CZ287921B6

CZ287921B6 - Hybridom označený 199M a monoklonální protilátka sekretovaná tímto hybridomem

Info

Publication number: CZ287921B6
Application number: CZ19973286A
Authority: CZ
Inventors: Michael W. Gallatin; Der Vieren Monica Van
Original assignee: Icos Corporation
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2001-03-14
Also published as: NO974852D0; JP2001526524A; HU223977B1; SK283135B6; WO1997031099A1; US5817515A; HUP9901579A3; SK140997A3; CN1189851A; CA2218755A1; PL187013B1; EP0835301A1; PL323195A1; AU723110B2; EP0835301B1; ATE293685T1; BR9702101A; NO974852L; AU2133397A; NO318764B1

Abstract

Hybridom označený 199M uložený ve sbírce ATCC pod depozitním číslem HB 12058 a monoklonální protilátka sekretovaná tímto hybridomem.ŕ

Description

Hybridom označený 199M a monoklonální protilátka sekretovaná tímto hybridomem

Oblast techniky

Vynález se týká hybridomu označeného 199M a monoklonální protilátky sekretované tímto hybridomem. Obecně vynález popisuje klonování a expresi polynukleotidů kódujících novou a podjednotku lidského integrinu β₂, označovanou jako a_d, která je strukturně podobná známým a podjednotkám lidského integrinu β₂, označovaným CD 11 a, CD 11b a CD 11c. Vynález se rovněž týká polynukleotidů, které vykazují homologii k sekvenci kódující lidský a_d, izolovaných z jiných živočišných druhů.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou třídou molekul asociovaných s membránou, které se aktivně účastní procesu buněčné adheze. Integriny jsou transmembránové heterodimery skládající se z podjednotky a, která je nekovalentně asociována s podjednotkou β. V současné době je známo přinejmenším čtrnáct podjednotek a a osm podjednotek β [shrnuto v Springer, Nátuře 346:425 až 434 (1990)]. Podjednotky β jsou obvykle schopny asociace s více než jednou podjednotkou a a heterodimery sdílející společnou podjednotku β vytvářejí v populaci integrinů jednotlivé podtřídy.

Jedna podtřída lidských integrinů, která je exprimována pouze na povrchu bílých krvinek, je charakterizována přítomností společné podjednotky β₂. Výsledkem této buněčně specifické exprese je skutečnost, že tyto integriny jsou obvykle označovány jako leukocytámí integriny, Leu-CAM nebo leukointegriny. Vzhledem k přítomnosti společné podjednotky β₂, je jinou alternativou označovat tyto integriny jako integriny β₂. Podjednotky β₂ (CD18) byla již dříve izolována ve spojení s jednou ze tří rozdílných podjednotek a, označovaných CD 11 a, CD 11b aCDllc. Izolace cDNA kódující lidský CD18 je popsána v publikaci Kishimoto a další, Cell 48:681 až 690 (1987). Podle oficiální nomenklatury WHO (Světová zdravotnická organizace) jsou tyto heterodimemí proteiny označovány jako CD1 la/CD18, CD1 lb/CD18 a CD1 lc/CD18; v obecně používané nomenklatuře jsou tyto označovány jako LFA-1 (CDlla/CD18), Mac-1 nebo Mol (CD1 lb/CD18) a p 15095 nebo LeuM5 (CD1 lc/CD18) [Cobbold a další, v Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, strana 788 (1987)]. Bylo prokázáno, že a podjednotky CD1 la, CD1 lb a CD1 lc lidského integrinu β₂ migrují při elektroforéze prováděné v redukujících podmínkách se zdánlivými molekulovými hmotnostmi přibližně 180 kD (CDlla), 155 kD (CD1 lb) a 150 kD (CD1 lc). DNA kódující tyto podjednotky již byly klonovány [CD1 la, Larson a další, J. Cell Biol. 108:703 až 712 (1989); CDllb, Corbi a další, J. Biol. Chem. 263:12403 až 12411 (1988) a CD1 lc, Corbi a další, EMBO J. 6:4023 až 4028 (1987)]. Domnělé homology a a β řetězců lidského integrinu β₂, definované podle přibližné podobnosti molekulových hmotností, byly pomocí nejrůznějších metod identifikovány u jiných živočišných druhů, včetně opic a primátů [Letvin a další, Blood 61:408 až 410 (1983)], myší [Sanchez-Madrid a další, J. Exp. Med. 154:1517 (1981)] a psů [Moore a další, Tissue Antigens 36:211 až 220 (1990)].

Ukázalo se, že absolutní molekulové hmotnosti předpokládaných homolog a a β řetězců lidského integrinu β₂, získaných z jiných živočišných druhů, se podstatně liší [viz. například Danilenko a další, Tissue Antigens 40:13 až 21 (1992)], a vzhledem k absenci informací týkajících se sekvence těchto homolog není možné s určitostí definovat vztah mezi podjednotkami lidského integrinu a podjednotkami identifikovanými u jiných druhů. Mezi různými druhy byly navíc pozorovány rozdíly v počtu zástupců u jednotlivých rodin proteinů. Uvažme například, že z králíků bylo izolováno více izotypů IgA než jich existuje u lidí [Bumett a další, EMBO J. 8:4041 až 4047 (1989) a Schneiderman a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:7561 až 7565 (1989)]. Obdobně, u lidí bylo dosud identifikováno přinejmenším šest variant metalothioneinů [Karin a Richards, Nátuře 299:797 až 802 (1982) a Varshney a další, Mol. Cell. Biol. 6:26 až 37,

-1 CL 287921 B6 (1986)], zatímco u myší existují důkazy o přítomnosti pouze dvou takových variant [Searle a další, Mol. Cell. Biol. 4:1221 až 1230 (1984)]. Z existence více zástupců nějaké rodiny proteinů u jednoho druhu se tudíž nedá jednoznačně odvodit, že by odpovídající zástupci rodiny proteinů museli existovat i u jiných druhů.

Co se týká integrinů β₂, bylo u psů pozorováno, že předpokládaný psí protějšek (β₂) lidského CD18 je schopen vytvářet dimery až se čtyřmi rozdílnými podjednotkami a [Danilenko a další, viz. výše]. Výsledkem imunizace myší pomocí splenocytů získaných z organizmu psů bylo vytvoření monoklonálních protilátek, které imunoprecipitovaly s proteiny experimentálně 10 označenými jako psí homologa k lidským CD18, CD1 la, CD1 lb a CD1 lc; tato homologie byla především založena na zjištění podobných, ale ne identických, molekulových hmotností. Další protilátka namířená proti splenocytům získaným z organizmu psů, označená Call.8H2, rozpoznávala a imunoprecipitovala se čtvrtou podjednotkou (psí) podobnou podjednotce a. Tato čtvrtá psí podjednotka je rovněž schopna asociace s podjednotkou β₂, ale má jedinečnou molekulovou 15 hmotnost a je exprimována pouze na subpopulaci diferencovaných tkáňových makrofágů.

Výsledkem imunizace křečků pomocí dendritických buněk získaných z organizmu myší bylo vytvoření dvou monoklonálních protilátek namířených proti integrinům [Metlay a další, J. Exp. Med. 171:1753 až 1771 (1990)]. Jedna ztěchto protilátek, označená 2E6, imunoprecipitovala 20 převážně s heterodimerem tvořeným podjednotkami o zdánlivých molekulových hmotnostech 180 kD a 90 kD, a v menší míře pak s proteiny o zdánlivých molekulových hmotnostech v rozmezí 150 až 160 kD. Druhá z těchto protilátek, označená N418, imunoprecipitovala s dalším zdánlivým heterodimerem tvořeným podjednotkami o zdánlivých molekulových hmotnostech 150 kD a 90 kD. Z výsledků studií, při kterých byla blokována buněčná adheze, bylo usouzeno, 25 že protilátka 2E6 rozpoznává myší protějšek lidského CD 18, zatímco molekulová hmotnost zjištěná u antigenu N418 naznačovala, že se jedná o myší homolog lidského CD1 lc/CDl 8, další analýzy ukazují, že tento myší antigen vykazuje distribuci ve tkáních, která neodpovídá distribuci pozorované u lidského CD 11 c/CD 18.

Antigeny rozpoznávané prostřednictvím psí protilátky Cal 1.8H2 a myší protilátky N418 mohou reprezentovat různé varianty (například s různým stupněm glykosylace nebo produkty různě sestřižených mRNA) již dříve identifikované psí nebo myší podjednotky a. Jinou možností je, že tyto antigeny mohou reprezentovat unikátní podjednotky a psích nebo myších integrinů. V momentě, kdy nejsou dostupné informace týkající se primární struktuiy, není možné tyto dvě 35 alternativy odlišit.

U lidí je heterodimer CDlla/CD18 exprimován na povrchu všech lymfocytů. Heterodimery CDllb/CD18 a CD 11 c/CD 18 jsou v podstatě exprimovány pouze na povrchu monocytů, granulocytů, makrofágů a NK buněk („natural killer celíš“), nicméně CDllc/CD18 byl rovněž 40 detekován u některých typů B-buněk. Obecně je možné říci, že CDlla/CD18 převažuje u lymfocytů, CD1 lb/CD18 u granulocytů a CD1 lc/CDl8 na povrchu makrofágů [viz. souhrnný článek, Amaout, Blood 75:1037 až 1050 (1990)]. Exprese řetězců a se nicméně různí v závislosti na stupni aktivace a diferenciace jednotlivých typů buněk [viz. souhrnný článek, Larson a Springer, Immunol. Rev. 114:181 až 217 (1990)].

Za použití protilátek, které jsou schopny blokovat buněčnou adhezi zprostředkovanou pomocí integrinů β₂, bylo prokázáno, že tyto integriny β₂ se v organizmu člověka účastní imunitní azánětlivé reakce. Například heterodimery CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18 se aktivně účastní vazby NK buněk na buňky lymfomu a adenokarcinomu [Patarroyo a další, 50 Immunol. Rev. 114:67 až 108 (1990)], akumulace granulocytů [Nourshargh a další, J. Immunol.

142:3193 až 3198 (1989)], úniku plazmy nezávislému na činnosti granulocytů [Arfors a další, Blood 69:338 až 340 (1987)], chemotaktické odpovědi stimulovaných leukocytů [Arfors a další, viz. výše] a adheze leukocytů k vaskulámímu endothelu [Price a další, J. Immunol. 139:4174 až 4177 (1987) a Smith a další, J. Clin. Invest. 83:2008 až 2017 (1989)]. Hlavní role integrinů β₂ při

-2CZ 287921 B6 imunitních a zánětlivých reakcích je zřejmá z klinického syndromu označovaného jako nedostatečnost adheze leukocytů (LAD - leukocyte adhesion deficiency), mezi jehož klinické projevy patří neustále se opakující bakteriální infekce často ohrožující život. LAD je zapříčiněna různorodými mutacemi vpodjednotce β₂ [Kishimoto a další, Cell 50:193 až 202 (1987)] a závažnost onemocnění koreluje se stupněm deficience v expresi podjednotky β₂. Vytvoření kompletního heterodimeru integrinu je mutací v podjednotce β₂ znesnadněno ÍKishimoto a další, Cell 50:193 až 202 (1987)].

Je zajímavé, že přinejmenším u jedné protilátky specificky namířené proti CD 18 bylo prokázáno, že in vitro inhibuje tvorbu syncytií způsobenou virem lidské imunodeficience typu 1 (HTV-1), ačkoliv přesný mechanizmus této inhibice je nejasný [Hildreth a Orentas, Science 244:1075 až 1078 (1989)]. Toto pozorování je v souladu s objevem, že hlavní receptor pro CDlla/CD18, kterým je ICAM-I, je rovněž povrchovým receptorem pro velkou skupinu rhinovirů [Greve a další, Cell 56:839(1989)].

Význam vazebné aktivity integrinu β₂ při imunitní a zánětlivé reakci u lidí podtrhuje nezbytnost dosažení dokonalejšího poznání této třídy povrchových proteinů, Identifikace dosud neznámých členů této subpopulace, jakož i jejich odpovídajících receptorů, a produkce monoklonálních protilátek nebo jiných rozpustných látek, které mohou pozměnit biologickou aktivitu integrinů β₂, poskytnou prostředky (využitelné v praxi) pro terapeutickou intervenci při imunitních a zánětlivých odpovědích svázaných s integriny β₂.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je hybridom označený 199M uložený ve sbírce ATCC pod depozitním číslem HB 12058 a monoklonální protilátka sekretovaná tímto hybridomem.

Jedna stránka vynálezu popisuje nově purifikované a izolované polynukleotidy (například DNA a RNA transkripty, jak kódující tak antikódující vlákna) kódující novou a podjednotku lidského integrinu β₂, označovanou a_d, a její varianty (například deleční, adiční nebo substituční analoga), které mají vazebné a/nebo imunologické vlastnosti vlastní podjednotce a_d. Ve výhodném provedení vynálezu patří mezi tyto molekuly DNA, genomová DNA, cDNA a úplně nebo částečně syntetizované molekuly DNA. V současné době se jako nejvýhodnější polynukleotid jeví molekula DNA, jak je zobrazená v SEK. ID. Č.: 1, kódující polypeptid o sekvenci SEK. ID. C.: 2. Vynález rovněž popisuje konstrukci rekombinantních plazmidových a virových konstruktů DNA (expresivní konstrukty), které obsahují kódující sekvenci pro a_d, přičemž tato sekvence kódující a_d je funkčně připojena k homolognímu nebo heterolognímu regulačnímu prvku/prvkům transkripce.

Vynález rovněž popisuje polynukleotidy izolované z myší a laboratorních potkanů, které vykazují homologii k polynukleotidům kódujícím lidský a_d. Ve výhodném provedení se jedná o polynukleotid získaný z myší, zobrazený v SEK. ID. Č.: 52; a o polynukleotid získaný z laboratorních potkanů zobrazený v SEK. ID. Č.: 54.

Jiná stránka vynálezu se týká prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných sekvencemi DNA podle vynálezu, které na svém povrchu exprimují polypeptid a_d nebo nějaké jeho varianty. Hostitelské buňky podle vynálezu jsou zvláště užitečné pro produkci velkých množství polypeptidu a_d, který může být izolován buď ze samotné hostitelské buňky nebo z média, v němž jsou tyto buňky kultivovány. Hostitelské buňky exprimující polypeptid a_d na extracelulámí straně membrány mohou být rovněž použity jako imunogeny při produkci protilátek specificky namířených proti a_d. Ve výhodném provedení vynálezu budou hostitelské buňky transfekované DNA kódující a_d kotransfekovány DNA kódující podjednotku β₂, aby byla na jejich povrchu umožněna exprese tohoto heterodimeru.

-3CZ 287921 B6

Vynález se rovněž týká purifikovaných a izolovaných polypeptidů, jejich fragmentů a různých variant. Ve výhodném provedení vynálezu jsou polypeptidy a_d polypeptidy o sekvenci znázorněné jako SEK. ID. C.: 2. Nové produkty a<i podle vynálezu mohou být izolovány z přirozených zdrojů, ale ve výhodném provedení jsou, spolu s produkty různých variant Oj, produkovány 5 s využitím rekombinantních postupů, ve kterých jsou využity hostitelské buňky podle vynálezu.

Za použití různých hostitelských buněk a/nebo specifickým zpracováním po izolaci, mohou být připraveny úplně glykosylované, částečně glykosylované a úplně deglykosylované formyl polypeptidu a_d. Mezi varianty polypeptidů a_d podle vynálezu patří ve vodě rozpustné a ve vodě nerozpustné polypeptidy a_d, včetně jejich analog, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin to odstraněno nebo nahrazeno: (1) beze ztráty, a ve výhodném provedení, s posílením jedné nebo více biologických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro ct^ nebo (2) za specifického zablokování určitého druhu vazby ligand/receptor nebo za zablokování signalizační funkce. Vynález rovněž popisuje fuzní polypeptidy, ve kterých jsou aminokyselinové sekvence z polypeptidu a<i exprimovány v návaznosti na aminokyselinové sekvence z jiných polypeptidů.

Takové fuzní polypeptidy mohou mít, ve srovnání s polypeptidem a_d divokého typu, pozměněné biologické, biochemické a/nebo imunologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu spadají analoga polypeptidů obsahující navíc aminokyselinový zbytek (například lysin nebo cystein), který usnadňuje tvorbu multimerů.

Vynález se rovněž týká polypeptidů a molekul nepeptidové povahy, které specificky vážou a_d. Mezi výhodné molekuly, které vážou a,j, patří protilátky (například monoklonální a polyklonální protilátky), receptory (například jejich rozpustné formy nebo formy asociované s membránou) a jiné ligandy (například přirozeně se vyskytující nebo uměle připravené molekuly) včetně těch molekul, které se za přítomnosti monoklonálních protilátek namířených proti a_d a/nebo specific25 kých receptorů pro a_d, kompetitivně váží na a_d. Molekuly, které se vážou na a_d, mohou být použity při purifikaci polypeptidů a_d a identifikaci typů buněk exprimujících polypeptid a_d.. Molekuly, které se vážou na a_d, mohou být rovněž použity za účelem modulace (tj. inhibice, blokování nebo stimulace) vazebných aktivit polypeptidů a_d (in vivo) a/nebo za účelem modulace přenosu signálů uskutečňovaných prostřednictvím a_d.

Vynález rovněž popisuje stanovení sloužící k identifikaci molekul vážících cij, včetně stanovení využívajících vazbu imobilizovaného ligandu, stanovení, při kterých je vazba sledována v roztoku, SPA (scintillation proximity assay - stanovení využívající přiblížení radioaktivní značky ke fluoroforu a následné monitorování světla emitovaného fluoroforem), stanovení, při kterých jsou 35 použity dvě hybridní molekuly a podobně.

Mezi in vitro stanovení sloužící k identifikaci protilátek nebo jiných sloučenin, které modulují aktivitu polypeptidu a_d, mohou patřit, například, imobilizace polypeptidu a_d nebo imobilizace přirozeného ligandu, ke kterému se a_d váže, detekovatelné značení neimobilizovaného vazebného 40 partnera, společná inkubace vazebných partnerů a stanovení vlivu testované sloučeniny na množství navázané značky, přičemž snížení množství navázané značky za přítomnosti testované sloučeniny (ve srovnání s množstvím značky navázané bez přítomnosti testované sloučeniny) naznačuje, že testované látka je inhibitorem vazby na a_d.

Jiným typem stanovení použitelným k identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi a_da jeho ligandem, je stanovení, při němž je polypeptid a_d nebo jeho fragment imobiiizován na povrchu pevného nosiče povlečeného (nebo napuštěného) fluorescenčním agens a ligand je označen sloučeninou schopnou excitovat zmíněné fluorescenční agens. Při tomto stanovení dojde, za přítomnosti nebo v nepřítomnosti domnělého modulátoru, ke kontaktu imobilizovaného polypeptidu a_d se značeným ligandem a následně je detekováno světlo emitované prostřednictvím fluorescenčního agens a jsou identifikovány sloučeniny s modulačními vlastnostmi. Jako sloučeniny s modulačními vlastnostmi jsou uvažovány ty sloučeniny, které ovlivňují emisi světla zprostředkovanou fluorescenčním agens ve srovnání s emisí světla zprostředkovanou fluores

-4CZ 287921 B6 ceněním agens v nepřítomnosti modulační sloučeniny. Jinou možností je imobilizace ligandu pro a<j a označení polypeptidu a_d.

Další metodou spadající do rozsahu vynálezu a sloužící k identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi a_d a jeho ligandem, je transformace nebo transfekce vhodných hostitelských buněk nějakým konstruktem DNA nesoucím reportérový gen pod kontrolou promotoru, regulovaný transkripčním faktorem skládajícím se z domény vážící DNA a aktivační domény, následná exprese (v hostitelské buňce) první sekvence hybridní DNA kódující první fuzní protein obsahující část nebo celý polypeptid a_d spolu s doménou vážící DNA nebo aktivační doménou a exprese druhé hybridní DNA kódující druhý fiizní protein obsahující část nebo celý ligand pro Od a spolu s doménou vážící DNA nebo aktivační doménou transkripčního faktoru, které nejsou inkorporovány v prvním fuzním proteinu. Dále je pak vyhodnocen vliv domnělé modulační sloučeniny na interakci mezi a_d a jeho ligandem. Tento vliv je sledován detekcí vazby ligandu na a_d v dané hostitelské buňce, tak, že je v dané hostitelské buňce stanovována tvorba produktu reportérového genu za přítomnosti nebo v nepřítomnosti domnělého modulátoru, a jako modulační sloučeniny jsou identifikovány ty sloučeniny, které pozměňují tvorbu produktu reportérového genu ve srovnání s tvorbou produktu reportérového genu v nepřítomnosti modulační sloučeniny. U tohoto stanovení jsou v dnešní době s výhodou používány promotor lexA, doména vážící DNA se sekvencí odpovídající lexA, transaktivační doména GAL4, reportérový gen lacZ a jako hostitelské buňky kvasinky.

Při izolaci polynukleotidu kódujícího protein, který se váže na a_d, může být použita upravená verze výše zmíněného stanovení. Při této modifikované verzi jsou vhodné hostitelské buňky transformovány nebo transfekovány konstruktem DNA nesoucím reportérový gen pod kontrolou promotoru regulovaného transkripčním faktorem skládajícím se z domény vážící DNA a aktivační domény. Následuje exprese (v hostitelské buňce) první sekvence hybridní DNA kódující první fuzní protein obsahující část nebo celý polypeptid a_d spolu s doménou vážících DNA nebo nějakou aktivační doménou zmíněného transkripčního faktoru a exprese knihovny druhé hybridní DNA kódující druhý fiizní protein obsahující část nebo celý polypeptid, u kterého existuje předpoklad vazby na a_d, a doménu vážící DNA nebo aktivační doménu transkripčního faktoru, které nejsou inkorporovány v prvním fuzním proteinu. Dále je pak vyhodnocen vliv domnělé modulační sloučeniny na interakci mezi a_d a jeho ligandem. Tento vliv je sledován detekcí vazby proteinu vážícího a_d na a_d v dané hostitelské buňce, tak, že je v dané hostitelské buňce detekována tvorba produktu reportérového genu. Nakonec je z příslušné hostitelské buňky izolována druhý hybridní sekvence DNA kódující protein vážící a_d.

Vynález se rovněž týká hybridomů produkujících protilátky specificky namířené proti a_d. V současnosti jsou velmi dobře známy techniky sloužící k produkci hybridomů, které sekretují monoklonální protilátky. Buněčné linie hybridomů mohou být vytvořeny imunizaci nějakého živočicha prostřednictvím purifikovaného a_d, variant polypeptidu a_d nebo buněk, které na svém extracelulámím povrchu exprimují polypeptid a_d nebo jeho varianty. Mezi imunogenní buněčné typy patří buňky, které exprimují a_d in vivo, nebo transfekované buněčné linie eukaryotických nebo prokaryotických buněk, které za normálních okolností in vivo polypeptid a_d neexprimují. Ve výhodném provedení vynálezu jsou upřednostňovány protilátky sekretované hybridomy označovanými 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195 A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1,197A-2, 197A-3, 197Α-Λ 199A, 199H a 199M.

Hodnota informací poskytnutých odhalením sekvencí DNA kódujících a_d a aminokyselinových sekvencí a_d je zřejmá. Sekvence cDNA kódující a_d, uvedená v jedné sérii příkladů umožňuje izolaci sekvence genomové DNA kódující a_d, včetně prvků řídících transkripci této genové sekvence. Vynález se rovněž týká možností identifikace alelických variant DNA kódujících a_da DNA kódující a_d z jiných druhů (například myší nebo potkanů). Izolace lidské genomové DNA

-5CZ 287921 B6 kódujících a_d a DNA pro a_d z jiných druhů, může být uskutečněna pomocí standardních technik hybridizace DNA/RNA, prováděné za vhodných podmínek, za použití části nebo celé sekvence cDNA pro a_d (tato sekvence cDNA pro a_d je použita jako sonda pro testování („sreening“) vhodné knihovny). Jinou možností použitelnou k amplifikaci a identifikaci sekvencí genomové 5 DNA kódující α,ι je využití polymerázové řetězcové reakce (PCR), při které jsou jako příměry použity oligonukleotidy vytvořené na základě známé sekvence cDNA. Pomocí konvenčních metod syntézy může být připravena syntetická DNA kódující polypeptid a_d, včetně jeho fragmentů a různých variant.

Informace o sekvenci DNA podle vynálezu rovněž umožňují vytvořit, prostřednictvím přístupu využívajícího rekombinantní techniky nebo strategie „knockoutování“ genů [viz. například Kapecchi, Science 244:1288 až 1292 (1989)], hlodavce, kteří nejsou schopni exprimovat funkční polypeptid a* nebo kteří exprimují nějakou z variant polypeptidu a_d. Tito hlodavci mohou sloužit jako vhodný model pro studium aktivit polypeptidu a_d a modulátorů polypeptidu a_d in 15 vivo.

Sekvence DNA a aminokyselinové sekvence podle vynálezu rovněž umožňují provést analýzu těch epitopů a_d, které se aktivně účastní vazby na receptor, a rovněž epitopů, které mohou tuto vazbu nějakým způsobem regulovat, spíše než se jí aktivně účastnit. Vynález rovněž zahrnuje 20 možnost identifikace epitopů, které se mohou účastnit přenosu signálů přes membránu.

DNA podle vynálezu je rovněž použitelná k detekci těch typů buněk, které exprimují polypeptid a<i. Ke stanovení hladiny konstitutivní transkripce a_d v buňkách, jakož i ke stanovení změn v transkripci v závislosti na přítomnosti interních nebo externích látek, mohou být využity 25 standardní techniky hybridizace DNA/RNA, které k detekci RNA kódující polypeptid a_dvyužívají DNA pro a_d. Identifikace látek modifikujících transkripci a/nebo translaci polypeptidu a<i může být zase využita pro stanovení potenciálních terapeutických nebo preventivních účinků těchto látek. DNA podle vynálezu rovněž umožňuje hybridizaci DNA pro a_d a buněčné RNA in šitu, čímž je možné určit lokalizaci RNA pro a_d v populacích buněk obsahujících více 30 buněčných typů a ve tkáních.

DNA podle vynálezu může být rovněž použita k identifikaci polynukleotidových sekvencí z jiných organizmů než ze člověka, které vykazují homologii k sekvencím lidského a_d. Znalost sekvencí DNA pro a_d u jiných organizmů než u lidí umožňuje vytvoření živočišných modelů 35 (včetně například transgenních modelů) k lidskému systému.

Jiná stránka vynálezu se týká monoklonálních a polyklonálních protilátek specificky namířených proti a_d, které mohou být využity při imunohistochemických analýzách k lokalizaci polypeptidu a_d v buněčných kompartmentech nebo v jednotlivých buňkách tkání. Tento typ imunohistoche40 mických stanovení je zvláště výhodně používán v kombinaci s hybridizaci in sítu, přičemž jsou lokalizovány jak mRNA pro a<j, tak polypeptidový produkt genu pro a_d.

Identifikace typů buněk, které exprimují polypeptid a_d, může výrazně pomoci při vývoji látek s terapeutickým nebo preventivním účinkem. Předpokládá se, že produkty podle vynálezu, které 45 jsou příbuzné a_d, mohou být využity při léčbě onemocnění, u kterých v procesu onemocnění hrají důležitou roli makrofágy. V současnosti je popsáno množství živočišných modelů pro patologické stavy spojené s pozměněnou aktivitou makrofágů. Například v publikaci Jutila a další, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993) je u myší popsáno hromadění makrofágů v místech jak chronických, tak akutních zánětů. U laboratorních potkanů popisuje Adams a další, [Transplan50 tation 53:1115 až 1119 (1992) a Transplantation 56:794 až 799 (1993)] model pro arteriosklerózu štěpu vznikající po transplantaci heterotropních abdominálních srdečních alloštěpů. Rosenfeld a další, [Arteriosclerosis 7:9 až 23 (1987) a Arteriosclerosis 7:24 až 34 (1987)] popisuje indukci arteriosklerózy u králíků krmených dietou s přídavkem cholesterolu. Hanenberg a další, [Diabetologia 32:126 až 134 (1989)] zmiňuje spontánní rozvinutí inzulíndependentního diabetů

K-.

-6CZ 287921 B6 u laboratorních potkanů BB. Yamada a další, [Gastroenterology 104:759 až 771 (1993)] popisuje u laboratorních potkanů injikovaných polymery peptidoglykanpolysacharid z baktérie Streptococcus výskyt zánětlivého onemocnění střev a chronické granulomatózní kolitidy. Cromartie a další, [J. Exp. Med. 146:1585 až 1602 (1977)] a Schwab a další, [Infection and Immunity 59:4436 až 4442 (1991)] zmiňují, že injekce proteinů buněčné stěny z bakterie Streptococcus do organizmu laboratorních potkanů má za následek artritický stav charakterizovaný zánětem periferních kloubů a následným poškozením těchto kloubů. A konečně Huitinga a další, [Eur. J. Immunol 23:709 až 715 (1993)] popisuje u laboratorních potkanů Lewis výskyt encefalomyelitidy (ložiskový zánět mozku a míchy), která je modelem pro roztroušenou sklerózu. U každého z těchto modelů jsou ke zmírnění průběhu nemoci využívány protilátky proti a_d nebo jiné proteiny vážící polypeptid a_d nebo rozpustné formy polypeptidu a_d. Cílem tohoto působení je pravděpodobně zamezit aktivaci makrofágů.

Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic použitelných při léčbě těchto a jiných onemocnění. Farmaceutické kompozice jsou navrhovány tak, aby inhibovaly interakce mezi a_da jeho ligandem (-dy). Mezi tyto farmaceutické kompozice patří nejrůznější rozpustné formy polypeptidu a_d a formy polypeptidu a_d asociované s membránou (obsahující celý polypeptid a_dnebo jeho fragmenty, které se aktivně účastní při vazbě polypeptidu a_d), nejrůznější rozpustné formy proteinů vážících a_d a formy proteinů vážících a_d asociované s membránou (včetně protilátek, ligandů a podobně), intracelulámí a extracelulámí modulátor vazebné aktivity polypeptidu a_d a/nebo modulátor exprese polypeptidu a_d a/nebo polypeptidu aa-ligand, včetně modulátorů transkripce, translace, posttranslačních úprav a/nebo intracelulámího transportu.

Vynález se rovněž týká metod sloužících k léčbě onemocnění, u kterých svou roli hraje vazba polypeptidu a_d nebo lokalizovaná akumulace buněk exprimující polypeptid a_d. V těchto metodách je pacientovi postiženému zmíněným onemocněním podávána farmaceutická kompozice podle vynálezu v množství dostačujícím k ovlivnění úrovně vazby polypeptidu a_d nebo v množství dostačujícím k ovlivnění akumulace buněk exprimujících polypeptid a_d. Tyto metody léčby podle vynálezu jsou použitelné při onemocněních jakými jsou například, ale nejenom, diabetes I. typu, ateroskleróza, roztroušená skleróza, astma, lupénka, záněty plic, syndrom akutní respirační tísně a revmatická artritida.

Přehled obrázků na výkresech

Množství dalších aspektů a výhod vynálezu bude zřejmější, jestliže se vezme v potaz následující popis vynálezu, kde jsou zmíněny i následující obrázky, kde:

Na Obrázcích IA až ID jsou znázorněny aminokyselinové sekvence lidských CDllb (SEK. ID. Č.: 3), CD1 lc (SEK. ID. Č.: 4) a a_d (SEK. ID. Č.: 2).

Příklady provedení vynálezu

Vynález je ilustrován následujícími příklady týkajícími se izolace klonu DNA kódující polypeptid a_d z knihovny cDNA z lidské sleziny. Přesněji řečeno, Příklad 1 ilustruje použití protilátky proti psímu citmi při pokusu detekovat homologní lidský protein. Příklad 2 detailně popisuje purifikaci psího polypeptidu cctmi a sekvenci N-koncové části tohoto polypeptidu, aby bylo možné vytvořit oligonukleotidové primeiy použitelné kamplifikaci psího genu pro cctmi pomocí PCR. Příklad 3 se týká purifíkace velkého množství polypeptidu cctmi z organizmu psa, aby bylo možné určit vnitřní sekvence tohoto polypeptidu a poté připravit další příměry pro PCR. Příklad 4 popisuje použití primerů komplementárních ke vnitřní sekvenci genu pro octmi při amplifikaci fragmentu genu kódujícího psí a™i pomocí PCR. Příklad 5 se týká klonování sekvence cDNA kódující lidský a_d. Příklad 6 popisuje analýzu exprese mRNA kódující a_d

-7CZ 287921 B6 v lidských tkáních a buňkách, prováděnou metodou Northem blot. Příklad 7 detailně popisuje konstrukci expresivních plazmidů obsahujících sekvenci kódující lidský a_d a transfekci buněk COS těmito plazmidy. Příklad 8 se týká analýzy exprese polypeptidu a_d v transfekovaných buňkách COS prováděné metodou ELISA. Příklad 9 popisuje analýzu buněk COS transfekovaných expresivními plazmidy obsahujícími sekvenci kódující lidský a_d prováděnou pomocí FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). Příklad 10 se týká imunoprecipitace polypeptidu CD 18 asociovaného s a_d v kotransfekovaných buňkách COS. Příklad 11 popisuje stabilní transfekci buněk ovárií čínského křečka (CHO buňky) pomocí expresivního konstruktu obsahujícího sekvenci kódující a_d. Příklad 12 se týká vazby polypeptidu a<i (závislé na přítomnosti polypeptidu CD 18) na intercelulámí adhezivní molekulu ICAM-R, mutantní protein ICAM-R a molekulu komplementu iC3b. Příklad 13 popisuje techniku SPA sloužící k identifikaci inhibitorů nebo posilovačů (tj. modulátorů) vazebných interakcí ligand pro a_d/anti-ligand pro a_d. Příklad 14 popisuje konstrukci expresivních plazmidů, které kódují rozpustné formy polypeptidu a_d a vazebné analýzy produktů exprese. Příklad 15 se týká produkce polyklonálních sér a monoklonálních protilátek specificky namířených proti a_d. Příklad 16 popisuje použití polyklonálního séra namířeného proti a<j při analýze tkáňové distribuce polypeptidu a_d, exprese a_d na povrchu leukocytů periferního krevního oběhu a exprese polypeptidu a_d vzánětlivé anezánětlivé synovii (kloubní nitroblána). Příklad 17 popisuje izolaci sekvencí cDNA, které vykazují homologii k sekvencím lidského genu pro a_d, z organizmu laboratorních potkanů. Příklad 18 se týká konstrukce expresivních plazmidů kódujících celý polypeptid a* expresivních plazmidů kódujících doménu I polypeptidu a_d, včetně fúzních proteinů domény I/IgG, a produkce monoklonálních protilátek proti celému polypeptidu a fuzním proteinům obsahujícím doménu I. Příklad 19 se týká izolace sekvencí cDNA, které vykazují homologii k sekvencím lidského genu pro a_d, z organizmu myší. Příklad 20 popisuje další izolaci klonů cDNA kódujících a_d použitých k potvrzení výsledků sekvenční analýzy. Příklad 21 se týká hybridizačních analýz prováděných in šitu v různých myších tkáních, které slouží ke stanovení specifity tkáňové ’ a buněčné exprese předpokládaného myšího homologu lidského a_d. Příklad 22 popisuje konstruk- ’' ci expresivních konstruktů, které kódují předpokládaný myší homolog lidského a_d. Příklad 23 se ” týká vytvoření „knockoutované“ myši, u které je rozrušen gen kódující předpokládaný myší homolog lidského a_d. Příklad 24 se týká izolace sekvencí cDNA, které vykazují homologii ke kódujícím sekvencím lidského genu pro a_d, z organizmu králíků. Příklad 25 popisuje živočišný model onemocnění člověka, ve kterém jsou stanovovány možnosti modulace a_d. Příklad 26 popisuje expresi polypeptidu a_d u živočišného modelu onemocnění.

Příklad 1

Pokus detekovat lidský homolog psího polypeptidu a™i

Za účelem pokusit se identifikovat lidský homolog psího polypeptidu oc-tmi byla na lidských leukocytech periferního krevního oběhu testována křížová reaktivita monoklonální protilátky Call.8H2 specificky namířené proti psímu cc-γμι [Moore a další, viz. výše]. Buňky (obvykle 1 x 10⁶ buněk) byly na ledu za přítomnosti 0,1% azidu sodného inkubovány s neředěným supematantem získaným po kultivaci hybridomů nebo s purifikovanou kontrolní myší protilátkou IgG-negativní (10 pg/ml). Vazba monoklonální protilátky byla detekována následnou inkubací koňskou protilátkou (o koncentraci 6 pg/ml) namířenou proti myším IgG konjugovanou s FITC (Vector 10 Laboratories, Burlingame, CA). Označené buňky byly ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem (PBS) fixovány pomocí 2 % w/v paraformaldehydu a poté analyzovány za použití přístroje FACS Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Při obvyklém provedení bylo s využitím logaritmického zesílení intenzity fluorescence analyzováno 10 000 buněk.

-8CZ 287921 B6

Získané výsledky naznačují, že protilátka Call.8H2 nereaguje křížově spovrchovými proteiny exprimovanými na povrchu lidských leukocytů periferního krevního oběhu, zatímco v podstatě všechny kontrolní buňky, kterými jsou neoplastické psí lymfocyty periferního krevního oběhu, polypeptid oc-tmi na svém povrchu exprimovaly.

Protože monoklonální protilátka Cal 1.8H2 specificky namířená proti psí podjednotce a nereagovala křížově s nějakým lidským homologem této podjednotky, byla nezbytným předpokladem izolace odpovídajícího lidského protějšku DNA kódující psí a™! (jestli ovšem tento lidský protějšek existuje) izolace zmíněné DNA kódující psí cctmi·

Příklad 2

Afínitní purifíkace psího polypeptidu a™i použitého k sekvenci N-koncové oblasti

Za účelem stanovení N-koncové sekvence byl afinitně purifikován psí polypeptid ατΜΐ a získaná aminokyselinová sekvence byla použita při návrhu oligonukleotidové sondy nebo příměru. Stručně řečeno, monoklonální protilátka Cal 1.8H2 namířená proti polypeptidu cctmi, byla navázána na chromatografický nosič Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) a požadovaný protein byl izolován pomocí specifické interakce protilátka-protein. Protilátka byla na nosič konjugována postupem doporučeným firmou Biorad a výsledná koncentrace byla 5 mg protilátky na ml nosiče. Po konjugaci byl přebytek protilátky odstraněn a nosič byl zablokován pomocí trojnásobného objemu 0,lM ethanolaminu. Nosič byl následně promyt fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem (PBS) o objemu odpovídajícímu třiceti objemům kolony.

Ve 250 ml pufru obsahujícího 0,32 M sacharózu ve 25mM Tris-HCl, pH 8,0, s inhibitory proteáz, bylo homogenizováno 25 gramů sleziny získané z jednoho psa. Buněčná jádra a celé buňky byly odstraněny centrifugací prováděnou při 1000 x g po dobu 15 minut. Membrány byly od supematantu odděleny centrifugám prováděnou při 100 000 xg po dobu 30 minut. Takto získaná peleta tvořená membránami byla rozsuspendována ve 200 ml lyzačního pufru (50 mM NaCl, 50 mM sůl kyseliny borité, pH 8,0, spolu s 2 % NP-40) a po dobu 1 hodiny inkubována na ledu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugám prováděnou při 100 000 x g po dobu 60 minut. Deset mililitrů čirého lyzátu bylo spolu s 0,5 ml nosiče Affigel 10 s konjugovanou protilátkou Cal 1.8H2 (viz. výše) přeneseno do polypropylénové zkumavky o objemu 15 ml. Tato zkumavka byla za stálého míchání inkubována přes noc při 4 °C a nosič byl následně promyt padesátinásobným množstvím D-PBS. Poté byl tento nosič přenesen do mikrocentrifúgační zkumavky a po dobu 10 minut vařen za přítomnosti 1 ml Laemmliho vzorkového pufru (neredukující) o složení 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 2 % SDS, 20 % glycerol a 0,002 % bromfenolová modř. Nosič byl následně odstraněn centrifugám'; k supematantu byla přidána 1/15 objemu βmerkaptoethanolu (Sigma, St. Louis, MO) a vzorek byl podroben elektroforéze na 7% polyakrylamidovém gelu. Rozdělené proteiny byly přeneseny na membránu Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) následujícím způsobem.

Gely byly jednou promyty deionizovanou vodou filtrovanou přes membránu Millipore a poté po dobu 15 až 30 minut ekvilibrovány v transferovém pufru o složení 10 mM kyselina 3-[cyklohexylamino]-l-propansulfonová (CAPS), pH 10,5 s 10% methanolem. Membrány Immobilon byly navlhčeny methanolem, promyty filtrovanou vodou a po dobu 15 až 30 minut ekvilibrovány v transferovém pufru CAPS. Počáteční přenos byl prováděn za použití přístroje pro Western Blot firmy BioRad při 70 voltech po dobu 3 hodin.

Membrány Immobilon byly poté z přístroje vyjmuty a po dobu 10 minut barveny 0,1% roztokem Coomassie R250. Následně byly membrány ve třech cyklech po deseti minutách odbarveny směsí 50 % methanol/10 % kyselina octová. Po odbarvení byly membrány promyty filtrovanou vodou a vysušeny na vzduchu.

-9CZ 287921 B6

Byly detekovány proužky proteinů o zdánlivých molekulových hmotnostech 150 kD, 95 kD, 50 kD a 30 kD. Proužky o zdánlivých molekulových hmotnostech 50 kD a 30 kD vznikly pravděpodobně v důsledku kontaminace protilátkou. Jak u proužku odpovídajícímu proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 kD, tak u proužku odpovídajícímu proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 95 kD byl učiněn pokus určit N-koncovou sekvenci, nicméně protein o zdánlivé molekulové hmotnosti 95 kD byl blokován, takže tuto sekvenci nebylo možné určit. Proužek proteinu o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 kD byl z membrány vystřižen a pomocí proteinového sekvenátoru Applied Biosystems (Foster City, CA) model 473A přímo sekvenován postupem podle výrobce. Získaná aminokyselinová sekvence je za použití jednopísmenného aminokyselinového kódu znázorněna jako SEK. ID. Č.: 5:

FNLDVEEPMVFQ (SEK. ID. Č.: 5)

Tato identifikovaná sekvence obsahuje sekvenci FLDN charakteristickou pro podjednotky a rodiny integrinů [Tamura a další, J. Cell. Biol. 111:1593 až 1604 (1990)].

Vytvoření primerů a pokus o amplifikaci sekvenci kódujících psí α™ι

S využitím získané informace o N-koncové sekvenci byly za účelem hybridizace navrženy tři oligonukleotidové sondy:

a) „Tommer“ - plně degenerovaný oligonukleotid; b) „Patmer“ - částečně degenerovaný oligonukleotid; a c) „Guessmer“ - nedegenerovaný oligonukleotid se sekvencí založenou na kodonech používaných u savců. Tyto sondy jsou znázorněny níže jako SEK. ID. Č.: 6, 7 a 8. Symboly v sekvencích nukleových kyselin použité ve všech nukleotidových sekvencích vynálezu odpovídají §1,882 37 C. R. F.

5’-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3'	(SEK. ID. Č.: 6)
5'-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3'	(SEK. ID. Č.: 7)
5'-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3'	(SEK. ID. Č.: 8)

Za použití těchto oligonukleotidů (vytvořených na základě dat získaných sekvenací polypeptidu) nebyly při několika hybridizačních analýzách, za podmínek umožňujících hybridizaci nedokonale komplementárních sekvencí, v knihovně cDNA získané ze psích makrofágů periferního krevního oběhu/slezinných buněk zaklonované do λΖΑΡ (Stratagene, La Jolla, CA), detekovány odpovídající klony.

Následně byly na základě odhadnuté sekvence N-konce polypeptidu vytvořeny čtyři oligonukleotidové primery označované 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec (jak jsou zobrazeny v SEK. ID. Č.: 9, 10, 11 a 12, kde Deg označuje degenerovanou sekvenci a Spec nedegenerovanou sekvenci). S těmito oligonukleotidovými primery byl proveden pokus o amplifikaci (pomocí PCR) sekvencí kódujících psí α_τΜ1 z DNA fágové knihovny purifikované z lyzátů knihovny firmy Stratagene popsané výše.

5'-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3'	(SEK. ID. Č.: 9)
5-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3'	(SEK. ID. Č.: 10)
5-TGRAANACCATNGGYTC-3'	(SEK. ID. Č.: 11)
5'-TTGGAAGACCATNGGYTC-3'	(SEK. ID. Č.: 12)

-10CZ 287921 B6

Oligonukleotidové primery pro amplifikaci a™i byly použity ve dvojicích s primery komplementárními k sekvenci vektoru označenými T3 a T7 znázorněnými v SEK. ID. Č.: 13 (T3) a 14 (T7), které hybridizují se sekvencemi ohraničujícími oblast polylinkeru fágmidu Bluescript nacházejícím se v λΖΑΡ.

5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3' (SEK. ID. Č.: 13)

5-AATACGACTCACTATAG-3' (SEK. ID. Č.: 14)

Amplifikace metodou PCR byla prováděna v pufru Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) obsahujícím hořečnaté ionty, za použití 150 ng knihovny DNA, 1 pg jednotlivého primeru, 220 μΜ každého z dNTP a 2,5 jednotek polymerázy Taq (Boehringer Mannheim). Produkty PCR reakce byly separovány elektroforézou na 1% agarózovém gelu v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE) s přídavkem ethidium bromidu o koncentraci 0,25 pg/ml. DNA byla metodou kapilárního přenosu přenesena na membránu Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Transfer byl prováděn přes noc v lOx SSPE. Po přenesení na membránu byla imobilizovaná DNA denaturována působením 0,5 M NaOH s 0,6 M NaCl, neutralizována 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0, v 1,5 M NaCl a před zesíťováním pomocí UV záření prováděným na přístroji Stratalinker (Stratagene) promyta 2x SSPE. Za stálého třepání byla membrána při 50 °C inkubována po dobu 2 hodin v prehybridizačním pufru (5x SSPE, 4x Denhardts, 0,8 % SDS, 30 % formamid).

Za použití pufru pro kinázu firmy Boehringer Mannheim s 100 až 300 pCi yP³²-dATP a 1 až 3 jednotek polynukleotid kinázy byly oligonukleotidové sondy 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec (SEK. ID. Č.: 9, 10, 11 a 12) radioaktivně označeny. Značení probíhalo 1 až 3 hodiny při 37 °C. Nezainkorporovaná radioaktivní značka byla odstraněna chromatografií na koloně Sephadexu G25 fine (Pharmacia, Piscataway, NJ) za použití pufru o složení 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE), a proteklá frakce byla přímo přidána k prehybridizačnímu roztoku. Hybridizace s radioaktivní sondou probíhala při 42 °C po dobu 16 hodin za stálého třepání. Nakonec byly membrány promývány při 50 °C po dobu 15 minut roztokem lxSSPE/0,1 % SDS. Membrány byly poté při -80 °C po dobu 1 až 4 hodin exponovány na film Kodak X-Omat AR.

Oligonukleotidy 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec hybridizovaly pouze s produkty těch PCR reakcí, při kterých byly použity jako primery, a nehybridizovaly, jak se očekávalo, s produkty PCR reakcí, u nichž jako primeiy použity nebyly. Bylo tudíž usouzeno, že žádný z produktů reakce PCR není specifický pro a™i, protože ani jeden z produktů nehybridizoval se všemi použitými sondami.

Příklad 3

Purifikace velkého množství polypeptidu a_TM1 z organizmu psa prováděná za účelem určení vnitřní sekvence polypeptidu

Aby bylo možné získat další aminokyselinovou sekvenci použitelnou k vytvoření příměrů, byl za účelem určení vnitřní sekvence polypeptidu purifikován psí polypeptid a_TM[. Kpurifikaci proteinu použitelného k určení vnitřní sekvence byly použity tři kusy zmrazené sleziny (každá o hmotnosti přibližně 50 g) a zmrazené buňky získané ze dvou slezin dospělých psů. Ve 200 až 300 ml borátového pufru bylo v míchacím zařízení Waring homogenizováno 50 g sleziny. Homogenizovaný materiál byl zředěn stejným objemem pufru obsahujícím 4 % NP-40 a směs byla lehce třepána přinejmenším jednu hodinu. Větší kusy byly zlyzátu odstraněny centrifúgací prováděnou při 2000 x g po dobu 20 minut a supematant byl přefiltrován buď přes filtr Coming (Coming, NY) nebo přes filtrační systém Coming s membránou o velikosti pórů 0,8 mikronů. Lyzát byl následně přečištěn filtrací přes filtrační systém Coming s membránou o velikosti pórů 0,4 mikronů.

-11CZ 287921 B6

Lyzát ze sleziny a nosič Affigel 10 s konjugovanou protilátkou (popsaný v Příkladu 2) byly smíchány v poměru 150:1 v alikvotech o objemu 100 ml a za stálého třepání inkubovány přes noc při 4 °C. Lyzát byl následně odstraněn centrifugací prováděnou při 1000 x g po dobu 10 minut, smíchán s dalším alikvotem nosiče Affigel 10 s konjugovanou protilátkou a inkubován přes noc za podmínek zmíněných výše. Alikvoty nosiče s navázaným proteinem byly poté spojeny a promyty 50-ti násobným objemem pufru D-PBS/0,1 % Tween20, a nosič byl umístěn na kolonu BioRad o objemu 50 ml. Navázaný protein byl z nosiče eluován 3 až 5 násobným objemem 0,1 M glycinu (pH 2,5); byly sbírány frakce o objemech 900 μΐ a tyto frakce byly neutralizovány pomocí 100 μΐ pufru 1M Tris, pH 8,0. Z každé frakce byl odebrán alikvot o objemu 15 μΐ a tento alikvot byl povařen se stejným objemem 2x Laemmliho vzorkového pufru s 1/15 objemu 1M dithiothreitolu (DTT). Tyto vzorky byly analyzovány elektroforézou na 8% polyakrylamidovém gelu Novex (San Diego, CA) a vizualizovány barvením Coomassie nebo stříbrem za použití Daiichiho kitu (Enprotech, Natick, MA), postupem popsaným výrobcem. Frakce obsahující největší množství proteinu byly smíchány a zakoncentrovány ve vakuu. Zbylý roztok byl zředěn na polovinu redukujícím Laemmliho vzorkovým pufrem a elektroforeticky rozdělen na 7% polyakrylamidovém gelu tloušťce 1,5 mm v pufru Tris-glycin/SDS. Po elektroforéze byly proteiny za použití přístroje pro Western Blot firmy Hoefer přeneseny z gelu na membránu Immobilon postupem popsaným v Příkladu 2.

