JP2001526524A

JP2001526524A - ヒトβ▲下２▼インテグリンαサブユニット

Info

Publication number: JP2001526524A
Application number: JP53033797A
Authority: JP
Inventors: ガラティン，ダブリュ．マイケル; ダーヴィーレン，モニカヴァン
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2001-12-18
Also published as: SK283135B6; CA2218755A1; EP0835301A1; BR9702101A; IL122011A0; FI974018A; HUP9901579A3; AU2133397A; PL187013B1; US5817515A; HU223977B1; SK140997A3; NO974852L; CN1189851A; CA2218755C; HUP9901579A2; CZ328697A3; DE69733051D1; NO318764B1; RU2183671C2

Abstract

(57)【要約】 α_dと命名した、新規ヒトβ₂インテグリンαサブユニットポリペプチドをコードするDNAが、組換え法によるその製造法及び製造のための材料とともに開示される。細胞外α_dタンパク質断片、α_dＩドメイン断片または全長のα_dポリペプチドと、ヒトイムノグロブリン定常領域とを包含する融合タンパク質もまた、開示される。α_dの生物学的活性をモジュレートするのに有用であるものとして、α_dに対して特異的な結合分子もまた開示される。ヒトα_dをコードする配列との相同性を示す、他の種からのDNAも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトβ₂インテグリンαサブユニット本出願は、1994年12月21日に出願され係属中である米国特許出願第08/362,652 号の一部継続出願であり、当該出願は、1994年８月５日に出願され1995年11月28 日に米国特許第5,470,953号として特許付与された、米国特許出願第08/286,889 号の一部継続出願であり、当該出願は、1993年12月23日に出願され1995年8月1日に米国特許第5,437,958号として特許付与された、米国特許出願第08/173,497号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、α_dと命名された新規ヒトβ₂インテグリンαサブユニットをコードするポリペプチドのクローニング及び発現に関し、当該サブユニットは、既知のヒトβ₂インテグリンαサブユニット、CD11a、CD11b及びCD11cに構造的に関連するものである。本発明はまた、ヒトα_dをコードする配列と相同性を示す、他の種から単離されたポリヌクレオチドにも関する。発明の背景インテグリンは、細胞接着に盛んに関与する膜会合分子のクラスの１つである。インテグリンは、βサブユニットと非共有的に会合するαサブユニットを含む膜貫通型のヘテロダイマーである。今日までに少なくとも14のαサブユニット及び８のβサブユニットが同定されている（Springer、Nature 346巻、425〜434頁 (1990)に概説）。βサブユニットは、通常１より多くのαサブユニットと会合することができ、共通のβサブユニットを共有するヘテロダイマーが、インテグリンの集団の中のサブファミリーとして分類されている。ヒトインテグリンの１つのクラスで、発現が白血球細胞に限定されるものは、共通のβ₂サブユニットによりその特徴が表される。この、細胞に特異的な発現の結果、これらインテグリンは一般に、白血球インテグリン、Leu-CAMまたはロイコインテグリンと呼ばれる。共通のβ₂サブユニットのゆえに、それらに代わるこのクラスの呼称は、β₂インテグリンである。β₂サブユニット（CD18）は、３つの異なるαサブユニット、CD11a、CD11bまたはCD11cのうちの１つと会合して以前に単離されている。ヒトCD18をコードするcDNAの単離は、Kishimotoら、C ell、48巻、681〜690頁(1987)に記載されている。公式のＷＨＯ命名法において、それらヘテロダイマータンパク質はCD11a/CD18、CD11b/CD18、及びCD11c/CD18 として言及され、一般の命名法においてはそれらは、各々LFA-1、Mac-1またはMo l、及びP150,95またはLeuM5として言及されている（Cobboldら、Leukocyte Typi ng III、McMichael（出版）、Oxford Press、788頁(1987)に掲載）。ヒトβ₂インテグリンαサブユニットCD11a、CD11b及びCD11cは、還元条件下、電気泳動にてそれぞれおよそ180 kD、155 kD及び150 kDの見かけの分子量に移動することが示され、これらのサブユニットをコードするDNAがクローン化されている（CD11a 、Larsonら、J.Cell Biol．108巻、703〜712頁(1989)；CD11b、Corbiら、J.Biol .Chem．263巻、12403〜12411頁(1988)及びCD11c、Corbiら、EMBO J．6巻、4023 〜4028頁(1987)）。分子量が概ね類似していることにより定義付けられた、ヒト β₂インテグリンα及びβ鎖として椎定される類似体は、サル及び他の霊長類（L etvinら、Blood 61巻、408〜410頁(1983)）、マウス（Sanchez-Madridら、J.Exp .Med．154巻、1517頁(1981)）、ならびにイヌ（Mooreら、Tissue Antigens 36巻、211〜220頁(1990)）を包含する他の種において、様々に同定されている。他の種からの推定される類似体の絶対分子量は、有意に多様性をもつことが示され（例えば、Danilenkoら、Tissue Antigens 40巻、13〜21頁(1992)）、配列情報がないと、ヒトインテグリンサブユニットと他の種において同定されたものとを確定的に関連付けることは可能でない。さらに、タンパク質ファミリーに含まれるメンバーの数の多様性が、異なる種間において観察されてきている。例えば、ヒトよりもウサギにおいて、より多くのIgAアイソタイプが単離されている（Burnetら、EMBO J.8巻、4041〜4047頁(1989)及びSchneidermanら、Proc.Natl. Acad.Sci.(USA)86巻、7561〜7565頁(1989)）ことを一考されたい。同様に、ヒトにおいて、メタロチオネインタンパク質の少なくとも６つの変異体がこれまでに同定されている（Karin及びRichards、Nature 299巻、797〜802頁(1982)及びVar shneyら、Mol.Cell.Biol．6巻、26〜37頁(1986)）が一方、マウスにおいてはこのような変異体は２つしか明らかにされていない（Searleら、Mol.Cell.Biol．4 巻、1221〜1230頁(1984)）。それゆえ、１つの種においてタンパク質ファミリーが複数メンバー存在するからといって、必ずしも他の種に対応するファミリーのメンバーが存在することが含意されるわけではない。 β₂インテグリンにおける特異的な情況の下で、イヌにおいては、ヒトCD18に対応すると推測されるイヌβ₂は４つも潜在的に異なるαサブユニットと、ダイマーを形成することができることが観察されている（Danilenkoら、前出）。イヌの脾細胞を用いてマウスを免疫付与することにより作製した抗体から、ヒトCD 18、CD11a、CD11b及びCD11cとのイヌにおける相同体として、それらと類似するが同じではない分子量に主として基づいて暫定的に称したタンパク質を、免疫沈降せしめるモノクローナル抗体が得られた。別の抗−イヌ脾細胞抗体であるCa11.8H2は、やはりβ₂サブユニットと会合することができるが独自の分子量を有し、分化した組織マクロファージのサブセツトに発現が限定されている、第４のα様イヌサブユニットを認識し、それを免疫沈降せしめた。ネズミ樹状細胞を用いてハムスターを免疫付与することにより作製された抗体では、２つの抗インテグリン抗体が得られた（Metlayら、J.Exp.Med．171巻、17 53〜1771頁(1990)）。抗体の１つである2E6は、150〜160kDの範囲の分子量にマイナーバンドを伴う、おおよその分子量が180kD及び90kDであるサブユニットをもつ、優勢のヘテロダイマーを免疫沈降せしめた。第２の抗体であるN418は、おおよその分子量が150kD及び90kDであるサブユニットをもつ、別の見かけ上のヘテロダイマーを沈殿せしめた。細胞接着阻止実験に基づき、抗体2E6はヒトCD18 のネズミにおける対応物を認識するとの仮説が提唱された。N418抗原の分子量により、ヒトCD11c/CD18のネズミ相同体を認識することが示唆されたが、さらに分析すると、ヒトCD11c/CD18について観察される分布パターンとは矛盾する組織分布パターンを、ネズミ抗原が呈することが示された。イヌCa11.8H2抗体及びネズミN418抗体により認識される抗原は、以前同定されたイヌまたはネズミのαサブユニットの変異種（例えば、グリコシル化またはスプライス変異）を呈する可能性がある。そうでなければ、これら抗原は、独自のイヌ及びネズミインテグリンαサブユニットを呈するのかもしれない。一次構造に関する特定の情報がなければ、前記のうちいずれであるかは、識別不能である。ヒトにおいては、CD11a/CD18はすべての白血球細胞で発現している。CD11b/CD 18及びCD11c/CD18の発現は、本質的に、単球、顆粒球、マクロファージ及びナチュラルキラー（NK）細胞に限定されているが、CD11c/CD18は、あるB-細胞型でも検出される。一般的に、CD11a/CD18はリンパ球に優勢に存在し、CD11b/CD18は顆粒球に、そしてCD11c/CD18はマクロファージに優勢に存在する（Arnaout、Blood 75巻、1037〜1050頁(1990)）。しかしながら、α鎖の発現は、個々の細胞型の活性化及び分化の状態とは無関係に、多様である（Larson及びSpringer、Immuno l.Rev.114巻、181〜217頁(1990)の概説を参照されたい）。ヒトの免疫及び炎症応答におけるβ₂インテグリンの関与は、β₂インテグリンが関わる細胞接着を阻止することができるモノクローナル抗体を用いて立証されている。例えば、CD11a/CD18、CD11b/CD18及びCD11c/CD18は、リンパ腫及び腺癌細胞へのナチュラルキラー（NK）細胞の結合（Patarroyoら、Immunol.Rev．114 巻、67〜108頁(1990)）、顆粒球蓄積（Noursharghら、J.Immunol．142巻、3193 〜3198頁(1989)）、顆粒球非依存性血漿漏出（Arforsら、Blood 69巻、338〜340 頁(1987)）、被刺激白血球の化学走化性応答（Arforsら、前出）及び血管内皮への白血球接着（Priceら、J.Immunol．139巻、4174〜4177頁(1987)及ひSmithら、 J.Clin.Invest．83巻、2008〜2017頁(1989)）に盛んに関与している。免疫及び炎症応答におけるβ₂インテグリンの基本的な役割は、白血球接着不全（LAD）と呼ばれる臨床的症候において顕著ならしめられ、このLADにおいて臨床的に明示されるのは、再発性でありしばしば脅威となる細菌感染である。LADは、β₂サブユニットの外生変異によって惹起こされ（Kishimotoら、Cell 50巻、193〜202頁 (1987)）、疾患状態の重篤さはβ₂サブユニット発現不全の程度に比例するものである。完全なインテグリンヘテロダイマーの形成が、β₂の変異によって損なわれるのである（Kishimotoら、前出）。興味深いことに、CD18に対して特異性を有する少なくとも１つの抗体がヒト１型免疫不全ウイルス（HIV-1）シンチウム形成をin vitroで阻害することが示されているが、とはいえこの阻害の正確な機構は明らかではない（Hildreth及びOr entas、Science 244巻、1075〜1078頁(1989)）。この観察は、CD11a/CD18に主に対応する受容体であるICAM-1が、ライノウイルス(rhinovirus)血清型の主たる群に対する表面受容体でもあるという発見（Greveら、Cell 56巻、839頁(1989)）に符合している。ヒト免疫及び炎症応答におけるβ₂インテグリン結合活性の重要性によって、このクラスの表面タンパク質のより充分な理解を進める必要性が際立ってくる。このサブファミリーの未だ知られていないメンバー、のみならずそれらに対応する受容体を同定すること、及び、モノクローナル抗体またはβ₂インテグリンの生物学的活性を変えることができる他の可溶性因子を作製することにより、β₂ が関係する免疫及び炎症応答において治療的に介入するための実利的な手段が提供されるであろう。発明の要約本発明の１つの特徴において、新規ヒトβ₂インテグリンαサブユニットであるα_d、及びα_d固有の結合及び／または免疫学的特性をもつα_dの変異体（すなわち、欠失、付加または置換による類似体）、をコードする、新規の精製され単離されたポリヌクレオチド（例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方の、DN A及びRNA転写物）が提供される。本発明の好ましいDNA分子には、cDNA、ゲノムD NA及び全体的にまたは部分的に化学合成されたDNA分子が包含される。現在のところ好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：2で示されるポリペプチドをコードする、配列番号：1で示されるDNAである。さらに提供されるのは、α_dをコードする配列を包含する組換えプラスミド及びウイルスDNA構築体（発現構築体）であり、ここでそのα_dをコードする配列は、同種または異種の、１以上の転写調節エレメントに、作動するようにつながれている。本発明によりさらに提供されるのは、ヒトα_dをコードするポリヌクレオチドに相同性を呈する、マウス及びラットの精製され単離されたポリヌクレオチドである。好ましいマウスのポリヌクレオチドは、配列番号：52で示され、好ましいラットのポリヌクレオチドは、配列番号：54で示される。本発明の別の特徴としては、本発明のDNA配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた、α_dポリペプチドまたはその変異体を発現する原核性または真核性宿主細胞が提供される。本発明の宿主細胞は、α_dポリペプチドの大規模な生産に特に有用であり、α_dポリペプチドは宿主細胞それ自体または宿主細胞か生育された培地のいずれかから単離することができる。細胞外膜表面にα_dポリペプチドを発現する宿主細胞は、α_d特異抗体の生産における免疫原としても有用である。好ましくは、α_dを用いてトランスフェクトした宿主細胞は、ヘテロダイマーの表面での発現を許容するために、β₂インテグリンサブユニットを発現するようコトランスフェクトされるであろう。本発明によりさらに提供されるのは、精製され単離されたα_dポリペプチド、その断片及び変異体である。好ましいα_dポリペプチドは、配列番号：2に示すとおりである。本発明の新規α_d産物は、天然のソースからの単離物として得てもよいが、α_d変異産物も同様に、好ましくは本発明の宿主細胞が関与する組換え手法によって生産されるものである。完全にグリコシル化された、部分的にグリコシル化された及び全休的に脱グリコシル化された、α_dポリペプチドのフォームを、組換え生産のために選択される宿主細胞を及び／または単離後の処理を、多様化することによって作製することができる。本発明の変異体α_dポリペプチドは、１以上のアミノ酸が欠失または置換された類似体であって(１)α_d に特異的な１以上の生物学的活性もしくは免疫学的特性を喪失することなく、好ましくは増強しつつ、または(２)特定のリガンド／受容体の結合もしくはシグナリング機能が特異的に損なわれたもの、を包含する類似体である、水溶性及び水不溶性α_dポリペプチドを含んでよい。融合ポリペプチドも提供され、これは、 α_dアミノ酸配列が他のポリペプチドと接近した状態に発現されるものである。このような融合ポリペプチドは野生型のα_dに比較して、その生物学的、生化学的、及び／または免疫学的特性が修飾されたものを保持するかもしれない。マルチマーの形成を容易とする、付加的なアミノ酸（例えばリジンまたはシステイン）残基を包含する類似体ポリペプチドが企図される。本発明により企図されるのはまた、α_dに特異的に結合するポリペプチド及び他の非ペプチド分子である。好ましい結合分子には、抗体（例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体）、対応する受容体（例えば、膜会合性及び可溶性フォーム）ならびに他のリガンド（例えば天然に生じている分子または合成分子）が包含され、これにはα_dモノクローナル抗体及び／または特異的な対応する受容体の存在下で競合的にα_dに結合するものが包含される。結合分子は、α_dポリペプチド分子の精製及びα_dを発現する細胞型の同定に有用である。結合分子はまた、α_dのin vivoでの結合性及び／またはシグナルトランスダクション活性を修飾（すなわち、阻害、ブロックまたは刺激）するためにも有用である。 α_d結合分子を同定するアッセイも提供され、これには固定化リガンド結合アッセイ、溶液結合アッセイ、シンチレーション近接アッセイ(scintillation pro ximity assay)、ジーハイブリッド(di-hybrid)スクリーニングアッセイ、などが包含される。抗体またはα_dの活性を修飾する他の化合物を同定するためのin vitroのアッセイには、例えばα_dまたはα_dが結合する天然のリガンドを固定化し、固定化されていない方の結合パートナーを検出可能なようにラベルし、結合パートナーとともにインキュベートし、そして結合したラベルの量に基づき被検化合物の効果を確定することが包含されるとよく、ここで被検化合物の非存在下で結合したラベルの量に比較して、被検化合物の存在下で結合したラベルが減少していれば、被検薬剤がα_dの結合の阻害剤であることを示唆するものである。 α_dとリガントとの間の相互作用を修飾する化合物を同定するためのいまひとつの型のアッセイには、蛍光剤が被覆（または含浸）された固体支持体にα_dまたはその断片を固定化し、蛍光剤を励起することができる化合物でリガンドをラベルし、モジュレーター化合物であることが椎定される化合物の存在下及び非存在下で固定化したα_dをラベルしたリガンドと接触せしめて蛍光剤による光放射を検出し、モジュレーター化合物の非存在下での蛍光剤による光放射と比較して、蛍光剤による光放射に影響を及ぼす化合物としてモジュレーター化合物を同定することが、包含される。代わりに、このアッセイにおいて、α_dリガンドが固定化され、α_dかラベルされてもよい。本発明によって、α_dとリガンドとの間の相互作用を修飾する化合物を同定するために企図される、さらなる別の方法は、DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体を用いて、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、α_dの一部またはすべてと転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１の融合体をコードする第１のハイブリッドDNA配列を宿主細胞で発現させ、リガンドの一部またはすべてと第１の融合体に組み込まれていない転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとをコードする第２のハイブリッドDNA配列を宿主細胞で発現させ、モジュレーター化合物であることが推定される化合物の存在下及び非存在下に、宿主細胞でのレポーター遺伝子産物の生産を測定することにより特定の宿主細胞におけるα_dへのリガンドの結合を検出することによって、α_dとリガンドとの相互作用に対する、モジュレーター化合物であることが推定される化合物の効果を評価し、そしてモジュレーター化合物の非存在下でのレポーター遺伝子産物の生産に比較して、レポートされた遺伝子産物の生産を変える化合物として、モジュレーター化合物を同定することを包含する。現在のところアッセイでの使用のために好ましいのは、lexAプロモーター、lexA DNA結合ドメイン、GAL4転写活性化ドメイン、lacZレポーター遺伝子、及び酵母宿主細胞である。前記したアッセイの修飾されたバージョンは、α_dに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離するのに用いられえ、これは、DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体を用いて適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、α_dの一部分または全体と、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれか、との第１の融合体をコードする第１のハイブリッドDNA配列を宿主細胞で発現させ、α_d結合タンパク質であると椎定されるタンパク質の一部分または全体と、前記第１の融合体には組み込まれていない転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメイン、との第２の融合体をコードする第２のハイブリッドDNA配列のライブラリーを宿主細胞で発現させ、宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を検出することにより、特定の宿主細胞におけるα_dに対するα_d結合タンパク質の結合を検出し、そしてその特定の宿主細胞からα_d結合タンパク質をコードする第２のハイブリッドD NA配列を単離することによってなされる。 α_dに特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が、本発明により企図される。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生産する技術は、当該技術分野においてよく知られている。ハイブリドーマ細胞系は、精製されたα_d、 α_dの変異体または細胞外膜表面にα_dもしくはその変異体を発現している細胞で動物を免疫付与した後に作製してよい。免疫原細胞型には、in vivoでα_dを発現している細胞、または普通はin vivoではα_dを発現しない、トランスフェクトされた原核細胞系または真核細胞系が包含される。現在のところ好ましい、本発明の抗体は、169A、169B、170D、170F、170E、170X、170H、188A、188B、188C、18 8E、188F、188G、1881、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R、188T、19 5A、195C、195D、195E、195H、197A-1、197A-2、197A-3、197A-4、199A、199H及び199Mと命名されたハイブリドーマによって分泌されるものである。 α_dのDNA及びアミノ酸配列の開示を通じて寄与される情報の価値は、明白である。一連の実験で、開示されたα_dcDNA配列によって、ゲノム配列に対する転写制御エレメントを包含するヒトα_dゲノムDNA配列の単離が可能ならしめられる。α_d対立変異体及び異種のもの（例えば、ラットまたはマウス）のDNAの同定もまた、企図される。適切なストリンジェンシーとした条件下で、プローブとしてα_dcDNA配列のすべてまたは一部分を用い、適切なライブラリーをスクリーニングする、標準DNA/DNAハイブリダイゼーション技術によって、ヒトα_dゲノムDNA及び異種のもののDNAの単離か成し遂げられうる。その代わりとして、既知のcDNA配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、ゲノムα_dDNA配列を増幅し同定するのに用いることができる。α_dポリぺプチド、ならびにその断片及び他の変異体も含めたペプチドをコードする合成DNAは、慣例の合成法により生産されるとよい。本発明のDNA配列情報により、相同組換えまたは「ノックアウト」ストラテジー（例えば、Kapecchi、Science 244巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい）によって、機能を有するα_dポリペプチドを発現しない齧歯類またはα_dポリペプチド変異体を発現する齧歯類の生産開発も可能となる。このような齧歯類は、in vivoにおけるα_d及びα_dモジュレーターの活性を研究するためのモデルとして有用である。本発明のDNA及びアミノ酸配列により、対応する受容体との結合に盛んに関与するα_dエピトープ、のみならず、盛んに関与するというよりもむしろ結合を調節するかもしれないエピトープを分析することが可能ならしめられる。膜を貫通するシグナルトランスダクションに関与するかもしれないエピトープの同定も、本発明により企図されるものである。本発明のDNAは、α_dポリペプチドを発現する細胞型の検出にも、有用である。 α_dDNAを利用してα_dRNAを検出する、標準のDNA/RNAハイブリダイゼーション技術を用いて、ある細胞内の α_d転写の構成的レベルを定量したり、そればかりか、内在性または外来性薬剤に応答した転写レベルの変化もまた、定量しうる。次いで、α_dの転写及び／または翻訳を修飾する薬剤の同定により、潜在性を有する治療的または予防的価値についてそれらを評価することができる。本発明のDNAにより、細胞のRNAに対するα_dDNAのin situハイブリダイゼーションが可能ならしめられ、複雑な細胞集団及び組織内におけるα_d特異的なメッセージの、細胞内での局在性を調べることができる。本発明のDNAは、ヒトα_d配列に相同性を示す非ヒトポリヌクレオチド配列を同定するためにも有用である。非ヒトα_dDNA配列を所有すれば、ヒトの系の動物モデル（例えば、トランスジェニックモデルを含む）を開発することが可能となる。本発明の他の特徴として、α_dに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を免疫組織化学的分析に使用し、組織内の、亜細胞の区画または個々の細胞におけるα_dの局在性が分析できる。このタイプの免疫組織化学的分析は、in situハイブリダイゼーションと併用して、α_dmRNA及びα_d遺伝子のポリペプチド産物の双方の局在性を調べるのに用いられる場合に特に有用である。 α_dを発現する細胞型を同定することによって、治療及び子防用の薬剤の開発のために重要な派生効果がもたらされるかもしれない。α_dに関連する本発明の産物を、マクロファージが疾患の過程における必須の要素であるような疾患の治療に、用いることができると予期される。マクロファージ活性が関わる多くの病理学的状態に対する動物モデルが、従来技術において報告されている。例えば、マウスで、慢性及び急性の両方の炎症部位に対するマクロファージの動員(recru itment)が、Jutilaら、J.Leukocyte Biol．54巻、30〜39頁(1993)に報告されている。ラットにおいては、Adamsら、（Transplantation 53巻、1115〜1119頁(1992)及びTransplantation 56巻、794〜799頁(1993)）が、異所性腹部心臓同種移植片移植(heterotropic abdominal cardiac allograft transplantation)に続く移植動脈硬化症(graft arteriosclerosis)に対するモデルが報告されている。Rosenfie ldら、（Arteriosclerosis ７巻、９〜23頁(1987)及びArteriosclerosis ７巻、 24〜34頁(1987)）は、コレステロール追加食餌を与えて飼育したウサギにおいて誘導した動脈硬化を、記載している。Hanenbergら、(Diabetologia 32巻、126〜 134頁(1989)）は、BBラットにおけるインシュリン依存性糖尿病の自発的な発症を報告している。Yamadaら、（Gastroenterolgy 104巻、759〜771頁(1993)）は、ラットにおける、レンサ球菌のペプチドグリカン−多糖ポリマーの注射に続く、誘導性炎症性腸疾患、慢性肉芽腫症大腸炎を記載している。Cromartieら、（J .Exp.Med．146巻、1585〜1602頁(1977)）及びSchwabら、（Infection and Immun ity 59巻、4436〜4442頁(1991)）は、ラットにレンサ球菌の細胞壁タンパク質を注射すると、周辺の(peripheral)関節の炎症及びそれに続く関節の破壊によりその特徴が表される、関節炎の状態が惹起こされることを報告している。最後に、 Huitingaら、（Eur.J.Immunol．23巻、709〜715頁(1993)）は、ルイス(Lewis)ラットにおける、多発性硬化症に対するモデルである、実験的アレルギー性脳脊髄炎、記載している。これらの各モデルで、α_d抗体、他のα_d結合タンパク質、またはα_dの可溶性フォームが、おそらくはマクロファージ活性を不活化することを通して、その疾患の状態を減衰せしめるのに利用される。これらの及び他の疾患状態の治療用の医薬組成物が、本発明により提供される。医薬組成物は、α_dとそのリガンド（１または複数）との間の相互作用の阻害を目的として設計され、α_dの種々の可溶性及び膜会合性フォーム（α_dポリペプチド全体、またはα_d結合に盛んに関与するその断片を含むものである）、α_d結合タンパク質の可溶性及び膜会合性フォーム（抗体、リガンド、等を包含する）、α_d結合活性の細胞内もしくは細胞外モジュレーター、ならびに／または、転写、翻訳、翻訳後のプロセッシング及び／もしくは細胞内輸送のモジユレーターを包含する、α_d及び／もしくはα_d-リガンドポリペプチド発現のモジュレーター、を包含するものである。本発明はまた、α_d結合、またはα_dを発現する細胞の局所的な蓄積が影響している疾患状態の治療法に関し、この方法において、当該疾患状態に罹患した患者に、α_d結合のレベルをモジュレートする、あるいはα_dを発現する細胞型の蓄積をモジュレートするに足る量の、本発明の医薬組成物が供給される。本発明の治療法は、Ｉ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、喘息、乾癬、肺の炎症、急性呼吸困難症候群及びリウマチ性関節炎などの疾患状態に適用可能であるが、もとよりこれらに限定されることはない。図面の簡単な説明本発明の数多くの他の特徴及び利点は、以下の発明の詳細な説明を考慮の上、図面を参照することにより明らかとなるであろう。ここで、図１Ａから１Ｄは、CD11b（配列番号：３）、CD11c（配列番号：４）及びα_d （配列番号：２）の、ヒトアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。発明の詳細な説明本発明は、ヒト脾臓cDNAライブラリーからα_dをコードするcDNAクローンを単離することに関する、以下の実施例によって示される。さらに詳細には、実施例１には、相同なヒトタンパク質を検出する試みにおける、抗イヌα_TM1抗体の使用を示す。