCAAC3720
TTACATGGAA ACAACTTCTG CATAGATCTG CACTGGCCTA AGCAACCTAC CAGGTGCTAA3780
GCACCTTCTC GGAGAGATAG AGATTGTCAA TGTTTTTACA TATCTGTCCA TCTTTTTCAG3940
CAATGACCCA CTTTTTACAG AAGCAGGCAT GGTGCCASCA TAAATTTTCA TATGCTTAAG3900
AATTGTCACA TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTTTAG3956 2 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 98:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 3785 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..3486 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. C.: 98:
GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ila Ph· Gin Glu Asp Ala | 96 | |||||||||||
20 | 25 | 30 | ||||||||||
GGC | GGC | TTT | GGG | CAG | AGC ' | GTG i | 3TG CAG TTC GGT GGA TCT ' | CGA i | CTC GTG | 144 | ||
Gly | Gly | Ph· | GLy | Gin | Sar | Val ’ | Val Gin Ph« Gly Gly ! | Sex | Atg ' | Leu ’ | Val | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||
GTG | GGA | GCA | CCC | CTG | GAG | GTG < | GTG GCG GCC AAC CAG ACG | GGA 1 | CGG i | CTG | 192 | |
Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val ' | Val Ala Ala Asn Gin Thr | Gly i | Arg ; | Leu | ||
50 | 55 | 60 | ||||||||||
TAT | GAC | TGC | GCA | GCT | GCC | ACC i | GGC ATG TGC CAG CCC ATC | CCG ' | CTG i | CAC | 240 | |
Tyr | Asp Cys | Ala | Ala | Ala | Thr i | Gly M«t Cys Gin Pro : | íle | Pro : | Leu 1 | Kis | ||
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||
ATC | CGC | CCT | GAG | GCC | GTG | AAC | ATG TCC TTG GGC CTG 1 | ACC | CTG ' | GCA 1 | GCC | 288 |
Ila | Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn : | Het Ser Leu Gly Leu * | ľhr | Leu | Ala . | Ala | |
BS | 90 | 95 | ||||||||||
TCC | ACC | AAC | GGC | TCC | CGG | CTC | CTG GCC TGT GGC CCG i | ACC | CTG ' | CAC . | AGA | 336 |
Sar | Thr | Asn | Gly | Ser | Arg | Leu | Lau Ala Cys Gly Pro 1 | Thr | Leu | His | Arg | |
100 | 105 | 1L0 | ||||||||||
GTC | TGT | GGG | GAG | AAC | TCA | TAC | TCA AAG GGT TCC TGC < | CTC | CTG | CTG 1 | GGC | 384 |
Val | Cys | Gly | G1U | Asn | Ser | Tyr | Ser Lys Gly Ser Cys : | Leu | Leu | Leu 1 | Gly | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||
ŤCG | CGC | TGG | GAG | ATC | ATC | CAG | ACA GTC CCC GAC GCC . | ACG | CCA | GAG | TGT | 432 |
Ser | Arg | Trp | Glu | 11· | Ila | Gin | Thr val Pro Asp Ala | Thr | Pro | Glu | Cys | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||
CCA | CAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATC | GTC TTC CTG ATT GAC | GGC | TCT | GGA | AGC | 480 |
Pro | Hi· | Gin | Glu | Mat | Asp | íle | Val Ph· L«u 11· Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||
ATT | GAC | CAA | AAT | GAC | TTT | AAC | CAG ATG AAG GGC TTT | GTC | CAA | GCT | GTC | 528 |
11· | Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin Mat Lys Gly Phe | Val | Gin | Ala | Val | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||
ATG | GGC | CAG | TTT | GAG | GGC | ACT | GAC ACC CTG TTT GCA | CTG | ATG | CAG | TAC | 576 |
Mat | Gly | Gin | Ph· | Glu | Gly | Thr | Asp Thr Lau Ph· Ala | L«u | Met | Gin | Tyr | |
190 | 185 | 190 | ||||||||||
TCA | AAC | CTC | CTG | AAG | ATC | CAC | TTC ACC TTC ACC CAA | TTC | CGG | ACC | AGC | 624 |
Sar | Asn | L«u | L«U | Lys | íle | Hla | Phe Thr Phe Thr Gin | Phe | Arg | Thr | Ser | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||
CCG | AGC | CAG | CAG | AGC | CTG | GTG | GAT CCC ATC GTC CAA | CTG | AAA | GGC | CTG | 612 |
Pro | Sar | Gin | Gin | Ser | Leu | val | Asp Pro íle Val Gin | Leu | ty» | Gly | Leu | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||
ACG | ; JTC | ACG | GCC | ACG | GGC | ATC | CTG ACA GTG GTG ACA | CAG | CTA | TTT | CAT | 720 |
Thr | Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | íle | Leu Thr Val Val Thr | Gin | Leu | Ph· | Kia | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||
CAT | AAC | AAT | GGG | GCC | CGA | AAA | AGT GCC AAG AAG ATC | CTC | ATT | GTC | ATC | 769 |
Hla | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg | Lys | S«r Ala Lys Lys íle | Leu | 11· | Val | 11« | |
245 | 2S0 | 255 | ||||||||||
ACA | GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GAC CCC CTG GAA TAC | AGT | GAT | GTC | ATC | 816 |
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp Pro Leu Glu Tyr | Ser | ASP | Val | 11· | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||
CCC | CAG | GCA | GAG | AAG | GCT | GGC | ATC ATC CGC TAC GCT | ATC | GGO | GTG | GGA | 864 |
Pre | Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | 11· 11· Arg Tyr Ala | 11· | Gly | Val | Gly | |
275 | 2Θ0 | 285 | ||||||||||
CAC | GCT | TTC | CAG | GGA | CCC | ACT | GCC AGG CAG GAG CTG | AAT | ACC | ATC | AGC | 912 |
His | Ala | Ph· | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala Arg Gin Glu Leu | Asn | Thr | 11« | Ser | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||
TCA | GCG | CCT | CCG | CAG | GAC | CAC | GTG TTC AAG GTG GAC | AAC | TTT | GCA | GCC | 960 |
S«r | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | Kis | Val Ph· Lys Val Asp | Asn | Ph· | Ala | Ala | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||
CTT | GGC | AGC | ATC | CAG | AAG | CAG | CTG CAG GAG AAG ATC | TAT | GCA | GTT | GAG | 1008 |
Leu | Gly | Sar | Ila | Gin | Lys | Gin | Leu Gin Glu Lys íle | Tyr | Ala | Val | Glu | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||
GGA ACC | CAG | TCC | AGG | GCA | AGC | AGC TCC TTC CAG CAC | GAG | ATG | TCC | CAA | 1056 | |
Gly | Thr | Gin | Ssr | Arg | Ala | Ser | Ser Ser Phe Gin His | Glu | Met | Ser | Gin | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||
GAA | GGC | TTC | AGC | ACA | GCC | CTC | ACA ATG GAT GGC CTC | TTC | CTG | GGG | GCT | 1104 |
Glu | Gly | Ph· | S«r | Thr | Ala | Leu | Thr Met Asp Gly Leu | Phe | Leu | Gly | Ala | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||
GTG | GGG | AGC | TTT | AGC | TGG | TCT | GGA GGT GCC TTC CTG | TAT | CCC | CCA AAT | 1152 | |
Val | Gly | S«r | Ph· | Ser | Trp | Ser | Gly Gly Ala Phe Leu | Tyr | Pro | Pro | Asn | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||
ATG | AGC | CCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG TCT CAG GAG AAT | GTG | GAC | ATG | AGG | 1200 |
Mat | Sar | Pre | Thr | Phe | íle | Aan | Met Ser Gin Glu Asn | Val | Asp | Met | Arg | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||
GAC | TCT | TAC | CTG | GGT | TAC | TCC | ACC GAG CTA GCC CTG | TGG | AAG | GGG | GTA | 1249 |
Asp | Ser | Tyr | L«u | Gly | Tyr | Ser | Thr Glu Leu Ala Lau | Trp | Lys | Gly | Val | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||
CAG | AAC | CTG | GTC | CTG | GGG | GCC | CCC CGC TAC CAG CAT | ACC | GGG | AAG | GCT | 1296 |
Gin | Asn | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro Arg Tyr Gin His | Thr | Gly | Lys | Ala | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||
GTC | ATC | TTC | ACC | CAG | GTG | TCC | AGG CAA TGG AGG AAG | AAG | : GCC | GAA | GTC | 1344 |
Val | 11· | Phe | Thr | Gin | Val | Ser | Arg Gin Trp Arg Lys | Lys | Ala | Glu | Val | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||
ACA | GGG | ACG | CAG | ATC | GGC | TCC | TAC TTC GGG GCC TCC | CTC | l TGC | TCC | GTG | 1392 |
Thr | Gly | Thr | Gin | 11· | Gly | Ser | Tyr Phe Gly Ala Ser | Leu | t Cys | S«r | Val | |
450 | 455 | 4 60 | ||||||||||
GAT | GTG | GAC | AGC | GAT | GGC | AGC | : ACC GAC CTG ATC CTC | : ATT | 1 GGG | i GCC | : CCC | 1440 |