Proužky proteinů o velikosti odpovídající psímu a_TM1 byly z 10 membrán PVDF vyříznuty; celkový obsah proteinu byl přibližně 47 pg. Tyto vyříznuté proužky byly odbarveny ve 4 ml 50% methanolu (5 minut), vysušeny na vzduchu a rozřezány na kousky o velikosti 1x2 mm. Tyto kousky membrán byly při 4 °C na 30 minut ponořeny do 2 ml 95% acetonu, občas vortexovány a nakonec vysušeny na vzduchu.

Před vlastním proteolytickým štěpením proteinu navázaného na membránu byly v 1,5 ml 70% kyseliny mravenčí rozpuštěny 3 mg bromkyanu (CNBr) (Pierce, Rockford, IL). Tento roztok byl · přidán do zkumavky obsahující kousky membrány PVDF a zkumavka byla inkubována po dobu 24 hodin při pokojové teplotě ve tmě. Supematant (Sl) byl následně přenesen do jiné zkumavky · a kousky membrány byly promyty 0,25 ml 70% kyseliny mravenčí. Tento supematant (S2) byl poté přidán ksupematantu Sl. Ke spojeným supematantům (Sl a S2) byly přidány 2 ml vody Milli Q a vzniklý roztok byl lyofilizován. Kousky membrán PVDF byly vysušeny pod proudem dusíku a při 42 °C po dobu 17 hodin znovu extrahovány 1,25 ml roztoku o složení 60% acetonitril, 0,1% kyselina tetrafluorooctová (TFA). Tento supematant (S3) byl odebrán a kousky membrán PVDF byly při 42 °C po dobu 1 hodiny znovu extrahovány 1,0 ml roztoku o složení 80 % acetonitril, 0,08% kyselina tetrafluorooctová. Tento supematant (S4) byl smíchán s předchozími supematanty (Sl, S2 a S3) a směs supematantů byla vysušena ve vakuu.

Vysušené fragmenty proteinu získané štěpením pomocí CNBr byly následně rozpuštěny v 83 μΙ roztoku o složení 8M močovina, 0,4 M NH4HCO3. Tyto fragmenty byly redukovány přidáním 5 μΐ 45 mM dithiothreitolu (DTT) a následnou inkubací při 50 °C po dobu 15 minut. Vzniklý roztok byl poté ochlazen na pokojovou teplotu a fragmenty byly alkylovány přidáním 5 μΐ 100 mM jodacetamidu (Sigma, St. Louis, MO). Po 15-ti minutové inkubaci při pokojové teplotě byl vzorek zředěn 187 μΐ vody Milli Q na výslednou koncentraci močoviny odpovídající 2,0 M. Následně byl ke vzorku přidán trypsin (Worthington, Freehold, NJ) v poměru enzym:protein 1:25 (w/w) a štěpení probíhalo při 37 °C po dobu 24 hodin. Štěpení bylo ukončeno přídavkem 30 μΐ TFA. Proteinové fragmenty byly poté separovány pomocí vysokoůčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na přístroji Waters 625 LC (Millipore, Milford, MA) za použití kolony Vydac C-18 (5 mikronů) o rozměrech 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) ekvilibrované v roztoku 0,05 % TFA ve vodě pro HPLC (pufr A). Peptidy byly eluovány zvyšující se koncentrací 80 % acetonitrilu v 0,04 % TFA (pufr B) s gradientem 38% až 75% pufr B po dobu 65 až 95 minut a 75% až 98 % pufr B po dobu 95 až 105 minut. Peptidy byly děleny při průtoku 0,2 ml/minuta a detekovány při vlnové délce 210 nm.

-12CZ 287921 B6

Po frakcionaci byla u peptidů stanovována aminokyselinová sekvence. Stanovení aminokyselinové sekvence bylo prováděno automaticky Edmanovým odbouráváním na proteinovém sekvenátoru Biosystems Model 437A za použití standardních cyklů doporučených výrobcem. Analýza získaných dat byla provedena softwarovým programem Data Analysis Model 610A, verze 1.2.1. Všechny sekvenační reagencie byly dodány firmou Applied Biosystems. Aminokyselinové sekvence sedmi z celkových osmi vnitřních fragmentů jsou znázorněny níže, přičemž „X“ označuje aminokyseliny, u kterých nelze s jistotou určit o jakou aminokyselinu se vlastně jedná.

VFQEXGAGFGQ	(SEK. ID. Č.	15)
LYDXVAATGLXQPI	(SEK. ID. Č.	16)
PLEYXDVIPQAE	(SEK. ID. Č.	17)
FQEGFSXVLX	(SEK. ID. Č.	18)
TSPTFIXMSQENVD	(SEK. ID. Č.	19)
LWGAPLEWAVXQTGR	(SEK. ID. Č.	20)
LDXKPXDTA	(SEK. ID. Č.	21)

Vytvoření primeru

Jedna ze získaných aminokyselinových sekvencí (zobrazení jako SEK. ID. Č.: 22) byla použita k vytvoření úplně degenerovaného oligonukleotidového primeru označeného p4(R) a zobrazeného jako SEK. ID. Č.: 23.

FGEQFSE

5'-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3' (SEK. ID. Č.: 22) (SEK. ID. Č.: 23)

Příklad 4

Klonování fragmentu psího a™i metodou PCR

S využitím PCR byla ze dvojvláknové cDNA ze psí sleziny amplifikována část na 5' konci genu kódujícího psí polypeptid a_TMiA. Vytvoření dvojvláknové cDNA ze psí sleziny

Jeden gram zmrazeného materiálu získaného ze sleziny mladého psa byl ve směsi kapalného dusíku a suchého ledu rozdrcen a homogenizován ve 20 ml pufru RNA-Stat 60 (TelTest B, lne, Friendswood, TX). Poté byly přidány 4 ml chloroformu a roztok byl oddělen centrifugací prováděnou při 12 000 x g po dobu 15 minut. Z vodné vrstvy byla RNA precipitována přídavkem 10 ml ethanolu. RNA obsahující poly-A sekvenci byla poté oddělena s využitím kuličkového nosiče Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Oslo, Norsko). Pět alikvotů RNA o celkové hmotnosti 100 pg bylo smícháno a zředěno stejným objemem 2x vazebného pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS). RNA byla následně po dobu 5 minut inkubována s nosičem Oligo dT Dynabeads (1,0 ml nebo 5 mg nosiče na všechny vzorky). Před vlastní elucí polyA mRNA prováděné roztokem o složení 2 mM EDTA, pH 7,5, byly kuličky nosiče promyty pufrem o složení lOmM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA a 0,1% SDS podle postupu popsaného výrobcem. Následně byla, postupem podle výrobce a za použití eluované mRNA s poly-A sekvencí a kitu pro syntézu cDNA firmy Boehringer Mannheim, syntetizována dvojvláknová cDNA.

-13CZ 287921 B6

B. Izolace cDNA kódující část psího polypeptidu a_TMi

Při standardní reakci PCR prováděné za použití 150 ng dvojvláknové cDNA, 500 ng každého zprimerů, 200 μΜ každého dNTP a 1,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Mannheim) 5 v pufru Taq (Boehringer Mannheim) s přídavkem hořečnatých iontů, byly použity oligonukleotidové primery 5'Deg (SEK. ID. Č.: 9) a p4(R) (SEK. ID. Č.: 23). Vzniklé produkty (1 μΐ původní reakce) byly, za účelem dosažení vyšších výtěžků, použity v další reakci PCR se stejnými primery. Tyto proužky byly při 60 °C v pufru o složení 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl eluovány z 1% agarózového gelu na papír Schleicher & Schuell (Keene, NH) NA4S, 10 precipitovány a za použití klonovacího kitu TA (Invitrogen) zaligovány do vektoru pCR^tmII (Invitrogen, San Diego, CA) (postupem doporučeným výrobcem). Ligační směsí byly elektroporačně transformovány bakterie XL-1 Blue (Stratagene). Jeden klon, označený 2.7, obsahoval sekvence odpovídající sekvencím DNA pro polypeptid α_ΤΜι, které nebyly využity při návrhu primerů.

Sekvence byla provedena pomocí sekvenátoru DNA Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) za použití sekvenačního kitu využívajícího kterminaci reakce deoxynukleotidy s navázanou značkou (ABI). Při této sekvenaci byly asymetrickou reakcí PCR [McCabe, „Production of Single Stranded DNA by Asymetrie PCR,“ v PCR Protocols: A Guide to Methods and 20 Applications, Innis a další (eds.), strany 76 až 83, Academie Press. New York (1990)] inkorporovány fluorescenčně značené dNTP následujícím postupem. Vzorky byly inkubovány po dobu 4 minut při 96 °C a poté podrobeny 25 cyklům: 96 °C, po dobu 15 sekund; 50 °C po dobu 1 sekundy; 60 °C po dobu 4 minut. Získaná data (včetně chromatogramu a textových souborů) byla automaticky načtena do referenčních souborů. Celá sekvence inzertu v klonu 2.7 je 25 znázorněna jako SEK. ID. Č.: 24.

Pokusy o izolaci cDNA (z knihovny firmy Stratagene; jak je popsána v Příkladu 2), kódující celý psí polypeptid citmi byly neúspěšné. Za použití klonu 2.7 jako sondy, bylo v podmínkách umožňujících hybridizaci sekvenaci s nižším stupněm komplementarity (použití 30% formamidu) 30 otestováno přibližně 1 x 10⁶ fágových plaků, ale nebyly identifikovány žádné pozitivní klony.

Rovněž neúspěšné byly pokusy o amplifikaci odpovídajících sekvencí nacházejících se po směru transkripce od sekvencí reprezentovaných v klonu 2.7. Pokusy o amplifikaci těchto sekvencí nacházejících se po směru transkripce od sekvencí reprezentovaných v klonu 2.7 byly prováděny za použití specifických oligonukleotidů odvozených z klonu 2.7 nebo degenerovaných primerů se 35 sekvencí vycházející z aminokyselinové sekvence jiných peptidových fragmentů, a jako druhý primer byl použit degenerovaný oligonukleotid se sekvencí vycházející z konzervativního aminokyselinového motivu GFFKR podjednotky a [Tamura a další, viz. výše],

Příklad 5

Klonování předpokládaného lidského homologu ke psímu a™i

Při pokusu o izolaci lidské sekvence homologní ke psí sekvenci kódující cctmi byl jako sonda 45 použit fragment psího αχΜΐ o velikosti přibližně 1 kb z klonu 2.7. Tato sonda byla vytvořena reakcí PCR za podmínek popsaných v Příkladu 2 a za použití primerů NT2 (viz. SEK. ID. Č.: 25) a p4(R) (SEK. ID. Č.: 23).

5'-GTNTTYCARGARGAYGGProdukt reakce PCR byl purifikován za použití kitu Quick Spin firmy Qiagen (Chatsworth, GA) postupem doporučeným výrobcem. Takto purifikovaná DNA byla za použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označena 200 pCi a³²-PdCTP. Nezainkorporovaný izotop byl odstraněn chromatografií na

-14CZ 287921 B6 koloně Sephadexu G25 (fíne). Před vlastním použitím byla sonda denaturována působením 0,2 M NaOH a neutralizována roztokem 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0.

Na filtračních papírech Hybond (Amersham) byly připraveny kolonie knihovny cDNA z lidské sleziny zaklonované do vektoru pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Filtry byly nejprve vystaveny působení denaturačních činidel a následně neutralizovány postupem popsaným v Příkladu 2 a poté za mírného třepání po dobu 2 hodin inkubovány při 50 °C v prehybridizačním roztoku (8 ml/filtr) se 30% formamidem. K tomuto roztoku byla přidána radioaktivně značená sonda (viz. výše) a spolu s filtry byl tento roztok inkubován při 42 °C po dobu 14 hodin. Filtry byly dvakrát promyty roztokem 2x SSC/0,1 % SDS o teplotě 37 °C a dvakrát roztokem 2x SSC/0,1 % SDS o teplotě 50 °C. Nakonec byly filtry promyty dvakrát roztokem lx SSC/0,1 % SDS o teplotě 65 °C (lx SSC má složení 150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný, pH 7,0). Po dobu 6 hodin byly filtry v kazetě s kontrastním filtrem exponovány na film Kodak X-Omat AR. Kolonie poskytující signál byly z duplikátu filtračního papíru natřeny na plotny s LB médiem obohaceným hořečnatými ionty (LBM)/karbenicilin a inkubovány přes noc při 37 °C. Vyrostlé kolonie byly přeneseny na filtry Hybond a tyto filtry byly zpracovány postupem popsaným výše. Tyto filtiy byly, za použití sondy o velikosti 1 kb z klonu 2.7, radioaktivně označené postupem popsaným výše, hybridizovány v podmínkách, při kteiých je k dosažení pozitivního signálu nezbytná vyšší komplementarita mezi sondou a testovanou DNA než tomu bylo v předchozím případě; podmínky hybridizace byly 50% roztok formamidu, 50 °C po dobu 3 hodin. Filtry byly nakonec promyty dvakrát roztokem lx SSC/0,1 % SDS o teplotě 65 °C a po dobu 2,5 hodin byly filtry při -80 °C v kazetě s kontrastním filtrem exponovány na film Kodak X-Omat AR. Byly identifikovány pozitivní kolonie a tyto kolonie byly přes noc kultivovány v LBM/karbenicilin. Z jednotlivých kultur byla pomocí kitu Promega Wizard pro minipreparaci DNA, postupem doporučovaným výrobcem, izolována DNA a tato DNA byla následně sekvenována.

Prvním screeningem bylo jako pozitivních vybráno 18 klonů, zatímco výsledkem druhého screeningu prováděného za podmínek, při kterých je k dosažení pozitivního signálu nezbytná vyšší komplementarita mezi sondou a testovanou DNA, byla identifikace jednoho pozitivního klonu označeného 19A2. Sekvence DNA a odhadnutá aminokyselinová sekvence klonu 19A2 lidského a_d jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 1 a 2.

Charakteristiky cDNA pro lidský a_d a predikovaného polypeptidu

Klon 19A2 obsahuje celou kódující oblast pro maturovaný protein a navíc ještě 48 bází (16 aminokyselinových zbytků) signální sekvence nacházející se na 5' konci proti směru transkripce od kódující oblasti, a 241 bází nepřekládané sekvence na 3' konci, která není ukončena polyadenylační sekvencí. Předpokládá se, že molekulová hmotnost maturovaného proteinu bude přibližně 125 kD. Předpokládaná extracelulámí doména zahrnuje přibližně aminokyselinové zbytky 17 až 1108 (v SEK. ID. Č.: 2). Na tuto extracelulámí oblast navazuje sekvence asi 20 aminokyselin, která je homologní k transmembránové oblasti lidského CDllc (aminokyselinové zbytky 1109 až 1128 v SEK. ID. Č.: 2). Cytoplazmatická doména je tvořena přibližně 30 aminokyselinami (aminokyselinové zbytky 1129 až 1161 v SEK. ID. Č.: 2). Protein rovněž obsahuje oblast (přibližně aminokyselinové zbytky 150 až 352) tvořenou asi 202 aminokyselinami, která je homologní k doméně I (inzerční) společné pro polypeptidy CDlla, CDllb a CD1 lc [Larson a Springer, viz. výše], polypeptid a_E [Shaw a další, J. Biol. Chem. 269:6016 až 6025 (1994)] a proteiny VLA-1 a VLA-2 [Tamura a další, viz. výše]. Bylo prokázáno, že doména I u jiných integrinů participuje na vazbě s ICAM [Landis a další, J. Cell. Biol. 120:1519 až 1527 (1993); Diamond a další, J. Cell. Biol. 120:1031 až 1043 (1993)], což naznačuje, že polypeptid a_d může rovněž vázat zástupce povrchových molekul proteinové rodiny ICAM. Bylo prokázáno, že tato oblast neexistuje v žádné jiné podjednotce integrinů.

-15CZ 287921 B6

Odhadnutá aminokyselinová sekvence polypeptidu a_d je z přibližně 36% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CD1 la, z přibližně 60 % homologní k aminokyselinové sekvencí polypeptidu CDllb a z přibližně 66% homologní k aminokyselinové sekvenci polypeptidu CDllc. Na Obrázku 1 jsou zobrazeny srovnané aminokyselinové sekvence polypeptidu CDllb (SEK. ID. Č.: 3), CD1 lc (SEK. ID. Č.: 4) a a_d (SEK. ID. Č.: 2).

U organizmů jednoho druhu se obvykle cytoplazmatické domény podjednotek a v integrinech β₂podstatně liší, zatímco jednotlivé typy podjednotek a vykazují mezi jednotlivými druhy vysoký stupeň homologie. V souladu s těmito pozorováními, se cytoplazmatická oblast polypeptidu a_dpodstatně liší od cytoplazmatických oblastí polypeptidů CD 11 a, CDllb a CDllc, ovšem s výjimkou aminokyselinové sekvence GFFKR (nacházející se v těsné blízkosti membrány), která je konzervována mezi všemi podjednotkami a [Rojiani a další, Biochemistry 30: 9859 až 9866 (1991)]. Protože oblast cytoplazmatického konce integrinů se účastní „inside out“ signalizace a regulace avidity [Landis a další, viz. výše], je možné, že polypeptid a_d interaguje s molekulami cytosolu, které jsou odlišné od molekul interagujících s CD1 la, CD1 lb a CD1 lc, a výsledkem toho může být skutečnost, že polypeptid a_d se účastní signálních drah odlišných od signálních drah, ve kterých participují jiné integriny β₂.

Extracelulámí doména polypeptidu a_d obsahuje, v pozici vedle domény I, konzervovanou aminokyselinovou sekvenci DGSGS; u polypeptidu CDllb je sekvence DGSGS oblastí vážící kovy, a je nezbytná pro interakci sligandem [Michishita a další. Cell 72:857 až 867 (1993)]. V aminokyselinové sekvenci polypeptidu a_d klonu 19A2 (SEK. ID. Č.: 1) jsou na pozicích 465 až 474, 518 až 527 a 592 až 600 konzervovány další tři místa, která jsou v polypeptidech CD1 lb a CD1 lc pravděpodobně odpovědná za vazbu kationtů. Doména I polypeptidu a_d vykazuje 36%, 62% a 57% homologii kodpovídajícím oblastem polypeptidů CDlla, CDllb resp. CDllc. Tento relativně nízký stupeň sekvenční homologie naznačuje, že podjednotka a_d může interagovat se skupinou extracelulámích proteinů, které jsou odlišné od proteinů, se kterými reagují jiné známé integriny β₂. Rovněž afinita polypeptidu a<i ke známým ligandům integrinů β₂, jakými jsou například ICAM-1, ICAM-2 a/nebo ICAM-R, může být odlišná od afinity demonstrované u interakcí integrin β₂/ΙΟΑΜ (viz. Příklad 12).

Izolace dalších klonů cDNA pro lidský a_d, použitých k ověření sekvence

Aby bylo možné potvrdit sekvenci DNA kódující lidský a_d, byly z knihovny cDNA z lidské sleziny (Invitrogen) zaklonované do vektoru pcDNA/Amp (popsané v Příkladu 5), pomocí hybridizace, izolovány další molekuly cDNA. Elektroforézou na agarózovém gelu byly vybrány pouze cDNA s délkou převyšující 3 kb. Sonda použitá při hybridizaci byla odvozena od 5' koncové oblasti a_d (jak je popsáno níže). Hybridizační podmínky byly totožné s podmínkami při izolaci prvního klonu lidského a* pouze stou výjimkou, že po hybridizaci byly filtry při pokojové teplotě dvakrát promyty v roztoku 2x SSC/0,1% SDS a jednou roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C. Filtry byly přes noc exponovány na film Kodak X-Omat AR.

Hybridizační sonda 5' a_d byla vytvořena pomocí reakce PCR z klonu 19A2 za použití primerů CDllc 5' For (SEK. ID. Č.: 94) a CDllc 5' Rev (SEK. ID. Č.: 95). Reakce byla prováděna následovně. Vzorky byly po dobu 4 minut udržovány při 94 °C a poté vystaveny, v cykleru Perkin-Elmer 9600, 30 cyklům změn teplot: i) 94 °C, po dobu 15 sekund; ii) 5 °C, po dobu 30 sekund; a iii) 72 °C, po dobu 1 minuty.

CD1 lc 5' For: (5')CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3') (SEK. ID. Č.: 94)

CD1 lc 5' Rev: (5')CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3') (SEK. ID. Č.: 95)

-16CZ 287921 B6

Produkt amplifikační reakce byl purifikován za použití kitu Prep-A-Gene firmy BioRad (Hercules, CA) postupem doporučeným výrobcem. Získaná sonda 5' aj byla dlouhá přibližně 720 bází, což odpovídá oblasti začínající oligonukleotidem 1121 a končící oligonukleotidem 1839 v SEK. ID. Č.: 1. Purifíkovaná DNA (přibližně 50 ng) byla, postupem doporučeným výrobcem, za použití kitu „Random Primer Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana) radioaktivně označena izotopem ³²P-dCTP. Nezainkorporovaný izotop byl odstraněn za použití sloupců „Centrisep Spin Columns“ (Princeton Separations, Adelphia, NJ) postupem doporučeným výrobcem. Radioaktivně označená sonda byla přidána k filtrům namočeným v prehybridizačním roztoku obsahujícím 45% formamid a inkubace probíhala přes noc při 50 °C. Po této inkubaci byly filtry promyty postupem popsaným výše.

Třináct kolonií poskytlo na obou duplikátech filtrů pozitivní signál. Pozitivní kolonie byly sebrány se zásobní plotny, zředěny pomocí LBM s karbenicilinem (100 pg/ml) a v různých ředěních vysety na filtry Hybond (Amersham). Duplikáty těchto filtrů byly hybridizovány v roztoku o stejném složení jako při první hybridizaci a po hybridizaci byly filtry promyty roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C a poté exponovány na film.

Při druhém testu byly potvrzeno deset z původně identifikovaných třinácti pozitivních kolonií. Dva z těchto deseti klonů (označené A7.Q a A8.Q) byly sekvenovány a bylo stanoveno, že kódují lidský α<ι. U klonu A7.Q bylo zjištěno, že je přibližně 2,5 kb dlouhý, obsahuje vedoucí sekvenci na 5' konci, část kódující oblasti a dalších 60 bází nepřekládané sekvence na 5' konci. Bylo zjištěno, že nekompletní kódující oblast je výsledkem nesprávně sestřižené oblasti intronu v místě odpovídajícím oligonukleotidu 2152 v SEK. ID. Č.: 1. U klonu A8.Q bylo zjištěno, že je přibližně 4 kb dlouhý, obsahuje celou kódující oblast pro polypeptid a_d a rovněž obsahuje sekvenci intronu v místě odpovídajícím bázi 305 v SEK. ID. Č.: 1. Ve srovnání s původně izolovaným klonem a_d (SEK. ID. Č.: 1) byl u obou klonů, jak A7.Q tak A8.Q, pozorován jeden rozdíl. Tímto rozdílem byla skutečnost, že klony A7.Q a A8.Q mají v místě báze 1495 vložen kodon tvořený třemi bázemi CAG. Sekvence klonů A7.Q a A8.Q jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 96 a 97, a složené lidské sekvence odvozené od klonů A7.Q a A8.Q spolu s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi jsou zobrazeny jako SEK. ID. C.: 98 a 99.

Příklad 6

Analýzy exprese lidského a_d ve tkáních, prováděná metodou Northem Blot

Za účelem stanovení relativní hladiny a tkáňové specifíty exprese aj, byla za použití fragmentů z klonu 19A2 jako sondy, provedena analýza metodou Northem Blot. Na agarózový gel s formaldehydem a 1 pg ethidium bromidu bylo z každého vzorku, získaného z několika lidských tkání a kultivovaných buněčných linií, naneseno přibližně 10 pg RNA. Po elektroforéze prováděné po dobu 4 hodin při napětí 100 V byla RNA přenesena na nitrocelulózovou membránu (Schleicher & Schuell) metodou kapilárního přenosu prováděnou v lOx SSC přes noc. Membrána byla „zapečena“ ve vakuu při 80 °C po dobu 1,5 hodin. K blokování membrány byl použit prehybridizační roztok obsahující 50% formamid v pufru kyseliny 3-(N-morfolino)propansulfonové (MOPS). Prehybridizace probíhala 3 hodiny při 42 °C. Fragmenty klonu 19A2 byly, postupem doporučeným výrobcem, za použití kitu „Random Primer Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim radioaktivně označena izotopem a³²P-dCTP a a³²P-dTTP. Nezainkorporovaná značka byla odstraněna na koloně Sephadexu G25 v pufru TE. K hybridizaci byl použit hybridizační pufr o aktivitě 1,5 x 10⁶ c. p. m./ml. Následně byl blot při pokojové teplotě promyt roztokem 2x SSC/0,1% SDS, dále pak roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C, roztokem 2x SSC/0,1% SDS o teplotě 50 °C, roztokem lx SSC/0,1% SDS o teplotě 50 °C, roztokem 0,5x SSC/0,1% SDS o teplotě 50 °C a nakonec roztokem 0,lx SSC/0,1% SDS o teplotě 50 °C. Poté byl blot po dobu 19 hodin exponován na film.

-17CZ 287921 B6

Hybridizace za použití fragmentu vyštěpeného z klonu 19A2 restrikčním enzymem BstXI (odpovídajícímu nukleotidům 2011 až 3388 v SEK. ID. Č.: 1) poskytla slabé signály u RNA, o velikosti přibližně 5 kb, z jater, placenty, thymu a mandlí (tonzil). Ve vzorcích z ledvin, mozku a srdce nebyl detekován žádný signál. Množství RNA přítomné ve vzorku z ledvin bylo minimální (jak ukázalo barvení ethidium bromidem).

Při použití druhého fragmentu z klonu 19A2 (zahrnujícího oblast bází 500 až 2100 v SEK. ID. Č.: 1) byly v lidských tkáních, metodou Northem Blot využívající RNA spoly-A sekvencí (Clontech), detekovány RNA transkripty dvou rozdílných velikostí. Ve slezině a kosterních svalech byl detekován proužek o velikosti 6,5 kb, zatímco v plicích a leukocytech periferního krevního oběhu byl detekován proužek o velikosti 4,5 kb. Rozdíly v pozorovaných velikostech mohou být způsobeny tkáňově specifickou polyadenylací, křížovou reaktivitou zmíněné sondy s jinými zástupci rodiny integrinů nebo hybridizací sondy s alternativně sestřiženými RNA.

Analýza prováděná metodou Northem Blot a využívající třetí fragment z klonu 19A2, zahrnující nukleotidy 2000 až 3100 v SEK. ID. Č.: 1, poskytla obdobné výsledky jako analýzy využívající jiné fragmenty klonu 19A2.

Za použití fragmentů odpovídajících nukleotidům 500 až 2100 a 2000 až 3100 v SEK. ID. Č.: 1 byla rovněž testována RNA získaná ze tří linií myeloidních buněk. Buněčná linie THP-1, stimulovaná prostřednictvím PMA, poskytla neostrý signál v té samé oblasti (přibližně 5,0 kb), jak tomu bylo u signálů z jiných tkání; tento signál byl nicméně poněkud silnější. RNA získaná z nestimulovaných buněk HL-60 a z buněk HL-60 stimulovaných prostřednictvím DMSO, poskytla při hybridizací se sondou a_d signál o intenzitě odpovídající intenzitě signálu u vzorků tkáně, nicméně zdálo se, že vystavení buněk působení PMA zvyšuje intenzitu tohoto signálu. Jelikož jak PMA, tak DMSO směrují diferenciaci buněk HL-60 po dráze monocyty/makrofágy (PMA) resp. granulocyty (DMSO), naznačuje tento výsledek existenci zvýšené exprese polypeptidu a_d u buněčného typu monocyty/makrofágy. V buňkách U937 je přítomna mRNA pro a<i a stimulací prostřednictvím PMA nedochází k zesílení signálu. Žádná pozitivní odezva nebyla detekována u buněk Molt, Daudi, H9, JY nebo Jurkat.

Příklad 7

Přechodná exprese konstruktů kódujících lidský a_d

A. Vytvoření expresivních konstruktů

Lidský klon 19A2 postrádá iniciační kodon pro methionin a pravděpodobně také část signální sekvence na 5' konci. K vytvoření expresivního plazmidu obsahujícího sekvence lidského klonu 19A2 byly tudíž použity dva odlišné přístupy. Při prvním přístupu byly zkonstruovány dva plazmidy, ve kterých byly k vytvoření chimérické sekvence kódující a_d použity sekvence kódující signální peptid odvozené od genů kódujících polypeptidy CDllb nebo CD 11c, které byly připojeny k sekvenci pro a_d. Při druhém přístupu byl zkonstruován třetí plazmid, ve kterém byl na pozici 0 v klonu 19A2 přidán adenosin a tím byl vytvořen kodon pro iniciační methionin.

Zmíněné tři plazmidy obsahovaly rozdílné oblasti, které se liší na 5' konci sekvence kódující polypeptid a_d nebo chimérický polypeptid a_d. Oblast kódující a_d byla pomocí PCR (viz. podmínky v Příkladu 2) amplifikována za použití specifického primeru BamRev vymezujícího 3' konec kódujícího vlákna (dále jen 3' primer nebo reverzní primer) (viz. SEK. ID. Č.: 26) a jednoho ze tří primerů vymezujících k 5' konec kódujícího vlákna (dále jen 5' primer nebo přímý primer). Zmíněné tři 5' primery v sekvenci obsahovaly: (1) na pozicích 1 až 6 identické nespecifické báze umožňující restrikční štěpení, na pozicích 7 až 12 restrikční místo EcoRI a na

-18CZ 287921 B6 pozicích 13 až 18 konvenční Kozákovu sekvenci; (2) část signální sekvence odvozené od CD1 lb (primer ER1B) nebo CD1 lc (primer ER1C) nebo adenosin (primer ER1D); a (3) dalších 15 až 17 bází komplementárních k sekvencím na 5' konci klonu 19A2, aby bylo umožněno „nasednutí“ primeru na DNA. Primeiy ER1B, ER1C nebo ER1D jsou zobrazeny v SEK. ID. Č.: 27, 28 nebo 29, kde je iniciační kodon pro methionin vyznačen tučně a restrikční místo EcoRI je podtrženo.

5'-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3' (SEK. ID. Č.: 26)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3' (SEK. ID. Č.: 27)

5'-AGTTACGAATTCGCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3' (SEK. ID. Č.: 28)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3' (SEK. ID. Č.: 29)

Produkty získané reakcí PCR byly rozštěpeny restrikčními enzymy EcoRI a BamHI.

Všechny tri plazmidy obsahovaly totožnou druhou část kódující a_d (byla vložena po směru transkripce ihned za 5' oblast popsanou v předchozím odstavci), včetně 3' konce klonu a_d. Tato druhá část kódující a_d, která zasahuje od nukleotidu 625 až do restrikčního místa Xbal nacházejícího se na 3' konci polylinkeru vektoru klonu 19A2, byla izolována štěpením klonu 19A2 restrikčními enzymy BamHI/Xbal.

Byly připraveny tři ligační reakce, při kterých byl fragment 3' a_d rozštěpený restrikčními enzymy BamHI/Xbal zaligován, za použití pufru pro ligázu a ligázy T4 (1 jednotka na 20 reakcí) firmy Boehringer Mannheim, do jednoho ze tří klonů 5' a_d rozštěpených restrikčními enzymy EcoRI/BamHI. Po čtyřhodinové inkubaci při 14 °C bylo ke každé ligační reakci, spolu s jednou jednotkou ligázy, přidáno odpovídající množství vektoru pcDNA.3 (Invitrogen) rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. Reakce probíhaly dalších 14 hodin. Jednou desetinou reakční směsi byly následně transformovány kompetentní buňky XL-1 Blue. Vyrostlé kolonie byly dále kultivovány a byla z nich izolována DNA (viz. Příklad 5). Štěpením pomocí EcoRI byly identifikovány tři klony, které obsahovaly restrikční místo EcoRI a tudíž i uměle vytvořené signální sekvence. Tyto klony byly označeny pATM.Bl (CDllb/a_d, primer ER1B), pATM.ClO (CD1 lc/a_d, primer ER1C) a pATM.D12 (adenosin/a_d, primer ERld). Přítomnost odpovídajících signálních sekvencí byla u každého klonu potvrzena sekvenováním příslušné nukleové kyseliny.

B. Transfekce buněk COS

Exprese z plazmidů kódujících a_d (zmíněných výše) bylo dosaženo kotransfekcí buněk COS vždy jedním z těchto plazmidů, spolu s expresivním plazmidem pro CD 18, označeným pRC.CD18. Jako pozitivní kontroly byly použity buňky COS kotransfekované plazmidem pRC.CD18 a expresivním plazmidem pro CD1 la, označeným pDC.CDl la.

hodin před vlastní transfekcí byly, při 50% konfluenci, buňky v kultivačním médiu (DMEM/10%FBS/penicilinstreptomycin) přepasážovány do Petriho misek pro tkáňové kultury firmy Coming o průměru 10 cm. Při všech pasážováních byly buňky z kultivačních misek odstraněny pomocí Verseneho pufru (0,5 mM NaEDTA v PBS). Před vlastní transfekcí byly misky jednou promyty médiem DMEM bez přídavku séra. Do každé misky bylo přidáno 15 pg jednotlivého plazmidů v 5 ml transfekčního pufru (DMEM s 20 pg/ml DEAE-Dextranu a0,5mM chlorochinem). Po 1,5 hodinové inkubaci při 37 °C byly buňky vystaveny šoku

-19CZ 287921 B6 přidáním 5 ml DMEM/10% DMSO. Tento roztok DMSO byl poté nahrazen kultivačním médiem o objemu 10 ml/miska.

Vzniklé transfektanty byly analyzovány metodami ELISA, FACS a imunoprecipitací, jak je popsáno v Příkladech 8,9 a 10.

Příklad 8

Analýza transfekovaných buněk COS metodou ELISA

Za účelem zjištění, jestli buňky COS kotransfekované expresivním plazmidem pRC.CD18 aplazmidem a_d exprimovaly na svém povrchu polypeptid a_d asociovaný s polypeptidem CD 18, byla, za použití primárních protilátek proti CD 18 (například TS1/18 purifikovaná zATCCHB203), provedena analýza metodou ELISA. Jako pozitivní kontrola byly použity buňky kotransfekované expresivním plazmidem pro CD18 a expresivním plazmidem pro CD1 la, označeným pDC.CDlla. U této kontroly byly jako primární protilátky použity protilátky proti CD 18 a protilátky proti CD1 la (například TS 1/22 purifikované z ATCC HB202).

Za účelem provedení analýzy metodou ELISA byly buňky z každé misky odstraněny pomocí Verseneho pufru a přeneseny na jednu 96-ti jamkovou destičku pro kultivaci tkáňových kultur firmy Coming. Buňky byly před vlastní analýzou ponechány v kultivačním médiu po dobu 2 dnů. Poté byly destičky dvakrát promyty roztokem D-PBS/0,5% želatina z kůže ryb (nadřádu Kostnatí) (Sigma) v objemu 150pl/jamka. Tento pufr byl používán při všech krocích vyjma barvení. Veškeré promývání a inkubace byly prováděny při pokojové teplotě. Následně byly jamky po dobu jedné hodiny blokovány roztokem želatiny. Primární protilátky byly roztokem želatiny zředěny na koncentraci 10 pg/ml a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ tohoto roztoku. Po jednohodinové inkubaci byly destičky 3x promyty roztokem želatiny v objemu 150 μΙ/jamkáí Ve zředění 1:3500 byla přidána sekundární protilátka (kozí protilátka specificky namířená proti myší Ig/HRP-Fc [Jackson, West Grove, PA]) v objemu 50 μΐ/jamka a destičky byly inkubovány p dobu 1 hodiny. Po třech promytích byly destičky, před přidáním 15% kyseliny sírové o objemu 50 μΐ/jamka, po dobu 20 minut barveny v roztoku o-fenyldiaminu (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD v citrátovém pufru).

Analýza transfekovaných buněk, prováděná metodou ELISA za použití protilátek specificky namířených proti CD 18, neodhalila u buněk transfekovaných pouze plazmidem kódujícím CD 18 žádnou výrazně vyšší hladinu exprese, než jaké bylo pozadí. Buňky kotransfekované plazmidy kódujícími CD11 a a CD 18 vykazovaly při analýzách, při kterých byly použity protilátky specificky namířené proti CD 18 nebo protilátky specificky namířené proti CD1 la, vyšší hladiny exprese, než jaké bylo pozadí. Další analýzy buněk transfekovaných plazmidem kódujícím CD18 a jedním z expresivních konstruktů kódujících a_d (pATM. C10 nebo pATM.D12) odhalily, že exprese CD 18 na povrchu buněk je zvýšena souběžnou expresí polypeptídu a_d. Zvýšení exprese polypeptidu CD 18, detekované u buněk COS transfekovaných plazmidy pATM. C10 nebo pATM.D12, bylo srovnatelné se zvýšením pozorovaným u kontrolních buněk kotransfekovaných plazmidy kódujícími CD1 la/CD18.

Příklad 9

Analýza transfekovaných buněk COS prováděné s využitím FACS

Buňkám v Petriho miskách bylo jeden den před transfekcí vyměněno kultivačním médium za čerstvé a před vlastní analýzou prováděnou s využitím FACS byly buňky inkubovány po dobu 2 dnů. Transfekované buňky byly pomocí 3 ml Verseneho pufru odstraněny z misek, jednou

-20CZ 287921 B6 promyty 5 ml pufru pro FACS (DMEM/2% FBS/0,2% azid sodný) a zředěny 0,1 ml pufru pro FACS na koncentraci 500 000 buněk/vzorek. Ke každému vzorku bylo přidáno buď 10 μΐ protilátek specificky namířených proti CD 18, CDlla nebo CDllb o koncentraci lmg/ml konjugovaných sFITC (Becton Dickinson) nebo 10 μΐ myší protilátky 23F2G (proti CD18) (ATCC HB11081) o koncentraci 800 pg/ml konjugované s CFSE. Poté byly vzorky inkubovány 45 minut na ledu, 3x promyty pufrem pro FACS o objemu 5 ml/promytí a rozsuspendovány v 0,2 ml pufru pro FACS. Vzorky byly měřeny na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson a získaná data byla analyzována za použití programu Lysys II (Becton Dickinson).

Buňky COS, transfekované pouze plazmidem kódujícím CD 18, nebyly značeny protilátkami (skonjugovaným markérem) namířeným proti CD 18, CDlla nebo CDllb. Jestliže byly buňky kotransfekovány sekvencemi kódujícími CDlla/CD18, bylo protilátkami namířenými proti CDlla nebo CD 18 označeno přibližně 15% buněk. Žádná z buněk transfekovaných plazmidem kódujícím CD 18 spolu sjakýmkoliv konstruktem kódujícím a_d nebyla značena protilátkou namířenou proti polypeptidům CDlla a CDllb. 4%, 13% a 8% buněk ze skupin transfekovaných plazmidy pATM.Bl, pATM.ClO resp. pATM.D12 reagovalo pozitivně na barvení protilátkou proti CD18. Intenzita fluorescence pozitivních populací ze skupiny CDlla/CD18 byla čtyřnásobně vyšší než pozadí. Pro srovnání, kotransfekce buněk konstruktem kódujícím a_da konstruktem pro CD 18 vedla k vytvoření pozitivní populace buněk, které vykazovala čtyř až sedmi násobné zvýšení intenzity fluorescence oproti hodnotám pozadí.

Příklad 10

Imunoprecipitace komplexů lidský a_d/CD18 z kotransfekovaných buněk COS značených biotinem

Za účelem zjištění, jestli může být polypeptid a_d izolován jako část heterodimemího komplexu αβ s charakteristikou integrinů, byl u buněk kotransfekovaných expresivním plazmidem kódujícím CD 18 a každým z expresivních plazmidů kódujících polypeptid a_d (popsaných v Příkladu 7), proveden pokus o imunoprecipitaci komplexu a^CDlS.

Transfekované buňky (1 až 3 x 10⁸ buněk/skupina) byly zPetriho misek odstraněny pomocí Verseneho pufru a třikrát promyty roztokem D-PBS v objemu 50 ml/skupina. Každý vzorek byl označen pomocí 2 mg Sulpho-NHS Biotin (Pierce, Rockford, IL). Značení probíhalo 15 minut při pokojové teplotě a bylo ukončeno promytím (třikrát) chladným roztokem D-PBS v objemu 50ml/vzorek. Promyté buňky byly rozsuspendovány v 1 ml lyzačního pufru (1% NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM Ca⁺⁺, 2 mM Mg⁺⁺ a inhibitory proteáz) a inkubovány po dobu 15 minut na ledu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací prováděnou při lOOOOxg po dobu 5 minut a supematant byl přenesen do prázdných zkumavek. Aby byl odstraněn materiál nespecificky reagující s myším imunoglobulinem, bylo na počátku provedeno předčištění vzorku. Při 4 °C bylo se supematanty inkubováno 25 pg myšího imunoglobulinu (Cappel, West Chester, PA). Po 2,5 hodinách bylo ke každému vzorku přidáno 100 μΐ (25 pg) Sepharózy konjugované s králičí protilátkou namířenou proti myším Ig (připraveno z Proteinu ASepharózy 4B a králičí protilátky namířené proti myšímu IgG, obojí od firmy Zymed, San Francisco, CA); inkubace probíhala za stálého třepání při 4 °C po dobu 16 hodin. Částice Sepharózy byly od supematantu odstraněny centrifugací. Po tomto předčištění byly supematanty při 4 °C po dobu 2 hodin inkubovány s 20 pg protilátky namířené proti CD 18 (TS1.18). Od supematantů byly komplexy protilátka/antigen izolovány inkubací s přípravkem králičí protilátka proti myším Ig/Protein A-Sepharóza o objemu 100 μΐ/vzorek, postupem popsaným výše. Částice nosiče byly čtyřikrát promyty roztokem 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl a 1% Triton-X 100. Promyté částice byly zcentrifugovány a po dobu 10 minut vařeny ve 20 μΙ 2x Laemmliho vzorkového pufru s 2% β-merkaptoethanolem. Vzorky byly zcentrifugovány a rozděleny elektroforézou na polyakiylamidovém gelu Novex (Novex) prováděnou po dobu 30 minut při

-21CZ 287921 B6 napětí 100V. Proteiny byly poté v pufru TBS-T přeneseny na nitrocelulózové membrány (Schleicher & Schuell); 100 mA po dobu 1 hodiny. Membrány byly 2 hodiny blokovány pomocí 3% BSA v TBS-T. Po dobu 1 hodiny byly membrány inkubovány s křenovou peroxidázou se strepavidinem (POD) (Boehringer Mannheim) ve zředění 1:6000 a poté třikrát promyty v TBST. K obarvení blotu byl použit (postupem popsaným výrobcem) „Enhanced Chemiluminescence kit“ firmy Amersham. Membrány byly na 0,5 až 2 minuty exponovány na Hyperfilm MP (Amersham).

Imunoprecipitace komplexů CD 18 z buněk transfekovaných plazmidem pRC.CD18 spolu s jedním zplazmidů pATM.Bl, pATM.ClO nebo pATM.D12 odhalila povrchovou expresi heterodimerů skládajících se z řetězce β o molekulové hmotnosti přibližně 100 kD, která odpovídá předpokládané velikosti CD 18, a řetězce a o molekulové hmotnosti přibližně 150 kD, která odpovídá molekulové hmotnosti polypeptidu a_d.

Příklad 11

Stabilní transfekce lidského a_d do buněk ovárií čínského křečka

Za účelem zjištění, jestli je polypeptid a_d exprimován na povrchu buněk ve formě heterodimeru spolu s CD18, byly buněčné linie postrádající jak a_d, tak CD18, přechodně a stabilně transfekovány molekulami cDNA kódujícími tyto jednotlivé řetězce.

Pro tyto experimenty byla, způsobem popsaným v Příkladu 7, k cDNA kódující a_d přidána další vedoucí sekvence a Kozákova konvenční sekvence, a celý tento konstrukt byl zaklonován do expresivního vektoru pcDNA3. Výsledným konstruktem, označeným pATM.D12, společně smodifikovaným komerčně dostupným vektorem pDCl.CD18 kódujícím lidský CD18, byly kotransfekovány buňky ovárií čínského křečka (CHO) deficientní v aktivitě dihydrofolát reduktázy (DHFR)^-. Plazmid pDCl.CD18 kóduje markér DHFR⁺ a transfekované buňky mohou být selektovány za použití vhodného média neobsahujícího příslušný nukleosid. K vytvoření plazmidu pDCl.CD18 byly použity následující modifikace.

Plazmid pRC/CMV (Invitrogen) je savčí expresivní vektor s promotorem cytomegaloviru a jako selekční markér obsahuje gen pro rezistenci vůči ampicilinu. Gen kódující DHFR zplazmidů pSC1190-DHFR byl vložen na 5' konec počátku replikace SV40 ve vektoru pRC/CMV. Navíc byl do plazmidového konstruktu pRC/CMV/DHFR zaligován, na 3' konec genu pro DHFR, polylinker z 5' oblasti plazmidu pHF2G-DHF. Následně byly do vzniklého plazmidu zaklonovány, mezi oblast polylinkeru na 5' konci a oblast poly-A sekvence bovinního růstového hormonu, kódující sekvence pro CD18.

Povrchová exprese polypeptidu CD 18 byla analyzována průtokovou cytometrií za použití monoklonální protilátky TS1/18. Tvorba heterodimerů mezi a_d a CD 18 u této buněčné linie byla v souladu s údaji získanými imunoprecipitací popsanou v Příkladu 10 při přechodné expresi buněk COS.

Příklad 12

Lidský a_d se váže na molekulu ICAM-R a tato vazba je závislá na přítomnosti CD 18

Vzhledem k publikovaným údajům, které prokazují interakce mezi integriny leukocytů a mezibuněčnými adhezivními molekulami (ICAM), které zprostředkovávají kontakt buňka-buňka [Hyneš, Cell 69:11 až 25 (1992)], byla schopnost buněk CHO exprimujících a_d/CD18 vázat ICAM-1, ICAM-R nebo VCAM analyzována dvěma metodami.

-22CZ 287921 B6

V opakovaných stanoveních byly rozpustné fúzní proteiny ICAM-1, ICAM-R nebo VCAM s IgGl imobilizovány na povrchu plastu, a byla stanovována schopnost buněk COS transfekovaných plazmidy kódujícími ad/CD18 vázat se k těmto imobilizovaným ligandům. Transfekované buňky byly intracelulámě označeny pomocí kalceinu, promyty vazebným pufrem (RPMI s 1% BSA) a inkubovány buď v samotném pufru (s nebo bez přítomnosti 10 ng/ml PMA) nebo v pufru s monoklonálními protilátkami namířenými proti CD18 v koncentracích 10pg/ml. Transfekované buňky byly umístěny do čtyř 96-ti jamkových mikrotitračních destiček Immulon s jamkami předem potaženými rozpustnými fuzními proteiny ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM1/IgGl nebo hovězím sérovým albuminem (BSA) jako negativní kontrolou. Rozpustné formy těchto adhezivních molekul jsou dokonale popsány v dosud nevyřízené Patentové přihlášce US č. 08/102852 (stejného vlastníka) podané 5. srpna 1993. Před přidáním značených buněk byly jamky blokovány roztokem 1% BSA vPBS. Po promytí destiček, prováděným ponořením destiček na 20 minut do roztoku 0,1% BSA vPBS, byla za použití přístroje Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA) měřena celková fluorescence v každé jamce.

V experimentech s imobilizovanými molekulami ICAM vykazovaly buňky kotransfekované plazmidy kódujícími ad/CD18 v jamkách s ICAM-R/IgGl, ve srovnání s jamkami potaženými BSA, 3 až 5 násobně vyšší intenzitu vazby. Specifíta této vazby a její závislost na přítomnosti CD18 byla prokázána inhibičními účinky protilátky TS1/18 namířené proti CD18. Buňky transfekované plazmidy kódujícími CDlla/CD18 vykazovaly 2 až 3 násobně vyšší intenzitu vazby v jamkách s ICAM-1/IgGl pouze když byly tyto buňky předem vystaveny působení PMA. Působení PMA na buňky transfekované ad/CD18 nemělo na intenzitu fluorescence v jamkách potažených ICAM-1/IgGl nebo ICAM-R/IgGl žádný vliv. Nebyla detekována žádná vazba buněk transfekovaných a_d/CD18 na jamky potažené VCAM-1/IgGl.

Vazba buněk, transfekovaných ad/CD18, k rozpustným fúzním proteinům ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM-1/IgGl byla stanovována průtokovou cytometrií. Na každé měření byl ve 100 μΐ vazebného pufru (RPMI a 1% BSA), s nebo bez přítomnosti protilátky namířené proti CD 18 v koncentraci 10 pg/ml, rozsuspendován přibližně 1 milion buněk CHO transfekovaných ad/CD18 (kultivovaných za účelem vyšší exprese v lahvích s míchadlem - „spinner flask“). Po 20 minutové inkubaci při pokojové teplotě byly buňky promyty vazebným pufrem a byly k nim přidány fúzní proteiny ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl na výslednou koncentraci 5 pg/ml. Navazování probíhalo 30 minut při 37 °C a poté byly buňky třikrát promyty a rozsuspendovány ve 100 μΐ vazebného pufru obsahujícího ve zředění 1:100 ovčí protilátku namířenou proti lidskému IgGl konjugovanou s FITC. Po 30 minutové inkubaci byly vzorky třikrát promyty a rozsuspendovány ve 200 μΐ vazebného pufru a analyzovány na přístroji FACScan firmy Becton Dickinson.

Přibližně 40 až 50% buněk transfekovaných ad/CD18 vázalo ICAM-R/IgGl, ale nebyla pozorována žádná vazba na proteiny ICAM-1/IgGl a VCAM-1/IgGl. Vystavení transfekovaných buněk předběžnému působení PMA nemělo žádný vliv na vazbu a<i/CD18 k proteinům ICAM-1/IgGl, ICAM-R/IgGl nebo VCAM-1/IgGl, což odpovídá stanovením prováděným s imobilizovanými proteiny. Při vystavení buněk transfekovaných aa/CD18 působení protilátky TS1/18 namířené proti CD18, byla intenzita vazby k ICAM-R/IgGl snížena na hodnoty pozadí.