実施例２には、イヌα_TM1遺伝子のPCR増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための、イヌα_TM1の精製及びそのポリペプチドのN-末端配列の決定を詳述する。実施例３には、さらに追加のPCRプライマーを設計するための、内部配列決定用のイヌα_TM1の大規模精製を述べる。実施例４には、イヌ α_TM1遺伝子の断片を増幅するための、PCRと内部配列プライマーの使用を記載する。実施例５には、ヒトα_dをコードするcDNA配列のタローニングを述べる。実施例６には、α_dmRNAの発現に対する、ヒト組織及び細胞のノザンブロットハイブリダイゼーション分析を記載する。実施例７には、ヒトα_d発現プラスミド及び、それにより得られたプラスミドを用いたCOS細胞のトランスフェクションを詳述する。実施例８には、トランスフェクトされたCOS細胞におけるα_d発現のEL ISA分析を述べる。実施例９には、ヒトα_d発現プラスミドを用いてトランスフェクトされたCOS細胞のFACS分析を記載する。実施例10には、コトランスフェクトされたCOS細胞における、α_dに会合したCD18の免疫沈降を述べる。実施例11は、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるα_d発現構築体の安定なトランスフェクションに関する。実施例12には、細胞間接着分子ICAM-R、ICAM-R変異体タンパク質、及び補体因子iC3bに対する、α_dのCD18依存性結合を述べる。実施例13には、α_dリガンド／抗リガンド結合相互作用の阻害剤または増強剤（すなわち、モジュレーター）を同定するためのシンチレーション近接アッセイを記載する。実施例14には、α_dの可溶性フォームをコードする発現プラスミドの構築、及び発現産物の結合分析を述べる。実施例15は、α_d−特異ポリクローナル血清及びモノクローナル抗体の製造に関する。実施例16には、抗α_dポリクローナル血清を用いたα_d組織分布、末梢血白血球でのα_dの発現、ならびに炎症性及び非炎症性滑膜におけるα_d発現の分析を記載する。実施例17には、ヒトα_d遺伝子配列と相同性を示すラットのcDNA配列の単離を記載する。実施例18は、Ｉドメイン／IgG融合タンパク質を包含する、全長のラットα_d発現プラスミド、ラットα_dＩドメイン発現プラスミドの構築、ならびに、全長及びＩドメイン融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の生産に関する。実施例19には、ヒトα_d遺伝子配列と相同性を示すマウスcDNA配列の単離を述べる。実施例20には、配列分析を確認するために用いられる、追加のマウスα_dcDNAクローンの単離を記載する。実施例21は、ヒトα_dのマウス相同体と推定されるものの、組織及び細胞に特異的な発現を調べるための、種々のマウス組織のin situハイブリダイゼーション分析に関するものである。実施例22には、ヒトα_dのマウス相同体と推定されるものをコードする発現構築体の作製を記載する。実施例23には、ヒトα_dのマウス相同体と椎定されるものをコードする遺伝子が崩壊された「ノックアウト」マウスの設計を述べる。実施例24には、ヒトα_dをコードする配列と相同性を示すウサキcDNA クローンの単離を記載する。実施例25には、ヒトの疾患状態の動物モデルであって、治療的な可能性について、α_dのモジュレーションがアッセイされるものを記載する。実施例26は、動物モデルの疾患状態におけるα_dの発現を記載する。実施例１イヌα_TM1のヒト相同体を検出する試みイヌα_TM1のヒト相同体を同定する試みで、イヌα_TM1に特異的なモノクローナル抗体Ca11.8H2（Mooreら、前出）を、ヒト末梢血白血球との交差反応性について調べた。細胞調製物（典型的には、１×10⁶細胞）を、0.1％ナトリウムアザイドの存在下で氷上にて、希釈していないハイブリドーマ上清または精製したマウスIgG陰性コントロール抗体（10μg/ml）とともにインキュベートした。引き続き、６μg/mlでFITC-接合ウマ抗マウスIgG（ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)、Burlingame、カリホルニア州）とともにインキュベートすることにより、モノクローナル抗体の結合性を検出した。染色された細胞は、リン酸緩衝性生理食塩水（PBS）中２％w/vのパラホルムアルデヒドを用いて固定化し、ファクスター・プラス・蛍光活性化細胞ソーター(Facstar Plu s fluorescence-activated cell sorter)（ベクトン・ディッキンソン(Becton D ickinson)、Mountain View、カリホルニア州）で分析した。典型的には、蛍光強度に対する対数的な増幅を用いて、10,000の細胞を分析した。その結果、ヒト末梢血白血球上に発現されている表面タンパク質とCa11.8H2とは交差反応性を示さず、一方、コントロール細胞である、新生物である(neoplas tic)イヌ末梢血リンパ球は、本質的に、α_TM1に対してすべて陽性であった。イヌαサブユニットに対して特異的なモノクローナル抗体であるCa11.8H2はヒト相同体と交差反応しなかったので、もしヒト遺伝子の対応物が存在するのであれば、それを単離するためにイヌα_TM1DNAを単離することが必要不可欠であると認められた。実施例２ N- 末端配列決定用のイヌα_TM1のアフィニティー精製オリゴヌクレオチドプローブ／プライマーの設計用の、N-末端アミノ酸配列を調べるため、イヌα_TM1をアフィニティー精製した。手短に述べると、抗α_TM1モノクローナル抗体Ca11.8H2をアフィゲル(Affigel)10クロマトグラフィー樹脂（バイオラッド(BioRad)、Hercules、カリホルニア州）に付け、次いで特異的な抗体−タンパク質相互作用によりタンパク質を単離した。抗体は、バイオラッドが示すプロトコルに従って、樹脂１ml当たりおよそ５mgの濃度で、樹脂に接合させた。接合反応の後、過剰の抗体を除き、0.1Mのエタノールアミン３倍容量を用いて樹脂をブロックした。次いで、カラム容量の30倍のリン酸緩衝性生理食塩水（ PBS）で樹脂を洗浄した。１頭のイヌの脾臓25グラムを、プロテアーゼインヒビターとともに0.32Mシュクロースを含有する25mMトリス塩酸、pH8.0の緩衝液250mlにホモジナイズした。核及び細胞デブリスは、1000gにて15分間遠心してペレットとした。その上清から、100,000gにて30分間遠心することにより膜をペレットとして得た。その膜ペレットを、200mlの溶解用緩衝液(50mM NaCl、50mMホウ酸塩、pH8.0、２％ NP-40 を含む)に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、不溶性の物質を、100,000gにて60分間遠心することによりペレットとした。15mlのポリプロピレンチューブに、そのようにして透明となった溶解液10mlを、前記のCa11.8H2が接合したアフィゲル10樹脂0.5mlとともに移した。チューブを回転させなから４ ℃にて一晩インキュベートし、引き続き、カラムの50倍容量のD-PBSを用いて樹脂を洗浄した。次に樹脂をミクロ遠心チューブに移し、0.1Mトリス塩酸、pH6.8 、２％SDS、20％グリセロール及び0.002％ブロモフェノールブルーを含有するリームリ（Laemmli）の（非還元）試料用緩衝液１ml中で10分間煮沸させた。遠心により樹脂をペレットとして廃棄し、上清は、1/15容量のβ-メルカプトエタノール（シグマ(Sigma)、St．Louis、ミズーリ州）で処理して７％のポリアクリルアミドケルにて展開した。分離したタンパク質は、イモビロン(Immobilon)PVDF膜（ミリポア(Millipore)、Bedford、マサチューセッツ州）に、以下のようにして転写した。脱イオン化しミリポアフィルターで濾過した水の中で、ゲルを１度洗浄し、10 ％メタノールを含む10mMの3-[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスルホン酸（C APS）転写用緩衝液、pH10.5に15〜45分間平衡化した。イモビロン膜はメタノールで湿潤化し濾過水にてすすぎ、CAPS転写用緩衝液中に15〜30分間平衡化しておいた。最初の転写は、バイオラッド転写装置を用いて70ボルトにて３時間行った。転写後イモビロン膜を取り出し、濾過した0.1％ R250クマシー(Coomassie)染色液中で10分間染色した。膜を50％メタノール／10％酢酸で３回、１回に10分づつ脱色した。脱色の後、膜を濾過水で洗浄し、風乾した。およそ150kD、95kD、50kD及び30kDの、タンパク質のバンドが検出された。50k D及び30kDのバンドは、おそらくは、抗体の混合汚染に起因するものであった。次いで、150kD及び95kD双方について、N-末端配列決定を試みたが、95kDのタンパク質はブロックされており、その配列決定は妨げられた。150kDのタンパク質バンドを膜から切り出し、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)（ Foster City、カリホルニア州)473Aタンパク質シーケンサーを用いて、製造業者の指図に従い直接配列決定を行った。得られたアミノ酸配列を、１文字のアミノ酸表記を用いて配列番号：５に示す。同定した配列は、インテグリンファミリーのαサブユニットに特徴的なFNLD配列（Tamuraら、J.Cell.Biol．111巻、1593〜1604頁(1990)）を包含していた。イヌα_TM1配列を増幅するためのプライマーの設計及びその試み N-末端配列の情報から、ハイブリダイゼーション用に３つのオリゴヌクレオチドプローブを設計した、すなわち、 a)「Tommer,」完全に縮重したオリゴヌクレオチド、 b)「Patmer,」部分的に縮重したオリゴヌクレオチド、及び c)「Guessmer,」哺乳動物のコドン使用に基づいており、縮重していないオリゴヌクレオチドである。これらのプローブはそれそれ、以下の配列番号：６、７及び８に示す。核酸の表記は、これらの表記及び本明細書中の他のすべての核酸配列の表記について、米国特許法施行規則第1.882条に従うものである。配列決定のデータに基けば、λZAP（ストラタジーン(Stratagene)、La Jolla 、カリホルニア州）の中にクローニングしたイヌ脾臓／末梢血マクロファージcD NAライブラリーへの、ある程度低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションにおいてこれらのオリゴヌクレオチドを用いると、関連するクローンは検出されなかった。引き続き、前記のストラタジーンライブラリーの、血小板溶解物から精製したファージライブラリーDNAより、PCRによってイヌα_TM1配列を増幅する試みのため、決定したN-末端配列に基づいて、5'Deg、 5'Spec、3'Deg及び3'Specと称した４つの他のオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ配列番号：９、10、11及び12で示され、ここでDegは縮重を示し、Spec は非縮重を示す）を設計した。 α_TM1オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ、配列番号：13及び14に示す、T3またはT7ベクタープライマーと対をなし、これらはλZAPに見出されるブルースクリプトファージミドにおけるポリリンカー領域の側部(flanking)配列にハイブリダイズする。 PCR増幅は、150ngのライブラリーDNA、１μｇの各プライマー、200μM dNTP（複数）及び2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム(Boehringe r Mannheim)）とともにマグネシウムを含有するTaq緩衝液（ベーリンガーマンハイム、Indianapolis、インディアナ州）中で行い、その産物は、0.25μg/mlのエチジウムブロマイドを含むトリス−アセテート-EDTA（TAE）緩衝液中で１％アガロースゲルでの電気泳動により分離した。DNAは、10X SSPE中で一晩、毛管作用により移動させること(wicking)によってハイボンド(Hybond)（アマーシャム(Amersham)、Arl ington Heights、イリノイ州）膜に転写した。転写後、固定化したDNAを、0.6M NaClを含む0.5M NaOHで変性し、1.0Mトリス塩酸、pH8.0を含む1.5M NaClで中和し、次いで、ストラタリンカー(Stratalinker)（ストラタジーン）交差結合装置を用いてUV交差結合を行う前に、2X SSPEで洗浄した。膜は、プレハイブリダイゼーション用緩衝液(５X SSPE、４Xデンハーツ、0.8％SDS、30％ホルムアミド）中で、振動しながら50℃にて２時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドプローブ5'Deg、5'Spec、3'Deg及び3'Spec（それぞれ、配列番号：９、10、11及び12）を、100〜300μCiのγP³²-dATP及び１〜３ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含むベーリンガーマンハイムキナーゼ用緩衝液を用いて、37℃にて１〜３時間ラベルした。取り込まれなかったラベルは、10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA(TE)緩衝液を用いてセファデックス(Sephadex)G-25 ファイン（ファルマシア(Pharmacia)、Piscataway、ニュージャージー州）クロマトグラフィーで除去して、その流出分(flow-through)を直接、プレハイブリダイゼーション溶液に添加した。膜を、振動しなから42℃にて16時間プローブと接触させ、繰り返し洗浄して、最終的な洗浄の強度は１X SSPE/0.1％ SDSで、50℃ にて15分間とした。次いで、ブロットを、コダックX-Omat ARフィルムに、-80℃ にて１〜４時間露光した。オリゴヌクレオチド5'Deg、5'Spec、3'Deg及び3'Specは、それらをプライマーとして用いて反応を行ったものからのPCR産物のみとハイブリダイズするだけであり、期待したように、それらをプライマーとして用いなかった反応からのPCR 産物とは、ハイブリダイズしなかった。かくして、PCR産物のいずれもがすべての適切なプローブとハイブリダイズしなかったので、PCR産物のどれも、α_TM1 に特異的なものではないと結論付けられた。実施例３内部配列決定のためのイヌα_TM1の大規模なアフィニティー精製プライマー設計のためにさらに追加となるアミノ酸配列を提供するために、内部配列決定用に、イヌα_TM1を精製した。凍結した脾臓の３つの切片（それぞれおよそ50g）、及び、成犬からの２つの脾臓の一部分からとった凍結細胞を、内部配列決定用のタンパク質を作製するために用いた。15グラムの脾臓をウオーリン(Waring)ブレンダーを用いて200〜300mlのホウ酸塩緩衝液中にホモジナイズした。ホモジナイズした材料を、４％のNP-40を含有する１容量の緩衝液で希釈し、次いでその混液を少なくとも１時間穏やかに攪拌した。得られた溶解液を、20 00gにて20分間遠心することにより、大きなデブリスを除いて透明な液とし、その後コーニング(Corning)（コーニング、ニューヨーク州）プレフィルター、またはコーニング0.8ミクロンフィルターのいずれかを通して濾過した。その溶解液は、さらにコーニング0.4ミクロンフィルターシステムを通して濾過することによって、より清澄化した。実施例２に記載した脾臓溶解液及び抗体が接合したアフィゲル10の樹脂を、10 0ml液体中150:1の割合の容量で配合し、振動させながら４℃にて一晩インキュベートした。1000gにて５分間遠心した後、溶解液を取り出し、さらに多くの抗体接合アフィゲル10樹脂と配合して、前記と同様に一晩インキュベートした。次いで、吸収した樹脂部分を合わせて50容量のD-PBS/0.1％ツイーン(Tween)20で洗浄し、その樹脂を50mlのバイオラッドカラムに移した。0.1Mグリシン（pH2.5）を３〜５倍容量用いて、吸着したタンパク質を樹脂から溶出し、およそ900μlの画分を集めて100μlの１ Mトリス緩衝液、pH8.0で中和した。各画分から、一部づつ、15μlの溶液を取り出し、等容量の2Xリームリの試料用緩衝液（1/15容量で、１Mのジチオスレイトール(DTT)を含む）中で煮沸した。これらの試料を８％ノベックス(Novex)(ノベックス、San Diego、カリホルニア州)ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、次いでクマシー染色または、業者が示したプロトコルに基づいてダイイチ(Daiichi )キット（エンプロテック(Enprotech)、Natick、マサチューセッツ州）を用いて銀染色を行った。タンパク質を最も多量に含む画分を集めて、真空下に濃縮した。得られた溶液を還元リームリ試料用緩衝液を用いて50％にまで希釈し、トリス −グリシン／SDS緩衝液中、1.5mlの７％ポリアクリルアミドゲルで展開した。ホーファー(Hoefer)転写装置を用いて実施例２に記載した手法により、ゲルからタンパク質をイモビロン膜に転写した。イヌα_TM1に対応するタンパク質バンドを、10枚のPVDF膜から切り出し、総量およそ47μgのタンパク質を得た。４mlの50％メタノール中で、バンドを５分間脱色し、風乾して１X２mmの小片に切断した。膜の小片を２mlの95％アセトン中に、４℃にて30分間、時折ボルテックスをかけながら浸漬し、その後、風乾した。膜に結合したタンパク質のタンパク分解切断に先立って、３mgの臭化シアン（ CNBr）(ピアス(Pierce)、Rockford、イリノイ州)を1.25mlの70％ギ酸中に溶解しておいた。次にこの溶液をPVDF膜の小片が入ったチューブに添加し、そのチューブを室温にて24時間、暗室内でインキュベートした。上清（S1）を別のチューブに取り出し、膜の小片は、0.25mlの70％ギ酸で洗浄した。この上清（S2）は、取り出してその前の上清（S1）に加えた。このようにして合わせた上清（S1及びS2）に、２mlのミリ(Milli)Q水を添加して、その溶液を凍結乾燥した。PVDF膜の小片は、チッ素下で乾燥して、再度、1.25mlの60％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を用いて42℃にて17時間抽出した。この上清（S3）を取り出し、膜の小片は再度、0.08％TFAを含む1.0mlの80％アセトニトリルを用いて42℃にて１時間抽出した。この上清（S 4）は、この前の上清（S1、S2及びS3）と合わせて、そして真空で乾燥した。乾燥したCNBr断片を、次に、63μlの8M尿素、0.4M NH₄HCO₃に溶解した。５μl の45mMジチオスレイトール（DTT）中でその断片を還元し、引き続き、50℃にて1 5分間インキュベートした。次いでその溶液を室温にまで冷却して、５μlの100m Mヨードアセタミド（シグマ、St.Louis、ミズーリ州）を添加することにより断片をアルキル化した。室温にて15分間インキュベートした後、試料を187μlのミリQ水で最終尿素濃度が2.0Mとなるように希釈した。次いでトリプシン（ワーシントン(Worthington)、Freehold、ニュージャージー州）を、酵素対タンパク質の割合が１：25（重量：重量）となるように添加して、タンパク質を37℃にて24 時間消化した。30μlのTFAを添加することにより、消化を終結させた。タンパク質の断片は、次いで、ウォーターズ(Waters)625LCシステム（ミリポア、Milford、マサチューセッツ州）で、0.05％TFA及びHPLC用の水（緩衝液A）で平衡化した、2.1ｘ250mm、５ミクロンのバイダック(Vydac)C-18カラム（バイダック、Hesperia、カリホルニア州）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HP LC）にて分離した。ペプチドは、0.04％TFA中80％アセトニトリル（緩衝液B）の濃度を増大させて、具体的には、65〜95分について38〜75％の緩衝液B、次いで9 5〜105分について75〜98％の緩衝液Bという濃度勾配にて、溶出した。ペプチドは0.2ml/分の流速にて分画し、210nmで検出した。分画に続いて、アプライドバイオシステムズモデル437Aタンパク質シーケンサーで、製造業者の標準サイクル及び、モデル610Aデータアナリシス(Data Anal ysis)ソフトウェアプログラムバージョン1.2.1を用いて実施した、自動化エドマン分解により、ペプチドのアミノ酸配列を分析した。すべての配列決定用試薬は、アプライドバイオシステムズ社により供給されたものであった。８つの内部断片のうち７つのアミノ酸配列を以下に記すが、ここで「X」は、アミノ酸の同定が定かでなかったことを示す。プライマーの設計得られたうち１つの内部アミノ酸配列（配列番号：22で示される）を、次に配列番号：23で示され、p4(R)と称する、完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに用いた。実施例４イヌα_TM1断片のPCRクローニングイヌα_TM1遺伝子の5'部分を、PCRにより二本鎖イヌ脾臓cDNAから増幅した。Ａ．二本鎖イヌ脾臓cDNAの作製幼若犬の脾臓から採取した１グラムの凍結した材料を、ドライアイス上、液体チッ素中で粉砕し、そして20mlのRNA-スタツト（Stat）60緩衝液（テル−テスト（Tel-Test）B社、Friends-wood、テキサス州）にてホモジナイズした。４mlのクロロホルムを添加し、次いでその溶液を12,000gにて15分間遠心することによって抽出した。次に、ダイナルオリゴdTダイナビーズ(Dynal Oligo dT Dynabead s)（ダイナル、Oslo、ノルウェー）でポリA⁺RNAを選択した。10mlのエタノールを用いて、水層からRNAを沈殿させた。100μｇの総RNAを５つ分合わせて、等容量の2X結合用緩衝液（20mMトリス塩酸、pH7.5、1.0M LiCl、１mM EDTA、0.1％ S DS）で希釈した。次いで、RNAはオリゴdTダイナビーズ（全試料に対し、1.0mlまたは５mg）とともに５分間インキュベートした。製造業者が示したプロトコルに従って、２mM EDTA、pH 7.5を用いてポリA⁺mRNAを溶出する前に、10mMトリス塩酸、pH7.5、0.15M LiCl、１mM EDTA及び0.1％ SDSを含有する緩衝液を用いてビーズを洗浄した。次いで、溶出したポリA⁺mRNA及びベーリンガーマンハイムcDNA シンセシスキットを用い、製造業者が示したプロトコルに従って二本鎖cDNAを作製した。Ｂ．部分的なイヌα_TM1cDNAの単離マグネシウムを含むTaq緩衝液（ベーリンガーマンハイム）中、150ngの二本鎖cDNA、500ngの各プライマー、200μMのdNTP（複数種）及び1.5 ユニットのTaqポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）を用いた、標準PCR反応を、オリゴヌクレオチドプライマー5'Deg（配列番号：９）及びp4(R)（配列番号：23）を使用して行った。その結果得られた産物（最初の反応の１μl）は、産物の収率を高めるために同じプライマーを用いて第２回目のPCRに付した。この産物のバンドを、10mMトリス塩酸、pH ８、１mM EDTA、1.5M NaClを含有する緩衝液中で65℃にて、１％アガロースゲルからシュライヒャー・アンド・シュエル (Schleicher & Schuell)（Keene、ニューハンプシャー州）NA45ペーパーへと溶出し、沈澱させ、TAクローニングキット（インビトロゲン（Invitrogen)）及び製造業者の示したプロトコルを用いて、pCR^tmIIベクター（インビトロケン、San Diego、カリホルニア州）の中へと連結した。連結後の混液を、エレクトロポレーション法によってXL-1ブルー(Blue)バクテリア（ストラタジーン）内に形質転換した。１つのクローンである2.7が、プライマーの設計において利用されなかった、α_TM1ペプチド配列に対応する配列を含有することが確かめられた。非対称PCR反応(McCabe、「Production of Single Stranded DNA by Asymmetri c PCR,」、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Innisら（出版）、Academic Press:New York(1990)、76〜83頁に掲載）において蛍光でラベルしたdNTP（複数種）が組み込まれた、ダイデオキシ・ターミネーター・サイクルシーケンスキット（ABI）を用いて、アプライドバイオシステムズ373A DNAシーケンサー（Foster City、カリホルニア州）で以下のように配列決定を実施した。試料を96℃に４分間保ち、次いで配列決定の工程、すなわち、96℃で15秒間、50℃で１秒間、60℃で４分間、の工程25サイクルに付した。配列決定のデータは、クロマトグラム及びテキストファイルを包含する、コンピューター上のサンプルファイルの中へ自動的に写し取った。クローン2.7の全インサートの配列を、配列番号：24に示す。ストラタジーンライブラリー（実施例２に記載）から全長のイヌα_TM1cDNAを単離する試みは、失敗に終わった。プローブとしてクローン2.7の30％ホルムアミド液を用いた、低いストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションにより、おおよそ１x10⁶のファージプラークがスクリーニングされたが、陽性のクローンは得られなかった。クローン2.7から、または、保存されたαサブユニットアミノ酸モチーフGFFKR（Tamuraら、前出）に基づく縮重オリゴヌクレオチドと対にした、他のペプチド断片からのアミノ酸配列に基づく縮重プライマーから、由来した特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、クローン2.7で表される配列より下流の関連配列を増幅する試みもまた、失敗に終わった。実施例５イヌα_TM1のヒトにおける相同体と椎定されるもののクローニングイヌα_TM1と相同であるヒトにおける配列の単離を試みて、クローン2.7からの、おおよそ１kbのイヌα_TM1断片を、プローブとして用いた。NT2（配列番号：25 で示されるとおり）及びp4(R)（配列番号：23）プライマーを用い、実施例２に記載した条件下で、PCRによりプローブを作製した。クィアゲン(Qiagen)（Chatswort、ジョージア州）クイック・スピン（Quick Spi n）キット及び製造業者が示したプロトコルを用いて、そのPCR産物を精製した。精製されたDNA（200ng）は、ベーリンガーマンハイムのランダム・プライム・ラベリング（Random Prime Labelling）キット及び製造業者が示したプロトコルを用いて200μCiのα³²PdCTPでラベルした。組み込まれなかった同位体は、セファデックスG25（ファイン）重力クロマトグラフイーにて除去した。プローブは、使用前に0.2N NaOHで変性させ、0.4Mトリス塩酸、pH 8.0で中和した。 pCDNA/Amp（インビトロゲン、San Diego、カリホルニア州）内のヒト脾臓cDNA ライブラリーのハイボンドフィルター（アマーシャム）上へのコロニー採取物(l ift)を調製した。実施例２に記載のように最初にフィルターを変性し、中和して、続いて50℃にて穏やかに振盪しながら30％ホルムアミドを含むプレハイブリダイゼーション用溶液（8ml/フィルター）中で、２時間インキュベートした。前記のごとくにラベルしたプローブをこの溶液に添加し、42℃にて14時間フィルターとともにインキュベートした。フィルターは、37℃にて２X SSC/0.1％ SDSで２回、そして50℃にて２X SSC/0.1％ SDSで２回洗浄した。最後の洗浄のストリンジェンシーは、65℃にて１X SSC/0.1％ SDSで２回（１X SSCは、150mM NaCl、15 mMクエン酸ナトリウムpH 7.0である）とした。フィルターを、補力スクリーンとともに６時間、コダックX-Omat ARフィルムに露光した。２重に採取した物で、シグナルを与えるコロニーを、マグネシウムを含むLB培地（LBM）／カルベニシリン(carbenicillin)プレート上に塗沫し、37℃にて一晩インキュベートした。その結果得られた塗沫されたコロニーを、ハイボンドフィルターを用いて採取し、これらのフィルターを前記と同様に処置した。このフィルターを、 50％ホルムアミドハイブリダイゼーション用溶液中で50℃にて３時間、前記と同様にラベルしたクローン2.7からの１kbのプローブとともに、よりストリンジェントな条件下でハイブリダイズした。プローブと反応させたフィルターは、最終的なストリンジェンシーを、65℃にて0.1X SSC/0.1％ SDSとして洗浄し、補力スクリーンとともに-80℃にて2.5時間、コダックX-Omat ARフィルムに露光した。陽性コロニーを同定して、LBM／カルベニシリン培地中で一晩培養した。プロメガ(Promega)ウィザード(Wizard)ミニプレップ(miniprep)キットを用い、製造業者が示したプロトコルに従って培養液からDNAを調製して、得られたDNAを配列決定した。最初のスクリーニングでは18の陽性クローンが得られ、一方、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での第二次スクリーニングでは１つの陽性クローンが得られて、これを19A2と称することとした。そのDNA及び決定したヒトα_dクローン19A2のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１及び２に示す。ヒトα_dcDNA及び予測されたポリペプチドの特性クローン19A2は成熟タンパク質の全コード領域に加えて、5'上流シグナル配列の48塩基（16アミノ酸残基）及びポリアデニル化配列で終結しない3'非翻訳配列の241塩基にわたるものである。成熟タンパク質の中核の分子量は、125kD近辺であると予測される。細胞外ドメインは配列番号：２のアミノ酸残基のおよそ第17 〜1108位にわたることが予測される。この細胞外領域は、ヒトCD11c膜貫通領域と相同である約20アミノ酸の領域（配列番号：２の残基第1109〜1128位）に隣接している。細胞質ドメインは、およそ30のアミノ酸（配列番号：２の約第1129〜 1161位の残基）を含む。このタンパク質はさらに、CD11a、CD11b及びCD11c（Larson及びS pringer、前出）、α_E（Shawら、J.Biol.Chem．269巻、6016〜6025頁(1994)）ならびにVLA-1及びVLA-2（Tamuraら、前出）に共通のＩ（挿入）ドメインに相同であるおよそ202のアミノ酸の領域（第150〜352位の残基の近辺）をも包含する。他のインテグリンにおけるＩドメインがICAM結合に関与することが示されており（Landisら、J.Cell.Biol．120巻、1519〜1527頁(1993)；Diamondら、J.Cell.Bi ol．