Asp | Val | Aap | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr Asp Leu íle Leu | 11« | i Gly | - Ala | Pro | |
465 | 470 | 47S | 480 | |||||||||
CAT | TAC | TAT | GAG | CAG | ACC | : CGA | . GGG GGC CAG GTG TCC | ’ GTC | ; TGT | ' CCC | TTG | 1489 |
KiS | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | 1 Gly Gly Gin Val Ser | Val | . Cys | < Pro | i Leu | |
4B5 | 490 | 4 95 |
MC MC TTC CCC ACT GTG CTI CTI CTG ASI GTC CTG GCT TCT TM CM «S
Het Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr Hli
10 15
CCT | AGG | GGG | AGG | GTG | CAG | TGG | CAG | TGT | GAC | GCT | GTT | CTC | CGT | GGT | GAG | 1536 |
Pro | Arg | Gly | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Aap | Al* | Val | Leu | Arg | Gly | Glu | |
500 | SOS | 510 | ||||||||||||||
CAG | GGC | CAC | CCC | TGG | GGC | CGC | TTT | GGG | GCA | GCC | CTG | ACA | GTG | TTG | GGG | 1584 |
Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Lau | Thr | Val | Lau | Gly | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
GAT | GTG | AAT | GAG | GAC | AAG | CTG | ATA | GAC | GTG | GCC | ATT | GGG | GCC | CCG | GGA | 1632 |
Aap | Val | Asn | Glu | Asp | Lya | Leu | Zle | Aap | Val | Al* | Zle | Gly | Al* | Pro | Gly | |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
GAG | CAG | GAG | AAC | CGG | GGT | GCT | GTC | TAC | CTG | TTT | CAC | GGA | GCC | TCA | GAA | 1680 |
Glu | Gin | Glu | Aan | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | His | Gly | Ala | Ser | Glu | |
545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
TCC | GGC | ATC | AGC | CCC | TCC | CAC | AGC | CAG | CGG | ATT | GCC | AGC | TCC | CAG | CTC | 1728 |
Ser | Gly | íle | Ser | Pro | Ser | Si* | Ser | Gin | Arg | £1* | Ala | Ser | Sar | Gin | Leu | |
565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
TCC | CCC | AGG | CTG | CAG | TAT | TTT | GGG | CAG | GCG | CTG | AGT | GGG | GGT | CAG | GAC | 1776 |
Ser | Pro | Arg | Lau | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp | |
580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
CTC | ACC | CAG | GAT | GGA | CTG | ATG | GAC | CTG | GCC | GTG | GGG | GCC | CGG | GGC | CAG | 1824 |
Leu | Thr | Gin | Aap | Gly | Leu | Met | Aap | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly | Gin | |
595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
GTG | CTC | CTG | CTC | AGG | AGT | CTG | CCG | GTG | CTG | AAA | GTG | GGG | GTG | GCC | ATG | 1872 |
Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Al* | Met | |
610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
AGA | TTC | AGC | CCT | GTG | GAG | GTG | GCC | AAG | GCT | GTG | TAC | CGG | TGC | TGG | GAA | 1920 |
Arg | Phe | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Al* | Lys | Al* | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | Glu | |
62$ | 630 | 635 | 640 |
GAG AAG CCC AGT GCC CTG GAA GCT GGG GAC GCC ACC GTC TGT CTC ACC1968
Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr
645 650655
ATC CAG AAA AGC TCA CTG GAC CAG CTA GGT GAC ATC CAA AGC TCT GTC2016 íle Gin Lys Ser Ser Leu Asp Gin Leu Gly Asp íle Gin Ser Ser Val
660 665670
AGG TTT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGT CGT CTG ACT TCT CGT GCC ATT2064
Arg Phe Asp Lau Al* Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala íle
675 6B0685
TTC AAT GM ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG GGA2112
Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
690 695700
CTG GGG ATT CAC TGT GAA ACC CTG AAG CTG CTT TTG CCA GAT TGT GTG216C
Leu Gly íle His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp CysVal
705 710 715720
GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC AAC TTC TCA CTG GTG220:
Glu Asp Val V*1 Sar Pro íle íle Leu His Leu Aan Phe Ser LeuVal
725 730735
AGA | GAG | CCC | ATČ | CCC | TCC | CCČ | CAG | AAC | CTG | CGT | CCT | GTG | CTG | GCC | GTG | 2256 |
Arg | Glu | Pro | íle | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Al* | Val | |
740 | 74 5 | 750 | ||||||||||||||
GGC | TCA | CM | GAC | CTC | TTC | ACT | GCT | TCT | CTC | CCC | TTC | GAG | AAG | AAC | TGT | 2304 |
Gly | Ser | Gin | Aap | Leu | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lys | Asn | Cys | |
755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
GGG | CM | GAT | GGC | CTC | TGT | GM | GGG | GAC | CTG | GGT | GTC | ACC | CTC | AGC | TTC | 2352 |
Gly | Gin | Asp | Gly | Leu | Cys | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | Val | Thr | Leu | Ser | Phe | |
770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
TCA | GGC | CTG | CAG | ACC | CTG | ACC | GTG | GGG | AGC | TCC | CTG | GAG | CTC | AAC | GTG | 2400 |
Ser | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Leu | Asn | Val | |
785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
ATT | GTG | ACT | GTG | TGG | MC | GCA | GGT | GAG | GAT | TCC | TAC | GGA | ACC | GTG | GTC | 2448 |
11* | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Ala | Gly | Glu | A*P | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val | Val | |
605 | 810 | 815 | ||||||||||||||
AGC | CTC | TAC | TAT | CCA | GCA | GGG | CTG | TCG | CAC | CGA | CGG | GTG | TCA | GGA | GCC | 2496 |
Sar | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | ser | Hli | Arg | Arg | val | Ser | Gly | Al* | |
820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
CAG | AAG | CAG | CCC | CAT | CAG | AGT | GCC | CTG | CGC | CTG | GCA | TGT | GAG | ACA | GTG | 2544 |
Gin | Lys | Gin | Pro | His | Gin | Ser | Ala | Leu | Arg | Leu | Ala | Cya | Glu | Thr | Val | |
835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
CCC | ACT | GAG | GAT | GAG | GGC | CTA | AGA | AGC | AGC | CGC | TGC | AGT | GTC | AAC | CAC | 2592 |
Pro | Thr | G1U | Asp | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Ser | Arg | Cya | Ser | Val | Asn | His | |
850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
CCC | ATC | TTC | CAT | GAG | GGC | TCT | AAC | GGC | ACC | TTC | ATA | GTC | ACA | TTC | GAT | 2640 |
Pro | Zle | Phe | Hla | Glu | Gly | Ser | Asn | Gly | Thr | Phe | íle | Val | Thr | Phe | Asp | |
865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
GTC | TCC | TAC | AAG | GCC | ACC | CTG | GGA | GAC | AGG | ATG | CTT | ATG | AGG | GCC | AGT | 2688 |
Val | Ser | Tyr | Lys | Ala | Thr | Leu | Gly | Asp | Arg | Met | Leu | Met | Arg | Ala | Ser | |
885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
GCA | AGC | AGT | GAG | AAC | AAT | AAG | GCT | TCA | AGC | AGC | AAG | GCC | ACC | TTC | CAG | 2736 |
Ala | Ser | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Ala | Ser | Ser | Ser | Lya | Ala | Thr | Phe | Gin | |
900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
CTG | GAG | CTC | CCG | GTG | AAG | TAT | GCA | GTC | TAC | ACC | ATG | ATC | AGC | AGG | CAG | 2784 |
Leu | G1U | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala | V* L | Tyr | Thr | Het | íle | Ser | Arg | Gin | |
915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
GM | GAA | TCC | ACC | AAG | TAC | TTC | AAC | TTT | GCA | ACC | TCC | GAT | GAG | AAG | AAA | 2832 |
G1U | Glu | Ser | Thr | Lys | Tyr | Phe | Asn | Phe | Ala | Thr | Ser | Asp | Glu | Lys | Lys | |
930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
ATG | AAA | GAG | GCT | GAG | CAT | CGA | TAC | CGT | GTG | AAT | AAC | CTC | AGC | CAG | CGA | 2980 |