Data získaná zobou těchto stanovení ilustrují skutečnost, že a<j/CD18 se přednostně váže k molekule ICAM-R (ve srovnání s vazbou k ICAM-1 nebo VCAM-1). Upřednostňování vazby ad/CD18 k ICAM-R oproti vazbě k ICAM-1 je v protikladu ke skutečnostem zjištěným pro CDlla/CD18 a CDllb/CD18. Můžeme tudíž očekávat, že modulace vazby a<j/CD18 může selektivně ovlivnit normální a patologické funkce imunitního systému, v nichž hraje molekula ICAM-R prominentní roli. Navíc výsledky podobných stanovení, při kterých byla testována schopnost protilátek, specificky namířených proti různým extracelulámím doménám proteinu ICAM-R, inhibovat vazbu na buňky transfekované ad/CD18, naznačují, že heterodimery ad/CD18 a CD1 la/CD18 interagují s odlišnými doménami polypeptidu ICAM-R.

-23CZ 287921 B6

Nemožnost detekovat v roztoku vazbu CDlla/CD18 kfúzním proteinům ICAM-1/IgGl a ICAM-R/IgGl naznačuje, že afinita vazby mezi heterodimerem CD1 la/CD18 a ICAM-1 nebo ICAM-R je příliš nízká na to, aby umožnila vazbu těchto molekul v roztoku. Detekce vazby heterodimeru ad/CD18 kfuznímu proteinu ICAM-R/IgGl nicméně naznačuje neobvykle vysokou hodnotu afinity.

K testování vazby mutantu proteinu ICAM-R, označeného E37A/Ig, na buňky CHO exprimující heterodimer a<|/CD18 byla adheze analyzována s využitím FACS, postupem popsaným výše. Bylo prokázáno, že E37A/Ig se neváže k chimérickému proteinu LFA-l/Ig [Sadhu a další, Cell Adhesion a Communication 2: 429 až 440 (1994)]. Tento mutantní protein byl ve své rozpustné formě produkován stabilně transfekovanou buněčnou linií CHO a byl purifikován na koloně ProsepA postupem popsaným v publikaci Sadhu a další, viz. výše.

V opakovaných pokusech nebyla detekována vazba proteinu E37A/Ig na buňky transfekované ad/CD18. Intenzita fluorescence v hlavním píku (MFI - mean fluorescence intensity) chimérického proteinu E37A/Ig, detekovaná s využitím protilátky namířené proti lidskému IgGl konjugované s FITC, byla totožná s MFI naměřenou u samotné protilátky, což naznačuje, že při použití mutantního proteinu E37A/Ig není v tomto experimentu detekován žádný signál převyšující hodnoty pozadí. Podobně při analýze prováděné metodou ELISA, postupem popsaným v Příkladu 14, se mutantní E37A/Ig nejspíš nevázal na imobilizovaný ayCD18.

Vazba polypeptidu a_d k proteinu iCb3

Komponenta komplementu označovaná C3 může být proteolyticky štěpena, čímž dojde k vytvoření komplexu iC3b, který iniciuje aktivaci alternativní cesty aktivace komplementu, jejíž výsledkem je buněčně zprostředkované zničení cíle. Jak CDllb tak CDllc se mohou účastnit vazby k iCb3 a následné fagocytózy částic obalených komplexem iCb3. Jako místo interakce s komplexem iCb3 byl nedávno identifikován peptidový fragment domény I vpolypeptidu CDllb [Ueda a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 91:10680 až 10684 (1994)]. Oblast odpovědná za vazbu iCb3 je vpolypeptidech CDllb, CDllc a a_d velmi konzervativní, což naznačuje existenci vazebné interakce a_d/iCb3.

Vazba polypeptidu a_d k iCb3 byla analyzována „růžicovým testem“ [Dana a další, J. Clin. Invest. 73:153 až 159 (1984)] za použití transfekovaných buněk nebo buněčných linií přirozeně exprimujících polypeptid a_d (například buňky HL60 stimulované pomocí PMA). Za přítomnosti nebo v nepřítomnosti monoklonální protilátky namířené proti CD 18 (například protilátky TS1/18.1) byla srovnávána schopnost buněk CHO transfekovaných ayCDie, buněk CHO transfekovaných VLA-4 (negativní kontrola) a buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA (pozitivní kontrola), vytvářet „růžice“.

Příklad 13

Testování prováděné technikami SPA

Inhibitory specificky inhibující vazbu mezi ligandy a_d podle vynálezu a jejich vazebnými partnery (páru ligand «^“anti-ligand“) mohou být analyzovány nejrůznějšími způsoby, například technikami SPA popsanými v Patentové přihlášce US č. 4271139, publikacích Hart a Greenwald, Mol. Immunol. 12:265 až 267 (1979) a Hart a Greenwald, J. Nuc. Med. 20:1062 až 1065 (1979).

Stručně řečeno, jeden člen z dvojice ligand a_d/“antiligand“ je přímo nebo nepřímo navázán na pevný nosič. Nepřímá vazba může být zprostředkována monoklonální protilátkou přímo navázanou na pevnou podložku, přičemž tato protilátka rozpoznává specifický epitop na C-konci

-24CZ 287921 B6 rozpustného β řetězce integrinu. Tímto epitopem by mohl být buď hemaglutinin nebo mykobakteriální epitop IIIE9 [Anderson a další, J. Immunol. 141:607 až 613 (1988)]. Na nosič je přímo navázána také fluorescenční látka. Jinou možností může být inkorporace fluorescenční látky přímo v pevném nosiči, jak je popsáno v Patentové přihlášce US č. 4568649. Ten člen dvojice ligand ad/“anti-ligand“, který není navázán na nosič, je označen radioaktivní sloučeninou, která emituje záření schopné excitovat fluorescenční agens. V případě, kdy ligand váže radioaktivně značený „anti-ligand“, se radioaktivní značka dostane dostatečně blízko k fluoroforu navázanému na nosič a může tento fluorofor excitovat a vyvolat tím světelnou emisi. Jestliže nedochází k vazbě, je radioaktivní značka obvykle příliš vzdálená od pevného nosiče, aby byla schopna excitovat fluorescenční agens a intenzita emitovaného světla je nízká. Emitované světlo je měřeno a korelováno s vazbou mezi ligandem a „anti-ligandem“. Přidání inhibitoru vazby ke vzorku způsobí snížení emise světla fluoroforem tím, že zabrání navázání radioaktivní značky v blízkosti pevného nosiče. Inhibitory vazby mohou být tudíž identifikovány měřením jejich vlivu na emisi světla fluoroforem ve vzorcích. Podobně mohou být rovněž identifikovány „antiligandy“ polypeptidu a_d.

Při testování modulátorů vazby CAM prováděnými postupem zmíněným níže je při SPA použit rozpustný rekombinantní konstrukt a(j/CD18 s leucinovým zipem (viz. Příklad 14). Tento rekombinantní integrin je pomocí neblokující protilátky namířené proti podjednotce a nebo proti podjednotce β imobilizován na destičce předem pokryté fluorescenční látkou. Sloučeniny chemické knihovny a biotinylovaný chimérický protein CAM/Ig jsou na destičku přidány současně. Vazba chimérického proteinu CAM/Ig je detekována pomocí radioaktivně značeného streptavidinu. V tomto stanovení jsou chimérické proteiny ICAM-l/Ig a ICAM-3/Ig biotinylovány pomocí kitu NHS-Sulfo-biotin LC (dlouhý řetězec, Pierce) postupem doporučeným výrobcem. Takto označené proteiny stále reagují s protilátkami specificky namířenými proti CAM a s využitím metody ELISA může být ukázáno, že reagují s imobilizovaným proteinem LFA-1. Detekce je prováděna s využitím konjugátu Strepavidin-HRP a následným obarvením s využitím OPD.

Jinou možností je přímé navázání purifíkovaného nebo částečně puntíkovaného rekombinantního leucinového zipu na destičku předem pokrytou fluorescenční látkou. Sloučeniny chemické knihovny a neznačený chimérický protein CAM/Ig jsou na destičku přidány současně. Navázaný CAM/Ig je detekován protilátkou namířenou proti lidskému Ig označenou izotopem ¹²⁵I.

Ještě jinou možností je imobilizovat na scintilační destičku purifíkovaný protein CAM/Ig. Poté jsou na destičku přidány sloučeniny chemické knihovny a koncentrovaný supematant z buněk exprimujících rekombinantní integrin typu leucinového zipu. Vazba tohoto rekombinantního integrinu je detekována pomocí značené neblokující protilátky namířené proti podjednotce a nebo proti podjednotce β.

Příklad 14

Expresivní konstrukty rozpustného lidského polypeptidu a_d

Exprese nezkráceného rozpustného lidského heterodimeru a_d/CD18 poskytuje lehce purifikovatelný materiál, použitelný k imunizaci a vazebným studiím. Výhodou vytvoření rozpustného proteinu je skutečnost, že tento protein může být purifikován ze supematantů a nemusí se purifíkovat z lyzátů buněk (jako nezkrácený heterodimer a^CDlS vázaný na membránu); tento protein je tedy získán snadněji a s menším zastoupením nečistot.

Expresivní plazmid kódující rozpustný a_d byl vytvořen následovně. Štěpením restrikčními enzymy HindlII a AatlI byl z plazmidu pATM.D12 izolován nukleotidový fragment odpovídající oblasti bází 0 až 3161 v SEK. ID. Č.: 1. S využitím primerů sHAD.5 a sHAD.3, zobrazených

-25CZ 287921 B6 jako SEK. ID. Č.: 30 a 31, byl zplazmidu pATM.D 12 reakcí PCR amplifíkován fragment odpovídající oblasti bází 3130 až 3390 v SEK. ID. Č.: 1. Sekvence tohoto fragmentu se překrývá se sekvencí fragmentu získanou štěpením restrikčními enzymy HindlII/AatlI a na 3' konci obsahuje navíc restrikční místo Mlul.

5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (SEK. ID. Č.: 30)

5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3' (SEK. ID. Č.: 31)

Produkt získaný amplifikací prováděnou PCR byl rozštěpen restrikčními enzymy Aatl a Mlul azaligován s fragmentem získaným štěpením restrikčními enzymy HindlII/AatlI. Získaný produkt byl zaligován do plazmidu pDC.l.s rozštěpeného restrikčními enzymy HindlII/MluI.

Tento konstrukt byl ve stabilně transfekováných buňkách CHO exprimován společně s rozpustným proteinem CD 18 a exprese byla detekována autoradiografickou vizualizací imunoprecipitovaných komplexů CD 18 získaných z buněk označených ³⁵S-methioninem. Tento konstrukt byl rovněž spolu sCD18 exprimován v buňkách 293 [Berman a další, J. Cell. Biochem. 52:183 až 195 (1993)].

Rozpustný nezkrácený konstrukt a_d

Vynález se rovněž týká alternativních expresivních konstruktů pro a_d. K usnadnění exprese apurifikace intaktního heterodimeru a_d/CD18 budou zkonstruovány expresivní plazmidy kódující rozpustný a_d a CD 18. Polypeptidy kódované těmito plazmidy budou obsahovat fuzní sekvenci „leucinového zipu“, která bude v průběhu purifíkace tento heterodimer stabilizovat [Chang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 91:11408 až 11412 (1994)]. Stručně řečeno, DNA kódující aminokyselinové řetězce tvořené kyselými a zásaditými aminokyselinami tvořícími leucinový zip byly vytvořeny připojením primerů za použití oligonukleotidů popsaných v publikaci Chang a další. Sekvence DNA byly dále modifikovány tak, že do nich byly na 5' a 3' koncích zavedeny restrikční místa Mlul (5' konec) a Xbal (3' konec). Tato modifikace slouží k usnadnění zaklonování těchto sekvencí do expresivních konstruktů pro CD 18 nebo a<j popsaných dříve. Ke zmíněným sekvencím DNA byly rovněž připojeny sekvence kódující hemaglutinin nebo polyhistidin a za restrikční místo Xbal byl vložen stop kodon. Sekvence kódující hemaglutinin nebo polyhistidin byly vloženy za účelem usnadnění afinitní purifíkace exprimovaného proteinu. Do expresivního vektoru kódujícího CD18 jsou vloženy sekvence kódující řetězec leucinového zipu tvořený bazickými aminokyselinami; do konstruktu kódujícího řetězec a_d je vložena sekvence kódující řetězec leucinového zipu tvořený kyselými aminokyselinami. Předpokládá se, že po expresi modifikovaných proteinů a_d a CD 18 v hostitelských buňkách, bude interakce mezi řetězcem tvořeným bazickými aminokyselinami a řetězcem tvořeným kyselými aminokyselinami stabilizovat tento heterodimer a umožní izolaci intaktní molekuly a_d/CD18 metodou afinitní purifíkace popsanou výše.

Byly zkonstruovány plazmidy pro expresi rozpustného a_d a CD 18 s „leucinovým zipem“ tvořeným sekvencemi kódujícími kyselé a bazické aminokyseliny, a těmito plazmidy byly, metodou využívající DEAE/Dextran popsanou v Příkladu 7, transfekovány buňky COS. Vzniklý protein byl označen jako a_d/CD18LZ. Transfekované buňky byly po dobu 14 dnů kultivovány v médiu se sníženým obsahem séra (2%). Supematanty z transfekovaných buněk byly sbírány každý pátý den, a metodou ELISA popsanou v Příkladu 8, v nich byla analyzována produkce proteinů. Stručně řečeno, heterodimer ad/CDISLZ byl imobilizován na destičkách povlečených monoklonální protilátkou 169B namířenou proti a_d (viz. Příklad 15). Komplex ad/CD18LZ byly detekován přidáním biotinylované monoklonální protilátky namířené proti CD18 (TS1/18.1, viz.

-26CZ 287921 B6

Příklad 8) s následným přidáním konjugátu streptavidin/křenová peroxidáza (HRP) a ofenyldiaminu (OPD). V supematantech byla detekována přítomnost těchto proteinů.

Vazebné studie prováděné za použití nezkráceného expresivního produktu a_d

Funkční vazebné analýzy s rozpustným nezkráceným heterodimerem a_d/CD18LZ, popsaným výše, byly prováděny při imobilizaci heterodimeru na destičky potažené monoklonální protilátkou 169B nebo neblokující monoklonální protilátkou namířenou proti CD18 (viz. Příklad 15). K zamezení nespecifických vazeb byly jamky, před přidáním chimérických proteinů CAM/Ig (viz. Příklad 12) v počáteční koncentraci 10 pg/ml, blokovány pomocí želatiny získané z rybí kůže. Vazba zmíněných chimérických proteinů k heterodimeru ad/CD18LZ byla detekována prostřednictvím konjugátu HRP s kozí protilátkou namířenou proti lidskému Ig (Jackson Labs) a následným obarvením pomocí OPD.

Bylo pozorováno, že VCAM-l/Ig se k imobilizovanému heterodimeru ad/CD18LZ váže 3 až 5krát intenzivněji než k imobilizovanému heterodimeru CDlla/CD18. Molekuly ICAM-l/Ig aICAM-2/Ig poskytují při vazbě na rozpustný heterodimer CDlla/CD18 15-krát resp. 10-krát intenzivnější signál (ve srovnání s pozadím), ale nevážou se na heterodimer ad/CD18LZ. Vazba VCAM-1 byla, za přítomnosti kombinace protilátek 130K a 130P specificky namířených proti VCAM-1, snížena přibližně o 50 %.

Vazebné studie byly rovněž prováděny na 96-ti jamkových destičkách s imobilizovaným proteinem ICAM/Ig a následným přidáním rozpustného rekombinantního integrinu přítomného v buněčném supematantu. Vazba rozpustných integrinů byla detekována pomocí neznačené neblokující myší protilátky namířené proti řetězci a nebo β, a následnou inkubací s kozí protilátkou specificky namířenou proti myším Ig konjugovanou s HRP a obarvením s využitím OPD.

Získané výsledky naznačují, že naměřená hodnota při vazbě a<j/CD18LZ k ICAM-R/Ig, detekované pomocí neblokující protilátky, byla 10-krát vyšší než tomu bylo v kontrolních jamkách neobsahujících žádnou protilátku. Nebyla detekována vazba rozpustného heterodimeru ad/CD18 k imobilizovanému ICAM-l/Ig, ale naproti tomu byla detekována vazba mezi aa/CD18LZ a imobilizovanými heterodimery CD1 lb/CD18 a CD1 la/CD18 15-krát (CD1 lb/CD18) a 5-krát (CD1 la/CDl 8) vyšší než byly hodnoty pozadí.

Jelikož předchozí studie prokázaly, že molekuly CDllb a CDllc vážou lipopolysacharid (LPS) [Wright, Curr. Opin. Immunol. 3:83 až 90 (1991)]; Ingalls a Golenbock, J. Exp. Med. 181:1473 až 1479 (1995)], byla, pomocí průtokové cytometrie a stanovení prováděných na titračních destičkách, rovněž analyzována vazba LPS na heterodimer a<j/CD18. Získané výsledky ukazují, že LSP, značený FITC, izolovaný z mikroorganizmů S. Minnesota a S. typhosa (oba získány od firmy Sigma) se v koncentraci 20 pg/ml slabě vázal na buňky CHO transfekované a<j/CD18. U netransfekovaných buněk CHO nebyla detekována žádná vazba. Při stanoveních prováděných metodou ELISA se biotinylovaný LPS [Luk a další, Alan. Biochem. 232:217 až 224 (1995)] v množství 0,5 až 3,0 pg vázal k imobilizovanému heterodimeru ad/C18 a poskytoval čtyřikrát větší signál, než tomu bylo v jamkách se samotnou protilátkou a blokujícím agens. Zdánlivá vazba LPS na CD 1 la/CDl8 byla, po odečtení hodnot pozadí (vazba protilátky TS2/4 namířené proti CD1 la), nevýznamná.

Aby bylo možné identifikovat další ligandy pro a<j/CD18, je rekombinantní protein a<j/CD18LZ použit ve dvou provázaných studiích. Za účelem stanovení, které buňky na svém povrchu exprimují ligandy pro oj, je analyzována vazba různých typů buněk na imobilizovaný protein. Následně je využita inhibice vazby s využitím protilátek, s jejichž pomocí je možné stanovit, které známé povrchové adhezivní molekuly jsou odpovědné za pozorovanou vazbu buněk.

-27CZ 287921 B6

Jestliže není pozorována žádná inhibice, je při pokusu o identifikaci ligandu využita koimunoprecipitace heterodimeru a_d/CDI8LZ navázaného na proteiny (které budou vázat a_d) z lyžovaných buněk.

Expresivní konstrukty kódující doménu I rozpustného lidského polypeptidu a_d

Již dříve bylo publikováno, že doména I v molekule CD1 la může být exprimována jako nezávislá strukturní jednotka, která si udržuje schopnost vázat ligandy a schopnost být rozpoznávána protilátkami [Randi a Hogg, J. Biol. Chem. 269:12395 až 12398 (1994); Zhout a další, J. Biol. Chem. 269:17075 až 12398 (1994); Zhout a další, J. Biol. Chem. 269:17075 až 17079 (1994); Michishita a další, Cell 72:857 až 867 (1993)]. Za účelem vytvoření rozpustného fúzního proteinu skládajícího se z domény I polypeptidu a_d a lidského IgG4, byla pomocí PCR amplifikována sekvence kódující doménu I polypeptidu a_d. K této PCR reakci byly použity primery, které, kvůli usnadnění klonování, přidávají na konce sekvence restrikční místa BamHI a Xhol. Tyto primery jsou zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 32 a 33 a restrikční místa jsou zde podtržena.

5'-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3' (SEK. ID. Č.: 32) 5'-ACTGCATGTCTCGAGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3' (SEK. ID. Č.: 33)

Nukleotid C nacházející se v SEK. ID. Č.: 32 na 3' konci vedle restrikčního místa BamHI odpovídá nukleotidu 435 v SEK. ID. Č.: 1; nukleotid G nacházející se v SEK. ID. Č.: 33 na 3' konci vedle restrikčního místa Xhol odpovídá nukleotidu 1067 v SEK. ID. Č.: 1. Amplifikovaná doména I je rozštěpena odpovídajícími restrikčními enzymy a purifikovaný fragment je zaligován do savčího expresivního vektoru pDCs a prokaryotického expresivního vektoru pGEX-4T-3 (Pharmacia) a fragment domény I je sekvenován. Fúzní protein je následně exprimován v buňkách COS, CHO nebo E. coli transfekovaných nebo transformovaných odpovídajícím expresivním konstruktem.

Vzhledem k afinitě polypeptidu a_d k ICAM-R, může mít exprimovaná doména I polypeptidu a_dostatečnou afinitu, aby mohla být použita jako inhibitor buněčné adheze, při níž aktivně participuje polypeptid a_d.

Analýza fúzního proteinu tvořeného doménou I lidského a_d/IgG4

Protein byl rozdělen pomocí SDS-PAGE v redukujících a neredukujících podmínkách a vizualizován barvením stříbrem nebo barvením Coomassie. Následně byl protein přenesen na membrány Immobilon PVDF a analyzován pomocí monoklonálních protilátek namířených proti lidskému IgG nebo monoklonálních protilátek namířených proti bovinnímu IgG.

U detekovaných proteinů bylo stanoveno, že v neredukujících podmínkách migrují se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 120 kD a redukujících podmínkách migrují se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 45 kD. Na gelu z elektroforézy prováděné v neredukujících podmínkách byly rovněž detekovány méně intenzivní proužky se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 40 až 50 kD, které reagovaly s protilátkami namířenými proti lidskému IgG, ale nereagovaly s protilátkami namířenými proti bovinnímu IgG. Méně intenzivní proužek o zdánlivé molekulové hmotnosti 200 kD byl metodou Western Blot detekován jako bovinní Ig.

-28CZ 287921 B6

Vazebné studie prováděné za použití expresivních produktů domény I

Metodou ELISA byla testována schopnost domény I specificky rozpoznávat chimérický protein ICAM-R/IgG. Jednotlivá sériová ředění fuzního proteinu IgG4 a domény I polypeptidu a_d(Ia/IgG4) vTBS byla inkubována sICAM-l/IgG, ICAM-R/IgG, VCAM-l/IgG nebo IgGl proteinem (produkovaným buňkami myelomu) imobilizovanými na destičkách Immulon IV pro RIA/EIA. Jako negativní kontroly byly použity chimérický protein domény I CD1 la/IgG a lidský myelomový protein IgG4/kappa. Navázaný IgG4 byl detekován prostřednictvím biotinylované monoklonální protilátky HP6023 namířené proti IgG4 s následným přidáním konjugátu streptavidin-peroxidáza a barvením za použití substrátu o-fenyldiaminu.

V opakovaných stanoveních nebyla detekována vazba mezi proteinem CD1 la/IgG4 nebo myelomovým proteinem IgG4 a kterýmkoliv z imobilizovaných proteinů. Protein Ia_d/IgG4 se nevázal na lidský IgGl, ICAM-1/IgGl nebo blokující agens, jako želatinu z rybí kůže nebo bovinní sérový albumin. Za použití proteinu Ia<j/IgG4 v koncentracích 1 až 5 pg/ml byla v jamkách povlečených ICAM-R/IgG detekována, ve srovnání s pozadím, dvoj- až třínásobně vyšší intenzita signálu. Intenzita signálu v jamkách povlečených VCAM-I/IgG byla 7 až 10 vyšší než pozadí. V předchozích stanoveních se buňky CHO transfekované ad/CD18 nevázaly na VCAMI/IgG, což naznačuje, že vazba VCAM-I může být charakteristická pro aminokyselinovou sekvenci izolované domény I.

Další konstrukty domény I polypeptidu a_d

Další konstrukty domény I polypeptidu a_d byly vytvořeny stejným způsobem jako předchozí konstrukt s výjimkou toho, že zde bylo, kolem domény I polypeptidu a_d, začleněno více aminokyselin. Tyto specifické konstrukty obsahují: i) sekvence z exonu 5 (aminokyseliny 127 až 353 v SEK. ID. Č.: 2), umístěné před doménou I; ii) opakování motivu „EF-hand“ (motiv v oblastech odpovědných za vazbu vápenatých iontů) (aminokyseliny 17 až 603 v SEK. ID. Č.: 2) umístěné za doménou I; iii) řetězec alfa ukončený v transmembránové oblasti (aminokyseliny 17 až 1029 v SEK. ID. Č.: 2) spolu s IgG4 použitým pro purifikaci a detekci. Tyto konstrukty jsou zaligovány jak do savčího expresivního vektoru pDCSl, tak do prokaryotického expresivního vektoru pGEX-4T-3 (Pharmacia) a doména I je sekvenována. Fúzní proteiny jsou následně exprimovány v buňkách COS, CHO nebo E. coli transformovaných nebo transfekovaných příslušnými expresivními konstrukty. Proteiny jsou purifikovány a koloně ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, England) a je testována jejich reaktivita s monoklonální protilátkou HP6023 namířenou proti IgG4. Tyto proteiny jsou na polyakrylamidovém gelu obarveny pomocí Coomassie.

Aby bylo možné zkonstruovat expresivní plazmid kódující kompletní polypeptid a_d, je plazmid pATM.D12 (popsaný výše) modifikován následujícím způsobem tak, aby zněj bylo možné exprimovat fuzní protein a_d/IgG4. DNA kódující IgG4 je pomocí PCR za použití primerů, které zavádějí na 5' konec restrikční místo AatlI (SEK. ID. Č.: 89) a na 3' konec restrikční místo Xbal (SEK. ID. Č.: 90), izolována z vektoru pDCSl.

5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3'

5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK. ID. C.: 89) (SEK. ID. Č.: 90)

Plazmid pATM.D12 je rozštěpen restrikčními enzymy AatlI a Xbal a rozštěpený a purifikovaný produkt PCR reakce, IgG4, je zaligován do linearizovaného vektoru.

-29CZ 287921 B6

Příklad 15

Produkce protilátek specificky namířených proti lidskému aa

A. Produkce monoklonálních protilátek

1. Přechodně transfekované buňky z Příkladu 7 byly třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem podle Dulbecca (D-PBS) a vPBS injikovány, v množství 5 x 10⁶ buněk/myš spolu s 50 pg/myš muramyl dipeptidázy (Sigma), do myší Balb/c. Myši byly injikovány stejným způsobem dvakrát ve dvoutýdenním intervalu. Preimunizační séra a séra z imunizovaných myší byly testovány s využitím FACS, jak je popsáno v Příkladu 9, a slezinné buňky z myší s nej vyšší reaktivitou proti buňkám transfekovaným a<j/CD18, byly použity k fúzi. Supematanty z kultur hybridomů byly jednotlivě testovány za účelem zjištění, jestli nereagují s buňkami COS transfekovanými pomocí CDlla/CD18 a rovněž, jestli reagují s buňkami kotransfekovanými expresivními plazmidy kódujícími polypeptidy a_d a CD18.

Tímto postupem se nepodařilo připravit žádné monoklonální protilátky.

2. Jako alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl použit postup, při kterém byl rozpustný fuzní protein domény I polypeptidu ad/IgG4 afinitně purifikován ze supematantu stabilně transfekovaných buněk COS, a byl použit k imunizaci myší Balb/c, jak je popsáno výše. Byly vytvořeny hybridomy a supematanty získané při kultivaci těchto hybridomů byly metodou ELISA testovány za účelem zjištění reaktivity proti fůznímu proteinu domény I polypeptidu a_d. Pozitivní kultury byly následně analyzovány za účelem zjištění, jestli reagují s nezkrácenými komplexy a_d/CD18 exprimovanými na povrchu transfekovaných buněk CHO.

Myš 1908 byla nejprve třikrát imunizována buňkami CHO transfekovanými a_d/CD18 a následně pak dvěma posilovacími dávkami, obsahujícími rozpustný heterodimer ayCDie. Dávky pro poslední dvě imunizace obsahovaly rovněž fůzní protein doména I polypeptidu a,j/IgG4 v množství 50 pg/myš. Výsledkem těchto imunizací bylo 270 jamek, ve kterých hybridomy produkovaly protilátky proti IgG. Pomocí metody ELISA bylo stanoveno, že supematanty ze 45 jamek vykazovaly přinejmenším 7-krát silnější vazbu k fúznímu proteinu Ia(j/IgG4 než k samotnému lidskému IgG. Analýzou s využitím FACS bylo zjištěno, že žádný z těchto supematantů nereaguje s buňkami CHO transfekovanými a_d/CD18.

Za účelem zjištění, jestli jsou protilátky v těchto supematantech schopny rozpoznávat alfa podjednotku integrinu v jiném kontextu, byly pomocí supematantů (ze 24 z celkového počtu 45 jamek) označeny čerstvě zmrazené řezy sleziny. Tři supematanty poskytly pozitivní reakci: jeden obarvil velké buňky červené pulpy, zatímco další dva obarvily buňky roztroušené v červené pulpě a rovněž v trabekule.

U těchto supematantů byla dále analyzována jejich schopnost imunoprecipitovat biotinylované komplexy CD 18 buď z buněk CHO transfekovaných a<i/CD18 nebo buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA. K dalšímu pasážování byly vybrány jamky, ve kterých byly přítomny supematanty reagující s proteiny zlyzátů získaných působením detergentů (tyto proteiny by neměly mít tak definované struktury jak je tomu u proteinů exprimovaných jako heterodimery). Monoklonální protilátky, které rozpoznávají proteiny v detergentů, mohou být užitečnější při imunoprecipitaci heterodimemích komplexů z transfekovaných buněk, tkání a buněčných linií.

3. Jako další alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl použit postup, při kterém byly zlyzátů lidské sleziny, pomocí monoklonální protilátky 23F2G namířené proti CD 18, imunoprecipitovány komplexy CD 18; této imunoprecipitaci předcházelo odstranění komplexu

-30CZ 287921 B6

CDlla/CD18 (pomocí monoklonální protilátky TS2/4) a komplexu CDllb/CD18 (pomocí monoklonální protilátky Mo-1). Pět myší Balb/c, starých 10 až 12 týdnů, bylo imunizováno subkutánní injikací přibližně 30 pg proteinu, připraveného postupem popsaným výše, v kompletním Freundově adjuvans. Tato imunizace byla provedena v 0. dni a poté následovaly imunizace dvěma posilovacími dávkami obsahujícími 30 pg imunogenu/myš v nekompletním Freundově adjuvans, které byly prováděny 28. a 43. den. Deset dní po poslední imunizaci byla myším odebrána krev a u získaných sér zředěných v poměru 1:500 byla metodou Western Blot stanovována reaktivita vůči imunogenům, v množstvích 1 pg/dráha. Séra ze tří myší detekovala proužky odpovídající proteinům o molekulové hmotnosti přibližně 95 a 150 kD; ve drahách, ve kterých byla k detekci použita séra ve z neimunizovaných myší zředění 1:50, nebyl detekován žádný signál. Předpokládalo se, že proužek o velikosti 150 kD reprezentuje in vivo glykosylovaný polypeptid a_d. Všechna séra získaná z imunizovaných myší navíc imunoprecipitovala s proteinem z lyzátů biotinylovaných buněk CHO transfekovaných a_d/CD18, který při SDS elektroforéze na polyakrylamidovém gelu migroval s molekulovou hmotností odpovídající heterodimeru. Na základě těchto výsledků byla vybrána myš #2212 a tato myš byla dále imunizována intraperitoneální injekcí obsahující 30 pg imunogenu v PBS (prováděná ve dni 64). Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena a z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina.

Suspenze jednotlivých slezinných buněk byla vytvořena rozmělněním tkáně mezi dvěmi namraženými podložními sklíčky ponořenými do média RPMI 1640 bez přítomnosti séra s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilinu v koncentraci lOOjednotek/ml a streptomycinu v koncentraci 100 pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčné sítko Nitex o velikosti ok 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát promyta centrifiigací při 200 x g po dobu 5 minut a peleta byla následně rozsuspendována ve 20 ml média RPMI bez přítomnosti séra. Thymocyty ze tří myší Balb/c (neimunizovaných) byly připraveny obdobným způsobem.

Myelomy NS-1, udržované po tři dny před tuzí v log fázi v médiu RPMI s obsahem 10% fetálního séra (FBS) (Hyclpone Laboratories, lne. Logan, Utah), byly centrifugovány při 200 x g po dobu 5 minut a peleta byla dvakrát promyta, postupem popsaným výše, a buňky byly spočítány. Přibližně 1,15 x 10⁸ slezinných buněk bylo smícháno s 5,8 x 10⁷ buněk NS-1, zcentrifiigováno a supematant byl odstraněn. Peleta byla poklepem uvolněna ode dna kyvety. K buněčné peletě byly, za stálého míchání po dobu jedné minuty, přidávány 2 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufru 75mM HEPES o pH=8,0) zahřátého na teplotu 37 °C. Následně bylo k buněčné suspenzi přidáno 14 ml média RPMI bez přítomnosti séra a suspenze byla míchána po dobu 7 minut. Následoval přídavek 16 ml média RPMI a buňky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 200 x g. Supematant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve 200 ml média RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 0,4 mM aminopterin, 16 mM thymidin (HAT) (Gibco), IL-6 o koncentraci 25 jednotek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶thymocytů/ml. Suspenze byla rozdělena do 10-ti 96-jamkových (s plochým dnem) destiček pro tkáňové kultury (Coming, Velká Británie) v objemu 200 pl/jamka a buňky byly vyživovány 4., 5., 6. a 7. den odebráním 100 pl média z každé jamky 18G-jehlou (Becton Dickinson) a přidáním 100 pl čerstvého média, popsaného výše, ale s IL-6 v koncentraci 10 jednotek/ml a neobsahujícího thymocyty.

až 10 dní po fúzi byly supematanty z každé jamky testovány metodou ELISA, na přítomnost myších IgG. Čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při teplotě 4 °C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším imunoglobulinům IgA, IgG nebo IgM (Organon Teknika) v množství 50 pl/jamku, zředěnou v poměru 1:5000 v uhličitanovém pufru opH=9,6. Destičky byly třikrát promyty pufrem PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a bylo do nich přidáno 50 pl supematantu získaného z buněčných kultur. Po inkubaci probíhající 30 minut při teplotě 37 °C a promytí, postupem popsaným výše, byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou namířená proti myšímu IgG(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěná v poměru 1:3500 v roztoku PBST. Destičky byly

-31CZ 287921 B6 inkubovány, postupem popsaným výše, a čtyřikrát promyty roztokem PBST. Ihned potom bylo přidáno 100 μΐ substrátu, který obsahoval o-fenylendiamin v koncentraci 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 ve 100 mM citrátovém pufru o pH=4,5. Barevná reakce byla po 5 minutách zastavena přídavkem 50 μΐ 15% H2SO4. Absorbance byla stanovována při vlnové délce 490 nm na čtečce destiček firmy Dynatech.

Hybridomy byly dále charakterizovány následovně. Supematanty získané kultivací klonů produkujících IgG byly analyzovány průtokovou cytometrií, zda-li jsou reaktivními vůči buňkám CHO transformovaným aa/CD18 a přitom nejsou imunoreaktivní vůči buňkám JY (linie Bbuněk exprimující LFA-1, ale ne jiné integriny β₂). Tato skutečnost byla pozorována v předchozích experimentech). Stručně řečeno, 5 x 10⁵ buněk CHO transformovaným ad/CD18 nebo Od/CD18~ buněk JY bylo rozsuspendováno v 50 μΐ média RPMI obsahujícího 2% FBS a 10 mM NaN₃ (pufr pro FACS). Do jamek na 96-ti jamkových destičkách (s jamkami s kulatým dnem) (Coming) byly k 50 μΐ supematantů, získaných z klonů hybridomů produkujících IgG, přidány jednotlivé suspenze buněk. Po 30 minutové inkubaci na ledu byly buňky dvakrát zcentrifugovány (a promyty), jednotlivé supematanty byly odstraněny a pelety byly rozsuspendovány ve 200 až 300 μΙ pufru pro FACS. Poslední promývací roztok byl nahrazen konjugátem fragmentu F(ab')2 ovčí protilátky namířeným proti myšímu IgG (H+L)-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) v objemu 50 μΙ/jamka zředěného v poměru 1:100 v pufru pro FACS. Po inkubaci, prováděné postupem popsaným výše, byly buňky dvakrát promyty PBS modifikovaným podle Dulbacca (D-PBS) doplněným 10 mM NaN₃, a nakonec rozsuspendovány vB-PBS obsahujícím 1% paraformaldehyd. Následně byly vzorky přeneseny do polystyrénových zkumavek pro analýzu průtokovou cytometrií (FACS) a analyzovány na analyzátoru FACscan firmy Becton Dickinson.

Výsledkem fúze bylo vytvoření čtyř buněčných kultur, které splňovaly obě kritéria. Když byl přibližně po čtyřech dnech prováděn u supematantů sekundární screening, tři ze čtyř kultur zůstaly pozitivní. Kultury z těchto tří jamek, označené 169A, 169B a 169D byly dvakrát až třikrát úspěšně pasážovány vždy dvojnásobným zředěním v médiu RPMI obsahujícím 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 16 mM thymidin a IL-6 o koncentraci 10 jednotek/ml. Po čtyřech dnech byly jamky na destičkách vizuálně zhodnoceny a v jamkách s nejmenším počtem kolonií byl určen počet těchto kolonií. Po 7 až 10 dnech byly kultury ve vybraných jamkách z každého pasážování analyzovány s využitím FACS. U dvou těchto kultur, 169A a 169B, byla detekována aktivita. Při posledním pasážování byly kolonie z pozitivně reagujících jamek (přítomna vždy jedna v jamce) rozrosteny v médiu RPMI s 11% FBS. U protilátek ze supematantů klonů 169A a 169B byl za použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupem doporučeným výrobcem, stanovován jejich izotyp. Bylo zjištěno, že se jedná o protilátky izotypu IgGl.

Při terciálním testování specifity těchto protilátek bylo využito precipitace s komplexy ad/CD18 získanými z transfekovaných buněk CHO a buněk HL60 stimulovaných prostřednictvím PMA. Protilátky produkované hybridomy 169A a 169B precipitovaly s proužky o odpovídající velikosti (u proteinů z linií CHO) a precipitovaly rovněž s jedním typem řetězce a o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 až 160 kD z buněk HL60. Tato skutečnost byla stanovena pomocí SDS-PAGE. Hybridomy 169A a 169B byly 31. května 1995 uloženy v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 a bylo jim přiděleno přístupové číslo HB11907 (169A) a HB11906 (169B).

Aby bylo možné lépe charakterizovat vazebné vlastnosti protilátek 169A a 169B, byla u každé z těchto protilátek testována jejich schopnost inhibovat vazbu druhé protilátky nebo protilátky TS1/18.1 namířené proti CD 18 k rozpustnému heterodimeru ad/CD18. Rozpustný nezkrácený heterodimer ad/CD18 byl pomocí každé z těchto protilátek (neznačených) jednotlivě imobilizován na 96-ti jamkové destičce a k detekci proteinu, navázaného prostřednictvím stejné nebo odlišné neznačené protilátky, byly použity protilátky označené biotinem. Vazba byla detekována za použití konjugátu kozí protilátka namířená proti myším Ig/HRP s následným barvením substrátem OPD. Získané výsledky naznačují, že protilátka 169A byla schopna blokovat vazbu

-32CZ 287921 B6 biotinylovaných protilátek 169A a TS 1/18.1, zatímco protilátka 169B blokovala pouze vazbu sebe samotné.

4. Jiná z myší (#2214), imunizovaná stejným postupem jako myš #2212, byla 70. den dále imunizována pomocí 30 pg purifíkovaného polypeptidu a_d, získaného z lyzátu sleziny, v PBS. Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena a z jejího organizmu byla sterilně odebrána slezina.

Fúze a selekce pozitivně reagujících buněk byla prováděna postupem popsaným výše. Výsledkem fuze byl vznik pěti hybridomů produkujících monoklonální protilátky proti a_d, které byly označeny 170D, 170F, 170E, 170X a 170H. Za použití kitu IsoStrip (Boehringer Mannheim), postupem doporučeným výrobcem, byl stanoven izotyp těchto protilátek a bylo zjištěno, že se jedná o protilátky izotypu IgGl.

5. Jiná z myší (#2211), imunizovaná stejným postupem jako myši #2212 a #2212, byla 88. den dále imunizována pomocí 30 pg imunogenu a 203. den proběhla, s využitím 30 pg imunogenu, další imunizace. Po čtyřech dnech byla tato myš usmrcena, zjejího organizmu byla sterilně odebrána slezina a fúze buněk proběhla postupem popsaným výše. Supematant získaný při kultivaci hybridomů byl testován metodami ELISA a průtokovou cytometrií, jak je detailně popsáno v předchozích odstavcích.

Pomocí metody ELISA bylo identifikováno 15 pozitivně reagujících klonů hybridomů označených 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R a 188T. U těchto klonů byl rovněž stanoven izotyp produkovaných protilátek. Stručně řečeno, čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při 4 °C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším IgA, G, M (Organon Teknika) zředěnou v poměru 1:5000 v 50 mM uhličitanovém pufru, pH 9,6, v objemu 50 μΐ/jamka. Destičky byly po dobu 30 minut při 37 °C blokovány pomocí 1% BSA v PBS, třikrát promyty v PBS/0,05 % Tween 20 (PBST) a do jamek bylo přidáno 50 μΐ supematantu získaného při kultivaci hybridomů (zředěného v poměru 1:10 v PBS). Po inkubaci a promytí, prováděném postupem popsaným výše, bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ králičí protilátky (konjugované s křenovou peroxidázou) namířené proti myším IgG_t, IgG_2a nebo IgG (Zymed, San Francisco, Califomia), zředěné v poměru 1:1000 v PBST s 1% normálním kozích sérem. Destičky byly inkubovány postupem popsaným výše, čtyřikrát promyty pomocí PBST a poté bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ substrátu obsahujícího 1 mg/ml o-fenyldiaminu (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H₂O₂ ve 100 mM citrátovém pufru, pH 4,5. Barvení bylo zastaveno po 5 minutách přídavkem 50 μΐ 15% H₂SO₄. Na čtečce destiček (Dynatech) byla při vlnové délce 490 nm odečítána intenzita a bylo zjištěno, že všech 15 protilátek jsou protilátky izotypu IgGl.

Zbylé slezinné buňky z myši #2211 byly zmrazený v kryozkumavce a skladovány v kapalném dusíku. Obsah této kryozkumavky byl rozmražen umístěním kryozkumavky do vodní lázně o teplotě 37 °C a třepáním do chvíle, kdy buňky právě roztály. Buňky byly přeneseny do centrifúgační zkumavky o objemu 15 ml a po jednom mililitru k nim bylo přidáváno teplé médium RPMI obsahující 11% FBS. Mezi jednotlivými přídavky média byly tří až pětiminutové intervaly. Bylo přidáno dalších 5 ml teplého média RPMI a po pětiminutovém stání byla zkumavka centrifúgována po dobu 5 minut při 200 x g, a supematant byl odstraněn. Buňky byly rozsuspendovány v RPMI a fúze byla provedena postupem popsaným výše. Supematant získaný při kultivaci hybridomů byl testován metodami ELISA a průtokovou cytometrií, postupem popsaným výše.

Výsledkem fúze byl vznik pěti klonů označených 195A, 195C, 195D, 195E a 195H. U těchto klonů byl metodou ELISA, postupem popsaným výše, stanoven jejich izotyp; bylo zjištěno, že monoklonální protilátky 195A, 195C, 195D a 195E jsou protilátky izotypu IgGi a monoklonální protilátka 195H je protilátka izotypu IgG_2a.

-33CZ 287921 B6

6. Aby byly získány protilátky schopné inhibovat funkční vazbu polypeptidu a_d, byl k imunizaci použit rozpustný a<i/CD18LZ (viz. Příklad 14). Tento protein byl izolován ze supematantu získaného při kultivaci přechodně transfekovaných buněk COS na nosiči pro afmitní chromatografii, a jako imunogen byl použit polypeptid a_d navázaný na nosič. Vybraná myš byla imunizována postupem popsaným vše a poslední posilovači dávka jí byla podána dva týdny po první imunizaci. Imunizace provádění tímto postupem zamezuje možným změnám vkonformaci proteinu, které jsou často spojeny s lýzou buněk prováděnou prostřednictvím detergentu. Další myši byly imunizovány pomocí rekombinantního proteinu, rovněž navázaného na nosič, ale tyto myši nebyly na počátku imunizovány proteinem purifikovaným z lyzátu buněk.

Hybridomy, získané postupem popsaným výše, které jsou výsledkem imunizace, byly testovány metodou ELISA na rekombinantních proteinech izolovaných z buněčných supematantu za použití Fab fragmentů neblokující protilátky. Jinou možností testování je využití průtokové cytometrie pro stanovení reaktivity proti buňkám JY, které byly předem transformovány cDNA kódující a_d.

7. Jinou možností je produkce monoklonálních protilátek následujícím způsobem. K imunizaci myší Balb/c, prováděné postupem popsaným výše, byl použit heterodimemí protein a_d/CD18, purifikovaný afmitní chromatografií z lyzátů stabilně transfekovaných buněk CHO, spolu s muramyl dipeptidázou v koncentraci 50 pg/ml. Předtím, než byla imunoprecipitací biotinylovaných komplexů z transfekovaných buněk CHO stanovována reaktivita séra proti a<i/CD18, byly myši, ze kterých bylo toto sérum získáno, třikrát imunizovány. Z pozitivně reagujících zvířat byly, pomocí standardních technik, získány linie hybridomů. Následně byly tyto hybridomy kultivovány a pak selektovány pomocí průtokové cytometrie, za použití buněk transfekovaných a<j/CD18. Buňky transfekované CD1 la/CD18 byly využity jako kontrola pro identifikaci protilátek reagujících pouze s CD 18.

8. Jako další alternativa pro produkci monoklonálních protilátek byl využit postup, při kterém byl u myší Balb/c použit protokol imunizace/imunosuprese, který byl navržen tak, aby byla snížena reaktivita vůči imunogenním determinantům transfekovaných buněk CHO, použitých k imunizaci. Tento protokol využívá imunizaci prováděnou pomocí netransfekovaných buněk CHO a následné zničení B-buněk (ve stadiu blastů) reaktivních vůči CHO buňkám, kterého je dosaženo působením cyklofosfamidu. Po třech kolech imunizace a následného zničení reaktivních Bbuněk přídavkem cyklofosfamidu jsou myši imunizovány pomocí buněk transfekovaných a<j/CD18, postupem popsaným výše.

9. Jinou alternativou je postup, při němž jsou, postupem popsaným výše, lyzáty buněk HL60 stimulovaných pomocí PMA (získané působením detergentu) obohaceny o frakci komplexů CD18. Na stejných sloupcích jsou odstraněny jiné integriny β₂. Imunizace pomocí získaných komplexů, produkce hybridomů a jejich testování jsou prováděny postupy popsanými výše.

B. Produkce polyklonálního séra

K vytvoření polyklonálního antiséra v organizmu králíků byl použit purifikovaný chimérický protein doména I polypeptidu a(j/IgG4 (Příklad 14). Na počátku byl antigen doména I polypeptidu a_d/IgG4 injikován do organizmu králíků v kompletním Freundově adjuvans v množství 100 pg/králík, a poté následovaly tři posilovači dávky, obsahující stejné množství proteinu v nekompletním Freundově adjuvans. Po třetí a čtvrté imunizaci byly analyzovány vzorky krve. Králičí imunoglobulin (Ig) byl ze séra purifíkován na koloně Sepharóza-protein A a na koloně lidský IgG/Affigel 10 byl zbaven frakce namířené proti lidskému IgG. K potvrzení dokonalého odstranění frakce namířené proti lidskému IgG byla využita metoda ELISA, při které bylo testováno, že sérum nereaguje s lidským IgG, ale pouze s částí chimérického proteinu odpovídající doméně I.

-34CZ 287921 B6

Takto předčištěné polyklonální sérum bylo použito k imunoprecipitaci proteinů z lyzátů buněk CHO, které byly na povrchu biotinylovány, a které byly předem transfekovány expresivními vektory kódujícími a_d a CD18. Imunoprecipitace byla prováděna postupem popsaným v Příkladu 10. Toto předčištěné sérum rozpoznávalo proteinový komplex o stejné molekulové hmotnosti jakou měl komplex precipitovaný pomocí monoklonální protilátky TS1.18 namířené proti CD18. Při analýze komplexů CD 18 získaných z buněk CHO transfekovaných pomocí a<i/CD18, prováděné metodou Western Blot, rozpoznávalo toto sérum jeden proužek odpovídající velikosti. Králičí polyklonální sérum nerozpoznávalo afinitně purifikované integriny CDlla/CD18, CDllb/CD18 a protein VLA4 z lidské sleziny. Jak bylo stanoveno průtokovou cytometrií, toto sérum rovněž v roztoku nereagovalo s buňkami CHO transfekovanými a_d. Bylo tudíž usouzeno, že polyklonální králičí sérum je schopno rozpoznávat pouze denaturované proteiny domény I polypeptidu a_d/IgG4.

Při pokusu o izolaci polyklonálního séra proti a<j/CD18 byla myš třikrát imunizována pomocí buněk CHO transfekovaných a_d (D6.CHO, α^ΟϋΙδ) spolu sadjuvantním peptidem, a jednou byla imunizována purifikovaným heterodimerem OCVCD18. Poslední posilovači dávka obsahovala pouze heterodimer ad/CD18. Přídavkem asi 10⁸ buněk CHO transfekovaných LFA-1 (na dobu 2 hodin při 4 °C) bylo přibližně 100 μΐ séra získaného z imunizované myši předčištěno. U takto upraveného séra byla, v ředěních 1/5000, 1/10 000, 1/20 000 a 1/40 000, analyzována, na buňkách lidské sleziny, reaktivita vůči polypeptidu a_d. Tato polyklonální protilátka byla reaktivní v ředění 1/20 000, zatímco při ředění 1/40 000 byly buňky barveny velmi slabě.

Příklad 16

Analýza distribuce polypeptidu a_d

Pomocí polyklonálního séra, vytvořeného postupem popsaným v Příkladu 15, byla stanovována tkáňová distribuce komplexu a_d/CD18.

