NO318764B1 - Humant <beta><N>2</N>-integrin-alfa-subenhet - Google Patents

Description

Foreliggende patentsøknad er en delvis fortsettelse

av US patentsøknad nr. 08/362 652, innsendt 21. desember 1994, som i sin tur er en delvis fortsettelse av US patentsøknad nr. 08/286 889, innsendt 5. august 1994, meddelt som US patent nr. 5 470 953 den 28. november 1995, som i sin tur er en delvis fortsettelse av US patentsøknad nr. 08/173 497, innsendt 23. desember 1993, meddelt som US patent nr. 5 437 958 den

1. august 1995.

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår hybridomcellelinjen 199M med aksesjonsnummer ATCC HB-12058 og tilhørende antistoff for et dd-bindingsprotein som er en ny human S2-integrin-a-subenhet som er strukturelt beslektet med de kjente humane {32-integrin-a-subenheter CDlla, CDllb og CDllc.

Oppfinnelsens bakgrunn

Integrinene er en klasse av membranassosierte molekyler som deltar aktivt i cellulær adhesjon. Integriner er transmembranheterodimerer som omfatter en a-subenhet i ikke-kovalent forbindelse med en p-subenhet. Hittil er det blitt identifisert minst 14 a-subenheter og 8 p-subenheter [beskrevet av Springer, Nature, 346:425-434 (1990)]. £}-"subenhetene er generelt i stand til assosiasjon med flere enn én a-subenhet,

og heterodimerene som deler en felles p-subenhet, er blitt klassifisert som underfamilier innen integrinpopulasjonen.

Én klasse av humane integriner, begrenset til ekspresjon i hvite blodceller, er kjennetegnet ved en felles p2-subenhet. Som et resultat av denne cellespesifikke ekspresjon refereres disse integriner vanligvis til som leukocyttinte-griner, Leu-CAM eller leukointegriner. På grunn av den felles |32-subenhet er en alternativ betegnelse på denne klasse |32-integriner. p2-subenheten (CD18) er tidligere blitt isolert i forbindelse med én av tre særskilte a-subenheter, CDlla, CDllb eller CDllc. Isoleringen av et cDNA som koder for human CD18,

er beskrevet av Kishimoto et al., Cell, 48:681-690 (1987). Med offisiell WHO-nomenklatur refereres de heterodimere proteiner

til som CDlla/CD18, CDllb/CD18 og CDllc/CD18; med vanlig nomenklatur refereres de til som henholdsvis LFA-1, Mac-1 eller Mol og pl50,95 eller LeuM5 [Cobbold et al., i Leukocyte Typing III, McMichael (red.), Oxford Press, s. 788 (1987)]. De humane pvintegrin-a-subenheter CDlla, CDllb og CDllc er vist å vandre under reduserende betingelser ved elektroforese med tilsynelatende molekylvekter på henholdsvis ca. 180 kD,- 155 kD og 150 kD, og DNA som koder for disse subenheter, er blitt klonet [CDlla, Larson et al., J. Cell Biol., 108:703-712

(1989); CDllb, Corbi et al., J. Biol. Chem., 263:12403-12411

(1988) og CDllc, Corbi et al., EMBO J., 6:4023-4028 (1987)]. Antatte homologer av de humane £J2-integrin-a- og -p-kjeder, definert ved tilnærmet likhet i molekylvekt, er blitt identifisert på forskjellige måter i andre arter, inkludert aper og andre primater [Letvin et al., Blood, 61:408-410 (1983)], mus [Sanches-Madrid et al., J. Exp. Med., 154:1517 (1981)] og hunder [Moore et al., Tissue Antigens, 36:211-220 (1990)].

De absolutte molekylvekter for antatte homologer fra andre arter er blitt vist å variere i betydelig grad [se f.eks. Danilenko et al., Tissue Antigens, 40:13-21 (1992)], og i fravær av sekvensinformasjon har en definitiv korrelasjon mellom humane integrinsubenheter og de som er identifisert i andre arter ikke vært mulig. Variasjon i antallet medlemmer i en proteinfamilie er dessuten blitt observert mellom forskjellige arter. Man kan f.eks. tenke over at flere IgA-isotyper er blitt isolert i kaniner enn i mennesker [Burnett et al., EMBO J., 8:4041-4047 (1989) og Schneiderman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 86:7561-7565 (1989)]. I mennesker er det likeledes tidligere identifisert minst seks varianter av metallotioninproteinet [Karin og Richards, Nature, 295:797-802

(1982) og Varshney et al., Mol. Cell. Biol., 6:26-37 (1986)], mens i mus foreligger det kun bevis på to slike varianter [Searle et al., Mol. Cell. Biol., 4:1221-1230 (1984)]. Fore-komst av mange forskjellige medlemmer av en proteinfamilie i én art impliserer derfor ikke nødvendigvis at tilsvarende familiemedlemmer eksisterer i en annen art.

I den spesielle sammenheng angående fJ2-integriner er det i hunder blitt observert at den antatte hunde-p2-motpart til den humane CD18 er i stand til dimerdannelse med så mange som fire potensielt forskjellige a-subenheter [Danilenko et al., aupra] . Antistoffer dannet ved immunisering av mus med hundesplenocytter resulterte i monoklonale antistoffer som immunutfelte proteiner som foreløpig betegnes som hundehomo-loger av human CD18, CDlla, CDllb og CDllc, hovedsakelig basert på lignende, men ikke identiske, molekylvekter. Et annet anti-hunde-splenocyttantistoff, Call.8H2, gjenkjente og immunutfelte en fjerde a-lignende hundesubenhet som også er i stand til assosiasjon med £2-subenheten, men som har en en-tydig molekylvekt og er begrenset med hensyn til ekspresjon til et undersett av differensierte vevsmakrofager.

Antistoffer dannet ved immunisering av hamstere med musedendrittceller resulterte i to antiintegrin-antistoffer [Metlay et al., J. Exp. Med., 171:1753-1771 (1990)]. Ett antistoff, 2E6, immunutfelte en alt vesentlig heterodimer med subenheter med tilnærmede molekylvekter på 180 kD og 90 kD, i tillegg til mindre bånd i molekylvektområdet 150-160 kD. Det andre antistoff, N418,' utfelte en annen tilsynelatende heterodimer med subenheter med tilnærmede molekylvekter på 150 kD og 90 kD. Basert på celleadhésjonsblokkeringsstudier ble det fremsatt en hypotese om at antistoff 2E6 gjenkjente en muse-motpart til human CD18. Selv om molekylvekten av N418-anti-genet antydet gjenkjennelse av en musehomolog til human CDllc/CD18, indikerte ytterligere analyse at museantigenet oppviste et vevsfordelingsmønster som var uoverensstemmende med mønsteret observert for human CDllc/CD18.

Antigenene gjenkjent av hunde-Call.8H2-antistoffet og muse-N418-antistoffet kunne representere en variantart (f.eks. en glykosylerings- eller spleisevariant av en tidligere identifisert hunde- eller muse-a-subenhet. Alternativt kan disse antigener representere unike hunde- og museintegrin-a-subenheter. I fravær av spesifikk informasjon angående primærstruktur kan disse alternativer ikke skjelnes fra hverandre.

I mennesker uttrykkes CDlla/CD18 på alle leukocytter. CDllb/CD18 og CDllc/CD18 er vesentlig begrenset til ekspresjon på monocytter, granulocytter, makrofager og naturlige dreper-celler (NK), men CDllc/CD18 påvises også på noen B-celletyper. Generelt dominerer CDlla/CD18 på lymfocytter, CDllb/CD18 på granulocytter og CDllc/CD18 på makrofager [se oversikt, Arnaout, Blood, 75:1037-1050 (1990)]. Ekspresjon av a-kjedene er imidlertid variabel med hensyn til aktiveringstilstanden og differensieringen av de individuelle celletyper [se oversikt, Larson og Springer, Immunol. Rev., 114:181-217 (1990)].

Involveringen av p2-integrinene i humane immunresponser og inflammatoriske responser er blitt demonstrert ved anvendelse av monoklonale antistoffer som er i stand til å blokkere p2-integrinassosiert celleadhesjon. CDlla/CDl8, CDllb/CD18 og CDllc/CD18 deltar f.eks. aktivt i naturlig dreper(NK)cellebinding til lymfomer og adenokarsinomceller [Patarroyo et al., Immunol. Rev., 114:67-108 (1990)], granulo-cyttakkumulering [Nourshargh et al., J. Immunol., 142:3193-3198 (1989)], granulocyttuavhengig plasmalekkasje [Arfors et al., Blood, 65:338-340 (1987), kjemotaktisk respons av stimulerte leukocytter [Arfors et al., aupra] og leukocyttadhesjon til vaskulært endotel [Price ét al., J. Immunol., 139:4174-4177 (1987), og Smith et al., J. Clin. Invest., 83:2008-2017

(1989)]. Den fundamentale rolle for jp2-integriner i immunresponser og inflammatoriske responser gjøres synlig ved det kliniske syndrom referert til som leukocyttadhesjonssvikt (LAD), hvori kliniske manifestasjoner inkluderer tilbake-vendende og ofte livstruende bakterieinfeksjoner. LAD resulterer fra heterogene mutasjoner i p2-subenheten [Kishimoto et al., Cell, 50:193-202 (1987)], og sykdomstilstandens alvorlig-het er proporsjonal med graden av svikten i ekspresjon av £2-subenhet. Dannelse av den komplette integrinheterodimer svekkes av p"2-mutasjonen [Kishimoto et al., supra] .

Det er interessant at minst ett antistoff som er spesifikt for CD18, er blitt vist å inhibere human immunsvikt-virustype 1(HIV-1)-syncytiumdannelse in vitro, skjønt den eksakte mekanisme for denne inhibering er uklar [Hildreth og Orentas, Science, 244:1075-1078 (1989)]. Denne observasjon overensstemmer med oppdagelsen at en hovedmotreseptor for CDlla/CD18, ICAM-1, også er en overflatereseptor for hoved-gruppen av rhinovirusserotyper [Greve et al., Cell, 56:839

(1989)].

I tillegg til den ovenfor beskrevne rollen til £2-integrin beskriver nyere publiserte data som er fremlagt i WO 95/17412 isolering av en ny fi2-integrin-a-subenhet også kalt Od-

Betydningen av p2-integrinbindingsaktivitet i humane immunresponser og inflammatoriske responser underverdsetter dermed nødvendigheten for å utvikle en mer fullstendig forståelse av denne klasse av overflateproteiner. Identifikasjon av hittil ukjente medlemmer av denne integrin-underfamilien, så vel som deres motreseptorer, og dannelsen av monoklonale antistoffer eller andre oppløselige faktorer som kan endre biologisk aktivitet av p2-integrinene, vil tilveiebringe praktiske midler for terapeutisk intervensjon i J32-integrinbeslektede immunresponser og inf lammatoriske responser.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Hybridomcellelirijer som produserer antistoffer spesifikke for åa, er omfattet av foreliggende.oppfinnelse. Teknikker for produksjon av hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer, er velkjente i teknikken. Hybridomcelle-linjer kan dannes etter immunisering av et dyr med renset dd, varianter av Oa eller celler som uttrykker eid eller en variant derav på den ekstracellulære membranoverflate. Immunogencelle-typer inkluderer celler som uttrykker Od in vivo, eller transfekterte prokaryote eller eukaryote cellelinjer som vanligvis ikke uttrykker dd in vivo. For tiden foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen utskilles av hybridomer med betegnelsene 169A, 169B, 170D, 170F, 170E 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R, 188T, 195A, 195C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3, 197A-4, 199A, 199H OG 199M.

Foreliggende oppfinnelse angår også polypeptider og andre ikke-peptidmolekyler som spesifikt bindes til 0.3. Foretrukne bindingsmolekyler inkluderer antistoffer (f.eks. monoklonale og polyklonale antistoffer), motreseptorer (f.eks. membranassosierte og oppløselige former) og andre ligander (f.eks. naturlig forekommende eller syntetiske molekyler), inkludert de molekyler som kompetitivt binder a<j i nærvær av ad-monoklonale antistoffer og/eller spesifikke motreseptorer. Bindingsmolekyler er anvendelige for rensing av aa-polypeptider og identifisering av celletyper som uttrykker Od. Bindingsmolekyler er også anvendelige for modulering (dvs. inhibering, blokkering eller stimulering) av in vivo-bindings-og/eller signaltransduksjonsaktiviteter hos da.

Nye rensede og isolerte polynukleotider (f.eks. DNA-og RNA-transkripter, både sense- og antisensetråder) som koder for en ny human p2-integrin-a-subenhet, ad, og varianter derav (dvs. delesjons-, addisjons- eller substitusjonsanaloger) som besitter bindings- og/eller immunologiske egenskaper som er uløselig forbundet med eid beskrives. Foretrukne DNA-molekyler inkluderer cDNA, genomisk DNA og helt eller delvis kjemisk syntetiserte DNA-molekyler. Et for tiden foretrukket polynukleotid er DNA som er vist i SEKV.ID. NR. 1, som koder for polypeptidet i SEKV.ID. NR. 2. Rekombinante plasmid- og virus-DNA-konstruksjoner (ekspresjonskonstruksjoner) som inkluderer Od-kodende sekvenser, hvori den eid-kodende sekvens er operativt bundet til et homologt eller heterologt trans-kripsjonsregulatorisk element eller elementer, beskrives også.

Isolerte og rensede muse- og rottepolynukleotider som oppviser homologi med polynukleotider som koder for human Od beskrives også. Et foretrukket musepolynukleotid er vist i SEKV.ID. NR. 52; et foretrukket rottepolynukleotid er vist i SEKV.ID. NR. 54.

Prokaryote eller eukaryote vertsceller transformert eller transfektert med DNA-sekvenser som uttrykker Od-polypeptid eller varianter derav beskrives. Vertsceller som er beskrevet er spesielt anvendelige for produksjon av Od-polypeptid i stor skala som kan isoleres fra enten selve vertscellen eller fra mediet som vertscellen dyrkes i. Vertsceller som uttrykker Od-polypeptid på deres ekstracellulære membranoverflate, er også anvendelige som immunogener ved produksjonen av aa-spesifikke antistoffer. Vertsceller transfektert med Od vil fortrinnsvis transfekteres sammen for å uttrykke en £2-integrinsubenhet for å tillate overflateekspresjon av heterodimeren.

Rensede og isolerte cia-polypeptider, fragmenter og variasjoner derav beskrives også. Foretrukne ad-polypeptider er som vist i SEKV.ID. NR. 2. Nye aa-produkter kan erholdes som isolater fra naturlige kilder, men produseres fortrinnsvis, sammen med da-variantprodukter, ved hjelp av rekombinante prosedyrer som involverer vertsceller. Fullstendig glykosylerte, delvis glykosylerte og helt deglykosylerte former av aa-polypeptidet kan dannes ved å variere vertscellen som er utvalgt for rekombinant produksjon og/eller bearbeidelse etter isolering. Variant-Oa-polypeptider kan omfatte vannoppløselige og uoppløselige aa-polypeptider, inkludert analoger hvori én eller flere av aminosyrene er deletert eller erstattet: (1) uten tap, og fortrinnsvis med økning, av én eller flere biologiske aktiviteter eller immunologiske karakteristika som er spesifikke for Oa; eller (2) med spesifikk udyktiggjørelse av en spesiell ligand-/reseptorbindings- eller signaleringsfunksjon. Det beskrives også fusjonspolypeptider hvori ad-aminosyresekvensene uttrykkes i sammenheng med aminosyresekvenser fra andre polypeptider. Slike fusjonspolypeptider kan besitte modifiserte biologiske, biokjemiske og/eller immunologiske egenskaper sammenlignet med villtype-aa. Analoge polypeptider, inkludert ytterligere aminosyrerester (f.eks. lysin eller cystein) som letter multimer-

dannelse, er inkludert.

Analyser for å identifisere Oa-bindingsmolekyler beskrives også, inkludert immobiliserte ligandbindings-analyser, oppløsningsbindingsanalyser, seintillasjonsnærhets-analyser, dihybridscreeningsanalyser og lignende.

In vi tro-analyser for identifikasjon av antistoffer eller andre forbindelser som modulerer aktiviteten av cia, kan f .eks. involvere immobilisering av cia eller en naturlig ligand som oa bindes til, påvisbar merking av den ikke-immobiliserte bindingspartner, inkubasjon av bindingspartnerne sammen og bestemmelse av virkningen av en testforbindelse på mengden av bundet markør, hvori en reduksjon av markør bundet i nærvær av testforbindelsen sammenlignet med mengden av markør bundet i fravær av testforbindelsen, indikerer at testforbindelsen er

en inhibitor av oa-binding.

En annen type analyse for identifikasjon av forbindelser som modulerer interaksjonen mellom a<j og en ligand, involverer immobilisering av eta eller et fragment derav på et fast støttemateriale belagt (eller impregnert) med et fluorescerende middel, merking av liganden med en forbindelse som er i stand til å eksitere det fluorescerende middel, tilveie-bringelse av kontakt mellom den immobil i sert e Od og den merkede ligand i nærvær og fravær av en antatt modulator-forbindelse, påvisning av lysemisjon fra det fluorescerende middel og identifikasjon av modulerende forbindelser som de forbindelser som påvirker emisjon av lys fra det fluorescerende middel, sammenlignet med emisjonen av lys fra det fluorescerende middel i fravær av en moduleringsforbindelse. Alternativt kan ad-liganden være immobilisert, og ad kan være merket i analysen.

En ytterligere fremgangsmåte for identifikasjon av forbindelser som modulerer interaksjonen mellom dd og en ligand, involverer transformasjon eller transfeksjon av egnede vertsceller med en DNA-konstruksjon som omfatter et rapportørgen under kontroll av en promotor regulert av en transkripsjonsfaktor med et DNA-bindingsdomene og et aktiveringsdomene, ekspresjon i vertscellene av en første hybrid-DNA-sekvens som koder for en første fusjon av en del av, eller hele, Od, og enten DNA-bindingsdomenet eller det aktiverende domenet av transkripsjonsfaktoren, ekspresjon i vertscellene av en andre hybrid-DNA-sekvens som koder for en del av, eller hele, liganden og DNA-bindingsdomenet eller aktiveringsdomenet av transkripsjonsfaktoren som ikke er inkorporert i den første fusjon, evaluering av virkningen av en antatt modulerende forbindelse på interaksjonen mellom dd og liganden, ved påvisning av binding av liganden til Od i en spesiell vertscelle ved måling av produksjonen av rapportørgenproduktet i vertscellen i nærvær eller fravær av den antatte modulator, og identifikasjon av modulerende forbindelser som de forbindelser som endrer produksjon av rapportørgenproduktet sammenlignet med produksjon av rapportørproduktet i fravær av den modulerende forbindelse. Spesielt foretrukket for anvendelse i analysen er 2 exA-promotoren, lexA-DNA-bindingsdomenet, Gal4-transakti-veringsdomenet, lacZ-rapportørgenet og en gjærvertscelle.

En modifisert versjon av den ovenfor beskrevne analyse kan anvendes for isolasjon av et polynukleotid som koder for et protein som bindes til eid, ved transformasjon eller transfeksjon av egnede vertsceller med en DNA-konstruksjon som omfatter et rapportørgen under kontroll av en promotor som reguleres av en transkripsjonsfaktor med et DNA-bindingsdomene og et aktiveringsdomene, ekspresjon i vertscellene av en første hybrid-DNA-sekvens som koder for den første fusjon av en del av, eller hele, eid og enten DNA-bindingsdomenet eller aktiveringsdomenet av transkripsjonsfaktoren, ekspresjon i vertscellene av et bibliotek av andre hybrid-DNA-sekvenser som koder for andre fusjoner av en del, eller alle, antatte Od-bindingsproteiner og DNA-bindingsdomenet eller aktiveringsdomenet av transkripsjonsfaktoren som ikke er inkorporert i den første fusjon, påvisning av binding av et ad-bindingsprotein til ad i en spesiell vertscelle ved påvisning av produksjonen av rapportørgenproduktet i vertscellen, og isolering av andre hybrid-DNA-sekvenser som koder for ad-bindingsprotein fra den spesielle vertscelle.

Verdien av informasjonen som tilveiebringes ved beskrivelse av DNA og aminosyresekvenser for er inn-lysende. I en serie av eksempler muliggjør den beskrevne Od-cDNA-sekvens isolering av den humane aa-genomiske sekvens, inkludert transkripsjonene kontroilelementer for den genomiske sekvens. Identifikasjon av Od-allele varianter og heterologe DNA-typer (f.eks. fra rotte eller mus) er også beskrevet. Isolering av det humane ad-genomiske DNA og heterologe DNA-typer kan oppnås ved hjelp av standard DNA/DNA-hybridiseringsteknikker under egnede stringente betingelser, ved anvendelse av hele, eller en del av, Od-cDNA-sekvensen som en probe for å screene et passende bibliotek. Alternativt kan polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av oligonukleotidprimere som er utformet basert på den kjente cDNA-sekvens, anvendes for å amplifisere og identifisere genomiske ad-DNA-sekvenser. Syntetiske DNA som koder for cid-polypeptidet, inkludert fragmenter og andre varianter derav, kan produseres ved hjelp av konvensjonelle synteseraetoder.

DNA-sekvensinformasjon som fremlegges muliggjør også utvikling for ved hjelp av homolog rekombinasjon eller "knockout"-strategier [se f.eks. Kapecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)] å produsere gnagere som ikke uttrykker et funksjonelt Od-polypeptid eller som uttrykker et variant-Od-polypeptid. Slike gnagere er anvendelige som modeller for studering av aktivitetene til cia og da-modulatorer in vivo.

DNA- og aminosyresekvenser som fremlegges her mulig-gjør også analyse av Od-epitoper som aktivt deltar i motresep-torbinding, så vel som epitoper som kan regulere, istedenfor aktivt å delta i, binding. Identifikasjon av epitoper som kan delta i transmembransignaltransduksjon, er også beskrevet.

DNA som beskrives her er også anvendelig for påvisning av celletyper som uttrykker ad-polypeptid. Standard DNA/RNA-hybridiseringsteknikker som benytter Od-DNA for å påvise Od-RNA, kan anvendes for å bestemme det grunnleggende nivå av ad-transkripsjon i en'celle, så vel som endringer av transkripsjonsnivået som respons på interne eller eksterne midler. Identifikasjon av midler som modifiserer transkripsjon og/eller translasjon av ad, kan i sin tur vurderes for poten-siell terapeutisk eller profylaktisk verdi. DNA som beskrives her muliggjør også in situ-hybridisering av Od-DNA til cellulært RNA for å bestemme den cellulære lokalisering av oa-spesifikke budskap i komplekse cellepopulasjoner og vev.

DNA som beskrives her er også anvendelig for identifikasjon av ikke-humane polynukleotidsekvenser som fremviser homologi med humane Od-sekvenser. Besittelse av ikke-humane Od-DNA-sekvenser tillater utvikling av dyremodeller (inkludert f.eks. transgene modeller) av det humane system.

Som et annet aspekt av oppfinnelsen kan monoklonale eller polyklonale antistoffer spesifikke for ad anvendes ved immunhi st ok j etnisk analyse for å lokalisere Od til subcellulære rom eller individuelle celler i vev. Immunhistokjemiske analyser av denne typen er spesielt anvendelige når de benyttes i kombinasjon med in situ-hybridisering for å lokalisere både cid-mRNA og polypeptidprodukter av ad-genet. Identifikasjon av celletyper som uttrykker oa, kan ha betydelige forgreninger for utvikling av terapeutiske og profylaktiske midler. Det forventes at produktene ifølge oppfinnelsen relatert til eid kan benyttes ved behandling av sykdommer hvori makrofager er et vesentlig element av sykdomsprosessen. Dyremodeller for mange patologiske tilstander forbundet med makrofagaktivitet er beskrevet i teknikken. Hos mus er f.eks. makrofagrekruttering til stede med både kronisk og akutt inflammasjon, rapportert av Jutila et al., J. Leukocyte Biol., 54:30-39 (1993). Hos rotter beskriver Adams et al.

[Transplantation, 53:1115-1119 (1992) og Transplantation, 56:794-799 (1993)] en modell for transplantasjonsarteriosklerose etter heterotrof abdominal hjerteallotransplantasjon. Rosenfeld et al. [Arteriosclerosis, 7:9-23 (1987) og Arteriosclerosis, 7:24-34 (1987)] beskriver indusert aterosklerose hos kaniner foret med en kolesterolsupplert diett. Hanenberg et al. [Diabetologia, 32:126-134 (1989)] rapporterer den spontane utvikling av insulinavhengig diabetes i BB-rotter. Yamada et al. [Gastroenterology, 104:759-771 (1993)] beskriver en indusert inflammatorisk tarmsykdom, kronisk granulomatøs kolitt, hos rotter etter injeksjoner av peptidglykan-poly-sakkaridpolymerer fra streptokokker. Cromartie et al. [J. Exp. Med., 146:1585-1602 (1977)] og Schwab et al. [Infection and Immunity, 59:4436-4442 (1991)] rapporterer at injeksjon av celleveggsprotein fra streptokokker i rotter fører til en artrittisk tilstand karakterisert ved inflammasjon av perifere ledd og etterfølgende leddestruksjon. Til sist beskriver Huitinga et al. [Eur. J. Immunol., 23:709-715 (1993)] eksperimentell allergisk encefalomyelitt, en modell for multippel sklerose, hos Lewis-rotter. I hver av disse modeller benyttes dd-antistoffer, andre Od-bindingsproteiner eller oppløselige former av cia for å svekke sykdomstilstanden, antakeligvis gjennom inaktivering av makrofagaktivitet.

Farmasøytiske preparater for behandling av disse og andre sykdomstilstander er omtalt her. Farmasøytiske preparater er utformet for formålet å inhibere interaksjon mellom eid og dens ligand (er) , og inkluderer forskjellige oppløselige og membranassosierte former av Oa (omfattende hele Qd-polypeptidet eller fragmenter derav som aktivt deltar i eid-binding), oppløselige og membranassosierte former av oa-bindingsproteiner {inkludert antistoffer, ligander og lignende), intracellulære eller ekstracellulære modulatorer av Od-bindingsaktivitet og/eller modulatorer av ad- og/eller ad-ligandpolypeptidekspresjon, inkludert modulatorer av transkripsjon, translasjon, posttranslasjonell bearbeidelse og/eller intracellulær transport.

Fremgangsmåter for behandling av sykdomstilstander hvori citi-binding eller lokalisert akkumulering av celler som uttrykker eta, er implisert hvori en pasient som lider av sykdomstilstanden, tilføres en mengde av et farmasøytisk preparat som er tilstrekkelig til å modulere nivåer av eta - binding, eller å modulere akkumulering av celletyper som uttrykker cia omtales også. Behandlingsfremgangsmåten kan anvendes på sykdomstilstander slik som, men ikke begrenset til, type I-diabetes, aterosklerose, multippel sklerose, astma, psoriasis, lungeinflammasjon, akutt åndenødssyndrom og reumatoid artritt.

Kort beskrivelse av figurene

Utallige andre aspekter og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå ved betraktning av den følgende beskrivelse med referanse til figurene, hvori: figurene 1A-1D omfatter en linjeoppstilling av de humane aminosyresekvenser av CDllb (SEKV.ID. NR. 3), CDllc (SEKV.ID. NR. 4) og da (SEKV.ID. NR. 2).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse illustreres ved hjelp av de følgende eksempler som angår isolering av en cDNA-klon som koder for da fra et humant milt-cDNA-bibliotek. Nærmere bestemt illustrerer eksempel 1 anvendelse av anti-hunde-ami-antistoff i et forsøk på å påvise et homologt humant protein. Eksempel 2 beskriver i detalj rensing av hunde-Omi og N-terminal sekvensering av polypeptidet for å utforme oligonukleotidprimere for PCR-amplifikasjon av hunde- a- mi-genet. Eksempel 3 beskriver rensing i stor skala av hunde-Omi for intern sekvensering for å utforme ytterligere PCR-primere. Eksempel 4 beskriver anvendelse av PCR og de interne sekvensprimere for å amplifisere et fragment av hunde-Otmi-genet. Eksempel 5 beskriver kloning av den humane Od-kodende cDNA-sekvens. Eksempel 6 beskriver Northern blot-hybridiseringsanalyser av humane vev og celler for ekspresjon av Od-mRNA. Eksempel 7 beskriver i detalj konstruksjon av humane Od-ekspresjonsplasmider og transfeksjon av COS-celler med de resulterende plasmider. Eksempel 8 beskriver ELISA-analyse av Od-ekspresjon i transfekterte COS-celler. Eksempel 9 beskriver FACS-analyse av COS-celler transfektert med humane" aa-ekspresjonsplasmider. Eksempel 10 beskriver immunutfelling av CD18 i forbindelse med ad i kotransfekterte COS-celler. Eksempel 11 angår stabil transfeksjon av cid-ekspresjonskonstruksjoner i ovarieceller fra kinesisk hamster. Eksempel 12 beskriver CD18-avhengig binding av Od til det intercellulære adhesjonsmolekyl ICAM-R, et ICAM-R-mutant protein, og komplementfaktor iC3b. Eksempel 13 beskriver scintillasjonsproksimalitetsscreeningsanalyser for å identifisere inhibitorer eller enhancere (dvs. modulatorer) av dd-ligand-/antiligandbindingsinteraksjoner. Eksempel 14 beskriver konstruksjon av ekspresjonsplasmider som koder for oppløselige former av Od, og bindingsanalyser av ekspresjonsproduktene. Eksempel 15 angår produksjon av ad-spesifikke, polyklonale sera og monoklonale antistoffer. Eksempel 16 beskriver analyse av Od-vevsfordeling, ekspresjon av Od på perifere blodleukocytter og dd-ekspresjon i inflammatorisk og ikke-inflammatorisk leddvæske ved anvendelse av anti-dd-polyklonalt serum. Eksempel 17 beskriver isolering av rotte-cDNA-sekvenser som viser homologi med humane dd-gen-sekvenser. Eksempel 18 angår konstruksjon av uforkortede rotte-dd-ekspresjonsplasmider, rotte-od-1-domeneekspres jons - plasmider, inkludert I-domene-/IgG-fusjonsproteiner, og produksjon av monoklonale antistoffer mot uforkortede og I-domenefusjonsproteiner. Eksempel 19 beskriver isolering av muse-cDNA-sekvenser som viser homologi med humane dd-gen-sekvenser. Eksempel 20 beskriver isolering av ytterligere muse-dd-cDNA-kloner anvendt for å bekrefte sekvensanalysen. Eksempel 21 angår in aitu-hybridiseringsanalyse av forskjellige musevev for å bestemme vevs- og cellespesifikk ekspresjon av den antatte musehomolog til human Oa. Eksempel 22 beskriver dannelse av ekspresjonskonstruksjoner som koder for den antatte musehomolog av human eid. Eksempel 23 beskriver utforming av en "knockout"-mus hvori genet som koder for den antatte musehomolog av human ad, er ødelagt. Eksempel 24 beskriver isolering av kanin-cDNA-kloner som viser homologi med humane Qd-kodende sekvenser. Eksempel 25 beskriver dyremodeller av humane sykdomstilstander hvori modulering av dd analyseres for terapeutiske muligheter. Eksempel 26 beskriver ekspresjon av Od i dyremodellsykdomstUstander.

