SK283135B6

SK283135B6 - Hybridóm označený 199M a monoklonálna protilátka proti integrínu beta2 produkovaná týmto hybridómom

Info

Publication number: SK283135B6
Application number: SK1409-97A
Authority: SK
Inventors: W. Michael Gallatin; Der Vieren Monica Van
Original assignee: Icos Corporation
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2003-03-04
Also published as: BR9702101A; NO318764B1; JP2001526524A; AU2133397A; WO1997031099A1; DE69733051D1; PL187013B1; SK140997A3; HU223977B1; FI974018A; CA2218755C; ATE293685T1; CZ328697A3; CN1103812C; FI974018A0; NO974852L; EP0835301A1; HUP9901579A3; IL122011A0; PL323195A1

Abstract

Hybridóm označený 199M, uložený v zbierke ATCC pod depozitným číslom HB 12058, a monoklonálna protilátka proti a podjednotke integrínu beta2 sekretovaná týmto hybridómom.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka hybridómu označeného 199M a monoklonálnej protilátky sekretovanej týmto hybridómom. Všeobecne vynález opisuje klonovanie a expresiu polynukleotidov kódujúcich novú a podjednotku ľudského integrínu β₂, označovanú ako u_d, ktorá je štruktúrne podobná známym a podjednotkám ľudského integrínu β₂, označovaným CDlla, CDllb a CDllc. Vynález sa takisto týka polynukleotidov, ktoré majú homológiu k sekvencií kódujúcej ľudský a_d, izolovaných z iných živočíšnych druhov.

Doterajší stav techniky

Integriny sú triedou molekúl asociovaných s membránou, ktoré sa aktívne zúčastňujú na procese bunkovej adhézie. Integriny sú transmembránové heterodiméry zložené z podjednotky a, ktorá je nekonvalentne asociovaná s podjednotkou β. V súčasnosti je známych prinajmenšom štrnásť podjednotiek a a osem podjednotiek (zhrnuté vSpringer, Náture 346 : 425 až 434 (1990)). Podjednotky sú obvykle schopné asociácie s viac ako jednou podjednotkou a a heterodiméry majúce spoločnú podjednotku β vytvárajú v populácii integrínov jednotlivé podtriedy.

Jedna podtrieda ľudských integrínov, ktorá je exprimovaná len na povrchu bielych krviniek, je charakterizovaná prítomnosťou spoločnej podjednotky β₂. Výsledkom tejto bunkovej špecifickej expresie je skutočnosť, že tieto integríny sú obvykle označované ako leukocytové integriny, Leu-CAM alebo leukointegríny. Vzhľadom na prítomnosť spoločnej podjednotky β₂, je inou alternatívou označovať tieto integriny ako integriny β₂. Podjednotka β₂ (CD18) bola už predtým izolovaná v spojení s jednou z troch rozdielnych podjednotiek a, označovaných CDlla, CDllb a CD1 lc. Izolácia cDNA kódujúcej ľudský CD18 je opísaná v publikácii Kishimoto a ďalší. Celí 48 : 681 až 690 (1987). Podľa oficiálnej nomenklatúry WHO (Svetová zdravotnícka organizácia) sú tieto heterodimérne proteíny označované ako CDlla/CD18. CDllb/CD18 a CDllc/CD18; vo všeobecne používanej nomenklatúre sú tieto označované ako LFA-1 (CDlla/CD18). Mac-1 alebo Mol (CD1 lb/CD18) a P15095 alebo LeuM5 (CDllc/CD18) [Cobbold a ďalší, v Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, strana 788 C 1987)]. Bolo dokázané, že a podjednotky CD1 la, CD1 lb a CD1 lc ľudského integrínu β₂ migrujú pri elektroforéze uskutočňovanej v redukujúcich podmienkach so zdanlivými molekulovými hmotnosťami približne 180 kD (CDlla), 155 kD (CDllb) a 150 kD (CDllc). DNA kódujúca tieto podjednotky už boli klonovanc [CDlla, Larson a ďalší. J. Celí Biol. 180 : 703 až 712 (1989); CDllb, Corbi a ďalší. J. Biol. Chem. 263 : 12403 až 12411 (1988) a CD1 lc, Corbi a ďalší. EMBO J. 6 : 4023 až 4028 (1987)]. Domnelé homológy a a β reťazcov ľudského integrínu β₂, definované podľa približnej podobnosti molekulových hmotností, boli pomocou najrôznejších metód identifikované u iných živočíšnych druhov, vrátane opíc a primátov [Letvin a ďalší, Blood 61 : 408 až 410 (1983),], myší [Sanchez-Madrid a ďalší, J. Exp. Med. 154 : 1517 (1981)] a psov [Moare a ďalší, Tissue Antigens 36:211 až 220 (1990)].

Ukázalo sa, že absolútne molekulové hmotnosti predpokladaných homológov a a B reťazcov ľudského integrínu β₂ získaných z iných živočíšnych druhov, sa podstatne líšia [pozri napríklad Danilenko a ďalší, Tissue Antigens 40 : 13 až 21 (1992)] a vzhľadom na absenciu informácii týkajúcich sa sekvencie týchto homológov nie je možné s určitos ťou definovať vzťah medzi podjednotkami ľudského integrínu a podjednotkami identifikovanými u iných druhov. Medzi rôznymi druhmi boli navyše pozorované rozdiely v počte zástupcov jednotlivých rodín proteínov. Uvážme napríklad, že z králikov bolo izolovaných viac izotypov IgA ako ich existuje u ľudí [Bumctt a ďalší. EMBO J. 8 : 4041 až 4047 (1989) a Schneiderman a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86 : 7561 až 7565 (1989)]. Obdobne, u ľudí bolo doteraz identifikovaných prinajmenšom šesť variantov metalotioneínov [Karin a Richards, Náture 299.797 až 802 (1982) a Varshney a ďalší, Mol. Celí. Biol. 6 : 26 až 37. (1986)], zatiaľ čo u myší existujú dôkazy o prítomnosti len dvoch takýchto variantov [Searle a ďalší, Mol. Celí. Biol. 4 : 1221 až 1230 (1984)]. Z existencie viacerých zástupcov proteínov u jedného druhu sa teda nedá jednoznačne odvodiť, žeby príslušný zástupcovia rodiny proteínov museli existovať aj u iných druhov.

Pokiaľ ide o integriny fi₂, bolo u psov pozorované, že predpokladaný psí náprotivok (β₂) ľudského CD 18 je schopný vytvárať diméry až so štyrmi rozdielnymi podjednotkami a [Danilenko a ďalší, pozri skôr]. Výsledkom imunizácie myší pomocou splenocytov získaných z organizmov psov bolo vytvorenie monoklonálnych protilátok, ktoré imunoprecipitovali s proteínmi experimentálne označenými ako psie homológy k ľudským CD 18, CDlla, CDllb a CDllc; táto homológia bola predovšetkým založená na zistení podobných, ale nie identických, molekulových hmotností. Ďalšia protilátka namierená proti splenocytom získaným z organizmu psov, označené Call.8H2, rozpoznávala a imunoprecipitovala so štvrtou podjednotkou (psou) podobnou podjednotke a. Táto štvrtá psia podjednotka je takisto schopná asociácie s podjednotkou β₂, ale má jedinečnú molekulovú hmotnosť a je exprimovaná len na subpopulácii diferencovaných tkanivových makrofágov.

Výsledkom imunizácie chrčkov pomocou dendritických buniek získaných z organizmov myší bolo vytvorenie dvoch monoklonálnych protilátok namierených proti integrínom [Metlay a ďalší, J. Exp. Med. 171 : 1753 až 1771 (1990)]. Jedna z týchto protilátok, označená 2E6, imunoprecipitovala prevažne s heterodimérom tvoreným podjednotkami so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 180 kD a 90 kD a v menšej miere potom s proteínmi so zdanlivými molekulovými hmotnosťami v rozmedzí 150 až 160 kD. Druhá z týchto protilátok, označená N418, imunoprecipitovala s ďalším zdanlivým heterodimérom tvoreným podjednotkami so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 150 kD a 90 kD. Z výsledkov štúdií, pri ktorých bola blokovaná bunková adhézia, bolo usúdené, že protilátka 2E6 rozpoznáva myšací náprotivok ľudského CD 18, zatiaľ čo molekulová hmotnosť zistená pri antigéne N418 naznačovala, že ide o myšací homológ ľudského CD1 lc/CD18, ďalšie analýzy ukazujú, že tento myšací antigén má distribúciu v tkanivách, ktorá nezodpovedá distribúcii pozorovanej u ľudského CD1 lc/CD18.

Antigény rozpoznávané prostredníctvom psej protilátky Call.8H2 a myšacej protilátky N418 môžu reprezentovať rôzne varianty (napríklad s rôznym stupňom glykozylácie alebo produkty rôzne zostrihnutých mRNA) už predtým identifikovanej psej alebo myšacej podjednotky a. Inou možnosťou je, že tieto antigény môžu reprezentovať unikátne podjednotky a psích alebo myšacích integrínov. V momente, keď nie sú dostupné informácie týkajúce sa primárnej štruktúry, nie je možné tieto dve alternatívy odlíšiť.

U ľudí je heterodimér CDlla/CD18 exprimovaný na povrchu všetkých lymfocytov. Heterodimér CD1 lb/CD18 a CDllc/CD18 sú v podstate exprimované len na povrchu monocytov, granulocytov, makrofágov a NK buniek („na tural killer celí“), ale CDllc/CD18 bol takisto delegovaný u niektorých typov B-buniek. Všeobecne je možné povedať, že CDI la/CD18 prevažuje u lymfocytov, CDI lb/CD18 u granulocytov a CDllc/CD18 na povrchu makrofágov [pozri súhrnný článok Amaout; Blood 75 : 1037 až 1050 (1990)]. Expresia reťazcov a sa však líšila v závislosti od stupňa aktivácie a diferenciácie jednotlivých typov buniek [pozri súhrnný článok, Larson a Springer, Immunol. Rev. 114: 181 až 217 (1990)].

Pri použití protilátok, ktoré sú schopné blokovať bunkovú adhéziu sprostredkovanú pomocou íntegrínov β₂, bolo dokázané, že tieto integríny β₂ sa v organizme človeka zúčastňujú na imunitnej a zápalovej reakcii. Napríklad heterodiméry CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18 sa aktívne zúčastňujú na väzbe NK buniek na bunky lymfómu a adenokarcinómu [Patarroyo a ďalší, Immunol. Rev: 114 : 67 až 108 (1990)], akumulácii granulocytov [Nourshargh a ďalší. J. Immunol. 142 : 3193 až 3198 (1989)], úniku plazmy nezávislému od činnosti granulocytov [Arfors a ďalší, Blood 69 : 338 až 340 (1987)], chemotaktickej odpovede stimulovaných leukocytov [Arfors a ďalší, pozri skôr] a adhézii leukocytov k vaskulámemu endotelu [Price a ďalší, J. Immunol. 139 : 4174 až 4177 a Smith a ďalší, J. Clin. Invest. 83 : 2008 až 2017 (1989)]. Hlavná úloha integrínov β₂ pri imunitných a zápalových reakciách je zrejmá z klinického syndrómu označovaného ako nedostatočnosť adhézie leukocytov (LAD - leukocyte adhesion deficiency); medzi ktorého klinické prejavy patria neustále sa opakujúce bakteriálne infekcie ohrozujúce život. LAD je zapríčinená rôznorodými mutáciami v podjednotke β₂ [Kishimoto a ďalší, Celí 50 : 193 až 202 (1987)] a závažnosť chorôb koreluje so stupňom deftciencie v expresii podjednotky [L. Vytvorenie kompletného heterodiméru integrínu je mutáciou v podjednotke β₂ sťažené [Kishimoto a ďalší, Celí 50; 193 až 202 (1987)].

Je zaujímavé, že prinajmenšom pri jednej protilátke špecificky namierenej proti Dl8 bolo dokázané, že in vitro inhibuje tvorbu syncýcií spôsobenou vírusom ľudskej imunodeficiencie typu 1 (HIV-1), aj keď presný mechanizmus tejto inhibície je nejasný (Hildreth a Orentas, Science 244 : 1075 až 1078 (1989)]. Toto pozorovanie je v súlade s objavom, že hlavný receptor pre CDlla/CD18, ktorým je ICAM-1, je takisto povrchovým receptorom pre veľkú skupinu rinovírusov [Greve a ďalší, Celí 56 : 839 (1989)].

Význam väzbovej aktivity integrínu β₂ pri imunitnej a zápalovej reakcii u ľudí podčiarkuje nevyhnutnosť dosiahnutia dokonalejšieho poznania tejto triedy povrchových proteínov. Identifikácia doteraz neznámych členov tejto subpopulácie, ako aj ich zodpovedajúcich receptorov a produkcia monoklonálnych protilátok alebo iných rozpustných látok, ktoré môžu pozmeniť biologickú aktivitu integrínov β₂, poskytnú prostriedky (využiteľné v praxi) na terapeutickú intervenciu pri imunitných a zápalových odpovediach zviazaných s integrínmi β₂.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je hybridóm označený 199M, uložený v zbierke ATCC pod depozitným číslom HB 12058 a monoklonálna protilátka sekretovaná týmto hybridómom.

Jedna stránka vynálezu opisuje novopurifikované a izolované polynukleotidy (napríklad DNA a RNA transkripty, tak kódujúce, ako aj antikódujúce vlákna) kódujúce novú a podjednotku ľudského integrínu fi₂, označovanú a_da jej varianty (napríklad delečné, adičné alebo substitučné analógy), ktoré majú väzbové a/alebo imunologické vlast nosti vlastné podjednotke a_d. Vo výhodnej realizácii vynálezu patria medzi tieto molekuly DNA, genómová DNA, cDNA a úplne alebo čiastočne syntetizované molekuly DNA. V súčasnosti sa ako najvýhodnejší polynukleotid javí molekula DNA, ako je zobrazená v SEK. ID. č.: 1, kódujúca polypeptid so sekvenciou SEK. ID. č.: 2. Vynález takisto opisuje konštrukciu rekombinantných plazmidových a vírusových konštruktov DNA (expresívne konštrukty), ktoré obsahujú kódujúcu sekvenciu pre a_d, pričom táto sekvencia kódujúca a_d je funkčne pripojená k homológnemu alebo heterológnemu regulačnému prvku/prvkom transkripcie.

Vynález takisto opisuje polynukleotidy izolované z myší a laboratórnych potkanov, ktoré majú homológiu k polynukleotidom kódujúcim ľudský a_d. Vo výhodnej realizácii ide o polynukleotid získaný z myší, zobrazený v SEK. ID. č.: 52 a o polynukleotid získaný z laboratórnych potkanov zobrazený v SEK. ID. č.: 54.

Iná stránka vynálezu sa týka prokaryotických a eukaryotických hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných sekvenciami DNA podľa vynálezu, ktoré na svojom povrchu exprimujú polypeptid a_d alebo nejaké jeho varianty. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú veľmi užitočné pre produkciu veľkých množstiev polypeptidu 5_d, ktorý môže byť izolovaný buď zo samostatnej hostiteľskej bunky alebo z média, v ktorom sú tieto bunky kultivované. Hostiteľské bunky exprimujúce polypeptid a_d na extracelulámej strane membrány môžu byť takisto použité ako imunogény pri produkcii protilátok špecificky namierených proti a_d. Vo výhodnej realizácii vynálezu budú hostiteľské bunky transfekované DNA kódujúcou a_d kotransfekované DNA kódujúcou podjednotku β₂, aby boli na ich povrchu umožnené expresie tohto heterodiméru.

Vynález sa takisto týka purifikovaných a izolovaných polypeptidov, ich fragmentov a rôznych variantov. Vo výhodnej realizácii vynálezu sú polypeptidy a_d polypeptidy so sekvenciou znázornenou ako SEK. ID. č.: 2. Nové produkty a_d podľa vynálezu môžu byť izolované z prirodzených zdrojov, ale vo výhodnej realizácii sú spolu s produktmi rôznych variantov a_d produkované s využitím rekombinantných postupov, v ktorých sú využité hostiteľské bunky podľa vynálezu. Pri použití rôznych hostiteľských buniek a/alebo špecifickým spracovaním po izolácii, môžu byť pripravené úplne glykozylované, čiastočne glykozylované a úplne deglykozylované formy polypeptidu a_á. Medzi varianty polypeptidov a_d podľa vynálezu patria vo vode rozpustné a vo vode nerozpustné polypeptidy a_d, vrátane ich analógov, v ktorých je jedna alebo viac aminokyselín odstránená alebo nahradená: (1) bez straty, a vo výhodnej realizácii, s posilnením jednej alebo viacerých biologických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre a_d; alebo (2) pri Špecifickom zablokovaní určitého druhu väzby ligand/receptor alebo pri zablokovaní signalizačnej funkcie. Vynález takisto opisuje íúzne polypeptidy, v ktorých sú aminokyselinové sekvencie z polypeptidu a_d exprimované v nadväznosti na aminokyselinové sekvencie z iných polypeptidov. Takéto íúzne polypeptidy môžu mať v porovnaní s polypeptidom a_d divokého typu pozmenené biologické, biochemické a/alebo imunologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu patria analógy polypeptidov obsahujúce navyše aminokyselinový zvyšok (napríklad lyzín alebo cysteín), ktorý uľahčuje tvorbu multimérov.

Vynález sa takisto týka polypeptidov a molekúl s nepeptidovou povahou, ktoré špecificky viažu u_d. Medzi výhodné molekuly, ktoré viažu a_d, patria protilátky (napríklad monoklonálne a polyklonálne protilátky), receptory (napríklad ich rozpustné formy alebo formy asociované s membránou) a iné ligandy (napríklad prirodzene sa vyskytujúce alebo umelo pripravené molekuly) vrátane molekúl, ktoré sa za prítomnosti monoklonálnych protilátok namierených proti aj a/alebo špecifických receptorov pre a_d, kompetitívne viažu na a_d. Molekuly, ktoré sa viažu na ct_d, môžu byť použité pri purifikácii polypeptidov ct_d a identifikácii typov buniek exprimujúcich a_d. Molekuly, ktoré sa viažu na a_d, môžu byť takisto použité s cieľom modulácie (to znamená inhibície, blokovania alebo stimulácie) väzbových aktivít polypeptidov a_d (in vivo) a/alebo s cieľom modulácie prenosu signálov uskutočňovaných prostredníctvom a_d.

Vynález takisto opisuje stanovenie slúžiace na identifikáciu molekúl viažucich <Xd, vrátane stanovení využívajúcich väzbu imobilizovaného ligandu, stanovení, pri ktorých je väzba sledovaná v roztoku. SPA (scintillation proximity assay - stanovení využívajúcich priblíženie rádioaktívnej značky k fluorofóru a potom monitorovanie svetla cmitovaného flurofórom), stanovení, pri ktorých sú použité dve hybridné molekuly a podobne.

Medzi in vitro stanovenia slúžiace na identifikáciu protilátok alebo iných zlúčenín, ktoré modulujú aktivitu polypeptidu a_d, môže patriť napríklad imobilizácia polypeptidu a_d alebo imobilizácia prirodzeného ligandu, ku ktorému sa ot_d viaže, detegovateľné značenie neimobilizovaného väzbového partnera, spoločná inkubácia väzbových partnerov a stanovenie vplyvu testovanej zlúčeniny na množstvo naviazanej značky, pričom zníženie množstva naviazanej značky za prítomnosti testovanej zlúčeniny (v porovnaní s množstvom značky naviazanej bez prítomnosti testovanej zlúčeniny) naznačuje, že testovaná látka je inhibítorom väzby na a_d.

Iným typom stanovenia použiteľným na identifikáciu zlúčení, ktoré modulujú interakciu medzi a_d a jeho ligandom, je stanovenie, pri ktorom je polypeptid a_d alebo jeho fragment imobilizovaný na povrchu pevného nosiča potiahnutého (alebo napusteného) fluorescenčným agens a ligand je označený zlúčeninou schopnou excitovať uvedené fluorescenčné agens. Pri tomto stanovení dôjde, za prítomnosti alebo neprítomnosti domnelého modulátora, ku kontaktu imobilizovaného polypeptidu a_d so značeným ligandom a potom je detegované svetlo emitované prostredníctvom fluorescenčného agens a sú identifikované zlúčeniny s modulačnými vlastnosťami. Ako zlúčeniny s modulačnými vlastnosťami sú uvažované tie zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú emisiu svetla sprostredkovanú fluorescenčným agens v porovnaní s emisiou svetla sprostredkovanou fluorescenčným agens v neprítomnosti modulačnej zlúčeniny. Inou možnosťou je imobilizácia ligandu pre a_d a označenie polypeptidu ct_d.

Ďalšou metódou patriacou do rozsahu vynálezu a slúžiacou na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú interakciu medzi Od a jeho ligandom, je transformácia alebo transfekcia vhodných hostiteľských buniek nejakým konštruktom DNA nesúcim reportérový gén pod kontrolou promótora, regulovaný transkripčným faktorom skladajúcim sa z domény viažucej DNA a aktivačnej domény, následná expresia (v hostiteľskej bunke) prvej sekvencie DNA kódujúcej prvý fúzny protein obsahujúci časť alebo celý polypeptid a_dspolu s doménou viažucou DNA alebo aktivačnú doménu a expresia druhej hybridnej DNA kódujúcej druhý fúzny protein s obsahom časti alebo celého ligandu pre a_d a spolu s doménou viažucou DNA alebo aktivačnou doménou transkripčného faktora, ktoré nie sú inkorporované v prvom fúznom proteíne. Ďalej je potom vyhodnotený vplyv domnelej modulačnej zlúčeniny na interakciu medzi a_d a jeho ligandom. Tento vplyv je sledovaný detekciou väzby ligandu na a_d v danej hostiteľskej bunke tak, že je v danej hostiteľskej bunke stanovovaná tvorba produktu reportérového génu za prítomnosti alebo neprítomnosti domnelého modulátora, a ako modulačné zlúčeniny sú identifikované tie zlúčeniny, ktoré pozmeňujú tvorbu produktu reportérového génu v porovnaní s tvorbou produktu reportérového génu v neprítomnosti modulačnej zlúčeniny. Pri tomto stanovení sú dnes výhodne používané promótor lexA, doména viažuca DNA so sekvenciou zodpovedajúcou lexA, transaktivačná doména GAL4, reportérový gén lacZ a ako hostiteľské bunky kvasinky.

Pri izolácii polynukleotidu kódujúceho protein, ktorý sa viaže na a_d, môže byť použitá upravená verzia uvedeného stanovenia. Pri tejto modifikovanej verzii sú vhodné hostiteľské bunky transformované alebo transfekované konštruktom DNA nesúcim reportérový gén pod kontrolou promótora regulovaného transkripčným faktorom zloženým z domény viažucej DNA a aktivačnej domény. Nasleduje expresia (v hostiteľskej bunke) prvej sekvencie DNA kódujúcej prvý fúzny protein obsahujúci časť alebo celý polypeptid ct_d spolu s doménou viažucou DNA alebo nejakou aktivačnou doménou uvedeného transkripčného faktora a expresia faktora knižnice druhej hybridnej DNA kódujúcej druhý fúzny protein obsahujúci časť alebo celý polypeptid, pri ktorom existuje predpoklad väzby na a_d a spolu s doménou viažucou DNA alebo aktivačnou doménou transkripčného faktora, ktoré nie sú inkorporované v prvom fúznom proteíne. Ďalej je potom vyhodnotený vplyv domnelej modulačnej zlúčeniny na interakciu medzi a_d a jeho ligandom. Tento vplyv je sledovaný detekciou väzby proteínu viažuceho a_d na a_d v danej hostiteľskej bunke, že je v danej hostiteľskej bunke detegovaná tvorba produktu reportérového génu. Nakoniec je z príslušnej hostiteľskej bunky izolovaná druhá hybridná sekvencia DNA kódujúca protein viažuci a_d.

Vynález sa takisto týka hybridómov produkujúcich protilátky špecificky namierené proti a_d. V súčasnosti sú veľmi dobre známe techniky slúžiace na produkciu hybridómov, ktoré sekretujú monoklonálne protilátky. Bunkové línie hybridómov môžu byť vytvorené imunizáciou nejakého živočícha prostredníctvom purifikovaného a_d, variantov polypeptidu a_d alebo buniek, ktoré na svojom extracelulárnom povrchu exprimujú polypeptid a_d alebo jeho varianty. Medzi imunogénne bunkové typy patria bunky, ktoré exprimujú u_d in vivo, alebo transfekované bunkové línie eukaryotických alebo prokaryotických buniek, ktoré pri normálnych okolnostiach in vivo polypeptid a_d neexprimujú. Vo výhodnej realizácii sú uprednostňované sekretované hybridómami označovanými 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 18L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3, 197A-4, 199A, 199H a 199M.

Hodnota informácií poskytnutých odhalením sekvencií DNA kódujúcich a_d a aminokyselinových sekvencií a_d je zrejmá. Sekvencia cDNA kódujúca Od, uvedená v jednej sérii príkladov umožňuje izoláciu sekvencie genómovej DNA kódujúcej otd, vrátane prvkov riadiacich transkripciu tejto génovej sekvencie. Vynález sa takisto týka možnosti identifikácie alelických variantov DNA kódujúcich a_d a DNA kódujúcej a_d z iných druhov (napríklad myši alebo potkanov). Izolácia ľudskej genómovej DNA kódujúcej a_d a DNA pre a_d z iných druhov, môže byť uskutočnená pomocou štandardných techník hybridizácie DNA/RNA, uskutočňovanej pri vhodných podmienkach, pri použití časti alebo celej sekvencie cDNA pre a_d (táto sekvencia cDNA pre a_d je použitá ako sonda na testovanie („sereening“) vhodnej knižnice). Inou možnosťou použiteľnou na amplifikáciu a identifikáciu sekvencií genómovej DNA kódujú

SK 283135 Β6 cej a_d, je využitie polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR), pri ktorej sú ako priméry použité oligonukleotidy vytvorené na základe známej sekvencie cDNA. Pomocou konvenčných metód syntézy môže byť pripravená syntetická DNA kódujúca polypeptid a_d, vrátane jeho fragmentov a rôznych variantov.

Informácie o sekvencií DNA podľa vynálezu takisto umožňujú vytvoriť, prostredníctvom prístupu využívajúceho rekombinantné techniky alebo stratégie „knockoutovania“ génov [pozri napríklad Kapecchi, Science 244 : 1288 až 1292 (2989)], hlodavce, ktoré nie sú schopné exprimovať funkčný polypeptid a_d, alebo ktoré exprimujú nejaké z variantov polypeptidu a_d. Tieto hlodavce môžu slúžiť ako vhodný model na štúdium aktivít polypeptidu a_d a modulátorov polypeptidu ot_d in vivo.

Sekvencie DNA a aminokyselinové sekvencie podľa vynálezu takisto umožňujú uskutočniť analýzu tých epitopov a_d, ktoré sa aktívne zúčastňujú na väzbe na receptor, a takisto epitopov, ktoré môžu túto väzbu nejakým spôsobom regulovať, skôr ako sa na nej aktívne zúčastňovať. Vynález takisto zahrnuje možnosť identifikácie epitopov, ktoré sa môžu zúčastňovať na prenose signálov cez membránu.

DNA podľa vynálezu je takisto použiteľná na detekciu tých typov buniek, ktoré exprimujú polypeptid a_d. Na stanovenie hladiny konštitutívnej transkripcie a_d v bunkách, ako aj na stanovenie zmien v transkripcii v závislosti od prítomnosti interných alebo externých látok, môžu byť využité štandardné techniky hybridizácie DNA/RNA, ktoré na detekciu RNA kódujúcej polypeptid a_d využívajú DNA pre a_d. Identifikácia látok modifikujúcich transkripciu a/alebo transláciu polypeptidu a_d môže byť zasa využitá na stanovenie potenciálnych terapeutických alebo preventívnych účinkov týchto látok. DNA podľa vynálezu takisto umožňuje hybridizáciu DNA pre a_d a bunkovej RNA in situ, čím je možné určiť lokalizáciu RNA pre a_d v populácii buniek obsahujúcich viac bunkových typov a v tkanivách.

DNA podľa vynálezu môže byť takisto použitá na identifikáciu polynukleotidových sekvencií z iných organizmov ako z človeka, ktoré majú homológiu k sekvenciám ľudského a_d. Znalosť sekvencií DNA pre a_d u iných organizmov ako u ľudí umožňuje vytvorenie živočíšnych modelov (vrátane napríklad transgénnych modelov) k ľudskému systému.

Iná stránka vynálezu sa týka monoklonálnych a polygonálnych protilátok špecificky namierených proti a_d, ktoré môžu byť využité pri imunohistochemických analýzach na lokalizáciu polypeptidu a_d v bunkových kompartmentoch alebo v jednotlivých bunkách tkanív. Tento typ imunohistochemických stanovení je veľmi výhodne používaný v kombinácii s hybridizáciou in situ, pričom sú lokalizované ako mRMA pre a_d, tak aj polypeptidový produkt génu pre a_d.

Identifikácia typov buniek, ktoré exprimujú polypeptid a_d, môže výrazne pomôcť pri vývoji látok s terapeutickým alebo preventívnym účinkom. Predpokladá sa, že produkty podľa vynálezu, ktoré sú príbuzné a_d, môžu byť využité pri liečení chorôb, pri ktorých v procese chorôb hrajú dôležitú úlohu makrofágy. V súčasnosti je opísané množstvo živočíšnych modelov pre patologické stavy spojené s pozmenenou aktivitou makrofágov. Napríklad v publikácii Jutila a ďalší, J. Leukocyte Biol. 54 : 30 až 39 (1993) je u myší opísané hromadenie makrofágov v miestach tak chronických, ako aj akútnych zápalov. U laboratórnych potkanov opisujú Adams a ďalší [Transplantation 53 : 1115 až 1119 (1992) a Transplantation 56 : 794 až 799 (1993)] model pre artériosklerózu štepu vznikajúcu po transplantácii heterotropných abdominálnych srdcových aloŠtepov. Rosenfeld a ďalší [Arteriosclerosis 7 : 9 až 23 (1987) a Arteriosclerosis 7 : 24 až 34 (1987)] opisujú indukciu artériosklerózy u králikov kŕmených diétou s prídavkom cholesterolu. Hanenberg a ďalší [Diabetológia 32 : 126 až 134 (1989)] uvádzajú spontánne rozvinutie inzulíndependentného diabetu u laboratórnych potkanov BB. Yamada a ďalší [Gastroenterology 104 : 759 až 771 (1993)] opisujú u laboratórnych potkanov injikovaných polymérmi peptidoglykánpolysacharid z baktérie Streptococcus výskyt zápalovej choroby čriev a chronickej granulomatóznej kolitídy. Cromartie a ďalší [J. Exp. Med. 146 : 1585 až 1602 (1977)] a Schwab a ďalší [Infection and Immunity 59 : 4436 až 4442 (1991)] uvádzajú, že injekcie proteínov bunkovej steny z baktérie Streptococcus do organizmu laboratórnych potkanov má za následok artritický stav charakterizovaný zápalom periférnych kĺbov a následným poškodením týchto kĺbov. A nakoniec Huitinga a ďalší [Eur. J. Immunol 23 : 709 až 715 (1993)] opisujú u laboratórnych potkanov Lewis výskyt encefalomyelitídy (ložiskový zápal mozgu a miechy), ktorá je modelom pre roztrúsenú sklerózu. Pri každom z týchto modelov sú na zmiernenie priebehu chorôb využívané protilátky proti a_d alebo iné proteíny viažuce polypeptid a_d, alebo rozpustné formy polypeptidu a_d. Cieľom tohto pôsobenia je pravdepodobne zamedziť aktivácii makrofágov.

Vynález sa takisto týka farmaceutických kompozícií použiteľných pri liečení týchto a iných chorôb. Farmaceutické kompozície sú navrhované tak, aby inhibovali interakcie medzi a_d a jeho ligandom(dmi). Medzi tieto farmaceutické kompozície patria najrôznejšie rozpustné formy polypeptidu a_d a formy polypeptidu a_d asociované s membránou (s obsahom celého polypeptidu a_d alebo jeho fragmentov, ktoré sa aktívne zúčastňujú pri väzbe polypeptidu Od), najrôznejšie rozpustné formy proteínov viažucich a_d a formy proteínov viažucich a_d asociované s membránou (vrátane protilátok, ligandov a podobne), intracelulámy a extracelulámy modulátor väzbovej aktivity ct_d a/alebo modulátor expresie polypeptidu a_d a/alebo polypeptidu rí_d-ligand, vrátane modulátorov transkripcie, translácie, posttranslačných úprav a/alebo intracelulámeho transportu.

Vynález sa takisto týka metód slúžiacich na liečenie chorôb, pri ktorých svoju úlohu hrá väzba polypeptidu a_dalebo lokalizovaná akumulácia buniek exprimujúcich polypeptid a_d. V týchto metódach je pacientovi postihnutému uvedenou chorobou podávaná farmaceutická kompozícia podľa vynálezu v množstve dostačujúcom na ovplyvnenie úrovne väzby polypeptidu a_d alebo v množstve dostačujúcom na ovplyvnenie akumulácie buniek exprimujúcich polypeptid a_d. Tieto metódy liečenia podľa vynálezu sú použiteľné pri chorobách, akými sú napríklad, ale nielen, diabetes I. typu, ateroskleróza, roztrúsená skleróza, astma, lupienka, zápal pľúc, syndróm akútnej respiračnej tiesne a reumatická artritída.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Množstvo ďalších aspektov a výhod vynálezu bude zrejmejšie, ak sa zoberie do úvahy nasledujúci opis vynálezu, kde sú uvedené aj nasledujúce obrázky, kde:

Na obrázkoch 1A až 1D sú znázornené aminokyselinové sekvencie ľudských CDllb (SEK. ID. č.: 3), CD11 c (SEK. ID. č.: 4) a a_d (SEK: ID. č.: 2).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi týkajúcimi sa izolácie klonu DNA kódujúcej polypeptid a_d z knižnice cDNA z ľudskej sleziny. Presnejšie povedané, príklad 1 ilustruje použitie protilátky proti psiemu a_TMI pri pokuse detegovať homológny ľudský proteín. Príklad 2 detailnej opisuje purifikáciu psieho polypeptidu a_TMI a sekvenáciu N-koncovej časti tohto polypeptidu, aby bolo možné vytvoriť oligonukleotidové primery použiteľné na amplifikáciu psieho génu pre a_TM1 pomocou PCR. Príklad 3 sa týka purifikácie veľkého množstva polypeptidu a_TM1 z organizmu psa, aby bolo možné určiť vnútorné sekvencie tohto polypeptidu a potom pripraviť ďalšie priméry pre PCR. Príklad 4 opisuje použitie primárov komplementárnych k vnútornej sekvencii génu pre a_TM1 pri amplifikácii fragmentu génu kódujúceho psí a_TM1 pomocou PCR. Príklad 5 sa týka klonovania sekvencie cDNA kódujúcej ľudský a_d. Príklad 6 opisuje analýzu expresie mRNA kódujúcej a_d v ľudských tkanivách a bunkách, uskutočňovanú metódou Northem blot. Príklad 7 detailne opisuje konštrukciu expresívnych plazmidov obsahujúcich sekvenciu kódujúcu ľudský a_d a transfekciu buniek COS týmito plazmidmi. Príklad 8 sa týka analýzy expresie polypeptidu a_d v transfekovaných bunkách COS uskutočňovanej metódou ELISA. Príklad 9 opisuje analýzu buniek COS transfekovaných expresívnymi plazmidmi obsahujúcimi sekvenciu kódujúcu ľudský a_d uskutočňovanú pomocou FACS (Fluorescence Activated Celí Sorter). Príklad 10 sa týka imunoprecipitácie polypeptidu CD 18 asociovaného s a_c v kotransfekovaných bunkách COS.

Príklad 11 opisuje stabilnú transfekciu buniek ovárií čínskeho chrčka (CHO bunky) pomocou expresívneho konštruktu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu a_d. Príklad 12 sa týka väzby polypeptidu a_d (závislej od prítomnosti polypeptidu CD 18) na intercelulárnu adhezívnu molekulu ICAM-R, mutantný proteín ICAM-R a molekulu komplementu iC3b. Príklad 13 opisuje techniku SPA slúžiacu na identifikáciu inhibítorov alebo posilňovačov (to znamená modulátorov) väzbových interakcií ligandov pre a_d/anti-ligand pre a_d. Príklad 14 opisuje konštrukciu expresívnych plazmidov, ktoré kódujú rozpustné farmy polypeptidu a_d a väzbové analýzy produktov expresie. Príklad 15 sa týka produkcie polyklonálnych sér a monoklonálnych protilátok špecificky namierených proti a_d. Príklad 16 opisuje použitie polyklonálneho séra namiereného prot a_d pri analýze tkanivovej distribúcie polypeptidu a_d, expresie a_d na povrchu leukocytov periférneho krvného obehu a expresie polypeptidu ct_d v zápalovej a nezápalovej synovii (klbna mazotvorná blana). Príklad 17 opisuje izoláciu sekvencii cDNA, ktoré majú homológiu k sekvenciám ľudského génu pre a_d, z organizmu laboratórnych potkanov. Príklad 18 sa týka konštrukcie expresívnych plazmidov kódujúcich celý polypeptid a_d, expresívnych plazmidov kódujúcich doménu I polypeptidu a_d, vrátane fúznych proteínov domény i/IgG a produkcie monoklonálnych protilátok proti celému polypeptidu a fúznym proteínom obsahujúcim doménu I. Príklad 19 sa týka izolácie sekvencii cDNA, ktoré majú homológiu k sekvenciám ľudského génu pre a_d, z organizmu myší. Príklad 20 opisuje ďalšiu izoláciu klonov cDNA kódujúcich a_d použitých na potvrdenie výsledkov sekvenčnej analýzy. Príklad 21 sa týka hybridizačných analýz uskutočňovaných in situ v rôznych myšacích tkanivách, ktoré slúžia na stanovenie špecificity a bunkovej expresie predpokladaného myšacieho homológu ľudského a_d. Príklad 22 opisuje konštrukciu expresívnych konštruktov, ktoré kódujú predpokladaný myšací homológ ľudského a_d. Príklad 23 sa týka vytvorenia „knockoutovanej“ myši, pri ktorej je rozrušený gén kódujúci predpokladaný myšací homológ ľudského a_d. Príklad 24 sa týka izolácie sekvencii cDNA, ktoré majú homológiu ku kódujúcim sekvenciám ľudského génu pre a_d, z organizmu králikov. Príklad 25 opisuje živočíšny model choroby človeka, v ktorom sú stanovované možnosti modulácie a_d. Príklad 26 opisuje expresiu polypeptidu a_dpri živočíšnom modeli choroby.

Príklad 1

Pokus detegovať ľudský homológ psieho polypeptidu a_TM1

S cieľom pokúsiť sa identifikovať ľudský homológ psieho polypeptidu a_TM] bola na ľudských leukocytoch periférneho krvného obehu testovaná krížová reaktivita monoklonálnej protilátky Call.8H2 špecificky namierenej proti psiemu a_TM| [Moore a ďalší, pozri skôr]. Bunky (obvykle 1 x 10⁶ buniek) boli na ľade za prítomnosti 0,1 % azidu sodného inkubované s nariedeným supernatantom získaným po kultivácii hybridómov alebo s purifikovanou kontrolnou myšacou protilátkou IgG-negatívnou (10 pg/ml). Väzba monoklonálnej protilátky bola detegovaná následnou inkubáciou konskou protilátkou (s koncentráciou 6 pg/ml) namierenou proti myšacím IgG konjugovanou s FITC (Vector 10 Laboratories, Burlingame, CA). Označené bunky boli vo ľyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom (PBS) fixované pomocou 2 % w/v paraformaldehydu a potom analyzované pri použití prístroja FACS Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Pri obvyklej realizácii bolo s využitím logaritmického zosilnenia intenzity fluorescencie analyzovaných 10 000 buniek.

Získané výsledky naznačujú, že protilátka Call.8H2 nereaguje krížovo s povrchovými proteínmi exprimovanými na povrchu ľudských leukocytov periférneho krvného obehu, zatiaľ čo v podstate všetky kontrolné bunky, ktorými sú neoplastické psie lymfocyty periférneho krvného obehu, polypeptid a_TM| na svojom povrchu exprimovali.

Pretože monoklonálna protilátka Cal 1.8H2 špecificky namierená proti psej podjednotke a nereagovala krížovo s nejakým ľudským homológom tejto podjednotky, bola nevyhnutným predpokladom izolácia príslušného ľudského náprotivku DNA kódujúcej psi a_TM1 (ak však tento ľudský náprotivok existuje) izolácia uvedenej DNA kódujúcej psí ^αΤΜ1·

Príklad 2

Afinitná purifikácia psieho polypeptidu ct_TM1 použitého na sekvenovanie N-koncovej oblasti

S cieľom stanovenia N-koncovej sekvencie bol afinitne purifikovaný psí polypeptid α_ΤΜι a získaná aminokyselinová sekvencia bola použitá pri návrhu oligonukleotidovej sondy alebo priméru. Stručne povedané, monoklonálna protilátka Call.8H2 namierená proti polypeptidu a_TMhbola naviazaná na chromatografický nosič Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) a požadovaný proteín bol izolovaný pomocou špecifickej interakcie protilátka-proteín. Protilátka bola na nosič konjugovaná postupom odporúčaným firmou BioRad a výsledná koncentrácia bola 5 mg protilátka na ml nosiča. Po konjugácii bal prebytok protilátky odstránený a nosič bol zablokovaný pomocou trojnásobného objemu 0,1 M etanolamínu. Nosič bol potom premytý fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátovým pufrom (PBS) s objemom zodpovedajúcim tridsiatim objemom kolóny.

V 250 ml pufra obsahujúceho 0,32 M sacharózu v 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, s inhibítormi proteáz, bolo homogenizovaných 25 gramov sleziny získanej z jedného psa. Bunkové jadrá a celé bunky boli odstránené centrifúgáciou uskutočňovanou pri 1000 x g počas 15 minút. Membrány boli od supematantu oddelené centrifugáciou pri 100 000 x g počas 30 minút. Takto získaná peleta tvorená membránami bola rozsuspendovaná v 200 ml lyzačného pufra (50 mM NaCl, 50 mM soľ kyseliny boritej, pH 8,0, spolu s 2 % NP-40) a počas 1 hodiny inkubovaná na ľade. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 100 000 x g počas 60 minút. Desať mililitrov číreho lyzátu bolo spolu s 0,5 ml nosiča Affigel 10 s konjugovanou protilátkou Cal 1.8H2 (pozri skôr) prenesených do polypropylénovej skúmavky s objemom 15 ml. Táto skúmavka bola pri stálom miešaní inkubovaná cez noc pri 4 °C a nosič bol potom premytý päťdesiatnásobným množstvom D-PBS. Potom bol tento nosič prenesený do mikroccntrifúgačnej skúmavky a počas 10 minút varený za prítomnosti 1 ml Laemliovho vzorkového pufra (neredukujúci) so zložením 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 2 % SDS, 20 % glycerol a 0,002 % brómfenolová meď. Nosič bol potom odstránený centrifugáciou; k supematantu bola pridaná 1/15 objemu β-merkaptoetanolu (Sigma, St. Louis, MO) a vzorka bola podrobená elektroforéze na 7 % polyakrylamidovom géli. Rozdelené proteíny boli prenesené na membránu Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) nasledujúcim spôsobom.

Gély boli raz premyté deionizovanou vodou filtrovanou cez membránu Millipore a potom počas 15 až 30 minút ekvilibrované v transferovom pufri so zložením 10 mM kyselina 3-[cyklohexylamino]-l-propánsulfónová (CAPS), pH 10,5 s 10 % metanolom. Membrány Immobilon boli navlhčené metanolom, premyté filtrovanou vodou a počas 15 až 30 minút ekvilibrované v transferovom pufri CAPS. Začiatočný prenos bol uskutočňovaný pri použití prístroja pre Westem Blot firmy BioRad pri 70 voltoch počas 3 hodín.

Membrány Immobilon boli potom z prístroja vybrané a počas 10 minút zafarbené 0,1 % roztokom Coomasie R250. Potom boli membrány v troch cykloch po desiatich minútach odfarbené zmesou 50 % metanol/10 % kyselina octová. Po odfarbení boli membrány premyté filtrovanou vodou a vysušené na vzduchu.

Boli detegované prúžky proteínov so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 150 kD, 95 kD, 50 kD a 30 kD. Prúžky so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 50 kD a 30 kD vznikli pravdepodobne v dôsledku kontaminácie protilátkou. Ako pre prúžok zodpovedajúceho proteínu s molekulovou hmotnosťou 150 kD, tak aj pre prúžok zodpovedajúci proteínu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 95 kD bol uskutočnený pokus určiť N-koncovú sekvenciu, ale proteín so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 95 kD bol blokovaný, takže túto sekvenciu nebolo možné určiť. Prúžok proteínu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150 kD bol z membrány vystrihnutý a pomocou proteínového sekvenátora Applied Biosystems (Foster City, CA) model 472A priamo sekvenovaný postupom podľa vynálezu. Získaná aminokyselinovú sekvencia je pri použití jednopísmenového aminokyselinového kódu znázornená ako SEK. ID. č.: 5:

FNLDVEEPMVFQ (SEK. ID. č.: 5)

Táto identifikovaná sekvencia obsahuje sekvenciu FLDN charakteristickú pre podjednotky a rodiny integrínov [Tamura a ďalší, J. Celí. Biol. 111 : 1593 až 1604 (1990)].

Vytvorenie primérov a pokus o amplifikáciu sekvencií kódujúcich psí a_TM,

S využitím získanej informácie o N-koncovej sekvencií boli s cieľom hybridizácie navrhnuté tri oligonukleotidové sondy: a) „Tommer“ - úplne degenerovaný oligonukleotid; b) „Patmer“ - čiastočne degenerovaný oligonukleotid; a c) „Guessmer“ - nedegenerovaný aligonukleotid so sekvenciou založenou na kodónoch používaných u cicavcov. Tieto sondy sú znázornené ďalej ako SEK. ID. č.: 6, 7 a 8. Symboly v sekvenciách nukleových kyselín použité vo všetkých nukleotidových sekvenciách vynálezu zodpovedajú § 1, 882 37 C. R. F.

5’-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3'

5'-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3'

5-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3' (SEK. ID. č.: 6) (SEK. ID. č.: 7) (SEK. ID. č.: 8)

Pri použití týchto oligonukleotidov (vytvorených na základe dát získaných sekvenáciou polypeptidu) neboli pri niekoľkých hybridizačných analýzach, pri podmienkach umožňujúcich hybridizáciu nedokonale komplementárnych sekvencií, v knižnici cDNA získanej z psích makrofágov periférneho krvného obehu/slezinných buniek zaklonovanej do lambdaZAP (Stratagene, La Jolla, CA), detegované príslušné klony.

Potom boli na základe odhadnutej sekvencie N-konca polypeptidu vytvorené štyri oligonukleotidové priméry označované 5' Deg, 5' Spec, 3' Deg a 3' Spec (ako sú zobrazené v SEK. ID. č.: 9, 10, 11 a 12, kde Deg označuje degenerovanú sekvenciu a Spec nedegenerovanú sekvenciu). S týmito oligonukleotidovými primármi bol uskutočnený pokus a amplifikáciu (pomocou PCR) sekvencií kódujúcich psí ct_TM1 z DNA fágovej knižnice puriftkovanej z lyzátov knižnice firmy Stratagene opísanej skôr.

5'-TTYAA YYTNGAYGTNGARGARCC-3'

5'-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3' (SEK. ID. ¢.: 9) (SEK. TD. č.: 10)

5'-TGRAANACCATNGGYTC-3' (SEK. ID. č.: 11)

5'-TTGGAAGACCATNGGYTC-3' (SEK. ID. č.: 12)

Oligonukleotidové priméry na amplifikáciu a_TM] boli použité v dvojiciach s primármi komplementárnymi k sekvencii vektora označenými T3 a T7 znázornenými v SEK. ID. č.: 13 (T3) a 14 (T7), ktoré hybridizujú so sekvenciami ohraničujúcimi oblasť polylinkéra fágmidu Bluescript nachádzajúcom sa v lambdaZAP.

5'-ATTAACCCTCAGTAAAG-3' (SEK. ID. i.: 13)

5'-AATACGACTCACTATAG-3' (SEK. ID. ¢.: 14)

Amplifikácia metódou PCR bola uskutočnená v pufri Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) obsahujúcom horečnaté ióny, pri použití 150 ng knižnice DNA, 1 pg jednotlivého priméru, 200 μΜ každého z dNTP a 2,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim). Produkty PCR reakcie boli separované elektroforézou na 1 % agarózovom géli v pufri Tris-acetát-EDTA (TAE) s prídavkom etidium bromidu s koncentráciou 0,25 pg/ml. DNA bola metódou kapilárneho prenosu prenesená na membránu Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Transfer bol uskutočnený cez noc v 10 x SSPE. Po prenesení na membránu bola imobilizovaná DNA denaturovaná pôsobením

0,5 M NaOH s 0,6 M NaCl, neutralizovaná 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0, v 1,5 M NaCl a pred zosieťovaním pomocou UV žiarenia uskutočňovaným na prístroji Stratalinker (Stratagene) premytá 2 x SPE. Pri stálom trepaní bola membrána pri 50 °C inkubovaná počas 2 hodín v prehybridizačnom pufri (5 x SSPE, 4 x Denhardts, 0,8 % SDS, 30 % formamid).

Pri použití pufra na kinázu firmy Boehringer Mannheim so 100 až 300 pCi rP³²-dATP a 1 až 3 jednotiek polynukleotid kinázy boli oligonukleotidové sondy 5'Deg, 5'Spes, 3'Deg a 3'Spec (SEK. ID. č.: 9, 10, 11 a 12) rádioaktívne označené. Značenie prebiehalo í až 3 hodiny pri 37 °C. Nezainkorporovaná rádioaktívna značka bola odstránená chromatagrafiou na kolóne Sephadexu G-25 fme (Pharmacia, Piscataway, NJ) pri použití pufra so zložením 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) a pretečená frakcia bola priamo pridaná k prehybridizačnému roztoku. Hybridizácia s rádioaktívnou sondou prebiehala pri 42 °C počas 16 hodín pri stálom trepaní. Nakoniec boli membrány premývané pri 50 °C počas 15 minút roztokom 1 x SSPE/0,1 % SDS. Membrány boli potom pri -80 °C počas 1 až 4 hodín exponované na film Kodak X-Omat AR.

Oligonukleotid 5' Deg, 5' Spec, 3' Deg a 3' Spec hybridizovali len s produktmi tých PCR reakcií, pri ktorých boli použité ako priméry, a nehybridizovali, ako sa očakávalo s produktmi PCR reakcií, pri ktorých ako priméry použité neboli. Usúdilo sa teda, že žiadny z produktov reakcie PCR nie je špecifický pre a_TMI, pretože ani jeden z produktov nehybiridizoval so všetkými použitými sondami.

Príklad 3

Purifikácia veľkého množstva polypeptidu a_TM1 z organizmu psa uskutočňovaná s cieľom určiť vnútornú sekvenciu polypeptidu

Aby bolo možné získať ďalšiu aminokyselinovú sekvenciu použiteľnú na vytvorenie primárov, bol s cieľom určenia vnútornej sekvencie polypeptidu purifikovaný psí polypeptid α_ΤΜι· Na purifikáciu proteínu použiteľného na určenie vnútornej sekvencie boli použité tri kusy zmrazenej sleziny (každá s hmotnosťou približne 50 g) a zmrazené bunky získané z dvoch slezín dospelých psov. V 200 až 300 ml borátového pufra bolo v miešacom zariadení Waring homogenizovaných 50 g sleziny. Homogenizovaný materiál bol zriedený rovnakým objemom pufra obsahujúcim 4 % NP-40 a zmes bola ľahko trepaná prinajmenšom jednu hodinu. Väčšie kusy boli z lyzátu odstránené centrifugáciou pri 2000 x g počas 20 minút a supematant bol prefiltrovaný buď cez filter Coming (Corning, NY) alebo cez filtračný systém Corning s membránou s veľkosťou pórov 0,8 mikrónov. Lyzát bol potom prečistený filtráciou cez filtračný systém Coming s membránou s veľkosťou pórov 0,4 mikrónov.

Lyzát za sleziny a nosič Affigel 10 s konjugovanou protilátkou (opísaný v príklade 2) boli zmiešané v pomere 150 : 1 v alikvótach s objemom 100 ml a pri stálom trepaní inkubované cez noc pri 4 °C. Lyzát bol potom odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 1000 x g počas 10 minút, zmiešaný s ďalším alikvótom nosiča Affigel 10 s konjugovanou protilátkou a inkubovaný cez noc pri uvedených podmienkach. Alikvóty nosiča s naviazaným proteínom boli potom spojené a premyté 50-násobným objemom pufra D-PBS/0,1 % Tween 20 a nosič bol umiestený na kolónu BioRad s objemom 50 ml. Naviazaný proteín bol z nosiča eluovaný 3 až 5 násobným objemom 0,1 M glycínu (pH 2,5); boli zozbierané frakcie s objemami 900 μΐ a tieto frakcie boli neutralizované pomocou 100 μΐ pufra IM Tris, pH 8,0: Z každej frakcie bol odobraný alikvót s objemom μΐ a tento alikvót bol povarený s rovnakým objemom 2 x Laemmliovho vzorkového pufra s 1/15 objemu IM ditiotreitolu (DTT). Tieto vzorky boli analyzované elektroforézou na 8 % polyakrylamidovom géli Novex (San Diego, CA) a vizualizované farbením Coamasie alebo striebrom pri použití Daiichiovho kitu (Enprotech. Natick. MA), postupom opísaným výrobcom. Frakcie obsahujúce najväčšie množstvo proteínu boli zmiešané a skoncentrované vo vákuu. Zvyšný roztok bol zriedený na polovicu redukujúcim Laemmliovým vzorkovým pufrom a elektroforeticky rozdelený na 7 % polyakrylamidovom géli s hrúbkou 1,5 mm v pufri Tris-glycín/SDS. Po elektroforéze boli proteíny pri použití pristroja pre Westem Blot firmy Hoefer prenesený z gélu na membránu Immobilom postupom opísaným v príklade 2.

Prúžky proteínov s veľkosťou zodpovedajúcou a_TMi boli z 10 membrán PVDF vyrezané; celkový obsah proteínu bol približne 47 pg. Tieto vyrezané prúžky boli odfarbené v 4 ml 50 % metanolu (5 minút), vysušené na vzduchu a rozrezená na kúsky s veľkosťou 1x2 mm. Tieto kúsky membrán boli pri 4 °C na 30 minút ponorené do 2 ml 95 % acetónu, občas vortexované nakoniec vysušené na vzduchu.

Pred vlastným proteolytickým štiepením proteínu naviazaného na membránu boli v 1,5 ml 70 % kyseliny mravčej rozpustené 3 mg brómkyánu (CNBr) (Pierce, Rockford, IL). Tento roztok bol pridaný do skúmavky obsahujúcej kúsky membrány PVDF a skúmavka bola inkubovaná počas 24 hodín pri izbovej teplote v tme. Supematant (SI) bol potom prenesený do inej skúmavky a kúsky membrány boli premyté 0,25 ml 70 % kyseliny mravčej. Tento supematant (S2) bol potom pridaný k supernatantu SI. K spojeným supernatantom (SI a S2) boli pridané 2 ml vody Milli Q a vzniknutý roztok bol lyofilizovaný. Kúsky membrán PVDF boli vysušené pod prúdom dusíka a pri 42 °C počas 17 hodín opäť extrahované 1,25 ml roztoku so zložením 60 % acetonitril, 0,1 % kyselina tetrafluóroctová (TFA). Tento supematant (S3) bol odobraný a kúsky membrán PVDF boli pri 42 °C počas 1 hodiny opäť extrahované 1,0 ml roztoku so zložením 80 % acetonitril, 0,08 % kyselina tetrafluóroctová. Tento supematant (S4) bol zmiešaný s predchádzajúcimi supematantmi (SI, S2 a S3) a zmes supernatantov bola vysušená vo vákuu.

