JPH05508308A - 血小板細胞付着分子とその変種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板細胞付着分子とその変種 本発明は、インビボにおいて、血小板や、内皮細胞膜に結合する、タンパクやそ の他の薬物のリガンドとして働くことのできるポリペプチド分子に係わる。 多種類の細胞が、「インテグリン」と呼ばれる表面タンパクを持っているが、こ のものは、細胞の周囲にたいする付着状態に影響を及ぼす細胞外タンパク、例え ば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オストポンチン、コラーゲン、トロン ボスポンヂン、フィブリノーゲン、フォノ・ウィルプラント因子（ＶＷＦ）によ って識別される。上記細胞外タンパクのいくつかにたいしてレセプターとして働 くインテグリンは、従来、血小板が、外気に暴露した血管内皮に、ＶＷＦ依存性 に付着するのを一部仲介する、ヒト血小板糖蛋白１　ｂ　（ＧＰＩＩ）と特定さ れている。フィブロネクチンレセプターのβ鎖に対応するのがＧＰＩＩａであり 、また、異性二量体タンパク複合体ＧＰＩＩｂ−ＧＰｉｌｌｘがあり、これは、 血小板において、フィブリノーゲンにたいするレセプターとして、フィブリノー ゲンの無い場合はＶＷＦにたいするレセプターとして、また、フィブロネクチン およびビトロネクチンのレセプターとして働く。 ＧＰＩＩｂ、　ＧＰＩＩｌｌに共通なα−β鎖構成は、レセプターのインテグリ ン族構成員に典型的な性質である。付着促進性タンパクのもう一つのグループで 、一般に「細胞付着分子Ｊ　（ＣＡＭ類）と呼ばれているものがあるが、これは 、免疫グロブリン遺伝子超族の遺伝子によってコードされるタンパクと一緒に分 類されている。例えば、Ｗｉｌｌｉｉｍｓ　＆　Ｂｘｒｃｌ畠７．　Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ、Ｉａｍｉａｏｌ。 ６：３８１−４０５　（１９８８）を参照されたい。その内容を、引用すること によって、ここに含めることにする。免疫グロブリン超族に関連するその他のタ ンパク同様、ＣＡＭ類も共通の構造を持っている、すなわち、免疫グロブリン相 同ユニットである。これは、約１００残基長の、アミノ酸配列を持ち、その中央 にはジスルフィド架橋を配するが、この架橋が、一連の、反平行β鎖を、いわゆ る抗体折れ目（ｆｏｌｄ）として安定化する。特に、免疫グロブリン相同ユニッ トは、保存性アミノ酸配列Ｇ１７−１−４−Ｙ直１／Ｌｅｅ／１ｉｅ−Ｘ−Ｖａ ｌ／Ｌｅ＋＋／ｌ１ｅ−１−Ｃｒｔ／　（３３−５５アミノ酸）／Ａｓｐ４−Ｇ ｌｙ−４−Ｔ７ｔ−Ｘ−Ｃ７ｓ−１４ｘｌ／＾１を含む。［１ｕａｋｔｐｉｌｌ ｅｔ　＆Ｈｏｏｄ、Ｎ［＋＋ｒｅ　３２３１５　（ＩＨ６１を参照のこと。 既知のＣＡＭ類の中には、インテグリン・リンパ球機能関連分子−１（ＬＦ＾− １）と結合して白血球付着を仲介する、細胞間付着分子−１（］Ｃ＾ト１）；癌 細胞胎生抗原（ＣＥＡ）；ファスチクリンＩＩ　、　ＣＤ４　、　［１ＩＶ−１ にたいする細胞レセプターの１成分である、Ｔ細胞サブセット・マーカー；神経 細胞の付着を仲介する、神経細胞付着因子（Ｎ−ＣＡＭ　）　；髄硝化のために 働くとされている、ミニリン関連性糖蛋白（ｉｌＡＧ）、リンパ球機能関連性抗 原３　（ＬＦ人−３）；末梢ミニリンの主要糖蛋白、がある。 ＣＤ４とＩＩＩマー１との機能的関連の他に、ウィルスレセプターとしてのＣＡ ＭＩＩの役割は、次の事実の中に見て取ることができる。 すなわち、２種のピコルナ・ウィルス、すなわち、ヒトのライノ・ウィルスとポ リオ嗜ウィルスにたいするレセプターが、それぞれ、ＩＣ＾Ｃエト細胞表面糖蛋 白と特定されており、後者は、３個の免疫グロブリン様ループ領域（ＩｃＡト１ の、同様の、５個の区域と比較せよ）から成るものであった。 ＣＡ、Ｍ分子は、インビボにおいては重要な機能を果たしているけれども、血小 板からほぼ純粋な形で得られたタンパクで、ＣＡＭ族の構成員として、構造的、 機能的に、特定されたものはこれまでに一つもない。このようにして、その性質 を明らかにしていくことは重要であろうと思われるが、それは、そのようなタン パク、並びに、それに基づく変異分子が、血小板を含む、基本的な細胞表面認識 過程において演じることが予想される役割にとって重要だからであって、その過 程の中には、血小板の自己連結（凝集）、その他の血液細胞や、血管壁を構成す る内皮細胞との結合、並びに、細胞外基質成分、例えば、血管外傷のさいに露呈 される内皮上組織への付着等が含まれる。 発明の要約 したがって、本発明の目的は、血小板や、内皮細胞上に存在するＣＡＭタンパク の純粋形を、回収可能な量として、得ることである。 また、本発明の目的は、インビボで、血小板膜タンパクに結合する、タンパクや 、その他の薬物にたいし、ＣＡＭ様のやり方で、レセプターとして働くポリペプ チド分子を与えることである。　本発明のさらにもう一つの目的は、免疫グロブ リン超族と関連する構造特性を持つタンパクを生産する手段を与えることである 。このタンパクは、血小板表面の認識過程を変えるのに用いることができる。 前記の目的を実行するために、本発明のある一面に即して、回収可能量のＰＥＣ ＡＭ−１を含む組成物が与えられる。ある好ましい実施例では、その組成物は、 実質的に純粋形のＰＥＣＡＭ−１であるが、一方、また別の好ましい実施例では 、組成物は、成熟ＰＥＣＡＭ−１を含むものである。 本発明の別の一面に即して、ある　ＰＥＣＡＭ変種が与えられる。 このものは、ＰＥＣＡＭ突然変異タンパク質と、ある分子とから成るグループか ら選ばれたもので、ここに、その分子は、付着促進作用を示す。また、その分子 とは、ＰＥＣＡｌｌのある一部に一致し、または、ＰＥＣＡｌｌの一部に一致せ ず、その一部を含むものである。ある好ましい実施例では、このＰＥＣＡＭ変種 は、ＰＥＣＡｌｌ−１の、細胞外部分に一致、ないし、その部分を包含するが、 膜通過部分ないし細胞内部分には、一致も包含もしない。 その他の好ましい実施例では、前述の細胞外部分はそれぞれ、Ｎ末端Ｇｉｎ−Ｇ ｌａ−Ａｓｎ−９ｅｔ−Ｐｈｅを含み、５７４残基のアミノ酸配列を持つ。 さらに本発明のもう一つの面に即して、あるポリペプチドが与えられる。これは 、ＰＥＣＡＭ−１アミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列を持つが、ここに、こ のポリペプチド分子（ａ）は、上記ＰＥＣＡＭ−１アミノ酸配列には一致しない が、（ｂ　）　ＰＥＣＡＭ−１作用は持つ。ある好ましい実施例では、このポリ ペプチドは、４から１００アミノ酸残基長である。 さらに、本発明の別の一面に即して与えられるものは、ＰＥＣＡＭ−１をコード する単離したポリヌクレオチド分子と、ＰＥＣＡＭ変種をコードするポリヌクレ オチド分子である。ある好ましい実施例では、あるポリヌクレオチド分子は、で きれば、約７９キロダルトン（ｋ　ｄ）の分子量のポリペプチドを持ち、Ｎ末端 が、Ｇｌａ−Ｇｉｎ−Ａ＋ｎ−３ｅｒ−Ｐｂｅ−丁ｈｒ−１１ｅである、そのよ うなタンパクをコードし、さらに、厳重条件下で、１１１図に示すヌクレオチド 配列の、少なくとも約１０ヌクレオチド長の、一部にたいして相補的な、オリゴ ヌクレオチド・プローブとハイブリダイズする。 