K imunocytochemickým analýzám zmrazených řezů lidské sleziny byla purifikovaná králičí polyklonální protilátka použita v koncentracích v intervalu 120 ng/ml až 60 pg/ml. Řezy o tloušťce 6 mikrometrů byly umístěny na podložní sklíčka Superfrost Plus (VWR) a skladovány při -70 °C. Před použitím byla sklíčka vyjmuta z -70 °C a na 5 minut umístěna do teploty 55 °C. Následně byly řezy po dobu 2 minut fixovány acetonem a vysušeny na vzduchu. Řezy byly po dobu 30 minut při pokojové teplotě blokovány v roztoku obsahujícím 1% BSA, 30% normální lidské sérum a 5% normální králičí sérum. Na každý řez byla aplikována primární protilátka při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Nenavázaná protilátka byla odstraněna trojnásobným promytím sklíček v TBS (po dobu 5 minut). Dále byla na každý řez nanesena králičí protilátka namířená proti myšímu IgG ve stejném pufru TBS. K detekci sekundární protilátky byla použita 30 minutová inkubace (při pokojové teplotě) s myší protilátkou namířenou proti alkalické fosfatáze značenou alkalickou fosfatázou (APAAP). Následně byly sklíčka třikrát promyty v pufru TBS. Poté byl přidán substrát Fast Blue (Vector Labs) a barvení bylo zastaveno ponořením sklíčka do vody. Sklíčka byla dobarvena pomocí Nuclear Fast Red (Sigma) a před ukotvením pomocí Aqua Mount (Baxter) promyta vodou. V červené pulpě sleziny bylo detekováno barvení při použití této protilátky, ale ne při použití králičího polyklonálního Ig (proti jiným proteinům) nebo při použití nepurifikovaného séra získaného ze stejného jedince před imunizací.

Jakmile byla jednou u myšího séra stanovena specifická reaktivita vůči a_d, bylo toto sérum použito ke značení různých lymfoidních a nelymfoidních tkání. V totožných experimentech byly jako kontroly využity monoklonální protilátky rozpoznávající polypeptidy CD 18, CD1 la, CD1 lb a CD 11c. Značením řezů z normální sleziny prováděným pomocí polyklonálního séra proti a_d, a pomocí monoklonálních protilátek proti CD 18, CD 11 a, CDllb a CD 11c, byly získány tyto výsledky. Distribuce markéru pozorovaná při použití polyklonálního séra proti a_d byla odlišná od

-35CZ 287921 B6 distribuce značky namířené proti polypeptidům CD18, CD1 la, CD1 lb a CD1 lc. Existuje odlišná distribuce značky u některých buněk umístěných v hraniční zóně bílé pulpy a odlišná distribuce značky u periferních buněk hraniční zóny. Taková distribuce nebyla pozorována při použití jiných protilátek. Jednotlivé buňky roztroušené v červené pulpě byly rovněž označeny. Tyto buňky mohou, ale nemusí, být ze stejné populace nebo podskupiny jako buňky označené pomocí protilátek proti CD1 la a CD 18.

Značení protilátkou proti CD1 lc obarvilo nějaké buňky v hraniční zóně, ale nebyl pozorován, ve srovnání s použitím polyklonálního séra proti a_d, zřetelný kruh kolem bílé pulpy. Rovněž distribuce značky v červené pulpě neodpovídala distribuci značky při použití polyklonálního séra proti a_d.

Distribuce značky pozorovaná při použití polyklonálního séra proti a_d byla tudíž jedinečná ve srovnání s distribucí pozorovanou při použití protilátek proti jiným integrinům β₂ CDlla, CDllb, CDllc a CD18). Tyto výsledky naznačují, že in vivo distribuce polypeptidu a_dv organizmu člověka, je odlišná od distribuce jiných integrinů β₂.

Charakterizace exprese lidského polypeptidu a_d prováděná pomocí monoklonálních protilátek

Při analýze exprese lidského polypeptidu a_d prováděné imunocytochemicky na zmrazených tkáňových řezech a pomocí průtokové cytometrie na buněčných liniích a leukocytech periferního krevního oběhu, byly použity protilátky sekretované hybridomy 169A a 169B. V obou experimentech byly supematanty získané kultivací hybridomů použity v nezředěné formě.

Značení tkání

Veškeré značení, kromě značení řezů jater prováděné podle protokolu popsaného dále, bylo prováděno postupem popsaným výše. Po fixaci acetonem byly řezy po dobu 15 minut při pokojové teplotě promyty v roztoku 1% H₂O₂ a 1% azidu sodného v TBS. Po označení primární protilátkou byly na řezy na 30 minut při pokojové teplotě aplikována králičí protilátka namířená proti myšímu IgG konjugovaná s peroxidázou. Řezy byly třikrát promyty v pufru TBS. Za účelem detekce sekundární protilátky byla použita inkubace s prasečí protilátkou (konjugovanou s peroxidázou) namířenou proti králičí protilátce, prováděná při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Řezy byly následně třikrát promyty v pufru TBS, byl k nim přidán substrát AEC (Vector Labs) a reakce byla ponechána probíhat. Řezy byly dobarveny Hematoxylinem Gill č. 2 (Sigma) a následně, před vysušením a ukotvením, byly promyty vodou.

V řezech ze sleziny byla většina exprese lokalizována v červené pulpě sleziny, a to na buňkách morfologicky odpovídajících granulocytům a makrofágům. Označeno bylo velké množství granulocytů, zatímco signál poskytla jenom část z makrofágů. Pomocí protilátek proti a_d bylo slabě obarveno malé množství folikulámích dendritických buněk přítomných v bílé pulpě. Barvení pomocí protilátek proti CD1 la a CD18 poskytlo signál jak v červené, tak v bílé pulpě. Barvení pomocí protilátek proti CD1 lc bylo výraznější u velkých buněk přítomných v bílé pulpě sleziny (předpokládá se, že jde o makrofágy) a v hraniční zóně obklopující bílou pulpu; byla rovněž pozorována difúzně rozptýlená značka v červené pulpě. Zdá se, že distribuce polypeptidu CDllb v červené pulpě se překiývá, ale není identická, s distribucí a_d, ale není pozorována distribuce CD1 lb v bílé pulpě.

Byla srovnávána exprese integrinů v normální a (revmatoidní) artritické tkáni synovia. Ve zdravé (normální) tkáni byla, při značení jakoukoliv protilátkou namířenou proti integrinů (včetně protilátek specificky imunoreaktivních vůči CDlla, CDllb, CDllc, CD 18 a také a_d), pozorována minimální odezva s distribucí značky na rezidentních buňkách, převážně makrofázích. U zaníce

-36CZ 287921 B6 né tkáně byla exprese všech integrinů více lokalizovaná, a to na buňkách nahloučených kolem lymfatických cév. Zatímco distribuce exprese a_d a CD1 lb byly podobné, ukázalo se, že polypeptid CDllc není exprimován v tak velké míře, a jeho exprese je omezena pouze na podskupinu leukocytů.

U tkáňových řezů z jater psa byla na jatemích makrofázích, neboli Kuppferových buňkách, pozorována exprese CD 11b, ale ne exprese polypeptidů a_d. Značení řezů z jater „zdravých“ lidí (prováděné postupem popsaným pro značení řezů ze psích jater, viz. výše) potvrdilo konzervovanost distribuce této značky u člověka. Navíc ze byla detekována nízká hladina exprese CDllc. V řezech z jater pacientů postižených hepatitidou byla intenzita značky pro všechny leukointegriny vyšší, než tomu bylo u „normálních“ jater, zatímco na povrchu granulocytů a makrofágů byla v těchto vzorcích detekována exprese polypeptidů a_d.

Při barvení pomocí protilátek proti a_d bylo u řezů z tlustého střeva zdravých lidí pozorováno jen nevýrazné barvení; byla pozorována slabá intenzita značky na buňkách hladkého svalstva a leukocytech. U řezů získaných z pacientů postižených Crohnovou chorobou byla detekována zvýšená hladina exprese všech leukointegrinů.

Na řezech z plic zdravých jedinců bylo pozorováno omezené množství buněk pozitivních na přítomnost a_d; tyto buňky odpovídaly morfologicky makrofágům a neutrofílům. U tkáňových řezů z plic pacientů postižených rozedmou byl výskyt značky proti a_d pozorován u neutrofilů a makrofágů obsahujících hemosiderin, což je pigment obsahující železo. Tato skutečnost naznačuje pohlcení červených krvinek těmito buňkami.

Exprese integrinů byla rovněž analyzována na tkáňových řezech mozku zdravých jedinců a tkáňových řezech z lézí z pacientů postižených roztroušenou sklerózou (MS - multiple sclerosis). Ve tkáňových řezech ze zdravých jedinců bylo barvení a_d méně intenzivní než barvení CD 11 a, CDllb a CDllc, a toto barvení bylo omezeno na buňky, morfologicky a přítomnosti CD68, odpovídající mikrogliálním buňkám. Buňky exprimující CDllb byly situovány v místech obklopujících cévy a rozptýleny ve tkáni. CD1 lc⁺ buňky byly situovány uvnitř cév, zatímco a/ buňky obklopovaly tyto cévy. Ve tkáňových řezech z mozku pacientů postižených MS byla exprese polypeptidů ad nalezena jak na mikrogliálních buňkách, tak na části leukocytů jiných než makrofágů; ad⁺ buňky byly situovány uvnitř lézí a rovněž v kortexu těchto lézí. Signál pro ad měl stejnou intenzitu jako signál pro CD1 lc, ale jeho intenzita byla nižší než u signálu pro CD1 lb.

Pomocí protilátek proti leukointegrinů a CAM byly analyzovány vzorky tkáňových řezů jak hrudní aorty tak břišní aorty z PDAY (Pathobiologické Determinanty Atherosklerózy u mladých lidí; LSU Medical Center). Zkoumané leze odpovídaly aterosklerotickým plátům, které pod intimou obsahovaly agregáty velkých pěnových buněk (převážně makrofágů „nacpaných“ lipidy) a infiltrované menší leukocyty. Studie, při kterých byly samostatně použity protilátky specificky namířené proti a_d nebo jiným a řetězcům integrinů β₂ (CD1 la, CD1 lb a CD1 lc) spolu s protilátkou proti markéru makrofágů (CD68), odhalily, že většina makrofágů „nacpaných“ lipidy exprimovala a_d a CD18v průměrné hladině, zatímco exprese CD1 la byla slabá a exprese CD1 lc byla v rozmezí slabá až střední. CDllb byl exprimován velmi slabě, a to pouze na části makrofágů.

Za účelem zjištění relativní lokalizace antigenu a_d a ICAM-R, byly na řezech aorty provedeny studie, při kterých bylo použito současného značení dvěmi značkami. Jelikož pěnové buňky v těchto řezech byly značeny protilátkou Ham 56, specificky namířenou proti markéru makrofágů, ale nebyly značeny protilátkami proti aktinu buněk hladké svaloviny, byly stanoveno, že pěnové buňky nebyly odvozeny od subintimálních buněk hladké svaloviny. CD68⁺ makrofágy exprimující aa byly obklopeny malými leukocyty exprimujícími ICAM-R; tyto leukocyty byly rovněž přítomny mezi CD68⁺ makrofágy exprimujícími ad. Zdálo se, že existuje omezené

-37CZ 287921 B6 množství malých leukocytů, které neexprimují CD68, ale jsou značeny jak protilátkami proti a_d, tak protilátkami proti ICAM-R.

Distribuce polypeptidu a_d na leukocytech přítomných ve tkáních zdravých jedinců se překiývala, ale nebyla identická, s distribucí CD1 lb a CD1 lc, dvěma dalšími a řetězci leukointegrinů, které byly již dříve charakterizovány jako řetězce, jejichž exprese je omezena na leukocyty. Buněčná morfologie naznačila, že značkou namířenou proti a_d jsou barveny především makrofágy a granulocyty, a v omezené míře lymfocyty. Obecně lze říci, že zánět ve tkáni zvyšuje, spolu s výskytem vyšší intenzity značení leukointegrinů, množství i počet typů leukocytů pozorovaných v příslušné tkáni. Jelikož buněčná a prostorová distribuce leukointegrinů nebyla v patologických tkáních identická, bylo odvozeno, že každý člen rodiny integrinů, včetně a_d, má, v daném kontextu, odlišné funkce a ligandy.

Zajímavé je, že exprese polypeptidu α<ι v aterosklerotických lézích byla výraznější než exprese CD1 la, CD1 lb a CD1 lc, což naznačuje, že a_d může hrát klíčovou úlohu ve vytváření těchto lézí. Společná distribuce a/ a ICAM-R⁺ buněk, podpořená důkazy naznačujícími možnost interakce mezi a_d a ICAM-R naznačuje, že polypeptid a_d může, v časných stádiích těchto lézí, hrát úlohu při infiltraci leukocytů nebo při jejich aktivaci.

Značení buněčných linií a leukocytů periferní krve

Buněčná linie promyeloidních monocytů HL60 značená protilátkami 169A a 169B byla analyzována s využitím FACS. Exprese cc_d na povrchu těchto buněk je negativně ovlivněna stimulací pomocí PMA, který indukuje diferenciaci po makrofágové dráze, ale není ovlivněna stimulací DMSO, který indukuje diferenciaci po dráze granulocytů [Collins a další, Blood 70:1233 až 1244 (1987)]. Distribuce značky byla (v analýze s využitím FACS) za použití protilátek 169A a 169B při stimulaci buněk pomocí PMA odlišná od distribuce značky získané při použití monoklonálních protilátek namířených proti CDllb a CD 11c. Buněčná linie monocytů THP-1 je rovněž slabě značena protilátkami 169A a 169B. Navíc část z leukocytů periferní krve spadajících do oblasti („gate“) lymfocytů a monocytů se při analýze s využitím FACS jevila jen slabě pozitivní. Část monocytů periferní krve byla slabě zmáčená protilátkami 169A a 169B, zatímco na povrchu B-lymfocytů nebyla zjištěna žádná exprese ct_d. Část CD8 pozitivních T-lymfocytů byl také a_d pozitivní. Dále se nepodařilo protilátkami 169A a 169B detekovat antigen na liniích B-buněk JY, Ramos, na linii bazofílů KU812, a na liniích T-buněk Jurkat, SKW a Molt 16.

Na základě výsledků analýz s buňkami HL60 byly, pomocí gradíentové centrifiigace s nosičem Ficoll/Hypaque a následnou lýzou červených krvinek, z periferní krve izolovány granulocyty. Všechny izolované preparáty obsahovaly více než 90% PMN (polymorfonukleámích leukocytů), jak bylo zjištěno vizualizací morfologie jader v kyselině octové. Jednotlivé populace byly vystaveny na 30 minut působení 50 ng/ml PMA nebo ΙΟ^-8 M formyl peptidů (fMLP), aby se uvolnily potencionální zásoby integrinů. Nestimulované populace vykazovaly v porovnání s IgGl kontrolou sice nízkou, ale statisticky významnou expresi antigenů 169A a 169B, která po stimulaci rostla. Hladiny exprese a_d a CDllc na povrchu polymorfonukleámích leukocytů si odpovídaly více, než tyto hladiny pozorované u buněk HL60. Protilátka 169B byla následně použita k precipitaci heterodimemí molekuly z biotinylovaných PMN lyžovaných detergentem. Podjednotky o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 resp. 95 kD odpovídaly velikosti a_d resp. CD18.

Výskyt a_d na PMN nemohl být předpovězen na základě znalosti exprese a_d u psů. Psí neutrofíly, na rozdíl od lidských protějšků, exprimují na pomocných T-buňkách markér CD4 a také integrin VLA-4, a tudíž mohou mít v organizmu psů jiné ligandy a funkce, než je tomu u člověka.

-38CZ 287921 B6

Značení subpopulací PBL

Tato studie posloužila k určení distribuce integrinů β₂ v leukocytech lidské periferní krve. Kromě toho byla porovnána povrchová hustota a_d ve srovnání s jinými integriny β₂. Nakonec byla také vyhodnocena okamžitá regulace exprese a_d v purifíkovaných lidských eozinofilech.

Leukocyty lidské periferní krve byly izolovány centrifugací v hustotním gradientu a rozděleny do frakce mononukleámích buněk (obsahující monocyty, lymfocyty a bazofily) a do frakce granulocytů (neutrofily a eozinofíly) [Wamer a další, J. Immunol. Meth. 105:107-110 (1987)]. Pro některé experimenty byly eozinofíly purifikovány imunomagneticky na čistotu větší než 95% použitím CD16 [Hansel a další, J. Immunol. Meth. 122:97-103 (1989)]. Kožní žímé buňky byly enzymaticky odděleny z lidské kůže a namnoženy, jak bylo popsáno dříve [Lawrence a další, J. Immunol. 139:3062-3069 (1987)].

Buňky byly značeny vhodnými ředěními monoklonálních protilátek specificky namířených proti CDlla (MHM24), CDllb (H5A4), CDllc (BU-15) nebo proti a_d (169A). Jako kontrola byl zařazen myší IgGl. Buňky byly promyty a pak inkubovány skozí protilátkou namířenou proti myším IgG konjugovanou s fykoerythrinem. V některých pokusech byly buňky inkubovány v nadbytku myšího IgG a myší monoklonální protilátky nebo kozí polyklonální protilátky, které byly značeny FITC, specifické pro antigen konkrétní buňky (například CD3, CD4 nebo CD8 pro T-buňky; CD16⁺ lymfocyty pro NK buňky; anti-IgE pro bazofily) [Bochner a další, J. Immunol. Meth. 125:265-271 (1989)]. Pak byly tyto vzorky zkoumány průtokovou cytometrií (Coulter EPICS profil) za použití vhodného „gatinku“, aby mohly být identifikovány podskupiny buněk.

V experimentech s lidskými eozinofíly byla zkoumána okamžitá aktivace exprese a_d. Buňky byly stimulovány 15 minut při 37 °C esterem forbolu (lOng/ml), RANTES (lOOng/ml) [Schall, Cytokine 3:165-183 20 (1991)] nebo interleukinem IL-5 (lOng/ml), a potom byly značeny různými monoklonálními protilátkami, jak je popsáno výše.

Výsledky ukázaly, že polypeptid a_d byl přítomen na všech eozinofilech, bazofilech, neutrofílech, monocytech a NK-buňkách periferní krve. Také malý podíl (přibližně 30%) CD8⁺ lymfocytů vykazoval expresi ad. Kožní žímé buňky a CD4⁺ lymfocyty podjednotku ad neexprimovaly. Obecně jsou CD1 la a CD1 lb přítomny na leukocytech ve vyšší hustotě než a_d. Podjednotka a_dje exprimována na relativně nízké hladině podobné hladině exprese CDllc. U leukocytů je polypeptid a_d s největší hustotou exprimován na monocytech a CD8⁺ buňkách, zatímco eozinofíly mají úroveň exprese a_d nejnižší. Hladina exprese na neutrofílech, bazofilech a NK-buňkách je střední.

Aktivace eozinofilů periferní krve vyvolaná působením CC-chemokinu RANTES nezpůsobuje změnu v expresi žádného z integrinů β₂. Působení esteru forbolu mělo nicméně za následek dvojaž trojnásobné zvýšení exprese CDllb a a_d, avšak neovlivnilo expresi CDlla nebo CDllc. Působením interleukinu IL-5 se selektivně aktivovala exprese podjednotky CDllb, přičemž nebyla ovlivněna hladina exprese jiných integrinových podjednotek.

Získané výsledky ukázaly, že podjednotka a_d je u leukocytů periferní krve exprimována v přibližně stejném množství jako podjednotka CD1 lc. Nejvyšší hladina exprese byla zjištěna na monocytech a populaci CD8⁺ lymfocytů. Žímé buňky lidské kůže polypeptid a_d neexprimovaly. U purifíkovaných eozinofilů byly uvnitř cytoplazmy objeveny předvytvořené zásoby podjednotek CD1 lb a a_d. Z pozorované rozdílné aktivace interleukinem IL-5 oproti PMA se usuzuje, že tyto zásoby podjednotek jsou od sebe odděleny.

Distribuce značky u subpopulací leukocytů periferní krve (PBL) byla také určována metodou průtokové cytometrie za použití kombinace „gatingu“ (definování jednotlivých buněčných typů na základě hodnot rozptylu světla měřených v přímém směru a v úhlu 90°) a povrchových

-39CZ 287921 B6 značek, jak bylo popsáno výše. Tato metoda byla použita při pokusu přesněji definovat populaci lymfocytů, která neexprimuje 169 A/B. PBL byly izolovány pomocí Ficollu, postupem popsaným výše, a jednotlivě označeny protilátkami 169A, 169B a monoklonálními protilátkami proti CD 14 (značka monocytů a makrofágů), CD20 (B-buňky), CD56 (NK-buňky), receptoru α/β T-buněk (T-buňky), CD16 (neutrofily a NK-buňky) a a4 (negativní markér neutrofílů). Jednotlivé oblasti („gates“) byly definovány na základě velikosti buněk a distribuce značek.

Získané výsledky naznačují, že buňky v oblasti („gate“) CD14⁺ monocytů vykazují nízkou hladinu značení protilátkami 169A a 169B. Bimodální distribuce značky pozorovaná v dřívějších experimentech v oblasti („gate“) lymfocytů byla rozlišena při zvýšeném rozptylu měřeném v přímém směru. Smíšená populace TCR⁺/CD20⁺ buněk vykazovala nízkou, ale homogenní hladinu exprese antigenů pro 169A/B. Populace mapovaná při mírně zvýšeném bočním rozptylu (buněčná komplexita), která byla pro CD56 z 50% pozitivně označena, se ukázala jasně 169A/B negativní populací. Negativní populace nebyla rovněž rozpoznána pomocí protilátek namířených proti TCR, CD20, CD 14 nebo CD 16.

Distribuce a_d v synoviu

K určení buněčné distribuce polypeptidu a_d, dalších integrinů β₂ a jejich příslušných receptorů u zánětlivé a nezánětlivé synovie byly použity imunohistologická studie využívající monoklonální protilátky namířené proti různým integrinům β₂ a supergenovým rodinám imunoglobulinů. Exprese proteinů byla stanovována v normálních, osteoartritidických a revmatoidních tkáňových kulturách synovií.

Získané výsledky naznačují, že vrstva epitheliálních buněk synovia má vysokou úroveň exprese VCAM-1, CDllb/CD18 a ad/CDie. V těchto buňkách je omezena exprese CDllc/CD18 a exprese CDlla/CD18 není většinou detekována. Při revmatoidním artritickém zánětu synoviální blány vzrůstá exprese integrinu β₂ na synoviálních buňkách úměrně stupni hyperplazie. Množství buněk exprimujících CDllc se podstatně zvětšuje, čímž se blíží množství buněk exprimujících CD1 lb a a_d, ale není pozorováno zvýšení exprese CD1 la.

V subepitheliálních oblastech tkáně jsou CD3/CD1 la/ICAM-R⁺ lymfocyty, ve formě agregátů a difuzních infiltrátů, roztroušeny mezi CD68/CD1 lb/ad⁺ makrofágy. Na vysoký počet agregátů poukazuje intenzivní značení ad, a to hlavně v oblastech bohatých na T-buňky.

Synoviální endotel proměnlivě exprimuje ICAM-1 a ICAM-2, s minimálními stopami exprese ICAM-R.

Tyto výsledky dokazují, že synoviální makrofágy a makrofágům podobné synoviální buňky konstitutivně exprimují vysoké množství podjednotek CDllb a a_d integrinů β₂. Při zánětu synoviální blány dochází, jak v epitheliální tak subepitheliální oblasti, k velkému pomnožení těchto populací buněk, současně s patrným nárůstem v expresi CDllc. Specifické populace revmatoidních synoviálních T-lymfocytů exprimují nejen CDlla a ICAM-R, ale také velké množství a_d. Tato molekula, jak bylo ukázáno výše, je exprimována v nízké úrovni na lymfocytech periferní krve.

Příklad 17

Izolace klonů potkaní cDNA

Vzhledem k existenci psích a lidských podjednotek a_d byly prováděny pokusy izolovat homologní geny z jiných druhů, včetně laboratorních potkanů (tento příklad) a myší (Příklad 17, viz níže).

-40CZ 287921 B6

Částečná sekvence potkaní cDNA vykazující homologii k lidskému genu pro a_d, byla získána využitím ÁgtlO knihovny z potkaní sleziny (Clontech). Knihovna byla vyseta v koncentraci 2 x 10⁴ pfu/miska na LBM/agarových miskách o průměru 150 mm. Knihovna byla přenesena na membránu Hybond (Amersham), denaturována 3 minuty, 3 minuty neutralizována a 5 minut promývána pufry popsanými ve standardním protokolu [Sambrook a další, Molecular Cloning: alaboratory manual, strana 2.110]. Membrány byly okamžitě přeneseny do Stratalinkeru (Stratagene) a DNA zesítěna pomocí autozesíťovacího nastavení. Za účelem dosažení podmínek, při kterých je pro hybridizaci potřebný nízký, resp. vysoký stupeň komplementarity mezi sondou testovanou sekvencí byly membrány prehybridizovány a hybridizovány v 30% resp. 50% formamidu. Membrány byly na počátku testovány pomocí sondy značené ³²P získané z cDNA kódující lidský a_d, odpovídající oblasti od báze 500 do 2100 v klonu 19A2 (SEK. ID. Č.: 1). Sonda byla za použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označena. Filtry byly promyty v 2x SSC při teplotě 55 °C.

Byly identifikovány dva klony, označené 648.3 a 705.1, které vykazovaly sekvenční homologii k sekvenci lidského a_d, lidského CD1 lb a lidského CD1 lc. Oba klony odpovídají 3'-oblasti genu pro lidský a_d, a začínají od báze 1871 a pokračují až k bázi 3012 u klonu 648.3, resp. od báze 1551 až k 3367 u klonu 705.1.

Pro získání úplnější potkaní sekvence, zahrnující i oblast odpovídající 5' konci, byla, postupem stejným jako u prvního testování, znovu testována stejná knihovna, ale při tomto testování byly použity myší sondy získané z klonu AI 160 (viz Příklad 17, viz níže). Pomocí druhého testování byly vyselektovány jednotlivé izolované plaky, které byly uchovány jako jednotlivé klony na miskách s LBM/agar. K vytvoření DNA použitelné pro sekvenování byly ve standardní PCR reakci použity sekvenační primeiy 434FL a 434FR (SEK. ID. Č.: 34 resp. 35).

5-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3' '-TG AAG ATTGGGGGTAAATAAC AG A-3' (SEK. ID. Č.: 34) (SEK. ID. Č.: 35)

DNA získaná metodou PCR byla purifikována za použití kolony Quick Spin (Qiagen) dle protokolu doporučeného výrobcem.

Byly identifikovány dva klony, označené 741.4 a 741.11, jejichž sekvence se překrývaly se sekvencemi klonů 684.3 a 705.1; v překrývajících se oblastech byly klony 741.4 a 741.11 100% homologní s klony 684.3 a 705.1. Složená potkaní cDNA homologní k lidskému genu pro a_d, je zobrazena v SEK. ID. Č: 36; předpovězená aminokyselinová sekvence je uvedena v SEK. ID. Č: 37.

Klonování 5' konce sekvence kódující potkaní a_d

Fragment 5' konce cDNA pro gen kódující potkaní a_d byl získán z potkaní sleziny s využitím klonovacího kitu RACE (Clonetech) postupem doporučeným výrobcem. Použité oligonukleotidy specifické pro tento gen byly označeny 741.11#2R a 741.2#1R (SEK. ID. Č: 59 resp. 58).

5'-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3'

5'-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3' (SEK. ID. Č: 59) (SEK. ID. Č: 58)

Oligonukleotid 741.11#2R zahrnuje báze 131 až 152 v SEK. ID. Č: 36 v opačné orientaci a oligonukleotid 741.2#1R zahrnuje báze 696 až 715 v SEK. ID. Č: 36 také v opačné orientaci. Primární reakce PCR byla provedena za použití oligonukleotidu 741.2#1R vymezujícího 3' konec kódujícího vlákna (nejblíže 3'-konci). Následná druhá reakce PCR byla provedena za použití

-41CZ 287921 B6 oligonukleotidu 741.11#2R a DNA získané z první reakce. Na 1% agarózovém gelu byl detekován proužek o velikosti přibližně 300 párů bází.

Produkt druhé reakce PCR byl, podle protokolu doporučeného výrobcem, zaklonován do plazmidu pCRTAII (Invitrogen). Do každé z 96 jamek (s kulatým dnem) na destičce pro tkáňové kultuiy byly, do 100 μΐ LBM média obsahujícího 1 μΐ zásobního roztoku karbenicilinu o koncentraci 50mg/ml a 1 μΐ kultury fága Ml3 K07, přidány bílé (pozitivní) kolonie. Směs byla inkubována 30 minut až jednu hodinu při teplotě 37 °C. Po této inkubaci bylo přidáno 100 μΐ LBM média (obsahující 1 μΐ zásobního roztoku karbenicilinu o koncentraci 50mg/ml a zásobní roztok kanamycinu o koncentraci 10 mg/ml v ředění 1:250) a inkubace pokračovala při teplotě 37 °C přes noc.

Sterilní kovovou transferovou vidlicí byl supematant z 96 jamkové destičky přenesen na čtyři nylonové filtry Hybond (Amersham). Filtry byly denaturovány, neutralizovány a DNA zesítěna podle standardních protokolů. Filtry byly prehybridizovány za stálého třepání ve 20 ml prehybridizačního pufru (5x SSPE; 5x Denhardts; 1% SDS; 50 pg/ml denaturované DNA z lososích spermií) při teplotě 50 °C po dobu několika hodin.

Oligonukleotidové sondy 741.11#1 a 741.11#1R (SEK. ID. Č: 56 a 57), zahrnující páry bází 86 až 105 (SEK. ID. Č: 36) v přímé a reverzní orientaci, byly radioaktivně označeny následovně.

5'-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3' (SEK. ID. Č: 56)

5-AGGTTAGACCCATGACAGG-3' (SEK. ID. Č: 57)

Přibližně 65 ng oligonukleotidové DNA bylo dvě minuty při teplotě 65 °C zahříváno ve 12 μΐ dH₂O. Do zkumavky byly přidány 3 μΐ 10 mCi/ml γ-³²Ρ-ΑΤΡ spolu s 4 μΐ 5x pufru pro kinázu (Gibco) a 1 μΐ DNA kinázy T4 (Gibco). Směs byla inkubována 30 minut při teplotě 37 °C. Po skončení inkubace bylo 16 μΐ každé ze značených olígonukleotidových sond přidáno k filtrům v prehybridizačním pufru a inkubace pokračovala při 42 °C přes noc. Filtry byly třikrát, po dobu 5 minut při pokojové teplotě, promývány v roztoku 5x SSPE s 0,1% SDS a 6 hodin autoradiografovány. Pozitivní klony byly namnoženy a DNA byla purifikována kitem při minipreparaci DNA „Magie Mini“ (Promega) podle výrobcem doporučeného protokolu. K sekvenování byl vybrán klon 2F7 a tento klon vykázal, v překrývající se oblasti, 100% homologii ke klonu 741.11. Kompletní potkaní nukleotidová sekvence genu pro a_d je zobrazena v SEK. ID. Č: 54; aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 55.

Charakteristiky potkaní cDNA a aminokyselinové sekvence

Nukleotidová ani aminokyselinová sekvence potkaní a podjednotky integrinu β₂ nebyly dříve publikovány. Srovnání těchto sekvencí s publikovanými sekvencemi kódujícími podjednotky a lidských integrinů β₂ naznačuje, že izolovaný potkaní klon podjednotky a_d má velmi podobnou nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci.

Na úrovni sekvence nukleotidů vykazuje izolovaný klon potkaní cDNA 80% shodu ve srovnání s cDNA pro lidský a_d; 68% shodu s cDNA pro lidský CD1 lb; 70% shodu s cDNA pro lidský CD1 lc a 65% shodu s cDNA pro myší CD1 la.

Na úrovni sekvence aminokyselin vykazuje předpokládaný potkaní polypeptid, kódovaný izolovanou cDNA, 70% shodu v porovnání s lidským polypeptidem a_d; 28% shodu s lidskou podjednotkou CD1 la; 58% shodu s lidskou podjednotkou CD1 lb; 61% shodu s lidskou podjednotkou CDllc; 28% shodu smyší podjednotkou CDlla a 55% shodu smyší podjednotkou CDllb.

-42CZ 287921 B6

Příklad 18

Produkce a charakterizace protilátek specificky namířených proti podjednotce a_d hlodavců

A. Protilátky namířené proti fúzním proteinům doména I potkaního polypeptidu a_d/HuígG4

Jelikož bylo dokázáno, že doména I lidského integrinu β₂ se účastní vazby ligandu, předpokládalo se totéž pro potkaní protein a_d. Imunospecifické monoklonální protilátky proti a_d by proto měly být užitečné u potkaních modelů lidských nemocí, při nichž hraje úlohu vazba podjednotky a_d.

Oligonukleotidy alfa-DI5 (SEK. ID. Č: 87) a alfa-DI3 (SEK. ID. Č: 88) byly vytvořeny ze sekvence potkaní a_d odpovídají oblasti bází 469 až 493 resp. 1101 až 1125 (v reverzní orientaci) v SEK. ID. Č: 54. Oligonukleotidy byly použity ve standardní PCR reakci k vytvoření fragmentu DNA kódujícího potkaní a_d obsahující doménu I v oblasti bází 459 až 1125 v SEK. ID. Č: 54. Produkt PCR byl vklonován do vektoru pCRTAII (Invitrogen) podle výrobcem doporučeného protokolu. Byla vybrána pozitivní kolonie a z její rozrostlé kultury byla, za použití kitu pro izolaci DNA „Midi Prep“ firmy Qiagen (Chatsworth, GA) podle protokolu výrobce, izolována DNA. DNA byla klasicky naštěpena restrikčními enzymy Xhol a BglII. Vzniklý fragment o velikosti 600 bází byl izolován z gelu a následně zaklonován do expresivního vektoru pDCSl/HuIgG4. Pozitivní kolonie byly selektovány a namnoženy, a za použití kitu pro izolaci DNA „Maxi“ firmy Quiagen z nich byla purifikována DNA.

Buňky COS byly v poloviční konfluenci vysety na misky o průměru 100 mm a kultivovány přes noc při teplotě 37 °C v 7% CO₂. Buňky byly lx propláchnuty 5 ml média DMEM. K 5 ml DMEM bylo přidáno 50 μΐ DEAE-Dextranu, 2 μΐ chlorokinu a 15 μg potkaní DNA kódující fuzní protein doména I polypeptidu a_d/Hu IgG4 popsaný výše. Tato směs byla přidána k buňkám COS a buňky byly inkubovány tři hodiny při teplotě 37 °C. Médium bylo odstraněno a buňky byly přesně jednu minutu inkubovány v 5 ml 10% DMSO vCMF-PBS. Buňky byly jedenkrát mírně propláchnuty v DMEM. K těmto buňkám bylo přidáno deset mililitrů DMEM obsahujícího 10% FBS a inkubace pokračovala přes noc při teplotě 37 °C v 7% CO₂. Následující den bylo médium nahrazeno čerstvým médiem a inkubace probíhala po následující tři dny. Toto médium bylo odebráno a do misky bylo přidáno čerstvé médium. Po třech dnech bylo médium opět odebráno a misky byly vyhozeny. Postup byl opakován, dokud nebyly z kultury získány 2 litry supematantu.

Supematant získaný výše popsanou metodou byl nanesen na kolonu Prosep-A (Bioprocessing Limited) a protein byl purifikován postupem popsaným níže.

Kolona byla nejdříve promyta 15-ti násobným objemem promývacího pufru obsahujícího 35 mM Tris a 150mM NaCÍ o pH=7,5. Supematant byl nanášen při rychlosti menší než přibližně 60 objemů kolony za hodinu. Následně byla kolona promyta 15-ti násobným objemem promývacího pufru, 15-ti násobným objemem roztoku 0,55 M diethanolaminu o pH=8,5 a 15-ti násobným objemem roztoku 50 mM kyseliny citrónové o pH=5,0. Protein byl eluován roztokem 50 mM citrónové kyseliny o pH=3,0 a dále neutralizován roztokem 1,0 M Tris a dialyzován do sterilního roztoku PBS.

Doména I potkaního proteinu a_d byla analyzována postupem popsaným v Příkladu 14. Detekovaný protein putoval stejným způsobem jako protein lidské domény I.

-43CZ 287921 B6

B. Produkce monoklonálních protilátek namířených proti fuznímu proteinu doména I potkaního polypeptidu a_d/HuIgG4

Myši byly jednotlivě imunizovány 50 pg purifikovaného fúzního proteinu doména I potkaního polypeptidu Od/HuIgG4, který byl nejdříve emulgován stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Sigma). Přibližně 200 μΐ tohoto preparátu bylo na čtyřech místech vstříknuto do hřbetu a boku myši. O dva týdny později byla myš podruhé injikována 100 μΐ antigenu doména I potkaního polypeptidu (Xd/HuIgG4 (ve množství 50 pg/myš), který byl předtím emulgován stejným objemem Freundova nekompletního adjuvans. Za následující dva týdny bylo myším intravenózně aplikováno 50 pg antigenu ve 200 μΐ roztoku PBS.

Pro zjištění titru krevního séra imunizovaných myší byl deset dní po třetí imunizaci proveden retro-orbitální odběr krve. Krev se nechala srazit, sérum bylo izolováno centrifugací a použito k imunoprecipitaci proteinů ze slezinných buněk potkanů značených biotinem (BIP). Sérum získané z každé myši imunoprecipitovalo proteinové proužky o molekulové hmotnosti předpokládané pro potkaní a_d a CD 18. Jedna z myší byla vybrána pro fúzi a počtvrté injikována, postupem popsaným výše (pro třetí injekci).

Protilátky v supematantech získaných kultivací hybridomů byly testovány následujícím způsobem. Čtyři destičky Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) byly při teplotě 4°C potaženy kozí protilátkou namířenou proti myším imunoglobulinům IgA, IgG nebo IgM (Organon Teknika) v množství 50pl/jamku, zředěnou v poměru 1:5000 v uhličitanovém pufru o pH=9,6. Destičky byly třikrát promyty pufrem PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a bylo do nich přidáno 50 μΐ supematantu získaného z buněčných kultur. Po inkubaci probíhající 30 minut při teplotě 37 °C a promytí, postupem popsaným výše, byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou namířená proti myšímu IgG9(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěná v poměru 1:3500 v roztoku PBST. Misky byly inkubovány, postupem popsaným výše, a čtyřikrát promyty roztokem PBST. Ihned potom bylo přidáno 100 μΐ substrátu, který obsahoval o-fenylendiamin v koncentraci 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 v 100 mM citrátu o pH=4,5. Barevná reakce byla po 5 minutách zastavena přídavkem 50 μΐ 15% H2SO4. Absorbance byla stanovována při vlnové délce 490 nm na čtečce destiček firmy Dynatech.

Supematant z jamek obsahujících protilátku byl dále analyzován metodou ELISA za použití imobilizovaného fuzního proteinu doména I potkaního polypeptidu a_d/HuIgG4. Jako kontrola reaktivity proti fuznímu partneru IgG byla použita metoda ELISA, při níž byly destičky povlečeny protilátkou HuIgG4. Pro další testování metodou BIP s potkaním slezinným lyzátem byly, technikami popsanými níže, selektovány pozitivně reagující jamky.

C. Produkce polyklonálního séra namířeného proti fuznímu proteinu doména I potkaního polypeptidu ad/HuIgG4

Dvěma králíkům byla před imunizací, prováděnou s využitím 100 pg purifikovaného fuzního proteinu doména I potkaního polypeptidu α<ι/Ηυ^Ο4 ve Freundovu kompletním adjuvans, odebrána krev. Každé tři týdny byli králíci injikováni stejnou dávkou, tentokrát ovšem ve Freundově nekompletním adjuvans. Po třech injekcích byla králíkům odebrána krev a získané sérum použito ke standardní imunoprecipitaci s lyzátem potkaních splenocytů. Sérum z obou králíků bylo imunoreaktivní vůči potkanímu polypeptidu a_d. Králíci byli znovu injikováno 100 pg antigenu ve Freundovu nekompletním adjuvans a získané sérum bylo, za účelem detekce rostoucí imunoreaktivity, testováno imunoprecipitaci s potkaním a_d. Po deseti dnech od aplikace poslední posilovači dávky byla králíkům odebrána krev a získáno sérum.

-44CZ 287921 B6

Histologie potkaního a_d

Králičí polyklonální sérum namířené proti doméně I potkaního polypeptidu a_d bylo použito při imunohistochemickém značení potkaních tkáňových řezů. Toto značení bylo prováděno technikami popsanými v Příkladu 16. Distribuce značky, zjištěná na zmrazených nebo do parafinu zapuštěných řezech potkaních slezin, byla v podstatě identická s distribucí pozorovanou při značení jednotlivých buněk uvnitř červené pulpy protilátkami proti lidskému a_d. Distribuce značky se lišila od distribuce značky při značení prováděném pomocí monoklonálních protilátek namířených proti potkanímu CD1 la, CD1 lb a CD 18. Kromě toho byl pozitivní signál detekován u jednotlivých buněk v kůře brzlíku. Ani jednak z těchto tkání neposkytla pozitivní signál při značení králičím sérem odebraným před imunizací.

D. Analýza specifícity protilátek

Potkani byli usmrceni asfyxií oxidem uhličitým a jejich sleziny byly odebrány standardními technikami. Slezinné buňky byly získány jemným protlačením sleziny pomocí pístu injekční stříkačky přes drátěné sítko do 20 ml RPMI média. Buňky byly posbírány do kónické baňky o objemu 50 ml a promyty vhodným pufrem.

Buňky byly třikrát promyty roztokem studeného D-PBS a rozsuspendovány na hustotu 10⁸ až 10⁹buněk ve 40 ml PBS. K suspenzi buněk byly přidány čtyři mg NHS-Biotinu (Pierce) a reakce probíhala při pokojové teplotě přesně 15 minut. Buňky byly zcentrifugovány a třikrát promyty studeným D-PBS.

Buňky byly ve studeném lyzačním pufru (složení: 1% NP40; 50 mM Tris-HCl o pH=8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCI₂; 2 mM MgCl; roztok pepstatinu, leupeptinu a aprotinu v ředění 1:100 přidaný do pufru před přidáním buněk; a 0,0001 g krystalického PMSF přidaného do pufru těsně před přidáním buněk) rozsuspendovány na hustotu 10⁸ buněk/ml. Lyzáty byly protřepávány po dobu 30 vteřin, pak inkubovány 5 minut při pokojové teplotě a dále 15 minut na ledu. Následně byly centrifugovány 10 minut při lOOOOxg, aby se odstranil nerozpustný materiál. Supematant byl převeden do nové zkumavky a uchován při teplotách v rozmezí 4 °C až -20 °C.

Jeden mililitr buněčného lyzátu byl částečně přečištěn inkubací s 200 μΐ suspenze proteinu ASepharozy (Zymed) prováděné přes noc při teplotě 4 °C. Takto přečištěný lyzát byl pro každou testovanou protilátku rozdělen do mikrozkumavek v objemu 50 μΐ/zkumavka. K lyzátu bylo přidáno 25 μΐ polyklonálního séra nebo 100 až 500 μΐ supematantů obsahujícího monoklonální protilátku a tato směs byla za stálého třepání inkubována 2 hodiny při 4 °C. Následně bylo přidáno 100 μΐ králičí protilátky namířené proti myšímu IgG (Jackson) vázané na kuličky Sepharozy s proteinem A v PBS a inkubace pokračovala za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě. Po mírné centrifugaci byly kuličky třikrát promyty studeným promývacím pufrem (složení: 10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1% Triton X-100). Supematant byl odstraněn odsátím a ke kuličkám bylo přidáno 20 μΐ 2x SDS vzorkového pufru obsahujícího 10% β-merkaptoethanolu. Vzorek byl povařen 2 minuty ve vodní lázni a nanesen na 5% SDS-polyakrylamidový gel pro elektroforézu. Po rozdělení byly proteiny přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Tento přenos probíhal přes noc za konstantního proudu. Membrána byla blokována 1 hodinu při pokojové teplotě ve 3% BSA v pufru TBS-T. Po odstranění blokovacího pufru byl k nitrocelulózové membráně přidán konjugát streptavidin-HRP (Jackson) v 0,1% BSA v pufru TBS-T a inkubace pokračovala dalších 30 minut při pokojové teplotě. Membrána byla třikrát po dobu 15 minut promývána pufrem TBS-T. Následná autoradiografíe byla provedena kitem ECL (Amersham) postupem doporučeným výrobcem.

-45CZ 287921 B6

E. Produkce monoklonálních protilátek namířených proti nezkrácenému potkanímu proteinu a_d

Purifikace potkaního proteinu a_d

Za účelem přípravy imunogenu použitelného k produkci monoklonálních protilátek namířených proti potkanímu polypeptidu a_d, byl potkaní protein a_d purifikován z potkaních slezinných buněk. Sleziny byly izolovány z přibližně 50 normálních samic potkanů Lewis starých 12 až 20 týdnů. Jednolitá buněčná suspenze byla získána pasírováním tkáně přes jemné drátěné sítko. Červené krvinky byly odstraněny lyží v pufru o pH=7,4 obsahujícím 150 mM NH4CI, 10 mM 10 KHCO3, 0,1 mM EDTA a zbylé leukocyty byly dvakrát promyty pufrem PBS. Slezinné buňky byly odstředěny a lyžovány v pufru obsahujícím 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂,10 mM PMSF, leupeptin, pepstatin a 1% Triton X-100. Lýza slezinných buněk probíhala na ledu po dobu 30 minut v jednom mililitru lyzačního pufru na 5 x 10* slezinných buněk. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugách

Polypeptidy CD 11 a, CDllb a CDllc byly ze slezinného lyzátu odstraněny imunoprecipitací provedenou postupem popsaným dále. Po dobu 30 minut bylo, při teplotě 4 °C, 750 μΐ suspenze protein A-Sepharózy inkubováno s 2 mg králičí protilátky namířené proti myšímu imunoglobulinu. Vzniklý komplex byl třikrát promyt lyzačním pufrem a nakonec rozsuspendován v 1,5 ml 20 lyzačního pufru. K 50 ml potkaního slezinného lyzátu bylo přidáno přibližně 200 pg každé ze specifických monoklonálních protilátek, 515F (specificky namířená proti potkaní CD 11 a), OX42 (specificky namířená proti potkaní CDllb) a lOOg (specificky namířená proti potkaní CD1 lc). Po 30 minutové inkubaci při teplotě 4 °C bylo k lyzátu přidáno 500 μΐ komplexu králičí protilátky s protein A-Sepharozou a tato směs byla třepána při teplotě 4 °C třepáno po dobu 25 30 minut na třepačce. Lyzát byl centrifugován při 2500 x g po dobu 10 minut, aby se oddělily

CDlla, CDllb a CDllc navázané na komplex králičí protilátky sprotein A-Sepharozou. Supematant byl převeden do nové centrifugační kyvety. Tato imunoprecipitace s protilátkami 515F, OX-42 a lOOg byla opakována ještě dvakrát, aby bylo zajištěno kompletní odstranění CDlla, CDllb a CDllc.

Zbylé integriny β₂ byly z lyzátu izolovány pomocí afmitní chromatografie. K lyzátu bylo přidáno přibližně 250 μΐ suspenze obsahující monoklonální protilátku 20C5B namířenou proti myší CD 18 navázanou na CNBr-Sepharózu a vzniklý roztok byl při teplotě 4 °C třepán po dobu 30 minut na třepačce. Komplex protilátka/antigen byl centrifugován při 2500 x g po dobu 10 minut, peleta 35 byla třikrát promyta lyzačním pufrem a skladování při teplotě 4 °C.

Imunizace arménských křečků

Arménští křečkové, staří šest až osm týdnů, byli poprvé imunizováni pomocí přibližně 50 pg rekombinantního proteinu sestávajícího z domény I potkaního polypeptidu a_d připojené k těžkému řetězci lidského lgG₄. Tento protein byl před imunizací emulgován Freundovým kompletním adjuvans. Následné imunizace proběhly se stejným proteinem emulgovaným ve Freundově nekompletním adjuvans 14. den, 33. den a 95. den po první imunizaci. Byly provedeny dvě 45 oddělené fúze, označené 197 a 199.

Čtyři dny před fúzí 197 (306. den) byla jednomu křečkovi aplikována směs potkaního proteinu a_dpurifikovaného ze slezinných buněk a buněk CHO transfekovaných potkaním a_d. Tři dny před fúzí (307. den) byla křečkovi aplikována posilovači dávka obsahující purifíkovaný potkaní 50 protein a_d a CHO buňky transfekované a_d. Transfekce buněk CHO potkaním a_d byla provedena následovně.

Segment genu kódující nezkrácený potkaní protein a_d byl vložen do vektoru pDCl, kterým byly, spolu s lidským konstruktem CD18-pRC, elektroporací transfekovány buňky CHO. Transfeko

-46CZ 287921 B6 váné buňky byly kultivovány v přítomnosti hypoxanthinu a g418, aby se vyselektovaly buňky úspěšně transfekované konstruktem pRC resp. konstruktem pDČl. Po třech týdnech byly buňky značeny specifickým polyklonálním sérem namířeným proti potkaní a_d a rozděleny s využitím FACS. Malý podíl buněk, který na svém povrchu vykazoval nejvyšší hladinu exprese polypeptidu a_d (přibližně 3% populace), byl separován a buňky byly dále pomnoženy. Tento postup byl několikrát opakován, aby byla získána populace buněk s nejvyšší povrchovou expresí a_d.

Transfekované buňky byly také charakterizovány průtokovou cytometrií za použití polyklonálního séra specificky namířeného proti potkanímu polypeptidu a_d a monoklonální protilátky TS 1.18.1 specificky namířené proti lidské CD18. Získané výsledky potvrdily vysokou hladinu exprese obou antigenů na povrchu transfekovaných buněk CHO.

Exprese a_d a CD 18 v buňkách byla nakonec analyzována imunoprecipitací. Králičí polyklonální sérum specificky namířené proti potkanímu polypeptidu a_d imunoprecipitovalo se dvěma proteiny o rozdílné molekulové hmotnosti. Molekulové hmotnosti byly 170kDa u většího proteinu a 95 kDa u menšího proteinu. Tyto výsledky byly v souladu s expresí heterodimemího komplexu potkaní a_d/lidský CD18 na povrchu transfekovaných buněk CHO.

V den fuze byla vyjmuta slezina. Suspenze jednotlivých slezinných buněk byla vytvořena rozmělněním tkáně mezi dvěmi namraženými podložními sklíčky ponořenými do média RPMI bez přítomnosti séra s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, penicilinu v koncentraci 100 jednotek/ml a streptomycinu v koncentraci 100pg/ml (Gibco, Kanada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčné sítko Nitex o velikosti ok 212 pm (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát promyta centrifúgací při 200 x g po dobu 5 minut a peleta byla následně rozsuspendována ve 20 ml média RPMI bez přítomnosti séra. Thymocyty ze tří myší Balb/c (neimunizovaných) byly připraveny obdobným způsobem. Myelomy NS-1, udržované po tři dny před fúzí v log fázi v médiu RPMI s obsahem 10% fetálního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne. Logan, Utah), byly centrifugovány při 200 x g po dobu 5 minut a peleta byla dvakrát promyta, postupem popsaným výše.