Vysušené fragmenty proteínu získané štiepením pomocou CN-Br boli potom rozpustené v 83 μΐ roztoku so zložením 8M močovina, 0,4 M NH₄HCO₃. Tieto fragmenty boli redukované pridaním 5 μΐ 45 mM ditiotreitolu (DTT) a následnou inkubáciou pri 50 počas 15 minút. Vzniknutý roztok bol potom ochladený na izbovú teplotu a fragmenty boli alkylované pridaním 5 μΐ 100 mM jódacetamidu (Sigma, St. Louis, MO). Po 15-minútovej inkubácii pri izbovej teplote bola vzorka zriedená 187 μΐ vody Milli Q na výslednú koncentráciu močoviny zodpovedajúcu 2,0 M. Potom bol k vzorke pridaný trypsín (Worthington, Freehold, NJ) v pomere enzým : proteín 1 : 25 (w/w) a štiepenie prebiehalo pri 37 počas 24 hodín. Štiepenie bolo skončené prídavkom 30 μΐ TFA. Proteínové fragmenty boli potom separované pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) na prístroji Waters 625 LC (Millipore, Milford, MA) pri použití kolóny Vydac C-18 (5 mikrónov) s rozmermi 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) ekvilibrovanej v roztoku 0,05 % TFA vo vode pre HPLC (pufer A). Peptidy boli eluované zvyšujúcou sa koncentráciou 80 % acetonitrilu v 0,04 % TFA (pufer B) s gradientom 38 % až 75 % pufer B počas 65 až 95 minút a 75 % až 98 % pufer B počas 95 až 105 minút. Peptidy boli delené pri prietoku 0,2 ml/minúta a detegované pri vlnovej dĺžke 210 nm.

Po frakcionizácii bola u peptidov stanovovaná aminokyselinová sekvencia. Stanovenie aminokyselinovej sekvencie bolo uskutočnené automaticky Edmanovým odburávaním na proteínovom sekvenátore Biosystems Model 473A pri použití štandardných cyklov odporúčaných výrobcom. Analýza získaných dát bola uskutočnená softvérovým programom Data Analysis Model 610A, verzia 1.2.1. Všetky sekvenačné reagencie boli dodané firmou Applied Biosystems. Aminokyselinové sekvencie siedmich z celkových ôsmich vnútorných fragmentov sú znázornené ďalej, pričom „X“ označuje aminokyseliny, pri ktorých nie je možné s istotou určiť o akú aminokyselinu vlastne ide.

VFQEXGAGFGQ	(SEK. ID. č.: 15)
LYDXVAATGLXQPI	(SEK. ID. č.: 16)
PLEYXDV1PQAE	(SEK:ID. č.: 17)
FQEGFSXVLX	(SEK. ID. č.: 18)
TSPTFIXMSQNVD	(SEK. ID. č.: 19)
LVVGAPLEWAVXQTGR	(SEK. ID. č.: 20)
LDXKPXDTA	(SEK. ID. C.: 21)

Vytvorenie priméru

Jedna zo získaných aminokyselinových sekvencií (zobrazené ako SEK. ID. č.: 22) bola použitá na vytvorenie úplne degenerovaného oligonukleotidového priméru označeného p4(R) a zobrazeného ako SEK. ID. č.: 23.

FGEQFSE (SEK. ID. č.: 22)

5-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3' (SEK. ID. č.: 23)

Príklad 4

Klonovanie fragmentu psieho u_Tmi metódou PCR

S využitím PCR bola z dvojvláknovej cDNA z psej sleziny amplifikovaná časť na 5' konci génu kódujúceho psí polypeptid a™,.

A. Vytvorenie dvojvláknovej cDNA z psej sleziny

Jeden gram zmrazeného materiálu získaného zo sleziny mladého psa bol v zmesi kvapalného dusíka a suchého ľadu rozdrvený a homogenizovaný v 20 ml pufri RNA-Stat 60 (TelTest B, Inc, Friendswood, TX). Potom boli pridané ml chloroformu a roztok bol oddelený centrifúgáciou uskutočňovanou pri 12 000 x g počas 15 minút. Z vodnej vrstvy bola RNA precipitovaná prídavkom 10 ml etanolu. RNA obsahujúca poly-A sekvenciu bola potom oddelená s využitím nosiča Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Osla, Norsko). Päť alikvótov RNA s celkovou hmotnosťou 100 pg bolo zmiešaných a zriedených rovnakým objemom 2 x väzbového pufra (20 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) . RNA bola potom počas minút inkubovaná nosičom Oligo dT Dynabeads (1,0 ml alebo 5 mg nosiča na všetky vzorky). Pred vlastnou elúciou poly-A mRNA uskutočňovanou roztokom sa zložením 2 mM EDTA, pH 7,5, boli gulôčky nosiča premyté pufrom sa zložením 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA a 0,1 % SDS podľa postupu opísaného výrobcom. Potom bola, postupom podľa výrobcu a pri použití eluovanej mRNA s poly-A sekvenciou a kitu na syntézu cDNA firmy Boehringer Mannheim, syntetizovaná dvojvláknová cDNA.

B. Izolácia cDNA kódujúcej časť psieho polypeptidu a_TM1

Pri štandardnej reakcii PCR uskutočňovanej pri použití 150 ng dvojvláknovej cDNA, 500 ng každého z primérov, 200 μΜ každého dNTP a 1,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim) v pufri Taq (Baehringer Mannheim) s prídavkom horečnatých iónov, boli použité aligonukleotidové priméry 5' Deg (SEK. ID. č.: 9) a p4(R) (SEK. ID. č.: 23). Vzniknuté produkty (1 μΐ pôvodnej reakcie) boli, s cieľom dosiahnuť vyššie výťažky, použité v ďalšej reakcii PCR s rovnakými primármi. Tieto prúžky boli pri 60 °C v pufri so zložením 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl eluované z 1 % agarózového gélu na papier Schleider & Shuell (Keene, NH) NA4S, precipitované a pri použití klonovacieho kitu TA (Invitrogen) zaligované do vektora pCRtmII (Invitrogen, San Diego, CA) (postupom odporúčaným výrobcom). Ligačné zmesi boli elektroporačne transformované baktérie XL-1 Blue (Stratagene). Jeden kloň, označený 2.7, obsahoval sekvencie zodpovedajúce sekvenciám DNA pre polypeptid a_TMi, ktoré neboli využité pri návrhu primérov.

Sekvenácia bola uskutočnená pomocou sekvenátora DNA Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) pri použití sekvenačného kitu využívajúceho na termináciu reakcie deoxynukleotidy s naviazanou značkou (ABI). Pri tejto sekvenácii boli asymetrickou reakciou PCR [McCabe, „Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR“, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a ďalší (eds.), strany 76 až 83, Academic Press: New York (1990)] inkorporované fluorescenčné značené dNTP nasledujúcim postupom. Vzorky boli inkubované počas 4 minút pri 96 °C a potom podrobené 25 cyklom: 96 °C počas 15 sekúnd; 50 °C počas 1 sekundy; 60 °C počas 4 minút. Získané dáta (vrátane chromatografii a textových súborov) boli automaticky načítané do referenčných súborov. Celá sekvencia inzertu v klone 2.7 je znázornená ako SEK. ID. č.: 24.

Pokusy o izoláciu cDNA (z knižnice firmy Stratagene; ako je opísaná v príklade 2), kódujúcej celý psí polypeptid a_TM1, boli neúspešné. Pri použití klonu 2.7 ako sondy, bolo v podmienkach umožňujúcich hybridizáciu sekvencií s nižším stupňom komplementarity (použitie 30 % formamidu) otestovaných približne 1 x 10⁶ fágových plakov, ale neboli identifikované žiadne pozitívne klony. Takisto neúspešné boli pokusy o amplifikáciu príslušných sekvencií nachádzajúcich sa v smere transkripcie od sekvencií reprezentovaných v klone 2.7. Pokusy o amplifikáciu týchto sekvencií nachádzajúcich sa v smere transkripcie od sekvencií reprezentovaných v klone 2.7 boli uskutočňované pri použití špecifických oligonukleotidov odvodených z klonu 2.7 alebo degenerovaných primérov so sekvenciou vychádzajúcou z aminokyselinovej sekvencie iných peptidových fragmentov, a ako druhý primér bol použitý degenerovaný oligonukleotid so sekvenciou vychádzajúcou z konzervatívneho aminokyselinového motívu GFFKR podjednotky α [Tamura a ďalší, pozri skôr].

Príklad 5

Klonovanie predpokladaného ľudského homológa k psiemu ^aTMl

Pri pokuse o izoláciu ľudskej sekvencie homológnej k psej sekvencií kódujúcej a_TM1 bol ako sonda použitý fragment psieho a_TM1 s veľkosťou približne 1 kb z klonu 2.7. Táto sonda bola vytvorená reakciou PCR pri podmienkach opísaných v príklade 2 a pri použití primérov NT2 (pozri SEK. ID. č.: 25) a p4(R) (SEK. ID. č.: 23).

5'-GTNTTYCARGARGAYGG-3' (SEK. ID. č.: 25)

Produkt reakcie PCR bol purifikovaný pri použití kitu Quick Spin firmy Qiagen (Chatsworth, GA) postupom odporúčaným výrobcom. Takto purifikovaná DNA bola pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označená 200 pCi a³²-PdCTP. Nezainkorporovaný izotop bol odstránený chromatografiou na kolóne Sephadexu G25 (fine). Pred vlastným použitím bola sonda denaturovaná pôsobením 0,2 M NaOH a neutralizovaná roztokom 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0.

Na filtračných papieroch Hybond (Amersham) boli pripravené kolónie knižnice cDNA z ľudskej sleziny zaklonované do vektora pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Filtre boli najprv vystavené pôsobeniu denaturačných činidiel a potom ncutralizované postupom opísaným v príklade 2 a potom pri miernom trepaní počas 2 hodín najprv inkubované pri 50 °C v prehybridizačnom roztoku (8 ml/fílter) s 30 % formamidom. K tomuto roztoku bola pridaná rádioaktívne značená sonda (pozri skôr) a spolu s filtrami bol tento roztok inkubovaný pri 42 °C počas 14 hodín. Filtre boli dvakrát premyté roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 37 °C a dvakrát roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 °C. Nakoniec boli filtre premyté dvakrát roztokom 1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 65 °C (1 x SSC má zloženie 150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný, pH 7,0). Počas 6 hodín boli filtre v kazete s kontrastným filtrom exponované na film Rodák X-Omat AR. Kolónie poskytujúce signál boli z duplikátu filtračného papiera natrené na platne s LB médiom obohateným horečnatými iónmi (LBM)/karbenicilín a inkubované cez noc pri 37 °C. Vyrastené kolónie boli prenesené na filtre Hybond a tieto filtre boli spracované opísaným postupom. Tieto filtre boli, pri použití sondy s veľkosťou 1 kb z klonu 2.7, rádioaktívne označené opísaným postupom, hybridizované v podmienkach, pri ktorých je na dosiahnutie pozitívneho signálu nevyhnutná vyššia komplementarita medzi sondou a testovanou DNA než v predchádzajúcom prípade; podmienky hybridizácie boli 50 % roztok formamidu, 50 °C počas 3 hodín. Filtre boli nakoniec premyté dvakrát roztokom 1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 65 °C a počas 2,5 hodiny boli filtre pri -80 °C v kazete s kontraktným filtrom exponované na film Rodák X-Omat AR. Boli identifikované pozitívne kolónie a tieto kolónie boli cez noc kultivované v LBM/karbenicilín. Z jednotlivých kultúr bola pomocou kitu Promega Wizard na minipreparáciu DNA, postupom odporúčaným výrobcom, izolovaná DNA a táto DNA bola potom sekvenovaná.

Prvým screeningom bola ako pozitívnych vybraných 18 klonov, zatiaľ čo výsledkom druhého screeningu uskutočňovaného pri podmienkach, pri ktorých je na dosiahnutie pozitívneho signálu nevyhnutná vyššia komplementarita medzi sondou a testovanou DNA, bola identifikácia jedného pozitívneho klonu označeného 19A2. Sekvencia DNA a odhadnutá aminokyselinová sekvencia klonu 19A2 ľudského aj sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 1 a2.

Charakteristiky cDNA pre ľudský ct_d a predikovaného polypeptidu

Kloň 19A2 obsahuje celú kódujúcu oblasť pre maturovaný protein a navyše ešte 48 báz (16 aminokyselinových zvyškov) signálnej sekvencie nachádzajúcej sa na 5' konci proti smeru transkripcie od kódujúcej oblasti a 241 báz neprekladanej sekvencie na 3' konci, ktorá nie je ukončená polyadenylačnou sekvenciou. Predpokladá sa, že molekulová hmotnosť maturovaného proteínu bude približne 125 kD. Predpokladaná extraceluláma doména zahrnuje približne aminokyselinové zvyšky 17 až 1108 (v SEK. ID.

č.: 2). Na túto extracelulámu oblasť nadväzuje sekvencia asi 20 aminokyselín, ktorá je homológna k transmembránovej oblasti ľudského CD1 lc (aminokyselinové zvyšky 1109 až 1128 v SEK. ID. č.: 2). Cytoplazmatická doména je tvorená približne 30 aminokyselinami (aminokyselinové zvyšky 1129 až 1161 v SEK. ID č.: 2). Protein takisto obsahuje oblasť (približne aminokyselinové zvyšky 150 až 352) tvorenú asi 202 aminokyselinami, ktorá je homológna k doméne I (inzerčnej) spoločnej pre polypeptidy CD 11 a, CDllb a CDllc [Larson a Springer, pozri skôr], polypeptid a_E [Shaw a ďalší, J. Biol. Chem. 269 : 6016 až 6025 (1994)] a proteíny VLA-1 a VLA-2 [Tamura a ďalší, pozri skôr]. Bolo dokázané, že doména I u iných integrínov participuje s ICAM [Landis a ďalší, J. Celí. Biol. 120 : : 1519 až 1527 (1993); Diamond a ďalší, J. Celí. Biol. 120 : 1031 až 1043 (1993)], čo ukazuje, žc polypeptid a_Dmôže takisto viazať zástupcu povrchových molekúl proteínovej rodiny ICAM. Bola dokázané, že táto oblasť neexistuje v žiadnej inej podjednotke integrínov.

Odhadnutá aminokyselinová sekvencia polypeptidu a_Dje z približne 36 % homológna k aminokyselinovej sekvencii polypeptidu CD1 la, z približne 60 % homológna k aminokyselinovej sekvencii polypeptidu CDllb a z približne 66 % homológna k aminokyselinovej sekvencii polypeptidu CDllc. Na obrázku 1 sú zobrazené porovnané aminokyselinové sekvencie polypeptidov CDllb (SEK. ID. č.: 3), CD 11 c (SEK. ID. č.: 4) a a_D (SEK. ID. č.: 2).

Pri organizmoch jedného druhu sa obvykle cytoplazmatické domény podjednotiek a v integrínoch β podstatne líšia, zatiaľ čo jednotlivé typy podjednotiek a majú medzi jednotlivými druhmi vysoký stupeň homológie. V súlade s týmito pozorovaniami sa cytoplazmatická oblasť polypeptidu ct_D, podstatne líši od cytoplazmatických oblastí polypeptidov CDlla, CDllb a CD1 lc, ale s výnimkou aminokyselinovej sekvencie GFFKR (nachádzajúcej sa v tesnej blízkosti membrány), ktorá je konzervovaná medzi všetkými podjednotkami a [Rojiani a ďalší, Biochemistry 30: 9859 až 9866 (1991)]. Pretože oblasť cytoplazmatického konca integrínov sa zúčastňuje na „inside out“ signalizácii a regulácii avidity [Landis a ďalší, pozri skôr], je možné, že polypeptid a_D interaguje s molekulami cytozolu, ktoré sú odlišné od molekúl interagujúcich s CDlla, CDllb a CDllc a výsledkom toho môže byť skutočnosť, že polypeptid a_D sa zúčastňuje na signálnych dráhach odlišných od signálnych dráh, v ktorých participujú iné integríny β₂.

Extraceluláma doména polypeptidu a_D obsahuje, v pozícii vedľa domény I, konzervovanú aminokyselinovú sekvenciu DGSGS; pokiaľ ide o polypeptid CDllb, je sekvencia DGSGS oblasťou viažucou kovy a je nevyhnutná na interakciu s ligandom [Michishita a ďalší, Celí 72 : 857 až 867 (1993)]. V aminokyselinovej sekvencii polypeptidu a_Dklonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1) sú na pozíciách 465 až 474, 518 až 527 a 592 až 600 konzervované ďalšie tri miesta, ktoré sú v polypeptidoch CDllb a CDllc pravdepodobne zodpovedné za väzbu katiónov. Doména I polypeptidu a_Dmá 36 %, 62 % a 57 % homológiu k príslušným oblastiam polypeptidov CD1 la, CD1 lb, resp. CD1 lc. Tento relatívne nízky stupeň sekvenčnej homológie naznačuje, že podjednotka ct_D môže interagovať so skupinou extracelulámych proteínov, ktoré sú odlišné od proteínov; s ktorými reagujú iné známe integríny fl₂. Takisto afinita polypeptidu a_D k známym ligandom integrínov β₂, akými sú napríklad ICAM-1, ICAM-2 a/alebo ICAM-R, môže byť odlišná od afinity demonštrovanej pri interakcii [L/ICAM (pozri príklad 12).

Izolácia ďalších klonov cDNA pre ľudský a_D, použitých na otvorenie sekvencie

Aby bolo možné potvrdiť sekvenciu DNA kódujúcu ľudský a_D, boli z knižnice cDNA z ľudskej sleziny (Invitrogen) zaklonovanej do vektora pcDNA/Amp (opísanej v príklade 5), pomocou hybridizácie, izolované ďalšie molekuly cDNA. Elektroforézou na agarózovom gél i boli vybrané len cDNA s dĺžkou prevyšujúcou 3 kb. Sonda použitá pri hybridizácii bola odvodená od 5' koncovej oblasti a_D(ako je opísané ďalej). Hybridizačné podmienky boli totožné s podmienkami pri izolácii prvého klonu ľudského a_D, len s tou výnimkou, že po hybridizácii boli filtre pri izbovej teplote dvakrát premyté v roztoku 2 x SSC/0,1 % SDS a raz roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 °C. Filtre boli exponované na film Kodak X-Omat AR.

Hybridizačná sonda 5' a_D bola vytvorená pomocou reakcie PCR z klonu 19A2 pri použití primérov CD1 lc 5' For (SEK. ID. č.: 94) a CDllc 5' Rev (SEK. ID. č.: 95). Reakcia bola uskutočňovaná nasledujúcim postupom. Vzorky boli počas 4 minút udržiavané pri 94 °C a potom vystavené, v cykléri Perkin-Elmer 9600, 30 cyklom zmien teploty; i) 94 °C počas 15 sekúnd; ii) 5 °C počas 30 sekúnd; a iii) 72 °C počas 1 minúty.

CD1 lc 5’ For: (5')CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3') (SEK. ID. č.: 94)

CD1 lc 5’ Rev: (5')CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3') (SEK: ID. č.: 95)

Produkt amplifikačnej reakcie bol purifikovaný pri použití kitu Prep-A-Gene firmy BioRad (Hercules, CA) postupom odporúčaným výrobcom. Získaná sonda 5' a_D bola dlhá približné 720 báz, čo zodpovedá oblasti začínajúcej oligonukleotidom 1121 a končiacej oligonukleotidom 1839 v SEK. ID. č.: 1. Purifikovaná DNA (približne 50 ng) bola, postupom odporúčaným výrobcom, pri použití kitu „Rondom Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim (Indianopolis, Indiana) rádioaktívne označená izotopom ³²P-dCTP. Nezainkorporovaný izotop bol odstránený pri použití stĺpcov „Centrisep Spin Columns“ (Princeton Separations, Adelphia, NJ) postupom odporúčaným výrobcom. Rádioaktívne označená sonda bola pridaná k filtrom namočeným v prehybridizačnom roztoku obsahujúcom 45 % formamid a inkubácia prebiehala cez noc pri 50 °C. Po tejto inkubácii boli filtre premyté opísaným postupom.

Trinásť kolónií poskytlo na obidvoch duplikátoch filtrov pozitívny signál. Pozitívne kolónie boli zozbierané zo zásobnej platne, zriedené pomocou LBM s karbenicilínom (100 pg/ml) a v rôznych riedeniach vysiate na filtre Hyband (Amersham). Duplikáty týchto filtrov boli hybridizované v roztoku s rovnakým zložením ako pri prvej hybridizácii a po hybridizácii boli filtre premyté roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 ’C a potom exponované na film.

Pri druhom teste bolo potvrdených desať z pôvodne identifikovaných trinástich pozitívnych kolónií. Dva z týchto desiatich klonov (označené A7.Q a A8.Q) boli sekvenované a bolo stanovené, že kódujú ľudský a_D. Pre kloň A7.Q bolo zistené, že je približne 2,5 kb dlhý, obsahuje vedúcu sekvenciu na 5' konci, časť kódujúcej oblasti a ďalších 60 báz neprekladanej sekvencie na 5' konci. Bolo zistené, že nekompletná kódujúca oblasť je výsledkom nesprávne zastrihnutej oblasti intrónu v mieste zodpovedajúcom oligonukleotidu 2152 v SEK. ID. č.: 1. Pre kloň A8.Q bolo zistené, že je približne 4 kb dlhý, obsahuje celú kódujúcu oblasť pre polypeptíd a_D a takisto obsahuje sekvenciu intrónu v mieste zodpovedajúcom báze šesť v SEK. ID. č.: 1. V porovnaní s pôvodne izolovaným klonom a_D (SEK.

ID. č.: 1) bol pri obidvoch klonoch, tak A7.Q, ako aj AB.Q, pozorovaný jeden rozdiel. Týmto rozdielom bola skutočnosť, že klony A7.Q a AB.Q majú v mieste bázy 1495 vložený kodón tvorený troma bázami CAG. Sekvencie klonov A7.Q a AB.Q sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 96 a 97 a zložené ľudské sekvencie odvodené od klonov A7.Q a AB.Q spolu sa zodpovedajúcimi aminokyselinovými sekvenciami sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 98 a 99.

Príklad 6

Analýza expresie ľudského a_D v tkanivách, uskutočňovaná metódou Northern Blot

S cieľom stanoviť relatívnu hladinu a tkanivovú špecifitu expresie a_D bola pri použití fragmentov z klonu 19A2 ako sondy uskutočnená analýza metódou Northern Blot. Na agarózový gél s formaldehydom a 1 pg etídium bromidu bolo z každej vzorky získanej z niekoľkých ľudských tkanív a kultivovaných bunkových línií nanesených približne 10 pg RNA. Po elektroforéze uskutočňovanej počas 4 hodín pri napätí 100 V bola RNA prenesená na nitrocelulózovú membránu (Schleicher & Schuell) metódou kapilárneho prenosu uskutočňovanou v 10 x SSC cez noc. Membrána bola „zapečená“ vo vákuu pri 80 °C počas 1,5 hodiny. Na blokovanie membrány bol použitý prehybridizačný roztok obsahujúci 50 % formamid v pufri kyseliny 3-(N-morfolino)propánsulfónovej (MOPS). Prehybridizácia prebiehala 3 hodiny pri 42 °C. Fragmenty klonu 19A2 boli, postupom odporúčaným výrobcom, pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim rádioaktívne označené izotopom a³²P-dCTP a a³²P-dTTP. Nezainkorporovaná značka bola odstránená na kolóne Sephadexu G25 v pufri TE. Na hybridizáciu bol použitý hybridizačný pufer s aktivitou 1,5 x 10⁶ c.p.m./ml. Potom bol blot pri izbovej teplote premytý roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS, ďalej potom roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 ’C, roztokom 2 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 ’C, roztokom 1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 ’C, roztokom 0,5 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 ’C, a nakoniec roztokom 0,1 x SSC/0,1 % SDS s teplotou 50 °C. Potom bol blot počas 19 hodín exponovaný na film.

Hybridizácia pri použití fragmentu vyštiepeného z klonu 19A2 reštrikčným enzýmom BstXI (zodpovedajúcim nukleotidom 2011 až 3388 v SEK. ID. č.: 1) poskytla slabo signály u RNA, s veľkosťou približne 5 kb, z pečene, placenty, týmusu a mandlí (tonzíl). Vo vzorkách z obličiek, mozgu a srdca nebol detegovaný žiadny signál. Množstvo RNA prítomné vo vzorke z obličiek bolo minimálne (ako ukázalo farbenie etídium bromidom).

Pri použití druhého fragmentu z klonu 19A2 (zahrnujúceho oblasť báz 500 až 2100 v SEK. ID. č.: 1) boli v ľudských tkanivách, metódou Northern Blot využívajúcou RNA s poly-A Sekvenciou (Clontech), detegované RNA transkripty s dvoma rozdielnymi veľkosťami. V slezine a kostrových svaloch bol detegovaný prúžok s veľkosťou 6,5 kb, zatiaľ čo v pľúcach a leukocytoch periférneho krvného obehu bol detegovaný prúžok s veľkosťou 4,5 kb. Rozdiely v pozorovaných veľkostiach môžu byť spôsobené tkanivovo špecifickou polyadenyláciou, krížovou reaktivitou uvedenej sondy s inými zástupcami rodiny integrínov alebo hybridizáciou sondy s alternatívne zostrihnutými RNA.

Analýza uskutočňovaná metódou Northern Blot a využívajúca tretí fragment z klonu 19A2, zahrnujúci nukleotidy 2000 až 3100 v SEK. ID. č.: 1, poskytla obdobné výsledky ako analýzy využívajúce iné fragmenty klonu 19A2.

Pri použití fragmentov zodpovedajúcich nukleotidom 500 až 2100 a 2000 až 3100 v SEK. ID. č.: 1 bola takisto testovaná RNA získaná z troch línií myeloidných buniek. Bunková línia THP-1, stimulovaná prostredníctvom PMA, poskytla neostrý signál v tej istej oblasti (približne 5,0 kb), ako to bolo pri signáloch z iných tkanív; tento signál bol však trocha silnejší. RNA získaná z nestimulovaných buniek HL-60 a z buniek HL-60 stimulovaných prostredníctvom DMSO, poskytla pri hybridizácii so sondou a_D signál s intenzitou zodpovedajúcou intenzite signálu pre vzorku tkaniva, ale zdalo sa, že vystavenie buniek pôsobeniu PMA zvyšuje intenzitu tohto signálu. Keďže tak PMA, ako aj DMSO, smerujú diferenciáciu buniek HL-60 po dráhe monocyty/makrofágy (PMA), resp. granulocyty (DMSO), naznačuje tento výsledok existenciu zvýšenej expresie polypeptidu a_D pri bunkovom type monocyty/makrofágy. V bunkách U937 je prítomná mRNA pre a_D a stimuláciou prostredníctvom PMA nedochádza k zosilneniu signálu. Žiadna pozitívna odpoveď nebola detegovaná pri bunkách Molt, Daudi, H9, JY alebo Jurkat.

Príklad 7

Prechodná expresia konštruktov kódujúcich ľudský a_DA. Vytvorenie expresných konštruktov

Ľudskému klonu 19A2 chýba iniciačný kodón pre metionín a pravdepodobne tiež časť signálnej sekvencie na 5’ konci. Na vytvorenie expresívneho plazmidu obsahujúceho sekvencie ľudského klonu 19A2 boli teda použité dva odlišné prístupy. Pri prvom prístupe boli skonštruované dva plazmidy, v ktorých boli na vytvorenie chimerickej sekvencie kódujúcej použité sekvencie kódujúce signálny peptid odvodené od génov kódujúcich polypeptidy CDllb alebo CD1 lc, ktoré boli pripojené k sekvencii pre a_D. Pri druhom prístupe bol skonštruovaný tretí plazmid, v ktorom bol na pozícii 0 v klonc 19A2 pridaný adenozín a tým bol vytvorený kodón pre iniciačný metionín.

Uvedené tri plazmidy obsahovali rôzne oblasti, ktoré sa líšia na 5' konci sekvencie kódujúcej polypeptid a_D alebo chimérický polypeptid a_D. Oblasť kódujúca a_D bola pomocou PCR (pozri podmienky v príklade 2) amplifikovaná pri použití špecifického priméru BamRev vymedzujúceho 3' koniec kódujúceho vlákna (ďalej len 3' primér alebo reverzný primér) (pozri SEK. ID. č.: 26) a jedného z troch primárov vymedzujúcich k 5' koniec kódujúceho vlákna (ďalej len 5' primér alebo priamy primér). Uvedené tri 5' priméry v sekvencii obsahovali: (1) na pozíciách + až 6 identické nešpecifické bázy umožňujúce reštrikčné štiepenie, na pozíciách 7 až 12 reštrikčné miesto EcoRI a na pozíciách 13 až 18 konvenčnú Kozákovu sekvenciu; (2) časť signálnej sekvencie odvodenej od CDllb (primér ER1B) alebo CDllc (primér ER1C) alebo adenozín (primér ER1D); a (3) ďalších 15 až 17 báz komplementárnych k sekvenciám na 5' konci klonu 19A2, aby bolo umožnené „nasadnutie“ priméru na DNA. Priméry ER1B, ER1C alebo ER1D sú zobrazené v SEK. ID. č.: 27, 28 alebo 29, kde je iniciačný kodón pre metionín vyznačený hrubo a reštrikčné miesto EcoRI je podčiarknuté.

5'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3' 5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3’

5'AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTC TG-3' (SEK. ID. i.: 28)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (SEK. ID. č.: 29) (SEK. ID. ¢::26) (SEK ID. č,: 27)

Produkty získané reakciou PCR boli rozštiepené reštrikčnými enzýmami EcoRI a BamHI.

Všetky tri plazmidy obsahovali totožnú druhú časť kódujúcu a_D (bola vložená v smere transkripcie hneď za 5' oblasť opísanú v predchádzajúcom odseku), vrátane 3' konca klonu a_D. Táto druhá časť kódujúca a_D, ktorá zasahuje od nukleotidu 625 až do reštrikčného miesta Xbal nachádzajúceho sa na 3' konci polylinkéra vektora klonu 19A2, bola izolovaná štiepením klonu 19A2 reštrikčnými enzýmami BamHI/Xbal.

Boli pripravené tri ligačné reakcie, pri ktorých bol fragment 3' a_D rozštiepený enzýmami BamHI/Xbal zaligovaný, pri použití pufra pre ligázu a ligázy T4 (1 jednotka na 20 reakcií) firmy Boehringer Mannheim, do jedného z troch klonov 5' a_D rozštiepených reštrikčnými enzýmami EcoRI/BamHI. Po štvorhodinovej inkubácii pri 14 °C bolo ku každej ligačnej reakcii, spolu s jednou jednotkou ligázy, pridané zodpovedajúce množstvo vektora pcDNA.3 (Invitrogen) rozštiepeného reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xbal. Reakcie prebiehali ďalších 14 hodín. Jednou desatinou reakčnej zmesi boli potom transformované kompetentné bunky XL-1 Blue. Vyrastené kolónie boli ďalej kultivované a bola z nich izolovaná DNA (pozri príklad 5). Štiepením pomocou EcoRI boli identifikované tri klony, ktoré obsahovali reštrikčné miesto EcaRI a teda aj umelo vytvorené signálne sekvencie. Tieto klony boli označené pATM.Bl (CDllb/a_D, primér ER1B), pATM.ClO (CDUc/a_D, primér ER1C) a pATM.D12 (adenozín/a_D, primér ERld). Prítomnosť zodpovedajúcich signálnych sekvencii bola pri každom klone potvrdená sekvenovaním príslušnej nukleovej kyseliny.

B. Transfekcia buniek COS

Expresia z plazmidov kódujúcich a_D (uvedených skôr) bola dosiahnutá kotransfekciou buniek COS vždy jedným z týchto plazmidov, spolu s expresívnym plazmidom pre CD18, označeným pCR.CD18. Ako pozitívne kontroly boli použité bunky COS kotransfekované plazmidom pCR.CD18 a expresívnym plazmidom pre CDlla, označeným pDC.CDl la.

hodín pred vlastnou transfekciou boli pri 50 % konfluencii bunky v kultivačnom médiu (DMEM/10 % FBS/penicilín-streptomycín) prepasážované do Petriho misiek na tkanivové kultúry firmy Corning s priemerom 10 cm. Pri všetkých pasážovaniach boli bunky z kultivačných misiek odstránené pomocou Versenovho pufra (0,5 mM NaEDTA v PBS). Pred vlastnou transfekciou boli misky raz premyté médiom DMEM bez prídavku séra. Do každej misky bolo pridaných 15 pg jednotlivého plazmidu v 5 ml transfekčného pufra (DMEM s 20 pg/ml DEAE-Dextranu a 0,5 mM chlorochínom). Po 1,5-hodinovcj inkubácii pri 37 °C boli bunky vystavené šoku pridaním 5 ml DMEM/10 % DMSO. Tento roztok DMSO bol potom nahradený kultivačným médiom s objemom 10 ml/miska.

Vzniknuté transfektanty boli analyzované metódami ELISA, FACS a imunoprecipitáciou, ako je opísané v príkladoch 8, 9 a 10.

Príklad 8

Analýza transfekovaných buniek COS metódou ELISA

S cieľom zistiť, či bunky COS transfekované expresívnym plazmidom pCR.CDlS a plazmidom a_D exprimovali na svojom povrchu polypeptid a_D asociovaný s polypeptidom CD 18, bola pri použití primárnych protilátok proti CD18 (napríklad TS1/18 purifikovaná z ATCC HB203) uskutočnená analýza metódou ELISA. Ako pozitívna kon

SK 283135 Β6 trola boli použité bunky kotransfekované expresívnym plazmidom pre CD 18 a expresívnym plazmidom pre CDI la, označeným PDC.CD1 la. Pri tejto kontrole boli ako primárne protilátky použité protilátky proti CD 18 a protilátky proti CDI la (napríklad TS 1/22 puriíikované z ATCC HB202).

S cieľom uskutočniť analýzu metódou ELISA boli bunky z každej misky odstránené pomocou Versenovho pufra a prenesené na jednu 96-jamkovú doštičku na kultiváciu tkanivových kultúr firmy Coming. Bunky boli pred vlastnou analýzou ponechané v kultivačnom médiu počas 2 dní. Potom boli doštičky dvakrát premyté roztokom D-PBS/0,5 % želatína z kože rýb (nadradu kostnaté) (Sigma) v objeme 150 μΐ/jamka. Tento pufer bol používaný pri všetkých krokoch okrem farbenia. Všetky premývania a inkubácie boli uskutočňované pri izbovej teplote. Potom boli jamky počas jednej hodiny blokované roztokom želatíny. Primáme protilátky boli roztokom želatíny zriedené na koncentráciu 10 p g/ml a do každej jamky bolo pridaných 50 μΐ tohto roztoku. Po jednohodinovej inkubácii boli doštičky 3 x premyté roztokom želatíny v objeme 150 μΐ/jamka. V zriedení 1 : 3500 bola pridaná sekundárna protilátka (kozia protilátka namierená proti myšacej Ig/HRP-Fc [Jackson, West Grove, PA] v objeme 50 μΐ/jamka a doštičky boli inkubované počas 1 hodiny. Po troch premytiach boli doštičky, pred pridaním 15 % kyseliny sírovej v objeme 50 μΐ/jamka, počas 20 minút farbené v roztoku o-fenyldiamínu (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD v citrátovom pufri).

Analýza transfekovaných buniek, uskutočňovaná metódou ELISA pri použití protilátok špecificky namierených proti CD 18, neodhalila pri bunkách transfekovaných len plazmidom kódujúcim CD 18 žiadnu výrazne vyššiu hladinu expresie, než aké bolo pozadie. Bunky kotransfekované plazmidmi kódujúcimi CDI la a CD18 mali pri analýzach, pri ktorých boli použité protilátky špecificky namierené proti CD 18 alebo protilátky špecificky namierené proti CDI la, vyššie hladiny expresie, než aké bolo pozadie. Ďalšie analýzy buniek transfekovaných plazmidom kódujúcim CD 18 a jedným z expresných konštruktov kódujúcich a_D, (pATM. C10 alebo pATM.D12) odhalili, že expresia CD18 na povrchu buniek je zvýšená súbežnou expresiou polypeptidu a_D. Zvýšenie expresie polypeptidu CD 18, detegované pri bunkách transfekovaných plazmidmi pATM.ClO alebo pATM.D12, bolo porovnateľné so zvýšením pozorovaným pri kontrolných bunkách kotransfekovaných plazmidmi kódujúcimi CDI la/CD18.

Príklad 9

Analýza transfekovaných buniek COS uskutočňovaná s využitím FACS

Bunkám v Petriho miskách bolo jeden deň pred transfekciou vymenené kultivačné médium za čerstvé a pred vlastnou analýzou uskutočňovanou s využitím FACS boli bunky inkubované počas 2 dní. Transfekované bunky boli pomocou 3 ml Versenovho pufra odstránené z misiek, raz premyté 5 ml pufra pre FACS (DMEM/2 % FBS/0,2 % azid sodný) a zriedené 0,1 ml pufra pre FACS na koncentráciu 500 000 buniek/vzorka. Ku každej vzorke bolo pridaných 10 μΐ protilátok špecificky namierených proti CD 18, CDIla a CDllb s koncentráciou lmg/ml konjugovaných s FITC (Becton Dickinson) alebo 10 μΐ myšacej protilátky 23F2G (proti CD18) (ATCC HB11081) s koncentráciou 800 pg/ml konjugovanej s CFSE. Potom boli vzorky inkubované 45 minút na ľade, 3 x premyté pufrom pre FACS s objemom 5 ml/premytie a rozsuspendované v 0,2 ml pufri pre FACS. Vzorky boli merané na prístroji FACScan firmy

Becton Dickinson a získané dáta boli analyzované pri použití programu Lysys II (Becton Dickinson).

Bunky COS, transfekované len plazmidom kódujúcim CD 18, neboli značené protilátkami (s konjugovaným markérom) namierenými proti CD18, CDI la alebo CDI lb. Ak boli bunky kotransfekované sekvenciami kódujúcimi CDlla/CD18, bolo protilátkami namierenými proti CDIla alebo CD18 označených približne 15 % buniek. Žiadna z buniek transfekovaných plazmidom kódujúcim CD 18 spolu s akýmkoľvek konštruktom kódujúcim a_D nebola značená protilátkou namierenou proti polypeptidom CDI la a CDI lb. 4 %, 13 % a 8 % buniek zo skupín transfekovaných plazmidmi pATM.Bl, pATM.ClO a resp. pATM.D12 reagovalo tu pozitívne na farbenie protilátkou proti CDI8. Intenzita fluorescencie pozitívnych populácií zo skupiny CDI la/CD18 bola štvornásobne vyššia než pozadie. Na porovnanie, kotransfekcia buniek konštruktom kódujúcim a_Da konštruktom pre CD 18 viedla k vytvoreniu pozitívnej populácie buniek, ktorá vykazovala štvor- až sedemnásobné zvýšenie intenzity fluorescencie oproti hodnotám pozadia.

Príklad 10

Imunoprecipitácia komplexov ľudský a[>/CD18 z kotransfekovaných buniek COS značených biotínom

S cieľom zistiť, či môže byť polypeptid a_D izolovaný ako časť heterodimémeho komplexu αβ s charakteristikou integrínov, bol pri bunkách kotransfekovaných expresívnym plazmidom kódujúcim CD 18 a každým z expresívnych plazmidov kódujúcich polypeptid a_D (opísaných v príklade 7), uskutočnený pokus o imunoprecipitáciu UD/CD18.

Transfekované bunky (1 až 3 x 10⁸ buniek/skupina) boli z Petriho misiek odstránené pomocou Versenovho pufra a trikrát premyté roztokom D-PBS v objeme 50 ml/skupina. Každá vzorka bola označená pomocou 2 mg Sulpho-NHS Biotín (Pierce, Rockford, IL). Značenie prebiehalo 15 minút pri izbovej teplote a bolo ukončené premytím (trikrát) chladným roztokom D-PBS v objeme 50 ml/vzorka. Premyté bunky boli rozsuspendované v 1 ml lyzačnéha pufra (1 % NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM C⁺⁺, 2 mM Mg⁺⁺ a inhibítory proteáz) a inkubované počas 15 minút na ľade. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 10 000 x g počas 5 minút a supematant bol prenesený do prázdnych skúmaviek. Aby bol odstránený materiál nešpecifický reagujúci s myšacím imunoglobulinom, bolo na začiatku uskutočnené predčistenie vzorky. Pri 4 °C bolo sa supernatantmi inkubovaných 25 pg myšacieho imunoglobulinu (Cappel, West Chester, PA). Po 2,5 hodinách bolo ku každej vzorke pridaných 100 μΐ (25 pg) Sepharózy konjugovanej s králičou protilátkou namierenou proti myšacím Ig (pripravené z Proteínu A-Sepharózy 4B a králičej protilátky namierenej proti myšaciemu IgG, obidva od firmy Zymed, San Francisco, CA); inkubácia prebiehala pri stálom trepaní pri 4 °C počas 16 hodín. Častice Sepharózy boli od supernatantu odstránené centrifugáciou. Po tomto predčistení boli supematanty pri 4 °C počas 2 hodín inkubované s 20 pg protilátky namierenej proti CD 18 (TS1.18). Od supematantov boli komplexy protilátka/antigén izolované inkubáciou s prípravkom králičej protilátky proti myšacím Ig/Proteín A-Sepharóza s objemom 100 pl/vzorka, opísaným postupom. Častice nosiča boli štyrikrát premyté roztokom 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl a 1 Triton-X 100. Premyté častice boli scentrifugované a počas 10 minút varené v 20 pl 2 x Laemmliovho vzorkového pufra s 2 % B-merkaptoetanolom. Vzorky boli scentrifugované a rozdelené elektroforézou na polyakrylamidovom géli Novex (Novex) uskutočňovanou počas 30 minút pri napätí 100 V. Proteíny boli potom v pufri TBS-T prenesené na nitrocelulózové membrány (Schleicher & Schuell); 100 mA počas 1 hodiny. Membrány boli 2 hodiny blokované pomocou 3 % BSA v TBS-T. Počas 1 hodiny boli membrány inkubované s chrenovou peroxidázou so strepavidínom (POD) (Boehringcr Mannheim) v zriedení 1 : 6 000 a potom trikrát premyté v TBS-T. Na ofarbenie blotu bol použitý (postupom opísaným výrobcom) „Enhanced Chemiluminescence kit“ firmy Amersham. Membrány boli na 0,5 až 2 minúty exponované na Hyperfilm MP (Amersham).

Imunoprecipitácia komplexov CD 18 z buniek transfekovaných plazmidom pRC-CD18 spolu s jedným z plazmidov pATM.Bl, pATM.ClO alebo pATM.D12 odhalila povrchovú expresiu heterodimérov zložených z reťazca β s molekulovou hmotnosťou približne 100 kD, ktorá zodpovedá predpokladanej veľkosti CD 18 a reťazca a s molekulovou hmotnosťou približne 150 kD, ktorá zodpovedá molekulovej hmotnosti polypeptidu a_D,

Príklad 11

Stabilná transfekcia ľudského a_D do buniek ovárií čínskeho chrčka

S cieľom zistiť, či je polypeptid a_D exprimovaný na povrchu buniek vo forme heterodiméru spolu s CD 18, boli bunkové línie, ktorým chýba tak a_D, ako aj CD18, prechodne a stabilne tmasfekované molekulami cDNA kódujúcimi tieto jednotlivé reťazce.

Pre tieto experimenty bola, spôsobom opísaným v príklade 7, k cDNA kódujúcej a_D, pridaná ďalšia vedúca sekvencia a Kozákova konvenčná sekvencia a celý tento konštrukt bol zaklonovaný do expresívneho vektora pcDNA3. Výsledným konštruktom, označeným pATM.D12, spoločne s modifikovaným komerčne dostupným vektorom pDCl.CD18 kódujúcim ľudský CD18, boli kotransfekované bunky ovárií čínskeho chrčka (CHO) deficientné v aktivite dihydrofolát reduktázy (DHFR)’. Plazmid pDCl.CDlS kóduje markér DHFR⁺ a transfekované bunky môžu byť selektované pri použití vhodného média neobsahujúceho príslušný nukleozid. Na vytvorenie plazmidu pDCl.CD18 boli použité nasledujúce modifikácie.

Plazmid pRC/CMV (Invitrogen) je cicavčí expresívny vektor s promótorom cytomegalovírusu a ako selekčný markér obsahuje gén na rezistenciu proti ampicilínu. Gén kódujúci DHFR z plazmidu PSC1190-DHFR bol vložený na 5' koniec začiatku replikácie SV40 vo vektore pRC/CMV. Navyše bol do plazmidového konštruktu pRC/CMV/DHFR zaligovaný, na 3' koniec génu pre DHFR, polylinkér z 5' oblasti plazmidu pHF2G-DHF. Potom boli do vzniknutého plazmidu zaklonované, medzi oblasť polylinkéra na 5' konci a oblasť poly-A sekvencie bovinného rastového hormónu, kódujúce sekvencie pre CD 18.

Povrchová expresia polypeptidu CD 18 bola analyzovaná prietokovou cytometriou pri použití monoklonálnej protilátky TS1/18. Tvorba heterodimérov medzi a_D a CD 18 pri tejto bunkovej línii bola v súlade s údajmi získanými imunoprecipitáciou opísanou v príklade 10 pri prechodnej expresii buniek COS.

Príklad 12

Ľudský a_D sa viaže na molekulu ICAM-R a táto väzba je závislá od prítomnosti CD 18

Vzhľadom na publikované údaje, ktoré dokazujú interakcie medzi integrínmi leukocytov a medzibunkovými adhezívnymi molekulami (ICAM), ktoré sprostredkúvajú kontakt bunka-bunka [Hynes, Celí 69 : 11 až 25 (1992)], bola schopnosť buniek CHO exprimujúcich ao/CD18 via zať ICAM-1, ICAM-R alebo VCAM analyzovaná dvoma metódami.

V opakovaných stanoveniach boli rozpustné fúzne proteíny ICAM-1, ICAM-R alebo VCAM s IgGl imobilizované na povrchu plastu a bola stanovovaná schopnosť buniek COS transfekovaných plazmidmi kódujúcimi (VCD18 viazať sa k týmto imobilizovaným ligandom. Transfekované bunky boli intraceluláme označené pomocou kalceínu, premyté väzbovým pufrom (RPMI s 1 % BSA) a inkubované buď v samotnom pufri (s alebo bez prítomnosti 10 ng/ml PMA) alebo v pufri s monoklonálnymi protilátkami namierenými proti CD18 v koncentráciách 10 pg/ml. Transfekované bunky boli umiestené do štyroch 96-jamkových mikrotitračných doštičiek Immulon s jamkami dopredu potiahnutými rozpustnými fúznymi proteínmi ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl alebo VCAM-1/IgGl alebo hovädzím sérovým albumínom (BSA) ako negatívnou kontrolou. Rozpustné formy týchto adhezívnych molekúl sú dokonale opísané v doteraz nevybavenej patentovej prihláške US č. 08/102852 (s rovnakým vlastníkom) podanej 5. augusta 1993. Pred pridaním značených buniek boli jamky blokované roztokom 1 % BSA v PBS. Po premytí doštičiek, uskutočňovaným ponorením doštičiek na 20 minút do roztoku 0,1 % BSA v PBS, bola pri použití pristroja Cytoíluor 2300 (Millipore, Milford, MA) meraná celková fluorescencia v každej jamke.

V experimentoch s imobilizovanými molekulami ICAM mali bunky kotransfekované plazmidmi kódujúcimi ao/CD18 v jamkách s ICAM-R/IgGl, v porovnaní s jamkami potiahnutými BSA, 3- až 5-násobne vyššiu intenzitu väzby. Špecifita tejto väzby a jej závislosť od prítomnosti CD 18 bola dokázaná inhibičnými účinkami protilátky TS1/18 namierenej proti CD18. Bunky transfekované plazmidmi kódujúcimi CDlla/CD18 mali 2- až 3-násobne vyššiu intenzitu väzby v jamkách s ICAM-1/IgGl, len keď boli tieto bunky dopredu vystavené pôsobeniu PMA. Pôsobenie PMA na bunky transfekované Ql/CDU nemala na intenzitu fluorescencie v jamkách potiahnutých ICAM-1/IgGl alebo ICAM-R/IgGl žiadny vplyv. Nebola detegovaná žiadna väzba buniek transfekovaných a^/CDIS na jamky potiahnuté VCAM-1/IgGl.

Väzba buniek, transfekovaných a_r)/CD18, k rozpustným fúznym proteínom ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl alebo VCAM-1/lgGl bola stanovovaná prietokovou cytometriou. Na každé meranie bol v 100 pl väzbového pufra (RPMI a 1 % BSA), s protilátkou alebo bez prítomnosti protilátky namierenej proti CD 18 v koncentrácii 10 pg/ml, rozsuspendovaný približne 1 milión buniek CHO transfekovaných at>/CD18 (kultivovaných s cieľom vyššej expresie vo fľašiach s miešadlom - „Spinner flask“). Po 20minútovej inkubácii pri izbovej teplote boli bunky premyté väzbovým pufrom a boli k nim pridané fúzne proteíny ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl na výslednú koncentráciu 5 pg/ml. Nadväzovanie prebiehalo 30 minút pri 37 °C a potom boli bunky trikrát premyté a rozsuspendované v 100 pl väzbového pufra obsahujúceho v zriedení 1 : 100 ovčiu protilátku namierenú proti ľudskému IgGl konjugovanú s FITC. Po 30-minútovej inkubácii boli vzorky trikrát premyté a rozsuspendované v 200 pl väzbového pufra a analyzované na prístroji FACScan firmy Becton Dickinson.

Približne 40 až 50 % buniek transfekovaných Uq/CDIS viazalo ICAM-R/IgGl, ale nebola pozorovaná žiadna väzba na proteíny ICAM-1/IgGl a VCAM-1/IgGl. Vystavenie transfekovaných buniek predbežnému pôsobeniu PMA nemalo žiadny vplyv na väzbu «q/CDIS k proteínom ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl alebo VCAM-1/IgGl, čo zodpovedá stanoveniam uskutočňovaným s imobilizova nými proteínmi. Pri vystavení buniek transfekovaných cto/CDie pôsobeniu protilátky TSI/18 namierenej proti CD 18, bola intenzita väzby k ICAM-R/IgGl znížená na hodnoty pozadia.

Dáta získané z obidvoch týchto stanovení ilustrujú skutočnosť, že απ/CD 18 sa prednostne viaž k molekule ICAM-R (v porovnaní s väzbou k ICAM-1 alebo VCAM-1). Uprednostňovanie väzby an/CD18 k ICAM-R oproti väzbe k ICAM-1 je v protiklade k skutočnostiam zisteným pre CDlla/CD18 a CDllb/CD18. Môžeme teda očakávať, že modulácia väzby απ/CD 18 môže selektívne ovplyvniť normálne a patologické funkcie imunitného systému, v ktorých hrá molekula ICAM-R prominentnú úlohu. Navyše výsledky podobných stanovení, pri ktorých bola testovaná schopnosť protilátok, špecificky namierených proti rôznym extracelulámym doménam proteínu ICAM-R, inhibovať väzbu na bunky transfekované απ/CD 18, naznačujú, že heterodiméry ap/CD18 a CD1 la/CD18 interagujú s odlišnými doménami polypeptidu ICAM-R.

Nemožnosť detegovať v roztoku väzbu CD1 la/CD18 k fúznym proteínom ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl naznačuje, že afinita väzby medzi heterodimérom CDlla/CD18 a ICAM-1 alebo ICAM-R je príliš nízka na to, aby umožnila väzbu týchto molekúl v roztoku. Detekcia väzby heterodiméru an/CD18 k fúznemu proteínu ICAM-R/IgGl však naznačuje neobvykle vysokú hodnotu afinity.

Na testovanie väzby mutantu proteínu ICAM-R, označeného E37A/Ig, na bunky CHO exprimujúce heteradimcr ao/CD18 bola adhézia analyzovaná s využitím FACS, opísaným postupom. Bolo dokázané, že E37A/Ig sa neviaže k chimerickému proteínu LFA-l/Ig [Sadhu a ďalší, Celí Adhesion a Communication 2 : 429 až 440 (1994)]. Tento mutantný proteín bol vo svojej rozpustnej forme produkovaný stabilne transfekovanou bunkovou líniou CHO a bol purifikovaný na kolóne ProsepA postupom opísaným v publikácii Sadhu a ďalší, pozri skôr.

V opakovaných pokusoch nebola detegovaná väzba proteínu E37A/Ig na bunky transfekované an/CD18. Intenzita fluorescencie v hlavnom piku (MFI - mean fluorescence intensity) chimerického proteínu E37A/Ig, detegovaná s využitím protilátky namierenej proti ľudskému IgGl konjugovanej s FITC, bola totožná s MFI nameranou pre samotnú protilátku, čo naznačuje, že pri použití mutantného proteínu E37A/Ig nie je v tomto experimente detegovaný žiadny signál prevyšujúci hodnoty pozadia. Podobne pri analýze uskutočňovanej metódou ELISA, postupom opísaným v príklade 14, sa mutantný E37A/Ig najskôr neviazal na imobilizovaný απ/CD 18.

Väzba polypeptidu a_D, k proteínu iCb3

Komponent komplemcntu označovaný C3 môže byť proteolyticky štiepený, čím dôjde k vytvoreniu komplexu iC3b, ktorý iniciuje aktiváciu alternatívnej cesty aktivácie komplementu, ktorej výsledkom je bunkovo sprostredkované zničenie cieľa. Ako CD 11 b, tak aj CD 11 c, sa môžu zúčastňovať na väzbe k iCb3 a následnej fragmatóze častíc obalených komplexom ÍCb3. Ako miesto interakcie s komplexom iCb3 bol nedávno identifikovaný peptidový fragment domény I v polypeptide CD1 lb [Ueda a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91 : 10680 až 10684 (1994)]. Oblasť zodpovedná za väzbu iCb3 je v polypeptidoch CDllb, CD11 c a a_D veľmi konzervatívna, čo naznačuje existenciu väzbovej interakcie ao/iCb3.

Väzba polypeptidu a_D k iCb3 bola analyzovaná „ružicovým testom“ [Dana a ďalší, J. Clin. Invest. 73 : 153 až 159 (1984)] pri použití transfekovaných buniek alebo bun kových línií prirodzene exprimujúcich polypeptid a_D (na^: príklad bunky HL60 stimulované pomocou PMA). Za prítomnosti alebo neprítomnosti monoklonálnej protilátky namierenej proti CD18 (napríklad protilátky TS1/18.1) bola porovnávaná schopnosť buniek CHO transfekovaných ct[/CD18, buniek CHO transfekovaných VLA-4 (negatívna kontrola) a buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PMA (pozitívna kontrola), vytvárať „ružice“.

Príklad 13

Testovanie uskutočňované technikami SPA

Inhibítory špecificky inhibujúce väzbu medzi ligandmi a_D podľa vynálezu a ich väzbovými partnermi (páru ligand ao/„anti-lingand“) môžu byť analyzované najrôznejšími spôsobmi, napríklad technikami SPA opísanými v patentovej prihláške US č. 4271139, publikáciách Hart a Greenwald, Mol. Immunol. 12 : 265 až 267 (1979) a Hart a Greenwald, J. Nuc. Med. 20 : 1062 až 1065 (1979).