さらに与えられるオリゴヌクレオチドは、第１図に示したヌクレオチド配列の一 部に一致、ないし、相補的であり、それによって、そのオリゴヌクレオチド、ま たは、その転写産物の存在が、ＰＫＣＡＭ−１またはＰＫＣＡＭ−１変種をコー ドするＤＮＡ配列を発現する細胞において、そのＤＮＡ配列の転写および翻訳を 抑制する、そのようなオリゴヌクレオチドである。好ましい実施例では、このオ リゴヌクレオチドは、ＲＮＡ　（で、かつ、ＤＮＡ配列を抑制する）か、ＤＮＡ 　（で〜かつ・上記ＤＮＡ配列の転写を抑制する）のどちらかである。 本発明の、他の目的、特質、利点は、下記の詳細な説明から明らかとなろう。し かしながら、詳細な説明や、特定の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すも のではあるが、ただ例示のためだけに呈示するものである。なぜなら、本発明の 主旨や範囲に抵触することなく様々な変更、修正が可能であることは、本技術に 習熟した人々であれば、この詳細な説明から自ずから明かであろうから。特にそ うと断わらない限り、下記に言及する文書のそれぞれの内容は、引用することに よってここに含めることにする。 図面の簡単な説明 第１図は、本発明における血小板膜種蛋白（ＰＥＣＡト１）の−次構造を、その −次構造をコードするヌクレオチド配列と共に、示す。成熟糖蛋白の、疎水性の 信号（シグナル）成分と予想されるペプチドと、膜通過区域に下線を施す。天然 に見られる、２個のＥｅａ　Ｒ［部位を四角で囲った。ＰＥＣＡＭ−１の全細胞 外区域を通じて、約５０アミノ酸隔たっているシスティン残基を丸で囲った。こ れらは、個々の免疫グロブリン相同ユニットにおいて、ジスルフィド結合に参加 していると考えられるからである。 残基６８６の、ティロジン燐酸化と考えられる部位を、黒丸で示した。ＴＡＧ停 止コドンは、太線で下線を施した。 第２図は、ＰＥＣＡＭ−１を、上記の、他の、いくつかのＣＡＭ分子と共に、細 胞膜（点綴領域）に関連させて描いた模式図である。円は、個々の、免疫グロブ リン相同ユニットである。 Ｗｉｌｌｉｓｍ＋、Ｉａｍｕｎｏｌｏｇ７　Ｔｏｄｔ７８：　２９８ｆ１９８７ ）の分類に従うと、ＣＡＭ類と描かれるものは、Ｃ２タイプの区域から成る。た だし、ＣＥＡは除く。これは、アミノ酸末端に１個のｖタイプの区域しか持たな い。ファスチクリン■とｌｌ−ＣＡＭにおいては、膜に近位の斜線入りの四角は 、フィブロネクチン・タイプ１区域を表す。ＰＥＣ＾ト１においてＮ結合性炭水 化物績と考えられるものを、（＝）で表す。 好ましい実施例の詳細な説明 上記の基準に照らして、正しくＣＡＭと特定される血小板膜種蛋白が発見された 。この成熟タンパクは、２７個のアミノ酸信号ペプチド配列を欠くけれども、約 １３０キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を持っている。この大きさは、既知の血小 板膜種タンパクのメンバーと同じ範囲にはないけれども、この新しい糖蛋白は、 本発明に関連し、回収可能な量として、入手でき、その形態は、その糖蛋白が、 銀染色５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル上で単一バンドとして移動する、そのようなものと して得ることができる（「はとんど純粋な形」）。できれば、この糖蛋白は、十 分に純粋な形のもので、下記に論するものを含めて、治療等に使用できるものが 望ましい。 本発明の糖蛋白は、血小板・内皮細胞細胞付着分子−１（ＰＩＮｅｌｅｔ／Ｅｎ ｄｏｊｂｅｌｉｓｌ　Ｃｅ１ｌ　＾ｄｈｅ＋ｉｏｏ　ｉｌｏ！ｅｃｕｌｅ−１（ ＰＥＣＡＭ−１））と名付ける。なぜなら、これは、血小板膜、内皮細胞膜の両 方に存在するからである。成熟形では、ＰＥＣＡＭ−１は、７１１個のアミノ酸 配列（ポリペプチド分子量＝　７９．５７８ダルトン）を持つ。この配列を、前 述の信号ペプチドと共に、第１図に示す。 ＰＥＣＡＭ−１は、その分子量の約３９％が炭水化物であるという程度に糖化さ れており、その成熟タンパクは、９個と予想される、アスパラギン結合性糖化部 位を持つ。この部位を、第１図では、黒い三角でマークする。上記部位はすべて 、５７４個のアミノ酸を持つ糖蛋白細胞外区域にある。ＰＥＣＡＭ−１はまた、 １９アミノ酸の膜通過部分と、１１８アミノ酸の細胞質部分を持つ。区域の、こ のような配置（策２図参照）は、細胞膜内におけるＰＥＣＡ１１−１の方向性と 一致する。また、この方向性は、その他の統合性膜糖蛋白にも共通する。 Ｉ’ＥＣＡｌｌ−１をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも、 第１図に示しである。２５５７塩基対（ｂｐ）の配列は〜１４１、ｂｐの、５° 未翻訳（ＵＴ）領域、２０４−ｂ９の開放読み取り領域、これは、成熟タンパク 、及び、信号ペプチドを構成する７３８アミノ酸をコードする領域であるが、お よび、２０２　ｈｐの３’　ＵＴ領領域含む。ＰＥＣＡト１コードニーを含むポ リヌクレオチドを得るには、５’　、３’　ＵＴ領領域配列を用いて、相補性オ リゴヌクレオチド・プライマーを構築するのが望ましい。それによって、ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ないし同様の増幅法を用いて、このＰＥＣＡＭ−１コ 一ド配列を増幅することができるからである。 ＰＥＣ＾トｌは、好中球、単球、骨髄細胞、未熟なリンパ様細胞、骨髄造血細胞 や、白血病、リンパ腫患者から得た細胞の膜にも、血小板や内皮細胞膜と同様、 存在する。実質的に純粋なＰＥＣＡＭ−１は、このタンパクを、上記細胞供給源 から単離することによって、また、後にもつと詳しく論する、通常の遺伝子工学 的技術によって、回収可能量として生産できる。 この意味での「回収可能」量とは、この糖蛋白の単離量は、イムノアッセーのよ うな放射標識よりも、もつと感度の低い方法によっても検出可能であり、このタ ンパク自体を、溶液に移すことを含めて、さらに操作を施すことが可能であるこ とを意味する。できれば、ＰＥＣＡｌｌの回収可能量は、そのタンパクを溶液に 移した場合、少なくとも５０１１１１　％さらに好ましくは、少なくとも　１μ Ｍの濃度となる程度のものであることが望ましい。 天然の供給源から、はぼ純粋なＰＥＣＡＭ−１の、回収可能量を単離するには、 血小板のようなＰＫＣＡＭ−１含有細胞から可溶化膜タンパクを調整し、成熟糖 蛋白を、既知の方法に従って、免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによっ て精製しなければならない。Ｗｉｌｃｈｅｅｋ、ｃｌ　１１．、　Ｍａｉｍ、Ｅ 口ｇａｏ１．　１０４：３　（１９８４）　：ａｎｄ　Ａｕ＋ａｂｓｌ、’　ｅ ｌ　ｘｉ、、（ｅｄ＋、）、ＣＵＲＲＥｌｉＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＩ、Ｓ　ｌＮ１ ＩＧＬＥｃＩｔＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ｆｉｌｅｌ　Ｉｎ１ｅ＋＋ｃｉｅｎｃ＋ 、Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ　（１９８７゜１９８９）の第１０．１１節を参照のこと。 例えば、血小板を、単離、可溶化、遠心し、次に、得られた上溝を、レクチン・ セファローズ・カラム、例えば、コンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）−セファロー ズ・カラムに与える。ＰＥＣＡＭ−１は、ＣｏｎＡ様レクチンには結合し、ない ので、そのようなカラムの通過液を用いて、これを、ＰＥＣＡＭ−１富裕性標本 とすることができる。 さらに精製するために、ＰＥＣＡＭ−１特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ畠） を、セファローズ・カラム（例えば、Ａｏｓｎｂｅｌ上記、箪１０．１６節を参 照のこと）のようなアフィニティー・カラムに付着させ、上記の通過液を、この アフィニティー・カラムに還流し、ＰＥＣＡＭ−１を結合することもできる。Ｐ ＫＣＡＭ−１結合時の、非特異的結合は、カラムのｐＨや、塩濃度を調節して、 減衰させることができる。次に、はぼ純粋なｊＥｃＡＭ−１を、種やかな洗剤を 含む、適当に酸性の溶出バブファー、例えば、ヂギトニン、オクチルグルコシド 、ＣＢＡＰＳまたは、グリシン／トリトンｘ−ｉｏｏを用いてカラムから溶出し 、次に、使用可能量として回収する。 このようにして得られたＰＥＣＡｌｌ−１の純度は、このＰＥＣＡＭ−１標本を 、還元性および非還元性条件下に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に走らせ、そのＰＥＣＡ Ｍ−１が、単一バンドとして移動するかどうかを定めて、定量することができる 。必要なら、溶出したＰＥＣＡＭ−１をさらに別のレクチン・セファロース・カ ラム、例えば、麦芽セファロースに吸着させ、適当な溶出バッファー、例えば、 穏やかな洗剤を含むグリシン・バッファーで溶出し、はぼ純粋なＰＥＣＡＭ−１ を得ることができる。 ＰＥＣＡｌｌの、免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによる精製に用いる のに適当な抗体は、下記にさらに精しく述べるやり方に従って入手できる。また 、次のような発見も行なった。 すなわち、従来、他の目的、例えば、リン１４球や、骨髄腫分化の様々の段階を 区別するのに用いられているある覆のＭＡｂ類を、本発明にしたがって、ＰＥＣ Ａｌｌ−１の免疫アフィニティー精製にも使用することができる。このＭａｂ類 には、Ｍｏ１ｌｅ＋、ｅｊ　ｉｔ、、ｌ。 Ｅｘｐ、　Ｍｓｄ、１７０：　３９９−４１４　（１９８９）の特定した抗ｈｅ ｃ７　；　Ｇｏ７ｅｒｌ。 ｒｌ　ａｔ、、１．　１ｍ１ｕｏｏ１．　１３７＋　３９０９　（１９８６）の 明らかにした５Ｇ１３４　；マａｎ　Ｍｏａｒｉｋ、　ｃｌ　１１．、　Ｉ、　 Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２６Ｇ：　１１３００　ｆ１９８５１の明らかにした Ｃｌ３−［ＩＥＣ７５；　０ｈｔ３　ｅｔ　ａｔ、、Ｂｌｏｏｄ　６６８７３（ ＋９８５）の特定したＴＭ２．　ＴＭ３が含まれる。 免疫アフィニティー・クロマトグラフの別法として、カラム・クロマトグラフィ ーを用いる、従来の糖蛋白精製法を用０て、細胞供給源から、ＰＥＣＡＭ−１を 単離することもできる。Ａｔｕａｂｅｌ上記、１．Ｇ、１２−１０．１５節を参 照のこと。このやり方によるＰＥＣＡｌｌ単離には、イオン交換高圧液体クロマ トグラフィー（）ＩＰＬＣ）　、サイズ排除（ＳＥ）　−１１ＰＬＣ，高性能ク ロマトフオーカブシング、疎水性干渉クロマトグラフィー等を１種以上使用しな ければならない。高性能クロマトフオー力ツシングと、疎水性干渉クロマトグラ フィーが、望ましい単離手段である。なぜなら、このいずれの方法においても、 生物学的活性を持つ、洗剤可溶性の、ＰＥＣＡＭ−１様タンパクを、最小の変性 と高い収量で、急速に精製することができるからである。 第１図のヌクレオチド配列と、成熟ＰＥＣ＾ト１分子（第２図；照）の、細胞外 、膜通過、細胞内各区域（冨２図参照）の知識に基づき、天然に見られる分子の 変種となる、ポリペプチド分子をも生産できる。このようなポリペプチド分子を 、ここでは、一般名として、ｒ　ＰＥＣＡＭ変種」と呼ぶことにし、例えば、Ｐ ＥＣＡＭ−１の各部に対応する、ＰＥＣＡＭ突然変異タン／ぐり質、分子を含め ることにする。 この意味で、ｒ　ＰＥＣＡＭ突然変異タンｄり質」とは、構造の基本的な性質、 すなわち、免疫グロブリン相同ユニットと、ＣＡＭの付着促進作用を保持する、 ＰＥＣＡＭ−１にたいして相同なポリペプチドである。ここでの記述のために、 ２配列間の「相同性」とは、第１配列が、第２配列からの誘導体であることを示 す同一性を欠く、相似性を意味する。特に、あるポリペプチドと、　ＰＥＣＡｌ ｌのアミノ酸配列を比較して、約７０％を越える同−性が明らかならば、そのポ リペプチドは、ＰＥＣ＾ト１にたいしては「相同」である。そのような配列比較 は、既知のアルゴリズム、例えば、Ｌｉｐｍｓｎ　ｌａｄ　ｌ’ｅａｒｓｏｎ、 ５ｃｉＩｃｅ　２２７１１４３５（１９Ｈ１によって記載されたものを用いて実 行できる。このアルゴリズムは、すぐにコンピュータで行なうことができる。 ＰＫＣＡＭ突然変異突然変異タンパ本質明に従って、従来の、部位指向性突然変 位発生法によって生産することができる。この方法は、修飾可能なＰＥＣ＾ト１ 分子の残基を、得られたポリペプチドを生物学的に非活性にすることなしに特定 する、通例の一法である。Ａａ＋ａｂｅｌ上記、第８節参照。オリゴヌクレオチ ド指向性突然変位生成法としては、［ｉｌ所期のヌクレオチド置換体を含む配列 によるオリゴヌクレオチドの合成（突然変位）、［ｉ１］そのヌクレオチドを、 ＰＫＣＡＭ−１をコードする構造配列を含む鋳型にハイブリダイズする、［ｉ　 ｉ　ｉ］　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用い、このオリゴヌクレオチドをプライ マーとして延長する、から成る、そのような方法が好ましいが、それは、特定の 変化が、ＰＥＣＡＭ−１の構造配列に及ぼす作用を定量するのにすぐに用いるこ とができるからである。しかし、その相対的に高い出費は、別の、既知の直接的 突然変位発生法を有利にするかもしれない。 さらに、本発明に含まれるもので、ＰＥＣＡＩＩ変種の例となるものとしては、 ＰＥＣＡＭ−１の一部に一致する分子、または、ＰＥＣＡＭ−１の一部を含むが 、天然分子とは一致せず、しかも、上記のように、ＣＡＭの付着促進作用を持つ 分子がある。この上うな変覆の中には、膜通過部分、細胞内部分を持たない、Ｐ ＥＣ＾ト１の細胞外区域に相当する、すなわち、ＰＥＣＡｌ！−１の「可溶性レ セプター」の形の、アミノ酸配列を含むポリペプチドがある。 本発明の、他のＰＥＣＡＭ変種としては、ＣＡＭ様付着促進作用を保持する、Ｐ ＥＣ＾トｌのフラグメントがある。同様に、本発明の範囲内にあるものとして、 （ｉ　）　ＰｆｆＣＡＭ−１アミノ酸配列の一部に一致し、（ｉ　ｉ　）　ＰＥ ＣＡＭ−１の作用特性を保持する、合成ポリペプチドがある。