FI100601B - Menetelmä liukoisen intrasellulaarisen adheesiomolekyyli-1:n (sICAM-1) ja sen vasta-aineen valmistamiseksi sekä sICAM-1:tä koodaava DNA, sit ä sisältävä solu ja vasta-ainetta tuottava hybridooma - Google Patents

Description

100601

Menetelmä liukoisen intrasellulaarisen adheesiomolekyy-li-l:n (sICAM-1) ja sen vasta-aineen valmistamiseksi sekä sICAM-l:tä koodaava DNA, sitä sisältävä solu ja vasta-ainetta tuottava hybridooma 5

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää liukoisen intersellulaarisen adheesiomolekyyli-1:n (sICAM-1) talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi, joka intersellulaa-rinen adheesiomolekyyli on liukoinen ilman detergenttiä ja on 5 kuviossa 1 esitetyn DNA-sekvenssin translaatiotuote tai sen funktionaalinen johdannainen, joka sisältää kuviossa 1 esitetyn sekvenssin 11 C-terminaalista aminohappoa ja sICAM-1:tä koodaavaa DNA-sekvenssiä ja sitä sisältävää nisäkässolua.

10 Keksinnön kohteena on myös menetelmä vasta-aineen valmistamiseksi, joka pystyy sitoutumaan sICAM-l:een sekä hybridoomasolulinja, joka tuottaa tällaista vasta-ainetta. sICAM-l:n ja ICAM-l:n välillä on huomattavaa yhtäläisyyttä siten, että niille ovat yhteisiä ekstrasellulaarisen alu-15 een NH2-pään 442 ensimmäistä aminohappoa. sICAM-1 eroaa kuitenkin ICAM-l:stä C-päässä ja nämä muutokset tekevät : sICAM-1:n liukoiseksi. ICAM-l:n tiedetään välittävän monen ; solutyypin, mukaan lukien endoteelisolut, adheesiota imu- · soluihin, jotka ilmentävät imusolun toimintaan liittyvää 20 antigeeni-1:tä (LFA-1) . ICAM-l:llä on kyky suoraan sitoa • ♦ » LFA-1. On myös todisteita LFA-1:n välittämästä adheesios- ta, joka ei tapahdu ICAM-l:n välityksellä. Lisäksi ICAM- ;·. 1: llä on kyky sitoa sekä LFA-1: ta että ihmisen nuhavirus- • · ta. Sillä on kyky estää nuhavirus- ja Coxsackie A -vi- * * * *. 25 rusinfektiota. Sitä voidaan käyttää vastustamaan ICAM-l:n • · · sitoutumisen välittämää solujen adheesiota, mukaan lukien ICAM-l/LFA-l-sitoutuminen, ja siten se voi olla käyttökelpoinen tulehduksen, siirrännäisen hyljinnän, LFA-1:tä ilmentävien kasvainten ja muiden soluadheesiota sisältävien 30 prosessien hoidossa. Huomattavaan ICAM-l:n ja sICAM-l:n 2 100601 ekstrasellulaarisen alueen samankaltaisuuteen perustuen sICAM-1:llä on ICAM-l:lle identifioituja ominaisuuksia.

Tärkein ihmisen nuhavirusreseptori (HRR) on trans-fektoitu, identifioitu, puhdistettu ja rekonstituoitu, ku-5 ten julkaisuissa EP-319 815 ja US-5 589 453 on kuvattu. Tämän reseptorin on osoitettu olevan identtinen aikaisemmin kuvatun solun pintaproteiinin, ICAM-l:n, kanssa. EP-patenttihakemus 289 949 kuvaa membraaniin liittyneen solu-adheesiomolekyylin (ICAM-1:n), joka välittää monien solu-10 tyyppien kiinnittymistä, mukaan lukien endoteelisolujen kiinnittyminen LFA-l:tä sisältäviin imusoluihin. Tämä patenttihakemus sisältää keskustelun solujen välisiä adheesiomolekyylejä koskevasta nykyisestä tutkimuksesta. On tärkeää huomata, että keksijät nimenomaan etsivät vaih-15 toehtoisesti silmukoitua mRNA:ta ICAM-1:lie, eivätkä löytäneet sellaista. ICAM-1 identifioitiin ensimmäiseksi perustuen sen rooliin valkosolujen kiinnittymisessä T-solui-hin [Rothlein, R. et ai. . J. Immunol. 137 (1989) 1270 - 1274], jonka kiinnittymisen on osoitettu välittyvän ICAM-20 l:n heterotyyppisen sitoutumisen LFA-l:een kautta (Mariin et ai. Cell 51 (1987) 813 - 819]). ICAM-1 :n primaarinen ' · rakenne on paljastanut, että se on homologinen soluad- heesiomolekyylien hermosoluadheesiomolekyyli (NCAM) ja my-eliiniin liittyvä glykoproteiini (MAG) kanssa, ja tämä on 25 johtanut ehdotukseen, että se on immunoglobuliinisuper- ;***. geeniperheen jäsen [Simmons et ai. , Nature 331 (1988) 624- .···. 627; Staunton et ai.. Cell 52 (1988) 925 - 933] . cDNA- • · · kloonien DNA-sekvenssi, josta ICAM-1:n aminohappojärjestys .. voidaan päätellä, kuvataan edellä mainituissa julkaisuissa • · • · » *... 30 Simmons et ai. ja Staunton et ai. , supra. ICAM-l-molekyy- • · · ’·[ ‘ Iissä on tyypillinen hydrofobinen, 24 aminohappoa sisältä- :***: vä membraaniin ulottuva alue ja lyhyt, 28 aminohappoa si- • · · sältävä sytoplasminen häntä. Tekniikan tason mukainen ICAM-1 on liukenematon molekyyli, joka on liuotettu solu-35 membraaneista hajoittamalla solut ionittomaan deter- 3 100601 genttiin. Detergentissä oleva ICAM-l-seos johdetaan sitten pylväsmatriisimateriaalin läpi ja sitten monokloonaalista vasta-ainetta sisältävän pylväsmatriisin läpi seoksen puhdistamiseksi .