Přibližně 1,15 x 10* slezinných buněk bylo smícháno s 5,8 x 10⁷ buněk NS-1, zcentrifugováno a supematant byl odstraněn odsátím. Peleta byla poklepem uvolněna ode dna kyvety. K buněčné peletě bylo, za stálého míchání po dobu jedné minuty, přidáváno 7 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufru 75mM HEPES o pH=8,0) zahřátého na teplotu 37 °C. Následně bylo k buněčné suspenzi přidáno 14 ml média RPMI bez přítomnosti séra a suspenze byla míchána po dobu 7 minut. Bylo přidáno dalších 8 ml média RPMI a buňky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 200 x g. Supematant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve 200 ml média RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 0,4 mM aminopterin, 16 mM thymidin (HAT) (Gibco), IL-6 o koncentraci 25 jednotek/ml (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶thymocytů/ml. Suspenze byla rozdělena do 10-ti 96-jamkových (s plochým dnem) destiček pro tkáňové kultury (Coming, Velká Británie) v objemu 200 μΐ/jamka a buňky byly vyživovány 4., 5., 6. a 7. den odebráním 100 μΐ média z každé jamky 18G-jehlou (Becton Dickinson) a přidáním 100 μΐ čerstvého média, popsaného výše, avšak neobsahujícího thymocyty.

Desátý den byl supematant z jamek testován průtokovou cytometrií, zda-li reaguje s buňkami CHO transfekovanými heterodimerem potkaní a<i/lidská CD 18. Přibližně 5 x 10⁵ buněk CHO transfekovaných potkaní a_d bylo rozsuspendováno v 50 μΐ média RPMI obsahujícího 2,0% FBS a 0,05% azid sodný a na 96-jamkových destičkách s jamkami s kulatým dnem přidáno ke 100 μΐ supematantu získaného při kultivaci hybridomů. Pozitivní kontrolou bylo značení pomocí králičího polyklonálního séra namířeného proti a_d a protilátky TS1/18 namířené proti lidskému CD 18. Buňky byly inkubovány 30 minut na ledu, třikrát promyty v pufru FACS (RPMI, 2,0% FBS, 0,05% azid sodný) a inkubovány 30 minut na ledu skozí protilátkou značenou FITC namířenou proti křeččím Ig (Jackson Immunol Research Labs) zředěnou v poměru 1:200 v pufru FACS. Buňky byly třikrát promyty v pufru FACS a resuspendovány ve 200 ml tohoto pufru.

-47CZ 287921 B6

Vzorky byly analyzovány na analyzátoru FACscan firmy Becton Dickinson. Za účelem potvrzení, že klony z pozitivně reagujících jamek jsou specifické proti potkaní a_d, byl celý pokus opakován s netransfekovanými buňkami CHO. Klony, které splnily podmínky a reagovaly s buňkami CHO transfekovanými potkaní a_d, ale nereagovaly s netransfekovanými buňkami, 5 byly dále pomnoženy.

Po primárním screeningu byly buňky z pozitivně reagujících jamek pasážovány nejprve dvojnásobným zředěním a následně mezním zředěním v médiu RPMI obsahujícím 15 % FBS, 100 mM hypoxanthin sodný, 16 mM thymidin a IL-6 v koncentraci 10 jednotek/ml. V tomto kroku bylo 10 určeno procento jamek vykazující růst a s využitím Poissonovy distribuční analýzy byla předpovězena klonalita. Po 10 až 12 dnech byly jamky obsahující množící se populace analyzovány s využitím FACS. Po posledním pasážování byly buňky z pozitivních jamek namnoženy v médiu RPMI s 11% FBS. Byla získána jedna kultura, která se podle těchto kritérií jevila jako pozitivní. Z této kultury byly rozrostlé 4 separátní subklony označené 197A-1,197A-2,197A-3 a 197A-4.

Druhému křečkovi bylo 307. den aplikováno 2,3 x 10⁶ buněk CHO transfekovaných potkaní ad. Dvě závěrečné imunizace byly provedeny 4 dny před fúzí 199 (334. den) a opět tři dny před fúzí (335. den). Injekce ze dne 334, aplikovaná intraperitoneálně, obsahovala 2 x 10⁶ buněk CHO transfekovaných potkaní ad a 200 μΐ purifikované potkaní podjednotky a_d navázané k Sepharóze 20 (popsáno dříve). Injekce ze 335. dne, aplikovaná rovněž intraperitoneálně, obsahovala 5 x 10⁶buněk CHO transfekovaných potkaní a* Postup fuze a protokol testování byl stejný jako u fůze 197. Byly identifikovány a pomnoženy tři hybridomy označené 199A, 199H a 199M. Hybridom 199M byl 1. března 1996 uložen u Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod přístupovým číslem HB-12058.

Charakterizace monoklonálních protilátek proti potkanímu polypeptidu a<i

Aby bylo možno charakterizovat protilátky namířené proti potkanímu a_d, byly, postupem 30 popsaným v Příkladu 18, oddíl D, připraveny biotinem značené slezinné lyzáty. Před vlastní imunoprecipitací byly lyzáty předčištěny. Na počátku byl k lyzátu přidán normální myší imunoglobulin v koncentraci 50 pg/ml a výsledná směs byla po dobu 30 minut při teplotě 4 °C třepána na rotační třepačce. K této směsi bylo přidáno 75 μΐ suspenze protein A-Sepharozy potažené králičí protilátkou namířenou proti myším Ig a třepání pokračovalo dalších 30 minut. 35 Kuličky s navázanou protilátkou byly odstředěny při 15 000 otáčkách za minutu ve stolní centrifúze. Centrifugace probíhala po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Supematant byl odebrán a peleta odstraněna.

Z každého klonu hybridomu bylo do mikrozkumavky odebráno přibližně 300 μΐ supematantu. 40 K tomuto supematantu bylo přidáno 30 μΐ 10% Tritonu X-100, 30 μΐ ze lOx zásobního roztoku pepstatinu, leupeptinu a aprotinu, dále 100 pg krystalického PMSF a 50 μΐ předčištěného biotinylovaného lyzátu z potkaní sleziny. Obsah mikrozkumavek byl mírně protřepán a na dobu 30 minut při teplotě 4 °C umístěn na rotačku. Kontrolní vzorek byl připraven přidáním králičí polyklonální protilátky specificky namířené proti potkanímu polypeptidu a_d o koncentraci 45 10 mg/ml k 50 μΐ potkaního slezinného lyzátu.

Po 30 minutové inkubaci bylo ke každému vzorku přidáno 75 μΐ suspenze kuliček protein ASepharózy v PBS pufru a vzorek byl inkubován na rotačce dalších 30 minut při teplotě 4 °C. Kuličky Sepharózy byly centrifugovány po dobu 5 minut při teplotě 4 °C při 15 000 otáčkách za 50 minutu ve stolní centrifúze a supematant byl odebrán. Kuličky byly postupně promyty jedním mililitrem z každého z následujících detegentních roztoků: pufr #1 obsahující lOmM Tris, 400 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, pH 8,0; pufr #2 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 8,0; pufr #3 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0% Triton X-100, 0,1% deoxycholát, pH 8,0; a pufr #4 obsahující 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCl, pH 8,0.

-48CZ 287921 B6

Poslední promytí bylo provedeno pufrem #1. Mezi jednotlivými promytími byly kuličky mírně protřepány na vortexu a odstředěny ve stolní centrifuze. Supematant byl vždy odstraněn pipetou a po posledním promytí byl zbylý pufr od kuliček odstraněn stříkačkou (Halmiton). Ke každé peletě kuliček byl přidán alikvot (50 μΐ) SDS vzorkového pufru obsahujícího bromfenolovou modř, barvivo Pyronin Y a β-merkaptoethanol o výsledné koncentraci 10%. Směs byla prudce 1 až 2 minuty třepána a inkubována 5 až 10 minut při pokojové teplotě. Vzorky byly centrifugovány po dobu 5 minut při 15 000 otáčkách za minutu ve stolní centrifuze při teplotě 4 °C a uvolněný protein byl přenesen do nové mikrozkumavky. Vzorky byly povařeny 4 minuty na vodní lázni a naneseny na 7,5% SDS polyakiylamidový gel. Po ukončení dělení byly proteiny přeneseny na nitrocelulózové filtry. Transfer probíhal při 200 mA po dobu 1 hodiny. Filtry byly blokovány v roztoku 3,0% BSA v pufru TBS-T přes noc při teplotě 4 °C. Ke každému filtru byl přidán roztok 0,1% BSA v pufru TBS-T obsahující streptavidin-OPD v ředění 1:6000, ve kterém byl ponechán jednu hodinu za pokojové teploty. Filtry byly promývány pětkrát vždy po dobu 10 minut v pufru TBS-T a obarveny použitím kitu ECL (Amersham) postupem doporučeným výrobcem.

Bylo prokázáno, že klon 199M imunoprecipituje heterodimemí protein. Větší proteinová podjednotka měla přibližnou molekulovou hmotnost 170 až 175 kDa, což odpovídalo velikosti proteinu imunoprecipitovaného kontrolní králičí polyklonální protilátkou namířenou proti potkaní α<]. Druhá imunoprecipitovaná podjednotka měla zdánlivou molekulovou hmotnost 95 kDa, shodnou s velikostí CD 18.

Příklad 19

Izolace klonů myší cDNA

Byl učiněn pokus o izolaci myšího homologu a_d.

Pomocí dvou sond vytvořených metodou PCR byla provedena mezidruhová hybridizace. První sondou byl fragment o velikosti 1,5 kb odpovídající bázím 522 až 2047 z lidského klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1), druhou sondou byl potkaní fragment o velikosti 1,0 kb odpovídající bázím 1900 až 2900 z lidského klonu 19A2 (SEK. ID. Č: 1). Lidská sonda byla vytvořena polymerázovou řetězovou reakcí primeru označených ATM-2 a 9-10.1 (SEK. ID. Č: 38 resp. 39). Potkaní sonda byla vytvořena s využitím primerů 434L a 434R (SEK. ID. Č: 34 resp. 35). Vzorky byly inkubovány 4 minuty při teplotě 94 °C a podrobeny 30 cyklům s následujícím teplotním režimem: 94 °C, 2 minuty při 50 °C; 4 minuty při 72 °C.

5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3'

5'-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3' (SEK. ID. Č: 38) (SEK. ID. Č: 39)

Produkt reakce PCR byl purifikován pomocí kitu Quick Spin firmy Qiagen, postupem doporučeným výrobcem, a přibližně 180 ng DNA bylo za použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označeno 200 pCi [³²P]-dCTP. Nenavázaný izotop byl odstraněn pomocí kolony Centri-sep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Sondy byly před použitím denaturovány 0,2 N NaOH a neutralizovány roztokem 0,4 M Tris-HCl o pH=8,0.

Knihovna cDNA získaná z buněk myšího thymu s využitím sekvence oligo-dT jako primeru zabudovaná v lambda ZAP II (Stratagene) byla vyseta v koncentraci přibližně 30 000 plaků na 1 misku o průměru 15 cm. Plaky přenesené na nitrocelulózové filtry (Schleicher & Schuell, Keene, NH) byly za stálého míchání inkubovány při teplotě 50 °C po dobu jedné hodiny v prehybridizačním roztoku (8 ml/přenos) obsahujícím 30% formamid. K prehybridizačrtímu roztoku byly přidány značené lidské a potkaní sondy a inkubace pokračovala přes noc při teplotě

-49CZ 287921 B6 °C. Filtry byly dvakrát promyty v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, jednou v2X SSC/0,1% SDS o teplotě 37 °C a jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C. Expozice filtrů na film Kodak X-Omat AR probíhala při teplotě -80 °C po dobu 27 hodin za použití kontrastního filtru.

Čtyři plaky, které poskytly pozitivní signál při dvakrát opakovaném přenosu, byly znovu vysety na misky s LB médiem s přídavkem hořčíku a karbenicilinu v koncentraci 100 mg/ml a inkubovány přes noc při 37 °C. Fágové plaky byly přeneseny na filtry Hybond (Amersham), označeny jako v prvním pokusu a exponovány na film Kodak X-Omat AR při teplotě -80 °C po dobu 24 hodin za použití kontrastního filtru.

Dvanáct pozitivních plaků bylo přeneseno do ředicího roztoku s nízkým obsahem Mg²⁺ iontů (10 mM Tris-HCl a lmM MgCl₂). Velikost inzerčního fragmentu byla určena pomocí PCR reakce s T3 a T7 primery (SEK. ID. Č: 13 a 14) za následujících reakčních podmínek. Vzorky byly inkubovány při 94 °C po dobu 4 minut a vystaveny 30 cyklům s tímto teplotním režimem: 15 vteřin při 94 °C, 30 vteřin při 50 °C a 1 minutu při 72 °C.

Šest vzorků poskytlo rozdílné proužky DNA o velikosti od 300 bází do 1 kb. Fágmidy byly uvolněny pomocí koinfekce pomocným fágem a převedením do cyklické formy byl vytvořen Bluescript SK^- (Stratagene). Vzniklé kolonie rostly v LBM médiu s karbenicilinem (100 mg/ml) přes noc. DNA byla izolována pomocí kitu pro minipreparaci DNA „Wizard“ firmy Promega (Madison, WI) podle návodu výrobce. Restrikční analýza izolované DNA enzymem EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, odpovídající molekulovým hmotnostem zjištěným z PCR. Fragment DNA byl sekvenován za použití primeru M13 a reverzního primerů. 1 M13, jejichž sekvence jsou zobrazené v SEK. ID. Č: 40 resp. 41.

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEK. ID. Č: 40)

5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEK. ID. Č: 41)

Sekvenování bylo provedeno postupem popsaným v Příkladu 4.

Jen dva ze šesti klonů, označené 10.3-1 a 10.5-2, poskytly identickou sekvenci o velikosti 600 párů bází. Tato sekvence byla ze 68 % identická s odpovídající oblastí lidského a<j, ze 40 % identická s odpovídající oblastí lidského CD1 la, z 58 % identická s odpovídající oblastí lidského CDllc a z 54 % identická s odpovídající oblastí myšího CDllb. Tento fragment o velikosti 600 bp byl následně využit k získání úplnější cDNA kódující předpokládaný myší homolog a_d.

Knihovna cDNA z myší sleziny (vytvořená s využitím oligo-dT primerů a primerů o náhodných sekvencích), zaklonovaná do fága lambda Zap II (Stratagene), byla vyseta v koncentraci 2,5 x 10⁴fágů na LBM misku o průměru 15 cm. Plaky byly přeneseny na nylonovou membránu Hybond (Amersham) denaturovány 0,5 M NaOH s 1,5 M NaCl, neutralizovány 0,5M Tris-HCl s 1,5M NaCl a promyty v 2X SSC. DNA byla na membráně zesítěna ultrafialovým zářením.

Pomocí sond 10.3-1 a 10.5-2, značených postupem popsaným výše, bylo testováno přibližně 500 000 plaků. Sondy byly přidány do prehybridizačního roztoku a inkubovány přes noc při teplotě 50 °C. Filtry byly dvakrát promyty v 2X SSC/0,1% SDS při pokojové teplotě, jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 37 °C a jednou v 2X SSC/0,1% SDS o teplotě 42 °C. Expozice filtrů na film Kodak X-Omat AR probíhala při teplotě -80 °C po dobu 13 hodin za použití kontrastního filtru.

Osmnáct pozitivních plaků bylo přeneseno do roztoku s nízkým obsahem Mg²⁺ iontů a velikost fragmentu byla určena PCR metodou, postupem popsaným výše. Každý ze sedmi vzorků poskytl jediný proužek DNA o velikostech od 600 párů bází do 4 kb. Restrikční analýza purifíkované DNA enzymem EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, odpovídající molekulovým hmotnostem

-50CZ 287921 B6 zjištěným z PCR. Fragment DNA byl sekvenován za použití primeru M13 a reverzního primeru.l M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41).

Klon označený B3800 obsahoval inzert o velikosti 4kb, který odpovídal oblasti nacházející se 200 bází po směru transkripce od 5' konce klonu 19A2 lidské a_d a obsahoval 553 bází 3' nepředkládané oblasti. Klon B3800 byl ze 77% identický s odpovídající oblastí lidské a_d, 44% identický s odpovídající oblastí lidské CDlla, 59% identický s odpovídající oblastí lidské CDllc a 51% identický s odpovídající oblastí myší CD 1 lb. Druhý klon Al 160 měl velikost 1,2 kb a odpovídal 5' konci kódující oblasti lidské a_d, přibližně 12 bází po směru transkripce od iniciačního kodonu pro methionin. Klon A1160 byl ze 75% identický s odpovídající oblastí lidské a_d, 46% identický sodpovídající oblastí lidské CDlla, 62% identický sodpovídající oblastí lidské CD1 lc a 66% identický s odpovídající oblastí myší CD1 lb.

Klon Al 160, fragment blíže 5' konci lidského klonu 19A2, se překrývá s klonem B3800 od báze 205 až kbázi 1134. Klon A1160 má vložen úsek 110 bází (báze 704 až 814), který není v překrývající se oblasti klonu B3800. Tento vložený úsek DNA se nejspíše vyskytuje na hranici exonu a intronu [Fleming a další, J. Immunol. 150:480 až 490 (1993)] a byl před následným spojením klonů Al 160 a B3800 odstraněn.

Rychlá amplifikace 5' konce cDNA předpokládaného klonu myšího a_d

K získání chybějících 5' úseků předpokládaných klonů myší a_d, včetně 5' nepřekládané sekvence a iniciačního methioninu, byla použita RACE PCR [Frohman, „RACE: Rapid Amplifícation of cDNA Ends,“ v PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis a další, (editoři) 28 až 38, Academie Press: New York (1990)]. Myší slezinný kit „RACE-Ready“ (Clontech, Palo Alto, CA) byl použit podle návodu výrobce. Pro uskutečnění první a vnořené PCR byly vybrány dva xantisense specifické primery (Al 160 RACEl-primámí primer a A1160 RACE2-vnořený primer, SEK. ID. Č: 42 resp. 43).

5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3'

5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3' (SEK. ID. Č: 42) (SEK. ID. Č: 43)

Primery, SEK. ID. Č: 42 a 43, odpovídají oblastem začínajících 302 resp. 247 bází od 5' konce. Za použití 5' primeru (SEK. ID. Č: 44) a myší slezinné cDNA dodané v kitu byla, postupem popsaným výše, provedena PCR.

5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3' (SEK. ID. Č: 44)

Elektroforéza produktu PCR reakce odhalila proužek o velikosti 280 bází, kteiý byl zaklonován pomocí klonovacího kitu TA (Invitrigen), postupem doporučeným výrobcem. Deset získaných kolonií bylo pomnoženo, DNA izolována a zjištěna její sekvence. Touto metodou bylo identifikováno dalších 60 bází 5' sekvence, které odpovídají bázím 1 až 60 v SEK. ID. Č: 45.

Charakteristiky myší cDNA a předpokládané aminokyselinové sekvence

Složená sekvence myší cDNA kódující předpokládaný homolog lidské a_d je zobrazena v SEK. ID. Č: 45. Ačkoli homologie mezi vnějšími doménami lidských a myších klonů je vysoká, homologie mezi cytoplazmatickými doménami je jen 30%. Pozorované odchylky mohou naznačovat rozdíl ve funkci C-koncové domény mezi lidskými a myšími proteiny. Odlišnosti

-51CZ 287921 B6 v cytoplazmatických doménách mohou být rovněž výsledkem rozdílného sestřihu RNA nebo mohou naznačovat existenci dalších genů pro integriny β₂.

Aminokyselinová sekvence proteinu, předpovězená na základě sekvence myší cDNA je z 28 % identická smyší CDlla, z 53% smyší CDllb, z 28% s lidskou CDlla, z 55% s lidskou CD1 lb, z 59 % s lidskou CD1 lc a z 70 % s lidskou a_d. Ze srovnání aminokyselinových sekvencí cytoplazmatických domén lidského polypeptidu a_d a předpokládaného myšího homologu vyplývá, že sice obsahují oblasti stejné délky, ale s odlišnou primární strukturou. Podobné velikosti sekvencí v těchto oblastech předpokládají spíše druhovou odlišnost než možnost vzniku rozdílných variant sestřihem. Když porovnáváme myší sekvenci s předpokládaným potkaním polypeptidem (příklad 16 zmíněný výše), dostáváme větší než 60% shodu myší a potkaní cytoplazmatické domény.

Příklad 20

Izolace dalších klonů myší cDNA a_d prováděná za účelem potvrzení sekvence

Aby byla potvrzena nukleotidová a aminokyselinová sekvence myší a_d popsané v Příkladu 19, byly izolovány další myší sekvence.

Hybridizací se dvěmi homologními a_d sondami (od 3' konce a od 5' konce) byla, s využitím jak myší slezinné knihovny vytvořené pomocí náhodných primerů, tak knihovny cDNA vytvořené pomocí primerů oligo-dT, zaklonovaných do fága lambda ΖΑΡΠ (Stratagene), provedena izolace myší cDNA. Knihovna byla nanesena v koncentraci 5 x 10⁵ fágů/miska na misky s LBM o průměru 15 cm. Plaky byly přeneseny na nylonové membrány Hybond (Amersham). Membrány byly denaturovány (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), neutralizovány (0,5 M Tris/1,5 M NaCI/11,6 M HCI) a promyty (2X SSC). DNA byla na membránách zesítěna pomocí ultrafialového záření.

Sondy byly vytvořeny pomocí primerů popsaných níže v PCR reakci prováděné za následujících podmínek. Vzorky byly vystaveny 4 minuty teplotě 94 °C, a potom následovalo 30 cyklů s tímto teplotním režimem: 15 vteřin při 94 °C, 30 vteřin při 50 °C a 1 minutu při 72 °C v cykléru Perkin-Elmer 9600.

3-sonda, která byla přibližně 900 bází dlouhá, překrývala oblast nukleotidů 2752 až 3651 (v SEK. ID. Č: 1, ve směru od 5' k 3') a byla vytvořena pomocí primerů 1 l.b-l/2FORl 1 a 1 l.b1/2REV2 zobrazených v SEK. ID. Č: 69 resp. 74. Tato sonda byla použita v první sérii přenosů.

5'-sonda, která byla přibližně 800 bází dlouhá, zahrnovala oblast nukleotidů 145 do 946 (v SEK. ID. Č: 1, ve směru od 5' k 3') a byla vytvořena pomocí primerů ll.b-l/2FORl a Il.a-1/1REV1 zobrazených v SEK. ID. Č: 50 resp. 85). Tato sonda byla použita v druhé sérii přenosů.

Ve třetí sérii přenosů byly použity obě sondy společně na stejných miskách.

Pomocí obou sond, popsaných výše, značených způsobem popsaným v Příkladu 17, bylo testováno přibližně 500 000 plaků. Značené sondy byly přidány k prehybridizačnímu roztoku s 45% formamidem a inkubovány přes noc při teplotě 50 °C. Membrány byly promyty dvakrát v 2X SSC/0,1 % SDS při pokojové teplotě (22 °C). Poslední promytí bylo provedeno v2X SSC/0,1 % SDS při teplotě 50 °C. Autoradiografíe byla prováděna po dobu 19 hodin při teplotě -80 °C na film Kodak Y-Omat AR za použití kontrastního filtru.

Třináct plaků pozitivních nejméně při dvou přenosech bylo podrobeno druhému testování, které bylo provedeno stejně jako první testování, až na dvě výjimky. K hybridizací byly použity obě

-52CZ 287921 B6 značené sondy 3' a 5' a bylo přidáno závěrečné promytí v 2X SSC/0,1% SDS při teplotě 65 °C. Autoradiografíe byla provedena stejným postupem popsaným výše, ale probíhala pouze po dobu 2,5 hodiny.

Třináct pozitivních plaků (označených MS2P1 až MS2P13) bylo přeneseno do ředicího roztoku s nízkým obsahem hořečnatých iontů. Velikost inzertu byla stanovena metodou PCR (cykler Perkin-Elmer 9600) za použití primerů T3 a T7, které přisedají k fágmidu Bluescript zabudovanému ve vektoru ZAPII (sekvence již dříve popsaná). Podmínky PCR byly stejné, jak bylo popsáno výše. Velikosti proužků DNA se pohybovaly od 500 párů bází do 4kb. Fágmidy byly izolovány a sekvenovány s využitím primeru M13 a reverzního primeru.l M13 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41). Pět ze třinácti klonů (MS2P-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12, a MS2P-13) bylo sekvenováno a po složení reprezentovalo přibližně oblast od báze 200 na 5' konci až k 300. bázi za prvním stop kodonem na 3' konci.

Za účelem zjištění sekvencí konců všech klonů a určení jejich relativní pozice vůči konstruktu #17 (SEK. ID. Č: 45) bylo, postupem stejným jako v Příkladu 4, provedeno automatické sekvenování s využitím primeru Ml3 a reverzního primeru.l Ml3 (SEK. ID. Č: 40 resp. 41). Každý klon byl pak úplně sekvenován použitím vhodných primerů (uvedených níže) pro konkrétní oblasti.

l.b-l/2FORl 5'-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3'

11.a-1/1FOR2 5'-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3'

11.a-1/1FOR3 5'-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3'

l.b-l/2FOR4 5'-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3'

l.b-l/2FOR5 5'-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3'

l.b-l/2FOR6 5'-CAGATCGGCTCCTACTITGG-3'

l.b-l/2FOR7 5'-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3'

l.b-l/2FOR8 5'-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3'

l.b-l/2FOR9 5'-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3'

I l.b-l/2FOR10 5'-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3'

II ,b-l/2FORl 1 5'-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3'

l.b-l/2FOR12 5'-GTCACAGAGGGAACCTCC-3'

l.b-l/2FOR13 5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3'

l.b-l/2FOR14 5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3'

l.b-l/2FOR15 5'-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3'

l.b-l/2REV2 5'-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3' ll.b-l/2REV3 5'-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3'

l.b-l/2REV4 5'-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3'

l.b-l/2REV5 5'-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3'

l.b-l/2REV6 5'-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3'

l.b-l/2REV7 5'-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3'

l.b-l/2REV8 5'-GATCCAACGCCAGATCATACC-3'

l.b-l/2REV9 5'-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3'

l.b-l/2REV10 5'-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3'

l.b-l/2REVl 1 5'-CCATGTCCACCAGAACAGAGAG-3' (SEK. ID. Č: 50) (SEK. ID. Č: 60) (SEK. ID. Č: 61) (SEK. ID. Č: 62) (SEK. ID. Č: 63) (SEK. ID. Č: 64) (SEK. ID. Č: 65) (SEK. ID. Č: 66) (SEK. ID. Č: 67) (SEK. ID. Č: 68) (SEK. ID. Č: 69) (SEK. ID. Č: 70) (SEK. ID. Č: 71) (SEK. ID. Č: 72) (SEK. ID. Č: 73) (SEK. ID. Č: 74) (SEK. ID. Č: 75) (SEK. ID. Č: 76) (SEK. ID. Č: 77) (SEK. ID. Č: 78) (SEK. ID. Č: 79) (SEK. ID. Č: 80) (SEK. ID. Č: 81) (SEK. ID. Č: 82) (SEK. ID. Č: 51)

-53CZ 287921 B6

l.b-l/2REV12 5'-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3'

l.b-l/2REV13 5'-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3'

l.a-l/2REVl 5'-CTGGATGTGCGAAGTGCTAC-3'

l.a-l/2REV2 5'-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3' (SEK. ID. Č: 83) (SEK. ID. Č: 84) (SEK. ID. Č: 85) (SEK. ID. Č: 86)

Sekvence byly upraveny, přiřazeny a porovnány s dříve izolovanými sekvencemi myší a_(i(konstrukt #17, SEK. ID. Č: 45).

Přiřazení nových sekvencí odhalilo v konstruktu #17 deleci 18 bází, která začínala od nukleotidu 2308. Tato delece nezapříčinila posun čtecího rámce. Klon MS2P-9 obsahoval stejnou deleci o délce 18 bází. Výskyt této delece byl pozorován u 50% myších klonů obsahujících tuto oblast, avšak tato delece nebyla zjištěna v potkaních ani lidských klonech podjednotky a_d. Delece 18 bází je charakterizována palindromovou sekvencí 12 bází AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEK. ID. Č: 91). Tato inverzní repetice je komplementární sama k sobě a může vytvořit smyčku, která způsobuje štěpení během reverzní transkripce. Sekvence myší a<i, která obsahuje navíc 18 bází je zobrazena v SEK. ID. Č: 52; odvozená aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 53.

Příklad 21

In šitu hybridizace u myší

Distribuce myší a_d v tkáních byla určena proto, aby mohlo být provedeno její srovnání s distribucí lidské Od, popsané v Příkladu 6.

Pomocí transkripce RNA prováděné in vitro s použitím ³⁵S-UTP (Amersham) byla z templátu DNA získána jednovláknová sonda mRNA o velikosti 200 bp, odpovídající nukleotidům 3460 až 3707 v cytoplazmatické oblasti myší cDNA.

Celá myší embrya (odebrána 11 až 18 dní po oplození) a různé myší tkáně (slezina, ledvina, játra, střevo a thymus) byly in šitu hybridizovány s radioaktivně značenou jednovláknovou sondou mRNA.

Z tkání byly připraveny řezy o tloušťce 6 pm, které byly adherovány na sklíčka potažená přípravkem Vectabond (Vector Laboratories, lne., Burlingame, CA) a uloženy při teplotě -70 °C. Před použitím byla sklíčka vystavena 5 minut teplotě 50 °C. Řezy byly po dobu 20 minut při teplotě 4 °C fixovány v 4% paraformaldehydu, dehydratovány zvyšující se koncentrací ethanolu (70-95100%) (1 minutu při teplotě 4 °C pro každou koncentraci) a vysušeny na vzduchu (30 minut při pokojové teplotě). Řezy byly denaturovány 2 minuty při teplotě 70 °C v roztoku 70% formamid/2X SSC, dvakrát propláchnuty v 2X SSC a dehydratovány ethanolem (postupem popsaným výše) a 30 minut vysoušeny na vzduchu. Hybridizace byla provedena přes noc (12 až 16 hodin) při teplotě 55 °C v roztoku obsahujícím sondu značenou izotopem ³⁵S v koncentraci 6 x 10⁵ cpm na řez a vodu (vystavenou účinkům diethylpyrokarbonátu - DEPC) tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace 50% formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH=7,5), 10% dextran sulfát, IX Denhardtův roztok, 100 mM dithiothreitol (DTT) a 5 mM EDTA. Po hybridizaci byly řezy promývány 1 hodin při pokojové teplotě v 4X SSC/10 mM DTT, 40 minut při 60 °C v 50% formamidu/2X SSC/10 mM DTT, 30 minut při pokojové teplotě v 2X SSC a 30 minut při pokojové teplotě v 0,lX SSC. Řezy byly dehydratovány, po dobu 2 hodin vysoušeny na vzduchu, potaženy fotografickou emulzí Kodak NTB2, vysoušeny 2 hodiny na vzduchu, vyvolány (uchování při 4 °C v úplné tmě) a dobarveny hematoxylinem/eosinem.

-54CZ 287921 B6

Slezinná tkáň vykázala silný signál hlavně v červené pulpě. Tato distribuce signálu odpovídá distribuci tkáňových makrofágů ve slezině, ale nevylučuje přítomnost jiných typů buněk.

Příklad 22

Příprava myších expresivních konstruktů

Aby mohl být vytvořen expresivní plazmid obsahující sekvenci myší cDNA vykazující homologii k lidské a_d, byly spojeny inzerty klonů Al 160 a B3800. Před ligací byla k inzertu z klonu Al 160 přidána vedoucí („leader“) sekvence obsahující na 5' konci kodon pro iniciační methionin. Primer označený „5-PCR leader“ (SEK. ID. Č: 47) byl navržen tak, aby obsahoval: (1) identické nespecifické báze na pozicích 1 až 6 umožňující štěpení: (2) restrikční místo BamHI od pozice 7 až 12 umožňující zaklonování do expresního vektoru; (3) konzervativní Kozákovu sekvenci od pozice 13 až 18; (4) signální sekvenci obsahující kodon pro iniciační methionin (tučně v SEK. ID. Č: 47) a dalších 31 bází specificky překrývajících sekvenci na 5' konci klonu A1160, aby bylo umožněno přisednutí primeru. Kamplifikaci inzertu z klonu A1160 byl spolu sprimerem „5-PCR leader“ použit druhý primer nazvaný ,,3'-end frag“ (SEK. ID. Č: 48).

5-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3' (SEK. ID. Č: 47)

5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3'

Vzniklý PCR produkt nebyl štěpen restrikčním enzymem BamHI nejspíše proto, že před restrikčním místem byl nedostatečný počet bází, což znemožnilo rozpoznání místa enzymem. U 5'-primeru byla prodloužena délka sekvence předcházející místo pro BamHI (SEK. ID. Č: 47) a s amplifikovaným produktem první reakce byla opakována PCR reakce. 5'-primer označený mAD.5'.2 (SEK. ID. Č: 49) byl vytvořen přidáním nespecifických bází na pozici 1 až 4 a dalších 20 bází specificky překrývajících dříve použitý „5-PCR leader“ primer.

5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3'

Primery „mAD.5'.2“ a ,,3'-end frag“ byly společně použity v PCR reakci, kde byl templátem produkt z první amplifikační reakce. Vzniklý druhý PCR produkt byl zaklonován do plazmidu pCRtmII (Invitrogen), podle návodu doporučeného výrobcem, a vzniklým plazmidem byly transformovány kompetentní buňky „One shot“ (Invitrogen). Analýzou restrikčními enzymy BamHI a EcoRI byl identifikován jeden klon, který obsahoval PCR produkt, a tento klon byl sekvenován. Po ověření sekvence byl inzert vyštěpen restrikčními enzymy BamHI a EcoRI a izolován z gelu.

Inzert z klonu B3800 byl získán restrikčním štěpením enzymy EcoRI a Notl a následnou izolací z gelu. Tento inzert byl, spolu s fragmentem Al 160 rozštěpeným restrikčními enzymy BamHI/EcoRI, přidán do ligační reakce, která probíhala 14 hodin při teplotě 14 °C. K ligační reakci byl přidán vektor pcDNA.3 (Invitrogen), štěpený enzymy BamHI a Notl, a reakce pokračovala dalších 12 hodin. Z reakční směsi byl odebrán alikvot, kterým byly transformovány kompetentní buňky E. coli. Vzniklé kolonie byly namnoženy a s využitím primerů ll.b-l/2FORl a 1 l.b— 1/2REV11 (SEK. ID. Č: 50 resp. 51) byl analýzou PCR identifikován jeden pozitivní klon. Primery 1 l.b-l/2FORl a 1 l.b-l/2REVl 1 přemosťují fragmenty Al 160 a B3800, a tudíž slouží k detekci úspěšné ligace obou fragmentů (vznik PCR produktu). Sekvence pozitivního klonu byla ověřena pomocí primerů (zobrazené v SEK. ID. Č: 50 a 51), které amplifikují od báze 100 do 1405 za kodonem pro startovní methionin.

-55CZ 287921 B6

Příklad 23

Konstrukce „knockoutovaných“ myší

Aby bylo možno přesněji určit imunologickou roli proteinu kódovaného předpokládanou myší cDNA α₄, byla vytvořena „knockoutovaná“ myš, v jejíž organizmu je sekvence genomové DNA kódující homolog a_d přerušena pomocí homologní rekombinace. Na význam proteinu kódovaného porušeným genem je usuzováno z jeho nepřítomnosti. Produkce „knockoutovaných“ myší je popsána v publikaci Deng a další, Mol. Cell. Biol. 13:2134 až 2140 (1993).

Prvním krokem při produkci takových myší je konstrukce plazmidu, který v sobě obsahuje sekvence, které budou vyřazeny („knockoutovány“) homologní rekombinací. K identifikaci myší genomové sekvence kódující předpokládaný myší homolog a_d z genomové knihovny XFIXII byl použit fragment myší cDNA o velikosti 750 bází (odpovídající nukleotidům 1985 až 2733 v SEK. ID. Č: 45). Výsledkem prvního testování bylo 14 pozitivních plaků, z nichž sedm bylo potvrzeno druhým testováním. Ze dvou plaků byly získány lyzáty dávajících nejsilnější signál a λ DNA byla izolována pomocí konvenčních metod. Restrikční mapování a Southemova analýza potvrdila hodnověrnost jednoho z klonů (označený 14-1). Inzert dna byl restrikčně štěpem enzymem Notl a zaklonován do vektoru Bluescript SKII⁺.

K identifikaci restrikčního fragmentu o velikosti přibližně o velikosti 9 až 14 kb, což je délka udávaná jako optimální pro uskutečnění homologní rekombinace, byla s cDNA sondou o velikosti 750 bp provedena Southemova hybridizace. Před hybridizací byla pro klon 14-1 vytvořena restrikční mapa. Jako možný kandidát byl identifikován fragment o velikosti 12 kb, který byl zaklonován do vektoru pBluescript SKII⁺ do pozice, kde je myší DNA ohraničena kazetami kódujícími thymidin kinázu. Další analýza tohoto klonu pomocí sondy domény I (odpovídající nukleotidům 454 až 1064 v SEK. ID. Č: 45) prokázala, že tento klon neobsahuje sekvenci kódující doménu I.

Genomová knihovna lambdaFIXII byla znovu testována použitím stejné sondy domény I. Ze šesti pozitivních klonů zůstal jeden pozitivní i po druhém testování. DNA izolovaná z tohoto klonu silně reagovala při Southemově analýze se sondou domény I. Při použití původní sondy o velikosti 750 bp nebyl detekována žádná odezva, avšak bylo zjištěno, že tento klon zahrnuje nukleotidy 1985 až 2773 v 5' oblasti ze SEK. ID. Č: 45.

Neexistence hybridizace se sondou o velikosti 750 bp může také naznačovat, že tento klon je dalším členem z rodiny integrinových proteinů. Z důvodu ověření věrohodnosti tohoto vysvětlení byl inzert o velikosti 13 kb zaklonován do vektoru pBluescript SKII⁺. Při použití primerů odpovídajících nukleotidovým sekvencím 441 až 461, 591 až 612, 717 až 739 a nukleotidové sekvenci 898 až 918 v reverzní orientaci v doméně I a_d (SEK. ID. Č: 52) byla zjištěna sekvence purifikované DNA. Sekvence DNA byla získána jen při použití prvního primeru (441 až 461), a účinně amplifikován byl pouze exon nacházející se nejblíže 5' konci sekvence domény I. Amplifikace zbytku domény I neproběhla. Výsledný klon tedy obsahuje exon šest genu myšího a_d a sekvence intronů přilehlých ke 3' a 5' konci tohoto exonu. Exon 7 nebyl v tomto klonu přítomen. Po sekvenování byl vytvořen konstrukt obsahující gen pro rezistenci na neomycin a gen pro thymidin kinázu.

Gen pro rezistenci na neomycin (neo^r) byl vnesen do plazmidu způsobem, který přerušil sekvenci genomové myší DNA kódující protein. Vzniklý plazmid tedy obsahuje gen neo^r uvnitř sekvencí myší genomové DNA, a to vše je uvnitř oblasti kódující thymidin kinázu. Takto zkonstruovaný plazmid je vyžadován proto, aby byla upřednostněna homologní rekombinace před náhodnou rekombinací [Chisaka a další, Nátuře 355:516 až 520 (1992)].

-56CZ 287921 B6

Příklad 24

Klonová králičí a_d - Vytvoření a testování králičí cDNA knihovny

Nalezení lidských homolog a_d v organizmu potkanů a myší vedlo k výzkumům existence králičího homologu, který by mohl být užitečný v králičích modelech lidských nemocí popsaných níže.

Pomocí kitu FastTrack firmy Invitrogen (San Diego, CA), podle návodu uvedeného výrobcem, ío a reakčních činidel dodaných v kitu byla z celé králičí sleziny připravena poly-A⁺ RNA. Z 1,65 g tkáně bylo izolováno 73 pg poly-A⁺ RNA. Tato RNA z králičí sleziny byla použita ke konstrukci cDNA knihovny ZAP Express s využitím kitu od firmy Stratagene (La Jolla, CA). Získaná cDNA byla směrově zaklonována do restrikčních míst EcoRI a Xhol v lambda ramenech fágmidového vektoru pBK-CMV. K zabalení lambda ramen do fágových částic byl použit kit „Gigapack II 15 Gold“ (Stratagene). Titr vzniklé knihovny byl odhadnut na přibližně 8 x 10⁵ částic, s inzertem o průměrné velikosti 1,2 kb.

Knihovna byla jedenkrát amplifikována tak, aby narostlé plaky byly konfluentní a buněčný lyzát byl sebrán. Namnožená knihovna transformovaná do E. colí byla vyseta v koncentraci 20 30 000 pfu/miska (průměr 150 mm) a vzniklá směs byla inkubována 12 až 16 hodin při teplotě °C, aby došlo k vytvoření plaků. Fágové DNA byly přeneseny na nylonové membrány Hybond N⁺ (Amersham, Arlington Heights, lllinois). Membrány byly hybridizovány se směsí dvou radioaktivně značených sond myší a_d PCR DNA připravených pomocí primerů o náhodné sekvenci. První sonda byla získána z PCR produktu, který zahrnuje nukleotidy 149 až 946 25 v SEK. ID. Č: 52. Druhá sonda byla získána z PCR produktu, který zahrnuje nukleotidy 2752 až

3651 v SEK. ID. Č: 52. Sondy byly za použití kitu „Random Prime Labelling kit“ firmy Boehringer Mannheim, postupem doporučeným výrobcem, radioaktivně označeny, a reakční směs byla nanesena na kolonu Sephadex G-50, aby byly odstraněny nezainkorporované nukleotidy. Hybridizační roztok se skládal z 5X SSPE, 5X Denhardtsova činidla, 1% SDS, 40% formamidu 30 a ze značených sond v koncentraci 1 x 10⁶ dpm/ml. Hybridizace probíhala po dobu 16 až hodin při teplotě 42 °C. Membrány byly intenzívně promyty v 2X SSPE/0,1% SDS při pokojové teplotě a exponovány na rentgenový film, aby došlo k vizualizaci všech hybridizovaných plaků.

Byly identifikovány dva klony, které vykázaly vysoký stupeň sekvenční homologie se sekvencí lidské a_d. Klon #2 byl přibližně 800 bp dlouhý a mapoval 5' konec lidské a_d. Klon #2 obsahuje kodon pro startovní methionin a kompletní vedoucí sekvencí. Klon #7 byl přibližně 1,5 kb dlouhý a zahrnuje kodon pro startovní methionin. 5' konec klonu #7 překrýval klon #2, zatímco sekvence na 3' koncích končily v místech za sekvencemi domény I. Klon #7 byl kompletně osekvenován 40 pomocí sekvenační metody „primer-walking“. Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence klonu #7 jsou zobrazeny v SEK. ID. Č: 100 resp. 101.

Předpovězená N-koncová aminokyselinová sekvence pro králičí a_d, jak byla určena z klonů #2 a #7, naznačila, že tento protein je ze 73% identický s lidským a_d, ze 65% identický s myší a_d a z 45 5 8% identický s myší CD1 lb, lidským CD1 lb a lidským CD1 lc. Nukleotidová sekvence klonu #2 je zobrazena v SEK. ID. Č: 92; předpovězená aminokyselinová sekvence je zobrazena v SEK. ID. Č: 93.

S využitím radioaktivně značeného králičího klonu #7 a opětného testování cDNA knihovny, ze 50 které tento fragment pocházel, byl proveden pokus o získání nezkrácené cDNA kódující králičí a_d. Bylo identifikováno dalších 25 klonů a nejdelší byl klon označený jako #49. S využitím techniky síťových delecí byla zjištěna kompletní sekvence klonu #49. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence klonu #49 jsou zobrazeny v SEK. ID. Č: 102 resp. 103. Jelikož se klony #7 a #49 nepřekrývají, byly navrženy oligonukleotidy, které by mohly být použity jako primeiy při

-57CZ 287921 B6

PCR s prvním řetězcem králičí slezinné cDNA; cílem tohoto postupu je izolace chybějící sekvence.

Vztah mezi předpokládanými aminokyselinovými sekvencemi těchto dvou neúplných klonů a ostatních leukointegrinů je popsán v Tabulce 1.

Tabulka 1

Procento shody v aminokyselinové sekvenci u členů rodiny integrinů β₂

	Lidská a_d	Králičí #7	Králičí #49
Lidská a_d	100	74	80
Myší Od	70	67	74
Potkaní a_d	70	66	73
Myší CDlla	náhodná*	28	28
MyšíCDlln	55	59	53
Lidská CDlla	36	28	28
Lidská CDllb	60	58	55
Lidská CDllc	66	59	62

* je-li shoda < 25%, považuje se tato shoda za náhodnou

Izolace klonu králičí a_d umožňuje expresi proteinu, a to buď na povrchu transfekovaných buněk nebo ve formě rozpustného nezkráceného nebo zkráceného proteinu. Získaný protein je následně použit jako immunogen pro produkci monoklonálních protilátek, které najdou uplatnění v králičích modelech lidských chorob.

Příklad 25

Živočišné modely pro určení terapeutické využitelnosti a_d

Imunohistologická data získaná u psů a in šitu hybridizace u potkanů a myší určila, že a_d je exprimován hlavně makrofágy přítomnými v červené pulpě sleziny. V mízních uzlinách byl a_dnalezen v kapilárách a dutinách ve dřeni. Distribuce polypeptidu a<i je značně podobná distribuci, která byla získána pro dva myší antigeny rozpoznávané monoklonálními protilátkami F4/80 a SK39. Zatímco biochemická charakterizace těchto myších antigenů ukázala jejich odlišnost od a<j, je velmi pravděpodobné, že a_d určuje stejnou subpopulací makrofágů jako myší antigeny F4/80 a SK39.

U myší byl zjištěn výskyt SK39⁺ makrofágů v červené pulpě sleziny, kde se nejspíše účastní odstraňování cizorodého materiálu z oběhu, a v dřeni mízních uzlin [Jutila a další, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993)]. SK39⁺ makrofágy byly pozorovány také v místech akutního a chronického zánětu. Navíc monocyty infiltrované v dutinách peritonea, ve kteiých byl zánět vyvolán působením thioglykolátu, také exprimují antigen SK39. Souhrnem tyto výsledky naznačují, že jestliže jsou SK39⁺ buňky také a_d pozitivní, pak jsou tyto buňky odpovědné za odstranění cizorodého materiálu ve slezině a účastní se při zánětech, kde hrají makrofágy důležitou roli.

Zatímco funkce a_d zůstává neznámá, jiné mnohem lépe charakterizované integriny β₂ se účastní celé řady adhezních dějů, které usnadňují migraci buněk, posilují fagocytózu a podporují mezibuněčné interakce. Všechny tyto události vedou k urychlení zánětlivých dějů. Proto je velmi pravděpodobné, že ovlivnění normální funkce clí může současně narušit průběh zánětu, kde hrají makrofágy důležitou roli. Takový protizánětlivý účinek by mohl být výsledkem: a) zamezení

-58CZ 287921 B6 infiltrace makrofágů do míst zánětů; b) zamezení aktivace makrofágů v místě zánětu nebo c) rušení účinku efektorových funkcí makrofágů, které poškozují zdravou hostitelskou tkáň buď specifickou autoimunitní reakcí nebo následkem poškozování okolních buněk.

Mezi nemoce, u kterých existují důkazy o tom, že zde makrofágy hrají důležitou roli, patří roztroušená skleróza, artritida, arterioskleróza štěpu, některé formy diabetů a zánětlivé střevní onemocnění. U živočišných modelů, diskutovaných níže, bylo prokázáno, že tyto modely reprodukují mnoho lysů zmíněných lidských poruch. Aby bylo možno určit, zda-li existuje možnost léčby odpovídajících nemocí u lidí, byly na těchto modelových systémech testovány inhibitory funkce a<j.

A. Arterioskleróza štěpu

Transplantace srdce je nyní, u některých typů srdečních chorob v konečném stádiu, přijímanou formou lékařského zákroku. Používání cyklosporinu A zvýšilo počet přeživších první rok po transplantaci na 80 %, avšak rozvoj progresivní formy arteriosklerózy štěpu se projevil jako nejčastější příčina smrti u osob po prvním roce po transplantaci srdce. Nedávné studie prokázaly u 36 až 44 % případů výskyt arteriosklerózy štěpu v období tří let po transplantaci srdce [Adams a další, Transplantation 53:1115 až 1119 (1992); Adams a další, Transplantation 56:794 až 799 (1993)].

U arteriosklerózy štěpu se typicky vyskytují difuzní, okluzní a intimální léze, které postihují celou stěnu věnčitých cév. V těchto lézích dochází často k ukládání lipidů. Patogeneze arteriosklerózy štěpu zůstává neznámá, avšak pravděpodobně je spojená s histokompatibilitní odlišností mezi dárcem a příjemcem, a je ve své podstatě vyvolaná činností imunitního systému. Z histologického hlediska jsou oblasti, ve kterých dochází ke ztlušťování vnitřní cévní stěny, tvořeny především makrofágy, i když je zde občas pozorována i přítomnost T-buněk. Je proto možné, že makrofágy exprimující a_d, hrají při indukci a/nebo rozvoji arteriosklerózy štěpu důležitou roli. V takových případech by osobám s transplantovaným srdcem, u nichž existuje riziko rozvinutí arteriosklerózy štěpu, mohly být preventivně podávány monoklonální protilátky nebo nízkomolekulámí inhibitory funkce a_d (například rozpustný ICAM-R).

Ačkoliv arterioskleróza štěpu představuje největší ohrožení života pro pacienty s transplantovaným srdcem, byl výskyt arteriosklerózy štěpu pozorován rovněž u pacientů s jinými transplantovanými orgány včetně jater a ledvin. Terapeutické použití látek blokujících funkci a_d by mohlo zabránit vzniku arteriosklerózy štěpu u osob s jinými transplantovanými orgány a snížit komplikace vyplývající ze selhání transplantovaného orgánu.

Jeden model pro arteriosklerózu štěpu u potkanů zahrnuje heterotypické srdeční alloštěpy transplantované přes menší histokompatibilní bariéry. Když jsou srdeční alloštěpy z potkanů Lewis transplantovány do organizmu příjemců F-344, vyznačujících se vzhledem k dárcům kompatibilitou MHC glykoproteinů I. a II. třídy, 80 % alloštěpů přežívá alespoň 3 týdny a 25 % alloštěpů přežívá neomezeně dlouhou dobu. Při tomto velmi nízkém počtu odmítnutých štěpů se v srdci dárce vytvářejí arteriosklerotické léze. Arteriální léze valloštěpech starých 120 dní obvykle vykazují typické difúzní fibrotické ztluštění vnitřní stěny cévy, které je na pohled nerozlišitelné od lézí v arteriosklerotických štěpech pozorovaných u odmítnutých lidských srdečních alloštěpů.

