HU223977B1 - Alfa-d-integrin-re specifikus antitestek - Google Patents

Alfa-d-integrin-re specifikus antitestek Download PDF

Info

Publication number
HU223977B1
HU223977B1 HU9901579A HUP9901579A HU223977B1 HU 223977 B1 HU223977 B1 HU 223977B1 HU 9901579 A HU9901579 A HU 9901579A HU P9901579 A HUP9901579 A HU P9901579A HU 223977 B1 HU223977 B1 HU 223977B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ooo
cells
human
seq
protein
Prior art date
Application number
HU9901579A
Other languages
English (en)
Inventor
W. Michael Gallatin
Monica Van Der Vieren
Original Assignee
Icos Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icos Corporation filed Critical Icos Corporation
Publication of HUP9901579A2 publication Critical patent/HUP9901579A2/hu
Publication of HUP9901579A3 publication Critical patent/HUP9901579A3/hu
Publication of HU223977B1 publication Critical patent/HU223977B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70553—Integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Abstract

A találmány az alfa-d-nek nevezett új humán integrinre specifikusantitestekre vonatkozik. A találmány leírása ismerteti a megfelelőfúziós fehérjéket is, amelyek tartalmazzák az extracelluláris alfa-dfehérjefragmenseket, a megfelelő teljes hosszúságú polipeptideket és ahumán immunoglobulin konstans régióit. Az alfa-d-re specifikuskötőmolekulák alkalmasak más fajokból izolált alfa-d DNS biológiaiaktivitásának mérséklésére, melyek egyben a humán alfa-d-t kódolószekvenciákkal homológiát mutatnak. ŕ