Stručne povedané, jeden člen z dvojice ligand an/„antiligand“ jc priamo alebo nepriamo naviazaný na pevný nosič. Nepriama väzba môže byť sprostredkovaná monoklonálnou protilátkou priamo naviazanou na pevnú podložku, pričom táto protilátka rozpoznáva špecifický epitop na C-konci rozpustného reťazca integrinu. Týmto epitopom by mohol byť buď hemaglutinín alebo mykobakteriálny epitop IIIE9 [Anderson a ďalší, J. Immuno. 141 : 607 až 613 (1988)]. Na nosič je priamo naviazaná tiež fluorescenčná látka. Inou možnosťou môže byť inkorporácia fluorescenčnej látky priamo v pevnom nosiči, ako je opísané v patentovej prihláške US č: 4568649. Ten člen dvojice ligandov ao/„anti-ligand“, ktorý nie je naviazaný na nosič, je označený rádioaktívnou zlúčeninou, ktorá emituje žiarenie schopné excitovať fluorescenčné agens. V prípade, keď ligand viaže rádioaktívne značený „anti-ligand“, sa rádioaktívna značka dostane dostatočne blízko k fluorofóru naviazanému na nosič a môže tento fluorofór excitovať a vyvolať tým svetelnú emisiu. Ak nedochádza k väzbe, je rádioaktívna značka obvykle príliš vzdialená od pevného nosiča, aby bola schopná excitovať fluorescenčné agens a intenzita emitovaného svetla je nízka. Emitované svetlo je merané a korelované medzi ligandom a „anti-ligandom“. Pridanie inhibítora väzby k vzorke spôsobí zníženie emisie svetla flurofórom tým, že zabráni naviazaniu rádioaktívnej značky v blízkosti pevného nosiča. Inhibítory väzby môžu byť teda identifikované meraním ich vplyvu na emisiu svetla fluorofórom vo vzorcoch. Podobne môžu byť takisto identifikované „anti-ligandy“ polypeptidu a_D.

Pri testovaní modulátorov väzby CAM uskutočňovaným postupom uvedeným ďalej je pri SPA použitý rozpustný rekombinantný konštrukt απ/CD 18 s leucinovým zipsom (pozri príklad 14). Tento rekombinantný integrín je pomocou neblokujúcej protilátky namierenej proti podjednotke a alebo proti podjednotke β imobilizovaný na doštičke dopredu pokrytej fluorescenčnou látkou. Zlúčeniny chemickej knižnice a biotinylovaný chimerický protein CAM/Ig sú na doštičku pridané súčasne. Väzba chimérického proteínu CAM/Ig je detegovaná pomocou rádioaktívne značeného streptavidínu. V tomto stanovení sú chimérické proteíny ICAM-l/Ig a ICAM-3(Ig biotinylované pomocou kitu NHS-Sulfo-biotin LC (dlhý reťazec, Pierce) postupom odporúčaným výrobcom. Takto označené proteíny stále reagujú s protilátkami špecificky namierenými proti CAM a s využitím metódy ELISA môže byť ukázané, že reagujú s imobilizovaným proteínom LFA-1. Detekcia je uskutočňovaná s využitím konjugátu Strepavidin-HRP a následným ofarbením s využitím OPD.

Inou možnosťou je priame naviazanie purifikovaného alebo čiastočne purifikovaného rekombinantného leucíno

SK 283135 Β6 vého zipsu na doštičku dopredu pokrytú fluorescenčnou látkou. Zlúčeniny chemickej knižnice a neznačený chimérický proteín CAM/Ig sú na doštičku pridané súčasne. Naviazaný CAM/Ig je detegovaný protilátkou namierenou proti ľudskému Ig označenou izotopom ¹²³I.

Ešte inou možnosťou je imobilizovať na scintilačnú doštičku purifikovaný proteín CAM/Ig. Potom sú na doštičku pridané zlúčeniny chemickej knižnice a koncentrovaný supernatant z buniek exprimujúcich rekombinantný integrín typu leucinového zipsu. Väzba tohto rekombinantného integrínu je detegovaná pomocou značenej neblokujúcej protilátky namierenej proti podjednotke a alebo proti podjednotke β.

Príklad 14

Expresívne konštrukty rozpustného ľudského poiypeptidu a_D

Exprcsia neskráteného rozpustného ľudského heterodiméru a^/CDlS poskytuje ľahko purifikovateľný materiál, použiteľný na imunizáciu a väzbové štúdie. Výhodou vytvorenia rozpustného proteínu je skutočnosť, že tento proteín môže byť puriflkovaný zo supematantov a nemusí sa purifikovať z lyzátov buniek (ako neskrátený heterodimér aýCDlS viazaný na membránu); tento proteín je teda získaný ľahšie a s menším zastúpením nečistôt.

Expresívny plazmid kódujúci rozpustný a_D bol vytvorený nasledujúcim postupom Štiepenie reštrikčnými enzýmami HindlII a AatlI bol z plazmidu pATM.D12 izolovaný nukleotidový fragment zodpovedajúci oblasti báz 0 až 3161 v SEK. ID. č.: 1. S využitím primárov sHAD.S a sHAD.3, zobrazených ako SEK. ID. č.: 30 a 31, bol z plazmidu pATM.D12 reakciou PCR amplifikovaný fragment zodpovedajúci oblasti báz 3130 až 3390 v SEK. ID. č.: 1. Sekvencia tohto fragmentu sa prekrýva so sekvenciou fragmentu získanou štiepením reštrikčnými enzýmami HindIII/AatlI a na 3' konci obsahuje navyše reštrikčné miesto Mlul.

5’-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (SEK: ID. č.: 30)

5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3' (SEK. ID. č.: 31)

Produkt získaný amplifikáciou uskutočňovanou PCR bol rozštiepený enzýmami AatI a Mlul a zaligovaný s fragmentom získaným štiepením reštrikčnými enzýmami HindlII/AatlI. Získaný produkt bol zaligovaný do plazmidu pDC.l.s rozštiepeného reštrikčnými enzýmami HindIII/MluI.

Tento konštrukt bol v stabilne transfekovaných bunkách CHO exprimovaný spoločne s rozpustným proteínom CD 18 a expresia bola detegovaná autorádiografickou vizualizáciou imunoprecipitovaných komplexov CD 18 získaných z buniek označených ³⁵S-metionínom. Tento konštrukt bol takisto spolu s CD18 exprimovaný v bunkách 293 [Berman a ďalší, .1. Celí. Biochem. 52 : 183 až 195 (1993)].

Rozpustný neskrátený konštrukt ct_D

Vynález sa takisto týka alternatívnych expresívnych konštruktov pre a_D. Na uľahčenie expresie a purifikácie intaktného heterodiméru ao/CD18 budú skonštruované expresívne plazmidy kódujúce rozpustný a_D a CD18. Polypeptidy kódované týmito plazmidmi budú obsahovať fúznu sekvenciu „leucinového zipsu“, ktorá bude počas purifikácie tento heterodimér stabilizovať [Chang a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 91 : 11408 až 11412 (1994)]. Stručne povedané, DNA kódujúce aminokyselinové reťazce tvorené kyslými a zásaditými aminokyselinami tvoria cimi leucínový zips boli vytvorené pripojením primárov pri použití oligonukleotidov opísaných v publikácii Chang a ďalší. Sekvencie DNA boli ďalej modifikované tak, že do nich boli na 5' a 3' koncoch zavádzané reštrikčné miesta Mlul (5' koniec) a Xbal (3' koniec). Táto modifikácia slúži na uľahčenie zaklonovania týchto sekvencií do expresívnych konštruktov pre CD18 alebo a_D opísaných predtým. K uvedeným sekvenciám DNA boli tiež pripojené sekvencie kódujúce hemaglutinín alebo polyhistidín a za reštrikčné miesto Xbal bol vložený stup kodón. Sekvencie kódujúce hemaglutinín alebo polyhistidín boli vložené s cieľom uľahčiť afínitnú purifikáciu exprimovaného proteínu. Do expresívneho vektora kódujúceho CD18 sú vložené sekvencie kódujúce reťazec leucinového zipsu tvorený bázickými aminokyselinami; do konštruktu kódujúceho reťazec a_D je vložená sekvencia kódujúca reťazec leucinového zipsu tvorený kyslými aminokyselinami. Predpokladá sa, že po expresii modifikovaných proteínov a_D a CD18 v hostiteľských bunkách, bude interakcia medzi reťazcom tvoreným bázickými aminokyselinami a reťazcom tvoreným kyslými aminokyselinami stabilizovať tento heterodimér a umožní izoláciu intaktnej molekuly «O/CDI8 opísanou metódou afinitnej purifikácie.

Boli skonštruované plazmidy na expresiu rozpustného a_D a CD 18 s „leucínovým zipsom“ tvoreným sekvenciami kódujúcimi kyslé a bázické aminokyseliny a týmito plazmidmi boli metódou využívajúcou DEAE/Dextran opísanou v príklade 7 transfekované bunky COS. Vzniknutý proteín bol označený ako a[>/CD18LZ. Transfekované bunky boli počas 14 dni kultivované v médiu so zníženým obsahom séra (2 %). Supematanty z transfekovaných buniek boli zozbierané každý piaty deň a metódou ELISA opísanou v príklade 8, v nich bola analyzovaná produkcia proteínov. Stručne povedané, heterodimér (VCD18LZ bol imobilizovaný na doštičkách potiahnutých monoklonálnou protilátkou 169B namierenou proti a_D (pozri príklad 15). Komplex a_r)/CD18LZ bol detegovaný pridaním biotinylovanej monoklonálnej protilátky namierenej proti CD 18 (TS1/18.1, pozri príklad 8) s následným pridaním konjugátu streptavidín/chrenová peroxidáza (IIRP) a o-fenyldiamínu (OPD). V supematantoch bola detegovaná prítomnosť týchto proteínov.

Väzbové štúdie uskutočňované pri použití neskráteného expresívneho produktu a_D

Funkčné väzbové analýzy s rozpustným neskráteným heterodimérom a_rýCD18I.Z. opísaným skôr, boli uskutočňované pri imobilizácii heterodiméru na doštičky potiahnuté monoklonálnou protilátkou 169B alebo neblokujúcou monoklonálnou protilátkou namierenou proti CD 18 (pozri príklad 15). S cieľom zamedziť nešpecifickým väzbám boli jamky pred pridaním chimerických proteínov CAM/Ig (pozri príklad 12) v začiatočnej koncentrácii 10 μg/ml blokované pomocou želatíny získanej z rybacej kože. Väzba uvedených chimerických proteínov k heterodiméru «[ý'CDlSLZ bola detegovaná prostredníctvom konjugátov HRP s kozou protilátkou namierenou proti ľudskému Ig (Jackson Labs) a následným ofarbením pomocou OPD.

Bolo pozorované, že VCAM-l/Ig sa k imobilizovanému heterodiméru Uq/CDISLZ viaže 3- až 5-krát intenzívnejšie ako k imobilizovanému heterodiméru CDlla/CD18. Molekuly ICAM-l/Ig a ICAM-2/Ig poskytujúce pri väzbe na rozpustný heterodimér CDlla/CD18 15-krát, resp. 10-krát intenzívnejší signál (v porovnaní s pozadím), ale neviažu sa na heterodimér (ip/CDlSLZ. Väzba VCAM-1 bola, za prítomnosti kombinácie protilátok 130K a 130P

SK 283135 Bé špecificky namierených proti VCAM-1, znížená približne o 50 %.

Väzbové štúdie boli takisto uskutočňované na 96-jamkových doštičkách s imobilizovaným proteínom ICAM/Ig a následným pridaním rozpustného rekombinantného integrínu prítomného v bunkovom supematante. Väzba rozpustných integrínov bola detegovaná pomocou neznačnej neblokujúcej myšacej protilátky namierenej proti reťazcu a alebo B a následnou inkubáciou s kozou protilátkou špecificky namierenou proti myšacím Ig konjugovanou s HRP a ofarbením s využitím OPD.

Získané výsledky naznačujú, že nameraná hodnota pri väzbe (1D/CD18LZ k ICAM-R/Ig, detegovanej pomocou neblokujúcej protilátky, bola 10-krát vyššia ako to bolo v kontrolných jamkách neobsahujúcich žiadnu protilátku. Nebola detegovaná väzba rozpustného heterodiméru cip/CDIS k imobilizovanému ICAM-l/Ig, ale oproti tomu bola detegovaná väzba medzi cin/CDlSLZ a imobilizovanými heterodimérmi CDllb/CD18 a CDlla/CD18 15-krát (CD1 lb/CD18) a 5-krát (CDlla/CD18) vyššia ako boli hodnoty pozadia.

Keďže predchádzajúce štúdie ukázali, že molekuly CDllb a CDllc viažu lipopolysacharid (LPS) [Wright; Curr. Opin. Immunol. 3 : 83 až 90 (1991); Ingalls a Golenbock. J. Exp. Med. 181 : 1473 až 1479 (1995)], bola pomocou prietokovej cytometrie a stanovení uskutočňovaných na titračných doštičkách, takisto analyzovaná väzba LPS na heterodimér ao/CD18. Získané výsledky ukazujú, že LPS, značený FITC, izolovaný z mikroorganizmov S. Minnesota a S. typhosa (obidva získané od firmy Sigma) sa v koncentrácii 20 pg/ml slabo viazal na bunky CHO transfekované ao/CD18. Pri netransfekovaných bunkách CHO nebola detegovaná žiadna väzba. Pri stanoveniach uskutočňovaných metódou ELISA sa biotinylovaný LPS [Luk a ďalší, Alan. Biochem. 232 : 217 až 224 (1995)] v množstve 0,5 až 3,0 pg viazal k imobilizovanému heterodiméru afyCDlS a poskytoval štyrikrát väčší signál, ako to bolo v jamkách so samotnou protilátkou a blokujúcim agens. Zdanlivá väzba LPS na CDlla/CD18 bola po odčítaní hodnôt pozadia (väzba protilátky TS2/4 namierenej proti CD 11 a) nevýznamná.

Aby bolo možné identifikovať ďalšie ligandy pre ao/CD18, je rekombinantný proteín u^CDlSLZ použitý v dvoch prevádzkových štúdiách. S cieľom stanovení, ktoré bunky na svojom povrchu exprimujú ligandy pre a_D, je analyzovaná väzba rôznych typov buniek na imobilizovaný proteín. Potom je využitá inhibícia väzby s využitím protilátok, pomocou ktorých j c možné stanoviť, ktoré známe povrchové adhezívne molekuly sú zodpovedné za pozorovanú väzbu buniek. Ak nie je pozorovaná žiadna inhibícia, je pri pokuse o identifikáciu ligandu využitá koimunoprecipitácia heterodiméru αρ/CD 18LZ naviazaného na proteiny (ktoré budú viazať a_D) z lyzovaných buniek.

Expresívne konštrukty kódujúce doménu I rozpustného ľudského polypeptidu a_D

Už predtým bolo publikované, že doména 1 v molekule CDlla môže byť exprimovaná ako nezávislá štruktúrna jednotka, ktorá si udržiava schopnosť viazať ligandy a schopnosť byť rozpoznaná protilátkami [Randi a Hogg, J. Biol. Chem. 269 : 12395 až 12398 (1994); Zhout a ďalší, J. Biol. Chem. 269 : 17075 až 17079 (1994); Michishita a ďalší, Celí 72 : 857 až 867 (1993)]. S cieľom vytvoriť rozpustný fúzny proteín zložený z domény I polypeptidu a_D, a ľudského IgG4, bola pomocou PCR amplifikovaná sekvencia kódujúca doménu I polypeptidu a_D. Na túto PCR reakciu boli použité priméry, ktoré kvôli uľahčeniu klonovania pridávajú na konce sekvencie reštrikčné miesta BamHI a Xhol. Tieto priméry sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 32 až 33 a reštrikčné miesta sú tu podčiarknuté.

5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3' (SEK. ID. č.: 32)

5’-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3' (SEK. ID. č.: 33)

Nukleotid C nachádzajúci sa v SEK. ID. č.: 32 na 3' konci vedľa reštrikčného miesta BamHI zodpovedá nukleotidu 435 v SEK. ID. č.: 1; nukleotid G nachádzajúci sa v SEK. ID. č.. 33 na 3' konci vedľa reštrikčného miesta Xhol zodpovedá nukleotidu 1067 v SEK. ID. č.: L Amplifikovaná doména I je rozštiepená zodpovedajúcimi reštrikčnými enzýmami a purifikovaný fragment je zaligovaný do cicavčieho expresívneho vektora pDCs a prokaryotického expresívneho vektora pGEX-4T-3 (Pharmacia) a fragment domény I je sekvenovaný. Fúzny proteín je potom exprimovaný v bunkách COS, CHO alebo E. coli transfekovaných alebo transformovaných zodpovedajúcimi expresívnym konštruktom.

Vzhľadom na afinitu polypeptidu a_D k ICAM-R, môže mať exprimovaná doména I polypeptidu ot_D dostatočnú afinitu, aby mohla byť použitá ako inhibítor bunkovej adhézie, pri ktorej aktívne participuje polypeptid a_D.

Analýza fúzneho proteínu tvoreného doménou 1 ľudského 0,7^04 Proteín bol rozdelený pomocou SDS-PAGE v redukujúcich a neredukujúcich podmienkach a vizualizovaný farbením striebrom alebo farbením Coomasie. Potom bol proteín prenesený na membrány Immobilon PVDF a analyzovaný pomocou monoklonálnych protilátok namierených proti ľudskému IgG alebo monoklonálnych protilátok namierených proti bo vinnému IgG.

Pre detegovaná proteiny bolo stanovené, že v neredukujúcich podmienkach migrujú so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 120 kD a redukujúcich podmienkach migrujú so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 45 kD. Na géli z elektroforézy uskutočňovanej v neredukujúcich podmienkach boli takisto detegované menej intenzívne prúžky so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 40 až 50 kD, ktoré reagovali s protilátkami namierenými proti ľudskému IgG, ale nereagovali s protilátkami namierenými proti bovinnému IgG. Menej intenzívny prúžok so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 200 kD bol metódou Westem Blot detegovaný ako bovinný Ig.

Väzbové štúdie uskutočňované pri použití expresívnych produktov domény I

Metódou ELISA bola testovaná schopnosť domény I špecificky rozpoznávať chimerický proteín ICAM-R/IgG. Jednotlivé sériové riedenia fúzneho proteínu IgG4 a domény I polypeptidu a_D (Ia_D/IgG4) v TBS boli inkubované s ICAM-l/IgG, ICAM-R(IgG, VCAM-l/IgG alebo IgGl proteínom (produkovaným bunkami myelómu) imobilizovanými na doštičkách Immulon IV pre RIA/EIA. Ako negatívna kontrola boli použité chimerický proteín domény I CDlla/IgG a ľudský myelómový proteín IgG4/kappa. Naviazaný IgG4 bol detegovaný prostredníctvom biotinylovanej monoklonálnej protilátky HP6023 namierenej proti lgG4 s následným pridaním konjugátu streptavidín-peroxidáza a farbením pri použití substrátu o-fenyldiamínu.

V opakovaných stanoveniach nebola detegovaná väzba medzi proteínom CDlla/IgG4 alebo myelómovým proteínom IgG4 a ktorýmkoľvek z imobilizovaných proteínov. Proteín IaD/IgG4 sa neviazal na ľudský IgGl, ICAM-1/IgGl alebo blokujúce agens, ako je želatína z rybacej kože alebo bovinný sérový albumín. Pri použití proteínu Iut>/IgG4 v koncentráciách 1 až 5 ug/ml bola v jamkách potiahnutých ICAM-R/IgG detegovaná, v porovnaní s pozadím; dvoj- až trojnásobne vyššia intenzita signálu. Intenzita signálu v jamkách potiahnutých VCAM-I/IgG bola 7- až 10-krát vyššia ako pozadie. V predchádzajúcich stanoveniach sa bunky CHO transfekované a_w'CD18 neviazali na VCAM-I/IgG, čo naznačuje, že väzba VCAM-I môže byť charakteristická pre aminokyselinovú sekvenciu izolovanej domény I.

Ďalšie konštrukty domény I polypeptidu a_D

Ďalšie konštrukty domény I polypeptidu a_D boli vytvorené rovnakým spôsobom ako predchádzajúci konštrukt s výnimkou toho, že tu bolo okolo domény I polypeptidu a_Dzačlenených viac aminokyselín. Tieto špecifické konštrukty obsahujú: i) sekvencie z exónu 5 (aminokyseliny 127 až 353 v SEK. ID. č.: 2), umiestené pred doménou I; ii) opakovania motívu „EF-hand“ (motív v oblastiach zodpovedných na väzbu vápenatých iónov) (aminokyseliny 17 až 603 v SEK. ID. č.: 2) umiestené za doménou I; iii) reťazec alfa ukončený v transmembránovej oblasti (aminokyseliny 17 až 1029 v SEK. ID. č.: 2) spolu s IgG4 použitým na purifikáciu a detekciu. Tieto konštrukty sú zaligované tak do cicavčieho expresívneho vektora pDCSl, ako aj do prokaryotického expresívneho vektora pGEX-4T-3 (Pharmacia) a doména I je sekvenovaná. Fúzne proteíny sú potom exprimované v bunkách COS, CHO alebo E. coli transformovaných alebo transfekovaných príslušnými expresívnymi konštruktmi. Proteíny sú purifikované na kolóne ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, England) a je testovaná ich reaktivita s monoklonálnou protilátkou HP6023 namierenou proti IgG4. Tieto proteíny sú na polyakrylamidovom géli ofarbené pomocou Coomassie.

Aby bolo možné skonštruovať expresívnym plazmid kódujúci kompletný polypeptid a_D, je plazmid pATM.D12 (opísaný skôr) modifikovaný nasledujúcim spôsobom tak, aby z neho bolo možné exprimovať fúzny proteín a»'IgG4. DNA kódujúca IgG4 je pomocou PCR pri použití primárov, ktoré zavádzajú na 5' koniec reštrikčné miesto AatlI (SEL. ID. č.: 89) a na 3' koniec reštrikčné miesto Xbal (SEK. ID. č.; 90), izolovaná z vektora pDCS 1.

5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3' (SEK. ID. č.: 89)

5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK. ID. č.: 90)

Plazmid pATM.D12 je rozštiepený reštrikčnými enzýmami AatlI a Xbal a rozštiepený a purifikovaný produkt PCR reakcie, IgG4, je zaligovaný do linearizovaného vektora.

Príklad 15

Produkcia protilátok špecificky namierených proti ľudskému a_D

A. Produkcia monoklonálnych protilátok

1. Prechodne transfekované bunky z príkladu 7 boli trikrát premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátovým pufrom podľa Dulbecca (D-PBS) a v PBS indikované, v množstve 5 x 10⁶ buniek/myš spolu s 50 pg/myš muramyl dipeptidázy (Sigma), do myší Balb/c. Myši boli indikované rovnakým spôsobom dvakrát v dvojtýždennom intervale. Preimunizačné séra a séra z imunizovaných myší boli testované s využitím FACS, ako je opísané v príklade 9, a slezinné bunky z myší s najvyššou reaktivitou proti bunkám transfekovaným (ttýCDlS boli použité na fuziu. Supema tanty z kultúr hybridómov boli jednotlivo testované s cieľom zistiť, či nereagujú s bunkami COS transfekovanými pomocou CDlla/CD18 a takisto, či reagujú s bunkami kotransfekovanými expresívnymi plazmidmi kódujúcimi polypeptidy a_D a CD18.

Týmto postupom sa nepodarilo pripraviť žiadne monoklonálne protilátky.

2. Ako alternatíva pre produkciu monoklonálnych protilátok bol použitý postup, pri ktorom bol rozpustný fúzny proteín domény I polypeptidu ct[>/IgG4 afinitne purifikovaný zo supernatantu stabilne transfekovaných buniek COS a bol použitý na imunizáciu myší Balb/c, ako je opísané. Boli vytvorené hybridómy a supernatanty získané pri kultivácii týchto hybridómov boli metódou ELISA testované s cieľom zistiť reaktivitu proti fúznemu proteínu domény I polypeptidu a_D. Pozitívne kultúry boli potom analyzované s cieľom zistiť, či reagujú s neskrátenými komplexmi αβ/CD 18 exprimovanými na povrchu transfekovaných buniek CHO.

Myš bola najprv trikrát imunizovaná bunkami CHO transfekovanými ao/CD18 a potom dvoma posilňovacími dávkami obsahujúcimi rozpustný heterodimér αβ/CD 18. Dávky na posledné dve imunizácie obsahovali takisto fúzny proteín doména I polypeptidu αβ/IgGd v množstve 50 pg/myš. Výsledkom týchto imunizácii bolo 270 jamiek, v ktorých hybridómy produkovali protilátky proti IgG. Pomocou metódy ELISA bolo stanovené, že supernatanty zo 45 jamiek mali prinajmenšom 7-krát silnejšiu väzbu k fúznemu proteínu Iar>/IgG4 než k samotnému ľudskému IgG. Analýzou s využitím FACS bolo zistené, že žiadny z týchto supernatantov nereaguje s bunkami CHO transfekovanými OD/CD18.

S cieľom zistiť, či sú protilátky v týchto supernatantoch schopné rozpoznávať alfa podjednotku integrínu v inom kontexte, boli pomocou supernatantov (z 24 z celkového počtu 45 jamiek) označené čerstvo zmrazené rezy sleziny. Tri supernatanty poskytli pozitívnu reakciu: jeden ofarbil veľké bunky červenej pulpy, zatiaľ čo ďalšie dva ofarbili bunky roztrúsené v červenej pulpe a takisto v trabekule.

Pri týchto supernatantoch bola ďalej analyzovaná ich schopnosť imunoprecipitovať biotinylované komplexy CD 18 buď z buniek CHO transfekovaných αβ/CDlS alebo buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PMA. Na ďalšie pasážovanie boli vybrané jamky, v ktorých boli prítomné supernatanty reagujúce z lyzátov získaných pôsobením detergentov (tieto proteíny by nemali mať tak definované štruktúry, ako pokiaľ ide o proteíny exprimované ako heterodiméry). Monoklonálne protilátky, ktoré rozpoznávajú proteíny v dctcrgcntc, môžu byť užitočnejšie pri imunoprecipitácii heterodimérnych komplexov z transfekovaných buniek, tkanív a bunkových línií.

3. Ako ďalšia alternatívna na produkciu monoklonálnych protilátok bol použitý postup, pri ktorom boli z lyzátov ľudskej sleziny, pomocou monoklonálnej protilátky 23F2G namierenej proti CD 18, imunoprecipitované komplexy CD 18; tejto imunoprecipitácii predchádzalo odstránenie komplexu CDlla/CD18 (pomocou monoklonálnej protilátky TS2/4) a komplexu CDllb/CD18 (pomocou monoklonálnej protilátky Mo-1). Päť myší Balb/c, starých 10 až 12 týždňov, bolo imunizovaných subkutánnou injikáciou približne 30 pg proteínu, pripraveného opísaným postupom, v kompletnom Freundovom adjuvans. Táto imunizácia bola uskutočnená 0. deň a potom nasledovali imunizácie dvoma dávkami obsahujúcimi 30 pg imunogénu/myš v nekompletnom Freundovom adjuvans, ktoré boli uskutoč ňované 28. a 43. deň. Desať dní po poslednej imunizácii bola myšiam odobraná krv a pre získané séra zriedené v pomere 1 : 500 bola metódou Western Blot stanovovaná reaktivita proti imunogénom v množstve 1 pg/dráha. Séra z troch myší detegovali prúžky zodpovedajúce proteínom s molekulovou hmotnosťou približne 95 a 150 kD; v dráhach, v ktorých boli na detekciu použité séra z neimunizovaných myší v zriedení 1 : 50, nebol detegovaný žiadny signál. Predpokladalo sa, že prúžok s veľkosťou 150 kD reprezentuje in vivo glykozylovaný polypeptid a_D. Všetky séra získané z imunizovaných myší navyše imunoprecipitovali s proteínom z lyzátov biotinylovaných buniek CHO transfekovaných ao/CD18, ktorý pri SDS elektroforéze na polyakrylamidovom géli migroval s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou heterodiméru. Na základe týchto výsledkov bola vybraná myš #2212 a táto myš bola ďalej imunizovaná intraperitoneálnou injekciou obsahujúcou 30 pg imunogénu v PBS (uskutočňovaná 64. deň). Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená a z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina.

Suspenzia jednotlivých slezinných buniek bola vytvorená rozmelením tkaniva medzi dvoma namrazcnými podložnými sklíčkami ponorenými do média RPMI 1640 bez prítomnosti séra s prídavkom 2 mM L-glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilínu v koncentrácii 100 jednotiek/ml a streptomycínu v koncentrácii 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilné bunkové sitko Nitex s veľkosťou ôk 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola potom rozsuspendovaná v 20 ml média RPMI bez prítomnosti séra. Tymocyty z troch myší Balb/c (neimunizovaných) boli pripravené podobným spôsobom.

Myelómy NS-1, udržiavané tri dni pred fúziou v log fáze v médiu RPMI s obsahom 10 % fetálneho séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc. Logan, Utah), boli centrifugované pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá opísaným postupom, a bunky boli spočítané. Približne 1,15 x 10^B slezinných buniek bolo zmietaných s 5,8 x 10⁷ buniek NS-1 scentrifugovaných a supematant bol odstránený. Peleta bola poklepom uvoľnená odo dna kyvety. K bunkovej pelete boli pri stálom miešaní počas jednej minúty pridávané 2 ml PEG 1500 (Boehrimger Mannheim) (50 % roztok v pufri 75 mM HEPES s pH = 8,0) zahriateho na teplotu 37 °C. Potom bolo k bunkovej suspenzii pridaných 14 ml média RPMI bez prítomnosti séra a suspenzia bola miešaná počas 7 minút. Nasledoval prídavok 16 ml média RPMI a bunky boli centrifugované počas 10 minút pri 200 x g. Supernatant bol odstránený a peleta bola resuspendovaná v 200 ml média RPMI obsahujúceho 15 % FBS, 100 mM hypoxantin sodný, é, 4 mM aminopterín, 16 mM tymidín (HAT) (Gibco), IL-6 s koncentráciou 25 jednotiek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶ tymocytov/ml. Suspenzia bola rozdelená do 10-tich 95-jamkových (s plochým dnom) doštičiek na tkanivové kultúry (Coming, Veľká Británia) v objeme 200 μΐ/jamka a bunky boli vyživované 4., 5., 6. a 7. deň odohraním μΐ média z každej jamky 18G-ihlou (Becton Dickinson) a pridaním 100 μΐ čerstvého média, opísaného skôr, ale s IL-6 v koncentrácii 10 jednotiek/ml a neobsahujúceho tymocyty.

až 10 dní po fúzii boli supematanty z každej jamky testované metódou ELISA na prítomnosť myšacích IgG. Štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) boli pri teplote 4 °C potiahnuté kozou protilátkou namierenou proti myšacím imunoglobulínom IgA, IgG alebo IgM (Organon Teknika) v množstve 50 μΐ/jamku, zriedenú v pomere 1 : 5000 v uhličitanovom pufri s pH = 9,6.

Doštičky boli trikrát premyté pufrom PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBST) a bolo do nich pridaných 50 μΐ supematantu získaného z bunkových kultúr. Po inkubácii prebiehajúcej 30 minút pri teplote 37 °C a premytí, opísaným postupom, bola pridaná kozia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou namierená proti myšaciemu IgG(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove. Pennsylvania) zriedené v pomere 1 : 3500 v roztoku PBST. Doštičky boli inkubované, opísaným postupom, a štyri razy premyté roztokom PBST. Hneď potom bolo pridaných 100 μΐ substrátu, ktorý obsahoval o-fenyléndiamín v koncentrácii 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30 % H₂O₂ v 100 mM citrátovom pufri s pH = 4,5. Farebná reakcia bola po 5 minútach zastavená prídavkom 50 μΐ 15 % H₂SO₄. Absorbancia bola stanovovaná pri vlnovej dĺžke 490 nm na čítačke doštičiek firmy Dynatech.

Hybridómy boli ďalej charakterizované nasledujúcim postupom. Supematanty získané kultiváciou klonov produkujúcich IgG boli analyzované prietokovou cytometriou, či sú reaktívne proti bunkám CHO transformovaným ap/CDlS a pritom nie sú imunoreaktívne proti bunkám JY (línie B-buniek exprimujúca LFA-1, ale nie iné integríny β₂). Táto skutočnosť bola pozorovaná v predchádzajúcich experimentoch). Stručne povedané, 5 x 10⁵ buniek CHO transformovaných aJCDlS alebo Ud/CDIK buniek JY bolo rozsuspendovaných v 50 μΐ média RPMI obsahujúceho 2 % FBS a 10 mM NaN₃ (pufer pre FACS). Do jamiek na 96-jamkových doštičkách (s jamkami s guľatým dnom) (Coming) boli k 50 μΐ supematantov, získaných z klonov hybridómov produkujúcich IgG, pridané jednotlivé suspenzie buniek. Po 30-minútovej inkubácii na ľade boli bunky dvakrát scentrifugované (a premyté), jednotlivé supematanty boli odstránené a pelety boli rozsuspendované v 200 až 300 μΐ pufri pre FACS. Posledný premývací roztok bol nahradený konjugátom fragmentu F(ab')₂ ovčej protilátky namiereným proti myšaciemu IgG (H+L)-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) v objeme 50 μΐ/jarnka zriedeného v pomere 1 : 100 v pufri pre FACS. Po inkubácii, uskutočňovanej opísaným postupom, boli bunky dvakrát premyté PBS modifikovaným podľa Dulbacca (D-PBS) doplneným 10 mM NaNj a nakoniec rozsuspendované v B-PBS obsahujúcom 1 % paraformaldehyd. Potom boli vzorky prenesené do polystyrénových skúmaviek na analýzu prietokovou cytometriou (FACS) a analyzované na analyzátore FACscan firmy Becton Dickinson.

Výsledkom fúzie bolo vytvorenie štyroch bunkových kultúr, ktoré spĺňali obidve kritériá. Keď bol približne po štyroch dňoch uskutočňovaný pri supematantoch sekundárny sereening, tri zo štyroch kultúr zostali pozitívne. Kultúry' z týchto troch jamiek, označené 169A, 169B a 169D, boli dvakrát až trikrát úspešne pasážované vždy dvojnásobným zriedením v médiu RPMI obsahujúcom 15 % FBS, 100 mM hypoxantin sodný, 16 mM tymidín a IL-6 s koncentráciou 10 jednotiek/ml. Po štyroch dňoch boli jamky na doštičkách vizuálne zhodnotené a v jamkách s najmenším počtom kolónií bol určený počet týchto kolónií. Po 7 až 10 dňoch boli kultúry vo vybraných jamkách z každého pasážovania analyzované s využitím FACS. Pri dvoch týchto kultúrach, 169A a 169B, bola detegovaná aktivita. Pri poslednom pasážovaní boli kolónie z pozitívne reagujúcich jamiek (prítomná vždy jedna v jamke) rozrastené v médiu RPMI s 11 % FBS. Pri protilátkach zo supematantov klonov 169A a 169B bol pri použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupom odporúčaným výrobcom, stanovovaný ich izotyp. Bolo zistené, že ide o protilátky izotypu IgGl.

Pri terciálnom testovaní špecifity týchto protilátok bola využitá precipitácia s komplexmi a^/CDlS získanými z transfekovaných buniek CHO a buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PMA. Protilátky produkované hybridómami 169A a 169B precipitovali s prúžkami s príslušnou veľkosťou (proteíny z línií CHO) a precipitovali takisto s jedným typom reťazca a so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150 až 160 kD z buniek HL60. Táto skutočnosť bola stanovená pomocou SDS-PAGE. Hybridómy 169A a 169B boli 31. mája 1995 uložené v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 a bolo im pridelené prístupové číslo HB11907 (169A) aHB11906 (169B).

Aby bolo možné lepšie charakterizovať väzbové vlastnosti protilátok 169A a 169B, bola pri každej z týchto protilátok testovaná ich schopnosť inhibovať väzbu druhej protilátky alebo protilátky TS1/18.1 namierenej proti CD18 k rozpustnému heterodiméru ao/CDie. Rozpustný neskrátený heterodimér a_D/CD18 bol pomocou každej z týchto protilátok (neznačených) jednotlivo imobilizovaný na 96-jamkovej doštičke a na detekciu proteínu, naviazaného prostredníctvom rovnakej alebo odlišnej neznačenej protilátky, boli použité protilátky označené biotínom. Väzba bola detegovaná pri použití konjugátu kozia protilátka namierená proti myšacím Ig/HRP s následným farbením substrátom OPD. Získané výsledky naznačujú, že protilátka 169A bola schopná blokovať väzbu biotinylovaných protilátok 169A a TS 1/18.1, zatiaľ čo protilátka 169B blokovala len väzbu seba samej.

4. Iná z myší (#2214), imunizovaná rovnakým postupom ako myš #2212, bola 70. deň ďalej imunizovaná pomocou 30 pg purifikovaného polypeptidu a_D, získaného z lyzátu sleziny, v PBS. Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená a z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina.

Fúzia a selekcia pozitívne reagujúcich buniek bola uskutočňovaná opísaným postupom. Výsledkom fúzie bol vznik piatich hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky proti a_D, ktoré boli označené 170D, 170F, 170E, 170X a 170H. Pri použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupom odporúčaným výrobcom, bol stanovený izotyp týchto protilátok a bolo zistené, že ide o protilátky izotypu IgGl.

5. Iná z myší (#2211), imunizovaná rovnakým postupom ako myši #2212 a #2214, bola 88. deň ďalej imunizovaná pomocou 30 pg imunogénu a 203. deň prebehla, s využitím 30 pg imunogénu, ďalšia imunizácia. Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená, z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina a fúzia buniek prebehla opísaným postupom. Supematant získaný pri kultivácii hybridómov bol testovaný metódami ELISA a prietokovou cytometriou, ako je detailne opísané v predchádzajúcich odsekoch.

Pomocou metódy ELISA bolo identifikovaných 15 pozitívne reagujúcich hybridómov označených 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R a 188T. Pri týchto klonoch bol takisto stanovený izotyp produkovaných protilátok. Stručne povedané, štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusctts) boli pri 4 °C potiahnuté kozou protilátkou namierenou proti myšacím IgA, G, M (Organon Teknika) zriedenou v pomere 1 : 5000 v 50 mM uhličitanovom pufri, pH 9,6, v objeme 50 pl/jamka. Doštičky boli počas 80 minút pri 37 °C blokované pomocou 1 % BSA v PBS, trikrát premyté v PBS/0,05 Tween 20 (PBST) a do jamiek bolo pridaných 50 μΐ supematantu získaného pri kultivácii hybridómov (zriedeného v pomere 1 : 10 v PBS). Po inkubácii a premytí, uskutočňovanom opísaným postupom, bolo do každej jamky pridaných 50 μΐ králičej protilátky (konjugovanej s chrenovou peroxidázou) namierenej proti myšacím IgG_b IgG_2a, alebo IgG₃ (Zymed, San Francisco, California), zriedenej v pomere 1 : 1000 v PBST s 1 % normálnym kozím sérom. Doštičky boli inkubované opísaným postupom, štyri razy premyté pomocou PBST a potom bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ substrátu obsahujúceho 1 mg/ml o-fenyldiamínu (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30 % H₂O₂ v 100 mM citrátovom pufri, pH 4, 5. Farbenie bolo zastavené po 5 minútach prídavkom 50 μΐ 15 % H₂SO₄. Na čítačke doštičiek (Dynatech) bola pri vlnovej dĺžke 490 nm odčítaná intenzita a bolo zistené, že všetkých 15 protilátok je izotypu IgGl.

Zvyšné slezinné bunky z myši #2211 boli zmrazené v kryoskúmavke a skladované v kvapalnom dusíku. Obsah tejto kryoskúmavky bol rozmrazený umiestením kryoskúmavky do vodného kúpeľa s teplotou 37 °C a trepaním do chvíle, keď sa bunky práve roztopili. Bunky boli prenesené do centrifugačnej skúmavky s objemom 15 ml a po jednom mililitri k nim bolo pridávané teplé médium RPMI obsahujúce 11 % FBS. Medzi jednotlivými prídavkami média boli tri až päťminútové intervaly. Bolo pridaných ďalších 5 ml teplého média RPMI a po päťminútovom státí bola skúmavka centrifugovaná počas 5 minút pri 200 x g a supematant bol odstránený. Bunky boli rozsuspendované v RPMI a fúzia bola uskutočnená opísaným postupom. Supematant získaný pri kultivácii hybridómov bol testovaný metódami ELISA a prietokovou cytometriou, opísaným postupom.

Výsledkom fúzie bol vznik piatich klonov označených 195A, 195C, 195D, 195E a 195H. Pri týchto klonoch bol metódou ELISA, opísaným postupom, stanovený ich izotyp; bolo zistené, že monoklonálne protilátky 195A, 195C, 195D a 195E sú protilátky izotypu IgGi a monoklonálna protilátka 195H je protilátka izotypu IgG_2a.

6. Aby boli získané protilátky schopné inhibovať funkčnú väzbu polypeptidu do, bol na imunizáciu použitý rozpustný ctn/CDlSLZ (pozri príklad 14). Tento proteín bol izolovaný zo supematantu získaného pri kultivácii prechodne transfekovaných buniek COS na nosiči na afmitnú chromatografiu a ako imunogén bol použitý polypeptid a_D naviazaný na nosič. Vybraná myš bola imunizovaná opísaným postupom a posledná posilňovacia dávka jej bola podaná dva týždne po prvej imunizácii. Imunizácia uskutočňovaná týmto postupom zamedzuje mocným zmenám v konformácii proteínu, ktoré sú často spojené s dýzou buniek uskutočňovanou prostredníctvom detergentu. Ďalšie myši boli imunizovaná pomocou rekombinantného proteínu, takisto naviazaného na nosič, ale tieto myši neboli na začiatku imunizované proteínom purifikovaným z lyzátu buniek.

Hybridómy, získané opísaným postupom, ktoré sú výsledkom imunizácie, boli testované metódou ELISA na rekombinantných proteínoch izolovaných z bunkových supernatantov pri použití Fab fragmentov neblokujúcej protilátky. Inou možnosťou testovania je využitie prietokovej cytometrie na stanovenie reaktivity proti bunkám JY, ktoré boli dopredu transformované cDNA kódujúcou a_D.

7. Inou možnosťou je produkcia monoklonálnych protilátok nasledujúcim spôsobom. Na imunizáciu myši Balb/c, uskutočňovanú opísaným postupom, bol použitý heterodimémy proteín a[j/CD18, purifikovaný afinitnou chromatografiou z lyzátov stabilne transfekovaných buniek CHO, spolu s muramyl dipeptidázou v koncentrácii 50 pg/ml. Predtým, ako bola imunoprecipitáciou biotinylovaných komplexov z transfekovaných buniek CHO stanovovaná reaktivita séra proti Oq/CDIS, boli myši, z ktorých bolo toto sérum získané, trikrát imunizované. Z pozitívne reagujúcich zvierat boli pomocou štandardných techník získané línie hybridómov. Potom boli tieto hybridómy kultivované a potom selektované pomocou prietokovej cytometrie, pri použití buniek transfekovaných ao/CDlS. Bunky transfekované CD1 la/CD18 boli využité ako kontrola na identifikáciu protilátok reagujúcich len s CD 18.

8. Ako ďalšia alternatíva na produkciu monoklonálnych protilátok bol využitý postup, pri ktorom bol pre myši Balb/c použitý protokol imunizácie/imunosupresie, ktorý bol navrhnutý tak, aby bola znížená reaktivita proti imunogénnym determinantom transfekovaných buniek CHO, použitých na imunizáciu. Tento protokol využíva imunizáciu uskutočňovanú pomocou netransfekovaných buniek CHO a potom následne zničenie B-buniek (v štádiu blastov) reaktívnych proti CHO bunkám, čo je dosahované pôsobením cyklafosfamidu. Po troch kolách imunizácie a následného zničenia reaktívnych B-buniek prídavkom cyklofosfamidu sú myši imunizované pomocou buniek transfekovaných Oq/CDI 8 opísaným postupom.

9. Inou alternatívou je postup, pri ktorom sú, opísaným postupom, lyzáty buniek HL60 stimulovaných pomocou PMA (získalo sa pôsobením detergentu) obohatené o frakciu komplexov CD18. Na rovnakých stĺpcom sú odstránené iné integriny β₂. Imunizácie pomocou získaných komplexov, produkcia hybridómov a ich testovania sú uskutočňované opísanými postupmi.

B. Produkcia polyklonálneho séra

S cieľom vytvoriť polyklonálne antisérum v organizme králikov bol použitý purifikovaný chimerický proteín doména 1 polypeptidu aďlgGT (príklad 14). Na začiatku bol antigén doména I polypeptidu cqý'IgGd injikovaný do organizmu králikov v kompletnom Freundovom adjuvans v množstve 100 pg/králik a potom nasledovali tri posilňovacie dávky, obsahujúce rovnaké množstvo proteínu v nekompletnom Freundovom adjuvans. Po tretej a štvrtej imunizácii boli analyzované vzorky krvi. Králičí imunoglobulín (Ig) bol zo séra purifikovaný na kolóne Sepharoza-proteín A a na kolóne ľudský IgG/Affigel 10 bol zbavený frakcie namierenej proti ľudskému IgG. Na potvrdenie dokonalého odstránenia frakcie namierenej proti ľudskému IgG bola využitá metóda ELISA, pri ktorej bolo testované, že sérum nereaguje s ľudským IgG, ale len s časťou chimerického proteínu zodpovedajúcou doméne I.

Takto predčistené polyklonálne sérum bolo použité na imunoprecipitáciu proteínov z lyzátov buniek CHO, ktoré boli na povrchu biotinylované, a ktoré boli dopredu transfekované expresívnymi vektormi kódujúcimi a_D a CD18. Imunoprecipitácia bola uskutočňovaná postupom opísaným v príklade 10. Toto predčistené sérum rozpoznávalo proteínový komplex s rovnakou molekulovou hmotnosťou akú mal komplex precipitovaný pomocou monoklonálnej protilátky TS1.18 namierenej proti CD 18. Pri analýze komplexov CD 18 získaných z buniek CHO transfekovaných pomocou an/CD18, uskutočňovanej metódou Westem Blot, rozpoznávalo toto sérum jeden prúžok s príslušnou veľkosťou. Králičie polyklonálne sérum nerozpoznávalo afinitne purifikované integriny CDlla/CD18, CDllb/CD18 a proteín VLA4 z ľudskej sleziny. Ako bolo stanovené prietokovou cytometriou, toto sérum takisto v roztoku nereagovalo s bunkami CHO transfekovanými a_D. Bolo teda usúdené, že polyklonálne králičie sérum je schopné rozpoznávať len denaturované proteíny domény I polypeptidu a_[:>/IgG4.

Pri pokuse o izoláciu polyklonálneho séra proti 0[>/CD18 bola myš trikrát imunizovaná pomocou buniek CHO transfekovaných a_D (D6.CHO, «[/CD 18) spolu s adjuvantným peptidom a raz bola imunizovaná purifikovaným heterodimérom (1d/CD18. Posledná posilňovacia dávka obsahovala len heterodimér a!>/CD18. Prídavkom asi 10⁸buniek-CHO transfekovaných LFA-1 (na 2 hodiny pri °C) bolo približne 100 μΐ séra získaného z imunizovanej myši predčistených. Pri takto upravenom sére bola, v riedeniach 1/5000, 1/10 000, 1/20 000 a 1/40 000, analyzovaná, na bunkách ľudskej sleziny, reaktivita proti polypeptidu a_D. Táto polyklonálna protilátka bola reaktívna v riedení 1/20 000, zatiaľ čo pri riedení 1/40 000 boli bunky farbené veľmi slabo.

Príklad 16

Analýza distribúcie polypeptidu a_D

Pomocou polyklonálneho séra, vytvoreného postupom opísaným v príklade 15, bola stanovovaná tkanivová distribúcia komplexu aiýCDlS.

Na imunocytochemické analýzy zmrazených rezov ľudskej sleziny bola purifikovaná králičia polyklonálna protilátka použitá v koncentráciách v intervale 120 ng/ml až 60 pg/ml. Rezy s hrúbkou 6 mikrometrov boli umiestené na podložné sklíčka Superľrost Plus (VWR) a skladované pri -70 °C. Pred použitím boli sklíčka vybrané z -70 °C a na minút umiestené do teploty 55 °C. Potom boli rezy počas 2 minút fixované acetónom a vysušené na vzduchu. Rezy boli počas 30 minút pri izbovej teplote blokované v roztoku obsahujúcom 1 % BSA, 30 % normálne ľudské sérum a 5 % králičie sérum. Na každý rez bola aplikovaná primárna protilátka pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Nenaviazaná protilátka bola odstránená trojnásobným premytím sklíčok v TBS (počas 5 minút). Ďalej bola na každý rez nanesená králičia protilátka namierená proti myšaciemu IgG v rovnakom pufri TBS. Na detekciu sekundárnej protilátky bola použitá 30-minútovú inkubácia (pri izbovej teplote) s myšacou protilátkou namierenou proti alkalickej fosfatáze značenou alkalickou fosfatázou (APAAP). Potom boli sklíčka trikrát premyté v pufri TBS. Potom bol pridaný substrát Fast Blue (Vector Labs) a farbenie bolo zastavené ponorením sklíčka do vody. Sklíčka boli dofarbené pomocou Nuclear Fast Red (Sigma) a pred ukotvením pomocou Aqua Mount (Baxter) premyté vodou. V červenej pulpe sleziny bolo detegované farbenie pri požití tejto protilátky, ale nie pri použití králičieho polyklonálneho Ig (proti iným proteínom) alebo pri použití nepurifikovaného séra získaného z rovnakého jedinca pred imunizáciou.

Hneď ako bola raz pre myšacie sérum stanovená špecifická reaktivita proti a_D, bolo toto sérum použité na zničenie rôznych lymfoidných a nelymfoidných tkanív. V totožných experimentoch boli ako kontroly využité monoklonálne protilátky rozoznávajúce polypeptidy CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Značením rezov z normálnej sleziny uskutočňovaným pomocou polyklonálneho séra proti a_D a pomocou monoklonálnych protilátok proti CD18, CDlla, CDllb a CDllc, boli získané tieto výsledky. Distribúcia markéra pozorovaná pri použití polyklonálneho séra proti a_D bola odlišná od distribúcie značky namierenej proti polypeptidom CD18, CDlla, CDllb a CDllc. Existuje odlišná distribúcia značky pri niektorých bunkách umiestených v hraničnej zóne bielej pulpy a odlišná distribúcia značky pri periférnych bunkách hraničnej zóny. Takáto distribúcia nebola pozorovaná pri použití iných protilátok. Jednotlivé bunky roztrúsené v červenej pulpe boli takisto označené. Tieto bunky môžu, ale nemusia, byť z rovnakej populácie alebo podskupiny ako bunky označené pomocou protilátok proti CDI la a CD18.

Značenie protilátkou proti CDllc ofarbilo nejaké bunky v hraničnej zóne, ale nebol pozorovaný, v porovnaní s použitím polyklonálneho séra proti a_D, zreteľný kruh okolo bielej pulpy. Takisto distribúcia značky v červenej pulpe nezodpovedala distribúcii značky pri použití polyklonálneho séra proti a_D.

Distribúcia značky pozorovaná pri použití polyklonálneho séra proti a_D bola teda jedinečná v porovnaní s distribúciou pozorovanou pri použití protilátok proti iným integrínom β₂ CDIla, CD11 b, CDllc a CDI8. Tieto výsledky naznačujú, že in vivo distribúcia polypeptidu (i_D v organizme človeka je odlišná od distribúcie iných integrínov β₂.

Charakterizácia expresie ľudského polypeptidu a_D uskutočňovaná pomocou monoklonálnych protilátok

Pri analýze expresie ľudského polypeptidu a_D uskutočňovanej imunocytochemicky na zmrazených tkanivových rezoch a pomocou prietokovej cytometrie na bunkových líniách a leukocytoch periférneho krvného obehu boli použité protilátky sekretované hybridómami 169A a 169B. V obidvoch experimentoch boli supematanty získané kultiváciou hybridómov použité v nezriedenej forme .

Značenie tkanív

Všetky značenia, okrem značenia rezov pečene uskutočňovaného podľa protokolu opísaného ďalej, boli uskutočňované opísaným postupom. Po fixácii acetánom boli rezy počas 15 minút pri izbovej teplote premyté v roztoku 1 % H₂O₂ a 1 % azidu sodného v TBS. Po označení primárnou protilátkou bola na rezy na 30 minút pri izbovej teplote aplikovaná králičia protilátka namierená proti myšaciemu IgG konjugovaná s peroxidázou. Rezy boli trikrát premyté v pufri TBS. S cieľom detekcie sekundárnej protilátky bola použitá inkubácia s prasacou protilátkou (konjugovanou s peroxidázou) namierenou proti králičej protilátke, uskutočňovaná pri izbovej teplote počas 30 minút. Rezy boli potom trikrát premyté v pufri TBS, bol k nim pridaný substrát AEC (Vector Labs) a reakcia bola ponechaná prebiehať. Rezy boli dofarbené Hematoxylínom Gill č. 2 (Sigma) a potom, pred vysušením a ukotvením, boli premyté vodou.

V rezoch zo sleziny bola väčšia expresia lokalizovaná v červenej pulpe a to na bunkách morfologicky zodpovedajúcich granulocytom a makrofágom. Označené bolo veľké množstvo granulocytov, zatiaľ čo signál poskytla len časť z makrofágov. Pomocou protilátok proti a_D bolo slabo ofarbené malé množstvo folikulárnych dendritických buniek prítomných v bielej pulpe. Farbenie pomocou protilátok proti CDI la a CD 18 poskytlo signál tak v červenej, ako aj v bielej pulpe. Farbenie pomocou protilátok proti CDllc bolo výraznejšie pri veľkých bunkách prítomných v bielej pulpe sleziny (predpokladá sa, že ide o makrofágy) a v hraničnej zóne obklopujúcej bielu pulpu; bola tiež pozorovaná difúzne rozptýlená značka v červenej pulpe. Zdá sa, že distribúcia polypeptidu CD11 b v červenej pulpe sa prekrýva, ale nie je identická, s distribúciou a_D, ale nie je pozorovaná distribúcia CDI lb v bielej pulpe.

Bola porovnávaná expresia integrínov v normálnom a (reumatodnom) artritickom tkanive synovia. V zdravom (normálnom) tkanive bola, pri značení akoukoľvek protilátkou namierenou proti integrínu (vrátane protilátok špecificky imunoreaktívnych proti CDIla, CD11 b, CDllc, CD 18 a tiež a_D), pozorovaná minimálna odpoveď s distribúciou značky na rezidentných bunkách, prevažne makrofágoch. Pri zapálenom tkanive bola expresia všetkých in tegrínov viac lokalizovaná, a to na bunkách nazhlukovaných okolo lymfatických ciev. Zatiaľ čo distribúcie expresie a_D CDllb boli podobné, ukázalo sa. že polypeptid CDllc nie je exprimovaný v takej veľkej miere a jeho expresia je obmedzená len na podskupinu leukocytov.

Na tkanivových rezoch z pečene psa bola na pečeňových makrofágoch, čiže Kuppferových bunkách, pozorovaná expresia CDllb, ale nie expresia polypeptidu a_D. Značenie rezov z pečene „zdravých“ ľudí (uskutočňované postupom opísaným pre značenie rezov z psej pečene, pozri skôr) potvrdilo konzervovanosť distribúcie tejto značky u človeka. Navyše tu bola detegovaná nízka hladina expresie CDI lc. V rezoch z pečene pacientov postihnutých hepatitídou bola intenzita značky pre všetky leukointegríny vyššia, ako to bolo pri „normálnych“ pečeniach, zatiaľ čo na povrchu granulocytov a makrofágov bola v týchto vzorkách detegovaná expresia polypeptidu a_D.

Pri farbení pomocou protilátok proti a_D bolo na rezoch z hrubého čreva zdravých ľudí pozorované len nevýrazné farbenie; bola pozorovaná slabá intenzita značky na bunkách hladkého svalstva a leukocytoch. Na rezoch získaných od pacientov postihnutých Crohnovou chorobou bola detegovaná zvýšená hladina expresie všetkých leukointegrínov.

Na rezoch z pľúc zdravých jedincov bolo pozorované obmedzené množstvo buniek pozitívnych na prítomnosť a_D; tieto bunky zodpovedali morfologicky makrofágom a neutrofilom. Na tkanivových rezoch z pľúc postihnutých rozdutím bol výskyt značky proti a_D pozorovaný pri neutrofiloch a makrofágoch obsahujúcich hemosiderín, čo je pigment obsahujúci železo. Táto skutočnosť naznačuje pohltenie červených krviniek týmito bunkami.