Potkanům jsou trans transplantována srdce, která se v méně důležitých histokompatibilních antigenech liší od genotypu příjemce. Takovým příkladem jsou transplantace z potkanů Lewis do potkanů F-344. Příjemcům transplantátů jsou pravidelně podávány monoklonální protilátky specifické proti potkanímu a_d nebo nízkomolekulámí inhibitory a_d. Očekává se, že tato léčba sníží incidenci arteriosklerózy štěpu v neodvržených srdcích dárců. Léčba potkanů pomocí monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulámích inhibitorů nemusí být omezena pouze na

-59CZ 287921 B6 prevenci. Očekává se rovněž, že zablokování funkce α,ι poyede ke zmírnění zánětů zprostředkovaného makrofágy a umožní zvrat poškození artérií v transplantátu.

B. Arterioskleróza u králíků krmených cholesterolem

U králíků, kteří byli, po dobu přibližně 12 až 16 týdnů, krmeni aterogenní dietou s přídavkem cholesterolu, došlo ke vzniku lézí na vnitřní straně cév, a tyto léze pokrývaly většinu lumenálního povrchu vzestupného úseku aorty [Rosenfeld a další, Arteriosclerosis 7:9 až 23 (1987); Rosenfeld a další, Arteriosclerosis 7:24 až 34 (1987)]. Aterosklerotické léze pozorované u těchto králíků jsou mírnější než tytéž u lidí. V těchto lézích je přítomen velký počet T-buněk, z nichž většina exprimuje CD45RO, který je markérem paměťových T-lymfocytů. Přibližně polovina z infiltrovaných T-buněk exprimuje antigen MHC Π. třídy a některé exprimují receptor pro IL-2, což naznačuje, že mnohé z těchto buněk se nacházejí v aktivovaném stavu.

Jedním z rysů aterosklerotických lézí pozorovaných u králíků krmených cholesterolem, který se ale zřejmě nevyskytuje u hlodavčích modelů, je akumulace lézí bohatých na přítomnost pěnových buněk. Předpokládá se, že vznik pěnových buněk (makrofágy) je důsledkem příjmu oxidovaných lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) prostřednictvím specifických receptorů. Bylo zjištěno, že oxidované částice LDL jsou toxické pro některé typy buněk včetně endotheliálních buněk a buněk hladké svaloviny. Příjem těchto potenciálně toxických oxidovaných částic LDL makrofágy slouží jako iritant a pomáhá aktivovat makrofágy, což přispívá k vytvoření zánětů doprovázejících výskyt aterosklerotických lézí.

Jakmile byly připraveny monoklonální protilátky proti králičí a_d, začala léčba králíků krmených cholesterolem. Léčba zahrnovala podávání monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulámích inhibitorů, aby bylo prokázáno, že a_d ⁺ makrofágy se účastní těchto procesů během onemocnění. Dodatečné studie by ukázaly, že monoklonální protilátky proti a_d nebo nízkomolekulámí inhibitory mohou zvrátit cévní poškození detekované u králíků během aterogenní diety.

C. Inzulin-dependetní diabetes

U potkanů BB se inzulin-dependetní diabetes samovolně vyvinul v období mezi 70. až 150. dnem života. Pomocí imunohistochemických analýz byla již v ranném stádiu nemoci pozorována v Langerhansových ostrůvcích přítomnost infiltrovaných MHC II⁺ a ED1⁺ makrofágů. Mnoho makrofágů se zdá být zaměstnáno fagocytózou buněčných trosek nebo normálních buněk. S postupem nemoci je pozorován stále se zvětšující počet makrofágů infiltrujících Langerhansovy ostrůvky, a rovněž se zdá, že se do tohoto místa soustředí velké množství T-buněk a později také B-buněk [Hanenberg a další, Diabetologia 32:126 až 134 (1989)].

Rozvoj cukrovky u potkanů BB se zdá být závislý, jak na časné infiltraci makrofágů, tak na následném soustřeďování T-buněk. Léčba potkanů BB pomocí částic oxidu křemičitého, které jsou pro makrofágy toxické, byla účinná tím, že zabránila infiltraci makrofágů do Langerhansových ostrůvků včasném stádiu nemoci. Bez časné infiltrace makrofágů nenastává následné poškození tkáně autoagresivní populací lymfocytů. Podávání monoklonální protilátky OX-19 (specifické proti potkanímu CD5) nebo monoklonální protilátky OX-8 (specifické proti potkanímu CD8), které blokují fázi nemoce spojenou sT-buňkami, je rovněž účinné při potlačení rozvoje diabetů.

Centrální role kterou mají makrofágy v patologii tohoto modelu, činí tento model atraktivní pro testování inhibitorů funkce a_d. Potkani geneticky predisponovaní k rozvinutí inzulin-dependetního diabetů jsou léčeni monoklonálními protilátkami proti a_d nebo nízkomolekulámími inhibitory,

-60CZ 287921 B6 a je u nich vyhodnocován vývoj onemocnění. Zabránění nebo oddálení nástupu nemoci je důkazem, že a_d hraje klíčovou roli v poškození buněk ostrůvků způsobeném makrofágy.

D. Zánětlivé střevní onemocnění (Crohnova choroba, vředovitá kolitida)

Živočišné modely, použité při studiu zánětlivého střevního onemocnění (IBD- inflammatoiy bowel disease), jsou zpravidla vystaveny intrarektálnímu podávání škodlivých dráždidel (například kyselina octová nebo kyselina trinitrobenzensulfonová/ethanol). Zánět tračníku vyvolaný těmito látkami je výsledkem chemického nebo metabolického poškození a postrádá chronický a spontánně recidivní charakter, doprovázející lidské zánětlivé střevní onemocnění. Nicméně se zdá, že nedávno popsaný model využívající subserózní injekce purifikovaného polymeru peptidoglykan-polysacharid (PG-PS) získaného ze streptokoků skupiny A nebo skupiny D, poskytuje lepší, fyziologicky relevantní model pro lidské IBD [Yamada a další, Gastroenterology 104:759 až 771 (1993)].

V tomto modelu je PG-PS aplikován do subserózní vrstvy distálního tračníku. Vyvolaná zánětlivá odezva má dvě fáze, první akutní fázi tři dny po injekci, která je následována spontánní chronickou fází o tři až čtyři týdny později. Odezva pozdní fáze je ve své podstatě granulomatózní a vede ke ztluštění tračníku, adhezím, ke vzniku uzlíků a mukózních lézí. Kromě poškození sliznice vede kolitida (vyvolaná PG-PS) často k artritidě, anémii a granulomatózní hepatitidě. Extraintestinální projevy nemoci činí model atraktivní pro studium Crohnovy kolitidy, proto, že velké množství pacientů s rozvinutou Crohnovou chorobou trpící záněty kloubů a hepatobiliámími záněty.

Vznik granulomatózních lézí je důsledkem chronického zánětu, který vede k infiltraci a následné aktivaci buněk z linie monocyty/makrofágy. Výskyt granulomatózních lézí u Crohnovy choroby a u výše zmíněného živočišného modelu, Činí z tohoto modelu atraktivní klinický cíl pro monoklonální protilátky namířené proti a_d a pro jiné inhibitory funkce a_d. U inhibitorů funkce a_dse očekává zamezení tvorby lézí doprovázejících IBD či dokonce zvrat v tkáňových poškozeních vyskytujících se u této nemoci.

E. Artritida

Zdá se, že artritida je multifaktoriální onemocnění, kterého se účastní různé typy buněk zánětu, včetně neutrofilů, T-lymfocytů a fagocytámích makrofágů. Ačkoli existuje celá řada modelů artritidy, aplikace proteoglykanu získaného z buněčné stěny streptokoků způsobuje poruchu nejvíce podobnou lidskému onemocnění.

V organizmu potkanů vyvolává buněčná stěna streptokoků zánět periferních kloubů, který je charakterizován opakovanými záchvaty postupujícího onemocnění následovanými remisemi a nakonec, během několika měsíců, končí destrukcí kloubu [Cromartie a další, J. Exp. Med. 146:1585 až 1602 (1977); Schwab a další, Infection and Immunity 59:4436 až 4442 (1991)]. Předpokládá se, že největší roli v destrukci synovie hrají během chronické fáze onemocnění mononukleámí fagocyty a makrofágy. Mimoto látky potlačující infiltraci makrofágů do synovie účinně snižují zánětlivé a patologické charakteristiky artritidy.

Centrální role makrofágů při destrukci synovie vedoucí k artritidě naznačuje, že monoklonální protilátky proti a_d a inhibitory funkce a_d mohou být při léčbě tohoto onemocnění terapeuticky účinné. Stejně jako u výše popsaných modelů se předpokládá, že tyto monoklonální protilátky a nízkomolekulámí inhibitory podávané preventivně zablokují nebo zmírní kloubní zánět a zabrání zničení synovie. Látky mající rušivý vliv na funkci a_d mohou rovněž zmírnit probíhající zánět tím, že zabrání infiltraci dalších makrofágů ke kloubu a zablokují aktivaci makrofágů. Výsledným efektem by byl zvrat postupující destrukce kloubu a usnadnění uzdravení tkáně.

-61CZ 287921 B6

F. Roztroušená skleróza

Ačkoli patogeneze roztroušené sklerózy (MS) zůstává nejasná, je všeobecně přijímáno, že onemocnění je zprostředkováno CD4⁺ T-buňkami, které rozpoznávají autoantigeny přítomné v centrálním nervovém systému a zahajují tak zánětlivou kaskádu. Vzniklá imunitní odezva má za následek infiltrací dalších buněk zánětu, včetně aktivovaných makrofágů, které přispívají k rozvoji onemocnění. Živočišný model experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) reprodukuje některé aspekty onemocnění MS. Nedávno bylo prokázáno, že monoklonální protilátky reagující sCDllb/CD18 přítomnými na makrofázích způsobujících zánět [Huitinga a další, Eur. J. Immunol. 23:709 až 715 (1993)] blokují jak klinické, tak histologické příznaky onemocnění. Výsledky napovídají, že monoklonální protilátky nebo nízkomolekulámí inhibitory polypeptidu a_d jsou pravděpodobně u onemocnění EAE účinné v blokování zánětlivé reakce. Tyto látky mají tedy důležité terapeutické uplatnění při léčbě MS.

G. Alveolitida vyvolaná imunitním komplexem (Immune Complex Alveolitis)

Alveolámí makrofágy lokalizované v alveolámích sklípcích, kanálcích, pojivové tkáni a pohrudničních dutinách plic, představují první obrannou linii plic proti látkám vdechovaným z okolního prostředí. Jako odezvu na stimulaci látkami (bakteriální lipopolysacharid, interferon IFN-γ a imunitní komplex) produkují alveolámí makrofágy celou řadu silných mediátorů zánětu, včetně velmi reaktivních kyslíkových radikálů a dusíkatých meziproduktů. Zatímco hyperoxidové anionty, peroxidy vodíku a oxidy dusíku (NO·) mají důležitou funkci při ničení patogenů a lýzi nádorů, mohou tyto látky ve zdravých tkáních způsobit jejich poškození.

U potkaního modelu alveolitidy vyvolané imunitním komplexem bylo prokázáno, že produkce' NO· alveolámími makrofágy způsobuje mnoho z poškození plic [Mulligan a další, Proč. NatE Acad. Sci. (USA) 88:638 až 6342 (1991)]. Radikály NO· vykonávají funkci mediátorů i u jiných poškození spojených s imunitním komplexem, včetně dermální vaskulitidy [Mulligan a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88:638 až 6342 (1991)], a mohly by potenciálně hrát roli u nemocí jako je například glomerulonefritida.

Poškození způsobená NO· nejsou omezena jen na záněty s účastí imunitního komplexu. Například mikrogliální buňky stimulované látkami jako je PMA, LPS nebo IFN-γ, produkují NO· v množství schopném usmrtit oligodendrocyty [Merrill a další, Immunol. 151:2132 (1993)]. Bylo zjištěno, že pankreatické ostrůvky jsou citlivé k radikálům NO· a uvolňování tohoto mediátorů makrofágy způsobilo poškozování tkání, které vedlo k diabetů [Kroncke a další, BBRC 175:752 až 758 (1991)]. Nedávno bylo přesvědčivě dokázáno, že produkce NO· hraje roli u endotoxického šoku [MacMicking a další, Cell 81:641 až 650 (1995)]. Když byl aplikován lipopolysacharid (LPS) zdravým myším divokého typu, byl pozorován vážný progresivní pokles tepenného tlaku končící smrtí. U myší, u nichž nelze indukovat tvorbu NO·, byl, v reakci na přítomnost LPS, pozorován mnohem menší pokles tepenného tlaku a všechny myši tento experiment přežily.

Pokusy prováděné in vitro prokázaly, že zablokování a_d je účinné při potlačení některých aspektů aktivace makrofágů (nebo obecně leukocytů exprimujících a_d), včetně uvolňování NO·. Alveolámí makrofágy stimulované za přítomnosti polyklonálního séra proti a_d (proti potkaní doméně I polypeptidu a_d, připravené v králících) produkovaly podstatně méně dusitan/dusičnanových produktů při odbourávání NO·, než makrofágy vystavené působení kontrolního séra. Tato zjištění dokazují, že monoklonální protilátky namířené proti a_d, konkrétně proti I-doméně, mohou být účinnými protizánětlivými činidly s možným využitím u MS, diabetů, zánětu plic a endotoxického šoku. Navíc, v protikladu k CD 18 podjednotce, která ovlivňuje funkci celé řady typů leukocytů, omezená distribuce a_d činí z této podjednotky mnohem atraktivnější cíl (než je tomu u CD 18) pro blokování aktivace makrofágů (nebo obecně leukocytů exprimujících a_d).

-62CZ 287921 B6

Alveolitida vyvolaná potkaním IgG imunitním komplexem je obecně používaný experimentální model důležitý pro porozumění akutnímu poranění plic. Toto poranění je vyvoláno nakapáním protilátek namířených proti hovězímu sérovému albuminu (BSA) do plic pomocí tracheální kanyly, následovaným intravenózní injekcí BSA. Zformování imunitních komplexů v plicních kapilárách vede k aktivaci komplementu a infiltraci neutrofilů do plic. Podle všeho, po zformování imunitních komplexů v plicích, dojde k extravazaci leukocytů z krve a následnému pohybu leukocytů přes plicní epitel. Následné uvolnění mediátorů včetně radikálů, TNF-α a NO· zaktivovaných endoteliálních buněk, neutrofilů a makrofágů, přispívá kpostupu onemocnění. Patologické rysy onemocnění zahrnují zvětšení vaskulámí permeability vedoucí k otokům a přítomnosti velkého počtu erytrocytů a polymorfonukleámích buněk v alveolámích dutinách.

Polyklonální sérum specifické proti doméně I polypeptidu a_d bylo testováno na potkaním modelu alveolitidy vyvolané imunitním komplexem. Toto polyklonální sérum bylo aplikováno do plic tracheální kanylou spolu s protilátkami proti BSA. Poranění plic bylo následně vyvoláno intravenózní aplikací BSA se stopovým množstvím BSA značeného izotopem ¹²⁵I (přibližně 800 000cpm), aby mohl být kvantifikován otok vzniklý poraněním plic. Plicní poranění probíhalo další 4 hodiny a velikost poranění byla vyhodnocena z hodnoty plicní permeability, která je definována jako poměr BSA značeného izotopem ¹²⁵I v plicích ku jeho množství přítomném v krvi. Typické hodnoty plicní permeability pro pozitivní kontrolu leží mezi 0,6 až 0,8, zatímco negativní kontroly (potkany, které nedostaly BSA) mají hodnoty plicní permeability v rozsahu 0,1 až 0,2.

První studie dokázaly, že při léčbě pomocí polyklonálního séra proti a_d se snižuje permeabilita plic o více než 50 %, což představuje dramatické zmírnění plicního poranění. Z historie je známé snížení permeability plic o 60 %, kterého bylo dosaženo podáváním protilátek proti CD18. Tato zjištění dokazují, že a_d může být nejdůležitější integrin β₂ během akutního poranění plic, ačkoli nemůže být přesně určeno, jestli účinek protilátek zabraňuje extravazaci leukocytů z krve nebo pohybu leukocytů přes plicní epitel.

Dalším důkazem skutečnosti, že polypeptid a_d zmírňuje průběh poranění plic, bylo stanovení hladiny TNF-α v kapalině získané výplachem jejich bronchoalveolámí části. Při podáváním protilátek proti a_d byl zjištěn čtyřnásobný pokles hladiny TNF-α. TNF-alfa byl již dlouho považován za důležitý mediátor u akutního zánětu plic a látku odpovědnou za infiltraci buněk zánětu do míst zánětu, aktivaci buněk a poškození tkání. Sérum namířené proti a<j pravděpodobně blokuje aktivaci rezidentních alveolámích makrofágů během vzniku alveolitidy vyvolané imunitním komplexem, a tím zmírňuje uvolňování TNF-alfa a NO· a snižuje následné poškození tkání způsobené těmito látkami a infiltraci neutrofilů.

Příklad 26

Exprese a_d v preklinických modelech

Aby mohla být stanovena rozdílná exprese a_d v různých stádiích onemocnění, byly řezy tkání z živočišných modelů onemocnění značeny polyklonálním sérem proti a_d získaný, postupem popsaným výše (viz Příklad 18). Tkáně ze zdravých a nemocných potkanů byly rozřezány na tloušťku 6 pm a vysušeny na vzduchu na podložních sklíčkách Superfrost Plus (VWR Scientific) přes noc při pokojové teplotě. Po vysušení byly řezy až do použití skladovány při teplotě -70 °C. Před použitím byla sklíčka přeložena z -70 °C na přibližně 5 minut do 50 °C. Řezy byly po dobu 10 minut při pokojové teplotě fixovány studeným acetonem (4 °C) (Stephens Scientific) a ponechány schnout při pokojové teplotě. Každý řez byl, po dobu 30 minut při pokojové teplotě, blokován 150 μΐ roztoku o složení 30% normální potkaní sérum (Harlan Bioproducts), 5% normální kozí sérum (Vector Laboratories) a 1% hovězí sérum (BSA) (Sigma Chemical Company) v IX TBS, a následně byl roztok z řezů jemně odsát. Králičí polyklonální sérum

-63CZ 287921 B6 (koncentrace proteinu 34 pg/ml) a sérum ze stejného králíka (získané před imunizací) (koncentrace proteinu 38,5 pg/ml) bylo zředěno v blokovacím roztoku. Ke každému řezu bylo poté, na dobu 30 minut při teplotě 37 °C, přidáno 100 μΐ jednotlivého séra. Roztok protilátek byl poté odsán a nenavázané protilátky odstraněny trojnásobným promytím v IX TBS vždy po dobu 5 minut. Po posledním promytí byl nadbytek TBS odstraněn odsátím. Biotinylovaná kozí protilátka namířená proti králičím Ig byla připravena s využitím kitu „Elitě Rabbit lgG Vectastain ABC“ (Vector), podle návodu doporučeného výrobcem, a 100 μΐ výsledného roztoku bylo naneseno na každý řez ňa 15 minut při teplotě 37 °C. Sklíčka byla dvakrát promývána v IX TBS, vždy po dobu 5 minut. Potom bylo na tkáňové řezy naneseno 100 μΐ konjugátu streptavidin-zlato (Goldmark Biologicals) ředěného v poměru 1:100 v 5% normálním potkaním séru a 1% BSA, a tento roztok byl ponechán působit 1 hodinu při pokojové teplotě. Sklíčka byla třikrát promývána pufrem TBS, vždy po dobu 5 minut, a následně na ně bylo, na 5 minut při pokojové teplotě, naneseno 100 μΐ 1% glutaraldehydu (Sigma) v TBS pufru. Sklíčka byla opět třikrát promývána v TBS, vždy po dobu 5 minut, a pětkrát ve sterilní deionizované vodě, vždy po dobu 3 minut. Přebytek kapalin byl odsát a na každý řez byly naneseny dvě kapky stříbrného zesilujícího roztoku a dvě kapky iniciačního roztoku (Goldmark Biologicals). Reakce byla ponechána probíhat 20 až 30 minut při pokojové teplotě. Poté byly řezy důkladně opláchnuty sterilní deionizovanou vodou, vysušeny přes noc při pokojové teplotě na vzduchu a překryty Cytoseal 60 (VWR). Jako kontrola byly, při stejných pokusech a podle stejného protokolu, použity řezy tkání značené monoklonálními protilátkami rozpoznávajícími CD1 la, CD1 lb, CD1 lc a CD18.

Značení polyklonálním sérem proti a_d a značení monoklonálními protilátkami proti CDlla, CD1 lb, CD1 lc a CD18 odhalilo u a_d, ve srovnání s distribucí pozorovanou u jiných podjednotek a, odlišnou distribuci značky.

V normální plicní tkáni byla exprese a<i detekována na respiračním epitelu průdušek (avšak ne na epitelu plicních sklípků) a na jednotlivých buňkách, což by mohly být alveolámí makrofágy ve vzduchových kanálcích. Signál pozorovaný při značené pomocí polyklonálního séra byl podstatně silnější než signál pozadí, pozorovaný při kontrole prováděné se sérem získaným před imunizací. V plicní granulomatózní tkáni, byl, 24 a 96 hodin po aplikaci glykanu, detekován odlišný signál, kdy se a_d značení objevilo v respiračním epitelu uvnitř plicních sklípků a silnější signál byl zaznamenán na alveolámích makrofázích uvnitř vzduchových kanálků. V plicní tkáni živočichů podle všeho zotavených z onemocnění (usmrcených 16 dní po aplikaci glykanu), nebyl pozorován žádný signál při značení protilátkou proti a_d. U každé z těchto tkání byl detekován, při značení pomocí séra získaného před imunizací, velmi slabý signál pozadí.

Při použití potkaní plicní tkáně v modelu astma vyvolaného antigenem byl, v respiračním epitelu jak průdušek, tak plicních sklípků, detekován velmi silný signál protilátky namířené proti a_d. Intenzita tohoto signálu byla podstatně vyšší než úroveň signálu pozadí získaná při použití kontrolního séra z neimunizovaného živočicha.

Je možné předpokládat, že odborníky napadnou další četné modifikace a variace vynálezu vysvětleného ve výše uvedených ilustrativních příkladech. Proto by pro vynález měla platit pouze ta omezení, která jsou uvedena v připojených patentových nárocích.

-64CZ 287921 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Gallatin, W. Michael

Van der Vieren, Monica (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Nová alfa podjednotka lidského integrinu β₂ (iii) POČET SEKVENCÍ: 103 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE: Národní 32 (C) MĚSTO: Praha 1 (D) STÁT: Česká Republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.25 (vi) DAT O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/173497 (B) DATUM PODÁNÍ: 23. Prosince 1993 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/286889 (B) DATUM PODÁNÍ: 5. Října 1994 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/362652 (B) DATUM PODÁNÍ: 21. Prosince 1994 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: GOWSHALL, Jonathan Vallance (B) ČÍSLO SPISU: PÍ 1779SK-JGV/smt (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON:

(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.: 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3726 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

-65CZ 287921 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 3..3485 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:l:

TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47

Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His

10 15

GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT

ACG ATC

TTC CAG GAG GAT GCA

95

Gly Phe Asn Leu Asp

Val

Glu

Pro

Thr 25

Ile

Phe Gin

Glu

Asp 30

Ala

20

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC

GTG

CAG

TTC

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

143

Gly Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG

GTG

GCG

GCC

AAC

CAG

ACG

GGA

CGG

CTG

191

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC

GGC

ATG

TGC

CAG

CCC

ATC

CCG

CTG

CAC

239

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

65

70

75

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

TTG

GGC

CTG

ACC

CTG

GCA

GCC

287

Ile

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

80

85

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG

GCC

TGT

GGC

CCG

ACC

CTG

CAC

AGA

335

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA

AAG

GGT

TCC

TGC

CTC

CTG

GGC

383

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

TCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA

GTC

CCC

GAC

GCC

ACG

CCA

GAG

TGT

431

Ser

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

CCA

CAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATC

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGA

AGC

479

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

ATT

GAC

CAA

AAT

GAC

TTT

AAC

CAG

ATG

AAG

GGC

TTT

GTC

CAA

GCT

GTC

527

Ile

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

160

165

170

175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC

ACC

CTG

TTT

GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

575

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

TTC

ACC

TTC

ACC

CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

623

Ser

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

-66CZ 287921 B6

CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG

671

Pro Ser Gin Gin Ser

Leu Val

Asp 215

Pro

Ile

Val

Gin

Leu 220

Lys

Gly Leu

210

ACG

TTC

ACG

GCC

ACG

GGC

ATC

CTG

ACA

GTG

ACA

CAG

CTA

TTT

CAT

719

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

CAT

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATT

GTC

ATC

767

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

240

245

250

255

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

GAA

TAC

AGT

GAT

GTC

ATC

815

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

260

265

270

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC

CGC

TAC

GCT

ATC

GGG

GTG

GGA

863

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

911

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

959

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

AAG

ATC

TAT

GCA

GTT

GAG

1007

Leu

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

320

325

330

335

GGA

ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

TCC

TTC

CAG

CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1055

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA

ATG

GAT

GGC

CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1103

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

CTG

TAT

CCC

CCA

AAT

1151

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1199

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GAG

CTA

GCC

CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1247

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

400

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC

CGC

TAC

CAG

CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1295

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly Lys

Ala

420

425

430

GTC

ATC

TTC

ACC

CAG

GTG

TCC

AGG

CAA

TGG

AGG

AAG

GCC

GAA

GTC

1343

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

-67CZ 287921 B6

ACA GGG ACG

CAG Gin

ATC Ile

GGC Gly

TCC Ser

TAC TTC GGG GCC TCC CTC TGC TCC GTG

Thr Gly

Thr 450

Tyr Phe 455

Gly Ala

Ser

Leu Cys Ser Val 460

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

CCC

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

480

485

490

495

CCT

AGG

GGG

CAG

AGG

GTG

CAG

TGG

CAG

TGT

GAC

GCT

GTT

CTC

CGT

GGT

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

500

505

510

GAG

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

GGG

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

Gly Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

530

535

540

GGA

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

Gly

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

545

550

555

GAA

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

Glu

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

560 565 570 575

CTC TCC CCC AGG CTG CAG TAT TTT GGG CAG GCG CTG AGT GGG GGT CAG

Leu Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ala Leu Ser Gly Gly Gin 580 585 590

GAC CTC Asp Leu

ACC CAG Thr Gin 595

GAT GGA

CTG Leu

ATG GAC CTG GCC GTG GGG

GCC CGG GGC

Asp

Gly

Met Asp 600

Leu

Ala

Val

Gly

Ala 605

Arg Gly

CAG

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

Gin

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

610

615

620

ATG

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

Met

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

625

630

635

GAA

GAG

AAG

CCC

AGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

640

645

650

655

ACC

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

Thr

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly Asp

Ile

Gin

Ser

660

665

670

GTC

AGG

TTT

GAT

CTG

GCA

CTG

GAC

CCA

GGT

CGT

CTG

ACT

TCT

CGT

GCC

Val

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

675

680

685

1391

1439

1487 1535 1583 1631 1679 1727 1775 1823 1871 1919 1967 2015

2063

-68CZ 287921 B6

ATT TTC AAT

GAA ACC AAG AAC

CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA

ACC CTG Thr Leu

Ile Phe

Asn 690

Glu Thr

Lys Asn

Pro 695

Thr Leu

Thr

Arg Arg 700

Lys

GGA

CTG

GGG

ATT

CAC

TGT

GAA

ACC

CTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAT

TGT

Gly

Leu

Gly

Ile

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

705

710

715

GTG

GAG

GAT

GTG

AGC

CCC

ATC

ATT

CTG

CAC

CTC

AAC

TTC

TCA

CTG

Val

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

720

725

730

735

GTG

AGA

GAG

CCC

ATC

CCC

TCC

CCC

CAG

AAC

CTG

CGT

CCT

GTG

CTG

GCC

Val

Arg

Glu

Pro

Ile

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

TGT

GGG

CAA

GAT

GGC

CTC

TGT

GAA

GGG

GAC

CTG

GGT

GTC

ACC

CTC

AGC

Cys

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

770

775

780

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

785

790

795

GTG

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

AAC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

Val

Ile

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

300

805

810

815

GTC

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

Val

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

820

825

830

GCC

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA

Ala

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

835

840

845

GTG

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

Val

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

850

855

860

CAC

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

His

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

Ile

Val

Thr

Phe

865

870

875

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

880

885

890

895

AGT

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

900

905

910

CAG

CTG

GAG

CTC

CCG

GTG

AAG

TAT

GCA

GTC

TAC

ACC

ATG

ATC

AGC

AGG

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

Ile

Ser

Arg

915 920 925

2111 2159 2207 2255 2303 2351 2399 2447 2495 2543 2591 2639 2687 2735 2783

-69CZ 287921 B6

CAG GAA GAA

TCC ACC AAG TAC

TTC AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG

2831

Gin Glu

Glu 930

Ser Thr

Lys Tyr

Phe 935

Asn Phe

Ala

Thr Ser 940

Asp Glu Lys

AAA

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

2879

Lys

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

945

950

955

CGA

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

2927

Arg

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

Ile

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

960

965

970

975

GGG

GTG

GCT

GTG

TGG

GAT

GTG

GTC

ATG

GAG

GCC

CCA

TCT

CAG

AGT

CTC

2975

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

980

985

990

CCC

TGT

GTT

TCA

GAG

AGA

AAA

CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC

TTC

CTG

ACC

3023

Pro

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lys

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

995

1000

1005

CAG

ATT

TCA

AGA

AGT

CCC

ATG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

3071

Gin

Ile

Ser

Arg

Ser

Pro

Met

Leu

Asp

Cys

Ser

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

1010

1015

1020

CAG

TTC

CGC

TGT

GAC

GTC

CCC

TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG

CTG

GAT

3119

Gin

Phe

Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Asp

1025

1030

1035

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAT

CTC

AGT

TTC

GGC

TGG

GTC

CGC

GAG

ACA

TTG

3167

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

1040

1045

1050

1055

CAG

AAG

GTG

TTG

GTC

GTG

AGT

GTG

GCT

GAA

ATT

ACG

TTC

GAC

ACA

3215

Gin

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

1060

1065

1070

TCC

GTG

TAC

TCC

CAG

CTT

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

ATG

AGA

GCT

CAG

3263

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

1075

1080

1085

ATG

GAG

ATG

GTG

CTA

GAA

GAC

GAG

GTC

TAC

AAT

GCC

ATT

CCC

ATC

3311

Met

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

Ile

Pro

Ile

1090

1095

1100

ATC

ATG

GGC

AGC

TCT

GTG

GGG

GCT

CTG

CTA

CTG

GCG

CTC

ATC

ACA

3359

Ile

Met

Gly

Ser

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

IlOí

1110

1115

GCC

ACA

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAA

CGC

CAC

TAC

AAG

GAA

ATG

3407

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His

Tyr

Lys

Glu

Met

1120

1125

1130

1135

CTG

GAG

GAC

AAG

CCT

GAA

GAC

ACT

GCC

ACA

TTC

AGT

GGG

GAC

GAT

TTC

3455

Leu

Glu

Asp

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Phe

Ser

Gly Asp

Asp

Phe

1140

1145

1150

AGC

TGT

GTG

GCC

CCA AAT

GTG

CCT

TTG

TCC

TAATAATCCA CTTTCCTGTT

3505

Ser

Cys

Val

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Leu

Ser

1155 1160

-70CZ 287921 B6

TATCTCTACC

ACTGTGGGCT

GGACTTGCTT

GCAACCATAA

ATCAACTTAC

ATGGAAACAA

3566

CTTCTGCATA

GATCTGCACT

GGCCTAAGCA

ACCTACCAGG

TGCTAAGCAC

CTTCTCGGAG

3625

AGATAGAGAT

TGTAATGTTT

TTACATATCT

GTCCATCTTT

TTCAGCAATG

ACCCACTTTT

3685

TACAGAAGCA

GGCATGGTGC

CAGCATAAAT

TTTCATATGC

3726 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:2:

Thr Phe Gly Thr Val

Leu Leu Leu Ser Val 10

Leu

Ala Ser Tyr

His 15

Gly

1

5

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

Ile

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

Gly

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

Ile

65

70

75

80

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

Ser

85

90

95

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

Val

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

115

120

125

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

145

150

155

160

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

Met

165

170

175

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

185

190

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

Pro

195

200

205

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

Thr

210

215

220

-71CZ 287921 B6

Phe Thr 225

Ala

Thr Gly Ile 230

Leu Thr Val Val Thr Gin Leu Phe His His

235

240

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

Thr

245

250

255

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

Pro

260

265

270

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

His

275

280

285

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

Leu

305

310

315

320

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

Gly

325

330

335

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

340

345

350

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

Val

355

360

365

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Met

370

375

380

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

385

390

395

400

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

Gin

405

410

415

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

Val

420

425

430

Ile

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

Thr

435

440

445

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

450

455

460

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

465

470

475

480

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

Pro

485

490

495

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

-72CZ 287921 B6

Glu 545

Gin

Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr 550

Leu

Phe His Gly Ala 555

Ser Glu 560

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly Gly

Gin

Asp

580

585

590

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

595

600

605

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly Asp

Ile

Gin

Ser

Val

660

665

670

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

Ile

675

680

685

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

690

695

700

Leu

Gly

Ile

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

705

710

715

720

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725

730

735

Arg

Glu

Pro

Ile

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

740

745

750

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

Ile

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

-73CZ 287921 B6

Pro Ile 865

Phe

His Glu Gly 870

Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe 875

Asp 880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

Ile

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Glu

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

Ile

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Pro

980

985

990

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lys

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

Ile

Ser

Arg

Ser

Pro

Met

Leu

Asp Cys

Ser

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

Gin

1010

1015

1020

Phe Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

1070

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

Met

1075

1080

1085

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

Ile

Pro

Ile

1090

1095

1100

Met

Gly

Ser

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Ala

1105

1110

1115

1120

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His

Tyr Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

Glu

Asp

Lys

Pro

Glu Asp

Thr

Ala

Thr

Phe

Ser Gly Asp

Asp

Phe

Ser

1140

1145

1150

Cys

Val

Ala

Pro

Asn

Val

Pro

Lys

Ser

1155

1160 ·

-74CZ 287921 B6 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1153 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein <xi} POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:3:

Met 1

Ala

Leu

Arg Val 5

Leu Leu Leu Thr Ala Leu Thr Leu Cys His

Gly

10

15

Phe

Asn

Leu

Asp

Thr

Glu

Asn

Ala

Met

Thr

Phe

Gin

Glu

Asn

Ala

Arg

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Ser

Arg

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Gin

Glu

Ile

Val

Ala

Asn

Gin

Arg

Gly

Ser

Leu

Tyr

50

55

60

Gin

Cys

Asp

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ser

Cys

Glu

Pro

Ile

Arg

Leu

Gin

Val

65

70

75

80

Pro

Val

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

85

90

95

Thr

Ser

Pro

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Gin

Thr

100

105

110

Cys

Ser

Glu

Asn

Thr

Tyr

Val

Lys

Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

Phe

Gly

Ser

115

120

125

Asn

Leu

Arg

Gin

Pro

Gin

Lys

Phe

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly Cys

130

135

140

Pro

Gin

Glu

Asp

Ser

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

Ile

Pro

His

Asp

Phe

Arg

Met

Lys

Glu

Phe

Val

Ser

Thr

Val

165

170

175

Met

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Lys

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Glu

Phe

Arg

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Lys

Glu

Phe

Gin

Asn

195

200

205

Pro

Asn

Pro

Arg

Ser

Leu

Val

Lys

Pro

Ile

Thr

Gin

Leu

Gly Arg

210

215

220

Thr

His

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

Lys

Val

Arg

Glu

Leu

Phe

Asn

225

230

235

240

Ile

Thr

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Asn

Ala

Phe

Lys

Ile

Leu

Val

Ile

245

250

255

-75CZ 287921 B6

Thr Asp	Gly	Glu	Lys 260	Phe
Pro	Glu	Ala 275	Asp	Arg
Asp	Ala 290	Phe	Arg	Ser
Ser 305	Lys	Pro	Pro	Arg
Leu	Lys	Thr	Ile	Gin 325
Gly	Thr	Gin	Thr 340	Gly
Glu	Gly	Phe 355	Ser	Ala
Val	Gly 370	Ser	Tyr	Asp
Glu 385	Lys	Ser	Thr	Phe
Asp	Ala	Tyr	Leu	Gly 405
Gin	Ser	Leu	Val 420	Leu
Ala	Met	Phe 435	Arg	Gin
Lys	Gly 450	Thr	Gin	Ile
Asp 465	Val	Asp	Ser	Asn
His	Tyr	Tyr	Glu	Gin 485
Pro	Arg	Gly	Gin 500	Arg
Glu	Gin	Gly 515	Gin	Pro
Gly	Asp 530	Val	Asn	Gly
Gly 545	Glu	Glu	Asp	Asn
Gly	Ser	Gly	Ile	Ser 565

Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile
	265	270
Gly	Val	Ile	Arg	Tyr	Val	Ile	Gly	Val	Gly
	280					285
Lys	Ser	Arg	Gin	Glu	Leu	Asn	Thr	Ile	Ala
295				300
His	Val	Phe	Gin	Val	Asn	Asn	Phe	Glu	Ala
				315					320
Gin	Leu	Arg	Glu	Lys	Ile	Phe	Ala	Ile	Glu
		330					335
Ser	Ser	Ser	Phe	Glu	His	Glu	Met	Ser	Gin
		345					350
Ile	Thr	Ser	Asn	Gly	Pro	Leu	Leu	Ser	Thr
	360				365
Ala	Gly Gly	Val	Phe	Leu	Tyr	Thr	Ser	Lys
375					380
Asn	Met	Thr	Arg	Val	Asp	Ser	Asp	Met	Asn
				395					400
Ala	Ala	Ala	Ile	Ile	Leu	Arg	Asn	Arg	Val
			410					415
Ala	Pro	Arg	Tyr	Gin	His	Ile	Gly	Leu	Val
		425					430
Thr	Gly	Met	Trp	Glu	Ser	Asn	Ala	Asn	Val
	440				445
Ala	Tyr	Phe	Gly	Ala	Ser	Leu	Cys	Ser	Val
455					460
Ser	Thr	Asp	Leu	Val	Leu	Ile	Gly	Ala	Pro
				475					480
Arg	Gly Gly	Gin	Val	Ser	Val	Cys	Pro	Leu
			490					495
Arg	Trp	Gin	Cys	Asp	Ala	Val	Leu	Tyr	Gly
		505					510
Gly Arg	Phe	Gly	Ala	Ala	Leu	Thr	Val	Leu
	520					525
Lys	Leu	Thr	Asp	Val	Ala	Ile	Gly	Ala	Pro
535					540
Gly	Ala	Val	Tyr	Leu	Phe	His	Gly	Thr	Ser
				555					560
Ser	His	Ser	Gin	Arg	Ile	Ala	Gly	Ser	Lys
			570					575

-76CZ 287921 B6

Leu Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin

580 585 590

Asp

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Thr

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

595

600

605

His

Val

Leu

Arg

Ser

Gin

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Lys

Ala

Ile

610

615

620

Met

Glu

Phe

Asn

Pro

Arg

Glu

Val

Ala

Arg

Asn

Val

Phe

Glu

Cys

Asn

625

630

635

640

Asp

Gin

Val

Lys

Gly

Lys

Glu

Ala

Gly

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Leu

645

650

655

His

Val

Gin

Lys

Ser

Thr

Arg Asp

Arg

Leu

Arg

Glu

Gly

Gin

Ile

Gin

660

665

670

Ser

Val

Thr

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Ser

Gly

Arg

Pro

His

Ser

675

680

685

Arg

Ala

Val

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Thr

Arg Arg

Gin

Thr

Gin

690

695

700

Val

Leu

Gly

Leu

Thr

Gin

Thr

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Gin

Leu

Pro

705

710

715

720

Asn

Cys

Ile

Glu

Asp

Pro

Val

Ser

Pro

Ile

Val

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

725

730

735

Ser

Leu

Val

Gly

Thr

Pro

Leu

Ser

Ala

Phe

Gly

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

740

745

750

Leu

Ala

Glu

Asp

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Thr

Ala

Leu

Phe

Pro

Phe

Glu

755

760

765

Lys

Asn

Cys

Gly

Asn

Asp

Asn

Ile

Cys

Gin

Asp Asp

Leu

Ser

Ile

Thr

770

775

780

Phe

Ser

Phe

Met

Ser

Leu

Asp

Cys

Leu

Val

Gly

Pro

Arg

Glu

785

790

795

800

Phe

Asn

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Asp

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Arg

805

810

815

Thr

Gin

Val

Thr

Phe

Pro

Leu

Asp

Leu

Ser

Tyr Arg

Lys

Val

820

825

830

Ser

Thr

Leu

Gin

Asn

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg

Ser

Trp Arg

Leu

Ala

Cys

835

840

845

Glu

Ser

Ala

Ser

Thr

Glu

Val

Ser

Gly

Ala

Leu

Lys

Ser

Thr

Ser

850

855

860

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Pro

Glu

Asn

Ser

Glu

Val

Thr

Phe

865

870

875

880

Asn

Ile

Thr

Phe

Asp

Val

Asp

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Asn

Lys

Leu

885 890 895

-77CZ 287921 B6

Leu Leu Lys Ala Asn Val Thr Ser Glu Asn Asn Met Pro Arg Thr Asn

900

905

910

Lys

Thr

Glu

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Met

915

920

925

Val

Thr

Ser

His

Gly

Val

Ser

Thr

Lys

Tyr

Leu

Asn

Phe

Thr

Ala

930

935

940

Ser

Glu

Asn

Thr

Ser

Arg

Val

Met

Gin

His

Gin

Tyr

Gin

Val

Ser

Asn

945

950

955

960

Leu

Gly

Gin

Arg

Ser

Leu

Pro

Ile

Ser

Leu

Val

Phe

Leu

Val

Pro

Val

965

970

975

Arg

Leu

Asn

Gin

Thr

Val

Ile

Trp Asp Arg

Pro

Gin

Vál

Thr

Phe

Ser

980

985

990

Glu

Asn

Leu

Ser

Thr

Cys

His

Thr

Lys

Glu

Arg

Leu

Pro

Ser

His

995

1000

1005

Ser

Asp

Phe

Leu

Ala

Glu

Leu

Arg

Lys

Ala

Pro

Val

Asn

Cys

Ser

1010

1015

1020

Ile

Ala

Val

Cys

Gin

Arg

Ile

Gin

Cys

Asp

Ile

Pro

Phe

Gly

Ile

1025

1030

1035

1040

Gin

Glu

Phe

Asn

Ala

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Asp

Trp

1045

1050

1055

Tyr

Ile

Lys

Thr

Ser

His

Asn

His

Leu

Ile

Val

Ser

Thr

Ala

Glu

1060

1065

1070

Ile

Leu

Phe

Asn

Asp

Ser

Val

Phe

Thr

Leu

Pro

Gly

Gin

Gly

Ala

1075

1080

1085

Phe

Val

Arg )

Ser

Gin

Thr

Glu

Thr

Lys

Val

Glu

Pro

Phe

Glu

Val

Pro

109C

1095

1100

Asn

Pro

Leu

Pro

Leu

Ile

Val

Gly

Ser

Val

Gly Gly

Leu

1105

1110

1115

1120

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu Gly

Phe

Lys

Arg

1125

1130

1135

Gin Tyr

Lys

Asp

Met

Ser

Glu

Gly

Gly Pro

Pro

Gly

Ala

Glu

Pro

1140 1145 1150

Gin

2) INFORMACE 0 SEK. ID. Č.:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1163 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-78CZ 287921 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:4:

Met Thr Arg Thr 1

Arg 5

Ala

Ala Leu Leu Leu Phe Thr Ala Leu Ala Thr

10

15

Ser

Leu

Gly

Phe

Asn

Leu Asp

Thr

Glu

Leu

Thr

Ala

Phe

Arg

Val

20

25

30

Asp

Ser

Ala

Gly

Phe

Gly Asp

Ser

Val

Gin

Tyr

Ala

Asn

Ser

Trp

35

40

⁴⁵

Val

Gly

Ala

Pro

Gin

Lys

Ile

Ala

Asn

Gin

Ile

Gly

50

55

60

Gly

Leu

Tyr

Gin

Cys

Gly

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ala

Cys

Glu

Pro

Ile

Gly

65

70

75

80

Leu

Gin

Val

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Ala

Ser

Thr

Ser

Pro

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

100

105

110

His

Glu

Cys

Gly Arg

Asn

Met

Tyr

Leu

Thr

Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Pro

Thr

Gin

Leu

Thr

Gin

Arg

Leu

Pro

Val

Ser

Arg

Gin

Glu

130

135

140

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Gin

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

Ile

Ser

Arg

Asn

Phe

Ala

Thr

Met

Asn

Phe

Val

Arg

Ala

165

170

175

Val

Ile

Ser

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ser

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

180

185

190

Phe

Ser

Asn

Lys

Phe

Gin

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Glu

Phe

Arg

195

200

205

Thr

Ser

Asn

Pro

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Val

His

Gin

Leu

Gin

Gly

210

215

220

Phe

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Ala

Ile

Gin

Asn

Val

His

Arg

Leu

Phe

225

230

235

240

His

Ala

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

Asp

Ala

Ile

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

245

250

255

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

Glu

Gly

Asp

Ser

Leu

Asp

Tyr

Lys

Asp

Val

260

265

270

Ile

Pro

Met

Ala

Asp

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

275

280

285

Gly

Leu

Ala

Phe

Gin

Asn

Arg

Asn

Ser

Trp

Lys

Glu

Leu

Asn

Asp

Ile

290

295

300

Ala

Ser

Lys

Pro

Ser

Gin

Glu

His

Ile

Phe

Lys

Val

Glu

Asp

Phe

Asp

305

310

315

320

-79CZ 287921 B6

Ala Leu Glu Gly

Lys Thr Gly 355

Asp Ile Gin 325 Glu Thr Ile 340

Asn Ser Val

Gin Leu Lys Glu Lys Ile Phe Ala Ile

330

335 Met Ala Leu Gly

Ser Ser 345

Ser Phe Glu

Leu Glu 350

Gin

Glu

Phe Ser

Ala

Phe 360

Thr

Pro

Asp Gly

Pro 365

Val

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Thr

Trp

Ser

Gly Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Asn

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

385

390

395

400

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

405

410

415

Val

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Ile

Gly

Lys

420

425

430

Ala

Val

Ile

Phe

Ile

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Met

Lys

Ala

Glu

435

440

445

Val

Ile

Gly

Thr

Gin

Ile

dy

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

450

455

460

Val

Asp

Val

Asp

Thr

Asp Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

465

470

475

480

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

485

490

495

Leu

Pro

Arg

Gly

Trp

Arg

Trp

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Tyr

Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Ile

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Val

Leu

545

550

555

560

Gly

Pro

Ser

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Gly

Ser

Gin

565

570

575

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

580

585

590

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

605

Gin

Val

Leu

Arg

Thr

Arg

Pro

Val

Leu

Trp

Val

Gly

Val

Ser

610

615

620

Met

Gin

Phe

Ile

Pro

Ala

Glu

Ile

Pro

Arg

Ser

Ala

Phe

Glu

Cys

Arg

625

630

635

640

-80CZ 287921 B6

Glu

Gin Val

Val

Ser 645

Glu Gin Thr Leu Val Gin Ser Asn Ile Cys Leu

650

655

Tyr

Ile

Asp

Lys

Arg

Ser

Lys

Asn

Leu

Gly

Ser Arg

Asp

Leu

Gin

660

665

670

Ser

Val

Thr

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

Pro

Gly

Arg

Leu

Ser

Pro

675

680

685

Arg

Ala

Ile

Phe

Gin

Glu

Thr

Lys

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Arg

Val

Arg

690

695

700

Val

Leu

Gly

Leu

Lys

Ala

His

Cys

Glu

Asn

Phe

Asn

Leu

Pro

705

710

715

720

Ser

Cys

Val

Glu

Asp

Ser

Val

Ile

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

725

730

735

Thr

Leu

Val

Gly

Lys

Pro

Leu

Ala

Phe

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Met

740

745

750

Leu

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Tyr

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

755

760

765

Lys

Asn

Cys

Gly

Ala

Asp

His

Ile

Cys

Gin

Asp

Asn

Leu

Gly

Ile

Ser

770

775

780

Phe

Ser

Phe

Pro

Gly

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Gly

Ser

Asn

Leu

Glu

785

790

795

800

Leu

Asn

Ala

Glu

Val

Met

Val

Trp

Asn

Asp

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

805

810

815

Thr

Ile

Thr

Phe

Ser

His

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Val

820

825

830

Ala

Glu

Gly

Gin

Lys

Gin

Gly

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

His

Leu

Thr

Cys

835

840

845

Cys

Ser

Ala

Pro

Val

Gly

Ser

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Thr

Ser

Cys

Arg

850

855

860

Ile

Asn

His

Leu

Ile

Phe

Arg

Gly

Ala

Gin

Ile

Thr

Phe

Leu

Ala

865

870

875

880

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Pro

Lys

Ala

Val

Gly

Leu

Asp

Arg

Leu

885

890

895

Ile

Ala

Asn

Val

Ser

Glu

Asn

Ile

Pro

Arg

Thr

Ser

Lys

Thr

900

905

910

Ile

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Ile

Val

915

920

925

Ser

His

Glu

Gin

Phe

Thr

Lys

Tyr

Leu

Asn

Phe

Ser

Glu

Ser

Glu

930

935

940

Glu

Lys

Glu

Ser

His

Val

Ala

Met

His

Arg

Tyr

Gin

Val

Asn

Leu

945 950 955 960

-81CZ 287921 B6

Gly Gin Arg	Asp Leu Pro Val Ser	Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Glu
	965	970 Asp Val Glu Val Ser	975
Leu Asn Gin	Glu Ala Val Trp Met	His Pro Gin
	980	985	990
Asn Pro Ser	Leu Arg Cys Ser Ser	Glu Lys Ile Ala Pro	Pro Ala Ser
995	100(	) 100í
Asp Phe Leu 1010	Ala His Ile Gin Lys 1015	Asn Pro Val Leu Asp 1020	Cys Ser Ile
Ala Gly Cys	Leu Arg Phe Arg Cys	Asp Val Pro Ser Phe	Ser Val Gin
1025	1030	1035	1040
Glu Glu Leu	Asp Phe Thr Leu Lys 1045	Gly Asn Leu Ser Phe 1050	Gly Trp Val 1055
Arg Gin Ile	Leu Gin Lys Lys Val 1060	Ser Val Val Ser Val 1065	Ala Glu Ile 1070
Ile Phe Asp	Thr Ser Val Tyr Ser	Gin Leu Pro Gly Gin	Glu Ala Phe
1075 1080 1085
Met Arg Ala 1090	Gin Thr Ile Thr Val 1095	Leu Glu Lys Tyr Lys 1100	Val His Asn
Pro Ile Pro	Leu Ile Val Gly Ser	Ser Ile Gly Gly Leu	Leu Leu Leu
1105	1110	1115	1120
Ala Leu Ile	Thr Ala Val Leu Tyr 1125	Lys Val Gly Phe Phe 1130	Lys Arg Gin 1135
Tyr Lys Glu Met Met Glu Glu Ala Asn Gly Gin Ile Ala 1140 1145 Gly Thr Gin Thr Pro Ser Pro Pro Ser Glu Lys 1155 1160	Pro Glu Asn 1150