Description

A leírás terjedelme 140 oldal (ezen belül 4 lap ábra)
HU 223 977 Β1
A jelen találmány az ad-nek nevezett új humán β2 integrin α-alegységét kódoló polinukleotidok klónozásával és expressziójával foglalkozik, amely stukturálisan kapcsolatban van ismert humán β2 integrin a-alegységekkel, a CD11a-val, CD11b-vel és a CD11c-vel. A találmány a humán ad-t kódoló szekvenciákkal homológiát mutató más fajokból izolált polinukleotidokra is vonatkozik.
Az integrinek a celluláris adhézióban aktívan szerepet játszó membránnal kapcsolt molekulák egyik osztályába tartoznak. A transzmembrális heterodimer tulajdonságú integrinek egy α-alegységet és egy β-alegységet tartalmaznak nemkovalensen asszociálva. A mai napig legalább 14 α-alegységet és 8 β-alegységet azonosítottak [Springer: Natúré 346, 425-434 (1990)]. A β-alegység képes asszociálódni több mint egy aalegységgel, és a közös β-alegységű heterodimereket az integrinsokaságon belül alosztálynak tekintjük.
A humán integrinek egyik osztályába tartoznak azok az expressziójukban a fehérvérsejtekre korlátozódó integrinek, melyek egy közös β2-alegységgel jellemezhetők. A sejtspecifikus expresszié eredményeként ezeket az integrineket leukocita integrineknek, LeuCAM-oknak vagy leukointegrineknek hívják. Mivel a β2-alegység közös, ezért ezen osztály egyik alternatív elnevezése a β2 integrin. A β2-alegységet (CD18) korábban három megkülönböztethető a-alegységgel asszociáltan izolálták, a CD11a-val, a CD11b-vel vagy a CD11c-vel. A humán CD18-at kódoló cDNS izolálását Kishimoto és munkatársai írták le [Kishimoto és munkatársai: Cell. 48, 681-690 (1987)]. A WHO hivatalos nómenklatúrája alapján a heterodimer fehérjéket CD11a/CD18-nak, CD11b/CD18-nak és CD11c/CD18nak hívják; az általános nevezéktanban ezeket LFA-1nek, Mac-1-nek vagy Mo1-nek, illetőleg p150-nek, 95nek vagy LeuM5-nek hívják [Cobbold és munkatársai: Leukocyte Typing III, szerkesztő: McMichael, Oxford Press, 778 (1987)]. A humán β2 integrin CD11a, CD11b és CD11c α-alegységeiről kimutatták, hogy redukáló környezetben a 180 kD-os, 155 kD-os, illetve a 150 kD-os molekuláknak megfelelően vándorolnak elektroforézis során, és ezeket az alegységeket kódoló DNS-eket klónozták [CD11a: Larson és munkatársai: J. Cell. Bioi. 108, 703-712 (1989); CD11b: Cobri és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 263, 12 403-12 411 (1988); és CD11c: Cobri és munkatársai: EMBO Journal 6, 4023-4028 (1987)]. A humán β2 integrin a- és β-láncok feltételezett homológjait megközelítően azonos molekulatömegűeknek határozták meg, míg például a majmok és a főemlősök fajaiban [Letvin és munkatársai: Blood 61, 408-410 (1983)], valamint egereknél [Sanchez-Madrid és munkatársai: J. Exp. Med. 154, 1517 (1981)] és kutyáknál [Moore és munkatársai: Tissue Antigens 36, 211-220 (1990)] nagymértékben különbözőknek azonosították ezeket.
Más fajokból származó feltételezett homológok abszolút molekulatömegeiről kimutatták, hogy szignifikánsan különböznek egymástól [Danilenko és munkatársai: Tissue Antigens 40, 13-21 (1992)], és a szekvenciainformáció hiányában határozott kapcsolat nem lehetséges a humán integrinek alegységei és a más fajokból azonosított alegységek között. Továbbá az egy fehérjecsaládon belüli tagok számának változatosságát figyelték meg különböző fajoknál. Vegyük figyelembe, hogy például nyulakból több IgA izotípust izoláltak, mint emberből [Burnett és munkatársai: EMBO Journal 8, 4041-4047 (1989); Schneiderman és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 7561-7565 (1989)]. Hasonlóan eddig az embernél legalább 6 különböző metallotionein fehérjét izoláltak [Karín és Richards: Natúré 229, 797-802 (1982); és Varshney és munkatársai: Molecular & Cellular Biology 6, 26-37 (1986)], míg egérnél nyilvánvalóan csak két változatot [Searle és munkatársai: Molecular & Cellular Biology 4, 1221-1230 (1984)]. Ezért egy fehérjecsalád több tagjának léte egy adott fajban szükségszerűen nem azt jelenti, hogy egy másik fajban ugyanannak a családnak megfelelő tagjai léteznek.
Specifikusan a β2 integrinekkel kapcsolatban kutyáknál megfigyelték, hogy a humán CD18 kutyából származó feltételezett megfelelője képes dimer kialakítására legalább négy potenciálisan különböző a-alegységgel [Danilenko és munkatársai: Tissue Antigens 40, 13-21 (1992)]. Az egér immunizálásával a kutyafélék lépsejtjei ellen képzett monoklonális ellenanyagok olyan fehérjéket immunoprecipitálnak, melyeket első megközelítésben a humán CD18, CD11a, CD11b és CD11c kutyahomológjainak minősítenek főleg hasonló, de nem azonos molekulatömegük alapján. A másik antikutya lépsejt ellenanyag, azaz a Ca11.8H2, felismerte és immunoprecipitálta a β2-alegységgel asszociálódni képes negyedik α-szerű kutyából származó alegységet, de molekulatömege a többitől eltért, és expressziója a differenciált szöveti makrofágok egy részhalmazára korlátozódott.
Az egerek dendrikus sejtjeivel immunizált hörcsögökben képződő ellenanyagok között két antiintegrin ellenanyag volt [Metlay és munkatársai: J. Exp. Med. 171, 1753-1771 (1990)]. Az egyik ellenanyag, a 2E6, immunoprecipitált egy túlsúlyban lévő heterodimert megközelítőleg 180 kD-os és 90 kD-os molekulatömegű alegységekkel, ráadásul a kis mennyiségben lévő sávok mellett 150-160 kD-osak is voltak. A második ellenanyag az N418 láthatóan egy heterodimert precipitált 150 kD-os és 90 kD-os molekulatömegű alegységekkel. A celluláris adhézió blokkolásával foglalkozó tanulmányok alapján feltételezik, hogy a 2E6 ellenanyag felismer egy humán CD18-nak megfelelő egér alegység molekulát. Míg molekulatömeg alapján feltételezik, hogy az N418 felismer egy humán CD11c/CD18-cal homológ egérmolekulát, ennek ellenére a további analízis arra mutatott, hogy az egérantigén olyan szöveti eloszlási mintázatot mutat, ami ellentmondásban van a humán CD11c/CD18-nál megfigyeltekkel.
A kutyafélékből származó Ca11.8H2 ellenanyaggal és az N418 ellenanyaggal felismert antigének az előzőleg azonosított kutya vagy egér α-alegység különböző fajtáit képviselik (például glikozilezettségi vagy a splicing során keletkező összekapcsolódási változat). Alter2
HU 223 977 Β1 natívaként ezek az antigének a kutya- vagy egérfélék egyedi integrin α-alegységeit képviselhetik. Az elsődleges szerkezetre vonatkozó specifikus információk hiányában ezek a változatok nem különböztethetők meg.
Az embernél a CD11a/CD18 minden fehérvérsejtben expresszálódik. A CD11b/CD18 és a CD11c/CD18 expressziója alapvetően a monocitákra, granulocitákra, makrofágokra és a természetes ölősejtekre (NK) korlátozódik, de a CD11c/CD18 szintén kimutatható néhány B-sejt-típusban. Általában a CD11a/CD18 a limfocitákon, a CD11b/CD18 a granulocitákon és a CD11c/CD18 a makrofágokon van túlsúlyban [Arnaout: Blood 75, 1037-1050 (1990)]. Bár az α-láncok expressziója az aktivációs állapot és az egyedi sejttípusok differenciáltságának tekintetében különböző [Larson és Springer: Immunoi. Rév. 114, 181-217(1990)].
A β2 integrinek szerepét a humán immunválaszban és a gyulladási folyamatokban olyan monoklonális ellenanyagok segítségével mutatták ki, melyek képesek a β2 integrinnel kapcsolt sejtadhézió blokkolására. Például a CD11a/CD18, a CD11b/CD18 és a CD11c/CD18 aktívan részt vesz a természetes ölősejtek (NK) lymphoma- és adenokarcinómasejtekhez történő kapcsolásában [Patarroyo és munkatársai: Immunoi. Rév. 114, 67-108 (1990)], a granulocitafelszaporodásban [Nourshargh és munkatársai: J. Immunoi 142, 3193-3198 (1989)], a granulocitafüggetlen plazmakiáramlásban [Arfors és munkatársai: Blood 69, 338-340 (1987)], a stimulált fehérvérsejtek kemotaktikus válaszában [Arfors és munkatársai: Blood 69, 338-340 (1987)] és a fehérvérsejtek véredények endotheliumához történő kapcsolódásában [Price és munkatársai: J. Immunoi. 139, 4174-4177 (1987); és Smith és munkatársai: J. Clin. Invest. 83, 2008-2017 (1989)]. A β2 integrinek alapvető szerepe az immunválaszban és a gyulladásos folyamatokban a fehérvérsejtek adhéziós elégtelenségének (LAD) nevezett klinikai tünetben nyilvánvalóvá vált, mivel a kór klinikai megnyilvánulásában szerepet játszanak a visszatérő és gyakran az életet fenyegető bakteriális fertőzések. A LAD a β2-alegységben bekövetkező heterogén mutációk eredménye [Kishimoto és munkatársai: Cell. 50, 193-202 (1987)], és a betegség állapotának súlyossága arányos a β2-alegység-expresszió elégtelenségének mértékével. A β2-ιτιυ1έαό a teljes integrin heterodimer kialakulását károsítja [Kishimoto és munkatársai: Cell. 50, 193-202 (1987)].
Érdekes, hogy legalább egy CD18-ra specifikus ellenanyagról kimutatták, hogy in vitro gátolja a humán immunelégtelenség 1-es típusú vírus (HIV-1) szincíciumképzését, jóllehet ezen gátlás pontos mechanizmusa nem ismert [Hildreth és Orentas: Science 244, 1075-1078 (1989)]. Ez a megfigyelés összhangban van azzal a felfedezéssel, hogy a CD11a/CD18 legfontosabb ellenreceptora, az ICAM-1, szintén a rhinovírus szerotípusok fő csoportjának felületi receptora [Greve és munkatársai: Cell. 56, 839 (1989)].
A β2 integrin kötőaktivitásának jelentősége a humán immunválaszban és a gyulladásos folyamatokban aláhúzza annak fontosságát, hogy a felületi fehérjék ezen osztályának egy sokkal teljesebb megértésére törekedjünk. Ezen alcsalád még ismeretlen tagjainak, valamint ezek ellenreceptorainak azonosítása és a β2 integrinek biológiai aktivitását megváltoztatni képes monoklonális ellenanyagok vagy más oldható faktorok létrehozása gyakorlati eszközöket fog szolgáltatni a β2 integrinekkel kapcsolatos immunválasz és a gyulladási folyamatok terápiás jellegű beavatkozásaihoz.
A jelen találmány egyrészről gondoskodik új, tisztított és izolált polinukleotidokról (mint például: DNS és RNS transzkriptek mind kódoló értelmes szál, mind antiszensz szál formákban), melyek kódolnak egy új β2 integrin α-alegységet, az ad-t és ennek variánsait (úgymint a delécióval, kiegészítéssel vagy helyettesítéssel készült analógjait, melyek az ad-re jellemző kötőés/vagy immunológiai tulajdonságokkal rendelkeznek). A találmány előnyben részesített DNS-molekulái között vannak cDNS, genomiális DNS és teljesen vagy részlegesen szintetizált DNS-molekulák. A bemutatott előnyben részesített polinukleotid egy DNS, melyet 1es szekvenciaszámon tettünk közzé, és a 2-es szekvenciaszámú fehérjét kódolja. A találmány szintén gondoskodik ad-t kódoló szekvenciákat tartalmazó virális DNS-konstrukciókról (expressziós konstrukciókról), melyekben az ad-t kódoló szekvencia működésében kapcsolt a homológ vagy heterológ transzkripciót szabályozó elemmel vagy elemekkel.
A jelen találmány szintén gondoskodik a humán ad-t kódoló polinukleotidokkal homológiát mutató, izolált és tisztított, egérből és patkányból származó polinukleotidokról. Egy előnyben részesített egér polinukleotidot 52-es számon tettünk közzé, egy előnyben részesített patkány polinukleotidot 54-es számon tettünk közzé.
Egy másik vonatkozásában a találmány a leírtaknak megfelelő DNS-szekvenciával transzformált vagy transzfektált prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekre vonatkozik, melyek az ad polipeptidet vagy annak variánsait expresszálják. A találmány gazdasejtjei különösen hasznosak az ad polipeptid nagy mennyiségű előállításában, mely izolálható magából a gazdasejtből vagy a gazdasejt növekedését biztosító táptalajból. Az ad polipeptidet expresszáló és azt extracelluláris membránfelületükre kijuttató gazdasejtek immunogénként hasznosak az ad-specifikus ellenanyagok előállításában. Előnyösen az ad-vel transzfektált gazdasejteket kotranszfektáljuk a β2 integrin alegységgel a heterodimer felületi megnyilvánulása érdekében.
A jelen találmány szintén gondoskodik tisztított és izolált ad polipeptidekről, fragmenseiről és azok variánsairól. Az előnyben részesített ad polipeptidet a 2-es szekvenciaszámon tettük közzé. A találmány új ad termékei megkaphatok természetes forrásból izolátumként, de az ad-változatok termékeit előnyösen a találmány gazdasejtjeivei, rekombináns eljárással állítjuk elő. Az ad polipeptid glikozilezett, részlegesen glikozilezett és teljesen glikozilezetlen formáit létrehozhatjuk változtatva a rekombináns előállításra kiválasztott gazdasejtet és/vagy az izoláció utáni eljárást. A találmány
HU 223 977 Β1 különböző ad polipeptidjei tartalmazhatnak vízben oldható és oldhatatlan ad polipeptideket, beleértve azokat az analógokat, melyekben egy vagy több aminosav hiányzik vagy másikra cserélt, azzal jellemezve, hogy (1) az ad-re specifikus immunológiai jellemzők és egy vagy több biológiai aktivitás nem vész el, előnyösen inkább fokozódik, (2) egy adott ligand/receptor kötővagy jelfunkciója specifikusan bénul. A találmány olyan fúziós polipeptideket is biztosít, melyekben az ad aminosavszekvenciák más polipeptidekből származó aminosavszekvenciákkal folyamatosan expresszálódnak. Az ilyen fúziós polipeptidek a vad típusú ad-hez képest módosított biológiai, biokémiai és/vagy immunológiai sajátságokkal rendelkezhetnek. A találmány megfontolásai között a multimer képzést elősegítő analóg polipeptidek is szerepelnek, beleértve a hozzáadott aminosavcsoportokat (például lizint vagy arginint).
A jelen találmány szem előtt tartja az ad-hez specifikusan kötődő polipeptid és nem polipeptid molekulákat is. Az előnyben részesített kötőmolekulák az ellenanyagok (például monoklonális és poliklonális ellenanyagok), ellenreceptorok (például membránhoz kapcsolt és a nem kötött formák) és más ligandok (például a természetben előforduló és szintetikus molekulák), beleértve azokat, amelyek kompetitíven kötődnek adhez az ad monoklonális ellenanyagok és/vagy specifikus ellenreceptorok jelenlétében. A kötőmolekulák hasznosak az ad polipeptidek tisztításában és az ad-t expresszáló sejttípusok azonosításában. A kötőmolekulák szintén hasznosak az in vivő kötődés modulálásában (úgymint: gátlás, blokkolás vagy stimulálás) és/vagy az ad szignáltranszdukciós aktivitásaiban.
A találmány gondoskodik az ad kötőmolekulákat azonosító vizsgálati módszerekről, beleértve a rögzített ligandkötő vizsgálati módszereket, az oldatban történő kötődést vizsgáló módszereket, a szcintillációs közelségi vizsgálati módszereket, a dihibrid szűrési módszereket és hasonlókat.
Az ad-aktivitást moduláló ellenanyagok vagy más vegyületek azonosítására szolgáló in vitro vizsgálati módszerek tartalmazhatják például az ad vagy egy természetes ligandum rögzítését ad-kötőhöz, kimutathatóan jelölve a nem kötött kötőpartnert, a kötőpartnerek együttes inkubálását és egy tesztvegyület hatásának meghatározását a jelölt kötés mértékére, ahol a tesztvegyület jelenlétében a jelölt kötésben beálló csökkenés, összehasonlítva a tesztvegyület hiányában a kötött jel mértékéhez, jelzi, hogy a tesztvegyület az adkötődés egy inhibitora.
Az ad és egy ligand közötti kölcsönhatást moduláló vegyületek azonosítására egy másik vizsgálati módszer az, amikor az ad-t vagy annak fragmensét fluoreszcens vegyülettel bevont (vagy átitatott) szilárd felülethez rögzítjük, majd a ligandumot jelöljük fluoreszcens vegyületet gerjeszteni képes anyaggal, ezután a feltételezett modulátor vegyület jelenlétében és hiányában a rögzített ad-t kapcsoljuk a jelölt liganddal, végül a fluoreszcens vegyület fénykibocsátását észleljük, és meghatározzuk a moduláló vegyületeket, mivel ezek olyan vegyületek, amelyek a fluoreszcens vegyület általi fénykibocsátásra hatnak, majd ezt összevetjük a moduláló ágens hiányában a fluoreszcens vegyület fénykibocsátásával. Alternatívaként az ad-ligand rögzíthető és jelölhető a vizsgálati módszerben.
A találmány az ad és egy ligand közötti kölcsönhatást moduláló vegyületek azonosítására szem előtt tartott másik vizsgálati módszere magában foglalja a következőket:
- egy DNS-kötő domaínnel és egy aktiváló domainnel rendelkező transzkripciós faktor által szabályozott promoter kontrollja alatt álló riportergént tartalmazó DNSkonstrukcióval a megfelelő gazdasejtek transzformálását vagy transzfektálását,
- az ad egészét vagy első fúziós részét és akár a transzkripciós faktor DNS-kötő domainjét, akár az aktiváló domainjét kódoló első hibrid DNS-szekvencia gazdasejtekben történő expresszálását,
- a ligand egészét vagy egy részét és az első fúziókor be nem épült transzkripciós faktor DNS-kötő domainjét vagy aktiváló domainjét kódoló második hibrid DNS-szekvencia gazdasejtekben történő expresszálását,
- a ligand és az ad közötti kölcsönhatáson alapuló feltételezett modulálóhatás kiértékelését, mérve a feltételezett modulátor jelenlétében és hiányában a gazdasejtben a riportergéntermékek termelését, és
- a moduláló vegyületek azonosítását, mivel ezek a vegyületek a riportergéntermék termelését megváltoztatják, ha a moduláló vegyület hiányában a riportergéntermék termeléséhez viszonyítjuk. A vizsgálati módszerben felhasználásra bemutatott, előnyben részesített eszközök a következők: a lexA promoter, a lexA DNS-kötő domain, a GAL4 transzaktivációs domain, a lacZ riportergén és egy élesztőgazdasejt-típus.
A már említett vizsgálati módszer egy módosított változata, mely felhasználható az ad-hez kötődő fehérjét kódoló polinukleotid izolálásában, a következőket tartalmazza:
- egy DNS-kötő domainnel és egy aktiváló domainnel rendelkező transzkripciós faktor által szabályozott promoter irányítása alatt álló riportergént tartalmazó DNS-konstrukcióval a megfelelő gazdasejtek transzformálását vagy transzfektálását,
- az ad egészét vagy az első fúziós részét és akár a transzkripciós faktor DNS-kötő domainjét, akár az aktiváló domainjét kódoló első hibrid DNS-szekvencia expresszálását a gazdasejtekben,
- a valósnak vélt ad kötőfehérje egészét vagy második fúziós részét és az első fúzióban be nem épült transzkripciós faktor DNS-kötő domainjét vagy az aktiváló domainjét kódoló második hibrid DNS-szekvencia-könyvtár expresszálását a gazdasejtekben,
- egy adott gazdasejtben kimutatva egy ad kötőfehérje kötődését az ad-hez, a gazdasejtben a riportergéntermék termelésének detektálásával, és
- adott gazdasejtből a második hibrid DNS-szekvencia izolálását, mely az ad kötőfehérjét kódolja.
A találmány szintén magában foglalja az ad-re specifikus ellenanyagokat termelő hibridóma sejtvonalakat. Monoklonális ellenanyagokat szekretáló hibridó4
HU 223 977 Β1 mák előállítási technikája jól ismert a szakirodalomban. Hibridóma sejtvonalak előállíthatok állatok immunizálásával, mely történhet tisztított ad-vel, ad variánsaival vagy extracelluláris membránfelszínükön ad-t vagy variánsát expresszáló sejtekkel. Az immunogén sejttípusok közé tartoznak egyrészről olyan sejtek, melyek in vivő ad-t expresszálnak, vagy másrészről olyan transzfektált prokarióta vagy eukarióta sejtvonalak, amelyek természetes körülmények között in vivő ad-t nem expresszálnak. A találmány előnyben részesített, bemutatott ellenanyagait a következő hibridómák szekretálják: 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A,
188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K,
188L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195A, 195C,
195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3, 197A-4,
199A, 199H és 199M.
Az információ értékéhez nyilvánvalóan hozzájárulnak az ad közzétett DNS- és aminosavszekvenciái. Az egyik példasorozatban közzétett ad cDNS-szekvencia lehetővé teszi a humán ad genomiális DNS-szekvencia izolálását, beleértve a genomiális szekvencia transzkripcionális irányítóelemeit is. A találmány magában foglalja az ad allélikus variánsait és a heterológ DNSfajtákat is (például patkány vagy egér). A humán ad genomiális DNS és a heterológ fajok DNS-einek izolálása végrehajtható standard DNS/DNS hibridizációs technikákkal, megfelelően szigorú körülmények között, próbaként felhasználva az ad cDNS egészét vagy egy részét egy megfelelő könyvtár szűrésében. Alternatívaként ismert cDNS-szekvencián alapuló megtervezett oligonukleotidprimerekkel végzett polimeráz-láncreakció (PCR) használható genomiális ad-szekvenciák sokszorozására és azonosítására. Az ad polipeptideket kódoló szintetikus DNS-ek, beleértve ezek fragmenseit és variánsait, hagyományos és szintetikus módszerekkel előállíthatok.
A találmány DNS-szekvencia-információi homológ rekombinációval vagy „kiütéses” stratégiával [Kapecchi: Science 244, 1288-1292 (1989)] szintén lehetővé teszik olyan rágcsálók kialakítását, melyek egy funkcionális ad polipeptidet expresszálni képtelenek, vagy az ad polipeptid egy variánsát expresszálják. Az ilyen rágcsálók az ad és ad-modulátorok in vivő aktivitásának tanulmányozásában hasznos modellként szolgálnak.
A találmány DNS- és aminosavszekvenciái szintén lehetővé teszik az ellenreceptorok kötésében aktívan részt vevő, valamint a kötés szabályozásában inkább, mint az aktív részvételben szereplő epitópok analízisét. A találmány magában foglalja a transzmembrán szignáltranszdukcióban szerepet játszó epitópok azonosítását is.
A találmány DNS-e hasznos az ad polipeptideket expresszáló sejttípusok kimutatására is. Az ad RNS kimutatására szolgáló ad DNS-t használó standard DNS/RNS hibridizációs technikák felhasználhatók egy sejtben az ad-transzkripció konstitutív szintjének, valamint egy belső vagy külső ágens által kiváltott transzkripciós szintjében beálló változásoknak meghatározására. Az ad transzkripcióját és/vagy transzlációját módosító vegyületek azonosításán keresztül viszont megállapítható ezek potenciális terápiás vagy megelőző értéke. A találmány DNS-e szintén lehetővé teszi az ad
DNS RNS-hez történő in situ hibridizációján keresztül az ad-specifikus hírvivők celluláris helyzetének megállapítását összetett sejtpopulációkban és szövetekben.
A humán ad-szekvenciákkal homológiát mutató nem humán polinukleotidszekvenciák azonosítására is hasznos a találmány DNS-e. A nem humán ad DNSszekvenciák birtoklása lehetővé teszi humán rendszer állatmodelljének kifejlesztését (beleértve például a transzgenikus modelleket).
A találmány egy másik célkitűzéseként az ad-re specifikus monoklonális vagy poliklonális ellenanyagok alkalmazhatók immunhisztokémiai analízisben a szubcelluláris kompartmentek vagy szövetekben az egyedi sejtek helyének megállapítására. Az ilyen típusú immunhisztokémiai analízisek különösen hasznosak in situ hibridizációval kombinálva mind az ad mRNS, mind az ad gén által kódolt polipeptidtermékek helyzetének megállapítására.
Az ad-t expresszáló sejttípusok azonosítása jelentős elágazási pont lehet a terápiás és megelőző ágensek fejlesztésében. Előre látható, hogy az ad-vel kapcsolatos találmányban szereplő termékek alkalmazhatók azokban a kezelésekben, melyekben a körfolyamat egy lényeges elemében makrofágok vannak. A makrofágaktivitással kapcsolatos patológiai körülmények állatmodelljeit a szakirodalomban leírták. Például egérben Jutila és munkatársai beszámoltak a makrofágok felszaporodásáról mind krónikus, mind akut fertőzések helyein [Jutila és munkatársai: J. Leukocyte Bioi. 54, 30-39 (1993)]. Patkányokban Adams és munkatársai leírtak egy beültetési arteriosclerosis modellt a heterotropikus hasüregi allograft szívtranszplantációt követően [Adams és munkatársai: Transplantation 53, 1115-1119 (1992); Transplantation 56, 794-799 (1993)]. Rosenfeld és munkatársai indukált atherosclerosisról számoltak be a koleszterollal kiegészített étrenden tartott nyulaknál [Rosenfeld és munkatársai: Arteriosclerosis 7, 9-23 (1987)]. Hanenberg és munkatársai BB patkányokban spontán inzulinfüggő cukorbetegség kialakulásáról írtak [Hanenberg és munkatársai: Diabetologia 32, 126-134 (1989)]. Yamada és munkatársai leírták, hogy streptococcalis peptidoglükán-poliszacharid-polimerek patkányba történő beadása után gyulladásos bélbetegség, krónikus granulomás colitis alakult ki [Yamada és munkatársai: Gastroenterology 104, 759-771 (1993)]. Cromartie és munkatársai, valamint Schwab és munkatársai beszámoltak arról, hogy streptococcalis sejtfalfehérjék patkányba történő beadása után ízületi tünetek alakultak ki, melyet a perifériális ízületek és az utánuk következő ízületek pusztulása jellemez [Cromartie és munkatársai: J. Exp. Med. 146, 1585-1602 (1977); és Schwab és munkatársai: Infection and Immunity 59, 4436-4442 (1991)]. Végül Huitinga és munkatársai a sclerosis multiplex egy modelljéről az allergiás encephalomyelitisről számoltak be Lewis-féle patkányokban [Huitinga és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 23, 709-715 (1993)]. A kóros állapot csillapítására mindegyik modellben az ad ellenanyago5
HU 223 977 Β1 kát, más ad kötőfehérjéket vagy az ad oldható formáit alkalmazták, feltételezhetően a makrofágaktivitás inaktiválásán keresztül.
A találmány gondoskodik ezen és más kórállapotok kezelésére szolgáló gyógyszerészeti összetételekről. A gyógyszerészeti összetételeket úgy tervezzük, hogy azok az ad és ligandjai közötti kölcsönhatást gátolják, és az ad (mely tartalmazza az ad-kötődésben aktívan részt vevő teljes ad polipeptidet vagy annak fragmenseit) különböző oldható és membránhoz kapcsolódó formáit tartalmazza, valamint tartalmazza az ad kötőfehérjék (beleértve az ellenanyagokat, ligandokat és hasonlókat) oldható és membránhoz kapcsolódó formáit, az ad kötőaktivitás extracelluláris vagy intracelluláris modulátorait, és/vagy az ad és/vagy az ad-ligand polipeptidek expressziójának modulátorait, beleértve a transzkripciós, transzlációs, transzláció utáni folyamat és/vagy az intracelluláris transzport modulátorait.
A találmány magában foglalja a kóros állapotok kezelését is, melybe beleértjük az ad kötődését vagy az <xd-t expresszáló sejtek adott helyen történő felszaporodását, valamint az adott betegségtől szenvedő betegnek olyan mennyiséget adunk ezen készítményből, amely elegendő az ad kötődési szintjének vagy az ad-t expresszáló sejttípusok felhalmozódásának modulálására. A korlátozás szándéka nélkül a találmány kezelési módszerei alkalmazhatók a következő betegségekben: I. típusú cukorbetegség, arteriosclerosis, sclerosis multiplex, asztma, psoriasis, tüdőgyulladás, akut légzési rendellenesség szindróma és arthritis rheumatica.
A jelen találmány számos más vonatkozása és előnye nyilvánvalóvá válik a következő leírás figyelembevételével, a hivatkozás arra a rajzra vonatkozik, amelyben az 1A. ábrától az 1D. ábráig a CD11b (a szekvencia száma: 3) a CD11c (a szekvencia száma: 4) és az ad (a szekvencia száma: 2) humán aminosavszekvenciák egy elrendezését tartalmazza.
Ezután részletesen ismertetjük a találmányt.
A jelen találmány a következő példákkal mutatja be egy humán lép cDNS-könyvtárból származó, ad-t kódoló cDNS izolálását. Részletesebben, az 1. példa bemutatja az antikutya αγΜ1 ellenanyag használatát egy homológ humán fehérje kimutatásában. A 2. példa részletezi az αγΜ1 és a polipeptid N-terminálisának szekvenálását, ez utóbbi alapján lehetővé válik a kutya αγΜ1 gén PCR-sokszorozásához szükséges primerek megtervezése. A további PCR-primerek tervezéséhez szükséges belső szekvenciák megállapításához a 3. példa a kutya aTMi nagy mennyiségű tisztítására irányul. A kutya aTM1 gén egy fragmentjének sokszorozásához a 4. példa leírja a belső szekvenciaprimereket és a használt PCR-módszert. Az 5. példa a humán ad-t kódoló cDNS-szekvencia klónozására irányul. A 6. példa leírja a humán szövetek és sejtek ad mRNS-expresszióját analizáló Nothern-blot-hibridizációt. A 7. példa részletezi a humán ad expressziós plazmidok kialakítását, és az így eredményül kapott plazmidokkal a COS-sejtek transzfekcióját. A 8. példa a transzfektált COS-sejtekben expresszálódó ad ELISA analízisére irányul. A 9. példa a humán ad expressziós plazmidokkal transzfektált COS-sejtek FACS-analízisét írja le. A 10. példa a kotranszfektált COS-sejtekben az ad-vel asszociálódó CD18 immunoprecipitációjára irányul. A 11. példa az ad expressziós konstrukciók kínai hörcsög ovarialis sejtekbe irányuló stabil transzfekciójára vonatkozik. A 12. példa bemutatja az ICAM-R intracelluláris adhéziós molekula, egy ICAM-R mutáns fehérje és az iC3b komplement faktor CD18-függő kötődését az ad-vel. A 13. példa leírja az ad ligand/antiligand kötődési kölcsönhatásban szereplő inhibitorok vagy enhancerek (azaz modulátorok) azonosítására szolgáló szcintillációs közelségi szűrésre alkalmas vizsgálati módszert.
A 14. példa egyrészről az ad oldható formákat kódoló expressziós plazmidkonstrukciókra, másrészt az expressziós termékek kötőanalízisére irányul. A 15. példa az ad-re specifikus poliklonális szérumok és monoklonális ellenanyagok termelésére vonatkozik. A 16. példa leírja az ad szöveti megoszlásának analízisét, az ad expresszióját perifériális fehérvérsejtekben és az ad expresszióját gyulladásos és nem gyulladásos ízületi hártyában felhasználva az anti-ad poliklonális szérumot. A 17. példa leírja a humán ad génszekvenciával homológ patkány cDNS-szekvencia izolálását. A 18. példa vonatkozik a teljes hosszúságú ad expressziós plazmidok kialakításával, a patkány adl domainjét expresszáló plazmidokkal, beleértve az I domain/IgG fúziós fehérjéket, és foglalkozik a teljes hosszúságú és az I domain fúziós fehérjék elleni monoklonális ellenanyagok előállításával. A 19. példa a humán ad génszekvenciákkal homológ egér cDNS-szekvenciákra irányul. A 20. példa leírja további egér ad cDNS-klónok izolálását, melyeket felhasználhatunk a szekvenciaanalízis megerősítésére. A 21. példa különböző egérszövetek in situ hibridizációjára vonatkozik, ezzel a módszerrel megállapítható a feltételezetten humánnal homológ egér ad szövet és sejtspecifikus expressziója. A 22. példa leírja a humánnal feltételezetten homológ egér ad-t kódoló expressziós konstrukciók létrehozását. A 23. példa a „kiütéses” egér tervezésére irányul, melyben a humánnal feltételezetten homológ egér ad-t kódoló gén sérült. A 24. példa a humán ad kódolószekvenciával homológ nyúl cDNS-klónok izolálását írja le. A 25. ábra leírja a humán kórállapotok állatmodelljeit, melyekben az ad modulálását terápiás képességének szempontjából vizsgáljuk. A 26. ábra leírja az ad expresszióját kórképeket mutató állatmodellekben.
1. példa
Kísérlet a kutya otmi humán homológjának kimutatására
Egy kísérletben a kutya αγΜ·| egy humán homológjának azonosítására a kutya αγΜ1-Γβ specifikus Ca11.8H2 [Moore és munkatársai; Tissue Antigens 36, 211-220 (1990)] monoklonális ellenanyagot humán perifériális fehérvérsejtek keresztreaktivitására nézve teszteltük. A sejtpreparátumokat (tipikusan 1*106 sejt) inkubáltuk hígítatlan hibridóma felülúszóval vagy egy tisztított egér IgG-negatív kontrollellenanyaggal (10 pg/ml) jégen 0,1% nátrium-azid jelenlétében. A monoklonális ellenanyag kötődését közvetlenül ezután mutattuk ki
HU 223 977 Β1 pg/ml FTIC-vel konjugált ló antiegér IgG-vel (Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubálással. A megfestett sejteket fixáltuk 2 vegyes% paraformaldehidet tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS), és analizáltuk Facstar Plus fluoreszcens aktivációs sejtszortírozóval 5 (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Tipikusan 10 000 sejtet analizáltunk felhasználva a fluoreszcens intenzitás fokozásához a logaritmikus amplifikációt.
Az eredmények azt mutatták, hogy a Ca11.8H2 a humán perifériális fehérvérsejtek felületén megnyilvá- 10 nult fehérjékkel nem mutat keresztreakciót, míg a kontroll neoplasztikus kutya perifériális fehérvérsejtek aTMrre nézve lényegében mind pozitív volt.
Mivel a kutya α-alegységre specifikus Ca11.8H2 monoklonális ellenanyag a humán homológjával nem 15 mutat keresztreakciót, ezért a kutya αγΜ1 DNS-izolálását szükséges előfeltételnek tartottuk a humán gén hasonmásának izolálásához, ha ilyen létezik.
2. példa 20
Az N-terminális szekvenáláshoz a kutya aTM1 affinitástisztítása
Az oligonukleotid próba/primer tervezéshez szükséges N-terminális aminosavszekvenciák meghatározása érdekében affinitáskromatográfiával tisztítottuk a 25 kutya aTM1-et. Röviden, az anti-aTM1 Ca11.8H2 monoklonális ellenanyagot Affigel 10 kromatográfiás gyantához (Biorad, Herkules, CA) kötöttük, és a fehérjét specifikus ellenanyag-fehérje kölcsönhatás segítségével izoláltuk. A BioRad által ajánlott eljárási séma 30 szerint az ellenanyag konjugálódott a gyantához hozzávetőleg 5 mg ellenanyag/ml gyanta koncentrációban.
A konjugációs reakciót követően az ellenanyag feleslegét és a gyantát blokkoltuk három térfogatnyi 0,1 M etanol-aminnal. A gyantát ezután mostuk harminc ősz- 35 loptérfogatnyi foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS).
Egy kutyából 25 gramm lépet homogenizáltunk 250 ml proteázinhibitort tartalmazó következő összetételű pufferben: 0,32 M szukróz, 25 mM Tris-HCI, pH=8,0. A sejtmagokat és a sejttörmelékeket ülepítet- 40 tűk 15 perces centrifugálással 1000 g-n. A felülúszóból a membránokat ülepítettük 30 perces 100 000 g-s centrifugálással. A membránüledéket felszuszpendáltuk 200 ml lízispufferben (50 mM NaCl, 50 mM borát, pH=8,0, 2% ΝΡ-40-nel kiegészítve), és 1 órán át jégen 45 tartottuk. Az oldhatatlan anyagokat ezután ülepítettük 60 perces, 100 000 g-s centrifugálással. A kitisztult lizátum 10 ml-ét felvittük 15 ml-es polipropilénoszlopra, mely az előzőekben leírt 0,5 ml Ca11,8H2-vel konjugált Affigel 10 gyantát tartalmazott. Az oszlopot inkubáltuk 50 4 °C-on egy éjszakán át forgatás közben, és a gyantát ezután mostuk 50 oszloptérfogatnyi D-PBS-sel.
A gyantát ezután mikrocentrifugacsőbe tettük, és forraltuk 10 percig 1 ml Laemmli (nem redukáló) mintapufferben (0,1 M Tris-HCI, pH=6,2, 2% SDS, 20% glicerin és 0,002% brómfenolkék). A gyantát centrifugálással ülepítettük és eldobtuk, a felülúszót kezeltük 1/15 térfogatnyi 15-merkapto-etanollal (Sigma, St. Louis, MO), majd futtattuk 7%-os poliakrilamidgélben. Az elkülönített fehérjéket Immobilon PVDF membránra vittük át a következőkben leírtaknak megfelelően.
A géleket egyszer mostuk, ionmentes Millipor membránon szűrt vízzel, és 15-45 percig egyensúlyba hoztuk 10 mM 3-[ciklohexamino]-1-propánszulfonsav (CAPS) transzfer pufferben (pH=10,5, 10% metanollal kiegészítve). Az Immobilon membránokat metanollal nedvesítettük, öblítettük szűrt vízzel, és egyensúlyba hoztuk 15-30 percig történő CAPS-pufferes kezeléssel. Biorad transzferkészüléket használtunk (70 V, 30 perc) az első átvitelhez. Az Immobilon membránokat az átvitel után eltávolítottuk, és festettük 10 percig szűrt R250 Coomassie festékkel. A membránokat festékmentesítettük 50% metanol/10% ecetsav oldatban háromszor 10 perces mosással. A festékmentesítés után a membránokat szűrt vízben mostuk és szárítottuk.
A következő fehérjesávokat mutattuk ki: 150 kD, 95 kD, 50 kD és 30 kD. Feltételezhetően az 50 kD-os és 30 kD-os sávok az ellenanyag-szennyezésből származnak. Ezután megkíséreltük mind a 150 kD, mind a 95 kD sávok N-terminálisának szekvenálását, de a 95 kD-os fehérje blokkolt volt, így ez megakadályozta a szekvenálást. A 150 kD-os fehérjesávot kivágtuk a membránból, és közvetlenül szekvenáltuk egy Applied Biosystems (Foster City, CA) Model 473A fehérjeszekvenáló készülékben a gyártó utasításainak megfelelően. Az eredményül kapott aminosavszekvencia száma 5, a közzétételnél az aminosavak betűjelét használtuk:
FNLDVEEPMVFQ a szekvencia száma: 5
Az azonosított szekvencia tartalmazza az integrincsalád α-alegységeire jellemző FNLD szekvenciát [Tamura és munkatársai: J. Cell. Bioi. 111, 1593-1604 (1990)].
A primer tervezése és kísérlet a kutya aTM1-szekvenciák sokszorozására
Az N-terminális szekvenciainformációból három oligonukleotidpróbát terveztünk a hibridizációhoz: a) „Tommer” egy teljesen degenerált oligonukleotid; b) „Patner” egy részlegesen degenerált oligonukleotid; és c) „Guessmer egy nem degenerált emlős kodonhasználaton alapuló oligonukleotid. Ezen próbákat az alábbiakban közzétettük a 6, 7 és 8 szekvenciaszámon. A nukleinsavszimbólumok összhangban vannak a 37 C.F.R. 1.882 §ával ezeknél és minden további nukleotidszekvenciánál.
5’-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3'
5’-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3’
5’-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3’ (a szekvencia száma: 6) (a szekvencia száma: 7) (a szekvencia száma: 8)
Az oligonukleotidokat felhasználtuk a λΖΑΡ (Strata- riális vér makrofág cDNS-könyvtárnak több, alacsony gene, La Jolla, CA) vektorba klónozott kutya lép/perife- 60 pontosságú hibridizációjában, a szekvenálási adatok
HU 223 977 Β1 alapján azonban nem mutattunk ki tárgyhoz tartozó kiónokat.
Az N-terminális kikövetkeztetett szekvenciája alapján a fentiekben leírt Stratagene könyvtár lemezlizátumaiból tisztított kutya αγΜ1 DNS-szekvenciák PCR-ben 5 történő sokszorozásához közvetlenül ezután négy másik oligonukleotidprimert terveztünk, melyek jelölése: 5' Deg, 5’ Spec, 3’ Deg és 3’ Spec (a következő szekvenciaszámon tettük ezeket közzé: 9,10, 11, illetve 12), és ahol a Deg jelentése degenerált, és a Spec jelentése nem degenerált.
5’-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3’
5’-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3’
5’-TGRAANACCATNGGYTC-3’
5’-TTGGAAGACCATNGGYTC-3’ (a szekvencia száma: 9) (a szekvencia száma: 10) (a szekvencia száma: 11) (a szekvencia száma: 12)
Az αγΜ1 oligonukleotidprimereket párosítottuk a Bluescript phagemidben lévő polilinker régiót határoló T3 és T7 vektor primerekkel, és a következő számokon 15 szekvenciákkal hibridizálnak. tettük közzé: 13 és 14, ezek a λΖΑΡ-ban található,
5’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’
5’-AATACGACTCACTATAG-3' (a szekvencia száma: 13) (a szekvencia száma: 14)
A PCR-sokszorozást Taq pufferben (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) hajtottuk végre, mely tartalmazott: 150 ng könytár-DNS-t, 1 pg-ot mindegyik primerből, 200 μΜ dNTP-ket és 2,5 egység Taq polimerázt (Boehringer-Mannheim), és a termékeket elektroforézissel szétválasztottuk 1% agarózgélen, Tris-acetát-EDTA (TAE) pufferben és 0,25 pg/ml etidium-bromid jelenlétében. A DNS-t Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL) membránra lenyomatoltuk egy éjszakán át 10*SSPE-ben. Az átvitel után a rögzített DNS-t denaturáltuk 0,5 M NaOH-ot és 0,6 M NaCIot tartalmazó oldattal, majd semlegesítettük 1,5 M NaCI-ot tartalmazó 1,0 M Tris-HCI-oldattal (pH=8,0), és mostuk 2*SSPE-ben, mielőtt UV-keresztkötöttük egy Stratalinker (Stratagene) keresztkötő készülékkel. A membránt inkubáltuk prehibridizációs pufferrel (5*SSPE, 4*Denhardts, 0,8% SDS, 30% formamid) 2 órán át, 50 °C-on, enyhe mozgatás közben.
Az 5'Deg, az 5’Spec, a 3’Deg és a 3’Spec jelű oligonukleotidpróbákat (szekvenciaszámaik: 9, 10, 11, illetve 12) jelöltük 100-300 pCi yP32-dATP-vel 1-3 óráig 37 °C-on felhasználva egy Boehringer-Mannheim kinázpuffert és 1-3 egység polinukleotid-kinázt. A beépületlen jelt Sephadex G-25 finomszemcsés oszlopon (Pharmacia, Piscatway, NJ) eltávolítottuk TE-pufferrel (10 mM Tris-HCI, pH=8,0,1 mM EDTA), és a prehibridizációs oldathoz közvetlenül hozzáadtuk az átfolyó oldatot. A membránokat próbákkal kezeltük 16 órán át 42 °C-on, és ismételten mostuk azokat 15 percig 50 °C-on 1*SSPE/0,1% SDS-t tartalmazó nagy precizitást biztosító oldattal. A lenyomatokat ezután exponáltuk Kodak X-Omat AR filmre 1-4 óráig -80 °C-on. Az 5’Deg, 5’Spec, 3'Deg és 3’Spec oligonukleotidok csak azokkal a PCR-termékekkel hibridizáltak, melyek olyan reakcióból származtak, amelyekben primerként használtuk azokat, és a várakozással szemben nem hibridizáltak azokkal a PCR-termékekkel, melyekben nem primerként használtuk azokat. így arra a következtetésre jutottunk, hogy egyik PCR-termék sem volt specifikus az aTM1re nézve, mivel egyik termék sem hibridizált a megfelelő próbával.
3. példa
A belső szekvenáláshoz nagy mennyiségű kutya aTM1 affinitástisztítása
A primertervezéshez további aminosavszekvenciák biztosítására kutya aTM1-et tisztítottunk a belső szekvencia megállapításához. A belső szekvenáláshoz felnőtt kutyákból származó három fagyasztott lépmetszetet (hozzávetőleg 50 g-osak) és két lépdarabból származó fagyasztott sejteket használtunk a fehérjék ki35 nyeréséhez. Ötven gramm lépet homogenizáltunk 200-300 ml borátpufferben, Waring keverőben. A homogenizált anyagot hígítottuk 1 térfogatnyi 4% ΝΡ-40-et tartalmazó pufferrel, és a keveréket ezután gyengén mozgattuk legalább egy óráig. Az eredményül kapott lizátumot centrifugálással tisztítottuk meg a nagy törmelékektől (20 perc 2000 g), és ezután megszűrtük vagy Corning (Corning, NY) előszűrőn, vagy Corning 0,8 mikronos szűrőn. A lizátumot tovább tisztítottuk Corning 0,4 mikronos szűrőrendszerben.
A léplizátumot és a 2. példában leírt Affigel 10 gyantához konjugálódott ellenanyagot 150:1 arányban egymással elegyítettük 100 ml-es egyenlő egységekben, és egy éjszakán át inkuláltuk 4 °C-on forgatással. A lizátumot az 5 perces 1000 g-n történő centrifu50 gálással eltávolítottuk, és tovább elegyítettük az Affigel 10 gyantához konjugált ellenanyag további mennyiségével, és inkubáltuk a fentieknek megfelelő körülmények között egy éjszakán át. Ezután egyesítettük a fehérjékkel abszorbeálódott gyanta egyenlő mennyisé55 geit, és 50 térfogatnyi D-PBS/0,1% Tween 20-szal mostuk, és a gyantát 50 ml-es Biorad oszlopra vittük. Az abszorbeálódott fehérjét eluáltuk az oszlopról 3-5 térfogatnyi 0,1 M glicinnel (pH=2,5), a hozzávetőleg 900 μΙ-es frakciókat összegyűjtöttük és semlegesí60 tettük 100 pl 1 M Tris-HCI-dal (pH=8,0). 15 μΙ-es mintá8
HU 223 977 Β1 kát vettünk mindegyik frakcióból, és forraltuk egyenlő térfogatú 2xLaemmli mintapufferben, mely 1/15 térfogatnyi 1 M ditiotreitolt (DTT-t) tartalmazott. Ezeket a mintákat elektroforetizáltuk 8% Novex (San Diego, CA) poliakrilamidgélen, és akár Coomassie festékkel, akár 5 ezüstfestékkel, felhasználva a Daiichi készletet (Enprotech, Natick, MA), láthatóvá tettük a gyártó által javasolt kimutatási sémának megfelelően. A legtöbb fehérjét tartalmazó frakciókat összeöntöttük és betöményítettük vákuum alatt. A megmaradó oldatokat felére hígítottuk redukáló Laemmli mintapufferrel és futtattuk 7%-os 1,5 mm-es poliakrilamidgélben Tris-glicin/SDS puffért használva. A fehérjét a gélről a 2. példában leírt módszerrel Hoefer transzferkészülékkel lenyomatoltuk Immobilon membránra.
A kutya aTM1-nek megfelelő fehérjesávokat kivágtuk a 10 PVDF membránokból, és így hozzávetőleg 47 pg fehérjét kaptunk. A sávokat festékmentesítettük 5 percig 4 ml 50%-os metanolban, a levegőn megszárítottuk, és 1 *2 mm-es darabokra vágtuk. A membrán- 20 darabokat 2 ml 95%-os acetonba helyeztük 4 °C-on 30 percig időnként votexezve, majd a levegőn megszárítottuk.
A membránhoz kötött fehérjék proteolitikus hasítása előtt oldottunk 3 mg bróm-ciánt (CNBr, Pierce, Rockford, IL) 1,25 ml 70%-os hangyasavban. Ezt az oldatot ezután hozzáadtuk a PVDF membrándarabokat tartalmazó csövekhez, és inkubáltuk a csöveket sötétben szobahőmérsékleten 24 óráig. A felülúszót (S1) ezután eltávolítottuk, másik csőbe öntöttük, és a 30 membrándarabokat mostuk 0,25 ml 70%-os hangyasavval. Ezt a felülúszót (S2) is eltávolítottuk, és az első felülúszóhoz (S1) öntöttük. Az egyesített felülúszókhoz (S1 és S2) 2 ml Milli Q vizet adtunk, és az oldatot liofileztük. A PVDF membrándarabokat megszárítottuk nitrogén alatt, és újra extraháltuk 1,25 ml 60%-os acetonitrilt és 0,1% tetrafluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó oldatban 42 °C-on 17 óráig. A felülúszót (S3) eltávolítottuk, és a membrándarabokat újra kivonatoltuk 1,0 ml
0,08% TFA-val kiegészített 80% acetonitrilben 42 °Con 1 óráig. Ezt a felülúszót (S4) egyesítettük az előző felülúszókkal (S1, S2 és S3), és vákuumban szárítottuk.
A szárított CNBr-fragmenseket ezután feloldottuk 63 μΙ 8 M ureát és 0,4 M NH4HCO3-ot tartalmazó oldatban. A fragmenseket redukáltuk 5 μΙ 45 mM ditiotreitolban (DTT-ben), és közvetlenül ezután inkubáltuk 50 °C-on 15 percig. Az oldatot ezután lehűtöttük szo10 ba-hőmérsékletűre, és a fragmenseket alkileztük 5 μΙ 100 mM jód-acetamid (Sigma, St. Louis, MO) hozzáadásával. A szobahőmérsékleten történt 15 perces inkubáció után a mintákat hígítottuk 187 μΙ Milli Q vízzel 2,0 M urea végkoncentrációig. Ezután tripszin enzimet 15 (Worthington, Freehold, NJ) adtunk 1:25 térfogatarányban a fehérjéhez, és a fehérjét emésztettük 24 óráig 37 °C-on. Az emésztést 30 μΙ TFA-val állítottuk le.
Ezután a fehérjefragmenseket HPLC-vel elkülönítettük Waters 625 LC rendszeren (Millipore, Milford, MA), felhasználva egy 2,1 χ250 mm, 5 mikronos Vydac C-18 oszlopot (Vydac, Hesperia, CA), amelyet HPLC minőségű vízben oldott 0,05% TFA-val (A puffer) hoztunk egyensúlyba. A fehérjéket eluáltuk növekvő koncentrációjú 0,04% TFA-t tartalmazó 80% acetonitrilol25 dattal (B puffer), a gradiensben a B puffer 38-75%-ig változott a 65-95. percig, majd 75-98%-ig változott a 95-105. percig. A peptideket 0,2 ml/perc áramlási sebességgel választottuk el egymástól, és 210 nm-en detektáltuk.
A szétválasztást követően a peptidek aminosavszekvenciáját analizáltuk automatikus Edmann-lebontással egy Applied Biosystems Model 437A fehérjeszekvenáló berendezésben, felhasználva a gyártó standard ciklusait és a Model 610A Data Analysis prog35 ramot (a verzió száma: 1.2.1). A szekvenáláshoz minden reagenst az Applied Biosystemstől szereztünk be. A nyolc belső fragmens közül hét aminosavszekvenciáját az alábbiakban tettük közzé, ahol „X” azt az aminosavat jelöli, amely nem biztos.
VFQEXGAGFGQ LTDXVAATGLXQPI PLEYXDVIPQAE FQEGFSXVLX TSPTFIXMSQENVD LWGAPLEWAVXQTGR LDXKPXDTA (a szekvencia száma: 15) (a szekvencia száma: 16) (a szekvencia száma: 17) (a szekvencia száma: 18) (a szekvencia száma: 19) (a szekvencia száma: 20) (a szekvencia száma: 21)
A primer tervezése generált oligonukleotidprimer [jele: p4(R)] tervezésé-
Az egyik belső aminosavszekvenciát (22-es szá- 50 hez, az így kapott szekvenciát 23-as számon tettük
mon tettük közzé) ezután felhasználtuk a teljesen de- közzé.
FGEQFSE (a szekvencia száma: 22)
5’-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3’ (a szekvencia száma: 23)
4. példa
A kutya aTM1-fragmens PCR-klónozása A kettős szálú kutyalép cDNS-ből PCR-rel sokszoroztuk a kutya aTM1 gén 5' részét.
A) A kettős szálú kutyalép cDNS előállítása Egy fiatal fagyasztott kutyalép egy grammját felőröltük folyékony nitrogénben szárazjégen, és homo60 genináltuk 20 ml RNA-Stat 60 pufferben (TelTest B
HU 223 977 Β1
Inc., Friendswood, TX). Majd hozzáadtunk 4 ml kloroformot, és az oldatot extraháltuk 15 perces 12 000 gos centrifugálással. A vizes fázisból kicsaptuk az RNS-t 10 ml etanollal. Ezután a poliA+ RNS-t elválasztottuk Dynal oligo-dT Dyna gyöngyön (Dynal, Oslo, Norvégia). A teljes RNS öt egyenlő 100 pg-os mennyiségét összekevertük és hígítottuk egyező térfogatú 2*kötőpufferrel (20 mM Tris-HCl, pH=7,5, 1,0 M LiCI, 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Ezután inkubáltuk az RNS-t 5 percig oligo-dT Dyna gyöngyökkel (1 ml vagy 5 mg gyöngyöt adtunk mindegyik mintához). A gyöngyöket mostuk a gyártó által ajánlott eljárási séma alapján a következő összetételű pufferrel: 10 mM Tris-HCl, pH=7,5, 0,15 mM LiCI, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, majd a poli-A+ mRNS-t eluáltuk 2 mM EDTA-val (pH=7,5). Ezután kettős szálú cDNS-t készítettünk felhasználva az eluált poliA+ mRNS-t és a Boehringer-Mannheim cDNS-szintézis készletét a gyártó által ajánlott eljárási séma szerint.
B) Egy részleges kutyaeredetű αγΜ1 cDNS izolálása
Az 5’Deg (a szekvencia száma: 9) és a p4(R) (a szekvencia száma: 23) oligonukleotidprimereket standard PCR reakcióban alkalmaztuk, felhasználva 150 ng kettős szálú cDNS-t, 500 ng-ot mindegyik primerből, 200 pM dNTP-ket és 1,5 egység Taq polimerázt (Boehringer-Mannheim) Taq-pufferben (Boehringer-Mannheim) magnézium jelenlétében. A kitermelés növelése érdekében a keletkezett termékeket (az eredeti reakció 1 pl-re) újból PCR-rel sokszoroztuk ugyanazokkal a primerekkel. Ezt a sávot eluáltuk az 1%-os agarózgélből Schleicher & Schull (Keene, NH) NA45 papírra 65 °C-on a következő összetételű pufferben: 10 mM Tris-HCl, pH=8,0, 1 mM EDTA és 1,5 mM NaCl, majd kicsaptuk és ligáltuk a pCR,mH vektorba (Invitrogen, San Diego, CA), felhasználva a TA klónozókészletet (Invitrogen) a gyártó utasításainak megfelelő eljárási séma szerint. A ligációs keveréket elektroporációval transzformáltuk XL-1 Blue baktériumokba (Stratagene). A 2.7 jelű klónról megállapítottuk, hogy az αγΜ1 peptidszekvenciáknak megfelelő, a primerek tervezésében nem használt szekvenciákat tartalmaz.
A szekvenálást egy Applied Biosystems 373A DNS-szekvenáló készülékkel (Foster City, CA) végeztük Dye-deoxy terminátor szekvenciakészlettel (ABI), melyben a fluoreszcensen jelölt dNTP-k egy aszimmetrikus PCR reakcióban [McCabe: Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, szerkesztők: Innis és munkatársai 76-83, Academic Press: New York (1990)] épültek be a következőkben leírtak szerint. A mintákat 96 °C-on tartottuk 4 percig, és 25 ciklusban sokszoroztuk, egy ciklus a következő lépésekből áll: 15 s 96 °C-on, 1 s 50 °C-on és 4 perc 60 °C-on. A szekvenciaadatokat automatikusan mintafájlokba letöltöttük olyan komputerbe, amely kromatogramokat és szövegfájlokat tartalmazott. A 2.7 jelű klón teljes inszertszekvenciáját közzétettük a 24-es szekvenciaszámon.
A teljes hosszúságú kutya aTM1 cDNS izolálásának kísérlete sikertelen volt a Stratagene-könyvtárból (ahogy azt a 2. példában leírtuk). A 2.7 kiónt próbaként felhasználva hozzávetőleg 1*106 fágplakkot hibridizációval szűrtünk 30% formamid jelenlétében kis precizitást biztosító körülmények között. Azok a kísérletek, amelyek a tárgyhoz tartozó 2.7 kiónban 3' irányban elhelyezkedő szekvenciák sokszorozására irányultak, felhasználva a 2.7 klónból származó specifikus oligonukleotidokat vagy a konzervatív α-alegység GFFKR aminosavmotívumon [Tamura és munkatársai: J. Cell. Bioi. 111, 1539-1604 (1990)] alapuló degenerált oligonukleotidokkal párosodott más peptidfragmensek aminosavszekvenciáin alapuló degenerált primereket, sikertelenek voltak.
5. példa
A kutya aTU1 feltételezett humán homológjának klónozása
A kutya aTMi humán szekvencia homológjának izolálására szolgáló kísérletben a 2.7 klón hozzávetőleg 1 kb nagyságú kutya aTM1 fragmensét használtuk próbaként. A próbát PCR-rel készítettük a 2. példában leírtaknak megfelelő körülmények között, felhasználva az NT2 (a 25-ös szekvenciaszámon tettük közzé) és a p4(R) (a 23-as szekvenciaszámon tettük közzé) primereket.
5’-GTNTTYCARGARGAYGG-3' (a szekvencia száma: 25)
A PCR-termékeket tisztítottuk, felhasználva a Qiagen (Chatsworth, GA) Quick Spin készletet a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A tisztított DNS-t 50 (200 ng) jelöltük 200 pCi a32PdCTP-vel, felhasználva a Boehringer-Mannheim Random Prime Labelling készletét és a gyártó által javasolt eljárási sémát. Sephadex G-25 (finomszemcsés) kromatográfiával eltávolítottuk a beépületlen izotópot. A próbát denaturáltuk 0,2 N 55 NaOH-dal, és használat előtt semlegesítettük 0,4 M Tris-HCI-dal (pH=8,0).
Hybond szűrőre kolóniakiemelési módszerrel elkészítettük a pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA) plazmidban lévő humán lép cDNS-könyvtárat. A filtere- 60 két először denaturáltuk és semlegesítettük a 2. példában leírtaknak megfelelően, és közvetlenül ezután inkubáltuk 30% formamidot tartalmazó prehibridizációs oldatban (szűrőnként 8 ml) gyenge mozgatás közben 2 óráig. A fentiekben leírt jelzett próbát hozzáadtuk a fenti oldathoz, és a szűrőket inkubáltuk 14 óráig 42 °Con. A szűrőket kétszer mostuk 2*SSC/0,1% SDS-sel 37 °C-on, és kétszer 2*SSC/0,1% SDS-sel 50 °C-on. A végső nagy pontosságú mosásokat 1*SSC/0,1% SDS-sel kétszer végeztük 65 °C-on (az 1*SSC összetétele: 150 mM NaCl, 15 mM nátrium-citrát, pH=7,0). A szűrőket 6 óráig exponáltuk Kodak X-Omat AR filmre erősítőernyővel. A jelt adó kolóniákat a kiemelési repli10
HU 223 977 Β1 kák párjáról csíkoztuk magnéziummal (LBM) és carbenicillinnel kiegészített LB lemezekre, és 37 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. Az eredményül kapott kicsíkozott kolóniákat Hybond filterekre replikáztuk, és ezeket a filtereket kezeltük a fentieknek megfelelően. A filtereket szigorúbb feltételek mellett hibridizáltuk a 2.7 klónból származó 1 kb nagyságú próbával, az előzőekben leírtaknak megfelelően jelöltük 50% formamidot tartalmazó hibridizációs oldatban 3 óráig 50 °C-on. A próbával jelölt filtereket végül mostuk nagy pontosságú hibridizációt biztosító 1*SSC/0,1% SDS-sel 65 °C-on, és Kodak X-Omat AR filmre exponáltuk erősítőernyővel, 2,5 óráig, -80 °C-on. A pozitív kolóniákat azonosítottuk és tenyésztettük LBM/carbenicillin táptalajon egy éjszakán át. A tenyészetek DNS-ét kinyertük felhasználva a Promega Wizard miniprep készletet a gyártó által javasolt eljárási séma szerint, és az eredményül kapott DNS-t szekvenáltuk.
Az előszűréssel 18 pozitív kolóniát nyertünk, míg a második, szigorúbb hibridizációs feltételek mellett végzett szűrés csak egy kolóniát eredményezett, melyet 19A2-nek neveztünk el. A 19A2 klón humán ad DNS-szekvenciáját és a kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját 1-es, illetőleg 2-es szekvenciaszámon közzétettük.
A humán ad cDNS és a megjósolható polipeptid jellemzése
A 19A2 klón tartalmazza az érett fehérje teljes kódolórészét, ezenkívül a szignálszekvencia 5’ részének 48 bázisát (16 aminosavmaradék) és a 3’ nem transziáit szekvencia 241 bázisát, mely nem végződik poliadenilációs szekvenciában. Az érett fehérje magjának molekulatömege megjósolhatóan körülbelül 125 kD. Az extracelluláris domainről megjósolható, hogy hozzávetőleg a 2-es számú szekvencia 17-1108. aminosavmaradékait tartalmazza. Ez az extracelluláris régió folytonos a humán CD11c transzmembrán régiójának (a 2es számú szekvencia 1109-1128. aminosavmaradéka) körülbelül 20 aminosav nagyságú homológ régiójával. A citoplazmatikus domain hozzávetőleg 30 aminosavat tartalmaz (a 2-es szekvenciaszámú molekula 1129-1161. aminosavmaradékai). A fehérje egy olyan hozzávetőleg 202 aminosav hosszúságú régiót (körülbelül a 150-352. aminosavmaradékok) is tartalmaz, mely homológ a CD11a, CD11b és CD11c [Larson és Springer: Immunoi. Rév. 114, 181-217 (1990)], az aE [Shaw és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 6016-6025 (1994)] és a VLA-1, valamint a VLA-2 [Tamura és munkatársai: J. Cell. Bioi. 111, 1539-1604 (1990)] mindegyikében megtalálható l (inszerciós) domainnel. Más integrinekben kimutatták, hogy az I domain részt vesz az ICAM-kötésben [Landis és munkatársai: J. Cell. Bioi. 120, 1519-1527 (1993); és Diamond és munkatársai: J. Cell. Bioi. 120, 1031-1043 (1993)], ez a tény arra utal, hogy az ad is kapcsolódni képes a felületi molekulák ICÁM családjának más tagjaihoz. Erről a régióról nem mutatták ki, hogy létezne bármely más integrin alegységben.
Az ad kikövetkeztetett aminosavszekvenciája hozzávetőleg 36%-ban azonos a CD11a-val, hozzávetőleg
60%-ban azonos a CD11b-vel és hozzávetőleg 66%ban azonos a CD11c-vel. Az 1. ábrán bemutatjuk a
CD11b (a szekvencia száma: 3), a CD11c (a szekvencia száma: 4) és az ad (szekvencia száma: 2) aminosavszekvenciáinak elrendezését.
A β2 integrinek α-alegységeinek citoplazmatikus domainjei tipikusan különböznek egymástól ugyanabban a fajban, míg az egyedi ad alegységek nagyfokú homológiát mutatnak a fajhatárokon túl. Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban van, hogy az ad citoplazmatikus régiója jelentősen különbözik a CD11a-tól, CD11b-től és a CD11c-től, kivéve egy membránközeli GFFKR aminosavszekvenciától, amelyről kimutatták, hogy mindegyik integrinnél konzervatív [Rojiani és munkatársai: Biochemistry 30, 9859-9866 (1991)]. Mivel az integrinek citoplazmatikus farokrésze szerepet játszik az „inside-out” jelben és „mohóság” szabályozásában [Landis és munkatársai: J. Cell. Bioi. 120, 1519-1527 (1993)], ezért lehetséges, hogy az ad kölcsönhat azokkal a citoszolban lévő molekulákkal, amelyek különböznek a CD11a-val, CD11b-vel és CD11c-vel kölcsönható molekuláktól, és ennek eredményeként részt vesznek a β2 integrineket nem tartalmazó jelátviteli utakban.
Az ad extracelluláris domainje egy konzervatív aminosavszekvenciát tartalmaz az I domain közelében; a CD11b-ben a DGSGS szekvencia a ligandkölcsönhatáshoz szükséges fémkötő régió [Michishita és munkatársai: Cell. 72, 857-867 (1993)]. A CD11b-ben és a CD11c-ben lévő további három feltételezhetően kationkötő hely megőrződött a 19A2 kiónban is az ad 465-474., 518-527. és a 592-600. aminosavszekvenciáinál (a szekvencia száma: 1). Az ad domain azonos 36%-ban, 62%-ban és 57%-ban a CD11a, CD11b, illetőleg CD11c szóban forgó régióival, és a viszonylagosan kismértékű szekvenciahomológia arra utal, hogy az ad kölcsönhatásba léphet extracelluláris fehérjékkel, melyek más ismert β2 integrinekkel kölcsönhatást mutató fehérjéktől különböznek. Alternatívaként az ad és az ismert β2 integrin ligandok közötti affinitás (például ICAM-1, ICAM-2 és/vagy ICAM-R) különbözhet attól, melyet más integrin/ICAM kölcsönhatásoknál kimutattak (lásd a 12. példát).
További humán ad cDNS-klónok izolálása a szekvencia megerősítéséhez
A humán ad-t kódoló DNS-szekvenciák megerősítésére további humán cDNS-eket izoláltunk hibridizációval humán lép oligo dt-primeres cDNS-könyvtárából (Invitrogen) olyan pcDNA/Amp (leírása az 5. példában) vektorba, amelyet méret szerint agarózgélelektroforézissel szelektáltunk a 3 kb-nál nagyobb cDNS-ekre nézve. A hibridizációs próba az ad 5’ régiójából származott, ahogy azt már az alábbiakban leírtuk. Az első humán ad klón izolálásához a hibridizáció körülményei megegyeztek a fentiekben leírtakkal, kivéve, hogy az ezt követő hibridizációnál a filtereket kétszer mostuk 2*SSC/0,1% SDS-sel szobahőmérsékleten, és egyszer mostuk 2*SSC/0,1% SDS-sel 42 °C-on. A filtereket exponáltuk Kodak X-Omat AR filmre egy éjszakán át.
HU 223 977 Β1
Az 5’ ad hibridizációs próbát PCR-rel készítettük a 19A2 klónból, felhasználva a CD11c 5’ Fór (a szekvencia száma: 94) és a CD11c 5’ Rév (a szekvencia száma: 95) primereket a következő körülmények között.
A mintákat 4 percig 90 °C-on tartottuk, és 30 ciklusban sokszoroztuk, egy ciklus a következő lépésekből állt: i) 15 s 94 °C-on, ii) 30 s 5 °C-on és iii) 1 percig 72 °C-on Perkin-Elmer 9600 hőmérséklet-ciklizálóban.
CD11c 5’ Fór: (5’) CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG (3’) CD11c 5’ Rév: (5’) CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC (3’) (a szekvencia száma: 94) (a szekvencia száma: 95)
A sokszorozási terméket BioRad (Hercules, CA) 10 Prep-A-Gene készlettel tisztítottuk a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. Az eredményül kapott 5’ adpróbák hozzávetőleg 720 bázis hosszúságúak voltak, és megfeleltek az 1-es szekvencia 1121-1839. nukleotidjainak. A tisztított DNS-t jelöltük (hozzávetőleg 50 ng) 32P-dCTP-vel, felhasználva a Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana) Random Primer Labelling készletét a gyártó által javasolt eljárási sémának megfelelően. A beépületlen izotópot Centrisep Spin Collums (Princeton Separations, Adelphia, NJ) 20 oszloppal eltávolítottuk a gyártó által javasolt eljárási sémának megfelelően. A jelölt próbákat hozzáadtuk a filterekhez 45% formamidot tartalmazó prehibridizációs oldatban, és az inkubációt egy éjszakán át 50 °C-on végeztük. Az inkubáció után a filtereket a fentiekben leírtaknak megfelelően mostuk.
Tizenhárom kolónia mutatott jelt a replikákon. A pozitív kolóniákat kiemeltük a mesterlemezekről, hígítottuk carbenicillint (100 pg/ml) tartalmazó LBM-ben, és különböző koncentrációkban lemezeltük Hybond 30 (Amersham) filterekre. A filterek másolatait azonos oldattal hibridizáltuk, mint amit az elsődleges hibridizációnál használtunk, és a hibridizáció utáni végső nagy pontosságú mosásokat 2*SSC/0,1% SDS-sel 42 °Con végeztük, majd a filtereket exponáltuk filmre.
A tizenhárom eredetileg izolált kolónia közül 10-et megerősítettünk a második szűrésben. A tíz kolónia közül két kolóniát (A7.Q-val és A8.Q-val jelöltük) szekvenáltunk, és megállapítottuk, hogy a humán ad-t kódolják. Az A7.Q klónról azt találtuk, hogy tartalmaz egy 40 hozzávetőleg 2,5 kb nagyságú szekvenciát, mely tartalmazza az 5’ vezetőszekvenciát, a kódolórégió egy részét és egy további 60 bázisos 5’ nem transzlálódott szekvenciát. A részleges kódolórégióról megállapítottuk, hogy hibásan összekapcsolódó intronrégió ered- 45 ményeként keletkezett az 1-es számú szekvencia 2152. nukleotidjának megfelelő helyen. Az A8.Q klónról megállapítottuk, hogy hozzávetőleg 4 kb nagyságú, átfogja az egész ad kódolórégiót, és az 1-es szekvencia 305. nukleotidjának megfelelő helyen szintén intronszekvenciát tartalmaz. Az eredetileg izolált ad klónnal (a szekvencia száma: 1) egybevetve egy különbséget figyeltünk meg mind az A7.Q, mind az A8.Q kiónoknál, nevezetesen az 1495. bázisnál CAG kodoninszerciót találtunk. Az A7.Q és A8.Q kiónok szekvenciáit 96, illetőleg 97 szekvenciaszámon tettük közzé, és az A7.Q és A8.Q kiónokból származó összetett humán szekvenciát, valamint az abból levezethető aminosavszekvenciát 98, illetőleg 99 szekvenciaszámon tettük közzé.
6. példa
A humán a^expresszió Nothern-blot-analizise szövetekben
Az ad viszonyított expressziós szintjének és szövetspecificitásának meghatározására Nothern-blot15 analízist végeztünk, felhasználva a 19A2 klón fragmentjeit próbaként. Több humán szövet vagy tenyésztett sejtvonal mindegyikéből hozzávetőleg 10 pg teljes RNS-t formaldehid-agarózgélre vittünk 1 pg etidiumbromid jelenlétében. A 4 óráig tartó, 100 V-on történő elektroforézis után az RNS-t lenyomatoltuk nitro-cellulóz-membránra (Schleicher & Schull) 10*SSC-ben, egy éjszakán át. A membránt szárítottuk 1,5 óráig 80 °C-on vákuumban. A 3-(N-morfolino)-propánszulfonsav (MOPS)-pufferben 50% formamidot tartalmazó 25 prehibridizációs oldatot használtunk a membrán blokkolására 3 óráig 42 °C-on. A 19A2 klón fragmenseit aP32dCTP-vel és aP32dTTP-vel egyszerre jelöltük Boehringer-Mannheim Random Prime készlet segítségével a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A beépületlen jelt Sephadex G-25 oszlopon TE-pufferrel távolítottuk el. A membránok próbával történő kezelését 1,5*106 beütés/ml prehibridizációs pufferrel végeztük. A lenyomatot ezután mostuk egymás után a következő oldatokkal: 2*SSC/0,1% SDS szobahőmérsékleten, 35 2*SSC/0,1% SDS 42 °C-on, 2*SSC/0,1% SDS 50 °Con, 1*SSC/0,1% SDS 50 °C-on, 0,5*SSC/0,1% SDS 50 °C-on és 0,1*SSC/0,1% SDS 50 °C-on. A lenyomatokat ezután filmre exponáltuk 19 órán át.
A 19A2 klón BstXI fragmense (az 1-es számú szekvencián megfelel a 2011-3388. nukleotidoknak) gyenge jelt adott a lépből, a méhlepényből, a csecsemőmirigyből és a mandulából származó teljes RNS 5 kb-os tartományában. Az etidium-bromidos festés alapján a vese sávjában jelen lévő RNS mennyisége minimális volt.
A 19A2 klón másik fragmensének használatakor (az 1-es szekvencia 500-2100. bázisait átfogó régiója) két különböző nagyságú RNS-transzkriptet mutattunk ki a több humán szövetet tartalmazó Nothern-blot (MTN) segítségével poliA+ RNS-t használva (Clon50 tech). A lépből és a vázizmokból hozzávetőleg 6,5 kbos sávot figyeltünk meg, míg a perifériális fehérvérsejtekből és a tüdőből egy 4,5 kb-ost detektáltunk. A megfigyelt méretbeli különbségek oka lehet a szövetspecifikus poliadeniláció, a próba keresztreakciója más integ55 rin családból származó tagokkal vagy az alternatívan összekapcsolódó mRNS-ekkel történő hibridizáció.
A 19A2 klónból származó harmadik fragmens (az 1-es számú szekvencián megfelel a 2000-3100. nukleotidoknak) Nothern-blot-analízise egybevág a 60 19A2 klón más fragmenseinek analízisével.
HU 223 977 Β1
Három mieloid sejtvonalból származó RNS-t is próbákkal vizsgáltunk, felhasználva az 1-es számú szekvenciának megfelelő 500-2100. és 2000-3000. nukleotidfragmenseket. Egy PMA-val előzőleg stimulált THP-1 sejtvonal egy diffúz jelt adott azonos tartomány- 5 bán (hozzávetőleg 5 kb) egy kicsit erősebb intenzitással, mint a szöveti jel. A nem stimulált és DMSO-val stimulált HL-60 sejtekből származó RNS az ad-próbával azonos intenzitással hibridizált, mint a szöveti minta, bár a PMA-kezelt erősebb jelintenzitást mutatott. Mivel 10 a PMA és a DMSO a HL-60 differenciálódását monocita/makrofág, illetőleg granulocita irányba tereli, ezért ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ad expressziója a monocita/makrofág sejttípusokban megnő.
Az U937 sejtekben PMA-stimuláció hatására az ad- 15 expresszió és így a jel sem erősödik. Nem tudtunk sávot kimutatni Molt, Daudi, H9, JY és Jurkat sejtekben.
7. példa
A humán árkonstrukciók átmeneti expressziója 20
A) Az expressziós konstrukciók előállítása
A 19A2 humán klónból hiányzik az iniciáló metioninkodon, és valószínűleg az 5’ szignálszekvencia egy része. Ezért a 19A2 szekvenciát tartalmazó humán expressziós plazmid kialakításához két eltérő stratégiát 25 alkalmaztunk. Az elsőben két plazmidot állítottunk elő, ezekben a plazmidokban egy kiméra ad szekvencia kialakításához a CD11 b-t vagy a CD11 c-t kódoló génből származó szignálpeptid-szekvenciát beépítettük a 19A2 kiónba. A másik megközelítésben egy harmadik plazmidot készítettünk, amelyben adenozinbázist építettünk a 19A2 klón 0. helyzetébe az iniciáló metionin kialakításához.
A három plazmid az ad 5' szekvenciát vagy a kíméra ad szekvenciát kódoló különböző régiókat tartalmazza. Az ad régiót egy specifikus 3' BamRev primerrel (közzététele a 26-os szekvenciaszámon történt) és a három 5’ primer egyikével PCR-rel sokszoroztuk (a körülményeket lásd a 2. példában). A három 5’ primer a következőket tartalmazza: (1) az 1-6. helyzetben azonos emésztést biztosító nemspecifikus bázisok, a 7-12. helyzetben EcoRI-helyet és a 13-18. helyzetben konszenzus Kozák szekvenciát; (2) a CD11b (ER1B primer) egy részét vagy a CD11c (ER1C primer) szignálszekvenciát, vagy egy adenozint (ERID primer); és (3) a primer összeolvasztásához a 19A2 kiónból származó 5’ szekvenciát specifikusan átfedő további 15-17 bázist. Az ER1B, ER1C és ERID primerek szekvenciáit a 27, 28, illetőleg a 29 szekvenciaszámon tettük közzé, ahol az iniciáló metioninkodont aláhúztuk, és az EcoRI helyet pedig vastag dőlt betűvel jelöltük.
5’-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3’ (a szekvencia száma: 26)
5’-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3’ (a szekvencia száma: 27) 5’-AGTTACGAA77CGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3’ (a szekvencia száma: 28) 5'-AGTTACGAA7TCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (a szekvencia száma: 29)
Az eredményül kapott PCR-termékeket EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztettük.
Mind a három plazmid tartalmaz egy közös második ad régiót (az előző bekezdésben leírt 5’ régióból közvetlenül 3' irányban inszertált), beleértve az ad klón 3’ végét. A második ad régiót, mely a 625. nukleotidtól a 19A2 klón 3’ polilinker régiójában lévő Xbal helyéig tart, izoláltuk a BamHI és Xbal restrikciós enzimekkel emésztett 19A2 klónból.
Három ligálást végeztünk, melyekben a 3’ ad BamHl/Xbal fragmenst ligáltuk a három 5’ ad EcoRI/BamHI fragmens egyikéhez, felhasználva a Boehringer-Mannheim ligázpuffert és T4 ligázt (egy reakcióban 1 egységet). 4 órás 14 °C-on történő inkubálás után a pcDNA.3 vektor (Invitrogen) megfelelő mennyiségét EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel emésztettük, miközben még 1 egység ligázt adtunk mindegyik reakcióhoz. A reakciókat folytattuk még további 14 órán keresztül folytattuk. A reakciókeverékek tizedrészét transzformáltuk kompetens XL-1 Blue sejtekbe. Az eredményül kapott kolóniákat tenyésztettük, és a DNS-t izoláltuk, mint az 5. példában. EcoRI-emésztéssel három kolóniát azonosítottunk, melyek a restrikciós helyre nézve pozitívak voltak, és így az elkészített szignálszekvenciát tartalmazták. A kiónokat pATM.B1-nek (CD11b/ad, az ER1B primerből), pATM.C10-nek (CD11c/ad, az ER1C primerből) és pATM.DI2-nek (adenozin/ad, az ERID primerből) neveztük. Nukleinsavszekvenálással igazoltuk a megfelelő szignálszekvencia jelenlétét mindegyik kiónban.
B) A COS-sejtek transzfekciója
A fentiekben leírt ad plazmidok expresszióját befolyásolja a COS-sejtek kotranszfektálása az egyedi plazmidokkal és egy CD18 expressziós plazmiddal, a pRC.CD18-cal. Pozitív kontrollként a COS-sejteket kotranszfektáltuk a pRC.CD18-cal és egy expressziós plazmiddal, a pDC.CD11A-val is.
A sejteket 10 cm-es Corning szövettenyésztéshez kikészített Petri-csészékbe passzáltuk, a transzfekció előtt tenyésztettük a sejteket 50%-os fedettségig szövettenyésztő médiumban (DMEM/10% FBS/penstrep). A sejteket a felületről Versene pufferrel (0,5 mM NaEDTA PBS-ben) távolítottuk el, tripszint egyik eljárásban sem használtunk. Transzfekció előtt a sejteket egyszer mostuk szérummentes DMEM-ben. Tenyészedényenként mindegyik plazmidból 15 pg-ot adtunk 5 ml transzfekciós pufferhez (20 pg/ml DEAE-Dextránnal és 0,5 mM chloroquine-nel kiegészített DMEM). 1,5 órás 37 °C-on történő inkubálás után a sejteket 1 percig sokkoltuk 5 ml DMEM/10% DMSO-val. Ezután a DMSO-t kicseréltük 10 ml szövettenyésztő médiumra.
Az eredményül kapott transzfektált sejteket ELISAval, FACS-szal és immunoprecípitációval analizáltuk a 8., 9. és 10. példában leírtaknak megfelelően.
HU 223 977 Β1
8. példa
A COS-transzfektánsok ELISA-analizise
Annak érdekében, hogy a CD18 expressziós plazmiddal (pRC.CD18) és az ad-t expresszáló ad plazmiddai kotranszfektált COS-sejtek a felületükön valóban tartalmaznak ad-hez asszociálódott CD18-at, ELISA módszert alkalmaztunk, felhasználva a CD18 elleni primer ellenanyagot (például: az ATCC HB203-ból tisztított TS1/18). Pozitív kontrollként az ELISA-t végrehajtottuk a CD18 expressziós plazmiddal és egy CD11a expressziós plazmiddal (pDC.CD11A) kotranszfektált sejteken is. Ebben a kontroliban az elsődleges ellenanyagok között voltak a CD18 ellenanyagok és az anti-CD11a ellenanyagok (például: az ATCC HB202ből tisztított TS1/22). Az ELISA-hoz a sejteket a felületről Versene bufferrel távolítottuk el, és átvittük egy 96 lyukú Corning szövettenyésztő lemezre. A vizsgálat előtt a sejteket két napig szövettenyésztő médiumban inkubáltuk. A lemezeket ezután kétszer mostuk lyukanként 150 pl D-PBS/0,5% teleost bőr zselatin- (Sigma) oldattal. Ezt a puffért használtuk minden lépésben, kivéve az előhívást. Minden mosást és inkubációt szobahőmérsékleten végeztünk. A lyukakat zselatinoldattal blokkoltuk egy óráig. Az elsődleges ellenanyagot 10 pg/ml zselatinoldatban hígítottuk, és ezután 50 μΙ-t adtunk mindegyik lyukba. Mindegyik elsődleges ellenanyagot három lyukban vizsgáltunk. 1 órás inkubáció után a lemezeket 3-szor mostuk lyukanként 150 μΙ zselatinoldattal. A másodlagos ellenanyagot (kecske antiegér Ig/HRP-Fc specifikus, Jackson, West Grove, PA) 1:3500 hígításban adtuk, lyukanként 50 μΙ-t, és a lemezeket 1 órán át inkubáltuk. Három mosás után a lemezeket előhívtuk (20 perc) lyukanként 100 μΙ ofenil-diamin- (OPD, Sigma) oldattal (1 mg/ml OPD citrátpufferben), majd lyukanként 50 μΙ 15% kénsavoldatot adtunk.
Az anti-CD18-specifikus ellenanyagokkal ELISA módszerben vizsgált transzfektánsok analízise nem mutatott ki a háttérnél nagyobb szignifikáns expressziót a csak CD18-at kódoló plazmiddal transzfektált sejtekben. A CD11a-t és CD18-at tartalmazó plazmiddal kotranszfektált sejtek a háttérnél magasabb expressziét mutattak, ha CD18-specifikus ellenanyagokkal vagy a CD11a-ra specifikus reagensekkel analizáltuk azokat. A CD18-at és az ad egyik expressziós konstrukcióját (pATM.CIO vagy pATM.D12) kódoló plazmiddal transzfektált sejtek további analízise kimutatta, hogy a CD18 sejtfelszínen történő megnyilvánulása segíti az ad-t kísérő expressziót. A pATM.C10-zel vagy a pATM.D12-vel transzfektált COS-sejtekben kimutatható CD18-expresszió-növekedés összevethető a CD11a/CD18-cal kotranszfektált pozitív kontrollsejtekben megfigyelttel.
9. példa
A COS-transzfektánsok FACS-analízise
A FACS-analízíshez a Petri-csészében lévő sejteket friss szövettenyésztő médiummal láttuk el a transzfekciót követő napon, majd két napig tartó inkubáció után elvégeztük a vizsgálatot. A transzfektáns sejteket eltávolítottuk a lemezekről 3 ml Versene oldattal, és egyszer mostuk 5 ml FACS pufferrel (DMEM/2% FBS/0,2% nátrium-azid), ezután a sejteket hígítottuk FACS pufferrel 500 000 sejt/0,1 ml minta koncentrációig. Az 1 mg/ml FITC-konjugált CD18-, CD11a- vagy CD11 b-specifikus ellenanyagok (Becton Dickinson) 10 μΙ-ét vagy 800 μΙ CFSE-konjugált egér 23F2G-t (anti-CD18, ATTC HB11081) adtunk mindegyik mintához. A mintákat ezután jégen inkubáltuk 45 percig, 3szor mostuk mosásonként 5 ml FACS pufferrel, és újra felvettük őket 0,2 ml FACS pufferben. A mintákat Becton Dickinson FACscannel mértük, és az adatokat Lysys II programmal (Becton Dickinson) analizáltuk.
A csak CD18-cal transzfektált COS-sejtek nem festődtek CD18-ra, CD11a-ra vagy CD11b-re nézve. A CD11a/CD18 kotranszfekcióban körülbelül a sejtek 15%-a festődött a CD11a vagy CD18 ellenanyagokkal. A CD18-cal transzfektált sejtek és az ad-konstrukciók egyike sem eredményezett detektálható festődést CD11a-ra és CD11b-re nézve. A pATM.BI, a pATM.CIO és a pATM.D12 csoportok festődése 4%os, 13%-os, illetőleg 8%-os volt. A CD11a/CD18 csoport pozitív populációja 4-szer magasabb volt, mint a háttér. Összehasonlításként a CD18 konstrukciókkal kotranszfektált ad-konstrukciók egy olyan pozitív populációt eredményeztek, melynek fluoreszcenciaintenzitása 4-7-szerese volt a háttérnek.
10. példa
A kotranszfektált COS-sejtekből származó humán a</CD18 komplexek biotinjelölt immunoprecipitációja
Annak érdekében, hogy meghatározzuk, vajon az ad az integrinekre jellemző αβ heteromidimer komplex részeként izolálható-e, az immunoprecipitációs kísérleteket CD18-cal és minden egyes ad expressziós plazmiddal kotranszfektált sejteken elvégeztük.
A transzfektált sejteket (1-3*10® sejt/csoport) Versene pufferrel eltávolítottuk a Petri-csészékről, és 3-szor mostuk 50 ml/csoport D-PBS-sel. Mindegyik mintát jelöltük 2 mg Sulpho-NHS Biotinnal (Pierce, Rockford, IL) 15 percig szobahőmérsékleten. A reakciót háromszori 50 ml/minta hideg D-PBS-sel történő mosással kioltottuk. A mosott sejteket újra felvettük 1 ml lízispufferben (1% NP40, 50 mM Tris-HCI, pH=8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM Ca++, 2 mM Mg++ és proteázinhibitorok), és inkubáltuk percig jégen. Az oldhatatlan anyagot leülepítettük 10 000 g-s 15 percig tartó centrifugálással, és a felülúszót új csövekbe helyeztük. Az egér immunoglobulinnal nemspecifikusan reagáló anyagok eltávolítására először előtisztítási lépést hajtottunk végre. 25 pg egér immunoglobulint (Cappel, West Chester, PA) inkubáltunk a felülúszóval 4 °C-on. 2,5 óra után 100 μΙ (25 pg) nyúl antiegér IgG-konjugált Sepharose-t (Protein A-Sepharose 4B-ből és nyúl antiegér IgG-ből készítettük, mindkettő a Zymedtől származott, San Francisco, CA) adtunk mindegyik mintához; és inkubáltuk 4 °C-on forgatással, óráig. A Sepharose gyöngyöket centrifugálással távolítottuk el a felülúszóból. Az előtisztítás után a felülúszókat kezeltük 20 pg anti-CD18 ellenanyaggal
HU 223 977 Β1 (TS1.18) 2 óráig 4 °C-on. Az ellenanyag/antigén komplexeket a felülúszóból izoláltuk 100 μΙ/minta nyúl antiegér/Protein A-Sepharose preparátummal a fentiekben leírtaknak megfelelően. A gyöngyöket 4-szer mostuk a következő összetételű oldattal: 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl és 1% Triton-X 100. A mosott gyöngyöket leülepítettük, és 10 percig főztük 20 μΙ 2xLaemmli mintapufferben, kiegészítve 2% β-merkapto-etanollal. A mintákat centrifugáltuk és futtattuk 8%-os előöntött Novex poliakrilamidgélen (Novex, 100 V, 30 perc). A fehérjét átvittük nitro-cellulóz-membránra (Schleicher & Schull) TBS-T pufferben (200 mA, 1 óra). A membránokat blokkoltuk 2 óráig 3% BSA-val kiegészített TBS-T-ben. A membránokat 1:6000 hígításban Streptavidin torma-peroxidázzal (POD, Boehringer-Mannheim) 1 óráig kezeltük, majd 3-szor mostuk TBS-T-ben. Ezután az Amersham Enhanced Chemiluminescence készletet használtuk a lenyomat előhívásához a gyártó előírásainak megfelelően.
A membránt exponáltuk Hyperfilm MP-re (Amersham) 0,5-2 percig. A pRC.CD18-cal és akár a pATM.B1-gyel, pATM.C10-zel vagy a pATM.D12-vel transzfektált sejtekből származó CD18 immunoprecipitációs komplexek a felületen megnyilvánultak egy hozzávetőleg 100 kD β-láncot tartalmazó heterodimer fajtában, ez összhangban van a CD18 megjósolt méretével, és a hozzávetőleg 150 kD nagyságú ad-nek megfelelő a-lánccal.
11. példa
A humán ad stabil transzfekciója a kínai hörcsög ovarialis sejtekben
Annak érdekében, hogy meghatározzuk, vajon az ad megnyilvánul-e a sejtfelszínen egy, a CD18-cal asszociálódó heterodimerként, a láncokat kódoló cDNS-eket mind átmenetileg, mind stabilisán transzferáltuk mind ad-, mind CD18-hiányt mutató sejtvonalakba.
Ezekhez a kísérletekhez az ad cDNS-t megnöveltük egy további vezetőszekvenciával és egy Kozák konszenzusszekvenciával, ahogy azt a 7. példában leírtuk, és szubklónoztuk a pcDNA3 expressziós vektorba. A végleges konstrukciót, melyet pATM.DI 2-nek hívunk, kotranszfektáltuk egy módosított, kereskedelemben kapható vektorral, a humán CD18-at kódoló pDCI.CD18-cal a kínai hörcsög ovarialis (CHO) sejtekbe. A DHFR+ markert kódoló pDCI.CD18 plazmid és a transzfektánsok szelektálhatok a megfelelő nukleotidot nem tartalmazó médiummal. A módosítások, melyek eredménye a pDCI.CD18, a következők.
A pRC/CMV (Invitrogen) plazmid egy emlős expressziós vektor a citomegalovírus promoterével és az ampicillinrezisztencia-markergénnel. Egy, a pSC1190DHFR plazmidból származó DHFR gént inszertáltunk a pRC/CMV plazmid SV40 replikációs indítópontjának 5’ részébe. Ezenkívül a pHF2G-DHF plazmid 5’ részéből származó polilinkerrégiót ligáltuk a pCR/CMV/DHFR konstrukcióba a DHFR gén 3’ részéhez. A CD18-at kódoló szekvenciákat ezután klónoztuk az eredményül kapott plazmidba a polilinkert határoló 5’ régió és a borjú növekedési hormon poliA részét kódoló régió közé.
A CD18 felületi megnyilvánulását flow-citometriával analizáltuk, felhasználva a TS1/18 monoklonális ellenanyagot. Ebben a sejtvonalban az ad és a CD18 közötti heterodimer kialakulása szoros összefüggést mutatott a 10. példában leírt immunoprecipitációval a COS-sejtekben mutatkozó átmeneti expresszióval.
12. példa
A humán ad CD18-függő módon kötődik az ICAMR-hez
A nézeteket kifejtő riportokban, amelyek bemutatják a sejt-sejt kapcsolatokat módosító leukocita integrinek és az adhéziós molekulák (ICAM-ok) közötti kölcsönhatásokat [Hynes és munkatársai: Cell. 69, 11-25 (1992)], a CHO-sejtek azon képességét, hogy ad/CD18-at expresszáljanak az ICAM-1-hez, ICAM-R-hez vagy VCAM-1-hez történő kötődéshez, két módszerrel vizsgálták.
A replika vizsgálati módszerben az oldható ICAM-1, ICAM-R vagy VCAM-1 lgG1 fúziós fehérjéket műanyagon rögzítették, és meghatározták az ad/CD18-cal transzfektált CHO-sejtek rögzített ligandhoz történő kötődését. A transzfektált sejteket belsőleg calceinnel jelölték, kötőpufferrel (RPMI 1% BSA-val kiegészítve) mosták, és inkubálták vagy csak pufferben (10 ng/ml PMA-val vagy anélkül), vagy 10 pg/ml antiCD18 monoklonális ellenanyagot tartalmazó pufferben. A transzfektált sejteket előzőleg oldható ICAM-1/lgG1, ICAM-R/lgG1 vagy VCAM-1/lgG1 fúziós fehérjékkel, vagy negatív kontrollként borjúszérum-albuminnal (BSA) fedett 96 lyukú Immulon 4 mikrotiterlemezek lyukaiba adták. Ezen adhéziós molekulák oldható formáinak tervezését leírták és teljes egészében közzétették a következő szabadalomban: U.S. Patent Application Serial No. 08/102,852, 1993. augusztus 5-én iktatták. A lyukakat 1 % BSA-t tartalmazó PBS-sel blokkolták a sejtek hozzáadása előtt. A 20 perces 1 % BSA-t tartalmazó PBS-sel történő mosás után a lyukakban maradó teljes fluoreszcenciát Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA) készülékkel mérték.