Expresia integrínov bola takisto analyzovaná na tkanivových rezoch mozgu zdravých jedincov a tkanivových rezoch z lézií od pacientov postihnutých roztrúsenou sklerózou (MS - multiple sclerosis). V tkanivových rezoch zo zdravých jedincov bolo farbenie a_D menej intenzívne ako farbenie CDI la, CDI lb a CDI lc a toto farbenie bolo obmedzené na bunky, morfologicky a prítomnosťou CD68, zodpovedajúce mikrogliálnym bunkám. Bunky exprimujúce CDllb boli sitované v miestach obklopujúcich cievy a rozptýlené v tkanive. CDllc⁺ bunky boli situované vnútri cievy, zatiaľ čo aD⁺ bunky obklopovali tieto cievy. V tkanivových rezoch z mozgu pacientov postihnutých MS bola expresia polypeptidu aD zistená tak na mikrogliálnych bunkách, ako aj na časti leukocytov iných ako makrofágov; a_D ⁺bunky boli situované vnútri lézií a takisto v kortexe týchto lézií. Signál pre u_D mal rovnakú intenzitu ako signál pre CDllc, ale jeho intenzita bola nižšia, ako keď ide o signál pre CDI lb.

Pomocou protilátok proti leukointegrínom a CAM boli analyzované vzorky tkanivových rezov tak hrudnej aorty, ako aj brušnej aorty z PDAY (Patobiologické Determinanty Aterosklerózy u mladých ľudí; LSU Medical Center). Skúmané lézie zodpovedali aterosklerotickým platom, ktoré pod intimou obsahovali agregáty veľkých penových buniek (prevažne makrofágov „napchatých“ lipidmi) a boli infiltrované menšie leukocyty. Štúdie, pri ktorých boli samostatne použité protilátky špecificky namierené proti a_Dalebo iným a reťazcom integrínov β₂ (CDIla, CDllb a CDllc) spolu s protilátkou proti markéru makrofágov (CD68) odhalili, že väčšina makrofágov „napchaných“ lipidmi exprimovala a_D a CD18 v priemernej hladine, zatiaľ čo expresia CDIla bola slabá a expresia CDllc bola v rozmedzí slabá až stredná. CDllb bol exprimovaný veľmi slabo, a to len na časti makrofágov.

S cieľom zistiť relatívnu lokalizáciu antigénu u_D a ICAM-R, boli na rezoch aorty uskutočnené štúdie, pri kto

SK 283135 Β6 rých bolo použité súčasné značenie dvoma značkami. Keďže penové bunky v týchto rezoch boli značené protilátkou Ham 56, špecificky namierenou proti markéru makrofágov, ale neboli značené protilátkami proti aktívnu buniek hladkej svaloviny, bolo stanovené, že penové bunky neboli odvodené od subintimálnych buniek hladkej svaloviny. CD68⁺ makrofágy exprimujúce aD boli obklopené malými leukocytmi exprimujúcimi ICAM-R; tieto leukocyty boli takisto prítomné medzi CD68⁺ makrofágmi exprimujúcimi aD. Zdalo sa, že existuje obmedzené množstvo malých leukocytov, ktoré neexprimujú CD68, ale sú značené tak protilátkami proti a_D, ako aj protilátkami proti ICAM-R.

Distribúcia polypeptidu a_D na leukocytoch prítomných v tkanivách zdravých jedincov sa prekrývala, ale nebola identická s distribúciou CDllb a CDllc, dvoma ďalšími a reťazcami leukointegrínov, ktoré boli už predtým charakterizované ako reťazce, ktorých expresia je omedzená na leukocyt. Bunková morfológia naznačila, že značkou namierenou proti a_D sú farbené predovšetkým makrofágy a granulocyty a obmedzene lymfocyty. Všeobecne je možné povedať, že zápal v tkanive zvyšuje, spolu s výskytom vyššej intenzity značenia leukointegrínov, množstvo aj počet typov leukocytov pozorovaných v príslušnom tkanive. Keďže bunková a priestorová distribúcia leukointegrínov nebola v patologických tkanivách identická, bolo odvodené, že každý člen rodiny integrínov, vrátane a_D, má, v danom kontexte, odlišné funkcie a ligandy.

Zaujímavé je, že expresia polypeptidu a_D v aterosklerotických léziách bola výraznejšia ako expresia CDlla, CDllb a CDllc, čo naznačuje, že a_D môže hrať kľúčovú úlohu vo vytváraní týchto lézií. Spoločná distribúcia a_D ⁺ a ICAM-R⁺ buniek, podporené dôkazmi naznačujúcimi možnosť interakcie medzi a_D a ICAM-R naznačuje, že polypeptid a_D môže, v skorých štádiách, týchto lézií, hrať úlohu pri infiltrácii leukocytov alebo pri ich aktivácii.

Značenie bunkových línii a leukocytov periférnej krvi

Bunková línia promyeloidných monocytov HL60 značená protilátkami 169A a 169B bola analyzovaná s využitím FACS. Expresia a_D na povrchu týchto buniek je negatívne ovplyvnená stimuláciou pomocou PMA, ktorý indukuje difereciáciu po makrofágovej dráhe, ale nie ovplyvnená stimuláciou DMSO, ktorý indukuje difereciáciu po dráhe granulocytov [Collins a ďalší, Blood 70 : 1233 až 1244 (1987)]. Distribúcia značky bola (v analýze s využitím FACS) pri použití protilátok 169A a 1698 pri stimulácii buniek pomocou PMA odlišná od distribúcie značky získanej pri použití monoklonálnych protilátok namierených proti CD1 lb a CD1 lc. Bunková línia monocytov THP-1 je takisto slabo značená protilátkami 169A a 169B. Navyše časť z leukocytov periférnej krvi patriacich do oblasti („gate“) lymfocytov a monocytov sa pri analýze s využitím FACS javila len slabo pozitívna. Časť monocytov periférnej krvi bola slabo značená protilátkami 169A a 169B, zatiaľ čo na povrch B-lymfocytov nebola zistená žiadna expresia a_D. Časť CD8 pozitívnych T-lymfocytov bola tiež a_Dpozitívna. Ďalej sa nepodarilo protilátkami 169A a 169B detegovať antigén na líniách B-buniek JY, Ramos, na línii bazofilov KU812 a na líniách T-buniek Jurkat, SKW a Molt 16.

Na základe výsledkov analýz s bunkami HL60 boli, pomocou gradientovej centrifugácie s nosičom Ficoll/Hypaque a následnou analýzou červených krviniek, z periférnej krvi izolované granulocyty. Všetky izolované preparáty obsahovali viac ako 90 % PMN (polymorfonukleárnych leukocytov), ako bolo zistené vizualizáciou morfológie jadier v kyseline octovej. Jednotlivé populácie boli vystavené na 30 minút pôsobeniu 50 ng/ml alebo 10'⁸ M formyl peptidu (fMLP), aby sa uvoľnili potencionálne spôsoby integrínov. Nestimulované populácie mali v porovnaní s IgGl kontrolou síce nízku, ale štatisticky významnú expresiu antigénov 169A a 169B, ktorá po stimulácii rástla. Hladiny expresie a_D a CD1 lc na povrchu polymorfonukleámych leukocytov si zodpovedali viac, ako tieto hladiny pozorované pre bunky HL60. Protilátka 169B bola potom použitá na precipitáciu heterodimémej molekuly z biotinylovaných PMN lyzovaných detergentom. Podjednotky so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150, resp. 95 kD zodpovedali veľkosti a_D, resp. CD 18.

Výskyt a_D na PMN nemohol byť predpovedaný na základe znalosti a_D u psov. Psie neutrofily, na rozdiel od ľudských náprotivkov, exprimujú na pomocných T-bunkách marker CD4 a tiež integrín VLA-4 a teda môžu byť v organizme psov iné ligandy a funkcie, ako je to u človeka.

Značenie subpopulácií PBL

Táto štúdia poslúžila na určenie distribúcie integrínov β₂ v leukocytoch ľudskej periférnej krvi. Okrem toho bola porovnávaná hustota a_D v porovnaní s inými integrínmi β₂. Nakoniec bola tiež vyhodnotená okamžitá regulácia expresie a_D v purifikovaných ľudských eozinofiloch.

Leukocyty ľudskej periférnej krvi boli izolované centrifugáciou v hustotnom gradiente a rozdeleného do frakcie mononukleárnych buniek (s obsahom monocytov, lymfocytov a bazofilov) a do frakcie granulocytov (neutrofily a eozinofily) [Wamer a ďalší, J. Immunol. Meth. 105 :107 -110 (1987)]. Pre niektoré experimenty boli eozinofily purifikované imunomagneticky na čistotu väčšiu ako 95 % použitím CD16 [Hansel a ďalší, J. Immunol. Meth. 122 : 97-103 (1989)]. Kožné žime bunky boli enzymaticky oddelené z ľudskej kože a namnožené, ako to bolo opísané [Lawrence a ďalší, J. Immunol. 139 : 3062 - 3069 (1987)].

Bunky boli značené vhodnými riedeniami monoklonálnych protilátok špecificky namierených proti CDlla (MHM24), CD11B (H5A4), CD1 lc (BU-15) alebo proti a_D(169A). Ako kontrola bol zaradený myšací IgGl. Bunky boli premyté a potom inkubované s kozou protilátkou namierenou proti myšacím IgG konjugovanou s fykoerytrínom. V niektorých pokusoch boli bunky inkubované v nadbytku myšacieho IgG a myšacej monoklonálnej protilátky alebo kozej polyklonálnej protilátky, ktoré boli značené FITC (špecifické pre antigén konkrétnej bunky) (napríklad CD3, CD4 alebo CD8 pre T-bunky; CD16⁺ lymfocyty pre NK bunky; anti-IgE pre bazofily) [Bochner a ďalší, J. Immunol. Meth. 125 : 265 - 271 (1989)]. Potom boli tieto vzorky skúmané prietokovou cytometriou (Coulter EPICS profil) pri použití vhodného „gatingu“, aby mohli byť identifikované podskupiny buniek.

V experimentoch s ľudskými eozinofilmi bola skúmaná okamžitá aktivácia expresie a_D. Bunky boli stimulované 15 minút pri 37 °C esterom forbolu (10 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) [Schall, Cytokine 3 : 165 - 183 20 (1991)] alebo interleukínom (10 ng/ml) a potom boli značené rôznymi monoklonálnymi protilátkami, ako je to opísané.

Výsledky ukázali, že polypeptid bol prítomný na všetkých eozinofiloch, bazofiloch, neutrofiloch, monocytoch a NK-bunkách periférnej krvi. Tiež malý podiel (približne 30 %) CD8⁺ lymfocytov vykazoval expresiu aD. Kožné žime bunky a CD4⁺ lymfocyty podjednotku aD neexprimovali. Všeobecne sú CDlla a CDllb prítomné na leukocytoch vo vyššej hustote ako a_D. Podjednotka a_D je exprimovaná na relatívne nízkej hladine expresie CDllc. Pokiaľ ide o leukocyty, je polypeptid a_D s najväčšou hustotou exprimovaný na monocytoch a CD8⁺ bunkách, zatiaľ čo eozinofily majú úroveň expresie a_D najnižšiu. Hladina expresie na neutrofiloch, bazofiloch a NK-bunkách je stredná.

Aktivácia eozinofilov periférnej krvi vyvolaná pôsobením CC-chemokinu RANTES nespôsobuje zmenu v expresii žiadneho z integrinov β₂. Pôsobenie esteru forbolu malo však za následok dvoj- až trojnásobné zvýšenie expresie CDllb a a_D, ale neovplyvnilo expresiu CDlla alebo CD 11 c. Pôsobením interleukínu IL-5 sa selektívne aktivovala expresia podjednotky CDllb, pričom nebola ovplyvnená hladina expresie iných integrínových podjednotiek.

Získané výsledky ukázali, že podjednotka a_D je pri leukocytoch periférnej krvi exprimovaná v približne rovnakom množstve ako podjednotka CD 11 c. Najvyššia hladina expresie bola zistená na monocytoch a populácii CD8⁺ lymfocytov. Žírne bunky ľudskej kože polypeptid a_D neexprimovali. Pokiaľ ide o purifikované eozinofily, boli vnútri cytoplazmy objavené predvytvorené zásoby podjednotiek CD 11 b a ct_D. Z pozorovanej rozdielnej aktivácie interleukínom IL-5 oproti PMA sa usudzuje, že tieto zásoby podjednotiek sú od seba oddelené.

Distribúcia značky pri subpopulácii leukocytov periférnej krvi (PBL) bola tiež určovaná metódou prietokovej cytometrie pri použití kombinácie „gatingu“ (definovanie jednotlivých bunkových typov na základe hodnôt rozptylu svetla meraných v priamom smere a v uhle 90 °C) a povrchových značiek, ako to bolo opísané. Táto metóda bola použitá pri pokuse presnejšie definovať populáciu lymfocytov, ktorá exprimuje 169 A/B. PBL boli izolované pomocou Ficollu, opísaným postupom, a jednotlivo označené protilátkami 169A, 169B a monoklonálnymi protilátkami proti CD 14 (značka monocytov a makrofágov), CD20 (B-bunky), CD56 (NK-bunky), receptora α/β T-buniek (T-bunky), CD 16 (neutrofily a NK-bunky) a a4 (negatívny markér neutrofilov). Jednotlivé oblasti („gates“) boli definované na základe buniek a distribúcie značiek.

Získané výsledky naznačujú, že bunky v oblasti („gate“) CD14⁺ monocytov majú nízku hladinu značenia protilátkami 169A a 169B. Bimodálna distribúcia značky pozorovaná v predchádzajúcich experimentoch v oblastiach („gate“) lymfocytov bola rozlíšená pri zvýšenom rozptyle meranom v priamom smere. Zmiešaná TCR⁺/CD20⁺ buniek mala nízku, ale homogénnu hladinu expresie antigénov pre 169A/B. Populácia mapovaná pri mierne zvýšenom bočnom rozptyle (bunková komplexita), ktorá bola pre CD56 z 50 % pozitívne označená, sa ukázala jasne 169A/B negatívnou populáciou. Negatívna populácia nebola takisto rozpoznaná pomocou protilátok namierených proti TCR, CD20, CD 14 alebo CD 16.

Distribúcia a_D v synoviu

S cieľom určiť distribúciu polypeptidu a_D, ďalších integrínov β₂ a ich príslušných receptorov pri zápalovej a nezápalovej synovii boli použité imunohistologické štúdie využívajúce monoklonálne protilátky namierené proti rôznym integrínom a supergénovým rodinám imunoglobulínov. Expresia proteínov bola stanovovaná v normálnych, osteoartritidických a reumatoidných tkanivových kultúrach synovii.

Získané výsledky naznačujú, že vrstva epiteliálnych buniek synovia má vysokú úroveň expresie VCAM-1, CDllb/CD18 a a^CDIS. V týchto bunkách je obmedzená expresia CDllc/CD18 a expresia CDlla/CD18 nie je väčšinou detegovaná. Pri reumatoidnom artritickom zápale synoviálnej blany vzrastá expresia integrinu β₂ na synoviálnych bunkách úmerne stupňu hyperplázie. Množstvo buniek exprimujúcich CD1 lc sa podstatne zväčšuje, čím sa blíži množstvo buniek exprimujúcich CDllb a a_D, ale nie je pozorované zvýšenie expresie CD1 la.

V subepiteliálnych oblastiach tkanív sú CD3/CD1 la/ICAM-R⁺ lymfocyty, vo forme agregátov a difúznych infiltrátov, rozstrúsené medzi CD68/CD1 lb/aD⁺ makrofágmi. Na vysoký počet agregátov poukazuje intenzívne značenie aD, a to hlavne v oblastiach bohatých na T-bunky.

Synoviálny endotel premenlivo exprimuje ICAM-1 a ICAM-2, s minimálnymi stopami expresie ICAM-R.

Tieto výsledky dokazujú, že synoviálne makrofágy a makrofágom podobné synoviálne bunky konštitutívne exprimujú vysoké množstvo podjednotiek CDllb a a_D integrínov β₂. Pri zápale synoviálnej blany dochádza, tak v epiteliálnych, ako aj v subepiteliálnych oblastiach, k veľkému pomnoženiu týchto populácií buniek, súčasne so zrejmým nárastom v expresii CD 11 c. Špecifické populácie reumatoidných synoviálnych T-lymfocytov exprimujú nielen CD1 la a ICAM-R, ale tiež veľké množstvo a_D. Táto molekula, ako bolo ukázané, je exprimovaná v nízkej úrovni na lymfocytoch periférnej krvi.

Príklad 17

Izolácia klonov potkanej cDNA

Vzhľadom na existenciu psích a ľudských podjednotiek a_D boli uskutočňované pokusy izolovať homológne gény z iných druhov, vrátane laboratórnych potkanov (tento príklad) a myší (príklad 17, pozri skôr).

Čiastočná sekvencia potkanej cDNA majúca homológiu k ľudskému génu pre a_D bola získaná využitím lambdadtlO knižnice z potkanej sleziny (Clontech). Knižnica bola vysiata v koncentrácii 2 x 10⁴ pfu/miska na LBM/agarových miskách s priemerom 150 mm. Knižnica bola prenesená na membránu Hybond (Amersham), denaturovaná 3 minúty, 3 minúty neutralizovaná a 5 minút premývaná puframi opísanými v štandardnom protokole [Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: a laboratory manual, strana 2.110], Membrány boli okamžite prenesené do Stratalinkéra (Stratagene) a DNA zosieťovaná pomocou autozosieťovacieho nastavenia. S cieľom dosiahnuť podmienky, pri ktorých je pre hybridizáciu potrebný nízky, resp. vysoký stupeň komplementárny medzi sondou testovanou sekvenciou, boli membrány prchybridizované a hybridizované v 30 %, resp. 50 % formamide. Membrány boli na začiatku testované pomocou sondy značenej ³²P získanej z cDNA kódujúcej ľudský a_D, zodpovedajúcej oblasti od bázy 500 do 2100 v klone 19A2 (SEK. ID. č.: 1). Sonda bola pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označená. Filtre boli premyté v 2 x SSC pri teplote 55 °C.

Boli identifikované dva klony, označené 648.3 a 705.1, ktoré mali sekvenčnú homológiu k sekvencií ľudského a_D, ľudského CDllb a ľudského CD 11 c. Obidva klony zodpovedajú 3'-oblasti génu pre ľudský a_D a začínajú od bázy 1871 a pokračujú až k báze 3012 pre kloň 648.3, resp. od bázy 1551 až k 3367 pre kloň 705.1.

S cieľom získať úplnejšiu potkaniu sekvenciu, zahrnujúcu aj oblasť zodpovedajúcu 5' koncu, bola, postupom rovnakým ako pre prvé testovanie, opäť testovaná rovnaká knižnica, ale pri tomto testovaní boli použité myšacie sondy získané z klonu A1160 (pozri príklad 17, pozri ďalej). Pomocou druhého testovania boli vyselektované jednotlivé izolované plaky, ktoré boli uchované ako jednotlivé klony na miskách s LBM/agar. S cieľom vytvoriť DNA použiteľnú na sekvenovanie, boli v štandardnej PLR reakcii použité sekvenačné priméry 434FL a 434FR (SEK. ID. č.: 34, resp. 35).

5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3 ’ (SEK. ID. č.: 34)

5'-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3' (SEK. ID: í.: 35)

DNA získaná metódou PCR bola purifikovaná pri použití kolóny Quick Spin (Qiagen) podľa protokolu odporúčaného výrobcom. Boli identifikované dva klony, označené 741.4 a 741.11, ktorých sekvencie sa prekrývali so sekvenciami klonov 684.3 a 705.1; v prekrývajúcich sa oblastiach boli klony 741.4 a 741.11 100 % homológne s klonmi 684.3 a 705.1. Zložená potkania cDNA homológna k ľudskému génu pre a_D, je zobrazená v SEK. ID. č.: 36; predpovedaná aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEK. ID: č.: 37.

Klonovanie 5' konca sekvencie kódujúcej potkaní a_D

Fragment 5' konca cDNA pre gén kódujúci potkaní a_Dbol získaný z potkanej sleziny s využitím klonovacieho kitu RAČE (Clontech) postupom odporúčaným výrobcom. Použité oligonukleotidy špecifické pre tento gén boli označené 741.11 #2R a 741.2# 1R (SEK. ID. č.: 59, resp. 58).

5'-CCAAAGCTGGXTGCATCCTCTC-3' (SEK. Dl. č.: 59)

5'-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3' (SEK. ID. č.: 58)

Oligonukleotid 741.11#2R zahrnuje bázy 131 až 152 v SEK. ID. č.: 36 v opačnej orientácii a oligonukleotid 741.2&1R zahrnuje bázy 696 až 715 v SEK. ID. č.: 36 tiež v opačnej orientácii. Primárna reakcia PCR bola uskutočnená pri použití oligonukleotidu 741.2#1R vymedzujúceho 3' koniec kódujúceho vlákna (najbližšie 3'-koncu). Následná druhá reakcia PCR bola uskutočnená pri použití oligonukleotidu 741.11#2R a DNA získanej z prvej reakcie. Na 1 % agarózovom géli bol detegovaný prúžok s veľkosťou približne 300 párov báz.

Produkt druhej reakcie PCR bol, podľa protokolu odporúčaného výrobcom, zaklonovaný do plazmidu pGRTAII (Invitrogen). Do každej z 96 jamiek (s guľatým dnom) na doštičke na tkanivové kultúry boli do 100 μΐ LBM média obsahujúceho 1 μΐ zásobného roztoku karbenicilínu s koncentráciou 50 mg/ml a 1 μΐ kultúry fágu Ml3 K07 pridané biele (pozitívne) kolónie. Zmes bola inkubovaná 30 minút až jednu hodinu pri teplote 37 °C. Po tejto inkubácii bolo pridaných 100 μΐ LBM média (obsahujúceho 1 μΐ zásobného roztoku karbenicilínu s koncentráciou 50mg/ml a zásobný roztok kanamycínu s koncentráciou 10 mg/ml v riedení 1.250) a inkubácia pokračovala pri teplote 37 °C cez noc.

Sterilnou kovovou transferovou vidlicou bol supematant z 96-jamkovej doštičky prenesený na štyri nylonové filtre Hybond (Amersham). Filtre boli denaturované, neutralizované a DNA zosieťovaná podľa štandardných protokolov. Filtre boli prehybridizované pri stálom trepaní v 20 ml prehybridizačného pufra (5 x SSPE; 5 x Denhardts; 1 % SDS; 50 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií) pri teplote 50 °C počas niekoľkých hodín.

Oligonukleotidové sondy 741.11#1 a 741.11#1R (SEK. ID. č.: 56 a 57), zahrnujúce páry báz 86 až 105 (SEK. ID. č.: 36) v priamej a reverznej orientácii, boli rádioaktívne označené nasledujúcim spôsobom.

5-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3' (SEK. ID. č.: 56)

5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3' (SEK. ID. č.: 57)

Približne 66 ng oligonukleotidovej DNA bolo dve minúty pri teplote 65 °C zahrievaných v 12 μΐ dH₂O. Do skúmavky boli pridané 3 μΐ 10 mCi/ml τ-³²Ρ-ΑΤΡ spolu so μΐ 5 x pufra na kinázu (Gibco) a 1 μΐ DNA kinázy T4 (Gibco). Zmes bola inkubovaná 30 minút pri teplote 37 °C. Po skončení inkubácie bolo 16 μΐ každej zo značených oligonukleotidových sond pridaných k filtrom v prehybridizačnom pufri a inkubácia pokračovala pri 42 °C cez noc. Filtre boli trikrát, počas 5 minút pri izbovej teplote, premývané roztokom 5 x SSPE s 0,1 % SDS a 6 hodín autorádiografované. Pozitívne klony boli namnožené a DNA bola purifikovaná kitom na minipreparáciu DNA „Mágie Mini“ (Promega) podľa výrobcom odporúčaného protokolu. Pre sekvenovanie bol vybraný kloň 2F7 a tento kloň mal, v prekrývajúcej sa oblasti, 100 % homológiu ku klonu 741.11. Kompletná potkania nukleotidová sekvencia génu pre a_D je zobrazená v SEK. ID. č.: 54; aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 55.

Charakteristiky potkanej cDNA a aminokyselinovej sekvencie

Nukleotidová ani aminokyselinová sekvencia potkanej a_D podjednotky integrínu β₂ neboli predtým publikované. Porovnanie týchto sekvencií s publikovanými sekvenciami kódujúcimi podjednotky a ľudských integrínov fi₂ naznačuje, že izolovaný potkaní kloň podjednotky a_D má veľmi podobnú nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu.

Na úrovni sekvencie nukleotidov má izolovaný kloň potkanej cDNA 80 % zhodu v porovnaní s cDNA pre ľudský a_D; 68 % zhodu s cDNA pre ľudský CD1 lb; 70 % zhodu s cDNA pre ľudské CDllc a 65 % zhodu s cDNA pre myšací CD1 la.

Na úrovni sekvencie aminokyselín má predpokladaný potkaní polypeptid, kódovaný izolovanou cDNA, 70 % zhodu v porovnaní s ľudským polypeptidom a_D; 28 % zhodu s ľudskou podjednotkou CD 11a; 58 % zhodu s ľudskou podjednotkou CDllb; 61 % zhodu s ľudskou podjednotkou CDllc; 28 % zhodu s myšacou podjednotkou CDlla a 55 % zhodu s myšacou podjednotkou CD1 lb.

Príklad 18

Produkcia a charakterizácia protilátok špecificky namierených proti podjednotke a_D hlodavcov

A. Protilátky namierené proti fúznym proteínom doména I potkanieho polypeptidu aD/HuIgG4

Keďže bolo dokázané, že doména I ľudského integrínu β₂ sa zúčastňuje na väzbe ligandu, predpokladalo sa to isté pre potkaní proteín a_D. Imunošpecifické monoklonálne protilátky proti a_D by preto mali byť užitočné pri potkaních modeloch ľudských chorôb, pri ktorých hrá úlohu väzba podjednotky a_D.

Oligonukleotidy alfa-DI5 (SEK. ID. č.: 87) a alfa-DI3 (SEK. ID. č.: 88) boli vytvorené zo sekvencie potkanej a_Dzodpovedajúcej oblasti bázy 469 až 493, resp. 1101 až 1125 (v reverznej orientácii) v SEK. ID. č.: 54. Oligonukleotidy boli použité v štandardnej PCR reakcii na vytvorenie fragmentu DNA kódujúceho potkaní a_D s obsahom domény I oblasti báz 459 až 1125 v SEK. ID. č.: 54. Produkt PCR bol vyklonovaný do vektora pCRTAII (Invitrogen) podľa výrobcom odporúčaného protokolu. Bola vybraná pozitívna kolónia a z jej rozrastenej kultúry bola, pri použití kitu na izoláciu DNA „Midi Prep“ firmy Qiagen (Chatswoth, GA) podľa protokolu výrobcu izolovaná DNA. DNA bola klasicky naštiepená reštrikčnými enzýmami Xhol a BglII. Vzniknutý fragment s veľkosťou 600 báz bol izolovaný z gélu a potom zaklonovaný do expresívneho vektora pDCSl/HuIgG4. Pozitívne kolónie boli selektované a namnožené a pri použití kitu na izoláciu DNA „Maxi“ firmy Quiagen z nich bola purifikovaná DNA.

Bunky COS boli v polovičnej konfluencii vysiate na misky s priemerom 100 mm a kultivované cez noc pri teplote 37 °C v 7 % CO₂. Bunky boli 1 x prepláchnuté 5 ml média DMEM. K 5 ml DMEM bolo pridaných 50 pl DEAE-Dextánu, 2 pl chlorokinu a 15 pg potkanej DNA kódujúcej fúzny proteín doména I polypeptidu απ/Hu IgG4 opísaný skôr. Táto zmes bola pridaná k bunkám COS a bunky boli inkubované tri hodiny pri teplote 37 °C. Médium bolo odstránené a bunky boli presne jednu minútu inkubované v 5 ml 10 % DMSO v CMF-PBS. Bunky boli raz mierne prepláchnuté v DMEM. K týmto bunkám bolo pridaných desať mililitrov DMEM obsahujúceho 10 % FBS a inkubácia pokračovala cez noc pri teplote 37 °C v 7 % CO₂. Ďalší deň bolo médium nahradené čerstvým médiom a inkubácia prebiehala nasledujúce tri dni. Toto médium bolo odobrané a do misky bolo pridané čerstvé médium. Po troch dňoch bolo médium opäť odobrané a misky boli vyhodené. Postup bol opakovaný, dokiaľ neboli z kultúry získané 2 litre supematantu.

Supernatant získaný opísanou metódou bol nanesený na kolónu Prosep-A (Bioprocessing Limited) a proteín bol purifikovaný opísaným postupom.

Kolóna bola najprv premytá 15-násobným objemom premyvacieho pufra obsahujúceho 35 mM Tris a 150 mM NaCl s pH - 7,5. Supernatant bol nanášaný pri rýchlosti menšej ako približne 60 objemov kolóny za hodinu. Potom bola kolóna premytá 15-násobným objemom premývacieho pufra, 15-násobným objemom roztoku 0,55 M dietanolamínu s pH = 8,5 a 15-násobným objemom roztoku 50 mM kyseliny citrónovej s pH = 5,0. Proteín bol eluovaný roztokom 50 mM citrónovej kyseliny s pH = 3,0 a ďalej neutralizovaný roztokom 1,0 M Tris a dialyzovaný do sterilného roztoku PBS.

Doména I potkanieho proteínu u_D bola analyzovaná postupom opísaným v príklade 14. Detegovaný proteín putoval rovnakým spôsobom ako proteín ľudskej domény I.

B. Produkcia monoklonálnych protilátok namierených proti fúznemu proteínu doména I potkanieho polypeptidu aD/HuIgG4

Myši boli jednotlivo imunizované 50 pg purifikovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu afrHulgGd, ktorý bol najprv emulgovaný rovnakým objemom Freundovho kompletného adjuvans (Sigma). Približne 200 pl tohto preparátu bolo na štyroch miestach vstreknutých do chrbta a boku myši. O dva týždne neskôr bola mys druhý raz injikovaná 100 pl antigénu doména I potkanieho polypeptidu a[/HuIgG4 (v množstve 50 pg/ml), ktorý bol predtým emulgovaný rovnakým objemom Freundovho nekompletného adjuvans. Počas nasledujúcich dvoch týždňov bolo myšiam intravenózne aplikovaných 50 pg antigénu v 200 pl roztoku PBS.

S cieľom zistiť titer krvného séra imunizovaných myší bol desať dní po tretej imunizácii uskutočnený retroorbitálny odber krvi. Krv sa nechala zraziť, sérum bolo izolované centrifugáciou a použité na imunoprecipitáciu proteínov zo slezinných buniek potkanov značených biotínom (BIP). Sérum získané z každej myši imunoprecipitovalo proteínové prúžky s molekulovou hmotnosťou predpokladanou pre potkaní a_D a CD18. Jedna z myší bola vybraná na fúziu a štvrtý raz injikovaná, opísaným postupom (pre tretiu injekciu).

Protilátky v supematantoch získaných kultiváciou hybridómov boli testované nasledujúcim spôsobom. Štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) boli pri teplote 4 °C potiahnuté kozou protilátkou namierenou proti myšacím imunoglobulínom lgA, IgG alebo IgM (Or ganon Teknika) v množstve 50 μΐ/jamka, zriedenou v pomere 1 : 5000 v uhličitanovom pufri s pH = 9,6. Doštičky boli trikrát premyté pufrom PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBST) a bolo do nich pridaných 50 pl supematantu získaného z bunkových kultúr. Po inkubácii prebiehajúcej 30 minút pri teplote 37 °C a premytí, opísaným postupom, bola pridaná kozia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou namierená proti myšaciemu IgG9(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zriedená v pomere 1 : 3500 v roztoku PBST. Misky boli inkubované, opísaným postupom, a štyri razy premyté roztokom PBST. Hneď potom bolo pridaných 100 pl substrátu, ktorý obsahoval o-fenyléndiamín v koncentrácii 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 pl/ml 30 % H₂O₂ v 100 mM citrátu s pH = = 4,5. Farebná reakcia bola po 5 minútach zastavená prídavkom 50 pl 15 % II₂SO₄. Absorbancia bola stanovovaná pri vlnovej dĺžke 490 nm na čítačke doštičiek Dynatech.

Supernatant z jamiek obsahujúcich protilátku bol ďalej analyzovaný metódou ELISA pri použití imobilizovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu <XD/HuIgG4. Ako kontrola reaktivity proti fúznemu partnerovi IgG bola použitá metóda ELISA, pri ktorej boli doštičky potiahnuté protilátkou HuIgG4. Na ďalšie testovanie metódou BIP s potkaním slezinným lyzátom boli, opísanými technikami, selektované pozitívne reagujúce jamky.

C. Produkcia polyklonálneho séra namiereného proti fúznemu proteínu doména I potkanieho polypeptidu do/HuIgCá

Dvom králikom bola pred imunizáciou, uskutočňovanou s využitím 100 pg purifikovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu «_D/HuIgG4 vo Freundovom kompletnom adjuvans, odobraná krv. Každé tri týždne boli králiky injikované rovnakou dávkou, tentokrát však vo Freundovom nekompletnom adjuvans. Po troch injekciách bola králikom odobraná krv a získané sérum bolo použité na štandardnú imunoprecipitáciu s lyzátom potkaních splenocytov. Sérum z obidvoch králikov bolo imunoreaktívne proti potkaniemu polypeptidu a_D. Králiky boli opäť injikované 100 pg antigénu vo Freundovom nekompletnom adjuvans a získané sérum bolo, s cieľom detekcie rastúcej imunoreaktivity, testované imunoprecipitáciou s potkaním a_D. Po desiatich dňoch od aplikácie poslednej posilňovacej dávky bola králikom odobraná krv a získané sérum.

Histológia potkanieho a_D

Králičie polyklonálne sérum namierené proti doméne I potkanieho polypeptidu a_D bolo použité pri imunohistochemickom značení potkaních tkanivových rezov. Toto značenie bolo uskutočňované technikami opísanými v príklade 16. Distribúcia značky, zistená na zmrazených alebo do parafínu zapustených rezoch potkaních slezín, bola v podstate identická s distribúciou pozorovanou pri značení jednotlivých buniek vnútri červenej pulpy protilátkami proti ľudskému a_D. Distribúcia značky sa líšila od distribúcie značky pri značení uskutočňovanom pomocou monoklonálnych protilátok namierených proti potkaniemu CDlla, CDllb a CD18. Okrem toho bol pozitívny signál detegovaný pri jednotlivých bunkách v kôre týmusu. Ani jedno z týchto tkanív neposkytlo pozitívny signál pri značení králičím sérom odobraným pred imunizáciou.

D. Analýza špecificity protilátok

Potkany boli usmrtené asfyxiou oxidom uhličitým a ich sleziny boli odobrané štandardnými technikami. Slezinné bunky boli získané jemným pretlačením sleziny pomocou piesta injekčnej striekačky cez drôtené sitko do 20 ml

RPMI média. Bunky boli zozbierané do kónickej banky s objemom 50 ml a premyté vhodným pufŕom.

Bunky boli trikrát premyté roztokom studeného D-PBS a rozsuspendované na hustotu 10⁸ až 10⁹ buniek v 40 ml PBS. K suspenzii buniek boli pridané štyri mg NHS-Biotinu (Pierce) a reakcia prebiehala pri izbovej teplote presne 15 minút. Bunky boli scentrifugované a trikrát premyté studeným D-PBS.

Bunky boli v studenom lyzačnom pufri (zloženie: 1 % NP40; 50 mM Tris-HCl s pH = 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCl₂; 2 mM MgCl; roztok pepstatinu, leupeptinu a aprotinu v riedení 1 : 100 pridaný do pufra pred pridaním buniek; a 0,0001 g kryštalického PMSF pridaného do pufra tesne pred pridaním buniek) rozsuspendované na hustotu 10⁸ buniek/ml. Lyzáty boli pretrepávané 30 sekúnd, potom inkubované 5 minút pri izbovej teplote a ďalej 15 minút na ľade. Potom boli centrifúgované 10 minút pri 10 000 x g, aby sa odstránil nerozpustný materiál. Supernatant bol prevedený do novej skúmavky a uchovaný pri teplotách v rozmedzí 4 °C až -20 °C.

Jeden mililiter bunkového lyzátu bol čiastočne prečistený inkubáciou s 200 μΐ suspenzie proteínu A-Sepharózy (Zymed) uskutočňovanou cez noc pri teplote 4 °C. Takto prečistený lyzát bol pre každú testovanú protilátku rozdelený do mikroskúmaviek v objeme 50 μΐ/skúmavka. K lyzátu bolo pridaných 25 μΐ polyklonálneho séra alebo 100 až 500 μΐ supernatantu obsahujúceho monoklonálnu protilátku a táto zmes bola pri stálom trepaní inkubovaná 2 hodiny pri 4 °C. Potom bolo pridaných 100 μΐ králičej protilátky namierenej proti myšaciemu IgG (Jackson) viazanej na gulôčky Sepharózy s proteínom A v PBS a inkubácia pokračovala pri stálom trepaní 30 minút pri izbovej teplote. Po miernej centrifugácii boli guľôčky trikrát premyté studeným premývacím pufŕom (zloženie: 10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1 % Triton X-100). Supernatant bol odstránený odsatím a ku guľôčkam bolo pridaných 20 μΐ 2 x SDS vzorkového pufra obsahujúceho 10 % β-merkaptoetanolu. Vzorka bola ponorená 2 minúty vo vodnom kúpeli a nanesená na 5 % SDS-polyakrylamidový gél pre elektroforézu. Po rozdelení boli proteíny prenesené na nitrocelulózovú membránu. Tento prenos prebiehal cez noc pri konštantnom prúde. Membrána bola blokovaná 1 hodinu pri izbovej teplote v 3 % BSA v pufri TBS-T. Po odstránení blokovacieho pufra bol k vnútrocelulózovej membráne pridaný konjugát streptavidin-HRP (Jackson) v 0,1 % BSA v pufri TBS-T a inkubácia pokračovala ďalších 30 minút pri izbovej teplote. Membrána bola trikrát počas 15 minút premývaná pufŕom TBS-T. Následná autorádiografia bola uskutočnená kitom ECL (Amersham) postupom odporúčaným výrobcom.

E. Produkcia monoklonálnych protilátok namierených proti neskrátenému potkaniemu proteínu a_D

Purifikácia potkanieho proteínu a_D

S cieľom prípravy imunogénu použiteľného na produkciu monoklonálnych protilátok namierených proti potkaniemu polypeptidu a_D bol potkaní protein a_D purifikovaný z potkaních slezinných buniek. Sleziny boli izolované z približne 50 normálnych samíc potkanov Lewis starých 12 až 20 týždňov. Jednotlivá bunková suspenzia bola získaná pasírovaním tkaniva cez jemné drôtené sitko. Červené krvinky boli odstránené lýzou v pufri s pH = 7,4 obsahujúcom 150 mM NH₄C1, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA a zvyšné leukocyty boli dvakrát premyté pufŕom PBS. Slezinné bunky boli odstredené a lyzované v pufri obsahujúcom 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM PMSF, leupeptín, pepstatin a 1 % Triton X-100. Lyža slezinných buniek prebiehala na ľade počas minút v jednom mililitri lyzačného pufra na 5 x 10⁸ slezinných buniek. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou.

Polypcptidy CD1 la, CD1 lb a CD1 lc boli zo slezinného lyzátu odstránené imunoprecipitáciou uskutočňovanou postupom opísaným ďalej. Počas 30 minút bolo pri teplote 4 °C 750 μΐ suspenzie protein A-Sepharózy inkubovaných s mg králičej protilátky namierenej proti myšaciemu imunoglobulínu. Vzniknutý komplex bol trikrát premytý pufrom a nakoniec rozsuspendovaný v 1,5 ml lyzačného pufra. K 50 ml potkanieho slezinného lyzátu bolo pridaných približne 200 pg každej zo špecifických monoklonálnych protilátok, 515F (špecificky namierená proti potkaniemu CDlla), OX-42 (špecificky namierená proti potkaniemu CDllb) a 100 g (špecificky namierená proti potkaniemu CDllc). Po 30-minútovej inkubácii pri teplote 4 °C bolo k lyzátu pridaných 500 μΐ komplexu králičej protilátky s protein A-Sepharózou a táto zmes bola trepaná pri teplote 4 “C počas 30 minút na trepačke. Lyzát bol centrifiigovaný pri 2500 x g počas 10 minút, aby sa oddelili CDlla, CD1 lb a CD11 c naviazané na komplex králičej protilátky s protein A-Sepharózou. Supernatant bol prevedený do novej centrifugačnej kyvety. Táto imunoprecipitácia s protilátkami 515F, OX-42 a 100 g bola opakovaná ešte dvakrát, aby bolo zaistené kompletné odstránenie CDlla, CDllb a CDllc.

Zvyšné integríny β₂ boli z lyzátu izolované pomocou afinitnej chromatografie. K lyzátu bolo pridaných približne 250 μΐ suspenzie obsahujúcej monoklonálnu protilátku 20C5B namierenú proti myšaciemu CD 18 naviazanému na CNBr-Sepharózu a vzniknutý roztok bol pri teplote 4 °C trepaný počas 30 minút na trepačke. Komplex protilátka/antigén bol centrifiigovaný pri 2500 x g počas 10 minút, peleta bola trikrát premytá lyzačným pufŕom a skladovaná pri teplote 4 °C.

Imunizácia arménskych chrčkov

Arménske chrčky, staré šesť až osem týždňov, boli prvý raz imunizované pomocou približne 50 pg rekombinantného proteínu zloženého z domény I potkanieho polypeptidu a_D pripojenej k ťažkému reťazcu ľudského IgG4. Tento protein bol pred imunizáciou emulgovaný Freundovým kompletným adjuvans. Následné imunizácie prebehli s rovnakým proteínom emulgovaným vo Freundovom nekompletnom adjuvans 14. deň, 33. deň a 95. deň po prvej imunizácii. Boli uskutočnené dve oddelené fúzie, označené 197 a 199.

Štyri dni pred fuziou 197 (306. deň) bola jednému chrčkovi aplikovaná zmes potkanieho proteínu a_D purifikovaného zo slezinných buniek a buniek CHO transfekovaných potkaním a_D. Tri dni pred fuziou (307. deň) bola chrčkovi aplikovaná posilňovacia dávka obsahujúca purifikovaný potkaní protein a_D a CHO bunky transfekované a_D. Transfekcia buniek CHO potkaním a_D bola uskutočnená nasledujúcim postupom.

Segment génu kódujúci neskrátený potkaní protein a_Dbol vložený do vektora pDCl, ktorým boli, spolu s ľudským konštruktom CD18-pRC, elektroporáciou transfekované bunky CHO. Transfekované bunky boli kultivované v prítomnosti hypoxantínu a g418, aby sa vyselektovali bunky úspešne transfekované konštruktom pDCl. Po troch týždňoch boli bunky značené špecifickým polyklonálnym sérom namiereným proti potkaniemu a_D a rozdelené s využitím FACS. Malý podiel buniek, ktoré na svojom povrchu mali najvyššiu hladinu expresie polypeptidu a_D (približne % populácie), bol separovaný a bunky boli ďalej množené. Tento postup bol niekoľkokrát opakovaný, aby bola

SK 283135 Β6 získaná populácia buniek s najvyššou povrchovou expresiou a_D.

Transfekované bunky boli tiež charakterizované prietokovou cytometriou pri použití polyklonálneho séra špecificky namiereného proti potkaniemu polypeptidu a_D a monoklonálnej protilátky TS 1.18.1 špecificky namierenej proti ľudskému CDI8. Získané výsledky potvrdili vysokú hladinu expresie obidvoch antigénov na povrchu transfekovaných buniek CHO.

Expresia a_D a CD 18 v bunkách bola nakoniec analyzovaná imunoprecipitáciou. Králičie polyklonálne sérum špecificky namierené proti potkaniemu polypeptidu a_D imunoprecipitovalo s dvoma proteínmi s rozdielnou molekulovou hmotnosťou. Molekulové hmotnosti boli 170 kDa pre väčší proteín a 95 kDa pre menší proteín. Tieto výsledky boli v súlade s expresiou heterodimérneho komplexu potkanieho ct_D/ľudský CD 18 na povrchu transfekovaných buniek CHO.

Deň, keď prebiehala fúzia, bola vybraná slezina. Suspenzia jednotlivých slezinných buniek bola vytvorená rozmelením tkaniva medzi dvoma namrazenými podložnými sklíčkami ponorenými do média RPMI bez prítomnosti séra s prídavkom 2 mM L-glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilínu v koncentrácii 100 jednotiek/ml a streptomycínu v koncentrácii 100 gg/ml (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilné bunkové sitko Nitex s veľkosťou ôk 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola potom rozsuspendovaná v 20 ml média RPMI bez prítomnosti séra. Tymocyty z troch myší Balb/c (neimunizovaných) boli pripravené obdobným spôsobom. Myelómy NS-1, udržiavané počas troch dní pred fúziou v log fáze v médiu RPMI s obsahom 10 % fetálneho séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc. Logan, Utah), boli centrifugované pri 200 x g počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá, opísaným postupom.

Približne 1,15 x 10⁸ slezinných buniek bolo zmiešaných s 5,8 x 10⁷ buniek NS-1, scentrifugovaných a supernatant odstránený odsatím. Peleta bola poklepom uvoľnená odo dna kyvety. K bunkovej pelete bolo, pri stálom miešaní počas jednej minúty, pridávaných 7 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50 % roztok v pufri 75 mM HEPES s pH = 8,0) zahriateho na teplotu 37 °C. Potom bolo k bunkovej suspenzii pridaných 14 ml média RPMI bez prítomnosti séra a suspenzia bola miešaná 7 minút. Bolo pridaných ďalších 8 ml média RPMI a bunky boli centrifugované počas 10 minút pri 200 x g. Supematant bol odstránený a peleta bola resuspendovaná v 200 ml média RPMI obsahujúceho 15 % FBS, 100 mM hypoxantín sodný, 0,4 mM aminopterín, 16 mM tymidín (HAT) (Gibco), IL-6 s koncentráciou 25 jednotiek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶tymocytov/ml. Suspenzia hala rozdelená do 10-tich 96-jamkových (s plochým dnom) doštičiek na tkanivové kultúry (Corning, Veľká Británia) v objeme 200 μΐ/jamka a bunky boli vyživované 4., 5., 6. a 7. deň odohraním 100 μΐ média z každej jamky 18G-ihlou (Becton Dickinson) a pridaním 100 μΐ čerstvého média, opísaného, ale neobsahujúceho tymocyty.

Desiaty deň bol supematant z jamiek testovaný prietokovou cytometriou, či reaguje s bunkami CHO transfekovanými heterodimérom potkaní aq'ľudský CD1B. Približne 5 x 10³ buniek CHO transfekovaných potkaním a_D bolo rozsuspendovaných v 50 gl média RPMI obsahujúceho 2,0 % FBS a 0,05 % azid sodný a na 96-jamkových doštičkách s jamkami s guľatým dnom pridaných k 100 gl supernatantu získaného pri kultivácii hybridómov. Pozitívnou kontrolou bolo značenie pomocou králičieho polyklonálne ho séra namiereného proti a_D a protilátky TS 1/18 namierenej proti ľudskému CD 18. Bunky boli inkubované 30 minút na ľade, trikrát premyté v pufri FACS (RPMI, 2,0 % FBS, 0,05 % azid sodný) a inkubované 30 minút na ľade s koziou protilátkou značenou FITC namierenou proti chrčím Ig (Jackson Immunol Research Labs) zriedenou v pomere 1 : 200 v pufri FACS. Bunky boli trikrát premyté v pufri FACS a resuspendované v 200 ml tohto pufra. Vzorky boli analyzované na analyzátore FACscan firmy Becton Dickinson. S cieľom potvrdiť, že klony z pozitívne reagujúcich jamiek sú špecifické proti potkaniemu a_D, bol celý pokus opakovaný s netransfekovanými bunkami CHO. Klony, ktoré splnili podmienky a reagovali s bunkami CHO transfekovanými potkaním a_D, ale nereagovali s netransfekovanými bunkami, boli ďalej pomnožené.

Po primárnom sereeningu boli bunky z pozitívne reagujúcich jamiek pasážované najprv dvojnásobným zriedením a potom medzným zriedením v médiu RPMI obsahujúcom 15 % FBS, 100 mM hypoxantín sodný, 16 mM tymidín a IL-6 v koncentrácii 10 jednotiek/ml. V tomto kroku bolo určené percento jamiek majúcich rast a s využitím Poissonovej distribučnej analýzy bola predpovedaná klonalita. Po 10 až 12 dňoch boli jamky obsahujúce množiace sa populácie analyzované s využitím FACS. Po poslednom pasážovaní boli bunky z pozitívnych jamiek namnožené v médiu RPMI s 11 % FBS. Bola získaná jedna kultúra, ktorá sa podľa týchto kritérií javila ako pozitívna. Z tejto kultúry boli rozrastené subklony označené 197A-1, 197A-2, 197A-3 a 197A-4.

Druhému chrčkovi bolo 307. deň aplikovaných 2,3 x 10⁶buniek CHO transfekovaných potkaním aD. Dve zavárečné imunizácie boli uskutočnené 4 dni pred fúziou 199 (334. deň) a opäť 3 dni pred fúziou (335. deň). Injekcia zo dňa 334, aplikovaná intraperitoneálne, obsahovala 2 x 10^s buniek CHO transfekovaných potkaním aD a 200 gl purifikovanej potkanej podjednotky a_D naviazanej k Sepharóze (opísané predtým). Injekcia z 335. dňa, aplikovaná takisto intraperitoneálne, obsahovala 5 x 10⁶ buniek CHO transfekovaných potkaním a_D. Postup fúzie a protokol testovania bol rovnaký ako pri fúzii 197. Boli identifikované a pomnožené tri hybridómy označené 199A, 199H a 199M. Hybridom 199M bol 1. marca 1996 uložený v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod prístupovým číslom HB-12058.

Charakterizácia monoklonálnych protilátok proti potkaniemu polypeptidu a_D

Aby bola možné charakterizovať protilátky namierené proti potkaniemu a_D, boli, postupom opísaným v príklade 18, oddiel D, pripravené biotínom značené slezinné lyzáty. Pred vlastnou imunoprecipitáciou boli lyzáty predčistené. Na začiatku bol k lyzátu pridaný normálny myšací imunoglobulín v koncentrácii 50 gg/ml a výsledná zmes bola počas 30 minút pri teplote 4 °C trepaná na rotačnej trepačke. K tejto zmesi bolo pridaných 75 gl suspenzie proteín A-Sepharózy potiahnutej králičou protilátkou namierenou proti myšacím Ig a trepanie pokračovalo ďalších 30 minút. Guľôčky s naviazanou protilátkou boli odstredené pri 15 000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge. Centrifugácia prebiehala počas 5 minút pri teplote 4 °C. Supematant bol odobraný a peleta odstránená.

Z každého klonu hybridómu bolo do mikroskúmaviek odobraných približne 300 gl supernatantu. K tomuto supernatantu bolo pridaných 30 gl 10 % Tritonu X-100, 30 gl zo 100 x zásobného roztoku pepstatínu, leupeptínu a aprotín, ďalej 100 gg kryštalického PMSF a 50 gl predčisteného biotinylovaného lyzátu z potkanej sleziny. Obsah mikro28 skúmaviek bol mierne pretrepaný a na 30 minút pri teplote 4 °C umiestený na rotačku. Kontrolná vzorka bola pripravená pridaním králičej polyklonálnej protilátky špecificky namierenej proti potkaniemu polypeptidu cm s koncentráciou 10 mg/ml k 50 μΐ potkanieho slezinného lyzátu.

Po 30 minútach inkubácie bolo ku každej vzorke pridaných 75 μΙ suspenzie guľôčok proteín A-Sepharózy v PBS pufri a vzorka bola inkubovaná na rotačke ďalších 30 minút pri teplote 4 °C. Guľôčky Sepharózy boli centrifugované počas 5 minút pri teplote 4 °C pri 15 000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge a supernatant bol odobraný. Guľôčky boli postupne premyté jedným mililitrom z každej z nasledujúcich detergentných vzoriek: pufer #1 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100, pH 8,0; pufer #2 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 % Triton X-100, pH 8,0; pufer #3 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100, 0,1 % deoxycholát, pH 8,0; a pufer #4 obsahujúci 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCl, pH 8,0. Posledné premytie bolo uskutočnené pufrom #1. Medzi jednotlivými premytiami boli guľôčky mierne pretrepané na vortexe a odstredené v stolnej centrifúge. Supernatant bol vždy odstránený pipetou a po poslednom premytí bol zvyšný pufer od guľôčok odstránený striekačkou (Hamilton). Ku každej pelete guľôčok bol pridaný alikvót (50 μΐ) SDS vzorkového pufra obsahujúceho brómfenolovú modrú, farbivo Pyronín Y a β-merkaptoetanol s výslednou koncentráciou 10 %. Zmes bola prudko 1 až 2 minúty trepaná a inkubovaná 5 až 10 minút pri izbovej teplote. Vzorky boli centrifugované počas 5 minút pri 15 000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge pri teplote 4 °C a uvoľnený proteín bol prenesený do novej mikroskúmavky. Vzorky boli povarené 4 minúty na vodnom kúpeli a nanesené na 7,5 % SDS polyakrylamidový gél. Po ukončení delenia boli proteíny prenesené na nitrocelulózové fdtre. Transfer prebiehal pri 200 mA počas 1 hodiny. Filtre boli blokované v roztoku 3,0 % BSA v pufri TBS-T cez noc pri teplote 4 °C. Ku každému filtru bol pridaný roztok 0,1 % BSA v pufri TBS-T s obsahom streptavidínu-OPD v riedení 1 : 6000, v ktorom bol ponechaný jednu hodinu pri izbovej teplote. Filtre boli premývané päťkrát vždy 10 minút v pufri TBS-T a ofarbené použitím kitu ECL (Amersham) postupom odporúčaným výrobcom.

Bolo dokázané, že kloň 199M imunoprecipituje heterodimérny proteín. Väčšia proteínová podjednotka mala približnú molekulovú hmotnosť 170 až 175 kDa, čo zodpovedalo veľkosti imunoprecipitovaného kontrolnou králičou protilátkou namierenou proti potkaniemu a_D. Druhá imunoprecipitovaná podjednotka mala zdanlivú molekulovú hmotnosť 95 kDa, zhodnú s veľkosťou CD 18.

Príklad 19

Izolácia klonov myšacej cDNA

Bol uskutočnený pokus a izoláciu myšacieho homológu a_D·

Pomocou dvoch sond vytvorených metódou PCR bola uskutočnená medzidruhová hybridizácia. Prvou sondou bol fragment s veľkosťou 1 : 5 kb zodpovedajúci bázam 522 až 2047 z ľudského klonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1), druhou sondou bol potkaní fragment s veľkosťou 1,0 kb zodpovedajúci bázam 1900 až 2900 z ľudského klonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1). Ľudská sonda bola vytvorená polymerázovou reťazovou reakciou primárov označených ΛΤΜ-2 a 9-10.1 (SEK. ID. č.: 38, resp. 39). Potkania sonda bola vytvorená s využitím primérov 434L a 434R (SEK. ID. č.: 34, resp. 35), Vzorky boli inkubovaná 4 minúty pri teplote 94 °C a podrobené 30 cyklom s nasledujúcim teplotným režimom: 94 °C, 2 minúty pri 50 °C; 4 minúty pri 72 °C.

5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3' (SEK. ID. č.: 38)

5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3' SEK. ID. č.: 39)

Produkt reakcie PCR bol purifikovaný pomocou kitu Quick Spin firmy Qiagen, postupom odporúčaným výrobcom a približne 180 ng DNA bola pri použití kitu „Random Prime Labeling kiť firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označených 200 pCi [³²P]-dCTP. Nenaviazaný izotop bol odstránený pomocou kolóny Centri-sep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Sondy boli pred použitím denaturované 0,2 N NaOH a neutralizované roztokom 0,4 M Tris-HCl s pH = 8,0.