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineárni (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:5:

Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gin 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden

-82CZ 287921 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:6:

TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA 35 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:7:

TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:8:

TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:9:

TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bSzí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

-83CZ 287921 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:10:

TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:ll:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:ll:

TGRAANACCA TNGGYTC 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů b/zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:12:

TTGGAAGACC ATNGGYTC 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (0) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:13:

ATTAACCCTC ACTAAAG 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:14:

AATACGACTC ACTATAG 17

-84CZ 287921 B6 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. ¢.:15:

Val Phe Gin Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

CD) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:16:

Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gin Pro Ile 1 5 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:17:

Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gin Ala Glu 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:18:

Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa 15 10 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

-85CZ 287921 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:19:

Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gin Glu Asn Val Asp (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:20:

Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gin Thr Gly

10 15

Arg (2) INFORMACE O SEK. ID. ¢.:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:21:

Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:22:

Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

-86CZ 287921 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:23:

RAANCCYTCY TGRAAACTYT C (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1006 párů ba*zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:24:

TTCAACCTGG	ACGTGGAGGA	GCCCATGGTG	TTCAAGAGGA	TGGAGCTGGC	TTTGGACAGA	60
GCGTGGCCCA	GCTTGGCGGA	TCTAGACTCG	TGGTGGGAGC	CCCCCTGGAG	GTGGTGGCGG	120
TCAACCAAAC	AGGAAGGTTG	TATGACTGTG	TGGCTGCCAC	TGGCCTTGTC	AACCCATACC	180
CCTGCACACA	CCCCCAGATG	CTGTGAACAT	GTCCCTGGGT	CTGTCCCTGT	CAGCCGCCGC	240
CAGTCGCCCC	TGGCTGCTGG	CCTGTGGCCC	AACCATGCAC	AGAGCCTGTG	GGGAGAATAT	300
GTATGCAGAA	GGCTTTTGCC	TCCTGTTGGA	CTCCCATCTG	CAGACCATTT	GGACAGTACC	360
TGCTGCCCTA	CCAGAGTGTC	CAAGTCAAGA	GATGGACATT	GTCTTCCTGA	TTGATGGTTC	420
TGGCAGTATG	AGCAAAGTGA	CTTTAAACAA	ATGAAGGATT	TGTGAGAGCT	GTGATGGGAC	480
AGTTTGAGGG	CACCCAAACC	CTGTTCTCAC	TGATACAGTA	TCCCACCTCC	CTGAAGATCC	540
ACTTCACCTT	CACGCAATTC	CAGAGCAGCT	GGAACCCTCT	GAGCCTGGTG	GATCCCATTG	600
TCCAACTGGA	CGGCCTGACA	TATACAGCCA	CGGGCATCCG	GAAAGTGGTG	GAGGAACTGT	660
TTCATAGTAA	GAATGGGGCC	CGTAAAAGTG	CCAAGAAGAT	CCTCATTGTC	ATCACAGATG	720
GCAAAAATAC	AAAGACCCCC	TGGAGTACGA	GGACGTATCC	CCAGGCAGAG	AGAGCGGATC	780
ATCCGCTATG	CCATTGGGGT	GGGAGATGCT	TTCTGGAAAC	CCAGTGCCAA	GCAGGAGCTG	840
GACAACATTG	GCTCAGAGCC	GGCTCAGGAC	CATGTGTTCA	GGGTGGACAA	CTTTGCAGCA	900
CTCAGCAGCA	TCCAGGAGCA	GCTGCAGGAG	AAGATCTTTG	CACTCGAAGG	AACCCAGTCG	960
ACGACAAGTA	GCTCTTTCCA	ACATGAGATG	TTCCAAGAAG	GGTTCA		1006

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

-87CZ 287921 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:25:

GTNTTYCARG ARGAYGG 17 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů ba*zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:26:

CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:27:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:28:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

-88CZ 287921 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:29:

AGTTACGAAT ŤCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:30:

TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů ba'zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:31:

GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:32;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:32:

ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:33:

ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37

-89CZ 287921 B6 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (Xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:34:

TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:35:

TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3528 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3456 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:36:

GGC TGG GCC CTG GCT TCC TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT

GTG GAG GAA Val Glu Glu 15

48

Gly Trp Ala Leu Ala Ser

Cys

His Gly Ser 10

Asn Leu Asp

1

5

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

GGA

CAG

ACT

GTG

96

Pro

Ile

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

20

25

30

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

144

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

35

40

45

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

GCA

CCT

GCC

ACT

GGC

192

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

Asp

Cys

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

50

55

60

-90CZ 287921 B6

ATG TGC CAG

CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG

240

Met 65

Cys

Gin

Pro Ile Val Leu 70

Arg

Ser Pro

Leu 75

Glu Ala

Val Asn Met 80

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

288

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

85

90

95

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

AAG

AAC

ATG

TAT

GCG

336

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

100

105

110

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

384

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Tle

Gin

Ala

115

120

125

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

432

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

Zle

Ala

130

135

140

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

480

Phe

Leu

Zle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Zle

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

145

150

155

160

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

528

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

165

170

175

ACC

TTG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

TCG

AAC

ATC

CTG

AAG

ACC

CAT

TTT

576

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Zle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

180

185

190

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

624

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

Zle

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

195

200

205

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

672

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

Zle

Arg

210

215

220

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

720

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

768

Ala

Lys

Ile

Leu

Val

Zle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

816

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Zle

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

Ile

260

265

270

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

864

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

275

280

285

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

CCA

CAG

GAC

CAC

GTG

912

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

Zle

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

290 295 300

-91CZ 287921 B6

TTC Phe 305

AAG GTA GGC AAC Lys Val Gly Asn

TTT GCA GCA CTT CGC AGC ATC CAG AGG CAA CTT

960

Phe Ala 310

Ala

Leu Arg

Ser 315

Ile

Gin

Arg Gin Leu 320

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

TCA

AGG

TCA

AGT

1008

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

325

330

335

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

1056

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

340

345

350

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GYG

GGA

AGC

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

1104

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

355

360

365

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

1152

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

370

375

380

TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGA GAC TCC TAC CTG GGT TAC TCC ACC

1200

Ser 385

Gin

Glu

Asn

Val Asp 390

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr 395

Leu

Gly Tyr

Ser

Thr 400

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

1248

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

GCC

AGG

1296

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

CAT

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

1344

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

1392

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

450

455

460

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

1440

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465

470

475

480

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TKC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

1488

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

485

490

495

TGT

GAG

GCC ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GRC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

1536

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Xaa

His

Pro

Trp

Gly Arg

Phe

500

505

510

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

1584

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly Asp

Val

Asn

Gly Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA GAG

GAG

AGC

AGA

GGT

GCT

GTC

1632

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly Glu

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

530

535

540

-92CZ 287921 B6

TAC ATA

TTT CAT GGA GCC

TCG Ser

AGA CTG Arg Leu

GAG ATC ATG CCC TCA CCC AGC

1680

Tyr 545

Ile

Phe His

Gly Ala 550

Glu

Ile Met 555

Pro

Ser

Pro Ser 560

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

1728

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

1776

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

585

590

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

1824

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

595

600

605

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

1872

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

610

615

620

AAG GCT GTG TAC CAG TGC TGG GAA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT

1920

Lys 625

Ala

Val

Tyr

Gin Cys 630

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro 635

Thr Val

Leu Glu Ala 640

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

1968

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTA

GAT

CCG

2016

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

660

665

670

GGC

CGC

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

2064

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

2112

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

690

695

700

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

GTG

AGC

CCT

ATC

2160

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

Ile

705

710

715

720

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

2208

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

725

730

735

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

2256

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Ile

Thr

Ala

Ser

740

745

750

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

2304

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

755

760

765

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GTG

GGA

2352

Leu

Gly

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Val Gly

770

775

780

-93CZ 287921 B6

GGC Gly 785

TCC CCA GAG CTC Ser Pro Glu Leu

ACT GTG ACA GTC ACT GTG TGG AAT GAG GGT GAG

2400

Thr Val 790

Thr

Val Thr

Val 795

Trp Asn Glu

Gly Glu 800

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

2448

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

805

810

815

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

2496

Tyr

Arg Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

820

825

830

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

GAC

CTG

AGG

AGC

2544

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

835

840

845

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCA

AAG

ACC

2592

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

850

855

860

TTC Phe 865

ATG ATC Met Ile

ACA TTC

GAT GTC Asp Val 870

TCC TAC AAG GCC TTC CTA GGA GAC AGG

2640

Thr

Phe

Ser

Tyr

Lys

Ala 875

Phe Leu

Gly

Asp Arg 880

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

2688

Leu

Arg

Ala 885

Lys

Ala

Ser

Glu 890

Asn

Lys

Pro

Asp 895

Thr

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

AAG

TAC

ACC

GTC

TAT

2736

Asn

Lys

Thr

Ala 900

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu 905

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr 910

Val

Tyr

ACC

CTG

ATC

AGT

AGG

CAA

GAA

GAT

TCC

ACC

AAC

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

2784

Thr

Leu

Ile 915

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp 920

Ser

Thr

Asn

His

Val 925

Asn

Phe

Ser

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

2832

Ser

Ser 930

His

Gly

Arg

Arg 935

Gin

Glu

Ala

His 940

Arg

Tyr

Arg

Val

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

2880

Asn 945

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu 950

Lys

Leu

Ala

Val

Arg 955

Val

Asn

Phe

Trp

Val 960

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

GTG

ACT

CTG

AGC

2928

Pro

Val

Leu

Asn 965

Gly

Val

Ala

Val

Trp 970

Asp

Val

Thr

Leu

Ser 975

Ser

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC

GTG

TCC

CAG

ATG

AAA

CCT

CAG

AAT

2976

Pro

Ala

Gin

Gly 980

Val

Ser

Cys

Val

Ser 985

Gin

Met

Lys

Pro

Pro 990

Gin

Asn

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

CGT

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

3024

Pro

Asp

Phe 995

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin Arg 1000

Arg

Ser

Val

Leu Asp 1005

Cys

Ser

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TCC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

GAC

ATC

3072

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Ser

Arg

Cys

Asp

Ile

Pro

Ser

Leu

Asp

Ile

1010 1015 1020

-94CZ 287921 B6

CAG GAT GAA CTT Gin Asp Glu Leu 1025

GAC TTC ATT Asp Phe Ile 1030

CTG AGG GGC AAC CTC AGC TTC GGC

TGG Trp 1040

3120

Leu Arg

Gly Asn Leu 1035

Ser Phe Gly

GTC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

GAA

AAG

GTG

TTG

CTT

GTG

AGT

GAG

GCT

GAA

3168

Val

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Glu

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Glu

Ala

Glu

1045

1050

1055

ATC

ACT

TTC

GAC

ACA

TCT

GTG

TAC

TCC

CAG

CTG

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

3216

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

1060

1065

1070

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACA

ACG

TTA

GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

3264

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

1075

1080

1085

GAG

CCC

ATC

TTC

CTC

GTG

GCG

GGC

AGC

TCG

GTG

GGA

GGT

CTG CTG

ŤTA

3312

Glu

Pro

Ile

Phe

Leu

Val

Ala Gly

Ser

Val

Gly

Leu

1090

1095

1100

CTG

GCT

CTC

ATC

ACA

GTG

GTA

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TYC

AAA

CGT

3360

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Val

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Xaa

Lys

Arg

1105

1110

1115

1120

CAG

TAC

AAA

GAA

ATG

CTG

GAC

GGC

AAG

GCT

GCA

GAT

CCT

GTC

ACA

GCC

3408

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

Asp

Gly

Lys

Ala

Asp

Pro

Val

Thr

Ala

1125

1130

1135

GGC

CAG

GCA

GAT

TTC

GGC

TGT

GAG

ACT

CCT

CCA

TAT

CTC

GTG

AGC

TAGGAATCCA

3463

Gly Gin Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro	Pro Tyr Leu	Val Ser 1150
	1140	1145
CTCTCCTGCC	TATCTCTGNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA	TGAGTCTACT 1	3GCATGGGAA	3523
CGAGT										3528
(2)	INFORMACE 0 SEK. ID. Č.:37:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A) DÉLKA: 1151 aminokyselin
		(B) TYP: aminokyselina
		(D) TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	TYP MOLEKULY: protein
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEK.	ID.	Č.:37:
Gly	Trp Ala	Leu Ala Ser Cys His	Gly	Ser	Asn	Leu	Asp	Val	Glu	Glu
1		5		10					15
Pro	Ile Val	Phe Arg Glu Asp Ala	Ala	Ser	Phe	Gly	Gin	Thr	Val	Val
		20	25					30
Gin	Phe Gly	Gly Ser Arg Leu Val	Val	Gly	Ala	Pro	Leu	Glu	Ala	Val
	35	40					45
Ala	Val Asn	Gin Thr Gly Arg Leu	Tyr	Asp	Cys	Ala	Pro	Ala	Thr	Gly
	50	55				60

-95CL 287921 B6

Met Cys 65

Gin Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu

Glu Ala Val

Asn

Met 80

70

75

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

85

90

95

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

_Ty_r

Ala

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

115

120

125

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

130

135

140

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

145

150

155

160

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

180

185

190

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

Ile

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

195

200

205

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

210

215

220

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

Ala

Lys

Ile

Leu

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

Pro

Leu

Glu·

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

Ile

260

265

270

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

275

280

285

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

290

295

300

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Leu

305

310

315

320

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

325

330

335

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

355

360

365

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

370 375 380

-96CZ 287921 B6

Ser 385

Gin

Glu Asn Val Asp Met Arg Asp 390

Ser

Tyr Leu 395

Gly

Tyr

Ser Thr 400

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp Arg Asp

Gly

Ser

Xaa

450

455

460

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465

470

475

480

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly Arg

Trp

Gin

485

490

495

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Xaa

His

Pro

Trp

Gly Arg

Phe

500

505

510

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly Asp

Val

Asn

Gly Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

530

535

540

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

Ile

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

545

550

555

560

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

585

590

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

595

600

605

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

610

615

620

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

625

630

635

640

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

660

665

670

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

690

695

700

-97CZ 287921 B6

Lys Leu 705

Leu

Leu Pro Asp 710

Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile

715

720

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

725

730

735

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Ile

Thr

Ala

Ser

740

745

750

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

755

760

765

Leu

Gly

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Gly

770

775

780

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

785

790

795

800

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

805

810

815

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

820

825

830

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

835

840

845

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

850

855

860

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly Asp Arg

865

870

875

880

Leu

Arg

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

885

890

895

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

900

905

910

Thr

Leu

Ile

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

915

920

925

Ser

His

Gly

Gly Arg Arg

Gin

Glu

Ala

His

Arg

Tyr

Arg

Val

930

935

940

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

945

950

955

960

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Ser

965

970

975

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

Cys

Val

Ser

Gin

Met

Lys

Pro

Gin

Asn

980

985

990

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin

Arg Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

995

1000

1005

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Ser

Arg Cys Asp

Ile

Pro

Ser

Leu

Asp

Ile

1010

1015

1020

-98CZ 287921 B6

Gin Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

Ile

Leu

Arg

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly Trp

1025

1030

1035

1040

Val

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Glu

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Glu

Ala

Glu

1045

1050

1055

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

1060

1065

1070

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

1075

1080

1085

Glu

Pro

Ile

Phe

Leu

Val

Ala

Gly

Ser

Val

Gly Gly

Leu

1090

1095

1100

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Val

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Xaa

Lys

Arg

1105

1110

1115

1120

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu Asp

Gly

Lys

Ala

Ala Asp

Pro

Val

Thr

Ala

1125

1130

1135

Gly

Gin

Ala

Asp

Phe Gly Cys

Glu

Thr

Pro

Pro Tyr

Leu

Val

Ser

1140 1145 1150 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:38:

GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:39:

GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

-99CZ 287921 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:40:

TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:41:

GGAAACÁGCT ATGACCATG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. č.:42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bázi (B) TYP; nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:42:

GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:43:

GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:44:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 33

400 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3519 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 52..3519 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:45:

GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC

ACTGCTCAGA T ATG GTC Met Val 1

CGT GGA GTT GTG

ATC Ile

CTC CTG TGT GGC TGG

GCC CTG GCT TCC TGT CAT

105

Arg Gly Val

Val

Leu

Cys 10

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala 15

Ser

Cys

His

5

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

GAT

GCA

153

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

G1U

Asp

Ala

20

25

30

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

201

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

50

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CAG

TCG

249

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Gin

Ser

55

60

65

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

GCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

CTG

CAC

297

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

Ile

Leu

His

70

75

80

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

GCT

345

Ile

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

85

90

95

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

393

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

100

105

110

GCT

TGT

GCA

AAG

AAC

ATG

TAT

GCA

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTG

GGC

441

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

130

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

GAG

TGT

489

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

Glu

Cys

135

140

145

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

GGC

AGC

537

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

150 155 160

401

ATT GAT CAA Ile Asp Gin

AGT Ser

GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA GCT TTG

585

Asp

Phe Thr

Gin 170

Met

Lys

Asp

Phe

Val 175

Lys Ala

Leu

165

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

633

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

AGC

681

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Ser

195

200

205

210

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

GGC

CTG

729

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

215

220

225

ACG

TAC

ACA

GCC

TCG

GGC

ATC

CAG

AAA

GTG

AAA

GAG

CTA

TTT

CAT

777

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Phe

His

230

235

240

AGC AAG AAT Ser Lys Asn

GGG Gly

GCC CGA Ala Arg

AAA AGT GCC AAG AAG ATA

CTA ATT GTC ATC

825

Lys

Ser 250

Ala

Lys Lys Ile

Leu 255

Ile Val

Ile

245

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TTC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGA

CAT

GTC

ATC

873

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

Val

Ile

260

265

270

CCT

GAA

GCA

GAG

AAA

GCT

GGG

ATC

ATT

CGC

TAT

GCT

ATA

GGG

GTG

GGA

921

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

290

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

969

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Gly

295

300

305

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

GTA

GCA

1017

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

310

315

320

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

ATT

GAA

1065

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

325

330

335

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

1113

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGT

TTC

AGC

TCA

GCT

CTC

TCA

ATG

GAT

GGA

CCA

GTT

CTG

GGG

GCT

1161

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

355

360

365

370

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

TCA

AAT

1209

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Ser

Asn

375

380

385

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

ATG

AGG

1257

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

Met

Arg

390

395

400

402

GAC GCT TAC Asp Ala Tyr

CTG Leu

GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG GGG GTC

1305

Gly

Tyr Ser

Thr 410

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp 415

Lys Gly Val

405

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

1353

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

420

425

430

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

TCC

AGG

CAC

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

1401

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

435

440

445

450

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTT

GGG

GCA

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

1449

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

455

460

465

GAC

ATG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACT

GAC

CTG

GTC

CTG

ATT

GGA

GTC

CCC

1497

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Val

Pro

470

475

480

CAT His

TAC TAT

GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC CCC ATG

1545

Tyr

Tyr 485

Glu His

Thr

Arg

Gly Gly 490

Gin Val

Ser

Val Cys 495

Pro Met

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

GGG

GAG

1593

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

Gly

Glu

500

505

510

CAG

GGC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTA

GGG

1641

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

530

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

CCC

GGA

1689

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

535

540

545

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

TCG

AGA

1737

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Arg

550

555

560

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

1785

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

565

570

575

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1833

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

1881

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

595

600

605

610

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

TCC

ATT

1929

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

Ser

Ile

615

620

625

AGA

TTT

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GGA

1977

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Gly

630 635 640

403

AGG ACT CCC Arg Thr Pro

ACT Thr

GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT

CTC ACT Leu Thr

2025

Val

Leu Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

645

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

TCT

GTC

2073

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly Asp

Val

Gin

Ser

Val

660

665

670

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

2121

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile

675

680

685

690

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

2169

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

695

700

705

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

ATG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAC

TGT

GTG

2217

Leu

Gly Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

710

715

720

GAG GAT GCA Glu Asp Ala

GTG Val

ACC CCT Thr Pro

ATC ATC CTG CGC CTT AAC

TTA TCC CTG GCA

2265

Ile

Ile 730

Leu

Arg Leu Asn

Leu 735

Ser Leu

Ala

725

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

2313

Gly Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

740

745

750

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

GAG

2361

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Glu

755

760

765

770

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

2409

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

775

780

785

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

2457

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

790

795

800

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

2505

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Ile

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

805

810

815

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

GCC

CAG

CAA

CCT

CAT

CCG

TAC

CCA

2553

Leu

Ser

Tyr

Arg Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

Tyr

Pro

820

825

830

CTA

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

2601

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

835

840

845

850

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

2649

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

855

860

865

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

2697

Ala

Thr

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

870

875

880

404

GAC AGG TTG Asp Arg Leu

CTT Leu

CTG AGG GCC AGC GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT

2745

Leu

Arg Ala

Ser 890

Ala

Ser

Glu

Asn 895

Asn Lys Pro

885

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

2793

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

900

905

910

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

2841

Val

Tyr

Thr

Val

Ile

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Lys

His

Phe

Asn

915

920

925

930

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

CAG

AAA

GAG

GCC

GAA

CAT

CGA

TAT

2889

Phe

Ser

His

Gly

Glu

Arg

Gin

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

935

940

945

CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

TTG

ACG

CTG

GCC

ATC

AGC

GTT

AAC

TTC

2937

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Thr

Leu

Ala

Ile

Ser

Val

Asn

Phe

950

'955

960

TGG GTC CCC Trp Val Pro

ATC Ile

CTT CTG Leu Leu

AAT GGT GTG GCC GTG TGG

GAT GTG ACT CTG

2985

Asn

Gly 970

Val

Ala Val Trp

Asp 975

Val Thr

Leu

965

AGG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGT

GTG

TCA

CAG

AGG

GAA

CCT

3033

Arg

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

Cys

Val

Ser

Gin

Arg

Glu

Pro

980

985

990

CAA

CAT

TCC

GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

ATC

CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC

3081

Gin

His

Ser

Asp

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin

Gly Arg

Ser

Val

Leu

Asp

995

1000

1005

1010

TGC

GCC

ATC

GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

CTC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

3129

Cys

Ala

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Leu

Arg

Cys

Asp

Ile

Pro

Ser

Leu

1015

1020

1025

GGC

ACC

CTG

GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

ATT

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

3177

Gly

Thr

Leu

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

1030

1035

1040

GGC

TGG

ATC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

AAA

AAG

GTG

TTG

CTC

CTG

AGT

GAG

3225

Gly

Trp

Ile

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

1045

1050

1055

GCT

GAA

ATC

ACA

TTC

AAC

ACA

TCT

GTG

TAT

TCC

CAG

CTG

CCG

GGA

CAG

3273

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

1060

1065

1070

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

TCA

ACG

ATG

CTA

GAA

TAC

GTG

3321

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

Tyr

Val

1075

1080

1085

1090

GTC

TAT

GAG

CCC

GTC

TTC

CTC

ATG

GTG

TTC

AGC

TCA

GTG

GGA

GGT

CTG

3369

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Phe

Leu

Met

Val

Phe

Ser

Val

Gly

Leu

1095

1100

1105

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACT

GTG

GCG

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

3417

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Val

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

1110

1115

1120

405

AAA Lys

CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG GAT CTA CCA

TCT GCA GAT CCT GAC Ser Ala Asp Pro Asp 1135

Arg Gin Tyr 1125

Lys

Glu Met

Leu Asp 1130

Leu Pro

CCA

GCC

GGC CAG

GCA

GAT

TCC

AAC

CAT

GAG

ACT

CCT

CCA CAT

CTC

ACG

Pro

Ala

Gly Gin

Ala

Asp

Ser

Asn

His

Glu

Thr

Pro

Pro His

Leu

Thr

1140

1145

1150

TCC TAG

Ser

1155 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1155 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii> TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. č.:46:

3465

3513

3519

Met Val Arg Gly Val

Val

Ile

Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

35

40

45

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

Gin

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

Ile

Leu

65

70

75

80

Leu

His

Ile

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

130

135

140

Glu

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

Gly

Ser

Ile

Asp

Gin

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

Ala

Leu

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

406

Gin Tyr Ser

Asn Ile

Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys

195

200

205

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

245

250

255

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

Val

Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

325

330

335

Ile

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

Met

Ařg

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

465

470

475

480

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

500

505

510

407

Gly Glu Gin

Gly His

Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val

515

520

525

Leu

Gly Asp

Val

Asn

Gly Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

610

615

620

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Gly Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

675

680

685

Ala

Ile

Phe

Asp Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

Leu

Ala

Gly Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

770

775

780

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

785

790

795

800

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Ile

Lys

Phe

Tyr

Pro

805

810

815

Ala

Glu

Leu

Ser

Tyr Arg

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

820

825

830

40»

Tyr Pro Leu Arg	Leu Ala Cys Glu 840	Ala Glu Pro Thr	Gly Gin Glu Ser 845
	835
Leu Arg	Ser Ser	Ser Cys Ser Ile	Asn His Pro Ile	Phe Arg Glu Gly
850		855	860
Ala Lys	Ala Thr	Phe Met Ile Thr	Phe Asp Val Ser	Tyr Lys Ala Phe
865		870	875	880
Leu Gly	Asp Arg	Leu Leu Leu Arg	Ala Ser Ala Ser	Ser Glu Asn Asn
		885	890	895
Lys Pro	Glu Thr	Ser Lys Thr Ala	Phe Gin Leu Glu	Leu Pro Val Lys
	900		905	910
Tyr Thr	Val Tyr	Thr Val Ile Ser	Arg Gin Glu Asp	Ser Thr Lys His
	915	920		925
Phe Asn	Phe Ser	Ser Ser His Gly	Glu Arg Gin Lys	Glu Ala Glu His
930		935	940
Arg Tyr	Arg Val	Asn Asn Leu Ser	Pro Leu Thr Leu	Ala Ile Ser Val
945		950	955	960
Asn Phe	Trp Val	Pro Ile Leu Leu	Asn Gly Val Ala	Val Trp Asp Val
		965	970	975
Thr Leu	Arg Ser	Pro Ala Gin Gly	Val Ser Cys Val	Ser Gin Arg Glu
	980		985	990
Pro Pro	Gin His	Ser Asp Leu Leu	Thr Gin Ile Gin	Gly Arg Ser Val
	995	1000	1005
Leu Asp	Cys Ala	Ile Ala Asp Cys	Leu His Leu Arg	Cys Asp Ile Pro
1010	1015	1020
Ser Leu	Gly Thr	Leu Asp Glu Leu	Asp Phe Ile Leu	Lys Gly Asn Leu
1025		1030	1035	1040
Ser Phe	Gly Trp	Ile Ser Gin Thr	Leu Gin Lys Lys	Val Leu Leu Leu
		1045	1050	1055
Ser Glu	Ala Glu	Ile Thr Phe Asn	Thr Ser Val Tyr	Ser Gin Leu Pro
	1060	1065	1070
Gly Gin	Glu Ala	Phe Leu Arg Ala	Gin Val Ser Thr	Met Leu Glu Glu
	1075	1080	1085
Tyr Val	Val Tyr	Glu Pro Val Phe	Leu Met Val Phe	Ser Ser Val Gly
1090	1095	1100
Gly Leu	Leu Leu	Leu Ala Leu Ile	Thr Val Ala Leu	Tyr Lys Leu Gly
1105		1110	1115	1120
Phe Phe	Lys Arg	Gin Tyr Lys Glu	Met Leu Asp Leu	Pro Ser Ala Asp
		1125	1130	1135

409

Pro Asp Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His 1140 1145 1150

Leu Thr Ser

1155 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:47:

AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:48:

GCTGGACGAT GGCATCCAC 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:49:

GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:50:

GCAGCCAGCT TCGGACAGAC 20

410 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:51:

CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3803 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: COS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3486 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:52:

ATG Met 1

GTC CGT

GGA Gly

GTT GTG Val Val 5

ATC CTC CTG

TGT GGC TGG GCC CTG GCT

TCC Ser

48

Val

Arg

Ile

Leu

Cys 10

Gly

Trp

Ala Leu

Ala 15

TGT

CAT

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

96

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

GAT

GCA

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

144

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

35

40

45

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

192

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

CAG

TCG

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

GCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

240

Gin

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

Ile

Leu

65

70

75

80

CTG

CAC

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

283

Leu

His

Ile

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

GTG

GCT

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

336

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

411

CAG AGA GCT TGT GCA AAG

AAC ATG TAT GCA

AAA GGT TCC TGC CTC CTT

384

Gin Arg

Ala Cys 115

Ala

Lys

Asn

Met 120

Tyr Ala

Lys Gly

Ser 125

Cys Leu Leu

CTG

GGC

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

432

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

130

135

140

GAG

TGT

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

480

Glu

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

GGC

AGC

ATT

GAT

CAA

AGT

GAC

TTT

ACC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTC

GTC

AAA

528

Gly

Ser

Ile

Asp

Gin

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

GCT

TTG

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

576

Ala

Leu

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

CAA

TAC

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

624

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

AGC

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

672

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

GGC CTG

ACG TAC ACA

GCC Ala 230

TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG CTA

720

Gly 225

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ser Gly

Ile

Gin

Lys 235

Val

Lys Glu Leu 240

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATA

CTA

ATT

768

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

245

250

255

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TTC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGA

CAT

816

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

GTC

ATC

CCT

GAA

GCA

GAG

AAA

GCT

GGG

ATC

ATT

CGC

TAT

GCT

ATA

GGG

864

Val

Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

912

Val

Gly Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

960

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

GTA

GCA

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

1008

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

325

330

335

ATT

GAA

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

1056

Ile

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340 345 350

412

TCA CAA

GAA GGT Glu Gly 355

TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG

1104

Ser

Gin

Phe Ser

Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val

Leu

360

365

GGG

GCT

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

1152

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

TCA

AAT

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

1200

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

ATG

AGG

GAC

GCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

CTG

GCC

TTT

TGG

AAG

1248

Met

Arg Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

GGG

GTC

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

1296

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

TCC

AGG

CAC

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

1344

Lys

val

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTT

GGG

GCA

TCT

CTC

TGT

1392

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

4 60

TCT GTG GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA

1440

Ser 465

Val Asp

Met

Asp

Arg 470

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp 475

Leu

Val Leu

Ile Gly 480

GTC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAC

ACC

CGA

GGG

CAG

GTG

TCG

GTG

TGC

1488

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

CCC

ATG

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

1536

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

500

505

510

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

1584

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

CTA

GGG

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

1632

Leu

Gly Asp

Val

Asn

Gly Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

CCC

GGA

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

1680

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

TCG

AGA

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

1728

Ser

Arg

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

CAG

CTC

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

1776

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

413·

CAG GAC

CTT ACA Leu Thr 595

CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG

1824

Gin

Asp

Gin Asp

Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gin

600

605

GGG

CAC

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

1872

Gly

His 610

Val

Leu

Arg 615

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu 620

Lys

Val

Gly

Ile

TCC

ATT

AGA

TTT

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

1920

Ser 625

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro 630

Ser

Glu

Val

Ala

Lys 635

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys 640

TGG

GGA

AGG

ACT

CCC

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACC

GTC

TGT

1968

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro 645

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

CTC

ACT

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

2016

Leu

Thr

Val

Arg 660

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asp

Val 670

Gin

Ser

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

2064

Ser

Val

Arg 675

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu 680

Asp

Pro

Gly Arg

Leu 685

Ile

Ser

Arg

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

2112

Ala

Ile 690

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Arg

Lys

Thr

CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC

2160

Leu 705

Gly Leu

Gly

Asp

His 710

Cys

Glu

Thr

Met

Lys 715

Leu Leu

Leu Pro Asp 720

TGT

GTG

GAG

GAT

GCA

GTG

ACC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTT

AAC

TTA

TCC

2208

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

CTG

GCA

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

2256

Leu

Ala

Gly Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

2304

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

TGT

AAG

CAG

GAG

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

2352

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

770

775

780

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

24 CO

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

2443

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

2456

Ile

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

820

825

830

414

GCC CAG

CAA Gin 835

CCT CAT Pro His

CCG TAC CCA CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG

2544

Ala

Gin

Pro

Tyr

Pro Leu Arg 840

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Ala

Glu

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

2592

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

850

855

860

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

2640

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Ala

Thr

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AGC

2688

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Ser

885

890

895

GCA

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

2736

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

2784

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Val

Ile

Ser

Arg

Gin

915

920

925

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

2832

Glu

Asp

Ser

Thr

Lys

His

Phe

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Glu

Arg

930

935

940

CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG

2880

Gin 945

Lys Glu

Ala

Glu

His 950

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn 955

Asn Leu

Ser

Pro

Leu 960

ACG

CTG

GCC

ATC

AGC

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

CCC

ATC

CTT

CTG

AAT

GGT

2928

Thr

Leu

Ala

Ile

Ser

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Ile

Leu

Asn

Gly

965

970

975

GTG

GCC

GTG

TGG

GAT

GTG

ACT

CTG

AGG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

2976

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Arg

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

TGT GTG

TCA

CAG

AGG

GAA

CCT

CAA

CAT

TCC

GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

3024

Cys

Val

Ser

Gin

Arg

Glu

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

ATC

CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

GCC

ATC

GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

3072

Ile

Gin

Gly

Arg

Ser

Val

Leu

Asp

Cys

Ala

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

His

1010

1015

1020

CTC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

GGC

ACC

CTC-

GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

3120

Leu

Arg

Cys

Asp

Ile

Pro

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

ATT

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

GGC

TGG

ATC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

3168

Ile

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Ile

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

AAA

AAG

GTG

TTG

CTC

CTG

AGT

GAG

GCT

GAA

ATC

ACA

TTC

AAC

ACA

TCT

3216

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

1060

1065

1070

415

GTG TAT TCC CAG CTG CCG GGA CAG GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG

Val Tyr Ser Gin 1075

Leu

Pro Gly

Gin Glu 1080

Ala Phe

Leu

Arg Ala Gin Val 1085

TCA

ACG

ATG

CTA

GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

GAG

CCC

GTC

TTC

CTC

ATG

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Phe

Leu

Met

1090

1095

1100

GTG

TTC

AGC

TCA

GTG

GGA

GGT

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACT

GTG

Val

Phe

Ser

Val

Gly Gly

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Val

1105

1110

1115

1120

GCG

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAA

CGT

CAG

TAT

AAA

GAG

ATG

CTG

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

GAT

CTA

CCA

TCT

GCA

GAT

CCT

GAC

CCA

GCC

GGC

CAG

GCA

GAT

TCC

AAC

Asp

Leu

Pro

Ser

Ala

Asp

Pro

Asp

Pro

Ala Gly

Gin

Ala

Asp

Ser

Asn

1140

1145

1150

CAT

GAG

ACT

CCT

CCA

CAT

CTC

ACG

TCC

TAGGAATCTA CTTTCCTGTA

His

Glu

Thr

Pro

His

Leu

Thr

Ser

1155

1160

3264

3312

3360

3408

3456

3503

TATCTCCACA ATTACGAGAT TGGTTTTGCT AGTTCTCTTC AGCTCTGGGC TAGCCTGGGA AGCTGGGAGA TTTTTATGGT TTGCCCATGT GCAAGAGCAG GAATGGGGTC AGCATAAATT AGTAATATGC TCAATATTCA ATGTATTGCT

TTTGCCTATG AATCTACTGG CATGGGAACA3563

AACTTCCCAG AAATGATGCC CTACCTCCTG3623

GTCAGATTTC AGTGCTGATC CACTTTTTTT3683

TACATATGGA TAAGAACTAA CACAAGACTG3743

TGTATAAATT TTTAAAAAAT AAAATGAAAN3803 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:53:

Met

Val

Arg

Gly

Val

Ile

Leu

Cys

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

35

40

45

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

Gin

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

Ile

Leu

65

70

75

80

416

Leu

His

Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser

Leu

85

90

95

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Ile

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

130

135

140

Glu

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

Gly Ser Ile Asp Gin

Ser

Asp Phe Thr Gin Met Lys Asp Phe Val Lys

165

170

175

Ala

Leu

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

245

250

255

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

Val

Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

*

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Ile

Gin

Glu

LyS

Ile

Phe

Ala

325

330

335

Ile

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

417

Met

Arg Asp

Ala

Tyr 405

Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys

410

415

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Met

Asp Arg Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

465

470

475

480

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

500

505

510

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Gin

Asp

Ile

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ile

610

615

620

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

675

680

685

Ala

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

705 710 715 720

418

Cys Val Glu Asp

Ala 725

Val

Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser

730

735

Leu

Ala

Gly

Asp 740

Ser

Ala

Pro

Ser Arg 745

Asn

Leu

Arg

Pro

Val 750

Leu

Ala

Val

Gly

Ser 755

Gin

Asp

His

Val

Thr Ala 760

Ser

Phe

Pro

Phe 765

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys 770

Gin

Glu

Leu

Cys 775

Glu Gly

Asn

Leu

Gly 780

Val

Ser

Phe

Asn

Phe 785

Ser

Gly

Leu

Gin

Val 790

Leu

Glu Val

Gly

Ser 795

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr 800

Val

Thr

Val

Thr

Val 805

Trp

Asn

Glu Gly

Glu 810

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr 815

Leu

Ile

Lys

Phe

Tyr 820

Tyr

Pro

Ala

Glu Leu 825

Ser

Tyr Arg

Arg

Val 830

Thr

Arg

Ala

Gin

Gin 835

Pro

His

Pro

Tyr

Pro Leu 840

Arg

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Ala

Glu

Pro

Thr 850

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu 855

Arg Ser

Ser

Cys 860

Ser

Ile

Asn

His

Pro 865

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly 870

Ala

Lys Ala

Thr

Phe 875

Met

Ile

Thr

Phe

Asp 880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala 885

Phe

Leu

Gly Asp

Arg 890

Leu

Leu Arg

Ala 895

Ser

Ala

Ser

Glu 900

Asn

Lys

Pro Glu 905

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala 910

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu 915

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr Val 920

Tyr

Thr

Val

Ile 925

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp 930

Ser

Thr

Lys

His

Phe 935

Asn Phe

Ser

Ser 940

His

Gly

Glu

Arg

Gin 945

Lys

Glu

Ala

Glu

His 950

Arg

Tyr Arg

Val

Asn 955

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu 960

Thr

Leu

Ala

Ile

Ser 965

Val

Asn

Phe Trp

Val 970

Pro

Ile

Leu

Asn 975

Gly

Val

Ala

Val

Trp 980

Asp

Val

Thr

Leu Arg 985

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly 990

Val

Ser

Cys

Val

Ser 995

Gin

Arg

Glu

Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp

Leu 1005

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin 101C

Gly Arg 1

Ser

Val

Leu 1015

Asp Cys

Ala

Ile

Ala 102C

Asp 1

Cys

Leu

His

Leu 1025

Arg Cys Asp

Ile

Pro 103C

Ser 1

Leu Gly

Thr

Leu 1035

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe 1040

419

Ile

Leu

Lys

Gly Asn

Leu

Ser

Phe

Gly Trp Ile

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

Lys

Val

Leu

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asn

Thr

Ser

1060

1065

1070

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

1075

1080

1085

Ser

Thr

Met

Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

Val

Phe

Leu

Met

1090

1095

1100

Val

Phe

Ser

Val

Gly Gly

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Val

1105

1110

1115

1120

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Gin Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

Asp

Leu

Pro

Ser

Ala Asp

Pro

Asp

Pro

Ala Gly Gin

Ala

Asp

Ser

Asn

1140

1145

1150

His

Glu

Thr

Pro

His

Leu

Thr

Ser

1155

1160

(2)

INFORMACE O

SEK.

ID.

Č.:

54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3597 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 40..3525 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:54:

AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCAGTG ATG GCC GGT GGA GTT Met Ala Gly Gly Val 1 5

GTG

ATC

CTC

CTG

TGT

GGC

TGG

GTC

CTG

GCT

TCC

TGT

CAT

GGG

TCT

AAC

Val

Ile

Leu

Cys

Gly

Trp

Val

Leu

Ala

Ser

Cys

His

Gly

Ser

Asn

10

15

20

CTG

GAT

GTG

GAG

GAA

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

Ala

Ser

Phe

25

30

35

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

40

45

50

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly Arg

Leu

Tyr Asp

Cys

55

60

65

102

152

195 ž

420

GCA Ala 70

CCT GCC ACT GGC ATG

TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA

294

Pro

Ala Thr

Gly Met 75

Cys

Gin

Pro

Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu

80

85

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

342

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

90

95

100

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

390

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

105

110

115

AAG

AAC

ATG

TAT

GCG

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

438

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

120

125

130

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

486

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

135

140

145

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

534

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Gin

150

155

160

165

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

582

Arg Asp

Phe

Ala

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

170

175

180

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TTG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

TCG

AAC

ATC

630

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

185

190

195

CTG

AAG

ACC

CAT

TTT

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

678

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

Ile

Leu

Asp

Pro

200

205

210

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

726

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

215

220

225

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

774

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

230

235

240

245

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

822

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

250

255

260

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

870

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

Pro

Ala

265

270

275

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

918

Asp

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

280

285

290

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

966

Glr.

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

295

300

305

421

CCA Pro 310

CAG GAC

CAC His

GTG TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC

1014

Gin

Asp

Val

Phe 315

Lys Val

Gly

Asn Phe Ala 320

Ala

Leu Arg

Ser 325

ATC

CAG

AGG

CAA

CTT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

1062

Ile

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

Ile

Glu

Gly

Thr

Gin

330

335

340

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

1110

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

345

350

355

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GTG

GGA

AGC

1158

Ser

Ala

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

360

365

370

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

1206

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

375

380

385

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGA

GAC

TCC

TAC

1254

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg Asp

Ser

Tyr

390

395

400

405

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

1302

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

410

415

420

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

1350

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

Ile

Phe

425

430

435

ACC CAG Thr Gin

GAA GCC Glu Ala 440

AGG CAT Arg His

TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC AGA GGG ACA

1398

Trp

Arg 445

Pro Lys

Ser Glu Val 450

Arg

Gly Thr

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

1446

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

455

460

465

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

1494

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

470

475

480

485

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TTC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

1542

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

Pro

Val

Pro

Gly

Val

490

495

500

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

1590

Arg

Gly Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Gly

His

505

510

515

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

1638

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

520

525

530

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

1686

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

535 540 545

422

AGC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC

1734

Ser 550

Arg Gly

Ala

Val

Tyr 555

Ile

Phe

His

Gly

Ala 560

Ser

Arg Leu

Glu

Ile 565

ATG

CCC

TCA

CCC

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

1782

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

570

575

580

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

1830

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

585

590

595

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

1878

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

600

605

610

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

1926

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

615

620

625

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

AAG

GCT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GAA

AGG

ACT

CCC

1974

Pro

Met

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

630

635

640

645

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

2022

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

650

655

660

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

2070

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

665

670

675

CTG GCG Leu Ala

TTA GAT Leu Asp 680

CCG GGC Pro Gly

CGC CTG ATT TCT CGT

GCC ATT

TTT GAT GAG

2118

Arg

Leu 685

Ile

Ser

Arg

Ala

Ile 690

Phe

Asp

Glu

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

2166

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

695

700

705

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

2214

His

Cys

Glu

Thr

Val

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

710

715

720

725

GTG

AGC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

2262

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Arg Asp

Ser

730

735

740

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

2310

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

745

750

755

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

2353

His

Ile

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

760

765

770

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

2406

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

775 780 785

423

GTC TTG GTG GTG GGA GGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTC ACT GTG

2454

Val 790

Leu Val

Val

Gly

Gly 795

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr 800

Val

Thr Val

Thr

Val 805

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

2502

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

810

815

820

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

2550

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

825

830

835

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

2598

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu ..

840

845

850

GAC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

2646

Asp

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

855

860

865

GGT

GCA

AAG

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTC

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

2694

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

870

875

880

885

TTC

CTA

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

2742

Phe

Leu

Gly

Asp Arg

Leu

Arg

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu

Asn

890

895

900

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

2790

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

905

910

915

AAG TAC

ACC GTC Thr Val 920

TAT ACC CTG ATC AGT AGG CAA GAA GAT TCC ACC AAC

2838

Lys

Tyr

Tyr Thr

Leu Ile Ser Arg Gin Glu Asp Ser Thr Asn

925

930

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

2886

His

Val

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Gly Arg

Arg

Gin

Glu

Ala

935

940

945

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

2934

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

950

955

960

965

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

2982

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

Val

Ala

Val

Trp

Asp

970

975

980

GTG

ACT

CTG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC

GTG

TCC

CAG

ATG

3030

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

Cys

Val

Ser

Gin

Met

985

990

995

AAA

CCT

CAG

AAT

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

CGT

TCT

3078

Lys

Pro

Gin

Asn

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

Ile

Gin

Arg

Ser

1000

1005

1010

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TTC

CGC

TGT

GAC

ATC

3126

Val

Leu

Asp Cys

Ser

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

His

Phe

Arg Cys

Asp

Ile

1015

1020

1025

424

CCC TCC TTG GAC

ATC CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC

3174

Pro Ser 1030

Leu Asp

Ile

Gin Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn

1035

1040

1045

CTC

AGC

TTC

GGC

TGG

GTC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

GAA

AAG

GTG

TTG

CTT

3222

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Ser

Gin

Thr

Leu

Gin

Glu

Lys

Val

Leu

1050

1055

1060

GTG

AGT

GAG

GCT

GAA

ATC

ACT

TTC

GAC

ACA

TCT

GTG

TAC

TCC

CAG

CTG

3270

Val

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

1065

1070

1075

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACA

ACG

TTA

GAA

3318

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Leu

Glu

1080

1085

1090

GAA

TAC

GTG

GTC

TAT

GAG

CCC

ATC

TTC

CTC

GTG

GCG

GGC

AGC

TCG

GTG

3366

Glu

Tyr

Val

Tyr

Glu

Pro

Ile

Phe

Leu

Val

Ala

Gly

Ser

Val

1095

1100

1105

GGA

GGT

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACA

GTG

GTA

CTG

TAC

AAG

CTT

3414

Gly

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Val

Leu

Tyr

Lys

Leu

1110

1115

1120

1125

GGC

TTC

TYC

AAA

CGT

CAG

TAC

AAA

GAA

ATG

CTG

GAC

GGC

AAG

GCT

GCA

3462

Gly

Phe

Xaa

Lys

Arg

Gin

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

Asp

Gly

Lys

Ala

1130

1135

1140

GAT

CCT

GTC

ACA

GCC

GGC

CAG

GCA

GAT

TTC

GGC

TGT

GAG

ACT

CCT

CCA

3510

Asp

Pro

Val

Thr

Ala

Gly

Gin

Ala

Asp

Phe Gly

Cys

Glu

Thr

Pro

1145

1150

1155

TAT

Tyr

CTC

Leu

GTG , Val : 1160

AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATGAAGATTG Ser

3562

GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT

3597 (2)

INFORMACE O SEK. ID. Č.:55 (i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) '

TYP MOLEKULY: protein

(xi)

POPIS SEKVENCE: :

SEK.

ID.

Č. :.

55:

Met

Ala Gly

Gly

Val

Val Ile

Leu

Cys

Gly

Trp

Val

Leu

Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

His Gly

Ser

Asn

Leu Asp

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Phe

Arg

Glu

20

25

30

Asp

Ala Ala

Ser

Phe

Gly Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

35

40

45

425

Leu

Val 50

Val Gly Ala Pro

Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gin Thr

Gly

55

60

Arg

Leu

Tyr

Asp

Cys

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Val

65

70

75

80

Leu

Arg

Ser

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

Ile

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

130

135

140

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Ala

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

Gly

Ser

Ile

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

Gin

Tyr

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

Asn

Ile

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Arg

Thr

Val

Met

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

245

250

255

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

260

265

270

Val

Ile

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

275

280

285

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

Ile

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Ala

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Phe

Ala

325

330

335

Ile

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

426

Gly Ala

Val

Gly Ser Phe

Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr

Pro

370

375

380

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

385

390

395

400

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

Gly

Val

His

Ser

Leu

Ile

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Val

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

Asp

Leu

Val

Leu

Ile

Gly

465

470

475

480

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

485

490

4 95

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

500

505

510

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Ile

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Leu

Glu

Ile

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

610

615

620

Ser

Ile

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys

625

630

635

640

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly Arg

Leu

Ile

Ser

Arg

675

680

685

427

Ala Ile Phe Asp 690

Glu

Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Gly Ařg Lys Thr

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

725

730

735

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Ile

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

Gly

Ile

Ser

Phe

Asn

770

775

780

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Gly Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

820

825

830

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

835

840

845

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

Ile

Asn

His

850

855

860

Pro

Ile

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Met

Ile

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly Asp Arg

Leu

Arg

Ala

Lys

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Leu

Ile

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Arg

930

935

940

Arg

Gin

Glu

Ala

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

945

950

955

960

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

Cys

Val

Ser

Gin

Met

Lys

Pro

Gin

Asn

Pro

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995 1000 1005

42»

Ile Gin Arg	Arg Ser Val Leu	Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu His
10K		101Í		1020
Phe Arg 1025	Cys	Asp Ile Pro Ser 1030	Leu	Asp Ile Gin Asp 1035	Glu	Leu Asp Phe 1040
Ile Leu	Arg	Gly Asn Leu Ser 1045	Phe	Gly Trp Val Ser 1050	Gin	Thr Leu Gin 1055
Glu Lys	Val	Leu Leu Val Ser 1060	Glu	Ala Glu Ile Thr 1065	Phe	Asp Thr Ser 1070
Val Tyr	Ser	Gin Leu Pro Gly	Gin	Glu Ala Phe Leu	Arg	Ala Gin Val
107’	1080	1085
Glu Thr	Thr	Leu Glu Glu Tyr	Val	Val Tyr Glu Pro	Ile	Phe Leu Val
1090	1095	1100
Ala Gly 1105	Ser	Ser Val Gly Gly 1110	Leu	Leu Leu Leu Ala 1115	Leu	Ile Thr Val 1120
Val Leu	Tyr	Lys Leu Gly Xaa 1125	Xaa	Lys Arg Gin Tyr 1130	Lys	Glu Met Leu 1135
Asp Gly Cys Glu	Lys Ala Ala Asp Pro 1140 Thr Pro Pro Tyr Leu 1155	Val Thr Xaa Gly Gin 1145 Val Ser 1160	Ala	Asp Phe Gly 1150

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.-.56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:56:

CCTGTCATGG GTCTAACCTG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů ba'zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:57:

AGGTTAGACC CATGACAGG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:58:

429 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:58:

GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů ba’zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:59;

CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů ba*zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:60:

CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:61:

CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

439 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:62:

GCTGGGATCA TTCGCTATGC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ; jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:63:

CAATGGATGG ACCAGTTCTG G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:64:

CAGATCGGCT CCTACTTTGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:65:

CATGGAGCCT CGAGACAGG 19 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

43l· (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:66:

CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineárni (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:67:

CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineárni (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:68:

CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:69:

CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:70:

GTCACAGAGG GAACCTCC lí

432 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:71:

GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:72:

GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:73:

CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:74:

GTGGATCAGC ACTGAAATCT G 2*.