A rögzített ICAM-okkal végzett kísérletben, az ad/CD18-cal kotranszfektáltak konzisztensen 3-5-szörös növekedést mutattak a lyukakban lévő ICAM-R/lgG1-hez történő kötődésben, ha viszonyítjuk a BSA-val fedett lyukakhoz. A specifitást és az ezen kötődés CD18-tól való függését az anti-CD18 ellenanyag (TS1/18) gátlóhatásával demonstráltuk. A CD11a/CD18-cal transzfektált sejtek ICAM-1/lgG1-gyel fedett lyukakban történő kötődése összevethető volt a BSA-val fedett lyukakban megfigyelt kötődéssel. A CD11a/CD18-cal transzfektált sejtek 2-3szoros növekedést mutattak az ICAM-1/lgG 1-gyel fedett lyukakban, ha a sejteket PMA-val előkezelték. Az ad/CD18 transzfektánsok előkezelése PMA-val nem befolyásolja az ICAM-1/lgG 1-gyel vagy az ICAM-R/lgG1gyel fedett lyukakban a kötődést. Az α^ϋϋΐδ transzfektánsok nem mutattak kimutatható kötődést a VCAM-1/IgG 1-gyel fedett lyukakban.
Az ad/CD18 transzfektáns sejtek kötődését oldható ICAM-1/lgG1, ICAM-R/lgG1 vagy VCAM-1/lgG1 fúziós fehérjékhez flow-citometriával határoztuk meg. A méré15
HU 223 977 Β1 seriként hozzávetőleg egymillió ad/CD18-cal transzfektált CHO-sejtet szuszpendáltuk (a sejteket a nagyobb expresszió érdekében forgóedényekben tenyésztettük) 100 μΙ kötőpufferbe (1% BSA-val kiegészített RPMI) 10 μΙ/ml anti-CD18 jelenlétében vagy hiányában. 20 perces szobahőmérsékleten történt inkubáció után a sejteket kötőpufferben mostuk, és hozzáadtunk 5 pg/ml végkoncentrációban oldható ICAM-1/lgG1 vagy ICAMR/lgG1 fúziós fehérjét. A kötést 30 percig 37 °C-on végeztük, ezután a sejteket háromszor mostuk, és felvettük FITC-konjugált juh antihumán lgG1-et 1:100 hígításban tartalmazó 100 μΙ kötőpufferben. 30 perces inkubáció után a mintákat háromszor mostuk, és felszuszpendáltuk 200 μΙ kötőpufferben a Becton Dickinson FACScan-anal ízishez.
Hozzávetőleg az ad/CD18 transzfektánsoknak 40-50%-a kötődött az ICAM-R/IgG 1-hez, de nem kötődött az ICAM-1/lgG1 vagy a VCAM-1/lgG1 fehérjékhez. A transzfektáns sejtek előkezelése PMA-val nem befolyásolta az ad/CD18 kötődését se az ICAM-1/lgG1-hez, se az ICAM-R/IgG 1-hez vagy a VCAM-1/lgG1-hez, mely eredmény összhangban van a rögzítésen alapuló adhéziós vizsgálati módszer eredményeivel. Az ICAM-R kötődése a háttérszintre csökkent, miután az ad/CD18 transzfektánsokat antiCD18 ellenanyaggal (TS1/18) kezeltük.
Az ezen két kötődést vizsgáló módszerrel kapott összegyűjtött adatok azt mutatják, hogy az ad/CD18 kötődik az ICAM-R-hez, és előnyben részesíti ezt a kötődést az ICAM-1-hez vagy VCAM-1-hez képest. Az ad/CD18 előnyben részesített kötődése az ICAM-R-hez (az ICAM-1-gyel szemben) pont ellentétes azzal, amit a CD11a/CD18-cal és a CD11b/CD18cal megfigyeltünk. így az ad/CD18 kötődésről elvárhatjuk, hogy szelektíven befolyásolja azokat a normál és kóros immunfunkciókat, melyeknél az ICAM-R játssza a kiemelt szerepet. Továbbá hasonló vizsgálatok eredményei, melyekben az ICAM-R különböző extracelluláris domainjeire immunospecifikus ellenanyagokat vizsgáltuk az ICAM-R cxd/CD18 transzfektánsokhoz történő kötődést gátló képességük szempontjából, arra utalnak, hogy az ad/CD18 és a CD11a/CD18 kölcsönhat az ICAM-R különböző domainjeivel.
A CD11a/CD18 kötésének hiánya oldatban az ICAM-1/lgG1-hez vagy az ICAM-R/lgG1-hez arra utal, hogy a CD11a/CD18 és ICAM-1 vagy ICAM-R közötti kötés affinitása túl kicsi ahhoz, hogy oldatban lehetővé tegye a kötődés kialakulását. Bár az ad/CD18-nak ICAM-R/lgG1-hez történő kötődésének detektálása szokatlanul nagy kötőaffinitásra utal.
A fentiekben leírt FACS adhéziós vizsgálati módszert felhasználtuk egy ICAM-R mutáns (E37A/lg) kötődésének vizsgálatában a CHO-sejtek által expresszált ad/CD18-hoz. Az E37A/lg-ről kimutatták, hogy megakadályozta egy LFA-1/lg kiméra kötődését [Sadhu és munkatársai: Cell. Adhesion and Communícation 2, 429-440 (1994)]. A mutáns fehérjét a stabilan transzfektált CHO-sejt oldható formában expresszálta, és ezt Sadhu és munkatársai Prosep-A oszlopon tisztították [Sadhu és munkatársai: Cell. Adhesion and
Communication 2, 429-440 (1994)]. Az E37A/lg kötődését az ad/CD18 transzfektánsokhoz ismételt vizsgálatban sem lehetett kimutatni. A FITC-konjugált antihumán ellenanyag által kimutatott E37A/lg kiméra átlagos fluoreszcens intenzitása (MFI) azonos volt magával csak az ellenanyaggal kimutatott MFI-értékkel, ez arra utal, hogy nincs a háttérnél nagyobb kimutatható jel az E37A/lg mutáns fehérjével. Hasonlóan a 14. példában leírtaknak megfelelően végrehajtott ELISA-ban, az E37A/lg mutáns nem kötődött a rögzített ad/CD 18-hoz.
Az ad kötődése iC3b-hez
A C3-as komplement komponenst proteolitikusan ki lehet vágni az iC3b komplexből. A C3 a komplementrendszer egy alternatív útvonalát beindítja, és egy cél sejtközvetített végleges lerombolásához vezet. Mind a CD11b, mind a CD11c benne van az iC3b kötésben és az iC3b-vel borított részecskék rákövetkező fagocitózisában. A CD11b I domain peptidfragmensét mostanában izolálták az iC3b kölcsönhatás helyéről [Ueda és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91,10 680-10 684 (1994)]. Az iC3b kötőrégiójának nagymérvű konzervativitása arra utal, hogy egy ad/iC3b kötődik a kölcsönhatásban.
Az ad kötődését az iC3b-hez elvégezték transzfektánsokkal, ad-t természetes körülmények között expresszáló sejtvonalakkal (például PMA-stimulált HL60 sejtekkel) és iC3b-vel fedett juhvörösvérsejtekkel rozetta vizsgálati módszerben [Dana és munkatársai: J. Clin. Invest. 73, 153-159 (1984)]. Az ad/CD18 CHOtranszfektánsok, a VLA4-CHO-transzfektánsok (negatív kontroll) és a PMA-val stimulált HL60 sejtek (pozitív kontroll) rozettaképző képességét összehasonlították anti-CD18 monoklonális ellenanyag (például TS1/18.1) jelenlétében és hiányában.
13. példa
Szűrés szcintillációs közelségi vizsgálattal
A jelen találmány ad ligandjai és kötőpartnerei (ad ligand/antiligand páros) közötti kötődés specifikus inhibitorait számos módszerrel kimutathatjuk, úgy, mint azt az idézett irodalmakban leírt szcintillációs közelségi vizsgálati módszerrel tették [U.S. Patent száma: 4,271,139; Hart és Greenwald: Mól. Immunoi 12, 265-267 (1979); és Hart és Greenwald: J. Nuc. Med. 20, 1062-1065 (1979); ezeket itt hivatkozásként építettük be].
Röviden, az ad ligand/antiligand páros egyik tagját szilárd felülethez kötjük közvetlenül vagy közvetve. A közvetett kapcsolás magában foglal egy monoklonális ellenanyag közvetlenül a felülethez történő kötését, mely az oldható integrin β-láncának C-terminálisán elhelyezkedő egyik specifikus epitópját felismeri. Ez az epitóp lehet akár hemagglutinin fehérje vagy mycobacteriális IIIE9 epitóp [Anderson és munkatársai: J. Immunoi. 141, 607-613 (1988)]. A fluoreszcens vegyület is köthető a felülethez. Alternatívaként a fluoreszcens vegyület beépülhet a szilárd felületbe, ahogy azt az U.S. Patent (száma: 4,568,649) szabadalomban leírták (hivatkozásként idéztük). Az ad ligand/antiligand páros felülethez nem kötött tagját jelöltük radioaktív vegyülettel, mely által kibocsátott sugárzás képes a fluoresz16
HU 223 977 Β1 cens vegyületet gerjeszteni. Ha a ligand radioaktívan jelölt antiligandhoz kapcsolódik, akkor a jel kellően közel kerül a felülethez kötött fluoreszcens anyaghoz, így gerjeszti azt, ami végül is fénykibocsátással jár. Ha nem kötött, akkor a jel általában túl messze van a szi- 5 lárd felülettől, így nem gerjeszti a fluoreszcens vegyületet, és a fénykibocsátás kicsi. A mért kibocsátott fény mennyisége arányos a ligand és antiligand közötti kötés mértékével. Egy kötést gátló anyag adása a mintához csökkenteni fogja a fluoreszcenciaemissziót, mivel 10 a radioaktív jelet a szilárd felülettől elég távol tartja. Ezért a kötési inhibitorok a mintákból azonosíthatók a fluoreszcenciás emisszióra gyakorolt hatásuk alapján.
Az ad potenciális antiligandjai is azonosíthatók hasonló módszerekkel. 15
Az oldható rekombináns ad/CD18 leucin-cipzár konstrukciót (lásd a 14. példát) használtuk a szcintillációs közelségi vizsgálatban a CAM-kötő modulátorok szűrésére, ehhez a következő módszert alkalmaztuk.
A rekombináns integrint rögzítettük egy nem blokkoló 20 anti-a-alegység vagy anti-p-alegység ellenanyaggal előzőleg fedett szcintillációs lemezre. A kémiai könyvtár vegyületeit és egy specifikusan biotinilezett CAM/IgG kimérát egyszerre adtuk a lemezhez. Az ICAM-3/lg kimérát jelölt streptavidinnel mutattuk ki. A vizsgálati 25 módszerben az ICÁM—1/lg-t és az ICAM-3/lg-t NHSSulfo-biotin LC-vel (hosszú lánc, Pierce) biotinileztük a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A jelölt fehérjék még reaktivitást mutatnak a CAM-specifikus ellenanyagokkal, és ki lehet mutatni, hogy reagálnak rögzí- 30 tett LFA-1-gyel ELISA-ban, Streptavidin-HRP kimutatási módszerben OPD-s előhívással vizsgálva.
Alternatívaként a rekombináns leucin-cipzár fehérjét tisztítottuk vagy részlegesen tisztítottuk, és közvetlenül fedtük szcintillációs anyaggal előkezelt lemezen.
A jelöletlen CAM/lg kiméra és a kémiai könyvtár vegyületeit egyszerre adtuk a lemezhez. A kötött CAM/lg-t 125l-jelölt antihumán Ig-vel mutattuk ki.
Egy másik változatban a tisztított CAM/lg fehérjét rögzítettük szcintillációs anyaggal előkezelt lemezre. A kémiai könyvtár vegyületeit és a rekombináns leucin-cipzárt expresszáló sejtek koncentrált felülúszóit hozzáadtuk a lemezhez. A rekombináns integrin kötődését jelölt, nem blokkoló a- vagy β-alegység ellenanyaggal mutattuk ki.
14. példa
Oldható humán ad expressziós konstrukciók
Az oldható humán ad/CD18 heterodimer fehérje teljes hosszúságú expressziója könnyen tisztítható anyagot biztosít az immunizációhoz és a kötődést vizsgáló módszerhez. Az így létrehozott oldható fehérje előnye az, hogy a felülúszókból lehet tisztítani, és nem a sejtek lizátumából (ekkor ugyanis a teljes hosszúságú ad/CD18 a membránhoz kötve van); a kitermelés így javul, és a szennyezők mennyisége csökken.
Az oldható ad-t expresszáló konstrukciókat a következőképpen állítottuk elő. Az 1-es számú szekvencia 0-3161. bázisának megfelelő nukleotidfragmenst a pATM.D12 plazmidból Hindlll és Aatll restikciós enzimekkel történő emésztéssel izoláltuk. Az 1-es szekvencia 3130-3390. bázisának megfelelő PCR-fragmens átfed a Hindlll/Aatll fragmenssel, és tartalmaz egy további Miül restrikciós helyet a 3’ végén, ezt a fragmenst sokszoroztuk a pATM.D12 plazmidból az sHAD.5 és az sHAM.3 primerekkel (szekvenciáikat 30, illetőleg 3’ számon tettük közzé).
5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3’
5’-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3’ (a szekvencia száma: 30) (a szekvencia száma: 31)
A PCR sokszorozási terméket Aatll és Miül restrikciós enzimekkel emésztettük és ligáltuk a Hindlll/Aatll fragmenshez. A keletkezett terméket ligáltuk a Hindlll/MIul-gyel emésztett pCDI.s plazmidba.
Ezt a konstrukciót együtt expresszáltuk az oldható CD18-cal stabilan transzfektált CHO-sejtekben, és az expressziét a 35S-metioninnal jelölt sejtekből származó CD18 komplexekkel kialakult immunoprecipitátum autoradiográfiás megjelenítésével mutattuk ki. A konstrukciót együtt expresszáltuk a CD18-cal a 293 jelű sejtekben [Berman és munkatársai: J. Cell. Bioi. 52, 183-195(1993)].
Az oldható teljes hosszúságú árkonstrukciók
Az ad expressziós konstrukciók változatait szintén szem előtt tartjuk a találmányban. Egy sértetlen ayCDie heterodimer tisztításának és expressziójának elősegítésére oldható ad-t és CD18 expressziós plazmidokat készítünk, melyekbe beépítjük a leucin-cipzárt tartalmazó fúziós szekvenciát, mely a heterodimert tisztítás közben stabilizálhatja [Chang és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91,
11 408-11 412 (1994)]. Röviden, a cipzár savas és bázikus aminosavszálait primer összeolvasztással állítottuk elő, felhasználva a Chang által leírt oligonukleotidokat [Chang és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 11 408-11 412 (1994)].
Az előzőekben leírt ad vagy CD18 szubklónozásának elősegítésére a DNS-szekvenciákat tovább módosítottuk úgy, hogy további Miül és Xbal restrikciós helyeket tartalmazzon az 5’, illetőleg 3' végein. Ráadásul a hemagglutinin fehérjét vagy a polihisztidinszekvenciát reprezen50 táló szekvenciákat, valamint az Xbal hely után egy leállító kodont is beépítettük. A hemagglutinin- vagy polihisztidinszekvenciákat az expresszált fehérje affinitástisztításának elősegítésére építettük be. A cipzár bázikus fonalát kódoló szekvenciát beépítettük a CD18-at expresszá55 ló plazmidvektorba, míg a savas fonalát az a-lánc-konstrukcióba. A módosított ad és CD18 fehérjék gazdasejtben történő expressziójakor feltételeztük, hogy a cipzár savas és bázikus fonalai közötti kölcsönhatás stabilizálja a heterodimert, és megengedi az ad/CD18 molekula affi60 nitástisztítását a fentieknek megfelelően.
HU 223 977 Β1
Az oldható ad és a CD18, valamint a savas és a bázisos „leucin-cipzár szekvenciák expressziójára konstruált plazmidokat COS-sejtekbe transzfektáltuk DEAE/Dextrán módszerrel a 7. példában leírtaknak megfelelően. Az eredményül kapott fehérjét 5 ad/CD18LZ-nek neveztük. Hemagglutinin- és polihisztidinszekvencia-toldalékokat nem építettünk be az ad/CD18LZ-be. A transzfektált sejteket 14 napig növesztettük csökkentett szérumkoncentráció mellett (2%). A transzfektált sejtek felülúszóit ötnaponként összegyűjtöttük, és ELISA-val vizsgáltuk fehérjére nézve a 8. példában leírtaknak megfelelően. Röviden, az ad/CD18LZ heterodimert rögzítettük az anti-ad monoklonális ellenanyaggal (169B, lásd az 5. példát) fedett lemezekre. Az ad/CD18LZ komplexet biotinilezett anti-CD18 monoklonális ellenanyaggal (TS1/18.1, lásd a 8. példát) mutattuk ki, majd streptavidin/tormaperoxidáz (HPR) konjugátumot és o-fenil-diamint (OPD-t) adtunk hozzá. A felülúszókból a fehérjéket tisztán ki lehetett mutatni.
Az oldható teljes hosszúságú ad expressziós termékek vizsgálata kötőmódszerrel A fentiekben leírt oldható teljes hosszúságú ad/CD18LZ heterodimert funkcionális kötőmódszerrel úgy vizsgáltuk, hogy a heterodimert kötöttük a 169B 25 monoklonális ellenanyaggal vagy egy nem blokkoló anti-CD18 monoklonális ellenanyaggal (lásd a 15. példát) fedett lemezre. A 10 pg/ml kezdő koncentrációban alkalmazott CAM/lg kimérák (lásd a 12. példát) hozzáadása előtt a nemspecifikus kötődés gátlására a lyukakat blokkoltuk halbőr zselatinnal. A kimérák kötődését az ad/CD18LZ heterodimerhez kecske antihumán IgG-HRP konjugátummal (Jackson Labs) és az azt követő OPD-előhívással mutattuk ki.
A VCAM-1/lg-ről kimutattuk, hogy a befogott ad/CD18LZ-hez 3-5-ször jobban kötődik, mint a befogott CD11a/CD18-hoz. Az ICAM-1/lg és az ICAM-2/lg az oldott CD11a/CD18-hoz a háttérhez viszonyítva 15-ször, illetőleg 10-szer jobban kötődik, de nem kötődik az ad/CD 18-hoz. A VCAM-1 -kötődés hozzávetőleg 40 50%-kal csökkent a kombinációban használt 130K és 130P VCAM-1-specifikus ellenanyagok jelenlétében.
A kötőmódszert a 96 lyukú lemezen kötött ICAM/lg fehérjével is végrehajtottuk a rekombináns oldható celluláris integrinek tenyésztéséből nyert felülúszójának hozzáadását követően. Az oldható integrinek kötődésének kimutatására az integrineket kezeltük jelöletlen nem blokkoló a- vagy β-alegységekre specifikus egér ellenanyaggal, ezt követte a HPR-konjugált kecske antiegér ellenanyag hozzáadása és az OPD-s előhívás.
Az eredmények arra mutatnak, hogy egy nem blokkoló ellenanyaggal kimutatott ad/CD18LZ kötődése az ICAM/lg-hez 10-szer nagyobb, mint az ellenanyagot nem tartalmazó kontroli-lyukakban. Az oldható ad/CD18 kötődését nem tudtuk kimutatni kötött
ICAM-1/lg-vel, bár a háttérhez képest 15-szörös és 5szörös kötődést tapasztaltunk az ad/CD18 és a kötött
CD11b/CD18, illetőleg a CD11a/CD18 között.
Mivel a korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a CD11b és a CD11c kötődik a lipopoliszacharidhoz (LSP) [Wright: Curr. Opin, Immunoi. 3, 83-90 (1991); Ingalls és Golenbock; J. Exp. Med. 181, 1473-1479 (1995)], az LSP ad/CD18-hoz történő kötődését megál10 lapították flow-citometriával és lemezes vizsgálati módszerekkel is. Az eredmények arra utalnak, hogy az S. minnesotá-bói és az S. typhosá-ból (mindkettőt a Sigma cégtől vásároltuk) izolált, FITC-jelölt LPS 20 pg/ml koncentrációban képes volt gyengén kötődni a 15 ad/CD18-cal transzfektált CHO-sejtekhez. A nem transzfektált kontroll CHO-sejtekkel kötődést nem tudtunk megfigyelni. Az ELISA vizsgálati módszerben a biotinilezett LPS [Luk és munkatársai: Anal. Biochem 232, 217-224 (1995)] 0,5-0,3 pg tartományban négy20 szer nagyobb mértékben kötődik a rögzített ad/CD18LZ-hez, mint a befogott ellenanyag és a blokkoló vegyület magában. Az LPS CD11a/CD18-hoz történő kötődésének látható értékét kivontuk minden kísérleti háttérértékből, mely a TS2/4 anti-CD11a ellenanyag kötődésével készült.
Az ad/CD18 további ligandjainak azonosításához a rekombináns ad/CD18LZ fehérjét használtuk két kísérletsorozatban. A különböző sejttípusok kötött fehérjéhez történő kötődését felhasználtuk arra, hogy megha30 tározzuk, melyik sejt expresszálja az ad ligandokat a sejtek felületén. Ezután ellenanyaggátlást alkalmaztunk, hogy meghatározzuk, vajon a megfigyelt sejtkötődések ismert felületi adhéziós molekulákkal történő kölcsönhatás eredménye-e vagy nem. Ha nincsenek gát35 lási eredmények, akkor a ligand azonosításához az <xd-vel kötődő sejtek lizátumából származó fehérjék és az ad/CD18LZ koimmunoprecipitációját használjuk fel.
Az oldható humán ad I domainjének expressziós konstrukciói
Korábban beszámoltak arról, hogy a CD11a I domainje expresszálható független strukturális egységként, mely megtartja ligandkötő képességét és ellenanyag-felismerő tulajdonságát [Randi és Hogg: Journal of Bíological Chemistry 269, 12 395-12 398 (1994); 45 Zout és munkatársai: Journal of Bíological Chemistry 269, 17 075-17 079 (1994); Michishita és munkatársai: Cell. 72, 857-867 (1993)]. Az ad I domainjét és a humán lgG4-et tartalmazó oldható fúziós fehérje előállításához az ad I domainjét PCR-rel sokszoroztuk, felhasz50 nálva azokat a primereket, melyeket a határoló BamHI és Xhol restrikciós helyek bővítéséhez terveztünk a szubklónozás elősegítése érdekében. Ezeket a primereket 32 és 22 szekvenciaszámon tettük közzé, a restrikciós helyeket aláhúztuk.
5’-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3’ (a szekvencia száma: 32)
5’-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3’ (a szekvencia száma: 33)
A 32-es számú szekvenciában a BamHI hely 3’ ré- vencia 435. nukleotidjának; a 33-as számú szekvencia sze melletti C nukleotid megfelel az 1-es számú szék- 60 Xhol helyének 3’ G nukleotidja komplementer az 1-es
HU 223 977 Β1 számú szekvencia 1067. nukleotidjával. A sokszorozott I domaint emésztettük a megfelelő enzimekkel, a tisztított fragmenseket pDCs emlős expressziós vektorba ligáitok, és a pGEX-4T-3 (Pharmacia) prokarióta expressziós vektort és az I domain fragmenst szekvenáltuk. Ezután a fúziós fehérjéket expresszáltuk egy megfelelő expressziós konstrukcióval transzfektált vagy transzformált COS-, CHO- vagy Escherichia co//-sejtekben.
Az ad-nek ICAM-R-rel mutatott affinitása miatt úgy gondoljuk, hogy az ad I domainjének megnyilvánulása elegendő affinitást biztosíthat ahhoz, hogy az ad közreműködésével megvalósuló sejtadhézió hasznos inhibitora legyen.
A humán ad I domain/lgG4 fúziós fehérjék analízise
A fehérjét felbontottuk redukáló és nem redukáló körülmények között SDS-PAGE-val, és láthatóvá tettük ezüstfestéssel vagy Coomassie festéssel. A fehérjét ezután Immobilon PVDF membránra átvittük, és Western-blot-analízissel vizsgáltuk antihumán IgG monoklonális ellenanyagok vagy antiborjú IgG monoklonális ellenanyagok felhasználásával.
A kimutatott fehérjéről megállapítottuk, hogy körülbelül 120 kD nagyságú nem redukáló körülmények között és 45 kD nagyságú redukáló körülmények között.
Kis intenzitású sávokat is kimutattunk a nem redukáló gélen hozzávetőleg 40-50 kD-nak megfelelő helyen, ezek reagáltak az antihumán ellenanyaggal, de az antiborjú ellenanyaggal nem. Egy 200 kD nagyságú kis intenzitású sávot borjú Ig-vel mutattunk ki Western-blotmódszerrel.
Az I domain expressziós termékek használata a kötőmódszerben
Az I domainek ICAM-R/IgG kiméra fehérjét specifikusan felismerő képességét ELISA módszerrel vizsgál- 35 tűk. Az ad I domain lgG4 fúziós fehérje (lad/lgG4) TBS-es sorozathígítását inkubáltuk ICAM-1/lgG, ICAM-R/IgG, VCAM-1/lgG vagy tárgyhoz nem tartozó lgG1 mieloma fehérjével fedett Immulon IV RIA/EIA lemezeken. A CD11a I domain/IgG kiméra fehérjét és a humán lgG4/kappa mieloma fehérjét negatív kontrollként használtuk. Az lgG4 kötődését biotinilezett HP6023 anti-lgG4 monoklonális ellenanyaggal mutattuk ki, majd streptavidin-peroxidázzal konjugáltuk, és ennek szubsztrátjával, az o-fenil-diaminnal előhívtuk.
Egy ismételt vizsgálatban a CD11a/lgG4 fehérjét és az lgG4 mieloma fehérjét nem tudtuk kimutatni egyik rögzített fehérjével sem. Az lad/lgG4 fehérje nem kötődik a halbőr zselatin vagy a borjúszérum-albumin 5 blokkoló vegyületekhez, humán lgG1-hez vagy ICAM-1/lgG-hez. A háttérnél 2-3-szor nagyobb kötőjelet mutattunk ki az ICAM-R/IgG fehérjével fedett lyukakban 1-5 pg/ml koncentrációjú lad/lgG4 fehérje használatakor. A VCAM-1/lgG fehérjével fedett lyukakban a 10 jel 7-10-szer nagyobb volt, mint a háttér. Az előző vizsgálati módszerben az ad/CD18-cal transzfektált CHOsejtek nem kötődtek a VCAM-1/lgG fehérjéhez, ez arra utal, hogy a VCAM-1-kötődés jellemző lehet az izolált I domain aminosavszekvenciájára.
További ad I domain konstrukciók
További ad-konstrukciókat készítettünk hasonlóan az előző konstrukciókhoz, de több aminosavat építettünk be az ad I domainje köré. A specifikus konstrukciók a következőket tartalmazzák: i) a jelen konstrukciók elé 20 az exon-5 szekvencia egy részét (a 2-es számú szekvencia 127-353. aminosavai), ii) az I domain után az EF-kéz ismétléseket (a 2-es számú szekvencia 17-603. aminosavai), és iii) az α-lánc transzmembrán régiójának csonkolt darabját egy lgG4 farokkal a tisztítás és a ki25 mutatás céljából (a 2-es számú szekvencia 17-1029. aminosavai). Ezeket a konstrukciókat vagy pDCS1 emlős expressziós vektorba vagy pGEX-4T-3 (Pharmacia) prokarióta expressziós vektorba építettük, és az I domaint szekvenáltuk. A fúziós fehérjéket ezután COS-, 30 CHO- vagy Escherichia co/i-sejtekbe transzformáltuk vagy transzfektáltuk a megfelelő expressziós vektor konstrukcióval. A fehérjét ProSep-A oszlopon (Bioprocessing Limited, Durham, Anglia) tisztítottuk, reakcióképességét megvizsgáltuk HP6023 anti-lgG4 monoklonális ellenanyaggal, és láthatóvá tettük poliakrilamidgélen Coomassie festéssel.
Az egész ad polipeptidet expresszáló plazmid kialakításához a fentiekben leírt pATM.D12 plazmidot úgy módosítottuk a következő módszerrel, hogy exp40 resszálja az ad lgG4 fúziós fehérjét. Az lgG4-et kódoló DNS-t a pDCS1 vektorból PCR-rel izoláltuk, felhasználva azokat a primereket, melyek egyedileg beépülnek egy 5' Aatll restrikciós helyre (a szekvencia száma: 89) vagy egy 3’ Xbal restrikciós helyre (a szekvencia 45 száma: 90).
5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3’
5’-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3’ (a szekvencia száma: 89) (a szekvencia száma: 90)
A pATM.D12 plazmidot Aatll és Xbal restrikciós enzimekkel emésztettük, és a részlegesen emésztett és tisztított lgG4 PCR-termékkel a linearizált vektorba ligáltuk.
15. példa
A humán a^re specifikus ellenanyagok előállítása
A) A monoklonális ellenanyagok előállítása
1. A 7. példa átmenetileg transzformált sejtjeit háromszor mostuk Dulbecco-féle foszfáttal puffereit sóol- 60 datban (D-PBS), és 5*106 sejtet Balb/c egerekbe injektáltunk PBS-ben oldott 50 pg/egér muranil-dipeptidázzal (Sigma). Az egereket még kétszer oltottuk hasonló módon kéthetenként. Az egerekből az elvéreztetett és immunizált szérumot a 9. példában körvonalazott FACS-analízissel szűrtük, és az ad/CD18-cal transzfektált sejteket fuzionáltuk a legnagyobb reakciót mutató egérlépek sejtjeivel. Ezután a hibridóma tenyészetek felülúszóit egyenként szűrtük a CD11a/CD18cal transzfektált COS-sejtek elleni reakció hiányára és
HU 223 977 Β1 az ad expressziós plazmiddal és a CD18-cal transzfektált sejtekkel történő reakcióra.
A módszerrel nem kaptunk monoklonális ellenanyagokat.
2. A monoklonális ellenanyagok előállításának egy másik változatában az oldható ad I domain/lgG4 fúziós fehérjét affinitástisztítottuk a stabilisán transzfektált CHO-sejtek felülúszójából, és felhasználtuk a Balb/c egerek immunizálásához a fentiekben leírtaknak megfelelően. Elkészítettük a hibridómákat, és a hibridómák felülúszóját ELISA-val szűrtük az ad I domain fúziós fehérjével szemben mutatott reaktivitásukra nézve. Ezután a pozitív tenyészeteket analizáltuk a teljes hosszúságú ad/CD18 komplexeket expresszáló CHO-transzfektánsokkal szemben mutatott reakciójukra nézve.
Az 1908-as egeret háromszor előimmunizáltuk az ad/CD18-cal transzfektált COS-sejtekkel, majd az immunizációt kétszer megerősítettük az oldható ad/CD18 heterodimerrel. A két utolsó immunizációt 50 pg/egér I domain/lgG4 fúziós fehérjével végeztük. A fúzió 270 IgG-t termelő lyukat eredményezett. 45 lyukból nyert felülúszó ELISA-val legalább 7-szer nagyobb kötődést mutatott az lad/lgG4 fúziós fehérjéhez, mint a humán lgG4-hez. Egyik felülúszó sem reagált az ad/CD18-cal transzfektált COS-sejtekkel FACS-analízissel vizsgálva.
A felülúszók integrin alfa-alegység fehérjéket felismerő képességük meghatározására egy másik kísérletben a friss, fagyasztott lépmetszeteket festettük 45 lyuk közül 24 felülúszójával. Három felülúszó pozitív volt: az egyik a vörös pulpában a nagy sejteket festette, míg a két másik az elszórtan elhelyezkedő sejteket festette a vörös pulpában és a tabernaculaeban is.
Ezeket a felülúszókat tovább analizáltuk az ad/CD18-cal transzfektált CHO-sejtekből vagy a PMAval stimulált HL60 sejtekből származó biotinilezett CD18 komplexekkel mutatott immunoprecipitációs képességükre nézve. A további szubklónozást az alapján végeztük, hogy melyik lyukból származó felülúszó képes a detergens lizátumából a fehérjéket felismerni (amelynek nem kell annyira konformálisan korlátozottnak lennie, mint annak a fehérjének, amelyet heterodimerként expresszálnak). A detergensben fehérjéket felismerni képes monoklonális ellenanyagok hasznosak lehetnek a transzfektánsokból, szövetekből és sejtvonalakból származó heterodimer komplexek immunoprecipitációjában.
3. A monoklonális ellenanyag termelés egy másik alternatívájaként a humán léplizátumából származó CD18 komplexet immunoprecipitáltuk a 23F2G antiCD18 monoklonális ellenanyaggal, miután CD11a/CD18-ra (TS2/4 monoklonális ellenanyag felhasználásával) és CD11b/CD18-ra (Mo-1 monoklonális ellenanyag felhasználásával) nézve előtisztítottuk. Kettőtől tizenkét hetes öt Balb/c egeret szubkután injektálással immunizáltunk, a 0. napon hozzávetőleg 30 pg eredményül kapott fehérjét adtunk Freund-féle komplett adjuvánsban, ezt követően az immunizációt kétszer megerősítettük 30 pg immunogén/egér koncentrációban a 28. és 43. napon inkomplett Freundféle adjuvánsban. Az utolsó megerősítés után 10 nappal tesztszérumot vettünk le, és reagálóképességét meghatároztuk Western-blotban, felhasználva mindegyik szérumból 1:500 hígítású mennyiséget 1 pg/vonal immunogén kimutatásához. Három egér szérumában a kimutatott sávok 95 kD-osak és 150 kD-osak voltak; nem kaptunk jelet az 1:50 hígítású preimmunszérumokkal kezelt vonalakban. A 150 kD-os sávról feltételeztük, hogy az ad egy in vivő glikozilezett formája. Ráadásul mindegyik immunizáció utáni szérum immunoprecipitálta a heterodimer kimutatására szolgáló SDS-PAGE-n megfelelő molekulatömegnél vándoroló, az ad/CD18 CHO-sejtek biotinilezett lizátumaiból származó fehérjét. Ezen eredmények alapján a 2212-es számú egeret kiválasztottuk, és tovább intraperitoneális injekcióval immunizáltuk a 64. napon PBS-en oldott 30 pg immunogénnel. Az állatokat nappal később feláldoztuk, és lépjeiket steril körülmények között eltávolítottuk.
Az egyedi sejtekből álló szuszpenziót a lép két mikroszkóptárgylemez fagyasztott vége közötti őrlésével alakítottuk ki szérummentes RPMI 1640-ben, melyet 2 mM L-glutaminnal, 1 mM nátrium-piruváttal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml streptomicinnel (RPMI, Gibco, Canada) egészítettünk ki. A sejtszuszpenziót átszűrtük egy steril 70-es Nitex cell. stainer (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) szűrővel, és a szűrletet kétszer mostuk centrifugálással (200 g, perc). Az eredményül kapott üledéket felvettük 20 ml szérummentes RPMI-ben. Három kezeletlen Balb/c egérből a timocitákat hasonló módszerrel nyertük.
A fúzió előtt az NS-1 mielomasejteket log-fázisban tartottuk 10% Fetalclone szérummal (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) kiegészített RPMI táptalajban a fúzió előtti három napig, majd a sejteket leülepítettük centrifugálással (200 g, 5 perc), az előző bekezdésben leírtaknak megfelelő módon kétszer mostuk, és a sejteket megszámoltuk. Hozzávetőleg 2*108 lépsejtet elegyítettünk 4*107 NS-1 sejttel, és a keletkező elegyet 200 g-n centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük. A sejteket gyenge ütögetéssel kiszabadítottuk a csőből, és 2 ml 75 mM Hepes (pH=8,0, 37 °C) (Boehringer-Mannheim) pufferben oldott 50%-os PEG 1500-at adtunk hozzá egy perc alatt állandó keverés közben. További 14 ml szérummentes RPMI-t adtunk hozzá a következő hét percben, majd azonnal 16 ml RPMI-t. Az eredményül kapott keveréket 10 percig centrifugáltuk 200 g-vel, és a felülúszót elöntöttük. Az üledéket felvettük 15% FBS-t, 100 Mm nátrium-hipoxantint, 0,4 mM aminopterint, 16 mM timidint (HAT) (Gibco), 25 egység/ml IL-6-ot (Boehringer-Mannheim) és 1,5*108 timocitát/ml tartalmazó 200 ml RPMI-ben, és lyukanként 200 μΙ-t szétosztottuk tíz 96 lyukú lapos szövettenyésztő lemezbe (Corning, United Kingdom). A sejteket a fúzió utáni 2., 4. és 6. napokon tápláltuk, hozzávetőleg 100 μΙ-t leszívva mindegyik lyukból egy 18 G-s tűvel (Becton Dickinson), és hozzáadtunk a fentiekben leírt lemezelő médiumból 100 μΙ-t lyukanként, kivéve ott, ahol 10 egység/ml IL—6 volt, és hiányoztak a timociták.
HU 223 977 Β1
A fúzió utáni 7-10. napon minden lyukban lévő felülúszót szűrtük ellenanyagkötött ELISA-val, megvizsgálva az egér IgG jelenlétét. Az Immulon 4 lemezeket (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) fedtük 50 μΙ/lyuk kecske antiegér IgA-val, IgG-vel vagy IgMmel (Organon Teknika) 1:5000 hígításban 50 mM-os karbonátpufferben (pH=9,6, 4 °C). A lemezeket 0,5% Tween 20-at tartalmazó PBS-ben (PBST) háromszor mostuk, és mindegyik lyukhoz 50 μΙ tenyészetből származó felülúszót adtunk. A 37 °C-on történt 30 perces inkubáció után a sejteket mostuk a fentieknek megfelelően PBST-vel, és mindegyik lyukhoz 50 μΙ tormaperoxidázzal konjugált kecske antiegér lgG(fc)-t (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) adtunk PBS-sel 1:3500-ra hígítva. A lemezeket a fentiekben leírtaknak megfelelő körülmények között inkubáltuk, 4-szer PBST-vel mostuk, és 100 μΙ szubsztrátot adtunk hozzá, mely 100 mM citrátpufferben (pH=4,5) 1 mg/ml o-fenilén-diamint (Sigma) és 0,1 μΙ/ml 30% H2O2-t tartalmazott. A színreakciót öt perc után leállítottuk 50 μΙ 15%-os H2SO4-tal. Az abszorbanciát 490 nm-en minden lyukban meghatároztuk lemezleolvasóval (Dynatech).
A hibridómákat a következő eljárással tovább jellemeztük. A felülúszót az IgG-t termelő tenyészetekből flow-citometriával analizáltuk az ad/CD18-cal transzfektéit CHO-sejtekre nézve, de nem vizsgáltuk a JY sejteket (ez egy B-sejtvonal, mely LFA-1-re pozitív, de más β2 integrinekre nem, ahogy azt kimutattuk az előző festési kísérletekben). Röviden, 5*105 a(j/CD18-cal transzformált CHO- vagy ad/CD18_JY sejteket felvettünk 2% FBS-t és 10 mM NaN3-ot (FACS puffer) tartalmazó 50 μΙ RPMI-ben. Az egyedi sejtszuszpenziókat hozzáadtuk az 50 μΙ IgG pozitív hibridóma tenyészet felülúszóját tartalmazó 96 lyukú, görbe aljú lemezekhez (Corning). Jégen történt 30 perces inkubáció után a sejteket kétszer ülepítéssel mostuk klinikai centrifugában, a lyukak felülúszóit mind elöntöttük, és az üledéket felvettük 200-300 μΙ FACS pufferben. Az utolsó mosás után hozzáadtunk lyukanként 50 μΙ 1:100 hígításéi juh antiegér lgG(H+L)-FITC konjugátumnak F(ab’)2 fragmensét (Sigma, St. Louis, Missouri), melyet FACS pufferrel hígítottunk. A fentiekben leírt inkubáció után a sejteket kétszer mostuk 10 mM NaN3-dal kiegészített Dulbecco-féle PBS-sel (D-PBS), és végül 1% paraformaldehidet tartalmazó D-PBS-ben felvettük. A flow-citometriás analízishez (FACS) a mintákat polisztiréncsövekbe öntöttük, és Becton Dickinson FACscan-analizátorral vizsgáltuk.
A négy tenyészet fúziós eredményeit minden szempontból pozitívnak tartjuk. Amikor másodszor is elvégeztük a szűrést, megismételtük a további tenyésztésből származó felülúszókkal hozzávetőleg négy nappal később, a négy tenyészet közül három továbbra is pozitív maradt. A három lyukat 169A-val, 169B-vel és 169D-vel jelöltük, és egymás után kétszer-háromszor klónoztuk kettős hígítással a 15% FBS-t, 100 mM nátrium-hipoxantint, 16 mM timidint és 10 egység/ml IL-6-ot tartalmazó RPMI-ben. A klónlemezek lyukait négy nap után szemrevételeztük, és a legkevésbé sűrű lyukakban a kolóniákat megszámoltuk. Minden klónozás kiválasztott lyukait 7-10 nap után FACS-szal megvizsgáltuk. Két tenyészetben, a 169A-ban és a 169Bben aktivitást találtunk. Az utolsó klónozást a magányos kolóniákat tartalmazó pozitív lyukakban végeztük 11% FBS-sel kiegészített RPMI-ben. A 169A és a 169B kiónok felülúszóiból az ellenanyagok izotípusát meghatároztuk, felhasználva az IsoStrip készletet (Boehringer-Mannheim) a gyártó utasításainak megfelelően, és azt találtuk, hogy azok lgG1 izotípusúak.
A CHO-transzfektánsokból és a PMA-stimulált HL60 sejtekből származó ad/CD18 komplexeket felhasználtuk harmadlagosan a specifitásszűrésre. SDSPAGE analízisben a CHO-sejtvonalakból származó 169A és 169B hibridómák a megfelelő sávban adtak precipitációt, valamint egy, a HL60 sejtekből származó egyedüli 150-160 kD-os α-láncfajta is. A169A és 169B hibridómákat letétbe helyeztük 1995. május 31-én az American Type Culture Collectionnél, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, és ezek letéti számai: HB11907, illetőleg HB11906.
A 169A és 169B kötőképességének további teljes jellemzéséhez levizsgáltuk mindegyik ellenanyag képességét, hogy vajon gátolja-e más vagy a TS1/18.1 anti-CD18 ellenanyag a kötődését az oldható ad/CD18-hoz. Az oldható teljes hosszúságú ad/CD18-at külün-külön kötöttük mindegyik jelöletlen ellenanyaggal egy 96 lyukú lemezre, és a biotinilezett ellenanyagokat felhasználtuk azon fehérje kimutatására, mely ugyanazzal vagy különböző jelöletlen ellenanyaggal kötődik. A kötődés detektálásához kecske antiegér Ig/HRP konjugátumot használtunk, majd ezután adtuk hozzá az OPD szubsztrátot. Az eredmények azt mutatják, hogy a 169A ellenanyag képes volt a biotinilezett 169A és a TS1/18.1 kötődését blokkolni, míg a 196B ellenanyag csak a saját maga kötődését blokkolta.
4. Egy másik egeret (száma: 2214), melyet azonos eljárási sémával immunizáltunk, mint a 2212 számút, kiválasztottunk és tovább immunizáltunk a fúzió előtti erősítéssel a 70. napon 30 pg PBS-ben lévő léplizátumból származó tisztított ad-vel. Négy nappal később az egeret feláldoztuk, és a lépét steril körülmények között eltávolítottuk.
A fúziót és a pozitív sejtek klónozását a fentiekben leírtak szerint hajtottuk végre. A fúzió öt anti-ad monoklonális hibridómát eredményezett, melyek jelei: 170D, 170F, 170E, 170X és 170H, izotípusuk lgG1-nek bizonyult az IsoStrip készlettel (Boehringer-Mannheim) a gyártó utasításainak megfelelően eljárva.
5. Még egy másik egeret (száma: 2211), melyet azonos kezdeti eljárási sémában immunizáltunk, mint a 2212-es és a 2214-es számú egereket, kiválasztottunk és tovább immunizáltunk a 88. napon 30 pg immunogénnel, és a fúzió előtt megerősítettünk a 203. napon 30 pg immunogénnel. Az egeret négy nappal később feláldoztuk, és a lépét steril körülmények között a fentiekben leírtaknak megfelelően eltávolítottuk. A hibridóma felülúszókat szűrtük ellenanyagkötött ELISA-val és flow-citometriával, ahogy azt az előzőekben már részletesen leírtuk.
HU 223 977 Β1
Tizenöt pozitív hibridómát azonosítottunk, melyek jelei: 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R és 188T, és izotípusaikat ELISA módszerrel határoztuk meg. Röviden, az Immulon 4 lemezeket (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) fedtük 4 °C-on 50 μΙ/lyuk 50 mM karbonátpufferben (pH=9,6) 1:5000 arányban hígított kecske antiegér IgA, IgG vagy IgM ellenanyagokkal (Organon Teknika). A lemezeket blokkoltuk 30 percig 37 °C-on 1% BSA-t tartalmazó PBS-sel, háromszor mostuk PBS/0,05% Tween 20-szal (PBST), és hozzáadtunk az 1:10arányban PBST-vel hígítottfelülúszóból 50 μΙ-t. A fentiekben leírt inkubáció és mosás után 50 μΙ torma-peroxidázzal konjugált nyúl antiegér lgG1, IgG2a vagy lgG3 (Zymed, San Francisco, Califomia) ellenanyagot adtunk, melyet 1% normál kecskeszérumot tartalmazó PBST-vel 1:1000 arányban hígítottunk. A lemezeket a fentieknek megfelelően inkubáltuk és mostuk négyszer PBST-vel, ezután hozzáadtuk a 100 μΙ szubsztrátot, amely 1 mg/ml o-fenilén-diamint (Sigma) és 100 mM citrátpufferben (pH=4,5) 0,1 μΙ/ml H2O2-t tartalmazott. A színreakciót leállítottuk öt perc után 50 μ115%-os H2SO4-tal. Az A490-értéket lemezleolvasóval (Dynatech) határoztuk meg, valamint megállapítottuk, hogy mindegyik ellenanyag lgG1 izotípusú.
A 2211-es számú egérből származó sejtek feleslegét fagyasztófiolában lefagyasztottuk, és folyékony nitrogénben tároltuk. A fagyasztófiolát gyorsan felengedtük 37 °C-os vízfürdőben körkörös mozgatással, amíg a tartalma felolvadt. A sejteket 15 ml-es centrifugacsőbe tettük, 11% FBS-t tartalmazó melegített RPMI-t adtunk hozzá lassan, egyszerre 1 ml-t 3-5 perces időközönként. További 5 ml melegített RPMI-t adtunk, és 5 perces várakozás után a csöveket centrifugáltuk 200 g-vel 5 percig, ezután leszívtuk a felülúszót. A sejteket felvettük RPMI-ben, és elvégeztük a fentiek szerinti fúziót. A hibridóma felülúszókat szűrtük ellenanyag-befogásra nézve és flow-citometriával, ahogy azt a fentiekben leírtuk.
A fúzióval öt kiónt kaptunk, melyeket 195A-val, 195C-vel, 195D-vel, 195E-vel és 195H-val jelöltünk. A kiónok izotípusát a fentiekben leírtaknak megfelelően ELISA módszerrel határoztuk meg, a 195A, 195B, 195D és 195E monoklonális ellenanyagokat lgGrnek, míg a 195H-t lgG2a-nak azonosítottuk.
6. Az ad funkcionális kötődését gátolni képes ellenanyagok azonosítására az oldható ad/CD18LZ-t (lásd 14. példa) használtuk az immunizációhoz. A fehérjét az átmenetileg a transzfektált COS-sejtek felülúszójából izoláltuk affinitáskromatográfiás gyantán, és a gyantához kötött ad-t használtuk immunogénként. Egy kiválasztott egeret a fentiekben leírtak szerint immunizáltunk, és a végső megerősítést az első immunizáció után két héttel később végeztük el. Ezen technikával végzett immunizálás megakadályozza a fehérjekonformációban bekövetkező lehetséges változásokat, melyek a sejtek detergenssel végzett lízisénél gyakran fellépnek. További egereket immunizáltunk rekombináns fehérjékkel, gyantához kötöttel is, de az elsődleges immunizációt nem a sejtek lizátumából izolált fehérjével végeztük.
Az immunizáció eredményeként kapott, a fentiekben leírtak szerint készített hibridómákat ELISA-val szűrtük egy sejtfelülúszóból származó rögzített rekombináns fehérjén, felhasználva egy nem blokkoló ellenanyag Fab-fragmensét. Alternatívaként flow-citometriát használtunk az ad cDNS-sel előzőleg transzfektált JY sejtek reakcióképességének vizsgálatára.
7. Egy másik változatban a monoklonális ellenanyagokat a következőképpen állítottuk elő. Stabilisán transzfektált CHO-sejtek detergenssel készített lizátumából az ad/CD18 heterodimer fehérjét affinitáskromatográfiával tisztítottuk, és felhasználtuk 50 pg/ml muramil-dipeptidázzal a Balb/c egerek immunizálásához, ahogy azt a fentiekben leírtuk. Az egereket háromszor immunizáltuk, mielőtt az ad/CD18 elleni szérumreaktivitásukat meghatároztuk a CHO-transzfektánsokban biotinilezett komplexek immunoprecipitációjával. A pozitív állatokból a hibridómákat standard eljárási sémák szerint alakítottuk ki, ezután a hibridóma tenyészeteket flow-citometriával kiválasztottuk, felhasználva az ad/CD18 transzfektánsokat. A CD11a/CD18 transzfektánsokat kontrollként alkalmaztuk a csak CD18-reaktivitásúak kimutatására.
8. A monoklonális ellenanyag előállítás egy másik változatában a Balb/c egereken egy, az immunizációra felhasznált immunizációs/immunoszupressziós eljárási sémát alkalmaztunk, melyet a transzfektáns CHO-sejt determinánsokkal mutatott reakciókészségének mérséklésére terveztünk. Ez az eljárási séma magában foglalja a nem transzfektált CHO-sejtekkel történő immunizálását és közvetlenül utána a CHO-reaktív Bsejt-blasztok elpusztítását ciklofoszfamidos kezeléssel. Háromszori immunizáció és a ciklofoszfamidos kezelés után az egereket ad/CD18-cal transzfektált CHO-sejtekkel immunizáljuk a fentiekben leírtaknak megfelelően.
9. Egy másik változatban a PMA-val stimulált HL60 sejtek detergenssel készített lizátumából származó CD18 komplexeket feldúsítottuk az előzőekben leírt előtisztítással. Azonos oszlopon más β2 integrineket is tisztítunk. Az eredményül kapott komplexekkel történő immunizációt, a hibridóma-előállítást és a szűrési sémákat a fentiekben leírtaknak megfelelően végeztük.
B) A poliklonális szérumok előállítása
A tisztított ad I domain/lgG4 kimérát (lásd a 14. példát) felhasználtuk nyulakban poliklonális ellenanyagok előállítására. Az ad I domain/lgG4 antigént az első immunizáláskor 100 pg/nyúl mennyiségben injektáltuk Freund-féle adjuvánsban, ezt három megerősítés követte azonos mennyiségű fehérjével Freund-féle inkomplett adjuvánsban. A harmadik és negyedik injekció után vérmintákat vettünk a vizsgálathoz. A szérumból a nyúl immunoglobulint (ig) kitisztítottuk protein ASepharose oszlopon, és előtisztítottuk antihumán IgG reaktivitásra nézve egy humán IgG/Affigel 10 oszlopon. Az I domain kimérára adott ELISA-val mért reaktivitást, de nem a humán IgG-re, felhasználtuk a teljes előtisztítás megerősítésére.
Az előtisztított poliklonális szérumokat felhasználtuk az előzőleg ad és CD18 expressziós vektorokkal transz22
HU 223 977 Β1 fektéit felszínen biotinilezett CHO-sejtek detergens lizátumából származó fehérjék immunoprecipitálására. Az immunoprecipitációt a 10. példában előzőekben leírt módszerek alapján végeztük. Az előtisztított szérumok felismertek egy fehérjekomplexet azonos molekulatömeggel, mint amely a TS1.18 anti-CD18 monoklonális ellenanyaggal precipitálódott. Ráadásul a szérumok felismertek egy egyedi megfelelő méretű sávot az ad/CD18-cal transzfektált CHO-sejtekből származó CD18 komplexek Westem-blotjában. A humán lépből származó CD11a/CD18, CD11b/CD18 és VLA-4 affinitástisztított integrineket nem ismerték fel a nyúl poliklonális szérumok. A szérumok oldatban nem reagáltak az ad-vel transzfektált CHO-sejtekkel, ahogy azt flow-citometriával kimutattuk. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a nyúl poliklonális szérumok csak a denaturált ad I domain/lgG4 fehérjéket képesek felismerni.
Az ad/CD18 elleni poliklonális antiszérum előállításának egy másik kísérletében egy egeret háromszor immunizáltunk ad-vel transzfektált CHO-sejtekkel (D6.CHO, ad/CD18) adjuváns peptidek jelenlétében, és egyszer tisztított ad/CD18 heterodimerrel. A végső megerősítés csak ad/CD18 heterodimert tartalmazott. Hozzávetőleg 100 μΙ immunizált szérumot előtisztítottunk hozzávetőleg 108 LFA-1-gyel transzfektált CHOsejttel 2 óráig 4 °C-on. Az eredményül kapott szérumot ad-reaktivitásra nézve vizsgáltuk 1/5000, 1/10 000 és 1/40 000 hígításokban normál humán lépen. A poliklonális ellenanyag 1/20 000 hígításban aktív volt, de 1/40 000 hígításban már csak nagyon gyenge festődést adott.
16. példa
Az ad megoszlásának vizsgálata
Az ad/CD18 megoszlását a 15. példában leírt poliklonális antiszérummal határoztuk meg.
A tisztított nyúl poliklonális ellenanyagot 120 ng/ml és 60 pg/ml koncentrációtartományban használtuk a fagyasztott humán lépmetszetek analízisére. A 6 mikron vastagságú metszeteket Superfrost Plius Slides (VWR) tárgylemezekre helyeztük és -70 °C-on tároltuk. Felhasználás előtt a tárgylemezeket kivettük a hűtőből, és 55 °C-ra helyeztük 5 percre. Ezután a metszeteket fixáltuk jéghideg acetonban 2 percig, és levegőn megszárítottuk. A metszeteket blokkoltuk 1% BSA-t, 30% normál humán szérumot és 5% normál nyúlszérumot tartalmazó oldatban 30 percig szobahőmérsékleten. Az első ellenanyagot mindegyik metszeten 1 óráig alkalmaztuk szobahőmérsékleten. A nem kötött ellenanyagot a tárgylemezekről eltávolítottuk háromszor TBS pufferes 5 percig tartó mosással. Ezután egy nyúl antiegér IgG-kötött ellenanyagot alkalmaztunk azonos TBS pufferben mindegyik metszeten. Egy egér alkalikus-foszfatáz-antialkalikus-foszfatáz ellenanyagot (APAAP) 30 percig inkubáltunk szobahőmérsékleten a második ellenanyag kimutatására. A tárgylemezeket ezután mostuk háromszor TBS pufferben. Fást Blue szubsztrátot (Vector Labs) alkalmaztunk, és a szín előhívását vízbe mártással állítottuk le. A tárgylemezeket háttérfestettük Nuclear Fást Red (Sigma) festékkel, és az Aqva Mount (Baxter) beágyazás előtt vízzel öblítettük. Ezzel a reagenssel a festődést a lép vörös pulpájában mutattuk ki, de a tárgyhoz nem kapcsolódó nyúl poliklonális ellenanyag preparátummal vagy ugyanabból az állatból származó immunizálás előtti szérummal nem kaptunk festődést.
Ha az egérszérumról megállapítottuk, hogy az advel szemben specifikus reaktivitással rendelkezik, akkor ezt felhasználtuk különböző limfoid és nem limfoid szövetek festésére. Kontrollként a CD18-at, CD11a-t, CD11b-t és a CD11c-t felismerő monoklonális ellenanyagokat használtuk ugyanabban a kísérletben. A normál lépmetszetek festődése alapján a következő eredményeket kaptuk ad poliklonális szérumokkal, valamint CD11a-ra, CD11b-re, CD11c-re és CD18-ra specifikus monoklonális ellenanyagokkal. Az ad poliklonális ellenanyaggal megfigyelt mintázat nem azonos a CD11a-val, a CD11b-vel, a CD11c-vel és a CD18-cal kapott mintázattal. A különbség a fehér pulpa széli részében helyeződő néhány sejt eltérő jelölődési mintázatában és a széli rész perifériális sejtjeinek jelölődésében van. Ezt a mintázatot más ellenanyaggal nem tudtuk megfigyelni. A vörös pulpában szétszórtan elhelyezkedő egyedi sejtek szintén jelölődtek, mely lehet, hogy azonos vagy nem azonos a CD11a-nál és CD 18nál látható populációval vagy annak részével.
A CD11c-vel történt jelölés a széli zónában néhány sejt festődését mutatja, de az ellenanyag nem mutatja a fehér pulpa körül a gyűrűmintázatot, ha összehasonlítjuk az ad poliklonális szérumokkal, valamint nem ugyanolyan mintázatot ad a vörös pulpában, mint az ad poliklonális szérumokkal festettnél kaptunk.
Ezért az ad poliklonális szérummal mutatott jelölődési minta egyedi, összehasonlítva más β2 integrinekkel (CD11a, CD11b, CD11c és CD18), és ez arra utal, hogy az emberben az ad in vivő megoszlása különbözik más β2 integrinek megoszlásától.
A humán a^-expresszió jellemzése monoklonális ellenanyagokkal
A 196A és a 196B hibridómák által szekretált ellenanyagokat használtuk a fagyasztott szöveti metszetek humán ad-expressziójának immunocitokémiai vizsgálatához és a sejtvonalak, valamint a perifériális fehérvérsejtek flow-citometriás analíziséhez. Minkét kísérleti típusban a hibridóma felülúszókat hígítás nélkül alkalmaztuk.
A szövetek festése
Minden festést a fentiekben leírtak szerint végeztünk, kivéve a májmetszeteket, melyeket a következő módszerrel festettünk. Az acetonos fixálás után a metszeteket kioltottuk 1 % H2O2-t, 1 % nátrium-azidot tartalmazó TBS-sel 15 percig szobahőmérsékleten. Az első ellenanyaggal végzett festés után egy, a nyúl antiegér ellenanyaghoz közvetlenül konjugált peroxidázt alkalmaztunk 30 percig szobahőmérsékleten. A tárgylemezeket háromszor mostuk TBS pufferben. A második ellenanyag kimutatásához egy sertés antinyúl ellenanyagot, melyhez a peroxidáz közvetlenül kapcsolódik, 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltunk. A tárgylemezeket ezután háromszor mostuk TBS pufferben,
HU 223 977 Β1 majd AEC szubsztrátot (Vector Labs) alkalmaztunk, és hagytuk a szín kifejlődését. A tárgylemezeket háttérfestettük Hematoxylin Gill’s 2-vel (Sigma), és közvetlenül ezután, a dehidratáció és a beágyazás előtt, vízzel öblítettük.
A lépmetszetekben az expresszié túlsúlya a lép vörös pulpájában lévő sejtekben volt megfigyelhető, melyeket morfológiájuk alapján granulocitaként és makrofágként azonosítottunk. A granulociták nagy száma festődött, míg a makrofágok kis része adta csak a jelet. A fehér pulpa follicularis dendrikus sejtjeinek egy kis része gyengén festődött az ad ellenanyagokkal. A CD11a- és a CD18-festődését detektáltuk az egész vörös és fehér pulpában. A CD11a- és CD18-festődés sokkal erőteljesebb volt a lép fehér pulpában és a fehér pulpát körülvevő széli zónában lévő nagy sejtekben, feltételezhetően a makrofágokban; diffúz festődést vettünk észre a vörös pulpában is.
Az integrinexpressziót összehasonlítottuk normál és (reumaszerű) ízületi gyulladásos szövetekben. Mindegyik antiintegrin ellenanyaggal (beleértve a CD11a-ra, CD11b-re, CD11c-re, CD18-ra, valamint az ad-re specifikusan immunoreaktív ellenanyagokat) minimális festődést kaptunk a normálszövetekben egy széles eloszlást mutató sejttípussal, feltehetően a makrofágokkal. A gyulladásos ízületi hártyában az összes integrin elsősorban a nyirokerek körül csoportosuló sejtekben lokalizálódott. Míg az ad és CD11b expressziós mintázata azonos volt, addig a CD11c nem tűnt annyira erősen expresszáltnak, és a fehérvérsejtek egy alosztályára korlátozódott.
A kutyákban a CD11b expresszióját a májban lévő makrofágokban vagy a Kuppfer sejtekben figyeltük meg, ezzel szemben az ad expresszióját nem tudtuk megfigyelni. A normál humán lépmetszetek (ahogy azt korábban leírtuk a kutyamájmetszetek festésénél) megerősítették a konzervatív festődési mintázatot emberi metszetekre nézve is. Ráadásul a CD11c-t csak alacsony szinten tudtuk detektálni. Egy májgyulladásos beteg metszeteiben mindegyik leukointegrin festődése nagyobb volt, mint a normál májnál megfigyelt, és ezekben a mintákban az ad expresszióját figyeltük meg makrofágokon és granulocitákon.
A humán vastagbélmetszeteken minimális festődést figyeltünk meg anti-ad ellenanyagokkal: halvány izomfestődést és leukocitafestődést figyeltünk meg. A Crohn-féle betegségből származó metszetek mindegyik leukointegrinre nézve magasabb szinteket mutattak.
A normál tüdő korlátozott számban gyengén ad pozitív sejteket mutatott; ezek a sejtek morfológiájuk alapján makrofágok és neutrofilek. A tüdőtágulatos betegek tüdőszövetében ad-festődést figyeltünk meg neutrofileken és a hemosziderint, egy vastartalmú pigmentet tartalmazó makrofágokon, mely a vörösvérsejt bekebelezését jelenti ezeknél a sejteknél.
A normál agy és a sclerosis multiplexes (MS) betegek plakklézióit integrinexpresszióra nézve vizsgáltuk. A normál agyban az ad-festődés kevésbé intenzív volt, mint a CD11a-val, CD11b-vel és CD11c-vel, és morfológiájuk, valamint CD68-festődésük alapján mikrogliális sejttípusokra korlátozódott. A CD11b pozitív sejtek elszórtan helyezkedtek el a véredények körül az egész szövetben. A CD11c+ sejtek a véredényekben, míg az ad+ sejtek a véredények körül helyezkedtek el. Az MS szöveti metszetekben az ad-expresszió mind a mikroglia, mind a nem makrofág leukociták alosztályán megtalálható volt; az ad + sejtek a plakkléziókban helyezkedtek el, valamint szétszórtan az egész kéregben. Az ad jel azonos intenzitású volt a CD11c-vel, de kisebb volt, minta CD11bjele.
A PDAY (Pathobiological Determinats of Atherosclerosis in Youth, LSU Medical Center) szöveti mintáinak mind a mellkasi aorta, mind a hasi aorta szöveti metszeteit analizáltuk antileukointegrin és anti-CAM ellenanyagokra nézve. A megfigyelt léziók összhangban voltak az aorta zsírcsíkjaival, melyek a nagy habsejtek (főleg makrofágok megemésztett lipidekkel) érfal belső rétege alatti aggregátumaiból és kisebb leukocitabeszűrődésből álltak. Az ad-re és más β2 integrin a-láncokra (CD 11 a, CD11b és CD11c), meg egy makrofág markerre (CD68) specifikus monoklonális ellenanyagokkal végzett egyszeres jelölési kísérletek felfedték, hogy a lipiddel töltött makrofágok túlnyomó többsége mérsékelt mennyiségben expresszált ad-t és CD18-at, míg CD11a-t és CD11c-t gyengén, illetőleg gyenge szinttől a mérsékelt szintig. A CD11b alig expresszálódott, és akkor is csak a makrofágok egyik alosztályában.
A kettős jelölési kísérleteket azért végeztük el, hogy meghatározzuk az ad és az ICÁM antigének helyét az aortametszeteken. Mivel a habsejtek ezekben a metszetekben Ham 56 makrofágokra specifikus marker ellenanyaggal festődtek, de nem festődtek simaizomaktin ellenanyagokkal, így megállapítottuk, hogy a habsejtek nem az érfal belső rétege alatti simaizomsejtekből származnak. Az ad-t expresszáló CD68 pozitív makrofágok kis ICAM-R pozitív leukocitákkal vannak elszórtan körülvéve. Úgy tűnt, hogy a kis leukocitáknak korlátozott a száma, melyek CD68 negatívak, de mind ad, mind ICAM-R ellenanyagokkal festődnek.
A normálszövetekben az ad megoszlása úgy tűnik, hogy az ott tartózkodó leuciták egyik mintázatában átfed, de nem azonos a CD11b és a CD11c mintázatával, a két másik leukointegrin α-lánccal, amelyekről mostanában mutatták ki, hogy korlátozott leukocitamegoszlással rendelkeznek. A sejtek morfológiája alapján az ad-festődés főleg a makrofágokra és a granulocitákra korlátozódott, és csak kismértékben a limfociták festődésére. Általában a szöveti gyulladások megnövelték egy adott vizsgálati szövetben a leukociták számát és típusát, ez társult a leukointegrinekre nézve megnövekedett festődéssel, beleértve az ad-t is. Mivel a leukointegrinek celluláris és térbeli megoszlása nem volt azonos a kóros szövetekben, arra a következtetésre jutottunk, hogy elkülönülő funkciók és ligandok léteznek mindegyik fajta integrinre, beleértve ebbe az ad-t is.
Érdekes, hogy az ad expressziója korai atherosclerosisos léziókban erőteljesebbnek tűnt, mint a CD 11ánál, CD11b-nél és CD11c-nél, ez arra utal, hogy az ad központi szerepet játszik ezen léziók létrejöttében. Az
HU 223 977 Β1 egymás mellett elhelyezkedő ad és ICÁM pozitív sejtek bizonyíték arra nézve, hogy az ad részt vehet ezen léziók korai szakaszában a leukocitamegújulásban vagy -aktivációban.
A sejtvonalak és a perifériális fehérvérsejtek festődése
FACS-vizsgálattal megállapítottuk, hogy a 169A és a 169B ellenanyagok festik a HL60 promielocita sejtvonalat. Az ad felületi megnyilvánulását ezekben a sejtekben negatívan befolyásolja a PMA-stimuláció, amelyről beszámolták, hogy a differenciálódást makrofág irányba tereli, de nem hat rá a DMSO, amely a granulocitadifferenciálódást indukálja [Collins és munkatársai: Blood 70, 1233-1244 (1987)]. A 169A és a 169B FACS-eredményei PMA-stimulációkor ellentétesek voltak azokkal az eredményekkel, melyeket az anti-CD11b és az anti-CD11c monoklonális ellenanyagokkal figyeltünk meg. A THP-1 monocita sejtvonal is gyenge festődést mutatott a 169A-val és a 169B-vel. Ráadásul FACS-szal gyengén pozitívnak tűntek a perifériális fehérvérsejtek limfocitáinak és a gátfunkciót betöltő monocitáinak alosztályai. A perifériális vér monocitáinak egy alosztálya gyengén festődött 169A-val és 169B-vel, míg a B-limfociták nem mutattak ad felületi megnyilvánulást. A T-limfociták CD8+ alosztálya ad + volt. Ráadásul a 169A és 169B ellenanyagok nem tudtak antigént kimutatni JY és Ramos B-sejtvonalakon, egy KU812 bazofil sejtvonalon, és Jurkat, SKW, valamint Molt16 T-sejtvonalakon.
A HL60 sejtekkel kapott eredmények alapján a granulocitákat izoláltuk a perifériális vérből ficell/hypaque gradiens centrifugálással, és közvetlenül ezután a vérsejtek lízisével. A magmorfológia ecetsavban történő láthatóvá tételével megállapítottuk, hogy mindegyik preparátum több mint 90% PMN-t tartalmaz. A potenciális integrinraktárak kiürítésére különálló populációkat stimuláltunk 30 percig 50 ng/ml PMA-val vagy 10-8 M formil-peptiddel (fMLP). A nem stimulált populációk alacsony, de szignifikáns 169A és 169B antigénexpressziót mutattak az lgG1 kontrollal szemben, stimulációkor egy kimutatható növekedést figyeltünk meg. A PMN sejteken az ad és a CD11c felületi megnyilvánulása sokban azonos volt a HL60 sejteken megfigyeltekkel. A 169B ellenanyagot ezután közvetlenül a biotinilezett PMN sejtek detergenssel készült lizátumából származó heterodimer molekula kicsapására használtuk, melynek alegységei hozzávetőleg 150 kD és 95 kD nagyságúak, és megfelelnek az ad-nek, illetőleg a CD18-nak.
Az ad jelenléte a PMN sejteken nem volt elvárható a kutya ad expressziójával kapcsolatos ismert információk alapján. A kutya neutrofilek, nem úgy, mint humán megfelelőik, expresszálják a CD4-et, a segítő T-sejtmarkert, valamint a VAL-4 integrint is, és ezért lehetséges, hogy különböző ligandjaik és funkcióik vannak kutyában, mint emberben.
A PBL alcsoport festődése
A jelen tanulmány egyik célkitűzése, hogy meghatározza a szóban forgó β2 integrin megoszlását humán perifériális fehérvérsejtekben. Ráadásul az ad felületi sűrűségét összehasonlítottuk más β2 integrinekkel. Végül a tisztított humán eozinofilekben az ad-expresszió akut szabályozását szintén kiértékeltük.
A humán perifériális fehérvérsejteket sűrűséggradiens-centrifugálással elkülönítettük egy mononukleáris sejtfrakcióra (mely monocitákat, limfocítákat és bazofileket tartalmaz) és granulocitákra (neutrofilek és eozinofilek) [Warner és munkatársai: J. Immunoi. Meth. 105, 107-110 (1987)]. Néhány kísérletben az eozinofileket tisztítottuk, felhasználva a CD16 immunomagnetikus kiválasztási módszert a 95%-nál nagyobb tisztaság eléréséhez [Hansel és munkatársai: J. Immunoi. Meth. 122, 97-103 (1989)]. A bőr hízósejtjeit enzimatikusan diszpergáltuk a humán bőrből, és dúsítottuk a korábban már leírtaknak megfelelően [Lawrence és munkatársai: J. Immunoi, Meth. 139, 3062-3069 (1987)].
A sejteket jelöltük a CD11a-ra (MHM24), a CD11bre (H5A4), a CD11c-re (BU—15) vagy az ad-re (169A) specifikus monoklonális ellenanyagok megfelelő hígításaival. Az egér lgG3 kontrollt szintén felhasználtuk. A sejteket mostuk, és phycoerythrinkonjugált kecske antiegér IgG-vel inkubáltuk. Néhány kísérletben a sejteket inkubáltuk egér IgG feleslegével és FITC-jelölt monoklonális ellenanyaggal vagy kecske poliklonális ellenanyaggal, mely specifikus egy adott sejtre (például: a T-sejtekre a CD3, a CD4 vagy a CD8; az NK sejtekre a CD16+ limfociták; a bazofilekre az anti-IgE) [Bochner és munkatársai: J. Immunoi, Meth. 125, 265-271 (1989)]. A mintákat ezután flow-citometriával (Coulter EPICS Profile) vizsgáltuk, felhasználva a megfelelő kaput a sejtalosztályok azonosítására.
Az ad-expresszió akut up-regulációját mutató humán eozinofilek tanulmányozásához a sejteket 15 percig 37 °C-on stimuláltuk forbol-észterrel (10 ng/ml), RANTES-sel (100 ng/ml) [Schall: Cytokine 3, 165-183 (1991)] vagy IL—5-tel (10 ng/ml), majd különböző monoklonális ellenanyagokkal inkubáltuk a fentiekben leírtak szerint.
Az eredmények azt mutatják, hogy az ad minden perifériális eozinofilen, bazofilen, neutrofilen, monocitán és NK sejten jelen volt. A CD8+ limfociták egy kis mennyisége (hozzávetőleg 30%) szintén expresszálja az ad-t. A bőr hízósejtek és a CD4+ limfociták nem expresszálták az ad-t. Általában a CD11a és a CD11b nagyobb sűrűségben van a limfocitákon, mint az ad, az utóbbi viszonylag alacsony szinten expresszálódik, hasonlóan, mint a CD11c. A leukociták között a monociták és a CD8+ sejtek mutatják a legnagyobb ad-sűrűséget, míg az eozinofilek a legalacsonyabb szintű adexpresszióval rendelkeznek. A neutrofilek, a bazofilek és az NK sejtek közepes expressziót mutattak.
A perifériális eozinofilek CC chemokine RANTES stimulációja nem okozott változást egyik β2 integrin expressziójában sem. Ezzel szemben a forbol-észteres kezelés kétszeres-háromszoros növekedést okozott mind a CD11b, mind az ad expressziójában, de nem hatott a CD11a vagy a CD11c expressziójára. Az IL-5-kezelés a CD11b-expresszió szelektív up-regulációját eredményezte, anélkül hogy más integrinalegységek szintjét befolyásolta volna.
HU 223 977 Β1
Ezen eredmények összevetése arra utal, hogy a perifériális fehérvérsejtekben az ad általában a CD11c szintjével azonos mértékben expresszálódik. A monocitákon és CD8+ limfociták egy alosztályán találtuk a legnagyobb expressziét. A humán bőr hízósejtjei nem expresszálnak ad-t. A tisztított eozinofilekről úgy tűnik, hogy a CD11b-t és az ad-t tartalmazó előre elkészített intracitoplazmatikus raktárakkal rendelkeznek. Mivel az IL-5 által mutatott up-reguláció a PMA-tól különbözik, ezért valószínű, hogy a raktárak egymástól elkülönültek.
Egy kísérletben, hogy pontosabban meghatározzuk a 169A/B negatív limfocita csoportot, a perifériális fehérvérsejtek (PBL) alcsoportjainak festődését flow-citometriával is meghatároztuk, felhasználva a kapubeállítások kombinációit és a felületi markereket, ahogy azt a fentiekben leírtuk. A PBL-t a korábban leírtak szerint Ficollon izoláltuk, és külön-külön festettük 169A és 169B, és CD14 (monocita/makrofág marker), CD20 (B-sejt-marker), CD56 (NK sejt marker), T-sejt-receptor α/β (T-sejt-marker), CD16 (neutrofilek és NK-k markere) és a4 (a neutrofilek negatív markere) monoklonális ellenanyagokkal. A méret és a markerek megoszlása alapján határoztuk meg a kapukat.
Az eredmények azt mutatták, hogy a CD14+ monocita kapuval a sejteknek alacsony a 169A- és 169Bfestődése. A leukocita kapu korábbi kísérletekben megfigyelt bimodális expressziós mintázata feloldódott az előszórás növelésével. A TCR+/CD20+ kevert populáció alacsony, de homogén szintű 169A/B expressziót mutat, bár ha a populációt egy kicsit nagyobb oldalszórással (celluláris komplexitás) térképeztük, amely ha a CD56-ra 50%-ban pozitív volt, akkor egy elkülönülő 169A/B negatív populációt figyeltünk meg. A negatív populációkat nem ismerték fel a következő ellenanyagok sem: TCR, CD20, CD14 és CD16.
Az ad megoszlása ízületekben
Gyulladásos és nem gyulladásos ízületi hártyákon az ad, más β2 integrinek és ezek ellenreceptorainak celluláris megoszlásának meghatározásához különböző β2 integrinekre és immunológiailag szupergén családokra specifikus monoklonális ellenanyagokat használtunk fel az immunohisztokémiai vizsgálatokhoz. A fehérjeexpressziót meghatároztuk normál, osteoarthritikus és rheumatoid ízületi szövetek mintáin.
Az eredmények azt mutatják, hogy az ízületek határoló sejtrétege nagy mennyiségű VCAM-1-et, CD11b/CD18-at és a.d/CD18-at expresszál. Ezekben a sejtekben a CD11c/CD18 expresszió korlátozott, és a CD11a/CD18-at általában nem tudjuk kimutatni. A rheumatoid arthritis synovitisben a β2 integrinek expressziója az ízületi sejtrétegben a hiperpláziával arányosan megnő. A CD11 c-t expresszáló sejtek aránya szignifikánsan megnő, eléri a CD11b és az ad szintjét, de a CD11a expressziójában nincs növekedés.
A szövet határoló régiója alatt a CD3/CD11a/ICAM-R+ limfociták aggregátumai és diffúz beszűrődései eloszlanak a CD68/CD11b/ad+ makrofágok között. Az aggregátumok egy jelentős része intenzíven festődik ad-vel, különösen a T-sejt-gazdag területeken.
A ízületi endothelium különböző mértékben expresszál ICAM-1-et és ICAM-2-t, míg az ICAM-R expressziójára minimális bizonyíték van.
Összevetve az eredményeket az ízületi makrofágok és makrofágszerű sejtek állandó magas szinten expresszálnak CD11b és ad típusú β2 integrineket. Az ízületi gyulladásban mind a határoló, mind a határoló réteg alatti területeken a sejtek ezen alosztályának terjeszkedését figyelhetjük meg, a CD11 c-expresszió látható növekedésével együtt. A reumás ízületi T-limfociták a CD11a és az ICAM-R expresszióján kívül nagymértékben expresszálnak ad-t is, az utóbbi molekuláról kimutatták, hogy a perifériális fehérvérsejteknél magasabb szinten expresszálódnak.
17. példa
A patkány cDNS-klón izolálása
A kutya és humán ad-alegység létezése tükrében kísérletet tettünk más fajokból származó homológ gének izolálására, beleértve a patkányt (ez a példa) és az egeret (lásd a 17. példa után).
A humán ad génnel homológiát mutató patkány cDNS részleges szekvenciát a patkánylép Xgt1O könyvtárból (Clontech) nyertük. A könyvtárat 150 mm-es LBM/agar lemezekre vittük lemezenként 2*104 pfu koncentrációban. A könyvtárat replikáztuk Hybond membránokra (Amersham), 3 percig denaturáltuk, 3 percig neutralizáltuk, és 5 percig mostuk a standard eljárási sémában leírt pufferrel [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2.110. oldal], A membránokat azonnal Stratalinkerbe (Stratagene) helyeztük, és a DNS-t keresztkötöttük, felhasználva az autokeresztkötő beállítást. A membránokat előhibridizáltuk és hibridizáltuk 30%, illetőleg 50% formamiddal, a kis és nagy pontosságú körülmények kialakításához. Először szűrtük a membránokat humán ad cDNS alapján készített 32P-vel jelölt próbával, amely megfelel az 1-es számú szekvencia 19A2 kiónjában az 500-2100. bázisoknak. A próba jelölését a Boehringer-Mannheim’s Random Prime készlettel végeztük a gyártó által javasolt eljárási sémának megfelelően. A filtereket kétszer mostuk 2*SSC-vel 55 °C-on.
Két kiónt azonosítottunk: a 684.3-at és a 705.1-et, ezek szekvenciájukban homológok voltak a humán ad-vel, a humán CD11b-vel és a humán CD11c-vel. Mindkét kiónt összehasonlítottuk a humán ad gén 3’ régiójával, a 684.3 klón az 1871. bázistól a 3012. bázisig tart, míg a 705.1 klón az 1551-től tart a 3367. bázisig.
Az 5’ régiót tartalmazó teljesebb patkányszekvenciák izolálásához ugyanazt a könyvtárat újra szűrtük, felhasználva ugyanazt az eljárási sémát, melyet az első szűrésnél alkalmaztunk, de az A1160 kiónból (lásd a 17. példa után) készített egérpróbát használtuk. Az egyedül álló izolált plakkokat kiválasztottuk a második szűrésben, és egymástól független kiónokként tartottuk fenn LBM/agar lemezeken. A 434FL és a 434FR szekvenáló primereket (szekvenciaszámuk: 34, illetőleg 35) használtuk fel a standard PCR eljárási sémában a DNS szekvenálásához.
HU 223 977 Β1 (a szekvencia száma: 34) (a szekvencia száma: 35)
5’-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3’
5-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3'
A PCR DNS-t tisztítottuk, felhasználva egy Quick 5 Spin (Qiagen) oszlopot a gyártó által javasolt eljárási séma szerint.
Két kiónt, a 741.4-et és a 741.11-et, azonosítottuk és megállapítottuk, hogy a 684.3 és a 705.1 klónokkal átfedést mutatnak, az átfedő régiókban a 741.4 és a 10 741.11 100%-ban homológ a 684.3 és a 705.1 klónokkal. Egy összetett patkány cDNS-t, mely homológ a humán ad génnel, a 36-os szekvenciaszámon tettünk közzé; a megjósolható aminosavszekvenciáját 37-es számon tettük közzé.
A patkány ad 5' végének klónozása A patkány ad gén 5’ cDNS-fragmensét a Clontech patkánylép RACE klónozókészletének felhasználásával kaptuk meg a gyártó által javasolt eljárási séma alapján. A felhasznált génspecifikus oligonukleotidokat 741.11#2R-rel és 741.2#1R-rel jelöltük (szekvenciaszámuk: 59, illetőleg 58).
5’-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3’
5’-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3’ (a szekvencia száma: 59) (a szekvencia száma: 58)
Az oligo 741.11#2R magában foglalja a 36-os szekvencia 131-152. bázispárjait ellentétes irányban, és a 741.2#1R magában foglalja a 36-os szekvencia 696-715. bázispárjait szintén ellentétes irányban. Az első PCR-t a 741.2#1R 3’-most oligóval végeztük. Az ezt követő második PCR-t a 741.11#2R-rel és az első reakcióból származó DNS-sel végeztük. Hozzávetőleg 300 bázispár nagyságú sávot mutattunk ki az 1%-os agarózgélen.
A második reakció PCR-termékét a pCRTAII (Invitrogen) plazmidba ligáltuk a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A fehér (pozitív) kolóniákat kiemeltük, és a 96 lyukú kerek aljú szövettenyésztő lemez egyedi lyukaiban lévő 100 μΙ LBM oldatba tettük, mely az 50 mg/ml carbenicillin törzsoldatból 1 μΙ-t és 1 μΙ M13 K07 fág tenyészetet tartalmazott. A keveréket inkubáltuk 37 °C-on 30 perctől egy óráig. Az első inkubációt követően 100 μΙ LBM-et adtunk hozzá (mely az mg/ml carbenicillin törzsoldatból 1 μΙ-t és a 10 mg/ml kanamicin törzsoldatból 1:250 arányú hígítást tartalmazott), és az inkubációt tovább folytattuk egy éjszakán át 37 °C-on.
A felülúszót steril 96 ágú fémből készült átvivőpipettával a 96 lyukú lemezből átvittük Amersham Hybond nejlonfilterekre. A filtereket denaturáltuk, neutralizáltuk és keresztkötöttük standard eljárásokkal. A filtereket először hibridizáltuk 20 ml prehibridizációs pufferben (5*SSPE; 5*Denhardts; 1% SDS; 50 ugs/ml denaturált lazacsperma DNS) több órán keresztül rázás mellett 50 °C-on.
A 741.11#1 és a 741.11#1 R oligopróbák (szekvenciaszámuk: 56, illetőleg 57) magukban foglalják a 36os szekvencia 86-105. bázispárjait megegyező, illetőleg fordított irányban, és a következőkben leírtaknak megfelelően jelöltük.
5-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3’
5-AGGTTAGACCCATGACAGG-3’ (a szekvencia száma: 56) (a szekvencia száma: 57)
Hozzávetőleg 65 ng oligo DNS-t 12 μΙ dH2O-ban 65 °C-ra melegítettünk két percig. Ezután a csövekben beletettük a 10 mCi/ml y-32P-ATP-ből 3 μΙ-t és 4 μΙ 5*kináz puffért (Gibco), valamint 1 μΙ T4 DNS- 45 ligázt (Gibco). A keveréket inkubáltuk 37 °C-on 30 percig. Az inkubáció után mindegyik jelölt próbából 16 μΙ-t adtunk a prehibridizációs pufferhez, és a filterek hibridizálását egy éjszakán át 42 °C-on folytattuk. A filtereket háromszor mostuk 5*SSPE/0,1% 50 SDS-ben mosásonként 5 percig szobahőmérsékleten, és 6 óráig autoradiografáltuk. A pozitív kiónokat felszaporítottuk, és DNS-t izoláltunk, felhasználva a Magic Mini Prep készletet (Promega) a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A 2F7 kiónt kiválasz- 55 tottuk szekvenálásra. Ez a klón a 741.11 klón átfedő régiójával 100% homológiát mutatott. A teljes patkány ad nukleinsavszekvenciát 54-es számon tettük közzé; az aminosavszekvenciát 55-ös számon tettük közzé. 60
A patkány cDNS- és aminosavszekvenciák jellegzetességei
Korábban a patkány β2 integrinek «.-alegységeinek nukleinsav- és aminosavszekvenciáját még nem mutatták be. A leírt humán β2 integrin «-alegységeinek szekvencia-összehasonlítása arra utal, hogy az izolált patkányklón és a megjósolható aminosavszekvenciája szoros kapcsolatban van az ad nukleotid- és aminosavszekvenciájával.
Nukleinsavszinten az izolált patkány DNS-klón 80%-ban azonos a humán ad cDNS-sel, 68%-ban a humán CDUb-vel, 70%-ban a humán CD11c-vel és 65%-ban az egér CD11b-vel. Nem találtunk szignifikáns azonosságot a humán CD11a és az egér CD11a között.
Aminosavszinten a megjósolt patkány polipeptidet kódoló izolált cDNS 70%-os azonosságot mutat a humán ad polipeptiddel, 28%-os azonosságot a humán CD11 a-val, 58%-os azonosságot a humán CD11b27
HU 223 977 Β1 vei, 61 %-os azonosságot a humán CD11c-vel, 28%os azonosságot az egér CD11 a-val, és 53%-os azonosságot mutat az egér CD11 b-vel.
18. példa
A rágcsáló a^specifikus ellenanyagok előállítása és jellemzése
A) Ellenanyagok a patkány ad I domain/Hu lgG4 fúziós fehérjékre
Abból a tényből kiindulva, hogy a humán β2 integrinek I domainje precipitálódik ligandkötéskor, feltételeztük, hogy ugyanez igaz a patkány ad fehérjére is. A patkány ad I domainre immunospecifikus monoklonális ellenanyagok ezért hasznosak lehetnek a humán betegségek patkánymodelljeiben, ahol az ad-kötődés szerepet játszik.
A „patkány alfa D15” (a szekvencia száma: 87) és a „patkány D13” (a szekvencia száma: 88) oligókat készítettük a patkány ad szekvenciáinak megfelelő 469-493. bázispárokból, illetőleg az 1101-1125. bázispárokból (ellentétes irányban) kialakítva az 54-es számú szekvenciát. Az oligókat standard PCR-módszerben használtuk fel a patkány ad DNS egy fragmensének előállításához, mely tartalmazza az 54-es szekvencia I domaint átívelő 459-1125. bázispárjait. A PCR termékét a pCRTAII (Invitrogen) plazmidba ligáltuk a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A pozitív kiónokat kiválogattuk és felszaporítottuk a DNS tisztításához. A DNStisztítást Qiagen (Chatsworth, GA) Midi Prep készlettel végeztük a gyártó által javasolt eljárási sémának megfelelően. A DNS-t standard módszer felhasználásával Xhol és Bglll restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és egy 600 bázispár nagyságú sávot tisztítottunk ki gélen, melyet közvetlenül ezután a pDCS1/HulgG4 expressziós vektorba ligáltunk. Egy pozitív kolóniát kiválasztottunk, a DNS-tisztításhoz felszaporítottuk, és a DNS-t Quiagen Maxi Prep készlettel tisztítottuk.
A COS-sejteket tenyésztettük 100 mm-es szövettenyésztő edényekben, az inokulálást a telítési koncentráció felével végeztük, majd egy éjszakán át növesztettük 37 °C-on 7% CO2 jelenlétében. A sejteket mostuk egyszer 5 ml DMEM-ben. Az 5 ml DMEM-hez 50 pl DEAEDextránt, 2 μΙ chloroquine-t és 15 μΙ patkány ad I domain/HulgG4 DNS-t adtunk a fentiekben leírtak szerint. A keveréket hozzáadtuk a COS-sejtekhez, és 37 “C-on 3 óráig inkubáltuk. A tenyészfolyadékot ezután eltávolítottuk, és 5 ml CMF-PBS-ben 10% DMSO-t adtunk pontosan egy percig. A sejteket egyszer mostuk DMEMmel. A 10% FBS-t tartalmazó 10 ml DMEM-et hozzáadtuk a sejtekhez, és az inkubálást folytattuk egy éjszakán át 37 °C-on 7% CO2 jelenlétében. A következő napon a médiumokat kicseréltük friss médiumra, és az inkubálást folytattuk további három napig. A médiumot összegyűjtöttük, és a lemezekhez friss médiumot adtunk. Három nap után a médiumokat újból összegyűjtöttük, és a lemezeket eldobtuk. A folyamatot ismételtük 2 liter tenyésztésből származó felülúszó összegyűjtéséig.
A fentiekben leírtak szerinti összegyűjtött felülúszókat Prosep-A oszlopba (Bioprocessing Limited) töltöttük, és a fehérjét a következőkben leírtaknak megfelelően tisztítottuk. Az oszlopot mostuk először 15 oszloptérfogatnyi Wash pufferrel, mely tartalmazott 35 mM Trist, 150 mM NaCI-ot, pH=7,5. A felülúszót lassabban töltöttük az oszlopba, mint óránként hozzávetőleg 60 oszloptérfogat. A betöltés után az oszlopot mostuk 15 oszloptérfogatnyi Wash pufferrel, 15 oszloptérfogatnyi 0,55 M dietanol-aminnal (pH=8,5) és 15 oszloptérfogatnyi 50 mM citromsavval (pH=5,0). A fehérjét eluáltuk 50 mM citromsavval (pH=3,0). A fehérjét neutralizáltuk 1,0 M Trisszel (pH=8,0), és steril PBS-ben dializáltuk.
A patkány ad I domain fehérjét analizáltuk a 14. példában leírtak szerint. A kimutatott fehérje úgy futott, mint a humán I domain fehérje.
B) A patkány ad I domain/HulgG4 fúziós fehérje specifikus monoklonális ellenanyagok előállítása Az egereket egyedileg immunizáltuk 50 pg tisztított patkány ad I domain/HulgG4 fúziós fehérjével, miután előzőleg emulgeáltuk egyenlő térfogat Freunds Complete adjuvánssal (FCA, Sigma). Hozzávetőleg 200 μΙ antigén/adjuváns preparátumot 4 helyen injektáltunk mindegyik egér hátába és horpaszába. Két héttel később az állatok immunválaszát megerősítettük 100 μΙ patkány ad I domain/HulgG4 antigén (50 pg/egér) beadásával, melyet előzőleg emulgáltunk egyenlő térfogatú Freunds Incomplete adjuvánssal (FIA). További két hét után az egerek immunválaszát megerősítettük 200 pl PBS-en oldott 50 pg antigénnel, melyet intravénásán alkalmaztunk.
Az immunizált állatok szérumtitereinek kiértékeléséhez retroorbitalis véreztetést alkalmaztunk az állatokon tíz nappal a harmadik immunizáció után. A vér megalvadása után a szérumot centrifugálással izoláltuk. A szérumot a biotinilezett (BIP) patkánylépsejtek immunoprecipitációjára használtuk fel. Mindegyik egérszérum immunoprecipitálta a patkány ad és CD18 elvárt molekulatömegű fehérjesávjait. Egy állatot kiválasztottunk a fúzióhoz, és immunválaszát tovább erősítettük negyedszerre is a harmadik megerősítésben alkalmazott módszer szerint.
A hibridóma felülúszókat szűrtük rögzített ellenanyaggal a következőben leírtaknak megfelelően. Az Immulon 4 lemezeket (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) fedtük 4 °C-on 50 μΙ/lyuk kecske antiegér IgA-val, IgG-vel vagy IgM-mel (Organon Teknika) 1:5000 hígításban, a hígítást 50 mM karbonátpufferrel végeztük (pH=8,0). A lemezeket háromszor mostuk 0,05% Tween 20-at (PBST) tartalmazó PBS-sel, és 50 pl felülúszót adtunk a lyukakba. Miután 37 °C-on 30 percig inkubáltuk, és a fentiekben leírtak szerint mostuk, 50 pl torma-peroxidázzal konjugált kecske antiegér lgG9(Fc)-t (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) adtunk 1:3500 PBST-s hígításban. A lemezeket a fentiek szerint inkubáltuk és mostuk 4-szer PBST-vel. Közvetlenül ezután hozzáadtunk 100 pl szubsztrátot, mely 1 mg/ml o-fenilén-diamint (Sigma) és 0,1 μΙ/ml 30% H2O2-t tartalmazott 100 mM citrátoldatban (pH=4,5). A színreakciót 5 perc után leállítottuk 50 pl H2SO4-tal. Az abszorbanciát 490 nm-en Dynatech lemezleolvasóval határoztuk meg.
HU 223 977 Β1
Az ellenanyagot tartalmazó lyukakból származó felülúszókat ELISA-val is analizáltuk rögzített patkány ad I domain/HulgG4 fúziós fehérjével. A HulgG4 ellenanyaggal fedett lemezekkel végzett ELISA kontrollként szolgált az IgG fúziós partnerek kiszűrésére. A pozitív sejteket kiválasztottuk a patkánylépsejtek lizátumainak BIP-vel történő szűréséhez, felhasználva az alábbiakban leírt technikákat.
C) A patkány ad I domain/HulgG4 fúziós fehérje elleni poliklonális szérumok előállítása
Az immunizáció előtt két nyulat elvéreztettünk és immunizáltunk 100 pg komplett Freund-féle adjuvánsban lévő tisztított patkány ad I domaín/HulgG4 fúziós fehérjével. A beadásokat azonos dózisokban, de inkomplett Freund-féle adjuvánsban (IFA) háromhetenként megismételtük. A harmadik beadás után a nyulakat tesztvéreztettük, és az összegyűjtött szérumot standard módszerrel immunoprecipitáltuk patkánylépsejtek lizátumával. Megállapítottuk, hogy minden nyúl széruma immunoreaktív a patkány ad-vel. A nyulakat újra immunológiailag megerősítettük 100 pg antigénnel IFAban, és az összegyűjtött szérumok immunoreaktivitását vizsgáltuk patkány ad immunoprecipitációval. Az utolsó megerősítést 10 nappal később adtuk, majd az állatokat elvéreztettük, és a szérumokat összegyűjtöttük.
A patkány a^vel kapott hisztolögiai eredmények
A patkány ad „I” domainje ellen létrehozott nyúl poliklonális szérumokat felhasználtuk patkány szöveti metszetek immunohisztokémiai festéséhez a 16. példában leírt módszer szerint. A fagyasztott és a parafinba ágyazott patkánylépmetszetek megfigyelt festődési mintázata lényegében azonos volt a humán ad elleni ellenanyag által megfigyelttel: a vörös pulpa körül mindenütt festődtek az egyedi sejtek. A festődési mintázat különbözött a patkány CD11a, CD11b és CD11c elleni monoklonális ellenanyagokkal megfigyelttől. Ráadásul pozitív mintázat volt látható a csecsemőmirigy kérgében elszórt egyedi sejteken. Ezen szövetek egyike sem adott semmilyen jelt, amikor nyúl preimmunszérummal festettük azokat.
D) Az ellenanyag specifitásanalízise