120巻、1031〜1043頁(1993)）、表面分子のICAMファミリーのメンバーにα_d もまた結合するかもしれないことが示唆される。この領域が他のインテグリンサブユニットのいずれのものかに存在することは、立証されていない。 α_dの決定されたアミノ酸配列は、CD11aのものとはおよそ36％の同一性、CD11 bとはおよそ60％の同一性及びCD11cとはおよそ66％の同一性を示す。図１に、CD 11b（配列番号：３）、CD11c（配列番号：４）及びα_d（配列番号：２）に対するアミノ酸配列のアラインメントを表す。 β₂インテグリンにおけるαサブユニットの細胞質ドメインは、典型的には同種内でも互いに異なるが、一方個々のαサブユニットは種の境界を越えて、高度の相同性を有することが示される。これらの観察に一致して、α_dの細胞質領域は、すべてのαインテグリンの間で保存されていることが示されている、膜に近接したGFFKRアミノ酸配列（Rojianiら、Biocehmistry 30巻、9859〜9866頁(1991 )）を除いて、CD11a、CD11b及びCD11cとは顕著に異なっている。インテグリンの細胞質尾部領域は、「内外」シグナリング及びアビディティー調節に含意されているので（Landisら、前出）、CD11a、CD11b及びCD11cと相互作用する細胞質分子とは異なるものとα_dが相互作用し、その結果、他の β₂インテグリンが関与するシグナリング経路とは異なるシグナリング経路に関与している可能性がある。 α_dの細胞外ドメインは、I-ドメインに隣接して、保存されたDGSGSアミノ酸配列を包含しており、このDGSGS配列はCD11bにおいて、リガンドとの相互作用に必須である金属結合領域である（Michishitaら、Cell 72巻、857〜867頁(1993)）。CD11b及びCD11cにおける３つの付加的な陽イオン結合部位と椎定される部位が、α_dの配列においてクローン19A2（配列番号：１）の第465〜474位、第518〜52 7位及び第592〜600位のアミノ酸で、保存されている。α_dのI-ドメインは、CD11 a、CD11b及びCD11cにおいて対応する領域とそれぞれ36％、62％、及び57％の同一性を有し、そのようにこの領域で比較的配列の相同性が低いことにより、他の既知のβ₂インテグリンと相互作用するタンパク質とは異なる細胞外タンパク質の組とα_dは相互作用するかもしれないことが示唆される。いまひとつ考えられるのは、例えばICAM-1、ICAM-2及び／またはICAM-Rといった既知のβ₂インテグリンのリガンドに対するα_dの親和性が、他のβ₂インテグリン／ICAMの相互作用について示された親和性とは異なるかもしれない（実施例12を参照されたい）。配列を検証するための、さらなるヒトα_dcDNAクローンの単離ヒトα_dをコードするDNA配列を確認するために、３kbよりも長い鎖長のcDNAについてアガロースゲル電気泳動によりサイズを選択した、pcDNA/Amp（実施例５に記載）中のオリゴdt-プライマーをつけたヒト脾臓cDNAライブラリー（インビトロゲン）からのハイブリダイゼーションによって、さらなるヒトcDNAを単離した。ハイブリダイゼーション用のプローブは、下記のごとくα_dの5'領域に由来するものであった。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション後にフィルターを室温にて２X SSC/0.1% S DSで２度、そして42℃にて２X SSC/0.1% SDSで１度洗浄したことを除いては、最初のヒトα_dクローンの単離について前記した条件と同様であった。フィルターは、コダックX-Omat ARフィルムに終夜露光した。 5'α_dハイブリダイゼーションプローブは、以下の条件下で、プライマーCD11c 5'For（配列番号：94）及びCD11c 5'Rev（配列番号：95）を使用して19A2クローンからPCRによって作製した。試料を94℃にて４分間維持し、そしてパーキン −エルマー（Perkin-Elmer）9600サーモサイクラーにおいて、i)94℃、15秒間、 ii)５℃、30秒間、及びiii)72℃、１分間の温度工程のシーケンス30サイクルに供した。増幅産物は、バイオラッド（Hercules、カリフォルニア州）Prep-A-Geneキットを使用し、製造業者の示したプロトコルに従って精製した。得られた5'α_dプローブは、配列番号：１のヌクレオチド1121からヌクレオチド1839までの領域に対応する、およそ720塩基の長さのものであった。精製されたDNA（およそ50ng）は、ベーリンガーマンハイム（Indianapolis、インディアナ州）のランダムプライムラベリングキットを使用し、製造業者の示したプロトコルに従って³²P-dCTP でラベルした。取り込まれなかった同位体は、製造業者の示したプロトコルに従って、セントリプレツプスピンカラム（Centrisep Spin Columns、プリンセトンセパレーションズ（Princeton Separations）、Adelphia、ニュージャージー州）を使用して除去した。ラベルしたプローブは、45％ホルムアミドを含有するプレハイブリダイゼーション溶液中でフィルターに添加し、50℃にて終夜インキュベーションを進行させた。インキュベーションの後、フィルターを前記の通りに洗浄した。二重試験による採取物につき、13のコロニーからシグナルが得られた。陽性のコロニーをマスタープレートから拾い、LBM及びカルベニシリン（100μg/ml）で希釈して、ハイボンド（アマーシャム）フィルター上に様々な希釈率で播種した。二重に準備したフィルターを、第一次のハイブリダイゼーションからのものと同じ溶液を用いてハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに続いて、42℃にて２X SSC/0.1% SDSの最終ストリンジェンシーにてフィルターを洗浄してフィルムに露光した。当初に同定された13の陽性コロニーのうちの10を、第二次スクリーニングにおいて確認した。これらの10のクローンのうち、２つ（A7.Q及びA8.Qと命名した）を配列決定し、ヒトα_dをコードすることが判明した。クローンA7.Qは、5'リーダー、コード領域の一部、及び5'非翻訳配列の追加の60塩基を含む、およそ2.5k bの鎖長であることが見出された。不完全なコード領域は、配列番号：１の第215 2位に対応するヌクレオチドにて異所的にスプライシングされたイントロン領域に起因していることが判明した。クローンA8.Qは、α_dの全コード領域にわたり、そして配列番号：１の第305位に対応する塩基にてイントロン配列を含む、およそ４kbの鎖長であることが判明した。当初に単離されたα_dクローン（配列番号：１）に比較して、A7.Q及びA8.Qの両クローンが、第1495位の塩基に、３塩基のCAGコドンの挿入が生じていることが明らかになったという点で、１つの相違点が観察された。クローンA7.Q及びA8.Qに対する配列は、それぞれ配列番号：96 及び97に示され、クローンA7.Q及びA8.Qに由来する合成ヒト配列ならびに導き出された対応アミノ酸配列は、配列番号：98及び99にそれぞれ示される。実施例６組織におけるヒトα_d発現のノザン分析 α_dの相対的発現レベル及び組織特異性を調べるために、プローブとしてクローン19A2からの断片を用いてノザン分析を実施した。種々のヒト組織または培養細胞系の各々からの、およそ10μgの総RNAを、１μgのエチジウムブロマイド存在下でホルムアミドアガロースゲルに載せた。100Vにて４時間電気泳動した後、 10Ｘ SSC中で一晩、毛管作用により移動させることにより、ニトロセルロース膜（シュライヒャー・アンド・シュエル）にRNAを転写した。膜は、真空下で80℃ にて1.5時間ベーキングした。3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）緩衝液中に50％ホルムアミドを含有するプレハイブリダイゼーション用溶液を、42 ℃にて３時間、膜をブロックするために用いた。クローン19A2の断片は、ベーリンガーマンハイムランダムプライムキットを用い、製造業者の指図に従って、α P³²dCTP及びαP³²dTTPの双方を含めてラベルした。組み込まれなかったラベルは、TE緩衝液中、セファデックスG25カラムで除去した。膜は、プレハイブリダイゼーション用緩衝液１ml当たり1.5ｘ10⁶カウントを用いてプローブと反応させた。次いで、室温にて２X SSC/0.1％ SDS、42℃にて２X SSC/0.1％ SDS、50℃にて２X SSC/0.1％ SDS、50℃にて１X SSC/0.1％ SDS、50℃にて0.5X SSC/0.1％ SDS 及び50℃にて0.1X SSC/0.1％ SDSと、引き続いて洗浄した。その後、ブロット膜を19時間、フィルムに露光した。クローン19A2からのBstXI断片（配列番号：１のヌクレオチド第2011〜3388位に対応する）を用いたハイブリダイゼーションにより、肝臓、胎盤、胸腺、扁桃腺の総RNAにおいて、およそ５kbの範囲に弱いシグナルが現れた。腎臓、脳または心臓の試料中にはシグナルは検出されなかった。エチジウムブロマイド染色によって測定した場合、腎臓のレーンに存在する RNAの量が最少であった。クローン19A2の第２の断片（配列番号：１の第500〜2100位の塩基の範囲にわたる）を用いた場合、２つの異なるサイズのRNA転写物が、ポリA⁺RNA（クロンテック(Clontech)）を用いたヒト多組織ノザン(multi-tissue Nothern)（MTN）ブロットにおいて検出された。脾臓及び骨格筋ではおよそ6.5kbのバンドが観察され、一方肺及び末梢血白血球では4.5kbのバンドが検出された。観察されたサイズの多様性は、組織特異的なポリアデニル化、他のインテグリンファミリーのメンバーとのそのプローブの交差反応性、または異なってスプライシングがなされたmRNAとのハイブリダイゼーションによって惹起こされうるものであろう。配列番号：１で第2000〜3100位のヌクレオチドにわたる、クローン19A2からの第３の断片を用いたノザン分析では、他のクローン19A2の断片を用いた場合の結果に一致する結果が得られた。骨髄性の系統の細胞系からのRNAもまた、配列番号：１の第500〜2100位及び第 2000〜3100位のヌクレオチドに対応する断片を用いてプローブとの反応を行った。前もってPMAで刺激しておいたTHP-1細胞系において、組織でのシグナルよりもわずかに強い強度で、同じサイズの範囲（およそ5.0kb）に拡散したシグナルが得られた。刺激していないHL-60細胞及びDMSOで刺激したHL-60細胞からのRNAは、組織試料と同じ強度でα_dプローブとハイブリダイズしたが、PMA処置によればシグナル強度が高められるようであった。PMA及びDMSOはそれぞれ、単球／マクロファージ及び顆粒球経路へのHL-60細胞の分化を推進するので、この結果により、単球／マクロファージの細胞型においてα_dの発現が増強されることが示される。U937細胞は、α_dメッセージを発現しており、このシグナルはPMAによる刺激で増大しなかった。Mol t、Daudi、H9、JY、またはJurkat細胞においては、バンドは検出されなかった。実施例７ヒトα_d構築体の一過性の発現Ａ．発現構築体の作製ヒトクローン19A2は、開始のメチオニンコドン及びおそらくは5'シクナル配列のいくらかを欠くものである。従って、19A2配列を含み持つヒト発現プラスミドを作製するために、２つの異なるストラテジーを用いた。第１番目には、CD11b またはCD11cのいずれかをコードする遺伝子から由来したシグナルペプチド配列がクローン19A2の中スプライスされた２つのプラスミドが構築され、キメラα_d 配列が作製された。第２番目のアプローチでは、クローン19A2における０位にアデノシン塩基が付加されて開始のメチオニンをコードする、第３のプラスミドが構築された。この３つのプラスミドは、α_d配列の5'部分またはキメラα_d配列をコードする、異なる領域を包含するものであった。α_d領域は、特異的な3'プライマーBamRe v（配列番号：26、下記）及び、３つの5'プライマーのうちの１つを用いてPCRにより増幅した（実施例２の条件を参照されたい）。３つの5'プライマーは、(１) 第１〜６位に、消化を許容する同一の非特異的な塩基、第７〜12位に、EcoRI部位及び第13〜18位に、コンセンサスなコザック(Kozak)配列；(２)CD11b（プライマーER1B）もしくはCD11c（プライマーER1C ）シグナル配列の一部分、またはアデノシン（プライマーER1D）；及び(３)プライマーのアニーリングを許容するための、クローン19A2からの特異的重複5'配列である、追加の15〜17の塩基、を配列中に包含していた。プライマーER1B、ER1C またはER1Dは、それぞれ配列番号：27、28または29で示され、これらの配列において、開始のメチオニンコドンに下線を付し、EcoRI部位に二重下線を付した。得られたPCR産物は、EcoRI及びBamHIで消化した。３つのプラスミドすべてが、α_dクローンの3'端を包含して、共通の第２のα_d 領域（前段落に記載した5'領域から直ちに下流に挿入されるべき領域）を含み持っていた。第２のα_d領域は、クローン19A2のベクター3'ポリリンカー領域のXba I部位へと、625位のヌクレオチドから達しているものであって、クローン19A2を BamHI及びXbaIで消化することにより単離した。３つの連結反応は、ベーリンガーマンハイム連結用緩衝液及びT4リガーゼ（反応当たり１ユニット）を用いて、３つの5'α_dEcoRI/BamHI断片のうちの１つに3' α_dBamHI/XbaI断片を連結して調製した。14℃にて４時間インキュベートした後、EcoRI及びXbaIで消化した適切な量のベタターpcDNA.3（インビトロゲン）を、さらに追加のユニット数のリガーゼとともに各反応液に添加した。さらに14時間、反応を継続させた。その後、反応混液の10分の１を、コンピテントなXL-1ブルー細胞に形質転換した。その結果得られたコロニーを培養し、実施例５に記載したようにDNAを単離した。E coRIで消化すると、その制限酵素部位について陽性である３つのクローンが同定され、かくして製作したシグナル配列が同定された。クローンはpATM.B1（CD11b /α_d、プライマーER1B由来）、pATM.C10（CD11c/α_d、プライマーER1C由来）及びpATM.D12（アデノシン/α_d、プライマーER1d由来）と称することとした。各クローンに適切なシグナル配列が存在することは、核酸配列決定により確認した。Ｂ．COS細胞のトランスフェクション前記したα_dプラスミドからの発現は、個々のプラスミドとCD18発現プラスミドであるpRC.CD18とを用いたCOS細胞のコトランスフェクションによって成し遂げた。陽性のコントロールとして、COS細胞にpRC.CD18とCD11a発現プラスミドであるpDC.CD11Aとを用いたコトランスフェクションも行った。細胞は、トランスフェクションの16時間前に、10cmのコーニング組織培養処理ペトリ皿中、50％の集密度となるよう培養培地（DMEM/10％FBS/ペンストレップ( penstrep)）で継代した。すべての手順においてトリプシンを用いずに、ベルセン(Versene)緩衝液（0.5mM NaEDTAを含むPBS）を用いてプレートから細胞を採集した。トランスフェクションの前に、無血清のDMEMを用いてプレートを１度洗浄した。各プレートの、５mlのトランスフェクション用緩衝液（20μg/ml DEAEデキストラン及び0.5 mMクロロキンを含むDMEM）に、15μgの各プラスミドを添加した。37℃にて1.5時間インキュベートした後、細胞に５mlのDMEM/10％DMSOで１分間ショックを与えた。その後、このDMSO溶液は、10ml/プレートの培養培地、で置き換えた。得られたトランスフェクト体は、実施例８、９、及び10に記載したように、EL ISA、FACS、及び免疫沈降によって分析した。実施例８ COS トランスフェクト体のELISA分析 CD18発現プラスミドであるpRC.CD18とα_dプラスミドとをコトランスフェクトしたCOS細胞が、CD18と会合して細胞表面にα_dを発現しているか否かを調べるために、CD18に対して作製された一次抗体（例えば、ATCC HB203から精製したTS1/ 18）を用いたELISAを実施した。陽性コントロールとしてCD18発現プラスミドとC D11a発現プラスミドであるpDC.CD11Aとをコトランスフェクトした細胞でもELISA を実施した。このコントロールにおける一次抗体は、CD18抗体及び抗−CD11a抗体（例えば、ATCC HB202から精製したTS1/22）を含むものであった。 ELISA用に、各プレートから細胞をベルセン緩衝液を用いて採集して、単一の9 6ウェル平底コーニング培養プレートに移した。分析の前２日間、培養培地中で細胞をインキュベートしておいた。次いでプレートを、150μl/ウェルのD-PBS/0 .5％テリオスト(teleost)皮膚ゼラチン（シグマ）溶液で２度洗浄した。この緩衝液を、現像のあいだを除くすべての工程で用いた。洗浄及びインキュベーションはすべて、室温にて実施した。ウェルは、ゼラチン溶液で１時間ブロックした。一次抗体をゼラチン溶液で10μg/mlに希釈し、その後各ウェルに50μl添加した。各一次抗体に対し、３重に試験するようウェルを準備した。１時間インキュベートした後、プレートを150μl/ウェルのゼラチン溶液で３度洗浄した。1 :3500の希釈率の二次抗休（ヤギ抗−マウスIg/HRP-Fc特異的（ジャクソン(Jacks on)、West Grove、ペンシルベニア州）を50μl/ウェル添加し、そのプレートを１時間インキュベートした。３度洗浄した後、プレートをｏ-フェニルジアミン（OPD）（シグマ）溶液（１mg/mlのOPDを含むクエン酸緩衝液）100μl/ウェルで 20分間現像し、その後15％硫酸を50μl/ウェル添加した。抗−CD18特異抗体を用いたELISA形式でのトランスフェクト体の分析において、CD18をコードするプラスミドのみ用いてトランスフェクトした細胞では、バックグラウンドを越える有意な発現は現れなかった。CD11aとCD18とを含むプラスミドでコトランスフェクトした細胞ではCD18特異抗体を用いて、またはCD11aに特異的な試薬を用いて分析した場合に、バツクグラウンドを上回る発現の増大が示された。CD18をコードするプラスミドとα_d発現構築体のうちの１つ（pATM.C1 0またはpATM.D12）とでコトランスフェクトした細胞をさらに分析すると、CD18 の細胞表面での発現かα_dを付随して発現させることにより助けられることが明らかとなった。pATM.C10またはpATM.D12を用いてトランスフェクトしたCOS細胞における検出可能なCD18発現の増大は、CD11a/CD18をコトランスフェクトした陽性のコントロール細胞において観察された場合と同等であった。実施例９ COS トランスフェクト体のFACS分析 FACS分析用に、トランスフェクションの日より後、ペトリ皿内の細胞に新鮮な培養培地を与えて、アッセイの前に２日間、インキュベートさせておいた。３ml のベルセン緩衝液を用いて、プレートからトランスフェクトした細胞を採集して、５mlのFACS用緩衝液（DMEM /0.2％ FBS/0.2％ナトリウムアザイド）を用いて１度洗浄し、0.1mlのFACS用緩衝液中に、１試料当たり500,000細胞となるよう希釈した。１mg/mlのFITC接合CD 18、CD11a、もしくはCD11b特異抗体（ベクトン・ディッキンソン）のいずれか、または、800μg/mlのCFSE接合ネズミ23F2G（抗−CD18）（ATCC HB11081）を10μ l、各試料に添加した。次いで、試料を氷上で45分間インキュベートし、５mlのF ACS用緩衝液で３度洗浄し、そして0.2mlのFACS用緩衝液に再懸濁した。試料を、ベクトン・ディッキンソンFACscanで処理し、次いでリシス（Lysis）IIソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン）を用いてそのデータを分析した。 CD18配列のみでトランスフェクトしたCOS細胞に限り、CD18、CD11aまたはCD11 bに対する染色かなされなかった。CD11a/CD18でコトランスフェクトした場合、C D11aまたはCD18に対する抗体を用いると細胞の約15％が染色された。CD18とα_d 構築体のいずれかとでトランスフェクトしたすべての細胞において、CD11a及びC D11bに対する染色は検出されない結果となった。pATM.B1、pATM.C10及びpATM.D1 2群は、それぞれ、CD18に対して４％、13％及び８％陽性に染色された。CD11a/C D18群における陽性の集団の蛍光は、バックグラウンドよりも４倍高かった。これに比して、CD18構築体を用いたα_d構築体とのコトランスフェクションでは、バックグラウンドを上回って、蛍光強度で４〜７倍の増大が示された。実施例10 コトランスフェクトされたCOS細胞からの、ヒトα_d/CD18複合体のビオチンラベル免疫沈降 α_dがインテグリンに特徴的なαβヘテロダイマー複合体の一部として単離されうるのか否かを確かめることを目的として、実施例７に個々に記載した、CD18 発現プラスミドとα_d発現プラスミドのいずれかのものとでコトランスフェクトした細胞についての免疫沈降を試みた。トランスフェクトした細胞（１〜３ｘ10⁸細胞／群）を、ベルセン緩衝液を用いてペトリ皿から採集し、そして50ml／群のD-PBSで３回洗浄した。各試料は、２mgのスルホ-NHS-ビオチン(Sulpho-NHS Biotin)（ピアス、Rockford、イリノイ州）で、室温にて15分間ラベルした。反応は50ml／試料の冷D-PBSで３回洗浄することにより、終了させた。洗浄した細胞を１mlの溶解用緩衝液（１％ NP40、5 0mMトリス塩酸、pH8.0、0.2M NaCl、２mM Ca⁺⁺、２mM Mg⁺⁺、及びプロテアーゼインヒビター）に再懸濁し、氷上で15分間インキュベートした。10,000gで５分間遠心することによって、不溶性物質をペレットとし、その上清を新しいチューブに取り出した。マウスイムノグロブリンと非特異的な反応性を有する物質を除去するために、前処置(pre-clearance)の工程を最初に実施した。25μgのマウスイムノグロブリン（カッペル(Cappel)、West Chester、ペンシルベニア州）を４ ℃にて上清とともにインキュベートした。2.5時間後に、100μl（25μg）のウサギ抗−マウスIg接合セファロース（プロテインAセファロース4B及びウサギ抗− マウスIgG、いずれもザイメッド(Zymed)、San Francisco、カリホルニア州）を各試料に添加して、インキュベーションを16時間、振動しながら４℃にて継続した。セファロースビーズは、遠心によって上清から除去した。前処置の後に、次いで上清を、20μgの抗−CD18抗体（TS1.18）で４℃にて２時間処理した。抗体／抗原複合体は、100μl/試料の前記ウサギ抗−マウス／プロテインA-セファロース調製物とインキュベートすることにより、上清から単離した。ビーズを、10mM HEPES、0.2M NaCl、及び１％トライトン（Triton）X-100で４回洗浄した。洗浄したビーズをペレットとし、次いで２％のβ-メルカプトエタノールを含む２X リームリ試料用緩衝液20μl中で10分間煮沸した。試料を遠心し、前もって100Vで30分間電流を流しておいたノベックスポリアクリルアミドゲル（ノベックス）で展開した。タンパク質を、200mAmpで１時間、TBS-T緩衝液中でニトロセルロース膜（シュライヒャー・アンド・シュエル）に転写した。膜は、３％ BSA を含むTBS-Tで２時間ブロックした。膜をストレプ-アビジン(Strep-avidin)ホースラディッシュペルオキシダーゼ（POD）（ベーリンガーマンハイム）の1:6000 の希釈液で１時間処理し、その後TBS-Tで３回洗浄した。次いで、ブロットを現像するために、アマーシャムエンハンスドケミルミネセン(Enhanced Chemi-lumi nescene)キットを製造業者の指図に従って用いた。膜は、ハイパーフィルム(Hyp erfilm)MP（アマーシャム）に、0.5〜２分間、露光した。 pRC.CD18及び、pATM.B1、pATM.C10またはpATM.D12のいずれかでトランスフェクトした細胞からのCD18複合体の免疫沈降により、予測されるCD18のサイズに一致するおよそ100kDのβ鎖、及びα_dに対応するおよそ150kDのα鎖から成るヘテロダイマーの種が表面に発現していることが明らかとなった。実施例11 チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるヒトα_dの安定なトランスフェクション α_dが、CD18と会合して細胞表面にヘテロダイマーとして発現されているか否かを確かめるため、各鎖をコードするcDNAを、 α_d及びCD18の双方を欠く細胞系へと、一過性に及び安定にトランスフェクトした。これらの実験のために、α_dcDNAは、実施例７に記載のように追加のリーダー配列及びコザックのコンセンサス配列を付け加えて、そして発現ベクターpcDNA3 にサブクローニングした。pATM.D12と称することとした最終的な構築体は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）-チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞へと、ヒトCD18をコードする修飾された市販のベクターであるpDC1.CD18とともにコトランスフェクトした。プラスミドpDC1.CD18はDHFR⁺マーカーをコードしており、適切なヌクレオシド欠損培地を用いてトランスフェクト体を選択することができる。pDC1.CD18に施した修飾は以下の通りである。プラスミドpRC/CMV（インビトロゲン）は、サイトメガロウイルスプロモーター及びアンピシリン抵抗性マーカー遺伝子を含む哺乳動物の発現ベクターである。プラスミドpSC1190-DHFRからのDHFR遺伝子を、pRC/CMV5'に複製のSV40起点で挿入した。加えて、プラスミドpHF2G-DHFの5'領域からのポリリンカーを、pRC/C MV/DHFR構築体のDHFR遺伝子より3'側に連結した。続いてCD18をコードする配列を、得られたプラスミドの5'側部ポリリンカー領域とウシ成長ホルモンのポリＡコード領域との間にクローニングした。 CD18の表面での発現を、モノクローナル抗体TS1/18を用いてフローサイトメトリーにより分析した。この細胞系での、α_dとCD18との間に検出されるヘテロダイマー形成は、COS細胞における一過性の発現の場合について実施例10に記載した、免疫沈降の結果に一致していた。実施例12 CD18 依存性の様式で、ヒトα_dはICAM-Rに結合する白血球インテグリンと、細胞と細胞との接触を媒介する細胞間接着分子（ICAM ）との間の相互作用を証明する報告（Hynes、Cell 69巻、11〜25頁(1992)）に鑑みて、α_d/CD18を発現しているCHO細胞がICAM-1、ICAM-R、またはVCAM-1に結合する能力を２つの方法により評価した。繰り返しのアッセイにおいて、可溶性のICAM-1、ICAM-R、またはVCAM-1 IgG1 融合タンパク質がプラスチック上に固定化され、そしてα_d/CD18 CHOトランスフェクト細胞がその固定化されたリガンドに結合する能力を調べた。トランスフェクトされた細胞は、カルセインで内部ラベルし、結合用緩衝液（１％ BSAを含む RPMI）で洗浄して、緩衝液（10ng/ml PMA添加もしくは非添加）のみ、または10 μg/mlで抗−CD18モノクローナル抗体を加えた緩衝液のいずれかの中で、インキュベートした。可溶性のICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1、もしくはVCAM-1/IgG1融合タンパク質、または陰性コントロールとしてウシ血清アルブミン（BSA）で予め被覆しておいた96ウェルのイムノロン(Immuno-lon)4ミクロタイタープレートに、トランスフェクトされた細胞を加えた。これらの接着分子の可溶性フォームの設計は、1993年8月5出願の、同時係属であって共有である、米国特許出願第08/1 02,852号明細書に記載され、充分に開示されている。ラベルした細胞の添加に先立って、ウェルは１％ BSAを含むPBSでブロックしておいた。0.1％ BSAを含むPB S中に20分間浸漬することによりプレートを洗浄した後、サイトフロー(Cytofluo r)2300（ミリポア、Milford、マサチューセッツ州）を用いて、各ウェルに残留する総蛍光量を測定した。固定化したICAMを用いた実験において、α_d/CD18コトランスフェクト体のICAM -R/IgG1ウェルへの結合は、BSAを被覆したウェルの場合を上回り、一貫して３〜５倍高いことが示された。この結合の特異性及びCD18への依存性を、抗−CD18抗休であるTS1/18の阻害効果によって証明した。CD11a/CD18でトランスフェクトした細胞の、ICAM-1/IgG1ウェルへの結合はBSA が被覆されたウェルを用いて観察された結合と同等のものであった。CD11a/CD18 がトランスフェクトされた細胞は、PMAで全処理した後に限ってICAM-1/IgG1への結合が2〜3倍高まることが示された。α_d/CD18トランスフェクト体のPMA処理は、ICAM-1/IgG1またはICAM-R/IgG1のウェルへの結合に影響を及ぼさなかった。VC AM-1/IgG1ウェルへのα_d/CD18トランスフェクト体の結合は、検出不能であった。可溶性ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1、またはVCAM-R/IgG1融合タンパク質への、 α_d/CD18がトランスフェクトされた細胞の結合をフローサイトメトリーによって判定した。１回の計測当たり、およそ100万個のα_d/CD18をトランスフェクトしたCHO細胞（より高発現とするために攪拌(spinner)フラスコで生育した）を、10 μg/mlの抗−CD18抗体を添加または非添加の結合用緩衝液（RPMI及び１％ BSA） 100μl中に懸濁した。室温にて20分インキュベートした後、細胞を結合用緩衝液で洗浄し、そして可溶性ICAM-1/IgG1またはICAM-R/IgG1融合タンパク質を最終濃度が５μg/mlとなるように添加した。37℃にて30分間で結合を進行せしめ、その後、細胞を３回洗浄して、1:100の希釈率でFITC接合ヒツジ抗−ヒトIgG1を含有する100μlの結合用緩衝液中に再懸濁した。30分インキュベートした後、試料を３回洗浄し、ベクトン・ディッキンソンFACScanを用いた分析のために、200μl の結合用緩衝液に懸濁した。 α_d/CD18トランスフェクト体のおよそ40〜50％が、ICAM-R/IgG1に対する結合性を示したが、ICAM-1/IgG1またはVCAM-1/ IgG1タンパク質に対する結合性は示さなかった。トランスフェクトされた細胞を PMAて前処理しても、ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1またはVCAM-1/IgG1に対するα_d/ CD18の結合はなんら影響を受けず、これは固定化接着アッセイでの結果に一致していた。