Eksempel 1

Forsøk på å påvise en human homolog av hunde- Otmi

Det monoklonale antistoff Call.8H2 [Moore et al.,

supra] , som er spesifikt for hunde-a™., ble testet for kryss-reaktivitet på humane perifere blodleukocytter i et forsøk på å identifisere en human homolog av hunde-Orm- Cellepreparater {typisk 1 x IO<6> celler) ble inkubert med ufortynnet hybridomsupernatant eller et renset muse-IgG-negativt kontrollanti-stoff (10 ug/ml) på is i nærvær av 0,1 % natriumazid. Monoklonal antistoffbinding ble påvist ved etterfølgende inkubasjon med FlTC-konjugert heste-anti-muse-IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ved 6 ug/ml. Fargede celler ble fiksert med 2 % vekt/volum paraformaldehyd i fosfatbufret saltløsning (PBS) og ble analysert med en Facstar Plus fluor-escensaktivert cellesorterer (Becton Dickinson, Mountain View, CA). 10 000 celler ble typisk analysert ved anvendelse av logaritmisk amplifikasjon for fluorescensintensitet.

Resultatene indikerte at Call.8H2 ikke kryssreagerte med overflateproteiner uttrykt på humane perifere blodleukocytter, mens kontrollcellene, neoplastiske hundeperifere blodlymfocytter, var vesentlig alle positive for aTHi-

Fordi det monoklonale antistoff Call.8H2 spesifikt for hunde-a-subenheten ikke kryssreagerte med en human homolog, ble isolering av hunde-aTm-DNA ansett som en nødvendig forutsetning for å isolere human genmotpart, dersom en slik eksisterte.

Eksempel 2

Affinitetsrensing av hunde- aTHi for N- terminal sekvensering

Hunde-Orm ble affinitetsrenset for å bestemme N-terminale aminosyresekvenser for oligonukleotidprobe-/primerutforming. Kort beskrevet ble anti-Orm-monoklonalt antistoff Call.8H2 koplet til Affigel 10 kromatografisk resin (BioRad, Hercules, CA), og protein ble isolert ved spesifikk antistoff-proteininteraksjon. Antistoff ble-konjugert til resinet i overensstemmelse med den foreslåtte protokoll fra BioRad, ved en konsentrasjon på ca. 5 mg antistoff pr. ml resin. Etter konjugasjonsreaksjonen ble overskudd av antistoff fjernet, og resinet ble blokkert med 3 volumer 0,1 M etanolamin. Resinet ble deretter vasket med 3 0 kolonnevolumer fosfatbufret salt-løsning (PBS). 25 g av en enkelt hundemilt ble homogenisert i 250 ml buffer inneholdende 0,32 M sukrose i 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, med proteaseinhibitorer. Kjerner og nedbrutt cellemateriale ble pelletert ved sentrifugering ved 1000 g i 15 minutter. Membraner ble pelletert fra supernatanten ved sentrifugering ved 100 000 g i 30 minutter. Membranpelleten ble resuspendert 1 200 ml lysisbuffer (50 mM NaCl, 50 mM borat, pH 8,0, med 2 % NP-40) og inkubert i 1 time på is. Uoppløselig materiale ble deretter pelletert ved sentrifugering ved 100 000 i 60 minutter. 10 ml av det klarede lysat ble overført til et 15 ml polypropylenrør med 0,5 ml Cali.8H2-konjugert Affigel 10-resin, beskrevet ovenfor. Røret ble inkubert over natten ved 4 °C under rotasjon, og resinet ble deretter vasket med 50 kolonnevolumer D-PBS. Resinet ble deretter overført til et mikrosentrifugerør og kokt i 10 minutter i 1 ml Laemmli (ikke-reduserende) prøvebuffer inneholdende 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 2 % SDS, 20 % glyserol og 0,002 % bromfenolblått. Resinet ble pelletert ved sentrifugering og kastet; supernatanten ble behandlet med 1/15 volum {3-merkaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) og kromatografert på en 7 % polyakrylamidgel. De separerte proteiner ble overført til Immobilon PVDF-membran (Millipore, Bedford, MA) som følger.

Gelene ble vasket én gang i deionisert, Millipore-filtrert vann og ekvilibrert i 15-45 minutter i 10 mM 3-

[sykloheksylamino]-1-propansulfonsyre(CAPS)-overføringsbuffer, pH 10,5, med 10 % metanol. Immobilon-membraner ble fuktet med metanol, fylt med filtrert vann og ekvilibrert i 15-30 minutter i CAPS-overføringsbuffer. Den innledende overføring ble utført ved anvendelse av et Biorad-overføringsapparat ved 70 volt i 3 timer. Immobilon-membranen ble fjernet etter over-føringen og farget i filtrert 0,1 % R250 Coomassie-farge i 10 minutter. Membraner ble avfarget i 50 % metanol/10 % eddiksyre tre ganger, 10 minutter hver gang. Etter avfarging ble membranene vasket i filtrert vann og lufttørket.

Proteinbånd på ca. 150 kD, 95 kD, 50 kD og 3 0 kD ble påvist. Antakeligvis var båndene på 50 kD og 30 kD resultat av antistoffkontaminering. N-terminal sekvensering ble deretter forsøkt på både 150 kD- og 95 kD-båndene, men 95 kD-proteinet var blokkert, hvilket forhindret sekvensering. Proteinbåndet på 150 kD ble utskåret fra membranen og direkte sekvensert med et Applied Biosystems modell 473A-proteinsekvenseringsapparat (FoBter City, CA) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. Den resulterende aminosyresekvens er vist i SEKV.ID.

NR. 5 ved anvendelse av enkeltbokstavaminosyrebetegnelser.

Den identifiserte sekvens inkluderte FNLD-sekvenskarakteris-tika for a-subenheter av integrinfamilien [Tamura et al., J. Cell. Biol., 111:1593-1604 (1990)].

Primerutforming og forsøk på å amplifisere hunde- ami- sekvenser

Fra den N-terminale sekvensinformasjon ble tre oligonukleotidprober utformet for hybridisering: a) "Tommer", et fullstendig degenerert oligonukleotid; b) "Patmer", et delvis degenerert oligonukleotid; og c) "Guessmer", et ikke-degenerert oligonukleotid basert på utnyttelse av pattedyrkodon. Disse prober er vist nedenfor som henholdsvis SEKV.ID. NR. 6, 7 og 8. Nukleinsyresymboler er i overensstemmelse med 37 CF.R. §1.882 for disse og alle andre nukleotidsekvenser heri.

Basert på sekvenseringsdata ble ingen relevante kloner påvist ved anvendelse av disse oligonukleotider i flere lavstringenshybridiseringer til et hundemilt-/perifer blod-makrofag-cDNA-bibliotek klonet i AZAP (Stratagene, La Jolla,

CA) .

Fire andre oligonukleotidprimere, betegnet 5'Deg, 5'Spee, 3'Deg og 3'Spee (som vist i henholdsvis SEKV.ID.

NR. 9, 10, 11 og 12, hvori Deg indikerer degenerert og Spee indikerer ikke-degenerert), ble deretter utformet basert på den utledete N-terminale sekvens for forsøk på å amplifisere hunde-aTHi-sekvenser ved hjelp av PCR fra fagbibliotek-DNA renset fra platelysater av Stratagene-biblioteket beskrevet ovenfor. ciTMi-oligonukleotidprimerne ble paret med T3- eller T7-vektorprimerne, som vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 13 og 14, som hybridiserer til sekvenser som flankerer polylinkerområdet i Bluescript-fagemidet funnet i AZAP.

PCR-amplifikasjonen ble utført i Tag-buffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) inneholdende magnesium, med 150 ng bibliotek-DNA, 1 ug av hver primer, 200uM dNTP og 2,5 enheter Tag-polymerase (Boehringer Mannheim), og produktene ble separert ved elektroforese på en 1 % agarosegel i Tris-acetat-EDTA(TAE)-buffer med 0,25 ug/ml etidiumbromid. DNA ble over-ført til en Hybond-membran (Amersham, Arlington Heights, IL) ved "wicking" over natten i 10 x SSPE..Etter overføring ble det immobiliserte DNA denaturert med 0,5 M NaOH med 0,6 M NaCl, nøytralisert med 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0, i 1,5 M NaCl og vasket med 2 x SSPE før UV-kryssbinding med en Stratalinker (Stratagene) kryssbindingsapparatur. Membranen ble inkubert i prehybridiseringsbuffer (5 x SSPE, 4 x Denhardts, 0,8 % SDS, 30 % formamid) i 2 timer ved 50 °C under omrøring.

Oligonukleotidprober 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg og 3'Spee (henholdsvis SEKV.ID. NR. 9, 10, 11 og 12) ble merket ved anvendelse av en Boehringer Mannheim-kinasebuffer med 100-300 uCi Y<p32->clATP og 1-3 enheter polynukleotidkinase i 1-3 timer ved 37 °C. Uinkorporert markør ble fjernet ved Sephadex G-25 fine-kromatografi (Pharmacia, Piscataway, NJ) ved anvendelse av 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA(TE)-buffer, og eluatet ble tilsatt direkte til prehybridiserings-løsningen. Membraner ble probet i 16 timer ved 42 °C under omrøring og vasket gjentatte ganger med en siste stringensvask med 1 x SSPE/0,1 % SDS ved 50 °C i 15 minutter. Blottet ble deretter eksponert med Kodak X-Omat AR-film i 1-4 timer ved -80 °C.

Oligonukleotidene 5'Deg, 5'Spee, 3'Deg og 3'Spee hybridiserte kun til PCR-produkter fra reaksjonene som de ble anvendt i som primere, og hybridiserte ikke som forventet til PCR-produkter fra reaksjonene hvor de ikke ble anvendt som primere. Det ble således konkludert med at ingen av PCR-produktene var spesifikke for aTMi fordi intet produkt hybridiserte med alle probene.

Eksempel 3

Af f initetsrensing i stor skala av hunde- a- mi for intern sekvensering

For å tilveiebringe en ytterligere aminosyresekvens for primerutforming ble hunde-Orm renset for intern sekvensering. Tre deler av frossen milt (ca. 50 g av hver) og frosne celler fra to oppdelte milter fra voksne hunder ble anvendt for å danne protein for intern sekvensering. 50 g milt ble homogenisert i 200-300 ml boratbuffer med en Waring-blander. Det homogeniserte materialet ble fortynnet med 1 volum buffer inneholdende 4 % NP-40, og blandingen ble deretter forsiktig omrørt i minst 1 time. Det resulterende lysat ble klaret for store nedbrytningsfragmenter ved sentrifugering ved 2000 g i 20 minutter, og deretter enten filtrert gjennom et Corning-forhåndsfilter (Corning, NY) eller et Corning 0,8 mikron-filter. Lysatet ble ytterligere klaret ved filtrering gjennom Corning 0,4 mikron-filtersystemet.

Miltlysatet og det antistoffkonjugerte Affigel 10-resin beskrevet i eksempel 2, ble kombinert i et volumforhold på 150:1 i 100 ml aliquoter og inkubert over natten ved 4 °C på et vippebrett. Lysatet ble fjernet etter sentrifugering ved 1000 gi5 minutter, kombinert med mer antistoffkonjugert Affigel 10-resin og inkubert over natten, som beskrevet ovenfor. De absorberte resinaliquoter ble deretter kombinert og vasket med 50 volumer D-PBS/0,1 % Tween 20, og resinet ble overført til en 50 ml Biorad-kolonne. Adsorbert protein ble eluert fra resinet med 3-5 volumer 0,1 M glysin (pH 2,5); fraksjoner på ca. 900 ul ble oppsamlet og nøytralisert med 100 ul 1 M Tris-buffer, pH 8,0. Aliquoter på 15 ul ble fjernet fra hver fraksjon og kokt i et like stort volum 2 x Laemmli-prøvebuffer med 1/15 volum 1 M ditiotreitol (DTT). Disse prøver ble underkastet elektroforese på 8 % Novex (San Diego, CA) polyakrylamidgeler og enten visualisert ved Coomassie-farging eller ved sølvfarging ved anvendelse av et Daiichi-sett (Enprotech, Natick, MA) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Fraksjoner som inneholdt de største mengder protein, ble kombinert og konsentrert i vakuum. Den resterende oppløsning ble fortynnet med 50 % med reduserende Laemmli-prøvebuffer og kromatografert på 1,5 mm 7 % polyakrylamidgeler i Tris-glysin-/SDS-buffer. Protein ble overført fra gelene til Immobilon-membran ved hjelp av prosedyren beskrevet i eksempel 2 ved anvendelse av Hoefer-overføringsapparatet.

Proteinbåndene som tilsvarte hunde-a™./ ble utskåret fra 10 PVDF-membraner og ga ca. 47 ug totalt protein. Båndene ble avfarget i 4 ml 50 % metanol i 5 minutter, lufttørket og kuttet i 1 x 2 mm biter. Membranbitene ble nedsenket i 2 ml 95 % aceton ved 4 °C i 30 minutter med leilighetsvis virvling

og deretter lufttørket.

Før proteolytisk spalting av det membranbundne protein ble 3 mg cyanogenbromid (CNBr) (Pierce, Rockford, IL) oppløst i 1,25 ml 70 % maursyre. Denne oppløsning ble deretter tilsatt til et rør som inneholdt PVDF-membranbitene, og røret ble inkubert i mørke ved romtemperatur i 24 timer. Supernatanten (Sl) ble deretter overført til et annet rør, og membranbitene ble vasket med 0,25 ml 70 % maursyre. Denne supernatant (S2) ble fjernet og tilsatt til den første supernatant (Sl). 2 ml Milli Q-vann ble tilsatt til de kombinerte supernatanter (Sl og S2), og oppløsningen ble lyofilisert. PVDF-membranbitene ble tørket under nitrogen og ekstrahert på nytt med 1,25 ml 60 % acetonitril, 0,1 % tetrafluoreddiksyre (TFA) ved 42 °C i 17 timer. Denne supernatant (S3) ble fjernet, og membranbitene ble ekstrahert på nytt med 1,0 ml 80 % acetonitril med 0,08 % TFA ved 42 °C i 1 time. Denne supernatant (S4) ble kombinert med de foregående supernatanter (Sl, S2 og S3) og vakuumtørket.

De tørkede CNBr-fragmenter ble deretter oppløst i

63 pl 8 M urea, 0,4 M NH4HC03. Fragmentene ble redusert i 5 ul

45 mM ditiotreitol (DTT) og deretter inkubert ved 50 °C i

15 minutter. Oppløsningen ble deretter avkjølt til romtemperatur, og fragmentene ble alkylert ved tilsetning av 5 ul 100 mM jodacetamid (Sigma, St. Louis, MO). Etter 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur ble prøven fortynnet med 187 ul Milli

Q-vann til en endelig ureakonsentrasjon på 2,0 M. Trypsin (Worthington, Freehold, NJ) ble deretter tilsatt ved et forhold på 1:25 (vekt:vekt) mellom enzym og protein, og proteinet ble oppsluttet i 24 timer ved 37 °C. Oppslutningen ble avslut-tet med tilsetning av 30 ul TFA.

Proteinfragmentene ble deretter separert ved høy-ytelsesvæskekromatografi (HPLC) på et Waters 625 LC-system (Millipore, Milford, MA) ved anvendelse av en 2,1 x 250 mm,

5 mikron Vydac C-18-kolonne (Vydac, Hesperia, CA) ekvilibrert i 0,05 % TFA og HPLC-vann (buffer A). Peptidene ble eluert med økende konsentrasjon av 80 % acetonitril i 0,04 % TFA (buffer B) med en gradient på 38-75 % buffer B i 65-95 minutter og 75-98 % buffer B i 95-105 minutter. Peptider ble fraksjonert ved en strømningshastighet på 0,2 ml/minutt og påvist ved 210 nm.

Etter fraksjonering ble aminosyresekvensen av peptidene analysert ved hjelp av automatisert Edman-nedbryt-ning utført på et Applied Biosystems modell 473A-proteinsekvenseringsapparat ved anvendelse av fabrikantens standard-sykluser og modell 610A-dataanalysesoftwareprogrammet, versjon 1.2.1. Alle sekvenseringsreagenser ble levert av Applied Biosystems. Aminosyresekvensene for 7 av de 8 interne fragmenter er vist nedenfor, hvori "X" indikerer at identiteten til aminosyren ikke var sikker.

Primerut forming

Én av de interne aminosyresekvenser (vist i SEKV.ID. NR. 22) ble deretter anvendt for å utforme en fullstendig degenerert oligonukleotidprimer, betegnet p4(R), som vist i SEKV.ID. NR. 23.-

Eksempel 4

PCR- kloning av et hunde- Q- tmi- fragment

5<1->delen av hunde-a™i-genet ble amplifisert fra dobbelttrådet hundemilt-cDNA ved hjelp av PCR.

A. Dannelse av dobbelttrådet hundemilt- cDNA

1 g frossent materiale av en milt fra en ung hund ble oppmalt i flytende nitrogen på tørris og homogenisert i 20 ml RNA-Stat 60-buffer (Tel-Test B, Inc., Friendswood, TX). 4 ml kloroform ble tilsatt, og oppløsningen ble ekstrahert ved sentrifugering ved 12 000 g i 15 minutter. RNA ble utfelt fra det vandige lag med 10 ml etanol. Poly A<+>RNA ble deretter selektert på Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Oslo, Norge).

5 aliquoter 100 ug totalt RNA ble kombinert og fortynnet med et like stort volum av 2 x bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS). RNA ble deretter inkubert i 5 minutter med Oligo dT Dynabeads (1,0 ml eller 5 mg av mikrokulene for alle prøvene). Mikrokulene ble vasket med buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, -1 mM EDTA og 0,1 % SDS, i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll, før eluering av poly A<+>mRNA med 2 mM EDTA, pH 7,5. Dobbelttrådet cDNA ble deretter dannet ved anvendelse av det eluerte poly A<+>mRNA og Boehringer Mannheim cDNA-syntesesettet i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll.

B. Isolering av et partielt hunde- grøi- cDNA

Oligonukleotidprimere 5'Deg (SEKV.ID. NR. 9) og p4(R)

(SEKV.ID. NR. 23) ble anvendt i en standard PCR-reaksjon ved anvendelse av 150 ng dobbelttrådet cDNA, 500 ng av hver primer, 200 uM dNTP og 1,5 enheter Tag-polymerase (Boehringer Mannheim) i Tag-buffer (Boehringer Mannheim) med magnesium. De resulterende produkter (1 ul av den opprinnelige reaksjon) ble underkastet en andre runde PCR med de samme primere for å øke produktutbyttet. Dette båndet ble eluert fra en 1 % agarosegel på Na45-papir fra Schleicher & Schuell (Keene, NH) i en buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl, ved 65 °C, utfelt og ligert i pCR<tm>II-vektoren (Invitrogen, San

Diego, CA), ved anvendelse av TA-kloningssettet (Invitrogen) og fabrikantens foreslåtte protokoll. Ligeringsblandingen ble overført ved elektroporering i XL-l-blå bakterier (Stratagene) . Én klon, 2.7, ble bestemt til å inneholde sekvenser som tilsvarer axMi-peptidsekvenser som ikke ble benyttet ved utforming av primerne.

Sekvensering ble utført med et Applied Biosystems 373A DNA-sekvenseringsapparat (Foster City, CA), med et farge-deoksyterminatorsyklussekvenseringssett (ABI), hvori fluor-escensmerkede dNTP ble inkorporert i en asymmetrisk PCR-reaksjon [McCabe, "Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR", i PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (red.), s. 7.6-83, Academic Press: New York (1990)] som følger. Prøver ble oppbevart ved 96 °C i 4 minutter og underkastet 25 sykluser av den trinnvise sekvens: 96 °C i 15 sekunder; 50 °C i 1 sekund; 60 °C i 4 minutter. Sekvensdata ble automatisk innlastet på prøvefiler i datamaskinen, som inkluderte kromatogram og tekstfiler. Sekvensen av hele innføyelsen i klon 2.7 er vist i SEKV.ID. NR. 24.

Forsøk på å isolere det uforkortede hunde - Otmi ~ cDNA fra Stratagene-biblioteket (som beskrevet i eksempel 2) var mislykket. Cirka 1 x IO<6> fagplakker ble screenet ved hybridisering under lavstringensbetingelser ved anvendelse av 30 % formamid med klon 2.7 som en probe, men dette ga ingen positive kloner. Forsøk på å amplifisere relevante sekvenser ned-strøms fra sekvensene vist i klon 2.7 ved anvendelse av spesifikke oligonukleotider avledet fra klon 2.7, eller degenererte primere basert på aminosyresekvens fra andre peptidfragmenter paret med et degenerert oligonukleotid basert på det konser-verte a-subenhet-aminosyremotiv GFFKR [Tamura et al., supra], var også mislykket.

Eksempel 5

Kloning av en antatt human homolog av hunde- o- tmi

Som et forsøk på å isolere en human sekvenshomolog

til hunde-arm ble det ca. 1 kb hunde-a™.-fragment fra klon 2.7 anvendt som en probe. Proben ble dannet ved hjelp av PCR under betingelser beskrevet i eksempel 2 ved anvendelse av NT2- (som vist i SEKV.ID. NR. 25) og p4(R)-primere (SEKV.ID. NR. 23).

5'-GTNTTYCARGARGAYGG-3' (SEKV.ID. NR. 25)

PCR-produktet ble renset ved anvendelse av Qiagen (Chatsworth, GA) Quick Spin-settet og fabrikantens foreslåtte protokoll. Det rensede DNA (200 ng) ble merket med 200 uCi a<32->PdCTP ved anvendelse av Boehringer Mannheim "Random Prime"-merkingssett

og fabrikantens foreslåtte protokoll. Uinkorporert isotop ble fjernet ved hjelp av Sephadex G-25 (fine)-gravitasjonskromato-

grafi. Proben ble denaturert med 0,2 N NaOH og nøytralisert med 0,4 mM Tris-HCl, pH 8,0, før anvendelse.

Koloniopptrekk på Hybond-filtre (Amersham) av et humant milt-cDNA-bibliotek i pCDNA/Amp (Invitrogen, San Diego, CA) ble preparert. Filtrene ble først denaturert og nøytrali-sert som beskrevet i eksempel 2 og deretter inkubert i en prehybridiseringsoppløsning (8 ml/filter) med 30 % formamid ved 50 °C under forsiktig omrøring i 2 timer. Merket probe, som beskrevet ovenfor, ble tilsatt til denne oppløsning og inkubert med filtrene i 14 timer ved 42 °C. Filtrene ble vasket to ganger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 37 °C og to ganger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 50 °C. De siste stringensvaskinger var

1 x SSC/0,1 % SDS, to ganger ved 65 °C (lx SSC er 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitrat, pH 7,0). Filtrene ble eksponert med Kodak X-Omat AR-film i 6 timer med en intensifiseringsskjerm. Kolonier som ga signaler på to forskjellige opptrekk, ble streket på plater med LB-medium med magnesium (LBM)/karbenicillin og inkubert over natten ved 37 °C. Resulterende strekede kolonier ble trukket opp med Hybond-filtre, og disse filtre ble behandlet som beskrevet ovenfor. Filtrene ble hybridisert under mer stringente betingelser med 1 kb-proben fra klon 2.7, merket som beskrevet ovenfor, i en 50 % form-amidhybridiseringsoppløsning ved 50 °C i 3 timer. Probede filtre ble vasket med en endelig stringens på 0,1 x SSC/0,1 % SDS ved 65 °C og eksponert med Kodak X-Omat AR-film i

2,5 timer ved -80 °C med en intensifiseringsskjerm. Positive kolonier ble identifisert og dyrket i LBM/karbenicillinmedium over natten. DNA fra kulturene ble preparert ved anvendelse av Promega Wizard miniprep-settet i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll, og det resulterende DNA ble sekvensert.

Den innledende screening resulterte i 18 positive kloner, mens den andre screening under mer stringente hybridi-seringsbetingelser produserte én positiv klon som ble betegnet 19A2. DNA og de utledete aminosyresekvenser av den humane a<i-klon 19A2 er henholdsvis vist i SEKV.ID. NR. 1 og 2.

Karakteristiske egenskaper for det humane Od- cDNA og det beregnede polypeptid

Klon 19A2 omfatter hele kodingsområdet for det modne protein, pluss 48 baser (16 aminosyrerester) av 5'-oppstrøms-signalsekvensen og 241 baser av 3'-utranslatert sekvens som ikke terminerer i en polyadenyleringssekvens. Kjernemolekyl-vekten av det modne protein beregnes å være ca. 125 kD. Det ekstracellulære domenet beregnes å omfatte ca. aminosyrerester 17-1108 i SEKV.ID. NR. 2. Dette ekstracellulære området grenser opp til et ca. 20 aminosyrers område som er homologt med det humane CDllc-transmembrane området (rester 1109-1128 i SEKV.ID. NR. 2). Det cytoplasmatiske domenet omfatter ca. 30 aminosyrer (ca. rester 1129-1161 i SEKV.ID. NR. 2). Proteinet inneholder også et område (rundt rester 150-352) med ca. 2 02 aminosyrer som er homologt med I(innføyelse)-domenet som er felles for CDlla, CDllb og CDllc [Larson og Springer, supra], aE [Shaw et al., J. Biol. Chem., 265:6016-6025 (1994)] og i VLA-1 og VLA-2 [Tamura et al., supra]. I-domenet i andre integriner er blitt vist å delta i ICAM-binding [Landis et al., J. Cell. Biol., 120:1519-1527 (1993); Diamond et al., J. Cell. Biol., 120:1031-1043 (1993)], hvilket antyder at eid også kan binde medlemmer av ICAM-familien av overflatemolekyler. Dette området er ikke vist å eksistere i noen andre integrinsubenheter.

Den utledete aminosyresekvens av ad viser ca. 36 % identitet med sekvensen til CDlla, ca. 60 % identitet med CDllb og ca. 66 % identitet med CDllc. En linjeoppstilling av aminosyresekvenser for CDllb (SEKV.ID. NR. 3), CDllc (SEKV.ID. NR. 4) og dd (SEKV.ID. NR. 2) er vist i figur 1.

De cytoplasmatiske domener av a-subenheter i p2-integriner er typisk forskjellige fra hverandre innenfor den samme art, mens individuelle a-subenheter viser en høy grad av homologi over artsgrenser. Overensstemmende med disse observa-sjoner er det cytoplasmatiske området av dd markert forskjellig fra CDlla, CDllb og CDllc, med unntak av en membranproksi-mal GFFKR-aminosyresekvens som er blitt vist å være konservert blant alle a-integriner [Rojiani et al., Biochemistry, 30:9859-9866 (1991)]. Fordi det cytoplasmatiske haleområdet av integriner er blitt implisert i "inside out"-signalisering og aviditetsregulering [Landis et al., supra], er det mulig at da reagerer med cytosoliske molekyler forskjellige fra molekylene som reagerer med CDlla, CDllb og CDllc og som et resultat deltar i signaliseringsveier som er forskjellige fra de som

involverer andre p2-integriner.

Det ekstracellulære domenet av da inneholder en konservert DGSGS-aminosyresekvens som er tilgrensende til I-domenet; i CDllb er DGSGS-sekvensen et metallbindende område som fordres for ligandinteraksjon [Michishita et al., Cell, 72:857-867 (1993)]. Tre ytterligere antatte kationbindings-seter i CDllb og CDllc er bevart i aa-sekvensen ved aminosyrer 465-474, 518-527 og 592-600 i klon 19A2 (SEKV.ID. NR. 1). dd-I-domenet er 36 %, 62 % og 57 % identisk med de tilsvarende områder i henholdsvis CDlla, CDllb og CDllc, og den relativt lave sekvenshomologi i dette området antyder at aa kan reagere med et ekstra sett av ekstracellulære proteiner som er forskjellige fra proteiner som andre kjente p2-integriner reagerer med. Alternativt kan affiniteten av aa for kjente Pa-int egrinligander, f.eks. ICAM-1, ICAM-2 og/eller ICAM-R, være forskjellig fra affiniteten demonstrert for de andre p2-integrin-/ICAM-interaksjoner [se eksempel 12].

Isolering av ytterligere humane cta- cDNA- kloner for sekvens-bekreftelse

For å bekrefte DNA-sekvensen som koder for human Oa ble ytterligere humane cDNA isolert ved hybridisering fra et humant milt-oligo-dt-primet cDNA-bibliotek (Invitrogen) i pcDNA/Amp (beskrevet i eksempel 5), som ble størrelsesselek-tert ved agarosegelelektroforese for cDNA med lengde større enn 3 kb. Proben for hybridisering var avledet fra et 5'-område av aa, som beskrevet nedenfor. Hybridiseringsbetingelsene var de samme som beskrevet ovenfor for isolering av den opprinnelige humane aa-klon, med unntak av at etter hybridisering ble filtrene vasket to ganger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved romtemperatur og én gang i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 42 °C. Filtrene ble eksponert med Kodak X-Omat AR-film over natten.

5'-da-hybridiseringsproben ble dannet ved hjelp av

PCR fra 19A2-klonen ved anvendelse av primere CDllc-5'For (SEKV.ID. NR. 94) og CDllc-5'Rev (SEKV.ID. NR. 95) under de følgende betingelser. Prøver ble oppbevart ved 94 °C i 4 minutter og underkastet 30 sykluser med temperaturtrinnsekvensen i) 94 °C, 15 sekunder; ii) 5 °C, 30 sekunder; og iii)

72 °C, 1 minutt, i et Perkin-Elmer 9600-termosykliseringsapparat.

Ampiifikasjonsproduktet ble renset ved anvendelse av BioRad (Hercules, CA) Prep-A-gensettet i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Den resulterende 5'-Od-probe hadde en lengde på ca. 720 baser, som tilsvarer området fra nukleotid 1121 til nukleotid 1839 i SEKV.ID. NR. 1. Det rensede DNA (ca. 50 ng) ble merket med <32>P-dCTP ved anvendelse av et Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana) "Random Prime"-merkingssett i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Uinkorporert isotop ble fjernet ved anvendelse av Centrisep Spin-kolonner (Princeton Separations, Adelphia, NJ) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Merket probe ble tilsatt til filtrene i en pre-hybridiseringsløsning inneholdende 45 % formamid, og inkubasjonen ble tillatt å foregå over natten ved 50 °C. Etter inkubasjon ble filtrene vasket som beskrevet ovenfor. 13 kolonier ga signaler på duplikatopptrekk. Positive kolonier ble utplukket fra masterplater, fortynnet i LBM og karbenicillin (100 ug/ml) og utspredt i varierende fortynninger på Hybond-filtre (Amersham). Duplikatfiltre ble hybridisert med den samme oppløsning fra den primære hybridisering, og etter hybridisering ble filtrene vasket med en endelig stringens på 2 x SSC/0,1 % SDS ved 42 °C og eksponert med film. 10 av de opprinnelig identifiserte 13 positive kolonier ble bekreftet i den andre screening. Av disse 10 kloner ble 2 (betegnet A7.Q og A8.Q) sekvensert og bestemt til å kode for human Od. Klon A7.Q ble funnet å ha en lengde på ca. 2,5 kb, inkludert en 5'-leder, en del av et kodings-område og ytterligere 60 baser med 5'-utranslatert sekvens.