Az állatokat CO2-os fullasztással feláldoztuk, és a lépeket eltávolítottuk standard sebészeti technikákkal. A lépsejteket összegyűjtöttük, miután a lépet gyengén átnyomtuk 3 cc tűn 20 ml RPMI-vel. A sejteket 50 ml-es kónuszos csőben gyűjtöttük, és mostuk a megfelelő pufferrel.
A sejteket háromszor mostuk hideg D-PBS-ben, és felvettük 40 ml PBS-ben 108-109 sejt sűrűségben. A sejtszuszpenzióhoz hozzáadtunk 4 mg NHS-Biotint (Pierce), és a reakciót pontosan 15 percig szobahőmérsékleten végeztük. A sejteket ülepítettük, és háromszor mostuk hideg D-PBS-ben.
A sejteket felvettük 108 sejt/ml sűrűségben hideg lízispufferrel (1% NP40; 50 mM Tris-HCI, pH=8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCI2; 2 mM MgCI2; 1:100 pepstatinoldat; leupeptin; aprotinin, közvetlenül a sejtek hozzáadása előtt adtuk; 0,0001 g PMSF kristályok, közvetlenül a sejtek hozzáadása előtt adtuk). A lizátumokat 30 másodpercig vortexeztük, 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, és tovább inkubáltuk 15 percig jégen. A lizátumokat 10 percig centrifugáltuk 10 000 gn az oldhatatlan anyag eltávolítása érdekében. A felülúszót összegyűjtöttük egy új csőbe, és tároltuk 4 °C és
-20 °C közötti hőmérsékleten.
Egy milliliter sejtlizátumot előtisztítottunk 200 pl protein A-Sepharose gyöngyön (Zymed) egy éjszakán át 4 °C-on. Az előtisztított lizátum egyenlő mennyiségeit Eppendorf csövekbe tettük (50 pl/cső) azért, hogy mindegyik ellenanyagra nézve leteszteljük. A poliklonális szérum 25 pl-ét vagy a monoklonális ellenanyag 100-500 pl-ét hozzáadtuk az előtisztított lizátumokhoz, és az eredményül kapott keveréket 2 óráig forgatással inkubáltuk 4 °C-on. A protein A-Sepharose gyöngyökhöz kötöttünk PBS-ben 0,01 pl nyúl antiegér IgG-t (Jackson), és az inkubációt folytattuk 30 percig szobahőmérsékleten forgatással. A gyöngyöket ülepítettük gyenge centrifugálással, és háromszor mostuk hideg Wash pufferrel (10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1% Triton X-100). A felülúszót leszívással eltávolítottuk, és hozzáadtunk 20 pl 10% β-merkapto-etanolt tartalmazó 2*SDS mintapuffert. A mintákat vízfürdőn 2 percig forraltuk, és 5% SDS-PAGE gélre vittük. Az elválasztás után a fehérjéket nitro-cellulózra vittük át állandó áramerősségnél egy éjszakán keresztül. A nitro-cellulózfiltereket blokkoltuk 3% BSA-val TBS-T-ben 1 óráig szobahőmérsékleten, és a blokkoló puffért eltávolítottuk. A Streptavidin-HRP konjugátumot (Jackson) 0,1% BSA-t tartalmazó TBS-T-vel 1:6000 arányban hígítottuk, majd hozzáadtuk a filterekhez, és az inkubációt tovább folytattuk 30 percig szobahőmérsékleten. A filtereket háromszor mostuk 15 percig TBS-T-vel, és autoradiografáltuk, felhasználva az Amersham’s ECL készletet a gyártó által javasolt eljárási séma szerint.
E) A teljes hosszúságú patkány ad fehérje elleni monoklonális ellenanyagok előállítása A patkány ad fehérje tisztítása Az antipatkány ad monoklonális ellenanyag létrehozásához szükséges immunogén előállításához a patkány ad-t patkánylépsejtekből tisztítottuk. Hozzávetőleg 50 normál nőstény Lewis patkány lépét, 12-20 hetesek, összegyűjtöttünk, és a szövetből egysejtes szuszpenziót készítettünk finom fémszűrőn átpréselve. A vörösvérsejteket lízissel eltávolítottuk, a lízispuffer 150 mM NH4CI-ot, 10 mM KHCO3-ot és 0,1 mM EDTA-t tartalmazott (pH=7,4), és a maradék fehérvérsejteket kétszer mostuk foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS). A lépsejteket centrifugálással ülepítettük és lizáltuk egy pufferben, mely a következőket tartalmazta: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCI2, 2 mM MgCI2, 10 mM PMSF, leupeptin, pepstatin és 1% Triton X-100. A lépsejtek lízisét jégen 30 percig végeztük 1 ml lízispufferben, mely 5*108 lépsejtet tartalmazott milliliterenként. Az oldhatatlan anyagokat centrifugálással távolítottuk el.
A CD11a-t, a CD11b-t és a CD11c-t a következőképpen távolítottuk el immunoprecipitációval a lép lizátumából. 750 pl Protein A-Sepharose gyöngyöt inkubáltunk 2 mg nyúl antiegér immunoglobulinnal 4 °C-on 30 percig. A nyúl antiegér/Protein A-Sepharose-t mos29
HU 223 977 Β1 tűk háromszor lízispufferrel, és felszuszpendáltuk 1,5 ml végtérfogatú lízispufferben. Hozzávetőleg mindegyik patkány β2 integrinre specifikus monoklonális ellenanyagból, az 515F-ből (specifikus a patkány CD11a-ra), az ΟΧ-42-ből (specifikus a patkány CD11b-re) és a 1OOg-ből (specifikus a patkány CD 11cre) 200 pg-ot hozzáadtunk 50 ml patkányléplizátumhoz. Négy °C-on 30 perces inkubáció után 500 μΙ nyúl antiegér/Protein A-Sepharose-t adtunk a léplizátumokhoz, és kevertük végkitéréses forgatással 30 percig 4 °C-on. Az antiegér/Protein A-Sepharose-hoz kötődő CD11a, CD11b és CD11c ülepítéséhez a lizátumot centrifugáltuk 2500 g-vel 10 percig, és a felülúszót tiszta 50 ml-es centrifugacsövekbe öntöttük. Az 515F, az OX-42 és a 100g ellenanyagokkal az immunoprecipitációt két további alkalommal megismételtük a CD11a, a CD11b és a CD11c teljes eltávolítása érdekében.
A lizátumban maradó β2 integrineket izoláltuk affinitástisztítással. Hozzávetőleg 250 ml CNBr Sepharose gyöngyhöz konjugált 20C5B antipatkány CD18 monoklonális ellenanyagot adtunk a lizátumokhoz, és összekevertük végkitéréses forgatóban 30 percig 4 °C-on. Az ellenanyag/antigén komplexeket ülepítettük centrifugálással 2500 g-n 10 percig, és az üledéket mostuk lízispufferrel, mielőtt 4 °C-on tároltuk.
Az örmény hörcsög immunizálása
Hattól nyolchetes örmény hörcsögöket először immunizáltunk hozzávetőleg 50 pg, a humán lgG4 ellenanyaggal fuzionált patkány ad I domainjét tartalmazó rekombináns fehérjével, melyet Freund-féle komplett adjuvánsban emulgeáltunk. Az első immunizálást egy további immunizálás követte inkomplett Freund-féle adjuvánsban emuigáit patkány ad I domain/HulgG4gyel a 14., 33. és 95. napon. Ezután végrehajtottuk a 197-es és 199-es jelű fúziókat.
A 197-es fúzió előtt négy nappal (a 306. napon) egy hörcsögnek beadtunk egy fehérjekombinációt, amely a lépsejtekből és az ad-vel transzfektált CHO-sejtekből izolált patkány ad fehérjét tartalmazta. A megerősítést a fúzió előtt három nappal (a 307. napon) végeztük tisztított patkány ad fehérjével és transzfektált CHOsejtekkel. Az ad-vel transzfektált CHO-sejteket az alábbiakban leírtaknak megfelelően állítottuk elő.
A teljes hosszúságú patkány ad fehérjét kódoló génszegmenst beépítettük a pDC1 vektorba, és az így kialakított konstrukcióval, valamint a humán CD18-pRC konstrukcióval együtt elektroporációs úton transzferáltuk a CHO-sejteket. A pRC konstrukcióval sikeresen transzfektált sejtek kiválasztásához a transzfektált sejteket hipoxantin jelenlétében növesztettük, míg a pDC1 konstrukcióval transzfektált sejtek kiválasztásához g418 jelenlétében tenyésztettük. Három hét után a sejteket festettük patkány ad-ra specifikus nyúl poliklonális szérumokkal, és FACS-szal csoportokra különítettük el azokat. A felületi ad-t a legnagyobb mértékben expresszáló sejtek egy kis százalékát (hozzávetőleg a teljes populáció 3%-át) összegyűjtöttük és tovább szaporítottuk. A FACS-kíválasztást többször megismételtük az ad felületi megnyilvánulást magas szinten mutató sejtek biztosítása érdekében.
Az ad-vel transzfektált sejteket jellemeztük flowcitometriával is, felhasználva egy ad-re specifikus poliklonális szérumot és a humán CD18-ra specifikus TS1.18.1 monoklonális ellenanyagot. Az eredmények megerősítették, hogy a transzfektált CHO-sejtek mind a patkány ad-t, mind a humán CD18-at magas szinten expresszálják.
Végül az ad és CD18 sejtekben történő expresszióját kiértékeltük immunoprecipitációval is. Egy patkány ad-re specifikus poliklonális szérumról azt találtuk, hogy immunoprecipitálják a fehérjéket két egymástól jól elkülöníthető molekulatömegű sávra; a magasabb molekulatömegű fehérje (fehérjék) hozzávetőleg 170 kD-os (kD-osak), és az alacsonyabb molekulatömegű fehérje (fehérjék) 95 kD-os (kD-osak). Ezek a megállapítások összhangban vannak egy patkány ad/humán CD18 heterodimer komplex megnyilvánulásával a transzfektált CHO-sejtek felületén.
A fúzió napján a lépsejteket eltávolítottuk, és egy egysejtes szuszpenziót készítettünk a szövet két üveg tárgylemez fagyasztott végei közötti összedörzsölésével, szérummentes RPMI 1640-be mártva, melyet a következő anyagokkal egészítettünk ki: 2 mM L-glutamin, 1 mM nátrium-piruvát, 100 egység/ml penicillin és 100 pg/ml streptomicin (RPMI, Gibco, Canada). A sejtszuszpenziót átszűrtük Nitex 70-es steril sejtszűrőn (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) ezután kétszer mostuk centrifúgálással 200 g-n 5 percig, és az üledéket 20 ml szérummentes RPMI-ben felvettük. Három Balb/c egérből a timocitákat hasonló módszerrel nyertük ki. A fúzió előtt három napig 10% Fetaclone szérummal (FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) kiegészített RPMI-ben tenyésztett, log-fázisban tartott NS-1 mielomasejteket centrifugáltunk 200 g-vel 5 percig, és az üledéket kétszer mostuk az előzőekben leírtak szerint.
Hozzávetőleg 1,15*10® lépsejtet elegyítettünk 5,8* 107 NS-1 sejttel, centrifugáltuk, és a felülúszót leszívással eltávolítottuk. Az üledékben lévő sejteket a cső gyenge ütögetésével felszabadítottuk, és 7 ml 37 °C-os PEG 1500-at (50%-os, 75 mM HEPES-ben, pH=8,0, Boehringer-Mannheim) adtunk hozzá egy percnél hosszabb idő alatt, majd ezután 14 ml szérummentes RPMI-t adtunk hozzá hét perc alatt. Miután további 8 ml RPMI-t adtunk hozzá, a sejteket centrifugáltuk 200 g-n 10 percig. A felülúszót eltávolítottuk, és az üledéket felvettük 200 ml 15% FBS, 100 mM nátrium-hipoxantin, 0,4 mM aminopterin, 16 mM timidin (HAT) (Gibco), 25 egység/ml IL—6 (Boehringer-Mannheim) és 1,5*106 timocita/ml tartalmú RPMI-ben. A szuszpenziót szétosztottuk 96 lyukú, lapos aljú szövettenyésztő lemezekbe (Corning, United Kingdom), lyukanként 200 μΙ-t, és a sejteket tápláltuk a fúzió utáni 4., 5., 6. és 7. napon, úgy, hogy 18 G-s tűvel (Becton Dickinson) leszívtunk hozzávetőleg 100 μΙ-t, majd a fentiekben leírt médiumból 100 μΙ-t adtunk a lyukakhoz, kivéve a timocitákat.
A 10. napon a fúziós lyukak felülúszóit szűrtük flow-citometriával patkány ad/humán CD18-cal transzfektált CHO-sejtekkel szemben mutatott reaktivitásukra nézve. Hozzávetőleg 5*10® patkány ad-vel transzfek30
HU 223 977 Β1 tált CHO-sejtet szuszpendáltunk 50 μΙ 2,0% FBS-t és 0,05% nátrium-azidot tartalmazó RPMI-ben, és hozzáadtunk hozzávetőleg 100 μΙ hibridóma sejttenyészet felülúszót a 96 lyukú gömbölyített aljú lemezekhez. A festés pozitív kontrolijai nyúl anti-ad poliklonális szérumot és TS1/18-at (antihumán CD18-at) tartalmazott. A sejteket jégen 30 percig inkubáltuk, háromszor mostuk FACS pufferben (RPMI, 2,0% FBS, 0,05% nátrium-azid), és jégen 30 percig inkubáltuk FITC-konjugált kecske antihörcsög ellenanyaggal (Jackson ImmunoResearch Labs), melyet FACS pufferrel 1:2000 végkoncentrációban hígítottunk. A sejteket háromszor mostuk FACS pufferben, és felvettük 200 ml FACS pufferben. A mintákat analizáltuk Becton Dickinson FACscan analizátorral. A lyukakban lévő patkány ad-re specifikus pozitív kiónok megerősítésére a szűrést megismételtük nem transzfektált CHO-sejtekkel. Azokat a CHO-sejteket klónoztuk, melyek megfeleltek annak a követelménynek, hogy reagálnak a patkány ad CHOtranszfektánsaival, és nem reagálnak a nem transzfektált CHO-sejtekkel.
Az előszűrés után a pozitív lyukakból a sejteket klónoztuk kezdetben kettős hígítással, majd ezt követően határhígítással RPMI-ben, mely tartalmazott 15% FBS-t, 100 mM nátrium-hipoxantint, 16 mM timidint és 10 egység/ml IL-6-ot. A határhígítási lépésben a növekedést mutató lyukak százalékát meghatároztuk, és a klónképző sajátságot megjósoltuk Poisson eloszlási analízis alapján. Azokat a lyukakban lévő sejteket, melyek növekedést mutattak, analizáltuk FACS-szal 12 nap után. Az utolsó klónozás után a pozitív lyukakban lévő sejteket felszaporítottuk 11 % FBS-t tartalmazó RPMI-vel. A klónozással egy tenyészetet kaptunk, amelyről azt tartjuk, hogy megfelel a kritériumoknak, az ebből származó alklónokat, a 197-1-et, 197-2-t, 197-3at és 197-4-et felszaporítottuk.
A 199-es fúzió előtt egy másik hörcsögöt a 307. napon immunológiailag megerősítettünk 2,3*10® patkány ad-vel transzfektált CHO-sejtekkel. A két utolsó immunizálást a fúzió előtt négy nappal végeztük (334. napon), és megismételtük három nappal a fúzió előtt (335. napon). A 334. napon a megerősítést 2*10® patkány ad-vel transzfektált CHO-sejtet és 200 μΙ Sepharose-hoz kötött patkány ad-t tartalmazó intraperitoneális injekció beadásával végeztük. A 335. napon a beadott intraperitoneális injekció 5*10® patkány ad transzfektált CHO-sejteket tartalmazott, amit szintén intraperitoneálisan adtunk be. A 199-es fúzió módszerei és szűrési sémái azonosak a 197-esével, és a patkány ad-vel reaktív három hibridóma felülúszót, a 199A-t, a 199H-t és a 199M-et azonosítottuk és klónoztuk. A 199M jelű hibridómát letétbe helyeztük 1996. március 1-jén az American Type Culture Collectionnél, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, letéti száma: HB12058.
A patkány a^-re specifikus monoklonális ellenanyagok jellemzése
Az antipatkány ad ellenanyagok jellemzésére biotinjelölt léplizátumokat állítottunk elő, ahogy azt a 18. példa D) részében leírtuk. A lizátumokat előtisztítottuk az immunoprecipitációs felhasználás előtt. Először 50 μΙ/ml normál egér immunoglobulint adtunk a lizátumokhoz, és az eredményül kapott oldatot végkitéréses forgatással kevertük 30 percig 4 °C-on. Nyúl antiegér immunoglobulinnal fedett 75 μΙ protein A-Sepharose gyöngyöt adtunk hozzá, és végkitéréses forgatással 30 percig kevertük. A nyúl antiegér immunoglobulinnal fedett protein A gyöngyöket ülepítettük centrifugálással 1500 rpm-mel asztali mikrocentrifugában 4 °C-on, és a felülúszót összegyűjtöttük. Az üledéket kidobtuk.
Mindegyik klónozott hibridómához hozzávetőleg 300 μΙ felülúszót adtunk Eppendorf mikrocentrifugacsövekbe, melyhez ezután még adtunk 30 μΙ 10% Triton Χ-100-at, a 100-szoros törzsoldatból 30 μΙ pepstatint, leupeptint és aprotinint, 100 pg PMSF kristályokat és 50 μΙ előtisztított és biotinilezett patkányléplizátumot. A mintákat gyengén vortexeztük, és egy végkitéréses forgatóba helyeztük 4 °C-ra 30 percig. A kontrollmintát úgy készítettük, hogy 10 mg/ml nyúl antipatkány ad-specifikus ellenanyagot adtunk 50 μΙ patkányléplizátumához.
A 30 perces inkubálást követően 75 μΙ PBS-es protein A-Sepharose-t adtunk mindegyik mintához, és végkitéréses forgatóban 4 °C-on 30 percig inkubáltuk. A protein A-val kapcsolt gyöngyöket ülepítettük centrifugálással 15 000 rpm-mel asztali mikrocentrifugában 5 percig 4 °C-on, és a felülúszót gyűjtöttük. Az ülepített gyöngyöt egymás után mostuk a következő 1 ml-es detergens sorozattal: az 1-es puffer 10 mM Tris, 400 mM NaCI és 1,0% Triton X-100, pH=8,0; a 2-es puffer 10 mM Tris, 400 mM NaCI és 0,5% Triton X-100, pH=8,0; a 3-as puffer 10 mM Tris, 400 mM NaCI, 1,0% Triton X-100 és 0,1% deoxikolát, pH=8,0; a 4-es puffer 10 mM Tris, 400 mM NaCI és 0,5 M LiCI2, pH=8,0. Az utolsó mosást az 1-es pufferrel hajtottuk végre. A gyöngyöket gyengén vortexeztük minden mosás után, és ülepítettük asztali mikrocentrifugában. A felülúszókat átvivőpipettával eltávolítottuk, és az utolsó mosás után a maradék puffer teljes egészét is eltávolítottuk a gyöngyökről Hamilton fecskendővel. Mindegyik üledékhez hozzáadtunk 50 μΙ SDS mintapuffert, mely 10% végkoncentrációban Bromphenol Blue és Pyronin Y festéket és β-merkapto-etanolt tartalmazott. A keveréket erőteljesen vortexeztük 1-2 percig, és inkubáltuk szobahőmérsékleten 5-10 percig. A mintákat 5 percig 15 000 rpm-mel centrifugáltuk egy asztali centrifugában 4 °C-on, és a kibocsátott fehérjét összegyűjtöttük és átraktuk egy új mikrocentrifugacsőbe. A minták egyenlő mennyiségeit forraltuk 4 percig vízfürdőn, mielőtt a 7,5%-os SDS-PAGE gélekre vittük. A PAGEval történt elválasztás után a fehérjéket nitro-cellulózfilterekre átjuttattuk egy óra alatt 200 mA-rel, és a filtereket blokkoltuk 3% BSA/TBS-T oldattal egy éjszakán át 4 °C-on. Az 1:6000 hígítású streptavidin-OPD-t tartalmazó 0,1%-os BSA-TBS-T oldatot hozzáadtuk mindegyik filterhez, és további egy óráig inkubáltuk szobahőmérsékleten. A filtereket ötször mostuk minden alkalommal TBS-T-ben, és előhívtuk, felhasználva az Amersham-féle ECL készletet a gyártó által javasolt eljárási séma szerint.
HU 223 977 Β1
A 199M klónról azt találtuk, hogy egy heterodimer fehérjévé immunoprecipitálódik. A nagyobbik alegység molekulatömege 170—175 kD, amely összhangban van a nyúl antipatkány poliklonális szérumkontrollal precipitálódott fehérje méretével. Egy másik fehérje is precipi- 5 tálódott egy megközelítőleg 95 kD molekulatömegűvel, melynek tömege egybevág a CD18-cal.
19. példa
Az egér cDNS-klónok izolálása 10
Kísérletet tettünk az egér ad-homológ izolálására.
Fajok közti kereszthibridizációt hajtottunk végre, felhasználva a létrehozott PCR-próbákat: egy 1,5 kb nagyságú fragmens, mely megfelel a humán 19A2 klón (1-es szekvencia) 522-2047. bázisainak, és egy 1,0 kb nagyságú patkányfragmens, mely megfelel a humán 19A2 klón (1-es szekvencia) 1900-2900. bázisainak. A humán próbákat PCR-rel hoztuk létre, felhasználva a következő primerpárokat: ATM-2 és 9-10.1 (a 38-as, illetőleg a 39-es szekvenciaszámon tettük közzé); a patkánypróbához a 434L és a 434R primerpárt hoztuk létre, melyeket a 34-es, illetőleg 35-ös szekvenciaszámon tettünk közzé. A mintákat inkubáltuk 94 °C-on 4 percig, és alávetettük 30 ciklus hőmérsékleti lépcsőnek: 94 °C-on; 50 °C-on 2 percig; 72 °C-on 4 percig.
5-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3’
5’-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3’ (a szekvencia száma: 38) (a szekvencia száma: 39)
A PCR-termékeket tisztítottuk, felhasználva a Qiagen Quick Spin készletet a gyártó által javasolt eljárási 20 séma szerint, és hozzávetőleg 180 ng DNS-t jelöltünk 200 pCi [32P]-dCT-vel, felhasználva a Boehringer-Mannheim Random Primer Labelling készletet a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A beépületlen izotópot eltávolítottuk, felhasználva egy Centri-sep 25 Spin oszlopot (Princeton Separations, Adelphia, NJ) a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A próbákat denaturáltuk 0,2 N NaOH-dal, és használat előtt neutralizáltuk 0,4 M Tris-HCI-dal, pH=8,0.
Egy lambda ZAPII-ben lévő (Stratagene) egércsecsemőmirigy-eredetű oligo dT-primeres cDNS-könyvtárat lemezeltünk, hozzávetőleg 30 000 plakkot 15 cm-es lemezekre. A plakkokat replikáztuk nitrocellulóz-filterekre (Schleicher & Schuell, Keene, NH), és inkubáltuk 50 °C-on mozgatással 1 óráig prehibridi- 35 zációs oldatban (8 ml/replika), mely 30% formamidot tartalmazott. A jelölt humán és patkánypróbákat hozzáadtuk a prehibridizációs oldathoz, és az inkubációt folytattuk egy éjszakán át 50 °C-on. A filtereket kétszer mostuk 2*SSC/0,1% SDS-sel szobahőmérsékleten és egyszer 2*SSC/0,1% SDS-sel 37 °C-on, és még egyszer 2*SSC/0,1% SDS-sel 42 °C-on. A filtereket Kodak X-Omat AR filmre exponáltuk -80 °C-on 27 óráig sokszorozóernyővel.
A második replikán a négy pozitív jelet adó plak- 45 kot újracsíkoztuk LB táptalajra, mely 100 mg/ml magnéziumot és carbenicillint tartalmazott, ezután inkubáltuk egy éjszakán át 37 °C-on. A fág plakkokat replikáztuk Hybond filterekre (Amersham), és próbával kezeltük az előszűréshez, valamint Kodak X-Omat AR filmre exponáltuk 24 órán át -80 °C-on sokszorozóernyővel.
A tizenkét pozitív jelet adó plakkot átvittük alacsony magnéziumtartalmú hígító oldatba, mely 10 mM Tris-HCI-ot és 1 mM MgCI2-ot tartalmazott. Az inszert méretét meghatároztuk PCR-sokszorozással, felhasználva a T3 és T7 primereket (a szekvenciák száma: 30 13, illetőleg 14) a következő reakciókörülmények között. A mintákat inkubáltuk 94 °C-on 4 percig, és alávetettük 30 ciklus hőmérsékleti lépcsőnek: 90° C-on 15 s; 50 °C-on 30 s és 72 °C-on 1 perc.
Hat minta elkülönülő sávokat adott 300 és 1 kb tartományban. A phagemideket felszabadítottuk segítő tággal történő koinfekcióval, és recirkularizáltuk a Bluescript SK (Stratagene) létrehozásához. A keletkező kolóniákat tenyésztettük LBM/carbenicillin (100 mg/ml) táptalajon egy éjszakán át. A DNS-t izo40 láltuk a Promega Wizard miniprep készlettel (Madison, Wl) a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. A tisztított DNS EcoRI restrikciós analízise megerősítette a molekulatömeg értékét, melyet PCR-módszerrel mutattunk ki. A beépült DNS-t szekvenáltuk M13 és M13 reverse. 1 primerekkel, melyek szekvenciáit 40-es, illetőleg 41-es számon tettünk közzé.
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
5-GGAAACAGCTATGACCATG-3’ (a szekvencia száma: 40) (a szekvencia száma: 41)
A szekvenálást a 4. példában leírtak szerint végeztük.
A hat klón közül csak kettő, a 10.3-1 és a 10.5-2 klón szekvenciainformációjáról gondoskodtunk, 55 ezek azonos 600 bp nagyságú fragmensek. A 600 bp szekvencia 68%-ban azonos a humán ad megfelelő szekvenciájával, 54%-ban azonos a humán CD1 lávái, 58%-ban azonos a CD11c-vel és 40%-ban azonos az egér CD11 b-vel. Ezt a 600 bp fragmenst ezután fel- θθ használtuk egy feltételezhetően egér ad-homológot kódoló cDNS teljesebb izolálásához.
A lambda ZAPII-ben lévő (Stratagene) egérléperedetű cDNS-könyvtárat (oligo dT_ és random primerekkel készült) lemezeltük 2,5* 104 fág/15 cm LBM lemezre.
A plakkokat replikáztuk Hybond nejlon transzfer membránokra (Amersham), denaturáltuk 0,5 M NaOH/1,5 M NaCI-dal, neutralizáltuk 0,5 Tris bá32
HU 223 977 Β1 zis/1,5 M NaCI/11,5 M HCl-dal, és mostuk 2*SSCben. A DNS-t keresztkötöttük a filterekhez ultraibolya sugárzással.
Hozzávetőleg 500 000 plakkot szűrtünk, felhasználva az előzőleg fentiekben leírt módon jelölt 10.3-1 és a 10.5-2 próbákat. A próbákat hozzáadtuk a prehibridizációs oldathoz, és inkubáltuk egy éjszakán át 50 °C-on.
A filtereket kétszer mostuk 2*SSC/0,1% SDS-ben 42 °C-on. A filtereket Kodak X-Omat AR filmre exponáltuk 24 óráig -80 °C-on sokszorozóemyővel. A kétszere- 10 sen replikáit 14 pozitív jelet adó plakkot a második szűrésben is megkaptuk, kivéve a nagy pontosságú mosásoknál: 2*SSC/0,1% SDS 50 °C-on, 0,5*SSC/0,1%
SDS 50 °C-on és 0,2*SSC/0,1% SDS 55 °C-on. A filtereket Kodak X-Omat AR filmre exponáltuk 13 óráig -80 °C-on sokszorozóemyővel.
pozitív plakkot átraktunk alacsony magnéziumtartalmú fághígító oldatba, és az inszert méretét meghatároztuk PCR-sokszorozással a fentiekben leírtak szerint. Hét minta egyedi sávokat adott 600 bp és 4 kb mé- 20 rettartományban. A tisztított DNS EcoRI restrikciós analízise megerősítette a PCR-nél megfigyelt méreteket, és a DNS-t szekvenáltuk az M13 és M13 reverse.1 primerekkel (a szekvenciaszámok: 40, illetőleg 41).
Az egyik klón, a B3800-as, egy 4 kb inszertet tartalmazott, mely megfelel a humán ad 192A klón 5' végétől 3’ irányban lévő 200 bázispáijának, és egy 553 bázisos nem transziáit 3' régiót tartalmaz. A B3800 klón 77%ban azonosnak mutatkozott a humán ctd megfelelő régiójával, 44%-ban azonosnak mutatkozott a humán 30 CD11a-val, 59%-ban azonosnak mutatkozott a humán CD11 c megfelelő régiójával és 51 %-ban az egér CD11 b megfelelő régiójával. A második klón, az A1160-as, egy
1,2 kb nagyságú inszertet tartalmaz, mely a humán ctd kódolórégiójának 5’ végénél helyezkedik el az iniciáló metionintól 3’ irányban hozzávetőleg 12 nukleinsav távolságban. Az A1160 klón 75%-ban azonosnak mutat5 kozott a humán ad megfelelő régiójával, 46%-ban azonosnak mutatkozott a humán CD11a megfelelő régiójával, 62%-ban azonosnak mutatkozott a humán CD11c megfelelő régiójával és 66%-ban azonosnak mutatkozott az egér CD11 b megfelelő régiójával.
Az 1160 bázis hosszúságú A1160 klón a humán 19A2 klón 5' végéhez közel van, és a B3800 klónnal átfedő régiója a 205. bázistól tart az 1134. bázisig. Az A1160 klón 110 bázisos inszerciója (az A1160 klón 704-814. bázisáig) nem mutat átfedést a B3800 klón15 nal. Ez az inszerció valószínűleg egy exon-intron határrégió [Fleming és munkatársai: J. Immunoi. 150, 480-490 (1993)], és eltávolítottuk, mielőtt az A1160 és B3800 kiónokat ligáltuk.
A feltételezett egér ad klón 5' cDNS végének gyors sokszorozása
A feltételezett egér ad klón 5’ hiányzó szekvenciáinak kinyeréséhez, beleértve az 5’ nem transzlálódó szekvenciát és a metionin iniciáló kodont, RACE PCR-t használtunk [Frohman: RACE: Rapid Amplification of cDNA 25 Ends, mely megtalálható a PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications című könyvben, szerkesztők: Innis és munkatársai 28-38, Academic Press: New York (1990)]. Egy egérlép RACE-Ready készletet (Clontech, Palo Alto, CA) használtunk a gyártó által ajánlott eljárási séma szerint. Két antiszensz génspecifikus prímért terveztünk az elsődleges és a fészek PCR-hez: az A1160 RACE1-elsődlegest és az A1160 RACE2-fészek prímért (a szekvenciaszámok: 42, illetőleg 43).
5’-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3’ (a szekvencia száma: 42)
5’-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (a szekvencia száma: 43)
A 42-es és a 43-as primerek megfelelnek az 5’ vég mert (a szekvencia száma: 44) és a készlettel kapott
302., illetőleg 247. bázisainak. A PCR-t a fentiekben le- egérlép cDNS-t.
írtak szerint végeztük, felhasználva az 5’ horgony pri- 40
5’-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3’ (a szekvencia száma: 44)
A PCR-termékek elektroforézisével kimutattunk egy hozzávetőleg 280 bázis méretű sávot, melyet szubklónoztunk, felhasználva a TA klónozókészletet (Invitrogen) a gyártó által javasolt eljárási séma szerint. Az eredményül kapott 10 kolóniát tenyésztettük, és a DNS-t izoláltuk és szekvenáltuk. Az 5’ szekvencia további 60 bázisát, mely megfelel a 45-ös szekvencia 1-60. bázisainak, azonosítottuk ezzel a módszerrel.
Az egér cDNS jellemzői és a megjósolt aminosavszekvencia
A humán ad egy feltételezett homológját kódoló egér cDNS összetett szekvenciát közzétettük a 45-ös szekvenciaszámon. Bár a humán és az egérklónok külső domainjei között a homológia nagy, a citoplazmatikus domainek között a homológia csak 30%-os. A megfigyelt változatosság azt mutatja, hogy a humán és az egér fe45 hérjék C-terminálisai között funkcionális különbségek vannak. Alternatívaként a citoplazmatikus domainek változatossága származhat a splicing során bekövetkező összekapcsolódási változatokból, vagy arra mutathat, hogy további β2 integrin gén(ek) létezhet(nek).
Aminosavszinten az egér cDNS a 46-os szekvenciát adja, és 28%-ban azonos az egér CD11a-val, 53%-ban azonos az egér CD11b-vel, 28%-ban azonos a humán CD11a-val, 55%-ban azonos a humán CD11b-vel, 59%-ban azonos a humán CD11c-vel és
70%-ban azonos a humán ad-vel. Ha a humán ad citoplazmatikus domainjének aminosavszekvenciáját összehasonlítjuk a vélt egérhomológgal, arra a következtetésre jutunk, hogy a régiók azonos hosszúak, de különböző elsődleges felépítésük van. Az azonos szekvenciahossz ezekben a régiókban arra utal, hogy
HU 223 977 Β1 ezek inkább fajok közötti változatok, mint összekapcsolódás! formák változatai. Ha összehasonlítjuk a megjósolt patkány polipeptid (lásd 16. példa), az egér és a patkány citoplazmatikus domaineket, akkor ezek több mint 60%-os azonosságot mutatnak.
20. példa
További egér ad cDNS-klónok izolálása a szekvencia-ellenőrzéshez
Az egér ad 19. példában leírt aminosavszekvenciájának ellenőrzéséhez további egérszekvenciákat izoláltunk a megerősítés szándékával.
Az egér cDNS két homológ ad próbával (3’ és 5’) hibridizációval történő izolálásához felhasználtuk mind egy egér léperedetű random primerrel készített könyvtárát, mind egy lambda ZAPII-ben (Stratagene) lévő oligo dT-primeres cDNS-könyvtárat. A könyvtárat lemezesük 5x10® fág/15 cm-es LBM lemezre. A plakkokat replikáztuk Hybond nejlonmembránokra (Amersham), és a membránokat denaturáltuk (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), neutralizáltuk (0,5 M Tris bázis/1,5 M NaCI/11,6 M HCl) és mostuk (2xSSC sóoldat). A DNS-t keresztkötöttük a filterekhez ultraibolya sugárzással.
A próbákat létrehoztuk, felhasználva a PCR-ben alábbiakban leírt primereket a következő körülmények között. A mintákat 94 °C-on tartottuk 4 percig, és alávetettük 30 ciklus hőmérsékleti lépcsőnek (94 °C-on 15 s; 50 °C-on 30 s; 72 °C-on 1 perc, Perkin-Elmer 9600 hőmérséklet-ciklizálóban).
A 3’ próba hozzávetőleg 900 bázis hosszú, és átíveli az 1-es szekvencia 2752-3651. nukleotidjait (5’->3’), és a 11.b-1/2FOR11 és a 11.b-1/2REV2 primerekkel készítettük, a szekvenciákat 69-es, illetőleg 74-es számon mutattuk be. Ezt a próbát használtuk az első replikákhoz.
Az 5’ próba hozzávetőleg 800 bázispár hosszú, és átíveli az 1-es szekvencia 149-946. nukleotidjait (5’—>3'), és a 11.b-1/2FOR1 és a 11.a-1/1REV1 primerekkel készítettük, a szekvenciákat 50-es, illetőleg 85ös számon mutattuk be. Ezt a próbát használtuk a második replikákhoz.
A harmadik replikákat mindkét fentiekben leírt próbával egyszerre kezeltük ugyanazokon a lemezeken.
Hozzávetőleg 500 000 plakkot szűrtünk, felhasználva a fenti két próbát, melyet a 17. példában leírtaknak megfelelően jelöltünk. A jelölt próbákat hozzáadtuk a 45% formamidot tartalmazó prehibridizációs oldathoz, és egy éjszakán át inkubáltuk 50 °C-on. A filtereket kétszer mostuk 2xSSC/0,1% SDS-sel szobahőmérsékleten (22 °C). Az utolsó mosást 2xSSC/0,1% SDS-sel hajtottuk végre 50 °C-on. Az autoradiográfiát 19 óráig végeztük -80 °Con Kodak X-Omat AR filmre sokszorozóemyővel.
A legalább két replikán lévő 13 pozitív jelet adó plakkot másodszor is szűrtük az első szűrésnél leírtaknak megfelelően, kivéve, hogy mind a 3’, mind az 5’ jelölt próbákat felhasználtuk a hibridizációhoz, és egy további végső mosást is beiktattunk, melyhez 2xSSC/0,1% SDS-t használtunk 65 °C-on. Az autoradiográfiát a fentiekben leírtak alapján végeztük körülbelül 2,5 óráig.
A 13 pozitív jelet adó plakkot (MS2P-1-től MS2P-13-ig) átraktuk alacsony magnéziumion-tartalmú fághígító oldatba. Az inszert méretét meghatároztuk PCR-sokszorozással (Perkin-Elmer 9600 hőmérsékletciklizáló), felhasználva a T3 és a T7 primereket, amelyeket összeolvasztottunk a ZAPII-ben (a szekvenciát az előzőekben már leírtuk) lévő Bluescript phagemiddel a fentiekben leírt körülmények között. A sávok méretei 500 bázistól 4 kb-ig terjedtek. A phagemideket izoláltuk, preparáltuk és szekvenáltuk M13 és M13 reserve.1 primerekkel (a szekvenciák száma: 40, illetőleg 41). A 13 klón közül négyet szekvenáltunk: az MS2P-3-at, az MS2P-6-ot, az MS2P-9-et, az MS2P-12-t és az MS2P-13-at, ezek együtt egy régiót reprezentálnak az 5’ végen hozzávetőleg a 200. bázistól a 3' vég első stopkodonja utáni körülbelül 300. bázisig.
Minden klón végi szekvenciájának meghatározásához és a 17-es számú konstrukcióhoz (a szekvencia száma: 45) képest mindegyik klón helyének megállapításához az automata szekvenciameghatározást a 4. példában leírtaknak megfelelően végeztük, felhasználva először az M13 és M13 reverse.1 primereket (a szekvenciák száma: 40, illetőleg 41). Mindegyik kiónt teljes egészében szekvenáltuk, felhasználva a megfelelő primereket (lásd a következő listát) az adott régiókhoz.
,b-1/2FOR1 5’-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3’ .b-1 /1FOR2 5’-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3’ ,b-1/1FOR3 5’-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3’ ,b-1/2FOR4 5’-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3’ ,b-1/2FOR5 5’-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3’ ,b-1/2FOR6 5’-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3’ ,b-1/2FOR7 5’-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3’ ,b-1/2FOR8 5’-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3’ ,b-1/2FOR9 5’-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3' 11 ,b-1/2FOR10 5’-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3’ ,b-1/2FOR11 5’-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3’ ,b-1/2FOR12 5-GTCACAGAGGGAACCTCC-3’ ,b-1/2FOR13 5’-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3’
11.b-1/2FOR14 5’-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3’ ,b-1/2FOR15 5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3’ ,b-1/2REV2 5’-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3’ (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia száma: 50) száma: 60) száma: 61) száma: 62) száma: 63) száma: 64) száma: 65) száma: 66) száma: 67) száma: 68) száma: 69) száma: 70) száma: 71) száma: 72) száma: 73) száma: 74)
HU 223 977 Β1 .b-1/2REV3 5’-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3’ ,b-1/2REV4 5’-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3’ ,b-1/2REV5 5’-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3’ .b-1/2REV6 5’-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3’ ,b-1/2REV7 5’-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3’ ,b-1/2REV8 5’-GATCCAACGCCAGATCATACC-3’ ,b-1/2REV9 5’-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3’ ,b-1/2REV10 5-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3’ ,b-1/2REV11 5’-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3’ ,b-1/2REV12 5’-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3’ 11 ,b-1/2REV13 5-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3’ 11 .a-1/1 REV1 5-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3’ .a-1/1 REV2 5’-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3’ (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia (a szekvencia száma: 75) száma: 76) száma: 77) száma: 78) száma: 79) száma: 80) száma: 81) száma: 82) száma: 51) száma: 83) száma: 84) száma: 85) száma: 86)
A szekvenciákat szerkesztettük, elrendeztük és összehasonlítottuk az előzőleg egérből izolált ad szekvenciával (a 17-es konstrukció, a szekvencia száma: 45).
Az új szekvenciák elrendezése feltárta, hogy a 17es konstrukció kezdetén a 2308. nukleotidnál egy 18 bázisos deléció van; a deléció nem okoz eltolódást az olvasási kertben. Az MS2P-9 kiónban, melyet szekvenáltunk és a fentiekben leírtunk, is kimutattuk ugyanazt a 18 bázis nagyságú deléciót. Megfigyeltük, hogy ezen régió deléciója az egérklónok 50%-ában előfordul, de nem észleltük a patkány és a humán ctd-ben.
A 18 bázis nagyságú deléció jellemzője, hogy egy 12 bázisos palindrom szekvenciát rejt; AAGCAGGAGCTCCTGTGT (a szekvencia száma: 91). Ez a megfordított ismétlés a nukleotidszekvenciában önkiegészítő jellegű, és lehet, hogy hurkot képez, mely hasításhoz vezethet a reverz transzkripcióban. A további 18 bázist tartalmazó egér ad szekvenciát az 52-es számon tettük közzé; a kikövetkeztethető aminosavszekvenciát pedig közzétettük az 53-as szekvenciaszámon.
21. példa
Az in situ hibridizációk egérben
A 6. példában leírt humán ad-vel való összehasonlítás érdekében ezután meghatároztuk az egér ad sző- 40 veti megoszlását.
Egy 200 bp nagyságú egyszálú mRNS-próbát alkottunk egy DNS templátról, mely megfelel az egér cDNS citoplazmatikus farki régiójában elhelyezkedő 3460-3707. nukleotidoknak, és in vivő RNS-transzkripcióval beépítettünk 35S-UTP-t (Amersham).
Teljes egérembriókat (a megtermékenyítés után 11-18 nap után gyűjtöttük) és különböző egérszöveteket, beleértve a lépet, vesét, májat, beleket és a csecsemőmirigyet in situ hibridizáltunk radioaktívan jelölt egyszálú mRNS-próbával.
pm vastagságú metszeteket készítettünk, és Vectabonddal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) fedett tárgylemezekhez ragasztottuk, majd -70 °C-on tároltuk. A felhasználás előtt a tárgylemezeket eltávolítottuk -70 °C-ról, és 50 °C-ra helyeztük hozzávetőleg 5 percig. A metszeteket fixáltuk 4% paraformaldehiddel 20 percig, dehidratáltuk növekvő koncentrációjú etanollal (70-95-100%) 1 percig 4 °C-on mindegyik koncentrációnál, és levegőn szárítottuk 30 percig szobahőmér- 60 sékleten. A metszeteket denaturáltuk 2 percig 70 °C-on 70%-os formamid/2*SSC-vel, mostuk kétszer 2*SSCben, dehidratáltuk etanolgradienssel (lásd fent), és levegőn szárítottuk 30 percig. A hibridizációt egy éjsza20 kán át folytattuk (12-16 óra) 55 °C-on a 35S-jelölt ribopróbákkal (6*105 cpm/metszet) és dietil-pirokarbonát(DEPC) kezelt vízzel, mely végkoncentrációban 50% formamidot, 0,3 M NaCI-ot, 20 mM Tris-HCI-ot (pH=7,5), 10% dextránszulfátot, 1 *Denhardt-féle olda25 tót, 100 mM ditiotreitolt (DTT) és 5 mM EDTA-t tartalmazott. A hibridizáció után a metszeteket mostuk egy óráig szobahőmérsékleten 4*SSC/10 mM DTT-vel, 40 percig 60 °C-on 50% formamid/2*SSC/10 mM DTT-vel, 30 percig szobahőmérsékleten 2*SSC-vel és 30 30 percig szobahőmérsékleten 0,1*SSC-vel. A metszeteket dehidratáltuk, levegőn szárítottuk 2 óráig, előhívtuk (miután 4 °C-on teljes sötétségben tároltuk) és háttérfestettük hematoxilin/eozinnal.
A lépszövetek erős jelet mutattak elsősorban a vö35 rös pulpában. Ez a mintázat megegyezik a lépben lévő szöveti makrofágok eloszlásával, de nem zárható ki más sejttípus sem.
22. példa
Az egér expressziós konstrukciók létrehozása
A humán ad-vel homológiát mutató egér cDNSszekvenciát tartalmazó expressziós plazmid megalkotásához az A1160 és a B3800 kiónok inszertjeit ligáltuk. A ligálás előtt egy 5’ vezetőszekvenciát, mely tar45 talmaz egy iniciáló metionint, az A1160 kiónhoz adtunk. Az „5’ PCR leader”-t (a szekvencia száma: 47) úgy terveztük meg, hogy tartalmazza: (1) az emésztéshez kezdeti nemspecifikus bázisokat az 1-6. pozíciókban; (2) az expressziós vektorba történő szubklónozás 50 elősegítéséhez egy BamHI helyet (a 47-es szekvenciában aláhúztuk) a 7-12. pozícióban; (3) egy konszenzus Kozák szekvenciát a 13-18. pozícióig; (4) egy szignálszekvenciát, beleértve egy iniciáló metioninkodont (a 47-es szekvenciában vastag betűtípussal jelölve) és 55 (5) a primer összeolvasztásához egy további 3’ bázisos részt, mely az 1160 klón 5’ átfedőszekvenciájára specifikus. A második prímért, melyet „3' end fragment”-nek neveztünk (a szekvencia száma: 48), felhasználtuk az „5’ PCR ieader-rel az A1160 klón inszertjének sokszorozásához.
HU 223 977 Β1
5’-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3’ (a szekvencia száma: 47)
5’-GCTGGACGATGGCATCCAC-3’ (a szekvencia száma: 48)
Az eredményül kapott PCR-termék nem emészthető BamHI-gyel, ami arra utal, hogy a restrikciós helyet megelőző bázisok elégtelen száma meggátolja az enzim általi felismerését. Az 5’ primerben (a szekvencia száma: 47) a BamHl helyet megelőző „farok” szekven- 10 cia hossza megnőtt, és a PCR-t megismételtük az első
PCR-ből származó sokszorozási terméken. Az mAD.5’. 2 5’ primerhez (a szekvencia száma: 49) további nemspecifikus bázisokat terveztünk az 1-4. helyzetben, és egy további 20 bázisos primerszekvenciát, mely az előzőekben alkalmazott „5’ PCR leader” primerszekvenciát specifikusan átfedi.
5’-GTACAGTTACGGATCCGGCACCAT-3’ (a szekvencia száma: 49)
Az „mAD.5’.2” és a „3’ end frag” primereket terepiéiként együtt használtuk a PCR-ben az első sokszorozásból származó PCR-termékkel. Az eredményül kapott második PCR-terméket szubklónoztuk a pCRtmll (Invitrogen) plazmidba a gyártó által javasolt eljárási séma szerint, és transzformáltuk kompetens One shot sejtekbe (Invitrogen). A PCR-terméket tartalmazó egyik kiónt azonosítottuk restrikciós enzim analízissel, felhasználva a BamHl és EcoRl restrikciós enzimeket, majd szekvenáltuk. Miután a szekvenciát átvizsgáltuk, az inszertet BamHl és EcoRl restrikciós enzimekkel emésztettük és gélen tisztítottuk.
A B3800 klónból származó inszertet izoláltuk EcoRl és Notl restrikciós endonukleázos emésztéssel, majd gélen tisztítottuk és ligáltuk az A1160 BamHI/EcoRI megnövelt mennyiségű fragmenssel. A ligálást 14 óráig végeztük 14 °C-on. A BamHl és Notl restrikciós enzimekkel emésztett pcDNA.3 (Invitrogen) vektort hozzáadtuk a ligálási reakcióhoz további ligázzal, és a reakciót folytattuk még 12 óráig. A reakcióelegy egy részét transzformáltuk kompetens Escherichia coli-sejtekbe, az eredményül kapott kolóniákat tenyésztettük, és egy pozitív kiónt PCR-analízissel azonosítottunk a 11.b-1/2FOR1 és a 11.b-1/2REV11 (a szekvenciák száma: 50-es, illetőleg 51-es) primerek segítségével. Ezek a primerek áthidalják az A1160 és a B3800 fragmenseket, ezért egy sokszorozási termék kimutatása arra utal, hogy a két fragmenst összeligáltuk. A pozitív kiónok szekvenciáit átvizsgáltuk az 50es és 51-es szekvenciaszámon közzétett primerekkel, mely az iniciáló metionin után a 100-1405. bázisokig sokszoroz.
23. példa
A kiütéses egerek kialakítása
A feltételezett egér ad cDNS által kódolt fehérjék immunológiai szerepének pontosabb megállapításához egy „kiütéses” egeret terveztünk, melyben a feltételezhetően ad-homológot kódoló genomiális DNSszekvenciát homológ rekombinációval megszakítottuk. A megszakított gén kódolta fehérje jelentősége így megállapítható a kódolt fehérje hiányával. A „kiütéses” egerek kialakítását Deng és munkatársai írták le [Deng és munkatársai: Molecular & Cellular Biology 13, 2134-2140(1993)].
Az ilyen egerek tervezése a homológ rekombinációs események által „kiütött” szekvenciákat tartalmazó plazmidok elkészítésével kezdődik. Az egér cDNS egy 750 bázispár nagyságú fragmensét (megfelel a 45-ös szekvencia 1985-2733. nukleotidjainak) használtuk egy XFIXII genomiális könyvtárból származó feltételezhetően egér ad-homológot kódoló egér genomiális szekvencia azonosításához. Az elsődleges szűrés 14 pozitív kiónt eredményezett, melyek közül hetet a második szűréssel megerősítettünk. A legnagyobb jelt adó plakkokból származó két folyékony lizátumból a XDNS-t izoláltuk hagyományos módszerekkel. A restrikciós térképezés és a Southern-analízis megerősítette az egyik klón hitelességét, melyet 14-1-gyel jelöltünk, és az inszert DNS-t izoláltuk Notl restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel. Ezt a fragmenst klónoztuk a Bluescript SKII* vektorba.
Egy hozzávetőleg 9-14 kb nagyságú restrikciós fragmens izolálásához, ez az a méret, mely a beszámolók szerint a homológ rekombinációs esemény bekövetkezésének optimalizálásához szükséges, Southern-hibridizációt végeztünk a 750 bp cDNS-próbával. A hibridizáció előtt egy restrikciós térképet készítettünk a 14-1 kiónra nézve. Egy 12 kb fragmenst azonosítottunk a lehetséges jelöltként, és ezt a fragmenst szubklónoztuk a pBluescript SKII+ vektorba a timidin-kinázt kódoló kazettával határolt egér DNS mellé. Ezen klón további analízise az egyik I domain próbával (megfelel a 45-ös szekvencia 454-1064. nukleotidjainak) azt mutatta, hogy a klón nem tartalmazta az I domaint kódoló szekvenciákat.
Felhasználva ugyanazt az I domain próbát, a XFIXII genomiális könyvtárat újra szűrtük. Először hat pozitív kiónt mutattunk ki, az egyik ezek közül a második szűrésben is pozitív maradt. Az ebből a klónból izolált DNS erősen reagált egy I domain próbával Southern-analízisben. Nem kaptunk reakciót az eredeti 750 bp próbával, bár ez arra utal, hogy ez a klón tartalmazza a 45-ös szekvencia 1985-2773. nukleotidjait.
Alternatívaként, a 750 bp próbával mutatkozó hibridizációs hiány oka lehet, hogy ez a klón a fehérjék íntegrincsaládjának egy másik tagja. Ezen magyarázat eldöntésére nyilvánvalónak látszott a 13 kb inszert szubklónozása a pBluescript SKIΓ vektorba. A tisztított DNS-t szekvenáltuk, felhasználva az 52-es szekvencia ad I domainjének 441-461., 591-612., 717-739. és el36
HU 223 977 Β1 lentétes irányban a 898-918. nukleinsavszekvenciáit. A szekvenciákat megkaptuk csak az első prímért (4441-4461) felhasználva, és csak az I domain 5’-most exonját sokszoroztuk hatékonyan. Az I domain többi részét nem sokszoroztuk. A keletkező kiónok ezért tartalmazzák az egér ad gén 6. exonját, és intronszerű szekvenciákat az exon 3’ és 5’ végén. Az exon 7 nem volt képviselve a kiónban. A szekvenálás után egy konstrukciót alakítottunk ki, mely tartalmazza a neomicinrezisztencia- és a timidin-kináz-géneket.
A neomicinrezisztencia-gént (neor) inszertáltuk az eredményül kapott plazmidba úgy, hogy az egér genomiális DNS kódolta fehérjét megszakította. Az eredményül kapott plazmid ezért tartalmaz egy neor gént az egér genomiális DNS-szekvenciában, mely teljes egésze a timidin-kinázt kódoló régiójában helyezkedik el. Az így megalkotott plazmidkonstrukciótól elvárjuk, hogy a homológ rekombinációja előnyt jelentsen a random rekombinációval szemben [Chisaka és munkatársai: Natúré 355, 516-520 (1992)].
24. példa
A nyúl árkonstrukció klónozása és a nyúl cDNSkönyvtár szűrése
A humán ad patkány- és egérhomológjainak azonosítása egy nyúlhomológ létének vizsgálatához vezetett, mely hasznos lehet a fentiekben leírt humán kórállapotok nyúlban történő modellezéséhez.
A poliA* RNS-t előállítottuk egy teljes nyúllépből, felhasználva egy Invitrogen FastTrack készletet (San Diego, CA) a gyártó által javasolt eljárási séma szerint és a készletben biztosított vegyszerekkel. 73 pg poliA* RNS-t izoláltunk 1,65 g szövetből. Nyúllép RNS-t használtunk egy ZAP Express cDNA-könyvtár elkészítéséhez, felhasználva a Stratagene készletét (La Jolla, CA). Az eredményül kapott cDNS-t irányítottan klónoztuk a pBK-CMV phagemid vektor lambda-karjának EcoRI és Xhol helyeire. A Gigapack II Gold (Stratagene) készletet használtuk a lambda-karok fág részecskékben történő pakolásához. Az eredményül kapott könyvtár titere hozzávetőleg 8*105 részecske volt, míg az átlag inszert mérete 1,2 kb.
Az összefolyó plakknövekedéshez a könyvtárat egyszer sokszoroztuk lemezeléssel, és a lizátumot összegyűjtöttük. A sokszorozott könyvtárat lemezeltük hozzávetőleg 30 000 plakk-képző egység (pfu) per 150 mm-es lemezre Escherichia co//-val, és az eredményül kapott keveréket a plakkok kialakulása érdekében inkubáltuk 12-16 óráig 37 °C-on. A fág DNS-t átvittük Hybond N* nejlonmembránokra (Amersham, Arlington Heights, Illinois). A membránokat hibridizáltuk két random primeres radioaktívan jelölt egér ad PCRDNS próbák keverékével. Az első próbát létrehoztuk egy PCR-termékkel, mely az 52-es szekvencia 149-946. nukleotidjait íveli át. A próbákat random primerezéssel jelöltük (Boehringer-Mannheim Random Prímed DNA Labelling készlet), és a reakcióelegyet átengedtük Sephadex G-50 oszlopon a beépületlen nukleotidok eltávolítása végett. A hibridizációs oldat tartalmazott 5xSSPE-t, 5«Denhardtsot, 1% SDS-t, 40% formamidot és a jelölt próbákat 1*106 dpm/mlben. A hibridizációt 42 °C-on végeztük 16-18 óráig.
A filtereket erőteljesen mostuk 2*SSPE/0,1% SDS-sel szobahőmérsékleten, és röntgensugárfilmre exponáltuk a hibridizáló plakkok láthatóvá tételéhez.
Két kiónt, mely szignifikáns szekvenciahomológiát mutatott a humán ad-vel, azonosítottunk. A 2-es klón hozzávetőleg 800 bp hosszúságú, és a humán ad 5’ végéhez tartozik. A 2-es klón tartalmaz egy iniciáló metioninkodont és egy teljes vezetőszekvenciát. A 7-es klón hozzávetőleg 1,5 kb, és tartalmaz egy iniciáló metionint. A 7-es klón 5’ vége átfed a 2-es klónnal, míg a 3’ szekvenciák az I domain szekvenciák mögött végződnek. A 7-es kiónt teljes egészében szekvenáltuk primer sétálási módszerrel. A 7-es klón nukleotid, és a kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját közzétettük a 100-as, illetőleg a 101-es szekvenciaszámon.
A 2-es és a 7-es kiónból meghatározott nyúl adaminosavszekvencia megjósolt N-terminálisa arra mutat, hogy a fehérje 73%-ban azonos a humán ad-vel, 65%-ban azonos az egér ad-vel, 58%-ban azonos az egér CD11b-vel, humán CD11b-vel és a humán CD11c-vel. A 2-es klón nukleinsavszekvenciáját közzétettük a 92-es szekvenciaszámon; a megjósolt aminosavszekvenciáját pedig a 93-as számon.
A teljes hosszúságú nyúl ad cDNS izolálását megkíséreltük a jelölt 7-es nyúlklónnal és a cDNS-könyvtár, melyből a fragmens származott, újraszűrésével. További 25 kiónt azonosítottunk, melyek közül megállapításunk alapján a 49-es klón volt a legnagyobb. A 49-es kiónt teljes egészében szekvenáltuk, felhasználva az egymásba ágyazódó deléciós technikát. A 49-es klón nukleinsav- és aminosavszekvenciáit közzétettük a 102-es, illetőleg a 103-as szekvenciaszámon. Mivel a 7-es és a 49-es kiónok nem átfedők, ezért a hiányzó szekvenciák izolálásához oligonukleotidokat terveztünk a PCR-ben primerként történő felhasználásukhoz a nyúllépből származó cDNS első szálára nézve.
Az 1. táblázatban leírtuk ezen két részleges klón vélt aminosavszekvenciája és más integrinek közti viszonyt.
1. táblázat
A β2 integrincsalád tagjainak százalékos azonossága aminosavszinten
Humán ad Nyúl 7-es Nyúl 49-es
Humán ad 100 74 80
Egér ad 70 67 74
Patkány ad 70 66 73
EgérCD11a random* 28 28
EgérCDHb 55 59 53
Humán CD11a 36 28 28
Humán CD11b 60 58 55
Humán CD11c 66 59 62
* ha az azonosság 25%-nál kisebb, akkor random eloszlásról beszélünk, és ez nem szignifikáns.
A nyúl ad klón izolálása lehetővé teszi a fehérje expresszióját akár a transzfektánsok felületén, akár
HU 223 977 Β1 mint teljes hosszúságú vagy részleges nagyságú oldható formában. Ezt a fehérjét immunogénként használtuk fel monoklonális ellenanyagok előállításához, felhasználva a humán kórállapotok nyúlmodelljeiben.
25. példa
Az ad terápiás alkalmazásának felderítésére szolgáló állatmodellek
A kutya immunohisztokémiájával és a patkány, valamint az egér in situ hibridizációjával megállapítottuk, hogy a lépben az ad elsősorban a vörös pulpában és a nyirokcsomókban lévő makrofágokon figyelhető meg, ad található a velőállomány zsinórjaiban és szinuszaiban. Az expressziós mintázat figyelemreméltóan hasonló azzal, amit az F4/80 és SK39 monoklonális ellenanyagokkal határoztak meg két egérszerű antigénre nézve. Míg ezen egérszerű antigének biokémiai jellemzése azt mutatja, hogy különböznek az ad-től, mégis igen valószínű, hogy az ad ugyanazt a makrofág alosztályt határozza meg, mint az egérszerű F4/80 és SK39 antigének.
Az egerekben az SK39 pozitív makrofágokat azonosították a vörös pulpában, ahol részt vehetnek az idegen anyagok keringésből történő eltávolításában, és a nyirokcsomók velőállományában [Jutila és munkatársai: J. Leukocyte Bioi. 54, 30-39 (1993)]. Az SK39 pozitív makrofágokról beszámoltak mind akut, mind krónikus gyulladásokban. Továbbá a tioglikollal gyulladásba hozott peritoneális térben összegyűlt monociták is expresszálják az SK39 antigént. Összefoglalva ezek az eredmények arra utalnak, hogy ha az SK39+ sejtek ad +-ak is, akkor ezek a sejtek felelősek a lépben az idegen anyagok eltávolításáért, és részt vesznek a gyulladásban, melyben a makrofágok jelentős szerepet játszanak.
Amíg az ad funkciója tisztázatlan maradt, addig más jobban jellemzett β2 integrinekről kimutatták, hogy részt vesznek számtalan adhéziós eseményben, mely előmozdítja a sejtek vándorlását, növeli a fagocitózist és elősegíti a sejt-sejt kölcsönhatásokat, eseményeket, melyek a gyulladásos folyamatok mindegyikében upregulációhoz vezet. Ezért nyilvánvaló, hogy a normál ad funkció gátlása gátolhatja a gyulladást is, ott, ahol a makrofágok jelentős szerepet játszanak. Az ilyen gyulladás elleni hatások a következő tényezők eredményeként jöhetnek létre: i) a makrofágok összegyűlésének blokkolása a gyulladás helyén, ii) a makrofágok aktiválásának megakadályozása a gyulladás helyén, vagy iii) a makrofág effektor funkcióiba történő beavatkozás, amely károsíthatja a normálszövetet akár a specifikus autoimmun válaszon keresztül, akár a körülötte lévő sejtekre gyakorolt romboló mellékhatáson keresztül.
A makrofágok bizonyíthatóan jelentős szerepet játszanak a következő betegségekben: ízületi gyulladás, sclerosis multiplex, beültetési atherosclerosis, a cukorbetegség bizonyos fajtái és a gyulladásos bélrendszeri betegségek. Az alábbiakban megvitatásra kerülő állatmodellekről kimutatták, hogy reprodukálják a humán betegségek számos jellegzetes vonását. Az ad funkció gátlóit kipróbálták ezekben a modellrendszerekben a megfelelő humán betegségek kezelésében jelentkező potenciájuk meghatározása érdekében.
A) Beültetési arteriosclerosis
A szívtranszplantáció ma már elfogadott kezelési eljárás néhány végállapotú szívbetegségben. A ciklosporin A használatával az egyéves túlélési arány 80%ra növekedett, így a progresszív beültetési arteriosclerosis vezető szerepre tett szert a szívtranszplantátumok egy éven túli fennmaradásában. A napjainkban végzett tanulmányok alapján azt találták, hogy a szívtranszplantációt követő 3 évben a beültetési arteriosclerosis előfordulása jelentős, 36-44%-os tartományban van [Adams és munkatársai: Transplantation 53, 1115-1119 (1992); Adams és munkatársai: Transplantation 56, 794-799 (1993)].
A beültetési arteriosclerosis tipikusan az érfal belső rétegének diffúz, elzáródó lézióit tartalmazza, mely a koszorúér falainak teljes egészét érinti, és gyakran lipidlerakódással jár együtt. Míg a beültetési arteriosclerosis kórfejlődése ismeretlen marad, addig feltételezhetjük, hogy kapcsolatban van a donor és a recipiens közötti szöveti összeférhetőséggel, és immunológiai természetű. Szövettanilag az érfal belső rétegének vastagodásában elsődlegesen makrofágok vesznek részt, bár néha T-sejteket is lehet látni. Ezért valószínű, hogy az ad-t expresszáló makrofágok jelentős szerepet játszhatnak a beültetési arteriosclerosis indukálásában és/vagy kifejlődésében. Ezekben az esetekben profilaktikusan monoklonális ellenanyagokat vagy az ad-funkciót gátló kis molekulatömegű anyagokat (például ICAM-R) adhatnánk azoknak a betegeknek, akik szívtranszplantátumot kaptak, és azoknak, akiknél a beültetési arteriosclerosis kifejlődésének kockázata nagy.
Bár az arteriosclerosis a szívtranszplantációban a legnagyobb kockázati tényező, a beültetési arteriosclerosis más szervek transzplantációjában is előfordul, így a vese és a máj transzplantációjakor. Az ad-t blokkoló vegyületek terápiás alkalmazása megakadályozhatja a beültetési arteriosclerosist más szervek transzplantációjakor, és csökkentheti a beültetési hibákból eredő komplikációkat.
A patkány egyik beültetési arteriosclerosismodellje a heterotrop eredetű allotranszplantátumok beültetése a minor hisztokompatibilitási gáton át. Amikor a Lewis szív allograftokat beültették MHC I és II osztállyal kompatibilis F-344 recipiensbe, az allograftok 80%-a három hétnél tovább élt, míg 25%-uk határozatlan ideig fennmaradt. Az alacsony kilökődés mellett a donor szívében arteriosclerosisos léziók alakultak ki. A 120 napos allograftoknál tipikus diffúz fibrotikus belsőérfalvastagodások jelentek meg, melyek kinézetükben nem különböztethetők meg a humán szív allograftok kilökődésében talált beültetési arteriosclerosis lézióitól.
A szívtranszplantációs patkányoknál a minor hisztokompatibilitási ellenanyagok rosszul kapcsolódtak össze, például a Lewis F-344-gyé. A patkány ad-re specifikus monoklonális ellenanyagokat vagy az ad kis molekulatömegü inhibitorait periodikusan adták a recipienseknek. A kezeléstől elvárják, hogy a nem kilökődő donorszívekben csökken a beültetési arteriosclerosis
HU 223 977 Β1 előfordulása. A patkányok kezelését nem lehet a patkány ad-re specifikus monoklonális ellenanyagokkal vagy az ad kis molekulatömegü inhibitoraival történő megelőző kezelésekre korlátozni. Az ad-funkció blokkolásától elvárható, hogy csökkentse a makrofágok által közvetített gyulladást, és megfordítsa a transzplantátumban fellépő artériás károsodásokat.
B) A koleszterol étrenden tartott nyulak arteriosclerosisa
A hozzávetőleg 12-16 hétig koleszterol kiegészítést tartalmazó étellel táplált nyulak ereinek belső falán léziók fejlődtek ki, melyek befedik csaknem teljes egészében a felszálló aorta belső felszínét [Rosenfeld és munkatársai: Arteriosclerosis 7, 9-23 (1987); és Rosenfeld és munkatársai: Arteriosclerosis 7, 24-34 (1987)]. A nyulakban látható arteriosclerosisos léziók hasonlóak a humánban lévőkkel. A léziók nagy számban tartalmaznak T-sejteket, melyek legtöbbje a memória T-sejtekkel kapcsolatos CD45RO-t expresszál. A beszűrődő T-sejtek hozzávetőleg fele MHC II osztályú antigéneket is expresszál, és néhány IL—2 receptort expresszál, mely arra utal, hogy a sejtek nagy része aktivált állapotban van.
A koleszterol étrenden tartott nyulak arteriosclerosisos lézióinak egyik jellegzetessége, amely láthatóan hiányzik a rágcsálók modelljeiben, a habsejtekben gazdag régiók felszaporodása. A habsejtes makrofágokról azt hiszik, hogy kialakulásukban a specifikus receptorok által felvett oxidált, alacsony sűrűségű lipoproteinek (LDL) szerepet játszanak. Az oxidált LDL-részecskékről azt találták, hogy toxikusak néhány sejttípusra nézve, beleértve az endoteliális sejteket és a simaizomsejteket. A potenciálisan toxikus oxidált LDL-ek felvétele makrofágok által serkentő jellegű, és a makrofágok aktiválásához vezet, hozzájárulva az arteriosclerosisos léziókkal társuló gyulladásokhoz.
Egyszer már kezeltek koleszterol étrenden tartott állatokat a nyúl ad ellen létrehozott monoklonális ellenanyaggal. Az ad + makrofágok körfolyamatokban való részvételének bemutatására a kezelés magában foglalja az ad monoklonális ellenanyaggal vagy kis molekulájú inhibitorokkal történő megelőző jellegű kezelését. A további tanulmányok bemutathatják, hogy az ad-re specifikus monoklonális ellenanyagok és a kis molekulájú inhibitorok képesek az aterogenikus étrenden tartott nyulakban kimutatott érrendszeri sérülések megfordítására.
C) Az inzulinfüggő cukorbetegség
BB patkányokban spontán kifejlődik egy inzulinfüggő cukorbetegség 70-150 napos korban. Felhasználva az MHC ΙΓ osztály, ED1+ makrofágok immunohisztokémiáját, kimutathatók testecskék a kór korai szakaszában. A megjelenő makrofágok nagy része szerepet játszik a sejttörmelékek vagy normálsejtek fagocitózisában. A kór előrehaladtával nagyszámú makrofág található a testecskékbe beszűrődve, bár egy jelentős számú T-sejt és később B-sejt szintén megjelenik és összegyűlik ezen a helyen [Hanenberg és munkatársai: Diabetologia 32, 126-134 (1989)].
A cukorbetegség kifejlődése BB patkányokban úgy tűnik, hogy függ mind a korai makrofágbeszűrődéstől, mind a rákövetkező T-sejt-felhalmozódástól. A BB patkányok kezelése a makrofágokra toxikus szilikarészecskékkel hatékonynak bizonyult a korai makrofágok testecskékben történő beszűrődésének blokkolásában. A korai makrofágbeszűrődés hiányában egy autoagresszív limfocitapopuláció által okozott, ezt követő szöveti károsodás nem fordul elő. A betegségek T-sejttel kapcsolatos szakaszát blokkoló OX-19 (CD5-re specifikus) patkányeredetü monoklonális ellenanyag vagy az OX-8 (patkány CD8-ra specifikus) patkányeredetű monoklonális ellenanyag beadása a cukorbetegség kifejlődését hatékonyan szupresszálja.
A makrofágok központi szerepe alkalmassá teszi a modellt az ad-funkció inhibitorainak tesztelésére. Az inzulinfüggő cukorbetegség kifejlődésére genetikusán fogékony patkányokat kezeltek ad-re specifikus monoklonális ellenanyagokkal vagy kis molekulájú inhibitorokkal, és a betegség kifejlődése szempontjából vizsgálták hatásukat. A klinikai kórkép megakadályozása vagy késleltetése bizonyítja, hogy az ad sarkalatos szerepet játszik a testecskesejtek makrofágok általi károsításában.
D) A gyulladásos bélbetegség (Crohn-féle kór, colitis ulcerosa)
A gyulladásos bélbetegség (IBD) tanulmányozásában használt állatmodellek kiválthatók ártalmas ingerlő hatású anyagok (például ecetsav vagy trinitro-benzénszulfonsav/etanol) intrarektális beadásával. Az ezekkel az anyagokkal okozott vastagbélgyulladás kémiai jellegű vagy az anyagcsereutak sérülésének eredménye, és hiányzik a humán IBD-hez kapcsolódó gyulladás krónikus és spontán visszaesése. Egy mostanában leírt modell felhasználja a streptococcusok akár A, akár D csoportjaiból tisztított peptidoglükán-poliszacharid (PG-PS) subserosaiis injektálását, és úgy tűnik, hogy ez a humán IBD egy fiziológiásán helytállóbb modellje [Yamada és munkatársai: Gastroenterology 104, 759-771 (1993)].
Ebben a modellben a PG-PS-t a disztális végbél savós hártyájába adták. Az eredményül kapott gyulladásos reakció kétfázisú, az injekció után három nappal bekövetkező akut fázist egy spontán krónikus fázis követi az injekció beadása után 3-4 héttel később. A késői fázis jellegében granulomás, vastagbél-vastagodást, adhéziókat, vastagbélcsomócskákat és a mucosában léziókat eredményez. A mucosában bekövetkező sérüléseken kívül a PG-PS colitis gyakran vezet ízületi gyulladásos anémiákhoz és granulomás hepatitishez. A kór bélrendszeren kívüli megnyilvánulása a modellt vonzóvá teszi a Crohn-féle colitis tanulmányozására. Az aktív Crohn-kóros betegek jelentős száma szenved az ízületi betegségben, valamint máj- és epegyulladásban.
A granulomás léziók krónikus gyulladás eredményei, mely a monocita/makrofág sejtvonalak sejtjeinek összegyűléséhez és rákövetkező aktiválásához vezet. A granulomás léziók jelenléte a Crohn-féle kórban és a fenti állatmodellekben a modellek alkalmazását vonzóvá teszi klinikai célokra, mint például az ad monoklonális ellenanyagok vagy más ad-funkciót gátló anyagok vizsgálatára. Az ad-funkció inhibitorairól elvárjuk, hogy
HU 223 977 Β1 az IBD-vel kapcsolódó léziók kialakulását blokkolják, sőt megfordítsák az ezekben a betegségekben fellépő szöveti károsodásokat.
E) Az ízületi gyulladás
Az ízületi gyulladás többtényezős betegségnek látszik, melybe beletartoznak a különböző típusú gyulladásban részt vevő sejttípusok, úgymint a neutrofilek, T-limfociták és a fagocitózist végző makrofágok. Bár többféle modell létezik az ízületi gyulladásra nézve, a streptococcalis sejtfalak készítményeinek alkalmazásával közelíthetjük meg legjobban a humán betegséget.
A patkányokban a streptococcalis sejtfal a perifériális ízületek gyulladását indukálja, mely folyamot jellemez a kór előrehaladásának ismételt epizódjait követő remisszió és végül az ízület károsodása néhány hónap után [Cromartie és munkatársai: J. Exp. Med. 146, 1585-1602 (1977); és Schwab és munkatársai; Infection and Immunity 59, 4436-4442 (1991)]. A kór krónikus fázisa alatt a mononukleáris fagocitákról vagy a makrofágokról azt hiszik, hogy az ízületi hártya lerombolásában fő szerepet játszanak. Továbbá az ízületi hártyában a makrofágok összegyűlését szuppresszáló ágensek csökkentik az ízületi gyulladást jellemző gyulladást és körfolyamatot.
A makrofágok központi szerepe az ízületi hártyában, mely az ízületi gyulladáshoz vezet, előrevetíti, hogy az ad-re specifikus monoklonális ellenanyagok vagy az ad-funkciót gátló anyagok terápiás potenciával rendelkeznek ezen betegség kezelésében. Az előző modellekben leírtaknak megfelelően az ad monoklonális ellenanyagok vagy a kis molekulájú inhibitorok megelőző jellegű alkalmazása feltételezhetően blokkolja vagy csökkenti az ízületek gyulladását, és megakadályozza az ízületi hártya pusztulását. Az ad-funkcióra ható ágensek mérsékelhetik a folyamatban lévő gyulladást, megakadályozva további makrofágok összegyűlését az ízületekben vagy blokkolva a makrofágok aktiválását. A nettó eredmény ellentétes lehet a folyamatban lévő romboló hatással, és elősegítheti a szövetek megújulását.
F) A sclerosis multiplex
Bár a sclerosis multiplex (MS) kórtana tisztázatlan, általánosságban elfogadják, hogy a kórt a CD4+ T-sejtek közvetítik, melyek felismerik a központi idegrendszer autoantigénjeit, és megindítják a gyulladásos folyamat láncreakcióját. Az így kiváltott immunválasz további gyulladásban részt vevő sejtek összegyűlését eredményezi, beleértve a betegséghez hozzájáruló aktivált makrofágokat. A kísérletes autoimmun encephalomyelitis (EAE) az MS-t néhány vonatkozásában utánzó állatmodell. Mostanában a gyulladásos folyamatban résztvevő makrofágokon lévő CD11b/CD18-cal reaktív monoklonális ellenanyagokról [Huitinga és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 23, 709-715 (1993)] kimutatták, hogy blokkolják mind a klinikai, mind a hisztológiai betegségeket. Az eredmények arra utalnak, hogy az adre specifikus monoklonális ellenanyagok vagy az ad kis molekulájú inhibitorai valószínűleg hatékonyan blokkolják a gyulladásos reakciót az EAE-ben. Az ilyen vegyületeknek fontos gyógyászati alkalmazása van az MS kezelésében.
G) Az immunkomplex alveolitis
Az alveoláris makrofágok az alveoláris járatokban, a légutakban, a kötőszövetekben és a tüdő pleurális tereiben képviselik a környezetből belélegzett ágensek elleni első védelmi vonalat. A bakteriális ágensek, beleértve a bakteriális LPS-t, IFN-y-t és immunkomplexeket, stimuláló hatására az alveoláris makrofágok számos potens gyulladást serkentő vegyületet bocsátanak ki, mint például oxigéngyököket és nitrogén köztitermékeket. Míg a szuperoxid-anionoknak, mint például a hidrogén-peroxidnak és a nitrogén-monoxidnak (NO ), fontos szerepe van a patogének elpusztításában és a tumorcélpontok lizálásában, ezek a vegyületek károsan hathatnak a normálszövetekre is.
Az immunkomplex alveolitis patkánymodelljében az alveoláris makrofágokból felszabaduló NO-ról kimutatták, hogy a legtöbb tüdőt érő károsodásban részt vesz [Mulligan és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 6338-6342 (1991)]. A NO· med iátorként szerepel más immunkomplexek által közvetített sérülésekben, beleértve a dermalis vasculitist [Mulligan és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 6338-6342 (1991)], és potenciális szerepet játszhat olyan betegségben, mint a glomerulonephritis.
A NO· által közvetített szöveti károsodás nem korlátozódik az immunokomplexeket tartalmazó gyulladásra. Például a PMA-val, az LSP-vel vagy az IFN-y-val stimulált mikrogliasejtek által termelt NO· képes az oligodendrociták elpusztítására [Merril és munkatársai: J. Immunoi. 151, 2132 (1993)]. A hasnyálmirigy szigetecskéiben lévő sejtekről szintén azt találták, hogy érzékenyek NO-ra, és az ezt kibocsátó makrofágok szerepelnek a cukorbetegség kialakulásához vezető szöveti károsodásban [Kroncke és munkatársai: BBRC 175, 752-754 (1991)]. Legújabban konkluzívan bemutatták azt, hogy a NO- kibocsátása szerepet játszik az endotoxikus sokkban [MacMicking és munkatársai: Cell. 81, 641-650 (1995)]. Ha a beadott lipopoliszacharid (LPS) hatására a normál vad típusú egér átél egy progresszív hanyatlást az arteriális nyomásban, akkor az végül az egér elpusztulásához vezet. LPS hatására az indukálható nitrogén-monoxid-deficiens egerekben sokkal kevésbé komoly hanyatlás mutatkozik az artériás vérnyomásban, és mindegyik túléli a kezelést.
Az in vitro vizsgálatok azt mutatják, hogy az adgátlás hatékony a makrofágok (vagy ad-t általában expresszáló leukociták) néhány funkciójának blokkolásában, beleértve a NO-kibocsátást. Az anti-ad poliklonális antiszérum (a patkány ad I domain polipeptid ellen nyúlban létrehozott antiszérum) jelenlétében IFNy-val stimulált alveoláris makrofágokról azt találták, hogy a NO· nitrit/nitrát lebomlási termékei kisebb mértékben képződnek, mint a kontrollantiszérummal kezelt makrofágokban. Ez a megfigyelés azt mutatja, hogy az ad-re, különösen az I domainre specifikus monoklonális ellenanyagok potenciális gyulladásellenes szerek lehetnek a következő betegségekben: sclerosis multiplex, cukorbetegség, tüdőgyulladás és endotoxikus sokk. Továbbá a leukocitatípusok egy széles
HU 223 977 Β1 spektrumának funkcióira ható CD18-cal szemben az ad korlátozott előfordulása miatt egy sokkal vonzóbb cél lehet, mint a CD18, a makrofágok (vagy ad-t általában expresszáló leukociták) aktivációjának megakadályozására.
A patkány IgG immunkomplex-indukált alveolitis egy széles körben használt kísérleti modell, különösen fontos az akut tüdősérülések megértésében. A sérülés trachealis kanüllel tüdőbe juttatott antiborjúszérumalbumin (BSA) ellenanyagokkal váltható ki, melyet a BSA intravénás injektálása követ. Az immunkomplexek képződése a tüdő mikrovascularis rendszerében a komplementaktiváláshoz és a neutrofilek tüdőben történő felszaporodásához vezet. Feltehetően az immunkomplexek képződésének hatására ezt követően a vérből leukociták kerülnek be a tüdőbe, majd később a leukociták átjutnak a tüdő felhámján. Ezt követi a mediátorok - beleértve a gyököket, TNF-a-t és a nitrogénmonoxidot (NO ) - kibocsátása a betegség előrehaladásában részt vevő aktivált endoteliális sejtekből, neutrofilekből és makrofágokból. A betegség kórtani képébe beletartozik az ödémához vezető megnövekedett vascularis permeabilitás és az eritrociták, valamint PMS-ek nagyszámú megjelenése az alveoláris terekben.
Az ad I domainre specifikus poliklonális antiszérumot teszteltük immunkomplex indukálta alveolitises patkánymodellben. Az anti-ad poliklonális szérumot trachealis kanüllel adtuk be, ugyanakkor anti-BSA szérumot is beadtunk a tüdőbe. A tüdő sérülését ezután fokoztuk BSA intravénás adásával. A tüdő sérüléséből eredő ödéma mennyiségi meghatározásához a BSAval együtt 125l-jelölt BSA-t (hozzávetőleg 800 000 cpm) is adtunk. A tüdősérülés kifejlődését négy óra után vizsgáltuk, felhasználva a tüdő permeabilitási értékét, melyet a tüdőben lévő 125l-jelölt BSA és az 1 ml vérben jelen lévő jel arányaként határoztunk meg. Tipikusan a pozitív kontrollok tüdőpermeabilitási értékei 0,6 és 0,8 tartományban voltak, míg a negatív kontroliokban (a patkányok nem kaptak BSA-t) a permeabilitási értékek 0,1-0,2 tartományban voltak.
Az első kísérletek azt mutatták, hogy az anti-ad poliklonális antiszérummal történő kezelés több mint 50%-kal csökkentette a tüdő permeabilitási értékeit, mely a tüdősérülés drámai mérséklését jelenti. Történetileg, az anti-CD18-kezelések a permeabilitási értékeket 60%-kal csökkentették. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ad az egyik legfontosabb β2 integrin lehet az akut tüdősérülésben, bár nem lehet pontosan meghatározni, hogy ez a hatás az antiszérumok leukociták vérből történő kijutásával vagy a leukociták tüdőepitheliumokon való áthaladásával kapcsolatos.
Az ad tüdősérülést mérséklő hatására további bizonyíték az, hogy a TNF-alfa szintje a bronchoalveolaris öblítőfolyadékban megnőtt. Az anti-ad antiszérummal azt találtuk, hogy a TNF-alfa szintje hozzávetőleg négyszeresére csökkent. A TNF-alfáról hosszú ideig azt tartották, hogy az akut tüdőgyulladás egy fontos mediátora, és felelős a gyulladásban részt vevő sejtek felszaporodásában a gyulladás, a sejtaktiválás és a szöveti károsodás helyeinél. Feltehetően az anti-ad antiszérum blokkolja az immunkomplex alveolitis kialakulása alatt az ott-tartózkodó alveoláris makrofágokat, és így mérsékli a TNF-α és a NO· kibocsátását, és csökkenti ezen ágensek és a neutrofilek összegyűléséből eredő szöveti károsodást.
26. példa
Az ad expressziója preklinikai modellekben Különböző kórállapotokban az ad differenciális expressziójának megállapításához az állatkórmodellekből származó szöveti metszeteket festettük a fentiekben leírt (lásd 18. példa) anti-ad poliklonális szérummal. A normál és kóros patkányok szöveteiből 6 pm vastag metszeteket készítettünk, és levegőn megszárítottuk a tárgylemezeket Superfrost Plus (VWR Scientific) készüléken szobahőmérsékleten egy éjszakán át. A szárítás után a metszeteket -70 °C-ról 50 °C-ra helyeztük hozzávetőleg 5 percig. A metszeteket rögzítettük hideg (4 °C) acetonban (Stephens Scientific) 10 percig szobahőmérsékleten, és hagytuk megszáradni szobahőmérsékleten. Minden metszetet blokkoltunk 150 μΙ 30% normál patkányszérumot (Harlan Bioproducts), 5% kecskeszérumot (Vector Laboratories) és 1 % borjúszérumot (Sigma Chemical Company) tartalmazó 1*TBS oldatban 30 percig szobahőmérsékleten, majd az oldatot gyengén leitattuk a metszetekről. A nyúl poliklonális szérumot 34 pg/ml fehérje koncentrációra, és az ugyanabból az állatból származó immunizálás előtti szérumot 38,5 pg/ml fehérje koncentrációra hígítottuk a blokkoló oldattal, és minden szöveti metszetre különkülön 100 μΙ-t adtunk 37 °C-on 30 percig. A szérumoldatot leitattuk a metszetekről, és a nem kötött ellenanyagot háromszori mosással eltávolítottuk 1 *TBS-sel 5 percig. A TBS feleslegét leitattuk az utolsó mosás után. Egy Elité Rabbit IgG Vectastain ABC készlettel (Vector) a biotinilezett kecske antinyúl ellenanyagot elkészítettük a gyártó által javasolt eljárási séma szerint, és az így kapott oldatból 100 μΙ-t adtunk mindegyik metszethez 15 percig 37 °C-on. A tárgylemezeket kétszer mostuk 1 xTBS-ben mosásonként 5 percig, majd ezután 100 pl streptavidin-arany konjugátumot (Goldmark Biologicals) - 5% normál patkányszérumot és 1% BSA-t tartalmazó oldattal 1:100 arányban hígítva - adtunk mindegyik metszethez 1 óráig szobahőmérsékleten. A metszeteket háromszor mostuk TBS-sel mosásonként 5 percig, és hozzáadtunk 1% glutáraldehidet tartalmazó TBS pufferoldatból 100 μΙ-t (5 perc, szobahőmérséklet). A metszeteket újból háromszor mostuk, mindegyik mosás 5 percig tartott, és ötször mostuk ionmentes vízzel mosásonként 3 percig. A folyadék feleslegét leitattuk mindegyik metszetről, és 2 csepp ezüst erősítő-, valamint inicializáló oldatot (Goldmark Biologicals) adtunk mindegyik metszethez. A reakciót 20-30 percig végeztük szobahőmérsékleten, majd ezután a metszeteket teljesen leöblítettük steril ionmentes vízzel, a levegőn egy éjszakán át szárítottuk, és beágyaztuk Cytoseal 60-nal (VWR). Mint a kontrolloknál, a szöveti metszeteket jelöltük CD11a, CD11b, CD11c és CD18 monoklonális ellenanyagokkal, ugyanabban a kísérletben azonos eljárási sémával.
HU 223 977 Β1
Az ad poliklonális szérummal és a CD11a, CD11b, CD11c és CD18 monoklonális ellenanyagokkal történő jelölés felfedte, hogy az ad-mintázat különbözik más α-alegységeknél megfigyelt mintázattól.
A normál tüdőszövetben az ad-expresszió megfi- 5 gyelhető a bronchusok légzési epitheliumán (de nem az alveoláris terek epitheliumán) és a légterekben lévő alveoláris makrofágok egyedi sejtjein. A poliklonális szérummal megfigyelt jel jelentősen nagyobb volt, mint az immunizálás előtti szérumkontrollok által kapott háttérszínt jele. A tüdő granuloma szövetében a glükán beadása után 24 és 96 órával egy eltérő jelet kaptunk a légzési epithelium ad-festésekor a teljes alveoláris területen, és egy erősebb jelet mutattunk ki a légutakban elhelyezkedő alveoláris makrofágokon. A betegségből feltehetően kigyógyult állatok tüdejében (a glükán ada10 golása után 16 nappal az állatokat feláldoztuk) nem figyeltünk meg jelet ad ellenanyaggal. Nagyon kicsi hátteret kaptunk az immunizálás előtti szérumokkal ezekben a szövetekben.
Az antigén indukálta asztmamodellből származó tüdőket felhasználva egy erős jelet mutattunk ki ad ellenanyaggal mind a bronchusok, mind az alveoláris tér légzési epitheliumában. A jel jelentősen nagyobb volt, mint az immunizálás előtti szérumkontrollal kapott háttérjel.
A találmány fenti bemutató jellegű példáiban számos módosítást és változtatást tettünk közzé, melyekről feltételezzük, hogy előfordulnak a szakemberek kísérleteiben. Következésképpen csak mint korlátozások jelennek meg a csatolt igénypontokban, melyeket a találmányhoz kellett kapcsolnunk.
A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BENYÚJTÓ:
(A) NÉV: Gallatin, W. Michael Van dér Vieren, Monica (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: A humán béta-2 integrin alfa-alegysége (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 103 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍMZETT: SBG&K Szabadalmi és Ügyvédi iroda (B) UTCA: Andrássy út 113.
(C) VÁROS: Budapest (D) ÁLLAM:
(E) ORSZÁG: Magyarország (v) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:
(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC KOMPATIBILIS (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: PATENTIN RELEASE #1.0, VERSION #1.25 (vi) A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI:
(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA:
(B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA:
(C) OSZTÁLYOZÁS:
(vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:
(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: US 08/173,497 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 1993. december 23.
(vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:
(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: US 08/286,889 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 1994. december 5.
(vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:
(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: US 08/362,652 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 1994. december 21.
(viii) ÜGYVIVŐ/ÜGYNÖK INFORMÁCIÓ:
(A) NÉV: Williams Jr. Joseph A.
(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 38,659 (C) REFERENCIA/LAJSTROMSZÁM: 27866/32684 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:
(A) TELEFON: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448 (C) TELEX: 25-3856
HU 223 977 Β1
1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3726 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Tulajdonság:
(I) Név/kulcs: CDS (J) Lokalizáció: 3...3485 (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia
TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47
Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Alá Ser Tyr His
10 15
GGA Gly TTC AAC Phe Asn CTG Leu GAT Asp 20 GTG GAG GAG CCT Pro ACG Thr 25 ATC Ile TTC Phe CAG Gin GAG Glu GAT Asp 30 GCA Alá 95
Val Glu Glu
GGC GGC TTT GGG CAG AGC GTG GTG CAG TTC GGT GGA TCT CGA CTC GTG 143
Gly Gly Phe Gly Gin Ser Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
35 40 45
GTG GGA GCA CCC CTG GAG GTG GTG GCG GCC AAC CAG ACG GGA CGG CTG 191
Val Gly Alá Pro Leu Glu Val Val Alá Alá Asn Gin Thr Gly Arg Leu
50 55 60
TAT GAC TGC GCA GCT GCC ACC GGC ATG TGC CAG CCC ATC CCG CTG CAC 239
Tyr Asp Cys Alá Alá Alá Thr Gly Met Cys Gin Pro Ile Pro Leu His
65 70 75
ATC CGC CCT GAG GCC GTG AAC ATG TCC TTG GGC CTG ACC CTG GCA GCC 287
Ile Arg Pro Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Alá Alá
80 85 90 95
TCC ACC AAC GGC TCC CGG CTC CTG GCC TGT GGC CCG ACC CTG CAC AGA 335
Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Leu His Arg
100 105 110
GTC TGT GGG GAG AAC TCA TAC TCA AAG GGT TCC TGC CTC CTG CTG GGC 383
Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
115 120 125
TCG CGC TGG GAG ATC ATC CAG ACA GTC CCC GAC GCC ACG CCA GAG TGT 431
Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gin Thr Val Pro Asp Alá Thr Pro Glu Cys
130 135 140
CCA CAT CAA GAG ATG GAC ATC GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGA AGC 479
Pro His Gin Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
145 150 155
ATT GAC CAA AAT GAC TTT AAC CAG ATG AAG GGC TTT GTC CAA GCT GTC 527
Ile Asp Gin Asn Asp Phe Asn Gin Met Lys Gly Phe Val Gin Alá Val
160 165 170 175
ATG GGC CAG TTT GAG GGC ACT GAC ACC CTG TTT GCA CTG ATG CAG TAC 575
Met Gly Gin Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Alá Leu Met Gin Tyr
180 185 190
HU 223 977 Β1
TCA AAC CTC Leu CTG Leu 195 AAG Lys ATC He CAC His TTC Phe ACC Thr 200 TTC Phe ACC Thr CAA Gin TTC Phe CGG Arg 205 ACC Thr AGC Ser 623
Ser Asn
CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG 671
Pro Ser Gin Gin Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gin Leu Lys Gly Leu
210 215 220
ACG TTC ACG GCC ACG GGC ATC CTG ACA GTG GTG ACA CAG CTA TTT CAT 719
Thr Phe Thr Alá Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gin Leu Phe His
225 230 235
CAT AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATT GTC ATC 767
His Lys Asn Gly Alá Arg Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
240 245 250 255
ACA GAT GGG CAG AAG TAC AAA GAC CCC CTG GAA TAC AGT GAT GTC ATC 815
Thr Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile
260 265 270
CCC CAG GCA GAG AAG GCT GGC ATC ATC CGC TAC GCT ATC GGG GTG GGA 863
Pro Gin Alá Glu Lys Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val Gly
275 280 285
CAC GCT TTC CAG GGA CCC ACT GCC AGG CAG GAG CTG AAT ACC ATC AGC 911
His Alá Phe Gin Gly Pro Thr Alá Arg Gin Glu Leu Asn Thr Ile Ser
290 295 300
TCA GCG CCT CCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GAC AAC TTT GCA GCC 959