Knižnica cDNA získaná z buniek týmusu s využitím sekvencie oligo-dT ako priméru zabudovaná v lambda ZAP II (Stratagene) bola vysiata v koncentrácii približne 30 000 plakov na 1 misku s priemerom 15 cm. Plaky prenesené na nitrocelulózové filtre (Schleicher & Schuell, Keene, NH) boli pri stálom miešaní inkubované pri teplote 50 °C počas jednej hodiny v prehybridizačnom roztoku (8 ml/prenos) obsahujúcom 30 % formamid. K prehybridizačnému roztoku boli pridané značené ľudské a potkanie sondy a inkubácia pokračovala cez noc pri teplote 50 °C. Filtre boli dvakrát premyté v 2X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote, raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 37 °C a raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 °C. Expozícia filtrov na film Kodak X-Omat AR prebiehala pri teplote -80 °C počas 27 hodín pri použití kontrastného filtra.

Štyri plaky, ktoré poskytli pozitívny signál pri dvakrát opakovanom prenose, boli opäť vysiate na misky s LB médiom s prídavkom horčíka a karbenicilínu v koncentrácii 100 mg/ml a inkubované cez noc pri 37 °C. Fágové plaky boli prenesené na filtre Hybond (Amersham), označené ako v prvom pokuse a exponované na film Kodak X-Omat AR pri teplote -80 °C počas 24 hodín pri použití kontrastného filtra.

Dvanásť pozitívnych plakov bolo prenesených do riediaceho roztoku s nízkym obsahom Mg²⁺ iónov (10 mM Tris-HCl a 1 mM MgCl₂). Veľkosť inzerčného fragmentu bola určená pomocou PCR reakcie s T3 a T7 primérmi (SEK. ID. č.: 13 a 14) pri nasledujúcich reakčných podmienkach. Vzorky boli inkubované pri 94 °C počas 4 minút a vystavené 30 cyklom s týmto teplotným režimom: 15 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 50 °C a 1 minútu pri 72 °C.

Šesť vzoriek poskytlo rozdielne prúžky DNA s veľkosťou od 300 báz do 1 kb. Fágmidy boli uvoľnené pomocou koinfekcie pomocným fágom a prevedením do cyklickej formy bol vytvorený Bluescript SK‘ (Stratagene). Vzniknuté kolónie rástli v LBM médiu s karbenicilínom (lOOmg/ml) cez noc. DNA bola izolovaná pomocou kitu na minipreparáciu DNA „Wizard“ firmy Promega (Madison, WI) podľa návodu výrobcu. Reštrikčná analýza izolovanej DNA enzýmom EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti zodpovedajúce molekulovým hmotnostiam zisteným z PCR. Fragment DNA bol sekvenovaný pri použití priméru M13 a reverzného priméru.l M13, ktorých sekvencie sú zobrazené v SEK. ID. č.: 40, resp. 41.

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEK. ID. i.: 40)

5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3’ (SEK. ID. t.: 41)

Sekvenovanie bolo uskutočňované postupom opísaným v príklade 4.

Len dva zo šiestich klonov, označené 10.3-1 a 10.5-2, poskytli identickú sekvenciu s veľkosťou 600 párov báz. Táto sekvencia bola zo 68 % identická s príslušnou oblas ťou ľudského a_D, zo 40 % identická s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, z 58 % identická s príslušnou oblasťou ľudského CD11 c a z 54 % identická s príslušnou oblasťou myšacieho CD1 lb. Tento fragment s veľkosťou 600 bp bol potom využitý na získanie úplnejšej cDNA kódujúcej predpokladaný myšací homológ a_D.

Knižnica cDNA z myšacej sleziny (vytvorená s využitím aligo-dT primárov a primérov s náhodnými sekvenciami), zaklonované do fágu lambda Zap II (Stratagene), bola vysiata v koncentrácii 2,5 x 10⁴ fágov na LBM misku s priemerom 15 cm. Plaky boli prenesené na nylonovú membránu Hybond (Amersham), denaturované 0,5 M NaOH s 1,5 M NaCl, neutralizované 0,5 M Tris-HCl s 1,5 M NaCl a premyté v 2X SSC. DNA bola na membráne zosieťovaná ultrafialovým žiarením.

Pomocou sond 10.3-1 a 10.5-2, značených opísaným postupom, bolo testovaných približne 500 000 plakov. Sondy boli pridané do prehybridizačného roztoku a inkubované cez noc pri teplote 50 °C. Filtre boli dvakrát premyté v 2X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote, raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 37 °C a raz v 2X SSC/0,1 % SDS s teplotou 42 °C. Expozícia filtrov na film Kodak XOmat AR prebiehala pri teplote -80 °C počas 13 hodín pri použití kontrastného filtra.

Osemnásť pozitívnych plakov bolo prenesených do roztoku s nízkym obsahom Mg²⁺ iónov a veľkosť fragmentu bola určená PCR metódou, opísaným postupom. Každá zo siedmich vzoriek poskytla jediný prúžok DNA s veľkosťou od 600 párov báz do 4 kb. Reštrikčná analýza purifikovanej DNA enzýmom EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, zodpovedajúce molekulovým hmotnostiam zisteným z PCR. Fragment DNA bol sekvenovaný pri použití priméru M13 a reverzného priméru.l M13 (SEK. ID. č.: 40, resp. 41).

Kloň označený B3800 obsahoval inzert s veľkosťou 4kb, ktorý zodpovedal oblasti nachádzajúcej sa 200 báz v smere transkripcie od 5’ konca klonu 19A2 ľudského a_D a obsahoval 553 báz 3' neprekladanej oblasti. Kloň B3800 bol zo 77 % identický s príslušnou oblasťou ľudského a_D, 44 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, 59 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CDllc a 51 % identický s príslušnou oblasťou myšacieho CDllb. Druhý kloň A1160 mal veľkosť 1,2 kb a zodpovedal 5' koncu kódujúcej oblasti ľudského a_D, približne 12 báz v smere transkripcie od iniciačného kodónu pre metionín. Kloň A1160 bol zo 75 % identický s príslušnou oblasťou ľudského a_D, 46 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, 62 % identický s príslušnou oblasťou ľudského CD1 lc a 66 % identický s príslušnou oblasťou myšacieho CDllb.

Kloň Al 160, fragment bližšie k 5' koncu ľudského klonu 19A2, sa prekrýva s klonom B3800 od bázy 205 až k báze 1134. Kloň Al 160 má vložený úsek 110 báz (báza 704 až 814), ktorý nie je v prekrývajúcej sa oblasti klonu B3800. Tento vložený úsek DNA sa najskôr vyskytuje na hranici exónu a intrónu [Fleming a ďalší, J. Immunol. 150 : : 480 až 490 (1993)] a bol pred následným spojením klonov Al 160 a B3800 odstránený.

Rýchla amplifikácia 5' konca cDNA predpokladaného klonu myšacieho a_D

S cieľom získať chýbajúcich 5' úsekov predpokladaných klonov myšacieho a_D, vrátane 5’ neprekladanej sekvencie a iniciačného metionínu, bola použitá RAČE PCR (Frohman, „RAČE: Rapid Amlification oť cDNA Ends“, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Amplifications, Innis a ďalší, (editori) 28 až 38, Academic Press: NEW

York (1990)]. Myšací slezinný kit „RACE-Ready“ (Clontech, Palo Alto, CA) bol použitý podľa návodu výrobcu. Na uskutočnenie prvej a vnorenej PCR boli vybrané dva Xantisense špecifické priméry (A 1160 RAČE 1-primárny primér a A1160 RACE2-vnorený primér, SF.K. ID. č.: 42, resp. 43).

5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3' (SEK. ID. č.: 42) 5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (SEK. ID. č.: 43)

Priméry, SEK. ID. č.: 42 a 43, zodpovedajú oblastiam začínajúcim 302, resp. 247 bázou ad 5' konca. Pri použití 5' priméru (SEK. ID. č.: 44) a myšacej slezinnej cDNA dodanej v kite bola, opísaným postupom, uskutočnená PCR.

5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3' (SEK. ID. č.: 44)

Elektroforéza produktu PCR reakcie odhalila prúžok s veľkosťou 280 báz, ktorý bol zaklonovaný pomocou klonovacieho kitu TA (Invitrogen), postupom odporúčaným výrobcom. Desať získaných kolónií bolo pomnožených, DNA izolovaná a zistená jej sekvencia. Touto metódou bola identifikovaných ďalších 60 báz 5' sekvencie, ktoré zodpovedajú bázam 1 až 60 v SEK. ID. č.: 45.

Charakteristiky myšacej cDNA a predpokladanej aminokyselinovej sekvencie

Zložená sekvencia myšacej cDNA kódujúcej predpokladaný homológ ľudskej a_D je zobrazená v SEK. ID. č.: 45. Aj keď homológia medzi vonkajšími doménami ľudských a myšacích klonov je vysoká, homológia medzi cytoplazmatickými doménami je len 30 %. Pozorované odchýlky môžu naznačovať rozdiel vo funkcii C-koncovej domény medzi ľudskými a myšacími proteínmi. Odlišnosti v cytoplazmatických doménach môžu byť takisto výsledkom rozdielneho zostrihu RNA alebo môžu naznačovať existenciu ďalších génov pre integríny β₂.

Aminokyselinová sekvencia proteínu, predpovedaná na základe sekvencie myšacej cDNA, je z 28 % identická s myšacou CD1 la, z 53 % s myšacou CD1 lb, z 28 % s ľudskou CD1 la, z 55 % s ľudskou CD1 lb, z 59 % s ľudskou CD1 lc a zo 70 % s ľudskou a_D. Z porovnaní aminokyselinových sekvencií cytoplazmatických domén ľudského polypeptidu a_D a predpokladaného myšacieho homológu vyplýva, že síce obsahujú oblasti s rovnakou dĺžkou, ale s odlišnou primárnou štruktúrou. Podobné veľkosti sekvencií v týchto oblastiach predpokladajú skôr druhovú odlišnosť než možnosť vzniku rozdielnych variantov zostrihom. Keď porovnáme myšaciu sekvenciu s predpokladaným potkaním polypeptidom (príklad 16 uvedený skôr), dostávame väčšiu ako 60 % zhodu myšacej a potkanej cytoplazmatickej domény.

Príklad 20

Izolácia ďalších klonov myšacej cDNA a_D uskutočňovaná s cieľom potvrdiť sekvencie

Aby bola potvrdená nukleotidová sekvencia a aminokyselinová sekvencia myšacieho a_D opísaného v príklade 19, boli izolované ďalšie myšacie sekvencie.

Hybridizácia s dvoma homológnymi a_D sondami (od 3' konca a od 5' konca) bola, s využitím tak myšacej slezinnej knižnice vytvorenej pomocou náhodných primérov, ako aj knižnice cDNA vytvorenej pomocou primérov oligo-dT, zaklonovaných do fágu lambda ZAP II (Stratagene), uskutočnená izolácia myšacej cDNA. Knižnica bola nanesená v koncentrácii 5 x 10⁵ fágov/miska na misky s LBM s priemerom 15 cm. Plaky boli prenesené na nylonové membrány Hybond (Amersham). Membrány boli denaturované (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), neutralizované (0,5 M Tris/1,5 M NaCl/11,6 M HCI) a premyté (2X SSC). DNA bola na membránach zosieťovaná pomocou ultrafialového žiarenia.

Sondy boli vytvorené pomocou primérov opísaných v PCR reakcii uskutočňovanej pri nasledujúcich podmienkach. Vzorky boli vystavené 4 minúty teplote 94 °C a potom nasledovalo 30 cyklov s týmto teplotným režimom: 15 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 50 °C a 1 minútu pri 72 °C v cykléri Perkin-Elmer 9600.

3'-Sonda, ktorá bola približne 900 báz dlhá, prekrývala oblasť nukleotidov 2752 a 3651 (v SEK. ID. č.: 1, v smere od 5' k 3') a bola vytvorená pomocou primérov ll.b-l/2FORll a ll.b-l/2REV2 zobrazených v SEK. ID. č.: 69, resp. 74). Táto sonda bola použitá v prvej sérii prenosov.

5'-Sonda, ktorá bola približne 800 báz dlhá, zahrnovala oblasť nukleotidov 145 do 946 (v SEK. ID. č.: 1, v smere ad 5' k 3') a bola bola vytvorená pomocou primérov 11. b1/2FOR1 a Il.a-1/1REV1 zobrazených v SEK. ID. č.: 50, resp. 85). Táto sonda bola použitá v druhej sérii prenosov.

V tretej sérii prenosov boli použité obidve sondy spoločne na rovnakých miskách.

Pomocou obidvoch opísaných sond, značených spôsobom opísaným v príklade 17, bolo testovaných približne 500 000 plakov. Značené sondy boli pridané k prehybridizačnému roztoku 45 % formamidom a inkubované cez noc pri teplote 50 °C. Membrány boli premyté dvakrát v 2X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote (22 °C). Posledné premytie bolo uskutočnené v 2X SSC/0,1 % SDS pri teplote 50 °C. Autorádiografia bola uskutočňovaná 19 hodín pri teplote -80 °C na film Kodak X-Omat AR pri použití kontrastného filtra.

Trinásť plakov pozitívnych najmenej pri dvoch prenosoch bolo podrobených druhému testovaniu, ktoré bolo uskutočnené rovnako ako prvé testovanie, až na dve výnimky. Na hybridizáciu boli použité obidve značené sondy 3' a 5' a bolo pridané záverečné premytie v 2X SSC/0,1 % SDS pri teplote 65 °C . Autorádiografia bola uskutočnená rovnakým opísaným postupom, ale prebiehala len počas 2,5 hodiny.

Trinásť pozitívnych plakov (označených MS2P1 až MS2P13) bolo prenesených do riediaceho roztoku s nízkym obsahom horečnatých iónov. Veľkosť inzertu bola stanovená metódou PCR (cyklér Perkin-Elmer 9600) pri použití primérov T3 a T7, ktoré prisadajú k fágmidu Bluescript zabudovanému vo vektore ZAP II (sekvencia už predtým opísaná). Podmienky PCR boli rovnaké, ako bolo opísané skôr. Veľkosti prúžkov DNA sa pohybovali ad 500 párov báz do 4 kb. Fágmidy boli izolované a sekvenované s využitím priméru M13 a reverzného priméru.l M13 (SEK. ID. č.: 40, resp. 41). Päť z trinástich klonov (MS2P-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12 a MS2P-13) bolo sekvenovaných a po zložení reprezentovali oblasť od bázy 200 na 5' konci až k 300. báze za prvým stop kordónom na 3' konci.

S cieľom zistiť sekvencie koncov všetkých klonov a určiť ich relatívnu pozíciu proti konštruktu #17 (SEK. ID. č.: 45) bolo, postupom rovnakým ako v príklade 4, uskutočnené automatické sekvenovanie s využitím priméru M13 a reverzného priméru.l M13 (SEK. ID. č.: 40, resp. 41). Každý kloň bol potom úplne sekvenovaný použitím vhodných primérov (uvedených ďalej) pre konkrétne oblasti.

11.b-1Z2FOR1 5'-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3' (SEK. ID. Č: 50) .a-1/1 FOR2 5’-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3’ (SEK. ID. Č: 60)

11.a-1/1 FOR3 5'-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3' (SEK. ID. Č: 61)

I l.b-l/2FOR4 5'-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3' (SEK. ID. Č: 62)

II ,b-l/2FOR5 5'-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3' (SEK ID. Č: 63) ,b-lZ2FOR6 5'-CAGATCGGCTCCTACTITGG-3' (SEK. ID: Č: 64)

l.b-l/2FOR7 5'-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3' (SEK. ID. Č: 65)

I l.b-l/2FOR8 5'-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3' (SEK. ID. Č: 66)

II ,b-l/2FOR9 5'-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3' (SEK. ID.Č: 67) .b-l/2FOR10 5'-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3' (SEK. ID. Č: 68) .b-l/2FORl 1 5'-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3' (SEK. ID. Č: 69) b-1Z2FOR12 5’-GTCACAGAGGGAACCTCC-3' (SEK. ID. Č: 70)

I l.b-l/2FOR13 5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3' (SEK. ID.Č: 71)

II b-l/2FOR14 5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3' (SEK. ID.Č: 72) .M/2FOR15 5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3' (SEK. ID.Č: 73)

I l.b-l/2REV2 5'-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3' (SEK. ID. Č: 74) ll.b-l/2REV3 5'-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3' (SEK. ID. Č: 75)

II .M/2REV4 5'-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3' (SEK ID. Č: 76) ,b-l/2REV5 5'-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3' (SEK. ID. Č: 77) ll .b-l/2REV6 5'-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3' (SEK. ID. Č: 78) ,b-l/2REV7 5’-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3' (SEK. ID. Č: 79) .b-l /2REV8 5'-GATCCAACGCCAGATCATACC-3' (SEK. ID. Č: 80)

l.b-l/2REV9 5'-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3'(SEK. ID. Č: 81)

l.b-l/2REV10 5'-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3' (SEK. ID. Č: 82) .b-l/2REVl 1 5'-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3' (SEKID. Č: 51) ,b-l/2REV12 5'-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3' (SEK. ID. Č: 83)

l.b-l/2REV13 5’-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3' (SEK. ID. Č: 84)

Il.a-1/1REV1 5’-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3' (SEK. ID. Č: 85)

11. a-1/1 REV2 5'-GCC1TGGAGCTGGACGATGGC-3' (SEK. ID. Č: 86)

Sekvencie boli upravené, priradené a porovnané s predtým izolovanými sekvenciami myšacieho a_D (konštrukt# 17, SEK. ID. č.: 45).

Priradenie nových sekvencii odhalilo v konštrukte # deléciu 18 báz, ktorá začínala od nukleotidu 2308. Táto delécia nezapríčinila posun čítacieho rámca. Kloň MS2P-9 obsahoval rovnakú deléciu s dĺžkou 18 báz. Výskyt tejto delécie bol pozorovaný pri 50 % myšacích klonov obsahujúcich túto oblasť, ale táto delécia nebola zistená v potkaních ani ľudských klenoch podjednotky ti_D. Delécia 18 báz je charakterizovaná palindrómovou sekvenciou 12 báz AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEK. ID. č.: 91). Táto inverzná repetícia je komplementárna sama k sebe a môže vytvoriť slučku, ktorá spôsobuje štiepenie počas reverznej transkripcie. Sekvencia myšacieho a_D, ktorá obsahuje navyše 18 báz, je zobrazená v SEK. ID. č.: 52; odvodená aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 53.

Príklad 21

In situ hybridizácia u myší

Distribúcia myšacích a_D v tkanivách bola určená preto, aby mohlo byť uskutočnené jej porovnanie s distribúciou ľudského a_D, opísaného v príklade 6.

Pomocou transkripcie RNA uskutočňovanej in vitro s použitím ³⁵S-UTP (Amersham) bola z templátu DNA získaná jednovláknová sonda mRNA s veľkosťou 200 bp, zodpovedajúca nukleotidom 3480 až 3707 v cytoplazmatickej oblasti myšacej cDNA.

Celé myšacie embryá (odobrané 11 až dní 18 dní po oplodnení) a rôzne myšacie tkanivá (slezina, oblička, pečeň, črevo a týmus) boli in situ hybridizované s rádioaktívne značenou jednovláknovou sondou mRNA.

Z tkanív boli pripravené rezy s hrúbkou 6 pm, ktoré boli adherované na sklíčka potiahnuté prípravkom Vectabond (Vector Laboratories. Inc., Burlingame, CA) a uložené pri teplote -70 °C. Pred použitím boli sklíčka vystavené 5 minút teplote 50 °C. Rezy boli počas 20 minút pri teplote °C fixované v 4 % paraformaldehyde, dehydratované zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu (70-95-100 %) (1 minútu pri teplote 4 °C pre každú koncentráciu) a vysušené na vzduchu (30 minút pri izbovej teplote). Rezy boli denaturované 2 minúty pri teplote 70 °C v roztoku 70 % formamid/2X SSC, dvakrát prepláchnuté v 2X SSC a dehydratované etanolom (opísaným postupom) a 30 minút vysúšané na vzduchu. Hybridizácia bola uskutočnená cez noc (12 až 16 hodín, pri teplote 55 °C v roztoku obsahujúcom sondu značenú izotopom ³⁵S v koncentrácii 6 x 10⁵ cpm na rez a vodu (vystavenú účinkom dietylpyrokarbonátu - DEPC) tak, aby bola dosiahnutá koncentrácia 50 % formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 10 % dextrán sulfát, IX Denhardtov roztok, 100 mM ditiotreitol (DTT) a mM EDTA. Po hybridizácii boli rezy premývané 1 hodinu pri izbovej teplote v 4X SSC/10 mM DTT, 40 minút pri 60 °C v 50 % formamidu/2X SSC/10 mM DTT, 30 minút pri izbovej teplote v 2X SSC a 30 minút pri izbovej teplote v 0,lX SSC. Rezy boli dehydratované, počas 2 hodín vysúšané na vzduchu, potiahnuté fotografickou emulziou Kodak NTB2, vysúšané 2 hodiny na vzduchu, vyvolané (uchovanie pri 4 °C v úplnej tme) a dofarbené hematoxylínom/eozínom.

Slezinné tkanivové malo silný signál hlavne v červenej pulpe. Táto distribúcia signálu zodpovedá distribúcii tkanivových makrofágov v slezine, ale nevylučuje prítomnosť iných typov buniek.

Príklad 22 Príprava myšacích expresívnych konštruktov

Aby mohol byť vytvorený expresívny plazmid obsahujúci sekvenciu myšacej cDNA majúcu homológiu k ľudskej u_D, aby boli spojené inzerty klonov Al 160 a B3800. Pred ligáciou bola k inzertu z klonov Al 160 pridaná vedúca („leader“) sekvencia obsahujúca na 5' konci kodón pre iniciačný metionín. Primér označený ,,5'-PCR leader“ (SEK. ID. č.: 47) bol navrhnutý tak, aby obsahoval: (1) identické nešpecifické bázy na pozíciách 1 až 6 umožňujúce štiepenie; (2) reštrikčné miesto BamHI od pozície 7 až 12 umožňujúce zaklonovanie do expresného vektora; (3) konzervatívnu Kozákovu sekvenciu od pozície 13 do 18; (4) signálnu sekvenciu obsahujúcu kodón pre iniciačný metionín (hrubo v SEK. ID. č.: 47) a ďalších 31 báz špecificky prekrývajúcich sekvenciu na 5' konci klonu A1160, aby bolo umožnené prisadnutie priméru. Na amplifikáciu inzertu z klonu Al 160 bol spolu s primérom ,,5'-PCR leader“ použitý druhý primér nazvaný ,,3'-end frag“ (SEK. ID. č.: 48).

5'-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3' (SEK. ID. í.: 47)

5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3' (SEK. ID. č.: 48)

Vzniknutý PCR produkt nebol štiepený reštrikčným enzýmom BanHI pravdepodobne preto, že pred reštrikčným miestom bol nedostatočný počet báz, čo znemožnilo rozpoznanie miesta enzýmom. Pokiaľ ide o 5'-primér, bola predĺžená dĺžka sekvencie predchádzajúcej miesto pre BamHI (SEK. ID. č.: 47) a s amplifikovaným produktom prvej sekvencie bola opakovaná PCR reakcia. 5'-Primér označený mAD.5'.2 (SEK. ID. č.: 49) bol vytvorený pridaním nešpecifických báz na pozícii 1 až 4 a ďalších 20 báz špecificky prekrývajúcich predtým použitý „5-PCR leader“ primér.

5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3' (SEK. ID. č.: 49)

Priméry „mAD.5'.2“ a ,,3'-end frag“ boli spoločne použité v PCR reakcii, kde bol templátom produkt z prvej amplifikačnej reakcie. Vzniknutý druhý PCR produkt bol zaklonovaný do plazmidu pCRtmII (Invitrogen), podľa návodu odporúčaného výrobcom a vzniknutým plazmidom boli transformované kompetentné bunky „One shot“ (Invitrogen). Analýzou reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI bol identifikovaný jeden kloň, ktorý obsahoval PCR produkt a tento kloň bol sekvenovaný. Po overení bol inzert vyštiepený reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI a izolovaný z gélu.

Inzert z klonu B3800 bol získaný reštrikčným štiepením enzýmami EcaRI a Nôti a následnou izoláciou z gélu. Tento inzert bol, spolu s fragmentom Al 160 rozštiepeným reštrikčnými enzýmami BamHI/EcoRI, pridaný do ligačnej reakcie, ktorá prebiehala 14 hodín pri teplote 14 °C. K ligačnej reakcii bol pridaný vektor pcDNA.3 (Invitrogen), štiepený enzýmami BamHI a Nôti a reakcia pokračovala ďalších 12 hodín. Z reakčnej zmesi bol odobraný alikvót, ktorým boli transformované kompetentné bunky E. coli. Vzniknuté kolónie boli namnožené a s využitím primérov 1 l.b-l/2FORl a ll.b-l/2REVll (SEK. ID. č.: 50, resp. 51) bol analýzou PCR identifikovaný jeden pozitívny kloň. Priméry ll.b-l/2FORl a 1 l.b-l/2REVl 1 premosťujú fragmenty A1160 a B3800 a teda slúžia na detekciu úspešnej ligácie obidvoch fragmentov (vznik PCR produktov). Sekvencia pozitívneho klonu bola overená pomocou primérov (zobrazené v SEK. ID. č.: 50 a 51), ktoré amplifikujú od bázy 100 do 1405 za kodónom pre štartovný metionín.

SK 283135 Β6

Príklad 23

Konštrukcia „knockoutovaných“ myší

Aby bolo možné presnejšie určiť imunologickú úlohu proteínu kódovaného predpokladanou myšacou cDNA, bola vytvorená „knockoutovaná“ myš, v ktorej organizme je sekvencia genómovej DNA kódujúcej homológ a_D prerušená pomocou homológnej rekombinácie. Na význam proteínu kódovaného porušeným génom je usudzované z jeho neprítomnosti. Produkcia „knockoutovaných“ myší je opísaná v publikácii Deng a ďalší, Mol. Celí. Biol. 13 : :2134 až 2140 (1993).

Prvým krokom pri produkcii takýchto myší je konštrukcia plazmidu, ktorý v sebe obsahuje sekvencie, ktoré budú vyradené („knockoutované“) homológne rekombinácie. Na identifikáciu myšacej genómovej sekvencie kódujúcej predpokladaný myšací homológ a_D genómovej knižnice lambdaFIXII bol použitý fragment myšacej cDNA s veľkosťou 750 báz (zodpovedajúci nukleotidom 1985 až 2733 v SEK. ID. č.: 45). Výsledkom prvého testovania bolo 14 pozitívnych plakov, z ktorých sedem bolo potvrdených druhým testovaním. Z dvoch plakov boli získané lyzáty dávajúce najsilnejší signál a lambda DNA bola izolovaná pomocou konvenčných metód. Reštrikčné mapovanie a Southernova analýza potvrdili hodnovernosť jedného z klonov (označený 14-1). Inzert DNA bol reštrikčné štiepený enzýmom Nôti a zaklonovaný do vektora Bluescript SKII⁺.

Na identifikáciu reštrikčného enzýmu s veľkosťou približne 9 až 14 kb, čo je dĺžka udávaná ako optimálna na uskutočnenie homológnej rekombinácie, bola s cDNA sondou s veľkosťou 750 bp uskutočnená Southemova hybridizácia. Pred hybridizáciou bola pre kloň 14-1 vytvorený fragment s veľkosťou 12 kb, ktorý bol zaklonovaný do vektora pBluescript SK ΙΓ do pozície, kde je myšacia DNA ohraničená kazetami kódujúcimi tymidín kinázu. Ďalšia analýza tohto klonu pomocou sondy domény I (zodpovedajúcej nukleotidom 454 až 1064 v SEK. ID. č.: 45) ukázala, že tento kloň neobsahuje kódujúcu doménu I.

Genómová knižnica lambdaFIXII bola opäť testovaná použitím rovnakej sondy domény I. Zo šiestich pozitívnych klonov zostal jeden pozitívny aj po druhom testovaní. DNA izolovaná z tohto klonu silne reagovala pri Southemovej analýze so sondou domény I. Pri použití pôvodnej sondy s veľkosťou 750 bp nebola delegovaná žiadna odpoveď, ale bolo zistené, že tento kloň zahrnuje nukleotidy 1985 až 2773 v 5' oblasti zo SEK. ID. č.: 45.

Neexistencia hybridizácie so sondou s veľkosťou 750 bp môže tiež naznačovať, že tento kloň je ďalším členom z rodiny integrínových proteínov. Z dôvodu overenia vierohodnosti tohto vysvetlenia bol inzert s veľkosťou 13 kb zaklonovaný do vektora pBluescript SKI1⁺. Pri použití primárov zodpovedajúcich nukleotidovým sekvenciám 441 až 461, 591 až 612, 717 až 739 a nukleotidovej sekvencii 898 až 918 v reverznej orientácii v doméne I a_D(SEK. ID. č.: 52) bola zistená sekvencia purifikovanej DNA. Sekvencia DNA bola získaná len pri použití prvého priméru (441 až 461) a účinne amplifikovaný bol len exón nachádzajúci sa najbližšie 5' koncu sekvencie domény I. Amplifikácia zvyšku domény I neprebehla. Výsledný kloň teda obsahuje exón šesť génu myšacieho a_D a sekvencie intrónov priľahlých k 3' a 5' koncu tohto exónu. Exón 7 nebol v tomto klone prítomný. Po sekvenovaní bol vytvorený konštrukt obsahujúci gén pre rezistenciu na neomycín a gén pre tymidín kinázu.

Gén pre rezistenciu na neomycín (nco^r) bol vnesený do plazmidu spôsobom, ktorý prerušil sekvenciu genómovej myšacej DNA kódujúcej proteín. Vzniknutý plazmid teda obsahuje gén neo^r vnútri sekvencie myšacej genómovej

DNA a to všetko je vnútri oblasti kódujúcej tymidín kinázu. Takto skonštruovaný plazmid je vyžadovaný preto, aby bola uprednostnená homológna rekombinácia pred náhodnou rekombináciou [Chisaka a ďalší, Náture 355 : 516 až 520(1992)].

Príklad 24

Klonovanie králičieho a_D - vytvorenie a testovanie králičej cDNA knižnice

Nájdenie ľudských homológ a_D v organizme potkanov a myší viedlo k výskumu existencie králičieho homológu, ktorý by mohol byť užitočný v králičích modeloch opísaných ľudských chorôb.

Pomocou kitu FastTrack firmy Invitrogen (San Diego, CA), podľa návodu uvedeného výrobcom a reakčných činidiel dodaných v kite bola z celej králičej sleziny pripravená poly-A⁺ RNA. Z 1,65 g tkaniva bolo izolovaných 73 pg poly-A⁺ RNA. Táto RNA z králičej sleziny bola použitá na konštrukciu cDNA knižnice ZAP Express s využitím kitu od firmy Stratagene (La Jolla, CA). Získaná cDNA bola smerovo zaklonovaná do reštrikčných miest EcoRI a Xhol v lambda ramenách fágmidového vektora pBK-CMV. Na zabalenie lambda ramien do fágových častíc bol použitý kit „Gigapack II Gold“ (Stratagene). Titer vzniknutej knižnice bol odhadnutý na približne 8 x 10⁵ častíc, s inzertom s priemernou veľkosťou 1,2 kb.

Knižnica bola raz amplifikovaná tak, aby narastené plaky boli konfluentné a bunkový lyzát bol zozbieraný. Namnožená knižnica transformovaná do E. coli bola vysiata v koncentrácii 30 000 pfu/miska (priemer 150 mm) a vzniknutá zmes bola inkubovaná 12 až 16 hodín pri teplote 37, aby došlo k vytvoreniu plakov. Fágové DNA boli prenesené na nylonové membrány Hybond N⁺ (Amersham, Arlington Heights, Ilinois). Membrány boli hybridizované so zmesou dvoch rádioaktívne značených sond myšacieho a_D PCR DNA pripravených pomocou primárov s náhodnou sekvenciou. Prvá sonda bola získaná z PGR produktu, ktorý zahrnuje nukleotidy 149 až 94B v SEK. ID. č.: 52. Druhá sonda bola získaná z PCR produktu, ktorý zahrnuje nukleotidy 2752 až 3651 v SEK. ID. č.: 52. Sondy boli pri použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupom odporúčaným výrobcom, rádioaktívne označené a reakčná zmes bola nanesená na kolónu Sephadex G-50, aby boli odstránená nezainkorporované nukleotidy. Hybridizačný roztok sa skladal z 5X SSPE, 5X Denhardtovho činidla, 1 % SDS, 40 % formamidu a zo zničených sond v koncentrácii 1 x 10⁶ dpm/ml. Hybridizácia prebiehala počas 16 až 18 hodín pri teplote 42 °C. Membrány boli intenzívne premyté v 2X SSPE/0,1 % SDS pri izbovej teplote a exponované na rôntgenový film, aby došlo k vizualizácii všetkých hybridizovaných plakov.

Boli identifikované dva klony, ktoré mali vysoký stupeň sekvenčnej homológie so sekvenciou ľudského a_D. Kloň #2 bol približne 800 bp dlhý a mapoval 5' koniec ľudského a_D. Kloň #2 obsahuje kodón pre štartovný metionín a kompletnú vedúcu sekvenciu. Kloň #7 bol približne 1,5 kb dlhý a zahrnuje kodón pre štartovný metionín. 5' koniec klonu #7 prekrýval kloň #2, zatiaľ čo sekvencie na 3' koncoch končili v miestach za sekvenciami domény I. Kloň #7 bol kompletne osekvenovaný pomocou sekvenačnej metódy „primer-walking“ Nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia klonu #7 sú zobrazené v SEK. ID. č.: 100, resp. 101.

Predpovedaná N-koncová aminokyselinová sekvencia pre králičí a_D, ako bola určená z klonov #2 a #7, naznačila, že tento protein je zo 73 % identický s ľudským a_D> z 65 % identický s myšacím a_D a z 58 % identický s myšacím

CD1 lb, ľudským CD1 lb a ľudským CD11c. Nukleotidová sekvencia klonu #2 je zobrazená v SEK. ID. č.: 92; predpovedaná aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 93.

S využitím rádioaktívne značeného králičieho klonu #7 a opätovného testovania cDNA knižnice, z ktorej tento fragment pochádzal, bol uskutočnený pokus o získanie neskrátenej cDNA kódujúcej králičí a_D. Bolo identifikovaných ďalších 25 klonov a najdlhší bol kloň označený ako #49. S využitím techniky sieťových delécií bola zistená kompletná sekvencia klonu #49. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia klonu #49 sú zobrazené v SEK. ID. č.: 102, resp. 103. Keďže sa klony #7 a #49 neprekrývajú, boli oligonukleotidy, ktoré by mohli byť použité ako priméry pri PCR s prvým reťazcom slezinnej cDNA; cieľom tohto postupuje izolácia chýbajúcej sekvencie.

Vzťah medzi predpokladanými aminokyselinovými sekvenciami týchto dvoch neúplných klonov a ostatných leukointegrínov je opísaný v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Percento zhody v aminokyselinovej sekvencií u členov rodiny integrinov β₂

	ľudská	králičia #7 králičia #49
ľudská «d	100	74	ΘΟ
myšacia	70	67	74
potkania	70	66	73
myšacia CDlla	náhodná*	2Θ	29
myšacia	55	59	53
ľudská CDlla	36	28	28
ľudská CDllb	60	58	55
ľudská CDllc	66	59	62

* ak je zhoda < 25 %, považuje sa táto zhoda za náhodnú

Izolácia klonov králičej a_D umožňuje expresiu proteinu, a to buď na povrchu transfekovaných buniek, alebo vo forme rozpustného neskráteného alebo skráteného proteinu. Získaný proteín je potom použitý ako imunogén na produkciu monoklonálnych protilátok, ktoré nájdu uplatnenie v králičích modeloch ľudských chorôb.

Príklad 25

Živočíšne modely na určenie terapeutickej využiteľnosti a_DImunohistologickc dáta získané u psov a in situ hybridizácia u potkanov a myší určili, že a_D je exprimovaný hlavne makrofágmi prítomnými v červenej pulpe sleziny. V miazgových uzlinách bol a_D nájdený v kapilárach a dutinách v dreni. Distribúcia polypeptidu ot_D je značne podobná distribúcii, ktorá bola získaná pre dva myšacie antigény rozpoznávané monoklonálnymi protilátkami F4/80 a SK39. Zatiaľ čo biochemická charakterizácia týchto myšacích antigénov ukázala ich odlišnosť od a_D, je veľmi pravdepodobné, že a_D určuje rovnakú subpopuláciu makrofágov ako myšacie antigény F4/80 a SK39.

U myší bol zistený výskyt SK39⁺ makrofágov v červenej pulpe sleziny, kde sa najskôr zúčastňujú odstraňovania cudzorodých materiálov z obehu, a v dreni miazgových uzlín [Jutila a ďalší, J. Leukocyte Biol. 54 : 30 až 39 (1993)]. SK39⁺ makrofágy boli pozorované tiež v miestach akútneho a chronického zápalu. Navyše monocyty infiltrované v dutinách peritonea, v ktorých bol zápal vyvolaný pôsobením tioglykolátu, tiež exprimujú antigén SK39. Súhrnom tieto výsledky naznačujú, že ak sú SK39⁺ bunky tiež do pozitívne, potom sú tieto bunky zodpovedné za odstránenie cudzorodého materiálu v slezine a zúčastňujú sa pri zápaloch, kde hrajú makrofágy dôležitú úlohu.

Zatiaľ čo funkcia a_D zostáva neznáma, iné oveľa lepšie charakterizované integríny β₂ sa zúčastňujú mnohých adhéznych dejov, ktoré uľahčujú migráciu buniek, posilňujú fagocytózu a podporujú medzibunkové interakcie. Všetky tieto udalosti vedú k urýchleniu zápalových dejov. Preto je veľmi pravdepodobné, že ovplyvnenie normálnej funkcie a_D môže súčasne narušiť priebeh zápalu, kde hrajú makrofágy dôležitú úlohu. Takýto protizápalový účinok by mohol byť výsledkom: a) zamedzenia infiltrácie makrofágov do miest zápalu; b) zamedzenia aktivácie makrofágov v mieste zápalu alebo c) rušenia účinku efektorových funkcií makrofágov, ktoré poškodzujú zdravé hostiteľské tkanivo buď špecifickou autoimunitnou reakciou alebo následkom poškodzovania okolitých buniek.

Medzi choroby, pre ktoré existujú dôkazy o tom, že tu makrofágy hrajú dôležitú úlohu, patrí roztrúsená skleróza, artritída, artérioskleróza štepu, niektoré formy diabetu a zápalové črevné choroby. Pokiaľ ide o živočíšne modely, diskutované ďalej, bolo dokázané, že tieto modely reprodukujú mnoho črt uvedených ľudských porúch. Aby bolo možné určiť, či existuje možnosť liečby príslušných chorôb u ľudí, boli na týchto modelových systémoch testované inhibítory funkcie a_D.

A. Artérioskleróza štepu

Transplantácia srdca je teraz, pokiaľ ide o niektoré typy srdcových chorôb v konečnom štádiu, prijímanou formou lekárskeho zákroku. Používanie cyklosporínu A zvýšilo počet preživších prvý rok po transplantácii na 80 %, ale rozvoj progresívnej formy artériosklerózy štepu sa prejavil ako najčastejšia príčina smrti u osôb po prvom roku po transplantácii srdca. Nedávne štúdie ukázali v 36 až 44 % prípadov výskyt artériosklerózy štepu v období troch rokov po transplantácii srdca [Adams a ďalší, Transplantation 53 : 1115 až 1119 (1992); Adams a ďalší, Transplantation 56 : 794 at 799 (1993)].

Pri artérioskleróze štepu sa typicky vyskytujú difúzne, oklúzne a intimálne lézie, ktoré postihujú stenu vencových ciev. V týchto léziách dochádza často k ukladaniu lipidov. Patogenéza artériosklerózy štepu zostáva neznáma, ale pravdepodobne je spojená s histokompatibilitnou odlišnosťou medzi darcom a príjemcom, aje vo svojej podstate vyvolaná činnosťou imunitného systému. Z histologického hľadiska sú oblasti, v ktorých dochádza k zhrubovaniu vnútornej cievnej steny, tvorené predovšetkým makrofágmi, aj keď je tu občas pozorovaná aj prítomnosť T-buniek. Je preto možné, že makrofágy exprimujúce a_D, hrajú pri indukcii a/alebo rozvoji artériosklerózy štepu dôležitú úlohu. V takýchto prípadoch by osobám s transplantovaným srdcom, u ktorých existuje riziko rozvinutia artériosklerózy štepu, mohli byť preventívne podávané monoklonálne protilátky alebo nízkomolekuláme inhibítory funkcie a_D (napríklad rozpustný ICAM-R).

Aj keď artérioskleróza štepu predstavuje najväčšie ohrozenie života pre pacientov s transplantovaným srdcom, bol výskyt artériosklerózy štepu pozorovaný takisto u pacientov s inými transplantovanými orgánmi vrátane pečene a obličiek. Terapeutické použitie látok blokujúcich funkciu a_D by mohlo zabrániť vzniku artériosklerózy štepu u osôb s inými transplantovanými orgánmi a znížiť komplikácie vyplývajúce zo zlyhania transplantovaného orgánu.

Jeden model pre artériosklerózu štepu u potkanov zahrnuje heterotypické srdcové aloštepy transplantované cez menšie histokompatibilné bariéry. Aj keď sú srdcové aloštepy z potkanov Lewis transplantované do organizmu prí jemcov F-344, vyznačujúcich sa vzhľadom na darcov kompatibilitou MHC glykoproteínov I. a II. triedy, 80 % aloštepov prežíva aspoň 3 týždne a 25 % aloštepov prežíva neobmedzene dlhý čas. Pri tomto veľmi nízkom počte odmietnutých štepov sa v srdci darcu vytvárajú artériosklerotické lézie. Arteriálne lézie v aloštepoch starých 120 dní obvykle majú difúzne fibrotické zhrubnutie vnútornej steny cievy, ktoré je na pohľad nerozlíšiteľné od lézií v artériosklerotických štepoch pozorovaných pri odmietnutých ľudských srdcových aloštepoch.

Potkanom sú transplantované srdcia, ktoré sa v menej dôležitých histokompatibilných antigénoch líšia od genotypu príjemcu. Takýmto príkladom sú transplantácie z potkanov Lewis do potkanov F-344. Príjemcom transplantátov sú pravidelne podávané monoklonálne protilátky špecifické proti potkaniemu a_D alebo nizkomolekuláme inhibítory a_D. Očakáva sa, že táto liečba zníži incidenciu artériosklerózy štepu v neodvrhnutých srdciach darcov. Liečba potkanov pomocou monoklonálnych protilátok alebo nízkomolekulámych inhibítorov nemusí byť obmedzená len na prevenciu. Očakáva sa, že zablokovanie funkcie a_D povedie k zmierneniu zápalu sprostredkovaného makrofágmi a umožní zvrat poškodzovania artérií v transplantáte.

B. Artérioskleróza u králikov kŕmených cholesterolom

U králikov, ktoré boli počas približne 12 až 16 týždňov kŕmené diétou s prídavkom cholesterolu, došlo k vzniku lézií na vnútornej strane ciev a tieto lézie pokrývali väčšinu lumenálneho povrchu vzostupného úseku aorty [Rosenfeld a ďalší, Arterioscelrosis 7 : 9 až 29 (1987); Rasenfeld a ďalší, Arteriosclerosis 7 : 24 až 34 (1987)]. Aterosklerotické lézie pozorované u týchto králikov sú miernejšie ako tie isté u ľudí. V týchto léziách je prítomný veľký počet Tbuniek, z ktorých väčšina exprimuje CD45RO, ktorý je markérom pamäťových T-lymfocytov. Približne polovica z infiltrovaných T-buniek exprimuje antigén MHC II. triedy a niektoré exprimujú receptor pre IL-2, čo naznačuje, že mnohé z týchto buniek sa nachádzajú v aktivovanom stave.

Jednou z črt aterosklerotických lézií pozorovaných u králikov kŕmených cholesterolom, ktorá sa ale nevyskytuje v hlodavčích modeloch, je akumulácia lézií bohatých na prítomnosť penových buniek. Predpokladá sa, že vznik penových buniek (makrofágy) je dôsledkom príjmu oxidovaných lipoproteínov s nízkou hustotou (LDL) prostredníctvom špecifických receptorov. Bolo zistené, že oxidované častice LDL sú toxické pre niektoré typy buniek vrátane endoteliálnych buniek a buniek hladkej svaloviny. Príjem týchto potenciálne toxických oxidovaných častíc LDL makrofágmi slúži ako iritant a pomáha aktivovať makrofágy, čo prispieva k vytvoreniu zápalov sprevádzajúcich výskyt aterosklerotických lézií.

Hneď ako boli pripravené monoklonálne protilátky proti králičiemu a_D, začala liečba králikov kŕmených cholesterolom. Liečba zahrnovala podávania monoklonálnych protilátok alebo nízkomolekulámych inhibítorov, aby bolo dokázané, že a_D ⁺ makrofágy sa zúčastňujú na týchto procesoch počas choroby. Dodatočné štúdie by ukázali, že monoklonálne protilátky proti a_D alebo nizkomolekuláme inhibítory môžu zvrátiť cievne poškodenia detegované u králikov počas aterogénnej diéty.

C. Inzulín-dependentný diabetes

U potkanov BB sa inzulín-dependentný diabetes samovoľne vyvinul v období medzi 70. až 150. dňom života. Pomocou imunohistochemických analýz bola už v ranom štádiu choroby pozorovaná v Langerhansových ostrovčekoch prítomnosť infiltrovaných MHC II⁺ a ED1⁺ makrofá gov. Mnoho makrofágov sa zdá byť zamestnaných fagocytózou bunkových trosiek alebo normálnych buniek. S postupom choroby je pozorovaný stále sa zväčšujúci počet makrofágov infiltrujúcich Langerhansove ostrovčeky a takisto sa zdá, že sa do tohto miesta sústredí veľké množstvo T-buniek a neskôr tiež B-buniek [Hanenberg a ďalší, Diabetológia 32 : 126 až 134 (1989)].

Rozvoj cukrovky u potkanov BB sa zdá byť závislý tak od včasnej infiltrácie makrofágov, ako aj od následného sústreďovania T-buniek. Liečba potkanov BB pomocou častíc oxidu kremičitého, ktoré sú pre makrofágy toxické, bola účinná tým, že zabránila infiltrácii makrofágov do Langerhansových ostrovčekov v skorom štádiu choroby. Bez včasnej infiltrácie makrofágov nenastáva následné poškodenie tkaniva autoagresívnou populáciou lymfocytov. Podávanie monoklonálnej protilátky OX-19 (špecifickej proti potkaniemu CD5) alebo monoklonálnej protilátky OX-8 (špecifickej proti potkaniemu CD8), ktoré blokujú fázu choroby spojenú s T-bunkami, je takisto účinné pri potláčaní rozvoja diabetu.

Centrálna úloha, ktorú majú makrofágy v patológii tohto modelu, robí tento model atraktívnym na testovanie inhibítorov funkcie a_D. Potkany geneticky predisponované na rozvinutie inzulín-dependentného diabetu sú liečené monoklonálnymi protilátkami proti a_D alebo nizkomolekulámymi inhibítormi a je u nich vyhodnocovaný vývoj choroby. Zabránenie alebo oddialenie nástupu choroby je dôkazom, že a_D hrá kľúčovú úlohu v poškodení buniek ostrovčekov spôsobenom makrofágmi.

D. Zápalové črevné choroby (Crohnova choroba, vredovitá kolitída)

Živočíšne modely, použité pri štúdiu zápalovej črevnej choroby (IBD - inflammatory bowel disease), sú zvyčajne vystavené intrarektálnemu podávaniu škodlivých dráždidiel (napríklad kyselina octová alebo kyselina trinitrobenzénsulfónová/etanol). Zápal hrubého čreva vyvolaný týmito látkami je výsledkom chemického alebo metabolického poškodenia a nemá chronický a spontánne recidívny charakter, sprevádzajúci ľudské zápalové črevné choroby. Zdá sa však, že nedávno opísaný model využívajúci subserózne injekcie purifikovaného polyméru peptidoglykánpolysacharid (PG-PS) získaného zo streptokokov skupiny A alebo skupiny D, poskytuje lepší, fyziologicky relevantný model pre ľudské IBD [Yamada a ďalší, Gastroenterology 104: 759 až 771 (1993)].

V tomto modeli je PG-PS aplikovaný do subseróznej vrstvy distálneho hrubého čreva. Vyvolaná zápalová choroba má dve fázy, prvú akútnu fázu tri dni po injekcii, ktorá je nasledovaná spontánnou chronickou fázou o tri až štyri týždne neskôr. Odpoveď neskorej fázy je vo svojej podstate granulomatózna a vedie k zhrubnutiu hrubého čreva, adhéziám, k vzniku uzlíkov a mukóznych lézií. Okrem poškodenia sliznice vedie kolitída (vyvolaná PG-PS) často k artritíde, anémii a granulomatóznej hepatitíde. Extraintestinálne prejavy choroby robia model atraktívnym na štúdium Crohnovej kolitídy, pretože veľké množstvo pacientov s rozvinutou Crohnovou chorobou trpí zápalmi kĺbov a hepatobiliárnymi zápalmi.

Vznik granulomatóznych lézií je dôsledkom chronického zápalu, ktorý vedie k infiltrácii a potom aktivácii buniek z línie monocyty/makrofágy. Výskyt granulomatóznych lézií pri Crohnovej chorobe a pri uvedenom živočíšnom modeli, robí z tohto modelu atraktívny klinický cieľ pre monoklonálne protilátky namierené proti a_D a pre iné inhibítory funkcie a_D. Pokiaľ ide o inhibítory funkcie a_D, očakáva sa zamedzenie tvorby lézií sprevádzajúcich IBD či dokonca zvrat v tkanivových poškodeniach vyskytujúcich sa pri tejto chorobe.

E. Artritída

Zdá sa, že artritída je multifaktoriálna choroba, na ktorej sa zúčastňujú rôzne typy buniek zápalu, vrátane neutrofilov, T-lymfocytov a fagocytárnych makrofágov. Aj keď existuje množstvo modelov artritídy, aplikácia proteglykánu získaného z bunkovej steny streptokokov spôsobuje poruchu najviac podobnú ľudskej chorobe.

V organizme potkanov vyvoláva bunková stena streptokokov zápal periférnych kĺbov, ktorý je charakterizovaný opakovanými záchvatmi postupujúcej choroby nasledovanými remisiami a nakoniec, počas niekoľkých mesiacov, končí deštrukciou kĺbov [Cromartie a ďalší, J. Exp. Med. 146 : 1585 až 1602 (1977); Schwab a ďalší, Infection and Immunity 59 : 4436 až 4442 (1991)]. Predpokladá sa, že najväčšiu úlohu v deštrukcii synovie hrajú počas chronickej fázy choroby mononukleárne fagocyty a makrofágy. 0krem toho látky potláčajúce infiltráciu makrofágov do synovie účinne znižujú zápalové a patologické charakteristiky artritídy.

Centrálna úloha makrofágov pri deštrukcii synovie vedúcej k artritíde naznačuje, že monoklonálne protilátky proti a_D a inhibítory funkcie a_D môžu byť pri liečbe tejto choroby terapeuticky účinné. Rovnako ako pri opísaných modeloch sa predpokladá, že tieto monoklonálne protilátky a nízkomolekuláme inhibítory podávané preventívne zablokujú alebo zmiernia kĺbny zápal a zabránia zničeniu synovie. Látky majúce rušivý vplyv na funkciu a_D môžu takisto zmierniť prebiehajúci zápal tým, že zabránia infiltrácii ďalších makrofágov ku kĺbu a zablokujú aktiváciu makrofágov. Výsledným efektom by bol zvrat postupujúcej deštrukcie kĺbu a uľahčenie uzdravenia tkaniva.

F. Roztrúsená skleróza

Aj keď patogenéza roztrúsenej sklerózy (MS) zostáva nejasná, je všeobecne prijímané, že choroba je sprostredkovaná CD4⁺ T-bunkami, ktoré rozpoznávajú autoantigény prítomné v centrálnom nervovom systéme a začínajú tak zápalovú kaskádu. Vzniknutá imunitná odpoveď má za následok infiltráciu ďalších buniek zápalu, vrátane aktivovaných makrofágov, ktoré prispievajú k rozvoju choroby. Živočíšny model experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE) reprodukuje niektoré aspekty choroby MS. Nedávno bolo dokázané, že monoklonálne protilátky reagujúce s CD1 lb/CD18 prítomnými na makrofágoch spôsobujúcich zápal [Huitinga a ďalší, Eur. J. Immunol. 23 : 709 až 715 (1993)] blokujú tak klinické, ako aj histologické príznaky choroby. Výsledky napovedajú, že monoklonálne protilátky alebo nízkomolekuláme inhibítory polypeptidu a_D sú pravdepodobne Pri chorobe EAE účinné v blokovaní zápalovej reakcie. Tieto látky majú teda dôležité terapeutické uplatnenie pri liečbe MS.

G. Alveolitida vyvolaná imunitným komplexom (Immune Complex Alveolitis)

Alveolárne makrofágy lokalizované v alveolách, kanálikoch, spojivovom tkanive a pohrudničných dutinách pľúc, predstavujú prvú obrannú líniu pľúc proti látkam vdychovaným z okolitého prostredia. Ako odpoveď na simuláciu látkami (bakteriálny liposacharid, intergerón IFN-τ a imunitný komplex) produkujú alveolárne makrofágy mnohé silné mediátory zápalu, vrátane veľmi reaktívnych kyslíkových radikálov a dusíkatých medziproduktov. Zatiaľ čo hyperoxidové anióny, peroxidy vodíka a oxidy dusíka (NO’) majú dôležitú funkciu pri ničení patogénov a lýze nádorov, môžu tieto látky v zdravých tkanivách spôsobiť ich poškodenie.

Pre potkaní model alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom bolo dokázané, že produkcia NO' alveolárnymi makrofágmi spôsobuje mnohé z poškodení pľúc [Mulligan a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 : 638 až 6342 (1991)]. Radikály NO' vykonávajú funkciu mediátorov aj pri iných poškodeniach spojených s imunitným komplexom, vrátane dermálnej vaskulitídy [Mulligan a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 : 638 až 6342 (1991)] a mohli by potenciálne hrať úlohu pri chorobách, ako je napríklad glomerulonefritída.

Poškodenia spôsobené NO nie sú obmedzené len na zápaly s účasťou imunitného komplexu. Napríklad mikrogliálne bunky stimulované látkami, ako je PMA, LPS alebo IFN-τ, produkujú NO v množstve schopnom usmrtiť oligodendrocyty [Merrill a ďalší, Immunol. 151 : 2132 (1993)]. Bolo zistené, že pankreatické ostrovčeky sú citlivé k radikálom N0‘ a uvoľňovanie tohto mediátora makrofágu spôsobilo poškodzovanie tkanív, ktoré viedlo k diabetu [Kroncke a ďalší, BBRC 175 : 752 až 758 (1991)]. Nedávno bolo presvedčivo dokázané, že produkcia NO' hrá dôležitú úlohu pri endotoxickom šoku [MacMicking a ďalší, Celí 81 : 641 až 650 (1995)]. Keď bol aplikovaný lipopolysacharid (LPS) zdravým myšiam divokého typu, bol pozorovaný vážny progresívny pokles tepnového tlaku končiaci smrťou. Pokiaľ ide o myši, u ktorých nie je možné indukovať tvorbu NO’, bol v reakcii na prítomnosť LPS pozorovaný oveľa menší pokles tepnového tlaku a všetky myši tento experiment prežili.