Det ufullstendige kodingsområdet ble bestemt til å ha resul-tert fra et avvikende spleiset intronområde ved det tilsvarende nukleotid 2152 i SEKV.ID. NR. 1. Klon A8.Q ble bestemt til å ha en lengde på ca. 4 kb, omspente hele Od-kodingsområdet og inkluderte også en intronsekvens ved den tilsvarende base 305 i SEKV.ID. NR. 1. Sammenlignet med den opprinnelig isolerte Od-klon {SEKV.ID. NR. 1) ble én forskjell observert ved at både A7.Q- og A8.Q-klonene ble bestemt til å inneholde en 3 basers CAG-kodoninnføyelse ved base 1495. Sekvenser for kloner A7.Q og A8.Q er vist i henholdsvis

SEKV.ID. NR. 96 og 97, og en sammensatt human sekvens avledet fra kloner A7.Q og A8.Q og dens tilsvarende utledete aminosyresekvens er vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 98 og 99.

Eksempel 6

Northern- analyse av human aa- ekspresjon i vev

For å bestemme det relative ekspresjonsnivå og vevs-spesifisitet for ctd ble Northern-analyse utført ved anvendelse av fragmenter fra klon 19A2 som prober. Cirka 10 ug totalt RNA fra hvert av flere humane vev eller dyrkede cellelinjer ble applisert på en formaldehydagarosegel i nærvær av 1 ug etidiumbromid. Etter elektroforese ved 100 V i 4 timer ble RNA overført til en nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell)

ved neddypping i 10 x SSC over natten. Membranen ble oppvarmet i 1,5 time ved 80 °C under vakuum. Prehybridiseringsløsning inneholdende 50 % formamid i 3-(N-morfolino)propansulfonsyre-{MOPS)buffer ble anvendt for å blokkere membranen i 3 timer

ved 42 °C. Fragmenter av klon 19A2 ble merket med Boehringer Mannheim "Random Prime"-settet i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner, inkludert både aP<32>dCTP og aP<32>dTTP. Uinkorporert markør ble fjernet på en Sephadex G-25-kolonne i TE-buffer. Membranen ble probet med 1,5 x IO<6> tellinger pr. ml prehybridiseringsbuffer. Blottet ble deretter vasket suksessivt med 2 x SSC/0,1 % SDS ved romtemperatur, 2 x SSC/0,1 %

SDS ved 42 °C, 2 x SSC/0,1 % SDS ved 50 °C, 1 x SSC/0,1 % SDS

ved 50 °C, 0,5 x SSC/0,1 % SDS ved 50 °C og 0,1 x SSC/0,1 % SDS

ved 50 °C. Blottet ble deretter eksponert med film i 19 timer.

Hybridisering ved anvendelse av et BstXI-fragment fra klon 19A2 (tilsvarende nukleotider 2011-3388 i SEKV.ID. NR. 1) avslørte et svakt signal i det ca. 5 kb-området i totalt RNA fra lever, placenta, thymus og tonsill. Det ble ikke påvist noe signal i prøver fra nyre, hjerne eller hjerte. Mengden av RNA til stede i nyrefeltet var minimal, som bestemt ved etidiumbromidfarging.

Ved anvendelse av et andre fragment av klon 19A2 (omfattende området fra baser 500 til 2100 i SEKV.ID. NR. 1) ble RNA-transkripter med to forskjellige størrelser påvist i et humant multivev-Northern(MTN)-blot ved anvendelse av poly A<+->RNA (Clontech). Et ca. 6,5 kb-bånd ble observert i milt- og skjelettmuskel, mens et 4,5 kb-bånd ble påvist i lunge og perifere blodleukocytter. Variasjonen i observerte størrelser kunne være forårsaket av vevsspesifikk polyadenylering, kryss-reaktivitet av proben med andre integrinfamiliemedlemmer eller hybridisering med alternativt spleisede mRNA.

Northern-analyse ved anvendelse av et tredje fragment fra klon 19A2, som omspenner nukleotider 2 000-3100 i SEKV.ID. NR. 1, ga resultater som var overensstemmende med resultatene ved anvendelse av de andre klon 19A2-fragmenter.

RNA fra tre cellelinjer av myeloidslekten ble også probet ved anvendelse av fragmentene som tilsvarer nukleotider 500-2100 og 2000-3100 i SEKV.ID. NR. 1. En THP-l-cellelinje, tidligere stimulert med PMA, ga et diffust signal i det samme størrelsesområdet (ca. 5,0 kb) med en litt sterkere intensitet enn vevssignalene. RNA fra ustimulerte og DMSO-stimulerte HL-60-celler hybridiserte med Od-proben med samme intensitet som vevsprøvene, men PMA-behandling syntes imidlertid å øke signalintensiteten. Fordi PMA og DMSO styrer HL60-cellediffe-rensiering mot henholdsvis monocytt-/makrofag- og granulocytt-reaksjonsveier, antyder dette resultat forhøyet Od-ekspresjon i monocytt-/makrofagcelletyper. U937-celler uttrykte Od-bud-skapet, og dette signal økte ikke med PMA-stimulering. Intet bånd ble påvist i Molt-, Daudi-, H9-, JY- eller Jurkat-celler.

Eksempel 7

Forbigående ekspresjon av humane dg- konstruksjoner

A. Dannelse av ekspresjonskonstruksjoner

Den humane klon 19A2 mangler et initierende metioninkodon "og muligens noe av 5 1-signalsekvensen. For å danne et humant ekspresjonsplasmid som inneholder 19A2-sekvenser, ble det derfor anvendt to forskjellige strategier. I den første ble to plasmider konstruert hvori signalpeptidsekvenser avledet fra gener som koder for enten CDllb eller CDllc, ble spleiset i klon 19A2 for å danne en kimær Od-sekvens. I den andre metoden ble et tredje plasmid konstruert hvori en adeno-sinbase ble tilsatt i posisjon 0 i klon 19A2 for å kode for et initierende metionin.

De tre plasmider inneholdt forskjellige områder som kodet for 5<1->delen av Od-sekvensen eller den kimære ad-sekvens. dd-området ble PCR-amplifisert {se betingelser i eksempel 2) med en spesifikk 3'-primer, BåmRev (vist nedenfor i SEKV.ID. NR. 26), og én av tre 5'-primere. De tre 5'-primere inneholdt i rekkefølge: (1) identiske ikke-spesifikke baser i posisjoner 1-6 som tillater spalting, et EcoRI-sete fra posisjoner 7 til 12 og en konsensus-Kozak-sekvens fra posisjoner 13 til 18; (2) en del av CDllb(primer ER1B)- eller CDllc(primer ERIC)-signal sekvensen eller et adenosin (primer ER1D) ,■ og (3) ytterligere 15-17 baser som spesifikt overlapper 5'-sekvenser fra klon 19A2 for å tillate primerannealing. Primer ER1B, ERIC eller ER1D er henholdsvis vist i SEKV.ID. NR. 27, 28 eller 29, hvor det initierende metioninkodon er understreket og EcoRI-setet er dobbelt understreket.

Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med EcoRI og BamHI.

Alle tre plasmider inneholdt et felles andre Od-område (skal innføyes umiddelbart nedstrøms fra 5'-området beskrevet i det tidligere avsnitt) inkludert 3<1->enden av Od-klonen. Det andre Od-området, som strekker seg fra nukleotid 625 inn i Xbal-setet i vektor 3'-polylinkerområdet av klon 19A2, ble isolert ved spalting av klon 19A2 med BamHI og Xbal.

Det ble utført tre ligeringsreaksjoner hvori 3'-Od-BamHI/ Xbal-fragmentet ble ligert til ett av de tre S^-ctd-Eco-RI/BamHI-fragmenter ved anvendelse av Boehringer Mannheim-ligasebuffer og T4-ligase (1 enhet pr. reaksjon). Etter inkubasjon i 4 timer ved 14 °C ble en passende mengde av vektor pcDNA.3 (Invitrogen) spaltet med EcoRI og Xbal, tilsatt til hver reaksjonsblanding med en ytterligere enhet ligase. Reaksjonene ble tillatt å fortsette i ytterligere 14 timer. Én tiendedel av reaksjonsblandingen ble deretter overført til kompetente XL-l-Blue-celler. De resulterende kolonier ble dyrket, og DNA ble isolert som beskrevet i eksempel 5. Spalting med BcoRI identifiserte tre kloner som var positive for dette restriksjonssetet og således de konstruerte signalsekvenser. Klonene ble betegnet pATM.Bl (CDllb/dd, fra primer ER1B), pATM.CIO (CDllc/ad, fra primer ERIC) og pATM.D12 (adenosin/cid, fra primer ER1D) . Tilstedeværelsen av de passende signalsekvenser i hver klon ble verifisert ved nukleinsyresekvensering.

B. Transfeksjon av COS- celler

Ekspresjon av ad-plasmidene diskutert ovenfor, ble bevirket ved kotransfeksjon av COS-celler med de individuelle plasmider og et CD18-ekspresjonsplasmid, pRC.CD18. Som en positiv kontroll ble COS-celler også kotransfektert med plasmidet pRC.CD18 og et CDlla-ekspresjonsplasmid, pDC.CDllA.

Celler ble overført i kulturmedium (DMEM/10 % FBS/ penstrep) til 10 cm Corning-vevskulturbehandlede petriskåler ved 50 % konfluens 16 timer før transfeksjon. Celler ble fjernet fra platene med Versene-buffer (0,5 mM NaEDTA i PBS) uten trypain ved alle prosedyrer. Før transfeksjon ble platene vasket én gang med serumfritt DMEM. 15 ug av hvert plasmid ble tilsatt til 5 ml transfeksjonsbuffer (DMEM med 20 ug/ml DEAE-dekstran og 0,5 mM klorokin) på hver plate. Etter inkubasjon i 1,5 time ved 37 °C ble cellene sjokkbehandlet i 1 minutt med 5 ml DMEM/10 % DMSO. Denne DMSO-løsning ble deretter erstattet med 10 ml/plate kulturmedium.

Resulterende transfektanter ble analysert ved hjelp av ELISA, FACS og immunutfelling, som beskrevet i eksemplene 8, 9 og 10.

Eksempel 8

ELISA- analyse av COS- transfektanter

For å bestemme hvorvidt COS-cellene kotransfekterte med CD18-ekspresjonsplasmid pRC.CD18 og hvorvidt et oa-plasmid uttrykte aa på celleoverflaten i forbindelse med CD18, ble det utført ELISA ved anvendelse av primære antistoffer mot CD18 (f.eks. TS1/18 renset fra ATCC HB203). Som en positiv kontroll ble det også utført ELISA på celler kotransfektert med CD18-ekspresjonsplasmidet og et CDlla-ekspresjonsplasmid, pDC.CDllA. De primære antistoffer i denne kontroll inkluderte CD18-antistoffer og anti-CDlla-antistoffer (f.eka. TS1/22 renset fra ATCC HB202).

For ELISA ble celler fra hver plate fjernet med Versene-buffer og overført til en enkelt 96-brønners, flat-bunnet Corning-vevskulturplate. Celler ble tillatt å inkubere i kulturmedium 2 dager før analyse. Platene ble deretter vasket to ganger med 150 ul/brønn D-PBS/0,5 % teleost-hudgela-tinoppløsning (Sigma). Denne buffer ble anvendt i alle trinn unntatt under fremkallingen. Alle vaskinger og inkubasjoner ble utført ved romtemperatur. Brønnene ble blokkert med gela-tinoppløsning i 1 time. Primære antistoffer ble fortynnet til 10 ug/ml i gelatinoppløsning, og 50 ul ble deretter tilsatt til hver brønn. Tre brønner ble deretter anvendt for hvert primært antistoff. Etter inkubasjon i 1 time ble platene vasket tre ganger med 150 ul/brønn gelatinoppløsning. Sekundært antistoff (geite-anti-muse-Ig/HRP-Fc-spesifikt [Jackson, West Grove, PA]) ved en fortynning på 1:3500 ble tilsatt i en mengde på 50 ul/brønn, og platene ble inkubert i 1 time. Etter tre vaskinger ble platene fremkalt i 20 minutter med 100 ul/ brønn o-fenyldiaminoppløsning (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD i sitratbuffer) før tilsetning av 50 ul/brønn 15 % svovelsyre.

Analyse av transfektanter i ELISA-formatet med anti-CD18-spesifikke antistoffer avslørte ingen signifikant ekspresjon over bakgrunnsnivået i celler som kun var transfektert med plasmidet som koder for CD18. Celler som var kotransfektert med plasmid inneholdende CDlla og CD18, viste en ekspre-sjonsøkning i forhold til bakgrunnen ved analysering med CD18-spesifikke antistoffer eller med reagenser spesifikke for CDlla. Ytterligere analyse av celler som var kotransfektert med plasmider som koder for CD18 og én av aa-ekspresjons-konstruksjonene (pATM.ClO eller pATM.D12), avslørte at celle-overflateekspresjonen av CD18 ble reddet ved ledsagende ekspresjon av dd. Økningen av påviselig CD18-ekspresjon i COS-celler transfektert med pATM.ClO eller pATM.D12, var sammenlignbar med den observerte i kotransfekterte CDlla/CD18-positive kontrollceller.

Eksempel 9

FACS- analyse av COS- transfektanter

For FACS-analyse ble celler i petriskåler tilført friskt kulturmedium dagen etter transfeksjon og inkubert i 2 dager før analysen. Transfekterte celler ble fjernet fra platene med 3 ml Versene, vasket én gang med 5 ml FACS-buffer (DMEM/2 % FBS/0,2 % natriumazid) og fortynnet til 500 000 celler/prøve i 0,1 ml FACS-buffer. 10 pl av enten 1 mg/ml FITC-konjugerte CD18-, CDlla- eller CDllb-spesifikke antistoffer (Becton Dickinson) eller 800 ug/ml CFSE-konjugert muse-23F2G (anti-CD18) (ATCC HB11081) ble tilsatt til hver prøve. Prøvene ble deretter inkubert på is i 45 minutter, vasket tre ganger med 5 ml/vask FACS-buffer og resuspendert i 0,2 ml FACS-buffer. Prøvene ble bearbeidet på Becton Dickinson FACScan, og dataene ble analysert ved anvendelse av Lysis II-software (Becton Dickinson).

COS-celler kun transfektert med CD18-sekvenser ga ingen farge for CD18, CDlla eller CDllb. Når de ble kotransfektert med CDlla/CD18, ble ca. 15 % av cellene farget med antistoffer mot CDlla eller CD18. Alle celler transfektert med CD18 og enhver ad-konstruksjon ga ingen påvisbar farging for CDlla og CDllb. pATM.Bl-, pATM.ClO- og pATM.Dl2-gruppene ble farget henholdsvis 4 %, 13 % og 8 % positive for CD18. Fluorescens i den positive populasjon i CDlla/CD18-gruppen var fire ganger høyere enn bakgrunnen. Som sammenligning produserte kotransfeksjonen av ad-konstruksjoner med CD18-konstruksjonen en positiv populasjon som viste en 4-7 gangers økning av fluorescensintensitet i forhold til bakgrunnen.

Eksempel 10

Biotinmerket immunutfelling av humane ad/ CDl8- komplekser fra kotransfekterte COS- celler

Immunutfelling ble forsøkt på celler kotransfektert med CD18 og hvert av Od-ekspresjonsplasmidene separat beskrevet i eksempel 7, for å bestemme hvorvidt a& kunne isoleres som en del av det a{J-heterodimere kompleks som er karakteristisk for integriner.

Transfekterte celler (1-3 x 10<8> celler/gruppe) ble fjernet fra petriskåler med Versene-buffer og vasket tre ganger i 50 ml/gruppe D-PBS. Hver prøve ble merket med 2 mg sulfo-NHS-biotin (Pierce, Rockford, IL) i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet med vask tre ganger i 50 ml/prøve kald D-PBS. Vaskede celler ble resuspendert i 1 ml lysisbuffer (1 % NP40; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,2 M NaCl;

2 mM Ca<++>; 2 mM Mg<++> og proteaseinhibitorer) og inkubert i

15 minutter på is. Uoppløselige materiale ble pelletert ved sentrifugering ved 10 000 g i 5 minutter, og supernatanten ble overført til friske rør. For å fjerne materialet som var ikke-spesifikt reaktivt med museimmunglobulin ble det først utført et forhåndsklaringstrinn. 25 ug museimmunglobulin (Cappel, West Chester, PA) ble inkubert med supernatanter ved 4 °C.

Etter 2,5 timer ble 100 ul (25 ug) kanin-antimuse-Ig-konjugert Sepharose (fremstilt fra protein A-Sepharose 4B og kanin-anti-muse-IgG, begge fra Zymed, San Francisco, CA) tilsatt til hver prøve; inkubasjonen ble fortsatt ved 4 °C under vugging i 16 timer. Sepharose-kuler ble fjernet fra supernatanten ved sentrifugering. Etter forhåndsklåring ble supernatantene deretter behandlet med 20 ug anti-CD18-antistoff (TS1.18) i 2 timer ved 4 °C. Antistoff-/antigenkomplekser ble isolert fra supernatanter ved inkubasjon med 100 ul/prøve kanin-anti-muse-/protein A-Sepharose-preparatet beskrevet ovenfor. Kulene ble vasket fire ganger med 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl og 1 % Triton-X-100. Vaskede kuler ble pelletert og kokt i 10 minutter i 20 pl 2 x Laemmli-prøvebuffer med 2 % f<J->merkaptoetanol. Prøver ble sentrifugert og kromatografert på en 8 % forhånds-fylt Novex-polyakrylamidgel (Novex) ved 100 V i 30 minutter. Protein ble overført til nitrocellulosemembraner (Schleicher & Schuell) i TBS-T-buffer ved 200 mA i 1 time. Membraner ble blokkert i 2 timer med 3 % BSA i TBS-T. Membranene ble behandlet med 1:6000-fortynning av streptavidin-pepperrotperoksidase (POD) (Boehringer Mannheim) i 1 time, etterfulgt av tre vaskinger i TBS-T. Amersham forsterket kjemiluminescenssett ble deretter anvendt i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner for å fremkalle blottet. Membranen ble eksponert med hyperfilm MP (Amersham) i 0,5-2 minutter.

Immunutfelling av CD18-komplekser fra celler transfektert med pRC.CD18 og enten pATM.Bl, pATM.ClO eller pATM.D12 avslørte overflateekspresjon av en heterodimer type bestående av ca. 100 kD p-kjede, hvilket er overensstemmende med den forutsagte størrelse av CD18, og en a-kjede på ca. 150 kD som tilsvarer aa.

Eksempel 11

Stabil transfeksjon av human aa i ovarieceller fra kinesisk hamster

For å bestemme hvorvidt aa uttrykkes på celleoverflaten som en heterodimer i forbindelse med CD18 ble cDNA som koder for hver kjede, både forbigående og stabilt, transfektert inn i en cellelinje som manglet både cia og CD18.

For disse eksperimenter ble ad-cDNA forlenget med ytterligere ledersekvenser og en Kozak-konsensussekvens, som beskrevet i eksempel 7, og subklonet i ekspresjonsvektor pcDNA3. Den endelige konstruksjon, betegnet pATM.D12, ble kotransfektert med en modifisert kommersiell vektor, pDCl.CDIS, som koder for human CD18, i dihydrofolatreduktase-(DHFR) "-kinesisk hamster-ovarie(CHO)celler. Plasmidet pDCl.CDIS koder for en DHFR<+->markør, og transf ektanter kan utvelges ved anvendelse av et passende nukleosidmanglende medium. Modifikasjonene som resulterte i pDCl.CDIS, er som følger.

Plasmidet pRC/CMV (Invitrogen) er en pattedyrekspre-sjonsvektor med en cytomegaloviruspromotor og et ampicillin-resistensmarkørgen. Et DHFR-gen fra plasmidet pSC1190-DHFR ble innføyd i pRC/CMV-5' for SV40-replikasjonsstartområdet. En polylinker fra 5<1->området av plasmidet pHF2G-DHF ble dessuten ligert i pRC/CMV/DHFR-konstruksjonen, 3' for DHFR-genet. CD18-kodingssekvensene klones deretter i det resulterende plasmid mellom det 5<1->flankerende polylinkerområdet og det bovint veksthormon-poly A-kodingsområdet.

Overflateekspresjon av CD18 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av det monoklonale antistoff TS1/18. Heterodimerdannelse påvist mellom a<j og CD18 i denne cellen var overensstemmende med immunutfellingen beskrevet i eksempel 10 med forbigående ekspresjon i COS-celler.

Eksempel 12

Human aa bindes til ICAM- R på en CD18- avhengig måte

I betraktning av rapporter som demonstrerer inter-aksjoner mellom leukocyttintegrinene og de intercellulære adhesjonsmolekyler (ICAM) som formidler celle-cellekontakt [Hynes, Cell, 69:11-25 (1992)], ble evnen til CHO-celler som uttrykker Od/CD18 til å binde ICAM-1, ICAM-R eller VCAM-1, bestemt ved hjelp av to metoder.

I gjentatte analyser ble oppløselige ICAM-1-, ICAM-R-eller VCAM-1-IgGl-fusjonsproteiner immobilisert på plast, og aa/CD18-CHO-transfekterte cellers evne til å binde den immobiliserte ligand ble bestemt. Transfekterte celler ble merket internt med kalsein, vasket i bindingsbuffer (RPMI med 1 % BSA) og inkubert i enten buffer alene (med eller uten

10 ng/ml PMA) eller buffer med anti-CD18-monoklonale antistoffer ved 10 ug/ral. Transfekterte celler ble tilsatt til 96-brønners Iramulon 4-mikrotiterplater som tidligere var belagt med oppløselig ICAM-1/IgGl-, ICAM-R/IgGl- eller VCAM-l/IgGl-fusjonsprotein eller bovint serumalbumin (BSA) som en negativ kontroll. Utforming av de oppløselige former av disse adhesjonsmolekyler er beskrevet og fullstendig redegjort for i US patentsøknad nr. 08/102 852, innsendt 5. august 1993. Brønner ble blokkert med 1 % BSA i PBS før tilsetning av merkede celler. Etter vask av platene ved nedsenking i PBS med 0,1 % BSA i 20 minutter ble resterende total fluorescens i hver brønn målt ved anvendelse av en Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA).

I eksperimenter med immobiliserte ICAM oppviste dd/CD18-kotransfektanter konsekvent en 3-5 gangers økning i binding til ICAM-R/IgGl-brønner i forhold til BSA-belagte brønner. Spesifisiteten og CD18-avhengigheten av denne binding ble demonstrert ved de inhibitoriske effekter av anti-CD18-antistoff TS1/18. Bindingen av celler transfektert med CDlla/CD18 til ICAM-l/IgGl-brønner var sammenlignbar med bindingen observert med BSA-belagte brønner. CDlla/CD18-transfekterte celler viste en 2-3 gangers økning i binding til ICAM-1/IgGl-brønner kun etter forbehandling med PMA. PMA-behandling av Od/CD18-transfektanter påvirket ikke binding til ICAM-1/IgGl- eller ICAM-R/IgGl-brønner. Ingen påvisbar binding av ad/CD18-transfektanter til VCAM-1/IgGl-brønner ble observert .

Binding av ad/CD18-transfekterte celler til oppløse-lige ICAM-1/IgGl-, ICAM-R/IgGl- eller VCAM-1/IgGl-fusjonsproteiner ble bestemt ved hjelp av strømningscytornetri. Cirka 1 million Gm/CDIB-transfekterte CHO-celler (dyrket i rota-sjonskolber for høyere ekspresjon) pr. måling ble suspendert i 100 ul bindingsbuffer (RPMI og 1 % BSA) med eller uten 10 ug/ ml anti-CD18-antistoff. Etter 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur ble cellene vasket i bindingsbuffer, og oppløse-lig ICAM-1/IgGl- eller ICAM-R/IgGl-fusjonsprotein ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 ug/ml. Binding ble tillatt å foregå i 30 minutter ved 37 °C, hvoretter cellene ble vasket tre ganger og resuspendert i 100 pl bindingsbuffer inneholdende FITC-konjugert sau-antihuman-IgG ved en 1:100-fortynning. Etter 30 minutters inkubasjon ble prøver vasket tre ganger og suspendert i 200 pl bindingsbuffer for analyse med Becton Dickinson FACScan.

Cirka 40-50 % av a<i/CD18 - transf ektantene indikerte binding til ICAM-R/IgGl-, men ingen binding til ICAM-l/lgGl-eller VCAM-1/IgGl-proteiner. Forhåndsbehandling av transfekterte celler med PMA har ingen virkning på Oa/CDl8-binding til verken ICAM-l/lgGl, ICAM-R/IgGl eller VCAM-l/IgGl, hvilket var overensstemmende med den immobiliserte adhesjonsanalyse. Binding til ICAM-R ble redusert til bakgrunnsnivåer etter behandling av Od/CDl8-transfektanter med anti-CD18-antistoff TS1/18.

De kollektive data fra disse to bindingsanalyser illustrérer at Od/CD18 bindes til ICAM-R med preferanse sammenlignet med ICAM-1 og VCAM-1. Od/CD18-bindingspreferansen for ICAM-R fremfor ICAM-1 står i motsetning til det som observeres med CDlla/CD18 og CDllb/CD18. Modulering av aa/CD18-binding kan således forventes å selektivt påvirke normal og patologisk immunfunksjon hvor ICAM-R spiller en fremtredende rolle. Resultater fra lignende analyser hvori antistoffer immunspesifikke for forskjellige ekstracellulære domener av ICAM-R ble testet for deres evne til å inhibere binding av ICAM-R til ctd/CD18-transfektanter, indikerte dessuten at cid/CD18 og CDlla/CD18 reagerer med forskjellige domener av

ICAM-R.

Den manglende evne hos CDlla/CD18 til å binde ICAM-1/IgGl eller ICAM-R/IgGl i oppløsning antyder at bindings-affiniteten mellom CDlla/CD18 og ICAM-1 eller ICAM-R er for lav til å tillate binding i oppløsning. Påvisning av aa/CD18-binding til ICAM-R/IgGl antyder imidlertid en usedvanlig høy bindingsaffinitet.

FACS-adhesjonsanalysen beskrevet ovenfor ble anvendt for å teste bindingen av en ICAM-R-mutant, E37A/Ig, til CHO-celler som uttrykker cid/CD18. E37A/Ig er vist å forebygge binding til en LFA-l/Ig-kimær [Sadhu et al., Cell Adhesion and Communication, 2:429-440 (1994)]. Det mutante protein ble uttrykt i en oppløselig form fra en stabilt transfektert CHO-cellelinje og renset gjennom en Prosep-A-kolonne, som beskrevet av Sadhu et al., supra.

E37A/Ig-binding med ad/CD18-transfektantene ble ikke påvist ved gjentatte analyser. Den gjennomsnittlige fluorescensintensitet (MFI) av E37A/Ig-kimæren påvist ved hjelp av FITC-konjugert antihumant antistoff, var identisk med MFI for påvisningsantistoffet alene, hvilket indikerer at det ikke var noe påvisbart signal over bakgrunnsnivået ved anvendelse av det E37A/Ig-mutante protein i analysen. I en ELISA, utført som beskrevet i eksempel 14, syntes likeledes E37A/lg-mutanten ikke å binde immobilisert oa/CD18.

Q- d- binding til iC3b

Komplementkomponent C3 kan spaltes proteolytisk for å danne komplekset iC3b, som initierer den alternative reaksjonsvei med komplementaktivering og fører til sist til celleformidlet destruksjon av et mål. Både CDllb og CDllc er blitt implisert i iC3b-binding og etterfølgende fagocytose av iC3b-belagte partikler. Et peptidfragment i CDllb-I-domenet er nylig blitt identifisert som setet for iC3b-interaksjon [Ueda et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 51:10680-10684 (1994)]. Området for iC3b-binding er høykonservert i CDllb, CDllc og eid, hvilket antyder en dd/iC3b-bindingsinteraksjon.

Binding av Oa til iC3b utføres ved anvendelse av transf ektanter eller cellelinjer som naturlig uttrykker eid (f.eks. PMA-stimulerte HL60-celler) og iC3b-belagte røde saue-blodceller (sRBC) i en rosettanalyse [Dana et al., J. Clin. Invest., 73:153-159 (1984)]. Evnen hos ad/CD18-CHO-transfektanter, VLA4-CHO-transfektanter (negativ kontroll) og PMA-stimulerte HL60-celler (positiv kontroll) til å danne rosetter sammenlignes i nærvær og fravær av anti-CD18-monoklonalt antistoff (f.eks. TS1/18.1).

Eksempel 13

Screening ved seintillasjonsproksimalitetsanalyse_

Spesifikke inhibitorer av binding mellom ad-ligandene ifølge oppfinnelsen og deres bindingspartnere (ad-ligand-/ antiligandpar) kan bestemmes på mange forskjellige måter, slik som ved scintillasjonsproksimalitetsanalyseteknikker, som generelt beskrevet i US patent nr. 4 271 13 9, Hart og Greenwald, Mol. Immunol., 12:265-267 (1979), og Hart og Greenwald, J. Nuc. Med., 20:1062-1065 (1979), hvilke alle er inkorporert heri ved referanse.