Met | Lys | Glu | Ala | Glu | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Gin | Arg | |
945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
GAT | CTG | GCC | ATC | AGC | ATT | AAC | TTC | TGG | GTT | CCT | GTC | CTG | CTG | AAC | GGG | 2928 |
Asp | Leu | Ala | íle | Ser | 11* | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly | |
965 | 970 | 975 |
GTG Val | GCT Ala | GTG TGG GAT GTG GTC ATG | GAG GCC CCA TCT CAG AGT CTC CCC | 2976 | ||||||||||||
Val | Trp Aap Val 980 | Val Het | Glu 985 | Al* | Pro | Ser | Gin | Ser Leu Pro 990 | ||||||||
TGT | GTT | TCA | GAG | AGA | AM | CCT | CCC | CAG | CAT | TCT | GAC | TTC | CTG | ACC | CAG | 3024 |
Cys | Val | Ser | Glu | Arg | Lya | Pro | Pro | Gin | Kla | Ser | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin | |
995 | 1000 | 1005 | ||||||||||||||
ATT | TCA | AGA | AGT | ccc | ATG | CTG | GAC | TGC | TCC | ATT | GCT | GAC | TGC | CTG | CAG | 3072 |
Zle | Ser | Arg | Sar | Pro | Het | Leu | Asp | Cys | Ser | íle | Ma | Asp | Cys | Leu | Gin | |
1010 | 1015 | 1020 | ||||||||||||||
TTC | CGC | TGT | GAC | GTC | ccc | TCC | TTC | AGC | GTC | CAG | GAG | GAG | CTG | GAT | TTC | 3120 |
Phe | Arg | Cya | Aap | Val | Pre | Sar | Phe | Ser | Val | Gin | Glu | Glu | Leu | Aap | Phe | |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 |
ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG CAG3168
Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Cln
1045 10501055
MG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GM ATT ACG TTC GAC ACA TCC3216
Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu íle Thr Phe Asp ThrSer
1060 10651070
GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG ATG3264
Val Tyr Ser Gin Leu Pre Gly Gin Clu Ala Phe Met Arg Ala GinMet
1075 10BO10B5
GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC ATC3312
Glu Met Val Leu Glu Glu Aap Glu Val Tyr Aan Al* íle Pro íleíle
1090 10951100
ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA GCC3360
Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu íle ThrAla
1105 1110 11151120
ACA | CTG | TAC | AAG | CTT | GGC | TTC | TTC | AM | CGC CAC | TAC | AAG | GAA | ATG | CTG | 3408 |
Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg Hla | Tyr | Lys | G1U | Het | Leu | |
1125 | 1130 | 1135 | |||||||||||||
GAG | GAC | AAG | CCT | GM | GAC | ACT | GCC | ACA | TTC AGT | GGG | GAC | GAT | TTC | AGC | 3456 |
Glu | Asp | Ly* | Pro | Glu | Asp | Thr | Ma | Thr | Phe Ser | Gly | Asp | Asp | Phe | Ser | |
1141 | J | 114! | list | J | |||||||||||
TGT | GTG | GCC | CCA | MT | GTG | CCT | TTG | TCC | TMTAAT' | :ca i | cttti | CCTG' | ΓΤ | 3503 | |
Cya | Val | Ala | Pro | Asn | Val | Pro | Leu | Ser | |||||||
11S! | S | 1161 | 3 |
TAtCtCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATM ATCAACTTAC ATGGÄAACAA 3563
CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTMGCAC CTTCTCGGAG 3623
ÄGATAGAGAT TGTCAATGTT TTTACATATC TGTCCATCTT TTTCAGCMT GACCCACTTT 3683
TTACAGMGC AGGCATGGTG CCAGCATAAÄ TTTTCATATG CTTMGMTT GTCACATGAA 3742
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAÄAA AÄAAAACTTT AG 378:
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 99:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 99:
Mat | Thr | Phe | Gly | Thr | val | Leu | Leu | Leu | Ser | val | Leu | Ala | Ser | Tyr | His |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Phe | Asn | Leu | Asp | Val | Glu | Glu | Pro | Thr | íle | Phe | Gin | Glu | Asp | Mi |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Gly | Phe | Gly | Gin | ser | val | Val | Gin | Phe | Gly | Gly | Sar | Arg | Leu | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Glu | Val | val | Ala | Ala | Asn | Gin | Thr | Gly | Arg | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Tyr | Asp | Cya | Ma | Ma | Ma | Thr | Gly | Met | cys | Gin | Pro | íle | Pro | Leu | His |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
11· | Arg | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Leu | Gly | Leu | Thr | Leu | Ala | Ma |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Thr | Asn | Gly | Ser | Arg | Leu | Leu | Ala | Cys | Gly | Pro | Thr | Leu | His | Arg |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Val | Cys | Gly | Glu | Asn | Sar | Tyr | Ser | Lys | Gly | Ser | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly |
115 | 120 | 125 |
Ser Arg Trp Glu 11« Zle Gin Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Pro | His | Gin | Glu | Met | Asp | íle | Val | Phe | Leu | íle | A*p | Gly | Ser | Gly | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
íle | Asp | Gin | Asn | Asp | Phe | Asn | Gin | Met | Lys | Gly | Phe | Val | Gin | Ala | Val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Het | Gly | Gin | Phe | Glu | Gly | Thr | Asp | Thr | Leu | Phe | Ala | Leu | Met | Gin | Tyr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Asn | Leu | Leu | Lys | íle | His | Phe | Thr | Phe | Thr | Gin | Phe | Arg | Thr | Ser |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Pro | Ser | Gin | Gin | Ser | Leu | Val | Asp | Pro | íle | Val | Gin | Leu | Lys | Gly | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Phe | Thr | Ala | Thr | Gly | íle | Leu | Thr | Val | Val | Thr | Gin | Leu | Phe | His |
2Z5 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
His | Lys | Asn | Gly | Ala | Arg Lys | Ser | Ala | Lys | Ly* | íle | Leu | íle | Val | Ue | |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Thr | Asp | Gly | Gin | Lys | Tyr Lys | Asp | Pro | Leu | Glu | Tyr | Ser | Asp | Val | íle | |
260 | 265 | 270 |
Pro | Gin | Ala | Glu | Lys | Ala | Gly | íle | íle | Arg | Tyr | Ala | íle | Gly | Val | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
His | Ala | Phe | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asn | Thr | íle | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ser | Ala | Pro | Pro | Gin | Asp | His | Val | Phe | Lys | Val | Asp | Asn | Phe | Ala | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Gly | Ser | íle | Gin | Lys | Gin | Leu | Gin | Glu | Lys | Íle | Tyr | Ala | Val | Glu |
325 | 330 | 335 |
Gly Thr Gin Ser Arg Ala Sar Sar Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin 340 345350
Glu Gly Phe Str Thr Ala Lau Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala
355 360365
Val Gly Sar Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pre Pro Asn 370 375380
Met Ser Pro Thr Phe íle Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg 385 390 395400
Asp | Ser | Tyr | Leu | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Leu | Ala | Leu | Trp | Lya | Gly | Val |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gin | Asn | Leu | Val | Leu | Gly | Ala | Pro | Arg | Tyr | Gin | His | Thr | Gly | Lys | Ala |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Val | íle | Phe | Thr | Gin | Val | Ser | Arg | Gin | Trp | Arg | Lys | Lys | Ala | Glu | Val |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Thr | Gly | Thr | Gin | íle | Gly | Ser | Tyr | Phe | Gly | Ala | Ser | Leu | Cys | Ser | Val |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Val | Asp | Ser | Aap | Gly | Ser | Thr | Asp | Leu | íle | Leu | íle | Gly | Al* | Pro |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