Ser Alá Pro Pro Gin Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Alá Alá
305 310 315
CTT GGC AGC ATC CAG AAG CAG CTG CAG GAG AAG ATC TAT GCA GTT GAG 1007
Leu Gly Ser Ile Gin Lys Gin Leu Gin Glu Lys Ile Tyr Alá Val Glu
320 325 330 335
GGA ACC CAG TCC AGG GCA AGC AGC TCC TTC CAG CAC GAG ATG TCC CAA 1055
Gly Thr Gin Ser Arg Alá Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin
340 345 350
GAA GGC TTC AGC ACA GCC CTC ACA ATG GAT GGC CTC TTC CTG GGG GCT 1103
Glu Gly Phe Ser Thr Alá Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Alá
355 360 365
GTG GGG AGC TTT AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC CTG TAT CCC CCA AAT 1151
Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro Pro Asn
370 375 380
ATG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGG 1199
Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg
385 390 395
GAC TCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GAG CTA GCC CTG TGG AAG GGG GTA 1247
Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Alá Leu Trp Lys Gly Val
400 405 410 415
CAG AAC CTG GTC CTG GGG GCC CCC CGC TAC CAG CAT ACC GGG AAG GCT 1295
Gin Asn Leu Val Leu Gly Alá Pro Arg Tyr Gin His Thr Gly Lys Alá
420 425 430
HU 223 977 Β1
GTC Val ATC Ile TTC Phe ACC Thr 435 CAG Gin GTG Val TCC Ser AGG CAA TGG AGG AAG AAG GCC Alá 445 GAA Glu GTC Val 1343
Arg Gin 440 Trp Arg Lys Lys
ACA GGG ACG CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC TGC TCC GTG 1391
Thr Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Alá Ser Leu Cys Ser Val
450 455 460
GAT GTG GAC AGC GAT GGC AGC ACC GAC CTG ATC CTC ATT GGG GCC CCC 1439
Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Alá Pro
465 470 475
CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG GGC CAG GTG TCC GTG TGT CCC TTG 1487
His Tyr Tyr Glu Gin Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Cys Pro Leu
480 485 490 495
CCT AGG GGG CAG AGG GTG CAG TGG CAG TGT GAC GCT GTT CTC CGT GGT 1535
Pro Arg Gly Gin Arg Val Gin Trp Gin Cys Asp Alá Val Leu Arg Gly
500 505 510
GAG CAG GGC CAC CCC TGG GGC CGC TTT GGG GCA GCC CTG ACA GTG TTG 1583
Glu Gin Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Alá Alá Leu Thr Val Leu
515 520 525
GGG GAT GTG AAT GAG GAC AAG CTG ATA GAC GTG GCC ATT GGG GCC CCG 1631
Gly Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Alá Ile Gly Alá Pro
530 535 540
GGA GAG CAG GAG AAC CGG GGT GCT GTC TAC CTG TTT CAC GGA GCC TCA 1679
Gly Glu Gin Glu Asn Arg Gly Alá Val Tyr Leu Phe His Gly Alá Ser
545 550 555
GAA TCC GGC ATC AGC CCC TCC CAC AGC CAG CGG ATT GCC AGC TCC CAG 1727
Glu Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gin Arg Ile Alá Ser Ser Gin
560 565 570 575
CTC TCC CCC AGG CTG CAG TAT TTT GGG CAG GCG CTG AGT GGG GGT CAG 1775
Leu Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Alá Leu Ser Gly Gly Gin
580 585 590
GAC CTC ACC CAG GAT GGA CTG ATG GAC CTG GCC GTG GGG GCC CGG GGC 1823
Asp Leu Thr Gin Asp Gly Leu Met Asp Leu Alá Val Gly Alá Arg Gly
595 600 605
CAG GTG CTC CTG CTC AGG AGT CTG CCG GTG CTG AAA GTG GGG GTG GCC 1871
Gin Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Alá
610 615 620
ATG AGA TTC AGC CCT GTG GAG GTG GCC AAG GCT GTG TAC CGG TGC TGG 1919
Met Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Alá Lys Alá Val Tyr Arg Cys Trp
625 630 635
GAA GAG AAG CCC AGT GCC CTG GAA GCT GGG GAC GCC ACC GTC TGT CTC 1967
Glu Glu Lys Pro Ser Alá Leu Glu Alá Gly Asp Alá Thr Val Cys Leu
640 645 650 655
ACC ATC CAG AAA AGC TCA CTG GAC CAG CTA GGT GAC ATC CAA AGC TCT 2015
Thr Ile Gin Lys Ser Ser Leu Asp Gin Leu Gly Asp Ile Gin Ser Ser
660 665 670
HU 223 977 Β1
GTC Val AGG Arg TTT Phe GAT Asp 675 CTG GCA CTG GAC Asp CCA Pro 680 GGT Gly CGT Arg CTG Leu ACT Thr TCT Ser 685 CGT Arg GCC Alá 2063
Leu Alá Leu
ATT TTC AAT GAA ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG 2111
Ile Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu
690 695 700
GGA CTG GGG ATT CAC TGT GAA ACC CTG AAG CTG CTT TTG CCA GAT TGT 2159
Gly Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys
705 710 715
GTG GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC AAC TTC TCA CTG 2207
Val Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu
720 725 730 735
GTG AGA GAG CCC ATC CCC TCC CCC CAG AAC CTG CGT CCT GTG CTG GCC 2255
Val Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gin Asn Leu Arg Pro Val Leu Alá
740 745 750
GTG GGC TCA CAA GAC CTC TTC ACT GCT TCT CTC CCC TTC GAG AAG AAC 2303
Val Gly Ser Gin Asp Leu Phe Thr Alá Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn
755 760 765
TGT GGG CAA GAT GGC CTC TGT GAA GGG GAC CTG GGT GTC ACC CTC AGC 2351
Cys Gly Gin Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser
770 775 780
TTC TCA GGC CTG CAG ACC CTG ACC GTG GGG AGC TCC CTG GAG CTC AAC 2399
Phe Ser Gly Leu Gin Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn
785 790 795
GTG ATT GTG ACT GTG TGG AAC GCA GGT GAG GAT TCC TAC GGA ACC GTG 2447
Val Ile Val Thr Val Trp Asn Alá Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val
800 805 810 815
GTC AGC CTC TAC TAT CCA GCA GGG CTG TCG CAC CGA CGG GTG TCA GGA 2495
Val Ser Leu Tyr Tyr Pro Alá Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly
820 825 830
GCC CAG AAG CAG CCC CAT CAG AGT GCC CTG CGC CTG GCA TGT GAG ACA 2543
Alá Gin Lys Gin Pro His Gin Ser Alá Leu Arg Leu Alá Cys Glu Thr
835 840 845
GTG CCC ACT GAG GAT GAG GGC CTA AGA AGC AGC CGC TGC AGT GTC AAC 2591
Val Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn
850 855 860
CAC CCC ATC TTC CAT GAG GGC TCT AAC GGC ACC TTC ATA GTC ACA TTC 2639
His Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe
865 870 875
GAT GTC TCC TAC AAG GCC ACC CTG GGA GAC AGG ATG CTT ATG AGG GCC 2687
Asp Val Ser Tyr Lys Alá Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Alá
880 885 890 895
AGT GCA AGC AGT GAG AAC AAT AAG GCT TCA AGC AGC AAG GCC ACC TTC 2735
Ser Alá Ser Ser Glu Asn Asn Lys Alá Ser Ser Ser Lys Alá Thr Phe
900 905 910
HU 223 977 Β1
CAG Gin CTG GAG CTC Leu 915 CCG Pro GTG AAG TAT Tyr GCA Alá 920 GTC Val TAC ACC ATG ATC AGC AGG 2783
Leu Glu Val Lys Tyr Thr Met Ile 925 Ser Arg
CAG GAA GAA TCC ACC AAG TAC TTC AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG 2831
Gin Glu Glu 930 Ser Thr Lys Tyr Phe 935 Asn Phe Alá Thr Ser 940 Asp Glu Lys
AAA ATG AAA GAG GCT GAG CAT CGA TAC CGT GTG AAT AAC CTC AGC CAG 2879
Lys Met 945 Lys Glu Alá Glu His 950 Arg Tyr Arg Val Asn 955 Asn Leu Ser Gin
CGA GAT CTG GCC ATC AGC ATT AAC TTC TGG GTT CCT GTC CTG CTG AAC 2927
Arg 960 Asp Leu Alá Ile Ser 965 Ile Asn Phe Trp Val 970 Pro Val Leu Leu Asn 975
GGG GTG GCT GTG TGG GAT GTG GTC ATG GAG GCC CCA TCT CAG AGT CTC 2975
Gly Val Alá Val Trp 980 Asp Val Val Met Glu 985 Alá Pro Ser Gin Ser 990 Leu
CCC TGT GTT TCA GAG AGA AAA CCT CCC CAG CAT TCT GAC TTC CTG ACC 3023
Pro Cys Val Ser 995 Glu Arg Lys Pro Pro Gin 1000 His Ser Asp Phe Leu 1005 Thr
CAG ATT TCA AGA AGT CCC ATG CTG GAC TGC TCC ATT GCT GAC TGC CTG 3071
Gin Ile Ser Arg 1010 Ser Pro Met Leu Asp 1015 Cys Ser Ile Alá Asp 1020 Cys Leu
CAG TTC CGC TGT GAC GTC CCC TCC TTC AGC GTC CAG GAG GAG CTG GAT 3119
Gin Phe Arg 1025 Cys Asp Val Pro Ser 1030 Phe Ser Val Gin Glu 1035 Glu Leu Asp
TTC ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG 3167
Phe Thr 1040 Leu Lys Gly Asn Leu 1045 Ser Phe Gly Trp Val 1050 Arg Glu Thr Leu 1055
CAG AAG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GAA ATT ACG TTC GAC ACA 3215
Gin Lys Lys Val Leu 106C Val 1 Val Ser Val Alá 1063 Glu Ile Thr Phe Asp Thr 1070
TCC GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG 3263
Ser Val Tyr Ser Gin 1075 Leu Pro Gly Gin Glu 1080 Alá Phe Met Arg Alá 1085 Gin
ATG GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC 3311
Met Glu Met 109C Val 1 Leu Glu Glu Asp 1095 Glu Val Tyr Asn Alá HOC Ile ) Pro Ile
ATC ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA 3359
Ile Met Gly 1105 Ser Ser Val Gly 111C Alá 1 Leu Leu Leu Leu 1113 Alá Leu Ile Thr
GCC ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AAG GAA ATG 3407
Alá 112C Thr 1 Leu Tyr Lys Leu 1125 Gly 1 Phe Phe Lys Arg 113C His 1 Tyr Lys Glu Met 1135
CTG GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC 3455
Leu Glu Asp Lys Pro 1140 Glu 1 Asp Thr Alá Thr 1145 Phe Ser Gly Asp Asp 1150 Phe 1
HU 223 977 Β1
AGC TGT GTG GCC CCA AAT GTG CCT TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT 3505
Ser Cys Val Alá Pro Asn Val Pro Leu Ser
1155 1160
TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA 3566
CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG 3625
AGATAGAGAT TGTAATGTTT TTACATATCT GTCCATCTTT TTCAGCAATG ACCCACTTTT 3685
TACAGAAGCA GGCATGGTGC CAGCATAAAT TTTCATATGC T 3726
2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1161 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia
Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Alá Ser Tyr His Gly 15 10 15
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gin Glu Asp Alá Gly 20 25 30
Gly Phe Gly Gin Ser Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val 35 40 45
Gly Alá Pro Leu Glu Val Val Alá Alá Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr 50 55 60
Asp Cys Alá Alá Alá Thr Gly Met Cys Gin Pro Ile Pro Leu His Ile
70 75 80
Arg Pro Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Alá Alá Ser
90 95
Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Leu His Arg Val 100 105 110
Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser 115 120 125
Arg Trp Glu Ile Ile Gin Thr Val Pro Asp Alá Thr Pro Glu Cys Pro 130 135 140
His Gin Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile
145 150 155 160
Asp Gin Asn Asp Phe Asn Gin Met Lys Gly Phe Val Gin Alá Val Met
165 170 175
Gly Gin Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Alá Leu Met Gin Tyr Ser 180 185 190
Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gin Phe Arg Thr Ser Pro 195 200 205
HU 223 977 Β1
Ser Gin Gin 210 Ser Leu Val Asp 215 Pro Ile Val Gin Leu 220 Lys Gly Leu Thr
Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gin Leu Phe His His
225 230 235 240
Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr
245 250 255
Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro
260 265 270
Gin Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly His
275 280 285
Ala Phe Gin Gly Pro Thr Ala Arg Gin Glu Leu Asn Thr Ile Ser Ser
290 295 300
Ala Pro Pro Gin Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ser Ile Gin Lys Gin Leu Gin Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu Gly
325 330 335
Thr Gin Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin Glu
340 345 350
Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala Val
355 360 365
Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Met
370 375 380
Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg Asp
385 390 395 400
Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val Gin
405 410 415
Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gin His Thr Gly Lys Ala Val
420 425 430
Ile Phe Thr Gin Val Ser Arg Gin Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val Thr
435 440 445
Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp
450 455 460
Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro His
465 470 475 480
Tyr Tyr Glu Gin Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Cys Pro Leu Pro
485 490 495
Arg Gly Gin Arg Val Gin Trp Gin Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu
500 505 510
Gin Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly
515 520 525
HU 223 977 Β1
Asp Val Asn Glu 530
Glu Gin Glu Asn 545
Ser Gly Ile Ser
Ser Pro Arg Leu 580
Leu Thr Gin Asp 595
Val Leu Leu Leu 610
Arg Phe Ser Pro 625
Glu Lys Pro Ser
Ile Gin Lys Ser 660
Arg Phe Asp Leu 675
Phe Asn Glu Thr 690
Leu Gly Ile His 705
Glu Asp Val Val
Arg Glu Pro Ile 740
Gly Ser Gin Asp 755
Gly Gin Asp Gly 770
Ser Gly Leu Gin 785
Ile Val Thr Val
Ser Leu Tyr Tyr 820
Gin Lys Gin Pro 835
Asp Lys Leu Ile 535
Arg Gly Alá Val 550
Pro Ser His Ser 565
Gin Tyr Phe Gly
Asp Val Alá
Gly Leu Met Asp 600
Arg Ser Leu Pro 615
Val Glu Val Alá 630
Alá Leu Glu Alá 645
Ser Leu Asp Gin
Tyr Leu Phe 555
Gin Arg Ile 570
Gin Alá Leu 585
Leu Alá Val
Val Leu Lys
Alá Leu Asp Pro 680
Lys Asn Pro Thr 695
Cys Glu Thr Leu 710
Ser Pro Ile Ile 725
Pro Ser Pro Gin
Lys Alá Val 635
Gly Asp Alá 650
Leu Gly Asp 665
Gly Arg Leu
Leu Thr Arg
Leu Phe Thr Alá 760
Leu Cys Glu Gly 775
Thr Leu Thr Val 790
Trp Asn Alá Gly 805
Pro Alá Gly Leu
His Gin Ser Alá 840
Lys Leu Leu 715
Leu His Leu 730
Asn Leu Arg 745
Ser Leu Pro
Asp Leu Gly
Gly Ser Ser 795
Glu Asp Ser 810
Ser His Arg 825
Leu Arg Leu
Ile Gly Alá Pro Gly 540
His Gly Alá Ser Glu 560
Alá Ser Ser Gin Leu 575
Ser Gly Gly Gin Asp 590
Gly Alá Arg Gly Gin 605
Val Gly Val Alá Met 620
Tyr Arg Cys Trp Glu 640
Thr Val Cys Leu Thr 655
Ile Gin Ser Ser Val 670
Thr Ser Arg Alá Ile 685
Arg Lys Thr Leu Gly 700
Leu Pro Asp Cys Val 720
Asn Phe Ser Leu Val 735
Pro Val Leu Alá Val 750
Phe Glu Lys Asn Cys 765
Val Thr Leu Ser Phe 780
Leu Glu Leu Asn Val 800
Tyr Gly Thr Val Val 815
Arg Val Ser Gly Alá 830
Alá Cys Glu Thr Val 845
HU 223 977 Β1
Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys 860 Ser Val Asn His
850 855
Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp
865 870 875 880
Val Ser Tyr Lys Alá Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Alá Ser
885 890 895
Alá Ser Ser Glu Asn Asn Lys Alá Ser Ser Ser Lys Alá Thr Phe Gin
900 905 910
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Alá Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gin
915 920 925
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Alá Thr Ser Asp Glu Lys Lys
930 935 940
Met Lys Glu Alá Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gin Arg
945 950 955 960
Asp Leu Alá Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
965 970 975
Val Alá Val Trp Asp Val Val Met Glu Alá Pro Ser Gin Ser Leu Pro
980 985 990
Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gin His Ser Asp Phe Leu Thr Gin
995 1000 1005
Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Alá Asp Cys Leu Gin
1010 1015 1020
Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gin Glu Glu Leu Asp Phe
1025 1030 1035 1040
Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gin
1045 1050 1055
Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Alá Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
1060 1065 1070
Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin Glu Alá Phe Met Arg Alá Gin Met
1075 1080 1085
Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Alá Ile Pro Ile Ile
1090 1095 1100
Met Gly Ser Ser Val Gly Alá Leu Leu Leu Leu Alá Leu Ile Thr Alá
1105 1110 1115 1120
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu
1125 1130 1135
Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Alá Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser
1140 1145 1150
Cys Val Alá Pro Asn Val Pro Lys Ser
1155 1160
HU 223 977 Β1
3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1153 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
Met 1 Alá Leu Arg Val 5 Leu Leu Leu Thr Alá 10 Leu Thr Leu Cys His 15 Gly
Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Alá Met Thr Phe Gin Glu Asn Alá Arg
20 25 30
Gly Phe Gly Gin Ser Val Val Gin Leu Gin Gly Ser Arg Val Val Val
35 40 45
Gly Alá Pro Gin Glu Ile Val Alá Alá Asn Gin Arg Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Gin Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys Glu Pro Ile Arg Leu Gin Val
65 70 75 80
Pro Val Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Alá Alá Thr
85 90 95
Thr Ser Pro Pro Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Val His Gin Thr
100 105 110
Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly Leu Cys Phe Leu Phe Gly Ser
115 120 125
Asn Leu Arg Gin Gin Pro Gin Lys Phe Pro Glu Alá Leu Arg Gly Cys
130 135 140
Pro Gin Glu Asp Ser Asp Ile Alá Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Ile Ile Pro His Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val
165 170 175
Met Glu Gin Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser Leu Met Gin Tyr
180 185 190
Ser Glu Glu Phe Arg Ile His Phe Thr Phe Lys Glu Phe Gin Asn Asn
195 200 205
Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro Ile Thr Gin Leu Leu Gly Arg
210 215 220
Thr His Thr Alá Thr Gly Ile Arg Lys Val Val Arg Glu Leu Phe Asn
225 230 235 240
Ile Thr Asn Gly Alá Arg Lys Asn Alá Phe Lys Ile Leu Val Val Ile
245 250 255
Thr Asp Gly Glu Lys Phe Gly Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile
260 265 270
HU 223 977 Β1
Pro Glu Alá 275
Asp Alá Phe 290
Ser Lys Pro 305
Leu Lys Thr
Asp Arg Glu Gly
Gly Thr Gin
Glu Gly Phe 355
Val Gly Ser 370
Glu Lys Ser 385
Asp Alá Tyr
Arg Ser Glu Lys 295
Pro Arg Asp His 310
Ile Gin Asn Gin 325
Thr Gly Ser Ser 340
Ser Alá Alá Ile
Gin Ser Leu
Alá Met Phe 435
Lys Gly Thr 450
Asp Val Asp 465
His Tyr Tyr
Tyr Asp Trp Alá 375
Thr Phe Ile Asn 390
Leu Gly Tyr Alá 405
Val Leu Gly Alá 420
Arg Gin Asn Thr
Pro Arg Gly
Glu Gin Gly 515
Gly Asp Val 530
Gly Glu Glu 545
Gly Ser Gly
Gin Ile Gly Alá 455
Ser Asn Gly Ser 470
Glu Gin Thr Arg 485
Gin Arg Alá Arg 500
Gin Pro Trp Gly
Leu Ser Pro
Asn Gly Asp Lys 535
Asp Asn Arg Gly 550
Ile Ser Pro Ser 565
Arg Leu Gin Tyr 580
Val Ile Arg Tyr Val 280
Ser Arg Gin Glu Leu 300
Val Phe Gin Val Asn 315
Leu Arg Glu Lys Ile 330
Ser Ser Phe Glu His 345
Thr Ser Asn Gly Pro 360
Gly Gly Val Phe Leu 380
Met Thr Arg Val Asp 395
Alá Alá Ile Ile Leu 410
Pro Arg Tyr Gin His 425
Gly Met Trp Glu Ser 440
Tyr Phe Gly Alá Ser 460
Thr Asp Leu Val Leu 475
Gly Gly Gin Val Ser 490
Trp Gin Cys Asp Alá 505
Arg Phe Gly Alá Alá 520
Leu Thr Asp Val Alá 540
Alá Val Tyr Leu Phe 555
His Ser Gin Arg Ile 570
Phe Gly Gin Ser Leu 585
Ile Gly Val Gly 285
Asn Thr Ile Alá
Asn Phe Glu Alá 320
Phe Alá Ile Glu 335
Glu Met Ser Gin 350
Leu Leu Ser Thr 365
Tyr Thr Ser Lys
Ser Asp Met Asn 400
Arg Asn Arg Val 415
Ile Gly Leu Val 430
Asn Alá Asn Val 445
Leu Cys Ser Val
Ile Gly Alá Pro 480
Val Cys Pro Leu 495
Val Leu Tyr Gly 510
Leu Thr Val Leu 525
Ile Gly Alá Pro
His Gly Thr Ser 560
Alá Gly Ser Lys 575
Ser Gly Gly Gin
590
HU 223 977 Β1
Asp Leu Thr Met 595
His Val Leu Leu 610
Met Glu Phe Asn 625
Asp Gin Val Val
His Val Gin Lys 660
Ser Val Val Thr 675
Arg Alá Val Phe 690
Val Leu Gly Leu 705
Asn Cys Ile Glu
Ser Leu Val Gly 740
Leu Alá Glu Asp 755
Lys Asn Cys Gly 770
Phe Ser Phe Met 785
Phe Asn Val Thr
Thr Gin Val Thr 820
Ser Thr Leu Gin 835
Glu Ser Alá Ser 850
Cys Ser Ile Asn 865
Asn Ile Thr Phe
Leu Leu Lys Alá 900
Asp Gly Leu Val 600
Leu Arg Ser Gin 615
Pro Arg Glu Val 630
Lys Gly Lys Glu 645
Ser Thr Arg Asp
Tyr Asp Leu Alá 680
Asn Glu Thr Lys 695
Thr Gin Thr Cys 710
Asp Pro Val Ser 725
Thr Pro Leu Ser
Alá Gin Arg Leu 760
Asn Asp Asn Ile 775
Ser Leu Asp Cys 790
Val Thr Val Arg 805
Phe Phe Phe Pro
Asn Gin Arg Ser 840
Ser Thr Glu Val 855
His Pro Ile Phe 870
Asp Val Asp Ser 885
Asn Val Thr Ser
Asp Leu Thr Val
Pro Val Leu Arg 620
Alá Arg Asn Val 635
Alá Gly Glu Val 650
Arg Leu Arg Glu 665
Leu Asp Ser Gly
Asn Ser Thr Arg 700
Glu Thr Leu Lys 715
Pro Ile Val Leu 730
Alá Phe Gly Asn 745
Phe Thr Alá Leu
Cys Gin Asp Asp 780
Leu Val Val Gly 795
Asn Asp Gly Glu 810
Leu Asp Leu Ser 825
Gin Arg Ser Trp
Ser Gly Alá Leu 860
Pro Glu Asn Ser 875
Lys Alá Ser Leu 890
Glu Asn Asn Met 905
Gly Alá Gin Gly 605
Val Lys Alá Ile
Phe Glu Cys Asn 640
Arg Val Cys Leu 655
Gly Gin Ile Gin 670
Arg Pro His Ser 685
Arg Gin Thr Gin
Leu Gin Leu Pro 720
Arg Leu Asn Phe 735
Leu Arg Pro Val 750
Phe Pro Phe Glu 765
Leu Ser Ile Thr
Gly Pro Arg Glu 800
Asp Ser Tyr Arg 815
Tyr Arg Lys Val 830
Arg Leu Alá Cys 845
Lys Ser Thr Ser
Glu Val Thr Phe 880
Gly Asn Lys Leu 895
Pro Arg Thr Asn
910
HU 223 977 Β1
Lys Thr Glu 915 Phe Gin Leu Glu Leu 920 Pro Val Lys Tyr Alá 925 Val Tyr Met
Val Val 930 Thr Ser His Gly Val 935 Ser Thr Lys Tyr Leu 940 Asn Phe Thr Alá
Ser 945 Glu Asn Thr Ser Arg 950 Val Met Gin His Gin 955 Tyr Gin Val Ser Asn 960
Leu Gly Gin Arg Ser 965 Leu Pro Ile Ser Leu 970 Val Phe Leu Val Pro 975 Val
Arg Leu Asn Gin 980 Thr Val Ile Trp Asp 985 Arg Pro Gin Val Thr 990 Phe Ser
Glu Asn Leu 995 Ser Ser Thr Cys His 100C Thr 1 Lys Glu Arg Leu 1005 Pro Ser His
Ser Asp 101C Phe 1 Leu Alá Glu Leu 1015 Arg Lys Alá Pro Val 102C Val ) Asn Cys Ser
Ile 1025 Alá Val Cys Gin Arg 103C Ile 1 Gin Cys Asp Ile 1035 Pro I Phe Phe Gly Ile 1040
Gin Glu Glu Phe Asn 1045 Alá Thr Leu Lys Gly 105C Asn 1 Leu Ser Phe Asp 1055 Trp
Tyr Ile Lys Thr 106C Ser ) His Asn His Leu 1065 Leu Ile Val Ser Thr 107C Alá 1 Glu
Ile Leu Phe 1075 Asn Asp Ser Val Phe 1080 Thr 1 Leu Leu Pro Gly 1085 Gin 1 Gly Alá
Phe Val 109C Arg 1 Ser Gin Thr Glu 1095 Thr 1 Lys Val Glu Pro HOC Phe 1 Glu Val Pro
Asn 1105 Pro 1 Leu Pro Leu Ile 1110 Val i Gly Ser Ser Val 1115 Gly Gly Leu Leu Leu 1120
Leu Alá Leu Ile Thr 1125 Alá Alá Leu Tyr Lys 1130 Leu Gly Phe Phe Lys 1135 Arg
Gin Tyr Lys Asp Met Met Ser Glu Gly Gly Pro Pro Gly Alá Glu Pro
1140 1145 1150
Gin
4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1163 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia
Met Thr Arg Thr Arg Alá Alá Leu Leu Leu Phe Thr Alá Leu Alá Thr 15 10 15
HU 223 977 Β1
Ser Leu Gly Phe Asn Leu Asp Thr Glu 25 Glu Leu Thr Alá Phe 30 Arg Val
20
Asp Ser Alá Gly Phe Gly Asp Ser Val Val Gin Tyr Alá Asn Ser Trp
35 40 45
Val Val Val Gly Alá Pro Gin Lys Ile Ile Alá Alá Asn Gin Ile Gly
50 55 60
Gly Leu Tyr Gin Cys Gly Tyr Ser Thr Gly Alá Cys Glu Pro Ile Gly
65 70 75 80
Leu Gin Val Pro Pro Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
85 90 95
Alá Ser Thr Thr Ser Pro Ser Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Val
100 105 110
His His Glu Cys Gly Arg Asn Met Tyr Leu Thr Gly Leu Cys Phe Leu
115 120 125
Leu Gly Pro Thr Gin Leu Thr Gin Arg Leu Pro Val Ser Arg Gin Glu
130 135 140
Cys Pro Arg Gin Glu Gin Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ile Ser Ser Arg Asn Phe Alá Thr Met Met Asn Phe Val Arg Alá
165 170 175
Val Ile Ser Gin Phe Gin Arg Pro Ser Thr Gin Phe Ser Leu Met Gin
180 185 190
Phe Ser Asn Lys Phe Gin Thr His Phe Thr Phe Glu Glu Phe Arg Arg
195 200 205
Thr Ser Asn Pro Leu Ser Leu Leu Alá Ser Val His Gin Leu Gin Gly
210 215 220
Phe Thr Tyr Thr Alá Thr Alá Ile Gin Asn Val Val His Arg Leu Phe
225 230 235 240
His Alá Ser Tyr Gly Alá Arg Arg Asp Alá Ile Lys Ile Leu Ile Val
245 250 255
Ile Thr Asp Gly Lys Lys Glu Gly Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Asp Val
260 265 270
Ile Pro Met Alá Asp Alá Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val
275 280 285
Gly Leu Alá Phe Gin Asn Arg Asn Ser Trp Lys Glu Leu Asn Asp Ile
290 295 300
Alá Ser Lys Pro Ser Gin Glu His Ile Phe Lys Val Glu Asp Phe Asp
305 310 315 320
Alá Leu Lys Asp Ile Gin Asn Gin Leu Lys Glu Lys Ile Phe Alá Ile
325 330 335
HU 223 977 Β1
Glu Gly Thr Glu Thr Ile 340
Gin Glu Gly Phe Ser Alá 355
Alá Val Gly Ser Phe Thr 370
Asn Met Ser Pro Thr Phe 385 390
Arg Asp Ser Tyr Leu Gly 405
Val Gin Ser Leu Val Leu 420
Alá Val Ile Phe Ile Gin 435
Val Ile Gly Thr Gin Ile 450
Val Asp Val Asp Thr Asp 465 470
Pro His Tyr Tyr Glu Gin 485
Leu Pro Arg Gly Trp Arg 500
Glu Gin Gly His Pro Trp 515
Gly Asp Val Asn Gly Asp 530
Gly Glu Glu Glu Asn Arg 545 550
Gly Pro Ser Ile Ser Pro 565
Leu Ser Ser Arg Leu Gin 580
Asp Leu Thr Gin Asp Gly 595
Gin Val Leu Leu Leu Arg 610
Met Gin Phe Ile Pro Alá 625 630
Glu Gin Val Val Ser Glu 645
Ser Ser
Val Phe 360
Trp Ser 375
Ile Asn
Tyr Ser
Gly Alá
Val Ser 440
Gly Ser 455
Gly Ser
Thr Arg
Arg Trp
Gly Arg 520
Lys Leu 535
Gly Alá
Ser Ser Phe Glu 345
Thr Pro Asp Gly
Gly Gly Alá Phe 380
Met Ser Gin Glu 395
Thr Glu Leu Alá 410
Pro Arg Tyr Gin 425
Arg Gin Trp Arg
Tyr Phe Gly Alá 460
Thr Asp Leu Val 475
Gly Gly Gin Val 490
Trp Cys Asp Alá 505
Phe Gly Alá Alá
Ser His
Tyr Phe
Leu Val 600
Thr Arg 615
Glu Ile
Gin Thr
Thr Asp Val Val 540
Val Tyr Leu Phe 555
Ser Gin Arg Ile 570
Gly Gin Alá Leu 585
Asp Leu Alá Val
Pro Val Leu Trp 620
Pro Arg Ser Alá 635
Leu Val Gin Ser 650
Leu Glu Met Alá 350
Pro Val Leu Gly 365
Leu Tyr Pro Pro
Asn Val Asp Met 400
Leu Trp Lys Gly 415
His Ile Gly Lys 430
Met Lys Alá Glu 445
Ser Leu Cys Ser
Leu Ile Gly Alá 480
Ser Val Cys Pro 495
Val Leu Tyr Gly 510
Leu Thr Val Leu 525
Ile Gly Alá Pro
His Gly Val Leu 560
Alá Gly Ser Gin 575
Ser Gly Gly Gin 590
Gly Alá Arg Gly 605
Val Gly Val Ser
Phe Glu Cys Arg 640
Asn Ile Cys Leu
655
HU 223 977 Β1
Tyr Ile Asp Lys Arg 660
Ser Ser Val Thr Leu 675
Arg Alá Ile Phe Gin 690
Val Leu Gly Leu Lys 705
Ser Cys Val Glu Asp 725
Thr Leu Val Gly Lys 740
Leu Alá Alá Leu Alá 755
Lys Asn Cys Gly Alá 770
Phe Ser Phe Pro Gly 785
Leu Asn Alá Glu Val 805
Thr Thr Ile Thr Phe 820
Alá Glu Gly Gin Lys 835
Cys Ser Alá Pro Val 850
Ile Asn His Leu Ile 865
Thr Phe Asp Val Ser 885
Ile Alá Asn Val Ser 900
Ile Phe Gin Leu Glu 915
Ser Ser His Glu Gin 930
Glu Lys Glu Ser His 945
Gly Gin Arg Asp Leu 965
Ser Lys Asn Leu Leu Gly 665
Asp Leu Alá Leu Alá Pro 680
Glu Thr Lys Asn Arg Ser 695
Alá His Cys Glu Asn Phe 710 715
Ser Val Ile Pro Ile Ile 730
Pro Leu Leu Alá Phe Arg 745
Gin Arg Tyr Phe Thr Alá 760
Asp His Ile Cys Gin Asp 775
Leu Lys Ser Leu Leu Val 790 795
Met Val Trp Asn Asp Gly 810
Ser His Pro Alá Gly Leu 825
Gin Gly Gin Leu Arg Ser 840
Gly Ser Gin Gly Thr Trp 855
Phe Arg Gly Gly Alá Gin 870 875
Pro Lys Alá Val Gly Leu 890
Ser Glu Asn Asn Ile Pro 905
Leu Pro Val Lys Tyr Alá 92 0
Phe Thr Lys Tyr Leu Asn 935
Val Alá Met His Arg Tyr 950 955
Pro Val Ser Ile Asn Phe 970
Ser Arg Asp Leu Gin 670
Gly Arg Leu Ser Pro 685
Leu Ser Arg Val Arg 700
Asn Leu Leu Leu Pro 720
Leu Arg Leu Asn Phe 735
Asn Leu Arg Pro Met 750
Ser Leu Pro Phe Glu 765
Asn Leu Gly Ile Ser 780
Gly Ser Asn Leu Glu 800
Glu Asp Ser Tyr Gly 815
Ser Tyr Arg Tyr Val 830
Leu His Leu Thr Cys 845
Ser Thr Ser Cys Arg 860
Ile Thr Phe Leu Alá 880
Asp Arg Leu Leu Leu 895
Arg Thr Ser Lys Thr 910
Val Tyr Ile Val Val 925
Phe Ser Glu Ser Glu 940
Gin Val Asn Asn Leu 960
Trp Val Pro Val Glu
975
HU 223 977 Β1
Leu Asn Gin Glu 980 Ala Val Trp Met Asp 985 Val Glu Val Ser His 990 Pro Gin
Asn Pro Ser 995 Leu Arg Cys Ser Ser 100C Glu 1 Lys Ile Ala Pro 1005 Pro í Ala Ser
Asp Phe 101C Leu Ala His Ile Gin 1015 Lys 1 Asn Pro Val Leu 102C Asp Cys Ser Ile
Ala 1025 Gly Cys Leu Arg Phe 1030 Arg 1 Cys Asp Val Pro 1035 Ser 1 Phe Ser Val Gin 1040
Glu Glu Leu Asp Phe 1045 Thr í Leu Lys Gly Asn 1050 Leu 1 Ser Phe Gly Trp 1055 Val 1
Arg Gin Ile Leu 106C Gin 1 Lys Lys Val Ser 1065 Val ► Val Ser Val Ala 1070 Glu 1 Ile
Ile Phe Asp 1075 Thr Ser Val Tyr Ser 108C Gin 1 Leu Pro Gly Gin 1085 Glu 1 Ala Phe
Met Arg 1090 Ala 1 Gin Thr Ile Thr 1095 Val 1 Leu Glu Lys Tyr 1100 Lys 1 Val His Asn
Pro 1105 Ile 1 Pro Leu Ile Val 1110 Gly Ser Ser Ile Gly 1115 Gly Leu Leu Leu Leu 1120
Ala Leu Ile Thr Ala 1125 Val Leu Tyr Lys Val 1130 Gly 1 Phe Phe Lys Arg 1135 Gin
Tyr Lys Glu Met 1140 Met Glu Glu Ala Asn 1145 Gly Gin Ile Ala Pro 1150 Glu Asn
Gly Thr Gin Thr Pro Ser Pro Pro Ser Glu Lys
1155 1160
5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 12 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gin 15 10
6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 35 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia
TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA
HU 223 977 Β1
7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia
TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36
8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia
TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36
9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia
TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC 23
10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia
TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20
11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia
TGRAANACCA TNGGYTC 17
12. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia
TTGGAAGACC ATNGGYTC 18
13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia
ATTAACCCTC ACTAAAG 17
14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia
AATACGACTC ACTATAG 17
15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 11 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia
Val Phe Gin Glu Xaa Gly Alá Gly Phe Gly Gin 15 10
HU 223 977 Β1
16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 14 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia
Leu Tyr Asp Xaa Val Alá Alá Thr Gly Leu Xaa Gin Pro Ile 15 10
17. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 12 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 17. számú szekvencia
Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gin Alá Glu 15 10
18. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 10 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 18. szekvencia
Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa 15 10
19. számú szekvenciavázlat (í) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 14 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 19. számú szekvencia
Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gin Glu Asn Val Asp 15 10
20. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 20. számú szekvencia
Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Glu Val Val Alá Val Xaa Gin Thr Gly 15 10 15
Arg
21. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 9 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 21. számú szekvencia
Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Alá 1 5
22. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 7 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 22. számú szekvencia
Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu 1 5
23. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 23. számú szekvencia
RAANCCYTCY TGRAAACTYT C
24. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1006 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása; 24. számú szekvencia
TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCAAGAGGA TGGAGCTGGC TTTGGACAGA 60
GCGTGGCCCA GCTTGGCGGA TCTAGACTCG TGGTGGGAGC CCCCCTGGAG GTGGTGGCGG 120
TCAACCAAAC AGGAAGGTTG TATGACTGTG TGGCTGCCAC TGGCCTTGTC AACCCATACC 180
CCTGCACACA CCCCCAGATG CTGTGAACAT GTCCCTGGGT CTGTCCCTGT CAGCCGCCGC 240
CAGTCGCCCC TGGCTGCTGG CCTGTGGCCC AACCATGCAC AGAGCCTGTG GGGAGAATAT 300
GTATGCAGAA GGCTTTTGCC TCCTGTTGGA CTCCCATCTG CAGACCATTT GGACAGTACC 360
TGCTGCCCTA CCAGAGTGTC CAAGTCAAGA GATGGACATT GTCTTCCTGA TTGATGGTTC 420
TGGCAGTATG AGCAAAGTGA CTTTAAACAA ATGAAGGATT TGTGAGAGCT GTGATGGGAC 480
AGTTTGAGGG CACCCAAACC CTGTTCTCAC TGATACAGTA TCCCACCTCC CTGAAGATCC 540
ACTTCACCTT CACGCAATTC CAGAGCAGCT GGAACCCTCT GAGCCTGGTG GATCCCATTG 600
TCCAACTGGA CGGCCTGACA TATACAGCCA CGGGCATCCG GAAAGTGGTG GAGGAACTGT 660
TTCATAGTAA GAATGGGGCC CGTAAAAGTG CCAAGAAGAT CCTCATTGTC ATCACAGATG 720
GCAAAAATAC AAAGACCCCC TGGAGTACGA GGACGTATCC CCAGGCAGAG AGAGCGGATC 780
ATCCGCTATG CCATTGGGGT GGGAGATGCT TTCTGGAAAC CCAGTGCCAA GCAGGAGCTG 840
GACAACATTG GCTCAGAGCC GGCTCAGGAC CATGTGTTCA GGGTGGACAA CTTTGCAGCA 900
CTCAGCAGCA TCCAGGAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTTTG CACTCGAAGG AACCCAGTCG 960
ACGACAAGTA GCTCTTTCCA ACATGAGATG TTCCAAGAAG GGTTCA 1006
25. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 25. számú szekvencia
GTNTTYCARG ARGAYGG 17
26. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 26. számú szekvencia
CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20
27. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 42 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltipus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 27. számú szekvencia
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG 42
28. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 42 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 28. számú szekvencia
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG 42
29. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus; nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 29. számú szekvencia
AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36
30. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 30. számú szekvencia
TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20
HU 223 977 Β1
31. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 31. számú szekvencia
GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36
32. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 32. számú szekvencia
ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36
33. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 37 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 33. számú szekvencia
ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37
34. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 34. számú szekvencia
TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24
35. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 35. számú szekvencia
TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24
36. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3528 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(I) Név/kulcs: CDS (J) Lokalizáció: 1...3456 (xi) A szekvencia leírása: 36. számú szekvencia
GGC Gly 1 TGG Trp GCC Alá CTG Leu GCT Alá 5 TCC Ser TGT Cys CAT His GGG Gly TCT Ser 10 AAC Asn CTG Leu GAT Asp GTG Val GAG Glu 15 GAA Glu 48
CCC ATC GTG TTC AGA GAG GAT GCA GCC AGC TTT GGA CAG ACT GTG GTG 96
Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Alá Alá Ser Phe Gly Gin Thr Val Val
20 25 30
CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG 144
Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Glu Alá Val
35 40 45
GCA GTC AAC CAA ACA GGA CGG TTG TAT GAC TGT GCA CCT GCC ACT GGC 192
Alá Val Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys Alá Pro Alá Thr Gly
50 55 60
ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG 240
Met Cys Gin Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu Glu Alá Val Asn Met
65 70 75 80
TCC CTG GGC CTG TCT CTG GTG ACT GCC ACC AAT AAC GCC CAG TTG CTG 288
Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Alá Thr Asn Asn Alá Gin Leu Leu
85 90 95
GCT TGT GGT CCA ACT GCA CAG AGA GCT TGT GTG AAG AAC ATG TAT GCG 336
Alá Cys Gly Pro Thr Alá Gin Arg Alá Cys Val Lys Asn Met Tyr Alá
100 105 110
AAA GGT TCC TGC CTC CTT CTC GGC TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA 384
Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe Ile Gin Alá
115 120 125
GTC CCT GCC TCC ATG CCA GAG TGT CCA AGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT 432
Val Pro Alá Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gin Glu Met Asp Ile Alá
130 135 140
TTC CTG ATT GAT GGT TCT GGC AGC ATT AAC CAA AGG GAC TTT GCC CAG 480
Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gin Arg Asp Phe Alá Gin
145 150 155 160
HU 223 977 Β1
ATG Met AAG Lys GAC Asp TTT Phe GTC Val 165 AAA Lys GCT Alá TTG ATG GGA GAG TTT Phe GCG Alá AGC Ser ACC Thr 175 AGC Ser 528
Leu Met Gly 170 Glu
ACC TTG TTC TCC CTG ATG CAA TAC TCG AAC ATC CTG AAG ACC CAT TTT 576
Thr Leu Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe
180 185 190
ACC TTC ACT GAA TTC AAG AAC ATC CTG GAC CCT CAG AGC CTG GTG GAT 624
Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro Gin Ser Leu Val Asp
195 200 205
CCC ATT GTC CAG CTG CAA GGC CTG ACC TAC ACA GCC ACA GGC ATC CGG 672
Pro Ile Val Gin Leu Gin Gly Leu Thr Tyr Thr Alá Thr Gly Ile Arg
210 215 220
ACA GTG ATG GAA GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGG TCC CGT AAA AGT 720
Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser
225 230 235 240
GCC AAG AAG ATC CTC CTT GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TAC AGA GAC 768
Alá Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly Gin Lys Tyr Arg Asp
245 250 255
CCC CTG GAG TAT AGT GAT GTC ATT CCC GCC GCA GAC AAA GCT GGC ATC 816
Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Alá Alá Asp Lys Alá Gly Ile
260 265 270
ATT CGT TAT GCT ATT GGG GTG GGA GAT GCC TTC CAG GAG CCC ACT GCC 864
Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val Gly Asp Alá Phe Gin Glu Pro Thr Alá
275 280 285
CTG AAG GAG CTG AAC ACC ATT GGC TCA GCT CCC CCA CAG GAC CAC GTG 912
Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Alá Pro Pro Gin Asp His Val
290 295 300
TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC ATC CAG AGG CAA CTT 960
Phe Lys Val Gly Asn Phe Alá Alá Leu Arg Ser Ile Gin Arg Gin Leu
305 310 315 320
CAG GAG AAA ATC TTC GCC ATT GAG GGA ACT CAA TCA AGG TCA AGT AGT 1008
Gin Glu Lys Ile Phe Alá Ile Glu Gly Thr Gin Ser Arg Ser Ser Ser
325 330 335
TCC TTT CAG CAC GAG ATG TCA CAA GAA GGT TTC AGT TCA GCT CTC ACA 1056
Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Alá Leu Thr
340 345 350
TCG GAT GGA CCC GTT CTG GGG GCC GYG GGA AGC TTC AGC TGG TCC GGA 1104
Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Alá Xaa Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly
355 360 365
GGT GCC TTC TTA TAT CCC CCA AAT ACG AGA CCC ACC TTT ATC AAC ATG 1152
Gly Alá Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met
370 375 380
TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGA GAC TCC TAC CTG GGT TAC TCC ACC 1200
Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr
385 390 395 400
HU 223 977 Β1
GCA Alá GTG Val GCC Alá TTT Phe TGG Trp 405 AAG Lys GGG Gly GTT Val CAC His AGC Ser 410 CTG Leu ATC Ile CTG Leu GGG Gly GCC Alá 415 CCG Pro 1248
CGT CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA GCC AGG 1296
Arg His Gin His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe Thr Gin Glu Alá Arg
420 425 430
CAT TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC 1344
His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr
435 440 445
TTC GGG GCC TCT CTC TGT TCT GTG GAC GTG GAT AGA GAT GGC AGC ACY 1392
Phe Gly Alá Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa
450 455 460
GAC CTG GTC CTG ATC GGA GCC CCC CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG 1440
Asp Leu Val Leu Ile Gly Alá Pro His Tyr Tyr Glu Gin Thr Arg Gly
465 470 475 480
GGG CAG GTC TCA GTG TKC CCC GTG CCC GGT GTG AGG GGC AGG TGG CAG 1488
Gly Gin Val Ser Val Xaa Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gin
485 490 495
TGT GAG GCC ACC CTC CAC GGG GAG CAG GRC CAT CCT TGG GGC CGC TTT 1536
Cys Glu Alá Thr Leu His Gly Glu Gin Xaa His Pro Trp Gly Arg Phe
500 505 510
GGG GTG GCT CTG ACA GTG CTG GGG GAC GTA AAC GGG GAC AAT CTG GCA 1584
Gly Val Alá Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Alá
515 520 525
GAC GTG GCT ATT GGT GCC CCT GGA GAG GAG GAG AGC AGA GGT GCT GTC 1632
Asp Val Alá Ile Gly Alá Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Alá Val
530 535 540
TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC ATG CCC TCA CCC AGC 1680
Tyr Ile Phe His Gly Alá Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser
545 550 555 560
CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC TCC CTG AGA CTG CAG TAT TTT GGG 1728
Gin Arg Val Thr Gly Ser Gin Leu Ser Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly
565 570 575
CAG TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAC CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC 1776
Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin Asp Leu Thr Gin Asp Gly Leu Val Asp
580 585 590
CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC GTA CTG CTG CTC AGG AGT CTG CCT 1824
Leu Alá Val Gly Alá Gin Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro
595 600 605
CTG CTG AAA GTG GAG CTC TCC ATA AGA TTC GCC CCC ATG GAG GTG GCA 1872
Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Alá Pro Met Glu Val Alá
610 615 620
AAG GCT GTG TAC CAG TGC TGG GAA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT 1920
Lys Alá Val Tyr Gin Cys Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Alá
625 630 635 640
HU 223 977 Β1
GGA Gly GAG Glu GCC ACT GTC Val 645 TGT Cys CTC ACT GTC Val CAC His 650 AAA Lys GGC Gly TCA Ser CCT Pro GAC Asp 655 CTG Leu 1968
Alá Thr Leu Thr
TTA GGT AAT GTC CAA GGC TCT GTC AGG TAT GAT CTG GCG TTA GAT CCG 2016
Leu Gly Asn Val Gin Gly Ser Val Arg Tyr Asp Leu Alá Leu Asp Pro
660 665 670
GGC CGC CTG ATT TCT CGT GCC ATT TTT GAT GAG ACT AAG AAC TGC ACT 2064
Gly Arg Leu Ile Ser Arg Alá Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr
675 680 685
TTG ACG GGA AGG AAG ACT CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA GTG 2112
Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val
690 695 700
AAG CTG CTT TTG CCG GAC TGT GTG GAA GAT GCA GTG AGC CCT ATC ATC 2160
Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Alá Val Ser Pro Ile Ile
705 710 715 720
CTG CGC CTC AAC TTT TCC CTG GTG AGA GAC TCT GCT TCA CCC AGG AAC 2208
Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser Alá Ser Pro Arg Asn
725 730 735
CTG CAT CCT GTG CTG GCT GTG GGC TCA CAA GAC CAC ATA ACT GCT TCT 2256
Leu His Pro Val Leu Alá Val Gly Ser Gin Asp His Ile Thr Alá Ser
740 745 750
CTG CCG TTT GAG AAG AAC TGT AAG CAA GAA CTC CTG TGT GAG GGG GAC 2304
Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gin Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp
755 760 765
CTG GGC ATC AGC TTT AAC TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GTG GTG GGA 2352
Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gin Val Leu Val Val Gly
770 775 780
GGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTC ACT GTG TGG AAT GAG GGT GAG 2400
Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu
785 790 795 800
GAC AGC TAT GGA ACT TTA GTC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GGG CTA TCT 2448
Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Alá Gly Leu Ser
805 810 815
TAC CGA CGG GTA ACA GGG ACT CAG CAA CCT CAT CAG TAC CCA CTA CGC 2496
Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gin Gin Pro His Gin Tyr Pro Leu Arg
820 825 830
TTG GCC TGT GAG GCT GAG CCC GCT GCC CAG GAG GAC CTG AGG AGC AGC 2544
Leu Alá Cys Glu Alá Glu Pro Alá Alá Gin Glu Asp Leu Arg Ser Ser
835 840 845
AGC TGT AGC ATT AAT CAC CCC ATC TTC CGA GAA GGT GCA AAG ACC ACC 2592
Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Alá Lys Thr Thr
850 855 860
TTC ATG ATC ACA TTC GAT GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTA GGA GAC AGG 2640
Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Alá Phe Leu Gly Asp Arg
865 870 875 880
HU 223 977 Β1
TTG CTT CTG AGG GCC AAA GCC AGC AGT GAG
Leu Leu Leu Arg Alá 885 Lys Alá Ser Ser Glu 890
AAC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTC CCA
Asn Lys Thr Alá 900 Phe Gin Leu Glu Leu 905 Pro
ACC CTG ATC AGT AGG CAA GAA GAT TCC ACC
Thr Leu Ile 915 Ser Arg Gin Glu Asp 920 Ser Thr
TCT TCC CAC GGG GGG AGA AGG CAA GAA GCC
Ser Ser 930 His Gly Gly Arg Arg 935 Gin Glu Alá
AAT AAC CTG AGT CCA CTG AAG CTG GCC GTC
Asn 945 Asn Leu Ser Pro Leu 950 Lys Leu Alá Val
CCT GTC CTT CTG AAC GGT GTG GCT GTG TGG
Pro Val Leu Leu Asn 965 Gly Val Alá Val Trp 970
CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGC GTG TCC CAG
Pro Alá Gin Gly 980 Val Ser Cys Val Ser 985 Gin
CCC GAC TTT CTG ACC CAG ATT CAG AGA CGT
Pro Asp Phe 995 Leu Thr Gin Ile Gin Arg 1000 Arg
ATT GCT GAC TGC CTG CAC TCC CGC TGT GAC
Ile Alá Asp 1010 Cys Leu His Ser 1015 Arg Cys Asp
CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC
Gin Asp 1025 Glu Leu Asp Phe Ile 1030 Leu Arg Gly
GTC AGT CAG ACA TTG CAG GAA AAG GTG TTG
Val Ser Gin Thr Leu Gin 1045 Glu Lys Val Leu 1050
ATC ACT TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG
Ile Thr Phe Asp Thr 1060 Ser Val Tyr Ser 1065 Gin
TTT CTG AGA GCC CAG GTG GAG ACA ACG TTA
Phe Leu Arg Alá 1075 Gin Val Glu Thr 108C Thr 1 Leu
GAG CCC ATC TTC CTC GTG GCG GGC AGC TCG
Glu Pro 109C Ile 1 Phe Leu Val Alá 1095 Gly Ser Ser
CTG GCT CTC ATC ACA GTG GTA CTG TAC AAG
Leu Alá Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys
1105 1110
AAT AAT AAG CCT GAT ACC 2688
Asn Asn Lys Pro Asp Thr 895
GTG AAG TAC ACC GTC TAT 2736
Val Lys Tyr Thr Val Tyr 910
AAC CAT GTC AAC TTT TCA 2784
Asn His Val Asn Phe Ser 925
GCA CAT CGC TAT CGT GTG 2832
Alá His Arg Tyr Arg Val 940
AGA GTT AAC TTC TGG GTC 2880
Arg Val Asn Phe Trp Val 955 960
GAC GTG ACT CTG AGC AGC 2928
Asp Val Thr Leu Ser Ser 975
ATG AAA CCT CCT CAG AAT 2 97 6
Met Lys Pro Pro Gin Asn 990
TCT GTG CTG GAC TGC TCC 3024
Ser Val Leu Asp Cys Ser 1005
ATC CCC TCC TTG GAC ATC 3072
Ile Pro Ser Leu Asp Ile 1020
AAC CTC AGC TTC GGC TGG 3120
Asn Leu Ser Phe Gly Trp 1035 1040
CTT GTG AGT GAG GCT GAA 3168
Leu Val Ser Glu Alá Glu 1055
CTG CCA GGA CAG GAG GCA 3216
Leu Pro Gly Gin Glu Alá 1070
GAA GAA TAC GTG GTC TAT 3264
Glu Glu Tyr Val Val Tyr 1085
GTG GGA GGT CTG CTG TTA 3312
Val Gly Gly Leu Leu Leu 1100
CTT GGC TYC TYC AAA CGT 3360
Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg 1115 1120
HU 223 977 Β1
CAG TAC AAA GAA ATG CTG GAC GGC AAG GCT GCA
Gin Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Alá Alá
1125 1130
GGC CAG GCA GAT TTC GGC TGT GAG ACT CCT CCA
Gly Gin Alá Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro
1140 1145
CTCTCCTGCC TATCTCTGNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA
CGAGT
GAT CCT GTC ACA GCC 3408
Asp Pro Val Thr Alá
1135
TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA 3463
Tyr Leu Val Ser
1150
TGAGTCTACT GGCATGGGAA 3523
3528
37. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1151 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 37. számú szekvencia
Gly Trp Alá Leu Alá Ser Cys His Gly Ser Asn 15 10
Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Alá Alá Ser Phe 20 25
Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Alá 35 40
Alá Val Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys 50 55
Met Cys Gin Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu 65 70 75
Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Alá Thr Asn 85 90
Alá Cys Gly Pro Thr Alá Gin Arg Alá Cys Val 100 105
Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu 115 120
Val Pro Alá Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gin 130 135
Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gin 145 150 155
Met Lys Asp Phe Val Lys Alá Leu Met Gly Glu 165 170
Thr Leu Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser Asn Ile 180 185
Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro 195 200
Leu Asp Val Glu Glu 15
Gly Gin Thr Val Val 30
Pro Leu Glu Alá Val 45
Alá Pro Alá Thr Gly 60
Glu Alá Val Asn Met 80
Asn Alá Gin Leu Leu 95
Lys Asn Met Tyr Alá 110
Gin Phe Ile Gin Alá 125
Glu Met Asp Ile Alá 140
Arg Asp Phe Alá Gin 160
Phe Alá Ser Thr Ser 175
Leu Lys Thr His Phe 190
Gin Ser Leu Val Asp 205
HU 223 977 Β1
Pro Ile Val Gin 210
Thr Val Met Glu 225
Alá Lys Lys Ile
Pro Leu Glu Tyr 260
Ile Arg Tyr Alá 275
Leu Lys Glu Leu 290
Phe Lys Val Gly 305
Gin Glu Lys Ile
Leu Gin Gly 215
Glu Leu Phe 230
Leu Leu Val 245
Ser Asp Val
Ile Gly Val
Ser Phe Gin His 340
Ser Asp Gly Pro 355
Gly Alá Phe Leu 370
Ser Gin Glu Asn 385
Alá Val Alá Phe
Asn Thr Ile 295
Asn Phe Alá 310
Phe Alá Ile 325
Glu Met Ser
Val Leu Gly
Arg His Gin His 420
His Trp Arg Pro 435
Phe Gly Alá Ser 450
Asp Leu Val Leu 465
Gly Gin Val Ser
Tyr Pro Pro 375
Val Asp Met 390
Trp Lys Gly 405
Thr Gly Lys
Lys Ser Glu
Cys Glu Alá Thr 500
Gly Val Alá Leu 515
Leu Cys Ser 455
Ile Gly Alá 470
Val Xaa Pro 485
Leu His Gly
Thr Val Leu
Leu
His
Ile
Ile
Gly
280
Gly
Alá
Glu
Gin
Alá
360
Asn
Arg
Val
Val
Val
440
Val
Pro
Val
Glu
Gly
520
Thr Tyr Thr Alá 220
Ser Lys Asn Gly 235
Thr Asp Gly Gin 250
Pro Alá Alá Asp 265
Asp Alá Phe Gin
Ser Alá Pro Pro 300
Leu Arg Ser Ile 315
Gly Thr Gin Ser 330
Glu Gly Phe Ser 345
Xaa Gly Ser Phe
Thr Arg Pro Thr 380
Asp Ser Tyr Leu 395
His Ser Leu Ile 410
Val Ile Phe Thr 425
Arg Gly Thr Gin
Asp Val Asp Arg 460
His Tyr Tyr Glu 475
Pro Gly Val Arg 490
Gin Xaa His Pro 505
Asp Val Asn Gly
Thr Gly Ile Arg
Ser Arg Lys Ser 240
Lys Tyr Arg Asp 255
Lys Alá Gly Ile 270
Glu Pro Thr Alá 285
Gin Asp His Val
Gin Arg Gin Leu 320
Arg Ser Ser Ser 335
Ser Alá Leu Thr 350
Ser Trp Ser Gly 365
Phe Ile Asn Met
Gly Tyr Ser Thr 400
Leu Gly Alá Pro 415
Gin Glu Alá Arg 430
Ile Gly Ser Tyr 445
Asp Gly Ser Xaa
Gin Thr Arg Gly 480
Gly Arg Trp Gin 495
Trp Gly Arg Phe 510
Asp Asn Leu Alá 525
HU 223 977 Β1
Asp Val Alá Ile Gly 530
Tyr Ile Phe His Gly 545
Gin Arg Val Thr Gly 565
Gin Ser Leu Ser Gly 580
Leu Alá Val Gly Alá 595
Leu Leu Lys Val Glu 610
Lys Alá Val Tyr Gin 625
Gly Glu Alá Thr Val 645
Leu Gly Asn Val Gin 660
Gly Arg Leu Ile Ser 675
Leu Thr Gly Arg Lys 690
Lys Leu Leu Leu Pro 705
Leu Arg Leu Asn Phe 725
Leu His Pro Val Leu 740
Leu Pro Phe Glu Lys 755
Leu Gly Ile Ser Phe 770
Gly Ser Pro Glu Leu 785
Asp Ser Tyr Gly Thr 805
Tyr Arg Arg Val Thr 820
Leu Alá Cys Glu Alá 835
Alá Pro Gly 535
Alá Ser Arg 550
Ser Gin Leu
Gly Gin Asp
Gin Gly His 600
Leu Ser Ile 615
Cys Trp Glu 630
Cys Leu Thr
Gly Ser Val
Arg Alá Ile 680
Thr Leu Gly 695
Asp Cys Val 710
Ser Leu Val
Alá Val Gly
Asn Cys Lys 760
Asn Phe Ser 775
Thr Val Thr 790
Leu Val Lys
Gly Thr Gin
Glu Pro Alá 840
Glu
Leu
Ser
Leu
585
Val
Arg
Arg
Val
Arg
665
Phe
Leu
Glu
Arg
Ser
745
Gin
Gly
Val
Phe
Gin
825
Alá
Glu Glu Ser Arg Gly Alá Val 540
Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser 555 560
Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly 570 575
Thr Gin Asp Gly Leu Val Asp 590
Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro 605
Phe Alá Pro Met Glu Val Alá 620
Thr Pro Thr Val Leu Glu Alá 635 640
His Lys Gly Ser Pro Asp Leu 650 655
Tyr Asp Leu Alá Leu Asp Pro 670
Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr 685
Gly Asp His Cys Glu Thr Val 700
Asp Alá Val Ser Pro Ile Ile 715 720
Asp Ser Alá Ser Pro Arg Asn 730 735
Gin Asp His Ile Thr Alá Ser 750
Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp 765
Leu Gin Val Leu Val Val Gly 780
Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu 795 800
Tyr Tyr Pro Alá Gly Leu Ser 810 815
Pro His Gin Tyr Pro Leu Arg 830
Gin Glu Asp Leu Arg Ser Ser 845
HU 223 977 Β1
Ser Cys Ser Ile Asn His Pro 855 Ile Phe Arg Glu Gly 860 Alá Lys Thr Thr
850
Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Alá Phe Leu Gly Asp Arg
865 870 875 880
Leu Leu Leu Arg Alá Lys Alá Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr
885 890 895
Asn Lys Thr Alá Phe Gin Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr
900 905 910
Thr Leu Ile Ser Arg Gin Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser
915 920 925
Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gin Glu Alá Alá His Arg Tyr Arg Val
930 935 940
Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Alá Val Arg Val Asn Phe Trp Val
945 950 955 960
Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Alá Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser
965 970 975
Pro Alá Gin Gly Val Ser Cys Val Ser Gin Met Lys Pro Pro Gin Asn
980 985 990
Pro Asp Phe Leu Thr Gin Ile Gin Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser
995 1000 1005
Ile Alá Asp Cys Leu His Ser Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile
1010 1015 1020
Gin Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp
1025 1030 1035 1040
Val Ser Gin Thr Leu Gin Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Alá Glu
1045 1050 1055
Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin Glu Alá
1060 1065 1070
Phe Leu Arg Alá Gin Val Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr
1075 1080 1085
Glu Pro Ile Phe Leu Val Alá Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu
1090 1095 1100
Leu Alá Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg
1105 1110 1115 1120
Gin Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Alá Alá Asp Pro Val Thr Alá
1125 1130 1135
Gly Gin Alá Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser
1140 1145 1150
HU 223 977 Β1
38. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 38. számú szekvencia
GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G 21
39. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 39. számú szekvencia
GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23
40. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 40. számú szekvencia
TGTAAAACGA CGGCCAGT 18
41. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 41. számú szekvencia
GGAAACAGCT ATGACCATG 1 9
42. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus; nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 42. számú szekvencia
GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG 22
43. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 25 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 43. számú szekvencia
GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25
44. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 38 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 44. számú szekvencia
CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38
45. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3519 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 52...3519 (xi) A szekvencia leírása: 45. számú szekvencia
GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC 57
Met Val
CGT Arg GGA Gly GTT Val 5 GTG Val ATC Ile CTC Leu CTG Leu TGT Cys 10 GGC Gly TGG Trp GCC Alá CTG Leu GCT Alá 15 TCC Ser TGT Cys CAT His 105
GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG GAT GCA 153
Gly Ser 20 Asn Leu Asp Val Glu 25 Lys Pro Val Val Phe 30 Lys Glu Asp Alá
GCC AGC TTC GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG 201
Alá Ser Phe Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
40 45 50
HU 223 977 Β1
GTG Val GGA Gly GCC Alá CCT Pro CTG Leu 55 GAG GCG GTG Val GCA Alá GTC AAC CAA ACA GGA CAG TCG Ser 249
Glu Alá Val 60 Asn Gin Thr Gly Gin 65
TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA CTG CAC 297
Ser Asp Cys Pro Pro Alá Thr Gly Val Cys Gin Pro Ile Leu Leu His
70 75 80
ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG GTG GCT 345
Ile Pro Leu Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Alá
85 90 95
GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA CAG AGA 393
Asp Thr Asn Asn Ser Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Alá Gin Arg
100 105 110
GCT TGT GCA AAG AAC ATG TAT GCA AAA GGT TCC TGC CTC CTT CTG GGC 441
Alá Cys Alá Lys Asn Met Tyr Alá Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
115 120 125 130
TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC ATG CCA GAG TGT 489
Ser Ser Leu Gin Phe Ile Gin Alá Ile Pro Alá Thr Met Pro Glu Cys
135 140 145
CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGC TCC GGC AGC 537
Pro Gly Gin Glu Met Asp Ile Alá Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
150 155 160
ATT GAT CAA AGT GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA GCT TTG 585
Ile Asp Gin Ser Asp Phe Thr Gin Met Lys Asp Phe Val Lys Alá Leu
165 170 175
ATG GGC CAG TTG GCG AGC ACC AGC ACC TCG TTC TCC CTG ATG CAA TAC 633
Met Gly Gin Leu Alá Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met Gin Tyr
180 185 190
TCA AAC ATC CTG AAG ACT CAT TTT ACC TTC ACG GAA TTC AAG AGC AGC 681
Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys Ser Ser
195 200 205 210
CTG AGC CCT CAG AGC CTG GTG GAT GCC ATC GTC CAG CTC CAA GGC CTG 729
Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Asp Alá Ile Val Gin Leu Gin Gly Leu
215 220 225
ACG TAC ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG ATKA GAG CTA TTT CAT 777
Thr Tyr Thr Alá Ser Gly Ile Gin Lys Val Val Lys Glu Leu Phe His
230 235 240
AGC AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CTA ATT GTC ATC 825
Ser Lys Asn Gly Alá Arg Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
245 250 255
ACA GAT GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CAT GTC ATC 873
Thr Asp Gly Gin Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His Val Ile
260 265 270
CCT GAA GCA GAG AAA GCT GGG ATC ATT CGC TAT GCT ATA GGG GTG GGA 921
Pro Glu Alá Glu Lys Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val Gly
275 280 285 290
HU 223 977 Β1
GAT Asp GCC Ala TTC Phe CGG Arg GAA Glu 295 CCC Pro ACT Thr GCC Ala CTA Leu CAG Gin 300 GAG CTG AAC ACC Thr ATT Ile 305 GGC Gly 969
Glu Leu Asn
TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT GTA GCA 1017
Ser Ala Pro Ser Gin Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe Val Ala
310 315 320
CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC ATT GAA 1065
Leu Arg Ser Ile Gin Arg Gin Ile Gin Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu
325 330 335
GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG TCA CAA 1113
Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin
340 345 350
GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG GGG GCT 1161
Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala
355 360 365 370
GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC TCA AAT 1209
Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Ser Asn
375 380 385
ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT ATG AGG 1257
Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Glu Asp Met Arg
390 395 400
GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG GGG GTC 1305
Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys Gly Val
405 410 415
CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT 1353
His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gin His Thr Gly Lys Val
420 425 430
GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC 1401
Val Ile Phe Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val
435 440 445 450
AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT TCT GTG 1449
Arg Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val
455 460 465
GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA GTC CCC 1497
Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Val Pro
470 475 480
CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC CCC ATG 1545
His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Cys Pro Met
485 490 495
CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT GGG GAG 1593
Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His Gly Glu
500 505 510
CAG GGC CAT CCT TGG GGC CGC TTT GGG GCG GCT CTG ACA GTG CTA GGG 1641
Gin Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly
515 520 525 530
HU 223 977 Β1
GAC Asp GTG AAT GGG GAC Gly Asp 535 AGT Ser CTG GCG GAT Asp GTG Val 540 GCT Alá ATT Ile GGT Gly GCA Alá CCC Pro 545 GGA Gly 1689
Val Asn Leu Alá
GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA 1737
Glu Glu Glu Asn Arg Gly Alá Val Tyr Ile Phe His Gly Alá Ser Arg
550 555 560
CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC 1785
Gin Asp Ile Alá Pro Ser Pro Ser Gin Arg Val Thr Gly Ser Gin Leu
565 570 575
TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT GGG GGT CAG GAC 1833
Phe Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin Asp
580 585 590
CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC 1881
Leu Thr Gin Asp Gly Leu Val Asp Leu Alá Val Gly Alá Gin Gly His
595 600 605 610
GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC TCC ATT 1929
Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile Ser Ile
615 620 625
AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC TGG GGA 1977
Arg Phe Alá Pro Ser Glu Val Alá Lys Thr Val Tyr Gin Cys Trp Gly
630 635 640
AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT CTC ACT 2025
Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Alá Gly Glu Alá Thr Val Cys Leu Thr
645 650 655
GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC TCT GTC 2073
Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gin Ser Ser Val
660 665 670
AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT GCC ATT 2121
Arg Tyr Asp Leu Alá Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg Alá Ile
675 680 685 690
TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT CTG GGG 2169
Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
695 700 705
CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC TGT GTG 2217
Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val
710 715 720
GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC CTG GCA 2265
Glu Asp Alá Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser Leu Alá
725 730 735
GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT GTG GGC 2313
Gly Asp Ser Alá Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Alá Val Gly
740 745 750
TCA CAA GAC CAT GTA ACA GCT TCT TTC CCG TTT GAG AAG AAC TGT GAG 2361
Ser Gin Asp His Val Thr Alá Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn Cys Glu
755 760 765 770
HU 223 977 Β1
2409
GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG
Gly Asn Leu Gly Val 775 Ser Phe Asn Phe Ser 780 Gly Leu Gin Val Leu 785 Glu
GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG
Val Gly Ser Ser 790 Pro Glu Leu Thr Val 795 Thr Val Thr Val Trp 800 Asn Glu
GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACC TTA ATC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GAG
Gly Glu Asp 805 Ser Tyr Gly Thr Leu 810 Ile Lys Phe Tyr Tyr 815 Pro Alá Glu
CTA TCT TAC CGA CGG GTG ACA AGA GCC CAG CAA CCT CAT CCG TAC CCA
Leu Ser 820 Tyr Arg Arg Val Thr 825 Arg Alá Gin Gin Pro 830 His Pro Tyr Pro
CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG CCC ACG GGC CAG GAG AGC CTG AGG
Leu 835 Arg Leu Alá Cys Glu 840 Alá Glu Pro Thr Gly 845 Gin Glu Ser Leu Arg 850
AGC AGC AGC TGT AGC ATC AAT CAC CCC ATC TTC CGA GAA GGT GCC AAG
Ser Ser Ser Cys Ser 855 Ile Asn His Pro Ile 860 Phe Arg Glu Gly Alá 865 Lys
GCC ACC TTC ATG ATC ACA TTT GAT GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTG GGA
Alá Thr Phe Met 870 Ile Thr Phe Asp Val 875 Ser Tyr Lys Alá Phe 880 Leu Gly
GAC AGG TTG CTT CTG AGG GCC AGC GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT
Asp Arg Leu 885 Leu Leu Arg Alá Ser 890 Alá Ser Ser Glu Asn 895 Asn Lys Pro
GAA ACC AGC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTT CCG GTG AAG TAC ACG
Glu Thr 900 Ser Lys Thr Alá Phe 905 Gin Leu Glu Leu Pro 910 Val Lys Tyr Thr
GTC TAT ACC GTG ATC AGT AGG CAG GAA GAT TCT ACC AAG CAT TTC AAC
Val 915 Tyr Thr Val Ile Ser 920 Arg Gin Glu Asp Ser 925 Thr Lys His Phe Asn 930
TTC TCA TCT TCC CAC GGG GAG AGA CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT
Phe Ser Ser Ser His 935 Gly Glu Arg Gin Lys 940 Glu Alá Glu His Arg 945 Tyr
CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC
Arg Val Asn Asn 950 Leu Ser Pro Leu Thr 955 Leu Alá Ile Ser Val 960 Asn Phe
TGG GTC CCC ATC CTT CTG AAT GGT GTG GCC GTG TGG GAT GTG ACT CTG
Trp Val Pro 965 Ile Leu Leu Asn Gly 970 Val Alá Val Trp Asp 975 Val Thr Leu
AGG AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGT GTG TCA CAG AGG GAA CCT CCT
Arg Ser 980 Pro Alá Gin Gly Val 985 Ser Cys Val Ser Gin 990 Arg Glu Pro Pro
CAA CAT TCC GAC CTT CTG ACC CAG ATC CAA GGA CGC TCT GTG CTG GAC
Gin His Ser Asp Leu Leu Thr Gin Ile Gin Gly Arg Ser Val Leu Asp
995 1000 1005 1010
2457
2505
2553
2601
2649
2697
2745
2793
2841
2889
2937
2985
3033
3081
HU 223 977 Β1
TGC Cys GCC ATC GCC Alá GAC TGC Asp Cys 1015 CTG Leu CAC His CTC Leu CGC Arg 102C TGT Cys 1 GAC Asp ATC Ile CCC Pro TCC TTG Ser Leu 1025 3129
Alá Ile
GGC ACC CTG GAT GAG CTT GAC TTC ATT CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC 3177
Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe
1030 1035 1040
GGC TGG ATC AGT CAG ACA TTG CAG AAA AAG GTG TTG CTC CTG AGT GAG 3225
Gly Trp Ile Ser Gin Thr Leu Gin Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu
1045 1050 1055
GCT GAA ATC ACA TTC AAC ACA TCT GTG TAT TCC CAG CTG CCG GGA CAG 3273
Alá Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin
1060 1065 1070
GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG TCA ACG ATG CTA GAA GAA TAC GTG 3321
Glu Alá Phe Leu Arg Alá Gin Val Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val
1075 1080 1085 1090
GTC TAT GAG CCC GTC TTC CTC ATG GTG TTC AGC TCA GTG GGA GGT CTG 3369
Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu
1095 1100 1105
CTG TTA CTG GCT CTC ATC ACT GTG GCG CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC 3417
Leu Leu Leu Alá Leu Ile Thr Val Alá Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe
1110 1115 1120
AAA CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG GAT CTA CCA TCT GCA GAT CCT GAC 3465
Lys Arg Gin Tyr Lys Glu Met Leu Asp Leu Pro Ser Alá Asp Pro Asp
1125 1130 1135
CCA GCC GGC CAG GCA GAT TCC AAC CAT GAG ACT CCT CCA CAT CTC ACG 3513
Pro Alá Gly Gin Alá Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr
1140 1145 1150
TCC TAG 3519
Ser
1155
46. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1155 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 46. számú szekvencia
Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Alá Leu Alá Ser
1 5 10 15
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
20 25 30
Asp Alá Alá Ser Phe Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg
40 45
HU 223 977 Β1
Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Glu 50 55
Gin Ser Ser Asp Cys Pro Pro Alá 65 70
Leu His Ile Pro Leu Glu Alá Val 85
Val Alá Asp Thr Asn Asn Ser Gin 100
Gin Arg Alá Cys Alá Lys Asn Met 115 120
Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe Ile 130 135
Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Asp 145 150
Gly Ser Ile Asp Gin Ser Asp Phe 165
Alá Leu Met Gly Gin Leu Alá Ser 180
Gin Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr 195 200
Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu 210 215
Gly Leu Thr Tyr Thr Alá Ser Gly 225 230
Phe His Ser Lys Asn Gly Alá Arg 245
Val Ile Thr Asp Gly Gin Lys Phe 260
Val Ile Pro Glu Alá Glu Lys Alá 275 280
Val Gly Asp Alá Phe Arg Glu Pro 290 295
Ile Gly Ser Alá Pro Ser Gin Asp 305 310
Val Alá Leu Arg Ser Ile Gin Arg 325
Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser 340
Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Alá 355 360
Alá Val Alá Val Asn Gin Thr Gly 60
Thr Gly Val Cys Gin Pro Ile Leu 75 80
Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu 90 95
Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Alá 105 110
Tyr Alá Lys Gly Ser Cys Leu Leu 125
Gin Alá Ile Pro Alá Thr Met Pro 140
Ile Alá Phe Leu Ile Asp Gly Ser 155 160
Thr Gin Met Lys Asp Phe Val Lys 170 175
Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met 185 190
His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys 205
Val Asp Alá Ile Val Gin Leu Gin 220
Ile Gin Lys Val Val Lys Glu Leu 235 240
Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile 250 255
Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His 265 270
Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly 285
Thr Alá Leu Gin Glu Leu Asn Thr 300
His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe 315 320
Gin Ile Gin Glu Lys Ile Phe Alá 330 335
Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met 345 350
Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu 365
HU 223 977 Β1
Gly Alá Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro 370 375 380
Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Glu Asp
385 390 395 400
Met Arg Asp Alá Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Alá Leu Alá Phe Trp Lys
405 410 415
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Alá Pro Arg His Gin His Thr Gly 420 425 430
Lys Val Val Ile Phe Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser 435 440 445
Glu Val Arg Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Alá Ser Leu Cys 450 455 460
Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly
465 470 475 480
Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Cys
485 490 495
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His 500 505 510
Gly Glu Gin Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Alá Alá Leu Thr Val 515 520 525
Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Alá Asp Val Alá Ile Gly Alá 530 535 540
Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Alá Val Tyr Ile Phe His Gly Alá
545 550 555 560
Ser Arg Gin Asp Ile Alá Pro Ser Pro Ser Gin Arg Val Thr Gly Ser
565 570 575
Gin Leu Phe Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly 580 585 590
Gin Asp Leu Thr Gin Asp Gly Leu Val Asp Leu Alá Val Gly Alá Gin 595 600 605
Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile 610 615 620
Ser Ile Arg Phe Alá Pro Ser Glu Val Alá Lys Thr Val Tyr Gin Cys
625 630 635 640
Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Alá Gly Glu Alá Thr Val Cys
645 650 655
Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gin Ser 660 665 67 0
Ser Val Arg Tyr Asp Leu Alá Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg 675 680 685
HU 223 977 Β1
Alá Ile 690
Leu Gly 705
Cys Val
Leu Alá
Val Gly
Cys Glu 770
Leu Glu 785
Asn Glu
Alá Glu
Tyr Pro
Leu Arg 850
Alá Lys 865
Leu Gly
Lys Pro
Tyr Thr
Phe Asn 930
Arg Tyr 945
Asn Phe
Thr Leu
Pro Pro
Phe Asp
Leu Gly
Glu Asp
Gly Asp 740
Ser Gin 755
Gly Asn
Val Gly
Gly Glu
Leu Ser 820
Leu Arg 835
Ser Ser
Alá Thr
Asp Arg
Glu Thr 900
Val Tyr 915
Phe Ser
Arg Val
Trp Val
Arg Ser 980
Gin His 995
Glu Thr
Asp His 710
Alá Val 725
Ser Alá
Asp His
Leu Gly
Ser Ser 790
Asp Ser 805
Tyr Arg
Leu Alá
Ser Cys
Phe Met 870
Leu Leu 885
Ser Lys
Thr Val
Ser Ser
Asn Asn 950
Pro Ile 965
Pro Alá
Ser Asp
Lys Asn 695
Cys Glu
Thr Pro
Pro Ser
Val Thr 760
Val Ser 775
Pro Glu
Tyr Gly
Arg Val
Cys Glu 840
Ser Ile 855
Ile Thr
Leu Arg
Thr Alá
Ile Ser 920
His Gly 935
Leu Ser
Leu Leu
Gin Gly
Leu Leu 100i
Cys Thr
Thr Met
Ile Ile 730
Arg Asn 745
Alá Ser
Phe Asn
Leu Thr
Thr Leu 810
Thr Arg 825
Alá Glu
Asn His
Phe Asp
Alá Ser 890
Phe Gin 905
Arg Gin
Glu Arg
Pro Leu
Asn Gly 970
Val Ser 985
Thr Gin
Leu Thr 700
Lys Leu 715
Leu Arg
Leu Arg
Phe Pro
Phe Ser 780
Val Thr 795
Ile Lys
Alá Gin
Pro Thr
Pro Ile 860
Val Ser 875
Alá Ser
Leu Glu
Glu Asp
Gin Lys 940
Thr Leu 955
Val Alá
Cys Val
Ile Gin
Arg Arg
Leu Leu
Leu Asn
Pro Val 750
Phe Glu 765
Gly Leu
Val Thr
Phe Tyr
Gin Pro 830
Gly Gin 845
Phe Arg
Tyr Lys
Ser Glu
Leu Pro 910
Ser Thr 925
Glu Alá
Alá Ile
Val Trp
Ser Gin 990
Gly Arg 1005
Lys Thr
Pro Asp 720
Leu Ser 735
Leu Alá
Lys Asn
Gin Val
Val Trp 800
Tyr Pro 815
His Pro
Glu Ser
Glu Gly
Alá Phe 880
Asn Asn 895
Val Lys
Lys His
Glu His
Ser Val 960
Asp Val 975
Arg Glu
Ser Val
HU 223 977 Β1
Leu Asp 1010 Cys 1 Alá Ile Alá Asp 1015 Cys Leu His Leu Arg 1020 Cys Asp Ile Pro
Ser 1025 Leu 1 Gly Thr Leu Asp 1030 Glu 1 Leu Asp Phe Ile 1035 Leu Lys Gly Asn Leu 1040
Ser Phe Gly Trp Ile 1045 Ser 1 Gin Thr Leu Gin 1050 Lys Lys Val Leu Leu 1055 Leu
Ser Glu Alá Glu 1060 Ile Thr Phe Asn Thr 1065 Ser t Val Tyr Ser Gin 1070 Leu 1 Pro
Gly Gin Glu Alá 1075 Phe Leu Arg Alá 1080 Gin 1 Val Ser Thr Met 1085 Leu Glu Glu
Tyr Val 1090 Val 1 Tyr Glu Pro Val 1095 Phe 1 Leu Met Val Phe 1100 Ser 1 Ser Val Gly
Gly 1105 Leu 1 Leu Leu Leu Alá 111C Leu 1 Ile Thr Val Alá 1115 Leu Tyr Lys Leu Gly 1120
Phe Phe Lys Arg Gin 1125 Tyr 1 Lys Glu Met Leu 1130 Asp 1 Leu Pro Ser Alá 1135 Asp 1
Pro Asp Pro Alá 1140 Gly Gin Alá Asp Ser 1145 Asn His Glu Thr Pro 1150 Pro His
Leu Thr Ser
1155
47. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 49 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 47. számú szekvencia
AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49
48. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 48. számú szekvencia
GCTGGACGAT GGCATCCAC 19
HU 223 977 Β1
49. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 49. számú szekvencia
GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24
50. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 50. számú szekvencia
GCAGCCAGCT TCGGACAGAC 20
51. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus; egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 51. számú szekvencia
CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21
52. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3803 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (iii) Tulajdonság:
(I) Név/kulcs: CDS (J) Lokalizáció: 1...3486 (xi) A szekvencia leírása: 52. számú szekvencia
ATG Met 1 GTC Val CGT Arg GGA Gly GTT Val 5 GTG Val ATC Ile CTC Leu CTG Leu TGT Cys 10 GGC Gly TGG Trp GCC Alá CTG Leu GCT Alá 15 TCC Ser 48
TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG 96
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
25 30
HU 223 977 Β1
GAT Asp GCA GCC AGC TTC Phe GGA Gly CAG Gin ACT Thr 40 GTG Val GTG Val CAG Gin TTT Phe GGT Gly 45 GGA Gly TCT Ser CGA Arg 144
Alá Alá 35 Ser
CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA 192
Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Glu Alá Val Alá Val Asn Gin Thr Gly
50 55 60
CAG TCG TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA 240
Gin Ser Ser Asp Cys Pro Pro Alá Thr Gly Val Cys Gin Pro Ile Leu
65 70 75 80
CTG CAC ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG 288
Leu His Ile Pro Leu Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
85 90 95
GTG GCT GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA 336
Val Alá Asp Thr Asn Asn Ser Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Alá
100 105 110
CAG AGA GCT TGT GCA AAG AAC ATG TAT GCA AAA GGT TCC TGC CTC CTT 384
Gin Arg Alá Cys Alá Lys Asn Met Tyr Alá Lys Gly Ser Cys Leu Leu
115 120 125
CTG GGC TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC ATG CCA 432
Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe Ile Gin Alá Ile Pro Alá Thr Met Pro
130 135 140
GAG TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGC TCC 480
Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Asp Ile Alá Phe Leu Ile Asp Gly Ser
145 150 155 160
GGC AGC ATT GAT CAA AGT GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA 528
Gly Ser Ile Asp Gin Ser Asp Phe Thr Gin Met Lys Asp Phe Val Lys
165 170 175
GCT TTG ATG GGC CAG TTG GCG AGC ACC AGC ACC TCG TTC TCC CTG ATG 576
Alá Leu Met Gly Gin Leu Alá Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met
180 185 190
CAA TAC TCA AAC ATC CTG AAG ACT CAT TTT ACC TTC ACG GAA TTC AAG 624
Gin Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys
195 200 205
AGC AGC CTG AGC CCT CAG AGC CTG GTG GAT GCC ATC GTC CAG CTC CAA 672
Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu Val Asp Alá Ile Val Gin Leu Gin
210 215 220
GGC CTG ACG TAC ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG CTA 720
Gly Leu Thr Tyr Thr Alá Ser Gly Ile Gin Lys Val Val Lys Glu Leu
225 230 235 240
TTT CAT AGC AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CTA ATT 768
Phe His Ser Lys Asn Gly Alá Arg Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile
245 250 255
GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CAT 816
Val Ile Thr Asp Gly Gin Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His
260 265 270
HU 223 977 Β1
GTC Val ATC Ile CCT Pro 275 GAA Glu GCA GAG AAA Lys GCT Alá 280 GGG Gly ATC Ile ATT Ile CGC Arg TAT Tyr 285 GCT Alá ATA Ile GGG Gly 864
Alá Glu
GTG GGA GAT GCC TTC CGG GAA CCC ACT GCC CTA CAG GAG CTG AAC ACC 912
Val Gly Asp Alá Phe Arg Glu Pro Thr Alá Leu Gin Glu Leu Asn Thr
290 295 300
ATT GGC TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT 960
Ile Gly Ser Alá Pro Ser Gin Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305 310 315 320
GTA GCA CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC 1008
Val Alá Leu Arg Ser Ile Gin Arg Gin Ile Gin Glu Lys Ile Phe Alá
325 330 335
ATT GAA GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG 1056
Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met
340 345 350
TCA CAA GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG 1104
Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Alá Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu
355 360 365
GGG GCT GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC 1152
Gly Alá Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro
370 375 380
TCA AAT ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT 1200
Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Glu Asp
385 390 395 400
ATG AGG GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG 1248
Met Arg Asp Alá Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Alá Leu Alá Phe Trp Lys
405 410 415
GGG GTC CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG 1296
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Alá Pro Arg His Gin His Thr Gly
420 425 430
AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT 1344
Lys Val Val Ile Phe Thr Gin Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser
435 440 445
GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT 1392
Glu Val Arg Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Alá Ser Leu Cys
450 455 460
TCT GTG GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA 1440
Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly
465 470 475 480
GTC CCC CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC 1488
Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Cys
485 490 495
CCC ATG CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT 1536
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His
500 505 510
HU 223 977 Β1
GGG Gly GAG Glu CAG Gin 515 GGC Gly CAT His CCT Pro TGG Trp GGC Gly 520 CGC Arg TTT Phe GGG Gly GCG Alá GCT Alá 525 CTG Leu ACA Thr GTG Val 1584
CTA GGG GAC GTG AAT GGG GAC AGT CTG GCG GAT GTG GCT ATT GGT GCA 1632
Leu Gly 530 Asp Val Asn Gly Asp 535 Ser Leu Alá Asp Val 540 Alá Ile Gly Alá
CCC GGA GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC 1680
Pro 545 Gly Glu Glu Glu Asn 550 Arg Gly Alá Val Tyr 555 Ile Phe His Gly Alá 560
TCG AGA CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC 1728
Ser Arg Gin Asp Ile 565 Alá Pro Ser Pro Ser 570 Gin Arg Val Thr Gly 575 Ser
CAG CTC TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT GGG GGT 1776
Gin Leu Phe Leu 580 Arg Leu Gin Tyr Phe 585 Gly Gin Ser Leu Ser 590 Gly Gly
CAG GAC CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG 1824
Gin Asp Leu 595 Thr Gin Asp Gly Leu 600 Val Asp Leu Alá Val 605 Gly Alá Gin
GGG CAC GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC 1872
Gly His 610 Val Leu Leu Leu Arg 615 Ser Leu Pro Leu Leu 620 Lys Val Gly Ile
TCC ATT AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC 1920
Ser 625 Ile Arg Phe Alá Pro 630 Ser Glu Val Alá Lys 635 Thr Val Tyr Gin Cys 640
TGG GGA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT 1968
Trp Gly Arg Thr Pro 645 Thr Val Leu Glu Alá 650 Gly Glu Alá Thr Val 655 Cys
CTC ACT GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC 2016
Leu Thr Val Arg 660 Lys Gly Ser Pro Asp 665 Leu Leu Gly Asp Val 670 Gin Ser
TCT GTC AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT 2064
Ser Val Arg 675 Tyr Asp Leu Alá Leu 680 Asp Pro Gly Arg Leu 685 Ile Ser Arg
GCC ATT TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT 2112
Alá Ile 690 Phe Asp Glu Thr Lys 695 Asn Cys Thr Leu Thr 700 Arg Arg Lys Thr
CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC 2160
Leu 705 Gly Leu Gly Asp His 710 Cys Glu Thr Met Lys 715 Leu Leu Leu Pro Asp 720
TGT GTG GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC 2208
Cys Val Glu Asp Alá 725 Val Thr Pro Ile Ile 730 Leu Arg Leu Asn Leu 735 Ser
CTG GCA GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT 2256
Leu Alá Gly Asp 740 Ser Alá Pro Ser Arg 745 Asn Leu Arg Pro Val 750 Leu Alá
HU 223 977 Β1
GTG GGC TCA Ser 755 CAA Gin GAC Asp CAT His GTA ACA GCT Alá TCT Ser TTC Phe CCG Pro TTT Phe 765 GAG Glu AAG Lys AAC Asn 2304
Val Gly Val Thr 760
TGT AAG CAG GAG CTC CTG TGT GAG GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC 2352
Cys Lys Gin Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn
770 775 780
TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT 2400
Phe Ser Gly Leu Gin Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr
785 790 795 800
GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACC TTA 2448
Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu
805 810 815
ATC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GAG CTA TCT TAC CGA CGG GTG ACA AGA 2496
Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Alá Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg
820 825 830
GCC CAG CAA CCT CAT CCG TAC CCA CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG 2544
Alá Gin Gin Pro His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Alá Cys Glu Alá Glu
835 840 845
CCC ACG GGC CAG GAG AGC CTG AGG AGC AGC AGC TGT AGC ATC AAT CAC 2592
Pro Thr Gly Gin Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His