Kort beskrevet bindes et medlem av dd-ligand-/anti-ligandparet til et fast støttemateriale, enten direkte eller indirekte. Indirekte innfangelse vil involvere et monoklonalt antistoff, direkte bundet til støttematerialet, som gjenkjenner en spesifikk epitop ved C-terminalen av det oppløse-lige integrin-p-kjedeprotein. Denne epitop vil enten være hemagglutininproteinet eller den mykobakterielle IIIE9-epitop [Anderson et al., J. Immunol., 141:607-613 (1988)]. Et fluorescerende middel bindes også til støttematerialet. Alternativt kan det fluorescerende middel være integrert i det faste støttematerialet, som beskrevet i US patent nr. 4 568 649, inkorporert heri ved referanse. Medlemmet av ad-ligand-/anti-ligandparet som ikke er bundet til støttematerialet, merkes med en radioaktiv forbindelse som utsender stråling som er i stand til å eksitere det fluorescerende middel. Når liganden bindes til den radiomerkede antiligand, bringes markøren tilstrekkelig nært det støttematerialebundne, fluorescerende middel til at det eksiteres og forårsaker utsendelse av lys. Når den ikke er bundet, er markøren generelt for langt fra det faste støttematerialet til å eksitere det fluorescerende middel, og lysutsendelsen er lav. Det utsendte lys måles og korreleres med binding mellom liganden og antiliganden. Tilsetning av en bindingsinhibitor til prøven vil redusere fluor-escensutsendelsen ved å forhindre at den radioaktive markør innfanges i nærhet av det faste støttematerialet. Bindings-inhibitorer kan derfor identifiseres ved hjelp av deres effekt på fluorescensutsendelser fra prøvene. Potensielle anti-ligander mot Od kan også identifiseres på lignende måte.

Den oppløselige rekombinante cid/CD18-leucin-"glide-lås "-konstruksjon (se eksempel 14) anvendes i en scintilla-sjonsproksimalitetsanalyse for å screene for modulatorer av CAM-binding ved hjelp av den følgende metode. Det rekombinante integrin immobiliseres med et ikke-blokkerende anti-a-subenhet- eller anti-p-subenhet-antistoff som tidligere er belagt på en plate med innstøpt seintillasjonsmateriale. Forbindelser fra et kjemisk bibliotek og en spesifikk biotinylert CAM/Ig-kimaer tilsettes samtidig til platen. Binding av CAM/Ig-kimæren påvises med merket streptavidin. I analysen biotinyleres ICAM-l/Ig og ICAM-3/Ig med NHS-sulfobiotin LC (lang kjede, Pierce) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Merkede proteiner er fremdeles reaktive med CAM-spesifikke antistoffer og kan vises å reagere med immobilisert LFA-1 ved hjelp av ELISA, med påvisning ved hjelp av streptavidin-HRP og etterfølgende fremkalling med OPD.

Alternativt blir det rekombinante leucin-"glidelås"-protein renset, eller delvis renset, og belagt direkte på platen med innstøpt seintillasjonsmateriale. Umerkede CAM/Ig-kimærer og kjemisk bibliotek-forbindelser tilsettes samtidig. Bundet CAM/lg påvises med 12<5>I-merket antihumant lg.

Som et ytterligere alternativ immobiliseres renset CAM/Ig-protein på scintillasjonsplaten. Kjemisk bibliotek-forbindelser og konsentrert supernatant fra celler som uttrykker rekombinant leucin-"glidelås"-integrin, tilsettes til platen. Binding av det rekombinante integrin påvises med et merket, ikke-blokkerende a- eller p-subenhet-antistoff.

Eksempel 14

Oppløselige humane aa- ekspresjonskonstruksjoner

Ekspresjonen av uforkortet, oppløselig humant dd/CD18-heterodimert protein tilveiebringer på enkel måte renset materiale for immuniserings- og bindingsanalyser. For-delen ved å danne oppløselig protein er at det kan renses fra supernatanter istedenfor fra cellelysater (som med uforkortet membranbundet Od/CD18); gjenvinning forbedres derfor, og uren-heter reduseres.

Det oppløselige aa-ekspresjonsplasmid ble konstruert som følger. Et nukleotidfragment som tilsvarer området fra baser 0 til 3161 i SEKV.ID. NR. 1, klonet i plasmid pATM.D12, ble isolert véd spalting med Hindlll og Aatll. Et PCR-fragment som tilsvarer baser 3130 til 3390 i SEKV.ID. NR. 1, som overlapper Hindi 11 1 hat. II -f ragment et og inneholder et ytterligere ATluI-restriksjonssete ved 3'-terminalen, ble amplifisert fra pATM.D12 med primere sHAD.5 og sHAD.3, vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 30 og 31.

PCR-ampiifikasjonsproduktet ble spaltet med Aatll og Ml ul og ligert til Hindlll/Aatll-fragmentet. Det resulterende produkt ble ligert i det Hindi11/ Mlul-spaltede plasmid pDCl.s.

Denne konstruksjon uttrykkes sammen med oppløselig CD18 i stabilt transfekterte CHO-celler, og ekspresjonen påvises ved autoradiografisk visualisering av immunutfelte CD18-komplekser avledet fra <35>S-metioninmerkede celler. Konstruksjonen uttrykkes også sammen med CD18 i 293-celler [Berman et al., J. Cell. Biochem., 52:183-195 (1993)].

Oppløselig, uforkortet aa- konstruksjon

Alternative dd-ekspresjonskonstruksjoner omfattes også av oppfinnelsen. For å lette ekspresjon og rensing av en intakt ad/CDl8-heterodimer vil oppløselige Od- og CD18-ekspresjonsplasmider konstrueres for å inkludere en "leucin-glide-lås"-fusjonssekvens som vil stabilisere heterodimeren under rensing [Chang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 51:11408-11412 (1994)]. Kort beskrevet er det dannet DNA som koder for de sure og basiske aminosyretråder av glidelåsen ved primerannealing ved anvendelse av oligonukleotider, beskrevet av Chang et al. DNA-sekvensene er blitt videre modifisert for å inkludere ytterligere Aflul- og Xbal-restriksjonsseter ved henholdsvis 5'- og 3'-endene av DNA for å lette subkloning i tidligere beskrevne eid- eller CD18-ekspresjonskonstruksjoner.

I tillegg er det blitt tilføyd sekvenser som representerer enten hemagglutininprotein eller en polyhistidinsekvens, så vel som et stoppkodon innføyd etter Xbal-setet. Hemagglutinin-eller en polyhistidinsekvensene inkorporeres for å lette affinitetsrensing av det uttrykte protein. Sekvenser som koder for den basiske tråd av glidelåsen, inkorporeres i plasmid-vektoren som uttrykker CD18; den sure tråd innføyes i a-kjede-konstruksjonen. Ved ekspresjon av de modifiserte aa- og CD18-proteiner i en vertscelle antas det at interaksjon mellom de sure og basiske tråder av glidelåsstrukturen vil stabilisere heterodimeren og tillate isolering av det intakte cid/CD18-molekyl ved affinitetsrensing, som beskrevet ovenfor.

Plasmider ble konstruert for ekspresjon av oppløselig o-d og CD18 med sure og basiske "leucin-glidelås"-sekvenser og transfektert i COS-celler ved hjelp av DEAE-/dekstranmetoden beskrevet i eksempel 7. Det resulterende protein ble referert til som ad/CD18LZ. Hemagglutinin- og polyhistidin-"merke-lapper" ble ikke inkorporert i Oa/CDISLZ. Transfekterte celler ble dyrket i 14 dager under reduserte serum{2 %)betingelser. Supernatanter innhøstet hver 5. dag fra transfekterte celler ble analysert for proteinproduksjon ved hjelp av ELISA, som beskrevet i eksempel 8. Kort beskrevet ble Od/CD18LZ-heterodimeren immobilisert på plater belagt med anti-Od-monoklonalt antistoff 169B (se eksempel 15). Od/CD18LZ-komplekset ble påvist ved tilsetning av et biotinylert anti-CD18-monoklonalt antistoff, TS1/18.1 (se eksempel 18), etterfulgt av tilsetning av streptavidin-/pepperrotperoksidase(HRP)konjugat og o-fenyldiamin (OPD). Protein var tydelig påvisbart i supernatantene.

Bindingsanalyser ved anvendelse av oppløselige, uforkortede Qd- ekspresj onsprodukter

Funksjonelle bindingsanalyser ved anvendelse av den oppløselige, uforkortede ad/CD18LZ-heterodimer beskrevet ovenfor ble utført ved immobilisering av heterodimeren på plater belagt med monoklonalt antistoff 169B eller et ikke-blokkerende anti-CD18-monoklonalt antistoff (se eksempel 15). Brønner ble blokkert med fiskehudgelatin for å forhindre uspesifikk binding før tilsetning av CAM/Ig-kimærer (se eksempel 12) ved en startkonsentrasjon på 10 pg/ml. Binding av kimærene til ad/CD18 ble påvist med et geite-antihumant lg-HRP-konjugat (Jackson Labs) og etterfølgende fremkalling med OPD.

VCAM-1/lg ble observert å bindes til innfanget cid/CDlSLZ i en mengde som var 3-5 ganger høyere enn til innfanget CDlla/CD18. ICAM-l/Ig og ICAM-2/Ig bandt oppløselig CDlla/CD18-heterodimer i en mengde som var henholdsvis 15 og 10 ganger større enn bakgrunnen, men bandt ikke cm/CDlS. VCAM-1-binding ble redusert med ca. 50 % i nærvær av de VCAM-1-spesifikke antistoffer 130K og 130P anvendt i kombinasjon.

Bindingsanalysen ble også utført med ICAM/Ig-proteinet immobilisert på 96-brønners plater, etterfulgt av tilsetning av rekombinant oppløselig integrin i cellesupernatant. Binding av de oppløselige integriner ble påvist med et umerket, ikke-blokkerende a- eller p-subenhet-spesifikt muse-antistoff, etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugert geite-antimuse-antistoff og fremkalt med OPD.

Resultater indikerte at ikke-blokkerende antistoff påviste dd/CD18LZ-binding til ICAM-R/Ig i en mengde 10 ganger større enn bindingen påvist i kontroilbrønner uten innhold av antistoff. Oppløselig ad/CDl8-binding ble ikke påviBt med immobilisert ICAM-l/Ig, men binding ble imidlertid påvist mellom Od/CD18 og immobilisert CDllb/CD18 og CDlla/CDl8 i en mengde som var henholdsvis 15 og 5 ganger større enn bakgrunnsbinding.

Fordi tidligere undersøkelser har vist at CDllb og CDllc binder lipopolysakkarid (LPS) [Wright, Curr. Opin. Immunol., 3:83-90 (1991); Ingalls og Golenbock, J. Exp. Med., 181:1473-1479 (1995)], ble LPS-binding til dd/CD18 også bestemt ved anvendelse av strømningscytometri og platebaserte analyser. Resultater indikerte at FITC-merket LPS isolert fra S. Minnesota og S. typhosa (begge erholdt fra Sigma) ved

20 pg/ml var i stand til svak binding av c^/CDlS-transfekterte CHO-celler. Ingen binding ble observert med utransfekterte CHO-kontrollceller. I ELISA-formatanalyser bandt 0,5-3,0 pg biotinylert LPS [Luk et al., Alan. Biochem., 232:217-224

(1995)] immobilisert a<i/CD18LZ med et signal som var fire ganger større enn innfangelsesantistoffet og blokkerings-reagenset alene. Tilsynelatende binding av LPS til CDlla/CD18 ble utelukket ved å subtrahere bakgrunnsbinding til anti-CDlla-antistoff TS2/4 fra hver eksperimentverdi.

For å identifisere andre ligander for Od/CD18 anvendes det rekombinante ad/CD18LZ-protein i en totrinns under-søkelse. Binding av forskjellige celletyper til immobilisert protein anvendes for å bestemme hvilke celler som uttrykker oa-ligander på celleoverflaten. Antistoffinhibering anvendes deretter for å bestemme hvorvidt den observerte cellebinding resulterer fra interaksjon med kjente overflateadhesjonsmole-kyler. Dersom det ikke skjer noen inhibering, anvendes ko-immunut f elling med a<j/CD18LZ bundet til proteiner fra lysater av celler som vil binde a<j for å forsøke å identifisere liganden.

Oppløselige humane aa- I- domeneekspresjonskonstruksjoner

Det er tidligere rapportert at I-domenet i CDlla kan uttrykkes som en uavhengig strukturell enhet som opprettholder ligandbindingsevner og antistoffgjenkjennelse [Randi og Hogg, J. Biol. Chem., 269:12395-12398 (1994); Zhout et al., J. Biol. Chem., 269:17075-17079 (1994); Michishita et al., Cell, 72:857-867 (1993)]. For å danne et oppløselig fusjonsprotein som omfatter Oa-I-domenet og humant IgG4, blir a^-I-domenet amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere utformet for å tilføye flankerende BamHI- og Xhol-restriksjonsseter for å lette subkloning. Disse primere er vist i SEKV.ID. NR. 32 og 33, hvor restriksjonsseter er understreket. C-nukleotidet umiddelbart 3' for BamHI-setet i SEKV.ID. NR. 32 tilsvarer nukleotid 435 i SEKV.ID. NR. 1; G-nukleotidet 3' for Xhol-setet i SEKV.ID. NR. 33 er komplementært til nukleotid 1067 i SEKV.ID. NR. 1. Det amplifiserte I-domenet spaltes med de egnede enzymer, det rensede fragment ligeres i pattedyr-ekspresjonsvektor pDC, og den prokaryote ekspresjonsvektor pGEX-4T-3 (Pharmacia) og I-domenefragmentet sekvenseres. Fusjonsproteinet uttrykkes deretter i COS-, CHO- eller E. coli-celler transfektert eller transformert med en passende ekspresj onskonstruksj on.

Dersom affiniteten av ad overfor ICAM-R er gitt, kan ekspresjon av ad-I-domenet ha tilstrekkelig affinitet til å være en anvendelig inhibitor av celleadhesjon som eid deltar i.

Analyse av humane ad- I- domene-/ lgG4- fusjonsproteiner

Protein ble separert ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende og ikke-reduserende betingelser og visualisert ved enten sølvfarging eller Coomassie-farging. Protein ble deretter overført til Immobilon PVDF-membraner og underkastet Western blot-analyse ved anvendelse av antihumane IgG-monoklonale antistoffer eller antibovine lg-monoklonale antistoffer.

Påvist protein ble bestemt til å vandre ved ca.

120 kD under ikke-reduserende betingelser, og ved ca. 45 kD under reduserende betingelser. Mindre bånd ble også påvist på ikke-reduserende geler ved ca. 40-50 kD, og disse bånd var reaktive med de antihumane, men ikke antibovine, antistoffer. Et mindre bånd på 200 kD ble bestemt til å være bovint lg ved Western blot.

Bindingsanalyser ved anvendelse av I- domeneekspresjons-produkter I-domenets evne til spesifikt å gjenkjenne ICAM-R/IgG-kimært protein ble testet i et ELISA-format. Serie-fortynninger av Od-I-domene-IgG4-fusjonsprotein (Io.d/IgG4) i TBS ble inkubert med ICAM-l/IgGm, ICAM-R/IgG, VCAM-l/IgG eller et irrelevant IgGl-myelomprotein immobilisert på Immulon IV RIA/EIA-plater. CDlla-I-domene-/IgG-kimærprotein og humant IgG4/kappamyelomprotein ble anvendt som negative kontroller. Bundet IgG4 ble påvist med det biotinylerte anti-IgG4-monoklonale antistoff HP6023, etterfulgt av tilsetning av streptavidinperoksidasekonjugat og fremkalling med substratet o-fenyldiamin.

I gjentatte analyser ble det ikke påvist noe binding av CDlla/IgG4-proteinet eller IgG4-myelomproteinet med noen av de immobiliserte proteiner. Iad/lgG4-proteinet ble ikke bundet til fiskehudgelatin- eller bovint serumalbumin-blokkerings-midler, humant IgGl eller ICAM-l/IgG. En 2-3 gangers økning av bindingssignalet i forhold til bakgrunnen ble påvist i ICAM-R/IgG-proteinbelagte brønner ved anvendelse av 1-5 pg/ml konsentrasjoner av Icid/IgG4-protein. Signalet i VCAM-l/IgG-proteinbelagte brønner var 7-10 ganger .høyere enn bakgrunnen. I tidligere analyser bandt ikke ad/CD18-transfekterte CHO-celler VCAM-l/IgG-protein, hvilket antyder at VCAM-1-binding kan være karakteristisk for isolerte I-domeneaminosyre-sekvenser.

Ytterligere Qd- 1- domenekonstruksjoner

Ytterligere eid-1-domenekonstruks joner dannes på samme måte som den foregående konstruksjon, men ved å inkorporere flere aminosyrer rundt aa-I-domenet. Spesifikke konstruksjoner inkluderer: i) sekvenser fra exon 5 (aminosyrer 127-353 i SEKV.ID. NR. 2) forut for den verserende konstruksjon, ii) EF-sidegjentakelsene (aminosyrer 17-603 i SEKV.ID. NR. 2) etter I-domenet, og iii) a-kjeden trunkert ved transmembranområdet (aminosyrer 17-1029 i SEKV.ID. NR. 2) med en IgG4-hale for rensings- og påvisningsformål. Disse konstruksjoner ligeres i enten pattedyrekspresjonsvektoren pDCSl eller den prokaryote ekspresjonsvektor pGEX-4T-3 (Pharmacia) og det sekvenserte I-domenet. Fusjonsproteinene uttrykkes deretter i COS-, CHO-eller E. coli-celler transformert eller transfektert med en passende ekspresjonskonstruksjon. Protein renses på en ProSepA-kolonne (Bioprocessing Limited, Durham, England), testes for reaktivitet med det anti-IgG4-monoklonale antistoff HP6023 og visualiseres på polyakrylamidgeler med Coomassie-farging.

For å konstruere et ekspresjonsplasmid for hele Od-polypeptidet modifiseres pATM.D12, beskrevet ovenfor, for å uttrykke et Od-IgG4-fusjonsprotein ved hjelp av den følgende metode. DNA som koder for IgG4, isoleres fra vektoren pDCSl ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere som individuelt inkorporerer et 5<1->Aatll-restriksjonssete (SEKV.ID. NR. 89) og et 31-XJbal-restriksjonssete (SEKV.ID. NR. 90).

Plasmid pATM.D12 spaltes med Aati I og Xbal, og det passende spaltede og rensede IgG4-PCR-produkt ligeres i den lineære vektor.

Eksempel 15

Produksjon av humane Qd- spesifikke antistoffer

A. Produksjon av monoklonale antistoffer

1. Kortvarig transfekterte celler fra eksempel 7 ble vasket tre ganger i Dulbeccos fosfatbufrede saltløsning (D-PBS) og injisert ved 5 x IO<6> celler/mus i Balb/c-mus med 50 ug/musemuramyldipeptidase (Sigma) i PBS. Mus ble injisert to eller flere ganger på samme måte med 2 ukers mellomrom. Det forhåndstoppede og immuniserte serum fra musene ble Bcreenet ved hjelp av FACS-analyse, som skissert i eksempel 9, og milten fra musen med den høyeste reaktivitet overfor celler transfektert med Od/CD18 ble fusjonert. Hybridomkultursuper-natanter ble deretter screenet separat for mangel på reaktivitet mot COS-celler transfektert med CDlla/CD18 og for reaktivitet med celler kotransfektert med et Od-ekspresjonsplasmid og CD18.

Denne metoden tilveiebrakte ingen monoklonale antistoffer. 2. Som et alternativ til produksjon av monoklonale antistoffer ble oppløselig Od-I-domene-/IgG4-fusjonsprotein affinitetsrenset fra supernatanten fra stabilt transfekterte CHO-celler og anvendt for å immunisere Balb/c-mus, som beskrevet ovenfor. Hybridomer ble etablert, og supernatanten fra disse hybridomer ble screenet ved hjelp av ELISA for reaktivitet mot dd-I-domenefusjonsprotein. Positive kulturer ble deretter analysert for reaktivitet med uforkortede Od/CD18-komplekser uttrykt på CHO-transfektanter.

Mus 1908 mottok tre innledende immuniseringer med ad/CD18-transfekterte CHO-celler og to ytterligere for-sterkningsimmuniseringer med oppløselig ad/CD18-heterodimer. To endelige immuniseringer inkluderte 50 pg/mus Od-I-domene-/IgG4-fusjonsprotein. Fusjonen produserte 270 IgG-produserende brønner. Supernatant fra 45 brønner viste minst 7 ganger høyere binding til Iad/IgG4-fusjonsprotein enn til humant IgG4, vist ved ELISA. Ingen av supernatantene reagerte med aa/CD18-transfekterte CHO-celler, som bestemt ved FACS-analyse .

For å bestemme hvorvidt supernatantene var i stand til å gjenkjenne integrin-a-subenhet-proteiner i en annen sammenheng ble friske, frosne miltsnitt farget med supernatanter fra 24 av de 45 brønner. Tre supernatanter ble bestemt som positive: én farget store celler i den røde masse, mens to andre farget spredte celler i den røde masse og også trabekler.

Disse supernatanter ble videre analysert ved hjelp av deres evne til å immunutfelle biotinylerte CD18-komplekser fra enten Od/CD18-transfekterte CHO-celler eller PMA-stimulerte HL60-celler. Fusjonsbrønner med supernatanter som gjenkjente protein i detergentlysater (som ikke bør være så strukturelt innsnevret som protein uttrykt som heterodimerer), ble utvalgt for ytterligere subkloning. Monoklonale antistoffer som gjenkjenner protein i detergent, kan være mer anvendelige ved immunutfelling av heterodimere komplekser fra transfektanter, vev og cellelinjer.

3. Som et annet alternativ til monoklonal antistoff-produksjon ble CD18-komplekser immunutfelt fra humane miltlysater med det anti-CD18-monoklonale antistoff 23F2G etter forhåndsklaring av CDlla/CD18 (ved anvendelse av monoklonalt antistoff TS2/4) og CDllb/CD18 (ved anvendelse av monoklonalt antistoff Mo-1). Fem Balb/c-mus, 10-12 uker gamle, ble immunisert ved subkutan injeksjon med ca. 3 0 ug av det resulterende protein i komplett Freunds adjuvans på dag 0, etterfulgt av to forsterkningsinjeksjoner med 30 pg immunogen/mus på dagene 28 og 43 i ukomplett Freunds adjuvans. Testsera ble tappet 10 dager etter den siste forsterkningsinjeksjon, og reaktiviteten ble bestemt ved anvendelse av 1:500- fortynning av hvert serum for å påvise 1 pg/felt immunogen i en Western blot. I sera fra tre mus ble det påvist bånd på ca. 95 og 150 kD; intet signal ble observert i felt behandlet med l:50-fortynning av preimmunsera. Båndet på 150 kD ble antatt å representere dd i en in vivo-glykosyleringstilstand. Alle

postimmunsera immunutfelte dessuten protein fra lysater fra biotinylerte Od/CD18-CHO-celler som vandret ved tilnærmede molekylvekter på SDS-PAGE, som representerte heterodimeren. Fra disse resultater ble mus nr. 2212 utvalgt og ble ytterligere immunisert ved intraperitoneal injeksjon på dag 64 med 30 pg immunogen i PBS. Musen ble avlivet 4 dager senere, og milten ble fjernet sterilt. En enkeltcellesuspensjon ble dannet ved å gni milten mellom de mattslipte ender av to mikroskopobjektglass nedsenket i serumfritt RPMI 1640 supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 enheter/ml penicillin og 100 pg/ml streptomycin (RPMI) (Gibco, Canada). Cellesuspensjonen ble filtrert gjennom et sterilt 70-mesh Nitex-cellefilter (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), og filtratet ble vasket to ganger ved sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter. Den resulterende pellet ble resuspendert i 20 ml serumfritt RPMI. Thymocytter tatt fra tre naturlige Balb/c-mus ble preparert på lignende måte.

Før fusjon ble NS-l-myelomceller, holdt i logfase i RPMI med 10 % Fetalclone-serum (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) i 3 dager før fusjon, pelletert ved sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter, vasket to ganger som beskrevet i det foregående avsnitt og tellet. Cirka 2 x IO<8> miltceller ble kombinert med 4 x IO<7> NS-l-celler, og den resulterende blanding ble pelletert ved sentrifugering ved 200 x g. Supernatanten ble kastet. Cellepelleten ble flyttet ved tapping av røret, og 2 ml 50 % PEG 1500 i 75 mM HEPES

(pH 8,0, 37 °C) (Boehringer Mannheim) ble tilsatt i løpet av

1 minutt under omrøring. Ytterligere 14 ml serumfritt RPMI ble deretter tilsatt i løpet av de neste 7 minutter, etterfulgt av umiddelbar tilsetning av 16 ml RPMI. Den resulterende blanding ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter, og supernatanten

ble kastet. Pelleten ble resuspendert i 200 ml RPMI inneholdende 15 % FBS, 100 mM natriumhypoksantin, 0,4 mM aminopterin, 16 mM tymidin (HAT) (Gibco), 25 enheter/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) og 1,5 x IO<6> thymocytter/ml, og overført til ti 96-brønners, flatbunnede vevskulturplater (Corning, UK) i en mengde på 200 pg/brønn. Celler ble tilført næring på

dagene 2, 4 og 6 etter fusjon ved aspirasjon av ca. 100 ul fra hver brønn med en 18 G-nål (Becton Dickinson) og tilsetning av 100 ul/brønn utspredningsmedium, beskrevet ovenfor, med unntak av at det inneholdt 10 enheter/ml IL-6 og manglet thymocytter.

På dagene 7-10 etter fusjonen ble supernatant fra hver brønn screenet ved hjelp av antistoffinnfangelses-ELISA som en test på tilstedeværelse av muse-IgG. Immulon 4-plater (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) ble belagt med 50 ul/ brønn geite-antimuse-IgA, -IgG eller -IgM (Organon Teknika) fortynnet 1:5000 i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6, ved 4 °C. Plater ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,5 % Tween 20 (PBST), og 50 ul kultursupernatant fra hver brønn ble tilsatt. Etter inkubasjon ved 37 °C i 30 minutter ble brønner vasket med PBST, som beskrevet ovenfor, og 50 ul pepperrotperoksidasekonjugert geite-antimuse-IgG(fc) (Jackson Irnmuno-Research, West Grove, Pennsylvania) fortynnet 1:3500 i PBST ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert som beskrevet ovenfor, vasket fire ganger méd PBST og tilsatt 100 ul substrat bestående av 1 mg/ml o-fenylendiamin (Sigma) og 0,1 ul/ml 30 % H202 i 100 mM sitrat, pH 4,5. Fargereaksjonen ble stoppet etter 5 minutter ved tilsetning av 50 ul 15 % H2S04. Absorbans ved 490 nm ble bestemt for hver brønn ved anvendelse av en plateavleser (Dynatech).

Hybridomer ble ytterligere karakterisert som følger. Supernatanter fra IgG-produserende kulturer ble analysert ved hjelp av strømningscytometri for reaktivitet overfor a<i/CD18-transformerte CHO-celler, men ikke overfor JY-celler (en B-cellelinje positiv for LFA-1, men ikke for andre p2-integriner, som observert i tidligere fargingseksperimenter i laboratoriet). Kort beskrevet ble 5 x IO<5>Od/CDl8-transformerte CHO- eller Od/CD18"JY-celler suspendert i 50 ul RPMI inneholdende 2 % FBS og 10 mM NaN3 (FACS-buffer) . Individuelle cellesuspensjoner ble tilsatt til 50 ul igG-positiv hybridomkultursupernatant i brønner på 96-brønners, rundbunnede plater (Corning). Etter inkubasjon i 30 minutter på is ble cellene vasket to ganger ved pelletering i en klinisk sentrifuge, supernatant fra hver brønn ble kastet, og pelleter ble resuspendert i 200-300 ul FACS-buffer. Den siste vask ble erstattet med 50 ul/brønn av en 1:100-fortynning av et F (ab")2-fragment av saue-antimuse-IgG(H + L)-FlTC-konjugat {Sigma, St. Louis, Missouri) preparert i FACS-buffer. Etter inkubasjon, som beskrevet ovenfor, ble celler vasket to ganger med Dulbeccos PBS {D-PBS) supplert med 10 mM NaN3, og til slutt resuspendert i D-PBS inneholdende 1 % paraformaldehyd. Prøver ble deretter overført til polystyrenrør for strømnings-cytometrisk analyse (FACS) med et Becton Dickinson FACScan-analyseringsapparat.

Fusjonen ga fire kulturer som ble bedømt positive ved begge kriterier. Når den andre Bcreening ble gjentatt på ekspanderte supernatanter ca. 4 dager senere, forble tre av de fire kulturer positive. Tre brønner, betegnet 169A, 169B og 169D, ble deretter suksessivt klonet 2-3 ganger ved for-doblings fortynning i RPMI, 15 % FBS, 100 mM natriumhypoksantin, 16 mM tymidin og 10 enheter/ml IL-6. Brønner på klon-plater ble tellet visuelt etter 4 dager; og antallet kolonier i de minst tette brønner ble registrert. Utvalgte brønner fra hver kloning ble analysert ved hjelp av FACS etter 7-10 dager. Aktivitet ble funnet i to av kulturene, 169A og 169B. I den siste kloning ble positive brønner som inneholdt enkle kolonier, ekspandert i RPMI med 11 % FBS. Antistoff fra klonale supernatanter av 169A og 169B ble isotypebestemt ved anvendelse av IsoStrip-sett (Boehringer Mannheim) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner og funnet å være av IgGl-isotypen.

Immunutfelling av Od/CD18-komplekser fra CHO-transfektanter og PMA-stimulerte HL60-celler ble anvendt som en tertiær screening for spesifisitet. Hybridomer 169A og 169B utfelte passende bånd fra CHO-linjer og en enkelt a-kjedetype på 150-160 kD fra HL60-celler, som bestemt ved SDS-PAGE. Hybridomer 169A og 169B ble deponert 31. mai 1995 hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, og gitt henholdsvis aksesjonsnummer HB11907 og HB11906.

For å karakterisere mer fullstendig bindingsegen-skapene til 169A og 169B ble hvert antistoffs evne til å inhibere binding av det andre antistoff eller anti-CD18-antistoff TS1/18.1 til oppløselig o.d/CD18 testet. Oppløselig, uforkortet Od/CD18 ble immobilisert separat ved hjelp av et umerket antistoff i et 96-brønners plateformat, og biotinylerte antistoffer ble anvendt for å påvise protein bundet av de samme, eller andre, umerkede antistoffer. Binding ble påvist ved anvendelse av et geite-antimuse-Ig/HRP-konjugat, etterfulgt av tilsetning av OPD-substrat. Resultatene indikerte at antistoff 169A var i stand til å blokkere binding av biotinylert 169A og TS1/18.1, mens antistoffet 169B kun blokkerte binding av seg selv. 4. En annen mus (nr. 2214), immunisert ved hjelp av den samme protokoll som mus nr. 2212, ble utvalgt og ytterligere immunisert ved hjelp av en forsterkningsinjeksjon før fusjon på dag 70 med 30 pg renset eid fra miltlysater i PBS. Musen ble avlivet 4 dager senere, og milten ble fjernet sterilt.