His | Tyr | Tyr | Glu | Gin | Thr | Arg | Gly | Gly | Gin | Val | Ser | Val | Cys | Pro | Leu |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Arg | Gly | Arg | Val | Gin | Trp | Gin | Cys | Asp | Ala | Val | Leu | Arg | Gly | Glu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gin | Gly | His | Pro | Trp | Gly | Arg | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | GLy |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Asp | Val | Asn | Glu | Aap | Lya | Lau | íle | Aap | Val | Ala | íle | Gly | Ala | Pro | Gly |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Clu | Gin | Glu | Asn | Arg | Gly | Ala | Val | Tyr | Leu | Phe | Hla | Gly | Ala | Ser | Glu |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Gly | íle | Ser | Pro | Ser | Hla | Ser | Gin | Arg | íle | Ala | Ser | Ser | Gin | Leu |
565 | 570 | 57$ | |||||||||||||
Sar | Pro | Arg | Leu | Gin | Tyr | Phe | Gly | Gin | Ala | Leu | Ser | Gly | Gly | Gin | Asp |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Leu | Thr | Gin | Asp | Gly | Leu | Met | Asp | Leu | Ala | Val | Gly | Ala | Arg | Gly | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Val | Leu | Leu | Leu | Arg | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Lys | Val | Gly | Val | Ala | Met |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Arg | Phe | Ser | Pro | Val | Glu | Val | Ala | Lya | Ala | Val | Tyr | Arg | Cys | Trp | Glu |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Glu | Lys | Pro | Ser | Ala | Leu | Glu | Al* | Gly | Asp | Ala | Thr | Val | Cys | Leu | Thr |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
íle | Gin | Lys | Ser | Ser | Leu | Aap | Gin | Leu | Gly | Asp | íle | Gin | Ser | Ser | Val |
660 | 665 | 670 |
Arg Phe Aep Leu Ala Leu Aap Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala íle
675 680685
Phe | Asn | Glu | Thr | Lys | Asn | Pro | Thr | Leu | Thr | Arg | Arg | Lys | Thr | Leu | Gly |
590 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Gly | íle | His | Cys | Glu | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Leu | Pro | Aap | Cys | Val |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Glu | Aap | Val | Val | Ser | Pro | 11« | íle | Leu | Hla | Leu | Asn | Phe | Ser | Leu | Val |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Arg | Glu | Pro | íle | Pro | Ser | Pro | Gin | Asn | Leu | Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Val |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Gly | Ser | Gin | Asp | Leu | Phe | Thr | Ala | Ser | Leu | Pro | Phe | Glu | Lya | Asn | Cya |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Gly | Gin | Aap | Gly | Leu | Cya | Glu | Gly | Asp | Leu | Gly | Val | Thr | Leu | Ser | Phe |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Ser | Gly | Leu | Gin | Thr | Leu | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Leu | Asn | Val |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
íle | Val | Thr | Val | Trp | Asn | Ala | GLy | Glu | Asp | Ser | Tyr | Gly | Thr | Val | Val |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ser | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Hla | Arg | Arg | Val | Ser | Gly | Ala |
820 | 825 | 830 |
Gin | Lys | Gin | Pro | Hla | Gin | Ser | Ala | Leu | Arg | Leu | Ala | cys | Glu | Thr | val |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Pro | Thr | Glu | Asp | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Ser | Arg | Cys | Ser | Val | Asn | His |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Pro | íle | Phe | His | GlU | Gly | Ser | Aan | Gly | Thr | Phe | íle | Val | Thr | Phe | Asp |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Val | Ser | Tyr | Lya | Ala | Thr | Leu | Gly | Aap | Arg | Met | Leu | Met | Arg | Ala | Ser |
685 | 890 | 895 | |||||||||||||
Al* | Ser | ser | Glu | Asn | Asn | Lya | Ala | ser | ser | ser | Lys | Ala | Thr | Phe | Gin |
900 | 905 | 910 |
Leu | Glu | Leu | Pro | Val | Lys | Tyr | Ala | Val | Tyr | Thr | Met | íle | Ser | Arg | Gin |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Glu | Glu | Ser | Thr | Ly* | Tyr | Phe | Asn | Phe | Ala | Thr | Ser | Asp | Glu | Lys | Lys |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Met | Ly* | Glu | Al* | Glu | His | Arg | Tyr | Arg | Val | Asn | Asn | Leu | Ser | Gin | Arg |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Asp | Leu | Ala | íle | Ser | íle | Asn | Phe | Trp | Val | Pro | Val | Leu | Leu | Asn | Gly |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Val | Ala | Val | Trp | Asp | Val | Val | Met | Glu | Ala | Pro | Ser | Gin | Ser | Leu | Pro |
980 | 985 | 990 | |||||||||||||
Cys | Val | Ser | Glu | Arg | Lya | Pro | Pro | Gin | His | Ser | Asp | Phe | Leu | Thr | Gin |
995 | 1000 | 1005 | |||||||||||||
lla | Ser | Arg | Ser | Pro | Het | Leu | Asp | Cys | Ser | íle | Ale | A3D | Cya | Leu | Gin |
1010 | 1015 | 1020 | |||||||||||||
Phe | Arg | Cys | Asp | Val | Pro | Ser | Phe | Ser | Val | GLn | G1U | G1U | Leu | Asp | Phe |
1025 | 1030 | 1035 | 1040 | ||||||||||||
Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Gly | Trp | Val | Arg | Glu | Thr | Leu | Gin |
1045 | 1050 | 105! | 5 | ||||||||||||
Lys | Lys | val | Leu | val | val | Ser | Val | Ala | Glu | íle | Thr | Phe | Asp | Thr | Ser |
1060 | 1065 | L070 | |||||||||||||
Val | Tyr | Ser | Gin | Leu | Pro | Gly | Gin | Glu | Ala | Phe | Met | Arg | Ala | Gin | Met |
1075 | 1081 | í | 1085 | ||||||||||||
Glu | Met | Val | Leu | Glu | Glu | Asp | Glu | Val | Tyr | Asn | Ala | íle | Pro | íle | íle |
1091 | J | 109! | 5 | 1101 | 3 | ||||||||||
Met | Gly | Ser | Sar | Val | Gly | Ala | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | Leu | íle | Thr | Ala |
1105 | 1110 | 111! | 5 | 1120 | |||||||||||
Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | His | Tyr | lys | Glu | Met | Leu |
112! | 5 | 113' | 0 | 113 | 5 | ||||||||||
Glu | Asp | Lys | Pro | Glu | Aap | Thr | Ala | Thr | Phe | Ser | Gly | Aap | Aap | Phe | Ser |
1141 | 114! | 5 | 115' | 0 | |||||||||||
Cys | Val | Ala | Pro | Asn | Val | Pro | Leu | Ser | |||||||
115. | 5 | 116 | 0 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 100:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1318 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 17..1255 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 100:
AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT 4 9
Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser 15 10
TAC Tyr | CAC GGA TTC AAC TTG | GAC Asp | GTG Val | GAT GAG CCG GTG ATC TTC CAG GAA | 97 | |||||||||||
His | Gly | Phe Asn 15 | Leu | Aap 20 | Glu Pro | Val | íle Phe 25 | Gin Glu | ||||||||
GAC | GCA | GCG | GGC | TTC | GGG | CAG | AGC | GTG | ATG | CAG | TTT | GGA | GGA | TCT | CGA | 145 |
Aep | Ala | Ala | Gly | Phe | Gly | Gin | Ser | Val | Met | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | |
30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
CTC | GTG | GTG | GGA | GCC | CCC | CTG | GCG | GTG | GTG | TCG | GCC | AAC | CAC | ACA | GGA | 193 |
Lau | Val | Val | Gly | Ala | Pro | Leu | Ala | Val | Val | Ser | Ala | Asn | Hla | Thr | Gly | |
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
CGG | CTG | TAC | GAG | TGT | GCG | CCT | GCC | TCC | GGC | ACC | TGC | ACG | CCC | ATT | TTC | 241 |
Arg | Leu | Tyr | Glu | Cys | Al* | Pro | Ala | Sex | Gly | Thr | Cya | Thr | Pro | íle | Phe | |