850 855 860
CCC ATC TTC CGA GAA GGT GCC AAG GCC ACC TTC ATG ATC ACA TTT GAT 2640
Pro Ile Phe Arg Glu Gly Alá Lys Alá Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp
865 870 875 880
GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTG GGA GAC AGG TTG CTT CTG AGG GCC AGC 2688
Val Ser Tyr Lys Alá Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Alá Ser
885 890 895
GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT GAA ACC AGC AAG ACT GCC TTC CAG 2736
Alá Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Alá Phe Gin
900 905 910
CTG GAG CTT CCG GTG AAG TAC ACG GTC TAT ACC GTG ATC AGT AGG CAG 2784
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gin
915 920 925
GAA GAT TCT ACC AAG CAT TTC AAC TTC TCA TCT TCC CAC GGG GAG AGA 2832
Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg
930 935 940
CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG 2880
Gin Lys Glu Alá Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945 950 955 960
ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC TGG GTC CCC ATC CTT CTG AAT GGT 2928
Thr Leu Alá Ile Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly
965 970 975
GTG GCC GTG TGG GAT GTG ACT CTG AGG AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC 2976
Val Alá Val Trp Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Alá Gin Gly Val Ser
980 985 990
HU 223 977 Β1
TGT Cys GTG Val TCA Ser 995 CAG Gin AGG Arg GAA Glu CCT Pro CCT CAA Pro Gin 1000 CAT His TCC Ser GAC Asp CTT CTG Leu Leu 1005 ACC Thr CAG Gin 3024
ATC CAA GGA CGC TCT GTG CTG GAC TGC GCC ATC GCC GAC TGC CTG CAC 3072
Ile Gin 101C Gly 1 Arg Ser Val Leu Asp Cys 1015 Alá Ile Alá 102C Asp Cys ) Leu His
CTC CGC TGT GAC ATC CCC TCC TTG GGC ACC CTG GAT GAG CTT GAC TTC 3120
Leu Arg 1025 Cys Asp Ile Pro 103C Ser 1 Leu Gly Thr Leu Asp 1035 Glu Leu Asp Phe 1040
ATT CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC GGC TGG ATC AGT CAG ACA TTG CAG 3168
Ile Leu Lys Gly Asn 1045 Leu Ser Phe Gly Trp 105C Ile 1 Ser Gin Thr Leu Gin 1055
AAA AAG GTG TTG CTC CTG AGT GAG GCT GAA ATC ACA TTC AAC ACA TCT 3216
Lys Lys Val Leu Leu 1060 Leu Ser Glu Alá Glu 1065 Ile Thr Phe Asn 107C Thr 1 Ser
GTG TAT TCC CAG CTG CCG GGA CAG GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG 3264
Val Tyr Ser Gin 1075 Leu Pro Gly Gin Glu 1080 Alá Phe Leu Arg Alá 1085 Gin Val
TCA ACG ATG CTA GAA GAA TAC GTG GTC TAT GAG CCC GTC TTC CTC ATG 3312
Ser Thr Met 1090 Leu Glu Glu Tyr Val Val 1095 Tyr Glu Pro HOC Val Phe l Leu Met
GTG TTC AGC TCA GTG GGA GGT CTG CTG TTA CTG GCT CTC ATC ACT GTG 3360
Val Phe 1105 Ser Ser Val Gly 111C Gly 1 Leu Leu Leu Leu 1115 Alá Leu Ile Thr Val 1120
GCG CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG 3408
Alá Leu Tyr Lys Leu 1125 Gly Phe Phe Lys Arg 113C Gin 1 Tyr Lys Glu Met Leu 1135
GAT CTA CCA TCT GCA GAT CCT GAC CCA GCC GGC CAG GCA GAT TCC AAC 3456
Asp Leu Pro Ser Alá 1140 Asp Pro Asp Pro 1145 Alá Gly Gin Alá Asp 1150 Ser 1 Asn
CAT His GAG Glu ACT Thr 1155 CCT Pro CCA Pro CAT His CTC Leu ACG TCC Thr Ser 1160 TAGGAATCTA CTTTCCTGTA 3503
TATCTCCACA ATTACGAGAT TGGTTTTGCT TTTGCCTATG AATCTACTGG CATGGGAACA 3563
AGTTCTCTTC AGCTCTGGGC TAGCCTGGGA AACTTCCCAG AAATGATGCC CTACCTCCTG 3623
AGCTGGGAGA TTTTTATGGT TTGCCCATGT GTCAGATTTC AGTGCTGATC CACTTTTTTT 3683
GCAAGAGCAG GAATGGGGTC AGCATAAATT TACATATGGA TAAGAACTAA CACAAGACTG 3743
AGTAATATGC TCAATATTCA ATGTATTGCT TGTATAAATT TTTAAAAAAT AAAATGAAAN 3803
HU 223 977 Β1
53. számú szekvenciavazlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1161 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 53. számú szekvencia
Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu 1 5
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val 20
Asp Alá Alá Ser Phe Gly Gin Thr 35 40
Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Glu 50 55
Gin Ser Ser Asp Cys Pro Pro Alá 65 70
Leu His Ile Pro Leu Glu Alá Val 85
Val Alá Asp Thr Asn Asn Ser Gin 100
Gin Arg Alá Cys Alá Lys Asn Met 115 120
Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe Ile 130 135
Glu Cys Pro Gly Gin Glu Met Asp 145 150
Gly Ser Ile Asp Gin Ser Asp Phe 165
Alá Leu Met Gly Gin Leu Alá Ser 180
Gin Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr 195 200
Ser Ser Leu Ser Pro Gin Ser Leu 210 215
Gly Leu Thr Tyr Thr Alá Ser Gly 225 230
Phe His Ser Lys Asn Gly Alá Arg 245
Val Ile Thr Asp Gly Gin Lys Phe 260
Leu Cys Gly Trp Alá Leu Alá Ser 10 15
Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu 25 30
Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg 45
Alá Val Alá Val Asn Gin Thr Gly 60
Thr Gly Val Cys Gin Pro Ile Leu 75 80
Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu 90 95
Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Alá 105 110
Tyr Alá Lys Gly Ser Cys Leu Leu 125
Gin Alá Ile Pro Alá Thr Met Pro 140
Ile Alá Phe Leu Ile Asp Gly Ser 155 160
Thr Gin Met Lys Asp Phe Val Lys 170 175
Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met 185 190
His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys 205
Val Asp Alá Ile Val Gin Leu Gin 220
Ile Gin Lys Val Val Lys Glu Leu 235 240
Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile 250 255
Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His 265 270
HU 223 977 Β1
Val Ile Pro 275
Val Gly Asp 290
Ile Gly Ser 305
Val Alá Leu
Ile Glu Gly
Ser Gin Glu 355
Gly Alá Val 370
Ser Asn Met 385
Met Arg Asp
Gly Val His
Lys Val Val 435
Glu Val Arg 450
Ser Val Asp 465
Val Pro His
Pro Met Pro
Gly Glu Gin 515
Leu Gly Asp 530
Pro Gly Glu 545
Ser Arg Gin
Gin Leu Phe
Glu Alá Glu
Alá Phe Arg
Alá Pro Ser 310
Arg Ser Ile 325
Thr Glu Ser 340
Gly Phe Ser
Gly Gly Phe
Arg Ser Thr 390
Alá Tyr Leu 405
Ser Leu Ile 420
Ile Phe Thr
Gly Thr Gin
Met Asp Arg 470
Tyr Tyr Glu 485
Gly Val Arg 500
Gly His Pro
Val Asn Gly
Glu Glu Asn 550
Asp Ile Alá 565
Leu Arg Leu 580
Lys Alá Gly 280
Glu Pro Thr 295
Gin Asp His
Gin Arg Gin
Arg Ser Ser 345
Ser Alá Leu 360
Ser Trp Ser 375
Phe Ile Asn
Gly Tyr Ser
Leu Gly Alá 425
Gin Glu Ser 440
Ile Gly Ser 455
Asp Gly Ser
His Thr Arg
Ser Arg Trp 505
Trp Gly Arg 520
Asp Ser Leu 535
Arg Gly Alá
Pro Ser Pro
Gin Tyr Phe 585
Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly 285
Alá Leu Gin Glu Leu Asn Thr 300
Val Phe Lys Val Gly Asn Phe 315 320
Ile Gin Glu Lys Ile Phe Alá 330 335
Ser Ser Phe Gin His Glu Met 350
Ser Met Asp Gly Pro Val Leu 365
Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro 380
Met Ser Gin Glu Asn Glu Asp 395 400
Thr Alá Leu Alá Phe Trp Lys 410 415
Pro Arg His Gin His Thr Gly 430
Arg His Trp Arg Pro Lys Ser 445
Tyr Phe Gly Alá Ser Leu Cys 460
Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly 475 480
Gly Gly Gin Val Ser Val Cys 490 495
His Cys Gly Thr Thr Leu His 510
Phe Gly Alá Alá Leu Thr Val 525
Alá Asp Val Alá Ile Gly Alá 540
Val Tyr Ile Phe His Gly Alá 555 560
Ser Gin Arg Val Thr Gly Ser 570 575
Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly 590
HU 223 977 Β1
Gin Asp Leu 595
Gly His Val 610
Ser Ile Arg 625
Trp Gly Arg
Leu Thr Val
Ser Val Arg 675
Alá Ile Phe 690
Leu Gly Leu 705
Cys Val Glu
Leu Alá Gly
Val Gly Ser 755
Cys Lys Gin 770
Phe Ser Gly 785
Val Thr Val
Ile Lys Phe
Alá Gin Gin 835
Pro Thr Gly 850
Pro Ile Phe 865
Val Ser Tyr
Alá Ser Ser
Thr Gin Asp Gly Leu 600
Leu Leu Leu Arg Ser 615
Phe Alá Pro Ser Glu 630
Thr Pro Thr Val Leu 645
Arg Lys Gly Ser Pro 660
Tyr Asp Leu Alá Leu 680
Asp Glu Thr Lys Asn 695
Gly Asp His Cys Glu 710
Asp Alá Val Thr Pro 725
Asp Ser Alá Pro Ser 740
Gin Asp His Val Thr 760
Glu Leu Leu Cys Glu 775
Leu Gin Val Leu Glu 790
Thr Val Trp Asn Glu 805
Tyr Tyr Pro Alá Glu 820
Pro His Pro Tyr Pro 840
Gin Glu Ser Leu Arg 855
Arg Glu Gly Alá Lys 870
Lys Alá Phe Leu Gly 885
Glu Asn Asn Lys Pro 900
Val Asp
Leu Pro
Val Alá
Glu Alá 650
Asp Leu 665
Asp Pro
Cys Thr
Thr Met
Ile Ile 730
Arg Asn 745
Alá Ser
Gly Asn
Val Gly
Gly Glu 810
Leu Ser 825
Leu Arg
Ser Ser
Alá Thr
Asp Arg 890
Glu Thr 905
Leu Alá
Leu Leu 620
Lys Thr 635
Gly Glu
Leu Gly
Gly Arg
Leu Thr 700
Lys Leu 715
Leu Arg
Leu Arg
Phe Pro
Leu Gly 780
Ser Ser 795
Asp Ser
Tyr Arg
Leu Alá
Ser Cys 860
Phe Met 875
Leu Leu
Ser Lys
Val Gly Alá Gin 605
Lys Val Gly Ile
Val Tyr Gin Cys 640
Alá Thr Val Cys 655
Asp Val Gin Ser 670
Leu Ile Ser Arg 685
Arg Arg Lys Thr
Leu Leu Pro Asp 720
Leu Asn Leu Ser 735
Pro Val Leu Alá 750
Phe Glu Lys Asn 765
Val Ser Phe Asn
Pro Glu Leu Thr 800
Tyr Gly Thr Leu 815
Arg Val Thr Arg 830
Cys Glu Alá Glu 845
Ser Ile Asn His
Ile Thr Phe Asp 880
Leu Arg Alá Ser 895
Thr Alá Phe Gin 910
HU 223 977 Β1
Leu Glu Leu 915 Pro Val Lys Tyr Thr 920 Val Tyr Thr Val Ile 925 Ser Arg Gin
Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg
930 935 940
Gin Lys Glu Alá Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945 950 955 960
Thr Leu Alá Ile Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly
965 970 975
Val Alá Val Trp Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Alá Gin Gly Val Ser
980 985 990
Cys Val Ser Gin Arg Glu Pro Pro Gin His Ser Asp Leu Leu Thr Gin
995 1000 1005
Ile Gin Gly Arg Ser Val Leu Asp Cys Alá Ile Alá Asp Cys Leu His
1010 1015 1020
Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe
1025 1030 1035 1040
Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gin Thr Leu Gin
1045 1050 1055
Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu Alá Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser
1060 1065 1070
Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin Glu Alá Phe Leu Arg Alá Gin Val
1075 1080 1085
Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met
1090 1095 1100
Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Alá Leu Ile Thr Val
1105 1110 1115 1120
Alá Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Gin Tyr Lys Glu Met Leu
1125 1130 1135
Asp Leu Pro Ser Alá Asp Pro Asp Pro Alá Gly Gin Alá Asp Ser Asn
1140 1145 1150
His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr Ser
1155 1160
54. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3597 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 40...3525
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 54. számú szekvencia
AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCAGTG ATG GCC GGT GGA GTT 54
Met Alá Gly Gly Val
5
GTG Val ATC Ile CTC Leu CTG Leu TGT Cys 10 GGC Gly TGG Trp GTC Val CTG Leu GCT Alá 15 TCC Ser TGT Cys CAT His GGG Gly TCT Ser 20 AAC Asn 102
CTG GAT GTG GAG GAA CCC ATC GTG TTC AGA GAG GAT GCA GCC AGC TTT 150
Leu Asp Val Glu Glu Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Alá Alá Ser Phe
25 30 35
GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG GTG GGA GCC 198
Gly Gin Thr Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Alá
40 45 50
CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA CGG TTG TAT GAC TGT 246
Pro Leu Glu Alá Val Alá Val Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys
55 60 65
GCA CCT GCC ACT GGC ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA 294
Alá Pro Alá Thr Gly Met Cys Gin Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu
70 75 80 85
GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG GTG ACT GCC ACC AAT 342
Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Alá Thr Asn
90 95 100
AAC GCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA CAG AGA GCT TGT GTG 390
Asn Alá Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Alá Gin Arg Alá Cys Val
105 110 115
AAG AAC ATG TAT GCG AAA GGT TCC TGC CTC CTT CTC GGC TCC AGC TTG 438
Lys Asn Met Tyr Alá Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu
120 125 130
CAG TTC ATC CAG GCA GTC CCT GCC TCC ATG CCA GAG TGT CCA AGA CAA 486
Gin Phe Ile Gin Alá Val Pro Alá Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gin
135 140 145
GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGT TCT GGC AGC ATT AAC CAA 534
Glu Met Asp Ile Alá Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gin
150 155 160 165
AGG GAC TTT GCC CAG ATG AAG GAC TTT GTC AAA GCT TTG ATG GGA GAG 582
Arg Asp Phe Alá Gin Met Lys Asp Phe Val Lys Alá Leu Met Gly Glu
170 175 180
TTT GCG AGC ACC AGC ACC TTG TTC TCC CTG ATG CAA TAC TCG AAC ATC 630
Phe Alá Ser Thr Ser Thr Leu Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser Asn Ile
185 190 195
CTG AAG ACC CAT TTT ACC TTC ACT GAA TTC AAG AAC ATC CTG GAC CCT 678
Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro
200 205 210
HU 223 977 Β1
CAG Gin AGC Ser 215 CTG Leu GTG Val GAT Asp CCC Pro ATT Ile 220 GTC Val CAG Gin CTG Leu CAA Gin GGC Gly 225 CTG Leu ACC Thr TAC Tyr ACA Thr 726
GCC ACA GGC ATC CGG ACA GTG ATG GAA GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT 774
Alá Thr Gly Ile Arg Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn
230 235 240 245
GGG TCC CGT AAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC CTT GTC ATC ACA GAT GGG 822
Gly Ser Arg Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly
250 255 260
CAG AAA TAC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGT GAT GTC ATT CCC GCC GCA 870
Gin Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Alá Alá
265 270 275
GAC AAA GCT GGC ATC ATT CGT TAT GCT ATT GGG GTG GGA GAT GCC TTC 918
Asp Lys Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val Gly Asp Alá Phe
280 285 290
CAG GAG CCC ACT GCC CTG AAG GAG CTG AAC ACC ATT GGC TCA GCT CCC 966
Gin Glu Pro Thr Alá Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Alá Pro
295 300 305
CCA CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC 1014
Pro Gin Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe Alá Alá Leu Arg Ser
310 315 320 325
ATC CAG AGG CAA CTT CAG GAG AAA ATC TTC GCC ATT GAG GGA ACT CAA 1062
Ile Gin Arg Gin Leu Gin Glu Lys Ile Phe Alá Ile Glu Gly Thr Gin
330 335 340
TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG TCA CAA GAA GGT TTC 1110
Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin Glu Gly Phe
345 350 355
AGT TCA GCT CTC ACA TCG GAT GGA CCC GTT CTG GGG GCC GTG GGA AGC 1158
Ser Ser Alá Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Alá Val Gly Ser
360 365 370
TTC AGC TGG TCC GGA GGT GCC TTC TTA TAT CCC CCA AAT ACG AGA CCC 1206
Phe Ser Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro
375 380 385
ACC TTT ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGA GAC TCC TAC 1254
Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr
390 395 400 405
CTG GGT TAC TCC ACC GCA GTG GCC TTT TGG AAG GGG GTT CAC AGC CTG 1302
Leu Gly Tyr Ser Thr Alá Val Alá Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu
410 415 420
ATC CTG GGG GCC CCG CGT CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT GTC ATC TTT 1350
Ile Leu Gly Alá Pro Arg His Gin His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe
425 430 435
ACC CAG GAA GCC AGG CAT TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC AGA GGG ACA 1398
Thr Gin Glu Alá Arg His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr
440 445 450
HU 223 977 Β1
CAG Gin ATC Ile 455 GGC Gly TCC Ser TAC Tyr TTC Phe GGG Gly 460 GCC Alá TCT Ser CTC Leu TGT Cys TCT Ser 465 GTG Val GAC Asp GTG Val GAT Asp 1446
AGA GAT GGC AGC ACY GAC CTG GTC CTG ATC GGA GCC CCC CAT TAC TAT 1494
Arg Asp Gly Ser Xaa Asp Leu Val Leu Ile Gly Alá Pro His Tyr Tyr
470 475 480 485
GAG CAG ACC CGA GGG GGG CAG GTC TCA GTG TTC CCC GTG CCC GGT GTG 1542
Glu Gin Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Phe Pro Val Pro Gly Val
490 495 500
AGG GGC AGG TGG CAG TGT GAG GCC ACC CTC CAC GGG GAG CAG GGC CAT 1590
Arg Gly Arg Trp Gin Cys Glu Alá Thr Leu His Gly Glu Gin Gly His
505 510 515
CCT TGG GGC CGC TTT GGG GTG GCT CTG ACA GTG CTG GGG GAC GTA AAC 1638
Pro Trp Gly Arg Phe Gly Val Alá Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn
520 525 530
GGG GAC AAT CTG GCA GAC GTG GCT ATT GGT GCC CCT GGA GAG GAG GAG 1686
Gly Asp Asn Leu Alá Asp Val Alá Ile Gly Alá Pro Gly Glu Glu Glu
535 540 545
AGC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC 1734
Ser Arg Gly Alá Val Tyr Ile Phe His Gly Alá Ser Arg Leu Glu Ile
550 555 560 565
ATG CCC TCA CCC AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC TCC CTG AGA 1782
Met Pro Ser Pro Ser Gin Arg Val Thr Gly Ser Gin Leu Ser Leu Arg
570 575 580
CTG CAG TAT TTT GGG CAG TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAC CTT ACA CAG 1830
Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin Asp Leu Thr Gin
585 590 595
GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC GTA CTG CTG 1878
Asp Gly Leu Val Asp Leu Alá Val Gly Alá Gin Gly His Val Leu Leu
600 605 610
CTC AGG AGT CTG CCT CTG CTG AAA GTG GAG CTC TCC ATA AGA TTC GCC 1926
Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Alá
615 620 625
CCC ATG GAG GTG GCA AAG GCT GTG TAC CAG TGC TGG GAA AGG ACT CCC 1974
Pro Met Glu Val Alá Lys Alá Val Tyr Gin Cys Trp Glu Arg Thr Pro
630 635 640 645
ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACT GTC TGT CTC ACT GTC CAC AAA 2022
Thr Val Leu Glu Alá Gly Glu Alá Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys
650 655 660
GGC TCA CCT GAC CTG TTA GGT AAT GTC CAA GGC TCT GTC AGG TAT GAT 2070
Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asn Val Gin Gly Ser Val Arg Tyr Asp
665 670 675
CTG GCG TTA GAT CCG GGC CGC CTG ATT TCT CGT GCC ATT TTT GAT GAG 2118
Leu Alá Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg Alá Ile Phe Asp Glu
680 685 690
HU 223 977 Β1
ACT AAG AAC TGC Cys ACT Thr TTG Leu ACG Thr 700 GGA AGG AAG ACT CTG Leu 705 GGG Gly CTT Leu GGT Gly GAT Asp 2166
Thr Lys 695 Asn Gly Arg Lys Thr
CAC TGC GAA ACA GTG AAG CTG CTT TTG CCG GAC TGT GTG GAA GAT GCA 2214
His Cys Glu Thr Val Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Alá
710 715 720 725
GTG AGC CCT ATC ATC CTG CGC CTC AAC TTT TCC CTG GTG AGA GAC TCT 2262
Val Ser Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser
730 735 740
GCT TCA CCC AGG AAC CTG CAT CCT GTG CTG GCT GTG GGC TCA CAA GAC 2310
Alá Ser Pro Arg Asn Leu His Pro Val Leu Alá Val Gly Ser Gin Asp
745 750 755
CAC ATA ACT GCT TCT CTG CCG TTT GAG AAG AAC TGT AAG CAA GAA CTC 2358
His Ile Thr Alá Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gin Glu Leu
760 765 770
CTG TGT GAG GGG GAC CTG GGC ATC AGC TTT AAC TTC TCA GGC CTG CAG 2406
Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gin
775 780 785
GTC TTG GTG GTG GGA GGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTC ACT GTG 2454
Val Leu Val Val Gly Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val
790 795 800 805
TGG AAT GAG GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACT TTA GTC AAG TTC TAC TAC 2502
Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr
810 815 820
CCA GCA GGG CTA TCT TAC CGA CGG GTA ACA GGG ACT CAG CAA CCT CAT 2550
Pro Alá Gly Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gin Gin Pro His
825 830 835
CAG TAC CCA CTA CGC TTG GCC TGT GAG GCT GAG CCC GCT GCC CAG GAG 2598
Gin Tyr Pro Leu Arg Leu Alá Cys Glu Alá Glu Pro Alá Alá Gin Glu
840 845 850
GAC CTG AGG AGC AGC AGC TGT AGC ATT AAT CAC CCC ATC TTC CGA GAA 2646
Asp Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu
855 860 865
GGT GCA AAG ACC ACC TTC ATG ATC ACA TTC GAT GTC TCC TAC AAG GCC 2694
Gly Alá Lys Thr Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Alá
870 875 880 885
TTC CTA GGA GAC AGG TTG CTT CTG AGG GCC AAA GCC AGC AGT GAG AAT 2742
Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Alá Lys Alá Ser Ser Glu Asn
890 895 900
AAT AAG CCT GAT ACC AAC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTC CCA GTG 2790
Asn Lys Pro Asp Thr Asn Lys Thr Alá Phe Gin Leu Glu Leu Pro Val
905 910 915
AAG TAC ACC GTC TAT ACC CTG ATC AGT AGG CAA GAA GAT TCC ACC AAC 2838
Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Leu Ile Ser Arg Gin Glu Asp Ser Thr Asn
920 925 930
100
HU 223 977 Β1
CAT His GTC AAC TTT Phe TCA TCT TCC Ser 940 CAC His GGG Gly GGG Gly AGA Arg AGG Arg 945 CAA Gin GAA Glu GCC Alá GCA Alá 2886
Val 935 Asn Ser Ser
CAT CGC TAT CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA CTG AAG CTG GCC GTC AGA 2934
His 950 Arg Tyr Arg Val Asn 955 Asn Leu Ser Pro Leu 960 Lys Leu Alá Val Arg 965
GTT AAC TTC TGG GTC CCT GTC CTT CTG AAC GGT GTG GCT GTG TGG GAC 2982
Val Asn Phe Trp Val 970 Pro Val Leu Leu Asn 975 Gly Val Alá Val Trp 980 Asp
GTG ACT CTG AGC AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGC GTG TCC CAG ATG 3030
Val Thr Leu Ser 985 Ser Pro Alá Gin Gly 990 Val Ser Cys Val Ser 995 Gin Met
AAA CCT CCT CAG AAT CCC GAC TTT CTG ACC CAG ATT CAG AGA CGT TCT 3078
Lys Pro Pro 100C Gin I Asn Pro Asp Phe Leu 1005 Thr Gin Ile Gin Arg 1010 Arg Ser
GTG CTG GAC TGC TCC ATT GCT GAC TGC CTG CAC TTC CGC TGT GAC ATC 3126
Val Leu Asp 1015 Cys Ser Ile Alá Asp 1020 Cys Leu His Phe Arg 1025 Cys Asp Ile
CCC TCC TTG GAC ATC CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC 3174
Pro Ser 1030 Leu Asp Ile Gin Asp 1035 Glu Leu Asp Phe Ile 1040 Leu Arg Gly Asn 1045
CTC AGC TTC GGC TGG GTC AGT CAG ACA TTG CAG GAA AAG GTG TTG CTT 3222
Leu Ser Phe Gly Trp 105C Val ) Ser Gin Thr Leu 1055 Gin Glu Lys Val Leu Leu 1060
GTG AGT GAG GCT GAA ATC ACT TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG CTG 3270
Val Ser Glu Alá Glu 1065 Ile Thr Phe Asp Thr 1070 Ser Val Tyr Ser Gin 1075 Leu
CCA GGA CAG GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG GAG ACA ACG TTA GAA 3318
Pro Gly Gin 108C Glu I Alá Phe Leu Arg 1085 Alá Gin Val Glu Thr 109C Thr ) Leu Glu
GAA TAC GTG GTC TAT GAG CCC ATC TTC CTC GTG GCG GGC AGC TCG GTG 3366
Glu Tyr Val 1095 Val Tyr Glu Pro HOC Ile I Phe Leu Val Alá Gly 1105 Ser Ser Val
GGA GGT CTG CTG TTA CTG GCT CTC ATC ACA GTG GTA CTG TAC AAG CTT 3414
Gly 111C Gly ) Leu Leu Leu Leu 1115 Alá Leu Ile Thr Val 112C Val I Leu Tyr Lys Leu 1125
GGC TTC TYC AAA CGT CAG TAC AAA GAA ATG CTG GAC GGC AAG GCT GCA 3462
Gly Phe Xaa Lys Arg 113C Gin 1 Tyr Lys Glu Met 1135 Leu Asp Gly Lys Alá 114C Alá 1
GAT CCT GTC ACA GCC GGC CAG GCA GAT TTC GGC TGT GAG ACT CCT CCA 3510
Asp Pro Val Thr Alá Gly Gin Alá Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro
1145 1150 1155
TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATGAAGATTG 3562
Tyr Leu Val Ser
1160
GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT 3597
101
HU 223 977 Β1
55. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1161 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 55. számú szekvencia
Met Alá Gly Gly Val Val Ile Leu Leu 1 5
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu 20 25
Asp Alá Alá Ser Phe Gly Gin Thr Val 35 40
Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Glu Alá 50 55
Arg Leu Tyr Asp Cys Alá Pro Alá Thr 65 70
Leu Arg Ser Pro Leu Glu Alá Val Asn 85
Val Thr Alá Thr Asn Asn Alá Gin Leu 100 105
Gin Arg Alá Cys Val Lys Asn Met Tyr 115 120
Leu Gly Ser Ser Leu Gin Phe Ile Gin 130 135
Glu Cys Pro Arg Gin Glu Met Asp Ile 145 150
Gly Ser Ile Asn Gin Arg Asp Phe Alá 165
Alá Leu Met Gly Glu Phe Alá Ser Thr 180 185
Gin Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His 195 200
Asn Ile Leu Asp Pro Gin Ser Leu Val 210 215
Gly Leu Thr Tyr Thr Alá Thr Gly Ile 225 230
Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys 245
Val Ile Thr Asp Gly Gin Lys Tyr Arg 260 265
Cys Gly 10
Glu Pro
Val Gin
Val Alá
Gly Met 75
Met Ser 90
Leu Alá
Alá Lys
Alá Val
Alá Phe 155
Gin Met 170
Ser Thr
Phe Thr
Asp Pro
Arg Thr 235
Ser Alá 250
Asp Pro
Trp Val Leu Alá Ser 15
Ile Val Phe Arg Glu 30
Phe Gly Gly Ser Arg 45
Val Asn Gin Thr Gly 60
Cys Gin Pro Ile Val 80
Leu Gly Leu Ser Leu 95
Cys Gly Pro Thr Alá 110
Gly Ser Cys Leu Leu 125
Pro Alá Ser Met Pro 140
Leu Ile Asp Gly Ser 160
Lys Asp Phe Val Lys 175
Leu Phe Ser Leu Met 190
Phe Thr Glu Phe Lys 205
Ile Val Gin Leu Gin 220
Val Met Glu Glu Leu 240
Lys Lys Ile Leu Leu 255
Leu Glu Tyr Ser Asp 270
102
HU 223 977 Β1
Val Ile Pro Alá Alá Asp Lys Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly 275 280 285
Val Gly Asp Alá Phe Gin Glu Pro Thr Alá Leu Lys Glu Leu Asn Thr 290 295 300
Ile Gly Ser Alá Pro Pro Gin Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305 310 315 320
Alá Alá Leu Arg Ser Ile Gin Arg Gin Leu Gin Glu Lys Ile Phe Alá
325 330 335
Ile Glu Gly Thr Gin Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met 340 345 350
Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Alá Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu 355 360 365
Gly Alá Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro 370 375 380
Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp
385 390 395 400
Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Alá Val Alá Phe Trp Lys
405 410 415
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Alá Pro Arg His Gin His Thr Gly 420 425 430
Lys Val Val Ile Phe Thr Gin Glu Alá Arg His Trp Arg Pro Lys Ser 435 440 445
Glu Val Arg Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Alá Ser Leu Cys 450 455 460
Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa Asp Leu Val Leu Ile Gly
465 470 475 480
Alá Pro His Tyr Tyr Glu Gin Thr Arg Gly Gly Gin Val Ser Val Phe
485 490 495
Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gin Cys Glu Alá Thr Leu His 500 505 510
Gly Glu Gin Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Val Alá Leu Thr Val 515 520 525
Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Alá Asp Val Alá Ile Gly Alá 530 535 540
Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Alá Val Tyr Ile Phe His Gly Alá
545 550 555 560
Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser Gin Arg Val Thr Gly Ser
565 570 575
Gin Leu Ser Leu Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly 580 585 590
103
HU 223 977 Β1
Gin Asp Leu Thr Gin 595
Gly His Val Leu Leu 610
Ser Ile Arg Phe Ala 625
Trp Glu Arg Thr Pro 645
Leu Thr Val His Lys 660
Ser Val Arg Tyr Asp 675
Ala Ile Phe Asp Glu 690
Leu Gly Leu Gly Asp 705
Cys Val Glu Asp Ala 725
Leu Val Arg Asp Ser 740
Val Gly Ser Gin Asp 755
Cys Lys Gin Glu Leu 770
Phe Ser Gly Leu Gin 785
Val Thr Val Thr Val 805
Val Lys Phe Tyr Tyr 820
Thr Gin Gin Pro His 835
Pro Ala Ala Gin Glu 850
Pro Ile Phe Arg Glu 865
Val Ser Tyr Lys Ala 885
Ala Ser Ser Glu Asn 900
Asp Gly Leu 600
Leu Arg Ser 615
Pro Met Glu 630
Thr Val Leu
Gly Ser Pro
Leu Ala Leu 680
Thr Lys Asn 695
His Cys Glu 710
Val Ser Pro
Val Asp Leu Ala
Leu Pro Leu Leu 620
Val Ala Lys Ala 635
Glu Ala Gly Glu 650
Asp Leu Leu Gly 665
Asp Pro Gly Arg
Ala Ser Pro
His Ile Thr 760
Leu Cys Glu 775
Val Leu Val 790
Trp Asn Glu
Cys Thr Leu Thr 700
Thr Val Lys Leu 715
Ile Ile Leu Arg 730
Arg Asn Leu His 745
Ala Ser Leu Pro
Pro Ala Gly
Gin Tyr Pro 840
Asp Leu Arg 855
Gly Ala Lys 870
Phe Leu Gly
Gly Asp Leu Gly 780
Val Gly Gly Ser 795
Gly Glu Asp Ser 810
Leu Ser Tyr Arg 825
Leu Arg Leu Ala
Asn Lys Pro
Ser Ser Ser Cys 860
Thr Thr Phe Met 875
Asp Arg Leu Leu 890
Asp Thr Asn Lys 905
Val Gly Ala Gin 605
Lys Val Glu Leu
Val Tyr Gin Cys 640
Ala Thr Val Cys 655
Asn Val Gin Gly 670
Leu Ile Ser Arg 685
Gly Arg Lys Thr
Leu Leu Pro Asp 720
Leu Asn Phe Ser 735
Pro Val Leu Ala 750
Phe Glu Lys Asn 765
Ile Ser Phe Asn
Pro Glu Leu Thr 800
Tyr Gly Thr Leu 815
Arg Val Thr Gly 830
Cys Glu Ala Glu 845
Ser Ile Asn His
Ile Thr Phe Asp 880
Leu Arg Ala Lys 895
Thr Ala Phe Gin 910
104
HU 223 977 Β1
Leu Glu Leu 915 Pro Val Lys Tyr Thr 920 Val Tyr Thr Leu Ile 925 Ser Arg Gin
Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Gly Arg
930 935 940
Arg Gin Glu Alá Alá His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945 950 955 960
Lys Leu Alá Val Arg Val Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
965 970 975
Val Alá Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser Pro Alá Gin Gly Val Ser
980 985 990
Cys Val Ser Gin Met Lys Pro Pro Gin Asn Pro Asp Phe Leu Thr Gin
995 1000 1005
Ile Gin Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser Ile Alá Asp Cys Leu His
1010 1015 1020
Phe Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile Gin Asp Glu Leu Asp Phe
1025 1030 1035 1040
Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Ser Gin Thr Leu Gin
1045 1050 1055
Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Alá Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
1060 1065 1070
Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin Glu Alá Phe Leu Arg Alá Gin Val
1075 1080 1085
Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Ile Phe Leu Val
1090 1095 1100
Alá Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Alá Leu Ile Thr Val
1105 1110 1115 1120
Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg Gin Tyr Lys Glu Met Leu
1125 1130 1135
Asp Gly Lys Alá Alá Asp Pro Val Thr Xaa Gly Gin Alá Asp Phe Gly
1140 1145 1150
Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser
1155 1160
56. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száitípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 56. számú szekvencia
CCTGTCATGG GTCTAACCTG
105
HU 223 977 Β1
57. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 57. számú szekvencia
AGGTTAGACC CATGACAGG 19
58. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 58. számú szekvencia
GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20
59. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 59. számú szekvencia
CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC 22
60. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 60. számú szekvencia
CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C 21
61. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
106
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 61. számú szekvencia
CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA 22
62. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 62. számú szekvencia
GCTGGGATCA TTCGCTATGC 20
63. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 63. számú szekvencia
CAATGGATGG ACCAGTTCTG G 21
64. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 64. számú szekvencia
CAGATCGGCT CCTACTTTGG 20
65. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 65. számú szekvencia
CATGGAGCCT CGAGACAGG 19
107
HU 223 977 Β1
66. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszáíú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 66. számú szekvencia
CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21
67. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszáíú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 67. számú szekvencia
CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26
68. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszáíú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 68. számú szekvencia
CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21
69. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszáíú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 69. számú szekvencia
CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21
70. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszáíú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
108
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 70. számú szekvencia
GTCACAGAGG GAACCTCC 18
71. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 71. számú szekvencia
GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23
72. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 72. számú szekvencia
GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23
73. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 73. számú szekvencia
CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG 22
74. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 74. számú szekvencia
GTGGATCAGC ACTGAAATCT G 21
109
HU 223 977 Β1
75. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 75. számú szekvencia
CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G 21
76. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 76. számú szekvencia
CACAGCGGAG GTGCAGGCAG 2 0
77. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 77. számú szekvencia
CTCACTGCTT GCGCTGGC 18
78. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 78. számú szekvencia
CGGTAAGATA GCTCTGCTGG 20
79. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
110
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 79. számú szekvencia
GAGCCCACAG CCAGCACAGG 2 0
80. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 80. számú szekvencia
GATCCAACGC CAGATCATAC C 21
81. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 81. számú szekvencia
CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20
82. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 82. számú szekvencia
CACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21
83. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 83. számú szekvencia
TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22
111
HU 223 977 Β1
84. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 84. számú szekvencia
GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21
85. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 85. számú szekvencia
CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21
86. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 86. számú szekvencia
GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21
87. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 33 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 87. számú szekvencia
GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33
88. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 33 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS
112
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 88. számú szekvencia
CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC
89. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 32 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 89. számú szekvencia
CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32
90. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 90. számú szekvencia
GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21
91. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 91. számú szekvencia
AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18
92. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 852 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(B) Név/kulcs: CDS (C) Lokalizáció: 61 ...852 (xi) A szekvencia leírása: 92. számú szekvencia
TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60
113
HU 223 977 Β1
ATG GCC CTT GGG GCT GTG
Met 1 Alá Leu Gly Alá 5 Val
GGA TTC AAC TTG GAC GTG
Gly Phe Asn Leu 20 Asp Val
GGG CTT CGG GCA GAG CGT
Gly Leu Arg 35 Alá Glu Arg
GGA GCC CCC CTG GCG GTG
Gly Alá 50 Pro Leu Alá Val
GAG TGT GCG CCT GCC TCC
Glu 65 Cys Alá Pro Alá Ser 70
CCC CCC GAA GCC GTG AAC
Pro Pro Glu Alá Val 85 Asn
CCC AAC CAT TCC CAG CTG
Pro Asn His Ser 100 Gin Leu
TGC GGG GAG GAC GTG TAC
Cys Gly Glu 115 Asp Val Tyr
CAC GCA CAG CCC ATC GGG
His Alá 130 Gin Pro Ile Gly
GAT CAA GAG ATG GAC ATT
Asp 145 Gin Glu Met Asp Ile 150
AGC TCA AAT GAC TTC CGC
Ser Ser Asn Asp Phe 165 Arg
GAC CAG TTC AAG GAC ACC
Asp Gin Phe Lys 180 Asp Thr
AAT GTG CTG GTG ACA CAT
Asn Val Leu 195 Val Thr His
AAT CCT CAG GGC CTA GTG
Asn Pro 210 Gin Gly Leu Val
TTC ACG GCC ACA GGG ATC
Phe 225 Thr Alá Thr Gly Ile 230
GTC CTC CTT GGG GTC CTG
Val Leu Leu Gly 10 Val Leu
ATG AGC GGT GAT CTT CCA
Met Ser Gly 25 Asp Leu Pro
GAT GCA GTT TGG GGA TCT
Asp Alá 40 Val Trp Gly Ser
GTG TCG GCC AAC CAC ACA
Val 55 Ser Alá Asn His Thr 60
GGC ACC TGC ACG CCC ATT
Gly Thr Cys Thr Pro 75 Ile
ATG TCC CTG GGC CTG TCC
Met Ser Leu Gly 90 Leu Ser
CTG GCT TGT GGC CCG ACC
Leu Alá Cys 105 Gly Pro Thr
GCC CAG GGT TTC TGT GTG
Alá Gin 120 Gly Phe Cys Val
ACT GTG CCA GCT GCC CTG
Thr 135 Val Pro Alá Alá Leu 140
GTC TTC CTG ATT GAC GGC
Val Phe Leu Ile Asp 155 Gly
AAG ATG AAG GAC TTT GTC
Lys Met Lys Asp 170 Phe Val
AAC ACC CAG TTC TCG CTG
Asn Thr Gin 185 Phe Ser Leu
TTC ACC TTC AGC AGC TTC
Phe Thr 200 Phe Ser Ser Phe
GAG CCC ATT GTG CAG CTG
Glu 215 Pro Ile Val Gin Leu 220
CTG AAA GTG GTG ACA GAG
Leu Lys Val Val Thr 235 Glu
GCT TCT TAC CAC 108
Alá Ser Tyr His
GGA AGA CGC AGC 156
Gly Arg Arg Ser
CGA CTC GTG GTG 204
Arg Leu Val Val
GGA CGG CTG TAC 252
Gly Arg Leu Tyr
TTC CCA TTC ATG 300
Phe Pro Phe Met
CTG GCA GCC TCC 348
Leu Alá Alá Ser
GTG CAT AGA GCC 396
Val His Arg Alá
110
CTG CTG GAT GCC 444
Leu Leu Asp Alá
125
CCC GAG TGC CCA 492
Pro Glu Cys Pro
TCT GGC AGC ATT 540
Ser Gly Ser Ile
160
AGA GCT GTG ATG 588
Arg Alá Val Met
175
ATG CAG TAC TCC 636
Met Gin Tyr Ser
190
CGG AAC AGC TCC 684
Arg Asn Ser Ser
205
ACA GGC CTC ACG 732
Thr Gly Leu Thr
CTG TTT CAA ACC 780
Leu Phe Gin Thr
240
114
HU 223 977 Β1
AAG Lys AAC Asn GGG Gly GCC Alá CGC Arg 245 GAA Glu AGT Ser GCC Alá AAG Lys AAG ATC CTC Leu ATC Ile GTC Val ATC Ile 255 ACA Thr 828
Lys 250 Ile
GAT GGG CAG AAG TAC AAA GCG GCA 852
Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Alá Alá
260
93. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 264 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 93. számú szekvencia
Met 1 Alá Leu Gly Alá 5 Val Val Leu Leu Gly 10 Val Leu Alá Ser Tyr 15 His
Gly Phe Asn Leu Asp Val Met Ser Gly Asp Leu Pro Gly Arg Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Arg Alá Glu Arg Asp Alá Val Trp Gly Ser Arg Leu Val Val
35 40 45
Gly Alá Pro Leu Alá Val Val Ser Alá Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr
50 55 60
Glu Cys Alá Pro Alá Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met
65 70 75 80
Pro Pro Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Alá Alá Ser
85 90 95
Pro Asn His Ser Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Val His Arg Alá
100 105 110
Cys Gly Glu Asp Val Tyr Alá Gin Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Alá
115 120 125
His Alá Gin Pro Ile Gly Thr Val Pro Alá Alá Leu Pro Glu Cys Pro
130 135 140
Asp Gin Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile
145 150 155 160
Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Alá Val Met
165 170 175
Asp Gin Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gin Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser
180 185 190
Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser
195 200 205
Asn Pro Gin Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gin Leu Thr Gly Leu Thr
210 215 220
115
HU 223 977 Β1
Phe 225 Thr Alá Thr Gly Ile 230 Leu Lys Val Val Thr 235 Glu Leu Phe Gin Thr 240
Lys Asn Gly Alá Arg Glu Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr
245 250 255
Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Alá Alá
260
94. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 94. számú szekvencia
CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22
95. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 95. számú szekvencia
CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21
96. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 2499 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 96. számú szekvencia
ATGACCTTCG GCACTGTGCT TCTTCTGAGT GTCCTGGCTT CTTATCATGG ATTCAACCTG 60 GATGTGGAGG AGCCTACGAT CTTCCAGGAG GATGCAGGCG GCTTTGGGCA GAGCGTGGTG 120 CAGTTCGGTG GATCTCGACT CGTGGTGGGA GCACCCCTGG AGGTGGTGGC GGCCAACCAG 180 ACGGGACGGC TGTATGACTG CGCAGCTGCC ACCGGCATGT GCCAGCCCAT CCCGCTGCAC 240 ATCCGCCCTG AGGCCGTGAA CATGTCCTTG GGCCTGACCC TGGCAGCCTC CACCAACGGC 300 TCCCGGCTCC TGGCCTGTGG CCCGACCCTG CACAGAGTCT GTGGGGAGAA CTCATACTCA 360 AAGGGTTCCT GCCTCCTGCT GGGCTCGCGC TGGGAGATCA TCCAGACAGT CCCCGACGCC 420 ACGCCAGAGT GTCCACATCA AGAGATGGAC ATCGTCTTCC TGATTGACGG CTCTGGAAGC 480 ATTGACCAAA ATGACTTTAA CCAGATGAAG GGCTTTGTCC AAGCTGTCAT GGGCCAGTTT 540 GAGGGCACTG ACACCCTGTT TGCACTGATG CAGTACTCAA ACCTCCTGAA GATCCACTTC 600 ACCTTCACCC AATTCCGGAC CAGCCCGAGC CAGCAGAGCC TGGTGGATCC CATCGTCCAA 660 CTGAAAGGCC TGACGTTCAC GGCCACGGGC ATCCTGACAG TGGTGACACA GCTATTTCAT 720 CATAAGAATG GGGCCCGAAA AAGTGCCAAG AAGATCCTCA TTGTCATCAC AGATGGGCAG 780 AAGTACAAAG ACCCCCTGGA ATACAGTGAT GTCATCCCCC AGGCAGAGAA GGCTGGCATC 840
116
HU 223 977 Β1
ATCCGCTACG CTATCGGGGT GGGACACGCT TTCCAGGGAC CCACTGCCAG GCAGGAGCTG 900 AATACCATCA GCTCAGCGCC TCCGCAGGAC CACGTGTTCA AGGTGGACAA CTTTGCAGCC 960 CTTGGCAGCA TCCAGAAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTATG CAGTTGAGGG AACCCAGTCC 1020 AGGGCAAGCA GCTCCTTCCA GCACGAGATG TCCCAAGAAG GCTTCAGCAC AGCCCTCACA 1080 ATGGATGGCC TCTTCCTGGG GGCTGTGGGG AGCTTTAGCT GGTCTGGAGG TGCCTTCCTG 1140 TATCCCCCAA ATATGAGCCC CACCTTCATC AACATGTCTC AGGAGAATGT GGACATGAGG 1200 GACTCTTACC TGGGTTACTC CACCGAGCTA GCCCTGTGGA AGGGGGTACA GAACCTGGTC 1260 CTGGGGGCCC CCCGCTACCA GCATACCGGG AAGGCTGTCA TCTTCACCCA GGTGTCCAGG 1320 CAATGGAGGA AGAAGGCCGA AGTCACAGGG ACGCAGATCG GCTCCTACTT CGGGGCCTCC 1380 CTCTGCTCCG TGGATGTGGA CAGCGATGGC AGCACCGACC TGATCCTCAT TGGGGCCCCC 1440 CATTACTATG AGCAGACCCG AGGGGGCCAG GTGTCCGTGT GTCCCTTGCC TAGGGGGAGG 1500 GTGCAGTGGC AGTGTGACGC TGTTCTCCGT GGTGAGCAGG GCCACCCCTG GGGCCGCTTT 1560 GGGGCAGCCC TGACAGTGTT GGGGGATGTG AATGAGGACA AGCTGATAGA CGTGGCCATT 1620 GGGGCCCCGG GAGAGCAGGA GAACCGGGGT GCTGTCTACC TGTTTCACGG AGCCTCAGAA 1680 TCCGGCATCA GCCCCTCCCA CAGCCAGCGG ATTGCCAGCT CCCAGCTCTC CCCCAGGCTG 1740 CAGTATTTTG GGCAGGCGCT GAGTGGGGGT CAGGACCTCA CCCAGGATGG ACTGATGGAC 1800 CTGGCCGTGG GGGCCCGGGG CCAGGTGCTC CTGCTCAGGA GTCTGCCGGT GCTGAAAGTG 1860 GGGGTGGCCA TGAGATTCAG CCCTGTGGAG GTGGCCAAGG CTGTGTACCG GTGCTGGGAA 1920 GAGAAGCCCA GTGCCCTGGA AGCTGGGGAC GCCACCGTCT GTCTCACCAT CCAGAAAAGC 1980 TCACTGGACC AGCTAGGTGA CATCCAAAGC TCTGTCAGGT TTGATCTGGC ACTGGACCCA 2040 GGTCGTCTGA CTTCTCGTGC CATTTTCAAT GAAACCAAGA ACCCCACTTT GACTCGAAGA 2100 AAAACCCTGG GACTGGGGAT TCACTGTGAA ACCCTGAAGC TGCTTTTGCC AGTGAGGACT 2160 TTGGGTTCTG GGAAGGGGGA GAGAGGAGGA GCCCAAGGCT GGCCTGGAGC ACCCCCGTTC 2220 TCTGCTGAGC GAGGTGGGAA GGGTTAGGAT GTTGGGGCTG GAGAGAGGGA CATTAGGGCA 2280 GGAGAACCTG GCTCCACGGC TTGGAGGGAG CACTGTCAGG GCAGTGGGGA GTGGATGCAG 2340 TGGAGGAGGA CTTGTGGTGG AGCGTAGAGA GGACAGCAGG TTCTTGAAAG CCTGTTCTCT 2400 CTCAGGATTG TGTGGAGGAT GTGGTGAGCC CCATCATTCT GCACCTCAAC TTCTCACTGG 2460 TGAGAGAGCC CATCCCCTCC CCCCAGAACC TGCGTCCTG 2499
97. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3956 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (xi) A szekvencia leírása: 97. számú szekvencia
TTTAACTGCA CCAACTTTAA AATACGCTAT TGGAGCTGGA ATTACCGCGG CTGCTGGCAC 60 CAGACTTGCC CTCCAATGGA TCCTCGTTAA AGGATTTAAA GTGGACTCAT TCCAATTACA 120 GGGCCTCGAA AGAGTCCTGT ATTGTTATTT TTCGTCACTA CCTCCCCGGG TCGGGAGTGG 180 GTAATTTGCG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA TGTGGTAGCC GTTTCTCAGG CTCCCTCTCC 240 GGAATCGAAC CCTGATTCCC CGTCACCCGT GGTCACCATG GTAGGCACGT GCAGTTCGGT 300 GGATCTCGAC TCGTGGTGGG AGCACCCCTG GAGGTGGTGG CGGCCAACCA GACGGGACGG 360 CTGTATGACT GCGCAGCTGC CACCGGCATG TGCCAGCCCA TCCCGCTGCA CATCCGCCCT 420 GAGGCCGTGA ACATGTCCTT GGGCCTGACC CTGGCAGCCT CCACCAACGG CTCCCGGCTC 480 CTGGCCTGTG GCCCGACCCT GCACAGAGTC TGTGGGGAGA ACTCATACTC AAAGGGTTCC 540 TGCCTCCTGC TGGGCTCGCG CTGGGAGATC ATCCAGACAG TCCCCGACGC CACGCCAGAG 600 TGTCCACATC AAGAGATGGA CATCGTCTTC CTGATTGACG GCTCTGGAAG CATTGACCAA 660 AATGACTTTA ACCAGATGAA GGGCTTTGTC CAAGCTGTCA TGGGCCAGTT TGAGGGCACT 720 GACACCCTGT TTGCACTGAT GCAGTACTCA AACCTCCTGA AGATCCACTT CACCTTCACC 780 CAATTCCGGA CCAGCCCGAG CCAGCAGAGC CTGGTGGATC CCATCGTCCA ACTGAAAGGC 840 CTGACGTTCA CGGCCACGGG CATCCTGACA GTGGTGACAC AGCTATTTCA TCATAAGAAT 900 GGGGCCCGAA AAAGTGCCAA GAAGATCCTC ATTGTCATCA CAGATGGGCA GAAGTACAAA 960 GACCCCCTGG AATACAGTGA TGTCATCCCC CAGGCAGAGA AGGCTGGCAT CATCCGCTAC 1020 GCTATCGGGG TGGGACACGC TTTCCAGGGA CCCACTGCCA GGCAGGAGCT GAATACCATC 1080 AGCTCAGCGC CTCCGCAGGA CCACGTGTTC AAGGTGGACA ACTTTGCAGC CCTTGGCAGC 1140 ATCCAGAAGC AGCTGCAGGA GAAGATCTAT GCAGTTGAGG GAACCCAGTC CAGGGCAAGC 1200
117
HU 223 977 Β1
AGCTCCTTCC AGCACGAGAT GTCCCAAGAA GGCTTCAGCA CAGCCCTCAC AATGGATGGC 1260
CTCTTCCTGG GGGCTGTGGG GAGCTTTAGC TGGTCTGGAG GTGCCTTCCT GTATCCCCCA 1320
AATATGAGCC CCACCTTCAT CAACATGTCT CAGGAGAATG TGGACATGAG GGACTCTTAC 1380
CTGGGTTACT CCACCGAGCT AGCCCTGTGG AAGGGGGTAC AGAACCTGGT CCTGGGGGCC 1440
CCCCGCTACC AGCATACCGG GAAGGCTGTC ATCTTCACCC AGGTGTCCAG GCAATGGAGG 1500
AAGAAGGCCG AAGTCACAGG GACGCAGATC GGCTCCTACT TCGGGGCCTC CCTCTGCTCC 1560
GTGGATGTGG ACAGCGATGG CAGCACCGAC CTGATCCTCA TTGGGGCCCC CCATTACTAT 1620
GAGCAGACCC GAGGGGGCCA GGTGTCCGTG TGTCCCTTGC CTAGGGGGAG GGTGCAGTGG 1680
CAGTGTGACG CTGTTCTCCG TGGTGAGCAG GGCCACCCCT GGGGCCGCTT TGGGGCAGCC 1740
CTGACAGTGT TGGGGGATGT GAATGAGGAC AAGCTGATAG ACGTGGCCAT TGGGGCCCCG 1800
GGAGAGCAGG AGAACCGGGG TGCTGTCTAC CTGTTTCACG GAGCCTCAGA ATCCGGCATC 1860
AGCCCCTCCC ACAGCCAGCG GATTGCCAGC TCCCAGCTCT CCCCCAGGCT GCAGTATTTT 1920
GGGCAGGCGC TGAGTGGGGG TCAGGACCTC ACCCAGGATG GACTGATGGA CCTGGCCGTG 1980
GGGGCCCGGG GCCAGGTGCT CCTGCTCAGG AGTCTGCCGG TGCTGAAAGT GGGGGTGGCC 2040
ATGAGATTCA GCCCTGTGGA GGTGGCCAAG GCTGTGTACC GGTGCTGGGA AGAGAAGCCC 2100
AGTGCCCTGG AAGCTGGGGA CGCCACCGTC TGTCTCACCA TCCAGAAAAG CTCACTGGAC 2160
CAGCTAGGTG ACATCCAAAG CTCTGTCAGG TTTGATCTGG CACTGGACCC AGGTCGTCTG 2220
ACTTCTCGTG CCATTTTCAA TGAAACCAAG AACCCCACTT TGACTCGAAG AAAAACCCTG 2280
GGACTGGGGA TTCACTGTGA AACCCTGAAG CTGCTTTTGC CAGATTGTGT GGAGGATGTG 2340
GTGAGCCCCA TCATTCTGCA CCTCAACTTC TCACTGGTGA GAGAGCCCAT CCCCTCCCCC 2400
CAGAACCTGC GTCCTGTGCT GGCCGTGGGC TCACAAGACC TCTTCACTGC TTCTCTCCCC 2460
TTCGAGAAGA ACTGTGGGCA AGATGGCCTC TGTGAAGGGG ACCTGGGTGT CACCCTCAGC 2520
TTCTCAGGCC TGCAGACCCT GACCGTGGGG AGCTCCCTGG AGCTCAACGT GATTGTGACT 2580
GTGTGGAACG CAGGTGAGGA TTCCTACGGA ACCGTGGTCA GCCTCTACTA TCCAGCAGGG 2640
CTGTCGCACC GACGGGTGTC AGGAGCCCAG AAGCAGCCCC ATCAGAGTGC CCTGCGCCTG 2700
GCATGTGAGA CAGTGCCCAC TGAGGATGAG GGCCTAAGAA GCAGCCGCTG CAGTGTCAAC 2760
CACCCCATCT TCCATGAGGG CTCTAACGGC ACCTTCATAG TCACATTCGA TGTCTCCTAC 2820
AAGGCCACCC TGGGAGACAG GATGCTTATG AGGGCCAGTG CAAGCAGTGA GAACAATAAG 2880
GCTTCAAGCA GCAAGGCCAC CTTCCAGCTG GAGCTCCCGG TGAAGTATGC AGTCTACACC 2940
ATGATCAGCA GGCAGGAAGA ATCCACCAAG TACTTCAACT TTGCAACCTC CGATGAGAAG 3000
AAAATGAAAG AGGCTGAGCA TCGATACCGT GTGAATAACC TCAGCCAGCG AGATCTGGCC 3060
ATCAGCATTA ACTTCTGGGT TCCTGTCCTG CTGAACGGGG TGGCTGTGTG GGATGTGGTC 3120
ATGGAGGCCC CATCTCAGAG TCTCCCCTGT GTTTCAGAGA GAAAACCTCC CCAGCATTCT 3180
GACTTCCTGA CCCAGATTTC AAGAAGTCCC ATGCTGGACT GCTCCATTGC TGACTGCCTG 3240
CAGTTCCGCT GTGACGTCCC CTCCTTCAGC GTCCAGGAGG AGCTGGATTT CACCCTGAAG 3300
GGCAATCTCA GTTTCGGCTG GGTCCGCGAG ACATTGCAGA AGAAGGTGTT GGTCGTGAGT 3360
GTGGCTGAAA TTACGTTCGA CACATCCGTG TACTCCCAGC TTCCAGGACA GGAGGCATTT 3420
ATGAGAGCTC AGATGGAGAT GGTGCTAGAA GAAGACGAGG TCTACAATGC CATTCCCATC 3480
ATCATGGGCA GCTCTGTGGG GGCTCTGCTA CTGCTGGCGC TCATCACAGC CACACTGTAC 3540
AAGCTTGGCT TCTTCAAACG CCACTACAAG GAAATGCTGG AGGACAAGCC TGAAGACACT 3600
GCCACATTCA GTGGGGACGA TTTCAGCTGT GTGGCCCCAA ATGTGCCTTT GTCCTAATAA 3660
TCCACTTTCC TGTTTATCTC TACCACTGTG GGCTGGACTT GCTTGCAACC ATAAATCAAC 3720
TTACATGGAA ACAACTTCTG CATAGATCTG CACTGGCCTA AGCAACCTAC CAGGTGCTAA 3780
GCACCTTCTC GGAGAGATAG AGATTGTCAA TGTTTTTACA TATCTGTCCA TCTTTTTCAG 3840
CAATGACCCA CTTTTTACAG AAGCAGGCAT GGTGCCAGCA TAAATTTTCA TATGCTTAAG 3900
AATTGTCACA TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTTTAG 3956
98. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 3785 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1...3486
118
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 98. számú szekvencia
ATG Met 1 ACC Thr TTC Phe GGC Gly ACT Thr 5 GTG Val CTT Leu CTT Leu CTG Leu AGT Ser 10 GTC Val CTG Leu GCT Alá TCT Ser TAT Tyr 15 CAT His 48
GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA 96
Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gin Glu Asp Alá
20 25 30
GGC GGC TTT GGG CAG AGC GTG GTG CAG TTC GGT GGA TCT CGA CTC GTG 144
Gly Gly Phe Gly Gin Ser Val Val Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
35 40 45
GTG GGA GCA CCC CTG GAG GTG GTG GCG GCC AAC CAG ACG GGA CGG CTG 192
Val Gly Alá Pro Leu Glu Val Val Alá Alá Asn Gin Thr Gly Arg Leu
50 55 60
TAT GAC TGC GCA GCT GCC ACC GGC ATG TGC CAG CCC ATC CCG CTG CAC 240
Tyr Asp Cys Alá Alá Alá Thr Gly Met Cys Gin Pro Ile Pro Leu His
65 70 75 80
ATC CGC CCT GAG GCC GTG AAC ATG TCC TTG GGC CTG ACC CTG GCA GCC 288
Ile Arg Pro Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Alá Alá
85 90 95
TCC ACC AAC GGC TCC CGG CTC CTG GCC TGT GGC CCG ACC CTG CAC AGA 336
Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Leu His Arg
100 105 110
GTC TGT GGG GAG AAC TCA TAC TCA AAG GGT TCC TGC CTC CTG CTG GGC 384
Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
115 120 125
TCG CGC TGG GAG ATC ATC CAG ACA GTC CCC GAC GCC ACG CCA GAG TGT 432
Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gin Thr Val Pro Asp Alá Thr Pro Glu Cys
130 135 140
CCA CAT CAA GAG ATG GAC ATC GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGA AGC 480
Pro His Gin Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
ATT GAC CAA AAT GAC TTT AAC CAG ATG AAG GGC TTT GTC CAA GCT GTC 528
Ile Asp Gin Asn Asp Phe Asn Gin Met Lys Gly Phe Val Gin Alá Val
165 170 175
ATG GGC CAG TTT GAG GGC ACT GAC ACC CTG TTT GCA CTG ATG CAG TAC 576
Met Gly Gin Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Alá Leu Met Gin Tyr
180 185 190
TCA AAC CTC CTG AAG ATC CAC TTC ACC TTC ACC CAA TTC CGG ACC AGC 624
Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gin Phe Arg Thr Ser
195 200 205
CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG 672
Pro Ser Gin Gin Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gin Leu Lys Gly Leu
210 215 220
119
HU 223 977 Β1
ACG Thr 225 TTC ACG GCC ACG GGC ATC CTG ACA GTG GTG Val 235 ACA Thr CAG Gin CTA Leu TTT Phe CAT His 240 720
Phe Thr Alá Thr Gly 230 Ile Leu Thr Val
CAT AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATT GTC ATC 768
His Lys Asn Gly Alá Arg Lys Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
245 250 255
ACA GAT GGG CAG AAG TAC AAA GAC CCC CTG GAA TAC AGT GAT GTC ATC 816
Thr Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile
260 265 270
CCC CAG GCA GAG AAG GCT GGC ATC ATC CGC TAC GCT ATC GGG GTG GGA 864
Pro Gin Alá Glu Lys Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val Gly
275 280 285
CAC GCT TTC CAG GGA CCC ACT GCC AGG CAG GAG CTG AAT ACC ATC AGC 912
His Alá Phe Gin Gly Pro Thr Alá Arg Gin Glu Leu Asn Thr Ile Ser
290 295 300
TCA GCG CCT CCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GAC AAC TTT GCA GCC 960
Ser Alá Pro Pro Gin Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Alá Alá
305 310 315 320
CTT GGC AGC ATC CAG AAG CAG CTG CAG GAG AAG ATC TAT GCA GTT GAG 1008
Leu Gly Ser Ile Gin Lys Gin Leu Gin Glu Lys Ile Tyr Alá Val Glu
325 330 335
GGA ACC CAG TCC AGG GCA AGC AGC TCC TTC CAG CAC GAG ATG TCC CAA 1056
Gly Thr Gin Ser Arg Alá Ser Ser Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin
340 345 350
GAA GGC TTC AGC ACA GCC CTC ACA ATG GAT GGC CTC TTC CTG GGG GCT 1104
Glu Gly Phe Ser Thr Alá Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Alá
355 360 365
GTG GGG AGC TTT AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC CTG TAT CCC CCA AAT 1152
Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro Pro Asn
370 375 380
ATG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGG 1200
Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg
385 390 395 400
GAC TCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GAG CTA GCC CTG TGG AAG GGG GTA 1248
Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Alá Leu Trp Lys Gly Val
405 410 415
CAG AAC CTG GTC CTG GGG GCC CCC CGC TAC CAG CAT ACC GGG AAG GCT 1296
Gin Asn Leu Val Leu Gly Alá Pro Arg Tyr Gin His Thr Gly Lys Alá
420 425 430
GTC ATC TTC ACC CAG GTG TCC AGG CAA TGG AGG AAG AAG GCC GAA GTC 1344
Val Ile Phe Thr Gin Val Ser Arg Gin Trp Arg Lys Lys Alá Glu Val
435 440 445
ACA GGG ACG CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC TGC TCC GTG 1392
Thr Gly Thr Gin Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Alá Ser Leu Cys Ser Val
450 455 460
120
HU 223 977 Β1
GAT Asp 465 GTG Val GAC AGC GAT Asp GGC AGC ACC GAC Asp CTG Leu ATC Ile 475 CTC Leu ATT Ile GGG Gly GCC Ala CCC Pro 480 1440
Asp Ser Gly 470 Ser Thr
CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG GGC CAG GTG TCC GTG TGT CCC TTG 1488
His Tyr Tyr Glu Gin 485 Thr Arg Gly Gly Gin 490 Val Ser Val Cys Pro 495 Leu
CCT AGG GGG AGG GTG CAG TGG CAG TGT GAC GCT GTT CTC CGT GGT GAG 1536
Pro Arg Gly Arg 500 Val Gin Trp Gin Cys 505 Asp Ala Val Leu Arg 510 Gly Glu
CAG GGC CAC CCC TGG GGC CGC TTT GGG GCA GCC CTG ACA GTG TTG GGG 1584
Gin Gly His 515 Pro Trp Gly Arg Phe 520 Gly Ala Ala Leu Thr 525 Val Leu Gly
GAT GTG AAT GAG GAC AAG CTG ATA GAC GTG GCC ATT GGG GCC CCG GGA 1632
Asp Val 530 Asn Glu Asp Lys Leu 535 Ile Asp Val Ala Ile 540 Gly Ala Pro Gly
GAG CAG GAG AAC CGG GGT GCT GTC TAC CTG TTT CAC GGA GCC TCA GAA 1680
Glu 545 Gin Glu Asn Arg Gly 550 Ala Val Tyr Leu Phe 555 His Gly Ala Ser Glu 560
TCC GGC ATC AGC CCC TCC CAC AGC CAG CGG ATT GCC AGC TCC CAG CTC 1728
Ser Gly Ile Ser Pro 565 Ser His Ser Gin Arg 570 Ile Ala Ser Ser Gin 575 Leu
TCC CCC AGG CTG CAG TAT TTT GGG CAG GCG CTG AGT GGG GGT CAG GAC 1776
Ser Pro Arg Leu 580 Gin Tyr Phe Gly Gin 585 Ala Leu Ser Gly Gly 590 Gin Asp
CTC ACC CAG GAT GGA CTG ATG GAC CTG GCC GTG GGG GCC CGG GGC CAG 1824
Leu Thr Gin 595 Asp Gly Leu Met Asp 600 Leu Ala Val Gly Ala 605 Arg Gly Gin
GTG CTC CTG CTC AGG AGT CTG CCG GTG CTG AAA GTG GGG GTG GCC ATG 1872
Val Leu 610 Leu Leu Arg Ser Leu 615 Pro Val Leu Lys Val 620 Gly Val Ala Met
AGA TTC AGC CCT GTG GAG GTG GCC AAG GCT GTG TAC CGG TGC TGG GAA 1920
Arg 625 Phe Ser Pro Val Glu 630 Val Ala Lys Ala Val 635 Tyr Arg Cys Trp Glu 640
GAG AAG CCC AGT GCC CTG GAA GCT GGG GAC GCC ACC GTC TGT CTC ACC 1968
Glu Lys Pro Ser Ala 645 Leu Glu Ala Gly Asp 650 Ala Thr Val Cys Leu 655 Thr
ATC CAG AAA AGC TCA CTG GAC CAG CTA GGT GAC ATC CAA AGC TCT GTC 2016
Ile Gin Lys Ser 660 Ser Leu Asp Gin Leu 665 Gly Asp Ile Gin Ser 670 Ser Val
AGG TTT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGT CGT CTG ACT TCT CGT GCC ATT 2064
Arg Phe Asp 675 Leu Ala Leu Asp Pro 680 Gly Arg Leu Thr Ser 685 Arg Ala Ile
TTC AAT GAA ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG GGA 2112
Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
690 695 700
121
HU 223 977 Β1
CTG GGG ATT CAC His TGT Cys GAA Glu 710 ACC Thr CTG AAG CTG Leu CTT Leu 715 TTG Leu CCA Pro GAT Asp TGT Cys GTG Val 720 2160
Leu 705 Gly Ile Leu Lys
GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC AAC TTC TCA CTG GTG 2208
Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val
725 730 735
AGA GAG CCC ATC CCC TCC CCC CAG AAC CTG CGT CCT GTG CTG GCC GTG 2256
Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gin Asn Leu Arg Pro Val Leu Alá Val
740 745 750
GGC TCA CAA GAC CTC TTC ACT GCT TCT CTC CCC TTC GAG AAG AAC TGT 2304
Gly Ser Gin Asp Leu Phe Thr Alá Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys
755 760 765
GGG CAA GAT GGC CTC TGT GAA GGG GAC CTG GGT GTC ACC CTC AGC TTC 2352
Gly Gin Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe
770 775 780
TCA GGC CTG CAG ACC CTG ACC GTG GGG AGC TCC CTG GAG CTC AAC GTG 2400
Ser Gly Leu Gin Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val
785 790 795 800
ATT GTG ACT GTG TGG AAC GCA GGT GAG GAT TCC TAC GGA ACC GTG GTC 2448
Ile Val Thr Val Trp Asn Alá Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val
805 810 815
AGC CTC TAC TAT CCA GCA GGG CTG TCG CAC CGA CGG GTG TCA GGA GCC 2496
Ser Leu Tyr Tyr Pro Alá Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Alá
820 825 830
CAG AAG CAG CCC CAT CAG AGT GCC CTG CGC CTG GCA TGT GAG ACA GTG 2544
Gin Lys Gin Pro His Gin Ser Alá Leu Arg Leu Alá Cys Glu Thr Val
835 840 845
CCC ACT GAG GAT GAG GGC CTA AGA AGC AGC CGC TGC AGT GTC AAC CAC 2592
Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His
850 855 860
CCC ATC TTC CAT GAG GGC TCT AAC GGC ACC TTC ATA GTC ACA TTC GAT 2640
Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp
865 870 875 880
GTC TCC TAC AAG GCC ACC CTG GGA GAC AGG ATG CTT ATG AGG GCC AGT 2688
Val Ser Tyr Lys Alá Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Alá Ser
885 890 895
GCA AGC AGT GAG AAC AAT AAG GCT TCA AGC AGC AAG GCC ACC TTC CAG 2736
Alá Ser Ser Glu Asn Asn Lys Alá Ser Ser Ser Lys Alá Thr Phe Gin
900 905 910
CTG GAG CTC CCG GTG AAG TAT GCA GTC TAC ACC ATG ATC AGC AGG CAG 2784
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Alá Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gin
915 920 925
GAA GAA TCC ACC AAG TAC TTC AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG AAA 2832
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Alá Thr Ser Asp Glu Lys Lys
930 935 940
122
HU 223 977 Β1
ATG Met 945 AAA Lys GAG Glu GCT Alá GAG Glu CAT His 950 CGA Arg TAC Tyr CGT Arg GTG Val AAT Asn 955 AAC Asn CTC Leu AGC Ser CAG Gin CGA Arg 960 2880
GAT CTG GCC ATC AGC ATT AAC TTC TGG GTT CCT GTC CTG CTG AAC GGG 2928
Asp Leu Alá Ile Ser 965 Ile Asn Phe Trp Val 970 Pro Val Leu Leu Asn 975 Gly
GTG GCT GTG TGG GAT GTG GTC ATG GAG GCC CCA TCT CAG AGT CTC CCC 2976
Val Alá Val Trp 980 Asp Val Val Met Glu 985 Alá Pro Ser Gin Ser 990 Leu Pro
TGT GTT TCA GAG AGA AAA CCT CCC CAG CAT TCT GAC TTC CTG ACC CAG 3024
Cys Val Ser 995 Glu Arg Lys Pro Pro 100C Gin 1 His Ser Asp Phe Leu 1005 Thr Gin
ATT TCA AGA AGT CCC ATG CTG GAC TGC TCC ATT GCT GAC TGC CTG CAG 3072
Ile Ser 101C Arg 1 Ser Pro Met Leu 1015 Asp Cys Ser Ile Alá 102C Asp 1 Cys Leu Gin
TTC CGC TGT GAC GTC CCC TCC TTC AGC GTC CAG GAG GAG CTG GAT TTC 3120
Phe Arg 1025 Cys Asp Val Pro 103C Ser ) Phe Ser Val Gin Glu 1035 Glu Leu Asp Phe 1040
ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG CAG 3168
Thr Leu Lys Gly Asn Leu 1045 Ser Phe Gly Trp 105C Val ) Arg Glu Thr Leu Gin 1055
AAG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GAA ATT ACG TTC GAC ACA TCC 3216
Lys Lys Val Leu Val 1060 Val Ser Val Alá 1065 Glu Ile Thr Phe Asp 107C Thr ) Ser
GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG ATG 3264
Val Tyr Ser Gin 1075 Leu Pro Gly Gin 108C Glu 1 Alá Phe Met Arg Alá 1085 Gin Met
GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC ATC 3312
Glu Met 109C Val 1 Leu Glu Glu Asp 1095 Glu Val Tyr Asn Alá 110C He 1 Pro Ile He
ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA GCC 3360
Met Gly 1105 Ser Ser Val Gly 111C Alá 1 Leu Leu Leu Leu 1115 Alá Leu He Thr Alá 1120
ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AAG GAA ATG CTG 3408
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly 1125 Phe Phe Lys Arg 113C His 1 Tyr Lys Glu Met 1135 Leu
GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC AGC 3456
Glu Asp Lys Pro 114C Glu 1 Asp Thr Alá Thr 1145 Phe » Ser Gly Asp Asp 115C Phe 1 Ser
TGT Cys GTG Val GCC Alá CCA Pro AAT Asn GTG Val CCT Pro TTG Leu TCC Ser TAATAATCCA CTTTCCTGTT 3503
1155 1160
TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA 3563 CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG 3623 AGATAGAGAT TGTCAATGTT TTTACATATC TGTCCATCTT TTTCAGCAAT GACCCACTTT 3683 TTACAGAAGC AGGCATGGTG CCAGCATAAA TTTTCATATG CTTAAGAATT GTCACATGAA 3743 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAACTTT AG 3785
123
HU 223 977 Β1
99. számú szekvenciavazlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1161 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 99. számú szekvencia
Met Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu 1 5
Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu 20
Gly Gly Phe Gly Gin Ser Val Val 35 40
Val Gly Alá Pro Leu Glu Val Val 50 55
Tyr Asp Cys Alá Alá Alá Thr Gly 65 70
Ile Arg Pro Glu Alá Val Asn Met 85
Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu 100
Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser 115 120
Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gin Thr 130 135
Pro His Gin Glu Met Asp Ile Val 145 150
Ile Asp Gin Asn Asp Phe Asn Gin 165
Met Gly Gin Phe Glu Gly Thr Asp 180
Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe 195 200
Pro Ser Gin Gin Ser Leu Val Asp 210 215
Thr Phe Thr Alá Thr Gly Ile Leu 225 230
His Lys Asn Gly Alá Arg Lys Ser 245
Thr Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Asp 260
Leu Ser Val Leu Alá Ser Tyr His 10 15
Pro Thr Ile Phe Gin Glu Asp Alá 25 30
Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val 45
Alá Alá Asn Gin Thr Gly Arg Leu 60
Met Cys Gin Pro Ile Pro Leu His 75 80
Ser Leu Gly Leu Thr Leu Alá Alá 90 95
Alá Cys Gly Pro Thr Leu His Arg 105 110
Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly 125
Val Pro Asp Alá Thr Pro Glu Cys 140
Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser 155 160
Met Lys Gly Phe Val Gin Alá Val 170 175
Thr Leu Phe Alá Leu Met Gin Tyr 185 190
Thr Phe Thr Gin Phe Arg Thr Ser 205
Pro Ile Val Gin Leu Lys Gly Leu 220
Thr Val Val Thr Gin Leu Phe His 235 240
Alá Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile 250 255
Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile 265 270
124
HU 223 977 Β1
Pro Gin Alá Glu Lys Alá Gly 275
His Alá Phe Gin Gly Pro Thr 290 295
Ser Alá Pro Pro Gin Asp His 305 310
Leu Gly Ser Ile Gin Lys Gin 325
Gly Thr Gin Ser Arg Alá Ser 340
Glu Gly Phe Ser Thr Alá Leu 355
Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser 370 375
Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn 385 390
Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser 405
Gin Asn Leu Val Leu Gly Alá 420
Val Ile Phe Thr Gin Val Ser 435
Thr Gly Thr Gin Ile Gly Ser 450 455
Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser 465 470
His Tyr Tyr Glu Gin Thr Arg 485
Pro Arg Gly Arg Val Gin Trp 500
Gin Gly His Pro Trp Gly Arg 515
Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu 530 535
Glu Gin Glu Asn Arg Gly Alá 545 550
Ser Gly Ile Ser Pro Ser His 565
Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe 580
Ile Ile Arg Tyr Alá 280
Alá Arg Gin Glu Leu 300
Val Phe Lys Val Asp 315
Leu Gin Glu Lys Ile 330
Ser Ser Phe Gin His 345
Thr Met Asp Gly Leu 360
Gly Gly Alá Phe Leu 380
Met Ser Gin Glu Asn 395
Thr Glu Leu Alá Leu 410
Pro Arg Tyr Gin His 425
Arg Gin Trp Arg Lys 440
Tyr Phe Gly Alá Ser 460
Thr Asp Leu Ile Leu 475
Gly Gly Gin Val Ser 490
Gin Cys Asp Alá Val 505
Phe Gly Alá Alá Leu 520
Ile Asp Val Alá Ile 540
Val Tyr Leu Phe His 555
Ser Gin Arg Ile Alá 570
Gly Gin Alá Leu Ser 585
Ile Gly Val Gly 285
Asn Thr Ile Ser
Asn Phe Alá Alá 320
Tyr Alá Val Glu 335
Glu Met Ser Gin 350
Phe Leu Gly Alá 365
Tyr Pro Pro Asn
Val Asp Met Arg 400
Trp Lys Gly Val 415
Thr Gly Lys Alá 430
Lys Alá Glu Val 445
Leu Cys Ser Val
Ile Gly Alá Pro 480
Val Cys Pro Leu 495
Leu Arg Gly Glu 510
Thr Val Leu Gly 525
Gly Alá Pro Gly
Gly Alá Ser Glu 560
Ser Ser Gin Leu 575
Gly Gly Gin Asp 590
125
HU 223 977 Β1
Leu Thr Gin 595
Val Leu Leu 610
Arg Phe Ser 625
Glu Lys Pro
Asp Gly Leu Met
Ile Gin Lys
Arg Phe Asp 675
Phe Asn Glu 690
Leu Gly Ile 705
Glu Asp Val
Leu Arg Ser Leu 615
Pro Val Glu Val 630
Ser Ala Leu Glu 645
Ser Ser Leu Asp 660
Leu Ala Leu Asp
Arg Glu Pro
Gly Ser Gin 755
Gly Gin Asp 770
Ser Gly Leu 785
Ile Val Thr
Thr Lys Asn Pro 695
His Cys Glu Thr 710
Val Ser Pro Ile 725
Ile Pro Ser Pro 740
Asp Leu Phe Thr
Ser Leu Tyr
Gin Lys Gin 835
Pro Thr Glu 850
Pro Ile Phe 865
Val Ser Tyr
Gly Leu Cys Glu 775
Gin Thr Leu Thr 790
Val Trp Asn Ala 805
Tyr Pro Ala Gly 820
Pro His Gin Ser
Ala Ser Ser
Asp Glu Gly Leu 855
His Glu Gly Ser 870
Lys Ala Thr Leu 885
Glu Asn Asn Lys 900
Asp Leu 600
Pro Val
Ala Lys
Ala Gly
Gin Leu 665
Pro Gly 680
Thr Leu
Leu Lys
Ile Leu
Gin Asn 745
Ala Ser 760
Gly Asp
Val Gly
Gly Glu
Leu Ser 825
Ala Leu 840
Arg Ser
Asn Gly
Gly Asp
Ala Ser 905
Ala Val
Leu Lys
Ala Val 635
Asp Ala 650
Gly Asp
Arg Leu
Thr Arg
Leu Leu 715
His Leu 730
Leu Arg
Leu Pro
Leu Gly
Ser Ser 795
Asp Ser 810
His Arg
Arg Leu
Ser Arg
Thr Phe 875
Arg Met 890
Ser Ser
Gly Ala Arg Gly Gin 605
Val Gly Val Ala Met 620
Tyr Arg Cys Trp Glu 640
Thr Val Cys Leu Thr 655
Ile Gin Ser Ser Val 670
Thr Ser Arg Ala Ile 685
Arg Lys Thr Leu Gly 700
Leu Pro Asp Cys Val 720
Asn Phe Ser Leu Val 735
Pro Val Leu Ala Val 750
Phe Glu Lys Asn Cys 765
Val Thr Leu Ser Phe 780
Leu Glu Leu Asn Val 800
Tyr Gly Thr Val Val 815
Arg Val Ser Gly Ala 830
Ala Cys Glu Thr Val 845
Cys Ser Val Asn His 860
Ile Val Thr Phe Asp 880
Leu Met Arg Ala Ser 895
Lys Ala Thr Phe Gin 910
126
HU 223 977 Β1
Leu Glu Leu 915 Pro Val Lys Tyr Alá 920 Val Tyr Thr Met Ile 925 Ser Arg Gin
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Alá Thr Ser Asp Glu Lys Lys
930 935 940
Met Lys Glu Alá Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gin Arg
945 950 955 960
Asp Leu Alá Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
965 970 975
Val Alá Val Trp Asp Val Val Met Glu Alá Pro Ser Gin Ser Leu Pro
980 985 990
Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gin His Ser Asp Phe Leu Thr Gin
995 1000 1005
Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Alá Asp Cys Leu Gin
1010 1015 1020
Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gin Glu Glu Leu Asp Phe
1025 1030 1035 1040
Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gin
1045 1050 1055
Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Alá Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
1060 1065 1070
Val Tyr Ser Gin Leu Pro Gly Gin Glu Alá Phe Met Arg Alá Gin Met
1075 1080 1085
Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Alá Ile Pro Ile Ile
1090 1095 1100
Met Gly Ser Ser Val Gly Alá Leu Leu Leu Leu Alá Leu Ile Thr Alá
1105 1110 1115 1120
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu
1125 1130 1135
Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Alá Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser
1140 1145 1150
Cys Val Alá Pro Asn Val Pro Leu Ser
1155 1160
100. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1318 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszáíú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 17...1255
127
HU 223 977 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 100. számú szekvencia
AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT 49
Gly Alá Val Val Leu Leu Gly Val Leu Alá Ser
10
TAC Tyr CAC His GGA Gly TTC Phe 15 AAC Asn TTG Leu GAC Asp GTG Val GAT Asp 20 GAG Glu CCG Pro GTG Val ATC Ile TTC Phe 25 CAG Gin GAA Glu 97
GAC GCA GCG GGC TTC GGG CAG AGC GTG ATG CAG TTT GGA GGA TCT CGA 145
Asp Alá Alá Gly Phe Gly Gin Ser Val Met Gin Phe Gly Gly Ser Arg
30 35 40
CTC GTG GTG GGA GCC CCC CTG GCG GTG GTG TCG GCC AAC CAC ACA GGA 193
Leu Val Val Gly Alá Pro Leu Alá Val Val Ser Alá Asn His Thr Gly
45 50 55
CGG CTG TAC GAG TGT GCG CCT GCC TCC GGC ACC TGC ACG CCC ATT TTC 241
Arg Leu Tyr Glu Cys Alá Pro Alá Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe
60 65 70 75
CCA TTC ATG CCC CCC GAA GCC GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCC CTG 289
Pro Phe Met Pro Pro Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
80 85 90
GCA GCC TCC CCC AAC CAT TCC CAG CTG CTG GCT TGT GGC CCG ACC GTG 337
Alá Alá Ser Pro Asn His Ser Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Val
95 100 105
CAT AGA GCC TGC GGG GAG GAC GTG TAC GCC CAG GGT TTC TGT GTG CTG 385
His Arg Alá Cys Gly Glu Asp Val Tyr Alá Gin Gly Phe Cys Val Leu
110 115 120
CTG GAT GCC CAC GCA CAG CCC ATC GGG ACT GTG CCA GCT GCC CTG CCC 433
Leu Asp Alá His Alá Gin Pro Ile Gly Thr Val Pro Alá Alá Leu Pro
125 130 135
GAG TGC CCA GAT CAA GAG ATG GAC ATT GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT 481
Glu Cys Pro Asp Gin Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser
140 145 150 155
GGC AGC ATT AGC TCA AAT GAC TTC CGC AAG ATG AAG GAC TTT GTC AGA 529
Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg
160 165 170
GCT GTG ATG GAC CAG TTC AAG GAC ACC AAC ACC CAG TTC TCG CTG ATG 577
Alá Val Met Asp Gin Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gin Phe Ser Leu Met
175 180 185
CAG TAC TCC AAT GTG CTG GTG ACA CAT TTC ACC TTC AGC AGC TTC CGG 625
Gin Tyr Ser Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg
190 195 200
AAC AGC TCC AAT CCT CAG GGC CTA GTG GAG CCC ATT GTG CAG CTG ACA 673
Asn Ser Ser Asn Pro Gin Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gin Leu Thr
205 210 215
128
HU 223 977 Β1
GGC Gly 220 CTC Leu ACG Thr TTC ACG GCC ACA GGG Gly ATC Ile CTG Leu AAA Lys 230 GTG Val GTG Val ACA Thr GAG Glu CTG Leu 235 721
Phe Thr Alá 225 Thr
TTT CAA ACC AAG AAC GGG GCC CGC GAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATC 769
Phe Gin Thr Lys Asn Gly Alá Arg Glu Ser Alá Lys Lys Ile Leu Ile
240 245 250
GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAG TAC AAA GAC CCC CTG CAC TAC AGT GCT 817
Val Ile Thr Asp Gly Gin Lys Tyr Lys Asp Pro Leu His Tyr Ser Alá
255 260 265
GTC ATC CCA CAG GCA GAG CAG GCG GGC ATC ATC CGC TAC GCC ATC GGG 865
Val Ile Pro Gin Alá Glu Gin Alá Gly Ile Ile Arg Tyr Alá Ile Gly
270 275 280
GTG GGG GAC GCG TTC CAG AAA CCC ACA GCC AGG CAG GAG CTG GAC ACC 913
Val Gly Asp Alá Phe Gin Lys Pro Thr Alá Arg Gin Glu Leu Asp Thr
285 290 295
ATC GCC TCC GAG CCG CCC GAC GCC CAC GTG TTC CAG GTG GAC AAT TTC 961
Ile Alá Ser Glu Pro Pro Asp Alá His Val Phe Gin Val Asp Asn Phe
300 305 310 315
TCA GCA CTC AGC AGC ATC CAA AAG CAG CTG TAT GAC AGG ATC TTT GCC 1009
Ser Alá Leu Ser Ser Ile Gin Lys Gin Leu Tyr Asp Arg Ile Phe Alá
320 325 330
GTC GAG GGA ACC CTG TCA TCG GCA AGC ACC TCC TTC CAG CAT GAG ATG 1057
Val Glu Gly Thr Leu Ser Ser Alá Ser Thr Ser Phe Gin His Glu Met
335 340 345
TCC CAA GAG GGC TTC AGC TCA CTT CTC ACC ACG GAA GGA CCG GTG CTG 1105
Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Leu Leu Thr Thr Glu Gly Pro Val Leu
350 355 360
GGG GCT GTG GGC AGC TTC GAT TGG TCC GGG GGT GCT TTC CTG TAC CCC 1153
Gly Alá Val Gly Ser Phe Asp Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro
365 370 375
CCC GGC GGG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG CAG AAC GTG GAC 1201
Pro Gly Gly Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Gin Asn Val Asp
380 385 390 395
ATG AGG GAC TCC TAC CTG GGT GAG GAA GGG GTG GGG GTG GGG ACA GGT 1249
Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Val Gly Val Gly Thr Gly
400 405 410
GGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGGCTG GGAGGGGAGG GAAGAGGAGG 1305
Gly Ser
GGAGAGGCAA AGA 1318
101. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 413 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris
129
HU 223 977 Β1 (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 101. számú szekvencia
Gly Alá Val Val Leu Leu Gly Val Leu Alá Ser Tyr His Gly Phe Asn 15 10 15
Leu Asp Val Asp Glu Pro Val He Phe Gin Glu Asp Alá Alá Gly Phe 20 25 30
Gly Gin Ser Val Met Gin Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Alá 35 40 45
Pro Leu Alá Val Val Ser Alá Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Cys 50 55 60
Alá Pro Alá Ser Gly Thr Cys Thr Pro He Phe Pro Phe Met Pro Pro
70 75 80
Glu Alá Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Alá Alá Ser Pro Asn
90 95
His Ser Gin Leu Leu Alá Cys Gly Pro Thr Val His Arg Alá Cys Gly 100 105 110
Glu Asp Val Tyr Alá Gin Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Alá His Alá 115 120 125
Gin Pro He Gly Thr Val Pro Alá Alá Leu Pro Glu Cys Pro Asp Gin 130 135 140
Glu Met Asp He Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser He Ser Ser
145 150 155 160
Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Alá Val Met Asp Gin
165 170 175
Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gin Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser Asn Val 180 185 190
Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser Asn Pro 195 200 205
Gin Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gin Leu Thr Gly Leu Thr Phe Thr 210 215 220
Alá Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gin Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gly Alá Arg Glu Ser Alá Lys Lys Ile Leu He Val Ile Thr Asp Gly
245 250 255
Gin Lys Tyr Lys Asp Pro Leu His Tyr Ser Alá Val He Pro Gin Alá 260 265 270
Glu Gin Alá Gly He Ile Arg Tyr Alá Ile Gly Val Gly Asp Alá Phe 275 280 285
Gin Lys Pro Thr Alá Arg Gin Glu Leu Asp Thr Ile Alá Ser Glu Pro 290 295 300
130
HU 223 977 Β1
Pro Asp Alá 305 His Val Phe 310 Gin Val Asp Asn Phe 315 Ser Alá Leu Ser Ser 320
Ile Gin Lys Gin Leu Tyr Asp Arg Ile Phe Alá Val Glu Gly Thr Leu
325 330 335
Ser Ser Alá Ser Thr Ser Phe Gin His Glu Met Ser Gin Glu Gly Phe
340 345 350
Ser Ser Leu Leu Thr Thr Glu Gly Pro Val Leu Gly Alá Val Gly Ser
355 360 365
Phe Asp Trp Ser Gly Gly Alá Phe Leu Tyr Pro Pro Gly Gly Ser Pro
370 375 380
Thr Phe Ile Asn Met Ser Gin Gin Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr
385 390 395 400
Leu Gly Glu Glu Gly Val Gly Val Gly Thr Gly Gly Ser
405 410
102. számú szekvenciavázlat
0) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1484 bázispár
(B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris
(ii) A molekula típusa: cDNS
(ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS
(B) Lokalizáció: 1...1482
(xi) A szekvencia leírása: 102. számú szekvencia
GAT GTC CAG AGC TCC ATC AGC TAT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGC CGC 48
Asp Val Gin Ser Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Alá Leu Asp Pro Gly Arg
1 5 10 15
CTG GTC TCT CGG GCC ATT TTT CAA GAG ACC CAG AAC CAG ACT TTA ACT 96
Leu Val Ser Arg Alá Ile Phe Gin Glu Thr Gin Asn Gin Thr Leu Thr
20 25 30
CGA AGG AAG ACC CTG GGG CTG GGG CGT CAC TGT GAA ACC ATG AGG CTA 144
Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu
35 40 45
CTT TTG CCA GAC TGC GTA GAG GAC GTG GTG AAC CCC ATC GTC CTG CAC 192
Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His
50 55 60
CTC AAC TTC TCC CTG GAG GGA CAG CCA ATC CTC TCA TCC CAG AAT CTG 240
Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gin Pro Ile Leu Ser Ser Gin Asn Leu
65 70 75 80
CGC CCT GTG CTG GCC ACG GGC TCG CAG GAC CAC TTC ATT GCC TCC CTC 288
Arg Pro Val Leu Alá Thr Gly Ser Gin Asp His Phe Ile Alá Ser Leu
85 90 95
131
HU 223 977 Β1
CCC Pro TTT Phe GAG Glu AAG Lys 100 AAC Asn TGC Cys GGA CAA GAT Gly Gin Asp 105 CGC Arg CTG Leu TGT Cys GAG Glu GGG Gly 110 GAC Asp CTG Leu 336
AGC ATC AGC TTC AAC TTC TCG GGC TTG AAT ACC CTG CTG GTG GGG CTC 384
Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu
115 120 125
TCC CTG GAG CTC ACA GTG ACA GTG ACC GTG CGG AAT GAG GGC GAG GAC 432
Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp
130 135 140
TCC TAT GGG ACC GCC ATC ACC CTC TAC TAC CCA GCA GGG CTA TCC TAC 480
Ser Tyr Gly Thr Alá Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Alá Gly Leu Ser Tyr
145 150 155 160
AGG CGG GTG TCG GGC CAG ACA CAA CCC TGG CAG CGC CCC CTG CAC CTC 528
Arg Arg Val Ser Gly Gin Thr Gin Pro Trp Gin Arg Pro Leu His Leu
165 170 175
GCA TGT GAG GCT GTA CCT ACC GAG AGC GAG GGC TTG AGG AGT ACC AGC 576
Alá Cys Glu Alá Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser
180 185 190
TGC AGC GTC AAC CAC CCC ATC TTC CAA GGG GGT GCT CAG GGC ACT TTC 624
Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gin Gly Gly Alá Gin Gly Thr Phe
195 200 205
GTA GTC AAG TTC GAT GTC TCC TCC AAG GCC AGC CTG GGT GAC AGG TTG 672
Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Alá Ser Leu Gly Asp Arg Leu
210 215 220
CTC ATG GGG GCC AGT GCC AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT GCG AGC AAC 720
Leu Met Gly Alá Ser Alá Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Alá Ser Asn
225 230 235 240
AAG ACC TCC TTT GAG CTG GAA CTG CCA GTG AAA TAC GCT GTC TAC ATG 768
Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Alá Val Tyr Met
245 250 255
ATG ATC ACA AGG CAC GAA GGC TCC ACC AGG TTC TTC AAC TTT TCC ACT 816
Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr
260 265 270
TCC GCT GAG AAG AGC AGC AAA GAG GCC GAG CAC CGC TAT CGG GTG AAC 864
Ser Alá Glu Lys Ser Ser Lys Glu Alá Glu His Arg Tyr Arg Val Asn
275 280 285
AAC CTG AGT CTG CGA GAT GTG GCC GTC AGC GTG GAC TTC TGG GCC CCC 912
Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Alá Val Ser Val Asp Phe Trp Alá Pro
290 295 300
GTG CAG CTG AAC GGA GCA GCT GTG TGG GAC GTG GCG GTG GAG GCC CCT 960
Val Gin Leu Asn Gly Alá Alá Val Trp Asp Val Alá Val Glu Alá Pro
305 310 315 320
GCC CAG AGC CTG CCC TGT GCG CGG GAG AGG GAA CCT CCG AGG ACC TCT 1008
Alá Gin Ser Leu Pro Cys Alá Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser
325 330 335
132
HU 223 977 Β1
GAC Asp CTG Leu AGC Ser CGG Arg 340 GTC Val CCG Pro GGG Gly AGT Ser CCC Pro 345 GTG Val CTG Leu GAC Asp TGC Cys AGC Ser 350 GTT Val GCG Alá 1056
CAC TGC CTG AGG TTC CGC TGC CAC ATC CCC TCC TTC AGC GCC AAG GAG 1104
His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Alá Lys Glu
355 360 365
GAG CTC CAC TTC ACC CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC GCC TGG GTC AGC 1152
Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Alá Trp Val Ser
370 375 380
CAG ATG CTG CAA AAG AAG GTG TCG GTG GTG AGT GTG GCC GAG ATC ACC 1200
Gin Met Leu Gin Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Alá Glu Ile Thr
385 390 395 400
TTC AAC AGG GCC GTG TAC TCC CAA GTT CCG GGC GAG GAG CCC TTT ATG 1248
Phe Asn Arg Alá Val Tyr Ser Gin Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met
405 410 415
AGA GCC CAG GTG GAG ACG GTG CTG GAG GAG TAT GAG GAG CAC GAC CCC 1296
Arg Alá Gin Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro
420 425 430
GTC CCC CTG GTG GTG GGC AGC TGT GTG GGC GGC CTG CTG CTG CTG GCT 1344
Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Alá
435 440 445
CTC ATC TCA GCC ACC CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAG CGC CGG TAC 1392
Leu Ile Ser Alá Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr
450 455 460
AAG GAG ATG CTG GGC GAG AAA CCG GGA GAC GCG GCC ACC TTC CCC GGG 1440
Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Alá Alá Thr Phe Pro Gly
465 470 475 480
GAG GAC GCC AGC TGC GGG GCT TCA GAT TTG CCT TTG TCC CAG 1482
Glu Asp Alá Ser Cys Gly Alá Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gin
485 490
TG 1484
103. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 494 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 103. számú szekvencia
Asp 1 Val Gin Ser Ser 5 Ile Ser Tyr Asp Leu 10 Alá Leu Asp Pro Gly 15 Arg
Leu Val Ser Arg Alá Ile Phe Gin Glu Thr Gin Asn Gin Thr Leu Thr
20 25 30
Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu
40 45
133
HU 223 977 Β1
Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His 50 55 60
Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gin Pro Ile Leu Ser Ser Gin Asn Leu 65 70 75 80
Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gin Asp His Phe Ile Ala Ser Leu 85 90 95
Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gin Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu 100 105 110
Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu 115 120 125
Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp 130 135 140
Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr
145 150 155 160
Arg Arg Val Ser Gly Gin Thr Gin Pro Trp Gin Arg Pro Leu His Leu
165 170 175
Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser 180 185 190
Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gin Gly Gly Ala Gin Gly Thr Phe 195 200 205
Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu 210 215 220
Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn
225 230 235 240
Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met
245 250 255
Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr 260 265 270
Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn 275 280 285
Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro 290 295 300
Val Gin Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro
305 310 315 320
Ala Gin Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser
325 330 335
Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala 340 345 350
His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu 355 360 365
134
HU 223 977 Β1
Glu Leu His Phe Thr Leu Lys 370 375
Gin Met Leu Gin Lys Lys Val 385 390
Phe Asn Arg Alá Val Tyr Ser 405
Arg Alá Gin Val Glu Thr Val 420
Val Pro Leu Val Val Gly Ser 435
Leu Ile Ser Alá Thr Leu Tyr 450 455
Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys 465 470
Glu Asp Alá Ser Cys Gly Alá 485
Gly Asn Leu Ser Phe Alá Trp Val Ser 380
Ser Val Val Ser Val Alá Glu Ile Thr 395 400
Gin Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met 410 415
Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro 425 430
Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Alá 440 445
Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr 460
Pro Gly Asp Alá Alá Thr Phe Pro Gly 475 480
Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gin 490