ICAM-Rによる結合は、α_d/CD18トランスフェクト体を抗−CD18抗体であるTS1/18で処理した後には、バックグラウンドのレベルにまで下がっていた。これらの２つの結合アッセイからのデータをまとめると、α_d/CD18はICAM-Rに結合し、ICAM-1及びVCAM-1に比して優先的に結合するものであることが示される。ICAM-1よりも優先的にICAM-Rに対してα_d/CD18が結合することは、CD11a/CD18 及びCD11b/CD18で観察される結合の優先性とは逆である。このようなα_d/CD18の結合性におけるモジュレーションから、ICAM-Rが顕著なる役割を演じる、正常及び病理学的な免疫機能に選択的に影響を及ぼすことが予測されうる。さらに、IC AM-Rの種々の細胞外ドメインに対し免疫的特異性を有する抗体を、α_d/CD18トランスフェクト体へのICAM-Rの結合を阻害する能力について試験した、前記のアッセイと類似したアッセイを行った結果、α_d/CD18及びCD11a/CD18はICAM-Rの異なるドメインと相互作用することが示唆された。溶液中でICAM-1/IgG1またはICAM-R/IgG1がCD11a/CD18に結合しないことは、CD 11a/CD18とICAM-1またはICAM-Rとの間の結合の親和性が低すぎて、溶液中で結合を許容しえないことを示唆する。しかしながら、α_d/CD18のICAM-R/IgG1に対する結合性は、異常なほど高い結合親和性を示すものである。前記のFACS接着アッセイを、α_d/CD18を発現しているCHO細胞へのICAM-R変異体E37A/Igの結合を調べるために使用した。E37A/Igは、LFA-1/Igキメラへの結合を回避することが示されている（Sadhuら、Cell Adhesion and Communication、２巻、429〜440頁(1994)）。変異体タンパク質は、安定に形質転換されたCHO細胞系から可溶性型にて発現され、そしてSadhuら、前出に記載のごとくプロセップ（Prosep）Aカラムで精製された。 α_d/CD18トランスフェクト体とのE37A/Igの結合は、繰り返し行ったアッセイで検出されることはなかった。FITCが接合された抗ヒト抗体によって検出された E37A/Igキメラの平均螢光強度（MFI）は、抗体のみを検出した場合のMFIと同じであり、アッセイにE37A/Ig変異体タンパク質を使用しても、バックグラウンドを越える検出可能なシグナルは認められないことが示唆された。同様に、実施例 14に記載の通りに行ったELISAにて、E37A/Ig変異体は固定化したα_d/CD18には結合しないようであった。iC3b へのα_dの結合補体成分C3は、タンパク質分解性切断を受けて複合体iC3bを形成し、このiC3b が補体活性化の副経路を開始せしめて、最終的には細胞により媒介される標的の破壊に至る。CD11b及びCD11cの双方ともで、iC3bへの結合性とそれに続く、iC3b が被覆された粒子の貧食が示されている。近年、CD11bのIドメィンの中のペプチド断片が、iC3bとの相互作用の部位として同定されている（Uedaら、Proc.Natl. Acad.Sci.(USA)91巻、10680〜10684頁(1994)）。iC3bの結合領域は、CD11b、CD1 1c、及びα_dで高く保存され、α_d/iC3b結合における両者の相互作用が示される。ロゼットアッセイ（Danaら、J.Clin.Invest．73巻、153〜159頁(1984)）において、トランスフェクト体、または、生来α_dを発現している細胞系（例えば、P MAで刺激したHL60細胞）と、iC3bを被覆したヒツジ赤血球細胞（sRBC）を用いて、α_dの iC3bに対する結合を実施する。α_d/CD18 CHOトランスフェクト休、VLA4-CHOトランスフェクト体（陰性コントロール）及びPMAで刺激したHL60細胞（陽性コントロール）がロゼットを形成する能力を、抗−CD18モノクローナル抗体（例えば、 TS1/18.1）の存在下及び非存在下で比較する。実施例13 シンチレーション近接アッセイによるスクリーニング本発明のα_dリガンドとそれらの結合パートナー（α_dリガンド／抗リガンドの対）との間の結合の特異的な阻害剤が、米国特許第4,271,139号明細書、ならびに、Hart及びGreenwald、J.Nuc.Med．20巻、1062〜1065頁(1979)（これらの文献はいずれも、参照することにより本明細書に組み込むものとする）に一般的に記載されるシンチレーション近接アッセイ技術などの種々の手段によって調べられうる。要約すると、直接的または間接的に、α_dリガンド／抗−リガンドの対の１つのメンバーが、固体支持体に結合される。間接的な捕捉には、モノクローナル抗体が関与することが考えられ、当該モノクローナル抗体は支持体に直接結合され、これが可溶性インテグリンβ鎖タンパク質のＣ末端で特異的なエピトープを認識する。このエピトープは、ヘマグルチニンタンパク質またはミコバクテリアの IIIE9エピトープのいずれかであってよい（Andersonら、J.Immunol.141巻、607 〜613頁(1988)）。蛍光剤も、その支持体に結合せしめられる。その代わりに、米国特許第4,568,649号明細書（参照することにより本明細書に組み込むものとする）に記載のように、個体支持体の中に蛍光剤を含浸してもよい。α_dリガンド／抗−リガンドの対の、支持体に結合させなかった方のメンバーは、蛍光剤を励起することができる、発光を放出する放射活性を有する化合物でラベルされる。リガンドが放射ラベルされた抗−リガンドに結合すると、ラベルは、支持体が結合した蛍光剤に充分に近接することとなり、蛍光剤を励起して光の放射を惹起こす。結合しない場合には、通常、蛍光剤を励起するには固体支持体からラベルが隔たりすぎており、光の放射は低い。放射された光が測定され、リガンドと抗−リガンドとの間の結合に相関づけられる。試料に結合阻害剤を添加すると、固体支持体の近傍に放射活性ラベルを捕捉させないようにすることにより、蛍光の放射が減じられるであろう。従って、結合阻害剤は、試料からの蛍光の放射に対する効果によって同定されうる。可能性のある、α_dに対する抗−リガンドもまた、同様の手段によって同定されうる。可溶性組換えα_d/CD18ロイシンジッパー構築体（実施例14を参照のこと）が、以下の方法によってCAM結合のモジュレーターをスクリーニングするシンチレーション近接アッセイにおいて使用される。発光体（scintillant）が埋設されたプレートに予め被覆された、非ブロッキング抗α−サブユニットまたは抗β−サブユニット抗体で、組換えインテグリンを固定化する。化学ライブラリー化合物及び特異的ビオチン化CAM/Igキメラを、同時にプレートに添加する。CAM/Igキメラの結合は、ラベルされたストレプトアビジンによって検出する。アッセイにおいて、ICAM-1/Ig及びICAM-3/Igは、製造業者が示したプロトコルに従つてNHS-スルフォ-ビオチン LC（長鎖、ピアス）を用いてビオチン化される。ラベルされたタンパク質は、CAM特異抗体に対してなおも反応性を有しており、固定化されたL FA-1と反応することをELISAによって示すことができ、このELISAでは、ストレプトアビジン-HRPと、次いでOPDで発色することで検出される。あるいは、組換えロイシンジッパータンパク質を精製、または部分精製し、発光体が埋設されたプレートに直接被覆される。ラベルされていないCAM/Igキメラ及び化学ライブラリー化合物を同時に添加する。結合したCAM/ Igは、¹²⁵Iでラベルされた抗ヒトIgで検出される。さらに別の態様としては、精製されたCAM/Igタンパク質が、発光体プレートに固定化される。化学ライブラリー化合物及び組換えロイシンジッパーインテグリンを発現する細胞からの上清濃縮物をプレートに添加する。組換えインテグリンの結合を、ラベルされた、非ブロッキングαまたはβサブユニット抗体で検出する。実施例14 可溶性ヒトα_d発現構築体全長の、可溶性ヒトα_d/CD18ヘテロダイマータンパク質の発現により、免疫付与及び結合アッセイのための精製された材料か容易に提供される。可溶性タンパク質を作製することの利点は、細胞溶解物から（全長の膜結合性のα_d/CD18においてのごとくに）でなく上清からそのタンパク質を精製することができ、従って、回収率は向上し、さらに不純物が減じられることである。可溶性α_dの発現プラスミドは、以下のように構築した。プラスミドpATM.D12 にクローニングした、配列番号：１の０〜3161の塩基の領域に対応するヌクレオチド断片を、HindIII及びAatIIで消化することにより単離した。HindIII/AatII 断片と重複し、3'末端に追加のMluI制限酵素部位を含む、配列番号：１の3130〜 3390の塩基に対応するPCR断片を、それぞれ配列番号：30及び31で示されるプライマーsHAD.5及びsHAD.3を用いてpATM.D12から増幅した。 PCR増幅による産物をAatII及びMluIで消化し、そしてHindIII/AatII断片に連結した。得られた産物を、HindIII/MluIで消化したプラスミドpDC1.sの中に連結した。この構築体は、安定にトランスフェクトされたCHO細胞内で可溶性CD18とともに共発現され、そしてその発現は、³⁵S-メチオニンでラベルした細胞由来の、免疫沈降したCD18複合体のオートラジオグラフィーによる目視化によって検出される。構築体はまた、293細胞内でCD18とともに共発現される（Bermanら、J.Cell. Biochem．52巻、183〜195頁(1993)）。全長の可溶性α_d構築体本発明によって、別のα_d発現構築体も企図される。完全型のα_d/CD18ヘテロダイマーの発現及び精製を容易ならしめるために、精製の際にヘテロダイマーを安定化するはずの「ロイシンジッパー」融合配列を含むように（Changら、Proc. Natl.Acad.Sci.(USA)91巻、11408〜11412頁(1994)）可溶性α_d及びCD18発現プラスミドを構築する。要約すると、ジッパーの酸性及び塩基性アミノ酸ストランドをコードするDNAを、Changらの文献に記載されたオリゴヌクレオチドを使用して、プライマーアニーリングによって作製する。そのDNA配列は、これまでに報告されたα_dまたはCD18発現構築体へのサブクローニングを容易ならしめるために、DNAのそれぞれ5'及び3'端に追加のMluI及びXbaI制限酵素部位を含むように、さらに修飾されている。加えて、ヘマグルチニンタンパク質またはポリヒスチジン配列のいずれかを表す配列が加えられ、さらにXbaI部位の後に終止コドンも挿入されている。ヘマグルチニンまたはポリヒスチジン配列は、発現されたタンパク質のアフィニティー精製を容易にするために組み込まれるものである。ジッパーの塩基性ストランドをコードする配列は、CD18を発現するプラスミドベタター上に組み込まれ、酸性ストランドは、α鎖構築体上に挿入される。宿主細胞における、修飾されたα_d及びCD18タンパク質の発現に際し、ジッパー構造の酸性及び塩基性ストランドの間の相互作用がヘテロダイマーを安定化させ、そして完全型のα_d/CD18分子を前記のごとくアフィニティー精製によって単離することが許容されるであろうと推定される。酸性及び塩基性「ロイシンジッパー」配列と共に可溶性α_d及びCD18を発現するためのプラスミドを構築し、実施例７にて記載したDEAE／デキストラン法によってCOS細胞にトランスフェクトした。得られたタンパク質は、α_d/CD18LZと称した。ヘマグルチニン及びポリヒスチジンのタグは、α_d/CD18LZへは組み込まなかった。トランスフェクトされた細胞は、血清を減じた（２％）条件にて14日間生育した。トランスフェクトされた細胞から５日毎に採集した上清を、実施例８に記載した通りにELISAによってタンパク質の生産につきアッセイした。手短に説明すると、α_d/CD18LZヘテロダイマーを、抗α_dモノクローナル抗体169Bで被覆したプレートに固定化した（実施例15参照）。α_d/CD18LZ複合体は、ビオチン化した抗CD18モノクローナル抗体、TS1/18.1の添加（実施例８参照）、次いでストレプトアビジン／セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）接合物とo-フェニルジアミン（OPD）の添加によって検出した。タンパク質は上清中に明瞭に検出された。全長の可溶性α_d発現産物を使用した結合アッセイ前記の、全長の可溶性α_d/CD18LZヘテロダイマーを使用した機能性結合アッセイを、モノクローナル抗体169Bまたは非ブロッキング抗CD18モノクローナル抗体で被覆したプレート上にヘテロダイマーを固定化することによって実施した（実施例15参照）。ウェルは、10μg/mlの開始濃度にて、CAM/Igキメラ（実施例12参照）を添加する前に、非特異的結合を防止するためにサカナ皮膚ゼラチンでブロッキングした。α_d/CD18へのキメラの結合は、ヤギ抗ヒトIg HRP接合物（ジャクソン・ラボラトリーズ）を用い、次いでOPDで発色させて検出した。 VCAM-1/Igは、捕捉されたCD11a/CD18よりも3〜5倍高いレベルで、捕捉された α_d/CD18LZに結合することが観察された。ICAM-1/Ig及びICAM-2/Igは、バックグラウンドよりも、それぞれおよそ15及び10倍上回る程度に、可溶性CD11a/CD18ヘテロダイマーに結合したが、α_d/CD18には結合しなかった。VCAM-1結合は、VCAM -1特異抗体130K及び130Pを組み合わせて用いて存在させた場合に、およそ50％低減された。結合アッセイは、96ウェルプレート上に固定化したICAM/Igタンパク質を用い、その後細胞上清中の組換え可溶性インテグリン添加したものについても実施した。可溶性インテグリンの結合は、ラベルしていない非ブロッキングαまたはβ サブユニット特異的ネズミ抗体を用い、その後HRPを接合したヤギ抗マウス抗体とインキュベートし、OPDで発色させて検出した。その結果、非ブロッキング抗体によって、抗体を含んでいないコントロールのウェルにおいて検出される結合より10倍高い、ICAM-R/Igに対するα_d/CD18LZ結合が検出されることが示された。可溶性α_d/CD18結合は、固定化ICAM-1/Igでは検出されなかったが、α_d/CD18と固定化CD11b/CD18及びCD11a/CD18との間の結合は、バックグラウンドよりもそれぞれ15及び５倍検出された。以前の研究によって、CD11b及びCD11がリポ多糖（LPS）に結合することが証明されており（Wright、Curr.Opin.Immunol．３巻、83〜90頁(1991)；Ingalls及び Golenbock、J.Exp.Med．181巻、1473〜1479頁(1995)）、α_d/CD18へのLPS結合も、フローサイトメトリー及びプレートに基づくアッセイを使用して評価した。その結果から、S.Minnesota及びS.typhosa（双方ともシグマ社より入手）から単離された、FITCラベルされたLPSが、20μg/mlにて、α_d/CD18がトランスフェクトされたCHO細胞に弱く結合できることが示された。トランスフェクトされていないコントロールのCHO細胞を用いると、結合は観察されなかった。ELISA形式のアッセイにおいて、ビオチン化されたLPS（Lukら、Alan.Biochem．232巻、217〜22 4頁(1995)）は、0.5〜3.0μgにて、固定化されたα_d/CD18LZに結合し、そのシグナルは、捕捉抗体及びブロッキング剤のみの場合より４倍強かった。CD11a/CD18 へのLPSの見かけの結合は、各実験値から抗CD11a抗体TS2/4へのバックグラウンド結合を引くことによって斟酌した。 α_d/CD18に対する他のリガンドを同定するために、組換えα_d/CD18LZタンパク質を、二連の実験で使用する。固定化されたタンパク質への様々な細胞型への結合を使用して、いずれの細胞がその細胞表面上にα_dリガンドを発現しているかを判定する。次いで、抗体阻害を使用して、観察される細胞の結合が、既知の表面接着分子との相互作用に起因するのか否かを判定する。阻害結果が認められない場合、α_dと結合するであろう細胞の溶解液からのタンパタ質に結合されたα_d /CD18LZとの共免疫沈降を用いて、リガンドの同定を試みる。可溶性ヒトα_dIドメイン発現構築体 CD11aのIドメインはリガンド結合能及び抗体認識能を維持する独立した構造単位として発現されうることが、これまでに報告されている（Randi及びHogg、J.B ioll.Chem．269巻、12935〜12938頁(1994)、Zhoutら、J.Biol.Chem．269巻、170 75〜17079頁(1994)、Michishitaら、Cell 72巻、857〜867頁(1993)）。α_dIドメイン及びヒトIgG4を含む可溶性融合タンパク質を作製するために、サブクローニングを容易にするため側部にBamHI及びXhoI制限酵素部位を付加するよう設計したプライマーを用いたPCRによりα_dIドメインを増幅する。これらのプライマーを配列番号：32及び33で示し、ここでは制限酵素部位に下線を付す。配列番号：32のBamHI部位の直ぐ3'側に位置するヌクレオチドCは、配列番号：１の第435位のヌクレオチドに対応し、配列番号：33のXhoI部位の3'側に位置するヌクレオチドGは、配列番号：１の第1067位のヌクレオチドに相補的なものである。増幅させたIドメインを適切な酵素で消化し、精製した断片を哺乳動物の発現ベクターpDC及び原核性動物の発現ベクターpGEX-4T-3（ファルマシア）の中へと連結し、そしてIドメインの断片の配列決定を行う。次いで、適切な発現用構築体でトランスフェクトまたは形質転換したCOS、CHOまたは大腸菌細胞において融合タンパク質を発現させる。 α_dがICAM-Rに対する親和性を有するなら、α_dIドメインの発現によって、α_d が関与する細胞接着の有用な阻害剤となるに足る親和性が得られるかもしれない。ヒトα_dIドメイン／IgG4融合タンパク質の分析還元条件及び非還元条件下でSDS-PAGEによりタンパク質を分離し、銀染色またはクマシー染色のいずれかにより目視化した。次いでタンパク質をイモビロンPV DF膜に転写し、抗−ヒトIgGモノクローナル抗体または抗−ウシIgモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析に付した。検出したタンパク質は非還元条件下では約120kDに、還元条件下では約45kDに移動することが確かめられた。非還元条件で行ったゲルでは、抗−ヒト抗体に反応するが抗−ウシ抗体には反応しないマイナーバンドも、およそ40〜50kDに検出された。200kDのマイナーバンドは、ウェスタンブロットによりウシIgであることが確認された。I ドメイン発現産物を用いた結合アッセイ IドメインがICAM-R/IgGキメラタンパク質を特異的に認識する能力を、ELISA形式で試験した。TBSでα_dIドメインIgG4融合タンパク質（Iα_d/IgG4）を連続的に希釈した溶液を、イムノロンIV RIA/EIAプレートに固定化した、ICAM-1/IgG、IC AM-R/IgG、VCAM-1/IgG、または無関係なIgG1ミエローマタンパク質とともにインキュベートした。CD11a Iドメイン/IgGキメラタンパク質及びヒトIgG4/カッパミエローマタンパク質を、陰性コントロールとして用いた。結合したIgG4は、ビオチン化した抗−IgG4モノクローナル抗体HP6023に続き、ストレプタビジン−ペルオキシダーゼ接合体を添加し、基質であるo-フェニレンジアミンで現像することによって検出した。アッセイを繰り返した結果、CD11a/IgG4タンパク質またはIgG4ミエローマタンパク質の、前記した固定化されたタンパク質のいずれに対する結合も検出されなかった。Ｉα_d/IgG4タンパク質は、サカナ皮膚ゼラチンまたはウシ血清アルブミンのブロッキング剤、ヒトIgG1、またはICAM-IgGに結合しなかった。1〜５μg/m lの濃度でIα_d/IgG4タンパク質を用いた場合、ICAM-R/IgGタンパク質が被覆されたウェルにおいて、バックグラウンドに対して2〜3倍上回る、結合シグナルの増大が検出された。VCAM-1/IgGタンパク質が被覆されたウェルにおけるシグナルは、バックグラウンドよりも7〜10倍高かった。前のアッセイでは、α_d/CD18がトランスフェクトされたCHO細胞はVCAM-1/IgGタンパク質に結合しなかったので、V CAM-1の結合は、単離されたIドメインアミノ酸配列に特徴的であることが示唆された。追加のα_dIドメイン構築体追加のα_dIドメイン構築体を、前記の構築体と同様に作製するか、α_dIドメイン近傍にさらなるアミノ酸を組み込む。特定の構築体には、i)現在の構築体の前に、エキソン５からの配列（配列番号：２の第127〜353位のアミノ酸）、ii)Iドメインに続く、EF-ハンド反復配列（配列番号：２の第17〜603位のアミノ酸）、及び、iii)精製及び検出の目的でIgG4尾部を伴い、膜貫通領域（配列番号：２の第17〜1029位のアミノ酸）でのα鎖の切除が包含される。これらの構築体は、哺乳動物発現ベクターpDCS1または原核性動物発現ベクターpGEX-4T-3（ファルマシア）の中に連結し、そしてIドメインを配列決定する。次いで、適切な発現構築体でトランスフェクトまたは形質転換したCOS、 CHO、または大腸菌細胞で、融合タンパク質が発現される。タンパク質はプロセップ(ProSep)Aカラム（バイオプロセッシング社(Bioprocessing Limited)、Durh am、英国）で精製し、抗IgG4モノクローナル抗体HP6023との反応性について試験し、そしてクマシー染色を行ってポリアクリルアミドゲル上で目視化する。 α_dポリペプチド全体に対する発現プラスミドを構築するために、前記のpATM. D12を以下の方法により修飾してα_d-IgG4融合タンパク質を発現する。IgG4をコードするDNAは、個々に5'AatII制限酵素酵素部位（配列番号：89）及び3'XbaI制限酵素酵素部位（配列番号：90）を組み込んだプライマーを用いたPCRにより、ベクターpDCS1から単離する。プラスミドpATM.D12は、AatII及びXbaIで消化し、適切に消化し精製したIgG4 PC R産物を、直鎖状のベクターの中へと連結する。実施例15 ヒトα_d−特異抗体の生産Ａ．モノクローナル抗体の生産１．実施例７からの一過性にトランスフェクトされた細胞を、ダルベッコ(Dul becco's)リン酸緩衝性生理食塩水（D-PBS）で３回洗浄し、次いで50μg／マウスのムラミル・ジペプチダーゼ（シグマ）のPBS溶液とともにBalb/cマウスに５ｘ1 0⁶の細胞／マウスで注射した。マウスには同じように２週間の間隔で、さらに２回注射を行った。マウスからの採血前に、免疫付与した血清を実施例９に概説したようにFACS分析によってスクリーニングし、そして、 α_d/CD18がトランスフェクトされた細胞に対して最も高い反応性を示すマウスからの脾臓を、細胞融合した。次いで、ハイブリドーマの培養上清を個々に、CD11 a/CD18でトランスフェクトしたCOS細胞に対する反応性を欠くこと及びα_d発現プラスミドとCD18とでコトランスフェクトした細胞との反応性についてスクリーニングした。この方法によってモノクローナル抗体は得られなかった。２．モノクローナル抗体を生産するための別の方法として、可溶性α_dIドメインIgG4融合タンパク質を、安定に形質転換されたCHO細胞の上清から親和性によって精製し、前記のようにBalb/cマウスを免疫付与するために用いた。ハイブリドーマを樹立し、これらのハイブリドーマからの上清を、α_dIドメイン融合タンパク質に対する反応性についてELISAによりスクリーニングした。次いで陽性の培養液を、CHOトランスフェクト体で発現した全長のα_d/CD18複合体との反応性について分析した。マウス1908に、α_d/CD18でトランスフェクトしたCHO細胞の初発免疫を３回行い、可溶性α_d/CD18ヘテロダイマーで引き続き２回、追加免疫を行った。２度の最終的な免疫付与は、マウス１匹当たり50μｇのα_dIドメイン/IgG4融合タンパク質を含むものとした。融合により、IgGを生産するウェルが270得られた。45のウェルからの上清が、ELISAによって、ヒトIgG4に対してよりもIα_d/IgG4融合タンパク質への結合が少なくとも７倍高いことが示された。FACS分析によって確認すると、上清のうちいずれも、α_d/CD18がトランスフェクトされたCHO細胞と反応しなかった。別の情況下で上清がインテグリンαサブユニットを認識することができるか否かを調べるために、新鮮な凍結脾臓切片を、 45のウェルのうち24からの上清を用いて染色した。３つの上清か陽性であることが確かめられ、１つは赤脾髄における大細胞(large cell)を染色し、一方他の２つは赤脾髄における分散細胞と、脾柱をも染色した。さらにこれらの上清を、α_d/CD18をトランスフェクトしたCHO細胞またはPMAで刺激したHL60細胞のいずれかからの、ビオチン化したCD18複合体を免疫沈降する能力について分析した。界面活性剤による溶解液（ヘテロダイマーとして発現されるタンパク質のようにコンホメーション的に束縛されるべきではない）中でタンパク質を認識する上清を含む融合細胞のウェルを、さらにサブクローニングするために選択した。タンパク質を認識するモノクローナル抗体の界面活性剤溶液は、トランスフェクト体、組織、及び細胞系からのヘテロダイマー複合体の免疫沈降においてさらに有用であるかもしれない。３．モノクローナル抗体生産のためのさらに別の選択手段として、ヒト脾臓溶解液から、CD11a/CD18を（モノクローナル抗体TS2/4を用いて）、そしてCD11b/C D18を（モノクローナル抗体Mo-1を用いて）予め除いた後、抗CD18モノクローナル抗体23F2GでCD18複合体を免疫沈降させた。10〜12週令の５匹のBalb/cマウスを以下のように免疫付与した。すなわち、得られたタンパク質をおよそ30μg含む完全フロインドアジュバントを、第０日に皮下注射し、続いて第28及び43日にマウス１匹当たり30μgの免疫原を不完全フロインドアジュバント中にて追加免疫した。試験すべき血清を、最終の追加免疫の後10日目に取り、ウェスタンブロットにおいて１レーン当たり１μgの免疫原を検出すべく各血清の１：500希釈液を使用して反応性を評価した。３匹のマウスからの血清で、およそ95及び150kD のバンドが検出され、免疫前の血清の１：50希釈液を用いて処理したレーンではシグナルは認められなかった。150kDのバンドは、in vivoでグリコシル化状態にある、α_dを表すものと推定された。加えて、SDS-PAGE上でヘテロダイマーを表すに相応の分子量に移動する、ビオチン化されたα_d/CD18 CHO細胞の溶解液からのタンパク質が、すべての免疫後の血清で免疫沈降された。これらの結果に基づきマウス#2212を選択し、さらにPBS中30μgの免疫原を用いて第64日目に腹腔内注射によって免疫付与した。４日後にマウスを屠殺し、無菌的に脾臓を摘出した。２mM L−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、100単位／mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清のRPMI 1640(RPMI)（ギブコ (Gibco)、カナダ）の中に沈めた２枚のガラス顕微鏡スライドの磨りガラス状の（frosted）端部の間で脾臓を擦り潰すことによって、単一細胞の懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、70メッシュの滅菌したナイテックス(Nitex)細胞濾過器（ベクトン・ディッキンソン、Parsippany、ニュージャージー州）を通して濾過し、そして、200×ｇで５分間遠心分離して、濾過物を２度洗浄した。このようにして得られたペレットを、20mlの無血清RPMI中に再懸濁した。３匹の未処置Balb /cマウスから摘出した胸腺細胞を、同様に調製した。 10％フィータルクローン(Fetalclone)血清(FBS)(ハイクローンラボラトリーズ (Hyclone Laboratories)、Logan、ユタ州)を含むRPMI中にて融合の前に対数増殖期に３日間保持しておいたNS-1ミエローマ細胞は、融合に先駆けて200×ｇで５分間遠心分離してペレット化し、前の段落に記載したように２回洗浄して計数した。およそ２×10⁸個の脾臓細胞を、４×10⁷個のNS-1細胞と合わせ、得られた混液を200×ｇで遠心分離することによってペレット化した。その上清は廃棄した。チューブを軽くたたくことにより、細胞ペレットを変位させ、50％PEG 1500を含む 75mM Hepes（pH 8.0、37℃）（ベーリンガーマンハイム）の２mlを、１分間にわたってかき混ぜながら加えた。続いて、さらに無血清RPMI 14mlを７分間かけて加え、その後直ちに16mlのRPMIを添加した。得られた混合液は、200×ｇで10分間遠心分離し、上消は廃棄した。ペレットは、15％FBS、100mMヒポキサンチンナトリウム、0.4mMアミノプテリン、16mMチミジン(HAT)(ギブコ）、25単位/ml IL- 6(ベーリンガーマンハイム)及び1.5×10⁶個の胸腺細胞/mlを含む、200mlのRPMI 中に再懸濁し、そして、96ウェル平底組織培養プレート（コーニング、連合王国）へ、ウェル当たり200μlで10個のウェルに分配した。細胞には、18Ｇの針（ベクトン・ディッキンソン）を用いて各々のウェルからおよそ100μlを吸引し、そしてウェル当たり100μlの培養用（plating）培地（10単位/mlのIL-6を含み胸腺細胞を欠いている以外は、前記に同じ）を加えることによって、融合後２、４及び６日目に栄養を供給した。融合後７〜10日目に、各ウェルからの上清を、抗体捕捉ELISAによってスクリーニングし、マウスIgGの存在について調べた。イムロン（Immulon）４プレート（ダイナテック(Dynatech)、Cambridge、マサチューセッツ州）を、50mMカーボネート緩衝液、pH9.6で１：5000に希釈した、ウェル当たり50μlのヤギ抗マウス IgA、IgG、またはIgM（オーガノン・テクニカ(Organon Teknika)）で、４℃にて被覆した。プレートを、0.5％ツイーン20を含むPBS（PBST）で３回洗浄し、次いで、各ウェルからの培養上清50μlを添加した。37℃にて30分間インキュベートした後、前記の通りにPBSTでウェルを洗浄し、PBSTで１：3500に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスIgG(fc)（ジャクソン・イムノ・リサーチ(Jackson Immuno Research)、West Grove ペンシルバニア州）を50μl、各ウェルに加えた。プレートは、前記の通りにインキュベートし、PBSTで４回洗浄し、そして10 0mMクエン酸塩、pH4.5中、１mg/mlのｏ-フェニレンジアミン（シグマ）及び0.1 μl/mlの30％H₂O₂からなる基質100μlを添加した。呈色反応は、15％H₂SO₄を50 μl加えて５分後に停止させた。プレートリーダー（ダイナテック）を用いて、4 90nmにおける吸光度を各ウェルについて測定した。ハイブリドーマは、さらに以下の通りにその特徴を調べた。