Pokusy uskutočňované in vitro ukázali, že zablokovanie a_D je účinné pri potlačení niektorých aspektov aktivácie makrofágov (alebo všeobecne leukocytov exprimujúcich a_D), vrátane uvoľňovania N0‘. Alveolárne makrofágy stimulované za prítomnosti polyklonálneho séra proti a_D(proti potkanej doméne I polypeptidu a_D1 pripravenej v králikoch) produkovali podstatne menej dusitan/dusičnanových produktov pri odbúravaní NO’, než makrofágy vystavené pôsobeniu kontrolného séra. Tieto zistenia dokazujú, že monoklonálne protilátky namierené proti a_D, konkrétne proti I-doméne, môžu byť účinnými protizápalovými činidlami s možným využitím pri MS, diabete, zápale pľúc a endotoxickom šoku. Navyše, v protiklade k CD18 podjednotke, ktorá ovplyvňuje funkciu mnohých typov leukocytov, obmedzená distribúcia a_D robí z tejto podjednotky oveľa atraktívnejší cieľ (ako je to pri CD 18) pre blokovanie aktivácie makrofágov (alebo všeobecne leukocytov exprimujúcich a_D).

Alveolitida vyvolaná potkaním IgG imunitným komplexom je všeobecne používaný experimentálny model dôležitý pre porozumenie akútnemu poraneniu pľúc. Toto poranenie je vyvolané nakvapkaním protilátok namierených proti hovädziemu sérovému albumínu (B SA) do pľúc pomocou tracheálnej kanyly, nasledovaným intravenóznou injekciou BSA. Sformovanie imunitných komplexov v pľúcnych kapilárach vedie k aktivácii komplementu a infiltrácii neutrofilov do pľúc. Podľa všetkého, po sformovaní imunitných komplexov v pľúcach, dôjde k extravazácii leukocytov z krvi a následnému pohybu leukocytov cez pľúcny epitel. Následné uvoľnenie mediátorov vrátane radikálov, TNF-α a NO’ z aktivovaných endoteliálnych buniek neutrofilov a makrofágov, prispieva k postupu choroby. Patologické črty choroby zahrnujú zväčšenie vaskulárnej permeability vedúce k opuchom a prítomnosti veľkého počtu erytrocytov a polymorfonukleámych buniek v alveolárnych dutinách.

SK 283135 Β6

Polyklonálne sérum špecifické proti doméne I polypeptidu a_D bolo testované na potkaňom modeli alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom. Toto polyklonálne sérum bolo aplikované do pľúc tracheálnou kanylou spolu s protilátkami proti BSA. Poranenie pľúc bolo potom vyvolané intravenózne alikáciou BSA so stopovým množstvom BSA značeného izotopom 1251 (približne 800 000 cpm), aby mohol byť kvantifikovaný opuch vzniknutý poranením pľúc. Pľúcne poranenie prebiehalo ďalšie 4 hodiny a veľkosť poranenia bola vyhodnotená z hodnoty pľúcnej permeability, ktorá je definovaná ako pomer BSA značeného izotopom ¹²⁵I v pľúcach k jeho množstvu prítomnom v krvi. Typické hodnoty pľúcnej permeability pre pozitívnu kontrolu leží medzi 0,6 až 0,8, zatiaľ čo negatívne kontroly (potkany, ktoré nedostali BSA) majú hodnotu pľúcnej permeability v rozsahu 0,1 až 0,2.

Prvé štúdie dokázali, že pri liečbe pomocou polyklonálneho séra proti a_D sa znižuje permeabilita pľúc o viac ako 50 %, čo predstavuje dramatické zmiernenie pľúcneho poranenia. Z histórie je známe zníženie permeability pľúc o 60 %, ktoré bolo dosiahnuté podávaním protilátok proti CD18. Tieto zistenia dokazujú, že a_D môže byť najdôležitejší integrín fi₂ počas akútneho poranenia pľúc, aj keď nemôže byť presne určené, či účinok protilátok zabraňuje extravazácii leukocytov z krvi alebo pohybu leukocytov cez pľúcny epitel.

Ďalším dôkazom skutočnosti, že polypeptid a_D zmierňuje priebeh poranenia pľúc, bolo stanovenie hladiny TNF-α v kvapaline získanej výplachom ich bronchoalveolámej časti. Pri podávaní protilátok proti a_D bol zistený štvornásobný pokles hladiny TNF-α. TNF-alfa bol už dlho považovaný za dôležitý mediátor pri akútnom zápale pľúc a látku zodpovednú za infiltráciu buniek zápalu do miest zápalu, aktiváciu buniek a poškodenie tkanív. Sérum namierené proti a_D pravdepodobne blokuje aktiváciu rezidentných alveolárnych makrofágov počas vzniku alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom a tým zmierňuje uvoľňovanie TNF-alfa a NO' a znižuje následné poškodenie tkanív spôsobené týmito látkami a infiltráciou neutrofilov.

Príklad 26

Expresia a_D v preklinických modeloch

Aby mohla byť stanovená rozdielna expresia a_D v rôznych štádiách choroby, boli rezy tkanív zo živočíšnych modelov choroby značené polyklonálnym sérom proti a_Dzískaným opísaným postupom (pozri príklad 18). Tkanivá zo zdravých a chorých potkanov boli rozrezané na hrúbku 6 pm a vysušené na vzduchu na podložných sklíčkach Supcrfrost Plus (VWR Scientific) cez noc pri izbovej teplote. Po vysušení boli rezy až do použitia skladované pri teplote -70 °C. Pred použitím boli sklíčka preložené z -70 °C na približne 5 minút od 50 °C. Rezy boli počas 10 minút pri izbovej teplote fixované studeným acetónom (4 °C) (Stephens Scientific) a ponechané schnúť pri izbovej teplote. Každý rez bol počas 30 minút pri izbovej teplote blokovaný 150 pl roztoku so zložením 30 % normálne potkanie sérum (Harlan Bioproducts), 5 % normálne kozie sérum (Vector Laboratories) a 1 % hovädzie sérum (BSA) (Sigma Chemical Company) v IX TBS a potom bol roztok z rezov jemne odsatý. Králičie polyklonálne sérum (koncentrácia proteínu 34 pg/ml) a sérum z rovnakého králika (získané pred imunizáciou) (koncentrácia proteínu 38,5 pg/ml) bolo zriedené v blokovacom roztoku. Ku každému rezu bolo potom, na čas 30 minút pri teplote 37 °C, pridaných 100 pl jednotlivého séra. Roztok protilátok bol potom odsatý a nenaviazané protilátky odstránené trojnásobným premytím v IX TBS vždy počas 5 minút. Po poslednom premytí bol nadbytok

TBS odstránený odsatím. Biotinylovaná kozia protilátka namierená proti králičím Ig bola pripravená s využitím kitu „Elite Rabbit IgG Vectastain ABC“ (Vector), podľa návodu odporúčaného výrobcom a 100 pl výsledného roztoku bolo nanesených na každý rez na 15 minút pri teplote 37 °C. Sklíčka boli dvakrát premývané v IX TBS, vždy počas 5 minút. Potom bolo na tkanivové rezy nanesených 100 pl konjugátu streptavidín-zlato (Goldmark Biologicals) riedeného v pomere 1 : 100 v 5 % normálnom potkaňom sére a 1 % BSA a tento roztok bol ponechaný pôsobiť 1 hodinu pri izbovej teplote. Sklíčka boli trikrát premývané pufrom TBS, vždy počas 5 minút a potom na ne bolo na 5 minút pri izbovej teplote nanesených 100 pl 1 % glutaraldehydu (Sigma) v TBS pufri. Sklíčka boli opäť trikrát premývané v TBS, vždy počas 5 minút a päťkrát v sterilnej deionizovanej vode, vždy počas 3 minút. Prebytok kvapalín bol odsatý a na každý rez boli nanesené dve kvapky strieborného zosilňujúceho roztoku a dve kvapky iniciačného roztoku (Goldmark Niologicals). Reakcia bola ponechaná prebiehať 20 až 30 minút pri izbovej teplote. Potom boli rezy dôkladne opláchnuté sterilnou deionizovanou vodou, vysušené cez noc pri izbovej teplote na vzduchu a prekryté Cytoseal 60 (VWR). Ako kontrola boli, pri rovnakých pokusoch a podľa rovnakého protokolu, použité rezy tkanív značené monoklonálnymi protilátkami rozpoznávajúcimi CDlla,CDllb, CDllcaCD18.

Značenie polyklonálnym sérom proti a_D a značenie monoklonálnymi protilátkami proti CD1 la, CD1 lb, CD1 lc a CD 18 odhalila pre a_D, v porovnaní s distribúciou pozorovanou pre iné podjednotky a, odlišnú distribúciu značky.

V normálnom pľúcnom tkanive bola expresia a_D detegovaná na respiračnom epiteli priedušiek (ale nie na epiteli pľúcnych alveol) a na jednotlivých bunkách, čo by mohli byť alveolárne makrofágy vo vzduchových kanálikoch. Signál pozorovaný pri značení pomocou polyklonálneho séra bol podstatne silnejší než signál pozadia, pozorovaný pri kontrole uskutočňovanej so sérom získaným pred imunizáciou. V pľúcnom granulomatóznom tkanive bol 24 a 96 hodín po aplikácii glykánu detegovaný odlišný signál, keď sa a_D značenie objavilo v respiračnom epiteli vnútri pľúcnych alveol a silnejší signál bol zaznamenaný na alveolárnych makrofágoch vnútri vzduchových kanálikov. V pľúcnom tkanive živočíchov podľa všetkého zotavených z choroby (usmrtených 16 dní po aplikácii glykánu), nebol pozorovaný žiadny signál pri značení protilátkou proti a_D. V každom z týchto tkanív bol detegovaný, pri značení pomocou séra získaného pred imunizáciou, veľmi slabý signál pozadia.

Pri použití potkanieho pľúcneho tkaniva v modeli astmy vyvolanej antigénom bol v respiračnom epiteli tak priedušiek, ako aj pľúcnych alveol detegovaný veľmi silný signál protilátky namierenej proti a_D. Intenzita tohto signálu bola podstatne vyššia ako úroveň signálu pozadia získaná pri použití kontrolného séra z neimunizovaného živočícha.

Je možné predpokladať, že odborníkov napadnú ďalšie modifikácie a variácie vynálezu vysvetleného v uvedených ilustratívnych príkladoch. Preto by pre vynález mali platiť len tie obmedzenia, ktoré sú uvedené v pripojených patentových nárokoch.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ: Gallatin, W. Michael Van de Vieren, Monica

SK 283135 Β6 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Nová alfa podjednotka ľudského integrínu β₂ (iii) POČET SEKVENCIÍ: 103 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:

(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŔEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelár (B) ULICA: Národní 32 (C) MESTO: Praha 1 (D) ŠTÁT: Česká republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppydisk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verzia č. 1.25 (vi) DÁTA O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA:

(C) ZATRIEDENIE:

(vii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/173497 (B) DÁTUM PODANIA: 23. decembra 1993 (vii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/286889 (B) DÁTUM PODANIA: 5. októbra 1994 (vii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/362652 (B) DÁTUM PODANIA: 21. decembra 1994 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: GOWSHALL, Jonathan Vallance (B) ČÍSLO SPISU: PI 1779SK-JVG/smt (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

(A) TELEFÓN:

(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3726 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 3 . .3485 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 1:

TG ACC TTC GGC ACT CTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47

Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His 15 10 15

GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT

ACG ATC

TTC CAG GAG GAT GCA

95

Gly Phe Asn Leu Asp

Val

Glu

Pro

Thr 25

íle

Phe

Gin

Glu Asp Ala 30

20

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC

GTG

CAG

TTC

GGT

GGA

TCT

CGÄ

CTC

GTG

143

Gly

Ph·

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Ph·

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG GTG

GTG

GCG

GCC

AAC

CAG

ACG

GGA

CGG

CTG

191

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC

GGC

ATG

TGC

CAG

CCC

ATC

CCG

CTG

CAC

239

Tyr

Asp

Cys

Ale

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

íle

Pro

Leu

HĹs

65

70

75

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG AAC

ATG

TCC

TTG

GGC

CTG

ACC

CTG

GCA

GCC

287

tie

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

80

85

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG

GCC

TGT

GGC

CCG

ACC

CTG

CAC

AGA

335

Ser

Thr

Asn

Gly

S«r

Arg

Leu

L«u

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

HÍS

Arg

100

105

110

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA

AAG

GGT

TCC

TGC

CTC

CTG

GGC

383

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

TCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA

GTC

CCC

GAC

GCC

ACG

CCA

GAG

TGT

431

Ser

Arg

Trp

Glu

íle

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

CCA CAT

CAA

GAG

ATG GAC ATC

GTC

TTC

CTG ATT

GAC

GGC

TCT

GGA

AGC

<79

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

ATT

GAC

CAA

AAT

GAC

TTT

AAC

CAG

ATG

AAG

GGC

TTT

GTC

CAA

GCT

GTC

527

íle

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Het

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

160

165

170

175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC

ACC

CTG

TTT

GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

57S

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

TTC

ACC

TTC

ACC

CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

623

Ser

Asn

Leu

Lys

íle

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Ph·

Arg

Thr

Ser

195

200

205

CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG

671

Pro Ser Gin Gin Ser

Leu VaL

Asp 215

Pro

íle

Val

Gin Leu Lys 220

Gly Leu

210

ACG

TTC

ACG

GCC

ACG

GGC

ATC

CTG

ACA

GTG

ACA

CAG

CTA

TTT

CAT

719

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

HÍS

225

230

235

CAT

AAG

AAT

GCG

GCC

CCA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATT

GTC

ATC

767

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

val

íle

240

245

250

255

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

GAA

TAC

AGT

GAT

GTC

ATC

815

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

260

265

270

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC

CGC

TAC

GCT

ATC

GGG

GTG

GGA

863

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Íle

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

VaL

Gly

275

280

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

911

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

959

Ser

Ale

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

AAG

ATC

TAT

GCA

GTT

GAG

1007

Leu

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Clu

Lys

íle

Tyr

Ala

Val

Glu

320

325

330

335

GGA

ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

TCC

TTC

CAG

CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1055

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Ph·

Gin

His

Glu

Het

Ser

Gin

340

345

350

GAA GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA

ATG

GAT

GGC

CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1103

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ale

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

CTG

TAT

CCC

CCA

AAT

1151

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1199

Het

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Het

Arg

385

390

395

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GAG

CTA

GCC

CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1247

ASp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

400

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC

CGC

TAC

CAG

CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1295

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

4 30

GTC

ATC

TTC

ACC

CAG

GTG

TCC

AGG

CAA

TGG

AGG

AAG

GCC

GAA

GTC

1343

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ale

Glu

Val

435

440

445

ACA GGG ACG CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC

TGC TCC GTG Cys Ser Val

1391

Thr Gly Thr Gin íle

Gly Ser

Tyr 455

Phe

Gly

Ala

Ser Leu 460

450

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

ccc

1439

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Zle

Leu

Zle

Gly

Ala

Pro

465

470

475

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

1487

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg Gly

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pxo

Leu

480

485

490

495

CCT

AGG

GGG

CAG

AGG

GTG

CAG

TGG

CAG

TGT

GAC

GCT

GTT

CTC

CGT

GGT

1535

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ale

Val

Leu

Arg Gly

500

505

510

GAG

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

1583

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

GGG

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

1631

Gly Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Zle

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

530

535

540

GGA

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

1679

Gly

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg Gly Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

Hla

Gly Ale

Ser

545

550

555

GAA

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

1727

Glu

Ser

Gly

11«

Ser

Pro

Ser

Hla

Ser

Gin

Arg

Zle

Ale

Ser

Gin

560

565

570

575

CTC

TCC

ccc

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

CCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

1775

L«U

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

SBO

595

590

GAC

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

1823

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

60S

CAG

GTG

CTC

CTG

CTC

ACG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA GTG

GGG

GTG

GCC

1871

Gin

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Vel

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

610

615

620

ATG

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

1919

Nst

Arg

Ph·

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

625

630

635

GAA

GAG

AAG

CCC

AGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

1967

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

640

645

650

655

ACC

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

2015

Thr

11«

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

11«

Gin

Ser

660

665

670

GTC

AGG

TTT

GAT

CTG

GCA

CTG

GAC

CCA

GGT

CCT

CTG

ACT

TCT

CGT

GCC

2063

Val

Arg

Ph·

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

675

680

685

CAG GAA GAA

TCC ACC

AAG Lys

TAC TTC Tyr Phs 935

AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG

2831

Gin

Glu

Glu 930

Ser

Thr

Asn Phe

Ala

Thr Ser Asp 940

Glu Lys

AAA

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

2679

Lys

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

Kla

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

945

950

955

CGA

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

2927

Arg Asp

Leu

Ala

íle

Ser

11«

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

960

965

970

975

GGG

GTG

GCT

GTG

TGG

GAT

GTG

GTC

ATG

GAG

GCC

CCA

TCT

CAG

AGT

CTC

2975

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Α«Ρ

Vel

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

980

965

990

CCC

TGT

GTT

TCA

GAG

AGA

AAA

CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC

TTC

CTG

ACC

3023

Pro

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lys

Pro

Pxo

Gin

His

Ser

Asp

Ph·

Leu

Thr

995

1000

1005

CAG

ATT

TCA

AGA

AGT

CCC

ATG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TK

CTG

3071

Gin

Zle

Ser

Arg

Ser

Pro

Met

L«u

Asp

Cys

Ser

11·

Ala

A*p

Cys

Leu

1010

1015

1020

CAG

TTC

CGC

TGT

GAC

GTC

CCC

TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG

CAG

CTG

GAT

3119

Gin

Phs

Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Vsi

Gin

Glu

Leu

Asp

1025

1030

1035

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAT

CTC

AGT

TTC

GGC

TGG

GTC

CGC

CAG

ACA

TTG

3167

Phs

Thr

Leu

Lya

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

1040

1045

1050

1C5S

CAG

AAG

GTG

TTG

GTC

GTG

AGT

GTG

GCT

GAA

ATT

ACG

TTC

GAC ACA

3215

Gin

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Asp Thr

1060

1065

1070

TCC

GTG

TAC

TCC

CAG

CTT

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

ATG

AGA

GCT

CAG

3263

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

1075

1080

1085

ATG

GAG

ATG

GTG

CTA

GAA

GAC

GAG

GTC

TAC

AKT

GCC

A7T

CCC

ATC

3311

Met

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

n·

Pro

íle

1090

1095

1100

ATC

ATG

GGC

AGC

TCT

GTG

GGG

GCT

CTG

CTA

CTG

GCG

CTC

ATC

ACA

3359

n·

Met

Gly

Ser

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

1105 1110 1115

GCC ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AM GAA ATG3407

Ala The Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Axg His Tyr Lys GluMet

1120 1125 11301135

CTG GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC3455

Leu Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Pht Ser Gly Asp AspPhe

1140 11451150

AGC TGT GTG GCC CCA AAT CTG CCT TTG TČC TAATAATCCA CTTTCCTGTT3505

Ser Cys val Ale Pro Asn Val Pro Leu Ser

11551160

ATT TTC AAT

GAA ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG

íle

Phs

Asn 690

G1U Thr

Lys

Asn

Pzo Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu

695

700

GGA

CTG

GGG

ATT

CAC

TGT

GAA

ACC

CTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAT

TGT

Gly

Leu

Gly

Zle

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

705

710

715

GTG

GAG

GAT

GTG

AGC

CCC

ATC

ATT

CTG

CAC

CTC

AAC

TTC

TCA

CTG

Val

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

íle

Xle

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ssr

Leu

720

725

730

735

GTG

AGA

GAG

CCC

ATC

CCC

TCC

CCC

CAG

AAC

CTG

CGT

CCT

GTG

CTG

GCC

Val

Arg

Glu

Pro

Zle

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

TGT

GGG

CAA

GAT

GGC

CTC

TGT

GAA

GGG

GAC

CTG

GCT

GTC

ACC

CTC

AGC

Cys

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

770

775

780

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

785

790

795

GTG

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

AAC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

Val

XI·

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

val

900

805

810

815

GTC

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

Val

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

820

825

830

GCC

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA

Ala

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Lau

Ala

Cys

Glu

Thr

835

840

845

GTG

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

Val

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

850

855

860

CAC

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

His

Pro

íle

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

íle

Val

Thr

Phe

665

870

875

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

880

885

890

895

AGT

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

Ssr

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

900

905

910

CAS

CTG

GAG

CTC

CCG

GTG

AAG

TAT

GCA

GTC

TAC

ACC

ATG

ATC

AGC

AGG

GLn

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lye

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

íle

Ser

Arg

915 920 925

2111

2159

2207

2255

2303

2351

2399

2447

2495

2543

2S91

2639

2687

2735

2783

TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA AGATAGAGAT TGTAATGTTT T7ACATATCT TACAGAAGCA GGCATGGTGC CAGCATAAAT

GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA3566

ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG3625

GTCCATCTTT TTCÄGCAATG ACCCACTTTT3695

TTTCATATGC T3726 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 2 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 2:

Thr

Phe

Gly

Thr

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

Tyr

His

Gly

1

5

10

15

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

Zle

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

Gly

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Zle

Pro

Leu

His

íle

65

70

75

80

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

ALa

Ser

85

90

95

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

Val

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

lis

120

125

Arg

Trp

Glu

íle

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

cys

Pro

130

135

140

His

Gin

Glu

Met

Asp

Zle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

145

150

15S

160

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

Het

165

170

175

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

165

190

Asn

Leu

Lys

íle

K18

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

Pro

195

200

205

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Ly»

Gly

Leu

Thr

210

215

220

Phe 22S

Thr Ala Thr Gly íle Lea Thr Val Val 230

Thr 235

Gin Leu

Phe

Kls

His 240

Pro 865

íle Phe His Glu

Gly Ser Asn Gly Thr Phe íle Val Thr Phe Asp

870

875

B80

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

Thr

245

250

255

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Äsp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

Pro

260

265

270

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

»10

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg Tyr

Al*

Ilt

Gly

Val

Gly

His

275

280

285

Leu

Glu

Leu

Pro

val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

íle

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

Glu

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Aan

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

GlU

Lys

930

935

940

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

Leu

305

310

315

320

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

94S

950

955

960

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Tyr

Ala

Val

Glu

Gly

11*

325

330

335

Asp

Leu

Ala

Ser

Zle

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Lau

Aan

Gly

965

970

975

Thr

GLn

Ser

Arg 340

Ala

Ser

Phe 345

Gin

His

Glu

Met

Ser 350

GlnGlu

Val

Al*

Val

Trp 980

A»P

Val

Met

G1U 985

Al*

Pro

Ser

Gin

Ser 990

Leu

Pro

Gly

Phe

Str 355

Thr

Ala

Leu

Thr

Ket 360

Asp Gly

Leu.

Phe

Leu 365

Gly

Ala

Val

Cys

Val

Ser 995

Glu

Arg

Lys

Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp

Phe Leu 1005

Thr

Gin

Gly

Ser 370

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly Gly 375

Ala

Phe

Leu

Tyr 380

Pro

Asn

Met

íle

Ser Arg 1010

Ser

Pro

Met

Lau Aap 1015

Cys

Sar

íle

Ala Aap 1020

Cys

Leu

Gin

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

Phe

Arg 5

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Asp

Phe

385

390

395

400

102!

1030

1035

1040

Sar

Tyr

Leu

Gly Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

Gin

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Gin

405

410

415

1045

1050

1055

Asn

Leu

Val

Leu

Gly Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

Val

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

420

425

4 30

1060

1065

1070

íle

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

GLn

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

Thr

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

Met

435

440

445

1075

1080

1085

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

íle

Pro

íle

450

455

460

1090

1095

1100

Val

Asp

Ser

Asp Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

íle

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

HiS

Het

Gly

Ser

Val

Gly

Al*

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Ala

465

470

475

480

1105

1110

1115

1120

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

Pro

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His Tyr Lys

Glu

Met

Leu

485

490

495

1125

1130

1135

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

Asp

Lys

Pro

Glu Asp

Thr

Ala

Thr

Phe Ser Gly Asp Asp

Phe

Ser

500

505

510

1140

1145

1150

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Cys

Val

Ala

Pro Asn

Val

Pro

Lys

Ser

515

520

525

1155

116Q

Aap

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

íle

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

530

S35

540

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.:

3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

(A) DĹŽKA: 1153 aminokyselín

545

SSO

555

560

(B) TYP: aminokyselina

Sar

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Ser

Gin

Leu

(C) POČET REŤAZCOV: jeden

565

570

575

(D) TOPOLOGIA: lineárna

Ser

Pro

Arg

Leu 580

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin 585

Ala

Leu

Ser

Gly

Gly 590

Gin

Asp

(ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.:

: 3:

Leu

Thr

Gin

Aap

Gly

Lau

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly Al*

Arg

Gly

Gin

595

600

605

Met Ala Leu Arg Val Leu Leu Leu Thr

Ala

Leu

Thr

Leu

Cys

His

Gly

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

1 5

10

15

610

615

620

Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met

Thr

Phe

Gin

Glu

Asn

Al*

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

20 25

30

625

630

635

640

Gly Phe Gly Gin Sar Val Val Gin Leu

Gin

Gly

Ser

Arg

Val

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

35 40

45

645

650

655

Gly Ala Pro Gin Glu íle Val Ala Ala

Asn

Gin

Arg

Gly

Ser

Leu

Tyr

íle

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu Gly

Asp

11*

Gin

Ser

Val

50 55

60

660

665

670

Ala

íle

Gin Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys

Glu

Pro

íle

Arg

Leu

GLn

Val

Arg

Phe

Asp

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

65 70

75

80

675

680

685

Gly

Pro Val Glu Ala Val Asn Met Ser Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Al*

Thr

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg Arg

Lys

Thr

Leu

85

90

95

690

695

700

His

Glu

Val

Thr Ser Pro Pro Gin Leu Leu Ala Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Gin

Thr

Leu

Gly

íle

Cys

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

100 105

110

705

710

715

720

íle

His

Leu

Val

Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

Phe

Gly

Ser

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

íle

Leu

Asn

Phe

Ser

115 120

125

725

730

735

Arg

Glu

Pro

íle

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Asn Leu Arg Gin Gin Pro Gin Lys Phe 130 135

Pro

GLu

Ala 140

Leu

Arg

Gly Cys

740

745

750

Gly

Ser

Gin 755

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala 760

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu 765

Lys

Asn

Cys

Pro Gin Glu Asp Ser Asp íle Ala Phe 145 150

Leu

íle 155

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser 160

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

íle íle Pro His Asp Phe Arg Arg Met 16S

Lys 170

Glu

Phe

Val

Ser

Thr 175

Val

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

Met Glu Gin Leu Lys Lys Ser Lys Thr 180 185

Leu

Phe

Ser

Leu

Het 190

Gin

Tyr

785

790

795

800

íle

Val

Thr

Val

Trp 805

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp 810

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val 815

Val

Ser Glu Glu Phe Arg íle His Phe Thr 195 200

Phe

Lys

Glu

Phe 205

Gin

Asn

Ser

Leu

Tyr

Tyr 820

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser 825

His

Arg

Val

Ser 830

Gly

Ala

Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro 210 215

íle

Thr

Gin 220

Leu

Gly

Arg

Gin

Lys

Gin 835

Pro

HiS

Gin

Sex

Ala 840

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Thr

val

Thr His Thr Ala Thr Gly 11* Arg Lys 225 230

Val

Val 235

Arg

Glu

Leu

Phe

Asn 240

Pro

Thr 850

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu 855

Arg

Ser

Arg

Cys 860

Ser

Val

Asn

His

íle Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn Ala 245

Phe 250

Lys

íle

Leu

Val

Val 255

íle

The Asp

Gly

Glu

Lys

Phe

Gly .

Aap

Pro

Leu

Gly

Tyr

Glu

ASp

Val

íle

260

265

270

Pro

Glu

Ala

Asp

Arg

Glu

Gly

Val

íle

Arg

Tyr

Val

Zle

Gly

Val

Gly

275

260

285

Mp

Ala

Ph·

Arg

Ser

Glu

Ly·

Sex

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Zle

Ala

290

295

300

Ser

Ly·

Pro

Arg

Aep

HL·

Val

Phe

Gin

Val

Asn

Phe

Glu

Ala

305

310

31S

320

Leu

Ly·

Thr

íle

Gin

Asn

Gin

Leu

Arg

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

Zle

Glu

325

330

335

Gly

Thr

Gin

Thr

Gly

Ser

Phe

Glu

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

Glu

Gly

Ph·

Sar

Ala

Ho

Thr

Sar

Asn

Gly

Pro

Leu

Ser

Thr

355

360

365

Val

Gly

Sir

Tyr

Asp

Trp

Ala

Gly

Val

Phe

Leu

Tyr

Thr

Sar

Lys

370

375

390

Glu

Lys

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Thr

Arg

Val

Asp

Ser

Asp

Met

Asn

385

390

395

400

Mp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ala

Zle

íle

Leu

Arg

Asn

Arg

Val

405

410

415

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

íle

Gly

Leu

val

'420

425

430

Ala

Met

Phe

Arg

Gin

Asn

Thr

Gly

Met

Trp

Glu

Ser

Asn

Ala

Asn

Val

435

440

445

Lya

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ala

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

val

450

455

4 60

Asp

Val

Asp

Ser

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

Hla

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Ala

Arg

Trp

Gin

cy.

Asp

Ala

val

Leu

Tyr

Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

Gin

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asp

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Thr

Ser

545

550

555

560

Gly

Sar

Gly

Zle

Sex

Pro

Sex

Hla

i Sex

Gin

i Ara

1 Zle

i Ali

i Gly Sex

• Lys

565

570

575

Leu Sar Pro Arg Leu Gin Tyr Ph· Gly Gin Sar Leu Sar Gly Gly Gin

580 595 590

ASp

Lau

Thr Met Asp 595

Gly Leu Val Asp Leu Thr Val Gly Ala Gin Gly

600

605

His

Val

Leu

Arg

Ser

Gin

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Lys

Ale

íle

610

615

620

M«t

Glu

Phe

Asn

Pro

Arg

Glu

Val

Ala

Arg

Asn

Val

Phe

Glu

Cys

Asn

625

630

635

640

Asp

Gin

Val

Lys

Gly

Lys

Glu

ALa

Gly

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Leu

645

650

655

His

Val

Gin

Ly·

Ser

Thr

Arg Asp

Arg

Leu

Arg

Glu

Gly

Gin

íle

Gin

660

655

670

Ser

Val

Thr

Tyr Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Ser

Gly Arg

Pro

His

Ser

675

680

685

Arg

Ala

Val

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Thr

Arg

Gin

Thr

Gin

690

695

700

Val

Leu

Gly

Leu

Thr

Gin

Thr

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Lau

Gin

Leu

Pro

705

710

715

720

Asn

Cys

íle

Glu

Asp

Pro

Val

Ser

Pro

íle

Val

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

725

730

735

Ser

Leu

Val

Gly

Thr

Pro

Leu

Ser

Ala

Phe

Gly

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

740

745

750

Leu

Ala

Glu

Asp

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Thr

Ala

Leu

Phe

Pro

Phe

Glu

755

760

765

Lys

Asn

Cys

Gly

Asn

Asp

Asn

íle

Cys

Gin

Asp Asp

Leu

Ser

íle

Thr

770

775

780

Phe

Ser

Phe

Kat

Ser

Leu

Asp Cys

Leu

Val

Gly Gly

Pro

Arg

Glu

785

790

795

800

Phe

Asn

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Asp Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Arg

805

810

815

Thr

Gin

Val

Thr

Phe

Pro

Leu

Asp Leu

Ser

Tyr Arg

Lys

Val

820

825

830

Ser

Thr

Leu

Gin

Asn

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg Ser

Trp Arg

Leu

Ala

Cys

835

840

845

Glu

Ser

Ala

Sar

Ser

Thr

Glu

Val

Ser

Gly Ala

Leu

Lys

Ser

Thr

Ser

850

855

860

Cys

Ser

11·

Asn

His

Pro

íle

Phe

Pro

Glu

Asn

Ser

Glu

Val

Thr

Phe

865

870

875

880

Asn

11«

Thr

Phe

Asp

Val

Asp

Ser

Ly.

Ala

Ser

Leu

Gly

Asn

Lys

Leu

885

890

895

Leu

Ly.

Ala

Asn

val

Thr

ser

Glu

Asn

Met

Pro

Arg

Thr

Asn

900

905

910

Ly·

Thr

Glu

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pzo

Val

Ly»

Tyr

Ala

val

Tyr

Met

915

920

»25

Val

Thr

Sex

Kla

Gly

Val

Sex

Thr

Ly.

Tyr

Leu

Asn

Phe

Thr

Ala

930

»35

940

Ser

Glu

Asn

Thr

Sex

Arg

Val

Met

Gin

Hl.

Gin

Tyr

Gin

Val

Ser

Asn

945

950

955

960

Leu

Gly

Gin

Arg

Sex

Leu

Pro

íle

Ser

Leu

Val

Phe

Leu

Val

Pro

Val

965

»70

975

Arg

Leu

Asn

Gin

Thr

Val

Zle

Trp

Asp

Arg

Pro

Gin

Val

Thr

Phe

Ser

»80

985

»90

Glu

Asn

Leu

Sex

Ser

Thr

Cy.

Hla

Thr

Lys

Glu

Arg

Leu

Pro

Ser

His

995

1000

1005

Ser

Asp

Phe

Leu

Ala

Glu

Leu

Arg

Ly.

Ala

Pro

Val

Asn

Cys

Ser

1010

1015

1021

)

íle

Ala

Val

Cys

Gin

Arg

íle

Gin

Cys

Aap

íle

Pro

Phe

GLy

íle

1021

5

1031

)

103!

5

1040

Gin

G1U

Glu

Phe

Asn

Ala

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

ASp

Trp

104!

5

1051

D

105!

5

Tyr

íle

Lys

Thr

Ser

His

Asn

His

Leu

íle

Val

Ser

Thr

Ala

Glu

1061

9

106:

5

107i

0

Zle

Leu

Phe

Asn

Asp

Ser

Val

Phe

Thr

Leu

Pro

Gly

Gin

Gly

Ala

1071

5

108 i

0

108!

5

Phe

Val

Arg

Ser

Gin

Thr

Glu

Thr

Lys

Val

Glu

Pro

Phe

Glu

Val

Pro

109

0

109

5

110

0

Asn

Pro

Leu

Pro

Leu

íle

Val

Gly

Ser

Val

Gly

Leu

110

5

111

0

111

5

1120

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Ala

Leu

Tyr

Ly.

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

1L2

5

113

0

113

5

Gin

Tyr

Lys

Asp

Met

Het

Ser

Glu

Gly

Pro

pro

Gly

Ala

Glu

Pro

1140 1145 1150

Gin (2) INFORMÁCIE O SEK.. ID. č.: 4 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1163 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 4:

Met

Thr

Arg

Thr

Arg

Ala

Ale

Leu

Phe

Thr

AL*

Leu

Ala

Thx

1

$

10

15

Ser

Leu

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Thr

Glu

Leu

Thx

Al*

Phe

Arg

Val

20

25

30

Aap

Ser

Ala

Gly

Phe

Gly

Asp

Sar

Val

Gin

Tyr

Ala

Asn

Ser

Trp

35

40

45

Val

Gly

Ala

Pro

Gin

Ly.

íle

11.

Ala

Asn

Gin

íle

Gly

50

55

60

Gly

Leu

Tyr

Gin

Cy.

Gly

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ala

Cys

Glu

Pro

lla

Gly

65

70

75

80

Leu

Gin

Val

Pro

Pxo

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

15

90

95

Ala

Ser

Thr

Sex

Pro

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

100

105

110

Hl.

His

Glu

Cy.

Gly

Arg

Asn

Met

Tyr

Leu

Thr

GLy

Leu

Cy.

Phe

Leu

115

120

12S

Leu

Gly

Pro

Thr

Gin

Leu

Thr

Gin

Arg

Leu

Pro

Val

Ser

Arg

Gin

Glu

130

135

140

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Gin

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

íle

Ser

Arg

Asn

Phe

Ala

Thr

Met

Asn

Phe

Val

Arg

Ala

165

170

175

Val

íle

Ser

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ser

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

180

185

190

Phe

Ser

Asn

ly.

Phe

Gin

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Glu

Phe

Arg

195

200

20$

Thr

Ser

Asn

Pro

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Val

H1S

Gin

Leu

Gin

Gly

210

215

220

Phe

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

AL*

íle

Gin

Asn

Val

His

Arg

Leu

Phe

225

230

235

240

His

Ala

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

Asp

Ala

Zle

Ly.

íle

Leu

Zle

Val

245

250

255

Zle

Thr

Asp

Gly

Ly.

Glu

Gly

Asp

Ser

Leu

Aap

Tyr

Ly.

Asp

Val

260

26S

270

Zle

Pro

Met

Ale

Asp

Ala

Ale

Gly

íle

Arg

Tyx

Ala

íle

Gly

Val

275

280

285

Gly

Leu

Ala

Fha

Gin

Asn

Arg

Asn

Ser

Trp

Lys

Glu

Leu

Asn

Asp

Zle

290

29S

300

Ale

Ser

Ly.

Pro

Ser

Gin

Glu

Kle

íle

Phe

Lys

Val

Glu

Aap

Phe

Aap

305

310

31$

320

SK 283135 Β6

Ala Leu Glu Gly

Lys Thr Glý 355

Asp 11« Gin Asn Gin L«u

Lys Glu Lys íle Phe 330 Ser Phe Glu Leu Glu 350

Ala 11« 335 Met Ala Leu Gly

Glu 340 Phe

325 Thr íle Ser Ser Ser 345

Gin

Glu

Ser

Ala

Val

Phe 360

Thr

Pro

Asp

Gly

Pro 365

Val

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Thr

Trp

Ser

Gly Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

360

Asn

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Zle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

365

390

395

400

Arg

Asp

Sar

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lya

Gly

405

410

415

Val

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ale

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

íle

Gly

Lys

420

42S

430

Ala

Val

11«

Phe

íle

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Met

Lys

Ale

Glu

435

440

445

Val

11«

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Alt

Ser

Leu

Cys

Ser

450

455

460

Val

Asp

Val

Asp

Thr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

465

470

475

480

Pro

His

Tyr Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

465

490

495

Leu

Pro

Arg Gly Trp Arg Arg Trp Trp Cys Asp

Ala

Val

Leu

Tyr Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

His

Pro Trp

Gly Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly

Asp

Val

Asn

GLy Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

íle

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

val

Tyr

Leu

Phe

HiS

Gly

Val

Leu

545

550

555

560

Gly

Pro

Ser

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

11«

Ala

Gly

Ser

Gin

565

570

575

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

580

S85

590

Asp

Leu

Thr

Glh

Asp Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

605

Gin

val

Leu

Leu Arg

Thr

Arg

Pro

Val

Leu

Trp

Val

Gly

Val

Ser

610

615

620

Met

Gin

Phe

íle

Pro

Ala

Glu

íle

Pro

Arg

Ser

Ala

Phe

Glu

Cys

Arg

625

630

635

640

Glu Gin Tyr íle

Val Asp Val 675

Val Ser Glu Gin Thr Leu

Val Gin Ser Asn Zle Cys Leu

Lys 660 Thr

645

650

655 Leu Gin

Arg Ser Leu Asp

Lys Asn Leu 665

Leu Gly

Ser Arg Asp 670

Ser

Leu

Ala 680

Leu

Ala

Pro

Gly

Arg Leu 685

Ser

Pro

Arg

Ala

íle

Phe

Gin

Glu

Thr

Lys

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Arg

Val

Arg

690

695

700

Val

Leu

Gly

Leu

Lys

Ala

His

Cys

Glu

Asn

Phe

Asn

Leu

Pro

705

710

715

720

Ser

Cys

Val

Glu

Asp

Ser

Val

íle

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

725

730

735

Thr

Leu

Val

Gly

Lys

Pro

Leu

Ala

Phe

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Met

740

745

750

Leu

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Tyr

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

755

760

765

Lys

Asn

Cys Gly

Ale

Asp

His

íle

Cys

Gin

Asp

Asn

Leu

Gly

íle

Ser

770

775

780

Phe

Ser

Phe

Pro

Gly

Leu

Lys

Sar

Leu

Val

Gly

Ser

Asn

Leu

GlU

785

790

795

800

Leu

Asn

Ala

Glu

Val

Met

Val

Trp

Asn

Asp

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

805

810

815

Thr

íle

Thr

Phe

Ser

His

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr Arg

Tyr

Val

820

825

830

Ala

Glu

Gly

Gin

Lys

Gin

Gly

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

His

Leu

Thr

Cys

835

840

845

Cys

Ser

Ala

Pro

Val

Gly

Ser

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Thr

Ser

Cy.

Arg

850

855

860

íle

Asn

His

Leu

íle

Phe

Arg

Gly

Ala

Gin

íle

Thr

Phe

Leu

Ala

865

870

875

880

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Pro

Lys

Ala

Val

Gly

Leu

Asp

Arg

Leu

885

890

895

íle

Ala

Asn

Val

Ser

Glu

Asn

íle

Pro

Arg

Thr

Ser

Lys

Thr

900

905

910

íle

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

íle

Val

915

920

925

Ser

HiS

Glu

Gin

Phe

Thr

Lys

Tyr

Leu

Asn

Phe

Ser

Glu

Ser

Glu

930

935

940

Glu

Lys

Glu

Ser

His

Val

Ala

Met

His

Arg

Tyr

Gin

Val

Asn

Leu

945

950

955

960

Gly Gin Arg

Asp Leu 965 Glu Ala 980 Leu Arg

Pro Val Ser íle Aan Phe Trp Val Pro 970

Val Glu 975 Pro Gin

Leu Asn

Asn Gin Pro Ser 995

Val Trp Met Asp Val Glu

Val Ser His

Cys

985

Ala

990 Pro Pro 1005

Ser

Ser Glu Lys 1000

11«

Ala

Ser

Asp

Phe

Leu

Ala

His

íle

Gin

Lys

Asn

Pro

Val

Leu

Asp )

Cys

Ser

íle

1010

1015

102(

Ala

Gly Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Sar

Phe

Ser

Val

Gin

1025

1030

1035

1040

Glu

Leu

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly Trp

Val

1045

1OS0

1055

Arg

Gin

íle

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

1060

1065

1070

íle

Phe

Asp

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

1075

1080

1085

Met

Arg

Ala

Gin

Thr

íle

Thr

Val

Leu

Glu

Lya

Tyr

Lys 3

Val

His

Asn

1090

1095

110<

Pro

Zle

Pro

Leu

íle

Val

Gly

Ser

11«

Gly Gly

Leu

1105

1110

1115

1120

Ala

Leu

íle

Thr

Ala

Val

Leu

Tyr

Lys

Val

Gly

Phe

Lys

Arg

Gin

1125

1130

1135

Tyr

Lys

Glu

Met

Glu

Ala

Asn

Gly Gin

íle

Ala

Pro

Glu Asn

1140

1145

1150

Gly

Thr

Gin

Thr

Pro

Ser

Pro

Ser Glu Lys

1155

1160

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 5 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 12 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 5:

Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gin 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 6:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 6:

TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA 35 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 7:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 7:

TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. i.: 8:

TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. ¢.: 9:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 9:

TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 10:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 10

TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 11:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 11:

TGRAANACCA TNGGYTC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 12:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 12:

TTGGAAGACC ATNGGYTC (2) INFORMÁCIE O SEK ID. č.: 13:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 13:

ATTAACCCTC ACTAAAG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 14:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 14:

AATACGACTC ACTATAG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. í.: 15:

Val Phe Gin Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin

5 10 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi)OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 16:

Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gin Pro íle 1 5 10 ²⁰ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 12 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 17:

Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val íle Pro Gin Ala Glu

5 10 ¹⁷ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID: č.: 18:

Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa

5 10 ¹⁸ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 19 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 19:

Thr Ser Pro Thr Phe íle Xaa Met Ser Gin Glu Asn Val Asp 1 5 10 ¹⁷ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. ¢.: 20:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 20:

Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gin Thr Gly

10 15

Arg (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 21:

Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala

5 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. t.: 22:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 22:

Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu

5 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 23:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 23:

RAANCCYTCY TGRAAACTYT C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1006 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 24:

TTCAXCCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCAAGAGGA TGGAGCT&GC TTTGGACAGA60

GCGTGGCCCA GCTTGGCGGA TCTAGACTCG TGGTGGGAGC CCCCCTGGÄG GTGGTGGCGG120

TCAÄCCAAAC AGGAASGTTG TATGACTGTG TGGCTGCCAC TGGCCTTGTC AACCCATACC180

CCTGCACACA CCCCCAGATG CTGTGÄACAT GTCCCTGGGT CTGTCCCTGT CAGCCGCCGC240

CAGTCGCCCC TGGCTGCTGG CCTGTGGCCC AACCATGCAC AGAGCCTGTG GGGAGAATAT300

GTATGCAGAA GGC1TTTGCC TCCTGTTGGA CTCCCATCTG CAGACCATTT GGACAGTACC360

TGCTGCCCTA CCAGAGTGTC CAAGTCAAGA GATGGACATT GTCTTCCTGA TTGATGGTTC420

TGGCAGTATG AGCAAAGTGA CTTTAAACAA ATGAAGGATT TGTGAGAGCt GTGATGGGAC480

AGTTTGAGGG CACCCAAACC CTGTTCTCAC TGATACAGTA TCCCACCTCC CTGAAGATCC540

ACTTCACCTT CACGCAATTC CAGAGCAGCT GGAACCCTCT GAGCCTGGTG GATCCCATTG600

TCCAACTGGA CGGCCTGACA TATACAGCCA CGGGCATCCG GAAAGTGGTG GAGGAACTGT660

TTCATAGTAA GAATGGGGCC CGIAAAAGTG CCAAGAAGAT CCTCATIGTC ATCACAGATG720

GCAAAAATAC AAAGACCCCC TGGAGTACGA GGACGTATCC CCAGGCAGAG AGAGCGGATC780

ATCCGCTATG CCATTGGGGT GGGAGATGCT TTCTGGAAAC CCAGTGCCAA GCAGGAGCTG840

GACAÄCATTG gctcagagcc GGCTCAGGAC CATGTGTTCA GGGTGGACAA CTTTGCAGCA900

CTCAGCAGCA TCCAGGAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTTTG CACTCGAAGG AACCCAGTCG960

ACGACAAGTA GCTCTTTCCA ACATGAGATG TTCCAAGAAG GGTTCA1006 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV; jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 25:

GTNTTYCARG ARGAYGG 17 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 26 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 26:

CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 27:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 27:

AGTTACGAATTCGCCACCATGGCrCTACGGGTGCTTCITCTG 42 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 28:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 28:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTICTIC TG 42 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 29:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 29:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 30:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 30:

TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 31:

GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 32:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 32:

ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 33:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 37 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 33:

ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. í.: 34:

TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24

ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA GAG CCA GTG AAC ATG

240

Mat Cys Gin Pro 11· Val

Leu

Arg

Ser

Pro Uu Glu Ala Val Asn Mat

65

70

75

80

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

299

Ser

Uu

Gly

Leu

Ser

Uu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Aan

Ala

Gin

Leu

Uu

85

90

95

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

AAG

AAC

ATG

TAT

GCG

336

Ala

Cye

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

100

105

110

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

384

Lys

Gly

Ser

Cye

Leu

Uu

Leu

Gly

Ser

U u

Gin

Phe

Zle

Gin

Ala

115

120

125

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

432

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cye

Pro

Arg

Gin

G1U

Het

Asp

íle

Ala

130

135

140

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

480

Ph·

Uu

11«

Asp

Gly

Ser

Cly

Ser

11·

Asn

Gin

Arg Asp

Phe

Ala

Gin

145

150

155

160

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

529

Het

Lye

Asp

Ph·

Val

Ly·

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ale

Ser

Thr

Ser

165

170

175

ACC

TTG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

TCG

AAC

ATC

CTG

AAG

ACC

CAT

TTT

576

Thr

Uu

Ph·

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

Leu

Lye

Thr

Hls

Phe

180

185

190

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

624

Thr

Ph·

Thr

Glu

Ph·

Lye

Asn

XI·

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

195

200

205

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

672

Pro

11·

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Uu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

210

215

220

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

720

Thr

Vel

Met

Glu

Uu

Ph·

Hla

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

768

AL*

Lys

Ly·

11«

Leu

Uu

Val

IL«

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

916

Pro

Uu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

11«

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

íle

260

265

270

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

864

XI·

Arg

Tyr

Ala

11«

Gly

Val

Gly Asp

Ala

Phe

Gin

G1U

Pr©

Thr

Ala

275

290

285

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

CCA

CAG

GAC

CAC

GTG

912

Leu

Lys

G1U

Leu

Asn

Thr

11«

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

290

295

300

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 35:

TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24

TTC

AAG

GTA

GGC

AAC

TTT

GCA

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

AGG

CAA

CTT

960

Phe

Ly·

Val

Gly

Aan

Phe

Ala

Uu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

305

310

315

320

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

TCA

AGG

TCA

AGT

1008

Gin

G1U

Ly*

íle

Phe

Al*

íle

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

325

330

335

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

1056

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Clu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

340

345

350

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GYG

GGA

AGC

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

1104

Ser

A»P

Gly

Pro

Val

Uu

Gly

Ala

Xaa

Gly

Set

Phe

Ser

Trp

Sex

Gly

355

360

365

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

1152

Gly

Ala

Ph·

Uu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

Xle

Asn

Met

370

375

380

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3528 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..3456

(xi)

OP

IS SEKVENCIE:

SE

K. 1

ID.

č.:.