このような合成ポ リペプチドは、できれば、４から１００アミノ酸長であることが望ましい。 基準（ｉ）を満たす合成ポリペプチドがまた、基準（ｆ　ｔ）を満たすかどうか は、ＰＥＣ＾ト１活性定量法によって、通常のやり方で決めることができる。そ のような二つの活性として、それぞれ、ある化学的牽引勧賞（化学的指向性）に たいする細胞の、付着依存性の運動仲介作用、内皮細胞の、細胞対細胞付着仲介 作用がある。前者の活動は、０ｈ）ｏ、ｅｔａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、　６６ｇ７ ３−８１　（ｌＨ５）に倣えば、問題の合成ポリペプチドに結合する抗体はまた 、適当な刺激勧賞、例えば、ε、　ｃｏｌｉエンドトキシンにたいする、好中球 や半球の化学的指向性を抑制するかどうかを調べることによって定量できる。内 皮細胞間の付着性を仲介する作用も同様にして、通常のやり方で定量することが できる。すなわち、ポリペプチド認識性抗体は、拡散内皮細胞が、適当り基質へ の沈着するのを、および慟または、その後、細胞間接合を形成するのを、抑制す るかどうかをテストして見ればよい。 ＰＥＣＡｌ！変種は、既知の、斬新合成法や、ＰＥＣＡＭ−１分子自体のフラグ メント化によっても生産することができるし、もちろん、宿主形質転換に用いら れる異種ポリヌクレオチドによってコードされる　ＰＥＣＡＭフラグメントを発 現する、遺伝子工学製宿主細胞を生産することによっても可能である。ＰＥＣＡ Ｍ−１ないしＰＥＣＡ１１変種の組み換え発現に用いるためには、ＰＥＣＡＭ− １ないし！’ＥＣＡＭ変種をコードするポリヌクレオチド分子はできれば、所期 のアミノ酸配列に相当する、ヌクレオチド配列を含んでいることが望ましい。こ のような配列は、コドンの利用、翻訳の開始、最適な糖化、商業的に有効な量の ＰＫＣＡＭ−１ないし所期のＰＥＣＡＩＩ変種の発現、という点で、選んだ宿主 にとって（下記参照）最適なものになるからである。また、選んだ宿主生物を、 そのようなポリヌクレオチド分子で形質転換するために選択したベクターは、そ のポリペプチドをコードする配列を、効率的に維持、転写するものでなければな らない。 本発明に関連して、一般に形質転換用に入手可能であって、宿主として好ましい ものは、第１図に特定した部位で糖化を実行できる真核細胞である。この真核細 胞としては、酵母発現系が例示でき、この中には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ７ｅｅ＋ 　、Ｐｉｅｈｉａ　。 ＫＩＢｖｅｒｏｍｙｅｅ＋の種を用いるものが含まれる。例えば、アメリカ特許 ４，４５６．０８２．４．８３７．Ｂ７　（Ｓｇｅｃｈａ＋ａｍ７ｅｅｍ　）　 、アメリカ特許４，８５５．２３Ｌ　４，８０８，５３７．４．８５７．４６７ 　（Ｐｉｃｈｉｇ）　、アメリカ特許４．８０６．４７２．４，８５９，５９６ 　（Ｈｕ７ｙｅｒｏＩＩＹｃｅｔ　）を参照されたい。 形質転換用に適当な酵母種を選ぶ場合、結論は、大部分、用いるベクターの、選 択可能なマーカー（単数または複数）や、その他の性賀で決まる。さらに、医療 用の候補として挙げられる、組み換えＰＲＣＡＭ分子は、その分子を糖化する宿 主関連性炭水化物半量体にたいしてアレルギー性反応を引き起こすかも知れない ので、糖化の低い、異種ＰＥＣＡＩＩ蛋白を生産できる能力の冑無を見て、宿主 を選択するのが有利であろう。そのようなＰＥＣＡＭ産生宿主細胞を一旦選んだ ならば、特定のクローンをスクリーニングし、医療用にもっともふされしい糖化 パターンの変種をめて選択する。本発明にしたがって使用するのにふされしいも のの例となる酵母種は、！２１８１−１１種で、遺伝子型がα１ｒｐｉ　ｇａｌ ｌ　ｘｄｅｌ　ｂ目２（酵母遺伝品種保存センター、バークレー、カリフォルニ ア州より入手可能）　；　ＡＴＣＣ５２６１１３種で、遺伝子型が、ａ　ｈｉ＋ ２　ｘｄｅｌ　ｊｒｐｌ　ｍ５ｔ１４　＊ｒｓ　３　（ｉｋａ種’１１？’で、 アメリカタイプカルチャアコレクシラン、ロックビル、メリーランド州より入手 可能）　、　ＡＴＣＣ４６１８３種で、遺伝子型がα　ｈ目ｌ１ｒｐｌ　ｉｋａ 　’　ｆＬＩ６６−５８’櫂で、これも、アメリカタイプｈ　ルチ＋アコレクシ ランで入手可能）。 もう一つの好ましい表現系では、本発明に含まれるポリヌクレオチドによって形 質転換した、は乳類宿主細胞の使用を必要とする。この目的のために用いること のできる、適当なは乳類細胞宿主の内の典型的なものとしては、Ｕｒｌａｂｕｂ 　＆　Ｃｈｉ＋ｉｏ。 Ｐｒｏｃ、　Ｎ＊ｌ’ｌ　Ａｃｇｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　？７：　４２１６ 　（１９８Ｇ）の記載した、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；／ Ｘムスター幼児腎臓細胞（ＢＨＫ）で、例示すれば、入手番号ＡＴＣＣＣＣＬ　 １０の下に保存されている系統と、もう−系ＡＴＣＣＣＣＬ　７Ｇであり；サル 腎臓ＣＶＩ細胞を、５Ｖ４Ｇで形質転換したもので、例示すれば、入手番号＾Ｔ ＣＣＣＲＬ　１６５１　（ｉｋｘ　’ＣＯ３−７’）の下に保存されている一系 統であり；ヒト胎児腎臓細胞で、Ｇ＋ｔｈ＊ｍ　ｃｌ　ｘｉ、、Ｊ、　Ｇｅｍ。 Ｙｉｒｏｌ、３６＋　５９　（１９７７）の記載する細胞系統で表されるものと 同種であり；マウス・セルトリ細胞で、Ｍｉｊｈｅｒ、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｔｏ ｄ。 ２３＋　２４３−５１　（１９８０）の記載しているもの；アフリカ緑サル腎臓 細胞で、例示すれば、ＡＴＣＣＣＲＬ　１５ｇ？系統（ａｋｓ　’　ＹＥＲＯ− ７６’　）であるもの；ヒト頚部癌（ＨεＬＡ）細胞（例えば、ＡＴＣＣＣＣＬ 　２系統を参照のこと）；イヌ腎臓細胞で、ＡＴＣＣ３４（ｘｋｘ　’ＭＤＣＫ ’）の下に保存されているものと同種のもの；バッファロー・ラット肝臓細胞テ あッテ、例示すれば、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２　（ａｋｓ　’ＢＩＩＬ３Ａ′ ）系統であり；ヒト肺細胞で、ＡＴＣＣＣＣＬ　７５　（ｌｋ暑’１１３ｇ’） 系統で表されるもの；ヒト肝臓細胞（例えば、Ｂｅｐ　Ｇ２．　Ｈａ　８０６５ を参照のこと）；マウス乳腺膿瘍細胞で、ＡＴＣＣＣＣＬ　５１　（ｉｋｘ　’ ＭＩＩＴ　Ｇ６０５６２″）の下に保存されているものと同種のもの：および、 ＴＲ，Ｉ細胞であって、Ｍａｌｈｅ＋、ｅｔ　１１．、＾ａｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａ ｃ１ｄ、Ｓｃｉ、　３８３：　４４　ｆ１９ｇ２１　の記載しているようなもの 、がある。 酵母、は乳類発現系のいずれにおいても、本発明に関連して用いることのできる 、通例的な形質転換法、スクリーニング用プロトコルがある。この点での標準法 は、Ｃ［ＩＩＲＥＮＴ　ＰＲＯτ０ＣＯＬＳＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬ ＯＧＹ、第９章（は乳類細胞）、および、第１３章（酵母細胞）上記に詳細に述 べられている。