Claims (2)

  1. 000 r** r* r*. r**h*r* oocooo
    asasz Öüűí (/)0(/) <;<;0 ^£^S0 O.U.U. 000 «J aj aaJ h— 0 1— (/)<< > > i> OS oss UJUlUI 0(/)0 0> 0 —1 3» —1 zzo M—IJ —4 —J —4 <(/)(/) 000 0.0.0. 1—0(Λ (/)OS0S ι—Ο» m« UH* 0 0*S 0 0 0 333 000 «4 —4 —4 0(/)0 S(/>0 O.OS0 (/)(/)0. 333 (ΛΧΟ. 000 h-s (/) (/)(/)0 000 ^sz« 0O. 0 0 Lu 0 (/)(/)(/) 0 0 0 OS OS O£ SS 3S JÜ.U. «£—10 000 000 00(/) 0 0 Ul 0.(/)0. SOS OS >M4MM (/)(/)<
    —J00 333 00O ►M M4 O. (/) > MM 0.0. (/)·—( 000 OQZ s§§ OSsn£0 OSQSOS s>->(/)(/)(/) 0>-0 >> OOO —1-4—J OSHH O-(/) 0MM 000 0 00 0ZZ <£ 0<£ Σ/)>ί/) UJUlUI 000 000 (/)(/) vo 0Z«C >*u.s 000 0 0 0 >-0(/) MM«J 0 ZCZ) 000 000 00O cu ZZZ (/) 0 0 000 -4 0 0 0SS > 9M 1 Ul(/) —4 0-4 UJUlUI >01-
    i 00 —10 atx—í aaz 000 (/)►—(/) (/)(/)0 000 ööo
    J-jS>
    ooo
    U4U4U4 uou
    SS5
    0h-0
    000
    O.O.O.
    000
    00U) <·«« ttt l-l—Mtítastíf >·>>· 0(/)(/) 000 UIUIUJ 000 <00
    000
    Ul
    333
    Ul
    0UJ0 0 0(/) 000 000 00> 0 0 «4 000 0UIUJ <<0 0 0(/) 000 000 U4UI0 0(/)0 zzz (Z)0Z a u a u a o a u rM iH r-lrM 0 0 0 0 MM 00 00 00 □ 00 □ 00 □ 00 □ 00 «00 β 0 0 BUU 8 0 0
    aD CETVPTED— EGLRSSRCSY NHPIFHEGSN GTFIVTFDVS Y—KATLG 888 CDIIb CESASSTEVS GALKSTSCSI NHPIFPENSE -—VTFNIT FDVDSKASLG 893 CDllc CCSA-PVGSQ GTW-STSCRI NHLIFRGGAQ —-ITFLAT FDVSPKAVGL 891
    1C. ábra
    138
    HU 223 977 B1
    Int. Cl.7: C 12 N 5/00 sd DRHLHRASAS SENNKASSSK ATFQLELPVK YAVYTMISRQ EESTKYFHFA 938 CDIIb NKLLLKANVT SENNMPRTNK TEFQLELPVK YAVYMVVTSH GVSTKYLNFT 943 CDllc DRLLLIANVS SENHIPRTSK TIFQLELPVK YAVYIVVSSH EQFTKYLNFS 941 f**M© CO0t9l © © cn
    O.U.X <»—U? LU>>
    >os©
    UJ ©©o in co inoo cooien ooo
    S> O >» m©m U.U.U. mu>m ooo ©MM
    U-OLk ooo
    OOO ooo o>o
    IflrtO co«r ooo ££S s©s ooo ooo gfcg mmm
    ÖSÖ xoS ooo
    Lk U.U. LkUkU. ooo ooo
    BBB mmm
    OO>
    32s Si αωο osaeae oo© mo© mmm ooo ozo
    LkLkLk h-OO OOO OO LŰUJLLl <<
    «wl ej < < < «J mJ «j l·· >· ooo mmm ooo £22 l/>BSO mJ mJ —j >o> oom «£©© ©©© H4 <O ►—4 5x5 > >o ©LUX mmm 535 mmm ©©© U.U.U. omo x>> ooo mmm Ο Η· o UJZO OOO OOO xx< omo. O.O.O. ZOX C^ flk ^k 555 0O0 <0.0. a-oc ©o© ac ac z fcÍOCH U.U.U. >· Ck X ttUl^ mmm UJUlS LU^UJ ooo
    ©U->
    LUQ.Z
    UIUJUJ zmz zo© ooo
    XXX uioz
    UJ>> zzz *ŰCX >zm OO© X l l ooo Smm 1 moé «J asJ —J ZMUJ i unó UJZO o.mm u.<bk OUIU1 ooo. ozo 1 1 UJ mzz OU.O mmm OO© UIUJUJ H<UJ mmo. LUUIUJ fi U ca u ca u Ο O oo o o O O o o o o ooo ooo ooo tíOO tíOO tíOO
    UIU1O
    ΣΗΗ ooo eoo ca u «d LEDKPED.......-TATFS GDDFSCVAPN VPLS 1161
    CDIIb H—SEG........GP—P GAE-----PQ —— 1153
    CDllc M—EEANGQ IAPEHGT--Q TPS-----PP SEK 1163
    139
    SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Hibridóma, amelynek jele 199M (ATCC letét szá-
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti hibridóma által kiválasz ma HB-12058). tott monoklonális antitest.
    135
    HU 223 977 B1
    Int. Cl.7: C 12 N 5/00 r>r>o <β· in r**fs.o CT» 0)0 vor**eo
    VOf*wOO 0 o*»
    0 0
    CM CM CM vor**oo CM CM CM αο TF-6T--VLL LSVLASYHGF NLDVEEPTIF QEDAGGFGÜS VVQFGGSRLV
    CDIIb ma-lr—vll ltaltlchgf nldtenamtf qenargfgqs vvqlqgsrvv
    CDllc mtrtraalll ftalatslgf nldteeltaf rvdsagfgds vvqyahsmvv stt
    H-unun _1_J«J 000 -J-J-J un un un ggg ooo oou
    UJ0UJ
    0020
    0—102
    OOO idOÍÖ UU.lL -JUJZ zujz un un un >->LL tfS un «Xunun 1-tfZ O UJ 02 0unz 0020 «xunun
    000
    2EXX >U._J U.U.U. 000 0 0 0 0*2 02 00.0 0O2S 000 OOO d* 0 0 000 <x«x«x wo.h 000 < 0 < UJ LU Ul HÖ-J 0uno 0*Z 0 0 0 0 2*0. UJ 0 0 0*CO2 0020 Ű2O£O2 0200 202 < UIZO 0 00 000 ►—4 2* ^* i —1 i U.0U. 00< 02*0 32OÖ O2Z0 000 00 0 000 -J—J—J un unó 000 <x«x<x «X UJ «X O.ÖÍO 000 ΣΣΜ {-£:£“ *2O£«X 0 0 0 _J LU —1 3> U-S0 UJ 0 0 O O O 0 UJ UJ —JU.U. SunS 0 00 «4 02 «U §ss CO ooo OOO 2^ 000 O. o. LÍ ΣΙΛ< un 00 U.U.U. *200 000 _Ω 000 000 0UJZ —100 HU 0 00 ^^0 *£2£X 000 0 0 0 < <<Λ(Λ un>0 xxx 0 1— S 0UJ2C 000 0020 000 000 <O0 UO0X SO2< 000 UJ 0 0 ooo zseae 000 OZ«X —J —J —J OOO UJUJO2 OOZ 0 00 Ο O. 0 000 000 ZSO2 000 0 00 .J-J-J 000 öa.(/) 000 52 00 Q2CZ)0 >HUJ Q0W αβί-ι >U-U1 000 02 00 000 OOO *2*2*2 0 02 0 ZSS 0</)CS) CZ1ZZ 00*2 ÖOO 000 0.0.0 0 0 0 000 000 unz0 0 0 0
    000 <<< OOO <<< 000 ooo
    0 h000
    UJUJ*2 ^-2-Z 000 U.U.O 00 OOO KOÖ 000 <<< 0O0 OOO Σ0Ο 000 0OO 0 0 0 Z00 UJOUI
    U.U.U. 0U1UJ 0*2 UJ U.U.U.
    ttfc
    ÍtflLM <<<
    unzo
    a u a υ a υ 0 0 00 0 0 0 0 00 00 □ QQ □ QQ OOO Ö 00 ÖOO öoo
    a a 0 0 KH
    OOO
    BOO □ QQ
    ÖOO
    136
    HU 223 977 B1
    Int. Cl.7: C 12 N 5/00 od QELHTISSAP PQDHVFKVDN FAALGSIQKQ LQEKIYAVEG TQSRASSSFQ 346 CDIIb QELNTIASKP PRDHVFQVNN FEALKTIQNQ LREKIFAIEG TQTGSSSSFE 347 CDllc KELNDIASKP SQEHIFKVED FDALKDIQNQ LKEKIFAIEG TETISSSSFE 348 orxco θ' θ' θ' <r<3uarxoo θ' θ' θ'
    Γ*» Γ*» minin
    >(/)!> LUZLki a. a. a. 0IXIUJ zoz Ut>UI 222 juj UIUIUJ ooo <1 ^cms ooo a. a. a- mfc-CZJ ascuS 2>* <«S< ssz mmm ooo §§o HHH ►Η Hí HM 0S49CÉ ooo <c U.U.U. t/IHt/l ooo HHh ooo ooo a. coo- OOO OSűSQÍ ; 1—· (/)^(/) f—OHM h-H— hr J ™J «J SUIS u-u-u- α αβ HMZHM LblLUUl ooo a.ma. >->->- UJOO a-H-a. >->>- 252 >->->» >>> -j-jj OOO ooo U- U. U- HM HM <<< 0 49 0.
    OOO OOO <Λ<ίΛ 333 OOQp U- >- u0 40 0 OOO
    OOO >- >·> űíöíqí a. a. a. ooS
    Η-ΗΉ· </)</></) 49 49 49
    U.U.U.
    OSOStt
    < H— < Ζ40(Ζ) 333 O(Z)O OOO ooo a. a-a. —1—1 —I 3! O 3! U-_!> ozo OOO ooo jo.o. XÍZiíÍ ööo ooo 303 40«/)«Λ UIUJUI -J.J.J OOO ooo jj hJ ·—J «J QC>->- C· Lh Uh -JhmZj mmm hU jhL <o ui<ui H-<H- sss 555 J-<< <Λ<ΙΛ U.U.U. ooo 40 «ΛΟ >· > > > ooo U.U.U. OOO (/)<</) ooo ooo 333 HtHIHM 0 03 ooo (/)<(/> OOO ><o m</)< ooo ooo sss aszó OOO 003 UIUIUI SSZ H-Ohm ooo ZS-J ooo >>> aoo o o o o CB U α o HH hM rH rH τΗ rH«H KH hMhí «-4rM i-Mr4 OOO OOO QOO OOO 800 ÖUW soo csOO
    ο r*·» r* O> ff' θ' in min aD ENRGAVYLFH GASESGISPS HSQRIASSQL SPRLQYFGQA LSGGQDLTQD CDIIb DNRGAVYLFH GTSGSGISPS HSQRIAGSKL SPRLQYFGQS LSGGQDLTMD CDllc ENRGAVYLFH GVLGPSISPS HSQRIAGSOL SSRLQYFGOA LSGGQDLTQD
    137
    HU 223 977 B1
    Int. Cl.7: C 12 N 5/00 aD GLMDLAVGAR GQVLLLRSLP VLKVGVAMRF SPVEVAKAVY RCUEEKPSAL 646 COllB GLVDLTVGAQ GHVLLLRSOP VLRVKAIMEF NPREVARNVF ECNDQVVKGK 647 CDllc GLVDLAVGAR GOVLLLRTRP VLWVGVSMQF IPAEIPRSAF ECREQVVSEQ 647 cr r>. r*. «τνν atchcn ’T’T’T σ»σισ*
HU9901579A 1996-02-22 1997-02-24 Alfa-d-integrin-re specifikus antitestek HU223977B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/605,672 US5817515A (en) 1993-12-23 1996-02-22 Human B2 integrin alpha subunit antibodies
PCT/US1997/002713 WO1997031099A1 (en) 1996-02-22 1997-02-24 Human beta 2 integrin alpha subunit