36:

GGC

TGG

GCC

CTG

GCT

TCC

TGT

CAT

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

GAA

48

Gly

Trp

Al*

L«u

Ala

Ser

Cys

Hla

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

1

5

10

15

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

QGA

CAG

ACT

GTG

9í

Pro

11·

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

Ala

Ale

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

20

25

30

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

144

Gin

Ph·

Gly

Ser

Arg

Uu

Val

val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

3$

40

45

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

GCA

CCT

GCC

ACT

GGC

192

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

Asp

Cys

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

SS 60

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGA

GAC

TCC

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

385

390

395

400

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GGC

CCG

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

Hl*

Ser

Uu

íle

Uu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

GCC

AGG

Arg

Hla

Gin

H18

Thr

Gly

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

CAT

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

Kla

Trp

Arg

Pro

Lya

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Xle

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

450

455

460

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

Asp

Leu

Val

Leu

Xle

Gly

Ala

Pro

K13

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465

470

475

490

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TKC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

405

490

495

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GRC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Xaa

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Ph·

500

505

510

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Uu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

AGC

AGA

GGT

GCT

GTC

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

Sar

Arg

Gly

Ala

Val

530

535

540

1200

124 9

1296

1344

1392

1440

148B

1536

1594

1632

TAC ΑΤΑ TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC ATG CCC TCA CCC AGC

Tyr 11· Ph· 545

Hla

Gly

Ala Ser 550

Arg Leu

Glu

íle Met Pro Ser Pro Ser

555

560

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

Gin

8«r

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

595

590

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

59S

600

605

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

Leu

Lye

Val

Clu

Leu

Ser

íle

Arg

Phe

Ale

Pro

Het

Glu

Val

Ala

610

615

620

MG

GCT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GM

AGG

ACT

CCC

ACT

GTC

CTC

GM

GCT

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cy»

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

625

630

<35

640

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

CTC

CAC

AAA

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cya

Leu

Thr

Val

Hla

Lya

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTA

GAT

CCG

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

660

665

.670

GGC

CGC

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

Gly Arg

Lau

11·

Ser

Arg

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

TTG

ACG

GSA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

Leu

Thr

Gly Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

690

69S

700

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

CTG

GAA

GAT

CCA

GTG

AGC

CCT

ATC

Lys

Leu

L«u

Pre

Aap

Cya

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

íle

705

710

715

720

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

Leu

Arg

Leu

Aan

Phe

Ser

Leu

Val

Arg

Aap

Ser

Ale

Ser

Pro

Arg

Asn

725

730

735

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

Leu

Hla

Pro

Val

Leu

Ale

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

Hla

íle

Thr

Ala

Ser

740

745

750

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CM

GM

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

Leu

Pro

Phe

Glu

Lya

Aan

Cya

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

755

760

765

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

. GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GTG

: GGA

Leu

Gly

11·

Ser

Phe

Aan

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Val Gly

770

775

790

16B0

CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC CTC AGC TTC GGC TGG

3120

Gin Asp 1025

Glu

Leu

Asp Phe íle Leu 1030

Arg Gly

Asn Leu Ser Phe Gly Trp

1035

1040

1728

GTC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

GAA

AAG

GTG

TTG

CTT

CTG

AGT

GAG

GCT

GAA

3168

Val

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Glu

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Glu

Ala

Glu

1045

1050

1055

1776

ATC

ACT

TTC

GAC

ACA

TCT

GTG

TAC

TCC

CAC

CTG

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

3216

íle

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Cln

Clu

Ale

1060

1065

1070

1824

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACA

ACG

TTA

GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

3264

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Clu

Thr

Leu

Glu

Tyr

Val

Val Tyr

1075

1080

10B5

1872

GAG

CCC

ATC

TTC

CTC

GTG

GCG

GGC

AGC

TCG

GTG

GGA

GGT

CTG

TTA

3312

Glu

Pro

íle

Phe

Leu

Val

Ala

Gly

Ser

Val

Gly Gly

Leu

1090

1095

1100

1920

CTG

GCT

CTC

ATC

ACA

GTG

GTA

CTG

TAC

AAC

CTT

GGC

TXC

AM

CCT

3360

Leu

Ma

Leu

íle

Thr

Val

Leu

Tyr

Lya

Leu

Gly

Xaa

Lys

Arg

1105

1110

1115

1120

1968

CAG

TAC

AM

GM

ATG

CTG

GAC

GGC

AAG

GCT

GCA

GAT

CCT

GTC

ACA

GCC

3408

Gin

Tyr

Lya

Glu

Met

Leu

Asp

Gly

Lya

Ma

Aap

Pro

Val

Thr

Ma

1125

1130

1135

2016

GGC CAG 3163

GCA

GAT

TTC

GGC

TGT

GAG

ACT

CCT

CCA

TAT

CTC

GTG

AGC

TAGGAATCCA

Giy Gin

Ma

Asp

Phe Giy Cys

Glu

Thr

Pro

Tyr

Leu

Val

Ser

1140

1145

1150

CTCTCCTGCC TATCTCTSNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA 3523

CGAGT

3528

GGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

GTG

ACA

GTC

ACT

GTG

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

785

790

79S

800

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

Aap

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

805

810

815

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CM

CCT

CAT

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

Hla

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

B20

825

830

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

GAC

CTG

AGG

AGC

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ma

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

835

840

845

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCA

AAG

ACC

Ser

Cys

Ser

IL·

Asn

His

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ma

Lys

Thr

850

855

860

TTC

ATG

ATC

ACA

TTC

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTA

GGA

GAC

AGG

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ma

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

665

870

875

B80

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

Leu

Arg

Ale

Lya

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Aap

Thr

885

890

895

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

AAG

TAC

ACC

GTC

TAT

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

GLu

Leu

Pro

val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

900

905

910

ACC

CTG

ATC

AGT

AGG

CAA

GAA

GAT

TCC

ACC

AAC

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

Thr

Leu

íle

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

915

920

925

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

Ser

His

Gly

Arg

Gin

Glu

Ala

HÍS

Arg

Tyr

Arg

Val

930

935

940

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

Asn

Aan

Leu

Ser

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

945

950

955

960

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

GTG

ACT

CTG

AGC

Pro

val

Leu

Asn

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Aap

Val

rhf

Leu

Ser

965

970

975

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC

GTG

TCC

CAG

ATG

AAA

CCT

CAG

AAT

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

Cya

Val

Ser

Gin

Het

Lya

Pro

Gin

Aan

980

985

990

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

. CGT

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

íle

Gin

Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

995

100

0

100

5

ATT

GCT

GAC

.TGC

: CTG

CAC

TCC

CGC

: TCT

¹ GAC

ATC

: CCC

: Tce

: TTC

! GAC

! ATC

íle

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Ser

Arg

Cya

Aap

íle

Pro

i Ser

' Leu

t Asp

' íle

101

0

101

5

102

0

2112

2160

220Θ

2256

2304

23S2

2400

2448

2496

2544

2592

2640

26BB

2736

2784

2832

2880

2928

2976

3C24

3072 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 37 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1151 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 37:

Gly

Trp

Ma

Leu

Ma

Ser

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

1

5

10

15

Pro

íle

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

ALa

Ma

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

20

25

30

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ma

Val

35

<0

65

hla

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

Aap

Cya

Ala

Pro

Ma

Thr

Gly

55 60

Het

Cys

Gin

Pro

íle

Val

Leu

Arg

Ser

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

65

70

75

80

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

ALa

Gin

Leu

85

90

95

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ma

Cys

Val

Lys

Asn

Het

Tyr

Ala

100

105

110

Lya

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

115

120

125

VaL

Pro

Ma

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

Zle

Ala

130

135

140

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

lle

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ma

Gin

145

150

155

160

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Het

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Zle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

180

1B5

190

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

lys

Asn

íle

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

VaL

Asp

195

200

205

Pro

íle

VaL

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ma

Thr

Gly

íle

Arg

210

215

220

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Aen

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

Ma

Lys

íle

Leu

Val

Zle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Zle

Pre

Ala

Asp

Lys

Ma

Gly

íle

260

265

270

íle

Arg

Tyr

Ala

Zle

Gly

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ma

275

280

285

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Gly

Ser

Ma

Pro

Gin

Asp

His

Val

290

295

300

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

305

310

315

320

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ma

íle

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

325

330

335

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ma

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

355

360

365

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

370

375

380

SK 283135 Β6

Ser

Gin

Glu

Asn

val

Asp

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

385

390

395

400

Ala

Val

Ale

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

H18

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

Arg

NÍS

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

Phe

Gly

Ale

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Aep

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

4S0

455

460

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465

470

475

480

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

V<1

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

4Θ5

490

495

Cys

Glu

Ale

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

xaa

Kla

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

500

505

510

Gly

Val

Ale

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

ASp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

Clu

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Vel

530

S35

540

Tyr

íle

Phe

HÍS

Gly

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

íle

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

545

550

555

560

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

585

590

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

595

600

605

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

íle

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

610

615

620

Lys

Al·

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

625

630

635

640

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

660

665

670

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Arg

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

Leu

Thr

Gly

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

His

Cys

Glu

Thr

Val

«50

695

700

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

val

Ser

Pro

íle

705

710

715

720

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Vel

Arg

Asp

Sar

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

725

730

735

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

íle

Thr

Ala

Ser

740

745

750

L· u

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lya

Gin

Glu

L«u

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

755

760

765

Leu

Gly

íle

Ser

Phe

Asn

Ph·

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

L«u

Val

Vsi

Gly

770

775

780

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

785

790

795

800

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

805

810

815

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

020

625

830

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

835

840

849

Ser

Cys

Ser

11·

Asn

Hla

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ale

Lys

Thr

650

055

860

Ph·

Met

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

865

870

875

880

L«U

Leu

Arg

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

885

890

895

Asn

Lys

Thr

Al·

Phe

Gin

L«u

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

900

905

910

Thr

Leu

íle

Ser

Axg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

915

920

925

S«x

Ser

His

Gly

Arg

Gin

Glu

Ala

His

Arg

Tyr

Arg

Val

930

935

940

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

945

950

9S5

960

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

Val

Ala

val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

ser

Ser

965

970

975

Pro

Ala

Gin

Oly

Val

Ser

Cys

val

Ser

Gin

Het

Lys

Pro

Gin

Asn

980

985

990

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

11·

Gin

Arg

Ser

Vsi

Leu

Asp

cys

Ser

995

100

0

100

5

11«

Kla

Asp

Cys

Leu

His

'Ser

Arg

Cys

Asp

11·

Pro

Ser

Leu

Asp

11·

1010 1015 1020

Gin

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

íle

Leu

Arg

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

1025

1030

1035

1040

val

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Glu

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Glu

Ala

Glu

1045

1050

1055

íle

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

1060

1065

1070

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

1075

1080

1085

Glu

Pro

íle

Phe

Leu

Val

Ala

Gly

Ser

Val

Gly

Leu

1090

109!

i

1100

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Val

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Xaa

Lya

Arg

1105

Hli

J

1115

1120

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

Asp

Gly

Lys

Ala

Asp

Pro

Val

Thr

Ala

1125

1130

1135

Gly

Gin

Ala

Asp

Ehe

Gly

Cys

Glu

Thr

Pro

Tyr

Leu

Val

Ser

1140 114S nwn (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 38:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 38:

GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 39:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK, ID. č.: 39:

GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 40:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 40:

TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 41:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 41:

GGAAACAGCTATGACCATG 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 42:

GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 43 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 43:

GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25

ATT GAT CAA 11« Asp Gin

AGT Ser

GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA GCT TTG

585

Asp

Phe Thr

Gin 170

Met

Lys

Asp

Phe

Val 175

Lys Ala Leu

165

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

633

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

AGC

681

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

Kla

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Ssr

Ser

195

200

205

210

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

GGC

CTG

729

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Aap

Ala

íle

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

215

220

225

ACG

TAC

ACA

GCC

TCG

GGC

ATC

CAG

AAA

GTG

AAA

GAG

CTA

TTT

CAT

777

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

lis

Gin

Lys

Val

Lys

G1U

L«U

Phe

Hla

230

235

240

825

ACC AAC AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CŤA ATT GTC ATC

Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys 11« Leu II· Vil íle

245 230 255 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 44:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 38 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 44:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3519 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 5..3519 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 45:

ACA Thr

GA7 Aap 260

GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CM GTC ATC

873

Gly

Gin Lys Phe Arg 265

Asp

Pro

Leu

Glu Tyr Arg 270

Hla

Val

íle

CCT

GAA

GCA

GAG

AAA

GCT

GGG

ATC

ATT

CGC

TAT

GCT

ATA

GGG

GTG

GGA

921

Pro

GLU

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

275

280

285

290

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

969

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Gly

295

300

305

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

GTA

GCA

1017

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

310

315

320

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

ATT

GAA

1065

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

íle

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

Íle

Glu

325

330

335

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

1113

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

H1S

Glu

Met

Ser

Cln

340

345

350

GAA

GGT

TTC

AGC

TCA

GCT

CTC

TCA

ATG

GAT

GGA

CCA

GTT

CTG

GGG

GCT

1161

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Mat

Asp

Cly

Pro

Val

Leu

Cly

Ala

355

360

365

370

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

TCA

AAT

120»

Val

Gly

Phe

Ssr

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Ser

Asn

375

390

395

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

ATG

AGG

1257

Mat

Arg

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

Het

Arg

390

395

400

GAC

GCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

CTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTC

1305

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

: GTT

1353

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

420

425

430

GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC1401

Val II· Ph· Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lya Ser GluVal

435 440 445450

GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC 57

Met Val 1

AGA Arg

GGG Gly

ACA Thr

CAG Gin

ATC íle 455

GGC Gly

TCC Ser

TAC Tyr

TTT Phe

GGG Gly 460

GCA Ala

TCT Ser

CTC Leu

TGT Cys

TCT Sex 465

GTG Val

1449

CGT

GGA

GTT

GTG

ATC

CTC

CTG

TGT

GGC

TGG

GCC

CTG

GCT

TCC

TGT

CAT

105

GAC

ATG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACT

GAC

CTG

GTC

CTG

ATT

GGA

GTC

CCC

1497

Arg

Gly

Val

íle

Leu

Cys

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala

8er

Cys

His

Aap

Met

Asp

Arg

Aap

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Val

Pro

5

10

15

470

475

480

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

GAT

GCA

153

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

G1U

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

G1U

Asp

Ala

CAT

TAC

TAT

GAG

CAC

ACC

CGA

GGG

CAG

GTG

TCG

GTG

TGC

CCC

ATG

1545

20

25

30

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Frc

Mat

485

490

495

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

201

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

GGG

GAG

1593

35

40

45

50

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

Gly

Glu

500

505

510

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CAG

TCG

249

vsi

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Gin

Ser

CAG

GGC

CAT

CCT

ŤGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTA

GGG

1641

55

60

65

Gin

Gly

HiS

pro

Trp

Gly Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

val

Leu

Gly

51S

520

525

530

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

CCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

CTG

CAC

297

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

val

cys

Gin

Pro

íle

Leu

His

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

CCC

GGA

1689

70

75

80

Asp

Val

Asn

Gly Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pre

Gly

535

540

545

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

GCT

345

íle

Pro

Leu

G1U

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

TCG

AGA

1737

85

90

95

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

11·

Phe

His

Gly

Ala

Sex

Arg

S 50

555

560

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

393

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

1785

100

105

110

Gin

Asp

íle

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

565

S70

575

GCT

TGT

GCA

AAG

AAC

ATG

TAT

GCA

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTG

GGC

441

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ale

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1833

115

120

125

130

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly Gly

Gin

Asp

580

585

590

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

GAG

TGT

43»

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ale

íle

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

Glu

Cys

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

1881

135

140

145

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Aap

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

595

600

605

610

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

GGC

AGC

537

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

TCC

ATT

1929

150

195

160

Val

Leu

Arg

Ssr

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

GLy

íle

Ser

íle

615

620

625

AGA

ťtt

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GGA

1977

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

GLn

cys

Trp

Gly

630

635

640

AGG

ACT

CCC

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

ACT

202S

Ar?

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

445

650

655

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

TCT

GTC

2073

Val

Ar?

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

Val

660

665

670

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

2121

Ar?

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Ar?

Ala

íle

67S

680

685

690

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

2169

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Ar?

Lys

Thr

Leu

Gly

695

700

705

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

ATG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAC

TGT

GTG

2217

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

710

715

720

GAG

GAT

GCA

GTG

ACC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTT

AAC

TTA

TCC

CTG

GCA

2265

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

725

730

735

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

2313

Gly

Asp

Ser

Ale

Pre

Ser

Ar?

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

lau

Ala

Vil

Gly

740

745

750

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

GAG

2361

Ser

Gin

Asp

H1S

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Glu

755

760

765

770

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

2409

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

val

Leu

Glu

775

780

785

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

2457

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

790

795

800

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

2505

Gly

Glu

Asp

ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

íle

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

805

810

815

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

GCC

CAG

CAA

CCT

CAT

CCG

TAC

CCA

2553

Leu

Ser

Tyr

Ar?

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

Tyr

Pro

820

825

830

CTA

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

2601

Leu

Ar?

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

835

840

845

850

ASC

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

2649

Ser

Cys

Ssr

íle

Asn

Kls

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

855

860

865

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

2697

Ala

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ma

Phe

Leu

Gly

870

875

880

GAC MQ TTG CIT CTG AGG GCC AGC GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT2745

Aap Ar? Leu Leu Leu Arg Ala Ser Al· S«r Ser Glu Asn Asn Lys Pro

885 890895

GAA ACC AGC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTT CCG GTG AAG TAC ACG2793

Glu Thr Ssr Lys Thr Ala Ph· Gin L«u Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr

900 905910

GTC TAT ACC GTG ATC AGT AGG CAG GAA GAT TCT ACC AAG CAT TTC AAC2841

Val Tyr Thr Val IL· Ser Ar? Gin Glu Asp Ser Thr Lys Hit Phe Asn

915 920 925930

TTC TCA TCT TCC CAC GGG GAG AGA CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT2889

Phe Ser Ser $«r His Gly Glu Arg Gin Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr

935 940945

CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC2937

Ar? Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Thr Leu Al· íle Ser Val Asn Phe

950 955960

TGG GTC CCC Trp Val Pro

ATC íle

CTT CTG Leu Leu

AAT GGT GTG GCC GTG TGG

GAT GTG ACT CTG

2985

Asn

Gly 970

Val

Ala Val Trp

Asp 975

Val Thr

Leu

965

AGG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGT

GTG

TCA

CAG

MG

GAA

CCT

3033

Ar?

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

Cys

Val

Ser

Gin

Arg

Glu

Pro

980

985

990

CAA

CAT

TCC

GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

ATC

CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC

3081

Gin

H1S

Ser

Asp

Leu

Thr

Gin

íle

Gin

Gly Ar?

Ser

Val

Leu

Asp

995

1000

1005

1010

TGC

GCC

ATC

GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

CTC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

3129

Cys

Ala

íle

Ale

Asp

Cys

Leu

His

Leu

Arg

Cys

Asp

íle

Pro

Ser

Leu

1015

1020

1025

GGC

ACC

CTG

GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

ATT

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

3177

Gly

Thr

Leu

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

íle

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

1030

1035

1040

GGC

TGG

ATC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

AAA

AAG

GTG

TTG

CTC

CIG

AGT

GAG

3225

Gly

Trp

íle

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

1045

1050

1055

GCT

GAA

ATC

ACA

TTC

AAC

ACA

TCT

GTG

TAT

TCC

CAG

CTG

CCG

GGA

CAG

3273

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

1060

1065

1070

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

TCA

ACG

ATG

CTA

GAA

TAC

GTG

3321

Glu

Ala

Phe

Leu

Ar?

Ala

Gin

Val

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

Tyr

Val

1075

1080

1085

1090

GTC

TAT

GAG

CCC

GTC

TTC

CTC

ATG

GTG

TTC

AGC

TCA

GTG

GGA

GGT

CTG

3369

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Ph·

Leu

Met

Val

Phe

Sex

Ser

Val

Gly

Gly Leu

1095

1100

1105

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACT

GTG

GCG

CTG

TAC

AAG

CTT

GCC

TTC TTC

3417

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

val

Ala

Leu Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

1110

1115

1120

AAA CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG GAT CTA CCA TCT GCA GAT CCT GAC 3465

Lys Ar? Gin Tyr Lys Glu H·t Leu Asp Leu Pre Ser Ala Asp Pro Asp

1125 1130 1135

CCA GCC GGC CAG GCA GAT TCC AAC CAT GAG ACT CCT CCA CAT CTC ACG3513

Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn Nís Glu Thr Pro Pro His LeuThr

1140 11451150

TCC TAG3519

Ser

1155 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 46 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1151 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 46:

Met Val Arg Gly Val Val íle Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser 15 1015

Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu

2530

Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly GLy Ser Ar?

4045

Leu Val Val Gly Ala Pro Lau Glu Ala Val Ala Val Asn Gin Thr Gly 50 5560

Gin Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gin Pro íle Leu ?0 7580

Leu His íle Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu

9095

Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gin Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala 100 105110

Gin Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu.

115 120125

Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe íle Gin Ala íle Pro Ala Thr Met Pro 130 135140

Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Asp íle Ala Phe Leu íle Asp GlySer

145 150 155160

Gly Ser íle Asp Gin Ser Asp Phe Thr Gin Met Lys Asp Phe ValLys

165 170175

Ala Leu Met Gly Gin Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met

180 185190

Gin Tyr Ser Asn íle Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys

195 200205

Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Asp Als íle Val Gin Leu Gin 210 215220

Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly íle Gin Lys Val Val Lys GluLeu

225 230 235240

Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys íle Leuíle

24S 25025S

Val íle Thr Asp Gly Gin Lys Phe Ar? Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His

260 265270

Vil íle Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly íle íle Arg Tyr Ala Íle Gly

275 280285

Val Gly Asp Ala Phe Ar? Glu Pro Thr Ala Leu Gin Glu Leu Asn Thr 290 295300 íle Gly Ser Ala Pro Ser Gin Asp His Val Phe Lys Val Gly AsnPhe

305 310 315320

Val Ala Leu Arg Sex íle Gin Ar? Gin íle Gin Glu Lys íle PheAla

325 330335

11« Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met 340 34S350

Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Als Leu Ser Het Asp Gly Pro Val Leu 355 360365

Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro 370 375380

Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe íle Asn Met Ser Gin Glu Asn Glu Asp

385 390 395400

Het Ar? Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser The Ala Leu Ala Phe Trp Lys

405 410415

Gly val His Ser Leu íle Leu Gly Ala Pro Ar? His Gin His Thr Gly

420 425430

Lys Val Val íle Phe Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser

435 440445

Glu Val Arg Gly Thr Gin íle Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys 450 455460

Ser Val Asp Met Asp Ar? Asp Gly Ser Thr Asp Leu Yal Leu ZleGly

465 470 475480

Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser ValCys

485 490495

Pro Met Pro Gly Val Ar? Ser Ar? Trp Hla Cys Gly Thr Thr Leu His

500 505510

Gly '

;iu i

Gin

Gly

His

Pro

Trp

GLy

Arg

Phe '

Gly

Al· .

Al·

Leu

Thr

Val

515

S20

525

Leu i

siy

Rsp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

V*1 .

Ala

íle

Gly

Ala

530

535

540

Pro <

Sly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ila

Phe

Kis

Gly

Ala

345

550

555

560

Ser ,

hrg

Gin

Aap

íle

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin .

Asp

Leu

Thr

Gin

ASp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

val

Gly

íle

610

615

620

Ser

íle

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Al·

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

L* u

GLy

Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Arg

675

680

685

Me

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

Leu

Ala

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Lau

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

G1U

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

val

Ser

Phe

Asn

Phe

ser

Gly

Leu

Gin

Val

770

775

780

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

785

790

795

Θ0Ο

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Íle

Lys

Phe

Tyr

Pro

805

810

815

Ale

Glu

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

820

825

830

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Al*

Glu

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Sar

835

840

845

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

950

855

860

Ala

Lys

Ala

Thr

Phe

Het

íle

Thr

Ph*

Asp

V*1

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

865

B70

875

890

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

885

890

895

Lys

Pro

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

900

90S

910

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Val

íle

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Lys

His

915

920

925

Phe

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Glu

Arg

Gin

Lys

Glu

Ala

Glu

His

930

935

940

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Thr

Leu

Al·

íle

Ser

Val

945

950

955

960

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

íle

Leu

Asn

Gly

Val

Ale

V«1

Trp

Asp

Val

965

970

975

Thr

Leu

Arg

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

VaL

Ser

Cys

Val

Ser

Gin

Arg

Glu

980

SBS

990

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Leu

Thr

Gin

íle

Gin

Gly

Arg

Ser

Val

995

100<

2

100!

5

Leu

Asp

Cys

Ala

íle

Ala

Asp

Cys

Leu

Kis

Leu

Arg

Cys

Asp

íle

Pro

101

0

101!

5

102<

0

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

íle

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

102

5

103'

0

103

5

1040

Ser

Phe

Gly

Trp

íle

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Lys

Val

Leu

104

5

105'

0

105!

5

Ser

Glu

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

106

0

106

S

107

0

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

107

5

108'

0

108

5

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Phe

Leu

Met

Val

Phe

Ser

Val

Gly

109

0

109

5

110

0

Gly

' Leu

i Leu

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Val

Ale

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

110

5

111

0

111

5

1120

Phe

! Lys

Arg

Gin

Tyr

Ly>

Glu

Met

Leu

Asp

> Leu

Pro

Ser

Ala

Asp

112

S

113

0

113

5

Pro Asp Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His ¹¹⁴⁰ 1145 1150

Leu Thr Ser

1155 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 47:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 49 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOEÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 47:

AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC

ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 48:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 48:

GCTGGACGAT GGCATCCAC 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 49:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 49:

GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 50:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 50:

GCAGCCAGCT TCGGACAGAC 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 51:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 51:

CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA : 3803 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKY ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..3486 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 52:

ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT TCC48

Het Val Arg Gly Val Val 11« Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser

1015

TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG96

Cys Hla Gly Str Asn Leu Aap Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lya Glu

2530

GAT GCA GCC AGC TTC GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA144

Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg

4«45

CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGÁ192

Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Aan Gin Thr Gly

SO 5560

CAG TCG TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA240

Gin Sar Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cya Gin Pro íleLeu

70 7580

CTG CAC ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG283

Leu Hla íle Pro Leu Glu Ala Val Aan Met Ser Leu Gly Leu SerLeu

9095

GTG GCT GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA335

Val Ala Aap Thr Asn Aan Ser Gin Leu Leu Ala Cys Gly Pro ThrAla

100 105110

CAG AGA GCT TGT GCA AAG AAC ATG TAT GCA AAA GGT TCC TGC CTC CTT384

Gin Arg Ala Cya Ala Lya Asn Met Tyr Ala Lya Gly Ser Cya LeuLeu

115 120125

CTG GGC TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC ATG CCA432

Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe íle Gin Ala íle Pro Ala Thr MetSto

130 135140

GAG TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGC TCC480

Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Aap íle Kla Pha Leu íle Asp GlySer

145 150 155160

GGC AGC ATT GAT CAA AGT GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA528

Gly Ser íle Aap Gin Ser Aap Phe Thr Gin Met Lya Aap Phe ValLya

165 170175

GCT TTG ATG GGC CAG TTG GCG AGC ACC AGC ACC TCG TTC TCC CTG ATG576

Ala Leu Het Gly Gin Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Pha Ser LeuMet

180 185190

CAA TAC TCA AAC ATC CTG AAG ACT CAT TTT ACC TTC ACG GAA TTC AAG624

Gin Tyr Ser Aan íle Leu Lys Thr Kla Phe Thr Phe Thr Glu PheLya

195 200205

AGC AGC CTG AGC CCT CAG AGC CTG GTG GAT GCC ATC GTC CAG CTC CAA672

Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Aap Ala íle Val Gin LeuGin

210 215220

GGC CTG ACG TAC ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG CTA720

Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly 11« Gin Lya Val Val Ly* GluLeu

225 230 235240

TTT CAT AGC AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CTA ATT76B

Phe Kla Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lya Ser Ala Lya Lys íle Leuíle

245 250255

GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CAT816

Val íle Thr Asp Gly Gin Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr ArgHl*

260 265270

GTC ATC CCT GAA GCA GAG AAA GCT GGG ATC ATT CCC TAT GCT ATA GGG864

Val íle Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly íle íle Arg Tyr Ala íleGly

275 280285

GTG GGA GAT GCC TTC CGG GAA CCC ACT GCC CTA CAG GAG CTG AAC ACC912

Val Gly Aap Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gin Glu Leu AsnThr

290 295300

ATT GGC TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT960 íle Gly Sar Ala Pro Ser Gin Asp Kla Val Phe Lys Val Gly Aanphe

305 310 31S320

GTA GCA CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC1008

Val Ala Leu Arg Ser íle Gin Arg Gin íle Gin Glu Lys íle PheAla

325 330335

ATT GAA GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG1056 íle Glu Gly Thr Glu Sar Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin Kla GluMet

340 345350

TCA CAA GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG1104

Str Gin Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro ValLeu

355 360365

GGG GCT GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC1152

Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Lau TvxPro

370 375380

TCA AAT ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT1200

Ser Asn Het Arg Ser Thr Phe íle Asn Met Ser Gin Glu Asn GluAsp

385 390 395400

ATG Αββ GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG1248

Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Sar Thr Ala Leu ALa Ph« TrpLys

405 410415

GGG GTC CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG1296

Gly Val Hla Str Leu íle Leu Gly Ala Pro Arg Hla Gin Hla ThrGly

420 425430

AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT1344

Ly* Val Val íle Phe Thr Gin Glu Ser Arg Hl* Trp Arg Pro LysSer

435 440445

GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT1392

Glu Val Arg Gly Thr Gin íle Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser LeuCys

450 455460

TCT GTG GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA1440

Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Lau íleGly

465 470 415480

GTC CCC CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC1489

Val Pro Hla Tyr Tyr Glu Hla Thr Arg Gly Gly Gin Val Sar ValCys

485 <90495

CCC ATG CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT1536

Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp Hla Cys Gly Thr Thr LeuHls

500 505510

GGG GAG CAG GGC CAT CCT TGG GGC CGC TTT GGG GCG GCT CTG ACA GTG1584

Gly Glu Gin Gly Hls Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Lau ThrVaL

515 520525

CTA GGG GAC GTG AAT GGG GAC AGT CTG GCG GAT GTG GCT ATT GGT GCA1632

Leu Gly Asp Val Aan Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala íle GlyAla

530 535 540

CCC GGA GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC1657

Pro Gly Glu Glu Glu Aan Arg Gly Ala Val Tyr íle Phe Hls GlyAla

545 SSO 555560

TCG AGA CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC172:

Ser Arg Gin Aap íle Ala Pro Ser Pro Ser Gin Arg Val Thr GlySer

569 570575

CAG CTC TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT GGG GGT177Ó

Gin Leu Phe Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser GlyGly

580 585590

CAG GAC CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG1824

Gin Asp Leu Thr Gin Aap Gly Leu Val Aap Leu Ala Val Gly Ala Gin

595 600605

GGG CAC GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC1872

Gly Hls Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glyíle

610 615620

TCC ATT AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC1920

8*r XI· Arg Pha Ala Pre S«r Glu Val AL* Ly* Thr V*L Tyr GLnCy*

625 630 635640

TGG GGA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT196B

Trp Glý Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr ValCys

645 650655

CTC ACT GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC2016

Leu Thr VaL Arg Lya Gly Ser Pro Asp Lau Lau Gly Aap Val GinSar

660 665670

TCT GTC AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT2064

Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu íle Ser Arg

675 680685

GCC ATT TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT2112

Ala íle Phe Aap Glu Thr Lya Aan Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr

690 695700

CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC2160

Lau Gly Leu Gly Asp Hls Cya Glu Thr Het Lys Leu Leu Leu Pro Aap

705 710 715720

TGT GTG GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC22OB

Cys Val Glu Aep Ala Val Thr Pre Xie Zle Leu Arg Leu Asn LeuSer

725 730735

CTG GCA GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT2256

Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Aan Leu Arg Pro Val LeuAla

740 745750

GTG GGC TCA CAA GAC CAT GTA ACA GCT TCT TTC CCG TTT GAG AAG AAC2304

VaL Gly Ser Gin Asp Hls Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu LyaAsn

755 760765

TGT AAG CAG GAG CTC CTG TGT GAG GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC2332

Cys Lys Gin Glu Leu Leu Cya Glu Gly Aan Leu Gly VaL Ser PheAsn

770 775780

TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT2400 phe Ser Gly Leu Gin Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu LeuThr

785 790 ?95Θ00

GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACC TTA2448

Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly ThrLeu

805 810815

ATC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GAG CTA TCT TAC CGA CGG GTG ACA AGA2496 íle Lya Phe Tyr Tyr Pro Ale Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val ThrArg

820 825830

GCC CAG CAA CCT CAT

CCG TAC Pro Tyr

CCA CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG

2544

Ala Gin

Gin 635

Pro

Kla

Pro Leu 840

Arg

Leu Ala

Cys Glu Ala Glu 845

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

2592

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Cya

Ser

íle

Aan

Hla

850

855

860

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

2640

Pro

íle

Phe

Arg

GLU

Gly

Ala

Lya

Ala

Thr

Phe

Mat

Ila

Thr

Phe

Aap

865

870

875

880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AGC

2688

val

Ser

Tyr

Lya

Ala

Phe

Leu

Gly Aap

Arg

Leu

Arg

Ala

Ser

B85

890

895

GCA

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

2736

Al*

Ser

Glu

Aan

Lya

Pro

Glu

Thr

Ser

Lya

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

2784

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lya

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Val

íle

Sex

Arg

Gin

915

920

925

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

2832

Glu

A*P

Ser

Thr

Lya

Hla

Phe

Aan

Phe

Ser

Hla

Gly

Glu

Arg

930

935

940

CAG

AAA

GAG

GCC

GAA

CAT

CGA

TAT

CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

TTG

2880

Gin

Lya

Glu

Ala

Glu

Hla

Arg

tyr

Arg

Val

Aan

Aen

Lau

Ser

Pro

Leu

945

950

955

960

ACG

CTG

GCC

ATC

AGC

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

CCC

ATC

CTT

CTG

AAT

GGT

2928

Thr

Leu

Ala

íle

Ser

Val

Aan

Phe

Trp

Val

Pro

íle

Leu

Asn

Gly

965

970

975

GTG

GCC

GTG

TGG

GAT

GTG

ACT

CTG

AGG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

2976

Val

Ala

Val

Trp Aap

Val

Thr

Leu

Arg

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

TGT

GTG

TCA

CAG

AGG

GAA

CCT

CAA

CAT

TCC

GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

3024

Cya

Val

Ser

Gin

Arg

Glu

Pro

Gin

Hla

Ser

Asp

Leu

Thr

Gin

99S

1000

1005

ATC

CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

GCC

ATC

GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

3072

íle

Gin

Gly Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Cys

Ala

íle

Ala

Asp

Cy.

Leu

Hla

1010

1015

1020

CTC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

GGC

ACC

CTG

GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

3120

Leu

Arg 5

Cya

Aip

íle

Pro

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

102'

1030

1035

1040

ATT

CTG

AAG

CGC

AAC

CTC

AGC

TTC

CGC

TGG

ATC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

3168

íle

Leu

Lya

Gly

Aan

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

íle

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1053

AAA

AAG

GTG

TTG

CTC

CTG

AGT

GAG

GCT

GAA

ATC

ACA

TTC

AAC

ACA TCT

3216

Lya

Val

Leu

Ser

Glu

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Aan

Thr

Ser

1060

1065

1070

GTG

TAT

TCC

CAG

CTG

CCG

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

3264

Val

Tyr

Ser

GLn

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Kla

Gin

Val

1075

1080

1083

TCA

ACG

ATG

CTA

GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

GAG

CCC

GTC

TTC

CTC

ATG

3312

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Phe

Leu

Het

1090

1095

1100

GTG

TTC

AGC

TCA

GTG

GGA

GGT

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACT

GTG

3360

Val

Phe

Ser

Val

Gly

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Val

nos

1110

1115

1120

GCG

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAA

CGT

CAG

TAT

AAA

GAG

ATG

CTG

3408

Ala

Leu

Tyr

Lya

Leu

Gly

Phe

Lya

Arg

Gin

Tyr

Lya

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

GAT

CTA

CCA

TCT

GCA

GAT

CCT

GAC

CCA

GCC

GGC

CAG

GCA

GAT

TCC AAC

3456

Aap

Leu

Pro

Ser

Ala

Asp

Pro

Asp

Pro

Ala Gly

Gin

Ala

Aap

Ser Aan

1140

1145

1150

CAT

GAG

ACT

CCT

CCA

CAT

CTC

ACG

TCC

TAGGAATCTA CTTTCCTGTA

3503

Hla

Glu

Thr

Pro

Hla

Leu

Thr

Sar

1155

1160

TATCTCCACA ATTKCGAGAT TGGTTTTGCT TTTGCCTATG AATCTACTGG CATGGGAACA 3563

AGTTCtCTTC AGCTCTGGGC TAGCCtGGGA AACTTCCCAG AÄATGATGCC CTACCTCCTG 3623

AGCTGGGAGA TTTTTATGGT TTGCCCATGT GTCAGATTTC AGTGCTGATC CACTTTTTTT 3683

GCAAGAGCAG GAATGGGGTC AGCATAAATT TACATATGGA TAAGAACTAA CACAAGACTG 3743

AGTAATATGC TCAATATTCA ATGTATTGCT TGTATAAATT TTTAAAAAAT AAAATGAAAN 3803 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 53:

Net

Val

Arg

Gly

Val

íle

Leu

Cys

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

35

40

45

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

Gin

Ser

Sar

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cya

Gin

Pro

íle

Leu

65

70

75

80

Leu Kla íle Pro Leu Glu Al* Val Aan Met Ser Leu Gly Leu Sar Leu

90 95

Val Al* Aap Thr Aan Aan Ser Gin L«u Leu Ala Cya Gly Pro Thr Al* 100 105110

Gin Arg Ala Cya Ala Lya Aan Mat Tyr Al* Lya Gly Ser Cys Leu Leu 115 120125

Leu Gly Ser Sar Leu Gin Phe íle Gin Al* íle Pro Ala Thr Met Pro 130 135140

Glu Cya Pro Gly Gin Glu Met Aap íle Ala Phe Leu íle Aap GlySer

145 150 155160

Gly Ser íle Aap Gin Ser Asp Phe Thr Gin Net Lys Asp Phe ValLys

165 170175

Ala Leu Met Gly Gin Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met 180 185190

Gin Tyr Ser Aan íle Leu Lya Thr Kla Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys 195 200205

Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Asp Ala íle Val Gin Lau Gin 210 215220

Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly íle Gin Lya Val Val Lya Glu Leu

225 230 235240

Phe Hla Ser Lya Aan Gly Ala Arg Lya Ser Ala Lya Lya íle Leu íle 245 250255

Val íle Thr Aap Gly GLn Lys Phe Arg Aap Pro Leu Glu Tyr Arg Hla 260 265270

Val íle Pro Glu Ala Glu Lya Ala Gly íle íle Arg Tyr Ala íle Gly 275 280285

Val Gly Aap Ala Ph* Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gin Glu Leu Aan Thr 290 295300 íle Gly Ser Ala Pro Ser Gin Aap Hla Val Phe Lya Val Gly Aan Phe

305 310 315320

Val Ala Leu Arg Ser íle Gin Arg Gin Ila Gin Glu Lys íle Phe Ala

325 330335 íle Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Sar Phe Gin Hla Glu Met 340 345350

Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Aap Gly Pro Val Leu 355 360363

Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Kla Phe Leu Tyr Pro 370 375380

Ser Aan Met Arg Ser Thr Phe íle Aan Met Ser Gin Glu Aan Glu Asp 385 390 395400

Met Arg Kap Ala

Tyr 405

Leu

Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys

410

415

Gly

Val

Kla

Sar

Leu

Tie

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

Ria

Thr

Gly

420

425

430

Lya

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

Kla

Trp

Arg

Pro

Ly.

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg Gly

Thr

GLn

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

465

470

475

480

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg Gly Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cya

Gly

Thr

Leu

Ria

500

505

510

Gly

Glu

Gin

Gly

Hla

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly Ala

Val

Tyr

íle

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Gin

Asp

íle

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

Hla

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

íle

610

615

620

Ser

íle

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lya

Thx

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp Gly

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

6S5

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

íle

Ser

Arg

675

680

685

Ala

íle

Phe

Aap Glu

Thr

Lys

Asn

Cya

Thr

Leu

Thr

Arg

Lya

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Aap

705

710

715

720

SK 283135 Β6

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

íle

Leu

Arg

Leu .

Asn

Lou

Ser

725

730

735

Leu

Ala

Gly

Asp

Sex

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

74S

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

Hla

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Lou

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

770

775

780

Pha

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

78$

790

795

800

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

Ila

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

Lou

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

820

825

830

Ala

Gin

Pro

Hla

Pro

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ale

Cys

Glu

Ala

Glu

835

840

845

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Cya

Ser

Zlo

Asn

Mís

850

855

860

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lya

Ala

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

A«p

865

B70

875

B80

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

Lou

Leu

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

Lou

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Val

íle

Ser

Arg

Gin

915

920

925

GlU

Asp

Ser

Thr

Lys

Hls

Phe

Asn

Phe

Ser

Kis

Gly

Glu

Arg

930

935

940

Gin

Lys

Glu

Ala

Glu

Hls

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Sar

Pro

Leu

945

950

955

960

Thr

Leu

Ala

íle

Ser

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Ila

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Arg

Sar

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

Cys

Val

Ser

Gin

Arg

Glu

Pro

Gin

Hla

Ser

ASP

Leu

Thr

Gin

995

100

0

100

5

íle

Gin

Gly

Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Cys

Ala

íle

Ala

Asp

Cys

Leu

His

101

0

101

5

102

0

Leu

Arg

Cys

Asp

íle

Pro

Ser

Leu

Gly

Thr

Lou

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

102

5

103

0

103

5

1040

íle

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

íle

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

1045

1050

105

5

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

1061

3

106!

107

0

val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

. Val

1075

1081

3

10B

5

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Pha

Leu

i Met

109í

3

109!

110

0

Val

Phe

Ser

Val

Gly

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Val

110!

5

1111

3

111.

5

1120

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Pha

Lys

Arg

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

112!

5

113i

3

113

15

Asp

Leu

Pro

Ser

Ala

Asp

Pro

Asp

Pro

Ala

Gly

Sln

Ala

Asp

Sex

• Asn

114i

3

114

5

115

0

His

Glu

Thr

Pro

Kis

Leu

Thr

Ser

115!

5

116'

0

GCA Ala 70

CCT GCC ACT GGC

ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA

Pro

Ala

Thr

Gly

Met 75

Cys

Gin

Pro Zle

Val 80

Leu

Arg Ser Pro Leu 85

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

Glu

Ale

Val

Asn

Mat

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

90

95

100

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cya

Val

105

110

115

AAG

AAC

ATG

TAT

GCG

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

Lya

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cya

Leu

Gly

Ser

Leu

120

125

130

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

G1U

Cys

Pro

Arg

Gin

135

140

145

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

Glu

Met

Asp

Zle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

GLy

Sor

Gly

Sex

Zle

Asn

Gin

150

155

160

165

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

Axg Aap

Phe

Ala

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

val

lys

Ala

Leu

Met

Gly

G1U

170

175

180

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TTG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

TCG

AAC

ATC

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

185

190

195

CTG

AAG

ACC

CAT

TTT

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

íle

Leu

Asp

Pro

200

205

210

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

Gin

Sar

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Lou

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

215

220

225

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

Thr

Val

Met

GLu

Glu

Leu

Phe

Hls

Sor

Lys

Asn

230

235

240

245

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

Gly

Sar

Arg

Lys

Ser

Ala

Lya

Lys

Ila

Leu

Lou

Val

Zle

Thr

Asp

Gly

250

255

260

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

Gin

Lys

Tyr

Arg

A*P

Pro

Leu

Glu

Tyr

Sor

Asp

Val

íle

Pro

Ala

265

270

275

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

Asp

Lys

Kla

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

280

285

290

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys

G1U

Leu

Asn

Thr

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

29$ 300 305

294

342

390

438

486

534

582

630

678

726

774

822

870

918

966 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3597 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 40..3525 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 54:

AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCÄGTG ATG GCC GGT GGA GTT Met Ala Gly Gly Val 1 5

GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GTC CTG GCT TCC TGT CAT GGG TCT AAC val Ila Leu Leu Cys Gly Trp Val Leu Ala Sar Cya Hla Gly Sor Asn

1520

CTG GAT GTG GAG GAA CCC ATC GTG TTC AGA GAG GAT GCA GCC AGC TTT

Leu Asp Val Glu Glu Pro Ila Val Pha Arg Glu Asp Ala Ala Sar Phe

3035

GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG GTG GGA GCC

Gly Gin Thr Val Val Gin Pha Gly Gly Sar Arg Leu Val Val Gly Ala

4550

CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA CGG TTG TAT GAC TGT

Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys

SO65

102

150

19S

6

CCA CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC

1014

Pro Gin Asp Kla Val Phe

lys

Val

Gly

Aan Phe Ala Ale Leu Arg Sor

310

315

320

325

ATC

CAG

AGG

CAA

CTT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

1062

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lya

I1O

Phe

Ala

íle

Glu

Gly

Thr

Gin

330

335

340

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

1110

Ser

Arg

Sor

Ser

Sor

Phe

Gin

Kia

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

345

350

355

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GTG

GGA

AGC

1158

Ser

Ala

Leu

Thr

Sor

Asp

Gly

Pro

Val

Lou

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

360

365

370

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

1206

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

375

380

385

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGA

GAC

TCC

TAC

1254

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

val

Aap

Met

Arg Asp

Sex

Tyr

390

395

400

405

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

1302

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lya

Gly

Val

His

Ser

Leu

410

415

420

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

1350

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Hla

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

íle

Phe

425

430

435

ACC

CAG

GAA

GCC

AGG

CAT

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

1398

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

Kla

Trp

Arg

Pro

Lys

Sor

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

440

445

4 50

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

1446

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Sar

Val

Asp

Val

Asp

455

460

46$

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

1494

Arg Asp

Gly

Sor

Xaa

Aap

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

470

475

480

485

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TTC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

1542

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

Pro

Val

Pro

Gly

Val

490

495

500

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

1590

Arg

Gly Arg

Trp

Gin

Cya

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Gly

Kla

505

510

515

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

1633

Pro

Trp

Gly Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Aap

Val

Asn

520

525

530

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

1686

Gly

Aap

Asn

Leu

Ala

Aap

val

Ala

íle

GLy

Ala

Pro

Gly

Glu

535

540

545

SK 283135 Β6

AGC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

TCG

AGA

CTG

GAG

ATC

1734

CCC

TCC

TTG

GAC

ATC

CAG GAT

GAA

CTT

GAC

TTC ATT

CTG

AGC

GGC

AAC

3174

Str

Arg

Gly

Ala

val

Tyr

Xle

Phe

Kis

Gly

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

íle

Pro

Ser

Leu

Atp

Xle

Gin Atp

Glu

Leu

Atp

Phe Xle

Leu

Arg

Gly

Arn

550

555

560

565

1030

1035

1040

1045

ATG

CCC

TCA

CCC

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

1782

CTC

AGC

TTC

GGC

TGG

GTC AGT

CAG

ACA

TTG

CAG GAA

AAG

GTG

TTG

CTT

3222

Kat

Pro

Ser

Pro

Ser 570

Gin

Arg

Val

Thr

Gly 575

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu 580

Arg

Leu

ser

Phe

Gly

Trp Val Ser 1050

Gin

Thr

Leu Gin Glu 1055

Lye

Val

Leu Leu 1060

CTG CAG TAT TTT

GGG CAG

TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAC CTT ACA CAG

1830

Leu

Gin Tyr

Phe 585

Gly

Gin

Ser Leu Ser 590

Gly

Gin Asp Leu $95

Thr Gin

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

1818

Atp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

600

605

610

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

1926

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

Xle

•Arg

Phe

Ala

615

620

625

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

AAG

GCT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GAA

AGG

ACT

CCC

1974

Pro

Mat

Glu

Val

Ala

Lya

Al*

V*1

Tyr

Gin

Cys

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

630

635

640

645

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

2022

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

Hla

Lys

6S0

655

660

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

2070

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

665

670

67S

CTG

GCG

TTA

GAT

CCG

GGC

CGC

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

2118

Leu

Al*

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

íle

Ser

Arg

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

680

685

690

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

2166

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly Asp

695

700

705

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

2214

His

Cys

Glu

Thr

Val

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

G1U

Asp

Ala

710

715

720

725

GTG

AGC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT.

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

2262

Val

Ser

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Ar?

Asp

Ser

730

735

740

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

2310

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

745

750

755

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

2353

His

íle

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

760

765

770

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

2406

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

íle

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

775

780

783

GTG AGT GAG GCT GAA ATC ACT

TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG CTG Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gin Leu

3270

Val

Ser

Glu Ala Glu íle 1065

Thr

1070

1075

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACA

ACG

TTA

GAA

3318

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Leu

Glu

1080

10B5

1090

GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

GAG

CCC

ATC

TTC

CTC

GTG

GCG

GGC AGC

TCG

GTG

3366

Glu

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

íle

Phe

Leu

Val

Ale

Gly Ser

Ser

Val

1095

1100

1105

GGA

GGT

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACA

GTG

GTA

CTG

TAC

AAG

crr

3414

Gly

Leu

Ala

Leu

Xle

Thr

Val

Leu

Tyr

Lys

Leu

1110

1115

1120

1125

GGC

TTC

TYC

AAA

CGT

CAG

TAC

AAA

GAA ATG

CTG

GAC

GGC

AAG

GCT

GCA

3462

Gly

Phe

Xaa

Lys

Arg

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

Asp

Gly

Lys

Ala

1130

1135

1140

GAT

CCT

GTC

ACA

GCC

GGC

CAG

GCA

GAT

TTC

GGC

TGT

GAG

ACT

CCT

CCA

3510

Asp

Pro

val

Thr

Ala Gly

Gin

Ala

Asp

Phe Gly

Cys

Glu

Thr

Pro

1145

1150

1155

TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATCAAGATTG 35É2

Tyr Leu Vil Str

1160

GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT

3597 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 55:

Met

Ala

Gly

Val

VaL

íle

Leu

Cys

Gly

Trp

Val

Leu

Ala Ser

1

5

10

15

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

íle

Val

Phe

Arg Glu

25 30

GTC

TTG

GTG

GGA

GGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

GTC

ACA

GTC

ACT

GTG

2454

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

. Val Gin Ph

e GI

y GI

y Se

r Arg

Val

Leu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

VaL

35

40

4

5

790

795

800

805

Leu

val

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

2502

50

55

60

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Cys

Ala

810

815

820

Arg

Leu

Tyr

Asp

Pro

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

GLn

Pro

íle

Val

65

70

75

80

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

CTA

ACA

CCG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

2S50

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

GLn

Pro

His

Leu

Arg

Ser

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Aan

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

825

830

835

85

90

95

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

2598

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Tyr

Pro • 40

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Al*

G1U

Pro

Ala 850

Ala

Gin

Glu

100

105

110

GAC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

2646

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Mat

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

115

120

125

855

860

865

Leu

Gly

Sar

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

GGT

GCA

AAG

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTC

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

2694

130

135

140

Gly

Ale

Lys

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

870

875

880

885

Glu

Cye

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

2742

145

150

155

160

TTC

CTA

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg 890

Leu

Arg

Ala 895

Lys

Ala

Ser

Glu 900

Asn

Gly

Ser

íle

Asn

Gin 165

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin 170

Met

Lys

Asp

Phe

Vaľ 175

Lys

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

2790

Gly

Glu

Phe

Ala

Thr

Phe

Ser

Leu

Met

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Ala

Leu

Met

Ser

Thr

Sar

Leu

905

910

915

180

185

190

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

AAG

TAC

ACC

GTC

TAT

ACC

CTG

ATC

AGT

AGG

CAA

GAA

CAT

TCC

ACC

AAC

2838

195

200

205

Lys

Tyr

Thr

val

Tyr

Thr

Leu

íle

Ser

Arg

GLn

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

920

925

930

Asn

íle

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Gin

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

TCT

TCC

CAC

GCG

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

2886

210

215

220

His

VaL

Asn

Phe

Ser

HiS

Gly

Arg

Gin

Glu

Ala

935

940

945

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

Thr

Val

Met

Glu

Leu

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

2934

225

230

235

240

Kis

Arg

Tyr

Arg

VaL

Asn

Leu

Sex

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

950

955

960

965

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

2982

245

250

255

CTT

AAC

TTC

TGG

GTC

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

íle

Thr

ASp

Gly

Gin

Lya

Tyr

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

970

975

980

260

265

270

GTG Val

ACT Thr

CTG

AGC Ser 985

AGC Ser

CCA Pro

GCA Ala

CAG Gin

GGT Gly 990

GTC Val

TCC Ser

TGC Cys

GTG Val

TCC Ser 995

CAG GLn

ATG Met

3030

Val

íle

Pro 275

Ala

Asp

Lys

Ala 280

Gly

íle

Arg

Tyr 285

Ala

íle

Gly

AAA

CCT

CAG

AAT

CCC

GAC

TTT

CTC

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

CGT

TCT

3078

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

Lys

Pro

Gin

Asn

Pro

Atp

Phe

Leu

Thr

Gin

íle

Gin

Arg

Ser

290

295

300

100

0

100

5

101

0

3126

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TTC

CGC

TGT

GAC

ATC

305

310

315

320

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

íle

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Phe

Arg

Cys

Asp

íle

101

S

102

0

102

5

Ala

AL*

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

325

330

335

íle

G1U

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

Sar

Ser

Phe

Gin

Hla

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

Ser

Asp

> Gly

Pro

Val

Leu

355 360 365

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Sar

Trp

Sar

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Pro

Asn

Thr

Ar?

Pro

Thr

Phe

11«

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

365

390

395

400

Mt

Ar?

Asp

Ser

Tyr

L.u

Gly

Tyr

Sar

Thr

Ala

val

Ala

Phe

Trp

Ly.

405

410

415

Gly

Val

Hla

3«r

Leu

Zla

Leu

Gly

Ala

Pro

AX?

H1S

Gin

Hla

Thr

Gly

420

425

430

Ly·

Val

Zla

Phs

Tbr

Gin

Glu

Ala

Ar?

Bií

Trp

Arg

Pro

Lys

Sar

«35 <<0 «5

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

4S5

460

Ser

Val

Aap

Val

Asp

Arg

Aap

Gly

Ssr

Xaa

Asp

Leu

Val

Leu

Zle

Gly

465

470

475

460

Ala

Pro

Hla

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

485

490

495

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Al*

Thr

Leu

Kis

500

505

5X0

Gly

Glu

Gin

Gly

Hla

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val·

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Lau

Ala

Asp

Val

Ala

11.

Gly

Ala

530

535

$40

Pro

Gly

Glu

Ser

Ar?

Gly

Alt

Val

Tyr

11«

Phe

Hla

Gly

Ale

545

550

555

560

Ser

Arg

Leu

Glu

íle

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Lsu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

ASp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

6

05

Gly

Hls

Val

Leu

Lau

Ar?

Ser

Leu

Pro :

Leu Leu L

ys V

*1 Glu Li

BU

610

615

620

Ser

íle

Ar?

Phe

Ala

Pro

Het

Glu

Val

Ala :

Lys Ala V

’al T

yr G:

Ln C'

/·

625

630

635

6

<0

Trp

Glu

Ar?

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala <

Gly Glu Ala Thr V

i C:

y·

645

550

t

55

Leu

Thr

Val

Kle

ty·

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Leu Gly Asn V

al G

ln G

ly

660

665

6

i70

Ser

Val

Ar?

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Aap

Pro

Gly Arg Leu 1

la S

•r Ar?

675

660

685

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Ly.

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Gly

Arg

Ly·

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Hls

Cya

Glu

Thr

Val

Ly*

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

725

730

735

Leu

Val

Ar?

Asp

Str

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

Hls

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

Hl*

íle

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Lye

Gin

Glu

Lau

Leu

Cys

G1U

Gly

Asp

Leu

Gly

íle

Ser

Phe

Asn

770

775

780

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

VaL

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

610

815

Val

Ly.

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Ar?

Val

Thr

Gly

820

825

830

Thr

Gin

Pro

HU

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

835

840

645

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

Cy.

Ser

Zle

Asn

Hls

850

655

860

Pro

11a

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Ly.

Thr

Phe

Het

íle

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Ly.

Ala

Phe

Lsu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Ly.

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Ly.

Pro

Aap

Thr

Asn

Ly.

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

•Val

Ly.

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Leu

íle

Ser

Ar?

Gin

915

920

925

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

Hl.

Val

Asn

Phe

Ser

HiS

Gly

Arg

930

»35

940

Arg

Gin

Glu

Ala

Hl.

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

945

950

955

960

Lys

Lau

AL*

Val

Ar?

Val

Asn

Pha

Trp

val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

Cys

Val

Sar

Gin

Met

Lys

Pro

Gin

A. n

Pro

Asp

Phe

Z>eu

Thr

Gin

995

100

D

100

5

11«

Gin

Arg

Ar?

Ser

V*1

Leu

A«P

Cys Ser

Zle

Ala

Asp I

Cys

Leu

Hls

1010

1015

102(

Phe

Arg

Cy.

Asp

íle

Pro

Ser

Leu

Asp 11*

Gin

kap

Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

íle

Leu

Ar?

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly Trp

Val

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

Glu

Lys

val

Leu

Val

Ser

Glu

Ale Glu

Zle

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

1070

val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu Ala

Phe

Leu

Ara

Ala

Gin

Val

1075

1080

1085

Glu

Thr

Leu

Glu

Tyr

Val

Val Tyr

Glu

Pro

Zle

Phe

Leu

val

1090

1095

1100

Ala

Gly

Ser

Val

Gly

Leu

Leu Leu

Leu

Ala

Leu

11*

Thr

Val

110!

5

1110

1115

1120

Val

Lbu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Xaa

Lys Arg

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

Asp

Gly

Ly.

Ala

Asp

Pro

Val

Thr Xaa

Gly

Gin

Ala

Asp

Phe

Gly

1140

1145

1150

Cy*

Glu

Thr

Pro

Tyr

Leu

Val

Ser

115!