Fusjonen og kloningen av positive celler ble utført som beskrevet ovenfor. Fusjonen produserte fem anti-Od-monoklonale hybridomer betegnet 17OD, 17OF, 17OE, 170X OG 170H, som ble isotypebestemt som IgGi ved anvendelse av IsoStrip-settet (Boehringer Mannheim) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. 5. Enda en annen mus, nr. 2211, immunisert ved hjelp av den samme startprotokoll som mus nr. 2212 og mus nr. 2214, ble utvalgt og ytterligere immunisert på dag 88 med 30 pg immunogen og en forsterkningsinjeksjon før fusjon på 30 pg immunogen på dag 2 03. Musen ble avlivet 4 dager senere, og milten ble fjernet og fusjonen utført som beskrevet ovenfor. Hybridomsupernatant ble screenet ved antistoffinnfangelses-ELISA og ved strømningscytometri, som beskrevet i detalj i avsnittene ovenfor.

Det ble identifisert 15 positive hybridomer, som ble betegnet 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 188J, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188R OG 188T, og isotypebestemt i ELISA-analyse. Kort beskrevet ble Immulon 4-plater (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) belagt ved 4 °C med 50 pl/brønn geite-antimuse-IgA, -G, -M (Organon Teknika) fortynnet 1:5000 i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6. Plater ble blokkert i

30 minutter ved 37 °C med 1 % BSA i PBS, vasket tre ganger med PBS/0,05 % Tween 20 (PBST), og 50 ul kultursupernatant (fortynnet 1:10 i PBST) ble tilsatt. Etter inkubasjon og vask, som beskrevet ovenfor, ble 50 pl pepperrotperoksidasekonjugert kanin-antimuse-IgGi, -G2a eller -G3 (Zymed, San Francisco, California) fortynnet 1:1000 i PBST med 1 % normalt geiteserum, tilsatt. Platene ble inkubert som beskrevet ovenfor, vasket fire ganger med PBST og deretter tilsatt 100 pl substrat bestående av 1 mg/ml o-fenylendiamin (Sigma) og 0,1 pl/ml 30 % H202 i 100 mM sitrat, pH 4,5. Fargereaksjonen ble stoppet etter 5 minutter ved tilsetning av 50 pl 15 % H2S04. A490 ble avlest på en plateavleser (Dynatech), og alle 15 antistoffer ble bestemt til å være IgGl. Overskuddet av miltceller fra mus nr. 2211 ble ned-frosset i en kryoampulle og lagret i flytende nitrogen. Kryo-ampullen ble tint hurtig ved plassering i et 37 °C vannbad og ved å rotere den til innholdet var smeltet. Cellene ble over-ført til et 15 ml sentrifugerør, og varm RPMI inneholdende 11 % FBS ble tilsatt langsomt i porsjoner å 1 ml med 3-5 minutters mellomrom. Ytterligere 5 ml varm RPMI ble tilsatt, og etter 5 minutter ble røret sentrifugert ved 200 x g i 5 minutter, og supernatanten ble avsugd. Celler ble resuspendert i RPMI, og en fusjon ble utført som beskrevet ovenfor. Hybridomsupernatant ble screenet ved hjelp av antistoffinnfangelse og strømningscytometri, som beskrevet ovenfor.

Fusjonen ga fem kloner betegnet 195A, 195C, 195D, 195E og 195H. Klonene ble isotypebestemt ved hjelp av ELI SA - prosedyren, som beskrevet ovenfor; monoklonale antistoffer 195A, 195C, 195D og 195E ble bestemt til å være IgGlf og 195H ble bestemt til å være IgG2a.

6. For å identifisere antistoffer som er i stand til å inhibere funksjonell aa-binding, anvendes oppløselig aa/ CD18LZ (se eksempel 14) for immunisering. Proteinet isoleres på et affinitetskromatografiresin fra supernatant fra kortvarig transfekterte COS-celler, og det resinbundne Oa anvendes som et immunogen. En utvalgt mus immuniseres som beskrevet ovenfor og gis en siste forsterkningsinjeksjon 2 uker etter den opprinnelige immunisering. Immunisering ved hjelp av denne teknikken forhindrer mulige endringer i proteinkonformasjon, som ofte forbindes med detergentlysis av celler. Ytterligere mus immuniseres med rekombinant protein, også resinbundne, men ble ikke opprinnelig immunisert med protein renset fra cellelysat.

Hybridomer, fremstilt som beskrevet ovenfor, som resulterer fra immuniseringen, screenes ved hjelp av ELISA av det rekombinante protein immobilisert fra en cellesupernatant ved anvendelse av Fab-fragmentet av et ikke-blokkerende antistoff. Alternativt anvendes strømningscytornetri for å analysere for reaktivitet overfor JY-celler som tidligere er transf ektert med ctd-cDNA. 7. Som et annet alternativ dannes monoklonale antistoffer som følger. Af f initetsrenset a,j/CD18-heterodimert protein fra detergentlysater fra stabilt transfekterte CHO-celler anvendes med 50 ug/ml muramylpeptidase for å immunisere Balb/c-mus, som beskrevet ovenfor. Mus mottar tre immuniseringer før serumreaktivitet mot Od/CD18 bestemmes ved immun-ut f ell ing av biotinylerte komplekser i CHO-transfektantene. Hybridomer fra positive dyr etableres i overensstemmelse med standardprotokoller, hvoretter hybridomkulturer utvelges ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av cid/CD18-transfektanter. CDlla/CD18-transfektanter anvendes som en kontroll med hensyn til kun CD18-reaktivitet. 8. Som et annet alternativ for fremstilling av monoklonale antistoffer gjennomgår Balb/c-mus en immuniserings-/ undertrykkelsesprotokoll utformet for å redusere reaktiviteten overfor CHO-celledeterminanter på transfektanter anvendt for immunisering. Denne protokoll involverer immunisering med utransfekterte CHO-celler og etterfølgende avliving av CHO-reaktive B-celleblaster ved syklofosfamidbehandling. Etter at tre runder med immunisering og syklofosfamidbehandling er ut-ført, immuniseres musene med ctd/CD18-CHO-transf ekterte celler, som beskrevet ovenfor. 9. Som et annet alternativ anrikes komplekser fra detergentlysater av PMA-stimulerte HL60-celler ved forhåndsklaring, som beskrevet ovenfor. Andre pVintegriner klares på de samme kolonner. Immunisering med de resulterende komplekser, hybridomproduksjon og screeningsprotokoller utføres som beskrevet ovenfor.

B. Produksjon av polyklonale sera

Rensede Od-I-domene-/IgG4-kimærer (eksempel 14) ble anvendt for å danne polyklonalt antiserum i kaniner. Od-I-domene-/IgG4-antigenet ble først injisert i en mengde på

100 pg/kanin i komplett Freunds adjuvans, etterfulgt av tre forsterkningsinjeksjoner med den samme mengde protein i ufull-stendig Freunds adjuvans. Blodprøver ble analysert etter den tredje og fjerde injeksjon. Kaninimmunglobulin (lg) ble renset fra serum på en protein A-Sepharose-kolonne og forhåndsklaret for antihuman IgG-reaktivitet på en human IgG/Affigel 10-kolonne. Reaktivitet ved ELISA overfor I-domenekimæren, men ikke overfor humant IgG, ble anvendt for å bekrefte fullstendig forhåndsklåring.

De forhåndsklarede polyklonale sera ble anvendt for å immunutfelle protein fra detergentlysater fra overflatebio-tinylerte CHO-celler som tidligere var transfektert med Od- og CD18-ekspresjonsvektorer. Immunutfelling ble utført ved hjelp av den tidligere beskrevne metode i eksempel 10. De forhåndsklarede sera gjenkjente et proteinkompleks med den samme molekylvekt som det utfelte ved hjelp av anti-CD18-monoklonalt antistoff TS1.18. Seraene gjenkjente dessuten et enkeltbånd med passende størrelse i et Western blot av CD18-komplekser fra ad/CD18-transfekterte CHO-celler. Affinitetsrensede integriner CDlla/CD18, CDllb/CD18 og VLA4 fra human milt ble ikke gjenkjent av de kaninpolyklonale sera. Seraene reagerte ikke med Od-transfekterte CHO-celler i oppløsning, som bestemt ved strømningscytometri. Det ble derfor konkludert med at de polyklonale kaninsera kun var i stand til å gjenkjenne denaturerte ad-I-domene-/IgG4-proteiner.

I et forsøk på å produsere polyklonale antisera mot ad/CD18 ble en mus immunisert tre ganger med ad-transfekterte CHO-celler (D6.CHO, Od/CD18) med adjuvanspeptid og én gang med renset dd/CD18-heterodimer. En siste forsterkningsinjeksjon inkluderte kun ad/CD18-heterodimer. Cirka 100 ul immunisert serum ble forhåndsklaret ved tilsetning av ca. 10s LFA-1-transfekterte CHO-celler i 2 timer ved 4 °C. Det resulterende serum ble analysert for eid-reaktivitet ved fortynninger på 1/5000, 1/10000, 1/20000 og 1/40000 på normal human milt. Det polyklonale antistoff var reaktivt ved en fortynning på 1/20000, mens en 1/40000-fortynning ble meget svakt farget.

Eksempel 16

Analyse av ag- fordeling

Vevsfordeling av Od/CD18 ble bestemt ved anvendelse av polyklonalt antiserum dannet som beskrevet i eksempel 15.

Renset kaninpolyklonalt antistoff ble anvendt i konsentrasjoner som varierte mellom 120 ng/ml og 60 pg/ml for immuncytokjemisk analyse av frosne humane miltsnitt. Snitt med tykkelse på 6 mikron ble lagt på Superfrost Plus-objektglass (VWR) og lagret ved -70 °C. Før anvendelse ble objektglassene fjernet fra -70 °C og plassert ved 55 °C i 5 minutter. Snittene ble deretter fiksert i kaldt aceton i 2 minutter og luft-tørket. Snittene ble blokkert i en oppløsning inneholdende 1 % BSA, 30 % normalt humant serum og 5 % normalt kaninserum i 30 minutter ved romtemperatur. Primært antistoff ble applisert på hvert snitt i 1 time ved romtemperatur. Ubundet antistoff ble fjernet ved å vaske objektglassene tre ganger i TBS-buffer i 5 minutter pr. vask. Et kanin-antimuse-IgG-bindingsantistoff ble deretter applisert på hvert snitt i den samme TBS-buffer. Et musealkalisk-fosfatase-antialkalisk-fosfatase(APAAP)-antistoff, inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, ble anvendt for å påvise det andre antistoff. Objektglassene ble deretter vasket tre ganger i TBS-buffer. Fast Blue-substrat (Vector Labs) ble applisert, og fargeutviklingen ble stanset ved nedsenking i vann. Objektglassene ble motfarget i Nuclear Fast Red (Sigma) og skylt i vann før montering med Aqua Mount (Baxter). Farging ble påvist i den røde miltmasse med et reagens, men ikke med et irrelevant kaninpolyklonalt Ig-preparat eller det urensede preimmunserum fra det samme dyr.

Et museserum ble bestemt til å ha spesifikk ctd-reaktivitet, og dette ble anvendt for å farge forskjellig lymfoid- og ikke-lymfoidvev. Monoklonale antistoffer som gjenkjenner CD18, CDlla, CDllb og CDllc, ble anvendt i det samme eksperiment som kontroller. Farging av normale miltsnitt med ad-polyklonale sera og monoklonale antistoffer mot CDlla, CDllb, CDllc og CD18 avslørte de følgende resultater. Mønsteret observert med cid-polyklonale sera fremviste ikke det samme merkingsmønster som CDlla, CDllb, CDllc eller CD18. Det er et distinkt merkingsmønster med noen celler som er lokalisert i den marginale sone av den hvite masse, og en distinkt merking av celler som er perifere for den marginale sone. Dette mønster ble ikke observert med de andre antistoffer. Individuelle celler som var spredt gjennom den røde masse, ble også merket, og disse celler kan være, eller ikke, den samme populasjon eller undergruppe observert med CDlla og CD18.

Merking med CDllc fremviste noen celler som ble farget i den marginale sone, men antistoffet viste ikke det distinkte ringmønster rundt den hvite masse sammenlignet med Od-polyklonale sera, og merking i den røde masse ga heller ikke det samme fargingsmønster som Od-polyklonale sera.

Merkingsmønsteret observert med Od-polyklonalt serum var derfor unikt sammenlignet med mønsteret observert ved anvendelse av antistoffer mot de andre p2-integriner (CDlla, CDllb, CDllc og CD18) og antyder at fordelingen in vivo av dd hos mennesket er forskjellig fra fordelingen av andre p2-integriner.

Karakterisering av human Od- ekspresjon med monoklonale antistoffer

Antistoffer utskilt av hybridomer 169A og 169B ble anvendt for å analysere human ad-ekspresjon i frosne vevssnitt ved immuncytokjemi, og på cellelinjer og perifere blodleukocytter ved hjelp av strømningscytometri. Hybridomsupernatanter anvendt i begge eksperimentsett var ufortynnede.

Vevsfarging

Alle farginger ble utført som beskrevet ovenfor, med unntak av leversnitt som ble farget på følgende måte. Etter acetonfiksering ble snitt herdet i 1 % H202 og 1 % natriumazid i TBS i 15 minutter ved romtemperatur. Etter farging av primært antistoff ble et kanin-antimuse-antistoff, direkte konjugert med peroksidase, applisert i 30 minutter ved romtemperatur. Objektglass ble vasket tre ganger i TBS-buffer. Et grise-antikanin-antistoff, direkte konjugert til peroksidase, ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur for å påvise det andre antistoff. Objektglassene ble deretter vasket tre ganger i TBS-buffer, og AEC-substrat (Vector Labs) ble applisert for å tillate fargeutvikling. Objektglassene ble motfarget med hematoksylin, Gill's nr. 2 (Sigma), og deretter skylt i vann før dehydrering og montering.

I miltsnitt var hovedmengden av ekspresjon lokalisert til den røde miltmasse i celler identifisert ved hjelp av morfologi som granulocytter og makrofager. Et stort antall granulocytter ble farget, mens kun en undergruppe av makrofager ga signal. Et lite antall follikulære dendrittceller i den hvite masse ble også svakt farget av aa-antistoffene. CDlla- og CD18-farging ble påvist gjennom hele den røde og hvite masse. CDllc-farging var mer uttalt i store celler, som ble antatt å være makrofager i den hvite miltmasse og i den marginale sone som omgir den hvite masse,- diffus farging i den røde masse ble også notert. CDllb syntes å ha en fordeling som overlappet, men som ikke var identisk med, Od i den røde masse uten noen involvering av hvit masse.

Integrinekspresjon i normalt og (reumatoid) artrittisk synovialvev ble sammenlignet. Minimal farging med alle antiintegrinantistoffer (inkludert antistoffer spesifikt immunreaktive med CDlla, CDllb, CDllc, CD18, så vel som aa) ble observert i normalt vev med en vidstrakt fordeling på stedsegne celler, antakeligvis makrofager. I det betente synovium var ekspresjon av alle integriner mer lokalisert til celler som var gruppert rundt lymfekar. Selv om dd- og CDllb-ekspresjonsmønsteret var lignende, syntes CDllc ikke å være så sterkt uttrykt og var begrenset til en undergruppe av leukocytter.

Hos hund ble det observert ekspresjon av CDllb, men ikke dd, på levermakrofager eller Kuppfer-celler. Farging av normale humane leversnitt (som tidligere beskrevet for farging av hundeleversnitt, supra) bekreftet konservering av dette fargingsmønster hos mennesker. CDllc ble dessuten påvist ved lave nivåer. I snitt fra en hepatittpasient var all leuko-integrinfarging høyere enn den observerte på normal lever, mens ekspresjon ble påvist på makrofager og granulocytter i disse prøver.

Minimal farging av normale humane tykktarmssnitt ble observert med anti-ad-antistof f er; svak farging av glatt muskulatur og leukocytter ble observert. Alle leukointegriner ble påvist ved høyere nivåer i snitt fra pasienter med Crohns sykdom.

Normal lunge viste et begrenset antall svakt ad-positive celler; disse ble bestemt ved morfologi til å være makrofager og nøytrofiler. I lungevev fra en pasient med emfysem ble dd-farging observert på nøytrofiler og makrofager inneholdende hemosiderin, et jerninneholdende pigment, hvilket indikerer at disse celler har slukt røde blodceller.

Snitt fra normal hjerne og plakklesjoner fra pasienter med multippel sklerose (MS) ble undersøkt for integrinekspresjon. I normal hjerne vår c^-farging mindre intens enn med CDlla, CDllb og CDllc og begrenset til celler typebestemt som mikrogliaceller ved morfologi og CD68-farging. CDllb-positive celler var lokalisert rundt blodkar og gjennom vevet. CDllc<+->celler synes å være lokalisert i blodkar, mens ein-celler omga blodkarene. I MS-vevssnitt ble c^-ekspresjon funnet på både mikrogliaceller og på en ikke-makrofag-leuko-cyttundergruppe; ad<+->celler var lokalisert i plakklesjoner og gjennom hele korteks. aa-signalet hadde en intensitet som var ekvivalent med CDllc, men lavere enn CDllb.

Både toraksaorta- og abdominalaortasnitt fra PDAY-vevsprøver (Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth, LSU Medical Center) ble analysert med antileukointe-grin- og anti-CAM-antistoffer. De undersøkte lesjoner var overensstemmende med aortafettstriper som besto av subintime aggregater av store skumceller (hovedsakelig makrofager med fordøyd lipid) og infiltrater av mindre leukocytter. Enkelt-markørstudier med monoklonale antistoffer spesifikke for Cm og de andre p2-integrin-a-kjeder (CDlla, CDllb og CDllc) pluss en makrofagmarkør (CD68) avslørte at majoriteten av lipidfylte makrofager uttrykte et moderat nivå av 0$ og CD18, mens CDlla og CDllc ble uttrykt i henholdsvis svake eller svake til moderate nivåer. CDllb ble svakt uttrykt og da kun av en undergruppe av makrofager.

Dobbeltmarkørstudier ble utført for å bestemme den

relative lokalisering av ad- og ICAM-R-antigener i aortasnitt. Fordi skumceller i disse snitt ble farget med antistoffet Ham 56, som er spesifikt for en makrofagmarkør, men ikke med antistoffer mot glattmuskelaktin, ble det bestemt at skumcellene ikke var avledet fra subintime glatte muskelceller. CD68-positive makrofager som uttrykker aa, var omgitt av og ispedd små ICAM-R-positive leukocytter. Det syntes å foreligge et begrenset antall små leukocytter som var CD68-negative, men som ble farget med både Od- og ICAM-R-antistoffer.

Fordeling av Od i normale vev synes å være på stedsegne leukocytter i et mønster som overlapper, men som ikke er identisk med, mønsteret til CDllb og CDllc, to andre leuko-integrin-a-kjeder som tidligere er blitt karakterisert som å ha begrenset leukocyttfordeling. Cellulær morfologi indikerte at ad-farging i stor grad er begrenset til makrofager og granulocytter, med begrenset lymfocyttfarging. Vevsinflamma-sjon syntes generelt å øke antallet og typene av leukocytter observert i et spesielt vev, sammen med økt farging av leukointegriner, inkludert ad- Fordi den cellulære og romlige fordeling av leukointegrinene ikke var identisk i patologiske vev, ble det trukket den slutning at distinkte funksjoner og ligander eksisterer for hvert familiemedlem, inkludert Od, i spesifikke sammenhenger.

Det er interessant at Od-ekspresjon i tidlige aterosklerotiske lesjoner syntes å være mer uttalt enn ekspresjonen av CDlla, CDllb og CDllc, hvilket antyder at Od kan spille en sentral rolle ved etablering av disse lesjoner. Fordelingen av ad- og ICAM-R-positive celler, understøttet av bevis som antyder en interaksjon mellom aa og ICAM-R, antyder at Od kan være involvert i leukocyttrekruttering eller aktivering på tidlige stadier i disse lesjoner.

Cellelinje- og perifer blodleukocyttfarging

Antistoffene 169A og 169B farget en promyeolmono-cyttisk cellelinje, HL60, ved hjelp av FACS. Overflateekspresjon av eid i disse celler blir negativt påvirket av PMA-stimulering, som rapporteres å indusere differensiering langs en makrofagreaksjonsvei, men er upåvirket av DMSO som induserer granulocyttdifferensiering [Collins et al., Blood, 70:1233-1244 (1987)]. FACS-profilene for 169A og 169B var med PMA-stimulering antitetiske for de observerte med anti-CDllb- og anti-CDllc-monoklonale antistoffer. En monocyttcellelinje, THP-1, oppviste også svak farging med 169A og 169B. En undergruppe av celler i lymfocytt- og monocyttinnløpene av perifere blodleukocytter syntes dessuten å være svakt positive ved FACS. En undergruppe av perifere blodmonocytter farget svakt med 169A og 169B, mens B-lymfocytter ikke ble funnet å ha noen overflateekspresjon av Od- CD8<+->undergruppen av T-lymfocytter var dd<+.> Antistoffer 169A og 169B gjenkjente dessuten ikke antigen på B-cellelinjene JY, Ramos, en basofil linje, KU812, og T-cellelinjer Jurkat, SKW og Molt 16.

I lys av resultatene med HL60-celler ble granulocytter isolert fra perifert blod ved hjelp av ficoll/hypaque-gradientsentrifugering og etterfølgende lysis av røde blodceller. Alle preparater ble funnet å bestå av > 90 % PMN ved visualisering av nukleær morfologi i eddiksyre. Separate populasjoner ble stimulert i 30 minutter med 50 ng/ml PMA eller 10"e M formylpeptid (fMLP) for å frigjøre potensielle intracellulære integrinlagre. Ustimulerte populasjoner oppviste lav, men signifikant, ekspresjon av 169A- og 169B-antigener i forhold til en IgGl-kontroll, med en påvisbar økning observert ved stimulering. På PMN var nivået av eid- og CDllc-overflateekspresjon mer lignende nivået observert på HL60-celler. Antistoffet 169B ble deretter anvendt for å utfelle et heterodimert molekyl fra et detergentlysat av biotinylerte PMN med subenhetsstørrelser på ca. 150 og 95 kD, som henholdsvis passer for Od og CD18.

Tilstedeværelsen av ad på PMN kunne ikke forventes fra den kjente informasjon om hunde-ad-ekspresjon. Hunde-nøytrofiler, i motsetning til deres humane motparter, uttrykker T-hjelpercellemarkøren CD4 og også integrin VLA-4, og kan derfor ha andre ligander og funksjoner hos hund enn hos

menneske.

Farging av PBL- undergrupper

Den foreliggende undersøkelse ble utført for å bestemme fordelingen av dette p2-integrin i humane perifere blodleukocytter. Celleoverflatetettheten av dd i forhold til andre p2-integriner ble dessuten sammenlignet. Den akutte regulering av eid-ekspresjon i rensede humane eosinofiler ble til sist også evaluert.

Humane perifere blodleukocytter ble separert ved tetthetsgradientsentrifugering i en mononukleær cellefraksjon (inneholdende monocytter, lymfocytter og basofiler)' og granulocytter (nøytrofiler og eosinofiler) [Warner et al., J. Immunol. Meth., 105:107-110 (1987)]. For noen eksperimenter ble eosinofiler renset ved anvendelse av CD16-immunmagnetisk seleksjon til renheter høyere enn 95 % [Hansel et al., J. Immunol. Meth., 122:97-103 (1989)]. Hudmastceller ble enzymat-isk dispergert fra menneskehud og anriket som beskrevet tidligere [Lawrence et al., J. Immunol., 139:3062-3069

(1987)].

Celler ble merket med egnede fortynninger av monoklonalt antistoff spesifikt for enten CDlla (MHM24), CDllb

(H5A4), CDllc (BU-15) eller dd (169A). Et musekontroll-IgGi ble også anvendt. Celler ble vasket og deretter inkubert med fyko-erytrinkonjugert geite-antimuse-IgG. I noen eksperimenter ble celler inkubert med overskudd av muse-IgG og FITC-merket, mu-semonoklonalt antistoff eller geitepolyklonalt antistoff spesifikt for en spesiell celle (f.eks. CD3, CD4 eller CD8 for T-celler; CD16+-lymfocytter for NK-celler; anti-IgE for basofiler [Bochner et al., J. Immunol. Meth., 125:265-271 (1989)]. Prøvene ble deretter undersøkt ved hjelp av strømningscyto-metri (Coulter EPICS Profile) ved anvendelse av egnet signal-styring for å identifisere celleundergrupper.

For undersøkelser med humane eosinofiler hvori akutt oppregulering av Od-ekspresjon ble undersøkt, ble celler stimulert i 15 minutter ved 37 °C med forbolester (10 ng/ml) , RANTES (100 ng/ml) [Schall, Cytokine, 3:165-183 (1991)] eller IL-5 (10 ng/ml) før merking med de forskjellige monoklonale

Resultater viste at ad var til stede på alle perifere blodeosinofiler, basofiler, nøytrofiler, monocytter og NK-celler. En liten undergruppe (ca. 30 %) av CD8<+->lymfocytter ble også funnet å uttrykke eid. Hudmastceller og CD4<+->lymfocytter uttrykte ikke aa. CDlla og CDllb er generelt til stede ved en høyere tetthet på leukocytter enn ad, idet den sistnevnte uttrykkes ved forholdsvis lave nivåer lignende CDllc. Blant leukocytter har monocytter og CD8<+->celler den høyeste tetthet av Oa, mens eosinofiler har det laveste nivå av c^-ekspresjon. Ekspresjon på nøytrofiler, basofiler og NK-celler lå i en mellomstilling.

Stimulering av perifere eosinofiler med CC-kjemokinet RANTES forårsaket ingen endring i ekspresjonen av noen av p2-integrinene. Behandling med forbolester ga imidlertid en 2-3 gangers økning i ekspresjon av både CDllb og ad, men bevirket ingen ekspresjon av CDlla eller CDllc. IL-5-behandling resulterte i selektiv oppregulering av CDllb-ekspresjon uten å påvirke nivåer av de andre integrinsubenheter.

Samlet indikerer disse resultater at i perifere blodleukocytter uttrykkes cia vanligvis ved et nivå som er sammen-lignbart med CDllc. De høyeste nivåer finnes på monocytter og en undergruppe av CD8<+->lymfocytter. Humane hudmastceller uttrykker ikke cia. Rensede eosinofiler synes å ha intracyto-plasmatiske lagre av CDllb og aa- Den differensielle oppregulering vist ved hjelp av IL-5 i forhold til PMA antyder imidlertid at disse lagre er atskilt fra hverandre.

Fargingsmønstre for perifere blodleukocytt(PBL)undergrupper ble også bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en kombinasjon av signalutvelgelse og overflate-markører, som beskrevet ovenfor, i et forsøk på mer nøyaktig definisjon av den 169A/B-negative lymfocyttgruppe. PBL ble isolert på ficoll, som beskrevet tidligere, og farget separat med 169A, 169B og monoklonale antistoffer mot CD14 (monocytt-/makrofagmarkør), CD20 (B-celle), CD56 (NK-celle), T-celle-reseptor a/p (T-celle), CD16 (nøytrofiler, NK) og a4 (en negativ markør for nøytrofiler). Utløp ble definert ved hjelp av størrelses- og markørfordeling.

Resultater indikerte at celler i CD14+-monocytt-utløpet oppviste lave nivåer av 169A- og 169B-farging. Et bimodalt ekspresjonsmønster observert i tidligere eksperimenter i lymfocyttutløpet ble spaltet ved å øke forovergående spredning. Den blandede TCR<+>/CD20<+->populasjon synes å ha lave, men homogene, nivåer for 169A/B-ekspresjon, mens en populasjon kartlagt ved litt høyere sidespredning (cellulær kompleksi-tet) , som ga 50 % positiv farging for CD56, synes å ha en distinkt 169A/B-negativ populasjon. Den negative populasjon ble altså ikke gjenkjent av TCR-, CD20-, CD14- eller CD16-antistoffer.

Synovialfordeling av Qd

For å bestemme cellulær fordeling av aa, andre {J2-integriner og deres motreseptorer i inflammatorisk og ikke-inflammatorisk synovium ble monoklonale antistoffer mot de forskjellige p2-integrin- og immunglobulinsupergenfamilier anvendt i immunhistologiske undersøkelser. Proteinekspresjon ble bestemt i normale, osteoartrittiske og reumatoide synovial vevsprøve r .

Resultater indikerte at cellelaget i synovialhinnen uttrykte høye nivåer av VCAM-1, CDllb/CD18 og Od/CD18. I disse celler er CDllc/CD18-ekspresjon begrenset, og CDlla/CDl8 blir vanligvis ikke påvist. Ved reumatoid arthritis synovitis øker ekspresjon av |32-integriner i det synoviale cellelag propor-sjonalt med graden av hyperplasi. Andelen av celler som uttrykker CDllc, øker signifikant og nærmer seg ekspresjonen av CDllb og aa, men det er ingen økning av CDlla-ekspresjon.

I vevsområdene under hinnen er aggregater og diffuse infiltrater av CD3/CDlla/ICAM-R<*->lymfocytter utspredt blant CD68/CDllb/ad+-makrofager. Et betydelig antall aggregater viser intens cta-farging, spesielt i T-cellerike områder.

Det synoviale endotel uttrykte variable ICAM-1 og ICAM-2 med minimalt bevis på ICAM-R-ekspresjon.

Samlet indikerer disse resultater at synoviale makrofager og makrofaglignende synovialceller konstitutivt uttrykker høye nivåer av p2-integrinene CDllb og ctd. Ved synovitt foreligger det en utvidelse av denne undergruppe av celler i både hinneområdene og områdene under hinnen, sammen med en tilsynelatende økning av ekspresjon av CDllc. Spesifikke populasjoner av reumatoide synovial-T-lymfocytter uttrykker således, i tillegg til å uttrykke CDlla og ICAM-R, høye nivåer av aa hvor det sistnevnte molekyl ovenfor er blitt vist å uttrykkes ved lave nivåer av perifere blodlymfocytter.

Eksempel 17

Isolering av rotte- cDNA- kloner

I betraktning av eksistensen av både hunde- og humane dd-subenheter ble det gjort forsøk på å isolere homogene gener i andre arter, inkludert rotte (dette eksempel) og mus (eksempel 17 nedenfor).

En partiell sekvens av et rotte-cDNA som viser homologi med det humane Od-gen, ble erholdt fra et rottemilt-Agt10-bibliotek (Clontech). Biblioteket ble utspredt ved 2 x 10<4> pfu/plate på 150 mm LBM/agarplater. Biblioteket ble oppsugd på Hybond-membraner (Amersham), denaturert i 3 minutter, nøytralisert i 3 minutter og vasket i 5 minutter med buffere, som beskrevet i standardprotokoller [Sambrook et al., Mole-cular Cloning: A Laboratory Manual, s. 110]. Membranene ble umiddelbart plassert i en Stratalinker (Stratagene), og DNA ble kryssbundet ved anvendelse av den automatiske kryss-bindingsinnstilling. Membranene ble prehybridisert og hybridisert i 30 % eller 50 % formamid, for henholdsvis lav- og høy-stringensbetingelser. Membranene ble først screenet med en <32>P-merket probe dannet fra det humane ctd-cDNA, som tilsvarer baser 500-2100 i klon 19A2 (SEKV.ID. NR. 1). Proben ble merket ved anvendelse av Boehringer Mannheims "Random Prime Kit" i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Filtrene ble vasket to ganger med SSC ved 55 °C.