60 | 65 | 70 | 75 | |||||||||||||
CCA | TTC | ATG | CCC | CCC | GAA | GCC | GTG | AAC | ATG | TCC | CTG | GGC | CTG | TCC | CTG | 2B9 |
Pro | Phe | Met | Pro | Pro | Glu | Ala | Val | Asn | Met | 8ar | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
GCA | GCC | TCC | CCC AAC | CAT | TCC | CAG | CTG | CTG | GCT | TGT | GGC | CCG | ACC | GTG | 337 | |
Al* | Ala | Ser | Pro | Asn | Hla | Ser | Gin | Leu | Leu | Ala | Cya | Gly | Pro | Thr | Val | |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||||
CAT | AGA | GCC | TGC | GGG | GAG | GAC | GTG | TAC | GCC | CAG | GGT | TTC | TGT | GTG | CTG | 385 |
Mi· | Arg | Ala | Cys | Gly | Glu | Asp | Val | Tyr | Ale | Gin | Gly | Phe | Cys | Val | Leu | |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
CTG | GAT | GCC | CAC | GCA | CAG | CCC | ATC | GGG | ACT | GTG | CCA | GCT | GCC | CTG | CCC | 433 |
Leu | Aep | Ala | Kla | Ala | Gin | Pro | íle | Gly | Thr | Val | Pro | Ala | Ala | Leu | Pro | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||||
GAG | TGC | CCA | GAT | CAA | GAG | ATG | GAC | ATT | GTC | TTC | CTG | ATT | GAC | GGC | TCT | 491 |
Glu | Cys | Pro | Asp | Gin | Glu | Met | Aap | íle | Val | Phe | Leu | íle | Aap | Gly | Ser | |
140 | 145 | 150 | 155 | |||||||||||||
GGC | AGC | ATT | AGC | TCA | AAT | GAC | TTC | CGC | AAG | ATG | AAG | GAC | TTT | GTC | AGA | 529 |
Gly | ser | U· | Ser | Ser | Asn | A*p | Phe | Arg | Lya | Met | Lya | Asp | Phe | Val | Arg | |
160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
GCT | GTG | ATG | GAC | CAG | TTC | AAG | GAC | ACC | AAC | ACC | CAG | TTC | TCG | CTG | ATG | 577 |
Al* | Val | Met | Aep | Gin | Phe | Lys | Aap | Thr | Asn | Thr | Gin | Phe | Ser | Leu | Met | |
175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
CAG | TAC | TCC | JAT | GTG | CTG | GTG | ACA | CAT | TTC | ACC | TTC | AGC | AGC | TTC | CGG | 625 |
Gin | Tyr | Ser | Asn | Val | Leu | Val | Thx | Hla | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Phe | Arg |
190 195 200
AAC AGC TCC | AAT CCT CAG | GGC CTA GTG GAG CCC ATT GTG CAG CTG ACA | 673 | |||||||||||||
Asn Sar 20S | sar | Asn | Pro Gin | Gly Leu Val Glu Pro 11* Val | Gin Lau Thr | |||||||||||
210 | 215 | |||||||||||||||
CGC | CTC | ACG | TTC | ACG | GCC | ACA | GGG | ATC | CTG | AAA | GTG | GTG | ACA | GAG | CTG | 721 |
Gly | Lau | Thr | Ph* | Thr | Al* | Thr | Gly | Ila | Lau | Lys | VaL | Val | Thr | Glu | Leu | |
220 | 225 | 230 | 235 | |||||||||||||
TTT | CAA | ACC | AAG | AAC | GGG | GCC | CGC | GAA AGT | GCC | AAG | AAG | ATC | CTC | ATC | 769 | |
Ph* | Gin | Thr | Lya | Ain | Gly | Alt | Arg | Glu | Sar | Al* | Lya | lya | íle | Leu | Ila | |
240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
GTC | ATC | ACA | GAT | GGG | CAG | AAG | TAC | AAA | GAC | CCC | CTG | CAC | TAC | AGT | GCT | 817 |
Val | Ila | Thr | Asp Gly | Gin | Lys | Tyr | Lys | Asp | Pro | Lau | Hla | Tyr | Sar | Ala | ||
25$ | 260 | 26$ | ||||||||||||||
GTC | ATC | CCA | CAG | GCA | GAG | CAG | GCG GGC | ATC | ATC | CGC | TAC | GCC | ATC | GGG | 865 | |
Val | Ila | Pro | Gin | Al* | Glu | Gin | Ala | Gly | Ila | Ila | Arg | Tyr | Ala | Ila | Gly | |
270 | 27$ | 280 | ||||||||||||||
GTG | GGG | GAC | GCG | TTC | CAG | AAA | CCC | ACA | GCC | AGG | CAG | GAG | CTG | GAC | ACC | 913 |
val | Gly Asp | Al* | Ph* | Gin | Lys | Pro | Thr | Al* | Arg | Gin | Glu | Lau | A«P | Thr | ||
285 | 290 | 295 | ||||||||||||||
ATC | GCC | TCC | GAG | CCG | CCC | GAC | GCC | CAC | GTG | TTC | CAG | GTG | GAC | AAT | TTC | 961 |
íle | Ala | Ser | G1U | Pro | Pro | Asp | Al* | Hl* | Val | Phe | Gin | val | Asp | Asn | Ph* | |
300 | 305 | 310 | 315 | |||||||||||||
TCA | GCA | CTC | AGC | AGC | ATC | CAA | AAG | CAG | CTG | TAT | GAC | AGG | ATC | TTT | GCC | 1009 |
Sar | Ala | Lau | Ser | Ser | Ila | Gin | Lys | Gin | Lau | Tyr | Asp | Arg | 11* | Pha | Al* | |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
GTC | GAG | GGA | ACC | CTG | TCA | TCG | GCA | AGC | ACC | TCC | TTC | CAG | CAT | GAG | ATG | 1057 |
VaL | Glu | Gly | Thr | Leu | Ser | Sar | Ala | Ser | Thr | Ser | Phe | Gin | Hla | Glu | Met | |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
TCC | CAA | GAG | GGC | TTC | AGC | TCA | CTT | CTC | ACC | ACG | GAA | GGA | CCG | GTG | CTG | 1105 |
Sar | Gin | Glu | Gly | Pha | Sar | Sar | Leu | Lau | Thr | Thr | Glu | Gly | Pro | Val | Leu | |
3S0 | 355 | 360 | ||||||||||||||
GGG | GCT | GTG | GGC | AGC | TTC | GAT | TGG | TCC | GGG | GGT | GCT | TTC | CTG | TAC | CCC | 1153 |
Gly | Al* | V* L | Gly | Sar | Phe | Α·Ρ | Trp | Ser | Gly | Gly | Al* | Ph* | Lau | Tyr | Pro | |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||||
CCC | GGC | GGG | AGC | CCC | ACC | TTC | ATC | AAC | ATG | TCT | CAG | CAG | AAC | GTG | GAC | 1201 |
Pro | Gly | Gly | Ser | Pro | Thr | Pha | Ila | Aan | Het | Sar | Gin | Gin | Aan | VaL | Aap | |
380 | 385 | 390 | 395 | |||||||||||||
ATG | AGG | GAC | TCC | TAC | CTG | GGT | GAG | GAA | GGG | GTG | GGG | GTG | GGG | ACA | GGT | 1249 |
Met | Arg | Aap | S«r | Tyr | Lau | Gly | Clu | Clu | Gly | Val | Gly | Val | Gly | Thr | Gly | |
400 | 405 | 410 |
CGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGCCTG CCAGCCGAGG GMCJtGGACG 1305
Gly Ser
Glu Gin Ala | Gly íle íle Arg | Tyr Ala íle Gly Val Gly Asp Ala Phe | |||||||||||||
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gin | Lys | Pro | Thr | Ala | Arg | Gin | Glu | Leu | Asp | Thr | íle | Ala | Ser | Glu | Pro |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Pro | Asp | Ala | HLs | Val | Phe | Gin | Val | Asp | Asn | Phe | Ser | Ala | Leu | Ser | Ser |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
íle | Gin | Lya | Gin | Leu | Tyr Asp Arg | íle | Phe | Ala | Val | Glu | Gly | Thr | Leu | ||
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ser | Ser | Ala | Ser | Thr | Ser | Phe | Gin | Kis | Glu | Met | Ser | Gin | Glu | Gly | Phe |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ser | Ser | Leu | Leu | Thr | Thr | Glu | Gly | Pro | Val | Leu | Gly | Ala | Val | Gly | Ser |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Phe | Aap | Trp | 8er | Gly Gly | Ala | Phe | Leu | Tyr | Pro | Pro | Gly Gly | Ser | Pro | ||
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Thr | Phe | Zle | Asn | Met | Ser | Gin | Gin | Asn | Val | Asp | Met | Arg | Aap | Ser | Tyr |
3B5 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Gly | Glu | Glu | Gly | Val | Gly | Val | Gly | Thr | Gly Gly | Ser | ||||
405 | 410 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 102:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1484 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..1482 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 102:
CCAGAGGCAX AGA me (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 101:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 413 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 101:
Gly | Ale | Val | Val | Leu | Leu | Gly | Val | Leu . | Ala | Ser | Tyr | Hla | Gly | Phe | Asn |
L | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Leu | Aap | VaL | Asp | Glu | Pro | Val | Zle | Phe | Gin | Glu | Asp | Al* | Al* | Gly | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Gin | Ser | Val | Met | Gin | Phe | Gly | Gly | Ser | Arg | Leu | Val | Val | Gly | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Pro | Leu | Ala | Val | Val | Ser | Ala | Asn | Hla | Thr | Gly | Arg | Leu | Tyr | Glu | Cys |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Pro | Al* | Ser | Gly | Thr | Cys | Thr | Pro | Zle | Phe | Pro | Ph* | Met | Pro | Pre |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Glu | Ala | Val | Asn | Met | Ser | Lau | Gly | Leu | Ser | Leu | Al* | Ala | Ser | Pro | Asn |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Hlo | Ser | Gin | Lau | Leu | Ala | Cya | Gly | Pro | Thr | Val | HL* | Arg | Ala | Cys | Gly |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Glu | Aap | Val | Tyr | Al* | Gin | Gly | Phe | Cys | Val | Leu | Leu | Asp | Al* | His | Al* |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Gin | Pro | Zle | Gly | Thr | Val | Pro | Al* | Al* | Leu | Pro | Glu | Cya | Pro | Asp | Gin |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Glu | Met | Asp | íle | Val | Phe | Lau | Zle | Asp | Gly | Ser | Gly | Ser | Zle | Ser | Sar |
145 | 150 | 1SS | 160 | ||||||||||||
Asn | Aap | Phe | Arg | Lys | Met | Lys | Asp | Phe | VaL | Arg | Ala | Val | Met | Asp | Gin |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Phe | Lys | Asp | Thr | Asn | Thr | Gin | Phe | Ser | Leu | Met | Gin | Tyr | Ser | Asn | Val |
180 | 18S | 190 | |||||||||||||
Leu | Val | Thr | HLs | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Phe | Arg | Asn | Ser | Ser | Asn | Pro |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gin | Gly | Leu | Val | Glu | Pro | ila | Val | Gin | Leu | Thr | Gly | Leu | Thr | Phe | Thr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ala | Thr | Gly | Zle | Leu | Lys | Val | VaL | Thr | Glu | Leu | Phe | Gin | Thr | Lys | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Al* | Arg | Glu | Ser | Ala | Lys | Lys | íle | Leu | 11* | Val | Zle | Thr | Asp | Gly |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Gin | Ly* | Tyr | Lys | Asp | Pro | Leu | His | Tyr | Ser | Al* | Val | Zle | Pro | Gin | Ala |
260 | 265 | 270 |
GAT GTC CAG AGC TCC ATC AGC TAT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGC CGC | 4S | |||||||||||||||
Asp Val Gin Ser Ser íle Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly | Arg | |||||||||||||||
1 | 5 | 10 | 1S | |||||||||||||
CTG GTC TCT OGG GCC i | m | TTT | CAA | GAG | ACC | CAG | AAC | CAG | ACT | TTA | ACT | 96 | ||||
Leu Val Ser Arg Ala : | íle | Phe i | Gin | Glu | Thr | Gin | Aan | Gin | Thr | Leu | Thr | |||||
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
CGA AGG AAG ACC i | CTG ' | GGG | CTG | GGG | CGT | CAC | TGT | GAA | ACC | ATG | AGG | CTA | 144 | |||
Arg Arg Lya Thr ! | Leu 1 | Gly | Leu | Gly Arg | Hia | Cya | Glu | Thr | Met | Arg | Leu | |||||
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
CTT TTG CCA GAC ' | TGC | GTA | GAG | GAC | GTG | GTG | AAC | CCC | ATC | GTC | CTG | CAC | 192 | |||
Leu Leu Pre Aap i | Cya | Val | Glu | Aap | Val | v*l | Aan | Pro | íle | Val | Leu | His | ||||
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
CTC | AAC | TTC | TCC | CTG | GAG | GGA | CAG | CCA | ATC | CTC | TCA | TCC | CAG | AAT | CTG | 240 |
Leu | Aan | Pha | Ser | Leu | Glu | Gly | Gin | Pro | 11* | Lau | Ser | Ser | Gin | Asn | Leu | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
CGC | CCT | GTG | CTG | GCC | ACG | GGC | TCG | CAG | GAC | CAC | TTC | ATT | GCC | TCC | CTC | 288 |
Arg | Pro | Val | Leu | Ala | Thr | Gly | Ser | Gin | Aap | Hia | Phe | íle | ALa | Ser | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
CCC | TTT | GAG | AAG | AAC | TGC | GGA | CAA | GAT | CGC | CTG | TGT | GAG | GGG | GAC | CTG | 336 |
Pre | Phe | Glu | Lya | Aan | Cya | Gly | Gin | Aap Arg | Lau | Cya | Glu | GLy | Asp | Leu | ||
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
AGC | ATC | AGC | TTC | AAC | TTC | TCG | GGC | TTG | AAT | ACC | CTG | CTG | GTG | GGG | CTC | 384 |
Ser | íle | Sar | Phe | Aan | Phe | Sar | Gly | Leu | Aan | Thr | Leu | Leu | Val | Gly | Leu | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TCC | CTG | GAG | CTC | ACA | GTG | ACA | GTG | ACC | GTG | CGG | AAT | GAG | GGC | GAG | GAC | 4 32 |
Ser | Leu | G1U | Leu | Thr | Val | Thr | Val | Thr | val | Arg | Aan | Glu | Gly | Glu | Asp | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
TCC | TAT | GGG | ACC | GCC | ATC | ACC | CTC | TAC | TAC | CCA | GCA | GGG | CTA | TCC | TAC | 4B0 |
Ser | Tyr Gly | Thr | Al* | 11* | Thr | Leu | Tyr | Tyr | Pro | Ala | Gly | Leu | Ser | Tyr | ||
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
AGG | CGG | GTG | TCG | GGC | CAG | ACA | CAA CCC | TGG | CAG | CGC | CCC | CTG | CAC | CTC | 528 | |
Arg | Arg | Yal | Sex | Gly Gin | Thr | Gin | Pro | Trp | Gin | Arg | Pro | Leu | His | Leu | ||
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GCA | TGT | GAG | GCT | GTA | CCT | ACC | GAG | AGC | GAG | GGC | TTG | AGG | AGT | ACC | AGC | 576 |
Al* | Cya | Glu | Ala | Val | Pro | Thr | Glu | Ser | Glu | Gly | Leu | Arg | Ser | Thr | Ser | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TGC | AGC | GTC | AAC | CAC | CCC | ATC | TTC | CAA | GGG | GGT | GCT | CAG | GGC | ACT | TTC | 624 |
Cya | Ser | Val | Aan | Hla | Pro | 11* | Phe | Gin | Gly | Gly | Ala | Gin | Gly | Thr | Phe | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
GTA | GTC | AAG | TTC | GAT | GTC | TCC | TCC | AAG | GCC | AGC | CTG | GGT | GAC | AGG | TTG | 672 |
Val | Val | Lya | Phe | Aap | Val | Ser | S«r | Lya | Ala | Ser | Leu | Gly Asp Arg | Leu | |||
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
CTC | ATG | GGG | GCC | AGT | GCC | AGC | AGT | GAG | AAT | AAT | AAG | CCT | GCG | AGC | AAC | 720 |
Leu | Met | Gly | Ala | Ser | Ala | Sar | Ser | Glu | Aan | Aan | Lya | Pro | Ala | Ser | Asn | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
AAG | ACC | TCC | TTT | GAG | CTG | GAA | CTG | CCA | GTG | AAA | TAC | GCT | GTC | TAC | ATG | 7 68 |
ty* | Thr | Ser | Phe | Glu | Leu | G1U | Leu | Pro | Val | Lya | Tyr | Alt | Val | Tyr | Met | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
ATG | ATC | ACA | AGG | CAC | GAA | GGC | TCC | ACC | AGG | TTC | TTC | AAC | TTT | TCC | ACT | 416 |
Het | íle | Thr | Arg | Hia | G1U | Gly | Ser | Thr | Arg | Pha | Phe | Asn | Phe | Ser | Thr | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
TCC | GCT | GAG | AAG | AGC | AGC | AAA | GAG | GCC | GAG | CAC | CGC | TAT | CGG | GTG | AAC | 864 |
Ser | Ala | Glu | Lya | Ser | Ser | Lya | Glu | Ala | Glu | Hia | Arg | Tyr | Arg | Val | Aan | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
AAC | CTG | AGT | CTG | CGA | GAT | GTG | GCC | GTC | AGC | GTG | GAC | TTC | TGG | GCC | CCC | 912 |
Asn | Leu | Ser | Leu | Ara Aap | Val | Ale | Val | Ser | Val | Asp | Ph* | Trp | Ala | Pro | ||
290 | 295 | 300 |
SK 283135 Β6
GTG CAG Val Gin 303 | CTG AAC GGA Leu Asn Gly | GCA GCT GTG TGG GAC GTG GCG GTG | GAG GCC | CCT Pro 320 | 960 | |||||||||||
Ala Ala Val Trp Asp Val Ala | Val | Glu | Al* | |||||||||||||
310 | 315 | |||||||||||||||
GCC | CAG | AGC | CTG | CCC | TGT | GCG | CGG | GAG | AGG | GAA | CCT | CCG | AGG | ACC | TCT | 1003 |
Al* | Gin | Ser | Leu | Pro | Cys | Ala | Arg | Glu | Arg | Clu | Pro | Pro | Arg | Thr | Ser | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