5

1161

3

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 56:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) . TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 56:

CCTGTCATGG GTCTAACCTG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 57:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 57:

AGGTTAGACCCATGACAGG 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 58:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 58:

GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 59:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET RE ŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 59:

CCAARGCTGG CTGCATCCTC TC 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna

SK 283135 Β6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 60:

CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C (2) INFORMÁCIE O SEK ID. č.: 61:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 61:

CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 62:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 62:

GCTGGGATCA TTCGCTATGC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č: 63:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 63:

CAATGGATGG ACCAGTTCTG G (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 64:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE; SEK. ID. č.: 64:

CAGATCGGCT CCTACTTTGG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 65:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 65:

CATGGAGCCT CGAGACAGG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 66:

CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. 1D. č.: 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 67:

CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 68:

CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 69:

CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 70:

GTCACAGAGG GAACCTCC 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 71:

GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 72:

GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 73:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 73:

CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 74:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 74:

GTGGATCAGC ACTGAAATCT G (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 75:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 75:

CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 76:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 76:

CACAGCGGAG GTGCAGGCAG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 77:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 77:

CTCACTGCTT GCGCTGGC (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 78:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 78:

CGGTAAGATA GCTCTGCTGG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 79:

GAGCCCACAG CCAGCACAGG 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 80:

GATCCAACGC CAGATCATAC C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 81:

CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 82:

C ACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 83:

TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP; nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 84:

GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 85:

CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 86:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 86:

GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 87:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 87:

GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 88:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 88:

CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. ¢.: 89:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 89:

CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 90:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 90:

GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID: č.: 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 91:

AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 852 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 61..852 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. ¢.: 92:

TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG

ATG GCC Met Ala 1

CTT GGG Leu Gly

GCT Ala 5

GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT TAC CAC

108

Val

Val Leu

Leu

Gly Val 10

Leu Ala

Ser Tyr His 15

GGA

TTC

AAC

TTG

GAC

GTG

ATG

AGC

GGT

GAT

CTT

CCA

GGA

AGA

CGC

AGC

156

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Met

Ser

Gly Asp

Leu

Pro

Gly

Arg

Ser

20

25

30

GGG

CTT

CGG

GCA

GAG

CGT

GAT

GCA

GTT

TGG

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

204

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Val

Trp Gly

Ser

Arg

Leu

Val

3S

40

45

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

CGG

CTG

TAC

252

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

CCA

TTC

ATG

300

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

íle

Pha

Pro

Phe

Met

65

70

75

80

ccc

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

GCA

GCC

TCC

348

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Lau

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

85

90

95

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCC

ACC

GTG

CAT

AGA

GCC

396

Pro

Asn

H1S

Ser

Gin

Lau

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Arg

Ala

100

105

110

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

GAT

GCC

444

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Alt

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

lau

Leu

Asp

Ala

115

120

125

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

GAG

TGC

CCA

492

His

Ala

Gin

Pro

íle

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Al*

Leu

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGC

AGC

ATT

540

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

11·

Val

Phe

Lau

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

145

150

155

160

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

GCT

GTG

ATG

5Θ9

Ser

Sar

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Al*

Val

Met

165

170

175

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

CAG

TAC

TCC

636

Asp

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

185

190

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

AAC

AGC

TCC

664

Asn

Val

Leu

Val

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

Asn

Ser

195

200

205

AAT

CCT

CAG

GGC

CTA

GTG

GAG

CCC

ATT

GTG

CAG

CTG

ACA

GGC

CTC

ACG

732

Asn

Pro

Gin

Gly

Lau

Val

Glu

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210

215

220

TTC

ACG

GCC

ACA

GGG

ATC

CTG

AAA

GTG

ACA

GAG

CTG

TTT

CAA

ACC

780

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

11«

Lau

Lya

Val

Thr

G1U

Leu

Phe

Gin

Thr

225

230

235

240

AAG

Axe

GGG

GCC

CGC

GAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

GTC

ATC

ACA

828

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

Lya

ILe

Leu

íle

val

íle

Thr

245

250

255

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GCG

GCA

852

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Ala

260 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 264 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 93:

ACGGGACGGC TGTATGACTG CGCAGCTGCC ACCGGCATGT GCCAGCCCAT CCCGCTGCAC

240

Met Ala 1

Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His

5

10

15

Gly

Phe

Asn

Leu 20

Asp

Val

Met

Ser

Gly Asp Leu 25

Pro

Gly Arg Arg 30

Ser

Gly

Leu

Arg 35

Ala

Glu

Arg Asp

Ala <0

Val

Trp Gly

Ser

Arg Leu 45

Val

Gly

Ala 50

Pro

Leu

Ala

Val

Val 55

Ser

Ala

Asn

His

Thr 60

Gly Arg

Leu

Tyr

Glu 65

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser 70

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro 75

íle

Phe Pro

Phe

Het 80

Pro

Glu

Ala

Val 85

Asn

Met

Ser

Leu

Gly 90

Leu

Ser

Leu Ala

Ala 95

Ser

Pro

Asn

His

Ser 100

Gin

Leu

Ale

Cys 105

Gly

Pro

Thr

Val His 110

Arg

Ala

Cys

Gly

Glu 115

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin 120

Gly

Phe

Cys

val

Leu Leu 125

Asp

Ala

His

Ala 130

Gin

Pro

íle

Gly

Thr 135

Val

Pro

Ala

Leu 140

Pro Glu

Cys

Pro

Asp 145

Gin

Glu

Met

Asp

íle 150

Val

Phe

Leu

íle

Asp Gly 155

Ser Gly

Ser

íle 160

Ser

Asn

Asp

Phe 165

Arg

Lys

Met

Lys

Asp 170

Phe

Val

Arg Ala

Val 175

Het

Asp

Gin

Phe

Lys 190

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin 195

Phe

Ser

Leu

Met Gin 190

Tyr

Ser

Asn

Val

Leu 195

Val

Thr

His

Phe

Thr 200

Phe

Ser

Phe

Arg Asn 205

Ser

Asn

Pro 210

Gin

Gly

Leu

Val

Glu 215

Pro

íle

Val

Gin

Leu 220

Thr Gly

Leu

Thr

Phe 225

Thr

Ala

Thr

Gly

íle 230

Leu

Lys

Val

Thr 235

Glu

Leu Phe

Gin

Thr 240

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ale

Lys

íle

Leu

íle Val

íle

Thr

245 250 255

ATCCGCCCTG AGGCCGTGAA CATGTCCTTG GGCCTGACCC TGGCAGCCTC CACCAACGGC

TCCCGGCTCC TGGCCTGTGG CCCGACCCTG CACAGAGTCT GTGGGGAGAA CTCATACTCA

AJIGGGTTCCT GCCTCCTGCT GGGCTCGCSC TGGGAGATCA TCCAGACAGT CCCCGACGCC

ACGCCAGAGT GTCCACATCA AGASATGGAC ATCGTCTTCC TGATTGACGG CTCTGGAAGC

ATTGACCAAA ATGACTTTAA CCAGATGAAG GGCTTTGTCC AAGCTGTCAT GGGCCAGTTT

GAGGGCACTG ACACCCTGTT TGCACTGATG CAGTACTCAA ACCTCCTGAA GATCCACTTC

ACCtTCACCC AATTCCGGAC CAGCCCGAGC CAGCAGAGCC TGGTGGATCC CATCGTCCAA

CTGAAAGGCC TGACGTTCAC GGCCACGGGC ATCCTGACAG TGGTGACACA GCTATTTCAT

CATAAGAATG GGGCCCGAAA AAGTGCCAAG AAGATCCTCA TTGTCATCAC AGATGGGCAG

AAGTACAAAG ACCCCCTGGA ATACAGTGAT GTCATCCCCC AGGCAGAGAA GGCTGGCATC

ATCCGCTACG CTATCGGGGT GGGACACGCT TTCCAGGGAC CCACTGCCAG GCAGGAGCTG

AATACCATCA GCTCAGCGCC TCCGCAGGAC CACGTGTTCA AGGTGGACAÄ CTTTGCAGCC

CTTGGCAGCA TCCAGAAGCA GCTGCAGGAG AASATCTATG CAGTTGAGGG AACCCAGTCC

AGGGCAAGCA GCTCCTTCCA GCACGAGATG ICCCAAGAAC GCTTCAGCAC AGCCCTCACA

ATGGATGGCC TCTTCCTGGG GGCTGTGGGG AGCTTTAGC7 GGTCTGGAGG TGCCTTCCTG

TATCCCCCAA ATATGAGCCC CACCTTCATC AACATGTCTC AGGAGAATGT GGACATGAGG

GACTCTTACC TGGGTTACTC CACCGAGCTA GCCCTGTGGA AGGGGGTACA GAACCTGGTC

CTGGGGGCCC CCCGCTACCA GCATACCGGG AAGGCTGTCA TCTTCACCCA GGTGTCCAGG

CAATGGAGGA AGAAGGCCGA AGTCACAGGG ACGCAGATCG GCTCCTACTT CGGGGCCTCC

CTCTGCTCCG TGGATGTGGA CAGCGATGGC AGCACCGACC TGATCCTCAT IGGGGCCCCC

CATTACTATG AGCAGACCCG AGGGGGCCAG GTGTCCGTGT GTCCCTTGCC TAGGGGGAGG

GTGCAGTGGC ÄGTGTGACGC TGTTCTCCGT GGTGAGCAGG GCCACCCCTG GGGOCGCTIT

GGGGCAGCCC TGACAGTGTT GGGGGATGTG AATGAGGACA AGCTGATAGA CGTGGCCATT

GGGGCCCCGG GAGAGCAGGA GAACCGGGGT GCTGTCTACC TGTTTCACGG AGCCTCAGAA

TCCGGCATCA GCCCCTCCCA CAGCCAGCGG ATTGCCACCT CCCAGCTCTC CCCCAGGCTG

CAGTATTTTG GGCAGGCGCT GAGTGGGGGT CAGGACCTCA CCCAGGATGG ACTGATGGAC

CIGGCCGTGG GGGCCCGGGG CCAGGTGCTC CTGCTCAGGA GTCTGCCGGT GCTGAÄAGTG

GGGGTGGCCA TGASATTCAC CCCTGTGGAG GTGGCCAAGG CTGTG7ACCG GTGCTGGGAA

GAGAAGCCCA GTGCCCTGGA AGCTGGGGAC GCCACCGTCT GTCTCACCAT CCAGAAAAGC

TCACTGGACC AGCTAGGTGA CATCCAAAGC TCTGTCAGGT TTGATCTGGC ACTGGACCCA

300

360

420 <eo

540

600

720

760

640

900

96Ó

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1390

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Ala Ala

260 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 94:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 94:

CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 95:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. t.: 95:

CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2499 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 96:

ATGACCTTCG GCACTGTGCT TCTTCTGAGT GTCCTGGCTT CTTATCATGG ATTCAACCTG

GATGTCGAGG AGCCIXCGXT CTTCCASGAG GATGCXGGCG GCTTTGGGCA GXGCGTGGTG

CXGTTCGGTG GKTCTCGACT CGTGGTGGGX CCACCCCTGG XGGTGGIGGC GGCCAACCXG

GGTCGTCTGA CTTCTCGTGC CATTTTCAAT GAAACCAAGA ACCCCACTIT GACTCGAAGA

AAAACCCTGG GACTGGGGAT TCACTGTGAA ACCCTGAAGC TGCTTTTGCC AGTGAGGACT

TTGGGTTCTG GGAAGGGGGA GAGAGGAGGA GCCCAAGGCT GGCCTGGAGC ACCCCCGTTC

TCTGCTGAGC GAGGTGGGAA GGGTTAGGAT GTTGGGGCIG GAGAGAGGGA CATTAGGGCA

GGAGAACCTG GCTCCACGGC TTGGAGGGAG CACTGTCAGG GCAGTGGGGA GTGGATGCAG

TGGAGGAGGA CTTGTGGTGG AGCGTAGAGA GGACAGCAGG TTCTTGAAAG CCTGTTCTCT

CTCAGGATTG TGTGGAGGAT GTGGTGAGCC CCATCATTCT GCACCTCAAC TTCTCACTGG

TGAGAGAGCC CATCCCCTCC CCCCAGAACC TGCGTCCTG (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3956 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 97:

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2499

	TTTAACTGCA CCAACTTTAA AATACGCTAT TGGAGCTGGA ATTACCGCGG CfGCTGGCAC	60
	CAGACTTGCC CTCCAATGGA TCCTCGTTAA AGGMTTAAA GTGGACTCAT TCCAATTACA	120
	GGGCCTCGAA AGAGTCCTGT ATTGTTATTT TTCGTCACTA CCTCCCCGGG TCGGGAGTGG	180
	CTAATTTGCG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA TGTGGTAGCC GTTTCTCAGG CTCCCTCTCC	240
	GGAATCGAAC CCTGATTCCC CGTCACCCGT GGICACCATG GTAGGCACGT GCAGTTCGGT	300
	GGATCTCGAC TCGTGGTGGG AGCACCCCTG GAGGTGGTGG CGGCCAACCA GACGGGACGG	360
	CTGTATGACT GCGCAGCTGC CACCGGCATG TGCCAGCCCA TCCCGCTGCA CATCCGCCCT	420
	GAGGCCGTGA ACATGTCCTT GGGCCTGACC CTGGCAGCCT CCACCAACGG CTCCCGGCTC	480
	CTGGCCTGTG GCCCGACCCT GCACAGAGTC TGTGGGGAGA ACTCATACTC AAAGGGTTCC	540
	TGCCTCCTGC TGGGCTCGCG C7GGGAGATC ATCCAGACAG TCCCCGACGC CACGCCAGAG	600
	TGTCCACATC AAGAGATGGA CATCGTCTTC CTGATtGACG GCTCTGGAAG CATTGACCMs	660
	AATGACTTTA ACCAGATGAA GGGCTTTGTC CAAGCTGTCA TGGGCCAGTT TGAGGGCACT	720
	GACACCCTGT TTGCACTGAT GCAGTACTCA AACCTCCTGA AGATCCACTT CACCTTCACC	780
	CAATTCCGGA CCAGCCCGAG CCAGCAGAGC CTGGTGGATC CCATCGTCCA ACTGAAAGGC	840
120	CTGACGTTCA CGGCCACGGG CATCCTGACA GTGGTGACAC AGCTATTTCA TCATAAGAAT	900
18C	GGGGCCCGAA AAAGTGCCAA GAAGATCCTC ATTGTCATCA CAGATGGGCA GAAGTACAAA	96C

SK 283135 Β6

GACCCCCTGG AATACAGTGA TGTCATCCCC CAGGCAGAGA AGGCTGGCAT CATCCGCTAC1020

GCTATCGGGG TGGGACACGC TTTCCAGGGA CCCACTGCCA GGCAGGAGCT GAATACCATC1000

AGCTCAGCGC CTCCGCAGGA CCACGTGTTC AAGGŤGGACA ACTTTGCAGC CCTTGGCAGC1140

ATCCAGAAGC AGCTGCAGGA GAAGATCTAT GCAGTTGAGG GAACCCAGTC CAGGGCAAGC1200

AGCTCCTTCC AGCACGAGAT GTCCCAAGAA GGCTTCAGCA CAGCCCTCAC AATGGATGGC1260

CTCTTCCTGG GGGCTGTGGG GAGCTTTAGC TGGTCTGGAG GTGCCTTCCT GTATCCCCCA1320

AATATGAGCC CCACCTTCAT CAACATGTCT CAGGAGAATG TGGACATGAG GGACTCTTAC1380

CTGGGTTACT CCACCGAGCT AGCCCTGTGG AAGGGGGTAC AGAACCŤGGT CCTGGGGGCC1440

CCCCCCTACC AGCATACCGG GAAGGCTGTC ATCŤTCACCC AGGTGTCCAG GCAATGGAGG1500

ÄAGAAGGCCG AAGTCACAGG GACGCAGATC GGCTCCTACT TCGGGGCCTC CCTCTGCTCC1560

GTGGATGTGG ACAGCGATGG CAGCACCGAC CTGATCCTCA TTGGGGCCCC CCATTACTAT1620

GAGCAGACCC GAGGGGGCCA GGTGTCCGTG TGTCCCTTGC CTAGGGGGAG GGTGCAGTGG1680

CAGTGTGACG CTGTTCTCCG TGGTGAGCAG GGCCACCCCT GGGGCCGCTT TGGGGCAGCC1740

CTGACAGTGT TGGGGGATGT GAATGAGGAC AAGCTGATAG ACGTGGCCAT TGGGGCCCCG1B00

GGAGAGCAGG AGAACCGGGG TGCTGTCTAC CTGTTTCACG GAGCCTCAGA ATCCGGCATC1860

AGCCCCTCCC ACAGCCAGCG GATTGCCAGC TCCCAGCTCT CCCCCAGGCT GCAGTATTTT1920

GGGCAGGCGC TGAGTGGGGG TCAGGACCTC ACCCAGGATG GACTGATGGA CCTGGCCGTG1980

CGGGCCCGGG GCCAGGTGCT CCTGCTCAGS AGTCTGCCGG TGCTGAAAGT GGGGGTGGCC2040

ATGAGATTCA GCCCTGTGGA GGTGGCCAAG GCTGTGTACC GGTGCTGGGA AGAGAAGCCC2100

AGTGCCCTGG AAGCTGGGGA CGCCACCGTC TGTCTCACCA TCCAGAAAAG CTCACTGGAC1160

CAGCTAGGTG ACATCCAAAG CTCTGTCAGG TTTGATCTGG CACTGGACCC AGGTCGTCTG222C

ACTTCTCGTG CCATTTTCAA TGAAACCAAG AACCCCACTT TGACTCGAAG AAAAACCCTG2280

GGACTGGGGA TTCACTGTGA AACCCTGAAG CTGCTTTTGC CAGATTGTGT GGAGGATGTG2340

GTGAGCCCCA TCATTCTGCA CCTCAACTTC TCACTGGTGA GAGAGCCCAT CCCCTCCCCC2400

CAGAACCTGC GTCCTGTGCT GGCCGTGGGC TCACAAGACC TCTTCACTGC TTCTCTCCCC2460

TTCGAGAAGA ACTGTGGGCA AGATGGCCTC TGTGAAGGGG ACCTGGGTGT CACCCTCAGC2520

TTCTCAGGCC TGCAGACCCT GACCGTGGGG AGCTCCCTGG AGCTCAACGT GATTGTGACT2580

GTGTGGAACG CAGGTGAGGA TTCCTACGGA ACCGTGGTCA GCCTCTACTA TCCAGCAGGG264*

CTGTCGCACC GACGGGTGTC AGGAGCCCAG AAGCAGCCCC ATCAGAGTGC CCTGCGCCTG27C0

GCATGTGA3A CAGTGCCCAC TGAGGATGAG GGCCTAAGAA GCAGCCGCTG CAGTGTCAAC2780

CACCCCATCT TCCATGAGGG CTCTAACGGC ACCTTCATAG TCACATTCGA TGTCTCCTAC2820

AAGGCCACCC TGGGAGACAG GATGCTTATG AGGGCCAGTG CAAGCAGTGA GAACAATAAG2880

GCTTCAAGCA GCAAGGCCAC CTTCCAGCTG GAGCTCCCGG TGAAGTATGC AGTCŤACACC2940

ATGATCAGCA GGCAGGAAGA ATCCACCAAG TACTTCAACT TTGCAACCTC CGATGAGAAG3000

AAAATGAAAG AGGCTGAGCA TCGATACCGT GTGAATAACC TCAGCCAGCG AGATCTGGCC3060

ATCAGCATTA ACTTCTGGGŤ TCCTGTCCTG CTGAACGGGG TGGCTGTGTG GGATGTGGTC3120

ATGGAGGCCC CATCŤCAGAG TCTCCCCTGT GTTTCAGAGA GAAAACCTCC CCAGCATTCT3180

GACTŤCCTGA CCCAGATTTC AAGAAGTCCC ATGCTGGACŤ GCTCCATTGC TGACTGCCTG3240

CAGTTCCGCŤ GTGACGTCCC CTCCTTCAGC GTCCAGGAGG AGCTGGATTT CACCCTGAAG3300

GGCAATCTCA GTTTCGGCTG GGTCCGCGAG ACAŤTGCAGA AGAAGGTGTT GGTCGTGAGT3360

GTGGCTGAAA TTACGTTCGA CACATCCGTG TACTCCCAGC TTCCAGGACA GGAGGCATTT3420

ATGAGAGCTC AGATGGAGAT GGTGCTAGAA GAAGACGAGG TCTACAATGC CATTCCCATC3400

ATCATGGGCA GCTCTGTGGG GGCTCTGCTA CTGCŤGGCGC TCATCACAGC CACACTGTAC3540

AAGCTTGGCT TCTTCAAACG CCACTACAAG GAAATGCTGG AGGACAAGCC TGAAGACACT3600

GCCACATTCA GTGGGGACGA TTTCAGCTGT GTGGCCCCAA ATGTGCCTTT GTCCTAATAA3660

TCCACTTTCC TGTTTATCTC TACCACTGTG GGCTGGACTŤ GCTTGCAACC ATAAATCAAC3720

TTACATGGAA ACAACTTCTG CATAGATCTG CACTGGCCTA AGCAACCTAC CAGGTGCTAA3780

GCACCTTCTC GGAGAGATAG AGATTGTCAA TGTTTTTACA TATCTGTCCA TCTTTTTCAG3940

CAATGACCCA CTTTTTACAG AAGCAGGCAT GGTGCCASCA TAAATTTTCA TATGCTTAAG3900

AATTGTCACA TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTTTAG3956 ² (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3785 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..3486 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. C.: 98:

GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ila Ph· Gin Glu Asp Ala

96

20

25

30

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC '

GTG i

3TG CAG TTC GGT GGA TCT '

CGA i

CTC GTG

144

Gly

Ph·

GLy

Gin

Sar

Val ’

Val Gin Ph« Gly Gly !

Sex

Atg '

Leu ’

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG

GTG <

GTG GCG GCC AAC CAG ACG

GGA ¹

CGG i

CTG

192

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val '

Val Ala Ala Asn Gin Thr

Gly i

Arg ;

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC i

GGC ATG TGC CAG CCC ATC

CCG '

CTG i

CAC

240

Tyr

Asp Cys

Ala

Thr i

Gly M«t Cys Gin Pro :

íle

Pro :

Leu 1

Kis

65

70

75

80

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG

AAC

ATG TCC TTG GGC CTG 1

ACC

CTG '

GCA ¹

GCC

288

Ila

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn :

Het Ser Leu Gly Leu *

ľhr

Leu

Ala .

Ala

BS

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG GCC TGT GGC CCG i

ACC

CTG '

CAC .

AGA

336

Sar

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Lau Ala Cys Gly Pro ¹

Thr

Leu

His

Arg

100

105

1L0

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA AAG GGT TCC TGC <

CTC

CTG

CTG ¹

GGC

384

Val

Cys

Gly

G1U

Asn

Ser

Tyr

Ser Lys Gly Ser Cys :

Leu

Leu ¹

Gly

115

120

125

ŤCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA GTC CCC GAC GCC .

ACG

CCA

GAG

TGT

432

Ser

Arg

Trp

Glu

11·

Ila

Gin

Thr val Pro Asp Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

CCA

CAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATC

GTC TTC CTG ATT GAC

GGC

TCT

GGA

AGC

480

Pro

Hi·

Gin

Glu

Mat

Asp

íle

Val Ph· L«u 11· Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

ATT

GAC

CAA

AAT

GAC

TTT

AAC

CAG ATG AAG GGC TTT

GTC

CAA

GCT

GTC

528

11·

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin Mat Lys Gly Phe

Val

Gin

Ala

Val

165

170

175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC ACC CTG TTT GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

576

Mat

Gly

Gin

Ph·

Glu

Gly

Thr

Asp Thr Lau Ph· Ala

L«u

Met

Gin

Tyr

190

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

TTC ACC TTC ACC CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

624

Sar

Asn

L«u

L«U

Lys

íle

Hla

Phe Thr Phe Thr Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

CCG

AGC

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT CCC ATC GTC CAA

CTG

AAA

GGC

CTG

612

Pro

Sar

Gin

Ser

Leu

val

Asp Pro íle Val Gin

Leu

ty»

Gly

Leu

210

215

220

ACG

; JTC

ACG

GCC

ACG

GGC

ATC

CTG ACA GTG GTG ACA

CAG

CTA

TTT

CAT

720

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu Thr Val Val Thr

Gin

Leu

Ph·

Kia

225

230

235

240

CAT

AAC

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT GCC AAG AAG ATC

CTC

ATT

GTC

ATC

769

Hla

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

S«r Ala Lys Lys íle

Leu

11·

Val

11«

245

2S0

255

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC CCC CTG GAA TAC

AGT

GAT

GTC

ATC

816

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp Pro Leu Glu Tyr

Ser

ASP

Val

11·

260

265

270

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC ATC CGC TAC GCT

ATC

GGO

GTG

GGA

864

Pre

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

11· 11· Arg Tyr Ala

11·

Gly

Val

Gly

275

2Θ0

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC AGG CAG GAG CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

912

His

Ala

Ph·

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala Arg Gin Glu Leu

Asn

Thr

11«

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG TTC AAG GTG GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

960

S«r

Ala

Pro

Gin

Asp

Kis

Val Ph· Lys Val Asp

Asn

Ph·

Ala

305

310

315

320

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG CAG GAG AAG ATC

TAT

GCA

GTT

GAG

1008

Leu

Gly

Sar

Ila

Gin

Lys

Gin

Leu Gin Glu Lys íle

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

GGA ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

AGC TCC TTC CAG CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1056

Gly

Thr

Gin

Ssr

Arg

Ala

Ser

Ser Ser Phe Gin His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA ATG GAT GGC CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1104

Glu

Gly

Ph·

S«r

Thr

Ala

Leu

Thr Met Asp Gly Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA GGT GCC TTC CTG

TAT

CCC

CCA AAT

1152

Val

Gly

S«r

Ph·

Ser

Trp

Ser

Gly Gly Ala Phe Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG TCT CAG GAG AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1200

Mat

Sar

Pre

Thr

Phe

íle

Aan

Met Ser Gin Glu Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC GAG CTA GCC CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1249

Asp

Ser

Tyr

L«u

Gly

Tyr

Ser

Thr Glu Leu Ala Lau

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC CGC TAC CAG CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1296

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro Arg Tyr Gin His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

GTC

ATC

TTC

ACC

CAG

GTG

TCC

AGG CAA TGG AGG AAG

AAG

: GCC

GAA

GTC

1344

Val

11·

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg Gin Trp Arg Lys

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

ACA

GGG

ACG

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC TTC GGG GCC TCC

CTC

l TGC

TCC

GTG

1392

Thr

Gly

Thr

Gin

11·

Gly

Ser

Tyr Phe Gly Ala Ser

Leu

t Cys

S«r

Val

450

455

4 60

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

: ACC GAC CTG ATC CTC

: ATT

¹ GGG

i GCC

: CCC

1440

Asp

Val

Aap

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr Asp Leu íle Leu

11«

i Gly

- Ala

Pro

465

470

47S

480

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

: CGA

. GGG GGC CAG GTG TCC

’ GTC

; TGT

' CCC

TTG

1489

KiS

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

1 Gly Gly Gin Val Ser

Val

. Cys

< Pro

i Leu

4B5

490

4 95

MC MC TTC CCC ACT GTG CTI CTI CTG ASI GTC CTG GCT TCT TM CM «S

Het Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr Hli

10 15

CCT

AGG

GGG

AGG

GTG

CAG

TGG

CAG

TGT

GAC

GCT

GTT

CTC

CGT

GGT

GAG

1536

Pro

Arg

Gly

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Aap

Al*

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

SOS

510

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

GGG

1584

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Lau

Thr

Val

Lau

Gly

515

520

525

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

GGA

1632

Aap

Val

Asn

Glu

Asp

Lya

Leu

Zle

Aap

Val

Al*

Zle

Gly

Al*

Pro

Gly

530

535

540

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

GAA

1680

Glu

Gin

Glu

Aan

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

CTC

1728

Ser

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

Si*

Ser

Gin

Arg

£1*

Ala

Ser

Sar

Gin

Leu

565

570

575

TCC

CCC

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

GCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1776

Ser

Pro

Arg

Lau

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

CAG

1824

Leu

Thr

Gin

Aap

Gly

Leu

Met

Aap

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

595

600

605

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

ATG

1872

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Al*

Met

610

615

620

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

GAA

1920

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Al*

Lys

Al*

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

62$

630

635

640

GAG AAG CCC AGT GCC CTG GAA GCT GGG GAC GCC ACC GTC TGT CTC ACC1968

Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr

645 650655

ATC CAG AAA AGC TCA CTG GAC CAG CTA GGT GAC ATC CAA AGC TCT GTC2016 íle Gin Lys Ser Ser Leu Asp Gin Leu Gly Asp íle Gin Ser Ser Val

660 665670

AGG TTT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGT CGT CTG ACT TCT CGT GCC ATT2064

Arg Phe Asp Lau Al* Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala íle

675 6B0685

TTC AAT GM ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG GGA2112

Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly

690 695700

CTG GGG ATT CAC TGT GAA ACC CTG AAG CTG CTT TTG CCA GAT TGT GTG216C

Leu Gly íle His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp CysVal

705 710 715720

GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC AAC TTC TCA CTG GTG220:

Glu Asp Val V*1 Sar Pro íle íle Leu His Leu Aan Phe Ser LeuVal

725 730735

AGA

GAG

CCC

ATČ

CCC

TCC

CCČ

CAG

AAC

CTG

CGT

CCT

GTG

CTG

GCC

GTG

2256

Arg

Glu

Pro

íle

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Al*

Val

740

74 5

750

GGC

TCA

CM

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

TGT

2304

Gly

Ser

Gin

Aap

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

GGG

CM

GAT

GGC

CTC

TGT

GM

GGG

GAC

CTG

GGT

GTC

ACC

CTC

AGC

TTC

2352

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

GTG

2400

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

MC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

GTC

2448

11*

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

A*P

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

605

810

815

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

GCC

2496

Sar

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

ser

Hli

Arg

val

Ser

Gly

Al*

820

825

830

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA

GTG

2544

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cya

Glu

Thr

Val

835

840

845

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

CAC

2592

Pro

Thr

G1U

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cya

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

GAT

2640

Pro

Zle

Phe

Hla

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

íle

Val

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

AGT

2688

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

CAG

2736

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lya

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

CTG

GAG

CTC

CCG

GTG

AAG

TAT

GCA

GTC

TAC

ACC

ATG

ATC

AGC

AGG

CAG

2784

Leu

G1U

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

V* L

Tyr

Thr

Het

íle

Ser

Arg

Gin

915

920

925

GM

GAA

TCC

ACC

AAG

TAC

TTC

AAC

TTT

GCA

ACC

TCC

GAT

GAG

AAG

AAA

2832

G1U

Glu

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

CGA

2980

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

GGG

2928

Asp

Leu

Ala

íle

Ser

11*

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

GTG Val

GCT Ala

GTG TGG GAT GTG GTC ATG

GAG GCC CCA TCT CAG AGT CTC CCC

2976

Val

Trp Aap Val 980

Val Het

Glu 985

Al*

Pro

Ser

Gin

Ser Leu Pro 990

TGT

GTT

TCA

GAG

AGA

AM

CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC

TTC

CTG

ACC

CAG

3024

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lya

Pro

Gin

Kla

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

ATT

TCA

AGA

AGT

ccc

ATG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAG

3072

Zle

Ser

Arg

Sar

Pro

Het

Leu

Asp

Cys

Ser

íle

Ma

Asp

Cys

Leu

Gin

1010

1015

1020

TTC

CGC

TGT

GAC

GTC

ccc

TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG

CTG

GAT

TTC

3120

Phe

Arg

Cya

Aap

Val

Pre

Sar

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Aap

Phe

1025

1030

1035

1040

ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG CAG3168

Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Cln

1045 10501055

MG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GM ATT ACG TTC GAC ACA TCC3216

Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu íle Thr Phe Asp ThrSer

1060 10651070

GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG ATG3264

Val Tyr Ser Gin Leu Pre Gly Gin Clu Ala Phe Met Arg Ala GinMet

1075 10BO10B5

GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC ATC3312

Glu Met Val Leu Glu Glu Aap Glu Val Tyr Aan Al* íle Pro íleíle

1090 10951100

ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA GCC3360

Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu íle ThrAla

1105 1110 11151120

ACA

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AM

CGC CAC

TAC

AAG

GAA

ATG

CTG

3408

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg Hla

Tyr

Lys

G1U

Het

Leu

1125

1130

1135

GAG

GAC

AAG

CCT

GM

GAC

ACT

GCC

ACA

TTC AGT

GGG

GAC

GAT

TTC

AGC

3456

Glu

Asp

Ly*

Pro

Glu

Asp

Thr

Ma

Thr

Phe Ser

Gly

Asp

Phe

Ser

1141

J

114!

list

J

TGT

GTG

GCC

CCA

MT

GTG

CCT

TTG

TCC

TMTAAT'

:ca i

cttti

CCTG'

ΓΤ

3503

Cya

Val

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Leu

Ser

11S!

S

1161

3

TAtCtCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATM ATCAACTTAC ATGGÄAACAA 3563

CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTMGCAC CTTCTCGGAG 3623

ÄGATAGAGAT TGTCAATGTT TTTACATATC TGTCCATCTT TTTCAGCMT GACCCACTTT 3683

TTACAGMGC AGGCATGGTG CCAGCATAAÄ TTTTCATATG CTTMGMTT GTCACATGAA 3742

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAÄAA AÄAAAACTTT AG 378:

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 99:

Mat

Thr

Phe

Gly

Thr

val

Leu

Ser

val

Leu

Ala

Ser

Tyr

His

1

5

10

15

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

íle

Phe

Gin

Glu

Asp

Mi

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

ser

val

Val

Gin

Phe

Gly

Sar

Arg

Leu

Val

35

40

45

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

Tyr

Asp

Cya

Ma

Thr

Gly

Met

cys

Gin

Pro

íle

Pro

Leu

His

65

70

75

80

11·

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

Ma

85

90

95

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Sar

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

Ser Arg Trp Glu 11« Zle Gin Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys

130

135

140

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

A*p

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

íle

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

165

170

175

Het

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Asn

Leu

Lys

íle

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

210

215

220

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

2Z5

230

235

240

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg Lys

Ser

Ala

Lys

Ly*

íle

Leu

íle

Val

Ue

245

250

255

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

260

265

270

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

275

280

285

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

Leu

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Íle

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

Gly Thr Gin Ser Arg Ala Sar Sar Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin 340 345350

Glu Gly Phe Str Thr Ala Lau Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala

355 360365

Val Gly Sar Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pre Pro Asn 370 375380

Met Ser Pro Thr Phe íle Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg 385 390 395400

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lya

Gly

Val

405

410

415

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

Thr

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

Asp

Val

Asp

Ser

Aap

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

íle

Leu

íle

Gly

Al*

Pro

465

470

475

480

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

GLy

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Aap

Lya

Lau

íle

Aap

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

Clu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

Hla

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

Ser

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

Hla

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

57$

Sar

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

595

600

605

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lya

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Al*

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

íle

Gin

Lys

Ser

Leu

Aap

Gin

Leu

Gly

Asp

íle

Gin

Ser

Val

660

665

670

Arg Phe Aep Leu Ala Leu Aap Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala íle

675 680685

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

590

695

700

Leu

Gly

íle

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Aap

Cys

Val

705

710

715

720

Glu

Aap

Val

Ser

Pro

11«

íle

Leu

Hla

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725

730

735

Arg

Glu

Pro

íle

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

740

745

750

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lya

Asn

Cya

755

760

765

Gly

Gin

Aap

Gly

Leu

Cya

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

íle

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

GLy

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Hla

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

Hla

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

cys

Glu

Thr

val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

Pro

íle

Phe

His

GlU

Gly

Ser

Aan

Gly

Thr

Phe

íle

Val

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lya

Ala

Thr

Leu

Gly

Aap

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

685

890

895

Al*

Ser

ser

Glu

Asn

Lya

Ala

ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

íle

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Glu

Ser

Thr

Ly*

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

Met

Ly*

Glu

Al*

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

Asp

Leu

Ala

íle

Ser

íle

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Pro

980

985

990

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lya

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

lla

Ser

Arg

Ser

Pro

Het

Leu

Asp

Cys

Ser

íle

Ale

A3D

Cya

Leu

Gin

1010

1015

1020

Phe

Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

GLn

G1U

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Gin

1045

1050

105!

5

Lys

val

Leu

val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

L070

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

Met

1075

1081

í

1085

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

íle

Pro

íle

1091

J

109!

5

1101

3

Met

Gly

Ser

Sar

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

íle

Thr

Ala

1105

1110

111!

5

1120

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His

Tyr

lys

Glu

Met

Leu

112!

5

113'

0

113

5

Glu

Asp

Lys

Pro

Glu

Aap

Thr

Ala

Thr

Phe

Ser

Gly

Aap

Phe

Ser

1141

114!

5

115'

0

Cys

Val

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Leu

Ser

115.

5

116

0

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1318 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 17..1255 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 100:

AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT 4 9

Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser 15 10

TAC Tyr

CAC GGA TTC AAC TTG

GAC Asp

GTG Val

GAT GAG CCG GTG ATC TTC CAG GAA

97

His

Gly

Phe Asn 15

Leu

Aap 20

Glu Pro

Val

íle Phe 25

Gin Glu

GAC

GCA

GCG

GGC

TTC

GGG

CAG

AGC

GTG

ATG

CAG

TTT

GGA

TCT

CGA

145

Aep

Ala

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Met

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

30

35

40

CTC

GTG

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

193

Lau

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

Hla

Thr

Gly

45

50

55

CGG

CTG

TAC

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

241

Arg

Leu

Tyr

Glu

Cys

Al*

Pro

Ala

Sex

Gly

Thr

Cya

Thr

Pro

íle

Phe

60

65

70

75

CCA

TTC

ATG

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

2B9

Pro

Phe

Met

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

8ar

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

80

85

90

GCA

GCC

TCC

CCC AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

337

Al*

Ala

Ser

Pro

Asn

Hla

Ser

Gin

Leu

Ala

Cya

Gly

Pro

Thr

Val

95

100

105

CAT

AGA

GCC

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

385

Mi·

Arg

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ale

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

110

115

120

CTG

GAT

GCC

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

433

Leu

Aep

Ala

Kla

Ala

Gin

Pro

íle

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

125

130

135

GAG

TGC

CCA

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

491

Glu

Cys

Pro

Asp

Gin

Glu

Met

Aap

íle

Val

Phe

Leu

íle

Aap

Gly

Ser

140

145

150

155

GGC

AGC

ATT

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

529

Gly

ser

U·

Ser

Asn

A*p

Phe

Arg

Lya

Met

Lya

Asp

Phe

Val

Arg

160

165

170

GCT

GTG

ATG

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

577

Al*

Val

Met

Aep

Gin

Phe

Lys

Aap

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

175

180

185

CAG

TAC

TCC

JAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

625

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val

Leu

Val

Thx

Hla

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

190 195 200

AAC AGC TCC

AAT CCT CAG

GGC CTA GTG GAG CCC ATT GTG CAG CTG ACA

673

Asn Sar 20S

sar

Asn

Pro Gin

Gly Leu Val Glu Pro 11* Val

Gin Lau Thr

210

215

CGC

CTC

ACG

TTC

ACG

GCC

ACA

GGG

ATC

CTG

AAA

GTG

ACA

GAG

CTG

721

Gly

Lau

Thr

Ph*

Thr

Al*

Thr

Gly

Ila

Lau

Lys

VaL

Val

Thr

Glu

Leu

220

225

230

235

TTT

CAA

ACC

AAG

AAC

GGG

GCC

CGC

GAA AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

769

Ph*

Gin

Thr

Lya

Ain

Gly

Alt

Arg

Glu

Sar

Al*

Lya

lya

íle

Leu

Ila

240

245

250

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

CAC

TAC

AGT

GCT

817

Val

Ila

Thr

Asp Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Lau

Hla

Tyr

Sar

Ala

25$

260

26$

GTC

ATC

CCA

CAG

GCA

GAG

CAG

GCG GGC

ATC

CGC

TAC

GCC

ATC

GGG

865

Val

Ila

Pro

Gin

Al*

Glu

Gin

Ala

Gly

Ila

Arg

Tyr

Ala

Ila

Gly

270

27$

280

GTG

GGG

GAC

GCG

TTC

CAG

AAA

CCC

ACA

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

GAC

ACC

913

val

Gly Asp

Al*

Ph*

Gin

Lys

Pro

Thr

Al*

Arg

Gin

Glu

Lau

A«P

Thr

285

290

295

ATC

GCC

TCC

GAG

CCG

CCC

GAC

GCC

CAC

GTG

TTC

CAG

GTG

GAC

AAT

TTC

961

íle

Ala

Ser

G1U

Pro

Asp

Al*

Hl*

Val

Phe

Gin

val

Asp

Asn

Ph*

300

305

310

315

TCA

GCA

CTC

AGC

ATC

CAA

AAG

CAG

CTG

TAT

GAC

AGG

ATC

TTT

GCC

1009

Sar

Ala

Lau

Ser

Ila

Gin

Lys

Gin

Lau

Tyr

Asp

Arg

11*

Pha

Al*

320

325

330

GTC

GAG

GGA

ACC

CTG

TCA

TCG

GCA

AGC

ACC

TCC

TTC

CAG

CAT

GAG

ATG

1057

VaL

Glu

Gly

Thr

Leu

Ser

Sar

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe

Gin

Hla

Glu

Met

335

340

345

TCC

CAA

GAG

GGC

TTC

AGC

TCA

CTT

CTC

ACC

ACG

GAA

GGA

CCG

GTG

CTG

1105

Sar

Gin

Glu

Gly

Pha

Sar

Leu

Lau

Thr

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

3S0

355

360

GGG

GCT

GTG

GGC

AGC

TTC

GAT

TGG

TCC

GGG

GGT

GCT

TTC

CTG

TAC

CCC

1153

Gly

Al*

V* L

Gly

Sar

Phe

Α·Ρ

Trp

Ser

Gly

Al*

Ph*

Lau

Tyr

Pro

365

370

375

CCC

GGC

GGG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

AAC

GTG

GAC

1201

Pro

Gly

Ser

Pro

Thr

Pha

Ila

Aan

Het

Sar

Gin

Aan

VaL

Aap

380

385

390

395

ATG

AGG

GAC

TCC

TAC

CTG

GGT

GAG

GAA

GGG

GTG

GGG

GTG

GGG

ACA

GGT

1249

Met

Arg

Aap

S«r

Tyr

Lau

Gly

Clu

Gly

Val

Gly

Val

Gly

Thr

Gly

400

405

410

CGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGCCTG CCAGCCGAGG GMCJtGGACG 1305

Gly Ser

Glu Gin Ala

Gly íle íle Arg

Tyr Ala íle Gly Val Gly Asp Ala Phe

275

280

285

Gin

Lys

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asp

Thr

íle

Ala

Ser

Glu

Pro

290

295

300

Pro

Asp

Ala

HLs

Val

Phe

Gin

Val

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

305

310

315

320

íle

Gin

Lya

Gin

Leu

Tyr Asp Arg

íle

Phe

Ala

Val

Glu

Gly

Thr

Leu

325

330

335

Ser

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe

Gin

Kis

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

340

345

350

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

355

360

365

Phe

Aap

Trp

8er

Gly Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Gly Gly

Ser

Pro

370

375

380

Thr

Phe

Zle

Asn

Met

Ser

Gin

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Aap

Ser

Tyr

3B5

390

395

400

Leu

Gly

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Gly

Thr

Gly Gly

Ser

405

410

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1484 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..1482 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 102:

CCAGAGGCAX AGA me (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 413 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 101:

Gly

Ale

Val

Leu

Gly

Val

Leu .

Ala

Ser

Tyr

Hla

Gly

Phe

Asn

L

5

10

15

Leu

Aap

VaL

Asp

Glu

Pro

Val

Zle

Phe

Gin

Glu

Asp

Al*

Gly

Phe

20

25

30

Gly

Gin

Ser

Val

Met

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

35

40

45

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

Hla

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

Glu

Cys

50

55

60

Ala

Pro

Al*

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

Zle

Phe

Pro

Ph*

Met

Pro

Pre

65

70

75

80

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Lau

Gly

Leu

Ser

Leu

Al*

Ala

Ser

Pro

Asn

85

90

95

Hlo

Ser

Gin

Lau

Leu

Ala

Cya

Gly

Pro

Thr

Val

HL*

Arg

Ala

Cys

Gly

100

105

110

Glu

Aap

Val

Tyr

Al*

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

Asp

Al*

His

Al*

115

120

125

Gin

Pro

Zle

Gly

Thr

Val

Pro

Al*

Leu

Pro

Glu

Cya

Pro

Asp

Gin

130

135

140

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Lau

Zle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Zle

Ser

Sar

145

150

1SS

160

Asn

Aap

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

VaL

Arg

Ala

Val

Met

Asp

Gin

165

170

175

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val

180

18S

190

Leu

Val

Thr

HLs

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

Asn

Ser

Asn

Pro

195

200

205

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

ila

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Phe

Thr

210

215

220

Ala

Thr

Gly

Zle

Leu

Lys

Val

VaL

Thr

Glu

Leu

Phe

Gin

Thr

Lys

Asn

225

230

235

240

Gly

Al*

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

11*

Val

Zle

Thr

Asp

Gly

245

250

255

Gin

Ly*

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

His

Tyr

Ser

Al*

Val

Zle

Pro

Gin

Ala

260

265

270

GAT GTC CAG AGC TCC ATC AGC TAT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGC CGC

4S

Asp Val Gin Ser Ser íle Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly

Arg

1

5

10

1S

CTG GTC TCT OGG GCC i

m

TTT

CAA

GAG

ACC

CAG

AAC

CAG

ACT

TTA

ACT

96

Leu Val Ser Arg Ala :

íle

Phe i

Gin

Glu

Thr

Gin

Aan

Gin

Thr

Leu

Thr

20

25

30

CGA AGG AAG ACC i

CTG '

GGG

CTG

GGG

CGT

CAC

TGT

GAA

ACC

ATG

AGG

CTA

144

Arg Arg Lya Thr !

Leu ¹

Gly

Leu

Gly Arg

Hia

Cya

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

35

40

45

CTT TTG CCA GAC '

TGC

GTA

GAG

GAC

GTG

AAC

CCC

ATC

GTC

CTG

CAC

192

Leu Leu Pre Aap i

Cya

Val

Glu

Aap

Val

v*l

Aan

Pro

íle

Val

Leu

His

50

55

60

CTC

AAC

TTC

TCC

CTG

GAG

GGA

CAG

CCA

ATC

CTC

TCA

TCC

CAG

AAT

CTG

240

Leu

Aan

Pha

Ser

Leu

Glu

Gly

Gin

Pro

11*

Lau

Ser

Gin

Asn

Leu

65

70

75

80

CGC

CCT

GTG

CTG

GCC

ACG

GGC

TCG

CAG

GAC

CAC

TTC

ATT

GCC

TCC

CTC

288

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Gly

Ser

Gin

Aap

Hia

Phe

íle

ALa

Ser

Leu

85

90

95

CCC

TTT

GAG

AAG

AAC

TGC

GGA

CAA

GAT

CGC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

336

Pre

Phe

Glu

Lya

Aan

Cya

Gly

Gin

Aap Arg

Lau

Cya

Glu

GLy

Asp

Leu

100

105

110

AGC

ATC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCG

GGC

TTG

AAT

ACC

CTG

GTG

GGG

CTC

384

Ser

íle

Sar

Phe

Aan

Phe

Sar

Gly

Leu

Aan

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

115

120

125

TCC

CTG

GAG

CTC

ACA

GTG

ACA

GTG

ACC

GTG

CGG

AAT

GAG

GGC

GAG

GAC

4 32

Ser

Leu

G1U

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

val

Arg

Aan

Glu

Gly

Glu

Asp

130

135

140

TCC

TAT

GGG

ACC

GCC

ATC

ACC

CTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCC

TAC

4B0

Ser

Tyr Gly

Thr

Al*

11*

Thr

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

145

150

155

160

AGG

CGG

GTG

TCG

GGC

CAG

ACA

CAA CCC

TGG

CAG

CGC

CCC

CTG

CAC

CTC

528

Arg

Yal

Sex

Gly Gin

Thr

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

His

Leu

165

170

175

GCA

TGT

GAG

GCT

GTA

CCT

ACC

GAG

AGC

GAG

GGC

TTG

AGG

AGT

ACC

AGC

576

Al*

Cya

Glu

Ala

Val

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Thr

Ser

180

185

190

TGC

AGC

GTC

AAC

CAC

CCC

ATC

TTC

CAA

GGG

GGT

GCT

CAG

GGC

ACT

TTC

624

Cya

Ser

Val

Aan

Hla

Pro

11*

Phe

Gin

Gly

Ala

Gin

Gly

Thr

Phe

195

200

205

GTA

GTC

AAG

TTC

GAT

GTC

TCC

AAG

GCC

AGC

CTG

GGT

GAC

AGG

TTG

672

Val

Lya

Phe

Aap

Val

Ser

S«r

Lya

Ala

Ser

Leu

Gly Asp Arg

Leu

210

215

220

CTC

ATG

GGG

GCC

AGT

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GCG

AGC

AAC

720

Leu

Met

Gly

Ala

Ser

Ala

Sar

Ser

Glu

Aan

Lya

Pro

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

AAG

ACC

TCC

TTT

GAG

CTG

GAA

CTG

CCA

GTG

AAA

TAC

GCT

GTC

TAC

ATG

7 68

ty*

Thr

Ser

Phe

Glu

Leu

G1U

Leu

Pro

Val

Lya

Tyr

Alt

Val

Tyr

Met

245

250

255

ATG

ATC

ACA

AGG

CAC

GAA

GGC

TCC

ACC

AGG

TTC

AAC

TTT

TCC

ACT

416

Het

íle

Thr

Arg

Hia

G1U

Gly

Ser

Thr

Arg

Pha

Phe

Asn

Phe

Ser

Thr

260

265

270

TCC

GCT

GAG

AAG

AGC

AAA

GAG

GCC

GAG

CAC

CGC

TAT

CGG

GTG

AAC

864

Ser

Ala

Glu

Lya

Ser

Lya

Glu

Ala

Glu

Hia

Arg

Tyr

Arg

Val

Aan

275

280

285

AAC

CTG

AGT

CTG

CGA

GAT

GTG

GCC

GTC

AGC

GTG

GAC

TTC

TGG

GCC

CCC

912

Asn

Leu

Ser

Leu

Ara Aap

Val

Ale

Val

Ser

Val

Asp

Ph*

Trp

Ala

Pro

290

295

300

SK 283135 Β6

GTG CAG Val Gin 303

CTG AAC GGA Leu Asn Gly

GCA GCT GTG TGG GAC GTG GCG GTG

GAG GCC

CCT Pro 320

960

Ala Ala Val Trp Asp Val Ala

Val

Glu

Al*

310

315

GCC

CAG

AGC

CTG

CCC

TGT

GCG

CGG

GAG

AGG

GAA

CCT

CCG

AGG

ACC

TCT

1003

Al*

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Clu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

GAC

CTG

AGC

CGG

GTC

CCG

GGG

AGT

CCC

GTG

CTG

GAC

TGC

AGC

GTT

GCG

1056

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cy*

Ser

Val

Ale

340

345

350

CAC

TGC

CTG

AGG

TTC

CGC

TGC

CAC

ATC

CCC

TCC

TTC

AGC

GCC

AAG

GAG

1104

His

Cys

Leu

Arg

Ph*

Arg

Cys

Hla

11*

Pro

Ser

Phe

Ser

Ala

Lys

Glu

3SS

360

365

GAS

CTC

CAC

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

GCC

TGG

GTC

AGC

1152

Glu

Leu

His

Ph*

Thr

L* u

Lys

Gly Asn

Leu

Ser

Phe

Al*

Trp

Val

Ser

370

375

380

CAG

ATG

CTG

CAA

AAG

GTG

TCG

GTG

AGT

GTG

GCC

GAG

ATC

ACC

1200

Cln

Met

Leu

Gin

Lya

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

Thr

385

390

395

400

TTC

AAC

AGG

GCC

GTG

TAC

TCC

CAA

GTT

CCG

GGC

GAG

CCC

TTT

ATG

1248

Ph*

Asn

Arg

Al*

val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

M*t

405

410

415

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACG

GTG

CTG

GAG

TAT

GAG

CAC

GAC

CCC

1296

Arg

Ale

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

His

Aap

Pro

420

425

430

GTC

CCC

CTG

GTG

GGC

AGC

TGT

GTG

GGC

CTG

GCT

1344

Val

Pro

Leu

Val

VaL

Gly

Ser

Cys

Val

Gly Gly

Leu

Al*

435

440

445

CTC

ATC

TCA

GCC

ACC

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAG

CGC

CGG

TAC

1392

Leu

íle

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg Arg

Tyr

<50

455

480

AAG

GAG

ATG

CTG

GGC

GAG

AAA

CCG

GGA

GAC

GCG

GCC

ACC

TTC

CCC

GGG

1440

Lys

Glu

Met

L«u

Gly

Glu

tys

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

<65

470

475

460

CAG

GAC

GCC

AGC

TGC

GGG

GCT

TCA

GAT

TTG

CCT

TTG

TCC

CAG

1482

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly

Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

485

4 90

TG

1484

(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 494 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 103:

Asp Val Gin 8er Sar II* Ser Tyr Asp Leu Al* Leu Asp Pro GLy Arg 15 10 1S

Val 305

Gin Leu Asn Gly

Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro

310

315

320

Ala

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Glu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

Val

Ala

340

345

350

His

Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

His

íle

Pro

Ser

Phe

Ser

Ale

Lys

Glu

355

360

365

G1U

Leu

His

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Trp

Val

Ser

370

375

380

Gin

Met

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

Thr

3B5

390

395

400

Phe

Asn

Arg

Ala

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

Met

405

410

415

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

KiS

Asp

Pro

420

425

430

Val

Pro

Leu

Val

Gly

Ser

Cys

VaL

Gly Gly

Leu

Ala

435

440

445

Leu

íle

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Tyr

450

455

460

Lys

Glu

Mat

Leu

Gly

Glu Lys

Pro

Gly Asp

Ale

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

465

470

475

480

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

<85

490

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hybridom označený 199M, uložený v zbierke ATCC pod depozitným číslom HB 12058.

2. Monoklonálna protilátka proti α-podjednotke integrínu B₂ sekretovaná hybridómom podľa nároku 1.

4 výkresy

Leu Val Ser Arg Ala 11« Phe Gin Glu Thr Gin Asn Gin Thr Leu Thr

20 25 30 Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu 35 40 45 Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro íle Val Leu Kla 50 55 60

Leu Asn Ph* Ser Leu Glu Gly Gin Pro II* Leu Ser Ser Gin Asn Leu

65 70 75 80 Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gin Asp His Phe íle Ala Ser Leu 85 90 95 Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gin Asp Arg Leu Cys Glu Gly ÄSp Leu 100 105 110 Ser íle Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu VaL Gly Leu 115 120 125 Ser Leu Glu Leu Thr V*1 Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp 130 135 140 Ser Tyr Gly Thr Ala íle Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr 145 150 155 L6Q Arg Arg Val Ser Gly Gin Thr Gin Pro Ttp Gin Arg Pro Leu His Leu 165 170 175 Ala Cys Glu Ale V*1 Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Sex iso 185 190 Cys Ser val Asn His Pro íle Phe Gin Gly Gly Ala Gin Gly Thr Phe 195 200 205 val val Lys Phe ASP Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu 210 215 220 Leu Met Gly Ala Ser AL* Ser Ser Glu Asn Asn Lye Pro Ala Ser Asn 225 230 235 240 Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lya Tyr Ala Val Tyr Met 245 250 255 Met Ila Thr Arg Kla Glu Gly Ser Thr Arg Phe Eh* Aan Phe Ser Thr 260 265 270 Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn 275 280 285 Aan Leu Ser Leu Arg Asp Val ALa Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro 290 295 300

1 / 4 r-r*, o *a- LD sso 91010 rH wsk «r HHH or»09 O19191 r<HH VO hs 00 <r CVNN vo r*, co 91 91 91 OUCMÍM

kd TF-GT—vll lsvlasyhgf nldveeptif qedaggfgos vvqfggsrlv

CDUb ma-lr—vll ltaltlciigf hldtehamtf oenargfgqs vvqlqgsrvv v>v>vi

0 U r-< r-i rK r-4 aaa <aO uuo QdO >>->·

OOO

Z Vi O OOO I— CC-M oeo <cvíví <>->SSS

0.0.0. g»ug> LU(5LU o. eso H-IZ < < V) αω> 0.0.0.

>U.-J ŕ-idZ aoa wo.hluoc 3X I

I -J I KZIV) vío.

CS(5(5

-JU.J

-JU-Ll. uuu Vi-J-J ««« ZZH Vi>-J >->->Vil-X

LULUQS O Vi (5 CJCJO >HUI OíO = ZZZ pifŕ

O.O.O. OOO uou sss moo V)Bl Vi 0 0.0. ZV) V)

0 o r4rH t-ír-H QQQ «G) (J

-u u. u. -JUJ i* ZLU Z Vi V) Vi líg 333 <vi vi

U.U.U. -J-J c f-h-H pižw H· Vi O. o&os uíSes ÍX--JLU oco (9LU V) ^viSÉ

Q. OSOS <<< O O (B «I— vi Z+-K zzz u. u. u. .J—J—J

K

za< o. a. ví U! «O L1.U.U· —J mJ mJ QQZ >·>□ q. a. v> ZZQS □ Jj qqq O O. Vi Vi V) Vi 2(5 C5 □ MW eias-J >>u.ui I—< ►—i ►—4 V) Vi V) 00.0. V)ZZ gíáí CD CD O 0.0. Vi CD CD CD V) V) V) WZh aaa CD CD CD h-zz Hf-H aoQ ZOO ►—«»—« F-4 F-r F-< F-( LuLuU. -J-J-J CLUUJ HOM U. U. U. -J-J-J ><c> Ll.lx.ll. F—1 F—« F—C hhh ***

i—(»—< HXV>3

UIQU1 <<< víza

0 U t-írri rH r4 QQQ BCJG)

0 O r4rH r-4 rri DDQ BGJUJ

0 u rHt-4 rH rH aaa

OBRÁZOK 1A aD QELHTISSAP PQDIIVFKVDN FAALGSIQKQ LQEKIYAVEG TQSRASSSFQ 346

CDlls QELNTIASKP PRDHVFQVNN FEALKTIQNQ LREKIFAIEG TQTGSSSSFE 347

CDllc KELNDIASKP SOEHIFKVED FDALKDIQNQ LKEKIFAIEG TETISSSSFE 348 u9 r>*co O) OY oš m mm va r*.co «ο· «Τ cr •r ty er ve r* oo O O» CTt ey ey var* r*, crcr unmun var* b*

Ch 0V OV vníma

>(/)> U1ZUJ 0.0.0. OUlUi ZQZ <<< -l.J-1 UJUIUJ IXl>IXl £z£ 0.0.0. tStíJtS aaa htícnz LJCJLJ 0.0.0. C/)fe-U) ZZZ ctíixiS 333 (/)1/)(/) <<< 000 ac as z ezo HHH Ctí 19 Ctí <<> U. U. U. (/)!—(/) uSS >>> ΗΉΙ— >Z> 000 aaa ζωα. pec ocaíeí hH j— UliíV) h 1— P -J-J-J ZLUZ ĽLU.U- ooo ac hc «u *-<z»-< UJUIUJ aaa o. σι o. ><> >>->- UI00 cl H· o. >->>- S3Í >>:>: >>> -J-J —1 ddd zzz aaa LUU.U. o< 1— ►—1 ►—l 0<5í§ 000 -J-J—J 000 ddd MMH >>>

</)QfU· »*“ —« (/) (/)(/) 000 >>> <>-<

0(/)0

Ix.-J> —10.0. «0«

V1O.

SĽ <o l-<< ΙΛΙΛΙΛ IX. U. U. 000 UJUIUJ OCO ocacec

O.O.O. <<< 000 >>> -JUJ ΖΙΛΙΛ ooo ^ar^

3 z 3

SKS

UJ<LU H < ί</»<</)

000 JJJ >>-> <Λ<ΙΛ h<>>

gge (/)1/)(/)

000

QZQ (Λ(/)Η aaa >>> aaa