例えば、形質転換因子は、機能的ＰＥＣＡＭ−１ないしＩ’ＥＣ Ａ１１変種の発現を目標に、適当なＰＥＣＡＭ特異性を示すＭＡｂ類を用いて選 択することができる。これについては前述した通りである。 本発明のポリヌクレオチドを、酵母細胞に導入するのに、もっとも一般的に用い られるプロトコルは、酢酸リチウム法であって、これは、アルカリ陽イオンは、 酵母細胞膜を、ＤＮＡにたいして通過可能なものとし、さらに、外来ＤＮＡの摂 取は、高分子量分子、ポリエチレングリコール溶液中で促進される、という事実 を利用する。別法として、スフ二ロプラスト形質転換法があるが、これは、用い ることができ、酢酸リチウム法よりも時間がかかるが、ＤＮＡ当り、より高効率 の形質転換をもたらす。 本発明のポリヌクレオチドをは乳類細胞に導入し、ＰＥＣＡＭ−１ないし　ＰＥ ＣＡＭ変種を発現する組み換え細胞を生産するのであるが、これは、燐酸カルシ ウム、または、［）ＥＡＥ−デキストラン争トランスフェクシコンのような、通 常の方法によって実行することができる。例えば、Ａａｓｉｂｅｌ上記、第９章 参照。本発明の、このような組み換え細胞の発現は、Ｐｌ：ＣＡＭ−１，ＰＥＣ ＡＭ変覆の、回収可能量を提供する。 下に論するように、ＰＥＣＡＭ−１は少なくとも免疫学的には、’ＣＤ３１’と 名付けられた抗原に関連する。この抗原の性質は、血清学的に、Ｌｅｅ、ｅ）　 １１．、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｔ　１６Ｂ：　１１９３−９１１９Ｈによって 明らかにされたが、回収可能な量としては与えられていない。ＣＤ３１は、各種 白血病において様々な発現を示すが、そのため、白血病の種類のインディケータ として用いることができる。同様に、ＰＥＣＡＭ−１も、白血病のインディケー タとして有用であり、標識オリゴヌクレオチド−プローブ（ｒＰＥｃＡＭプロー ブ」）を、ＰＥＣＡＭ−１ないしＰＫＣＡＭ変種をコードするポリヌクレオチド に基づいて、指定することも可能であり、これは、各種白血病の状態を分類する のに用いることができるであろう。 この種の　ＰＥＣＡＭプローブは、ＰＥＣＡＭ−１またはｐＥｃＡＭ変種をコ− ドするポリヌクレオチドにたいして相補的なオリゴヌクレオチドの７ラグメント であってもよい。別法として、合成オリゴヌクレオチドをＰεＣＡＭプローブと して使用することもできる。 このプローブは、できれば、少なくとも、約１０ヌクレオチド長であることが望 ましい。これは、ＰＥＣＡト１またはＰＥＣＡＭ変種をコードするポリヌクレオ チドにたいして特異的であるためである。核酸を、患者の血液、または、バイオ プシー組織から単離し、ＰＫＣＡＭプローブにたいしてハイブリダイズさせて分 析することもできる。このようなプローブは、できれば、高度に厳重な（ｓｔｒ ｔｏｇｅａｃ７）条件下に、すなわち、ハイブリダイゼーシツンと洗浄条件が（ バッファーのイオン強度、温度、持続時間など）、プローブの非特異的結合を最 小なものとする、そのような条件下に、ＰＥＣＡＭ−１をコードするヌクレオチ ドとハイブリダイズすることが望ましい。プローブの設計、ハイブリダイゼーシ タン法、厳重条件に関しては、Ａｏ＋ｗｂｅｌ上記、６．３．６．４節を参照さ れたい。プローブの設計、検出に関する、その他の方法、例えば、Ｌ１ａｄｇ＋ ｅａ、ｃｌ　ｔｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：　１０７７−８Ｇ　Ｆ１９８ ８）の明示した、リガーゼ仲介遺伝子検出法（ＬＭＧ［））、Ｗａｌｌ、ｅｊ　 ｓｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎｚｌ’ｌ　Ａｃｔｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：　８７９０ −９４（１９８８１の明示した、蛍光共鳴エネルギー伝達法（ＦｌεＴ）も用い ることができる。 ＰＥＣＡＭ−１はまた、好中球による化学的指向性や、内皮細胞の細胞間接合に 働いていると考えられている。［’ＥＣ＾ト１またはＰＥＣＡＭ変種、特に、前 記の可溶性レセプター形態は、血管起源の過程を修飾するのに有効であり、しか も、そのような過程は、例えば、腫瘍の成長時、好中球の化学的指向性、および ・または、内皮細胞間の接合部の形成に影響される。 同様にして、いわゆる「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを、（ａ）　ＰＥＣ ＾ト１またはｌ’ＥｃＡＭ変種をコードするＤＮＡを含むヌクレオチド配列にな いする相補的なポリヌクレオチドとして、または、（ｂ　）　ＰＥＣＡＭ−１ま たはＰＥＣＡＭ変種のメツセンジャー　ＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）を含むヌクレオ チド配列として、調整することができる。いずれの型においても、本発明の、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、プロモーター配列（ＤＮＡにたいして ）や、５ｂｉｌｌｅ−［１５１ｇ！＋ｎｏ部位（ＲＮＡにたいして）が存在しな い限り、重大なものとはならない。タイプ（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチ ドは、析たに、例えば、第１図に示したｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列に関 する知識に基づき合成することができよう。タイプ（ｂ）アンチセンスヌクレオ チドも、新たに（ＤＮＡまたはＲＮＡ）　、または、適当な宿主生物を、ること ができよう。このＲＮＡは、ＰＥＣＡＭ−１またはＰＥＣＡ１１変種１ＲＮＡを 結合する、そのようなＲＮＡである。本発明の範囲内にある、タイプ（ａ）、タ イプ（ｂ）の両オリゴヌクレオチドは共に、細胞表面におけるＰＥＣＡＭ−１の 発現を「下方制御」する（スイッチ・オフする）、即ち、転写（タイプ（ａ）） ないし翻訳（タイプ（ｂ））を抑制する、仲介物として有効であることが期待さ れる。 ＰＥＣＡＭ−１およびＰＥＣＡＭ変種、または、このポリペプチドの１覆以上に たいする抗体は、転移性の疾、！の予防に有効であることが期待される。この使 用法において、「抗体」という用語は、モノクローナル、ポリクローナル抗体全 体を指す。そのような抗体は、いずれの抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡな ど）に属していてもよい。モノクローナル抗体（Ｌｂ　）生産には、一般に、リ ンパ球を単離し、それを骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを作る。次に、こ のクローンされたハイブリドーマを、「抗ＰＥＣＡＭＪ抗体、すなわち、ＰＥＣ ＡＭ−１（全長ないし成熟形）またはＰＥＣＡＭ変種のどちらかに好んで結合す る抗体であるが、そのような抗体生産の冑無についてスクリーニングを行なう。 「抗体」はまた、Ｆｇｂや、Ｆ　（＊ｂ’　）　２のような、抗ＰＥＣＡＭ抗体 のフラグメント、そのようなフラグメントの複合体、および、抗ＰＥＣＡＭ抗体 に基づく、いわゆる「抗原結合タンパク」　（単一鎖抗体）をも含む。