Det ble identifisert to kloner betegnet 684.3 og 705.1, som viste sekvenshomologi med human a^, human CDllb og human CDllc. Begge kloner passet sammen med det humane ctd-gen i 3<1->området av genet, fra base 1871 til base 3012 for klon 684.3 og baser 1551-3367 for klon 705.1.

For å isolere en mer komplett rottesekvens som inkluderte 5'-området, ble det samme bibliotek screenet på nytt ved anvendelse av den samme protokoll som benyttet for den innledende screening, men ved anvendelse av en museprobe dannet fra klon A1160 (se eksempel 17 nedenfor). Enkle isolerte plakker ble utvalgt fra den andre screening og opprettholdt som enkle kloner på LBM/agarplater. Sekvenseringsprimere 434FL og 434FR (henholdsvis SEKV.ID. NR. 34 og 35) ble anvendt i en standard PCR-protokoll for å danne DNA for sekvensering.

DNA fra PCR ble renset ved anvendelse av en Quick Spin-kolonne (Qiagen) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll .

Det ble identifisert to kloner betegnet 741.4 og 741.11, som overlappet kloner 684.3 og 705.1; i de overlappende områder var kloner 741.1 og 741.11 100 % homologe med kloner 684.3 og 705.1. Et sammensatt rotte-cDNA med homologi med det humane ctd-gen er vist i SEKV.ID. NR. 36; den beregnede aminosyresekvens er vist i SEKV.ID. NR. 37.

Kloning av 5'- enden av rotte- aj

Et 5 *-cDNA-f ragment av rotte-aa-genet ble erholdt ved anvendelse av et Clonetech rottemilt-RACE-kloningssett i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. De anvendte genspesifikke oligonukleotider ble betegnet 741.11#2R og 741.2#1R (henholdsvis SEKV.ID. NR. 59 og 58).

Oligo 74l.ll#2R omfatter basepar 131-152 i SEKV.ID. NR. 36, i den motsatte orientering, og 741.2#1R omfatter basepar 696-715 i SEKV.ID. NR. 36, også i motsatt orientering. En primær PCR ble utført ved anvendelse av det mest 3'-oligo, 741.2#1R. Det ble utført en andre PCR ved anvendelse av oligo 741.11#2R og DNA dannet fra den primære reaksjon. Et bånd på ca. 300 basepar ble påvist på en 1 % agarosegel.

Det andre PCR-produkt ble ligert i plasmid pCRTAII (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Hvite (positive) kolonier ble utplukket og tilsatt til 100 pl LBM inneholdende 1 pl av en 50 mg/ml karbenicillin-stamløsning og 1 pl M13 K07-fagkultur, i individuelle brønner i en rundbunnet, 96-brønners kulturplate. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter til 1 time. Etter den innledende inkubasjonsperiode ble 100 pl LBM (inneholdende 1 pl 50 mg/ml karbenicillin og en 1:250-fortynning av en 10 mg/ml kanamycinstamløsning) tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt over natten ved 37 °C.

Ved anvendelse av en steril 96-brønners metallover-føringsgaffel ble supernatanten fra 96-brønners-platen over-ført til fire Amersham Hybond-nylonfiltre. Filtrene ble denaturert, nøytralisert og kryssbundet ved hjelp av standardprotokoller. Filtrene ble prehybridisert i 20 ml prehybridiseringsbuffer (5 x SSPE; 5 x Denhardts; 1 % SDS; 50 pg/ml denaturert laksesperma-DNA) ved 50 °C i flere timer under omrøring.

Oligoprober 741.11#1 og 741.11#1R (henholdsvis SEKV.ID. NR. 56 og 57), som omfattet basepar 86-105 (SEKV.ID. NR. 36) henholdsvis i orienteringen forover og bakover, ble merket som følger.

Cirka 65 ng oligo-DNA i 12 pl dH20 ble oppvarmet til 65 °C i

2 minutter. 3 pl 10 mCi/ml Y-<32p_>ATP ble tilsatt til røret sammen med 4 pl 5 x kinasebuffer (Gibco) og 1 ul T4-DNA-kinase (Gibco) . Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter. Etter inkubasjon ble 16 pl av hver merket oligoprobe tilsatt til prehybridiseringsbufferen og filtrene, og hybridiseringen ble fortsatt over natten ved 42 °C. Filtrene ble vasket tre ganger i 5 x SSPE; 0,1 % SDS, i 5 minutter pr. vask ved romtemperatur, og autoradiografert i 6 timer. Positive kloner ble ekspandert, og DNA ble renset ved anvendelse av Magic Mini Prep Kit (Promega) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Klon 2F7 ble utvalgt for sekvensering og viste 100 % homologi med klon 741.11 i det overlappende området. Den komplette rotte-Oa-nukleinsyresekvens er vist i SEKV.ID. NR. 54; aminosyresekvensen er vist i SEKV.ID. NR. 55.

Karakteristiske trekk for rotte- cDNA og aminosyresekvensene

Verken nukleinsyresekvenser eller aminosyresekvénser er tidligere rapportert for rotte-a-subenheter i p2-integriner. Sekvenssammenligninger med rapporterte humane p2-integrin-a-subenheter antydet imidlertid at den isolerte rotteklon og dens forutsagte aminosyresekvens er meget nært beslektet med Od-nukleotid og aminosyresekvénser.

På nukleinsyrenivået viser den isolerte rotte-cDNA-klon 80 % identitet sammenlignet med det humane cid-cDNA; 68 % identitet sammenlignet med human CDllb; 70 % identitet sammenlignet med human CDllc; og 65 % identitet sammenlignet med muse-CDllb. Ingen signifikant identitet finnes sammenlignet med human CDlla og muse-CDlla.

På aminosyrenivået viser det forutsagte rottepoly-peptid som kodes for av det isolerte cDNA, 70 % identitet sammenlignet med humant Od-polypeptid; 28 % identitet sammenlignet med human CDlla; 58 % identitet sammenlignet med human CDllb; 61 % identitet sammenlignet med human CDllc; 28 % identitet sammenlignet med muse-CDlla; og 55 % identitet sammenlignet med muse-CDllb.

Eksempel 18

Produksjon og karakterisering av gnager- Od- spesifikke antistoffer

A. Antistof f er mot rotte- ad- I- domene-/ HuIgG4- fusjonsproteiner

I betraktning av det faktum at I-domenet av humane p2-integriner er blitt vist å delta i ligandbinding, ble det antatt at det samme ville være tilfelle for rotte-oa-protein. Monoklonale antistoffer immunspesifikke for rotte-ctd-1-domenet kan derfor være anvendelige i rottemodeller av humane sykdomstilstander hvori cid-binding impliseres..

Oligonukleotider "rotte-a-DI5" (SEKV.ID. NR. 87) og "rotte-a-DI3" (SEKV.ID. NR. 88) ble dannet fra rotte-ctd-sekvensen og tilsvarte henholdsvis basepar 469-4 93 og basepar 1101-1125 (i den motsatte orientering) i SEKV.ID. NR. 54. 01igonukleotidene ble anvendt i en standard-PCR-reaksjon for å danne et rotte-Od-DNA-fragment som inneholder I-domenet, som omspenner basepar 459-1125 i SEKV.ID. NR. 54. PCR-produktet ble ligert i vektor pCRTAII (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. En positiv koloni ble utvalgt og ekspandert for DNA-rensing ved anvendelse av et Qiagen-Midi Prep-sett (Chatswoth, GA) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. DNA ble spaltet med Xhol og Bgrlll i en standardrestriksjonsenzymspalting, og et bånd med 600 basepar ble gelrenset og deretter ligert i pDCSl/HuIgG4-ekspresjonsvektor. En positiv koloni ble utvalgt, ekspandert og DNA-renset med et Qiagen Maxi Prep-sett.

COS-celler ble utspredt ved halv konfluens på 100 mm kulturskåler og dyrket over natten ved 37 °C i 7 % C02. Celler ble skylt én gang med 5 ml DMEM. Til 5 ml DMEM ble det tilsatt 50 ul DEAE-dekstran, 2 pl klorokin og 15 ug rotte-Od-I-domene-/HuIgG4-DNA, beskrevet ovenfor. Blandingen ble tilsatt til COS-cellene og inkubert ved 37 °C i 3 timer. Mediet ble deretter fjernet, og 5 ml 10 % DMSO i CMF-PBS ble tilsatt i nøyaktig 1 minutt. Cellene ble forsiktig skylt én gang med DMEM. 10 ml DMEM inneholdende 10 % FBS ble tilsatt til cellene, og inkubasjonen ble fortsatt over natten ved 37 °C i 7 % C02. Den neste dag ble mediet erstattet med friskt medium, og inkubasjonen ble fortsatt i 3 ytterligere dager. Mediet ble innhøstet, og friskt medium ble tilsatt til platen. Etter 3 dager ble mediet på nytt innsamlet, og platene ble kastet. Prosedyren ble gjentatt inntil det var oppsamlet 2 1 kultursupernatant.

Supernatant innsamlet som beskrevet ovenfor, ble applisert på en Prosep-A-kolonne (Bioprocessing Limited), og proteinet ble renset som beskrevet nedenfor.

Kolonnen ble først vasket med 15 kolonnevolumer vaskebuffer inneholdende 35 mM Tris og 150 mM NaCl, pH 7,5. Supernatant ble applisert ved en langsom hastighet på mindre enn ca. 60 kolonnevolumer pr. time. Etter applisering ble kolonnen vasket med 15 kolonnevolumer vaskebuffer, 15 kolonnevolumer 0,55 M dietanolamin, pH 8,5, og 15 kolonnevolumer 50 mM sitronsyre, pH 5,0. Protein ble eluert med 50 mM sitronsyre, pH 3,0. Proteinet ble nøytralisert med 1,0 M Tris, pH 8,0, og dialysert i steril PBS.

Rotte-ad-I-domeneproteinet ble analysert som beskrevet i eksempel 14. Det påviste protein vandret på samme måte som observert med humant I-domeneprotein.

B. Fremstilling av monoklonale antistoffer mot rotte- Od- I-domene-/ HuIgG4- fusj onsproteiner

Mus ble individuelt immunisert med 50 ug renset rotte-dd-I-domene-/HuIgG4-fusjonsprotein som tidligere var emulgert i et like stort volum Freunds komplette adjuvans (FCA) (Sigma). Cirka 200 pl av antigen-/adjuvanspreparatet ble injisert på fire steder i ryggen og sidene hos hver av musene.

2 uker senere mottok musene en forsterkningsinjeksjon på

100 pl rotte-dd-1-domene-/HuIgG4-antigen (50 pg/mus) som tidligere var emulgert i et like stort volum Freunds ukomplet-te adjuvans (FIA). Etter ytterligere 2 uker mottok musene en forsterkningsinjeksjon med 50 pg antigen i 200 pl PBS intra-venøst .

For å evaluere serumtitere i de immuniserte mus ble det utført retroorbitale bloduttappinger fra dyrene 10 dager etter den tredje immunisering. Blodet ble tillatt å koagulere, og serum ble isolert ved sentrifugering. Serumet ble anvendt i en immunutfelling på biotinylerte (BIP) rottesplenocytter. Serum fra hver mus immunutfelte proteinbånd med forventet molekylvekt for rotte-Od og rotte-CD18. Én mus ble utvalgt for fusjon og mottok en forsterkningsinjeksjon en fjerde gang, som beskrevet ovenfor, for den tredje forsterkningsinjeksjon.

Hybridomsupernatantene ble screenet ved hjelp av antistoffinnfangelse beskrevet som følger. Immulon 4-plater (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) ble belagt ved 4 °C med 50 pl/brønn geite-antimuse-IgA, -IgG eller -IgM (Organon Teknika) fortynnet 1:5000 i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6. Plater ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween 20 (PBST), og 50 pl kultursupernatant ble tilsatt. Etter inkubasjon ved 37 °C i 3 0 minutter og vask, som beskrevet ovenfor, ble 50 pl pepperrotperoksidasekonjugert geite-anti-muse-IgG9(fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) fortynnet 1:3500 i PBST tilsatt. Platene ble inkubert som beskrevet ovenfor og vasket fire ganger med PBST. Umiddelbart deretter ble det tilsatt 100 pl substrat inneholdende 1 mg/ml o-fenylendiamin (Sigma) og 0,1 pl/ml 30 % H202 i 100 mM sitrat, pH 4,5. Fargereaksjonen ble stoppet etter 5 minutter ved tilsetning av 50 pl 15 % H2S04. Absorbans ved 490 nm ble avlest på Dynatech-plateavleser.

Supernatant fra antistoffinneholdende brønner ble også analysert ved hjelp av ELISA med immobilisert rotte-cta-I-domene-/HuIgG4-fusjonsprotein. En ELISA med HuIgG4-antistoff-belagte plater tjente som en kontroll for reaktivitet mot igG-fusjonspartneren. Positive brønner ble utvalgt for ytterligere screening ved hjelp av BIP på rottesplenocyttlysater ved anvendelse av teknikker beskrevet nedenfor.

C. Fremstilling av polyklonale sera mot rotte- aa- I- domene-/ HuIgG4- fusjonsprotein

Blodprøver ble tatt fra to kaniner før immunisering med 100 ug renset rotte-cta-1-domene-/HuIgG4-fusjonsprotein i komplett Freunds adjuvans. Injeksjoner ble gjentatt med den samme dose i ukomplett Freunds adjuvans (IFA) hver 3. uke. Etter tre injeksjoner ble testblodprøver tappet fra kaninene, og de oppsamlede sera ble anvendt i en standardimmunutfelling på rottesplenocyttlysater. Det ble bestemt at sera fra begge kaniner var immunreaktive med rotte-Oa. Kaninene ble på nytt gitt forsterkningsinjeksjoner med 100 pg antigen i IFA, og de oppsamlede sera ble analysert for økt immunreaktivitet med rotte-cid ved immunutfelling. Dyrene ble gitt en siste for-sterkningsinj eks jon, og 10 dager senere ble alt blod tappet og sera ble oppsamlet.

Rotte- Qd- hiBtologi

Kaninpolyklonale sera dannet mot rotte-ad-"I"-domene ble anvendt ved immunhistokjemisk farging av rottevevssnitt ved hjelp av teknikken beskrevet i eksempel 16. Fargemønsteret påvist på frosne og parafininnstøpte rottemiltsnitt var vesentlig identisk med mønsteret observert med antistoffene mot human ad med farging av individuelle celler i hele den røde masse. Fargingsmønsteret var forskjellig fra mønsteret observert med monoklonale antistoffer mot rotte-CDlla, -CDllb og -CD18. Et positivt fargingsmønster ble dessuten observert i thymus på individuelle celler i hele korteks. Ingen av disse vev ga noe signal når de ble farget med kaninpreimmunsera.

D. Analyse av antistoffspesifisitet

Rotter ble avlivet ved kvelning med C02, og milter ble fjernet ved anvendelse av standard kirurgiske teknikker. Splenocytter ble innhøstet ved forsiktig pressing av milten gjennom et trådnett med et 3 cm<3> sprøytestempel i 20 ml RPMI. Celler ble oppsamlet i et 50 ml konisk rør og vasket i den passende buffer.

Celler ble vasket tre ganger i kald D-PBS og resuspendert ved en tetthet på 10B til IO<9> celler i 40 ml PBS. 4 mg NHS-biotin (Pierce) ble tilsatt til cellesuspensjonen, og reaksjonen ble tillatt å fortsette i nøyaktig 15 minutter ved romtemperatur. Cellene ble pelletert og vasket tre ganger i kald D-PBS. Cellene ble resuspendert ved en tetthet på 108 celler/ml i kald lysisbuffer (1 % NP40; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCl; 2 mM MgCl; 1:100-oppløsning av pepstatin, leupeptin og aprotinin, tilsatt like før tilsetning til cellene; og 0,0001 g PMSF-krystaller, tilsatt like før tilsetning til cellene). Lysater ble virvlet i ca. 30 sekunder, inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og inkubert i ytterligere 15 minutter på is. Lysater ble sentrifugert i 10 minutter ved 10 000 x g for å pelletere det uoppløselige materialet. Supernatant ble oppsamlet i et nytt rør og lagret ved mellom 4 °C og -20 °C. 1 ml cellelysat ble forhåndsklaret ved inkubasjon med

200 ul av en protein-A-Sepharose-oppslemming {Zymed) over natten ved 4 °C. Aliquoter på 50 pl/rør av forhåndsklaret lysat ble overført til Eppendorf-rør for hvert antistoff som skulle testes. 25 pl polyklonalt serum eller 100-500 ul monoklonalt antistoffsupernatant ble tilsatt til de forhåndB-klarede lysater, og den resulterende blanding ble inkubert i 2 timer ved 4 °C under omrøring. 100 ul kanin-antimuse-IgG (Jackson) bundet til protein-A-Sepharose-kuler i en PBS-oppslemming ble deretter tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 30 minutter ved romtemperatur under omrøring. Kulene ble pelletert ved forsiktig sentrifugering og vasket tre ganger med kald vaskebuffer (10 mM HEPES, 0,2 M NaCl og 1 % Triton-X-100). Supernatant ble fjernet ved avsuging, og 20 pl 2 x SDS-prøvebuffer inneholdende 10 % p-merkaptoetanol ble tilsatt. Prøven ble kokt i 2 minutter i et vannbad, og prøven ble applisert på en 5 % SDS-PAGE-gel. Etter separering ble proteinene overført til nitrocellulose over natten ved konstant strøm. Nitrocelluloséfiltrene ble blokkert med 3 % BSA i TBS-T i 1 time ved romtemperatur, og blokkeringsbufferen ble fjernet. En 1:6000-fortynning av streptavidin-HRP-konjugat (Jackson) i 0,1 % BSA-TBS-T ble tilsatt, og inkubasjonen ble fortsatt i 30 minutter ved romtemperatur. Filtrene ble vasket tre ganger i 15 minutter med TBS-T og autoradiografert ved anvendelse av Amershams ECL-sett i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll.

E. Fremstilling av monoklonale antistoffer mot uforkortet rotte- dd- protein

Rensing av rotte- Qd- protein

Rotte-Od ble renset fra rottesplenocytter for å preparere et immunogen for å danne antirotte-Od-monoklonale antistoffer. Milter fra ca. 50 normale Lewis-hunnrotter, 12-20 uker gamle, ble oppsamlet, og en enkelteellesuspensjon ble dannet fra vevet ved å tvinge det gjennom et fint trådnett. Røde blodceller ble fjernet ved lysis i buffer inneholdende 150 mM NH4C1; 10 mM KHCO3; 0,1 mM EDTA, pH 7,4; og resterende leukocytter ble vasket to ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS). Splenocyttene ble pelletert ved sentrifugering og lysert i buffer inneholdende 50 mM Tris, 150 mM NACl, 2 mM CaCl2/ 2 mM MgCl2, 10 mM PMSF, leupeptin, pepstatin og 1 % Triton X-100. Splenocyttlysis ble utført på is i 30 minutter med 1 ml lysisbuffer pr. 5 x IO<8> splenocytter. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering.

CDlla, CDllb og CDllc ble fjernet fra miltlysatet ved immunutfelling som følger. 750 ul av en protein A-Sepharose-oppslemming ble inkubert med 2 mg kanin-antimuse-immunglobulin ved 4 °C i 30 minutter. Kanin-antimuse-protein A-Sepharosen ble vasket tre ganger med lysisbuffer og suspendert i et sluttvolum på 1,5 ml lysisbuffer. Cirka 200 ug av hvert av rotte-fø-integrinspesif ikke, monoklonale antistoffer 515 F (spesifikt for rotte-CDlla), OX-42 (spesifikt for rotte-CDllb) og 100g (spesifikt for rotte-CDllc) ble tilsatt til 50 ml av rottemiltlysatet. Etter 30 minutters inkubasjon ved 4 °C ble 500 pl av kanin-antimuse-protein A-Sepharosen tilsatt til miltlysatene og blandet ved "ende-over-ende"-rotasjon i 30 minutter ved 4 °C. Lysatet ble sentrifugert ved 2500 x g i 10 minutter for å pelletere CDlla, CDllb og CDllc bundet til kanin-antimuse-protein A-Sepharosen, og supernatanten ble overført til et rent 50 ml sentrifugerør. Immunutfelling med antistoffene 515F, OX-42 og 100g ble gjentatt ytterligere to ganger for å sikre fullstendig fjerning av CDlla, CDllb og CDllc.

p2-integriner resterende i lysatet ble isolert ved anvendelse av affinitetsrensing. Cirka 250 ul av en oppslemming av antirotte-CDia-monoklonale antistoffer 20C5B, konjugert til CNBr-Sepharose, ble tilsatt til lysatene og blandet ved "ende-over-ende"-rotasjon i 30 minutter ved 4 °C. Antistoff -/ant igenkomplekser ble pelletert ved sentrifugering ved 2500 x g i 10 minutter, og pelleten ble vasket tre ganger med lysisbuffer før den ble lagret ved 4 °C.

Immunisering av armenske hamstere

Armenske hamstere med alder 6-8 uker ble innlednings-vis immunisert med ca. 50 ug av et rekombinant protein bestående av I-domenet av rotte-aa fusjonert til den humane IgG4-tunge kjede emulgert i komplett Freunds adjuvans. Primær immunisering ble etterfulgt av etterfølgende immuniseringer med rotte-ad-I-domene/HuIgG4 emulgert i ukomplett Freunds adjuvans på dagene 14, 33 og 95. To separate fusjoner, betegnet 197 og 199, ble deretter utført. 4 dager før fusjon 197 (dag 306) ble det til én hamster administrert en kombinasjon av rotte-aa-protein renset fra splenocytter og CHO-celler transfektert med rotte-Od-Fusjonsforsterkningsinjeksjonen ble gitt 3 dager før fusjonen (dag 307) med renset rotte-Od-protein og aa-trans fekt erte CHO-celler. Rot te-cia-trans f ekt erte CHO-celler ble preparert som beskrevet nedenfor.

Et gensegment som koder for uforkortet rotte-aa-protein, ble innføyd i pDCl-vektoren og transfektert ved elektroporering i CHO-celler sammen med en human CD18-pRC-konstruksjon. Transfekterte celler ble dyrket i nærvær av hypoksantin for å selektere celler som ble vellykket transfektert med pRC-konstruksjonen, og i nærvær av g418 for å selektere celler transfektert med pDCl-konstruksjonen. Etter 3 uker ble cellene farget med de rotte-da-spes i fikke kaninpolyklonale sera og sortert ved hjelp av FACS. En liten prosentdel av cellene som uttrykte de høyeste nivåer av overflate-aa (ca. 3 % av den totale populasjon), ble oppsamlet og ytterligere ekspandert. FACS-seleksjon ble gjentatt flere ganger for å tilveiebringe en cellepopulasjon med høye nivåer av aa-over-flateekspresj on.

De aa-transfekterte celler ble også karakterisert ved strømningscytometri ved anvendelse av et rotte-aa-spes i f ikt polyklonalt serum og et humant CD18-spesifikt monoklonalt antistoff, TS1.18.1. Resultatene bekreftet at de transfekterte CHO-celler uttrykte høye nivåer av både rotte-ad og human CD18.

Til slutt ble ad- og CD18-ekspresjon i cellene evaluert ved immunutfelling. Et rotte-aa-spesifikt kaninpolyklonalt serum ble funnet å immunutfelle proteiner med to distinkte molekylvekter: det mer høymolekylære protein(er) var ca. 170 kD, og det mer lavmolekylære protein(er) var 95 kD. Disse funn var overensstemmende med ekspresjon av et heterodimert kompleks av rotte-ad/human CD18 på overflaten av de

transfekterte CHO-celler.

På fusjonsdagen ble milten fjernet, og en enkeltcellesuspensjon ble dannet ved å gni vevet mellom mattslipte ender av to mikroskopobjektglass neddyppet i serumfritt RPMI 1640 supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat,

100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (RPMI)

{Gibco, Canada). Cellesuspensjonen ble filtrert gjennom et sterilt 70-mesh Nitex-cellefilter (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) og vasket to ganger ved sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter og resuspendering av pelleten i 20 ml serumfritt RPMI. Thymocytter tatt fra tre ubehandlede Balb/c-mus ble preparert på lignende måte. NS-l-myelomceller, opprettholdt i logfase i RPMI med 10 % Fetalclone-serum (FBS)

(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) i 3 dager før fusjon, ble sentrifugert ved 200 x g i 5 minutter, og pelleten ble vasket to ganger, som beskrevet tidligere.

Cirka 1,15 x IO<8> miltceller ble kombinert med 5,8 x 10<7> NS-l-celler og sentrifugert, og supernatanten ble fjernet ved avsuging. Cellepelleten ble forflyttet ved å tappe røret, og 7 ml 37 °C PEG 1500 (50 % i 75 mM HEPES, pH 8,0)

(Boehringer Mannheim) ble tilsatt under omrøring i løpet av

1 minutt, etterfulgt av tilsetning av 14 ml serumfritt RPMI i løpet av 7 minutter. Ytterligere 8 ml RPMI ble tilsatt, og cellene ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet, og pelleten ble resuspendert i 200 ml RPMI inneholdende 15 % FBS, 100 mM natriumhypoksantin, 0,4 mM aminopterin, 16 mM tymidin (HAT) (Gibco), 25 enheter/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) og 1,5 x IO<6> thymocytter/ml. Suspen-sjonen ble overført til ti 96-brønners, flatbunnede vevskulturplater (Corning, UK) i en mengde på 200 ug/brønn, og cellene ble tilført næring på dagene 4, 5, 6 og 7 etter fusjon ved avsuging av ca. 100 pl fra hver brønn med en 18 G-nål (Becton Dickinson) og tilsetning av 100 pl utspredningsmedium, beskrevet ovenfor, med unntak av at det manglet thymocytter.

På dag 10 ble supernatanter fra fusjonsbrønnene screenet ved strømningscytometri for reaktivitet overfor rotte-aa/human CD18-transfekterte CHO-celler. Cirka 5 x 10<5 >rotte-Od-transfekterte CHO-celler ble suspendert i 50 pl RPMI inneholdende 0,2 % FBS og 0,05 natriumazid, og tilsatt til ca. 100 ul hybridomkultursupernatant i 96-brønners, rundbunnede plater. Positive kontroller for farging inkluderte kanin-anti-ad-polyklonale sera og TS1/18 (antihuman CD18). Celler ble inkubert i 30 minutter på is, vasket tre ganger i FACS-buffer (RPMI, 2,0 % FBS, 0,05 % Na-azid) og inkubert i 30 minutter på is med et FITC-konjugert geite-antihamster-antistoff (Jackson ImmunoResearch Labs) ved en endelig fortynning på 1:200 i FACS-buffer. Celler ble vasket tre ganger i FACS-buffer og resuspendert i 200 ml FACS-buffer. Prøver ble analysert med et Becton Dickinson FACScan-analyseringsapparat. For å sikre at brønner med positive kloner var spesifikke for rotte-aa ble screeningen gjentatt med utransfekterte CHO-celler. Brønner som tilfredsstilte kriteriene for reaksjon med rotte-aa-CHO-transfektanter og ikke de utransfekterte CHO-celler, ble klonet.

Etter primær screening ble celler fra positive brønner først klonet ved doblingsfortynning og deretter ved begrensningsfortynning i RPMI, 15 % FBS, 100 mM natriumhypoksantin, 16 mM tymidin og 10 enheter/ml IL-6. I begrensnings-fortynningstrinnet ble prosentdelen av brønner som viste vekst, bestemt, og klonalitet ble forhåndsbestemt ved anvendelse av en Poisson-fordelingsanalyse. Brønner som viste vekst, ble analysert ved hjelp av FACS etter 10-12 dager. Etter den siste kloning ble positive brønner ekspandert i RPMI og 11 % FBS. Kloning ga én kultur som ble bedømt som positiv ved disse kriterier, og fra denne klon ble fire separate sub-kloner, betegnet 197A-1, 197A-2, 197A-3 og 197A-4, ekspandert.

Før fusjon 199 ble en andre hamster gitt en forsterk-ningsinj eks jon på dag 307 med 2,3 x IO<6> rotte-Oa-transfekterte CHO-celler. To siste immuniseringer ble administrert 4 dager før fusjonen (dag 334) og på nytt 3 dager før fusjonen (dag 335). Forsterkningsinjeksjonen på dag 334 besto av 2 x IO<6 >rotte-aa-transfekterte CHO-celler og 200 pl renset rotte-aa bundet til Sepharose (beskrevet tidligere), administrert ved intraperitoneal injeksjon. Forsterkningsinjeksjonen på dag 335 besto av 5 x 10<6> rotte-aa-transfekterte CHO-celler, også administrert ved intraperitoneal injeksjon. Fusjonen og screeningsprotokollene for fusjon 199 var identiske med fusjon 197, og tre hybridomer, betegnet 199A, 199H og 199M, med supernatant som var reaktiv med rotte-aa, ble identifisert og klonet. Hybridomen betegnet 199M ble deponert 1. mars 1996 hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, og gitt aksesjonsnummer HB12058.

Karakterisering av monoklonale antistoffer mot rotte- Od

For å karakterisere antirotte-Od-antistof f ene ble biotinmerkede miltlysater fremstilt, som beskrevet i eksempel 18, avsnitt D, ovenfor. Lysater ble forhåndsklaret før anvendelse i immunutfellinger. 50 ug/ml normalt museimmunglobulin ble først tilsatt til lysatet, og den resulterende oppløsning ble blandet ved "ende-over-ende"-rotasjon i 30 minutter ved 4 °C. 75 ul av en oppslemming av en protein A-Sepharose belagt med kanin-antimuse-immunglobulin ble tilsatt, og blandingen ble fortsatt ved "ende-over-ende"-rotasjon i 30 minutter. De kanin-antimuse-belagte protein A-kuler ble pelletert ved sentrifugering ved 15 000 rpm i en bordmikrosentrifuge i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten ble oppsamlet. Det pelleterte materialet ble kastet.

For hver klonet hybridom ble ca. 300 ul supernatant plassert i Eppendorf-mikrosentrifugerør, og til dette ble det tilsatt 30 ul 10 % Triton X-100, 30 ul av en 100 x stamoppløs-ning av pepstatin, leupeptin og aprotinin, 100 pg PMSF-krystaller og 50 pl forhåndsklaret biotinylert rottemiltlysat. Prøvene ble forsiktig virvlet og plassert på et "ende-over-ende"-rotasjonsapparat ved 4 °C i 30 minutter. En kontroll-prøve ble preparert ved tilsetning av 10 mg/ml av et kanin-antirotte-Od-spesifikt polyklonalt antistoff til 50 ul rottemiltlysat .