IgGを生産している培養液からの上清を、JY細胞（所内での染色実験において観察された結果では、LFA-1に対して陽性であるが、他のβ₂インテグリンには陽性ではないB細胞系）に対してでなく、α_d/CD18で形質転換されたCHO細胞に対する反応性について、フローサイトメトリーによって分析した。手短に説明すると、５×10⁵個の、 α_d/CD18で形質転換されたCHOまたはα_d/CD18^-JY細胞を、２％ FBS及び10mM NaN₃ を含有するRPMI（FACS緩衝液）50μl中に懸濁した。各々の細胞懸濁液を、96ウェル丸底プレート（コーニング）のウェル中に人れた50μlのIgG陽性ハイブリドーマ培養上清に添加した。氷土で30分間インキュベートした後、クリニカル（cl inical）遠心にてペレット化することによって細胞を２回洗浄し、各ウェルからの上清を廃棄して、200〜300μlのFACS緩衝液にペレットを再懸濁した。最後の洗浄で、FACS緩衝液中で調製したヒツジ抗マウスIgG(H+L)-FITC接合物（シグマ、St.Loius、ミズーリ州）のF(ab')₂断片の１：100希釈液ウェル当たり50μlに置き換えた。前記の通りにインキュベートした後、細胞を10mM NaN₃を添加したダルベッコPBS（D-PBS）を用いて２回洗浄し、最終的に１％パラホルムアミドを含有するD-PBSに再懸濁した。次いで、ベクトン・ディッキンソン FACsanアナライザーを用いるフローサイトメトリー分析（FACS）用のポリスチレンチューブに試料を移した。融合によって、双方の基準により陽性であると考えられる４つの培養物が得られた。およそ４日後に、増殖後の（expanded）上清について第二次のスクリーニングを繰り返すと、前記４つの培養物のうち３つが陽性のままであった。169A、 169B、169Dと命名した、係る３つのウェルは、RPMI、15％FBS、100mMヒポキサンチンナトリウム、16mMチミジン、及び10単位/ml IL-6中に倍希釈することによって、２から３回連続的にクローニングした。クローンのプレートのウェルは、４日後に目視的に評点し、最小密度のウェル内のコロニー数を記録した。各クローニングで選択されたウェルを、7〜10日後にFACSによってアッセイした。培養物のうち２つ、169A及び169Bに活性が見出された。最終クローニングで、単一のコロニーを含む陽性のウェルを11％FBSを含むRPMIにおいて増殖した。169A及び169 Bのクローン上清からの抗体を、イソストリップ(IsoStrip)キット（ベーリンガーマンハイム）を使用し、製造業者の指示書に従ってイソタイプ判定し、IgG₁イソタイプであることが見出された。 CHOトランスフェクト体及びPMAで刺激したHL60細胞からのα_d/CD18複合体の免疫沈降を、特異性についての第三次スクリーニングとして使用した。ハイブリドーマ169A及び169Bは、CHO系から適切なバンドを、そしてHL60細胞から、SDS-PAG Eにより判定して150〜160kDの単一α鎖種を沈降させた。ハイブリドーマ169A及び169Bは、郵便番号20852、メリーランド州、パークロウン、ロックビル12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、1995年５月31日に寄託され、それそれ受託番号HB11907及びHB11906を付与された。 169A及び169Bの結合特性をさらに充分に特徴付けるために、他の抗体または可溶性α_d/CD18に対する抗CD18抗体TS1/18.1の結合を阻害する、各抗体の能力について試験した。全長の可溶性α_d/CD18は、96ウェルプレート形式にて、各々の非ラベル抗体によって別々に固定化し、ビオチン化した抗体を使用して、同じかまたは異なる非ラベル抗体によって結合したタンパク質を検出した。ヤギ抗マウスIg/HRP接合物を使用し、次いでOPD基質を添加することによって、結合を検出した。その結果、抗体169Aはピオチン化した169A及びTS1/18.1の結合を阻止することかでき、一方抗体169Bはそれ自体のみしか阻止できないことが示唆された。４．マウス#2212と同じプロトコルによって免疫付与された別のマウス（#2214 ）を選択し、脾臓のPBS溶解液から精製されたα_dを30μg用い、第70日目に融合前の追加免疫を行うことによつて、さらに免疫付与した。４日後にマウスを屠殺し、脾臓を無菌的に摘出した。陽性細胞の融合及びクローニングは、前記の通りに行った。融合物から、170D 、170F、170E、170X及び170Hと命名された５つの抗α_dモノクローナルハイブリドーマが生産され、これはイソストリップキット（ベーリンガーマンハイム）を使用し、製造業者の指示書に従ってIgG₁イソタイプであると判定された。５．マウス#2212及ひマウス#2214と同じ初期プロトコルによって免疫付与したさらに別のマウス#2211を選択し、30μgの免疫原を用いて第88日目に、そして30 μgの免疫原を用いて第203日目に融合前の追加免疫を行うことにより、さらに免疫付与した。４日後にマウスを屠殺し、脾臓を摘出して、前記の通りに融合を行った。前段落に詳述した通りに、抗体捕捉ELISA及びフローサイトメトリーによって、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。 15の陽性ハイブリドーマを同定し、188A、188B、188C、188E、188F、188G、18 8I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、 188R及び188Tと命名し、ELISAアッセイにてイソタイプを判定した。簡単に説明すると、イムロン4プレート（ダイナテック、Cambridge、マサチューセッツ州）を、50mMカーボネート緩衝液、pH9.6で1:5000に希釈した、ウェル当たり50μlのヤギ抗−マウスIgA、G、M（オーガノン・テクニカ）で、4℃にて被覆した。プレートを、37℃にて30分間、1％BSAを含むPBSでブロッキングし、PBS/0.05％ツイーン20（PBST）で３度洗浄し、そして50μlの培養上清（PBSTにて1：10に希釈）を添加した。前記のごとくインキュベーション及び洗浄を行った後、1％正常ヤギ血清を含むPBSTで1:1000に希釈した、50μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ウサギ抗−マウスIgG₁、G_2a、G_2b、またはG₃（ザイメッド、San Francisc o、カリホルニア州）を加えた。プレートは、前記の通りにインキュベートし、P BSTで４回洗浄し、その後、100mMクエン酸塩、pH4.5中に1mg/ml o-フェニレンジアミン（シグマ）及び0.1μl/mlの30％H₂O₂からなる100μlの基質を添加した。呈色反応は、15％H₂SO₄を50μl加えて5分間で停止させた。プレートリーダー（ダイナテック）でＡ₄₉₀を読み取り、15の抗体がすべてIgG₁であると判定された。マウス＃2211由来の過剰の脾臓細胞は、凍結用バイアル中に凍結し、液体チッ素中にて保存した。凍結物は、37℃の水浴に入れ、内容物がまさしく融解するまで回転運動するように動かすことによって、迅速に解凍した。細胞を15mlの遠心チューブに移し、ここに11％FBSを含有する暖かいRPMIを、添加ごとの間隔を3〜 5分として１度に１mlずつゆっくりと添加した。さらに別途5mlの暖かいRPMIを加え、5分間待った後チューブを200×gにて5分間遠心し、そして上清を吸引した。細胞は、RPMIに再懸濁し、前記の通り融合を行った。ハイブリドーマ上清は、抗体捕捉及びフローサイトメトリーによって前記のごとくにスクリーニングした。 195A、195C、195D、195E及び195Hと命名された５つのクローンが、融合によって得られた。係るクローンを、前記の通りにELISA法によってイソタイプ判定し、モノクローナル抗体195A、195C、195D及び195EはIgG₁であり、195HはIgG_2aであると判定された。６．機能的なα_d結合を阻害することができる抗体を同定するために、可溶性 α_d/CD18LZ（実施例14参照）を、免疫付与のために使用する。タンパク質は、一過性にトランスフェクトされたCOS細胞の上清から、アフィニティークロマトグラフィー樹脂にて単離し、その樹脂に結合したα_dが、免疫原として用いられる。選択されたマウスを前記の通りに免疫付与し、初回免疫後2週で最終の追加免疫を付与する。この技術による免疫付与によって、時として界面活性剤による細胞の溶解に伴うタンパク質コンホメーションの変化の可能性が防止される。組換えタンパク質（これも樹脂に結合されたもの）で、さらなるマウスが免疫付与されるが、これらは細胞溶解液から精製されたタンパク質で最初に免疫付与されたものではない。上述の通りにして免疫付与の結果調製されたハイブリドーマは、非ブロッキング抗体のFab断片を使用して、細胞上清から固定化された組換えタンパク質についてのELISAによってスクリーニングされる。あるいは、フローサイトメトリーを使用して、予めα_dcDNAでトランスフェクトされたJY細胞に対する反応性についてアッセイを行う。７．別の取って代わる手段として、モノクローナル抗体を以下のように作製する。安定にトランスフェクトしたCHO細胞の界面活性剤による溶解液からアフィニティー精製したα_d/CD18ヘテロダイマータンパク質を、50μg/mlのムラミルジペプチダーゼとともに用いて、前記のようにBalb/cマウスを免疫付与する。CHOトランスフェクト体におけるビオチン化複合体の免疫沈降により、α_d/CD18に対する血清の反応性を調べる前に、マウスに３回免疫付与する。ハイブリドーマ培養液を、α_d /CD18トランスフェクト体を用いたフローサイトメトリーにより選択した後、標準のプロトコルに従って、陽性の動物からハイブリドーマを樹立する。CD11a/CD 18のトランスフェクト体は、CD18のみについての反応性を制御するために利用される。８．モノクローナル抗体生産のための別にとるべき方法として、Balb/cマウスに対し、免疫付与のために用いられるトランスフェクト体上のCHO細胞決定子への反応性を減ずるように設計された、免疫付与／免疫抑制のプロトコルを行う。このプロトコルには、トランスフェクトされていないCHO細胞を用いた免疫付与及び、引き続いてシクロホスファミド処理を用いたCHO反応性B-細胞芽細胞を死滅させることが、包含される。３回の免疫付与及びシクロホスファミド処理を行った後、マウスに前記のようにα_d/CD18 CHOトランスフェクト細胞で免疫付与する。９．別の代替え手段としては、PMAで刺激したHL60細胞の界面活性剤による溶解液からのCD18複合体を、前記と同様に予備精製によって濃縮する。他のβ2インテグリンは、同じカラムで予備精製しておく。得られた複合体を用いた免疫付与、ハイブリドーマ生産、及びスクリーニングプロトコルは、上述のように実施する。Ｂ．ポリクローナル血清の生産精製されたα_dIドメイン/IgG4キメラ（実施例14参照）を使用して、ポリクローナル抗血清をウサギで作製した。α_dIドメイン/IgG4抗原は、最初に完全フロインドアジュバント中、ウサギ１羽当たり100μgにて注射し、続いて、同量のタンパク質を含む不完全フロインドアジュバントを用いて３度追加免疫を行った。第３及び第４回目の注射の後に被検用の血液をアッセイした。プロテインA-セファロースカラムにて血清からウサギイムノグロブリン（Ig）を精製し、ヒトIgG/アフィゲル10カラムにて抗ヒト IgG反応性を予め除いた。ELISAにより、Iドメインキメラに対する反応性であって、ヒトIgGに対するものでない反応性を使用して、完全に抗ヒトIgG反応性か予め除かれたか否かを確認した。前記のごとく予備精製されたポリクローナル血清を使用して、α_d及びCD18発現ベクターを用いて予めトランスフェクトされた、表面がビオチン化されたCHO 細胞の界面活性剤溶解液から、タンパク質を免疫沈降させた。実施例10に前記した方法によって、免疫沈降を実施した。予備精製された血清は、抗CD18モノクローナル抗体TS1.18によって沈降されるものと同じ分子量のタンパク質複合体を認識した。加うるに、係る血清は、ウェスタンブロットにて、α_d/CD18がトランスフェクトされたCHO細胞からCD18複合体の適切なサイズの単一バンドを認識した。ヒト脾臓由来の、アフィニティー精製されたインテグリンCD11a/CD18、CD11b/ CD18及びVLA4は、そのウサギポリクローナル血清によって認識されなかった。係る血清は、フローサイトメトリーで判定した場合に、α_d/CD18がトランスフェクトされたCHO細胞と溶液中で反応することはなかった。従って、このポリクローナルウサギ血清は、変性したα_dIドメイン/IgG4タンパク質を認識することができるだけであることが結論付けられた。 α_d/CD18に対するポリクローナル抗血清を生産する試みにおいて、アジュバントペプチドと共に、α_dがトランスフェクトされたCHO細胞（D6.CHO,α_d/CD18）を用いて３回、そして精製されたα_d/CD18ヘテロダイマーを用いて１回、マウスを免疫付与した。最終の追加免疫は、α_d/CD18ヘテロダイマーのみが含まれているもので行った。およそ100 μlの免疫血清を、4℃にて2時間、LFA-1がトランスフェクトされたCHO細胞をおよそ10⁸個添加することによって予備精製した。得られた血清を、1/5000、1/100 00、1/20000及び1/40000の希釈率で、正常ヒト脾臓でのα_d反応性についてアッセイした。そのポリクローナル抗体は、1/20000の希釈率で反応性を示したが、1 /40000希釈では極めて微弱にしか染色されなかった。実施例16 α_d分布の分析 α_d/CD18の組織分布を、実施例15に記載した通りに作製したポリクローナル抗血清を用いて調べた。精製されたウサギポリクローナル抗体は、ヒト脾臓凍結切片の免疫細胞化学分析用に、120ng/mlと60μg/mlの間の範囲の濃度で使用した。6ミクロンの厚みの切片をスーパーフロスト・プラス・スライド(Superfrost Plus Slides)（VWR）に重ね、-70℃にて保存した。使用前に、スライドを-70℃より取り出し、55℃に 5分間置いた。次いで、切片を冷アセトン中で2分間固定し、そして風乾した。切片は、1％BSA、30％正常ヒト血清及び5％正常ウサギ血清を含有する溶液中で、室温にて30分間ブロッキングした。室温にて1時間、各切片を一次抗体に付した。結合しなかった抗体は、TBS緩衝液中で３回、一回の洗浄当たり5分間ずつ洗浄することによって除去した。次に、ウサギ抗マウスIgG結合抗体を、同じTBS緩衝液中で各切片に付した。第二抗体を検出するために、室温にて30分間インキュベートされた、マウスアルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（APAAP）抗体を使用した。次いで、スライドをTBS緩衝液中で３回洗浄した。ファスト・ブルー(Fast Blue)基質（ベクター・ラボラトリーズ）を付し、そして水中に浸漬することによって発色を停止した。スライドを、ヌクレア・ファスト・レッド（Nuclear Fast Red、シグマ）にて対比染色し、アクア・マウント(Aqu a Mount、バクスター(Baxter))に載置する前に水で濯いだ。この試薬を用いて赤脾髄に染色が検出されたが、無関係なウサギポリクローナルIg調製物または、前記と同じウサギ由来の免疫前の未精製血清では染色は検出されなかった。マウス血清が、特異的なα_d反応性を有することが一旦確かめられると、種々のリンパ様及び非リンパ様の組織を染色するために使用した。CD18、CD11a、CD1 1b、及びCD11を認識するモノクローナル抗体を、コントロールとして同じ実験において用いた。正常脾臓切片をα_dポリクローナル血清及びCD11a、CD11b、CD11c 、及びCD18に対するモノクローナル抗体を用いて染色して以下の結果が得られた。α_dポリクローナル血清を用いて観察されるパターンは、CD11a、CD11b、CD11c 、またはCD18の場合のラベルと同じパターンは呈しなかった。白脾髄の辺縁帯に位置するいくつかの細胞によるラベルの明瞭なパターンと、辺縁帯周辺の細胞の明瞭なラベルとが見られた。このパターンは他の抗体を用いた場合には観察されなかった。CD11a及びCD18を用いた場合に見られる集団またはサブセットと同じかまたは異ないうる、赤脾髄全体に分散する個々の細胞もまた、ラベルされた。 CD11cを用いたラベリングでは、辺縁域においていくつかの細胞の染色を呈したが、この抗体では、α_dポリクローナル血清に比して、白脾髄周辺に明瞭な環状のパターンを示さず、また、赤脾髄におけるラベルがα_dポリクローナル血清の場合と同じ染色パターンを与えることもなかった。従って、α_dポリクローナル血清を用いた場合に見られるラベリングパターンは、他のβ₂インテグリン（CD11a、CD11b、CD11c、及びCD18）に対する抗体を用いた場合に見られるパターンに比して独自のものであり、ヒトにおけるα_dのin vivoでの分布は他のβ₂インテグリンの場合と異なることが示唆される。モノクローナル抗体を用いた、ヒトα_d発現の特徴付けハイブリドーマ169A及び169Bによって分泌される抗体を使用して、免疫細胞化学により凍結組織切片におけるヒトα_dの発現を分析し、また、フローサイトメトリーによって細胞系及び末梢血白血球における分析を行った。双方の実験系で使用したハイブリドーマ上清は、希釈したものではなかった。組織染色肝切片が以下の方法にて染色されたことを除いては、すべて染色は前記のごとくに行った。アセトンによる固定の後、切片は室温にて15分間、1％H₂O₂及び1％アジ化ナトリウム中で消光（quench）した。一次抗体染色の後、ペルオキシダーゼに直接接合されたウサギ抗マウス抗体を、室温にて30分間付した。スライドを TBS緩衝液中で3分間洗浄した。第二抗体を検出するために、ペルオキシダーゼに直接接合されたブタ抗ウサギ抗体を室温にて30分間インキュベートした。次いで、スライドをTBS緩衝液中で３回洗浄し、そしてAEC基質（ベクター・ラボラトリーズ）を付して、発色を許容した。スライドは、ヘマトキシリン・ギルス2号(He matoxylin Gill's No.2、シグマ)で対比染色し、次いで脱水及び載置の前に水中で濯いだ。脾臓切片において、形態学的に顆粒球及びマクロファージとして同定される細胞上、主として赤脾髄に、発現は局在していた。多数の顆粒球が染色されたが、マクロファージはサブセットのみでシグナルが認められた。白脾髄では少量の濾胞樹状細胞が、α_dによって弱く染色された。CD11a及びCD18の染色は、赤脾髄及び白脾髄にわたって検出された。CD11c染色は、白脾髄において、及び白髄を取り囲む辺縁領域においてマクロファージであると推定される大細胞にて、より顕著であり、赤脾髄においても拡散染色が認められた。CD11bは、赤脾髄においてα_dと重複するが同じではない分布状態にあることが明らかになり白脾髄には含まれていなかった。正常及び（慢性関節リウマチ）関節滑膜組織におけるインテグリン発現を比較した。すべての抗インテグリン抗体（CD11a、CD11b、CD11c、CD18ならびにα_dと特異的な免疫反応性を有する抗体を包含する）を用いた最小の染色が正常組織で認められ、おそらくはマクロファージである常在（resident）細胞上に広範囲にわたって分布していた。炎症を伴う滑膜においては、すべてのインテグリンの発現が、リンパ管の周囲に群がる細胞に、より局在していた。α_d及びCD11b発現パターンは類似していたものの、CD11cは強く発現されていることはないらしく、それは白血球のサブセットに限定された。イヌにおいて、CD11b発現は、肝マクロファージ、すなわち、クッパー細胞上に観察されたが、α_d発現は観察されなかった。正常ヒト肝切片の染色（前出のイヌ肝切片に染色について記載したと同様）によって、ヒトにおいてこの染色パターンが保存されていることが確認された。加えて、CD11cが低いレベルで検出された。肝炎の患者からの切片では、すべてのロイコインテグリン染色が、正常の肝にて観察されるよりも高く、一方α_d発現は、これらの試料においてマクロファージ及び顆粒球に検出された。抗α_d抗体を用いると、正常ヒト結腸切片の最小染色が観察され、わずかな平滑筋染色と白血球の染色が観察された。限局性回腸炎（クローン病）に罹患した患者からの切片では、すべてのインテグリンが、より高レベルにて検出された。正常肺では、弱いα_d陽性を有する、特定数の細胞が示され、これらは、形態学的にマクロファージ及び好中球であると判定された。気腫に罹患した患者からの肺組織において、α_dの染色は、ヘモジデリン（鉄含有色素）を含む好中球上及びマクロファージ上に観察され、これらの細胞による赤血球細胞の取込みが示唆された。正常脳の切片及び多発性硬化症（MS）に罹患した患者由来のプラーク病変を、インテグリン発現について調べた。正常の脳において、α_d染色は、CD11a、CD11 b、及びCD11cの染色よりも強度が低く、そして、形態学的に及びCD68染色によって、小(神経)膠細胞として分類される細胞に限られていた。CD11b陽性細胞は、周囲の脈管及び組織全体に位置していた。CD11c⁺細胞は、脈管内に位置するようであり、一方α_d ⁺細胞は脈管を取り囲んでいた。MS組織切片において、α_d発現は、小(神経)膠細胞上及びマクロファージではない白血球のサブセットの双方に見出され、α_d ⁺細胞はプラーク病変内と皮質全体とに位置していた。α_dシグナルは、CD11cと同等の強度を有していたが、CD11bの場合よりも低かった。 PDAY(Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth，LSU Med ical Center)組織試料由来の、胸部大動脈及び腹部大動脈切片の双方を、抗ロイコインテグリン及び抗CAM抗体を用いて分析した。調べた病変は、内膜下での大泡沫細胞の凝集（ほとんどが、消化された脂質を伴うマクロファージ）及び小白血球の浸潤からなる、大動脈脂肪線条に一致していた。α_dならびに他のβ₂インテグリンα鎖（CD11a、CD11b、及びCD11c）に対して特異的なモノクローナル抗体にマクロファージマクロファージマーカー（CD68 ）を加えた、単一ラベル実験によって、脂質を積載したマクロファージのほとんどが、中程度のレベルのα_d及びCD18を発現し、一方CD11a及びCD11cを弱いかまたは、弱〜中程度のレベルでそれぞれ発現していることが明らかになった。CD11 bは、微弱に発現され、そしてそれはマクロファージのサブセットにおいてのみであった。動脈切片における、α_d及びICAM-R抗原の相対的な局在を判定するために、二重ラベル実験を行った。これらの切片において、マクロファージマーカーに対して特異的な抗体Ham 56で泡沫細胞が染色され、平滑筋アクチンに対する抗体では染色されなかったので、泡沫細胞は内膜下の平滑筋細胞に由来するものでないと判断された。α_dを発現しているCD68陽性マクロファージは、ICAM-R陽性小白血球に取り囲まれ、それらの間に散在していた。CD68陰性であるがα_d及びICAM-R 抗体の双方で染色される小白血球が限られた数あるようであった。正常組織におけるα_dの分布は、白血球に分布が限定されていることが以前に特徴付けられている２つの他のロイコインテグリンα鎖、CD11b及びCD11cと重複するが同じではないパターンで、常在白血球細胞上にあることが明らかとなった。細胞の形態学によって、α_d染色はマクロファージ及び顆粒球に大いに限局されており、リンパ球の染色は限定されていることが示唆された。一般に、組織の炎症は、特定の組織において観察される白血球の数及び型を増大させるようであり、α_dを包含するロイコインテグリンの染色の増強を伴っていた。ロイコインテグリンの細胞及び空間的分布は、病理学的組織では同様でないので、特定の情況で、α_dを包含する各ファミリーのメンバーに対する別個の機能及びリガンドが存在すると推量された。興味深いことに、動脈硬化の初期病変におけるα_d発現は、CD11a、CD11b、及びCD11cの発現よりもさらに顕著であるらしく、α_dがこれらの病変の樹立に中心的な役割を果たしているかもしれないことが示された。α_d及びICAM-R陽性細胞が並んで分布していることは、α_dとICAM-Rとの間の相互作用を示す証拠によって支持されるものであり、α_dがこれらの病変における初期段階での白血球の補強または活性化に関与しているかもしれないことを示している。細胞系及び末梢血白血球染色抗体169A及び169Bで、前骨髄単球細胞系のHL60をFACSによって染色した。これらの細胞でのα_dの表面発現は、PMA刺激によって陰性の影響を受け、これは、マクロファージ経路に伴う分化を誘導するが、DMSOによる影響は受けないことが報告されており、顆粒球の分化を誘導するものである（Collinsら、Blood、70巻、 1233〜1244頁(1987)）。169A及び169BのFACSの大略は、抗CD11b及び抗CD11cモノクローナル抗体を用いて観察された場合と、PMA刺激について正反対であった。単球細胞系のTHP-1も、169A及び169Bで微弱な染色を呈した。加えて、末梢血白血球のリンパ球における細胞のサブセット及び単球ゲート（のサブセット）は、 FACSによって微弱な陽性を示すようであった。末梢血単球のサブセットは、169A 及び169Bで弱く染色され、一方Bリンパ球は、α_dの表面発現をしていないことが見出された。Tリンパ球のCD8^-サブセットは、α_d ⁺であった。加うるに、抗体169 A及び169Bは、B細胞系であるJY、Ramos、好塩基系であるKU812、ならびにT細胞系であるJurkat、SKW、及びMolt 16上には抗原を検出できなかった。 HL60細胞での結果に鑑みて、フィコール／ハイパーク（ficoll/hypaque）勾配遠心と、それに続く赤血球溶解によって末梢血から顆粒球を単離した。すべての調製物は、酢酸における核形態の可視化により、90％を上回るPMNであることが見出された。潜在性を有する細胞内のインテグリン貯留物を遊離させるために、別々の個体群を50ng/ml PMAまたは10^-8Mホルミルペプチド（fMLP）を用いて30分間刺激した。刺激しなかった個体群は、低いものの、IgG1のコントロールを越える有意な169A及び169B抗原の発現を呈し、刺激に際して検出可能な増加か観察された。PMN上では、α_dとCD11cの表面発現のレベルは、HL60細胞にて観察されるよりさらに類似していた。抗体169Bを引き続き用いて、α_d及びCD18にそれぞれ適切なおよそ150及び95kDのサイズのサブユニットを持つヘテロダイマー分子をヒオチン化したPMNの界面活性剤溶解液から沈降させた。 PMN上のα_dの存在は、イヌでのα_d発現について知られている情報から予測することはできなかった。イヌ好中球は、それらのヒト相対物と異なり、Ｔ細胞ヘルパーマーカーCD4、及びインテグリンVL-4も発現し、従って、イヌにおいてはヒトにおける場合と相違するリガンド及び機能を有しているのかもしれない。PBL サブグループの染色ヒト末梢血白血球における、このβ₂インテグリンの分布を調べるために、本実験を行った。加えて、他のβ₂インテグリンに対するα_dの細胞表面密度を比較した。最後に、精製されたヒト好酸性球におけるα_d発現の急性調節も評価した。ヒト末梢血白血球は、密度勾配遠心によって、単核細胞画分（単球、リンパ球及び好塩基球を含む）ならびに顆粒球（好中球及び好酸球）に分離した（Warnerら、J.Immunol.Meth．105巻、107〜110頁(19 87)）。いくつかの実験については、CD16免疫磁気選択を使用して、95％を越える純度にまで好酸球を精製した（Hanselら、J.Immunol.Meth.122巻、97〜103頁( 1989)）。ヒフ肥満細胞を、ヒトのヒフから酵素的に分散させ、以前報告された通りに濃縮した（Lawrenceら、J.Immunol．139巻、3062〜3069頁(1987)）。 CD11a（MHM24）、CD11b（H5A4）、CD11c（BU-15）、またはα_d（169A）のいずれかに対して特異的なモノクローナル抗体を適切に希釈したものを用いて、細胞をラベルした。ネズミのコントロールIgG₁も使用した。細胞を洗浄し、次いでフィコエリスリン（phycoerythrin）接合ヤギ抗マウスIgGとインキュベートした。いくつかの実験においては、特定の細胞（例えば、T細胞についてはCD3、CD4、またはCD8；NK細胞についてはCD16+リンパ球；好塩基球については抗IgE（Bochn erら、J.Immunol.Meth．125巻、265〜271頁(1989)））に対して特異的な、FITC ラベルしたネズミモノクローナル抗体またはヤギポリクローナル抗体及び過剰量のネズミIgGと共に、細胞をインキュベートした。試料は、次いでフローサイトメトリー（コールター(Coulter)EPICSプロファイル）によって、細胞のサブセットを同定するために適切なゲート設定を用いて調べた。 α_d発現の急性アップレギュレーションを調べる、ヒト好酸球を用いた実験において、前記の様々なモノクローナル抗体でラベルする前に、細胞はホルボールエステル（10ng/ml）、RANTES（100ng/ml）（Schall、Cytokine、3巻、165〜183 頁(1991)）、またはIL-5（10ng/ml）で37℃にて15分間刺激した。その結果、α_dはすべての末梢血好酸球、好塩基球、好中球、単球、及びNK細胞上に存在することが示された。CD8⁺リンパ球の少量のサブセット（およそ30％）もまた、α_dを発現することが見出された。ヒフ肥満細胞及びC D4⁺リンパ球は、α_dを発現していなかった。一般に、CD11a及びCD11bは、α_dより高密度で白血球上に存在し、α_dはCD11cと同様に比較的低レベルで発現されている。白血球のうち、単球及びCD8⁺細胞はα_dの密度が最も高く、一方好酸球は α_dの発現レベルが最低である。好中球、好塩基球、及びNK細胞での発現は、中間的であった。 CCケモカインRANTESを用いた末梢の好酸球の刺激によって、β₂インテグリンのいずれの発現も変化が惹起こされることはなかった。ホルボールエステルを用いた処置によって、しかしながら、CD11b及びα_dの双方の発現が2〜3倍増大せしめられたが、CD11a及びCD11cの発現には影響がなかった。IL-5処置の結果、他のインテグリンサブユニットのレベルに影響することなくCD11b発現の選択的なアップレギュレーションが起こった。これらの結果を組み合わせて、末梢血白血球において、α_dは概してCD11cに匹敵するレベルで発現されていることが示唆されるものである。単球及びCD8⁺リンパ球のサブセットに、最高のレベルで認められる。ヒトのヒフ肥満細胞は、α_d を発現していない。精製された好酸球は、予め形成された、CD11b及びα_dの細胞質内貯蔵プールを有しているようである。しかしながら、IL-5とPMAとを対比して示される、分別的（differential）アップレギュレーションにより、これらの貯蔵プールは互いに分離していることが示される。 169A/B陰性のリンパ球群をさらに正確に特定する試みにおいて、末梢血白血球（PBL）サブグループについての染色パターンもまた、前記のごときゲート設定及び表面マーカーを組み合わせて使用したフローサイトメトリーによって調べた。前記の通りにフィコール上にPBLを単離し、169A、169BならびにCD14（単球／マクロファージマーカー）、CD20（B細胞）、CD56（NK細胞）、T細胞受容体α／β（T細胞）、CD16（好中球、NK）、及びα4（好中球に対する陰性マーカー）に対するモノクローナル抗体を用いて別々に染色した。