GAC | CTG | AGC | CGG | GTC | CCG | GGG | AGT | CCC | GTG | CTG | GAC | TGC | AGC | GTT | GCG | 1056 |
Asp | Leu | Ser | Arg | Val | Pro | Gly | Ser | Pro | Val | Leu | Asp | Cy* | Ser | Val | Ale | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
CAC | TGC | CTG | AGG | TTC | CGC | TGC | CAC | ATC | CCC | TCC | TTC | AGC | GCC | AAG | GAG | 1104 |
His | Cys | Leu | Arg | Ph* | Arg | Cys | Hla | 11* | Pro | Ser | Phe | Ser | Ala | Lys | Glu | |
3SS | 360 | 365 | ||||||||||||||
GAS | CTC | CAC | TTC | ACC | CTG | AAG | GGC | AAC | CTC | AGC | TTC | GCC | TGG | GTC | AGC | 1152 |
Glu | Leu | His | Ph* | Thr | L* u | Lys | Gly Asn | Leu | Ser | Phe | Al* | Trp | Val | Ser | ||
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
CAG | ATG | CTG | CAA | AAG | AAG | GTG | TCG | GTG | GTG | AGT | GTG | GCC | GAG | ATC | ACC | 1200 |
Cln | Met | Leu | Gin | Lya | Lys | Val | Ser | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | íle | Thr | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
TTC | AAC | AGG | GCC | GTG | TAC | TCC | CAA | GTT | CCG | GGC | GAG | GAG | CCC | TTT | ATG | 1248 |
Ph* | Asn | Arg | Al* | val | Tyr | Ser | Gin | Val | Pro | Gly | Glu | Glu | Pro | Phe | M*t | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
AGA | GCC | CAG | GTG | GAG | ACG | GTG | CTG | GAG | GAG | TAT | GAG | GAG | CAC | GAC | CCC | 1296 |
Arg | Ale | Gin | Val | Glu | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Tyr | Glu | Glu | His | Aap | Pro | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
GTC | CCC | CTG | GTG | GTG | GGC | AGC | TGT | GTG | GGC | GGC | CTG | CTG | CTG | CTG | GCT | 1344 |
Val | Pro | Leu | Val | VaL | Gly | Ser | Cys | Val | Gly Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Al* | ||
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
CTC | ATC | TCA | GCC | ACC | CTG | TAC | AAG | CTT | GGC | TTC | TTC | AAG | CGC | CGG | TAC | 1392 |
Leu | íle | Ser | Ala | Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg Arg | Tyr | ||
<50 | 455 | 480 | ||||||||||||||
AAG | GAG | ATG | CTG | GGC | GAG | AAA | CCG | GGA | GAC | GCG | GCC | ACC | TTC | CCC | GGG | 1440 |
Lys | Glu | Met | L«u | Gly | Glu | tys | Pro | Gly | Asp | Ala | Ala | Thr | Phe | Pro | Gly | |
<65 | 470 | 475 | 460 | |||||||||||||
CAG | GAC | GCC | AGC | TGC | GGG | GCT | TCA | GAT | TTG | CCT | TTG | TCC | CAG | 1482 | ||
Glu | Asp | Ala | Ser | Cys | Gly | Ala | Ser | Asp | Leu | Pro | Leu | Ser | Gin | |||
485 | 4 90 | |||||||||||||||
TG | 1484 |
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 103:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 494 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 103:
Asp Val Gin 8er Sar II* Ser Tyr Asp Leu Al* Leu Asp Pro GLy Arg 15 10 1S
Val 305 | Gin Leu Asn Gly | Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro | |||||||||||||
310 | 315 | 320 | |||||||||||||
Ala | Gin | Ser | Leu | Pro | Cys | Ala | Arg | Glu | Arg | Glu | Pro | Pro | Arg | Thr | Ser |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asp | Leu | Ser | Arg | Val | Pro | Gly | Ser | Pro | Val | Leu | Asp | Cys | Ser | Val | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
His | Cys | Leu | Arg | Phe | Arg | Cys | His | íle | Pro | Ser | Phe | Ser | Ale | Lys | Glu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
G1U | Leu | His | Phe | Thr | Leu | Lys | Gly | Asn | Leu | Ser | Phe | Ala | Trp | Val | Ser |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Gin | Met | Leu | Gin | Lys | Lys | Val | Ser | Val | Val | Ser | Val | Ala | Glu | íle | Thr |
3B5 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Phe | Asn | Arg | Ala | Val | Tyr | Ser | Gin | Val | Pro | Gly | Glu | Glu | Pro | Phe | Met |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Arg | Ala | Gin | Val | Glu | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Tyr | Glu | Glu | KiS | Asp | Pro |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Val | Pro | Leu | Val | Val | Gly | Ser | Cys | VaL | Gly Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala | |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Leu | íle | Ser | Ala | Thr | Leu | Tyr | Lys | Leu | Gly | Phe | Phe | Lys | Arg | Arg | Tyr |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Lys | Glu | Mat | Leu | Gly | Glu Lys | Pro | Gly Asp | Ale | Ala | Thr | Phe | Pro | Gly | ||
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Glu | Asp | Ala | Ser | Cys | Gly Ala | Ser | Asp | Leu | Pro | Leu | Ser | Gin | |||
<85 | 490 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Hybridom označený 199M, uložený v zbierke ATCC pod depozitným číslom HB 12058.
- 2. Monoklonálna protilátka proti α-podjednotke integrínu B2 sekretovaná hybridómom podľa nároku 1.4 výkresyLeu Val Ser Arg Ala 11« Phe Gin Glu Thr Gin Asn Gin Thr Leu Thr
20 25 30 Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu 35 40 45 Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro íle Val Leu Kla 50 55 60 Leu Asn Ph* Ser Leu Glu Gly Gin Pro II* Leu Ser Ser Gin Asn Leu65 70 75 80 Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gin Asp His Phe íle Ala Ser Leu 85 90 95 Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gin Asp Arg Leu Cys Glu Gly ÄSp Leu 100 105 110 Ser íle Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu VaL Gly Leu 115 120 125 Ser Leu Glu Leu Thr V*1 Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp 130 135 140 Ser Tyr Gly Thr Ala íle Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr 145 150 155 L6Q Arg Arg Val Ser Gly Gin Thr Gin Pro Ttp Gin Arg Pro Leu His Leu 165 170 175 Ala Cys Glu Ale V*1 Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Sex iso 185 190 Cys Ser val Asn His Pro íle Phe Gin Gly Gly Ala Gin Gly Thr Phe 195 200 205 val val Lys Phe ASP Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu 210 215 220 Leu Met Gly Ala Ser AL* Ser Ser Glu Asn Asn Lye Pro Ala Ser Asn 225 230 235 240 Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lya Tyr Ala Val Tyr Met 245 250 255 Met Ila Thr Arg Kla Glu Gly Ser Thr Arg Phe Eh* Aan Phe Ser Thr 260 265 270 Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn 275 280 285 Aan Leu Ser Leu Arg Asp Val ALa Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro 290 295 300 1 / 4 r-r*, o *a- LD sso 91010 rH wsk «r HHH or»09 O19191 r<HH VO hs 00 <r CVNN vo r*, co 91 91 91 OUCMÍM kd TF-GT—vll lsvlasyhgf nldveeptif qedaggfgos vvqfggsrlvCDUb ma-lr—vll ltaltlciigf hldtehamtf oenargfgqs vvqlqgsrvv v>v>vi0 U r-< r-i rK r-4 aaa <aO uuo QdO >>->·OOOZ Vi O OOO I— CC-M oeo <cvíví <>->SSS0.0.0. g»ug> LU(5LU o. eso H-IZ < < V) αω> 0.0.0.>U.-J ŕ-idZ aoa wo.hluoc 3X II -J I KZIV) vío.CS(5(5-JU.J-JU-Ll. uuu Vi-J-J ««« ZZH Vi>-J >->->Vil-XLULUQS O Vi (5 CJCJO >HUI OíO = ZZZ pifŕO.O.O. OOO uou sss moo V)Bl Vi 0 0.0. ZV) V)0 o r4rH t-ír-H QQQ «G) (J-u u. u. -JUJ i* ZLU Z Vi V) Vi líg 333 <vi viU.U.U. -J-J c f-h-H pižw H· Vi O. o&os uíSes ÍX--JLU oco (9LU V) ^viSÉQ. OSOS <<< O O (B «I— vi Z+-K zzz u. u. u. .J—J—JKza< o. a. ví U! «O L1.U.U· —J mJ mJ QQZ >·>□ q. a. v> ZZQS □ Jj qqq O O. Vi Vi V) Vi 2(5 C5 □ MW eias-J >>u.ui I—< ►—i ►—4 V) Vi V) 00.0. V)ZZ gíáí CD CD O 0.0. Vi CD CD CD V) V) V) WZh aaa CD CD CD h-zz Hf-H aoQ ZOO ►—«»—« F-4 F-r F-< F-( LuLuU. -J-J-J CLUUJ HOM U. U. U. -J-J-J ><c> Ll.lx.ll. F—1 F—« F—C hhh *** i—(»—< HXV>3UIQU1 <<< víza0 U t-írri rH r4 QQQ BCJG)0 O r4rH r-4 rri DDQ BGJUJ0 u rHt-4 rH rH aaaOBRÁZOK 1A aD QELHTISSAP PQDIIVFKVDN FAALGSIQKQ LQEKIYAVEG TQSRASSSFQ 346CDlls QELNTIASKP PRDHVFQVNN FEALKTIQNQ LREKIFAIEG TQTGSSSSFE 347CDllc KELNDIASKP SOEHIFKVED FDALKDIQNQ LKEKIFAIEG TETISSSSFE 348 u9 r>*co O) OY oš m mm va r*.co «ο· «Τ cr •r ty er ve r* oo O O» CTt ey ey var* r*, crcr unmun var* b*Ch 0V OV vníma>(/)> U1ZUJ 0.0.0. OUlUi ZQZ <<< -l.J-1 UJUIUJ IXl>IXl £z£ 0.0.0. tStíJtS aaa htícnz LJCJLJ 0.0.0. C/)fe-U) ZZZ ctíixiS 333 (/)1/)(/) <<< 000 ac as z ezo HHH Ctí 19 Ctí <<> U. U. U. (/)!—(/) uSS >>> ΗΉΙ— >Z> 000 aaa ζωα. pec ocaíeí hH j— UliíV) h 1— P -J-J-J ZLUZ ĽLU.U- ooo ac hc «u *-<z»-< UJUIUJ aaa o. σι o. ><> >>->- UI00 cl H· o. >->>- S3Í >>:>: >>> -J-J —1 ddd zzz aaa LUU.U. o< 1— ►—1 ►—l 0<5í§ 000 -J-J—J 000 ddd MMH >>> </)QfU· »*“ —« (/) (/)(/) 000 >>> <>-<0(/)0Ix.-J> —10.0. «0«V1O.SĽ <o l-<< ΙΛΙΛΙΛ IX. U. U. 000 UJUIUJ OCO ocacecO.O.O. <<< 000 >>> -JUJ ΖΙΛΙΛ ooo ^ar^ - 3 z 3SKSUJ<LU H < ί</»<</)000 JJJ >>-> <Λ<ΙΛ h<>>gge (/)1/)(/)000QZQ (Λ(/)Η aaa >>> aaa