Etter inkubasjon i 30 minutter ble 75 pl protein A--Sepharose-kuler i en PBS-oppslemming tilsatt til hver prøve og inkubert med "ende-over-ende"-rotasjon ved 4 °C i 30 minutter. De protein A-koplede kuler ble pelletert ved sentrifugering ved 15 000 rpm i en bordmikrosentrifuge i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten ble oppsamlet. De pelleterte kuler ble vasket sekvensielt med en serie av 1 ml detergentvaskinger som

følger: buffer nr. 1 inneholdende 10 mM Tris, 400 mM NaCl,

1,0 % Triton X-100, pH 8,0; buffer nr. 2 inneholdende 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 % Triton X-100, pH 8,0; buffer nr. 3 inneholdende 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100,

0,1 % deoksycholat, pH 8,0; og buffer nr. 4 inneholdende 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 0,5 M LiCl2, pH 8,0. En siste vask ble ut-ført med vaskebuffer nr. 1. Kulene ble forsiktig virvlet mellom hver vask og pelletert ved anvendelse av en bordmikrosentrifuge. Supernatanter ble fjernet ved hjelp av en over-føringspipette, og etter den siste vask ble all resterende buffer fjernet fra kulene med en Hamilton-sprøyte. En 50 ul aliquot av SDS-prøvebuffer inneholdende fargestoffene bromfenolblått og pyronin Y og p-merkaptoetanol, ved en sluttkonsentrasjon på 10 %, ble tilsatt til hver pellet. Blandingen ble kraftig virvlet i 1-2 minutter og inkubert ved romtemperatur i 5-10 minutter. Prøver ble sentrifugert i 5 minutter ved 15 000 rpm i en bordmikrosentrifuge ved 4 °C, og frigjort protein ble oppsamlet og overført til et nytt mikrosentrifuge-rør. Aliquoter fra hver prøve ble kokt i 4 minutter på et vannbad før applisering på 7,5 % SDS-PAGE-geler. Etter separa-sjon ved hjelp av PAGE ble proteiner overført til nitrocellulosefiltre i l time ved 200 mA, og filtrene ble blokkert i en oppløsning av 3 % BSA/PBS-T over natten ved 4 °C. En oppløs-ning av 0,1 % BSA-TBS-T inneholdende en 1:6000-fortynning av streptavidin-OPD ble tilsatt til hvert filter, og inkubasjonen ble tillatt å fortsette i 1 time ved romtemperatur. Filtrene ble vasket fem ganger i 10 minutter i TBS-T og fremkalt ved anvendelse av Amershams ECL-sett i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll.

Klon 199M ble funnet å immunutfelle et heterodimert protein. Den større proteinsubenhet hadde en tilnærmet molekyl vekt på 170-175 kD, hvilket var i overensstemmelse med størrelsen på proteinet som ble immunutfelt av den kanin-antirotte-Od-polyklonale kontroll. Det ble også utfelt et andre protein med en tilnærmet molekylvekt på 95 kD, hvilket er i overensstemmelse med vekten av CD18.

Eksempel 19

Isolering av muse- cDNA- kloner

Isolering av en muse-dd-homolog ble forsøkt.

Krysshybridisering mellom arter ble utført ved anvendelse av to PCR-tilveiebrakte prober: et 1,5 kb-fragment som tilsvarer baser 522-2047 fra human klon 19A2 (SEKV.ID. NR. 1), og et 1,0 kb-rottefragment som tilsvarer baser 1900-2900 i human klon 19A2 (SEKV.ID. NR. 1). Den humane probe ble dannet ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerpar betegnet ATM-2 og 9-10.1, henholdsvis vist i SEKV.ID. NR. 38 og 39; rotteproben ble dannet ved anvendelse av primerpar 434L og 434R, henholdsvis vist i SEKV.ID. NR. 34 og 35. Prøver ble inkubert ved 94 °C i 4 minutter og underkastet 30 sykluser med temperaturtrinnsekvensen: 94 °C; 50 °C, 2 minutter; 72 °C, 4 minutter.

PCR-produktene ble renset ved anvendelse av Qiagen Quick Spin-settet i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll, og ca. 180 ng DNA ble merket med 200 pCi [<32>P]-dCTP ved anvendelse av et Boehringer Mannheim Random Primer-merkingssett i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Uinkorporert isotop ble fjernet ved anvendelse av en Centrisep Spin-kolonne (Princeton Separations, Adelphia, NJ) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Probene ble denaturert med 0,2 N NaOH og nøytrali-sert med 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0, før bruk.

Et musethymus-oligo dT-primet cDNA-bibliotek i AZAPII (Stratagene) ble utspredt ved ca. 30 000 plakker pr. 15 cm plate. Plakkoverføringer på nitrocellulosefiltre (Schleicher & Schuell, Keene, NH) ble inkubert ved 50 °C under omrøring i

1 time i en prehybridiseringsoppløsning (8 ml/overføring) inneholdende 30 % formamid. Merkede human- og rotteprober ble tilsatt til prehybridiseringsoppløsningen, og inkubasjonen ble fortsatt over natten ved 50 °C. Filtre ble vasket to ganger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved romtemperatur, én gang i 2 x SSC/0,1 %

SDS ved 37 °C og én gang i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 42 °C. Filtre ble eksponert med Kodak X-Omat AR-film ved -80 °C i 27 timer med en intensifiseringsskjerm.

Fire plakker som ga positive signaler på dobbelte overføringer, ble utstreket på nytt på LB-medium med magnesium (LBM)/karbenicillinplater (100 mg/ml) og inkubert over natten ved 37 °C. Fagplakkene ble oppsugd med Hybond-filtre (Amersham), probet som i den innledende screening og eksponert med Kodak X-Omat AR-film i 24 timer ved -80 °C med en intensifiseringsskjerm. 12 plakker som ga positive signaler, ble overført til et fagfortynningsmiddel med lavt Mg<++->innhold, inneholdende 10 mM Tris-HCl og 1 mM MgCl2. Innføyelsesstørrelse ble bestemt ved hjelp av PCR-amplifikasjon ved anvendelse av T3- og T7-primere (henholdsvis SEKV.ID. NR. 13 og 14) og de følgende reaksjonsbetingeIser. Prøver ble inkubert ved 94 °C i 4 minutter og underkastet 30 sykluser med temperaturtrinnsekvensen: 94 °C, 15 sekunder; 50 °C, 30 sekunder,- og 72 °C, 1 minutt. 6 prøver produserte distinkte bånd som varierte i størrelse fra 300 baser til 1 kb. Fagemider ble frigjort via koinfeksjon med hjelperfagen og resirkularisert for å danne Bluescript SK" (Stratagene). De resulterende kolonier ble dyrket i LBM/karbenicillin (100 mg/ml) over natten. DNA ble isolert med et Promega Wizard miniprep-sett (Madison, WI) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Ecol-restriksjonsanalyse av det rensede DNA bekreftet molekyl-vektene, som ble påvist ved anvendelse av PCR. Innføyd DNA ble sekvensert med Ml3- og Ml3-revers.1-primere, henholdsvis vist i SEKV.ID. NR. 40 og 41.

Sekvensering ble utført som beskrevet i eksempel 4.

Av de 6 kloner tilveiebrakte kun 2, betegnet 10.3-1 og 10.5-2, sekvensinformasjon og var identiske 600 bp-fragmenter. 600 bp-sekvensen var 68 % identisk med et tilsvarende område av human da, 40 % identisk med human CDlla, 58 % identisk med human CDllc og 54 % identisk med muse-CDllb. Dette 60 0 bp-fragment ble deretter benyttet for å isolere et mer komplett cDNA som koder for en antatt muse-Od-homolog.

Et musemilt-cDNA-bibliotek (oligo dT" og vilkårlig primet) i AZAPII (Stratagene) ble utspredt ved 2,5 x 10<*> fag/ 15 cm LBM-plate. Plakker ble oppsugd på Hybond-nylonover-føringsmembraner (Amersham), denaturert med 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl, nøytralisert med 0,5 M Tris-base/1,5 M NaCl/11,6 M HCl og vasket i 2 x SSC. DNA ble kryssbundet til filtre ved hjelp av ultrafiolett bestråling.

Cirka 500 000 plakker ble screenet ved anvendelse av prober 10.3-1 og 10.5-2 som tidligere var merket som beskrevet ovenfor. Prober ble tilsatt til en prehybridiseringsoppløsning og inkubert over natten ved 50 °C. Filtrene ble vasket to ganger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved romtemperatur, én gang i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 37 °C og én gang i 2 x SSC/0,1 % SDS ved

42 °C. Filtre ble eksponert med Kodak X-Omat AR-film i

24 timer ved -80 °C med en intensifiseringsskjerm. 14 plakker som ga positive signaler på dobbelte overføringer, ble underkastet en andre screening som var identisk med den innledende screening, med unntak av ytterligere siste høystringens-vaskinger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 50 °C, i 0,5 x SSC/0,1 % SDS ved 50 °C og ved 55 °C i 0,2 x SSC/0,1 % SDS. Filtrene ble eksponert med Kodak X-Omat AR-film ved -80 °C i 13 timer med en intensifiseringsskjerm. 18 positive plakker ble overført til fagfortynningsmiddel med lavt Mg<++->innhold, og innføyelsesstørrelsen ble bestemt ved hjelp av PCR-amplifikasjon, som beskrevet ovenfor. 7 av prøvene ga enkle bånd som varierte i størrelse fra 600 bp til 4 kb. EcoRI-restriksjonsanalyse av renset DNA bekreftet størrelsene observert fra PCR, og DNA ble sekvensert med primere M13 og M13 revers.1 (henholdsvis SEKV.ID. NR. 40 og 41) .

Én klon betegnet B3800 inneholdt en 4 kb-innføyelse som tilsvarte et område 200 baser nedstrøms for 5'-enden av den humane Od-19A2-klon og inkluderer 553 baser av et 3'-utranslatert område. Klon B3800 viste 77 % identitet med et

tilsvarende område av human aa, 44 % identitet med et tilsvarende område av human CDlla, 59 % identitet med et tilsvarende område av human CDllc og 51 % identitet med et tilsvarende område av muse-CDllb. Den andre klon, A1160, var en 1,2 kb-innføyelse som passet sammen med 5<1->enden av kodingsområdet i human ctd ca. 12 nukleinsyrer nedstrøms for det innledende metionin. Klon Al160 viste 75 % identitet med et tilsvarende område av human ctd, 46 % identitet med et tilsvarende område av human CDlla, 62 % identitet med et tilsvarende område av human CDllc og 66 % identitet med et tilsvarende område av muse-CDllb.

Klon A1160, fragmentet nærmere 5<1->enden av human klon 19A2, har en lengde på 1160 baser og deler et overlappings-område med klon B3800 som starter ved base 205 og fortsetter til base 1134. Klon A1160 har en innføyelse på 110 baser (baser 704-814 i klon A1160) som ikke er til stede i det overlappende området i klon B3800. Denne innføyelse forekommer ved en antatt exon-introngrense [Fleming et al., J. Immunol., 250:480-490 (1993)] og ble fjernet før etterfølgende ligering av kloner A1160 og B3800.

Hurtig amplifikasjon av 5'- cDNA- enden av den antatte muse- Od-klon

RACE-PCR [Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends", i PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (red.), s. 28-38, Academic Press, New York

(1990)] ble anvendt for å erholde manglende 5'-sekvenser av den antatte muse-ad-klon, inkludert 5'-utranslatert sekvens og innledende metionin. Et musemilt-RACE-Ready-sett (Clontech, Palo Alto, CA) ble anvendt i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. To antisense-, genspesifikke primere, A1160-RACE1-primær og A1160-RACE2-nestet (SEKV.ID. NR. 42 og 43), ble utformet for å utføre primær og nestet PCR.

Primerne, SEKV.ID. NR. 42 og 43, tilsvarer henholdsvis områdene som starter 302 og 247 basepar fra 5'-enden. PCR ble utført som beskrevet ovenfor ved anvendelse av 5'-anker-primeren (SEKV.ID. NR. 44) og musemilt-cDNA supplert med settet.

Elektroforese av PCR-produktet avslørte et bånd med størrelse på ca. 280 baser, som ble subklonet ved anvendelse av et TA-kloningssett (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. 10 resulterende kolonier ble dyrket, og DNA ble isolert og sekvensert. Det ble identifisert ytterligere 60 baser av 5'-sekvensen ved hjelp av denne metoden, som tilsvarer baser 1-60 i SEKV.ID. NR. 45.

Karakteristikk for muse- cDNA og den forhåndsberegnede amino-syre sekvens

En sammensatt sekvens av muse-cDNA som koder for en antatt homolog av human aa, er vist i SEKV.ID. NR. 45. Selv om homologien mellom de eksterne domener av de humane kloner og museklonene er høy, er homologien mellom de cytoplasmatiske domener kun 30 %. Den observerte variasjon kan indikere C-terminale funksjonelle forskjeller mellom de humane proteiner og museproteinene. Alternativt kan variasjonen i de cytoplasmatiske domener resultere fra spleisingsvariasjoner, eller den kan indikere eksistensen av et ytterligere pVintegrin-gen(er) .

På aminosyrenivået forutsier muse-cDNA et protein (SEKV.ID. NR. 46) med 28 % identitet med muse-CDlla, 53 % identitet med muse-CDllb, 28 % identitet med human CDlla, 55 % identitet med human CDllb, 59 % identitet med human CDllc og 70 % identitet med human ad. Sammenligning mellom aminosyresekvensene i de cytoplasmatiske domener av human ad og den antatte musehomolog indikerer områder med den samme lengde, men med avvikende primærstruktur. Lignende sekvenslengde i disse områder antyder artsvariasjon istedenfor spleisings-variantformer. Ved sammenligning med det forutsagte rottepoly-peptid, eksempel 16 ovenfor, viser muse- og rottecytoplasmat-iske domener mer enn 60 % identitet.-

Eksempel 20 Isolering av ytterligere muse- Od- cDNA- kl oner for sekvens-verifisering

For å verifisere nukleinsyre- og aminosyresekvensene beskrevet i eksempel 19 for muse-Od ble ytterligere muse-sekvenser isolert for bekreftende formål.

Isolering av muse-cDNA ved hybridisering med to homologe ad-prober (3' og 5<1>) ble utført ved anvendelse av både et vilkårlig primet musemiltbibliotek og et oligo dT-primet cDNA-bibliotek i AZAPII (Stratagene). Biblioteket ble utspredt ved 5 x 10<5> fag pr. 15 cm LBM-plate. Plakker ble oppsugd på Hybond-nylonmembraner (Amersham), og membranene ble denaturert (0,5 M NaOH/1,5 M NaCl), nøytralisert (0,5 M Tris-base/l,5 M NaCl/11,6 M HC1, og vasket (2 x SSC-saltoppløsning). DNA ble kryssbundet til filtre ved hjelp av ultrafiolett bestråling.

Prober ble dannet ved anvendelse av primere beskrevet nedenfor i en PCR-reaksjon under de følgende betingelser. Prøver ble oppbevart ved 94 °C i 4 minutter og deretter underkastet 30 sykluser med temperaturtrinnsekvensen (94 °C i 15 sekunder; 50 °C i 30 sekunder; 72 °C i 1 minutt, i et Perkin-Eimer 9600-termosykliseringsapparat).

3'-proben var ca. 900 baser lang og omspente et område fra nukleotider 2752 til 3651 (i SEKV.ID. NR. 1) (5'->3') og ble produsert med primere 11.b-l/2FORll og 11.b-l/2REV2, som vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 69 og 74. Denne probe ble anvendt i et første sett av oppsuginger.

5<1->proben var ca. 800 baser lang og omspente et område fra nukleotider 149 til 946 (i SEKV.ID. NR. 1) (5'->3') og ble produsert med primere ll.b-l/2F0Rl og 11.a-l/lREVl, som vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 50 og 85. Denne probe ble anvendt i et andre sett av oppsuginger.

I et tredje sett av oppsuginger ble begge prober beskrevet ovenfor anvendt sammen på de samme plater.

Cirka 500 000 plakker ble screenet ved anvendelse av de to prober beskrevet ovenfor, som ble merket på samme måte som beskrevet i eksempel 17. Merkede prober ble tilsatt til en prehybridiseringsoppløsning inneholdende formamid og ble inkubert over natten ved 50 °C. Filtre ble vasket to ganger i 2 x SSC/0,1 % SDS ved romtemperatur (22 °C) . En siste vask ble utført i 2 x SSC/0,1 % SDS ved 50 °C. Autoradiografi ble ut-ført i 19 timer ved -80 °C på Kodak X-Omat AR-film med en intensifiseringsskjerm. 13 plakker som ga positive signaler på minst to oppsuginger, ble underkastet en andre screening utført som beskrevet for den innledende screening, med unntak av at både de 3'- og 5'-merkede prober ble anvendt for hybridisering og en ytterligere siste vask ble inkorporert ved anvendelse av 2 x SSC/0,1 % SDS ved 65 °C. Autoradiografi ble utført som beskrevet ovenfor i 2,5 timer. 13 plakker (betegnet MS2P1-MS2P13) som ga positive signaler, ble overført til et fagfortynningsmiddel med lavt Mg<++->innhold. Innføyelsesstørrelse ble bestemt ved hjelp av PCR-ampiifikasjon (Perkin-Eimer 9600-termosykliseringsapparat) ved anvendelse av T3- og T7-primere som annealer til Bluescript-fagemid i ZAPII (sekvens beskrevet tidligere) under de samme betingelser som vist ovenfor. Båndstørrelser varierte fra 500 baser til 4 kb. Fagemider ble isolert, preparert og sekvensert med M13- og M13-revers.1-primere (henholdsvis SEKV.ID. NR. 40 og 41). 5 av de 13 kloner, MS2P-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12 og MS2P-13, ble sekvensert og representerte til sammen et område fra ca. base 200 ved 5'-enden til ca. 300 baser forbi et første stoppkodon ved 3'-enden.

Automatisert sekvensering ble utført som beskrevet i eksempel 4 ved først å anvende M13- og M13-revers.1-primere (henholdsvis SEKV.ID. NR. 40 og 41) for å sekvensere endene av hver klon og bestemme posisjonen i forhold til konstruksjon nr. 17 (SEKV.ID. NR. 45). Hver klon ble deretter fullstendig sekvensert ved anvendelse av de egnede primere (oppført nedenfor) for det spesielle området.

Sekvenser ble redigert, linjeoppstilt og sammenlignet med en tidligere isolert muse-ad-sekvens {konstruksjon nr. 17, SEKV.ID. NR. 45).

Linjeoppstilling av de nye sekvenser avslørte en delesjon på 18 baser i konstruksjon nr. 17 med start ved nukleotid 2308; delesjonen forårsaket ikke et skift i avles-ningsrammen. Klon MS2P-9, sekvensert som beskrevet ovenfor, avslørte også den samme delesjon på 18 baser. Delesjonen er blitt observert å forekomme i 50 % av musekloner som inkluderer området, men er ikke blitt påvist i rotte- eller human-dd-kloner. Delesjonen på 18 baser er kjennetegnet ved en palindromisk sekvens på 12 baser, AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEKV.ID. NR. 91). Denne inverterte gjentakelse i nukleinsyresekvensen er selvkomplementær og kan danne en utposing og forårsake spalting under revers transkripsjon. Muse-aa-sekvensen som inkluderer de ytterligere 18 baser, er vist i SEKV.ID. NR. 52; den utledete aminosyresekvens er vist i SEKV.ID. NR. 53.

Eksempel 21

In si tu - hybridiseringer i mus

Vevsfordeling ble deretter bestemt for muse-ctd for å tilveiebringe en sammenligning med fordelingen i mennesker, beskrevet i eksempel 6.

En enkelttrådet 200 bp mRNA-probe ble dannet fra et DNA-templat, tilsvarende nukleotider 3460-3707 i det cytoplasmatiske haleområdet av muse-cDNA, ved hjelp av in vitro-RNA-transkripsjon ved inkorporering av <3>SS-UTP (Amersham).

Hele museembryoer (fjernet på dagene 11-18 etter befruktning) og forskjellige musevev, inkludert milt, nyre, lever, tarm og thymus, ble hybridisert in situ med den radiomerkede, enkelttrådete mRNA-probe.

Vev ble snittet i tykkelser på 6 pm, festet til Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) belagte objektglass og lagret ved -70 °C. Før anvendelse ble objektglassene plassert ved 50 °C i ca. 5 minutter. Snittene ble fiksert i 4 % paraformaldehyd i 20 minutter ved 4 °C, dehydrert med en økende etanolgradient (70-95-100 %) i 1 minutt ved 4 °C for hver konsentrasjon og lufttørket i 30 minutter ved romtemperatur. Snittene ble denaturert i 2 minutter ved 70 °C i 70 % formamid/2 x SSC, skylt to ganger i 2 x SSC, dehydrert med etanolgradienten beskrevet ovenfor og lufttørket i 30 minutter. Hybridisering ble utført over natten (12-16 timer) ved 55 °C i en oppløsning inneholdende <35>S-merkede riboprober ved 6 x 10<5> cpm/snitt og dietylpyrokarbonat(DEPC)-behandlet vann for å gi en sluttkonsentrasjon på 50 % formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 % dekstransulfat, 1 x Denhardts oppløsning, 100 mM ditiotreitol (DTT) og 5 mM EDTA. Etter hybridisering ble snittene vasket i 1 time ved romtemperatur i 4 x SSC/10 mM DTT, i- 40 minutter ved 60 °C i 50 % formamid/2 x SSC/10 mM DTT, i 30 minutter ved romtemperatur i 2 x SSC og i 30 minutter ved romtemperatur i 0,1 x SSC. Snittene ble dehydrert, lufttørket i 2 timer, belagt med Kodak NTB2 fotografisk emulsjon, lufttørket i 2 timer, fremkalt (etter lagring ved 4 °C i fullstendig mørke) og motfarget med hematoksylin/eosin.

Miltvev viste et sterkt signal hovedsakelig i den røde masse. Dette mønster overensstemmer med mønsteret for vevsmakrofagfordeling i milten, men ekskluderer ikke andre celletyper.

Eksempel 22

Dannelse av museekspresjonskonstruksjoner

For å konstruere et ekspresjonsplasmid som inkluderer muse-cDNA-sekvenser som oppviser homologi med human eid, ble innføvelser fra kloner A1160 og B3800 ligert. Før denne ligering ble imidlertid en 5'-ledersekvens som inkluderte et innledende metionin, tilføyd til klon A1160. En primer betegnet "5'-PCR-leder" (SEKV.ID. NR. 47) ble-utformet til å inneholde: (1) identiske uspesifikke baser i posisjoner 1-6, som mulig-gjør spalting; (2) et BamHI-sete (understreket i SEKV.ID. NR. 47) fra posisjoner 7 til 12 for å lette subkloning i en ekspresjonsvektor; (3) en konsensus-Kozak-sekvens fra posisjon 13 til 18; (4) en signalsekvens som inkluderer et kodon for et innledende metionin (med fet skrift i SEKV.ID. NR. 47); og (5) ytterligere 31 baser av spesifikt overlappende 5'-sekvens fra klon Al160 for å tillate primerannealing. En andre primer betegnet "3'-endefragment" (SEKV.ID. NR. 48) ble anvendt med primer "5•-PCR-leder" for å amplifisere innføyelsen fra klon A1160.

Det resulterende PCR-produkt ble ikke spaltet med BamHI, hvilket antyder at et utilstrekkelig antall baser var beliggende forut for restriksjonssetet, hvilket forhindret gjenkjennelse av enzymet. Lengden på "hale"-sekvensen forut for BamHI-setet i 5'-primeren (SEKV.ID. NR. 47) ble økt, og PCR ble gjentatt på amplifikasjonsproduktet fra den første PCR. En 5'-primer, betegnet mAD.5'.2 (SEKV.ID. NR. 49), ble utformet med ytterligere uspesifikke baser i posisjoner 1-4 og ytterligere 20 baser som spesifikt overlappet de tidligere benyttede "5<1->PCR-leder"-primersekvenser.

Primere "mAD.5'.2" og "3'-endefragment" ble anvendt sammen i PCR med produktet fra den første amplifikasjon som templat. Et resulterende sekundært PCR-produkt ble subklonet i plasmid pCRtmll (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll og transformert i kompetente "one shot"-celler (Invitrogen). Én klon som inneholdt PCR-produktet, ble identifisert ved restriksjonsenzymanalyse ved anvendelse av BamHI og EcoRI og sekvensert. Etter at sekvensen var verifisert, ble innføyelsen isolert ved spalting med BamHI og EcoRI og gelrenset.

Innføyelsen fra klon B3800 ble isolert ved spalting med EcoRI og Noti, gelrenset og tilføyd til en ligerings-reaksjon som inkluderte det forstørrede A1160-BamHI/EcoRI-fragment. Ligeringen ble tillatt å fortsette i 14 timer ved 14 °C. Vektor pcDNA.3 (Invitrogen), spaltet med BamHI og Noti, ble tilsatt til ligeringsreaksjonen med ytterligere ligase, og reaksjonen ble fortsatt i ytterligere 12 timer. En aliquot av reaksjonsblandingen ble transformert i kompetente E. coli-celler, de resulterende kolonier ble dyrket, og én positiv klon ble identifisert ved hjelp av PCR-analyse med primerne ll.b-l/2F0Rl og 11.b-l/2REVll (henholdsvis SEKV.ID. NR. 50 og 51). Disse primere danner bro mellom A1160- og B3800-fragmentene, slik at påvisning av et amplifikasjonsprodukt derfor indikerer at de to fragmenter ble ligert. Sekvensen av den positive klon ble verifisert med primerne vist i SEKV.ID.

NR. 50 og 51, som amplifiserer fra base 100 til 1405 etter det innledende metionin.

Eksempel 23

Konstruksjon av en " knock- out"- mus

For å foreta en mer nøyaktig vurdering av den immunologiske rolle til proteinet som kodes for av det antatte muse-oa-cDNA, utformes en "knock-out"-mus hvori den genomiske DNA-sekvens som koder for den antatte oa-homolog, avbrytes av homolog rekombinasjon. Betydningen av proteinet som kodes for av det avbrutte gen, vurderes derved ved fraværet av det kodete protein. Dannelse av "knock-out"-mus beskrives av Deng et al., Mol. Cell. Biol., 13:2134-2140 (1993).

Utformingen av en slik mus starter med konstruksjon av et plasmid som inneholder sekvenser som skal bli "knocked out" ved hjelp av homologe rekombinasjonstilfeller. Et fragment med 750 basepar av muse-cDNA (tilsvarende nukleotider 1985-2733 i SEKV.ID. NR. 45) ble anvendt for å identifisere en musegenomisk sekvens som koder for den antatte muse-cid-homolog fra et AFIXII-genombibliotek. Primær screening resulterte i 14 positive plakker, av hvilke 7 ble bekreftet ved hjelp av sekundær screening. Væskelysater ble erholdt fra to av plakkene som ga det sterkeste signal, og ADNA ble isolert ved hjelp av konvensjonelle metoder. Restriksjonskartlegging og Southern-analyse bekreftet autentisiteten av én klon, betegnet 14-1, og det innføyde DNA ble isolert ved spalting med Noti. Dette fragment ble klonet i Bluescript SKII<+>.

For å identifisere et restriksjonsfragment på ca. 9-14 kb, hvilket er en lengde som rapporteres å optimalisere sannsynligheten for homologe rekombinasjonstilfeller, ble Southern-hybridisering utført med 750 bp-cDNA-proben. Før hybridisering ble det konstruert et restriksjonskart for klon 14-1. Et 12 kb-fragment ble identifisert som en mulig kandi-dat, og dette fragment ble subklonet i pBluescript SKU<*> i en posisjon hvor muse-DNA er flankert av kassetter som koder for tymidinkinase. Videre analyse av denne klon med en I-domeneprobe (tilsvarende nukleotider 454-1064 i SEKV.ID. NR. 45) indikerte at klonen ikke inneholdt sekvenser som kodet for I-

domenet.

Ved anvendelse av den samme I-domeneprobe ble AFIXII-genombiblioteket screenet på nytt. Først ble det påvist 6 positive kloner, av hvilke én forble positiv ved sekundær screening. DNA isolert fra denne klon reagerte sterkt i Southern-analyse med en I-domeneprobe. Ingen reaktivitet ble imidlertid påvist ved anvendelse av den opprinnelige 750 bp-probe, hvilket indikerte at denne klon inkluderte områder 5' for nukleotider 1985-2773 i SEKV.ID. NR. 45.

Mangelen på hybridisering til 750 bp-proben kan alternativt antyde at klonen var et annet medlem av integrinfamilien av proteiner. For å bestemme hvorvidt denne for-klaring var plausibel ble 13 kb-innføyeIsen subklonet i pBluescript SKII<+>. Renset DNA ble sekvensert ved anvendelse av primere som tilsvarer Od-I-domenenukleinsyresekvensene 441-461, 591-612, 717-739 og revers 898-918 i SEKV.ID. NR. 52. Sekvensinformasjon ble erholdt ved anvendelse av kun den første 4441-4461-primer, og kun det mest 5' exon av I-domenet ble effektivt amplifisert. Resten av I-domenet ble ikke amplifisert. Den resulterende klon omfattet derfor exon 6 i muse-Od-genet og intronsekvenser til 3'- og 5'-enden i exonet. Exon 7 var ikke representert i klonen. Etter sekvensering dannes en konstruksjon inneholdende neomycinresistensgener og tymidin-kinasegener.

Neomycinresistens (neor)genet innføyes i det resulterende plasmid på en måte som avbryter proteinkodingssekven-sen til det genomiske muse-DNA. Det resulterende plasmid inneholder derfor et neo<r->gen i musegenom-DNA-sekvensene, hvor hele genet er beliggende innenfor et tymidinkinasekodings-område. Plasmidkonstruksjon på denne måte fordres for å begunstige homolog rekombinasjon i forhold til vilkårlig rekombinasjon [Chisaka et al., Nature, 355:516-529 (1992)].

Eksempel 24

Kloning av kanin- ag- konstruksjon og screening av kanin- cDNA-biblioteket

Identifikasjon av humane Oa-homologer i rotter og mus førte til undersøkelse av forekomsten av en kaninhomolog som ville være anvendelig i kaninmodeller av humane sykdomstilstander beskrevet nedenfor.

Poly A<+->RNA ble fremstilt fra en hel kaninmilt ved anvendelse av Invitrogen FastTrack-sett (San Diego, CA) i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll og reagenser tilhørende settet. Fra 1,65 g vev ble det isolert 73 pg poly A<+->RNA. Kaninmilt-RNA ble anvendt for å konstruere et ZAP-cDNA-ekspresjonsbibliotek ved anvendelse av et sett fra Stratagene (La Jolla, CA). Resulterende cDNA ble retnings-bestemt klonet i EcoRI- og Xhol-seter i A-armene av en pBK-CMV-fagemidvektor, Gigapack II Gold (Stratagene) ble anvendt for å pakke A-armene i fagpartikler. Den resulterende biblio-tektiter ble anslått til ca. 8 x IO<5> partikler, med en gjennomsnittlig innføyelsesstørrelse på 1,2 kb.