ゲートは、サイズ及びマーカーの分布によって規定した。その結果、CD14+単球ゲートにある細胞は、低レベルの169A及び169B染色を呈することが示された。リンパ球ゲートでの初期実験において観察された二形式の発現パターンを、前方分散を増大させることによって解明した。TCR⁺/CD20⁺混合個体群は、低いものの均一のレベルの169A/B発現を有するらしく、一方、わずかに高い側方分散にてマッピングされた個体群（複合細胞（cellular complexity ））は、CD56に対して50％陽性に染色されたが、明瞭に169A/B陰性の個体群を有していることがわかった。かかる陰性個体群は、TCR、CD20、CD14、またはCD16 抗体によっても認識されなかった。α_dの滑膜分布 α_d、他のβ₂インテグリンならびに炎症及び非炎症滑膜におけるそれらの相当物の細胞分布を調べるために、様々なβ₂インテグリン及びイムノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーに対するモノクローナル抗体を、免疫組織学的研究に使用した。タンパク質の発現は、正常、骨関節炎及びリウマチに罹患した滑膜組織試料において調べた。その結果、滑膜被蓋（lining）細胞層は、高レベルのVCAM-1、CD11b/CD18及び α_d/CD18を発現していることが示唆された。これらの細胞において、CD11c/CD18 発現は限定的でありCD11a/CD18は概ね検出されない。慢性関節リウマチ滑膜炎において、滑膜細胞層におけるβ₂インテグリンの発現は、過形成の程度に比例して増大した。CD11cを発現している細胞の割合は有意に増加しており、CD11b及びα_dを発現している細胞の割合に近づいているが、CD11a発現は増加していない。組織の下方被蓋（sublining）領域において、CD3/CD11a/ICAM-R⁺リンパ球の凝集物及び拡散浸潤物が、CD68/CD11b/α_d ⁺マクロファージの間に散在している。かなりの数の凝集物が、特にT細胞に富んだ領域において強いα_d染色を呈することが立証されるものである。滑膜内皮は、多様にICAM-1及びICAM-2を発現し、ICAM-R発現がなされている証拠は少なかった。これらの結果を組み合わせて、滑膜マクロファージ及びマクロファージ様滑膜細胞が、高レベルのβ₂インテグリンCD11b及びα_dを構成的に発現していることが示唆される。滑膜炎において、被蓋及び下方被蓋領域の双方でこの細胞のサブセットの増殖があり、CD11cの発現の明瞭な増加を伴っている。リューマチに罹患した滑膜のTリンパ球の特定の個体群は、CD11a及びICAM-Rの発現に加えて、高レベルのα_dも発現しており、係るα_d分子は、末梢血白血球によっては低レベルで発現されていることが前記のごとくに示されている。実施例17 ラットcDNAクローンの単離イヌ及びヒトα_dサブユニットの双方が存在することに鑑みて、ラット（本実施例）及びマウス（実施例17、下記）を含む、他の種における相同な遺伝子の単離を試みた。ヒトα_d遺伝子と相同性を示すラットcDNAの部分配列を、ラット脾臓λgt10ライブラリー（クロンテック）から得た。ライブラリーは、150mmのLBM/アガープレートに、２x10⁴pfu/プレートにて播いた。ライブラリーは、ハイボンド膜（アマーシャム）上に採取し、標準プロトコル（Sa mbrookら、Molecular Cloning:alaboratory manual、2.110頁）に記載の緩衝液を用いて、3分間変性し、3分間中和して次いで5分間洗浄した。直ちに、膜をストラタリンカー(Stratalinker)（ストラタジーン）の中に入れて、自動交差結合セット(autocrosslinking sett-ing)を用いてDNA交差結合を行った。膜を、それぞれ、低い及び高いストリンジェンシーの条件用に、30％または50％のホルムアミド中で、プレハイブリダイズ及びハイブリダイズした。最初に、クローン19A2 （配列番号：1）における第500〜2100位の塩基に対応する、ヒトcDNAから作製した³²P-ラベルプローブで、膜をスクリーニングした。ベーリンガーマンハイムランダムプライマーキットを用いて、製造業者の示したプロトコルに従い、プローブをラベルした。フィルターは55℃にて2 X SSCで洗浄した。ヒトα_d、ヒトCD11b、及びヒトCD11cとの相同性を示す配列である684.3及び70 5.1と称することとした２つのクローンを、同定した。いずれのクローンともヒトα_d遺伝子における3'領域に相応する(align)ものであり、クローン684.3については第1871位の塩基で始まり、第3012位の塩基にまで伸長しており、クローン 705.1については第1551〜3367位の塩基であった。 5'領域を包含する、より完全なラットの配列を単離するために、最初のスクリーニング用に採用したと同じプロトコルを用い、クローンA1160（実施例17、後掲）から作製したマウスのプローブを用いて、同じライブラリーを再スクリーニングした。第２回目のスクリーニングから、単一の、単離プラークを選択し、LB M/アガープレート上に、単一のクローンとして維持した。配列決定用のDNAを作製するための標準PCRプロトコルにおいて、配列決定用プライマー434FL及び434FR（それぞれ、配列番号：34及び35）を用いた。 PCRから得たDNAを、クイック・スピン・カラム（クィアゲン）を用いて、製造業者の示したプロトコルに従って、精製した。クローン684.3及び705.1と重複した、741.4及び741.11と称することとした２つのクローンを同定したが、この重複した領域において、クローン741.1と741.1 1は、クローン684.3及び705.1と100％の相同性を有していた。ヒトα_d遺伝子と相同性を有する合成(composite)ラットcDNAを、配列番号：36で示し、予測されるアミノ酸配列を、配列番号：37で示す。ラットα_dの5'端部のクローニングラットα，遺伝子に対する５’cDNA断片を、クロンテツクラツト脾臓RACEクローニングキットを用い、製造業者の示したプロトコルに従って得た。用いた遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、741.11#2R及び741.2#1R（それぞれ、配列番号：59及び58）と称することとした。オリゴ741.11#2Rは、配列番号：36における第131〜152位の塩基対にわたっており逆方向であって、741.2#1Rは、配列番号：36 の第696〜715位の塩基対にわたり、やはり逆方向である。第一次のPCRは、最も3 '-側であるオリゴ741.2#1Rを用いて行った。オリゴ741.11#2R及び第一次反応から作製したDNAを用いた第二次のPCRを、続けて行った。およそ300塩基対のバンドを、1％アガロースゲルで検出した。第二次のPCR産物を、製造業者の示したプロトコルに従って、プラスミドpCRTA II（インビトロゲン）の中に連結した。白色（陽性）コロニーを拾いあげて、50 mg/mlのカルベニシリン保存溶液1μl及びM13 K07ファージ培養液1μlを含有する 100μlのLBMを個々のウェルに含む、丸底96ウェル組織培養プレートの中に加えた。混合液は、37℃にて30分〜1時間インキュベートした。最初のインキュベーション時間に続いて、100μlのLBM（50mg/mlのカルベニシリン1μl及び10mg/ml のカナマイシン保存溶液を1:250の希釈倍率で含有するもの）を添加し、インキュベーションを37℃にて一晩継続した。滅菌96ウェル金属製転写用プロング(prong)を用いて、96ウェルプレートから上清を、4枚のアマーシャムハイボンドナイロンフィルターに転写した。標準プロトコルにより、フィルターを変性させ、中和して、交差結合させた。フィルターは、50℃にて数時間、振動しながら、20mlのプレハイブリダイゼーション用緩衝液（5 X SSPE、5Xデンハーツ、1％ SDS、50ugs/ml変性サケ精子DNA）中でプレハイブリダイゼーションを行った。オリゴプローブ741.11#1及び741.11#1R（それぞれ配列番号：56及び57）は、第86〜105位の塩基対（配列番号：36）で、それぞれ正方向及び逆方向に向かうものであるか、以下のようにラベルした。 12μlのdH₂O中、およそ65ngのオリゴDNAを、65℃にて2分間加熱した。10mCi/ml γ^-32P-ATPを3μl、5xキナーゼ緩衝液（ギブコ）4μl及びT4 DNAキナーゼ（キブコ）１μlとともに添加した。混合液は、37℃にて30分間インキュベートした。インキュベーションに続き、各ラベルしたオリゴプローブ16μlを、プレハイブリダイゼーション用緩衝液及びフィルターに添加し、42℃にて一晩、ハイブリダイゼーションを継続した。5 X SSPE、0.1％ SDS中で、1回当たり5分間、室温にてフィルターを洗浄し、6時間オートラジオグラフィーにかけた。陽性クローンを増やし(expand)て、製造業者が示したプロトコルに従って、マジック・ミニ・プレップ・キット(Magic Mini Prep Kit)（プロメガ）を用いてDNAを精製した。クローン2F7を配列決定用に選択し、その結果、741.11と重複する領域で100％の相同性が示された。完全なラットのα_d核酸配列を配列番号：54に示し、そのアミノ酸配列を配列番号：55に示す。ラットcDNA及びアミノ酸配列の特性ラツトのβ₂インテグリンαサブユニットについては、核酸配列もアミノ酸配列もこれまでに報告されていない。しかしながら、報告されているヒトβ₂インテグリンαサブユニットとの配列の比較により、単離されたラットのクローン及び、その予測されるアミノ酸配列が、α_dヌクレオチド配列及びそのアミノ酸配列に最も密接に関連していることが示唆される。核酸レベルでは、単離されたラットcDNAクローンは、ヒトα_dcDNAと比較すると80％の同一性を示し、ヒトCD11bと比較すると68％の同一性、ヒトCD11cと比較すると70％の同一性、及びマウスCD11bと比較すると65％の同一性が示される。ヒトCD11a及びマウスCD11a と比較すると、有意な同一性は見出されない。アミノ酸レベルでは、単離されたcDNAがコードする、予測されるラットのポリペプチドは、ヒトα_dポリペプチドと比較すると70％の同一性を示し、ヒトCD11a と比較すると28％の同一性、ヒトCD11bと比較すると58％の同一性、ヒトCD11cと比較すると61％の同一性、マウスCD11aと比較すると28％の同一性、そしてマウスCD11bと比較すると55％の同一性を示す。実施例18 齧歯類α_d特異抗体の生産及び特徴付けＡ．ラットα_dIドメイン/Hu IgG4融合タンパク質に対するモノクローナル抗体ヒトβ₂インテグリンのIドメインがリガンド結合に関与していると証明されている事実に鑑みて、ラットα_dタンパク質についても同じことがあてはまるであろうことが推定された。従って、ラットα_dIドメインに免疫特異性を有するモノクローナル抗体が、α_d結合が関連するヒトの疾患状態のラットにおけるモデルで有用であるかもしれない。「ラットアルファ-D15」（配列番号：87）及び「ラットアルファ-D13」（配列番号：88）のオリゴを、配列番号：54の、それぞれ、第469〜493位の塩基対及び第1101〜1125位の塩基対（逆方向で）に対応するラットα_d配列から作製した。それらのオリゴを、配列番号：54の第459〜1125位の塩基対にわたるIドメインを含むラットα_dDNA断片を作製するために、標準PCR反応において用いた。PCR産物を、製造業者のプロトコルに従って、ベクターpCRTAII（インビトロゲン）へと連結した。陽性コロニーを選択し、製造業者のプロトコルに従って、クィアゲン（Chatswoth、ジョージア州）ミディ・プレップ・キットを用いたDNA精製用に、増やした。DNAを、標準の制限酵素消化においてXhoI及びBglIIで消化し、600塩基対のバンドをゲル上で精製し、続いてそれを、pDCS1/HuIgG4発現ベクターへと連結した。陽性コロニーを選択し、増やして、クィアゲンマキシ・プレップ・キット(Maxi Prep Kit)を用いてDNA精製を行った。 COS細胞は、100mmの培養皿に半分の集密度に播き、7％CO₂中で37℃にて一晩生育した。細胞は5mlのDMEMですすいだ。5mlのDMEMに、50μlのDEAE-デキストラン、2μlのクロロキン及び15μgの前記ラットα_dIドメイン/HuIgG4 DNAを添加した。COS細胞にこの混合液を添加し、37℃にて3時間インキュベートした。次に培地を除去し、10％DMSOのCMF-PBS溶液5mlを、正確に1分間のあいだに添加した。細胞は、DMEMで１回、穏やかにすすいだ。10％FBSを含有する10mlのDMEMを細胞に添加し、7％CO₂中で37℃にて一晩インキュベーションを続けた。翌日、培地を新鮮な培地と交換し、さらに3日間、インキュベーションを続けた。培地を採集し、新鮮な培地をプレートに加えた。3日後に、再び培地を集め、プレートは廃棄した。この手法を、2リットルの培養上清を集めるまで繰り返した。前記のようにして集めた上清は、プロセップ-Aカラム（バイオプロセッシング）に負荷し、下記のようにタンパク質を精製した。最初にカラムは、35mMトリス及び150mM NaCl、pH7.5を含有する洗浄用緩衝液をカラム容量の15倍用いて洗浄しておいた。1時間当たりカラム容量のおよそ60 倍を下回るゆっくりした速度で上清を負荷した。負荷後、カラムの15倍容量の洗浄用緩衝液、カラムの15倍容量の0.55Mジエタノールアミン、pH8.5、カラムの15 倍容量の50mMクエン酸、pH5.0でカラムを洗浄した。タンパク質は、50mMクエン酸、pH3.0で溶出した。タンパク質を1.0Mトリス、p H8.0で中和し、滅菌PBS中に透析した。ラットα_dIドメインタンパク質は、実施例14に記載のように分析した。検出したタンパク質は、ヒトIドメインタンパク質で観察されたと同様の挙動をした。Ｂ．ラットα_dIドメイン/HuIgG4融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の生産予め、等量のフロインド完全アジュバント（FCA）（シグマ）の中に乳化しておいた、精製したラットα_dIドメイン/HuIgG4融合タンパク質50μgで、マウスを個々に免疫付与した。およそ200μlの抗原／アジュバント調製物を、各マウスの背部及び横腹部の４箇所に注射した。2週間後、予め、等量のフロインド不完全アジュバント（FIA）の中に乳化しておいた、ラットα_dIドメイン/HuIgG4抗原（ 50μg／マウス）を、100μl注射してマウスに追加免疫した。さらに2週間の後、 200μlのPBSに溶解した50μgの抗原を静脈注射して、マウスに追加免疫を施した。免疫付与したマウスの血清のタイターを評価するため、第３回目の免疫付与10 日後に、眼窩後方での採血を実施した。血液は凝血(clot)を許容し、遠心により血清を単離した。血消は、ビオチン化した（BIP）ラット脾臓細胞に対する免疫沈降に用いた。各マウスからの血清は、ラットα_d及びラットCD18に対して予測される分子量のタンパク質バンドを免疫沈降せしめた。１匹のマウスを融合用に選択し、そして第３回目の追加免疫について前記したと同様に第４回目の追加免疫を行った。ハイブリドーマの上清を、以下のように抗体捕捉によりスクリーニングした。イムノロン4プレート（ダイナテック、Cambridge、マサチューセッツ州）を、50 mM炭酸塩緩衝液、pH 9.6で1:5000に希釈したヤギ抗−マウスIgA、IgGまたはIgM（オーガノン・テタニカ）、50μl/ウェルで、4℃にて被覆した。プレートを0.05％ツイーン20を含有するPBS（PBST）で３度洗浄し、50μlの培養上清を添加した。37℃にて30分間インキュベートし、前記のように洗浄した後、PBSTで1:3500に希釈した50μlのホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウスIgG9(Fc)（ジャクソン・イムノリサーチ(ImmunoResearch)、West Grove、ペンシルベニア州）を添加した。前記と同様にプレートをインキュベートし、PBSTで４度洗浄した。その直後に、100mMクエン酸、pH4.5中に１mg/mlのo-フェニレンジアミン（シグマ）及び0.1 μl/mlの30％H₂O₂を含有する基質溶液100μlを添加した。発色反応は、5分後に1 5％H₂SO₄を50μl添加して停止した。ダイナテックプレートリーダーで、490nmにおける吸光度を読みとった。抗体を含有するウェル由来の上清は、固定化したラットα_dIドメイン/HuIgG4 融合タンパク質を用いたELISAによっても分析した。HuIgG4抗体を被覆したプレートを用いたELISAは、IgGの融合パートナーに対しての反応性についてのコントロールとして、役立った。陽性のウェルを、下記の技術を用いたラット脾臓細胞溶解物へのBIPによるさらなるスクリーニング用に、選択した。Ｃ．ラットα_dIドメイン/HuIgG4融合タンパク質に対するポリクローナル血清の生産２羽のウサギを、免疫付与する前に予備採血し、免疫は完全フロインドアジュバント中、精製されたラットα_dIドメイン/HuIgG4融合タンパク質100μgを用いて行った。不完全フロインドアジュバント（IFA）中にて３週毎に同量ずつ、注射を繰り返した。３回注射した後、ウサギから試験用に採血し、ここで集めた血清を、ラット脾臓細胞溶解液についての標準免疫沈降において使用した。双方のウサギ由来の血清が、ラットα_dと免疫反応性を有することが確かめられた。これらのウサギを、IFA中100μgの抗原を用いて再度追加免疫し、そして免疫沈降によって、集めた血清をラットα_dとの免疫反応性の増大についてアッセイした。10日後にウサギに最終の追加免疫を施し、採血して血清を集めた。ラットα_d組織学ラットα_d「I」ドメインに対して作製されたウサギポリクローナル血清を、実施例16に記載した技術によってラット組織切片の免疫組織化学的染色において使用した。凍結及びパラフィン埋設ラット脾臓切片上で検出された染色パターンは、本質的にはヒトα_dに対する抗体を用いて観察されたパターンと同様であり、赤脾髄全体にわたって個々の細胞が染色されていた。この染色パターンは、ラット CD11a、CD11b及びCD18に対するモノクローナル抗体を用いて観察された染色パターンとは異なっていた。加えて、胸腺において、皮質全体にわたる個々の細胞上に陽性染色パターンが認められた。これらの組織のいずれも、ウサギ免疫前血清を用いて染色すると全くシグナルが得られなかった。Ｄ．抗体特異性の分析ラットはCO₂を用い、窒息させることにより屠殺して、標準の外科的技術を用いて脾臓を摘出した。20mlのRPMI中、3ccのシリンジプランジャーでワイヤーメッシュに脾臓を穏やかに押し通すことにより、脾臓細胞を採集した。細胞は、50 mlのコニカルチューブに集め、適切な緩衝液で洗浄した。細胞を冷D-PBSで３回洗浄し、40mlのPBS中10⁸〜10⁹個の密度で再懸濁した。４ mgのNHS−ビオチン（ピアス）を細胞の懸濁液に添加し、室温にて正確に15分間、反応を継続させた。細胞をペレットとし、冷D-PBSで３回洗浄した。細胞を冷溶解用緩衝液（1％ NP-40、50mMトリス塩酸、pH8.0、150mM NaCl、2m M CaCl、2mM MgCl、ペプスタチンとロイペプチン及びアプロチニンの1:100溶液（細胞への添加直前に調整）、ならびに0.0001g PMSF結晶（細胞への添加直前に調整）中に10⁸細胞/mlの密度で再懸濁した。溶解液は、およそ30秒間ボルテックスをかけ、室温にて5分間インキュベートし、さらに氷上で15分間インキュベートした。溶解液を10,000 x gにて10分間遠心し、不溶性物質をペレットとした。上清は新しいチューブに集めて、4℃から-20℃の間の温度に保存した。細胞溶解液1mlを、200μlのプロテインAセファローススラリー（ザイメッド）とともに4℃にて一晩インキュベートすることによって、前処置した。前処置した溶解液を、エッペンドルフチューブに、試験すべき各抗体につき50μl/チューブずつ分注した。ポリクローナル血清25μlまたはモノクローナル抗体上清100〜 500μlを、前記の前処置した溶解液に添加し、得られた混液を回転させなから4 ℃にて2時間インキュベートした。その後、プロテインAセファロースビーズに結合し、PBS中のスラリーとした、100μlのウサギ抗−マウスIgG（ジャクソン）を添加し、回転させながら室温にて30分間インキュベーションを継続した。穏やかに遠心してビーズをペレットとし、冷洗浄用緩衝液（10mM HEPES、0.2M NaCl、1 ％トライトンX-100）で３回洗浄した。吸引して上清を除去し、10％メルカプトエタノールを含有する、20μlの2X SDS試料用緩衝液を添加した。試料を水浴中で2分間煮沸し、5％のSDS PAGEゲルの上に試料を負荷した。分離後、タンパク質を一晩定電流で、ニトロセルロースに転写した。ニトロセルロースフィルターは室温にて1時間、3％ BSAを含むTBS-Tでブロックし、ブロッキング用の緩衝液は除去した。ストレプトアビジン-HRP接合物（ジャクソン）を、0.1％BSAを含むTB S-Tで1:6000に希釈した溶液を添加し、室温にて30分間、インキュベーションを継続した。TBS-Tを用いて各々15分ずつ、フィルターを３回洗浄し、製造業者の示したプロトコルに従って、アマーシャムのECLキットを用いてオートラジオグラフィーにかけた。Ｅ．全長のラットα_dタンパク質に対するモノクローナル抗体の生産ラットα_dタンパク質の精製抗ラットα_dモノクローナル抗体の作製用の免疫原を調製するために、ラット脾臓細胞からラットα_dを精製した。およそ50匹の、12〜20週令の正常雌性Lewis ラットから脾臓を集め、微細なワイヤスクリーンに押し付けて通すことによって、その組織から単一細胞懸濁液をつくった。150mM NH₄Cl、10mM KHCO₃、0.1mM E DTA、pH7.4を含有する緩衝液中で溶解することによって赤血球を除去し、残存している白血球をリン酸緩衝性食塩水（PBS）を用いて２回洗浄した。脾臓細胞は遠心によってペレット化し、50mMトリス、150mM NaCl、2mM CaCl₂、2mM MgCl₂、 10mM PMSF、ロイペプチン、ペプスタチン及び1％トライトンX-100を含有する緩衝液中で溶解した。５×10⁸個の脾臓細胞当たり溶解用緩衝液1mlを用いて、氷上で30分間、脾臓細胞の溶解を行った。不溶性物質は、遠心によって除去した。 CD11a、CD11b及びCD11cは、以下の通りに免疫沈降によって脾臓溶解液から除去した。750μl容量のプロテインAセファローススラリーを、ウサギ抗マウスイムノグロブリン2mgと4℃にて30分間インキュベートした。ウサギ抗マウスプロテインAセファロースは、溶解用緩衝液を用いて３回洗浄し、最終容量1.5mlに溶解用緩衝液中へ懸濁した。それぞれおよそ200μgのラットβ₂インテグリン特異抗体（515F(ラットCD11aに対して特異的)、OX-42（ラットCD11bに対して特異的）及び100g(ラットCD11cに対して特異的)）を、各々50mlのラット脾臓溶解液に添加した。4℃にて30分間インキュベートした後、500μlのウサギ抗マウスプロテインAセファロースを、その脾臓溶解液に添加し、エンドーオーバーエンド回転で30分間4℃にて混合した。溶解液は、ウサギ抗マウスプロテインAセファロースに結合したCD11a、CD11b、及びCD11cをペレット化するために25 00×gで10分間遠心し、その上清は50mlのきれいな遠心チューブに移した。CD11a 、CD11b、及びCD11cの完全な除去を保証するために、抗体515F、OX-42、及び100 gを用いた免疫沈降をさらに２回繰り返した。溶解液中に残存するβ₂インテグリンを、アフィニティー精製を使用して単離した。CNBrセファロースに接合した抗ラットCD18モノクローナル抗体2OC5Bのスラリーおよそ250μlを溶解液に添加し、そして4℃にて30分間、エンド−オーバー−エンド回転で混合した。抗体／抗原複合体は、2500×gにて10分間遠心することによってペレット化し、そのペレットは、4℃にて保存する前に溶解用緩衝液を用いて３回洗浄した。アルメニアハムスターの免疫付与 6〜8週令のアルメニアハムスターを、完全フロインドアジュバント中に乳化した、ヒトIgG₄重鎖に融合したラットα_dのIドメインからなるおよそ50μgの組換えタンパク質で、先ず免疫付与した。一次免疫の後、第14、33、及び95日に不完全フロインドアジュバント中に乳化したラットα_dIドメイン/HuIgG₄で引き続き免疫付与した。次いで、197及び199と命名した２つの別々の融合を実施した。融合197の４日前（第306日）に、１匹のハムスターに、脾臓細胞から精製したラットα_dタンパク質とラットα_dでトランスフェタトされたCHO細胞とを組み合わせて投与した。融合の3日前（第307日）に、精製したラットα_dタンパク質と α_dがトランスフェクトされたCHO細胞を用いて、追加免疫を行った。ラットα_d がトランスフェクトされたCHO細胞は、下記の通りに調製した。全長のラットα_dタンパク質をコードしている遺伝子セグメントを、pDC1ベクターへと挿入し、ヒトCD18-pRC構築体と一緒にCHO細胞へとエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、pRC構築体で首尾良くトランスフェクトされた細胞を選択するためにヒポキサンチンの存在下で、そして、pDC1構築体でトランスフェクトされた細胞を選択するためにg4 18の存在下で生育した。３週間後に、ラットα_d特異的ウサギポリクローナル血清で細胞を染色し、FACSによって分別した。表面α_dを最も高レベルで発現していた少量の細胞（個体総数のおよそ3％）を集めて、さらに増殖させた。FACS選択を数回繰り返して、α_dの表面発現のレベルが高い個体細胞を準備した。 α_dがトランスフェクトされた細胞は、ラットα_d特異的ポリクローナル血清及びヒトCD18特異的モノクローナル抗体TS1.18.1を使用してフローサイトメトリーによってその特徴を調べた。その結果、トランスフェクトされたCHO細胞は、ラットα_d 及びヒトCD18の両方を、高レベルで発現していることが確認された。最後に、細胞内でのα_d及びCD18発現を、免疫沈降によって評価した。ラット α_d特異的ウサキポリタローナル血清は、およそ170kDの、比較的高分子量のタンパク質（単数または複数）と、これよりも低分子量の95kDのタンパク質（単数または複数）という、２つの相違する分子量を有するタンパク質を免疫沈降させることが見出された。これらの知見は、トランスフェクトされたCHO細胞の表面上の、ラットα_d/ヒトCD18ヘテロダイマー複合体の発現に一致するものであった。融合の日に脾臓を摘出し、2mM L-グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、10 0単位／mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清のRP MI 1640（RPMI）(ギブコ、カナダ)の中に沈めた２枚のガラス顕微鏡スライドの磨りガラス状の端部の間で組織を擦り潰すことによって、単一細胞の懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、70メッシュの、滅菌したナイテックス細胞濾過器（ベクトン・ディッキンソン、Parsippany、ニュージャージー州）を通して濾過し、そして、200×ｇで5分間遠心分離し、得られたペレットを20mlの無血清RPMI中に再懸濁することにより２度洗浄した。３匹の未処置Balb/cマウスから摘出した胸腺細胞を、同様に調製した。前記のように、10％フィータルクローン血清(FBS)(ハイクローンラボラトリーズ、Logan、ユタ州)を含むRPMI中にて融合の前に対数増殖期に３日間保持しておいたNS-1ミエローマ細胞は、200×ｇで5分間遠心分離し、ペレットを２回洗浄した。およそ1.15×10⁸個の脾臓細胞を、5.8×10⁷個のNS-1細胞と合わせ、遠心してその上清は吸引することによって除去した。チューブを軽くたたくことにより、細胞ペレットを変位させ、37 ℃のPEG1500（75mM Hepes、pH8.0中50％）（ベーリンガーマンハイム）の7mlを、1分間にわたってかき混ぜながら加え、続いて、無血清RPMI 14mlを7分間かけて加えた。さらに8mlのRPMIを添加し、細胞を200×ｇで10分間遠心分離した。上清は除去し、ペレットを、15％FBS、100mMヒポキサンチンナトリウム、0.4mMアミノプテリン、16mMチミジン(HAT)(ギブコ)、25単位/ml IL-6(ベーリンガーマンハイム)及び1.5×10⁶個の胸腺細胞/mlを含む、200mlのRPMI中に再懸濁した。懸濁液は、96ウェル平底組織培養プレート（コーニング、連合王国）に、ウェル当たり200μlで10個のウェルに分配し、18Ｇの針（ベクトン・ディッキンソン）を用いて各々のウェルからおよそ100μlを吸引し、そして100μlの培養用培地（胸腺細胞を欠いていること以外は、前記に同じ）を加えることによって、融合後4 、5、6、及び7日目に細胞へ栄養を供給した。 10日目に、融合体からの上清を、フローサイトメトリーによって、ラットα_d ／ヒトCD18でトランスフェクトされた細胞との反応性についてスクリーニングした。ラットα_dでトランスフェクトされたおよそ5×10⁵の細胞を、2.0％FBS及び0 .05％アジ化ナトリウムを含有する50μlのRPMI中に懸濁し、96ウェルの丸底プレート中に入れたおよそ100μlのハイブリドーマ培養上清に添加した。染色用の陽性コントロールには、ウサギ抗α_dポリクローナル血清及びTS1/18（抗ヒトCD18 ）が含まれていた。細胞を氷上で30分間インキュベートし、FACS緩衝液（RPMI、 2.0％FBS、0.05％アジ化ナトリウム）中で３回洗浄し、次いでFACS緩衝液中の最終的な希釈率が1：200としたFITC接合ヤギ抗ハムスター抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）と氷上で30分間インキユベートした。細胞をFACS 緩衝液中で３回洗浄し、200mlのFACS緩衝液に再懸濁した。試料は、ベクトン・ディッキンソンFACscanアナライザーで分析した。陽性クローンのウェルがラットα_dに対して特異的であることを保証するために、トランスフェクトされていないCHO細胞でスクリーニングを繰り返した。ラットα_dのCHOトランスフェクト体と反応し、トランスフェクトされていないCHO細胞とは反応しないという基準に見合うウェルをクローニングした。第一次スクリーニングの後、RPMI、15％FBS、100mMヒポキサンチンナトリウム、16mMチミジン、及び10単位/ml IL-6中で倍希釈、続いて限界希釈することによって、陽性ウェルからの細胞を先ずクローニングした。限界希釈の工程で、生育を示すウェルの割合を調べ、ポアソン分布分析を使用してクローニング度を予測した。生育を示すウェルを、10〜12日後にFACSによって分析した。最終のクローニングの後、11％FBSを含むRPMI中で陽性ウェルを増殖させた。クローニングによって、これらの基準により陽性であると推量される１つの培養物を得て、これより197A-1、197A-2、197A-3、及び197A-4と命名された、４つの別個のサブクローンを増殖させた。