5 Esillä oleva keksintö liittyy endogeeniseen, vaih toehtoisesti silmukoituun ICAM-l-molekyylilajiin, jota nimitetään sICAM-l:ksi, jolla on vaihtoehtoinen mRNA-sek-venssi ja joka on liukoinen ilman detergenttilisäystä.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän 10 puhdistetun ja eristetyn ihmisen liukoisen intersellulaa-risen adheesiomolekyylin (sICAM-1) tai sen funktionaalisen johdannaisen valmistamiseksi oleellisesti vapaana luonnollisista kontaminanteista. sICAM-1 voidaan saada HeLa- ja HEl-soluista ja niiden primaareista transfektanttisoluis-15 ta, ja sille on ominaista se, että se on liukoinen ilman ionittomia detergenttejä, ja että se on uuden mRNA-sek-venssin määrittämä translaatiotuote. Tällä ihmissolujen luonnollisella tuotteella on se etu, että se erittyy soluista liukoisessa muodossa, eikä ole immunogeeninen.

20 Luonnollinen liukoinen tuote eroaa luonnollisesta liukenemattomasta tuotteesta siinä, että liukoinen tuote si-’·sältää C-päässä uuden, 11 aminohappotähdettä sisältävän : ' : sekvenssin, eikä sisällä membraaniin ulottuvaa eikä syto- plasmista aluetta, jotka esiintyvät liukenemattomassa muo-; 25 dossa.

< t I

.*··. Esillä oleva keksintö antaa käyttöön puhdistetun ja **· eristetyn DNA-sekvenssin, joka koodaa sICAM-l:tä sekä mai- * · · nittua sekvenssiä koodaavan isäntäsolun. Näille on tun- .. nusomaista, se mitä patenttivaatimuksissa 3 ja 4 esite- • « • 30 tään.

• ·· • · · *·* * Keksinnön kohteena on siis menetelmä liukoisen so- :***· lujenvälisen adheesiomolekyylin talteenottamiseksi oleel- • · · lisesti puhtaassa muodossa. Menetelmälle on tunnusomaista, ·. että 4 100601 (A) poistetaan supernatantti hajoittamattomista soluista, jotka sisältävät kuvion 1 DNA:n, (B) viedään supernatantti affiniteettimatriisiin, joka sisältää sICAM-l:een sitoutumaan kykenevää, immobili- 5 soitua vasta-ainetta, mieluummin intersellulaarista adhee-siomolekyyli-1:tä ICAM-1:tä ja sICAM-l:tä vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden johdannaisia, (C) annetaan sICAM-l:n sitoutua matriisissa olevaan vasta-aineeseen, 10 (D) pestään affiniteettimatriisi sitoutumattomien kontaminanttien poistamiseksi, ja (E) otetaan talteen sICAM-1 eluoimalla mainittu sICAM-1 mainitusta matriisista.

Lisäpuhdistusta, jossa käytetään lektiini- tai veh-15 nänalkion agglutiini -pylvästä, voidaan käyttää ennen vas-ta-ainematriisivaihetta tai sen jälkeen. Muina puhdistus-vaiheina voidaan käyttää geelisuodatusta, ioninkromatogra-fiaa ja geelielektroforeesia. Lisäpuhdistusta nopeussedi-mentaatiolla sakkaroosigradientin läpi voidaan käyttää.

20 sICAM-1:tä sitomaan pystyvä vasta-aine voisi käsittää ICAM-l:tä tai HRR:ta vastaan muodostettuja vasta-aineita.

Tässä kuvataan myös sICAM-l:tä vastaan muodostet-! tuja polyklonaalisia vasta-aineita.

Tässä kuvataan lisäksi sICAM-l:lle spesifistä vas-25 ta-ainetta, joka pystyy sitoutumaan sICAM-1-molekyyliin, .···. mutta joka ei pysty sitoutumaan ICAM-1 :een. Menetelmä pep- .iji, tidiantiseerumien valmistamiseksi, katso Green et ai. .

* * Cell 28 (1982) 477 - 487.

Keksintö koskee myös hybridoomasolulinjaa CIII

• · : " 30 92.IA (ATCC H3 9594), joka kykenee tuottamaan sellaista ' vasta-ainetta.

;***; sICAM-1:tä vastaan suunnattuja vasta-aineita voi- daan käyttää terapeuttisesti ICAM-l:n ja LFA-l:n välittämän solujen adheesion lisäämiseksi.

5 100601

Lisäksi keksintö koskee menetelmää sellaisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka kykenee sitoutumaan sICAM-l:een mutta ei ICAM-l:een, jolloin: (a) valmistetaan peptidi-proteiini-konjugaatti, 5 joka mainittu peptidi-proteiini-konjugaatti on spesifinen ainakin osalle sICAM-l:ssa olevaa ainutlaatuista 11 aminohapon sekvenssiä, (b) immunisoidaan eläin mainitulla peptidi-proteiini - konj ugaat i11a, 10 (c) annetaan eläimille tehosteannos, ja (d) otetaan antiseerumit talteen.

Vasta-aineiden valmistusmenetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 5 esitetään.

Vasta-aineet kykenesivät sitoutumaan sICAM-l:een 15 eivätkä kykenisi sitoutumaan ICAM-l:een. Tässä kuvataan myös hybridoomalinjaa, joka tuottaa saman spesifisyyden omaavaa vasta-ainetta, hybridoomasolun tuottamaa vasta-ainetta ja tuotantomenetelmää.

Lisäksi tässä esitetään menetelmää imusolun toimin-20 taan liittyvän antigeenin (LFA-1) ja solujenvälisen adheesiomolekyyli l-.n (ICAM-1) vuorovaikutuksen inhiboimiseksi, joka menetelmä sisältää vaiheen, jossa LFA-1:tä sisältävät : solut saatetaan kosketukseen sICAM-l:n tai sen funktionaa- linen johdannaisen kanssa. Tällä menetelmällä ICAM-l:n 25 adheesion inhiboimiseksi on käyttöä sellaisissa sairausti- .·*·. loissa, kuten tulehduksissa ja siirrännäisten hyljinnässä, • · sekä LFA-1 :tä ilmentävissä syöpäsoluissa.

• · ♦ Tässä kuvataan lisäksi menetelmää LFA-1:tä ilmentävän syöpäsolun esiintymisen ja sijainnin diagnosoimiseksi.

• · • ” 30 Lisäksi tässä kuvataan menetelmää merkittävästi vä- • · · • · · *.* ' hentää ihmisen nuhaviruksen tärkeimmän reseptoriryhmän j*‘*; infektiota, jossa menetelmässä virus saatetaan kosketuk- ·»· seen sICAM-i:n tai sen funktionaalisen johdannaisen kanssa.

6 100601

Kuviossa 1 on sICAM-l:n nukleotidi- ja aminohappo-sekvenssi .

Kuviossa 2 on verrattu sICAM-l:n ja ICAM-1:n C-pään alueita. ICAM-l:n ja sICAM-l:n nukleotidisekvenssit ja 5 niistä päätellyt aminohapposekvenssit on esitetty alkaen aminohappotähteestä 435. Viivat sICAM-l-sekvenssissä osoittavat puuttuvia nukleotideja. Molempien proteiinien lopetuskodonien asemat on osoitettu tähdellä.

Kuviossa 3 on verrattu sICAM-l:n ja ICAM-l:n raken-10 netta. ICAM-l:n membraaniin ulottuva alue on osoitettu raidallisella laatikolla ja sytoplasminen alue varjostetulla laatikolla. Uusi sICAM-l:n C-pää on merkitty kiinteällä laatikolla. Viisi ennustettua immunoglobuliinin kanssa homologisuutta osoittavaa aluetta on numeroitu I -V.

15 Kuviossa 4 on ICAM-1-geeni ja sen ilmentyminen HRR- transfektanteissa. A: HeLa- (kaista 1) , LKT - (kaista 2) ja Hei- (kaista 3) DNA:n Southern blot-analyysi; DNA:t pilkottiin EcoRl:llä ja tutkittiin ICAM-l-oligonukleotidi-koettimella; B: HeLa- (kaista 1), LTK"- (kaista 2) ja HE1-20 (kaista 3) polyA+ -RNA:n Northern blot -analyysi, tutkittiin ICAM-l-oligonukleotidikoettimella; C: HeLa- (kaista 1), Ltk"- (kaista 2) ja HEI- (kaista 3) poly A+ -RNA: sta : ' : valmistetun cDNA:n PCR-monistus. Käytetyt alukkeet olivat ICAM-1:n N-päätä ja C-päätä koodaavista alueista, joiden 25 sekvenssit olivat .···. ggaattcATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC ja • · l\',m ggaattcTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTGTT.

• · · ' Ylempi tapaus kuvaa ICAM-1-sekvenssiä, alempi tapaus kuvaa restriktiokohdan linkkereitä. Kaistat 1 ja 2, 72 tunnin • » • “ 30 altistus, kaista 3, 90 minuutin altistus.

• · · *.* * Kuviossa 5 on geeli, joka esittää ICAM-1 :n ja sICAM-l:n mRNA:iden toteamista HeLa- ja HEl-soluista. PCR- t · · monistus tehtiin 100 ng:n näytteille yksisäikeistä cDNA:ta käyttäen alukkeita: 3 5 PCR 5.4 (CTTGAGGGCACCTACCTCTGTCGG) ja \‘·· PCR 3.4 (AGTGATGATGACAATCTCATACCG) .

7 100601

Pidennykset tehtiin 72 °C:ssa 25 syklin ajan ja yksi kymmenesosa tuotteesta analysoitiin 1 % agaroosi/3 % NuSieve -geelissä. Kaista 1, HeLa:n cDNA; kaista 2, HEI:n cDNA; kaista 3, LTK':n cDNA; kaista 4, ICAM-1 faagikontrolli; 5 kaista 5, sICAM-l-faagikontrolli; kaista 6, ICAM-1 + sICAM-1 -faagikontrolli. Spesifiset 105 emäsparin ja 86 emäsparin monistustuotteet on osoitettu nuolin.

Kuviossa 6 on Western blot -analyysi, joka esittää ICAM-l-proteiinin liukoisen muodon synteesin HeLa- ja HE1-10 solujen avulla. Se osoittaa proteiinilajien, jotka ovat sukua ICAM-1:lie, olemassaolon HeLa- ja HEl-solujen vil-jelysupernatantissa. Yhtä suuret määrät solulysaatteja ja viljelysupernatantteja erotettiin SDS-PAGE:11a, siirrettiin nitroselluloosaan ja tutkittiin ICAM-1:ta vastaan 15 muodostetulla kanin polyklonaalisella antiseerumilla ja sen jälkeen 125I-proteiini A:lla; lähelle membraaniin sidotun ICAM-1:n asemaa kulkeutunut näyte havaitaan sekä HeLa-että HEl-viljelmäsupernatanteissa.

Kuviossa 7 on kloonattujen sICAM-1- ja ICAM-1-20 plasmidien graafinen esitys.

7A. pHRR3 on PCR:llä saatu täysipituinen cDNA, joka ’·"· koodaa sICAM-l:tä. Kloonit 19.1-3 ja 4.5 ovat osittaisia cDNA-klooneja, jotka koodaavat sICAM-l:tä ja jotka on saatu lambda GTll:ssä olevasta HEl-cDNA-kirjastosta. Kloonien ; 25 alapuolella on sICAM-1-molekyylin kaaviokuva. S merkitsee .···. signaalipeptidiä ja I - V IgG:n kanssa homologista aluet- • * · .···, ta. Kiinteä laatikko osoittaa ainutlaatuista 11 aminohapon • · · C-päätä.

.. 7B. pHRRl ja pHRR2 ovat täysipituisia, PCR:llä saa- • · *ti]' 30 tuja ICAM-l-cDNA-klooneja. Jäljelle jäävät ICAM-l-kloonit • « · *·* * saatiin lambda GTll:ssa olevasta HEl-cDNA-kirjastosta.

Kloonien alapuolella on ICAM-1-molekyylin kaaviokuva, jos-sa näkyy signaalipeptidi (S), viisi IgG:n kanssa homologista aluetta (I-V), transmembraanialue (TM) ja sytoplas-: 35 minen alue (C).

8 100601

Eräs kyseessä olevan keksinnön puoli liittyy ihmisen nuhaviruksen (HRV) reseptorin sitoutumiskohtaan sitoutuvan liukoisen, luonnollisen ligandin keksimiseen, joka ligandi sitoutuu myös sitoo LFA-l:een. Tämä liukoinen 5 luonnollinen molekyyli on sukua, mutta siitä eroava, molekyylille, jota nimitetään "solujenväliseksi adheesiomolekyyli l:ksi" eli "ICAM-1:ksi" , joka on liukenematon, solumembraaniin sitoutunut ja omaa tyypillisen hydrofobisen membraaniin ulottuvan alueen ja lyhyen sytoplasmisen 10 hännän. Uudella proteiinilla on DNA-sekvenssi, joka on merkitsevästi erilainen kuin julkaistu ICAM-l:n DNA-sek-venssi. sICAM-1 sisältää suurimman osan ICAM-l:n ekst-rasellulaarisesta alueesta mukaan lukien monien toimintojen funktionaaliset alueet, kuten HRV:n ja LFA-l:n sitomi-15 nen, mutta siitä puuttuu membraaniin ulottuva alue ja sy-toplasminen alue. sICAM-1 säilyttää kykynsä sitoa HRVrtä ja LFA-1:tä ja se eritetään liukoisessa muodossa. sICAM-l:n DNA-sekvenssi sisältää 19 emäsparin deleetion nukleotideissä 1465 - 1483 Stauton et ai.1 in .suora (1988) 20 numeroinnin mukaan. sICAM-1:n kloonin loppuosa täsmää julkaistun ICAM-1-järjestyksen kanssa poiketen siitä G:n kor-vatessa A:n nukleotidiasemassa 1462, mikä muuttaa Glu : ; 442:n lysiiniksi, kuten kuviossa 1 on esitetty. Aminohap- potähteiden järjestys peptidissä on merkitty standarditer-25 minologian mukaisesti, esim. Lehninger, Biochemistry.

« · · .···. Worth Publishers, New York, NY (1970) . sICAM-1 on HeLa- ja HEl-solujen ja muiden ihmisen solujen luonnollinen tuote, • · · jolla tulee olla kyky sitoutua ja inhiboida ihmisen nuha-.. virus- ja Coxsackie A -virusinfektiota. Sillä on myös kyky • ” 30 sitoutua LFA-l:een ja sitä voidaan käyttää vastustamaan • · · • · · * soluadheesiota, jota välittää ICAM-l/LFA-1-sitoutuminen, :***· ja täten se voi olla käyttökelpoinen terapeuttisena ainee- ' na tulehduksen hoidossa, siirrännäisen hyljinnässä, LFA- l:ta ilmentävien syöpäsolujen ja muiden prosessien, joissa •35 tapahtuu soluadheesiota, tukahduttamisessa. Eristetyllä ja 9 100601 puhdistetulla sICAM-l-proteiinilla ei olisi terapeuttisena aineena vieraisiin proteiineihin liittyviä immunogeenisiä ongelmia. Liukoisen, luonnossa esiintyvän proteiinin erittäminen eliminoi ongelmat, jotka liittyvät liukenematto-5 maan, solumembraaniin sitoutuneen proteiinin tuotantoon ja puhdistamiseen, koska solun hajoittamista ei tarvita ja siten voidaan käyttää jatkuvaa viljelmää sekä yksinkertaisia menetelmiä sICAM-l:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi.

Muun nisäkkään kuin ihmisen nisäkässolulinjoja, 10 jotka ekspressoivat tärkeimmän ihmisen nuhavirusreseptorin geeniä, on aikaisemmin identifioitu ja ne on esitetty julkaisuissa EP-319 815 ja US-5 589 453 ja sisältävät viitteet solulinjojen ATCC-talletuksiin. Tärkein ihmisen nuha-viruksen reseptori identifioitiin käyttäen monoklonaalisia 15 vasta-aineita, jotka inhiboivat nuhavirusinfektiota. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet tunnistivat ihmissolujen ja nuhavirusta sitovaa fenotyyppiä ilmentävien hiiren trans-fektanttien 95 kilodaltonin solupinnan glykoproteiinin. Puhdistettu 95 kilodaltonin proteiini sitoutuu nuhaviruk-20 seen in vitro. 95 kilodaltonin proteiinin sekvenssi oli identtinen ICAM-1:n kanssa; cDNA-kloonilla, joka oli saatu nuhavirusreseptoria ilmentävistä hiiren transfektanteista, : oli sama sekvenssi kuin ICAM-l:lle julkaistu lukuun otta- : matta A:n vaihtumista G:ksi edellä kerrotun mukaisesti.

. 25 Täten pääteltiin, että tärkein ihmisen nuhavirusreseptori .·)·. ja ICAM-1 olivat sama proteiini. Helrksi nimetty trans- * · ‘1! fektoitu hiiren L-solulinja, joka sisälsi ja ilmensi HRR- • · · * geenin eli ICAM-1-geenin, oli eristetty. ICAM-1 terminologiaa on käytetty, vaikka nyt on havaittu, että HRR ja • · : ** 3 0 ICAM-1 merkitsevät samaa.

• · · V · cDNA-kirjasto valmistettiin lambda GTll:een random .···. priming -leimausmenetelmällä HEl:n polyA+ -RNA-.sta. Kir- • · ____: jasto seulottiin kahdesti käyttäen kahta oligonukleotidiä, jotka olivat peräisin julkaistusta ICAM-l-sekvenssistä.

35 Oligonukleotidi ICAM-1:llä on sekvenssi 10 100601 GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTGGGGCCGCAGGTCCAGTTC j a oligonukleotidi ICAM-3:lla on sekvenssi CGTTGGCAGGACAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGTGTTCT.

Yhdestä seulonnasta saatiin kahdeksan positiivista 5 kloonia, joista kolme valittiin lisätutkimukseen. Kahden kloonin DNA-sekvennssi oli identtinen julkaistun ICAM-1-sekvenssin kanssa. Kolmannen kloonin, lambda 19.1-3:n, sekvenssi oli merkittävästi erilainen kuin kahden muun kloonin siten, että siinä oli 19 emäsparin deleetio nuk-10 leotideissä 1465 - 1483 Stauton et ai.1 in. supra. numeroinnin mukaan. Toisessa cDNA:ssa, lambda HEl-4.5:ssä, esiintyi 19 emäsparin deleetio ja se oli itsenäisesti varmistettu käyttäen polymeraasiketjureaktiolla (PCRrllä) muodostettua cDNA:ta. cDNA-sekvenssin analyysi ennusti 15 ICAM-1:n eritetyn muodon olemassaoloa, joka muoto muodos tuu vaihtoehtoisella silmukointimekanismilla. sICAM-l:n Western blot-identifiointi HEI- ja HeLa-solulinjojen vil-jelysupernatantista varmistaa, että sICAM-l:n mRNA-sek-venssi koodaa ICAM-l:n liukoista muotoa, joka ei liity 20 solun pintaan, vaan vapautetaan soluväliaineeseen. Vaihtoehtoisesti silmukoitu mRNA, joka tuottaa toisen adheesiomolekyylin (NCAM:n) eritettyä muotoa, on indentifioitu [Glower et ai.. Cell 55 (1988) 955 - 964] , vaikka NCAMrssa ; eksoni on yhdistynyt mRNA:hän, kun taas esillä olevassa .2 5 keksinnössä eksoni on poistettu mRNA:sta. Vaihtoehtoista * « * .»··. mRNA-sekvenssiä ei ICAM-l:lle oltu aikaisemmin identifioi- • · tu (Staunton et ai.).

• · · sICAM-1-cDNA-Kloonit

Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, valmisti • · ’ “ 30 lambda GTll:een cDNA-kirjaston HEI:n poly A+:sta. Kirjasto • t · V ; seulottiin kahdella ICAM-l:n koodaavan sekvenssin keskeltä saadulla 47-meerin oligonukleotidikoettimella. Positiivi- (41 nen klooni, joka nimettiin 19.1-3 :ksi ja joka sisälsi 1,5 kiloemäksen insertin, eristettiin; toinen cDNA-klooni, : 35 joka nimettiin 4.5:ksi ja joka sisälsi 1,25 kiloemäksen » 11 100601 insertin, eristettiin; ja vielä yksi cDNA-klooni pHRR-3 saatiin subkloonaamalla PCR-monistuksen tuotteet Blue-script-vektoriin käyttäen Perkin-Elmer/Cetus DNA Amplification System -järjestelmä, Perkin-Elmer, Wellesley MA., 5 kuten kuviossa 4C, kaista 3, on esitetty. Nämä kloonit erosivat merkittävästi julkaistusta ICAM-l-sekvenssistä.

Nämä kaikki sisältävät 19 emäsparin deleetion nukleotideissä 1465 - 1483 Stauton et ai.1 in. supra. numeroinnin mukaan. Jotta osoitettaisiin suoraan, että sICAM-l:n 10 mRNA:ta on läsnä HEI- ja HeLa-soluissa, PCR-koe suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka reunustavat 19 emäsparin aluetta, jota ei esiinny sICAM-l:n mRNA:ssa (kuvio 5). Käyttäen näitä alukkeita ICAM-l:n mRNA-.n tuote on 105 emäsparia, kun taas sICAM-l:n tuote on 19 emäsparia lyhem-15 pi, ts. 86 emäsparia. Tämä koe osoittaa, että sekä HE1-että HeLa-solut sisältävät ICAM-l:n mRNA:n molempia muotoja, kun taas kontrollina käytetyt L-solut eivät sisällä. Synteettistä oligonukleotidiä, jota nimitetään PCR3.2:ksi ja jolla on seuraava järjestys: 2 0 ggaatt cTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT, käytettiin erottamaan 19 emäsparin deleetion sisältävät cDNA-kloonit klooneista, jotka eivät sisällä 19 emäsparin deleetiota. Synteettinen oligonukleotidi ei sitoudu cDNA-klooneihin, jotka sisältävät 19 emäsparin deleetion. Li-25 säksi cDNA 19.1-3:n ja PHRR-3:n osittainen sekvenssi var-mistivat 19 emäsparin deleetion. Nämä tiedot osoittavat, • · · että HEl-soluissa on vähintään kaksi selvästi erilaista • · · ICAM-1-lajia, tunnetun tekniikan mukainen liukenematon .. ICAM-1 ja uusi, esillä olevassa keksinnössä kuvattu liu- • < · 30 koinen muoto.

• · « \ ' Solujen välisen adheesiomolekyyli-1:n mRNA:n delee- • · · : : tion sisältävän (sICAM-1) ja deleetion sisältämättömän (ICAM-1) muodon sekvenssit, joita cDNA-kloonit edustavat, esitetään kuviossa 2. Deleetiokohdassa sekvenssi on AGGT, 35 joka on yhteensopiva RNA:n silmukoitumisliitoksen kanssa.

• t 12 100601 19 emäksen poistaminen mRNA:sta siirtää lukukehystä ja aiheuttaa näiden kahden polypeptidisekvenssin eron aminohappotähteessä 443. Deleetion sisältävä muoto (sICAM-1) sisältää ylimääräiset 11 tähdettä, joita seuraa kehyksen-5 sisäinen lopetuskodoni. Siten tämä molekyyli sisältää 453 aminohappoa verrattuna deleetion sisältämättömän muodon 505 aminohappoon. ICAM-l:n N- päästä alkaen sICAM-l:ssä on 442 yhteistä aminohappoa ICAM-l:n kanssa. Deleetion sisältävä muoto (sICAM-1) sisältää ainutlaatuisen 11 aminohapon 10 C-pään, mutta siitä puuttuu ICAM-l:n membraaniin ulottuva alue (24 aminohappoa) ja sytoplasminen alue (28 aminohappoa) , kuten kuviossa 3 on esitetty.

ICAM-I:n cDNA-kloonit

Monia menetelmiä voidaan käyttää geenien kloonaa-15 miseksi. Eräs menetelmä on käyttää kahta osittain päällekkäistä 47-meerin oligonukleotidikoetintä. Nämä kaksi koe-tinta, joita kutsutaan oligonukleotidi ICAM-l:ksi ja oli-gonukleotidi ICAM-3:ksi, syntetisoitiin julkaistusta ICAM-1-sekvenssistä. ICAM-l-oligonukleotidi leimattiin korkeaan 20 spesifiseen aktiivisuuteen ja hybridisoitiin Southern hiottiin hyvin rajoittavissa olosuhteissa. Kuten kuviossa 4A on esitetty, 4,4 kiloemäksen yksittäinen nauha havaittiin HeLa-, HEI- ja kahdessa primaarissa HRR-transfektant-tisolulinjassa, eikä sitä esiiintynyt Ltk'-soluissta. Tämä 25 tulos varmistaa, että HRR-transfektantit sisältävät ihmi- :***: sen ICAM-l-geenin. Fragmentin koko on yhtäpitävä Simmons • · * :*·*· et ai. 1 in mutta eroaa Staunton et ai. 1 in tuloksista, mikä todennäköisesti kuvastaa estopaikan monimuotoisuutta.

;·, ICAM-l-oligonukleotidia käytettiin saman solulinjan 3 0 polyA+ -RNA:n Northern hiotin tutkimiseen. Kuten kuviossa • · · *. 4B on esitetty, 3,3 kiloemäksen mRNA havaittiin HeLa-, • · · Σ.,.ί HEI- ja primaareissa transfektanttisolulinjoissa, mutta se puuttui Ltk'-soluista. HEl-solujen signaali oli monta kertaa voimakkaampi kuin muissa solulinjoissa, mikä osoittaa 35 paljon korkeampaa mRNA-pitoisuutta HEl-soluissa. Tämä so- 13 100601 pii yhteen HRR:n (ICAM-l:n) ekspression korkeamman tason kanssa Hei-soluissa. HEI-soluissa havaittiin myös toinen 2,4 kiloemäksen RNA. Nämä tiedot varmistavat, että ihmisen ICAM-l:n mRNA ilmentyy HRR-transfektanteissa. Katso kuvio 5 4B.

Ihmisen ICAM-l-geeni eristettiin HEl-transfektan-tista polymeraasiketjureaktio (PCR) -monistuksella käyttäen Perkin-Elmer/Seats DNA Amplification System -järjestelmää, Perkin Elmer, Wellesley MA. PCR-monistus suoritet-10 tiin HeLa-, Lkd‘-ja HEl-RNA:sta valmistetulle yksisäikei- selle cDNA:lie. Alukkeet tehtiin julkaistun ICAM-l-sek-venssin 5'- ja 3'-koodausalueista. ICAM-l-spesifiset mo-nistustuotteet todettiin PCR:n reaktioiden Southern blot-tien hybridisaatiolla käyttäen ICAM-l-oligonukleotidia.

15 Kuten kuviossa 4C on esitetty, yksi ainoa noin 1600 emäs-parin nauha, joka oli oletetun kokoinen, monistui HeLa-ja HEl-soluista, mutta puuttui Ltk'-soluista. Monistustuote kloonattiin Bluescript-vektoriin (Strategene, San Diego, CA) ja saatiin kaksi itsenäistä kloonia, jotka nimettiin 20 PHRRl:ksi JA PHRR2:ksi. Täydellinen PHRR2:n sekvenssi oli 100 - % : sti identtinen julkaistun ICAM-l:n koodaussekvenssin ' ' kanssa lukuun ottamatta yksittäisen G:n vaihtuminen A:ksi, : kuten edellä on kuvattu.

lambda GT11 -kirjasto, joka oli valmistettu random : : 25 priming -leimausmenetelmällä HEl:n cDNArsta, seulottiin ICAM-l- ja ICAM-3-koettimilla ja kahdeksan positiivista kloonia eristettiin. Kuusi kloonia, kuten kuviossa 7 on esitetty, valittiin lisätutkimusta varten ja analysoitiin .. osittaisella DNA-sekvenoinnilla. Näistä klooneista peräi- • ·' *... 30 sin olevan sekvenssin kaikkiaan noin 1000 nukleotidia oli- • < · * vat identtisiä ICAM-l-sekvenssin kanssa.

• · · : ! Liukoisen proteiinin puhdistus ia eristys ;··; HeLa- ja HEI-soluja kasvatetaan standardiolosuh- teissa DMEM:lla (Dulbecco's Modified Essentia Media), jos-35 sa on 10 % naudan sikiön seerumia. Näiden solujen käsitel- 14 100601 ty väliaine otetaan talteen ja sentrifugoidaan tai suodatetaan solujen tai solujäännösten poistamiseksi. Solumemb-raaniin sitoutunutta ICAM-l:tä ei ole läsnä supernatantis-sa. Sitten tämä alusta absorboidaan Sepharose-hartsiin, 5 johon on kytketty monoklonaalista vasta-ainetta (esimerkiksi monoklonaalinen vasta-aine C78.4A), joka on muodostettu ICAM-l:tä tai sICAM-l:tä vastaan, ja absorboitumattomat proteiinit pestään hartsista fysiologisella suola-liuospuskurilla, kuten fosfaatilla puskuroidulla fysiolo-10 gisella suolaliuoksella. Sitten sitoutunut sICAM-1 eluoi- daan sellaisissa olosuhteissa, että proteiinin natiivi konformaatio säilyy, kuten US-patentissa 5 589 453 on kuvattu. sICAM-1 voidaan puhdistaa edelleen lektiiniaf-finitettikromatografiällä, ioninvaihtofromatografiällä tai 15 geelisuodatuksella.

mRNA, joka kopioitiin in vitro Bluescript-vektoris-sa (Strategene) sICAM-l:tä koodaavasta cDNA:sta, luettiin in vitro. Mikrosomaalisten membraanien puuttuessa saatiin glykosyloitumaton proteiini, jonka näennäinen molekyyli-20 paino oli 52 000 daltonia; mikrosomaalisten membraanien läsnäollessa saatiin 72 400 daltonin glykosyloitunut laji, ' ' joka eristettiin mikrosomaalisesta membraanista, mikä osoittaa, että mikrosomaaliset membraanit virheettömästi siirsivät sICAM-polypeptidin paikaltaan, prosessoivat ja 25 glykosyloivat sen.

·**’· tmICAM:a ja sICAM:a koodaavat cDNA:t CDM8-vektoris- sa [See, B. ja Aruffo, A. PNAS 84 (1987) 3365] transfek- • « · toitiin COS-soluihin ja hiiren L-soluihin käyttäen DEAE- .. dekstraanitekniikkaa. 72 tunnin kuluttua solut analysoi- • 1 • « « 30 tiin kahdella menetelmällä: (1) FACS-analyysi käyttäen mo- • · · **| noklonaalista anti-ICAM:a (c78.4) ICAM-molekyylien solu- membraanin ilmentämiseksi ja (2) metabolinen leimaus ja • · · sen jälkeinen solusupernatanttien ja solulysaattien immuno- absorptio anti-ICAM Mabia käyttäen. Metabolisen leimauksen ·; 35 tulokset osoittivat, että sICAM-transfektoiduissa soluissa 15 100601 esiintyy 68 000 daltonin molekyylin intrasellulaarista akkumuloitumista, mutta ettei sICAMtn erittymistä superna-tanttiin tapahdu. Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä sen kanssa, että sICAM erittyy "säädellyn" eritysreitin kautta 5 ["Regulated" secretion pathway, Kelly, R. B., Science 230 (1985) 25].

sICAM-l:lle ja ICAM-l:lle spesifiset vasta-aine-koettimet valmistettiin. Synteettiset peptidit S-PEP, PPGMRLSSSLW (C), 10 joka saatiin sICAM-l:n C-pään ainutlaatuisesta 11 aminohapon sekvanssistä, ja P002, joka saatiin ICAM-l:n C-pääs-tä, GTPMKPNTQATPP (C), valmistettiin ja puhdistettiin; suluissa olevat C-pään C-15 tähteet lisättiin helpottamaan peptidien kytkentää pro-teiinikantajiin. Synteettinen peptidi kytkettiin KLH:iin (tulivuorikotilon hemosyaniini) standardimenetelmällä ja konjugaatti injektoitiin kaneihin, jolloin saatiin anti-peptidiantiseerumeja, joiden osoitettiin spesifisesti si-20 toutuvan vastaaviin peptidi-immunogeeneihin.

Seuraavat mikro-organismit on talletettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, 12301 Park-lawn Drive, Rockville, MD 20852, USA: nisäkässolulinja HE-1, jonka ATCC-talletustunnus on CRL 9592, nisäkässolulinja 25 HRVRI (HRRI) , jonka ATCC-talletustunnus on CRL 9593 ja hybridoomasolulinja CIII 92 . IA, jonka ATCC-talletustunnus • · · on HB 9594.

• · » • · • « • · • · · • · · 1 · • · • · ·

Claims (7)

100601

1. Menetelmä liukoisen intersellulaarisen adheesio-molekyyli-1:n (sICAM-1) talteenottamiseksi ja puhdistami-5 seksi, joka intersellulaarinen adheesiomolekyyli on liukoinen ilman detergenttiä ja on kuviossa 1 esitetyn DNA-sekvenssin translaatiotuote tai sen funktionaalinen johdannainen, joka sisältää kuviossa 1 esitetyn sekvenssin 11 C-terminaalista amino-10 happoa, tunnettu siitä, että (A) poistetaan supernatantti hajoittamattomista soluista, jotka sisältävät kuvion 1 DNA:n, (B) viedään supernatantti affiniteettimatriisiin, joka sisältää sICAM-l:een sitoutumaan kykenevää, immobili- 15 soitua vasta-ainetta, mieluummin intersellulaarista adhee siomolekyyli -1:tä ICAM-1:tä ja sICAM-l:tä vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden johdannaisia, (C) annetaan sICAM-l:n sitoutua matriisissa olevaan vasta-aineeseen, 20 (D) pestään affiniteettimatriisi sitoutumattomien kontaminanttien poistamiseksi, ja ' ' (E) otetaan talteen sICAM-1 eluoimalla mainittu ; sICAM-1 mainitusta matriisista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että supernatantti lisäksi viedään ;***; lektiini- tai vehnänalkion agglutiniini -pylvääseen ennen • « · supernatantin viemistä mainittuun vasta-ainepylvääseen tai sen jälkeen. ..f

3. Puhdistettu ja eristetty DNA-sekvenssi, t u n - • H · *... 30 n e t t u siitä, että se on kuviossa 1 esitetty ihmisen • · ( \ liukoista intersellulaarista adheesiomolekyyli l:tä koo- • · · : : daava DNA-sekvenssi .

• · · •: 4. Nisäkässolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen DNA-sekvenssin. 100601

5. Menetelmä vasta-aineen valmistamiseksi, joka pystyy sitoutumaan liukoiseen intersellulaariseen (sICAM-1:een), jolla on kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi eikä pysty sitoutumaan liukenemattomaan ICAM-l:een, 5 tunnettu siitä, että (a) valmistetaan peptidi-proteiini-konjugaatti, joka on spesifinen ainakin osalle sICAM-l:ssa olevaa ainutlaatuista 11 aminohapon sekvenssiä PPGMRLSSSLW 10 (b) immunisoidaan eläin peptidi-proteiini-konjugaa- tilla, (c) annetaan eläimille tehosteannos, ja (d) otetaan antiseerumit talteen tai immortalisoi-daan eläimen pernasoluja fuusioimalla sopivalla kasvainso- 15 lulinjalla ja viljellään fuusioidut solut monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine .

7. Hybridoomasolulinja CIII 92.IA, jonka ATCC-tal- letusnumero on HB 9594. ··· • · • · • · · * · « • « t « • I • f • i • « « » • 1 · • · · · · • · ♦ · ♦ «· is 100601