(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina

433CZ 287921 B6 (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:75:

CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:76:

CACAGCGGAG GTGCAGGCAG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:77:

CTCACTGCTT GCGCTGGC 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (CJ POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:78:

CGGTAAGATA GCTCTGCTGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů ba'zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

434 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:79:

GAGCCCACAG CCAGCACAGG 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:80:

GATCCAACGC CAGATCATAC C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. ¢.:81:

CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:82:

CACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů ba'zi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETÉZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární tii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:83:

TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:84:

435 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:84:

GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:85:

CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:86:

GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:87;

GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

436 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:88:

CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:89:

CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:90:

GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:91:

AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 852 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS

437 (B) UMÍSTĚNÍ: 61..852 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:92:

TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60

ATG GCC Met Ala 1

CTT GGG Leu Gly

GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT TAC CAC

108

Ala Val 5

Val Leu

Leu

Gly 10

Val Leu

Ala

Ser

Tyr His 15

GGA

TTC

AAC

TTG

GAC

GTG

ATG

AGC

GGT

GAT

CTT

CCA

GGA

AGA

CGC

AGC

156

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Met

Ser

Gly Asp

Leu

Pro

Gly

Arg

Ser

20

25

30

GGG

CTT

CGG

GCA

GAG

CGT

GAT

GCA

GTT

TGG

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

204

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Val

Trp Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

CGG

CTG

TAC

252

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly Arg

Leu

Tyr

50

55

60

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

CCA

TTC

ATG

300

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

Ile

Phe

Pro

Phe

Met

65

70

75

80

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

GCA

GCC

TCC

348

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

85

90

95

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

CAT

AGA

GCC

396

Pro

Asn

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Arg

Ala

100

105

110

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

GAT

GCC

444

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

Asp

Ala

115

120

125

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

GAG

TGC

CCA

492

His

Ala

Gin

Pro

Ile

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGC

AGC

ATT

540

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

145

150

155

160

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

GCT

GTG

ATG

588

Ser

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Ala

Val

Met

165

170

175

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

CAG

TAC

TCC

636

Asp

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

185

190

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

AAC

AGC

TCC

684

Asn

Val

Leu

Val

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

Asn

Ser

195

200

205

AAT

CCT

CAG

GGC

CTA

GTG

GAG

CCC

ATT

GTG

CAG

CTG

ACA

GGC

CTC

ACG

732

Asn

Pro

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210 215 220

438

780

TTC ACG Phe Thr 225

GCC Ala

ACA Thr

GGG Gly

ATC Ile 230

CTG Leu

AAA GTG GTG ACA GAG CTG TTT CAA ACC

Lys

Val

Thr Glu Leu 235

Phe Gin Thr 240

AAG

AAC

GGG

GCC

CGC

GAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

GTC

ATC

ACA

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

Thr

245

250

255

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GCG

GCA

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Ala

260

(2}

INFORMACE 0

SEK.

, ID.

, Č.:

:93:

828

852 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 264 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID.

Č.:93:

Met

Ala

Leu

Gly

Ala

Val

Leu

Gly

Val

Leu

Ala

Ser

Tyr

His

1

5

10

15

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Met

Ser

Gly Asp

Leu

Pro

Gly Arg Arg

Ser

20

25

30

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Val

Trp

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

Ile

Phe

Pro

Phe

Met

65

70

75

80

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

85

90

95

Pro

Asn

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Arg

Ala

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

Asp

Ala

115

120

125

His

Ala

Gin

Pro

Ile

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

145

150

155

160

Ser

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Ala

Val

Met

165

170

175

Asp

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

185

190

439

Asn

Val Leu 195

Val Thr

His

Phe

Thr Phe Ser Ser Phe Arg

Asn Ser

Ser

200

205

Asn

Pro

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210

215

220

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

Phe

Gin

Thr

225

230

235

240

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

Thr

245

250

255

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Ala

260 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:94:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina <C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:94:

CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:95:

CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2499 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:96:

ATGACCTTCG GCACTGTGCT TCTTCTGAGT GTCCTGGCTT

CTTATCATGG ATTCAACCTG

6C

GATGTGGAGG AGCCTACGAT CTTCCAGGAG

GATGCAGGCG GCTTTGGGCA GAGCGTGGTG

120

CAGTTCGGTG GATCTCGACT CGTGGTGGGA

GCACCCCTGG AGGTGGTGGC GGCCAACCAG

180

440

ACGGGACGGC	TGTATGACTG	CGCAGCTGCC	ACCGGCATGT	GCCAGCCCAT	CCCGCTGCAC	240
ATCCGCCCTG	AGGCCGTGAA	CATGTCCTTG	GGCCTGACCC	TGGCAGCCTC	CACCAACGGC	300
TCCCGGCTCC	TGGCCTGTGG	CCCGACCCTG	CACAGAGTCT	GTGGGGAGAA	CTCATACTCA	360
AAGGGTTCCT	GCCTCCTGCT	GGGCTCGCGC	TGGGAGATCA	TCCAGACAGT	CCCCGACGCC	420
ACGCCAGAGT	GTCCACATCA	AGAGATGGAC	ATCGTCTTCC	TGATTGACGG	CTCTGGAAGC	480
ATTGACCAAA	ATGACTTTAA	CCAGATGAAG	GGCTTTGTCC	AAGCTGTCAT	GGGCCAGTTT	540
GAGGGCACTG	ACACCCTGTT	TGCACTGATG	CAGTACTCAA	ACCTCCTGAA	GATCCACTTC	600
ACCTTCACCC	AATTCCGGAC	CAGCCCGAGC	CAGCAGAGCC	TGGTGGATCC	CATCGTCCAA	660
CTGAAAGGCC	TGACGTTCAC	GGCCACGGGC	ATCCTGACAG	TGGTGACACA	GCTATTTCAT	720
CATAAGAATG	GGGCCCGAAA	AAGTGCCAAG	AAGATCCTCA	TTGTCATCAC	AGATGGGCAG	780
AAGTACAAAG	ACCCCCTGGA	ATACAGTGAT	GTCATCCCCC	AGGCAGAGAA	GGCTGGCATC	840
ATCCGCTACG	CTATCGGGGT	GGGACACGCT	TTCCAGGGAC	CCACTGCCAG	GCAGGAGCTG	900
AATACCATCA	GCTCAGCGCC	TCCGCAGGAC	CACGTGTTCA	AGGTGGACAA	CTTTGCAGCC	960
CTTGGCAGCA	TCCAGAAGCA	GCTGCAGGAG	AAGATCTATG	CAGTTGAGGG	AACCCAGTCC	1020
AGGGCAAGCA	GCTCCTTCCA	GCACGAGATG	TCCCAAGAAG	GCTTCAGCAC	AGCCCTCACA	1080
ATGGATGGCC	TCTTCCTGGG	GGCTGTGGGG	AGCTTTAGCT	GGTCTGGAGG	TGCCTTCCTG	1140
TATCCCCCAA	ATATGAGCCC	CACCTTCATC	AACATGTCTC	AGGAGAATGT	GGACATGAGG	1200
GACTCTTACC	TGGGTTACTC	CACCGAGCTA	GCCCTGTGGA	AGGGGGTACA	GAACCTGGTC	1260
CTGGGGGCCC	CCCGCTACCA	GCATACCGGG	AAGGCTGTCA	TCTTCACCCA	GGTGTCCAGG	1320
CAATGGAGGA	AGAAGGCCGA	AGTCACAGGG	ACGCAGATCG	GCTCCTACTT	CGGGGCCTCC	1380
CTCTGCTCCG	TGGATGTGGA	CAGCGATGGC	AGCACCGACC	TGATCCTCAT	TGGGGCCCCC	1440
CATTACTATG	AGCAGACCCG	AGGGGGCCAG	GTGTCCGTGT	GTCCCTTGCC	TAGGGGGAGG	1500
GTGCAGTGGC	AGTGTGACGC	TGTTCTCCGT	GGTGAGCAGG	GCCACCCCTG	GGGCCGCTTT	1560
GGGGCAGCCC	TGACAGTGTT	GGGGGATGTG	AATGAGGACA	AGCTGATAGA	CGTGGCCATT	1620
GGGGCCCCGG	GAGAGCAGGA	GAACCGGGGT	GCTGTCTACC	TGTTTCACGG	AGCCTCAGAA	1680
TCCGGCATCA	GCCCCTCCCA	CAGCCAGCGG	ATTGCCAGCT	CCCAGCTCTC	CCCCAGGCTG	1740
CAGTATTTTG	GGCAGGCGCT	GAGTGGGGGT	CAGGACCTCA	CCCAGGATGG	ACTGATGGAC	1800
CTGGCCGTGG	GGGCCCGGGG	CCAGGTGCTC	CTGCTCAGGA	GTCTGCCGGT	GCTGAAAGTG	1360
GGGGTGGCCA	TGAGATTCAG	CCCTGTGGAG	GTGGCCAAGG	CTGTGTACCG	GTGCTGGGAA	192C
GAGAAGCCCA	GTGCCCTGGA	AGCTGGGGAC	GCCACCGTCT	GTCTCACCAT	CCAGAAAAGC	1930
TCACTGGACC	AGCTAGGTGA	CATCCAAAGC	TCTGTCAGGT	TTGATCTGGC	ACTGGACCCA	2040

441

GGTCGTCTGA CTTCTCGTGC CATTTTCAAT AAAACCCTGG GACTGGGGAT TCACTGTGAA TTGGGTTCTG GGAAGGGGGA GAGAGGAGGA TCTGCTGAGC GAGGTGGGAA GGGTTAGGAT GGAGAACCTG GCTCCACGGC TTGGAGGGAG TGGAGGAGGA CTTGTGGTGG AGCGTAGAGA CTCAGGATTG TGTGGAGGAT GTGGTGAGCC TGAGAGAGCC CATCCCCTCC CCCCAGAACC (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:97:

GAAACCAAGA ACCCCACTTT GACTCGAAGA 2100 ACCCTGAAGC TGCTTTTGCC AGTGAGGACT 2160 GCCCAAGGCT GGCCTGGAGC ACCCCCGTTC 2220 GTTGGGGCTG GAGAGAGGGA CATTAGGGCA 2280 CACTGTCAGG GCAGTGGGGA GTGGATGCAG 2340 GGACAGCAGG TTCTTGAAAG CCTGTTCTCT 2400 CCATCATTCT GCACCTCAAC TTCTCACTGG 2460 TGCGTCCTG 2499 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3956 párů bázi (B) TYP; nukleová kyselina (C> POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID.	. Č.:97:
TTTAACTGCA	CCAACTTTAA	AATACGCTAT	TGGAGCTGGA	ATTACCGCGG	CTGCTGGCAC	60
CAGACTTGCC	CTCCAATGGA	TCCTCGTTAA	AGGATTTAAA	GTGGACTCAT	TCCAATTACA	120
GGGCCTCGAA	AGAGTCCTGT	ATTGTTATTT	TTCGTCACTA	CCTCCCCGGG	TCGGGAGTGG	180
GTAATTTGCG	CGCCTGCTGC	CTTCCTTGGA	TGTGGTAGCC	GTTTCTCAGG	CTCCCTCTCC	240
GGAATCGAAC	CCTGATTCCC	CGTCACCCGT	GGTCACCATG	GTAGGCACGT	GCAGTTCGGT	300
GGATCTCGAC	TCGTGGTGGG	AGCACCCCTG	GAGGTGGTGG	CGGCCAACCA	GACGGGACGG	360
CTGTATGACT	GCGCAGCTGC	CACCGGCATG	TGCCAGCCCA	TCCCGCTGCA	CATCCGCCCT	420
GAGGCCGTGA	ACATGTCCTT	GGGCCTGACC	CTGGCAGCCT	CCACCAACGG	CTCCCGGCTC	480
CTGGCCTGTG	GCCCGACCCT	GCACAGAGTC	TGTGGGGAGA	ACTCATACTC	AAAGGGTTCC	540
TGCCTCCTGC	TGGGCTCGCG	CTGGGAGATC	ATCCAGACAG	TCCCCGACGC	CACGCCAGAG	600
TGTCCACATC	AAGAGATGGA	CATCGTCTTC	CTGATTGACG	GCTCTGGAAG	CATTGACCAA	660
AATGACTTTA	ACCAGATGAA	GGGCTTTGTC	CAAGCTGTCA	TGGGCCAGTT	TGAGGGCACT	72C
GACACCCTGT	TTGCACTGAT	GCAGTACTCA	AACCTCCTGA	AGATCCACTT	CACCTTCACC	780
CAATTCCGGA	CCAGCCCGAG	CCAGCAGAGC	CTGGTGGATC	CCATCGTCCA	ACTGAAAGGC	840
CTGACGTTCA	CGGCCACGGG	CATCCTGACA	GTGGTGACAC	AGCTATTTCA	TCATAAGAAT	900
GGGGCCCGAA	AAAGTGCCAA	GAAGATCCTC	ATTGTCATCA	CAGATGGGCA	GAAGTACAAA	960

442

GACCCCCTGG	AATACAGTGA	TGTCATCCCC	CAGGCAGAGA	AGGCTGGCAT	CATCCGCTAC	1020
GCTATCGGGG	TGGGACACGC	TTTCCAGGGA	CCCACTGCCA	GGCAGGAGCT	GAATACCATC	1080
AGCTCAGCGC	CTCCGCAGGA	CCACGTGTTC	AAGGTGGACA	ACTTTGCAGC	CCTTGGCAGC	1140
ATCCAGAAGC	AGCTGCAGGA	GAAGATCTAT	GCAGTTGAGG	GAACCCAGTC	CAGGGCAAGC	1200
AGCTCCTTCC	AGCACGAGAT	GTCCCAAGAA	GGCTTCAGCA	CAGCCCTCAC	AATGGATGGC	1260
CTCTTCCTGG	GGGCTGTGGG	GAGCTTTAGC	TGGTCTGGAG	GTGCCTTCCT	GTATCCCCCA	1320
AATATGAGCC	CCACCTTCAT	CAACATGTCT	CAGGAGAATG	TGGACATGAG	GGACTCTTAC	1380
CTGGGTTACT	CCACCGAGCT	AGCCCTGTGG	AAGGGGGTAC	AGAACCTGGT	CCTGGGGGCC	1440
CCCCGCTACC	AGCATACCGG	GAAGGCTGTC	ATCTTCACCC	AGGTGTCCAG	GCAATGGAGG	1500
AAGAAGGCCG	AAGTCACAGG	GACGCAGATC	GGCTCCTACT	TCGGGGCCTC	CCTCTGCTCC	1560
GTGGATGTGG	ACAGCGATGG	CAGCACCGAC	CTGATCCTCA	TTGGGGCCCC	CCATTACTAT	1620
GAGCAGACCC	GAGGGGGCCA	GGTGTCCGTG	TGTCCCTTGC	CTAGGGGGAG	GGTGCAGTGG	1680
CAGTGTGACG	CTGTTCTCCG	TGGTGAGCAG	GGCCACCCCT	GGGGCCGCTT	TGGGGCAGCC	1740
CTGACAGTGT	TGGGGGATGT	GAATGAGGAC	AAGCTGATAG	ACGTGGCCAT	TGGGGCCCCG	1800
GGAGAGCAGG	AGAACCGGGG	TGCTGTCTAC	CTGTTTCACG	GAGCCTCAGA	ATCCGGCATC	1860
AGCCCCTCCC	ACAGCCAGCG	GATTGCCAGC	TCCCAGCTCT	CCCCCAGGCT	GCAGTATTTT	1920
GGGCAGGCGC	TGAGTGGGGG	TCAGGACCTC	ACCCAGGATG	GACTGATGGA	CCTGGCCGTG	1980
GGGGCCCGGG	GCCAGGTGCT	CCTGCTCAGG	AGTCTGCCGG	TGCTGAAAGT	GGGGGTGGCC	2040
ATGAGATTCA	GCCCTGTGGA	GGTGGCCAAG	GCTGTGTACC	GGTGCTGGGA	AGAGAAGCCC	2100
AGTGCCCTGG	AAGCTGGGGA	CGCCACCGTC	TGTCTCACCA	TCCAGAAAAG	CTCACTGGAC	2160
CAGCTAGGTG	ACATCCAAAG	CTCTGTCAGG	TTTGATCTGG	CACTGGACCC	AGGTCGTCTG	2220
ACTTCTCGTG	CCATTTTCAA	TGAAACCAAG	AACCCCACTT	TGACTCGAAG	AAAAACCCTG	2280
GGACTGGGGA	TTCACTGTGA	AACCCTGAAG	CTGCTTTTGC	CAGATTGTGT	GGAGGATGTG	2340
GTGAGCCCCA	TCATTCTGCA	CCTCAACTTC	TCACTGGTGA	GAGAGCCCAT	CCCCTCCCCC	2400
CAGAACCTGC	GTCCTGTGCT	GGCCGTGGGC	TCACAAGACC	TCTTCACTGC	TTCTCTCCCC	2460
TTCGAGAAGA	ACTGTGGGCA	AGATGGCCTC	TGTGAAGGGG	ACCTGGGTGT	CACCCTCAGC	252C
TTCTCAGGCC	TGCAGACCCT	GACCGTGGGG	AGCTCCCTGG	AGCTCAACGT	GATTGTGACT	258C
GTGTGGAACG	CAGGTGAGGA	TTCCTACGGA	ACCGTGGTCA	GCCTCTACTA	TCCAGCAGGG	2640
CTGTCGCACC	GACGGGTGTC	AGGAGCCCAG	AAGCAGCCCC	ATCAGAGTGC	CCTGCGCCTG	2700
GCATGTGAGA	CAGTGCCCAC	TGAGGATGAG	GGCCTAAGAA	GCAGCCGCTG	CAGTGTCAAC	2760
CACCCCATCT	TCCATGAGGG	CTCTAACGGC	ACCTTCATAG	TCACATTCGA	TGTCTCCTAC	2820

443CZ 287921 B6

AAGGCCACCC TGGGAGACAG GATGCTTATG AGGGCCAGTG CAAGCAGTGA GAACAATAAG	2880
GCTTCAAGCA GCAAGGCCAC CTTCCAGCTG GAGCTCCCGG TGAAGTATGC AGTCTACACC	2940
ATGATCAGCA GGCAGGAAGA ATCCACCAAG TACTTCAACT TTGCAACCTC CGATGAGAAG	3000
AAAATGAAAG AGGCTGAGCA TCGATACCGT GTGAATAACC TCÁGCCAGCG AGATCTGGCC	3060
ATCAGCATTA ACTTCTGGGT TCCTGTCCTG CTGAACGGGG TGGCTGTGTG GGATGTGGTC	3120
ATGGAGGCCC CATCTCAGAG TCTCCCCTGT GTTTCAGAGA GAAAACCTCC CCAGCATTCT	3180
GACTTCCTGA CCCAGATTTC AAGAAGTCCC ATGCTGGACT GCTCCATTGC TGACTGCCTG	3240
CAGTTCCGCT GTGACGTCCC CTCCTTCAGC GTCCAGGAGG AGCTGGATTT CACCCTGAAG	3300
GGCAATCTCA GTTTCGGCTG GGTCCGCGAG ACATTGCAGA AGAAGGTGTT GGTCGTGAGT	3360
GTGGCTGAAA TTACGTTCGA CACATCCGTG TACTCCCAGC TTCCAGGACA GGAGGCATTT	3420
ATGAGAGCTC AGATGGAGAT GGTGCTAGAA GAAGACGAGG TCTACAATGC CATTCCCATC	3480
ATCATGGGCA GCTCTGTGGG GGCTCTGCTA CTGCTGGCGC TCATCACAGC CACACTGTAC	3540
AAGCTTGGCT TCTTCAAACG CCACTACAAG GAAATGCTGG AGGACAAGCC TGAAGACACT	3600
GCCACATTCA GTGGGGACGA TTTCAGCTGT GTGGCCCCAA ATGTGCCTTT GTCCTAATAA	3660
TCCACTTTCC TGTTTATCTC TACCACTGTG GGCTGGACTT GCTTGCAACC ATAAATCAAC	3720
TTACATGGAA ACAACTTCTG CATAGATCTG CACTGGCCTA AGCAACCTAC CAGGTGCTAA	3780
GCACCTTCTC GGAGAGATAG AGATTGTCAA TGTTTTTACA TATCTGTCCA TCTTTTTCAG	3840
CAATGACCCA CTTTTTACAG AAGCAGGCAT GGTGCCAGCA TAAATTTTCA TATGCTTAAG	3900
AATTGTCACA TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTTTAG	3956

(2) INFORMACE O SEK. ID. č.:98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3785 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..3486 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:98:

ATG

ACC

TTC GGC

ACT

GTG

CTT

CTG

AGT

GTC

CTG

GCT

TCT

TAT

CAT

48

Met

Thr

Phe Gly

Thr

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

Tyr

His

1

5

10

15

444

GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA

96

Gly Phe

Asn Leu 20

Asp

Val

Glu

Pro 25

Thr

Ile

Phe Gin

Glu Asp Ala 30

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC

GTG

CAG

TTC

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

144

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG

GTG

GCG

GCC

AAC

CAG

ACG

GGA

CGG

CTG

192

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC

GGC

ATG

TGC

CAG

CCC

ATC

CCG

CTG

CAC

240

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

65

70

75

80

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

TTG

GGC

CTG

ACC

CTG

GCA

GCC

288

Ile

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

85

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG

GCC

TGT

GGC

CCG

ACC

CTG

CAC

AGA

336

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA

AAG

GGT

TCC

TGC

CTC

CTG

GGC

384

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

TCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA

GTC

CCC

GAC

GCC

ACG

CCA

GAG

TGT

432

Ser

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

CCA

CAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATC

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGA

AGC

480

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

ATT

GAC

CAA

AAT

GAC

TTT

AAC

CAG

ATG

AAG

GGC

TTT

GTC

CAA

GCT

GTC

528

Ile

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

165

170

175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC

ACC

CTG

TTT

GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

576

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

ttc

ACC

TTC

ACC

CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

624

Ser

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

CCG

AGC

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

CCC

ATC

GTC

CAA

CTG

AAA

GGC

CTG

672

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

210

215

220

ACG

TTC

ACG

GCC

ACG

GGC

ATC

CTG

ACA

GTG

ACA

CAG

CTA

TTT

CAT

72G

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

240

CAT

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATT

GTC

ATC

768

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

245 250 255

445

ACA GAT GGG CAG AAG TAC

AAA GAC CCC

CTG GAA TAC AGT GAT GTC ATC

816

Thr

Asp

Gly

Gin Lys Tyr 260

Lys Asp

Pro 265

Leu Glu Tyr

Ser

Asp Val 270

Ile

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC

CGC

TAC

GCT

ATC

GGG

GTG

GGA

864

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

Val

Gly

275

280

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

912

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

960

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

AAG

ATČ

TAT

GCA

GTT

GAG

1008

Leu

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

GGA

ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

TCC

TTC

CAG

CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1056

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA

ATG

GAT

GGC

CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1104

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

CTG

TAT

CCC

CCA

AAT

1152

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1200

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GAG

CTA

GCC

CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1248

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC

CGC

TAC

CAG

CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1296

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

GTC Val

ATC TTC ACC CAG GTG Ile Phe Thr Gin Val 435

TCC AGG CAA TGG AGG AAG AAG GCC GAA GTC

1344

Ser

Arg 440

Gin

Trp

Arg

Lys Lys 445

Ala Glu Val

ACA

GGG

ACG

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCC

CTC

TGC

TCC

GTG

1392

Thr

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

CCC

1440

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

148 =

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485 490 495

446

CCT AGG GGG AGG GTG CAG

TGG CAG TGT Trp Gin Cys 505

GAC Asp

GCT GTT CTC CGT GGT GAG

1536

Pro

Arg

Gly

Arg Val Gin 500

Ala Val Leu Arg 510

Gly Glu

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

GGG

1584

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

GGA

1632

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

GAG

CAG

GAG

AAC

GGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

GAA

1680

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

CTC

1728

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

TCC

CCC

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

GCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1776

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

CAG

1824

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

595

600

605

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

ATG

1872

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

GAA

1920

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

GAG

AAG

CCC

AGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

ACC

1968

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

GTC

2016

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

Ile

Gin

Ser

Val

660

665

670

AGG Arg

TTT GAT CTG GCA CTG

GAC CCA GGT CGT CTG ACT TCT

CGT GCC ATT Arg Ala Ile

2064

Phe Asp 675

Leu Ala Leu

Asp Pro 680

Gly

Arg

Leu Thr

Ser 685

TTC

AAT

GAA

ACC

AAG

AAC

CCC

ACT

TTG

ACT

CGA

AGA

AAA

ACC

CTG

GGA

2112

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

690

695

700

CTG

GGG

ATT

CAC

TGT

GAA

ACC

CTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAT

TGT

GTG

216C

Leu

Gly

Ile

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

705

710

715

720

GAG

GAT

GTG

AGC

CCC

ATC

ATT

CTG

CAC

CTC

AAC

TTC

TCA

CTG

GTG

22C9

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725

730

735

447

AGA GAG CCC ATC CCC TCC

CCC CAG AAC Pro Gin Asn 745

CTG Leu

CGT CCT GTG CTG GCC GTG

2256

Arg

Glu

Pro

Ile Pro Ser 740

Arg Pro Val

Leu Ala 750

Val

GGC

TCA

CAA

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

TGT

2304

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

GGG

CAA

GAT

GGC

CTC

TGT

GAA

GGG

GAC

CTG

GGT

GTC

ACC

CTC

AGC

TTC

2352

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

GTG

2400

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

AAC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

GTC

2448

Ile

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

610

815

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

GCC

2496

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA

GTG

2544

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

CAC

2592

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

GAT

2640

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

Ile

Val

Thr

Phe

Asp

065

870

875

880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

AGT

2688

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

CAG

2736

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

CTG Leu

GAG CTC CCG GTG AAG

TAT GCA GTC TAC ACC ATG ATC AGC AGG CAG

2784

Glu Leu 915

Pro Val Lys

Tyr Ala 920

Val

Tyr

Thr Met

Ile 925

Ser Arg Gin

GAA

TCC

ACC

AAG

TAC

TTC

AAC

TTT

GCA

ACC

TCC

GAT

GAG

AAG

AAA

2832

Glu

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

CGA

2880

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

GGG

2928

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

Ile

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

448

GTG GCT GTG TGG GAT GTG

GTC ATG GAG Val Met Glu 985

GCC Ala

CCA TCT Pro Ser

CAG AGT CTC CCC

2976

Val

Ala

Val

Trp Asp Val 980

Gin Ser 990

Leu

Pro

TGT

GTT

TCA

GAG

AGA

AAA

CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC

TTC

CTG

ACC

CAG

3024

Cys

Val

Ser

Glu

Arg

Lys

Pro

Gin

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Gin

995

1000

1005

ATT

TCA

AGA

AGT

CCC

ATG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAG

3072

Ile

Ser Arg

Ser

Pro

Met

Leu

Asp Cys

Ser

Ile

Ala

Asp

Cys

Leu

Gin

1010

1015

1020

TTC

CGC

TGT

GAC

GTC

CCC

TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG

CTG

GAT

TTC

3120

Phe

Arg

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Gin

Glu

Leu

Asp

Phe

1025

1030

1035

1040

ACC

CTG

AAG

GGC

AAT

CTC

AGT

TTC

GGC

TGG

GTC

CGC

GAG

ACA

TTG

CAG

3168

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp

Val

Arg

Glu

Thr

Leu

Gin

1045

1050

1055

AAG

GTG

TTG

GTC

GTG

AGT

GTG

GCT

GAA

ATT

ACG

TTC

GAC

ACA

TCC

3216

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

Phe

Asp

Thr

Ser

1060

1065

1070

GTG

TAC

TCC

CAG

CTT

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

ATG

AGA

GCT

CAG

ATG

3264

Val

Tyr

Ser

Gin

Leu

Pro

Gly

Gin

Glu

Ala

Phe

Met

Arg

Ala

Gin

Met

1075

1080

1085

GAG

ATG

GTG

CTA

GAA

GAC

GAG

GTC

TAC

AAT

GCC

ATT

CCC

ATC

3312

Glu

Met

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Val

Tyr

Asn

Ala

Ile

Pro

Ile

1090

1095

1100

ATG

GGC

AGC

TCT

GTG

GGG

GCT

CTG

CTA

CTG

GCG

CTC

ATC

ACA

GCC

3360

Met

Gly

Ser

Val

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Ala

1105

1110

1115

1120

ACA

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAA

CGC

CAC

TAC

AAG

GAA

ATG

CTG

3408

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

His

Tyr

Lys

Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

GAG

GAC

AAG

CCT

GAA

GAC

ACT

GCC

ACA

TTC

AGT

GGG

GAC

GAT

TTC

AGC

3456

Glu

Asp

Lys

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Phe

Ser

Gly

Asp Asp

Phe

Ser

1140

1145

1150

TGT	GTG	GCC CCA	AAT	GTG	CCT	TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT	3503
Cys	Val	Ala Pro	Asn	Val	Pro	Leu Ser
	1155				1160

TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA

3563

CTTCTGCATA GATCTGCACT

GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG

3623

AGATAGAGAT

TGTCAATGTT TTTACATATC TGTCCATCTT TTTCAGCAAT GACCCACTTT

3693

TTACAGAAGC AGGCATGGTG

CCAGCATAAA TTTTCATATG CTTAAGAATT GTCACATGAA

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAACTTT AG

3785

449 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1161 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:99:

Met

Thr

Phe

Gly

Thr

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

Tyr

His

1

5

10

15

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

Ile

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

20

25

30

Gly Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Val Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly Arg

Leu

50

55

60

Tyr Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

Ile

Pro

Leu

His

65

70

75

80

Ile

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

85

90

95

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

Ser

Arg

Trp

Glu

Ile

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

Ile

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

165

170

175

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Asn

Leu

Lys

Ile

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

210

215

220

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

240

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

245

250

255

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

Ile

260

265

270

450

Pro

Gin

Ala 275

Glu Lys Ala Gly

Ile Ile 280

Arg

Tyr

Ala Ile 285

Gly

Val

Gly

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

Ile

Ser

290

295

300

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

Leu

Gly

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

Val

Ile

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

Thr

Gly

Thr

Gin

Ile

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

Ile

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580 585 590

451

Leu

Thr

Gin 595

Asp Gly Leu Met

Asp Leu 600

Ala Val

Gly

Ala Arg 605

Gly

Gin

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

Ile

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly Asp

Ile

Gin

Ser

Val

660

665

670

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

Ile

675

680

685

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

690

695

700

Leu

Gly

Ile

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

705

710

715

720

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ile

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725

730

735

Arg

Glu

Pro

Ile

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

740

745

750

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

Ile

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

Ile

Val

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly Asp Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900 905 910

452

Leu Glu Leu Pro Val Lys 915	Tyr	Ala Val Tyr 920	Thr	Met	Ile 925	Ser	Arg	Gin
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr	Phe	Asn Phe Ala	Thr	Ser	Asp	Glu	Lys	Lys
930	935			940
Met Lys Glu Ala Glu His	Arg	Tyr Arg Val	Asn	Asn	Leu	Ser	Gin	Arg
945 950			955					960
Asp Leu Ala Ile Ser Ile	Asn	Phe Trp Val	Pro	Val	Leu	Leu	Asn	Gly
965		970					975
Val Ala Val Trp Asp Val	Val	Met Glu Ala	Pro	Ser	Gin	Ser	Leu	Pro
980		985				990
Cys Val Ser Glu Arg Lys	Pro	Pro Gin His	Ser	Asp	Phe	Leu	Thr	Gin
995		1000			1005
Ile Ser Arg Ser Pro Met	Leu	Asp Cys Ser	Ile	Ala	Asp	Cys	Leu	Gin
1010	1015		1020
Phe Arg Cys Asp Val Pro	Ser	Phe Ser Val	Gin	Glu	Glu	Leu	Asp	Phe
1025 1030		1035				1040
Thr Leu Lys Gly Asn Leu	Ser	Phe Gly Trp	Val	Arg	Glu	Thr	Leu	Gin
1045		1050				1055
Lys Lys Val Leu Val Val	Ser	Val Ala Glu	Ile	Thr	Phe	Asp	Thr	Ser
1060		1065				1070
Val Tyr Ser Gin Leu Pro	Gly	Gin Glu Ala	Phe	Met	Arg	Ala	Gin	Met
1075		1080			1085
Glu Met Val Leu Glu Glu	Asp	Glu Val Tyr	Asn	Ala	Ile	Pro	Ile	Ile
1090	1095		1100
Met Gly Ser Ser Val Gly	Ala	Leu Leu Leu	Leu	Ala	Leu	Ile	Thr	Ala
1105 1110		1115				1120
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly	Phe	Phe Lys Arg	His	Tyr	Lys	Glu	Met	Leu
1125		1130				1135
Glu Asp Lys Pro Glu Asp	Thr	Ala Thr Phe	Ser Gly	Asp	Asp	Phe	Ser
1140		1145				1150
Cys Val Ala Pro Asn Val	Pro	Leu Ser

1155 1160 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1318 párů ba'zí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

453· i(ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 17..1255 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. ¢.:100:

AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT 49

Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser 15 10

TAC Tyr

CAC GGA TTC

AAC TTG GAC

GTG GAT GAG CCG GTG ATC TTC

CAG GAA Gin Glu

97

His

Gly Phe 15

Asn Leu

Asp

Val

Asp 20

Glu

Pro

Val

Ile

Phe 25

GAC

GCA

GCG

GGC

TTC

GGG

CAG

AGC

GTG

ATG

CAG

TTT

GGA

TCT

CGA

145

Asp

Ala

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Met

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

30

35

40

CTC

GTG

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

193

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly

45

50

55

CGG

CTG

TAC

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

241

Arg

Leu

Tyr

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

Ile

Phe

60

65

70

75

CCA

TTC

ATG

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

289

Pro

Phe

Met

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

80

85

90

GCA

GCC

TCC

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

337

Alá

Ala

Ser

Pro

Asn

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

95

100

105

CAT

AGA

GCC

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

385

His

Arg

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

110

115

120

CTG

GAT

GCC

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

433

Leu

Asp

Ala

His

Ala

Gin

Pro

Ile

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

125

130

135

GAG

TGC

CCA

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

481

Glu

Cys

Pro

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp Gly

Ser

140

145

150

155

GGC

AGC

ATT

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

529

Gly

Ser

Ile

Ser

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

160

165

170

GCT

GTG

ATG

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

577

Ala

Val

Met

Asp

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

175

180

185

CAG

TAC

TCC

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

625

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val

Leu

Val

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

190

195

200

454 i

AAC AGC Asn Ser 205

TCC AAT CCT CAG

GGC CTA GTG GAG CCC ATT GTG CAG CTG ACA

673

Ser

Asn Pro

Gin

Gly 210

Leu

Val

Glu

Pro Ile Val 215

Gin

Leu

Thr

GGC

CTC

ACG

TTC

ACG

GCC

ACA

GGG

ATC

CTG

AAA

GTG

ACA

GAG

CTG

721

Gly

Leu

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

220

225

230

235

TTT

CAA

ACC

AAG

AAC

GGG

GCC

CGC

GAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

769

Phe

Gin

Thr

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg Glu

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

240

245

250

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

CAC

TAC

AGT

GCT

817

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

His

Tyr

Ser

Ala

255

260

265

GTC

ATC

CCA

CAG

GCA

GAG

CAG

GCG

GGC

ATC

CGC

TAC

GCC

ATC

GGG

865

Val

Ile

Pro

Gin

Ala

Glu

Gin

Ala

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ala

Ile

Gly

270

275

280

GTG

GGG

GAC

GCG

TTC

CAG

AAA

CCC

ACA

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

GAC

ACC

913

Val

Gly Asp

Ala

Phe

Gin

Lys

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asp

Thr

285

290

295

ATC

GCC

TCC

GAG

CCG

CCC

GAC

GCC

CAC

GTG

TTC

CAG

GTG

GAC

AAT

TTC

961

Ile

Ala

Ser

Glu

Pro

Asp

Ala

His

Val

Phe

Gin

Val

Asp

Asn

Phe

300

305

310

315

TCA

GCA

CTC

AGC

ATC

CAA

AAG

CAG

CTG

TAT

GAC

AGG

ATC

TTT

GCC

1009

Ser

Ala

Leu

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Tyr

Asp

Arg

Ile

Phe

Ala

320

325

330

GTC

GAG

GGA

ACC

CTG

TCA

TCG

GCA

AGC

ACC

TCC

TTC

CAG

CAT

GAG

ATG

1057

Val

Glu

Gly

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

335

340

345

TCC

CAA

GAG

GGC

TTC

AGC

TCA

CTT

CTC

ACC

ACG

GAA

GGA

CCG

GTG

CTG

1105

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

350

355

360

GGG

GCT

GTG

GGC

AGC

TTC

GAT

TGG

TCC

GGG

GGT

GCT

TTC

CTG

TAC

CCC

1153

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Asp

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

365

370

375

CCC

GGC

GGG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

AAC

GTG

GAC

1201

Pro

Gly

Ser

Pro

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Asn

Val

Asp

380

385

390

395

ATG

AGG

GAC

TCC

TAC

CTG

GGT

GAG

GAA

GGG

GTG

GGG

GTG

GGG

ACA

GGT

Me:

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Gly

Thr

Gly

400

405

410

1249

GGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGGCTG GGAGGGGAGG GAAGAGGAGG 1305

Gly Ser

GGAGAGGCAA AGA

1318

455· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 413 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:101:

Gly Ala Val Val Leu

Leu Gly

Val

Leu Ala Ser Tyr His Gly Phe

Asn

1

5

10

15

Leu

Asp

Val

Asp

Glu

Pro

Val

Ile

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

Gly

Phe

20

25

30

Gly

Gin

Ser

Val

Met

Gin

Phe

Gly Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

35

40

45

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly Arg

Leu

Tyr

Glu

Cys

50

55

60

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

Ile

Phe

Pro

Phe

Met

Pro

65

70

75

80

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Asn

85

90

95

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Arg

Ala

Cys

Gly

100

105

110

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

Asp

Ala

His

Ala

115

120

125

Gin

Pro

Ile

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Cys

Pro

Asp

Gin

130

135

140

Glu

Met

Asp

Ile

Val

Phe

Leu

Ile

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

145

150

155

160

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Ala

Val

Met

Asp

Gin

165

170

175

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val

180

185

190

Leu

Val

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

Asn

Ser

Asn

Pro

195

200

205

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Phe

Thr

210

215

220

Ala

Thr

Gly

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

Phe

Gin

Thr

Lys

Asn

225

230

235

240

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

Ile

Leu

Ile

Val

Ile

Thr

Asp

Gly

245

250

255

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

His

Tyr

Ser

Ala

Val

Ile

Pro

Gin

Ala

260

265

270

456

Glu Gin Ala Gly

Ile

Arg

Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala

Phe

275

280

285

Gin

Lys

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asp

Thr

Ile

Ala

Ser

Glu

Pro

290

295

300

Pro

Asp

Ala

His

Val

Phe

Gin

Val

Asp

Asn

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

305

310

315

320

Ile

Gin

Lys

Gin

Leu

Tyr

Asp

Arg

Ile

Phe

Ala

Val

Glu

Gly

Thr

Leu

325

330

335

Ser

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

340

345

350

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

355

360

365

Phe

Asp

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Gly Gly

Ser

Pro

370

375

380

Thr

Phe

Ile

Asn

Met

Ser

Gin

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

385

390

395

400

Leu

Gly

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Gly

Thr

Gly Gly

Ser

405

410

(2)

INFORMACE 0

SEK.

ID.

. Č.:

102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1484 párů bází

		(B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	TYP MOLEKULY:	CDNA
	(ix)	CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
		(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS
		(B) UMÍSTĚNÍ:	1..1482
	(xi)	POPIS SEKVENCE	: SEK. ID. Č	.:102:
GAT	GTC	CAG AGC TCC ATC	AGC	TAT GAT	CTG	GCA	CTG	GAC	CCA	GGC	CGC
Asp	Val	Gin Ser Ser Ile	Ser	Tyr Asp	Leu	Ala	Leu	Asp	Pro	Gly	Arg
1		5			10					15
CTG	GTC	TCT CGG GCC ATT	TTT	CAA GAG	ACC	CAG	AAC	CAG	ACT	TTA	ACT
Leu	Val	Ser Arg Ala Ile	Phe	Gin Glu	Thr	Gin	Asn	Gin	Thr	Leu	Thr
		20		25					30
CGA	AGG	AAG ACC CTG GGG	CTG	GGG CGT	CAC	TGT	GAA	ACC	ATG	AGG	CTA
Arg	Arg	Lys Thr Leu Gly	Leu	Gly Arg	His	Cys	Glu	Thr	Met	Arg	Leu
		35		40				45
CTT	TTG	CCA GAC TGC GTA	GAG	GAC GTG	GTG	AAC	CCC	ATC	GTC	CTG	CAC
Leu	Leu	Pro Asp Cys Val	Glu	Asp Val	Val	Asn	Pro	Ile	Val	Leu	His
	50		55				60

144

192

457

CTC AAC TTC

TCC CTG GAG GGA

CAG CCA ATC CTC TCA TCC CAG AAT CTG

240

Leu 65

Asn

Phe

Ser

Leu Glu 70

Gly

Gin

Pro Ile

Leu 75

Ser

Gin

Asn Leu 80

CGC

CCT

GTG

CTG

GCC

ACG

GGC

TCG

CAG

GAC

CAC

TTC

ATT

GCC

TCC

CTC

288

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

85

90

95

CCC

TTT

GAG

AAG

AAC

TGC

GGA

CAA

GAT

CGC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

336

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Gly

Gin

Asp Arg

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

100

105

110

AGC

ATC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCG

GGC

TTG

AAT

ACC

CTG

GTG

GGG

CTC

384

Ser

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Asn

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

115

120

125

TCC

CTG

GAG

CTC

ACA

GTG

ACA

GTG

ACC

GTG

CGG

AAT

GAG

GGC

GAG

GAC

432

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

130

135

140

TCC

TAT

GGG

ACC

GCC

ATC

ACC

CTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCC

TAC

480

Ser

Tyr

Gly

Thr

Ala

Ile

Thr

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

145

150

155

160

AGG

CGG

GTG

TCG

GGC

CAG

ACA

CAA

CCC

TGG

CAG

CGC

CCC

CTG

CAC

CTC

528

Arg

Val

Ser

Gly

Gin

Thr

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

His

Leu

165

170

175

GCA

TGT

GAG

GCT

GTA

CCT

ACC

GAG

AGC

GAG

GGC

TTG

AGG

AGT

ACC

AGC

576

Ala

Cys

Glu

Ala

Val

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Thr

Ser

180

185

190

TGC

AGC

GTC

AAC

CAC

CCC

ATC

TTC

CAA

GGG

GGT

GCT

CAG

GGC

ACT

TTC

624

Cys

Ser

Val

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Gin

Gly Gly

Ala

Gin

Gly

Thr

Phe

195

200

205

GTA

GTC

AAG

TTC

GAT

GTC

TCC

AAG

GCC

AGC

CTG

GGT

GAC

AGG

TTG

672

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly Asp

Arg

Leu

210

215

220

CTC

ATG

GGG

GCC

AGT

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GCG

AGC

AAC

720

Leu

Met

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

AAG

ACC

TCC

TTT

GAG

CTG

GAA

CTG

CCA

GTG

AAA

TAC

GCT

GTC

TAC

ATG

768

Lys

Thr

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Met

245

250

255

ATG ATC ACA AGG CAC

GAA Glu

GGC TCC ACC AGG TTC TTC AAC TTT TCC ACT

816

Met Ile Thr

Arg 260

His

Gly

Ser

Thr Arg 265

Phe Phe Asn

Phe 270

Ser

Thr

TCC

GCT

GAG

AAG

AGC

AAA

GAG

GCC

GAG

CAC

CGC

TAT

CGG

GTG

AAC

864

Ser

Ala

Glu

Lys

Ser

Sex

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

275

280

285

AAC

CTG

AGT

CTG

CGA

GAT

GTG

GCC

GTC

AGC

GTG

GAC

TTC

TGG

GCC

CCC

912

Asn

Leu

Ser

Leu

Arg Asp

Val

Ala

Val

Ser

Val

Asp

Phe

Trp

Ala

Pro

290

295

300

458

GTG CAG CTG AAC

GGA GCA

GCT Ala

GTG Val

TGG GAC GTG GCG GTG GAG GCC CCT

960

Val 305

Gin

Leu

Asn

Gly

Ala 310

Trp Asp

Val 315

Ala

Val

Glu Ala

Pro 320

GCC

CAG

AGC

CTG

CCC

TGT

GCG

CGG

GAG

AGG

GAA

CCT

CCG

AGG

ACC

TCT

1008

Ala

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Glu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

GAC

CTG

AGC

CGG

GTC

CCG

GGG

AGT

CCC

GTG

CTG

GAC

TGC

AGC

GTT

GCG

1056

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

Val

Ala

340

345

350

CAC

TGC

CTG

AGG

TTC

CGC

TGC

CAC

ATC

CCC

TCC

TTC

AGC

GCC

AAG

GAG

1104

His

Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

His

Ile

Pro

Ser

Phe

Ser

Ala

Lys

Glu

355

360

365

GAG

CTC

CAC

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

GCC

TGG

GTC

AGC

1152

Glu

Leu

His

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Trp

Val

Ser

370

375

380

CAG

ATG

CTG

CAA

AAG

GTG

TCG

GTG

AGT

GTG

GCC

GAG

ATC

ACC

1200

Gin

Met

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

385

390

395

400

TTC

AAC

AGG

GCC

GTG

TAC

TCC

CAA

GTT

CCG

GGC

GAG

CCC

TTT

ATG

1248

Phe

Asn

Arg

Ala

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

Met

405

410

415

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACG

GTG

CTG

GAG

TAT

GAG

CAC

GAC

CCC

1296

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

His

Asp

Pro

420

425

430

GTC

CCC

CTG

GTG

GGC

AGC

TGT

GTG

GGC

CTG

GCT

1344

Val

Pro

Leu

Val

Gly

Ser

Cys

Val

Gly

Gly Leu

Leu

Ala

4 35

440

445

CTC

ATC

TCA

GCC

ACC

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAG

CGC

CGG

TAC

1392

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Tyr

450

455

460

AAG

GAG

ATG

CTG

GGC

GAG

AAA

CCG

GGA

GAC

GCG

GCC

ACC

TTC

CCC

GGG

1440

Lys

Glu

Met

Leu

Gly

Glu

Lys

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

4 65

470

475

480

GAG

GAC

GCC

AGC

TGC

GGG

GCT

TCA

GAT

TTG

CCT

TTG

TCC

CAG

1482

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly

Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

485 490

TG 1484 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

459 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:103:

Asp Val Gin Ser 1

Ser Ile Ser 5

Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly

Arg

10

15

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

Ile

Phe

Gin

Glu

Thr

Gin

Asn

Gin

Thr

Leu

Thr

²⁰

25

30

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly Arg

His

Cys

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

35

40

45

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Val

Asn

Pro

Ile

Val

Leu

His

50

55

60

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Glu

Gly

Gin

Pro

Ile

Leu

Ser

Gin

Asn

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

85

90

95

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Gly

Gin

Asp

Arg

Leu

Cys

Glu

Gly Asp

Leu

100

105

110

Ser

Ile

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Asn

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

115

120

125

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

130

135

140

Ser

Tyr

Gly

Thr

Ala

Ile

Thr

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

145

150

155

160

Arg Arg

Val

Ser

Gly

Gin

Thr

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

His

Leu

165

170

175

Ala

Cys

Glu

Ala

Val

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Thr

Ser

180

185

190

Cys

Ser

Val

Asn

His

Pro

Ile

Phe

Gin

Gly

Ala

Gin

Gly

Thr

Phe

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

210

215

220

Leu

Met

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

Lys

Thr

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Met

245

250

255

Met

Ile

Thr

Arg

His

Glu

Gly

Ser

Thr

Arg

Phe

Asn

Phe

Ser

Thr

260

265

270

Ser

Ala

Glu

Lys

Ser

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

275

280

285

Asn

Leu

Ser

Leu

Arg

Asp

Val

Ala

Val

Ser

Val

Asp

Phe

Trp

Ala

Pro

290

295

300

460

Val 305

Gin Leu Asn Gly

Ala Ala Val Trp Asp Val Ala

Val

Glu

Ala

Pro 320

310

315

Ala

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Glu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

Val

Ala

340

345

350

His

Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

His

Ile

Pro

Ser

Phe

Ser

Ala

Lys

Glu

355

360

365

Glu

Leu

His

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Trp

Val

Ser

370

375

380

Gin

Met

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Ile

Thr

385

390

395

400

Phe

Asn

Arg

Ala

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

Met

405

410

415

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

His

Asp

Pro

420

425

430

Val

Pro

Leu

Val

Gly

Ser

Cys

Val

Gly

Leu

Ala

435

440

445

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Tyr

450

455

4 60

Lys

Glu

Met

Leu

Gly

Glu

Lys

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

465

470

475

480

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly

Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

485

4 90

461

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hybridom označený 199M uložený ve sbírce ATCC pod depozitním číslem HB 12058.
2. Monoklonální protilátka sekretovaná hybridomem podle nároku 1.