融合199に先駆けて、第307日にラットα_dがトランスフェクトされたCHO細胞を 2.3×10⁶個用いて、第２のハムスターを追加免疫した。融合4日前（第334日）と融合3日前（第355日）に再度の、２度の最終免疫を行った。第334日における追加免疫は、腹腔内注射によって行い、これは、ラットα_dがトランスフェクトされた2×10⁶のCHO細胞と、セファロースに結合された精製ラットα_d200μl（前記の通り）からなるものを用いた。第335日目の追加免疫は、ラットα_dがトランスフェクトされたCHO細胞5×10⁶個からなり、やはり腹腔内注射によって行った。融合199のための融合及びスクリーニングのプロトコルは融合197と同様であって、その上清がラットα_dと反応性を有する３つのハイブリドーマが同定及びクローニングされ、これらを、199A、199H、及び199M と命名した。199Mと命名されたハイブリドーマは、郵便番号20852、メリーランド州、パークロウン、ロッタビル12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、1996年３月１日に寄託され、受託番号HB-12058を付与された。ラットα_dに対するモノクローナル抗体の特徴付け抗ラットα_d抗体を特徴付けするために、ビオチンでラベルした脾臓溶解液を、実施例18、Ｄ節に前記した通りに調製した。免疫沈降にて使用する前に、溶解液を予備精製した。最初に、50μg/mlの正常ネズミイムノグロブリンを溶解液に加え、得られた溶液を、4℃にて30分間エンドーオーバーエンド回転で混合した。ウサギ抗マウスイムノグロブリンで被覆されたプロテインAセファロースのスラリー75μlを加えて、エンド−オーバー−エンド回転で混合を30分間継続した。係るウサギ抗マウスイムノグロブリンが被覆されたプロテインAビーズを、卓上ミクロ遠心分離器において4℃にて5分間、15,000rpmで遠心分離することによってペレット化し、その上清を集めた。ペレット化されたものは廃棄した。クローニングした各ハイブリドーマにつき、エッペンドルフミクロ遠心チューブにおよそ300μlの上清を入れ、これに30μlの10％トライトンX-100、30μlのペプスタチン、ロイペプチン及びアプロチニンの100倍保存用溶液、100μgのPMS F結晶、ならびに50μlの予備精製したビオチン化ラット脾臓溶解液を添加した。試料に穏やかにボルテックスをかけ、4℃にて30分間、エンド−オーバー−エンド回転機に付した。コントロールの試料は、50μlのラット脾臓溶解液に10mg/ml のウサギ抗ラットα_d 特異ポリクローナル抗体を添加することによって調製した。 30分間インキュベートした後、PBSスラリーとした75μlのプロテインAセファロースビーズを各試料に加えて、4℃にて30分間、エンド−オーバー−エンド回転しながらインキュベートした。プロテインAがカップリングしたビーズを、卓上ミクロ遠心分離器において4℃にて5分間、15,000rpmで遠心分離することによってペレット化し、その上清を集めた。ペレット化したビーズは、以下の一連の洗浄剤１mlを用いて連続的に洗浄した。一連の洗浄剤とはすなわち、10mMトリス、400mM NaCl、1.0％トライトンX-100、pH8.0を含有する緩衝液#１、10mMトリス、400mM NaCl、0.5％ライトンX-100、pH8.0を含有する緩衝液#2、10mMトリス、4 00mM NaCl、1.0％トライトンX-100、0.1％デオキシコール酸塩、pH8.0を含有する緩衝液#3、及び10mMトリス、400mM NaCl、0.5mM LiCl₂、pH8.0を含有する緩衝液#4であった。洗浄用緩衝液＃１を用いて最終洗浄を行った。各洗浄工程の間に、ビーズに穏やかにボルテックスをかけ、そして卓上ミクロ遠心分離器を使用してペレット化した。移し替え用のピペットで上清を除去し、最終洗浄の後に、ハミルトンシリンジで残存している緩衝液をすべてビーズから除去した。ブロムフェノールブルー及びピロニンY染料ならびにβ-メルカプトエタノールを10％の最終濃度で含有するSDS試料用緩衝液の50μlアリコートを各ペレットに加えた。混合液を1〜2分間、激しいボルテックスに付し、室温にて5〜10分間インキュベートした。試料を、卓上ミクロ遠心分離器において4℃にて5分間、15,000rpmで遠心分離し、遊離したタンパク質を集めて、新しいミクロ遠心チューブに移した。 7.5％のSDS-PAGEゲルに供する前に、各試料からのアリコートを、水浴にて4分間煮沸した。PAGEによる分離の後、200mAmpにて1時間かけてニトロセルロースフィルターにタンパク質を転写し、そして4℃にて終夜、3.0％BSA/TBS-Tの溶液中でフィルターをブロッキングした。ストレプトアビジン-OPDの1：6000希釈液を含有する0.1％BSA-TBS-Tの溶液を各フィルターに加えて、室温にて1時間インキュベーションを継続させた。TBS-T中でそれぞれ10分間、５回ずつフィルターを洗浄し、製造業者のプロトコルに従って、アマーシャムのECLキットを使用して発色させた。クローン199Mは、ヘテロダイマータンパク質を免疫沈降することが見出された。大きい方のタンパク質サブユニットは、およそ170〜175kDの分子量を有しており、ウサギ抗ラットα_dポリクローナルコントロールによって免疫沈降されるタンパク質のサイズと一致していた。第２のタンパク質も、CD18の分子量と一致する、およそ95kDの分子量で沈降した。実施例19 マウスcDNAクローンの単離マウスα_d類似体の単離を試みた。２つの、PCRで作製したプローブ、すなわち、ヒトクローン19A2（配列番号：1 ）の第522〜2047位の塩基に対応する1.5kbの断片、及びヒトクローン19A2（配列番号：1）の第1900〜2900位の塩基に対応する1.0kbのラットの断片を用いて、種交差ハイブリダイゼーションを、実施した。ヒトのプローブはそれぞれ配列番号：38及び39で示される、ATM-2及び9-10.1と称したプライマーの対を用いてPCRにより作製し、ラットのプローブはそれぞれ配列番号：34及び35で示される、434L 及び434Rのプライマーの対を用いて作製した。試料を94℃にて4分間インキュベートし、94℃、50℃にて2分間、72℃にて4分間、の温度での工程継続を行う30サイクルに付した。 PCR産物は、製造業者のプロトコルに従ってクィアゲンクイック・スピン・キットを用いて精製し、およそ180ngのDNAを、ベーリンガーマンハイムランダムプライマーラベリングキットを用い、製造業者の示したプロトコルに従って、20 0μCi[³²P]-dCTPでラベルした。取り込まれなかった同位体は、セントリ-セップ・スピン・カラム(Centri-sep Spin Column)（プリンストン・セパレーションズ (Princeton Separations)、Adelphia、ニュージャージー州）を用いて、製造業者が示したプロトコルに従って除去した。使用前に、プローブは、0.2N NaOHを用いて変性し、0.4Mトリス塩酸、pH8.0で中和した。マウス胸腺のオリゴdT-プライムした、λZAPII（ストラタジーン）の中のcDNA ライブラリーは、15cmプレート当たりおよそ30,000プラークで播いた。ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー・アンド・シュエル、Keene、ニューハンプシャー州）上のプラーク採取物は30％ホルムアミドを含有するプレハイブリダイゼーション用溶液（8ml/採取物）中で振動させなから50℃にて１時間インキュベートした。ラベルしたヒト及びラットプローブをプレハイブリダイゼーション用溶液に添加し、50℃にて一晩、インキュベーションを継続した。フィルターを、2 X SSC/0.1％SDSで室温にて２回、2 X SSC/0.1％ SDSで37℃にて１回、そして42℃にて2 X SSC/0.1％ SDSで１回洗浄した。フィルターを、補力スクリーンとともに27時間、-80℃にて、コダックX-Omat ARフィルムに露光した。二重に行ったものの採取物上に陽性のシグナルを与える4つのプラークを、マグネシウムを含むLB培地（LBM）／カルベニシリン（100mg/ml）プレートに再び塗布し、37℃にて一晩インキュベートした。ハイボンドフィルター（アマーシャム）にファージプラークを採取し、初回のスクリーニングと同様にプローブと反応させ、補力スクリーンとともに24時間、-80℃にて、コダックX -Omat ARフィルムに露光した。陽性シグナルを与える12のプラークを、10mMトリス塩酸及び1mM MgCl₂を含有する低Mg⁺⁺ファージ希釈液の中に移した。インサートのサイズは、T3及びT7プライマー（それぞれ、配列番号：13及び14）を用い、以下の反応条件下でPCRを行うことによる増幅によって調べた。試料は、94℃にて4分間インキュベートし、9 4℃で15秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間の温度での工程継続を行う30サイクルに付した。６つの試料より、300塩基から1kbのサイズの領域にある、明瞭なバンドが得られた。ヘルパーファージとともに共感染することを介して、ファージミドを放出させ、それを再び環化して、ブルースクリプトSK^-（ストラタジーン）を作製した。得られたコロニーをLBM/カルベニシリン（100mg/ml）で一晩培養した。プロメガウィザードミニプレップキット（Madison、ウィスコンシン州）で、製造業者か示したプロトコルに従ってDNAを単離した。精製したDNAのEcoRI制限酵素分析により、PCRを用いて検出した分子量が確認された。DNAインサートは、それぞれ配列番号：40及び41に示す、M13及びM13 reverse.1プライマーを用いて配列決定した。配列決定は、実施例４に記載のように実施した。６つのクローンのうち、10.3-1及び10.5-2と称した２つのみで、配列の情報が得られ、これらは同一の600bpの断片であった。600bpの配列はヒトα_dの対応する領域に対し68％の同一性を有し、ヒトCD11aに40％の同一性、ヒトCD11cに58％の同一性、そしてマウスCD11bに54％の同一性を有していた。その後、マウスα_d 相同体と推定されるものをコードする、より完全なcDNAを単離するために、この 600bpの断片を利用した。マウス脾臓の、λZAPII（ストラタジーン）の中のcDNAライブラリー（オリゴd T-且つランダムプライムしたもの）を、15cmのLBMプレート当たり2.5x10⁴ファージ数で播いた。プラークをハイボンドナイロン転写膜（アマーシャム）上に採取し、0.5M NaOH/1.5M NaClを用いて変性し、0.5Mトリス塩基/1.5M NaCl/11.6 HCl で中相し、2 X SSCで洗浄した。紫外線照射により、フィルターにDNAを交差結合させた。およそ500,000のプラークを、前記と同様に予めラベルしたプローブ10.3-1及び10.5-2を用いてスクリーニングした。プローブをプレハイブリダイゼーション用溶液に添加して、50℃にて一晩インキュベートした。フィルターを、2 X SSC/ 0.1％ SDSで室温にて２回、2 X SSC/0.1％ SDSで37℃にて１回、そして42℃にて 2 X SSC/0.1％ SDSで１回洗浄した。フィルターを、補力スクリーンとともに24 時間、-80℃にて、コダックX-Omat ARフィルムに露光した。二重に行ったものの採取物上に陽性のシグナルを与える14のプラークを、第二次のスクリーニングに付したがここで、2 X SSC/0.1％ SDSで50℃にて、0.5 X SSC/0.1％SDSで50℃にて、そして55℃にて0.2 X SSC/0.1％ SDSで、さらに追加として最終的に高いストリンジェンシーをもって洗浄したこと以外は、最初のスクリーニングと同様に行った。フィルターは、補力スクリーンとともに13時間、-80℃にて、コダックX-Omat ARフィルムに露光した。 18の陽性プラークを、低Mg⁺⁺ｆファージ希釈液の中に移し、インサートのサイズを、前記と同様にPCR増幅によって調べた。試料のうち７つが、600bpから4kb のサイズの領域にある、単一バンドを与えた。精製したDNAのEcoRI制限酵素分析により、PCRを用いて観察した分子量が確認され、DNAは、M13及びM13reverse.1 プライマー（それぞれ配列番号：40及び41）を用いて配列決定した。 B3800と称することとした１つのクローンは、ヒトα_d19A2クローンの5'末端の下流200塩基対の領域に対応し、3'非翻訳領域の553塩基を包含する4kbのインサートを含むものであった。クローンB3800は、ヒトα_dの対応する領域と77％の同一性を示し、ヒトCD11aの対応する領域と44％の同一性、ヒトCD11cの対応する領域と59％の同一性、及びマウスCD11bの対応する領域と51％の同一性を示した。第２のクローンA1160は、ヒトα_dのコード領域5'末端の、開始のメチオニンのおよそ12核酸だけ下流に相応する、1.2kbのインサートである。クローンA1160は、ヒトα_dの対応する領域と75％の同一性を示し、ヒトCD11aの対応する領域と46％の同一性、ヒトCD11cの対応する領域と62％の同一性、及びマウスCD11bの対応する領域と66％の同一性を示した。クローンA1160は、ヒトのクローン19A2の5'末端により近い断片であるが、長さは1160塩基であり、クローンB3800の第205位の塩基に始まり第1134位の塩基に続く重複した領域を共有する。クローンA1160は、クローンB3800との重複領域に存在しない、110塩基の挿入（クローンA1160の第704〜814位の塩基）を有する。この挿入は、おそらくはエキソン−イントロンの境界と思われる部位で生じており（Flemingら、J.Immunol．150巻、480〜490頁(1993) ）、続いてクローンA1160及びB3800の連結を行う前に除去した。推定されるマウスα_dクローンの5'cDNA末端部の迅速な増幅 5'非翻訳配列及び開始のメチオニンを包含する、推定されるマウスα_dクローンの取り損なっている5'配列を得るために、RACE PCR（Frohman、「RACE:Rapid Amplification of cDNA Ends」、PCR Protocols:A Guide to Methods and Appli cations 、Innisら（出版）、28〜38頁、Academic Press:New York(1990)に掲載）を用いた。製造業者が示したプロトコルに従って、マウス脾臓RACE−レディ(R eady)キット（クロンテック、Palo Alto、カリホルニア州）を用いた。２つのアンチセンスの、遺伝子特異的なプライマーである、A1160 RACE-第一次及びA1160 RACE2-ネステッド(nested)（配列番号：42及び43）を設計して、第一次及びネステッドPCRを実施した。配列番号：42及び43のプライマーは、それぞれ、5'末端から302及び247塩基で始まる領域に対応する。PCRは、5'アンカープライマー（配列番号：44）及びキットとともに供給されたマウス脾臓cDNAを用いて、前記と同様に実施した。PCR産物の電気泳動により、およそ280塩基のサイズのバンドが現れ、これをTAクローニングキット（インビトロゲン）を用い、製造業者が示したプロトコルに従ってサブクローニングした。得られたコロニーを培養し、DNAを単離して配列決定した。5'配列の追加の60塩基がこの方法により同定され、これは配列番号：45 の第1〜60位の塩基に対応するものである。マウスcDNA及び予測されるアミノ酸配列の特徴付け推定されるヒトα_d相同体をコードするマウスのcDNAの組成配列を配列番号：4 5に示す。ヒトとマウスのクローンの細胞外ドメイン間の相同性は高いが、細胞質ドメイン間の相同性はわずか30％である。観察された多様性は、ヒト及びマウスのタンパク質間のC-末端での機能的な相違を示唆するかもしれない。さもなくば、細胞質ドメインにおける多様性は、スプライシングの多様性に起因するかまたは、さらなるβ₂インテグリン遺伝子の存在を示唆するものかもしれない。アミノ酸レベルでは、マウスCD11aと28％の同一性、マウスCD11bとは53％の同一性、ヒトCD11aとは28％の同一性、ヒトCD11bとは55％の同一性、ヒトCD11cとは59％の同一性、そしてヒトα_dとは70％の同一性を有するタンパク質（配列番号：46）が、マウスcDNAにより予測される。ヒトα_dの細胞質ドメインのアミノ酸配列と、マウスの相同体と推定されるものの細胞質ドメインのアミノ酸配列とを比較すると、同じ長さの領域であるが、異なる一次構造を有することが示される。これらの領域で配列の長さが類似していることから、スプライシングが相違するフォームというよりむしろ、種間で多様性を有することが示唆される。予測されるラットのポリペプチド（実施例16、前出）と比較すると、マウスとラットの細胞質ドメインは、60％を越える同一性を示す。実施例20 配列の証明用の追加のマウスα_dcDNAクローンの単離マウスα_dに対する実施例19に記載した核酸及びアミノ酸配列を証明するために、確認の目的で、追加のマウスの配列を単離した。マウス脾臓ランダムプライムライブラリーと、オリゴdT-プライムcDNAライブラリー（λZAP II（ストラタジーン）内）の両者を用いて、２つの相同なα_dプローブ（3'及び5'）でのハイブリダイゼーションにより、マウスcDNAの単離を行った。ライブラリーは15cmLBMプレート当たり、5x10⁵ファージを播いた。プラークをハイボンドナイロン膜（アマーシャム）に採取し、膜を変性（0.5M NaOH/1. 5M NaCl）し、中和（0.5Mトリス塩基/1.5M NaCl/11.6M HCl）し、洗浄（2 X SSC 塩溶液）した。紫外線照射により、フィルターにDNAを交差結合させた。以下の条件下でのPCR反応で、下記プライマーを用いて、プローブを作製した。試料は、94℃に4分間保ち、そして、以下のような温度で工程継続を行う30サイクルを実行した（パーキン−エルマー9600サーモサイクラー中、94℃で15秒間、50℃で30秒間、72℃で1分間）。 3'プローブはおよそ900塩基の長さであって、ヌクレオチド第2752〜3651位の領域にわたっており（配列番号：1において）（5'→3'）、それぞれ配列番号：6 9及び74に示されるプライマー11.b-1/2FOR11及び11.b-1/2REV2を用いて製造した。このプローブは、採取物の最初のセットにおいて用いた。 5'プローブはおよそ800塩基の長さであって、ヌクレオチド第149〜946位の領域にわたっており（配列番号：1において）（5'→3'）、それぞれ配列番号：50及び85に示されるプライマー11.b-1/2FOR1及び11.a-1/1REV1を用いて製造した。このプローブは、採取物の第２のセットにおいて用いた。第３の採取物のセットにおいては、前記のプローブの双方ともを、同じプレート上で用いた。およそ500,000のプラークを、実施例17に記載したと同様にラベルした前記からの2つのプローブを用いてスクリーニングした。ラベルしたプローブを、45％ホルムアミド溶液を含有するプレハイブリダイゼーション溶液に添加して、50℃ にて一晩インキュベートした。フィルターを、2 X SSC/0.1％ SDSで室温（22℃ ）にて２回洗浄した。最終段階の洗浄は、50℃にて、2 X SSC/0.1％ SDSで行った。オートラジオグラフィーは、補力スクリーンとともに19時間、-80℃にて、コダックX-Omat ARフィルムに対して行った。少なくとも二重に行ったものの採取物上に陽性のシグナルを与える13のプラークを、第二次のスクリーニングに付したが、このスクリーニングは、ハイブリダイゼーションに3'及び5'ラベルのプローブの双方を用いたことと、65℃にて2 X SSC/0.1％ SDSを用いた追加の最終的な洗浄を組み込んだことを除いては、最初のスクリーニングについて記載したと同様に実施した。オートラジオグラフィーは、前記と同様であり、2.5時間行った。陽性のシグナルを与える13のプラーク（MS2P1からMS2P13と称した）を、低Mg⁺ ⁺ ファージ希釈液の中に移した。インサートのサイズを、上記と同じ条件下でZAP II内のブルースクリプトファージミドにアニールするT3及びT7プライマー（配列は前記）を用い、PCR増幅（パーキン−エルマー9600サーモサイクラー）によって調べた。バンドのサイズは500塩基〜4kbの領域にあった。ファージミドを単離、調製し、そして、M13及びM13 reverse.1プライマー（それぞれ配列番号：40及び41）を用いて配列決定した。1 3のうち5つのクローン、すなわち、MS2P-3、MS2P-6、MS2P-9、MS2P-12、及びMS2 P-13を配列決定し、まとめて、5'端のおよそ200塩基から3'端で最初の終結コドンを越える約300の塩基までの領域が示された。最初にM13及びM13 reverse.1プライマー（それぞれ配列番号：40及び41）を用いて、実施例４に記載のように自動配列決定を実施し、各クローンの端部を配列決定して、構築体#17（配列番号：45）に対するその位置を調べた。各クローンは、次いで、その特定の領域に適したプライマー（下記）を用いて、完全に配列決定した。配列を編集し、アラインメントを行い、これより前に単離したマウスα_d配列（構築体#17、配列番号：45）と比較した。新しい配列のアラインメントにより、構築体#17では、第2308位のヌクレオチドにて始まる18の塩基の欠失か明らかとなったが、この欠失によって読み枠のシフトか惹起こされるものではなかった。前記のごとくに配列決定したクローンMS 2P-9でもまた、同じ18塩基が欠失していることが明らかとなった。この欠失は、当該領域を含むマウスクローンの50％で生じることが観察されたが、ラットまたはヒトα_dクローンにおいては検出されていない。1 8の塩基の欠失は、12塩基のパリンドローム配列AAGCAGGAGCTCCTGTGT（配列番号：91）によりその特徴が表される。核酸配列における、この逆方向の反復は、自己相補的であり、突出したループを形成するかもしれず、その結果逆転写の際に切断が生じうる。追加の18塩基を包含するマウスα_d配列を配列番号：52に示し、決定されたアミノ酸配列を配列番号：53に示す。実施例21 マウスにおけるin situハイブリダイゼーション次に、実施例６に記載したヒトにおけるα_dについての組織分布との比較を行うべく、マウスα_dについての組織分布を調べた。ネズミcDNAの細胞質尾部領域における第3460〜3707位のヌクレオチドに対応するDNAの鋳型から、³⁵S-UTP（アマーシャム）を取り込むin vitro RNA転写により、一本鎖の200bp mRNAプローブを作製した。マウス胎児全体（受胎後、11〜18日目に採集した）ならびに、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、及び胸腺を含む種々のマウス組織を、放射ラベルした一本鎖mRNAプローブで、in situにてハイブリダイズした。組織は、6μmの厚みの切片とし、ベクタボンド(Vectabond)（ベクター・ラボラトリーズ、Burlingame、カリホルニア州）を被覆したスライドに付着させ、-7 0℃にて保存した。使用前に、-70℃よりスライドを取り出し、およそ5分、50℃ に置いた。切片は4％パラホルムアルデヒド中、4℃にて20分間で固定し、エタノール濃度を勾配をつけて増大（70-95-100％、各濃度につき4℃にて1分間）して、脱水を行い、そして室温にて30分間風乾した。70％ホルムアミド/2 X SSC中、70℃にて2分間切片を変性し、2 X SSCで２回すすぎ、前記と同様にエタノール濃度勾配で脱水して、30分間風乾した。50 ％ホルムアミド、0.3M NaCl、20mMトリス塩酸、pH7.5、10％デキストラン硫酸、１Xデンハーツ溶液、100mMジチオスレイトール（DTT）及び5mMEDTAの最終濃度を与えるよう、6x10⁵cpm/切片の³⁵S-ラベルリボプローブ及びジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水を含有する溶液中で、55℃にて一晩（12〜16時間）ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、切片を4 X SSC/10mM DTTで室温にて１時間、50％ホルムアミド/2 X SSC/10mM DTTで60℃にて40分間、2 X SSCで室温にて30分間、及び、0.1 X SSCで室温にて30分間、洗浄した。切片を脱水し、２時間風乾して、コダックNTB2写真用乳剤で被覆して、2時間風乾し、現像して（完全な暗所で、4℃で保存した後）、さらにヘマトキシリン／エオシンで対比染色した。脾臓組織では、赤脾髄で主に強いシグナルが示された。このパターンは、脾臓における組織マクロファージ分布のパターンに一致するが、他の細胞のタイプもこの例にもれない。実施例22 マウス発現構築体の作製ヒトα_dと相同性を呈するマウスcDNA配列を包含する発現プラスミドを構築するために、クローンA1160及びB3800からのインサートの連結を行った。しかしながら、この連結に先立って、開始のメチオニンを含む5'リーダー配列を、クローンA1160に加えた。「5’PCRリーダー」（配列番号：47）と称することとしたプライマーは、(1)第1〜6位に、消化を許容する、同一の非特異的な塩基、(2)発現ベクターへのサブクローニングを容易とするための第7〜12位のBamHI切断部位（配列番号：47の下線部）、(3)第13〜18位のコンセンサスなコザック配列、(4)開始のメチオニンに対するコドン（配列番号：47の強調文字部）を含むシグナル配列、ならびに(5)プライマーのアニーリングを許容するための、クローンA1160より由来する特異的に重複する5'配列の、追加の31塩基を含むように設計した。「3'端フラッグ(frag)」（配列番号：48 ）と称することとした第２のプライマーを、「5’PCRリーダー」とともに用いて、クローンA1160からのインサートを増幅した。この結果得られたPCR産物は、BamHIで消化されず、制限酵素部位の前に不適当な数の塩基があって、この酵素による認識を妨げていることが示唆された。5'プライマー（配列番号：47）におけるBamHI部位の前にある「尾部」配列の長さを増し、第一次のPCRからの増幅産物についてPCRを繰り返した。mAD.5'.2と称することとした5'プライマー（配列番号：49）は、第1〜4位に追加の非特異的塩基、及び、これより前に用いた「5’PCRリーダー」プライマー配列と特異的に重複する追加の20塩基を合わせて設計した。鋳型として第一次の増幅からの産物を用いたPCRにおいて、プライマー「mAD.5 '.2」及び「3'端フラッグ」を共に使用した。その結果得られた第二次のPCR産物を、製造業者が示したプロトコルに従って、プラスミドpCRtmII（インビトロゲン）へとサブクローニングし、コンピテント・ワン(One)ショット細胞（インビトロゲン）に形質転換した。PCR産物を含む１つのクローンをBamHI及びEcoRIを用いて制限酵素分析により同定し、配列決定を行った。配列を確認した後、BamHI及びEcoRIを用いて消化することによりインサートを単離し、ゲルで精製した。クローンB3800由来のインサートは、EcoRI及びNotIを用いて消化することにより単離して、ゲルで精製し、付け加えたA1160のBamHI/EcoRI断片を包含する連結反応に添加した。連結反応は、14℃にて14時間進行させた。BamHI及びNotIを用いて消化したベクターpcDNA.3（インビトロゲン）を、追加のリガーゼとともに連結反応液に加え、さらに12時間、反応を続けた。反応混液の一部をコンピテントな大腸菌細胞へと形質転換し、得られたコロニーを培養して、プライマー11.b -1/2F0R1及び11.b-1/2REV11（それぞれ、配列番号：50及び51）を用いたPCR分析により１つの陽性クローンを同定した。これらのプライマーはA1160及びB3800にまたがるものであり、従って、増幅産物の検出により、２つの断片が連結されたことが示唆されるのである。陽性クローンの配列は、配列番号：50及び51に示すプライマーを用いて確認され、これは開始のメチオニンの後の第100〜1405位の塩基が増幅されるものであった。実施例23 ノックアウトマウスの構築推定されるマウスα_dcDNAがコードするタンパク質の免疫学的役割をより正確に評価するために、ノックアウトマウスを設計するが、ここでは、推定されるα_d 相同体をコードするゲノム DNA配列を相同組換えによって破壊する。それにより、破壊された遺伝子がコードするタンパク質の重要性が、コードするタンパク質が存在しないことによって評価されるのである。「ノックアウトマウス」の作製は、Dengら、Mol.Cell.Bio l．13巻、2134〜2140頁(1993)に記載されている。このようなマウスの設計は、相同組換えの発生により「ノックアウト」されるべき配列を含むプラスミドの構築に始まる。λFIXIIゲノムライブラリーから、推定されるα_d相同体をコードするマウスゲノム配列を同定するために、マウスc DNAの750塩基対の断片（配列番号：45の第1985〜2733位のヌクレオチドに対応する）を用いた。第一次のスクリーニングで14の陽性プラークが得られ、そのうち７つを第二次のスクリーニングによって確認した。最も強いシグナルを与えるプラークのうち２つから、液体溶解液を得て、通例の方法によってλDNAを単離した。制限酵素マッピング及びサザン分析によって、14-1と称した１つのクローンの真正さを確認し、NotIで消化することによりインサートDNAを単離した。この断片を、ブルースクリプトSKII⁺へとクローニングした。およそ9〜14kb（相同組換えの発生の成功の可能性を至適化すると報告される長さである）の制限酵素断片を同定するために、750bpのcDNAプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーションの前に、クローン14-1に対する制限酵素地図をつくっておいた。可能性を有する候補として 12kbの断片を同定し、チミジンキナーゼをコードするカセットの側部にマウスDN Aが配される位置で、この断片をpブルースクリプトSKII⁺へとサブクローニングした。Iドメインプローブ（配列番号：45の第454〜1064位のヌクレオチドに対応する）を用いたこのクローンのさらなる分析によって、このクローンがIドメインをコードする配列を含まないことが示唆された。同じIドメインプローブを用いて、λFIXIIゲノムライブラリーを再スクリーニングした。最初に６つの陽性クローンを検出し、そのうち１つが第二次のスクリーニングでもやはり陽性であった。このクローンから単離したDNAは、Iドメインプローブを用いたサザン分析で強い反応性を示した。しかしながら、元の750bp のプローブを用いると反応性は検出されず、したがって、このクローンが配列番号：45の第1985〜2773位のヌクレオチドに対して5'側の領域を包含することが示唆された。これとは異なって、750bpのプローブにハイブリダイゼーションしないことで、このクローンがインテグリンファミリーのタンパク質の他のメンバーであることが示されるかもしれない。この説明が妥当であるか否かを確かめるために、13 kbのインサートをpブルースクリプトSKII⁺へとサブクローニングした。配列番号：52の第441〜461位、第591〜612位、第717〜739位、及び逆向きの第898〜918位の、α_dIドメイン核酸配列に対応するプライマーを用いて、精製したDNAの配列決定を行った。