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/605,672 US5817515A (en) | 1993-12-23 | 1996-02-22 | Human B2 integrin alpha subunit antibodies |
PCT/US1997/002713 WO1997031099A1 (en) | 1996-02-22 | 1997-02-24 | Human beta 2 integrin alpha subunit |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK140997A3 SK140997A3 (en) | 1998-09-09 |
SK283135B6 true SK283135B6 (sk) | 2003-03-04 |
Family
ID=24424704
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1409-97A SK283135B6 (sk) | 1996-02-22 | 1997-02-24 | Hybridóm označený 199M a monoklonálna protilátka proti integrínu beta2 produkovaná týmto hybridómom |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5817515A (sk) |
EP (1) | EP0835301B1 (sk) |
JP (1) | JP2001526524A (sk) |
CN (1) | CN1103812C (sk) |
AT (1) | ATE293685T1 (sk) |
AU (1) | AU723110B2 (sk) |
BR (1) | BR9702101A (sk) |
CA (1) | CA2218755C (sk) |
CZ (1) | CZ287921B6 (sk) |
DE (1) | DE69733051D1 (sk) |
FI (1) | FI974018A (sk) |
HU (1) | HU223977B1 (sk) |
IL (1) | IL122011A (sk) |
NO (1) | NO318764B1 (sk) |
PL (1) | PL187013B1 (sk) |
RU (1) | RU2183671C2 (sk) |
SK (1) | SK283135B6 (sk) |
WO (1) | WO1997031099A1 (sk) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5837478A (en) * | 1993-12-23 | 1998-11-17 | Icos Corporation | Method of identifying modulators of binding between and VCAM-1 |
US6620915B2 (en) * | 1993-12-23 | 2003-09-16 | Icos Corporation | Monoclonal antibodies specific for integrin α-d subunit |
US20030055231A1 (en) * | 1998-10-28 | 2003-03-20 | Jian Ni | 12 human secreted proteins |
US6663863B2 (en) | 2000-03-17 | 2003-12-16 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Method of inhibiting stenosis and restenosis |
WO2023235971A1 (en) * | 2022-06-08 | 2023-12-14 | The Regents Of The University Of California | Antibodies and immunotherapies that target the active conformation of integrin beta 2 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4271139A (en) * | 1978-03-27 | 1981-06-02 | Hiram Hart | Scintillation proximity assay |
US4568649A (en) * | 1983-02-22 | 1986-02-04 | Immunex Corporation | Immediate ligand detection assay |
WO1992006697A1 (en) * | 1990-10-23 | 1992-04-30 | Repligen Corporation | Anti-inflammatory composition |
AU667487B2 (en) * | 1991-10-01 | 1996-03-28 | General Hospital Corporation, The | Preventing allograft rejection with antibodies to adhesion molecules |
WO1993006865A1 (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-15 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Treatment of ocular inflammation by blockage of cell adhesion molecules |
US5470953A (en) * | 1993-12-23 | 1995-11-28 | Icos Corporation | Human β2 integrin α subunit |
JPH09512252A (ja) * | 1994-04-12 | 1997-12-09 | ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 呼吸性ウイルス感染の処置における細胞間接着分子/受容体相互作用を遮断する薬剤の使用 |
-
1996
- 1996-02-22 US US08/605,672 patent/US5817515A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-02-24 SK SK1409-97A patent/SK283135B6/sk unknown
- 1997-02-24 PL PL97323195A patent/PL187013B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 JP JP53033797A patent/JP2001526524A/ja active Pending
- 1997-02-24 EP EP97906713A patent/EP0835301B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-24 DE DE69733051T patent/DE69733051D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-24 BR BR9702101A patent/BR9702101A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 RU RU97119175/13A patent/RU2183671C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 WO PCT/US1997/002713 patent/WO1997031099A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-24 CA CA002218755A patent/CA2218755C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-24 HU HU9901579A patent/HU223977B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 AT AT97906713T patent/ATE293685T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 CZ CZ19973286A patent/CZ287921B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 IL IL12201197A patent/IL122011A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 CN CN97190406A patent/CN1103812C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-24 AU AU21333/97A patent/AU723110B2/en not_active Ceased
- 1997-10-21 FI FI974018A patent/FI974018A/fi unknown
- 1997-10-21 NO NO19974852A patent/NO318764B1/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69733051D1 (de) | 2005-05-25 |
RU2183671C2 (ru) | 2002-06-20 |
EP0835301A1 (en) | 1998-04-15 |
NO974852D0 (no) | 1997-10-21 |
HU223977B1 (hu) | 2005-03-29 |
AU723110B2 (en) | 2000-08-17 |
AU2133397A (en) | 1997-09-10 |
IL122011A (en) | 2001-05-20 |
HUP9901579A2 (hu) | 1999-08-30 |
PL187013B1 (pl) | 2004-04-30 |
CA2218755C (en) | 1999-08-31 |
CZ328697A3 (cs) | 1998-07-15 |
FI974018A (fi) | 1997-12-03 |
WO1997031099A1 (en) | 1997-08-28 |
PL323195A1 (en) | 1998-03-16 |
JP2001526524A (ja) | 2001-12-18 |
FI974018A0 (fi) | 1997-10-21 |
SK140997A3 (en) | 1998-09-09 |
HUP9901579A3 (en) | 2001-10-29 |
NO974852L (no) | 1997-12-19 |
CA2218755A1 (en) | 1997-08-28 |
IL122011A0 (en) | 1998-03-10 |
CZ287921B6 (cs) | 2001-03-14 |
CN1189851A (zh) | 1998-08-05 |
NO318764B1 (no) | 2005-05-02 |
BR9702101A (pt) | 1999-07-20 |
EP0835301B1 (en) | 2005-04-20 |
ATE293685T1 (de) | 2005-05-15 |
CN1103812C (zh) | 2003-03-26 |
US5817515A (en) | 1998-10-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2001296839B2 (en) | Use of anti-human integrin alpha D antibodies to treat spinal cord injury | |
EP0686161B1 (en) | Novel human beta2 integrin alpha subunit | |
AU740106B2 (en) | Novel human beta2 integrin alpha subunit | |
US20060280739A1 (en) | Novel human beta-2 integrin alpha subunit | |
AU2001296839A1 (en) | Use of anti-human integrin alpha D antibodies to treat spinal cord injury | |
AU775300B2 (en) | Method for inhibiting macrophage infiltration using monoclonal anti-alpha-d-antibodies | |
SK283135B6 (sk) | Hybridóm označený 199M a monoklonálna protilátka proti integrínu beta2 produkovaná týmto hybridómom | |
US5728533A (en) | Human β2 integrin αsubunit | |
US5831029A (en) | Human β2 integrin α subunit | |
EP2182008A2 (en) | Monoclonal anti alpha-D (ITGAD) antibodies for use in the treatment of inflammation | |
Gallatin et al. | Human beta2 integrin alpha subunit |