これは、 例えば、アメリカ特許４．７６４．６９２に一致する。 別法として、本発明の範囲に含まれる、Ｍａ　ｂｉｌｌ、または、そのフラグメ ントは、そのようなＭａｂの各種領域をコードする単１１ＤＮＡを、宿主細胞に 発現させるというやり方の、従来の方法を用いて生産することができる。宿主細 胞が、Ｅ、ｃｏｌｉであれば、Ｗ畠＋ｄ、ｅｊ　ｔｌ、、ｌＩｓ＋ａｒｅ　３４ １：　５４４−４６　（１９８９）を参照のこと；トランスフェクトしたマウス 骨髄細胞の場合には、Ｇ１１ｌｉｅ＋、ｅｒ　ａｌ、、Ｂｉｏｊｅｃｈａｏｌ、 ７：　７９９−８０４　（１９８９）、５ａｄＮｒｋｘｔｓｎｉ、ｅｒ　＊１． 、　上記、８０５−１ｔｌを参照のこと。さらに、Ｆａｂ分子は、Ｅ、ｃｏｌｉ のような遺伝子的に形質転換された宿主において、発現、集合させることができ る。ラムダ・ベクター系も入手可能であるから、これにより、前駆抗体を発生し た対象の多様性以上の多様性を持つ可能性を秘めたＦａｂ集団を発現することが できる。　Ｈｗｓｅ、　ｒｔ　ｉｔ、、５ｃｉｅＱｃｅ　２４６＋　１２７５− ８１（１９８Ｈを参照のこと。 ＰＥＣ＾ト１またはＰＥＣＡＭ変種にたいする抗体は、また、従来の方法を用い て、抗自己型抗体（抗ＰＥＣＡＭ抗体を結合する抗体）の生産に用いることもで きる。これは、例えば、前述のハイブリドーマを用いて実行することができる。 例えば、アメリカ特許４．６９９．　ＮＯを参照のこと。このような抗自己型抗 体は、ある個人の抗ＰＥＣＡＭ抗体を隔離するのに用いることができる。これに よつて、ＰＥＣ＾ト１が、その個人の免疫系によって「異物」と認識されること によって生ずる免疫反応に関連する病理現象を治療ないし予防することができる 。 本発明について、下記の、例示的な実施例を参照することによってさらに説明を 加える。 タンパクにたいする多特異性を持つポリクローナル抗体の生産。 ヒト血小板統合膜タンパク富裕な溶解産物を、ＮｅｗＩｎ、　ｅｔａｔ、、Ｔｈ ｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ＋、２７：　２２１−２４　（１９８２）　に従って調 整し、この溶解産物に対抗する、多特異性ポリクローナル抗体を、Ｎｅｖｉｘｎ 、　ｅｔ　＊１．、１．　Ｃｓ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１１３：　８１−８６　（ １９８６）に倣って調整した。このようにして、血小板濃縮液を、ヒト全血のユ ニットを差動遠心して得、血小板膜を、この濃縮液から、超音波処理と、差動遠 心によって調整した。Ｎｅｗｔｏｎ、ｅＩＩｌ、、Ｊ。 Ｃｅ１ｌ　［１ｉｏ１．　９Ｇ＋　２４９−５３　（１９８１）を参照のこと。 血小板濃縮液１ユニツトは、５−８ｌｇのタンパクを含む、膜ペレットをもたら シタ。コノヘレットヲ、１％トリトンｌ−１１４（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｓｉｃｘ ｌＣｏｍｐｘｎ７．　セントルイス、マサチューセッツ州）２１１中に溶解した 。このトリトン　！−１１４液は、０．４℃Ｍフェニルメチルスルフォニル・フ ルオリドと　５ｉｉｉ　ＥＤＴ＾をプロテアーゼ抑制因子として含む、１ｈｌＪ 　トリスと　１５０ｓｌｌ　ＮｉＣｌ　（ｐＨｙ、　４）に溶解したものである 。膜集合体を拡散するために、手短に超音波処理した後に、氷上で６０分間、可 溶化を実行した。 次に、このトリトン可溶化膜を、１００．ＨＯｘｇで６０分間遠心し、上清２０ ０μＩを、１ｍｌのポリスチレンのフィッシャー遠心管（フィッシャー・モデル ５９、ミクロ遠心管）の、６％蔗糖クッション３００μｍの頂上に塗布した。こ の管を、３７℃で５分間インキュベートして、洗剤の濁点以上に温め、次に、１ ５００！ｇで５分間遠心し、大きな、タンパク洗剤混合ミセル集合体のベレット を形成した。蔗糖クッションの頂上に残った水層は取り出し、０℃に冷やし、水 冷トリトン　ｌ−１１４を加えて、最終濃度１％まで、再抽出した。この溶液を 再び温め、先の６％蔗糖クりシ目ンの頂上に戻し、上記のように遠心した。洗剤 層は、蔗糖クッシ３ンの下に、黄色の、油状の液滴として回収された。 洗剤層、水層のいずれも、最初に、タンパク濃度（３）について定量し、次に、 ＳＤＳ可溶化液（４％ＳＤＳ、１００ａ＋１１　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。 ｐＨ６，８，１０％グリセロール、ｏ、ｏｏｉ％ブロモフェノール・ブルー）で 、１：１に希釈し、それから、５ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳導によ る分析を行なった。還元標本については、２−メルカプトエタノールを、最終濃 度が５％になるように加えた。標本を５分間蕉沸した後、１ウェル当り　５−５ ０μｇのタンパクを、７％ＳＤＳポリアクリルアミド固相ゲルに塗布し、３０ｍ Ａで約３時間電気泳導した。電気泳導後、ゲルを固定し、Ｍｅｒｒｉｌ、ｅｔ　 １１．、５ｃｉｅｎｃｅ　２１１＋　１４３７−３８　（１９８１）の方法に従 って、銀染色した。 ポリクローナル抗血清は、ウサギに、１力月に２回、上記の富裕溶解産物を陵内 に注射して調整した。精製ｒｇＧは、硫化アンモニウム分画と、ＤＥＡＥセルロ ース−クロマトグラフィーの、通常の併用法により得た。得られた調整品の特異 性は、既知の方法により、放射性ヨー素標識、可溶化血小板の免疫沈澱法、交差 免疫電気泳導対可溶化全体血小板、ウェスタン・プロット分析によって確認した 。ムｗｓｕｂｅｌ上記、１０節参照のこと。 実施例２ｃＤＮＡライブラリーの抗体スクリーニングを行い、ＰＥＣ＾トｌコー ドニーローンを選び出すこと、ならびに、ＰＥＣＡＭ−１特異的抗体のエピトー プ選択 このようにして調整したポリクローナル抗血清を用い、内皮細胞・肺癌ハイブリ ッド細胞恒久系統ＥＡ’　ｈｒ　２９６から調整した、ｃＤＮＡ　λ　ｇｔ１１ 発現ライブラリーをスクリーニングした。この系統については、Ｅｄｇｅｌ、　 ｅｊ　＊１．、　Ｐｔｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃ５ｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　８１１＋　３７３４　（１！１８３）が記載している。特に、抗体陽性 クローンの素性は、「エピトープ選択法」を用いて決めた。この方法は、例えば 、［１１１１，ｅｊ　＊１．、ｌｌｔ＋ｕ＋ｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１１：　 ３７９　（１９８４）が開示している。そこにおいては、プラーク精製、抗体陽 性クローンから得た、固定βガラクトシダーゼ融合タンパクを用いて、多特異的 抗血清から、各融合タンパクによってコードされる特異的エピトープに結合する ことのできる抗体を選択した。 この方法により、２種のクローン、８Ｂ、８Ｃが特定された。 これらは、免疫プロットにおいて、単一の、１３（１−ｋｄ血小板タンパクと反 応する選ばれた抗体を備えていた。同じ分子量範囲の、既知の、血小板膜蛋白か ら、Ｎｏ−ｋｄ膜タンパク分離するために、二次元非還元・還元ゲル電気法部を 用いた。これにより、クローン８Ｂ、８Ｃのコードするタンパクの正確な特性を 調べた。 さらに具体的に言うと、１．６ｋｂ挿入体を含む、λ　ｇａｌｌバクテリオファ ージ・クローン８Ｂを、Ｅ、　ｃｏｌｉ株１０９Ｇ培地で、約５．ＧＯＧ　ｐｆ ｕ／プレートの密度まで育成し、イソプロピルチオガラクトシドによって、その βガラクトシダーゼ融合タンパクの発現を誘発した。このプレートに、１５０ａ ｍニトロセルロース円を３時間上層し、誘発ファージタンパクを吸着した。未結 合部位をゼラチンでブロックした後、このニトロセルロース膜を、ヒト血小板統 合膜タンパクに対抗するポリクローナル・ウサギ抗血清によってインキュベート した。すなわち、これによって、発現エピトープにたいして特異的な抗体集団が 、固定融合タンパクに特異的に結合することが可能になる。十分に洗浄した後、 エピトープ選択抗体、ＥＢＢを、膜から、ｐＨ２，３グリシン−ＨＣｌで溶出し 、Ｔ＋口塩基で中和し、全血小板溶解産物のウェスタン・プロットと反応させ、 １３ｆｌ　ｋｄ血小板タンパクを表す、−意のタンパク・スポットにたいする抗 体の特異性を証明した。結合は、アルカリ・フォスファターゼ複合の第２抗体処 理後、さらに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル燐酸／ニトロ青テトラ ゾリウム塩基質ベアによって視覚化した・実施例ａ　ＰＥＣＡＭ−１の性質、エ ピトープ選択性抗体による結合クローン８Ｂから得た、このエピトープ選択性抗 体は、このように、ウェスタン・プロットにおいて、ＰＥＣＡＭ−１と単一タン パク・スポットとして反応した。このスポットは、ＧＰＩｉ。 ＧＰＩｌａ、　ＧＰＩＩｂ、　ＧＰＩＩｌｌを含む、他の血小板膜蛋白とは別物 であった。このようにして区別されたタンパク、これがＰＥＣＡＭ−１であるが 、これは、電気法部下の移動が還元剤の影響を受けないタンパク類によって形成 される対角線よりやや上を移動した。 このことから、この単離タンパクは、鎖内にジスルフィド結合を持つ、単−級タ ンパクであることが分かる。 ＰＥＣＡｌｌに適用される、各種の生化学的基準は、このタンパクが、高度に糖 化した、大きな表面膜の糖蛋白であるという所見に一致していた。したがって、 無傷の血小板を、トリプシン、ニューラミニダーゼ、Ｎ−グリカナーゼで処理す ると、単離ＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドの分子量は激減した。これは、その処理 後、洗浄し、洗剤溶解した血小板について、ウェスタン・プロット法測定で明ら かにした。このように、分子量が低下したことは、ＰＥＣＡＭｉの糖化が際だっ ていること、そのタンパク部分は、露出アミノ酸配列を含んでおり、これが、ト リプシンの加水分解にたいし感受性を持つことを示していた。ＰＥＣＡＭ−１は 、未処理血小板を、炭水化物特異的標識である、過ヨウ素酸塩／水素化　［３１ ＋１　ホウ素ナトリウムで処理することによって効率よく標識されたが、ラクト パーオキシダーゼ触媒作用による、表ｆ放射ヨウ素化ではそれほどではなかった 。異なる、いくつかの、性質の明らかにされた血小板膜蛋白類にたいし、抗体プ ローブを用い、ウェスタン・プロットによって、半定量的比較分析を行なったと ころ、ＰＥＣＡｌｌ−１は、主要な膜タンパクであることが明らかになった。　 ＰＫＣＡＭ−１は、クマツシー青でごく僅かしか染まらないということが、従来 、このものが単離されず、その特性も明らかにされなかった原因であろう。 大きさやｐＩ（で、ＰＥＣＡＭ−１と相似の、血小板・内皮細胞表面糖蛋白にた いして従来対抗的に育成されてきた、一連のモノクローナル抗体について、それ らが、ＰＲＣＡＭ−１分子と反応できるかどうかをテストした。これらモノクロ ーナル抗体の内の２種、抗−ＣＤ３１．抗−ｈｅｃ７が、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル において、　ＰＥＣＡ１１−１と同調移動するある血小板タンパクと反応した。 前述したように、ＣＤ３１は、その構造・機能不明の、白血球差別用抗原であり 、これは、ヒト血小板、内皮細胞、顆粒細胞、単球にある（しかし、回収可能な 量としては得られていない）と報告されているものである。　ｌ：ｎａｐｐ、ａ ｔ　ｉｆ。、Ｉｓａｎｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏａｘ７１０：　２５３　（１９０）を 参照のこと。ｈｅｃ７抗原は、これも回収可能な量として単離されていないが、 これは、ヒト内皮細胞の細胞間接合部に局在すると報告されている。Ｍａｅｔｌ ｅｒ、　ｅ＋　ｔｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｊ、１７０：　３９９ｂｅｃｋ 、　、ＣＤ３１抗原を含む標本は、それぞれのモノクローナル抗体を含む免疫沈 降法により、ヒト内皮細胞溶解産物から調整される。（ＭＡｂ類は、Ｗｉｌｌｉ ｘａ＾、Ｗ１１ｅｒ博士（ロックフェラー大学）　、５ｉｎＱｓ　Ｍ、　Ｇｏ７ ｅｒｊ博士（ニーネル大学）の供与を受けた）。この標本を、抗−ＰＥＣＡＭ抗 血清による免疫プロットで分析したところ、ＰＥＣＡＭ−１，ＣＩＩＮ抗原、ｂ ｅｒ７抗原は、少なくとも免疫学的には関連していることが判明した。 実施例４　ＰＥＣＡ１１−１をコードするヌクレオチド配列の決定クローン８Ｂ からの　１．６ｋｂ　ｃＤＮＡ挿入体を、ｐＵＣ−１８由来プラスミド・ベクタ ー、ＤＴＨａｒ中にサブクローンした。次に、この８Ｂ挿入体を、既知の方法に より、プローブとして用いた。これは、例えば、Ａａｓａｈａｌ上記、６．３節 に開示されている通りである。これによって、さらに、２３個のクローンを特定 し、次に、これを、既知の方法に従って、制限マツピングとハイブリダイゼーシ タン分析により、その特性を明らかにした。このクローンの内二つ、　６−４　 （第１図の、ヌクレオチド１からヌクレオチド１１７０に延びている）と６−２ （ヌクレオチド７１５からヌクレオチド２５５７まで）が、ｊｌ！１図に示す、 ＰＥＣＡＭ−１コ一ド配列全体と重複し、かつ、それを含むことが判明した。 前述したように、２５５７−ｈｐ　ＰＥＣ＾ト１配列は、成熟タンパク＋信号ペ プチドにたいする　２２＋４−ｂｐコニー配列の他に、１４１−ｂ９５゜未翻訳 ＣＵＴ）領域と、２Ｇ２　ｂｐの３’　ＵＴ領領域含む。この５’　ＵＴＭ域は 、２個の、真核細胞性配給（ＡＵＧ　）コドンを含み、それは、それぞれ、塩基 ９５、ヌクレオチド１４２から始まる。このコドンのいずれも、その両端は、「 コザック配列」を構成するヌクレオチドで占められている。この配列は、はとん ど、Ｔ残基を持たず、また、−３位置にプリンを持っているために、タンパク合 成の配給部を容れることになる。Ｋｏｇｘｋ。 ｅｊ　ａｌ、、　Ｎ１ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓ＋、１５：　８１５２　（ １９８７１を参照のこと。 コザック配列の中にある、多くの、上流配給コドンの場合と同様、ＰＥＣＡ１１ −１コ一ド中ヌクレオチド配列の、塩基９５のＡＴＧでは、その後に、わずか１ ５塩基下流に、ＴＡＡ停止コドンが続く。この配置から、翻訳は、１５−Ｍの「 ミニシストロン」にたいして実行され、すぐに止み、その後は、リポソームが、 塩基１４２で翻訳を再開し、塩基２３５Ｇの停止コドンに至るまで続けるようで ある。 実施例５　天然供給源からのＰＥＣＡＭ−１の精製はぼ純粋な　ＰＥＣＡＭ−１ の回収可能量を、下記のようにして、血小板から単離した。血小板は、通例の操 作に従って、差動遠心法により、全血液から単離した。血小板を、Ｔ　Ｂ　Ｓ　 （２０ｍＭＴＲＩＳ、１５０１Ｍ　ＩＩｔＣｌ、　ｔａｌｌ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ ７，４）中で数回洗浄し、次に、１％Ｔｒｉｔｏｎ　！−１００と　ＩＩＭ　Ｃ ｌＣ１２を含むＴＢＳ中で、プロテアーゼ抑制剤（０，４ｍＭフェニルメチルス ルフォニル・クロリド、１０μｍロイペプチン〕の存在下に可溶化した。次に、 この混合液を、１５．０ＧＯｇで、３０分遠心して、澄明にし、上溝を、コンコ ナビリンＡセファローズのカラムに加え、無用の糖蛋白をすべて除去した。この カラムからの流通液を、ＰＥＣ＾トｌにたいして特異的な免疫アフィニティー・ カラムに与えた。この時、抗−ｈｅｃ７抗体を、セファロース・カラムに付着さ せた。次に、ＰＥＣ＾ト１を、ｐ１１１！、４で、ＩＧＯｍｉｌグリシン／ＨＣ Ｉと　０．１％Ｔ＋１ｔａａ　Ｘ−１００を含む溶液の短持続パルスによって溶 出した。この溶出液を、ＴＲｌ５塩基で中和し、５ｔ）Ｓ−ＰＡＧＥで分析して 、その純度を確定した。さらに精製することが必要であるならば、溶出液を、麦 芽セファローズ・カラムに吸着させ、ＧＪＭＮ−アセチルクルコサミンによって 溶出した。このようにして、ＰＥＣＡＭ−１が、還元性、非還元性Ｓ［１Ｓ−Ｐ ＡＧＥゲルのいずれにおいても単一バンドとして移動する標本において、回収可 能な量として得られた。 く の Ｃ 一 ■ ！ Ｆ！Ｇ、２ 要　約 糖蛋白ＰＥＣ＾ト１とその変種は、形賀転換宿主細胞における、その糖蛋白また は、変種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現によって、入手する ことができる。ＰＲＣＡＭ−１はまた、細胞性供給源から単離することもできる 。ＰＥＣＡｌｌまたは、ＰＥＣＡｌｌ−１変種にたいして特異的な抗体は、組み 換え法によって生産するか、または、ハイブリドーマから入手することができる 。 補正音の写しくＩ！訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年７月２０日 国

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．回収可能量のＰＥＣＡＭ−１を含む組成物。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の組成物であって、上記組成物が実質的に純粋な形 でのＰＥＣＡＭ−１である組成物。
3. ３．請求の範囲第１項に記載の組成物であって、上記組成物が、少なくとも約５ ０ｎＭの濃度のＰＥＣＡＭ−１の水溶液である組成物。
4. ４．請求の範囲第１項に記載の組成物であって、上記ＰＥＣＡＭ−１が成熟ＰＥ ＣＡＭ−１である組成物。
5. ５．ＰＥＣＡＭ突然変異タンパク質及びＰＥＣＡＭ−１の一部に相当する分子、 または、ＰＥＣＡＭ−１と一致はしないがＰＥＣＡＭ−１の一部を含む分子から 成るグループから選ばれたＰＥＣＡＭ変種で、ここに、上記分子は付着促進作用 を示す該変種。
6. ６．請求の範囲第５項に記載のＰＥＣＡＭ変種であって、上記変種は、ＰＥＣＡ Ｍ−１の細胞外部分に相当する、または、それを含むが、ＰＥＣＡＭ−１の膜通 過部分ないし細胞内部分は含まない該変種。
7. ７．請求の範囲第６項に記載のＰＥＣＡＭ変種であって、上記の細胞外部分が、 Ｎ末端Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｔ−Ｐｈｅを含む該変種。
8. ８．請求の範囲毎７項に記載のＰＥＣＡＭ変種であって、上記の細胞外部分が、 ５７４残基のアミノ酸配列を持つ該変種。
9. ９．請求の範囲第８項に記載のＰＥＣＡＭ変種であって、上記の細胞外部分が、 第１図のアミノ酸１−５７４に相当するアミノ酸配列を持つ該変種。
10. １０．請求の範囲第５項に記載のＰＥＣＡＭ変種であって、上記変種がＰＥＣＡ Ｍ突然変異タンパク質である該変種。
11. １１．請求の範囲第１０項に記載のせぃそちも変種であって、上記突然変異タン パク質がＮ末端Ｇｌｎ−Ｇｌｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む該変種。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載のＰＥＣＡＭ変種であって、上記突然変異タン パク質が５７４残基のアミノ酸配列を持つ該変種。
13. １３．ＰＥＣＡＭ−１アミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列を持つポリペプチ ド分子であって、上記ポリペプチド分子は、（ａ）上記ＰＥＣＡＭ−１アミノ酸 配列とは一致せず、かつ（ｂ）ＰＥＣＡＭ−１作用を持つ該分子。
14. １４．請求の範囲第１３項に記載のポリペプチド分子であって、上記アミノ酸配 列は、４から１００アミノ酸残基長である該分子。
15. １５．ＰＥＣＡＭ−１をコードする単離ポリヌクレオチド分子。
16. １６．ＰＥＣＡＭ変種をコードするポリヌクレオチド分子。
17. １７．請求の範囲第１６項に記載のポリヌクレオチド分子であって、上記ＰＥＣ ＡＭ変種は、ＰＥＣＡＭ−１の可溶性レセプター形態である該分子。
18. １８．Ｎ来端Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅをつタ ンパクをコードするポリヌクレオチド分子で、第１図に示したヌクレオチド配列 の、少なくとも一部にたいして相補的なオリゴヌクレオチド・プローブと、高度 に厳重な条件下でハイブリダイズする、上記ポリヌクレオチド分子で、上記の一 部は、少なくとも、約１０ヌクレオチド長である該分子。
19. １９．請求の範囲第１８項に記載のポリヌクレオチド分子であって、上記タンパ クが、約７９ｋｄのポリペプチド分子量を持つ該分子。
20. ２０．第１図に示したヌクレオチド配列の一部に相当する、または、それに相補 的なオリゴヌクレオチドであって、しかも、上記オリゴヌクレオチド、または、 その転写産物の存在が、ＰＥＣＡＭ−１ないしＰＥＣＡＭ−１変種をコードする ＤＮＡ配列を発現する細胞において、上記ＤＮＡ配列の転写ないし翻訳を抑制す る該オリゴヌクレオチド。
21. ２１．請求の範囲第２０項に記載のオリゴヌクレオチドであって、上記オリゴヌ クレオチドがＲＮＡで、上記ＤＮＡ配列の翻訳を抑製する該オリゴヌクレオチド 。
22. ２２．請求の範囲第２０項に記載のオリゴヌクレオチドであって、上記オリゴヌ クレオチドがＤＮＡで、上記ＤＮＡ配列の転写を抑制する該オリゴヌクレオチド 。