Biblioteket ble amplifisert én gang ved utspredelse for konfluent plakkvekst, og cellelysat ble oppsamlet. Det amplifiserte bibliotek ble utspredt med E. coli ved ca. 30 000 plakkdannende enheter (pfu) pr. 150 mm plate, og den resulterende blanding ble inkubert i 12-16 timer ved 37 °C for å tillate plakkdannelse. Fag-DNA ble overført til Hybond N<+->nylonmembraner (Amersham, Arlington Heights, Illinois). Membranene ble hybridisert med en blanding av to vilkårlig primede, radiomerkede muse-aa-PCR-DNA-prober. Den første probe ble dannet fra et PCR-produkt som omspente nukleotider 149-946 i SEKV.ID. NR. 52. Den andre probe var fra et PCR-produkt som omspente nukleotider 2752-3651 i SEKV.ID. NR. 52. Probene ble merket ved vilkårlig priming (Boehringer Mannheim Random Primed DNA-merkingssett), og reaksjonsblåndingen ble passert gjennom en Sephadex G-50-kolonne for å fjerne uinkorporerte nukleotider. Hybridiseringsoppløsningen var sammensatt av 5 x SSPE, 5 x Denhardts, 1 % SDS, 40 % formamid og de merkede prober ved 1 x IO<6> dpm/ml. Hybridisering ble utført ved 42 °C i 16-18 timer. Filtre ble grundig vasket i 2 x SSPE/0,1 % SDS ved romtemperatur og eksponert med røntgenfilm for å visuali-sere eventuelle hybridiserende plakker.

To kloner med betydelig sekvenshomologi med human aa ble identifisert. Klon nr. 2 hadde en lengde på ca. 800 bp og ble kartlagt til 5 *-enden av human cia. Klon nr. 2 inkluderer et initierende metionin og en komplett ledersekvens. Klon nr. 7 var på ca. 1,5 kb og inkluderer et initierende metionin. 5'-enden av klon nr. 7 overlappet enden av klon nr. 2, menB 3<*->sekvensene sluttet ved et punkt utenfor I-domenesekvensene. Klon nr. 7 ble fullstendig sekvensert ved hjelp av "primer walking"-metoden. De utledete nukleotid- og aminosyresekvénser for klon nr. 7 er henholdsvis vist i SEKV.ID. NR. 100 og 101.

Den forutsagte N-terminale aminosyresekvens for kanin-cid, som bestemt fra kloner nr. 2 og 7, indikerte et protein med 73 % identitet med human ctd, 65 % identitet med muse-Od og 58 % identitet med muse-CDllb, human CDllb og human CDllc. Nukleinsyresekvensen for klon nr. 2 er vist i SEKV.ID. NR. 92; den forutbestemte aminosyresekvens er vist i SEKV.ID. NR. 93.

Isolering av et uforkortet kanin-aa-cDNA ble forsøkt ved anvendelse av merket kaninklon nr. 7 og ny screening av cDNA-biblioteket som fragmentet stammet fra. Det ble identifisert 25 ytterligere kloner, hvor én, betegnet klon 49, ble bestemt å være den største. Klon 49 ble fullstendig sekvensert ved anvendelse av teknikken med nestede delesjoner. Nukleotid-sekvensene og aminosyresekvensene for klon 49 er vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 102 og 103. Fordi kloner nr. 7 og 49 ikke overlappet, ble oligonukleotider utformet for å anvendes som primere i en PCR med førstetråd-kaninmilt-cDNA for å isolere den manglende sekvens.

Forholdet mellom den antatte aminosyresekvens i disse to partielle kloner og sekvensen i andre leukointegriner er beskrevet i tabell 1.

Isolering av en kanin- a&-klon tillater ekspresjon av proteinet, enten på overflaten av transfektanter eller som en oppløselig, uforkortet eller trunkert form. Dette protein anvendes deretter som et immunogen for fremstilling av monoklonale antistoffer for anvendelse i kaninmodeller av humane sykdomstilstander.

Eksempel 25

Dyremodeller for bestemmelse av terapeutisk anvendelighet av Od

Immunhistologiske data fra hund og in situ-hybridisering av rotter og mus har bestemt at i milten uttrykkes ctd primært av makrofager som er til stede i den røde masse og i lymfekjertler, da finnes i medullastrenger og sinuser. Ekspre-sjonsmønsteret er bemerkelsesverdig lignende det som er rapportert for to museantigener definert ved hjelp av de monoklonale antistoffer F4/80 og SK39. Selv om biokjemisk karakterisering av disse museantigener har vist at de er forskjellige fra dd, er det meget sannsynlig at aa definerer det samme

makrofagundersett som muse-F4/80- og SK39-antigenene.

Hos mus er SK39-positive makrofager identifisert i miltens røde masse, hvor de kan delta ved klaring av fremmede materialer fra sirkulasjon, og i lymfekjertelmarg [Jutila et al., J. Leukocyte Biol., 54:30-39 (1993)]. SK39-positive makrofager er også rapportert på steder for både akutt og kronisk inflammasjon. Monocytter som er rekruttert til tio-glykolatinflammerte peritoneale hulrom, uttrykker dessuten også SK39-antigenet. Disse funn antyder samlet at dersom SK39<+->celler også er o.d+, så er disse celler ansvarlige for klaringen av fremmede materialer i milten og deltar i inflammasjon hvor makrofager spiller en vesentlig rolle.

Selv om funksjonen av a<i forblir uklar, er andre mer velkarakteriserte p2-integriner vist å delta i mange forskjellige adhesjonstilfeller som letter cellemigrasjon, forhøyer fagocytose og fremmer celle-celleinteraksjoner, hendelser som alle fører til oppregulering av inflammatoriske prosesser. Det er derfor plausibelt at forstyrrelse av den normale Od-funksjon også kan forstyrre inflammasjon hvor makrofager spiller en vesentlig rolle. En slik antiinflammatorisk effekt kan resultere fra: i) blokkering av makrofagrekruttering til inflammasjonssteder, ii) forhindring av makrofagaktivering på inflammasjonsstedet, eller iii) forstyrring av makrofag-effektorfunksjoner som skader normalt vertsvev, enten ved spesifikke autoimmunresponser eller som et resultat av til-skuercelleskade.

Sykdomstilstander hvor det finnes bevis for at makrofager spiller en vesentlig rolle i sykdomsprosessen, inkluderer multippel sklerose, artritt, transplantataterosklerose, noen former av diabetes og inflammatorisk tarmsykdom. Dyremodeller som er diskutert nedenfor, er blitt vist å reprodu-sere mange av aspektene av disse humane forstyrrelser. Inhibitorer av Od-funksjon testes i disse modellsystemer for å bestemme hvorvidt potensialet eksisterer for behandling av de tilsvarende humane sykdommer.

A. Transplantatarteriosklerose

Hjertetransplantasjon er nå den aksepterte form for terapeutisk inngrep mot noen typer hjertesykdom i sluttfasen. Da anvendelsen av syklosporin A har økt overlevelsesgraden i 1 år til 80 %, har utviklingen av progressiv transplantatarteriosklerose fremkommet som hovedårsaken til død hos hjertetransplantasjonspasienter som overlever første år. Nylige undersøkelser har funnet at forekomsten av betydelig transplantasjonsarteriosklerose 3 år etter en hjertetransplantasjon ligger i området 36-44 % [Adams et al., Transplantation, 53:1115-1119 (1992); Adams et al.. Transplantation, 56:794-799 (1993)].

Transplantasjonsarteriosklerose består typisk av diffuse, tilstoppende, indre lesjoner som påvirker hele krans-arterieveggen og ofte medfølges av lipidavsetning. Selv om patogenesen for transplantasjonsarteriosklerose forblir ukjent, har den antakeligvis sammenheng med hist©kompatibili-tet sforskj eller mellom donor og mottaker, og er immunologisk av natur. Histologisk består områdene med indre fortykning primært av makrofager, selv om T-celler leilighetsvis kan ses. Det er derfor mulig at makrofager som uttrykker ctd, kan spille en vesentlig rolle ved induksjon og/eller utvikling av transplantasjonsarteriosklerose. I et slikt tilfelle kan monoklonale antistoffer eller lavmolekylære inhibitorer (f.eks. oppløselig ICAM-R) med Od-funksjon gis profylaktisk til indi-vider som har mottatt hjertetransplantater og som risikerer å utvikle transplantasjonsarteriosklerose.

Selv om aterosklerose i hjertetransplantater er den største trusselen mot liv, kan det også observeres transplantasjonsarteriosklerose i andre faste organtransplantater, inkludert nyre og lever. Terapeutisk anvendelse av Od-blokkeringsmidler kan forhindre transplantatarteriosklerose i andre organtransplantater og redusere komplikasjoner som et resultat av mislykket transplantasjon.

Én modell for transplantasjonsarteriosklerose i rotte involverer heterotope hjerteallotransplantater transplantert gjennom mindre histokompatibilitetsbarrierer. Når Lewis-hjerteallotransplantater transplanteres til kompatible F-344-mottakere av MHC, klasse I og II, overlever 80 % av allo-transplantatene minst 3 uker, mens 25 % av transplantatene

overlever på ubestemt tid. Under denne mindre grad av trans-plantat avvisning dannes arterioskleroselesjoner i donor-hjertet. Arterielle lesjoner i 120 dager gamle allotransplan-tater har typisk en diffus, fibrotisk indre fortykning som ikke kan skjelnes i utseende fra transplantasjonsarterio-skleroselesjoner funnet i avvisende humane hjerteallotransplantater.

Rotter transplanteres med hjerter som ikke passer sammen med hensyn til mindre histokompatibilitetsantigener, f.eks. Lewis i F-344. Monoklonale antistoffer spesifikke for rotte-Od eller små molekyl inhibitorer av a<j gis periodisk til transplantasjonsmottakere. Behandlingen forventes å redusere forekomsten av transplantasjonsarteriosklerose i ikke-awisende donorhjerter. Behandling av rotter med cid-monoklonale antistoffer eller lavmolekylære inhibitorer behøver ikke å være begrenset til profylaktiske behandlinger. Blokkering av ctd-funksjon forventes også å redusere makrofag-formidlet inflammasjon og tillate reversering av arterieskade i transplantatet.

B. Aterosklerose i kaniner foret med kolesterol

Kaniner som ble f8ret med en aterogen diett inneholdende et kolesterolsupplement i ca. 12-16 uker, utviklet indre lesjoner som dekker det meste av den indre overflate av den oppstigende aorta [Rosenfeld et al., Arteriosclerosis, 7:9-23 (1987); Rosenfeld et al,, Arteriosclerosis, 7:24-34

(1987)]. De aterosklerotiske lesjoner observert hos disse kaniner er lignende lesjonene observert hos mennesker. Lesjoner inneholder et stort antall T-celler, av hvilke de fleste uttrykker CD45RO, en markør assosiert med hukommelses-T-celler. Cirka halvparten av de infiltrerende T-celler uttrykker også MHC-klasse II-antigen, og noen uttrykker IL-2-reseptoren, hvilket antyder at mange av cellene foreligger i en aktivert tilstand.

Ett trekk ved de aterosklerotiske lesjoner funnet i

kolesterolfSrede kaniner, men som tilsynelatende er fraværende i gnagermodeller, er akkumuleringen av skumcellerike lesjoner. Skumcellemakrofager antas å resultere fra opptaket av oksidert

lavdensitetslipoprotein (LDL) av spesifikke reseptorer. Oksiderte LDL-partikler er funnet å være■toksiske for noen celletyper, inkludert endotelceller og glatte muskelceller. Opptaket av potensielt toksiske, oksiderte LDL-partikler ved hjelp av makrofager tjener som et irritasjonsmiddel og styrer makrofagaktivering og bidrar til inflammasjonen forbundet med aterosklerotiske lesjoner.

Når det er dannet monoklonale antistoffer mot kanin-en, behandles kolesterolf6rede kaniner. Behandlinger inkluderer profylaktisk administrering av dd-monoklonale antistoffer eller lavmolekylære inhibitorer for å demonstrere at aa<+->makrofager er involvert i sykdomsprosessen. Ytterligere under-søkelser vil vise at monoklonale antistoffer mot ad eller lavmolekylære inhibitorer er i stand til å reversere blodkar-skade som påvises i kaniner som er foret med en aterogen diett.

C. Insulinavhengig diabetes

BB-rotter utvikler spontant insulinavhengig diabetes ved en alder på 70-150 dager. Ved anvendelse av immunhisto-kjemi kan MHC-klasse II<+>,EDl<+->makrofager påvises å infiltrere øycellene tidlig i sykdommen. Mange av makrofagene synes å være engasjert i fagocytose av nedbrutt cellemateriale eller normale celler. Når sykdommen fremskrider, finnes det et stort antall makrofager som infiltrerer øycellene, selv om et betydelig antall T-celler, og senere B-celler, også synes å rekrutteres til stedet [Hanenberg et al., Diabetologia, 32:126-134 (1989)].

Utvikling av diabetes hos BB-rotter synes å avhenge av både tidlig makrofaginfiltrering og etterfølgende T-celle-rekruttering. Behandling av BB-rotter med kiselpartikler, som er toksiske for makrofager, har vært effektiv for å blokkere den tidlige makrofaginfiltrering av øycellene. I fravær av tidlig makrofaginfiltrering forekommer ikke etterfølgende vevsskade av en autoaggressiv lymfocyttpopulasjon. Administrering av monoklonalt antistoff OX-19 (spesifikt for rotte-CD5) eller monoklonalt antistoff OX-8 (spesifikt for rotte-CD8), som blokkerer den T-celleassosierte fase av sykdommen, er også effektiv for å undertrykke utviklingen av diabetes.

Makrofagenes sentrale rolle i patologien av denne modell gjør den attraktiv for testing av inhibitorer av aa-funksjon. Rotter som er genetisk disponert for utvikling av insulinavhengig diabetes, behandles med monoklonale antistoffer mot aa eller lavmolekylære inhibitorer, og evalueres for utvikling av sykdommen. Forhindring eller forsinkelse av klinisk inntreden er bevis for at a«j spiller en sentral rolle ved makrofagskade på øycellene.

D. Inflammatorisk tarmsykdom ( Crohns sykdom, ulcerativ kolitt)

Dyremodeller anvendt ved undersøkelsen av inflammatorisk tarmsykdom (IBD), utløses generelt ved intrarektal administrering av skadelige irritasjonsmidler {f.eks. eddiksyre eller trinitrobenzensulfonsyre/etanol). Tarminflammasjon indusert av disse midler er resultatet av kjemisk eller meta-bolsk skade og mangler den kroniske og spontant tilbakefal-lende inflammasjon assosiert med human IBD. En nylig beskrevet modell som benytter subserøse injeksjoner av rensede peptid-glykan-polysakkarid(PG-PS)polymerer fra enten gruppe A- eller D-streptokokker, synes imidlertid å være en mer fysiologisk relevant modell for human IBD [Yamada et al., Gastroenterology, 104:759-771 (1993)].

I denne modell injiseres PG-PS i det subserøse lag av den distale tykktarm. Den resulterende inflammatoriske respons er dobbeltfaset med en innledende akutt episode 3 dager etter injeksjon, som følges av en spontan kronisk fase 3-4 uker senere. Den sene faserespons er granulomatøs av natur og resulterer i kronisk fortykning, adhesjoner, tykktarmsknuter og slimhinnelesjoner. I tillegg til slimhinneskade fører PG-PS-kolitt ofte til artrittisk anemi og granulomatøs hepatitt. Utslagene av sykdommen utenfor tarmen gjør modellen attraktiv for undersøkelse av Crohns kolitt ved at et betydelig antall pasienter med aktiv Crohns sykdom lider av artrittisk leddsyk-dom og lever-galleinflammasjon.

Granulomatøse lesjoner er resultatet av kronisk inflammasjon som fører til rekruttering og etterfølgende aktivering av celler av monocytt-/makrofagslekten. Tilstedeværelse av granulomatøse lesjoner ved Crohns sykdom og den ovennevnte dyremodell gjør dette til et attraktivt klinisk mål for ctd-monoklonale antistoffer eller andre inhibitorer av eid-funksjon. Inhibitorer av dd-funksjon forventes å blokkere dannelsen av lesjoner assosiert med IBD, eller til og med reversere vevsskade som observeres ved sykdommen.

E. Artritt

Artritt synes å være en sykdomsprosess med mange faktorer som involverer mange forskjellige inflammatoriske celletyper, inkludert nøytrofiler, T-lymfocytter og fago-cyttiske makrofager. Selv om det eksisterer mange forskjellige artrittmodeller, gir preparater av streptokokkcelleveggs-proteoglykan en sykdom som er mest lik den humane sykdom.

Hos rotter induserer streptokokkcellevegger inflammasjon av perifere ledd, kjennetegnet ved gjentatte episoder med sykdomsprogresjon etterfulgt åv remisjon, og resulterer til slutt i leddestruksjon i løpet av en periode på flere måneder [Cromartie et al., J. Exp. Med., 146:1585-1602 (1977); Schwab et al., Infection and Immunity, 55:4436-4442 (1991)]. Under den kroniske fase av sykdommen antas mononukleære fagocytter eller makrofager å spille en hovedrolle ved destruksjon av synovium. Midler som undertrykker rekrutteringen av makrofager inn i synovium, reduserer dessuten effektivt inflammasjonen og patologien som er karakteristisk for artritt.

En sentral rolle for makrofager ved synoviumdestruk-sjon som fører til artritt, forutsier at monoklonale antistoffer mot dd eller inhibitorer av ctd-funksjon kan ha terapeutisk potensial ved behandling av denne sykdommen. Som i andre tidligere beskrevne modeller forventes ctd-monoklonale antistoffer eller lavmolekylære inhibitorer som administreres profylaktisk, å blokkere eller moderere leddinflammasjon og forhindre destruksjon av synovium. Midler som forstyrrer ctd-funksjonen, kan også moderere pågående inflammasjon ved å forhindre rekruttering av ytterligere makrofager til leddet eller ved å blokkere makrofagaktivering. Nettoresultatet vil være å reversere pågående destruksjon av leddet og lette vevsrepara-

sjon.

F. Multippel sklerose

Selv om patogenesen av multippel sklerose (MS) forblir uklar, er det generelt akseptert at sykdommen formidles av CD4<+->T-celler som gjenkjenner autoantigener i sentralnerve-systemet og initierer en inflammatorisk kaskade. Den resulterende immunrespons fører til rekruttering av ytterligere inflammatoriske celler, inkludert aktiverte makrofager, som bidrar til sykdommen. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en dyremodell som reproduserer noen aspekter ved MS. Nylig er monoklonale antistoffer som reagerer med CDllb/CD18 [Huitinga et al., Eur. J. Immunol., 23:709-715 (1993)] til stede på inflammatoriske makrofager, vist å blokkere både klinisk og histologisk sykdom. Resultatene antyder at monoklonale antistoffer eller lavmolekylære inhibitorer av ad sannsynligvis er effektive ved å blokkere den inflammatoriske respons i EAE. Slike midler har også viktige terapeutiske anvendelser ved behandling av MS.

G. Immunkompleksalveolitt

Alveolare makrofager lokalisert i alveolkanalene, luftveiene, bindevev og pleurahulen i lungen, representerer lungens første forsvarslinje mot inhalerte stoffer fra om-givelsene. Som respons på stimulering av stoffer, inkludert bakterieavledet LPS, IFN-y og immunkomplekser, frigjør alveolare makrofager mange forskjellige potente inflammatoriske mediatorer, inkludert høyreaktive oksygenradikaler og nitrogenmellomprodukter. Selv om superoksid-anioner, hydrogen-peroksid og nitrogenoksid (NO) har viktige funksjoner ved å utrydde patogener og lysere tumormål, kan disse midler ha skadelige effekter på normale vev.

I en rottemodell av immunkompleksalveolitt er NO--frigivelse fra alveolare makrofager vist å mediere mye av lungeskaden [Mulligan et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 88:638-642 (1991)]. NO- er også blitt implisert som en mediator ved andre immunkompleksmedierte skader, inkludert dermal vas-kulitt [Mulligan et al., supra] og kan potensielt spille en

rolle ved sykdommer som glomerulonefritt.

N0--formidlet vevsskade er ikke begrenset til inflammasjon som involverer immunkomplekser. Mikrogliaceller stimulert av midler som PMA, LPS eller IFN-y, produserer f.eks. NO-i mengder som er i stand til å drepe oligodendrocytter [Merrill et al., Immunol., 151:2132 (1993)]. Pankreasøyceller er også funnet å være sensitive overfor NO-, og makrofag-frigivelse av denne mediator er blitt implisert i vevsskaden som fører til diabetes [Kroncke et al., BBRC, 175:752-758

(1991)]. I den senere tid ble det avgjørende demonstrert at NO--frigivelse spiller en rolle ved endotoksisk sjokk [MacMicking et al., Cell, 81:641-650 (1995)]. Når de administreres lipopolysakkarid (LPS), opplever normale villtypemus en alvorlig, progressiv reduksjon av arterietrykk som fører til døden. Mus som mangler induserbart nitrogenoksid, opplever imidlertid en mye mindre alvorlig reduksjon av arterietrykk som respons på LPS, og alle overlever behandlingen.

In vi tro-analyser indikerer at blokkering av ctd er effektiv for å blokkere noen aspekter av makrofagaktivering (eller leukocyttaktivering som uttrykker eid generelt) , inkludert NO--frigivelse. Alveolare makrofager stimulert med IFN-y i nærvær av anti-Od-polyklonalt antiserum (dannet i kaniner mot et rotte-Od-I-domenepolypeptid), ble funnet å produsere betydelig mindre nitritt-/nitratnedbrytningsprodukter av NO- enn makrofager behandlet med kontrollantiserum. Dette funn indikerer at monoklonale antistoffer mot ctd, spesielt mot I-domenet, kan være potente antiinflammatoriske midler med potensielle anvendelser ved MS, diabetes, lungeinflammasjon og endotoksisk sjokk. I motsetning til CD18, som bevirker funksjon av mange forskjellige leukocyttyper, gjør dessuten den begrensede fordeling av ctd at dette er et mer attraktivt mål enn CD18 for å forhindre makrofagaktivering (eller leukocyttaktivering som uttrykker ad generelt).

Rotte-IgG-immunkompleksindusert alveolitt er en bredt anvendt eksperimentmodell som er viktig for å forstå akutt lungeskade. Skaden utløses ved å dryppe antibovint serumalbumin(BSA)antistoffer ned i lungene via en kanyle i luftrøret, etterfulgt av en intravenøs injeksjon av BSA. Dannelsen av immunkomplekser i mikr©blodårene i lungen fører til komple-ment akt iver ing og rekruttering av nøytrofiler til lungen. Antakeligvis etterfølger dannelse av immunkomplekser i lungen uttredelse av leukocytter fra blodet og etterfølgende leuko-cyttbevegelse gjennom lungeepitelet. Den etterfølgende frigivelse av mediatorer inkluderer radikaler, TNF-a og nitrogenoksid (N0-) fra aktiverte endotelceller, nøytrofiler og makrofager som deltar ved utvikling av sykdommen. Patologiske trekk ved sykdommen inkluderer økt vaskulær permeabilitet som fører til ødem og tilstedeværelse av et stort antall erytrocytter og PMN til stede i de alveolare rom.

Polyklonalt antiserum spesifikt for I-domenet av cia ble testet i en rottemodell for immunkompleksindusert alveolitt. Det anti-ad-polyklonale serum ble administrert via luft-rørskanylering samtidig med at anti-BSA ble innført i lungene. Lungeskade ble deretter utløst ved intravenøs administrering av BSA sammen med en spormengde av <125>I-merket BSA (ca. 800 000 cpm) for å kvantifisere ødemer som et resultat av lungeskaden. Lungeskaden ble tillatt å utvikle seg i 4 timer, og skaden ble vurdert ved anvendelse av en lungepermeabili-tetsverdi, definert som forholdet mellom 12<5>I-merket BSA i lungen sammenlignet med mengden av markør til stede i 1,0 ml blod. Lungepermeabilitetsverdier for positive kontroller varierer typisk mellom 0,6 og 0,8, mens negative kontroller (rotter som ikke mottar BSA) har permeabilitetsindeksverdier i området 0,1-0,2.

Innledende undersøkelser indikerte at behandling med anti-Od-polyklonalt antiserum reduserte lungepermeabilitets-verdiene med mer enn 50 %, hvilket representerer en dramatisk moderasjon av lungeskaden. Historisk har behandlinger med anti-CD18 redusert permeabilitetsverdier med 60 %. Disse funn indikerer at ctd kan være det mest viktige p2-integrin under akutt lungeskade, men det kan imidlertid ikke bestemmes nøy-aktig hvorvidt effekten av antisera forhindrer leukocytt-uttredelse fra blodet eller bevegelse gjennom lungeepitel.

Som et ytterligere bevis for at aa modererer lungeskade, ble TNF-a-nivåer i den bronkoalveolare utskyllingsvæske evaluert. Behandling med ant i-ctd-ant i serum ble funnet å redusere TNF-a-nivåer ca. 4 ganger. TNF-a har lenge vært betraktet som en viktig mediator ved akutt lungeinflammasjon og ansvar-lig for rekruttering av inflammatoriske celler til steder med inflammasjon, celleaktivering og vevsskade. Antakeligvis blokkerer anti-aa-antiserum aktivering av tilstedeværende alveolare makrofager under dannelsen av immunkompleksalveolitt, og modererer derved frigivelsen av TNF-a og NO-, og reduserer etterfølgende vevsskade forårsaket av disse midler og rekrutteringen av nøytrofiler.

Eksempel 26

Ekspresjon av aa i prekliniske modeller

For å vurdere differensiell ekspresjon av aa ved forskjellige sykdomstilstander ble vevssnitt fra dyresykdoms-modeller farget med anti-aa-polyklonalt serum produsert som beskrevet ovenfor (se eksempel 18). Vev fra normale og syke rotter ble snittet i tykkelser på 6 um og lufttørket på Superfrost Plus-objektglass (VWR Scientific) ved romtemperatur over natten. Etter tørking ble snittene lagret ved -70 °C inntil de ble anvendt. Før anvendelse ble objektglassene fjernet fra -70 °C og plassert ved 50 'C i ca, 5 minutter. Snittene ble fiksert i kaldt (4 °C) aceton (Stephens Scientific) i 10 minutter ved romtemperatur og tillatt å tørke ved romtemperatur. Hvert snitt ble blokkert med 150 ul av en oppløsning inneholdende 3 0 % normalt rotteserum (Harlan Bioproducts), 5 % normalt geiteserum (Vector Laboratories) og 1 % bovint serum (BSA) (Sigma Chemical Company) i 1 x TBS i 30 minutter ved romtemperatur, hvoretter oppløsningen forsiktig ble tørket bort fra snittene. Kaninpolyklonalt serum, ved en proteinkonsentrasjon på 34 pg/ml, og preimmunserum fra den samme kanin, ved en proteinkonsentrasjon på 38,5 ug/ml, ble fortynnet i blokkeringsoppløsningen, og 100 pl ble separat applisert på hvert vevssnitt i 30 minutter ved 37 °C. Serumoppløs-ningen ble tørket bort fra snittene, og ubundet antistoff ble fjernet ved vask tre ganger i 1 x TBS i 5 minutter. Overskudd av TBS ble fjernet ved borttørking etter den siste vask. Biotinylert geite-antikanin-antistoff fra et Elite-kanin-IgG-Vectastain ABC-sett (Vector) ble fremstilt i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll, og 100 pl av den resulterende oppløsning ble applisert på hvert snitt i 15 minutter ved 37 °C. Objektglassene ble vasket to ganger i 1 x TBS i 5 minutter, hvoretter 100 pl streptavidin-gullkonjugat (Goldmark Biologicals), fortynnet 1:100 i 5 % normalt rotteserum og 1 % BSA, ble applisert på hvert snitt i 1 time ved romtemperatur. Objektglassene ble vasket tre ganger med TBS i 5 minutter, og 100 pl 1 % glutaraldehyd (Sigma) i TBS-buffer ble applisert i 5 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble på nytt vasket tre ganger i TBS i 5 minutter og fem ganger i sterilt, deionisert vann i 3 minutter. Overskudd av væske ble tørket bort fra hvert objektglass, og to dråper sølv-forsterknings- og initieringsoppløsning (Goldmark Biologicals) ble applisert på hvert snitt. Reaksjonen ble tillatt å foregå i 20-30 minutter ved romtemperatur, hvoretter snittene ble grundig skylt i sterilt, deionisert vann, lufttørket over natten ved romtemperatur og montert med Cytoseal 60 (VWR). Som kontroller ble vevssnitt merket med monoklonale antistoffer mot CDlla, CDllb, CDllc og CD18 i de samme eksperimenter ved hjelp av identiske protokoller.

Merking med a<i-polyklonale sera og monoklonale antistoffer mot CDlla, CDllb, CDllc og CD18 avslørte et fargings-mønster for da som var forskjellig fra det observerte for de andre a-subenheter.

I normalt lungevev ble aa-ekspresjon påvist på respi-ratorisk epitel i bronkiene (men ikke epitelet i alveolarhul-rommene) og på individuelle celler som synes å være alveolare makrofager i luftrommene. Signalet observert med det polyklonale serum var betydelig høyere enn bakgrunnssignalet med preimmunserumkontrollen. I lungegranulomvev, 24 og 96 timer etter administrering av glykan, ble det påvist et forskjellig signal med det ad-fargende respiratoriske epitel i hele det alveolare området, og et sterkere signal ble påvist på hva som synes å være alveolare makrofager gjennom hele luftveiene. I lungevev fra dyr som antakeligvis hadde kommet seg av sykdommen (avlivet 16 dager etter administrering av glykan), ble det ikke observert noe signal med aa-antistoffet. Meget liten bakgrunn ble observert med preimmuniseringsserumet i hvert av

disse vev.

Ved anvendelse av rottelungevev fra en antigen-indusert astmamodell ble det påvist et meget sterkt signal med cid-antistoff i det respirator i ske epitel i både bronkiene og alveolarrommene. Signalet var betydelig høyere enn bakgrunnssignalet i kontrollen med preimmuniseringsserum.

Mange modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i de illustrerende eksempler ovenfor, forventes å fremgå for fagfolk. Foreliggende oppfinnelse bør således kun begrenses i overensstemmelse med de med-følgende krav.

Claims (2)

1. Hybridom, karakterisert ved at den har betegnelsen 199M med aksesjonsnummer ATCC HB-12058.

2. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det utskilles av hybridomen ifølge krav 1.