最初の第4441〜4461位のプライマーを用いた場合にのみ、配列の情報が得られ、Iドメインの最も5'寄りのエキソンのみが、効率よく増幅されていた。Iドメインの残りの部分は、増幅されなかった。従って、得られたクローンは、マウスα_d遺伝子のエキソン6、ならびにそのエキソンの3'及び5'端部のイントロン配列を含んで成るものであった。エキソン７は、このクローンには見あたらなかった。配列決定の後、ネオマイシン耐性遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子を含む構築体を作製した。ネオマイシン耐性（neo^r）遺伝子は、マウスのゲノムDNAの、タンパク質をコードする配列を破壊するように、前記にて得られたプラスミドの中へと挿入する。従って、得られるプラスミドはマウスのゲノムDNA配列の中にneo^r遺伝子を包含し、すべて、チミジンキナーゼをコードする領域内に位置する。無作為の組換えよりも、相同組換えが有利になされるために、このようなプラスミドの構築が必須である（Chisakaら、Nat ure 355巻、516〜520頁(1992)）。実施例24 ウサギα_dのクローニング−ウサギcDNAライブラリーの構築及びスクリーニングラット及びマウスにおけるヒトα_dの相同体の同定から、後記するヒトの疾患状態のウサギでのモデルにおいて有用であろうと考えられる、ウサギの相同体の存在についての研究へと導かれることとなった。インビトロゲンファスト・トラック(FastTrack)キット（San Diego、カリホルニア州）を用い、製造業者が示したプロトコル及びそのキットとともに供給された試薬で、ウサギの脾臓全体からポリA⁺RNAを調製した。1.65gの組織から、73μ gのポリA⁺RNAを単離した。ストラタジーン（La Jolla、カリホルニア州）より入手したキットを用いて、ZAP発現cDNAライブラリーを構築するために、先のウサギ脾臓RNAを使用した。得られたcDNAを、pBK-CMVファージミドベクターのラムダアーム内の、EcoRI及びXhoI部位へと正方向にクローニングした。ギガパック（G igapack）II Gold（ストラタジーン）を用いて、ファージ粒子にラムダアームをパッケージした。得られたライブラリーのタイターはおよそ8x10⁵粒子であると見積もられ、平均インサートサイズは1.2kbであった。ライブラリーを集密なプラークの生育のために、播いて一度増幅し、細胞溶解液を集めた。増幅したライブラリーを、大腸菌とともに150mmプレート当たりおよそ30,000プラーク形成ユニット（pfu）にて播いて、得られた混液を37℃にて12〜16時間インキュベートし、プラーク形成を許容した。ファージDNAをハイボンドN⁺ナイロン膜（アマーシャム、Arlington H eights、イリノイ州）に転写した。膜を２つのランダムプライムの放射ラベルしたマウスα_dPCR DNAプローブの混合物とハイブリダイズさせた。第１のプローブは、配列番号：52の第149〜946位のヌクレオチドにわたるPCR産物から作製した。第２のプローブは、配列番号：52の第2752〜3651位のヌクレオチドにわたるPC R産物からのものであった。プローブは、ランダムプライム法によってラベルし（ベーリンガーマンハイムランダムプライムDNAラベリングキット）、反応混液をセファデックスG-50カラムに通して、取り込みがなされなかったヌクレオチドを除去した。ハイブリダイゼーション用溶液は、5 X SSPE、5 Xデンハーツ、1 ％ SDS、40％ホルムアミド及びラベルしたプローブ1x10⁶dpm/mlで構成した。ハイブリダイゼーションは、42℃にて16〜18時間行った。フィルターを室温にて大量の2 X SSPE/0.1％SDSで洗浄し、X-線フィルムに感光して、ハイブリダイズするプラークを目視化した。ヒトα_dと相同である重要な配列を持つ２つのクローンを同定した。クローン# 2は、およそ800bpの長さであって、ヒトα_dの5'端に位置づけられた。クローン# 2は開始のメチオニン及び完全なリーダー配列を包含していた。クローン#7は、およそ1.5kbで、開始のメチオニンを包含していた。クローン#7の5'端は、クローン#2の5'端と重複しており、一方3'配列はIドメイン配列を越える地点で終結していた。クローン#7を、プライマーウォーキング法によって完全に配列決定した。クローン#7に対する、ヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を、配列番号： 100及び101にそれぞれ示す。クローン#2及び#7より決定したウサギα_dに対する、予測されるN末端アミノ酸配列により、ヒトα_dと73％の同一性、マウスα_dと65％の同一性、ならびにマウスCD11b、ヒトCD11b、及びヒトCD11cと58％の同一性を持つタンパク質であることが示唆された。クローン#2に対する核酸配列を配列番号：92に示し、予測されるアミノ酸配列を配列番号：93に示す。ラベルしたウサキのクローン#7を用いて、その断片が由来するcDNAライブラリーの再スクリーニングを行って、全長のウサギα_dcDNAの単離を試みた。さらに2 5個のクローンが同定され、そのうちの１つでクローン49と命名したものが最長であることが判明した。クローン49を、ネステッド欠失技術を使用して完全に配列決定した。クローン49に対するヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：102及び103に示す。クローン#7とクローン#49とは重複していなかったので、欠損している配列を単離するために、第一鎖ウサギ脾臓cDNAとのPCRにおいてプライマーとして使用されるべき、オリゴヌクレオチドを設計した。これら２つの部分的なクローンの推定アミノ酸配列の、他のロイコインテグリンのものとの関係を、表１に記載する。表１アミノ酸レベルでのβ₂インテグリンファミリーメンバーの同一性（百分率） ^*同一性が25％を下回る場合、ランダムなアラインメントにすぎず、有意ではない。ウサギα_dクローンの単離により、トランスフェクト体の表面上に、または全長もしくは切除された可溶性型として、タンパク質の発現が許容される。このタンパク質は次いで、ヒト疾患状態のウサギにおけるモデルのためのモノクローナル抗体製造用の免疫原として用いられる。実施例25 α_dの治療上の有用性を調べるための動物モデルイヌにおける免疫組織学的データならびにラット及びマウスにおけるin situ ハイブリダイゼーションで、脾臓においては、 α_dが赤脾髄及びリンパ節に存在するマクロファージに主に発現されており、髄索及び導管にα_dが見出されることが確かめられた。発現パターンは、モノクローナル抗体F4/80及びSK39により特定される２つのネズミ抗原について報告されているものと顕著に類似している。これらのネズミ抗原の生化学的特性から、それらがα_dとは異なることが示されているが、α_dがネズミF4/80及びSK39抗原と同じマクロファージのサブセットを占める可能性は高い。マウスにおいて、SK39-陽性マクロファージは、赤脾髄で認められ、ここで循環系からの外来物質のクリアランスに関与しているかもしれず、また、リンパ節の髄質にも認められている（Jutilaら、J.Leukocyte Biol．54巻、30〜39頁(199 3)）。SK-39陽性マクロファージは急性及び慢性の炎症の双方の部位でも報告されている。さらに、チオグリコレートで炎症を起こした腹膜腔に動員される単球もまた、SK39抗原を発現する。まとめると、これらの発見から、SK39⁺細胞がα_d ⁺ でもあるならば、これらの細胞は脾臓において外来物質のクリアランスに関与しており、また、マクロファージが重要な役割を演じる炎症に、関与するものであることが示唆される。 α_dの機能は未だ不明のままであるが、他の、より詳細にその性質が明らかとされたβ₂インテグリンは、細胞の移動を容易とし、食作用を高め、そして細胞 −細胞間の相互作用を促進する、広範な接着現象に（これらはすべて炎症プロセスのアップレギュレーションへと導かれる現象である）関与することが示されている。よって、正常のα_d機能を干渉すると、そこでマクロファージが重要な役割を果たす炎症をも干渉するかもしれないという可能性が高い。このような抗炎症効果は、i)炎症の部位へのマクロファージの動員のブロッキング、ii)炎症の部位でのマクロファージ活性化の妨害、またはiii)特異的な自己免疫応答または局外の(b ystander)細胞損傷の結果を通じて正常な宿主組織に損傷を与えるマクロファージのエフェクター機能を干渉すること、に起因して起こりうる。疾患のプロセスにおいてマクロファージが重要な役割を演じている証拠のある疾患状態としては、多発性硬化症、関節炎、移植動脈硬化症、糖尿病のいくつかの型、及び炎症性腸疾患が挙げられる。下記の動物モデルで、これらのヒトの疾病の多くの特徴を再現されることが示されている。これらのモデルシステムでα_d 機能の阻害剤を試験して、対応するヒト疾患を治療できる可能性があるか否かを調べる。Ａ．移植動脈硬化症心臓移植は、末期状態の心疾患のいくつかのタイプのための治療的手段として、現在認められている方式である。サイクロスポリンAの使用により１年生存率が80％に増大したので、進行性移植動脈硬化症の発症が、１年を越えて生存し続ける心移植における主要な死因として表面化してきている。近年の研究により、心移植後３年での重篤な移植動脈硬化症の発生率は36〜44％の範囲にあることが見出されている（Adamsら、Transpla-ntation 53巻、1115〜1119頁(1992)、Adam sら、Transplant-ation 56巻、794〜799頁(1993)）。移植動脈硬化症は、典型的には、冠状動脈血管壁全体に作用する広汎性、閉塞性の血管内膜の障害からなり、しばしば脂質の沈着を伴う。移植動脈硬化症の病原論は未知なるままであるか、おそらくは提供者と被移植者との間の組織適合性の相違に関連しているらしく、実際、免疫学的なものである。組織学的には、血管内膜の肥厚の領域は主にマクロファージで構成さっれており、場合によってはT細胞が認められることもある。従って、α_dを発現しているマクロファージが移植動脈硬化症の誘導及び／または進行において重要な役割を果たしているかもしれないという可能性がある。このような場合に、モノクローナル抗体またはα_d機能の小分子阻害剤（例えば、可溶性ICAM-R）を、心移植を受けて移植動脈硬化症発症の危険がある個体に予防的に与えることができよう。心移植における動脈硬化症が生命に対する最大の脅威を呈するか、腎臓、肝臓を含む他の実質器官の移植においても移植動脈硬化症は認められる。α_dブロッキング剤を治療に用いることで、他の器官の移植における移植動脈硬化症を防ぎ、移植不全に起因する併発症を減じることができよう。移植動脈硬化症に対するラットにおける１つのモデルとしては、副組織適合性の障壁を越えて異所性心同種移植片を移植したラットが挙げられる。MHCクラスI 及びII適合性のF-344被移植体にLewis心同種移植片が移植される場合、80％の同種移植片が少なくとも3週間生残し、また無期限には、25％の移植片が生残する。この低い程度の移植拒絶の間に、提供者の心臓の中に動脈硬化症の障害が形成される。120日目の同種移植片における動脈硬化障害には、典型的には、ヒト心同種移植片拒絶において見出される移植動脈硬化症障害と所見上区別されえない広汎性線維症血管内膜肥厚が生じる。ラットに、副組織適合性では不適当な組み合わせである心臓を用いて（例えば Lewisの心臓をF-344に）移植が施される。ラットα_dに特異的なモノクローナル抗体またはα_dの小分子阻害剤が移植の被移植体に予防的に与えられる。拒絶を受けない提供者の心臓における移植動脈硬化症の発生率を低減する処理であることが、期待される。α_dモノクローナル抗体または小分子阻害剤を用いてラットを処理することは、予防的処理に限らないかもしれない。 α_dをブロックする機能により、マクロファージが媒介する炎症反応を低減させ、また移植における動脈損傷を回復させることも期待される。Ｂ．コレステロール追加食餌で飼育したウサギにおけるアテローム性動脈硬化症追加のコレステロールを含有するアテローム原性食餌で、およそ12〜16週間飼育したウサギは、上行大動脈の内腔表面のほとんどに及ぶ血管内膜障害を発症する（Rosenfeldら、Arteri-osclerosjs 7巻、9〜23頁(1987)、Rosenfeldら、Arte rioscle-rosis 7巻、24〜34頁(1987)）。これらのウサギにおいて認められるアテローム性動脈硬化障害は、ヒトにおける場合に類似している。障害部位には大量のT細胞が含まれ、そのほとんどが、記憶T細胞に関わる標識であるCD45ROを発現している。浸潤T細胞のおよそ半分はMHCクラスII抗原も発現しており、そのいくつかはIL-2受容体も発現しているので、これらの細胞の多くが活性化状態にあることが示される。コレステロール食餌で飼育したウサギで見出されるか、齧歯類のモデルでは外見上存在しないアテローム性動脈硬化障害の特徴の１つは、泡沫細胞に富んだ障害の蓄積である。泡沫細胞マクロファージは、特異受容体による酸化型低密度リポタンパク質（LDL）の取り込みに起因して生じると考えられている。酸化型LDL 粒子は内皮細胞及び平滑筋細胞を包含するいくつかの細胞型にとって毒性を有することが見出されている。潜在的に毒性を有する、酸化型LDL粒子のマクロファージによる取り込みは、刺激として働きマクロファージ活性化を駆動して、アテローム性動脈硬化障害に関わる炎症に寄与する。一旦モノクローナル抗体がウサギα_dに対して作製されれば、コレステロール追加食餌で飼育したウサギが、これで処理される。処理には、α_d ⁺マクロファージが疾患のプロセスに関与することを証明するため、予防的にα_dモノクローナル抗体または小分子阻害剤を投与することが包含される。さらなる研究で、α_d に対するモノクローナル抗体または小分子阻害剤が、アテローム原性食餌で飼育したウサギにおいて検出される血管損傷を回復させることができることが証明されよう。Ｃ．インシュリン依存性糖尿病 BBラットは、70〜150日齢で、自発的にインシュリン依存性糖尿病を発症する。免疫組織化学を用い、この疾患初期においてMHCクラスII⁺、ED1⁺マクロファージが小島(islet)に浸潤するのを検出することができる。マクロファージの多くは細胞デブリスまたは正常細胞の食作用に携わるようである。疾患が進行するに従って、さらに多量のマクロファージが小島に浸潤することが見出されるが、有意な数のT細胞、及び後期B細胞もまた、その部位に動員されるようである（Hane nbergら、Diabetol-ogia 32巻、126〜134頁(1989)）。 BBラットにおける糖尿病の発症は、初期のマクロファージ浸潤及びそれに続く T細胞の動員の双方に、依存するようである。BBラットを、マクロファージに対して毒性を有するシリカ粒子で処理すると、初期の小島へのマクロファージ浸潤のブロックに有効である。初期のマクロファージ浸潤が起こらなければ、それに続く自己免疫リンパ球の集団による組織損傷が惹起こされることはない。この疾患のT細胞が関わる局面をブロックする、モノクローナル抗体OX-19（ラットCD5 に特異的である）またはモノクローナル抗体OX-8（ラットCD8に特異的である）を投与することもまた、糖尿病の発症を抑制する上で有効である。このモデルの病理においてマクロファージが中心的な役割を果たすことから、 α_dの機能の阻害剤を試験することに関心が寄せれらる。遺伝的に予め、インシュリン依存性糖尿病が発症しやすい素因が授けられたラットを、α_dに対するモノクローナル抗体または小分子阻害剤で処理し、その疾患の発症について評価する。臨床的な疾患の兆候を妨げるかまたは遅延することが、小島細胞に対するマクロファージ損傷においてα_dが中枢的役割を果たすことの証拠となる。Ｄ．炎症性腸疾患（クローン病、消瘍性大腸炎）炎症性腸疾患（IBD）の研究に用いられる動物モデルは、通常有害な刺激物（例えば、酢酸またはトリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール）の直腸内投与により顕現される。これらの薬剤により誘導した結腸の炎症は、化学的または代謝的傷害の結果惹起こされるものであり、ここではヒトIBDに関連する慢性及び自発的再発性の炎症は見られない。しかしながら、グループAまたはグループDのレンサ球菌のいずれかに由来する精製されたペプチドグリカン多糖（PG-PS）ポリマーの漿膜下注射を用いた、最近報告されたモデルは、ヒトIBDに対してより生理学的に関連深いものであると考えられる（Yamadaら、Gastroenter-ology 10 4巻、759〜771頁(1993)）。このモデルにおいて、遠位結腸の漿膜下層へと、PG-PSが注射される。その結果生じる炎症応答は、注射後3日の初発の急性挿間状態と、それに続く3〜4週間後の自発性の慢性期とからなる、二相性を呈する。後期の応答は現実には肉芽腫性であり、結腸の肥厚、接着、結腸結節及び粘膜の障害を惹起こす。粘膜の傷害に加えて、PG-PS大腸炎は頻繁に、関節炎貧血及び肉芽腫性肝炎を伴う。活動性のクローン病に罹患している患者の多数が関節炎の疾患や肝胆汁性の炎症を被るという点から、PG-PS大腸炎での腸外における所見により、クローン性大腸炎を研究するための、そのモデルに関心が寄せれらる。肉芽腫障害は、単球／マクロファージ系統の細胞の動員及びそれに続く活性化を導く慢性の炎症の結果起こるものである。クローン病及び前記の動物モデルにおいて肉芽腫障害が存在することにより、これが、α_dモノクローナル抗体またはα_dの機能の他の阻害剤に対する臨床上の標的として関心が寄せられる。α_dの機能の阻害剤は、IBDに関連する障害の形成をブロックするか、もしくは、この疾患において認められる組織の損傷を回復せしめることすらも行うことが期待される。Ｅ．関節炎関節炎は、好中球、Tリンパ球及び貧食性マクロファージを包含する種々の炎症細胞型に関連する多因性の疾患プロセスであると考えられる。種々の関節炎モデルが存在するが、レンサ球菌細胞壁プロテオグリカンの調製物で最もヒトにおける疾患に類似した異常が作り出される。ラットにおいてレンサ球菌の細胞壁は、疾患の進行とそれに続く緩和の挿間状態の反復と、結果的に数ヶ月の期間を経て関節破壊に至ることに、その特徴が表される、周辺の関節の炎症を誘導する（Cromartieら、J.Exp.med．146巻、1585 〜1602頁(1977)、Schwabら、Infection and Immunity 59巻、4436〜4442頁(1991 )）。この疾患の慢性期の間に、単核食細胞またはマクロファージが、滑膜の破壊において主要な役割を果たすと考えられている。さらに、滑膜へのマクロファージの動員を抑制する薬剤が、関節炎の炎症と病理的特性を有効に低減せしめる。関節炎へと導かれる滑膜の破壊において、マクロファージが中心的な役割を果たすことから、α_dに対するモノクローナル抗体またはα_d機能の阻害剤がこの疾患の処置における治療的潜在能力を有するかもしれないことが予測される。これまでに記載した他のモデルにおいてと同様に、予防的に投与されたα_dモノクローナル抗体または小分子阻害剤は関節の炎症をブロックまたは緩解し、滑膜の破壊を妨げることが期待される。α_dの機能を干渉する薬剤もまた、関節への付加的なマクロファージの動員の防止、またはマクロファージ活性化のブロックによって、進行中の炎症を緩解するかもしれない。総括的な結果として、進行中の関節破壊を回復させ、組織の修復を容易ならしめることとなるであろう。Ｆ．多発性硬化症多発性硬化症（MS）の病原論は不明のままであるが、この疾患は、中枢神経系で自己抗原を認識し、炎症カスケードを開始させるCD⁴⁺T細胞が仲介することが、一般的に認められている。その結果生じる免疫応答が、この疾患に寄与する活性化マクロファージを包含するさらに追加の炎症細胞の動員を惹起こす。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSのいくつかの面を再現する動物モデルである。近年、炎症性マクロファージに存在するCD11b/CD18に反応性を有するモノクローナル抗体（Huitingaら、Eur.J.Immunol．23巻、709〜715頁(1993)）が、臨床的にも組織学的にも疾患をブロックすることが示されている。その結果により、 α_dに対するモノクローナル抗体または小分子阻害剤が、EAEにおける炎症性の応答をブロックする上で有効でありそうであることが示される。このような薬剤は、MSの処置において、重要性をもって治療に適用されえよう。Ｇ．免疫複合肺胞炎肺胞導管、気道、結合組織、及び肺の胸膜空間に位置する肺胞マクロファージは、吸入された環境物質に対する肺の第一の防御系に相当するものである。細菌に由来するLPS、IFN-γ及び免疫複合体を包含する物質による刺激に応答して、肺胞マクロファージは、高度に反応性を有する酸素ラジカル及びチッ素中間体を包含する、様々な潜在性を有する炎症メディエーターを遊離する。スーパーオキシドアニイオン、過酸化水素及び酸化チッ素（NO・）は、病原体を撲滅し、腫瘍の標的を溶解するうえで重要な役割を有しているものの、これらの物質は、正常組織に対して有害な効果を有する可能性がある。免疫複合肺胞炎のラットモデルにおいて、肺胞マクロファージからのNO・の遊離は肺の損傷の多くを仲介することが示されている（Mulliganら、Proc.Natl.Ac ad.Sci．(USA)、88巻、638〜6342頁(1991)）。NO・は、ヒフ脈管炎を包含する、他の免疫複合体が仲介する障害におけるメディエーターとしても関わっており（ Mulliganら、前出）、また、糸球体腎炎などの疾病において潜在的に役割を果たしうる。 NO・で仲介される組織の損傷は、免疫複合体の関わる炎症に限定されない。例えば、PMA、LPSまたはIFN−γなどの物質によって刺激された小(神経)膠細胞は、寡突起神経膠細胞を殺傷することができるレベルでNO・を生産する（Merrillら、Immunol.、151巻、2132頁(1993)）。膵臓小島細胞もまた、NO・に対して感受性を有することが見出されており、そしてこのメディエーターのマクロファージによる遊離が、糖尿病を惹起こす組織損傷に関わっている（Kronckeら、BBRC、175 巻、752〜758頁(1991)）。さらに最近、NO・の遊離が内毒素ショックにおいて役割を果たすことが、決定的に証明された（MacMickingら、Cell、81巻、641〜650頁(199 5)）。リポ多糖（LPS）を投与した場合、正常の野生型マウスは、死に至る、動脈圧の重篤で進行性の減衰に陥る。しかしながら、誘導可能な酸化窒素が欠如したマウスがLPSに応答して陥る動脈圧の重篤な減衰は随分軽度であり、処置によってすべてのマウスが生き残る。 in vitroアッセイによって、NO・の遊離を包含するマクロファージ（すなわち、概してα_dを発現している白血球）活性化の、ある局面を阻止する上で有効であることが示唆されている。抗α_dポリクローナル抗血清（ラットα_dIドメインポリペプチドに対してラビットにて作製したもの）の存在下にIFN-γで刺激した肺胞マクロファージは、コントロール抗血清を用いて処理されたマクロファージよりも、NO・のチッ素／チッ素分解産物の生産量が有意に低いことが見出された。この発見から、α_dに対するモノクローナル抗体、特にIドメインに対するモノクローナル抗体は、MS、糖尿病、肺炎症及び内毒素ショックにおける潜在的な用途を有する、強力な抗炎症剤となるかもしれないことが示唆される。さらに、広範な白血球の型の機能に影響を及ぼすCD18と対照的に、α_dが限局的に分布することで、α_dがマクロファージ（すなわち、概してα_dを発現している白血球）の活性化を防ぐために、CD18よりも誘引力を有する標的となりうるかもしれない。ラットIgG免疫複合体で誘導された肺胞炎は、急性の肺障害を理解する上で重要な、広範に用いられる実験モデルである。障害は、気管挿管を介して肺の中に抗ウシ血清アルブミン（BSA）抗体を注入し、その後BSAを静脈内注射することによって誘導される。肺の微少血管における免疫複合体の形成が、好中球の補足的な活性化と肺への好中球の動員を導く。おそらくは、肺での免疫複合体の形成に続く、血液からの白血球の管外溢出と、これに続く、肺上皮を横切る白血球の移動。次いで、疾病の進行に関与する、活性化内皮細胞、好中球及びマクロファージからの、ラジカル、TNF-α及び酸化チッ素（NO・）を包含するメディエーターの遊離。疾病の病理学的特徴には、浮腫を惹起こす血管透過性の増大と、肺胞空間に存在する多数の赤血球及びPMNの存在が包含される。 α_dのIドメインに対して特異的なポリクローナル抗血清を、免疫複合体で誘発した肺胞炎のラットモデルにて試験した。肺に抗BSAが導入されると同時に、気管挿管を介して抗α_dポリクローナル血清を投与した。次いで、肺の障害に起因する浮腫を定量化するための痕跡量の¹²⁵ＩラベルしたBSA（およそ800,000cpm）と共にBSAを静脈内投与することによって、肺の障害を誘導した。4時間にわたって肺の障害の進行を許容し、1.0mlの血液中に存在するラベルの量に比較した、肺での¹²⁵IラベルBSAの比率として規定される、肺の透過性値を使用して、損傷を評価した。典型的には、陽性コントロールの割合に対する透過性値は、0.6〜0 .8の範囲にあり、一方陰性コントロール（BSAを投与されないラット）は、0.1〜 0.2の範囲にある透過性の指標値を有している。初期の研究によって、抗α_dポリクローナル抗血清を用いた処置によって、50 ％を越える程度に肺の透過性値が減少することが示唆され、肺障害の劇的な軽減を表すものであった。史的には、抗CD18を用いた処理によって、60％まで透過性値が減じられている。これらの知見から、急性の肺障害の際に、α_dが最も重要なβ₂インテグリンであるかもしれないことが示唆されるが、しかし、抗血清の効果によって血液からの管外溢出、または肺上皮を横切る移動が妨げられるか否かを正確に確定することはできない。 α_dが肺障害を軽減することのさらなる証拠として、気管支肺胞の洗浄液中のT NF-アルファレベルを評価した。抗α_d抗血清を用いた処理で、TNF-アルファレベルがおよそ4倍減じられることが見出された。TNF-アルファは、急性の肺炎症における重要なメディエーターであり、炎症の部位への炎症細胞の動員、細胞の活性化及び組織損傷の原因であると、長きにわたって目されてきている。おそらくは、抗α_d抗血清は、免疫複合肺胞炎の形成に際して常在のマクロファージの活性化を阻止し、それによってTNF-α及びNO・の遊離を軽減し、そしてこれらの物質によって惹起こされるその後の組織損傷や好中球の動員を減少させるのである。実施例26 前臨床モデルにおけるα_dの発現様々な疾患状態におけるα_dの分別性発現を評価するために、動物の疾患モデル由来の組織切片を、前記（実施例18参照）のごとくに生産された抗α_dポリクローナル血清を用いて染色した。正常及び罹患ラット由来の組織を、6μmの厚さに切り、室温にて終夜、スーパーフロスト・プラス（VWRサイエンティフィック）スライド上で風乾した。乾燥の後、使用するまで切片を-70℃に保存しておいた。使用前に、スライドを-70℃から取り出し、およそ5分間５０℃においた。切片は、室温にて10分間、冷（4℃）アセトン（ステフェンズ(Stephens)・サイエンティフィック）中で固定し、そして室温にて乾燥させた。各切片を、30％正常ラット血清（ハーラン・バイオプロダクツ(Harlan Bio-products)）、5％正常ヤギ血清（ベクター・ラボラトリーズ）及び1％ウシ血清（BSA、シグマ・ケミカル・カンパニー）を1X TBSに含有する溶液150μlを用いて、室温にて30分間ブロッキングし、その後溶液は切片から穏やかに吸い取った。ウサギポリクローナル血清を34μg/mlのタンパク質濃度、及び免疫前の同じウサギの血清を38.5μg/mlのタンパク質濃度にブロッキング用緩衝液にて希釈し、100μlを、37℃にて30分間、各組織切片に別々に付した。血清溶液を切片から吸い取り、結合しなかった抗体は1X TBSで5分間３回洗浄することによって除去した。最後の洗浄の後、過剰のTBSを吸い取って除去した。エリート・ラビット(Elite Rabbit)IgGベクタステイン(Vectastain)A BCキット（ベクター）から入手したピオチン化ヤギ抗ウサギ抗体を、製造業者が示したプロトコルに従って調製し、そして得られた溶液のうち100μlを、37℃にて15分間、各切片に付した。洗浄１回ごとに5分間ずつ、1X TBSでスライドを２回洗浄し、その後、5％正常ラット血清及び1％BSA中に1：100に希釈した、ストレプトアビジン−ゴールド接合物（ゴールドマーク・バイオロジカルズ(Goldmar k Biologicals)）100μlを、室温にて1時間、各切片に付した。洗浄１回ごとに5 分間ずつ、TBSでスライドを３回洗浄し、そして1％グルタルアルデヒド（シグマ）を含むTBS緩衝液100μlを、室温にて5分間付した。再び、洗浄１回ごとに5分間ずつ、TBSでスライドを３回洗浄し、さらに洗浄１回ごとに3分間ずつ、滅菌脱イオン水で５回洗浄した。過剰の液体を各スライドから吸い取り、銀増感及び開始溶液（ゴールドマーク・バイオロジカルズ）をそれぞれ２滴ずつ各切片に付した。室温にて20〜30分間反応を進行させ、その後滅菌脱イオン水で切片を充分に濯いで、室温にて終夜風乾して、サイトシール（Cytoseal）60（VWR）に載置した。コントロールとして、同様のプロトコルによる同じ実験において、CD11a、C D11b、CD11c及びCD18を認識するモノクローナル抗体を用いて組織切片をラベルした。 α_dポリクローナル血清ならびにCD11a、CD11b、CD11c及びCD18に対するモノクローナル抗体を用いたラベル付によって、他のαサブユニットについて観察されるものとは異なる、α_dに対する染色パターンが明らかになった。正常の肺組織で、気管支の呼吸上皮（肺胞空間における上皮は除く）上及び空間内の肺胞マクロファージであるらしい個々の細胞上に、α_d発現が検出された。ポリクローナル血清を用いて観察されたシグナルは、免疫前のコントロール血清を用いた場合のバックグラウンドのシグナルのレベルよりも有意に高かった。肺の肉芽腫組織では、グリカンの投与後24及び96時間にα_dで異なるシグナルが検出され、肺胞領域全体にわたる呼吸上皮が染色されており、また、気道全体で肺胞マクロファージらしきものに、より強いシグナルが検出された。疾患からおそらくは快復していたらしい動物（グリカンの投与後16日目に屠殺）からの肺組織では、α_d抗体を用いて何らのシグナルも観察されなかった。これらの組織の各々で免疫前の血消を用いた場合、ごくわずかのバックグラウンドが観察された。抗原で誘発した喘息モデル由来のラット肺組織を使用して、気管支及び肺胞空間の双方の呼吸上皮で、α_d抗体を用いた場合に強いシグナルが検出された。シグナルは、免疫前のコントロール血清におけるバックグラウンドのシグナルレベルよりも有意に高かった。当業者であれば、前記のごとくに例示した実施例に述べられた発明に、多くの修飾や変更を着想することが予測される。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ、限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．199Mと命名されたハイブリドーマ。２．請求の範囲第１項記載のハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体。