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9901579A2 HUP9901579A2 (hu) 1999-08-30
HUP9901579A3 HUP9901579A3 (en) 2001-10-29
HU223977B1 true HU223977B1 (hu) 2005-03-29

Family

ID=24424704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9901579A HU223977B1 (hu) 1996-02-22 1997-02-24 Alfa-d-integrin-re specifikus antitestek

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5817515A (hu)
EP (1) EP0835301B1 (hu)
JP (1) JP2001526524A (hu)
CN (1) CN1103812C (hu)
AT (1) ATE293685T1 (hu)
AU (1) AU723110B2 (hu)
BR (1) BR9702101A (hu)
CA (1) CA2218755C (hu)
CZ (1) CZ287921B6 (hu)
DE (1) DE69733051D1 (hu)
FI (1) FI974018A (hu)
HU (1) HU223977B1 (hu)
IL (1) IL122011A (hu)
NO (1) NO318764B1 (hu)
PL (1) PL187013B1 (hu)
RU (1) RU2183671C2 (hu)
SK (1) SK283135B6 (hu)
WO (1) WO1997031099A1 (hu)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837478A (en) * 1993-12-23 1998-11-17 Icos Corporation Method of identifying modulators of binding between and VCAM-1
US6620915B2 (en) * 1993-12-23 2003-09-16 Icos Corporation Monoclonal antibodies specific for integrin α-d subunit
US20030055231A1 (en) * 1998-10-28 2003-03-20 Jian Ni 12 human secreted proteins
EP1267926A2 (en) 2000-03-17 2003-01-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting stenosis and restenosis with a mixture of antibodies anti cd18 and anti ccr2
WO2023235971A1 (en) * 2022-06-08 2023-12-14 The Regents Of The University Of California Antibodies and immunotherapies that target the active conformation of integrin beta 2

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4271139A (en) * 1978-03-27 1981-06-02 Hiram Hart Scintillation proximity assay
US4568649A (en) * 1983-02-22 1986-02-04 Immunex Corporation Immediate ligand detection assay
WO1992006697A1 (en) * 1990-10-23 1992-04-30 Repligen Corporation Anti-inflammatory composition
JPH07502727A (ja) * 1991-10-01 1995-03-23 ザ・ジエネラル・ホスピタル・コーポレーシヨン 接着分子に対する抗体を用いた同種移植片拒絶の防止
JP3679112B2 (ja) * 1991-10-04 2005-08-03 アメリカ合衆国 細胞接着分子の遮断による眼の炎症の治療
US5470953A (en) * 1993-12-23 1995-11-28 Icos Corporation Human β2 integrin α subunit
EP0757697A4 (en) * 1994-04-12 2000-05-17 Boehringer Ingelheim Pharma USE OF AGENTS INHIBITING INTERCELLULAR INTERACTION IN THE TREATMENT OF VIRAL BREATH INFECTION

Also Published As

Publication number Publication date
NO974852D0 (no) 1997-10-21
JP2001526524A (ja) 2001-12-18
SK283135B6 (sk) 2003-03-04
WO1997031099A1 (en) 1997-08-28
US5817515A (en) 1998-10-06
HUP9901579A3 (en) 2001-10-29
SK140997A3 (en) 1998-09-09
CN1189851A (zh) 1998-08-05
CA2218755A1 (en) 1997-08-28
PL187013B1 (pl) 2004-04-30
EP0835301A1 (en) 1998-04-15
PL323195A1 (en) 1998-03-16
AU723110B2 (en) 2000-08-17
EP0835301B1 (en) 2005-04-20
ATE293685T1 (de) 2005-05-15
BR9702101A (pt) 1999-07-20
NO974852L (no) 1997-12-19
AU2133397A (en) 1997-09-10
NO318764B1 (no) 2005-05-02
CA2218755C (en) 1999-08-31
FI974018A (fi) 1997-12-03
HUP9901579A2 (hu) 1999-08-30
FI974018A0 (fi) 1997-10-21
IL122011A0 (en) 1998-03-10
IL122011A (en) 2001-05-20
DE69733051D1 (de) 2005-05-25
CZ328697A3 (cs) 1998-07-15
CN1103812C (zh) 2003-03-26
RU2183671C2 (ru) 2002-06-20
CZ287921B6 (cs) 2001-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6432404B1 (en) Methods of inhibiting locomotor damage following spinal cord injury with α D-specific antibodies
AU740106B2 (en) Novel human beta2 integrin alpha subunit
EP0686161B1 (en) Novel human beta2 integrin alpha subunit
US20060280739A1 (en) Novel human beta-2 integrin alpha subunit
AU2001296839A1 (en) Use of anti-human integrin alpha D antibodies to treat spinal cord injury
US6620915B2 (en) Monoclonal antibodies specific for integrin α-d subunit
AU723110B2 (en) Human beta 2 integrin alpha subunit
US5728533A (en) Human β2 integrin αsubunit
US5831029A (en) Human β2 integrin α subunit
Gallatin et al. Human beta2 integrin alpha subunit
EP2182008A2 (en) Monoclonal anti alpha-D (ITGAD) antibodies for use in the treatment of inflammation

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050218

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees