JPH03504439A - 免疫グロブリンＥのための高アフィニティー受容体のγサブユニットをコードするｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンＥのための高アフィニティー受容体のγサブユニットをコードす るｃＤＮＡ本発明は、マスト細胞と好塩基性球上の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ） のための高アフィニティー受容体のγサブユニット用のｃＤＮＡの単離と配列に 関する。更に、本発明は、受容体のα、βおよびγサブユニットのｃＤＮＡが同 時に共トランスフェクシヨンされている時の受容体の発現にも向けられている。

発明の背景 ＩｇＨの高アフィニティー受容体は、マスト細胞と好塩基性球上に専ら見出され ている。

この受容体：ＦｃεＲ１は、アレルギーで重要な役目を果たしている。多価のア レルゲンが受容体に結合したＩｇＨに結合すると、その結果起こる受容体の凝集 は、アレルギー症の原因となるメジエイターを遊離する。

下記の表１から見られるように、ＦｃｔＲｌは非共有的に接合したサブユニット の四量体二車量のＩｇＨに結合するαサブユニット、単量のβサブユニットそし てジスルフィド結合したγサブユニットの二量体〔エイッチ、メツツガ−他（Ｈ ，Ｍｅｔｚｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、アニュアル、レビューウ、オブ、イミュノロ ジー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、４・４１９−４７０（１９８ ６）） 表　　１ ＩｇＥの高アフィニティー受容体の一次構造号ブコニフト　　数／受容体　　残 基数　　　特　　徴β　　　　１２４３　　高嫌水性であるαおよびβサブユニ ットの相補的ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ）は、最近単離されている〔ジェイ、−ビー、 キネット他ｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡ＞８５：１９０７−１９１１（１９８８）：　　ジェイ、コーチ ャン他、核酸研究（Ｊ、　Ｋｏｃｈａｎｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、）１６：３５８４（＋９８８）を参照。〕。

しかし、現在迄、γサブユニットの単離と特定は開示されていないし、トランス フェクションした細胞によりＩｇＥ−結合を発現することは出来なかった〔ジェ イ。

−ピー、キネット他、バイオケミストリー（Ｊ、　−Ｐ、　Ｋｉｎｅｔズ他、プ ロセス、ナショナル、アカデミ−サイエンス、ニーニスニー（Ａ、Ｓｈｉｍｉｚ ｕ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ）８ ５：１９０７−＋９１１（１９８Ｂ）を参照。〕。

ＩｇＥの高アフィニティーを持つ受容体（ＦｃεＲ１）は、マスト細胞、好塩基 性球および関連細胞上に専ら見出される。ＦｃεＲ１と結合したＩｇＥの、抗原 による凝集は、ヒスタミンとセロトニンのような予め形成されているメジエータ −の両方の遊離の引金になり、並びにロイコトリエンの合成を刺激する。これら のメジエータ−の遊離は、アレルギー状態をもたらす。

もっともよくその特徴が知られているＦｃεＲ１はラットの好塩基性の白血病（ ＲＢＬ）の細胞系のそれである。これは３個の異なるサブユニットから成る＝（ １）　Ｉ　ｇ　Ｅとの結合部位を含む、４０−５０キロダルトン（Ｋｃｌ）の糖 タンパク質のα鎖、（２）一本鎖の３３Ｋｄのβ鎖および（３）二本の７〜９Ｋ ｄのジスルフィド結合したγ鎖。

ヒトＦｃεＲ１は完全にクローン化および単離されていない。単に、ラットのＦ ｃεＲ１のαサブユニットのためにコードしている遺伝子がクローン化されその 配列が決められている〔キネット他、バイオケミストリー（Ｋｉｎｅｔ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６：４６０５（１９８７）を参照〕。

本発明はヒトＦＣＥＲＩのαサブユニットのクローニング、配列および発現を包 含する。

免疫グロブリンのＦｃ領域に結合している受容体（「Ｆｃ受容体Ｊ）は膜を通過 するそれらの伝達を媒介し、抗原抗体複合体により誘発されるいろいろな細胞活 動を刺戟する。幾つかのＦｃ受容体のｃＤＮＡは特定されている。受容体〔高分 子免疫グロブリンの受容体（１）、マクロファージとリンパ球上のＦｃ受容体（ ２）、そしてマスト細胞と好塩基性球上の高アフィニティーＦｃ受容体（３−５ ））の３種は共通の特徴を持っている：！１７ちそれらの免疫グロブリンに結合 する部分は２個以上の免疫グロブリン様のドメイン（＠城）を持つ。

高アフィニティーＦｃ受容体は、多数のサブユニットから成ると知られているＦ ｃ受容体のみである。免疫グロブリンに結合するアルファ鎖に加えて、これはβ 鎖と２個のジスルフィド結合したγ鎖を含む。トランスフェクションした細胞の 表面上にαサブユニットのｃＤＮＡを発現することは今までは出来なかった（３ ．４）。恐らく、他の多数のサブユニットの受容体と同様に、表面で発現するに は他の一個以上のサブユニットが一緒に合成されなければならないのであろう（ ７，８）。

この受容体の作用機構におけるβとγサブユニットの役目も興味あるものである 。

この報告書では、βサブユニットをコードしているＣＤＮＡの単離と配列を、我 々は記述する。トポロジカル模型を持つと暗示するポリペプチド配列は実験的に 一部分試験された。

発明の概略 本発明の一般的な目的は、ＦｃεＲ１のγサブユニットのＣＤＮＡを単離し、特 定しそしてクローン化することである。

本発明の別の目的は、その構造的特徴の多くを説明してＦｃεＲＩの模型（ｍｏ ｄｅｌ）を提供することである。

更に、本発明の別の目的は、α、βおよびγサブユニットのためのｃＤＮＡが同 時に共トランスフェクションされた時にＦｃεＲ１の発現を行うことである。

本発明のこれらの、そして他の目的は；下記の記述からこの技術分野の熟練者に は明瞭になるであろう。そしてこの目的は、γサブユニットのｃＤＮＡクローン の単離とＣＯ３７細胞にＩｇＥ受容体のｃＤＮＡの発現の成功により実施できた 。トランスフェクションしたＣ０８７細胞上でのＩｇＥの表面結合は、３種全て のサブユニットのｃＤＮＡの同時の共トランスフェクションを要求することが見 出された。

本発明は、ＩｇＥのためのヒト高アフィニティー受容体（ヒトＦｃＥＲＩ）のα サブユニットに該当するポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を包含する。

本発明は、ヒトＦｃεＲ１のαサブユニットに該当するポリペプチドも包含する 。

本発明は、ヒトＦｃεＲ１ポリペプチドのαサブユニットを発現する能力のある 原核または真核微生物の発現ｃｔＲ１ポリペプチドのαサブユニットを生産する これら微生物の培養、並びに固相合成法、もしくは必要な遺伝子配列が適合性の ある原核または真核有機体に適当なりＮＡベクターにより挿入される組換えＤＮ Ａ技術によるかのどちらかを介してヒトＦｃεＲ１ポリペプチドのαサブユニッ トを生産する工程をも包含する。

図面の簡単な説明 図１は、ラットのＦｃεＲ１のγサブユニットのヌクレオチド配列とそれが予測 するアミノ酸配列を示す。推定上のトランスメンブラン領域に下線を付しである 。

アミノ酸残基には、成熟タンパク質の最初の残基から番号を付しである。５′残 基から残基１迄にはマイナスの符号を付してあって、ゲー、フｔン　ヘイイン（ Ｇ、　ｖａｎＨｅｉｊｎｅ）の領域に該当する推定上のシグナルペプチドをコー ドしている残基を包含する〔核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａａｉｄｓ　Ｒｅｓ 、）、１４：４６８３−４６９０（１９８０）を参照〕。Ｎ−末端とＣ−末端の 切断部位を矢印により示した。

カバー（ｃｏｖｅｒ）かつ配列しであるトリプシンペプチドは括弧（（＋）して ある。アステリックで最初のトリプシンペプチドの配列における曖昧な残基を示 している。

図２Ａ−２Ｃは、ＦｃεＲ１の予測される配列の水透過性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ ｉｃｊｔｙ）のプロットである：αサブユニット（図２Ａ）、βサブユニット（ 図２Ｂ）およびγサブユニット（図Ｃ）である。水透過性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ ｊｃｉｔｙ）のュアル　レビュー　オブ　バイオフィジカル　ケミスト２ｌ−３ ５３（１９８６））　。

連続している「窓」中の２０個のアミノ酸の水透過性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｔｙ）値の総計がそれに該当する１０個目のアミノ酸の位置にプロットされて いる。

図３Ａ−３Ｄは、トランスフェクションしたＣＯ３７細胞とＲＢＬ細胞によるＩ ｇＢロゼツトの形成を示している。

（図３Ａ）ＣＯ３７細胞はα、βおよび７ｃＤＮＡのコード部分により共トラン スフェクションされており、ＴＮＰで誘導された赤血球に暴露する前に、マウス の抗−ＤＮＰのＩｇＨに感作させる。

（図３Ｃ）陽性の対照としてＲＢＬ細胞を同様にロゼツト形成のために試験した 。

（図３Ｂと図３Ｄ）マウスの抗＝ＤＮＰのＩｇＥを添加する前に、ラットのＩｇ Ｅ（抗−ＤＮＰ活性がない）と共にＣＯ３７細胞（図３Ｂ）またはＲＢＬ細胞（ 図３Ｄ）を予め保温する。

図４は、ＩｇＥのための高アフィニティー受容体四量体の模型を示している。ポ リペプチドはその充分にプロセシングした形で示しである。αサブユニットの大 きい細胞外部分が上部の初めの部分に、そしてその残部が右に位置するように示 しである。αサブユニットの右方向にその４個のトランスメンプレイン部分と共 にβサブユニットが示してあり、そしてその右にγ鎖が示しである。　α鎖中の システィン２６と６８およびシスティン１０７と１５１は、それらがジスルフィ ド結合するように対になっており、これはＦｃγ受容体における同族の−５５０ （１９８８））。推定上のトランスメンプレイン部分は全てが２１個の残基から なるものとして示され、α−へリックスの構造であると期待されてよい。アミノ 酸には単−綴りのコードが使用されている〔エム、ディホーフ他、タンパク質の 配列と構造の地図、補、３．デイホーフ編集、３６３−３７３．ナショナル・バ イオメジカル研究団体、ワシントン（Ｍ、Ｄａｙｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ 　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ、　５ｕｐｐ１．３．　ｅｄ、　Ｍ、　Ｄａｙｈｏｆｆ、３６３−３７ ３．　Ｎａｔｌ、　Ｂｊｏｍｅｄ、　Ｒｅｓ、　Ｆｎｄｔｎ、、　Ｗａｓｈｉｎ ｇｔｏｎＤ、ｃ、）を参照〕。Ｎ−末端から数えて各１０番目の残基に斜線を施 した。

図５は、ヒトＦｃεＲ１のαｃＤＮＡのヌクレオチド配列と予測したアミノ酸配 列を示している。

図６は、ラットのＦｃεＲ１のαサブユニット（Ｒ）、ヒトのＦｃＥＲＩのαサ ブユニット（Ａ）、およびマウスのＦｃεＲ１（Ｍ）のαサブユニットの同族体 を示している。３件の間で互いに同一のものは四角で囲んである。番号ｌの位置 は、各々のタンパク質の予測した成熟Ｎ−末端に該当する。

図７は、完全な生理的に活性なＰｃεＲ１のα鎖（ｐＨＡＩ、ｐＨＡｌ　Ｉ）ま たは溶解性の、分泌型の生理的に活性のＦｃεＲ１のα鎖（ｐＨＡＳ　Ｉ、ｐＨ ＡＳ　Ｉ　Ｉ）の合成を指針している真核発現ベクターの構成を示すフローチャ ートである。

図８は、溶解性の、生理的に活性のＦｃεＲ１のα鎖（これはアミノ酸残基２４ −２０４から成る）の合成を指針している原核発現ベクターの構成を示すフロー チャートである。

図９は、βｃＤＮＡの制限酵素切断地図と、それによりそれらが配列される戦略 を示す。空白の長方形はβサブユニットをコードすると予測されている配列を示 す：直線は５′と３′の非翻訳領域を示す。

・上方のスキームは、Ｐｓｔ　Ｉ切断部位を含む１．５キロ塩基（ｋ　ｂ）のク ローンを示す。

下方のスキームは、Ｃｉａ　Ｉの切断部位を含む２．４キロ塩基のクローンを示 す。後者の３′領域はスラッジで示したように端部を切断しである。その非翻訳 領域はそのクローンの残りの部分と同様に完全に配列した。

制限酵素切断部位は、矢印により示しである：Ｈｆ、Ｈｊｎｄ　ｌ；　Ｈｈ、　 　Ｈｈａｌ　ｌ；Ａ１．　　Ａｌｕ　１；　Ｈｐ、　　Ｈｐｎ；　Ａｙ、　　Ａ ｖａＩＩ；　Ａａ、　　Ａｃｅ　１；　Ｅｃ、　　ＥｃｏＲ１；Ｈｄ、　　）ｆ ｉｎｄ　ＩＩＩ　。

水平方向の矢印はジデオキシヌクレオチド・チェイン−ターミネーション法（ｄ ｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏＨｄｅ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｊｎａｔｉｏｎ法）に よる配列を示す。

図１〇八は、βサブユニットをコードしているｃＤＮＡのヌクレオチドと推測し たアミノ酸配列を示している。矢印の頭部（マ）の所で始まって、代わり得る配 列（β）が６個のクローンで観察される。推定上のトランスメンプレイン−ドメ インに下線を付しである。アミノ酸の配列が直接に決定されたサブユニットβの トリプンンペブチドは括弧（＜〉）で括っである。推定上の末端近くのポリ八シ グナルには下線を付しである。

図１０Ｂは、βｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの欠失型（ｄｅｌｅｔｅｄ　ｆｏｒｍ）のヌクレ オチ［・配列の続きを示している。連結する３′はＡ（）で示しである。

図１１Ａ−１１Ｃは、βサブユニットをコードしているｃＤＮＡの発現を示して いる。

図１１Ａは、ｉｎ　ｖｉｖｏとｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳生成物の比較であ る。ＲＢＬ細胞を［Ｉ６Ｓ］　ンステインを含有する培地中で生育する。細胞の 洗剤抽出物をｍＡｂβ（ＪＲＫ）と沈澱しそして、激しく洗浄した後、試料緩衝 液で抽出し電気泳動する（列１）。この実験では、受容体を完全に解離するのに 充分に高い濃度の洗剤を使用する。

βｃＤＮＡからの転写物を［”Ｓｌ　メチオニンを含有する培地中で１ｎ＼・ｉ 　ｔｒｏで処理した（列２，３．および５）。対照の試験は、ｃＤＮＡを含有し ていなかった（列４）。免疫沈澱物を洗浄した後、βサブユニットへのモノクロ ナール抗体と反応させた。特定の洗浄した沈澱物を試料緩衝液に溶解し、電気泳 動じた。

列２と４．ｍＡｂβ（ＨＲＫ）　；列３．ｍＡｂβ（ＮＢＩ　　列５　不適切な モノクロナール抗体［ｍＡｂ（ＬＢ）］、還元条件下、その上で試料を分析した １２．５％のポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示しである。

図１１Ｂは、βサブユニットのＮＨ，−末端ペプチドへの一つのニピトープのロ ー力すゼーンヨン（ｌａｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）である。Ｔ７　　ポリメラーゼ を使用する転写の前にβｃＤＮＡを含むベクターをＨｈａ　１で切断した。得ら れたｍＲＮＡを、［３Ｓｓ］　メチオニンで標識したβサブユニットのＮＢ２− 末端ペプチド（アミノ酸　１−２１）を生成すべく翻訳した。混合物をｍＡｂβ （ＪＲＫ）　　（列１）と不適切なｍＡｂ（ＬＢ）　　（列２）と反応させる。

沈澱物を非還元条件下、１７９６ゲル上分析した。

図１１０は、βサブユニットのＣ００Ｈ−末端断片のにサブクローンしたそして 抽出物を作製した。タンパク質を人におけるのと同しに電気泳動し、ニトロセル ロース紙に移した。続いて、後者を、アルカリホスファターゼ−抱合のヤギの抗 −マウスＩｇＥ（Ｆｃ）でデブロプした（’ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）モノクロナー ル抗体ｍＡｂβ（ＮＢ）と反応させそして常法でデブロプした（ｃｌｅｖｅｌｏ ｐｅｄ）（＋４）。イミュノプロットの下半分の拡大図を示す。列１．挿入しな い形質転換体からの抽出物０列２１間違った方向に挿入された形質転換体からの 抽出物：列３．正しい方向に挿入された形質転換体からの抽出物。

図１１Ｄは、Ｅ、　Ｃｏ１１の発現Ｈ】口ｄ１断片により誘導されたポリクロナ ール抗体とのβサブユニットの反応性を示している。精製したＩｇＥ−受容体複 合体を電気泳動し、ニトロセルロース紙に移し、そして抗体そして次いで適当な アルカリンホスファターゼ−抱合抗−免疫グロブリン抗体と反応させる。列１　 　ｍＡｂβ（ＪＲＫ）　；列２ｍＡｂβ（ＮＢ）　：列３　断片へに対する免疫 血清１列５　断片Ｂに対する免疫血清；列１と６　列３と５における免疫血清に それぞれ対応する免疫血清１列７と８，２番目の抗体だけである。このゲルは標 準分子量無しに使用した。

図１２はβサブユニットの予測した配列の水透過性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉ 　ｔｙ）を示している。インゲルマン他（Ｅｎｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）（２ １）により推薦されている方法と水透過性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｊｃｉｔｙ）の 尺度を使用した。連続している「窓Ｊ中の２０個のアミノ酸の水透過性（ｈｙｃ ｌｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）の正味値がそれに該当する１０個目のアミノ酸の位 置にプロットされている。水への移行のための＞　２０　ｋｃａｌ　（１ｃａｌ ＝４、１８Ｊ）の正味の自由エネルギーはトランスメンプレインの断片を暗示し ている（２１）。

発明の詳細な説明 本発明は、ＩｇＥのための高アフィニティー受容体（ＦｃεＲ１）のγサブユニ ットのｃＤＮＡの単離、特定およびクローニングに関する。更に、本発明はＦｃ εＲ１の模型にも直接向けらｎており、この模型はその知られた構造状の特徴の 多（を説明する。ＦｃεＲＩの３個全てのｃＤＮＡが同時に共トランスフェクシ ョンされているときは、本発明によってＣＯ３７細胞の表面上に受容体の発現が 実施される。ＩｇＥ結合の発現の成功はＩｇＥ−受容体の相互作用の詳細な解析 を可能にしそしてかくして治療的に有効な抑制剤の開発を可能にする。

γサブユニットのｃＤＮＡを単離そして特定するために、γサブユニットのｃＤ ＮＡは、オリゴヌクレオチド試料を使用してラットの好塩基性球の白血病（ＲＢ Ｌ）細胞から調製したγｇｔｌｌライブラリーから単離した〔ジエイ、−ピー、 キネット他、バイオケミストリー（Ｊ、−Ｐ、Ｋｉｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２６　：　４６０５−４６１０（１９８７）を参照〕。

４個のペプチド配列をＦｃεＲ１γサブユニットのトリプシン切断で同定した。

そして、ペプチドの２個を２個のオリゴヌクレオチドを合成するのに使用した（ 図１）。これらの２個の試料を使用して重複してライブラリーをスクリーンし、 重複するプラーク（ｐｌａｑｕｅ）を同定した。３個の分離したプラークを精製 し、サブクローンし、０．６−０．７キロ塩基（ｋｂ）の同様の挿入物を含んで いることを見い出した。

図１は、γｃＤＮＡの完全なヌクレオチドの配列、推測したアミノ酸の配列およ び４個の原始的（ｏｒｉｇｉｎａｌ）　）リブシンペプチドの配列における位置 を示している。配列（図２Ｃ）の解析は、１８残基のＮ−末端嫌水性ングナルペ プチドと推定上のトランスメンプレイン領域が細胞質内領域から５個の残基の短 い細胞外部分を分離していることを示している。以前の研究により予測されるよ うに、Ｎ−末端をプロセスしたγサブユニットは２個のシスティン残基を含有す るがメチオニン残基とトリプト２５７５（１９８７）を参照。〕。

成分の分析は、γサブユニットが一個のヒスチジン基を含んでいるようであるこ とを暗示している〔ジー、アルカラズ他、バイオケミストリー（Ｇ、Ａｌｃａｒ ａｚ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｂ胆吐■ｎ旦、２７２６：２５６９−２５７５（１９８ ７）を参照。）。

しかし、最近のＩＩｓメチオニンと３Ｈヒスチジンを使用する受容体の生合成的 二重標識法は受容体に同伴するγサブユニットにはヒスチジンの痕跡が取り込ま れないことを明瞭に示している。３個の独立のクローンからの読み取り枠の各々 はＣ−末端から６個のヒスチジン残基を予測しているので、γサブユニットはヒ スチジンを含有する断片を切り落とすＣ−末端プロセシングを経ていると期待さ れる。更に、このヒスチジンの直前のペプチドは回収されるので（図１）Ｃ−末 端部分はりジン６３（Ｌｙｓ　６３）で切断すると予想される。充分にプロセシ ングしたγの予測される分子量は従って７１３９Ｄａであり、これはドデシル硫 酸−尿素ゲル上で還元したγの精製品で得られた値と近接している〔ジー、アル カラズ他、バイオケミストリー（Ｇ、Ａｌｅａｒａｚ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒ　）２６：２５６９−２５７５（１９８７）を参照。〕。

γサブユニット（図１）の７量体または９量体ペプチドに対するポリクロナール 抗ペプチド抗体を製造し、ＲＢＬ細胞のＩｇＥ−受容体との反応性を試験した。

両方の精製した抗ペプチド抗体は、部分的に精製したγサブユニットの未還元２ 量体および還元したモノマーと、ウェスタン−プロット検定法で反応した。

更に、ＲＢＬ細胞からのまたは部分的に精製した受容体の調製物のいずれからで もの受容体結合した＋１Ｊ　　ＩｇＥを定量的に沈澱した。これらの事実を纏め ると、本発明に従って単離されたｃＤＮＡはＦｃεＲ１の７サブユニツトをコー ドしていることは疑いのない事実である。

ＣＯＳ　７細胞の表面上での受容体の発現を実施するために、γｃＤＮＡの領域 と以前に単離したαとβｃＤＮＡのコード領域を、ＣＯ３−７細胞中にトランス フェクシヨンする前に、第１にＳＶ４０プロモーターで作動する発現ベクターｐ ｓＶＬ中に別々にサブクローンする。

ＩｇＥ−結合をＩｇＥロゼツト検出法を使用することによりトランスフェクシヨ ンした細胞の表面上に検出した（実施例３を参照。）。　図３人は、α、βおよ びγサブユニットで共トランスフェクシヨンした細胞によるＩｇＥ−結合活性を 示している。実質的に、陽性対照として使用されたＲＢＬ細胞の全ては、ロゼツ トを形成した（図３Ｃ）。ロゼツトは、ラットのＩｇＨによるブレインキュベー ション（ｐｒｅｊｎｃｕｂａｔｊｏｎ）により完全に阻止されるが（図３ＢとＤ ）、ヒトＩｇＥ（図示せず）では阻止されなかった。これは、ラットのＦｃＥＲ Ｉの種特異性と一致する〔クルスズスキー他、ジェイ、イーエックスビー、エム イーデー、　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）１３９：６００−６１６（１９７４Ｉｇ Ｅ結合活性の表面発現に対する必要条件を研究するために、下の表２に示される ように３種のサブユニットのためのｃＤＮＡの異なる組合せで細胞をトランスフ ェクションした。

表　　２ トランスフェクション試験 上の表は本出願の提出時までに本発明者等により行われた全てのトランスフェク ション試験から出されたデータをまとめている。α、βおよびγを同時に共トラ ンスフェクションした場合にＩｇＢ結合の５量２％発現が通常達成されるように 、トランスフェクション試験の成功率は高められた。

ノーザンブロッティングにより評価されるように成功したトランスフェクション は全ての組合せに対して達成されたが、しかしロゼツト形成性細胞は１そろいの ｃＤＮＡの共トランスフェクション後に検出されるだけだった。これらの結果は 、βおよびγサブユニットがＩｇＥ結合性αサブユニットの表面発現に必要とさ れることを示す。さらに、全体がそろった受容体だけが原形質膜に到達すること が示される。この現象はまたその他の系においても観察されており（Ｍ、　Ｍｃ Ｐｈａｕｌ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ　８３：８８６３−８８６７　（１９８６）；　 Ｙ、　Ｍｉｎａｍｉ等。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｕｓＡ　　８４：２ ６１１８−２６９２　　（１９８７））　　、そしてポリマー性膜タンパク質に 対して一般に適用され得る。

αからβおよびγ、の容易な分離性（Ｂ、　Ｒｉｖｎａｙ等。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１：６９２２−６９２７　（１９８２））は、概 念的にγ。

およびβをＦｃεＲ１のサブユニットとみなすべきか、または「受容体関連」タ ンパク質とみなすべきかについて永続的な不明確さを生じさせた（後者の例は胸 腺誘導リンパ球上の抗原受容体と会合するＣＤ３複合体である（Ｈ，Ｃ１ｅｖｅ ｒｓ等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｊｍｍｕｎｏｌ、　６：６２９−６６２（１９ ８８））。

ＦｃεＲ１のためのサブユニットモデルは、例えばα、βおよびγ、の同調生合 成および異化に基づいて支持されてきた（　Ｒ，Ｑｕａｒｔｏ等、　ＭｏＬｅｃ 、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　２２：１０４５−１０５２　（１９８５）　）。本発明 により得られたトランスフェクションされた細胞に関する新しいデータは、αβ γ、がＦｃＥＲＩの最小限の構造である最も確実な証拠を提供する。

四量体ＦｃεＲ１受容体に対する本モデルは図４に示されている。このモデルに おいて、発現された受容体を構成する５８９個のアミノ酸残基の各々は丸で示さ れている。図中、細胞の外部は上部にあり、受容体が埋め込まれている原形質膜 は中央部にあり、そして細胞の内部は下部方向にある。各々のポリペプチド鎖（ 左側にあるα、中央部にあるβ鎖および右側にある２本のγ鎖）は１つまたはそ れ以上のトランスメンブレン断片を含む。

α鎖は２つの鎖内ジスルフィドループを含むと信じられており、そしてこれらの ループの配列は免疫グロブリンとかなりの相同性を示す（Ｊ、　−Ｐ、　Ｋｉｅ ｔ等、　Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ　２６：４６０５（１９８７）；　Ａ、　 　Ｓｈｉｍｊｚｕ等、　　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　１．ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８５：１９０７（１９８８）；　Ｊ、　Ｋｏｃｈａｎ等、　Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ！ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：３５８４（１９８Ｂ））　。従ッテ、αサ フユニットハ免疫グロブリンスーパーファミリーのもう一つの構成員である（Ａ 、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ：Ｌ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　６：３８ １（１９８８））。α鎖の細胞外およびトランスメンブレン断片は１ｇＧを結合 するＦｃ受容体の免疫グロブリン結合鎖とかなりの相同性を示すが（Ｊ、　Ｒａ ｖｅｔｃｈ等、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７８（１９８６）　）　、Ｌかし 細胞内細胞質尾部は全く異なっている。α鎖の細胞外部分に共有結合している炭 水化物残基は図４に示されていない。Ｎ−結合炭水化物に対する７つの可能な部 位があるが（Ｊ、　−Ｐ、　Ｋｊｅｔ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６： ４６０５（１９８７）；　Ａ、　　Ｓｈｉｍｉｚｕ等、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ Ｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｕｓＡ　８５：１９０７（１９８Ｂ））　、Ｌかしソノ中ノ細胞ニヨ リ実際に使用されている部位はまだ決定されていない。研究はこれら炭水化物が この鎖によるＩｇＥの結合に必須でないことを示す（Ｂ、　Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ 等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：１０７１７（１９８１））。

β鎖は４つのトランスメンブレン断片を含み（Ｊ、　−Ｐ。

Ｋｉｅｔ等、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８ ５：６４８３（１９８８））、そしてモノクローナル抗体でのこれまでの研究（ Ｊ、　−Ｐ。

Ｋｉｅｔ等、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＪＳＡ　８ ５：６４８３（１９８Ｂ）；　Ｊ、　Ｒ５ｖｅｒａ等、　ＭｏＬ、　Ｉｍｍｕｎ ｏＬ、　２５：６４７（１９８Ｂ））はアミノ末端およびカルボキシル末端がそ れぞれ５９および４３残基の長さであり、これが原形質膜の細胞質表面から突出 していることを示す。同様にγ鎖は長い細胞内伸長を有するが、しかし外部への 露出はご（限られている。

本モデルによれば、個々のサブユニットの推定上のトランスメンブレンドメイン は各々の水通過性プロットから推定される（図２参照、その中で水輸送のための 〉２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの真の自由エネルギーはトランスメンブレン断片または リーダーペプチドを示唆する（Ｄ、　Ｅｎｇｅｌｍａｎ等。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｗ、　１５ ：３２１−３５３（１９８６乃。

これらのプロットはα、βおよびγのだめのそれぞれ１．４および１個の疎水性 ドメイン（すなわち全体の受容体のための７個のトランスメンブレンドメイン） を示唆する。Ｇタンパク質と相互作用する受容体のファミリーの構成員もまた７ 個のトランスメンブレンドメインを含む（ｒ、　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ等、　Ｃ ｅ１ｌ　５０：９９５−９９６（１９８７）　）　。このファミリーはβおよび αアドレナリン産生、ムスカリン受容体およびロドプシンを包含する。ＦｃＥＲ Ｉとこれらの受容体との間の配列相同性は見ら出されないけれども、ＦｃεＲ１ とＧタンパク質との相互作用はこの受容体により活性化された生化学的経路の少 なくともいくつかを説明することが主張された（　Ｓ、　Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ等 ＋　Ｎａｔｕγｅ　３１４：５３４−５３６（１９８５））。αおよびβサブユ ニットのトポロジー、特にβサブユニットのＣ〜およびＮ−末端部分の細胞質局 在はＪ、　−Ｐ、　Ｋｉｅｔ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：４６０５ （１９８７）およびＡ、　　Ｓｈｉｍｉｚｕ等、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＩＪｓＡ　８５：１９０７−ｉ９１１（１９８８）で論議されている。２つの証 拠は図４に示されるようなγ−二量体のトポロジーを支持する：γは倒立小胞上 で酸化的にヨウ素化されるが無傷の細胞上ではされず（Ｄ、　Ｈｏｌｏｗｋａ等 、　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｍ。

２５９：３７２０−３７２８（１９８４））　、そして生体内において、γはト レオニン残基上でホスホリル化される（Ｒ，Ｑｕａｒｔｏ等。

Ｈｏｔ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　２３：１２１５−１２２３（１９８６））　、関 連する残基はγの小さい推定上の細胞質外断片には存在しないが、推定上の細胞 質尾部、すなわち２個のチロシンおよび４個のトレオニン残基上に全て存在する 。

受容体のトポロジーを試験するだめのその他の手段として、３種のサブユニット の推定上の細胞外および細胞内断片はＧ、　ｖａｎ　Ｈｅ１ｊｊｎｅ、　Ｂｉｏ ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９４７：３０７−３３３（１９８Ｂ ）により示唆されているように塩基性残基の相対含量が分析された。彼は塩基残 基／全残基の比率が被試験断片の長さの関数として変化するが、しかし一般には 膜タンパク質の転移（細胞外）断片におけるより非転移（細胞内）断片における 方が実質的に高いことを見出した。下の表３は本モデルに対して計算された比率 と「公知の」膜タンパク質（Ｇ、　ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｉｎｅ、　Ｂｉｏｃｈｉｒ ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９４７：３０７−３３３（１９８８）　）に基づ いて予測される比率との良好な一致を示すものであり、それにより本明細書で提 示したトポロジーモデルに対して別の支持を与える。

本モデルはサブユニットの構造に関していくつかの重要な特徴を明らかにしてい る。βと、γの二量体とは互いに相互作用し；界面活性剤溶液中でそれらはお互 いから分離する前にユニットとしてαから分離しく　Ｊ、　Ｒｉｖｅｒａ等、　 Ｈｏｔ、　ＩｍｔａｕｎｏＬ、　２５：６４７−６６１（１９８８））　、そし て時にはβとγ二量体は互いにジスルフィド結合されているのが観察される（Ｊ 、　−Ｐ、　Ｋｉｅｔ等、　Ｅｉｏｃｈｅｒａｉｓｔｒｙ　２２：５７２９−５ ７３２（１９８３）　）。この結合のための最も可能性高いものは、トポロジー 的に近似していることが予想されるγ−くともγ−ｃｙｓ２６残基がγ二量体中 でジスルフィド結合されていることが必要であろう。受容体生合成に関する予備 的なデータはαおよびβが互いに相互作用することを示唆する。

ＰｃεＲ１の機能的特性は種々のＦｃγＲのそれに広範囲にわたり類似している 。ＰｃγＲは免疫グロブリンのＦｃ領域の相同断片に結合することが明らかであ り（Ｂ、　Ｈｅ１ｍ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：１８０−１８３（１９８Ｂ） ；　Ａ、　Ｄｕｎｃａｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：５６３−５６４（１９８ ８））　、そして受容体上の結合部位が免疫グロブリン様ドメインを有する相同 ポリペプチドに見出されることが明らかである（　Ｊ、　−Ｐ、　Ｋｉｅｔ等、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：４６０５−４６１０（１９８７）；　Ｊ、 　Ｒａｖｅｔｃｈ等。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３４ニア１８−７２５（１９８６）　）　、両タイプの受容 体は細胞活性化を引き起こすために凝集することが必要であり、そして研兜によ れば、後者は広範囲に類似する第２のメツセンジャーの生成を含むことが明らか である（ＨｏＭｅｔｚｇｅｒ等、　Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　Ｉｒｔｒｒａｕｎ ｏｌ、　４：４１９−４７０（１９８６）；　Ｎ、　Ｈｏｇｇ、　Ｉｒｎｗｒｕ ｎｏｌ、　’ｒｏｄａｙ　９：１８５−１８７（１９８８）　）　６それ故にＦ ｃεＲ１が４つのポリペプチド鎖、７つのトランスメンブレン断片および５つの 細胞質断片からなるのに対し、ＦＣγＲはより単純な構造、すなわちα様サブユ ニットのみで類似の機能を果たすようにみえることは驚きである。

極端な場合はトランスメンブレン断片および細胞内断片さえも欠くようにみえる ＦｃγＲ１１ｌの場合である（　Ｐ、　５ｅｌｖａｒａｙ等、　Ｎａｔｕｒｅ　 ３３３：５６５−５６７（１９８８）；　Ｄ、　Ｓｉｍｍｏｎｓ等、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３３：５６８−５７０（１９８Ｂ）；　Ｔ、　Ｈｕｉｚｉｎｇａ等。

Ｎａｔｕｒｅ　３３３：６６７−６６９（１９８８））　、　Ｆ　Ｃ７受容体の 付加的な構成成分は遠（に放され得ることが示曖された。可能性として、そのよ うな構成成分はＦｃｅＲｌのβおよびγサブユニットに比べ、受容体の可溶化の 際により容易に失われる（Ｊ、−Ｐ、　Ｋｉｎｅｔ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　２４：４１１７−４１２４（１９８５）　）。そのような仮想的成分がβ もしくはγまたは両方に相同であると予想することは道理にかなっている。後者 の成分のための遺伝子プローブの有用性（±この可能性の十分な探究を可能にし ないであろう。

本発明に従って達成されたＩｇＥ結合の発現における成功は重要な治療上の意味 を有する。ＦｃｔＲｌにより刺激されたマスト細胞および好塩基性球の粒崩壊は アレルギーの多くの徴候の原因となる。この失調が高い頻度で得られれば、Ｉｇ Ｂ結合の特異的阻害剤の発見により多くの治療上の利益が得られることが気体さ れる。そのような阻害剤の発見はヒト受容体へのヒトＩｇＨの結合のための実際 的な試験管内アッセイの欠如により妨害されていた。例えば、ＩｇＥ誘導ペプチ ドの阻害能の最近の評価はめんどうで危険性のある操作である皮膚試験（Ｂ、　 Ｈｅｌ＋ｏ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：１８０−１８３（１９８８））により 決定されなければならなかった。

本発明がトランスフェクションしたげっ歯頚の受容体の発現を達成することは、 ヒトＦｃεＲ１が同様に発現され得ることを示す。また、現在ヒトαサブユニッ トをコードするｃＤＮＡだけが単離されているから（Ａ、　Ｓｈｉｍｊ　ｚｕ等 、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｈａｔｅ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　８５： １９０７（１９８Ｂ）；Ｊ、　Ｋｏｃｈａｎ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１６：３５８４（１９８８））、げっ歯頚のβおよびγ鎖をコード するｃＤＮＡとの共トランスフェクションで発現され得ることが期待される。

ヒトとラットのαサブユニットの比較を下の表４にまヒトとラットのアルファ鎖 の特性の比較細胞外　　　　　　　１８０　１８１　　４９トランスメンブレン 　　２１　　２１　　６７＋細胞内　　　　　　　　３１　　２０　　２３全体 　　　　　　　　　２３２　２２２　　４７３にネＷｔ　　ａｖｅ。

上の表から、ヒトとラットのアルファ鎖には約４７％の全体の相同性があり、予 測されたトランスメンブレンドメインにはほぼ７０％の相同性があることがわか る。

実際に、トランスメンブレンドメインが厳密に試験される場合、完全に同一であ る１０個の連続残基の範囲がある。連続残基のこの範囲は上の表で下線が付けら れている。

トランスメンブレン断片は、βおよびγ鎖と最も相互作用しそうなα鎖の領域で あるから、ラットのβおよびγ鎖と一緒にトランスフェクションされるならばヒ トα鎖は発現され得ることが期待された。これは、本発明者等がヒトαならびに ラットβおよびγサブユニットと同時にトランスフェクションされたＣＯ８細胞 によりヒトＩｇＥ結合を発現させることができたような場合であることを証明し た。もちろん、自然にトランスフェクションされた細胞系を有することは有利で あろうし、そしてそのような系のためにヒトβおよびγサブユニットを利用する ことを欲するであろう。本発明者等はトランスフェクションされたものの製造が 容易であるように、これらのサブユニットのコード性配列を同定する方法を入手 している。従って、金利用可能な材料でもって、試験管内でのヒトＩｇＥ結合の ペプチド阻害剤を探究することは既に実際的である。薬剤の実際の大量スクリー ニングに適当なアッセイを行うには現在の作業のわずかな拡張だけが必要とされ る。

もちろん遺伝的作業はアッセイより多くのものを提供し、同様に重要であろう。

直接突然変異により、さらに、重要な結合領域に関するその他の情報の発見が可 能になるであろう。この情報を用いて合理的な薬剤設計が可能になることが期待 される。受容体自体の機能を阻害すること、すなわち受容体の活性化を生じる初 期の生化学的シグナルと相互作用することが可能になることがさらに期待される 。

本発明を以下の実施例において詳細に説明する。これらの実施例は説明のための ものであり、本発明を制限するものではない。

実施例１ トランスフエンクション実験 表２に係る上記トランスフェクション実験において、ＦｃＲＩの３つのサブユニ ット（図３）ととしてｃＤＮＡｓの異なる組み合わせでＣＯ５−７細胞をトラン スフェクションした。表２に示されている各トランスフェクションについてロゼ ツト分析（ｒｏｓｅｔＨｎｇ　ａｓｓａｙ）を行った。ノザン・プロッティング によるｍＲＮＡの評価を一度だけ行ったＣ２ｘ１０７細胞で）。表２中のアスタ リスクでマークされている実験にインヒビターが細胞に加えられている（特異マ ウス抗−ＤＮＰ　　ＩｇＥの添加の３０分前に非特異ラットＩｇＥ　　５０ｇ／ ｍｆを細−胞に加えた。） 実施例２ γサブユニットのためのｃＤＮＡの単 離および特徴づけ アルカラッツ（Ｇ、Ａｌｃａｒａｚ　ｅｔ　ａｌ、）等「バイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ第２６巻、第２５６９〜２５７５頁（１９８７ 年）に記載のＴＮＰ−リジンビーズ（ＴＮＰ−１ｙｓｉｎｅ　ｂｅａｄｓ）を用 いるアフィニティクロマトグラフィーによりＦｃεＲ１を精製した。溶出液は、 シアノゲンブロミドによりモノクロナール抗−β（ＪＲＫ）に結合したセファロ ース４Ｂビーズに適用した〔ジェイ、リベラ等（Ｊ、　Ｒ４ｖｅｒｅｔａ１．） ｒモレキュラー　イムノロジー（Ｍｏｌ、　Ｉｍｍｕｎ−ｏｌ、）　Ｊ　２５： ６４７−６６１（１９８８））　、　ｐ　Ｈ８のホウ酸塩緩衝液中のＣＨＡＰＳ 　　２ｍ／でビーズを洗浄した後、合わせた物質を６５°ＣにてｐＨ６，５の０ ．１％ドデシル硫酸ナトリウム燐酸塩緩衝液で溶出した。次いでＦｃεＲ１から のサブユニットを、ＨＰＬＣサイズクロマトグラフィーで分離し、βおよびγ含 存画分を回収し、還元し、アルキル化しそしてトリプシンで消化した〔ジェイ、 ビー、キネット等（Ｊ、−Ｐ、　Ｋｉｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、）　　ｒバイオケミ ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ　２６　：　４６０５〜４６１０（１ ９８７））　、得られたポリペプチドを、〔ジェイ、ピー、キネット等（Ｊ。

−Ｐ、　Ｋｊｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、）　　ｒバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒ−ｙ）　Ｊ　２６　：　４６０５〜４６１０（１９８７））のように ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーにより分離した。βおよびγ消化からのクロマ トグラムを比較し、そして非重複γペプチドの配列が分析された〔ジェイ、ピー 、キネット等（Ｊ、　−Ｐ。

Ｋｉｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、）　　ｒバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）Ｊ２６　：　４６０５〜４６１０（１９８７））。

オリゴヌクレオチドプローブをペプチド３（残基４１ないし４７）およびペプチ ド４（残基５４ないし６２）の配列に従って合成した。その配列は、であった。

γｇｔｌｌライブラリーをスクリーニングし、サブクローンを精製しそして正ク ローンを配列するために用いられる方法は当該技術分野で公知である（　Ｊ、　 −Ｐ。

Ｋｉｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６　：　４６０５〜 ４６１０（１９８７））。

ペプチド３およびペプチド４はまた、ペプチド合成薬ＡＢ１４３１Ａを用いても 合成された。合成ペプチドの純度は、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー、アミノ 酸組成および質量分析により評価された。ペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイ ル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｐ、−Ｔ、　Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：　　６９０−６９７（１９７９））を５ ＝１のモル比で用いてオボアルブミン（ＯＶａ−１ｂｕｍｉｎ）にか、またはシ アノゲンブロミドでセファロース４Ｂに結合された。ウサギをオボアルブミン結 合ペプチドで免疫化し、抗血清を集め、その抗ペプチド抗体をセファロース４Ｂ 結合ペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。抗ペプ チド抗体を、ウェスタン・プロッティング法によりＦｃεＲ１の７サブユニツト との反応性について、およびそれらの免疫沈澱＋！Ｊ、−１ｇ１：受容体コンプ レックス成形能について試験した〔ジェイ、リベラ等（Ｊ、　Ｒｉｖｅｒａ　ｅ ｔ　ａｌ、）　　ｒ％レキュラー　イムノロジー（Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、） Ｊ　２５：６４７−６６１（１９８８））。

本発明方法を用いて得られたラットＰｃεＲ１のγサブユニットのヌクレオチド 配列ならびに予測されるアミノ酸配列を図１に示す。

実施例３ トランスフェンクシタンしたＣＯ３７細胞及びＲＢＬ細胞によるＩｇＥロゼツト の生成ａｃＤＮＡの８１０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｓｔｙ　Ｉ限定断片、βｃＤＮＡ の９６５ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ限定断片、および７ｃＤＮＡの９６５ｂ ｐ　ＥｃｏＲｌ−Ｄｄｅ　Ｉ限定断片を一時発現ベクター（ｔｒａｎｓ−４ｅｎ ｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　（Ｐｈａｒｍａｅ ｉａ社、スウェーデン国アップサラ）の３ｍａｌ側に別々にサブクローン化した 。これらの限定断片は、個々に適当なサブユニットの完全コード化配列と非翻訳 配列（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ−ｓｅｑｅｎｃｅｓ）の可変部分を含む。唯一 の外来配列はイニシャルリンカ−（ｉｎｉｔｉａｌ　１ｉｎｋｅｒ）に属する出 発ＥｃｏＲＩ認識配列であった。次いで、培養したＣ０Ｓ７サル腎細胞を次いで 標準燐酸カルシウム沈澱技術〔エル、デービス等（Ｌ、Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ ）、　　ｒベーシック　メソッヅ　インモレキュラー　バイオロジー（Ｂａｓｉ ｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ／分子の生 物学における基本方法）」エル、デービス（１，［１ａｖｉ　ｓ）纒、エルセヴ イア−（Ｅｌｓｅｖｊｅｒ）出版、二ニーヨーク（１９８６）　］により、ＤＮ Ａ４０μｇでトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションし た細胞（図８のパネルＡおよびＢ）ならびにＲＢＬ細胞（図３のパネルＣおよび Ｄ）を、ＩｇＥ結合の表面発現（ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）につ いて、ＩｇＥロゼツト分析により試験した。細胞（５ｘ１ｇ−ｓ細胞７田ｌ）を 室温で、非特異ラットＩｇＥ　　５０μｇ／’ｍｆと共に（パネルＢおよびＤ） かまたは無しに（パネルＡおよびＣ）８０分間、次いで抗−ＤＮＰ−１ｇＥ　　 ５μｇ／ｆｎ１と共に培養する〔エフ、ティ、ルイ等（Ｆ、−Ｔ、　Ｌｕ１ｅｔ 　ａｌ、）、　ｒジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。

−１，）１２４７２７２Ｂ−２７３６（１９８０）　）。次いで該細胞を、公知 方法〔エム、リッテンベルグ等（Ｍ、Ｒｉｔｔｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ）ｒＰ ｅｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　Ｊ　　１３２：５７２− ５８１（１９６９）〕により２，４．６−ドリニトロベンゼンスルホン酸で変質 させた雄牛赤血細胞でロゼッティングした。結果を図３に示す。

本発明はある特別の具体例に関して記載されているけれども、本発明の精神を逸 脱すること無く多くの改良および変更が当該技術分野の専門化によりなされ得る ことは明らかである。従って、本発明の真の精神および範囲内に含まれる全ての そのような改良および変更をカバーすることが従属クレームにより意図されてい る。

ヒトＦｃＥＲＩのαサブユニットに相当するポリペプチドについてコードされた ＤＮＡ配列を図５に示す。このＤＮＡは、当該技術分野の専門化によく知られて いる方法に従い、対応ラットＦｃｅＲＩ　　ＤＮＡでヒトの末梢血液白血球ｃＤ ＮＡライブラリーを調べることにより説明される。ハイブリッド化により得られ たｃＤＮＡは次いで標準的技術を用いてサブクローン化した。これらのｃＤＮＡ インサートは限定酵素分析により図化され、そして更にサブクローン化され配列 が分析された。結果は、ヒトＦｃＥＲＩ　　αサブユニットについてコード化さ れた約１．２００塩基のＤＮＡ配列であった。

最近の組換えＤＮＡ操作の適用において、宿主細胞中で模写できる組換えＤＮＡ 分子を生成するために、特定のＤＮＡ配列は適当な媒介物に挿入される。プラス ミドと呼ばれる環状二重−標準ＤＮＡ分子はしばしばベクターとして使用され、 そしてそのような組換えＤＮＡ形態の調製にはＤＮＡを特定の塩基配列部位で分 断する限定エンドヌクレアーゼ酵素の使用を伴う。プラスミド中でおよび挿入さ れるべき外米ＤＮＡ断片中で限定酵素により一度切断されると、２種のＤＮＡ分 子は、リガーゼとして知られている酵素により共存結合的に結合されるかもしれ ない。そのような組換えＤＮＡ分子の一般的な製造方法は、コーニン等（Ｃｏｈ ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４，２３７、２２４号、コリンズ等（Ｃｏｌ Ｈｎｓ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４゜３０４、８６３号およびマニアティス （ＭａｎｉａｔｊＳ　ｅｔ　ａｌ、）の「モレキュラー　クローニング、ア　ラ ボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）４１９８２年、コールド　スプリング　ハーバ −ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　）に記載されている。それは現技術水準の多くを示しているので、これらの 文献は本明細書に参照文献として組み入れられる。

一度調整された組換えＤＮＡ分子は、多くの条件がそろった場合のみ、挿入され た遺伝子配列により特定された生成物を産生ずる。真っ先に要求されることは、 組換え分子が宿主細胞に適合し、従って宿主細胞中で自発的な複製ができること である。ごく最近の操作で宿主有機体として大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１．）が使用さ れているのは、それが広範な組換えプラスミドと適合するからである。使用され るベクター／宿主細胞系に依存して組換えＤＮＡ分子は、形質転換、形質導入ま たはトランスフェクションにより宿主中に導入される。

宿主細胞中の組換えプラスミドの存在の検知は、プラスミドマーカー活性、例え ば抗生物質耐性の使用を通じて都合良く行われる。このようにアンピシリン（ａ ｍｐｊｃｉｌ−１ｉｎ）分解酵素の産生についてコード化されているプラスミド を持つ宿主は、アンピシリン含存培地中で宿主を発育させることによって変化し ない細胞から選択することができる。他の利点は、抗生物質耐性マーカーと捉え られることであり、そこではプラスミドが第二の抗生物質分解活性をコード化し ており、その部位では選択された限定エンドヌクレアーゼがそれをカットし外来 遺伝子配列が挿入されている。それで、適当な組換えプラスミドを含有する宿主 細胞は、次いで第一の抗生物質には耐性であるが第二番目には感受性であること により特徴づけられる。

宿主細胞中への組換えプラスミドの単なる挿入、および改良された宿主の単離は それ自体、存意義な量の望む遺伝子生成物が産生されることを明確にしない。こ の事が起こるために、外来遺伝子配列が、プロモーターと呼ばれるＤＮＡ転写用 プラスミド中の単一領域に適当な関係で融合されていなければならない。代わり に、外来ＤＮＡが、宿主に認識されるほどの長さのそれ自身のプロモーターを持 ってよい。その起源がとうであれ、そのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの 結合を指向し、それ故にＤＮＡのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）への転写 を“促進”するＤＮＡ配列である。

多量のｍ　ＲＮ　Ａを提供できる強い促進が与えられると、最終的に望む遺伝子 生成物の産生は、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳の有効性に依存するであろう。こ れは、他方では、ｍＲＮＡへのりボゾームの結合の有効性に依存する。大腸菌（ Ｅ、　Ｃｏ１１．　）において、ｍＲＮＡ上のりボゾームー結合部位は開始コド ン（ＡＵＧ）と上流側シンーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）　（ Ｓ　Ｄ　）配列を含む。３〜９のヌクレオチドとＡＵＧコドンから配置された３ 〜１１のヌクレオチドを含むこの配列は、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１ｊ、）１６Ｓリボ ゾームのＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の３′末端に補足されている〔シンおよびダルガル ノ（Ｓｈｊｎｅ　ａｎｄ　Ｄａｌｌｌａｒｎｏ）、　　ｒネイチャー（Ｎａｔｕ ｒｅ）Ｊ　　２５４　：　３４　（１９７５））　、明らかに、ｍＲＮＡへのり ボゾームの結合は、ｍＲＮＡ中のＳＤ配列と１６ＳｒＲＮ人３′−末端での配列 との間に塩基対を作ることにより容易化される。遺伝子発現を最高にする観点で は、ロバーツおよびラウェル（Ｒｏｂｅｒｔｓａｎｄ　Ｌａｕｅｒ）の「メソッ ド　イン　エンズイモロジ−（Ｍｅｔ−ｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） 　Ｊ第６８巻、第４７３頁（＋９７９）を参照。

現在までの組換えＤＮＡ分野における操作の多くは、大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１． 　）のようなバクテリア発現系の使用に焦点が当てられている。しかし、バクテ リア細胞の使用は多くの望ましくない面を存する。例えば大腸菌中で産生される 多くの蛋白質およびポリペプチドは性質空間（ｐｅｒ−ｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐ ａｃｅ）中に蓄積する。かくして、これらの遺伝子生成物の回収は、細胞の粉砕 を必要とし、その操作は、望む生成物が多くの他の大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１．　 ）の細胞成分から精製されなければならないので、役に立たずに重大な精製問題 を導く。またバクテリアは、多くの興味ある遺伝子生成物の合成を終了させるの に必要なグリコジル化を行うこと、または多くの真核蛋白質の適箔な形態と生物 学的活性に必須の特定ジスルフィド結合を生じることができない。

バクテリア発現系におけるこれらの欠点を克服するために、遺伝子技術者の注目 は、望ましいポリペプチドおよび蛋白質を作るだけでなく、そのうえ遺伝子発現 のコントロールを研究すべく、組換えＤＮ人用の真核宿主細胞にだんだんと注が れている。酵母および哺乳動物細胞のような細胞は、望むの遺伝子生成物を培地 中に分泌することができ、また実質的なグリコジル化プロセスを行うことができ る。しかし、組換えＤＮＡクローン化および発現のための哺乳動物細胞の使用は また、克服されなければならない技術的障害の主役を勤める。例えばバクテリア において相当存用であることが証明されている内因性プラスミドは、より高度な 真核細胞により複製されなければならない。

一つのアプローチは、より程度の真核酵母Ｓａｅｅｈａｒｏｍｙ−ｃｅｓ　ｃｅ ｒｅｖｉｓｊａｅを使用することであり、それは大腸菌（Ｅ、　Ｃｏｌ　ｉ、　 ）と同じように育成し、巧みに扱うことができる。酵母クローニング系は市販さ れており、そのような毛の使用を通じて酵母でのヒトインターフェロン遺伝子の 効果ある発現が達成された〔ハイツェマン等（Ｈｊｔｚｅ−ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ 、）、　　ｒネイチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｊ　　２９３　ニ ア１３　（１９８１））。インターフェロン遺伝子はイントロンを含まないが、 酵母細胞は、イントロンを含まない少なくとも１つの異種哺乳動物遺伝子にてウ サギβ−グロブリン遺伝子を正確に転写しないことが見出された〔ベッグス等（ Ｂｅｄｓ　ｅｔ　ａｌ、）、　　ｒネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏ ｎ）Ｊ２８３：８３５（１９８０）　）。

他のアプローチにおいて、外来遺伝子は哺乳動物細胞中に直接摂取手段により挿 入される。これはクローン化遺伝子の燐酸カルシウム共−沈澱によりなし遂げら れ、その操作では一般的に約１〜２％の細胞がＤＮＡを取り込むように誘導され る。しかしながら、そのような低レベルの摂取は、非常に低い発現レベルの所望 遺伝子生成物しか産生じない。チミジンキナーゼ遺伝子を欠く哺乳動物細胞（ｔ ｋ−細胞）が見出される場合、共−形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ ｏｎ）により、より良好な結果を得ることができる。選択的ＨＡ　Ｔ　（ｈｙｐ ｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）培地中で 発育できるＴｋ−細胞は、ｔｋ遺伝子を含む内因性ＤＮＡ　（例えば単純ヘルペ スウィルスのＤＮＡ）を取り込むことにより、燐酸カルシウム共−沈澱を通じて この失われた酵素活性を回復することができる。ｔｋＤＮＡに共存結合的に結紮 された、或はそれと単に混合された他のＤＮＡもまた細胞により取り込まれ、し ばしば共−発現されるであろう〔スキャンゴス等（Ｓｃａｎｇｏｓ　ｅｔ　ａｌ 、）　ｒジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　１４　：　１（１９８１））。

第三のアプローチにおいて、哺乳動物細胞中に他の遺伝子を導入するためのベク ターとしてウィルスゲノムが使用されてきており、そしてシミアンウィルス４０ 　（Ｓｉｍ−ｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）、乳頭腫ウィルスおよびアデノウィル スゲノムに基づく系が記載されている〔ピー、ダブリュ。

ジェイ、リグビー（Ｐ、Ｗ、Ｊ、　Ｒｉｇｂｙ）、“ウィルスレブリカントから 誘導されたベクター系を用いる真核細胞中でのクローン化遺伝子の発現（Ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１ｏｎｅｄ　Ｇｅｎｅｓｉｎ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ 　Ｃｅ１ｌｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ　ＳｙｓｔｅｍＳＤｅｒｉｖｅｄｆｒ ｏｍ　Ｖｉｒａｌ　Ｒｅｐｌｉｃａｎｔｓ）″　「ジエネティック　エンジニア リング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　Ｊ第３巻中；アール。

ウィリアムソン（Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｎｓｏｎ）編、アカデミツク　プレス（Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、二ニーヨーク、ｐｐ、　８３〜１４１（１９８２ ）、レビューとして、参照）。しかしながら、これらの系は限定された宿主細胞 範囲の欠点で悩まされる。更にこれらの系でのウィルスの複製は宿主細胞を死へ と導く。レトロウィルスＤＮＡ制御エレメントの使用は、これらのライスルベク ターの欠点の多（を避ける。

ゴーマン等（Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　　（プロセス　ナショナルアカデ ミ−サイエンス　ニーニスニー（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　）　７９：６７７７（１９８２）　）は、例 えばロウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ）長末端リピ ート（ＬＴＲ）が、ＣＶ−１サル腎細胞、ニワトリ胚フィブロブラスト、中国ハ ムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞およびマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含めた種々の 細胞中に、ＤＮＡ媒介トランスフェクションによって導入され得る強いプロモー ターであることを発表している。

本発明はまた、ヒトＦｃＥＲ１のαサブユニットに相当するアミノ酸配列のポリ ペプチドを含む。

ヒトＦｃεＲ１α鎖用の組換えＤＮＡクローンは、多量のα鎖ポリペプチドの合 成を図る目的でこれらのコード他用配列を適当な真核発現ベクター中に導入する ために使用された。α−サブユニットにとって真核細胞上に発現されるためには その遺伝子がβもしくはγの、または他のサブユニットのそれと複合化されるこ とが必要であろう。分泌形の発現にとってはこれは不必要かもしれない。適当な 真核発現ベクターの全て、例えば上記に示されているものが使用され得る。真核 細胞中のヒトＦｃεＲ１の蛋白質の発現は、それがヒトＦｃεＲ１に相当する蛋 白質と結合している成熟１ｇＥを合成する結果となろう。発現ベクターは次いで 標準的技術により適当な真核細胞中に導入され得る。蛋白質の合成は、これら細 胞にヒトＩｇＥまたはラットＩｇＥが結合する能力を証明することによりモニタ ーされる。

ヒトＦｃＥＲＩαポリペプチドはまた、公知方法により原核細胞中に発現され得 る。ヒトＦｃεＲ１α鎖用の組換えｃＤＮＡクローンは、α鎖から誘導されるポ リペプチドと結合しているＩｇＥが多量に合成されることを１指して、適当な原 核発現ベクター中に導入される。この発現ベクターは次いで適当は宿主中に形質 転換されてよ（、次いでヒトＩｇＥに結合できる蛋白質の発現がモニターされる 。

ヒトＦｃεＲ１α鎮の完全なまたは部分的なアミノ酸配列に相当するペプチドは また、例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、　　ｒジャーナルオフ アメリカンケミカル　ソサイエテイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｃｈ−ｅｍｉｃ−ａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　）　Ｊ　　８５．２１４９ （１９６３）に一般的に記載されている固相合成（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ）手段により合成され得る。この方法で合成されたペプチドは 完全なαサブユニットであってよく、または、より小さなαサブユニットの活性 部分に相当する断片であってもよい。

１、アレルギ一応答を防ぐための拮抗質として、または薬物スクリーニング分析 における試薬としてポリペプチドまたはその断片を使用すること。

２、療法としてポリペプチドを使用すること。

３、患者のＩｇＥレベルをモニターするためにポリベブチドを使用すること。

４．上記目的のために使用されるであろうポリペプチドを合成するためにＤＮＡ 配列を使用すること。

５　診断上の分析に有用なりＮＡプローブを作るｃＤＮ人配列配列成するために ＤＮＡ配列を使用すること。

本発明は以下の実施例と関連して更に詳述されるが、それらは例示の目的でのみ 示されている。

実施例１．ヒトＦｃεＲＩ　　アルファ　ｃ　ＤＮＡクローンの分離・ ＲＮＡは、チルブライン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）等、バイオケミスト５）に記載さ れたＫＵ８１２細胞から抽出され、そしてポリＡ＋ＲＮ人はアヴイヴ（Ａｖｉｖ ）等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、。

６９、１４０８（１９７２）の方法に従って、オリゴ−ｄＴクロマトグラフィー によって分離される。

ｃＤＮ人合成はキネット（Ｋｉｎｅｔ）等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ）＋２６．　２５６９　（１９８７）に既に記載されたように行わ れる。得られたｃＤＮ人分子はＥｃｏＲＩリンカ−（１ｉｎｋｅｒｓ）に連結さ れ、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断され、大きさを分別され、そしてヤング（Ｙｏｕ ｎｇ）等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）　＋２２２．７７８（１９８３）で述 べられたようなλｇｔｌｌ　　ＥｃｏＲＩアーム（ａｒｍｓ）に連結される。

λｇｔｌｌＤＮＡを含んだｃＤＮＡ挿入は、バクテリオファージ　ラムダ　粒子 中にパッケージされ、ＹＩＯ９０上で増幅される。全量１．２ｘｌＯ’の独立ｃ ＤＮＡクローンが得られる。ｃＤＮパライブラリ−は１５０ｍｍ”のプレート（ プレートあたり１０６）のＹ１０９０上に培養され、ニトロセルロース製のフィ ルターに転写される。ｃＤＮＡライブラリーフィルターはコーチャン（にｏｃｈ ａｎ）等、　’ａｔＬ−（Ｃｅｌｌ）：４４．６８９（１９８６）に於けるが如 くニックトランスレート（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）されたＣＤＮＡフ ラグメントを使用して、インサイチュ−ハイブリダイゼーション（ｉｎ　５ｉｔ ｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によってスクリーニングされる。ＣＤＮＡフ ラグメントは、ヌクレオチド１１９−７８１に相当するラットＦｃεＲ１アルフ ァ　ｃＤＮＡから得られる。正のプラクは同定され、精製され、そしてｃＤＮＡ 挿入は、標準手法を使用して、ｐＯＥＭベクター〔プロメガ　バイオチク（Ｐｒ ｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、マジソン（Ｍａｄｊｓｏｎ）、ライスコンシン （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）　）中にサブクローンされる。ｃＤＮＡ挿入は、制限酵 素分析によってマツプされ、ｐＧＥＭ誘導体中にサブクローンされ、そしてプロ メガ　バイオチク（マジソン。

ライスコンシン）のＧｅｍ５ｅｑ二重ストランド（ｓｔｒａｎｄｓ）Ｄ　Ｎ人配 列システムプロトコールに従って、サンガー　（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ 、Ｓ、ニア４．５４６３（１９７７）　（７）ジデオキシヌクレオチド法を使用 して配列される。

ＤＮＡシークエンスはｃＤＮＡクローンｐＬＪ６６３（ヌクレオチド１−１１５ １）の両ストランド、およびクローンｐＬＪ５８７（ヌクレオチド６５８−１１ ９８）の各末端の３００ｂｐを同定する。２つのｃＤＮＡクローン間のＤＮＡシ ークエンスの矛盾は観察されなかヒトＦｃεＲ１アルファ　ｃＤＮＡのシーフェ ンスは第５図に示されている。ヒトＦｃεＲ１アルファポリペプチド用の予測さ れるアミノ酸シークエンスは、ヌクレオチド１０７−１０９でメチオニンから始 まり、ヌクレオチド８７５−８７７でアスパラギンで終了する以下のヌクレオチ ドシーフェンスを示す。

予測される十分に発達してＮ末端の部位は、ヘイジン（Ｈｅｉｊｎｅ）、ヨー口 　ジャーナル　オブ　バイオケム（ＥｕｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ）：１３３，１７及び核酸研究（Ｎｕｃ］ｅｉｃ　Ａａｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ）：１４，４６８３（１９８６）に述べられた規則に従って、ヌクレオチド１ ８２−１８４でバリンがあることを同定する。

これは２５アミノ酸シグナル　ペプチドを予測する。

ｃＤＮＡＤＮＡシーフェンスは、ヒトＦｃεＲＩ　　アルファ鎖が１７９−残基 の細胞外部分（アミノ酸残基２６−２０４）と２個の相同性ドメイン（１４から ２５残部は同一である；残部８０−１０４および１６３−１９０）、２０−残基 のトランスメンプレインセグメント（残基２０５−２２４）及び８塩基性アミノ 酸を含む３３残基の細胞質ドメインを含むこと示す。

全体的にみて、ヒトとラットＦｃεＲＩ　　アルファシーフェンスの間に４９％ の同一性、そしてヒトＦｃεＲ１アルファとマウスＦｃＧＲアルファの間に３７ ％の同一性がある（第６図）。

相同性のもっとも高いレベルは、一般のアスパラギン酸残基を取り囲む９個のア ミノ酸が同一であるトランスメンプレイン部分の範囲内である。

実施例２．真核生物細胞におけるヒトＦｃεＲ１アルファの完全な及び可溶性形 態の発現 ヒトＦｃεＲ１アルファ鎖のための組み換えｃＤＮ人を使用して、これらのコー ドしているシーフェンスを、アルファ鎖の完全な及び可溶性形態の両方を大量に 合成することを指示するため、適当な真核生物発現ベクターに導入することがで きる。

表面の発現のためには、アルファサブユニットをベータまたはガンマ　サブユニ ットと複合化する必要があるだろう。これに対して、アルファサブユニットの分 泌された形態の真核生物発現のためには、これは必要としないであろう。この目 的のための適当なベクターは、クレノ（Ｃｕ１ｌｅｎ）、　（１９８７）、酵素 学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ）’）　１５２．ア カデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　６８４で既に記載され ているｐＢｃ１２ＢＩである。

完全なアルファ鎖をコードする発現ベクターの組み立ては、以下のように単離さ れつる（第７図）：独特なりｇｌｌｌ−Ｓｓｐｌフラグメント（ヌクレオチド６ ５−８９８）はｐＬＪ６６３から単離され、Ｂｇｌｌｌ末端はＤＮＡポリメラー ゼ　■クレノー断片で充填され、そして旧ｎｄ１１１−ＢａｍＨＩ　または旧ｎ ｄｌｌｌ−３ａｍｌのどちらか（末端はＤＮＡポリメラーゼ　Ｉクレノー断片で 充填されることによって平坦になる）で制限されたｐＢＣ１２Ｂ　］に連結され る。

２つの異なる構造を試みる理由は、前者が３′インドロンを含むのに対して、後 者は含まないからである。イントロンの存在または不存在は、これらのベクター によってトランスフェクションされた細胞中で合成されたアルファタンパク質の レベルに影響するかもしれない。

アルファ鎖の可溶性形態をコードする発現ベクターの組み立ては、上記の発現ベ クターのアルファ鎖中（ｐＨＡｌ、ｐＨＡＩＩ、第７図）、コード領域のヌクレ オチド７１９−７２１で末端コドンを導入することによってなし遂げられる。

これはヒトアルファ鎖の分泌可溶性形態の合成で得られた推定されたトランスメ ンブラン、および細胞質領域を除くだろう。末端コドンの導入は、モリナガ（Ｍ ｏｒｉｎａｇａ）等、バイオ　チク（Ｂｉｏ、　Ｔｅｃｈ、　）　：２．６３６ （１９８４）に概説されたようにオリゴヌクレオチドに指示された部位での特殊 な突然変移誘発によってなし遂げられる。

オリゴヌクレオチドのシーフェンスは５°ＡＡＧＴＡＳＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＴ ＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＴＴＧ３′であろう。得られた発現ベクターはｐＨＡｓＩ 及びｐＨＡｓ１１（第７図）であり、これらはアミノ酸１−２０４に相当する先 端を切ったアルファタンパク質の合成を指示するであろう。

真核生物細胞におけるこのプロティンの発現は、十分に発達した、アミノ酸残基 ２６−２０４を包含するＩｇＥ結合部分の合成に於いて得られるであろう。

その後、発現ベクターは、ＣＨＯまたはＣｏＳのような適当な真核生物細胞にク レノ（Ｃｕ１ｌｅｎ）、　（１９８７）、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１５２．アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　ニーニーヨーク、６８４で記載された標準手法によって 、０４１８またはメメトレキサート耐性のような選択マーカーの存在下で、導入 される。

メメトレキサート耐性の選択マーカーが付加された利点を持つため、発現のレベ ルは、より高いレベルの薬物に細胞を導入することによって増幅される。

タンパク質の合成は、これらの細胞（完全なアルファ鎖の場合）に結合するため に、またはアルファ鎖の可溶性形態に場合にこれらの細胞から分泌されたタンパ ク質がベータが存在してもしなくてもＩｇＥと結合する能力を持つことを証明す るために、ヒトＩｇＥ（またはラッ）ＩｇＥ）の能力を表示することによってモ ニターされる。

実施例３．原核生物細胞におけるヒトＦｃεＲ１アルファの可溶性形態の発現 ヒトＦｃεＲ１アルファ鎖のための組み換えｃＤＮ人クコクローン用して、これ らのコードしているシーフェンスを、アルファ鎖から誘導された可溶性（膜の無 い範囲）ＩｇＥ結合ポリペプチドを大量に合成を指示するため、適当な原核生物 発現ベクターに導入することができる。

この目的のための適当なベクターは、クロール（Ｃｒｏｗｌ）等、ジーン（Ｇｅ ｎｅ）：３８．３１（１９８５）に記載されたｐＥＶ−１である。

可溶性アルファ鎖をコードする発現ベクターの構成は、第８図に示されているよ うに単離することができる：独特なＭｓｔｌｌ−Ｓｓｐｌフラグメント（ヌクレ オチド１９５−８９８）はｐＬＪ６６３から単離され、Ｍｓｔ■１末端はＤＮＡ ポリメラーゼ　ｌクレノー残基で充填され、そしてＥｃｏＲＩで制限されたＰＥ Ｖ−１に結合し、末端はクレノー（第８図、ｐＥＶＡ）で充填される。

十分に発達したアルファ鎖のＮ末端は、オリゴヌクレオチドに指示された位置で の特殊な突然変移誘発によって再構成される。

オリゴヌクレオチドのシーフェンスは５’　ＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣ ＴＣＡＧＡＡＡＣＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧ３’である。発現ベクターｐＥｖ Ａへのこのシーフェンスの導入は、ＥＶ−１ベクターのメチオニン残基ヲアミノ 酸残基２７−２０４　（ｐＥＶＨＡ、第８図）によって引続くバリン−２６（ア ルファ鎖の予測される十分に発達したＮ末端）の隣に位置させる。

可溶性の形態のＦｃＢＲＩアルファの再構成は、オリゴヌクレオチドに部位を指 示された突然変移誘発によってなし遂げられる。オリゴヌクレオチドのシーフェ ンスは、５′　−八ＡＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＴ ＴＧ−３°であろう。

発現ベクターへのこのシーフェンスの導入は、トランスメンプラン領域の開始ち ょうど前にポリペプチドの合成を終わらせる。発現ベクターｐＥＶＨＡＳによっ て符号化されたタンパク質は、アミノ酸残基２６−２０４に相当するアルファ鎖 の可溶性形態の合成を正確に指示するべきである。

その後、発現ベクターは適当な宿主に形質転換される。

本発明は好ましい具体例に関連して記載されるが、本発明の範囲を特に述べられ た形態に、制限するものではないが、これに反して、記載されたクレームによっ て定義されているように本発明の意図および範囲内に含まれるような代替物、変 成物、および等個物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）は包含される。

物質及び方法 ポリアクリルアミドゲルから電気溶出したβサブユニットは、（９）で記載した 如く製造した。トリブンン含有ペプチドは、高圧液体クロマトグラフィーにより 分離し、次いで前の（３）の如く配列を分析した。

ｃＤＮＡのクローニング及び配列分析 グアニジニウムイソシアネート法（１０）によりラットの好塩基球白血病（ＲＢ Ｌ）’細胞から抽出したＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム（１１） 上で分画し、次いでｐｕｃ−９及びへｇｉｌｌライブラリー（１１，１２）を構 成するために使用した。

３略語ＲＢＬ、　　ラットの好塩基球白血病。

本文中に記載した配列分析法は、ＥＭＢＬ中に記載されている方法である。ジエ ンバンク　データ　ベースアンタイン　ジエネシス（ＧｅｎＢａｎｋ　ｄａｔａ 　ｂａｓｅ　Ｕｎｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅｓｉｓ）　＋　マウンテン　ビュー（Ｍｏ ｕｎｔａｉｎνｉｅｗ）、ＣＡ、及びＢｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｌａｂ 、　、　ハイダイベルク　アセッシタン（Ｈｅｉｄｅｉｂｅｒｇ　Ａｃｃｅｓｓ ｉｏｎ）　Ｎ（１１０３８−３９゜コロニーは、モデル３８０Ａ自動ＤＮＡ合成 装置〔アプライド　バイオンステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 、　フォスター　シティ−（Ｆｏｓｔｅｒ　ＣＨｙ　）　、　　ＣＡ）により製 造したオリゴヌクレオチドを使用して前の（３）の如くスフ−リーニングした。

ｃＤＮＡ挿入体をｐＧＥＭ−４又はｐＧＥＭ−３２にサブクローン化し、次いで その結果得られた二重螺旋ＤＮＡを供給者〔プロメガ　バイオチク　マデイソン （Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　）　）により推薦された 方法に従って、Ｇｅｍ５ｅｑ／ＲＴ配列分析系を用いて配列分析した。この方法 により予め配列分析された領域に相当する２０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを 、入手困難な他の重複配列を生じさせるだめのプライマーとして使用した。幾つ かの例において、ＤＮＡ配列分析は供給者〔ユナイテッド　スティン　バイオケ ミカル（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　）　、　　ク リーブランド（Ｃｕｅνｅｌａｎｄ　）　）により推薦された如き配列分析法を 使用して行った。

試験管内転写及び翻訳において、βサブユニット及びその種々の突然変異又は截 形形態をｐＧＥＭ−４又はｐＧＥＭ−３Ｚ転写ベクター（プロメガ　バイオチク ）の何れかにサブクローン化した。未標識化ＲＮＡ５は、供給者により推薦され た如きＳＦ３又はＴ７ボリメラーゼの何れかを使用して合成した。キャップ形成 反応は（１３）で報告したように行った。ＲＮアーゼを含まないＤＮＮアーゼを 用いた鋳型の消化後、ＲＮＡをフェノール／クロロフォルムを用いて抽出し次い でエタノールから３回沈澱させることにより更に精製した。次いで、このＲＮＡ を供給者（プロメガ　バイオチク）により推薦されたように、〔３″Ｓ〕メチオ ニンの存在下でラビット網状赤血球の微生物製ヌクレアーゼ処理分離体を用いて 翻訳した。翻訳生成物を、洗剤（３−（３−（コラミドプロピル）ジメチルサム ーモニオ）−Ｉ−プロパンスルフォネート２０ｍＭを用いて希釈した：ボレート ー緩衝化塩類（ｐＨ８）中には、ｍ１当たりアプロチニン３０μｍ、ｍ１当たり フェニルメチルースルフオニルフルオリド１７５μｇ、ｍ１当たりロイペプチン １０μｇ、及びｍ１当たりペプスタチン５μｇが含まれ、そして（１４）におい て記載したようなモノクローナル抗体を用いて免疫沈澱化される。

レセプターの内部標識化 標識化アミノ酸及びモノサッカライドの生物合成的結合は、（１５）において記 載した。ゲル上での精製及び分析並びに１ｇＥ−レセプター複合体のイムノブロ ッティングに関しては、（１４）において記載した。

ＲＮＡ　トランスファーブロッティング全ＲＮＡのうちの３０μｇを、２％ホル ムアルデヒドを含む１％アガロースゲルに溶解し、次いでニトロセルロースフィ ルター（１１）に滲ませた。このフィルターに、（１１）において記載したよう にβｃＤＮＡの制限フラグメント（ヌクレオチド１−１７４）を混合し、次いで ６５℃でクエン酸ナトリウム１５ｍＭ（ＮａＣ１／１．５ｍＭ）を用いて洗浄し た。

抗体− 所望の制限フラグメント（１６，１７）を含む発現ベクターを用いて翻訳された ニスチェリチア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を、培養し且つ誘 導させ、次いで再配列プロティンのために富化されたフラクションを（１７）に おいて記載したように製造した。ナトリウムドデシルサルフェート（Ｎ　ａ　Ｄ 　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４）中のポリアクリルアミドゲルにより分離後、形質転換−特 定プロチインを溶出し、次いでラビットを免疫化するために使用した。プロティ ン約１００μｇを、完全フロインドアジュバント中で注射した；これに続いて、 完全アジュバント中でプロティン２５μｇを付加免疫注射した。モノクローナル 抗−β抗体ｍＡＢβ（ＪＲＫ）及びｍＡ（ＮＢ）（後者は、デヴイッド　ハロウ カ（Ｄａｖｉｄ　Ｈａｌｏｗｋａ　）　、　コーネル大学（Ｃｏｒｎｅｉｌ　Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供された遺伝子〕の単離及び特性付けは、（１４） において記載した。

完全なβ鎖を配列分析するための繰り返しの試みは不成功だったので、我々はト リプシンの温浸物からペプチドを単離した。初期の温浸物から単離されたペプチ ド（ＮＣＬＩ）は配列Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｉ−Ｔｙ ｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−１ｉｅ−Ｔｙｒ　−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａ ｓｐ−Ｙｈｒを有していた。後の温浸物からの同じペプチドは、ＮＨ，末端にお ける付加的なロイシン及びＣ０ＯＨ末端におけるアルギニンを示した。３種の他 のペプチド（各々相当な収率で単離された）の配列分析を、続く図中に示す。

ペプチド１について得られた初期の配列分析は、３２倍縮重の２種の２６−ｍａ ｒオリゴヌクレオチド：５′ＴＣＡＴＡ−３’を構成するために使用した。ＲＢ Ｌ細胞のｍＲＮＡから構成されたＡＧＴ１１ライブラリーは、これらのオリゴヌ クレオチドの１＝１混合物を用いてスクリーニングした。６種の正のクローンは 、同じ制限パターンを与える。最も長い挿入体を含むクローンは、図１の上部に 示す手順に従って配列分析した。この配列はヌクレオチド４６−４８及び５５− ５７　（これらは、各々２４６又は２４３残部のポリペプチドを与えるであろう （図２人）〕における可能な出発コドンを予言する。

分子量約２７０００の予言されたＭは、ポリアクリルアミドゲル（１８）により 分析した場合には、βサブユニットの見掛けの分子量よりもほぼ２０％小さい。

更に、枠内に止まっているコドンは出発コドンの明らかな上流側ではなかった。

真の出発コドンはまだ別の５′であったという可能性を除外するために、我々は 制限フラグメント（ヌクレオチド７−４７４）及び合成オリゴヌクレオチドプロ ーブ（ヌクレオチド３−３２）を用いてｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニン グした。２８種の付加的なりローンを単離し、次いでそれらの制限パターンを調 べた。２０種は元のクローンと同じであった。５′末端における６種の付加的な ヌクレオチド（ヌクレオチド１−６１図２Ａ）のみを同定した。初期の終止が６ 種のコドンにおいて認められ、その他はヌクレオチド３７５（図２Ｂ）と同一の 配列を存していた。１種の２．４’−ｋｂクローンは、アデニンにより置換され たシチジン２４３を有していた。この置換はＰｓｔＩサイトを廃止し、そしてヌ クレオチド４７０に新規なＣ１ａｌサイトを創造する。更にこれにより、Ａｌａ −１４０はＡｓｐ−１４０になるであろう（図２Ａ）。最後に、１種のクローン は５′方向に約８５０の塩基対（ｂ　ｐ）により延長された。図２人に示す配列 分析を用いた結合はＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ人ＴＧ（新規に 生じたＡＴＧの最後の２種のヌクレオチドは、以前の配列のヌクレオチド８及び ９に相当する）であった。このクローンは２種の独立したｃＤＮＡの結紮から生 じたらしい。ｐｕｃ−９ライブラリーのスクリーニングは、３種のクローンを明 らかにした。しかしながら、これらの配列はヌクレオチド８４を越えて５′を全 く延長しなかった。

ＲＮＡ　トランスファーブロッティングＲＮＡ　）ランスファーブロッティング を、ＰｓｔＩフラグメントプローブ（ヌクレオチドｌ−４７４）を使用して高緊 縮下で行った。ＲＢＬ細胞は、約２．７ｋｂ及び１．７５ｋｂにおいて二つの大 きなバンド（上部バンドは下部バンドの約２倍の強度を有している）を与えた。

１．２ｋｂにおける小さなバンドも認められた。高親和性１ｇＥレセプターを発 現しない種々の細胞；ラット下垂体系統ＧＨ３（アメリカン　タイプ　カルチャ ー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ）　ＮＩＩＣＣＬ８２．Ｉ）、ラットグリア細胞系統Ｃ６（ＮＣＬＣ ＣＬｌ　０７）　、マウスライディッヒ細胞系統１−１０（ＮＩＩＬＣＣＬ８３ ）　、及びとりわけマウス単球系統Ｊ７７４（ｋＴＩＢ６７）及びラットリンパ 腫“ＮＴＤ’　　（１４）を用いて、負の結果を得た。

試験管内発現 ＰｓｔＩサイトを含むβクローンをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で 転写し、次いで得られたｍＲＮＡを（”Ｓ）メチオニンの存在下でラビット網状 赤血球の分離体を用いて翻訳した。非フラクション化翻訳物質は、ＲＮＡが省略 されたか又は互変性ＲＮＡ　（ブロウム（Ｂｒｏｍｅ　）モザイクウィルス）が 置換された（データは示されていない）対照と比較して、Ｍ約３２０００におい て大きな成分を示す。ＮａＤｏｄＳＯｎ中のポリアクリルアミドゲル上に放射性 物質を沈澱させたモノクローナル抗−β抗体ｍＡｂβ（ＪＲＫ）及びｍＡｂβ（ ＮＢ）（１４）（図３Ａ、　　レイン２及び３）・・・・しかし、不適切な抗体 （レイン５）ではない・・・・は、Ｍ３２０００において大きなバンドを示した 。このバンドは、標識化ＲＢＬ細胞（レインｌ）の抽出物からのｍＡｂβ（ＪＲ Ｋ）により沈澱させられた上部の二重バンドと同一の移動性を有していた。再現 性は良（なかったけれども、オートラジオダラムは試験管内で合成された物質も 試験管外で合成されたβ鎖中に見られた低分子量成分を含んでいたということを 示した。試験管内で合成されたプロティンの移動度は、以前にβサブユニットを 用いて観察された如く還元により不変であった。Ｃ１ａＩサイトを含むクローン （これは、最初のＡＴＧコドンを欠く）は、ゲル上の移動度がＰｓｔＩサイトを 含むクローンの移動度と区別できなかったプロティンの合成に導く。他方、新規 に生しだ八ＴＧ（上記）を含む変体クローンは、見掛けＭ３３５００を有する幾 分か大きなプロティンの合成に導く（データは示されていない）。βサブユニッ トのＮ　Ｈ２−末端２１アミノ酸のだめの転写コード化の試験管内翻訳は、ｍＡ ｂβ（ＪＲＫ）により沈澱可能な生成物を導く（図３Ｂ）。

イー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）発現 ２種のＨｉｎｄＩフラグメント（Ａ、　　ヌクレオチド１０６−９８：Ｂ、　　 ヌクレオチド４９９−７８７）を、イー、コリ発現ベクター中に個々にサブクロ ーン化し、次いて抽出物を誘導カルチャーから製造した。一つのイムノブロッテ ィング実験結果を図３０に示す。ＨｉｎｄＩフラグメントＢを含むベクターを用 いて形質転換したバクテリアから抽出した物質は、ｍＡｂβ（ＮＢ）と反応性で あるがしかしｍＡｂβ（ＪＲＫ）と反応性ではないＭ１４０００の成分を表わす 。別のＮＨ，−末端Ｈｉｎｄｌフラグメント人を含む形質転換体からの抽出物は 、■ 全（抗体とは反応しなかった（上記と比較）。フラグメントＡにより生じたラビ ット抗体は、イムノプロット上で２種のモノクローナル抗−β抗体が反応した位 置（図３Ｄ、　　レイン１−３）で、精製されたレセプターと正確に反応し、次 いでＲＢＬ細胞の非フラクンタン化洗剤抽出物から完全な１２′Ｉ−標識化１ｇ Ｅ−レセプター複合体を定量的に沈澱させる（データは示されていない）。

生物合成的混合 区別できるように標識化された２種の異なるアミノ酸の生物合成的混合を使用す ることにより、我々はレセプターのサブユニット中のそれらの比率を決定した（ 表１゜右部分）。互いに区別可能なアミノ酸４種の比率は、３種の潜在的グリコ ジル化サイトを予言するβサブユニットのためのβｃＤＮＡから予言された比率 と充分に一致したので、我々は〔３Ｈ〕マンノース及び（”Ｓ）システィンを使 用する二重標識実験も行った。

＊　　Ａｌｃａｒａｚ等（７）により報告されているように各アミルを示した（ 表１．右部、欄４）。

Ｌ」 一ユニ・・トについてのｃＤＮＡコード本発明者かβサブユニットにつきコード を単離したものはｃＤＮＡであるには十分な証拠がある。（ｉ）ｃＤＮＡのイン ビｉ・口転写および訪導されたｍ　ＲＮ　Ａの翻訳はゲル電気泳動による明確な 分子量が真正なβ鎖のそれと区別できないところの蛋白質を生成する（第３図） 。

（目）ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａはβ鎖のトリプシン消化酵素より単離された４個のペプチ ドの配列（第２Ａ図）そして直接分析および生合成組み入れとよく一致するとこ ろの組成（表１）を予測しうる。　（ｉｉｉ）βサブユニツト上の側別のエピト ープと反応性のある単クローン性抗体（１４）はクローンされたｃＤＮＡ　（第 ３Ａ図）からインビトロ合成された蛋白質を沈殿させ、そしてそのうちの−はｌ ：、ｃｏｌｉと表わされた蛋白質のフラグメントと反応する（第３Ｂ図）、（ｉ ｖ）Ｅ、ｃｏｌｉ形質転換細胞により合成されたβサブユニットのフラグメント に対して生じた多クローン性抗体は、イムノプロット（第３　Ｃ１，）上での鎖 とそして溶液中のＩｇＥ−受容体と反応する。

ｉ葭ヱヱユ クローンされたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｎｏ、１）の５°末端でのヌクレオチド配列 はそれ自体で読み取り枠の開始点゛を明瞭に限定するものでない、リーダー配列 は無くまた仮定開始コドンに先立つ枠内（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）終止コドンも無い 、加えて、該サブユニットはグリコジル化されていないけれども、ｃＤＮＡから 演纏された分子量（Ｍ　　２７０００）は、ＮａＤｏｄＳＯ，ゲルにつき観測さ れた分子量（Ｍ　　３２０００）より実質的に低い、したがって、おそらく開始 コドンは逸してしまったと思われる。にもかかわらず、集合データはβサブユニ ットについて十分なコーｌ〜配列か回復したという強力な証拠を提供する。（ｉ ）二つの別個の文献のいずれにおいても、より＆！ｌ：長した５°配列を用いて ｃＤＮＡを表わそうとした更なる試みは失敗した。　（ｉｉ）５°延長研究によ り生じた主な種は我々のクローンの多くが開始するところの点にて正確に終結し た。　（ｉｉｉ）　５°末端での第二ＡＴＧフトンは公知の開始サイト（２０） の常識的特性と合致する。近くの５°ＡＴＧコドンにより先立たれることは異常 であるか、積でなく　（２０）、そしてヒトαサブユニットについて観察されて いる（４．５）　、　（ｉｖ）ｅＥに述べたように、第二ＡＴＧコドンのみを含 むｃＤＮＡから転写されたｍ　ＲＮ　Ａのインビトロ翻訳は、真正なβ鎖から長 さにつき区別できないポリペプチドを与える。仮定開始コドンに対する開始コド ン４８ヌクレオチド５°を含む変態クローンは、βサブユニットの分子量よりも 適当に大きい明確な分子量を持ったポリペプチドのインビトロ合成を指図した（ 結果）、従って、真正な鎖とクローン１からインビトロ合成された蛋白質との間 の明確な分子量の一致は意義あるものである。ＲＮＡ転移プロットデータは、〜 ２．７　ｋｂのｍ　ＲＮ　Ａ　、正確には本発明者が連鎖（第２［２）Ｌ、たｃ ＤＮＡから予想されたものて、ユ２００ヌクレオチドのポリ（＾）テールを与え るものを示す、以降の検討において本発明者は、β鎖は第二ＡＴＧによりコード 化されたメチオニン残基から始まり、そして、従って２４コ残基の長さを有する ことを前提とする。

ユニ・・トの　の／嘱 分析された３７個のクローンの中で、　Ｃ１ａ　ｌ制限サイトを含む単クローン か唯一個のみｕｉａされた。このクローンはおそらくはクローニングの間に単塩 基突然変異から生じたものてありて正常に発生するｍ　ＲＮ　Ａを表現しそうも ない、逆に、欠失配列（第２図Ｂ）を示す６個のクローンが観察されそしておそ らくはｍＲＮＡの真正な種を反映したものであろう、翻訳する場合、単トランス メンブランセグメントのみを持つＭ、　１４０００蛋白質につきコードするであ ろう。

Ｌ且！１ βサブユニットの配列はＮ−結合グルコシル化のための潜在的サイトを残基５． １５１と１５４に含む、しかし、過去および新規の組み入れデータはβサブユニ ツト中の炭水化物について確証を与えない（文献１５および１８．並びに表１） 、該配列は、以前に報告された配列に対して。

特にＦｃ受容体またはＦｃ結合因子と関連した配列に対して、異常な特徴と相同 を何等示さない。

ポロジ　ル 水治療法分析は、βサブユニットがプラズマ膜を４回交差することを暗に示して いる［！４図）、従って親水性のＮＨ，およびＣＯＯＨ末端は膜の同じ側にある であろう、βｃＤＮＡのフラグメントの表現はｍＡｂβ−（ＮＢ）かアミノ酸残 基１４９−２４３　（第３　Ｃ［］）内で反応することそしてｍ　Ａ　ｂβ（Ｊ ＲＫ）が残基１−２１（第３Ｂ図）を含むフラグメントと反応することを示して いる。

いずれの抗体もそっくりそのままの細胞と目にみえるほどに反応しないが両者は 音波処理細胞と反応するので。

組み合わせた結果は、プラズマ膜のシトプラズマ側において研究されたＮＨ，末 端およびＣ０ＯＨ末端と一致する。

初期の研究は、β鎖は膜が結合する（１３）と同時にタンパク質加水分解に抵抗 する１　２００００βｌ領域を含むと提言していた。またこの部分は内部二層標 識試薬（１８゜２２）により改質されそして化学架橋試薬を使用した場合（１８ ）αおよび／またはｙサブユニットに結合しかつ同時にジスルフィド結合がβサ ブユニットとｙ２サブユニットの間で起きた場合（２３）ｙサブユニットに結合 するようになるところの該残基を含むものであプた。残りのもの、β、はその場 で（２４，２５）ホスホリル化するが決して分離したフラグメントとして陽性に 同定されないところのセリン残基を含むと思われた。　サブユニットについてｃ ＤＮＡにより予測された配列は、ＮＨ，−末端５９残基またはＣ００Ｈ−末端４ ４残基のいずれか、あるいは両方の一部または全体が開裂してβｌフラグメント な生しることを暗に示していた。

コトランスフェクシタン 過渡表現のためのベクターを使用することによりαおよびβサブユニットの十分 な長さのコート配列をコトランスフェクシタンした。これまて、ＩｇＥ結合サイ トはトランスフェクトされた細胞の表面に現われなかった。

たぶんすべてのサブユニットは受容体の表面表現に達することか必要てあろう。

の　　にお番　　　ユニ・・ト？ マクロファージ上のＩｇＨについて低アフイニテイを持りた受容体のβ研究は、 ＩｇＥ−結合部分と化学的に架橋てきそして高アフィニティ受容体のβサブユニ ット（２６）と同様の明確な分子量を有するところの成分を明らかに示した。こ の成分からプロテアーゼ消化により生じたペプチドはβサブユニットから放出さ れたものと明らかに異なるか、他のＦｃ受容体もまたこれまて検出を逃れてきた （文献１４も参照せよ、）ところのβ様サブユニ・ントを含むものであるという 可能性か起きてきた。これまで、ａ々はこれにつきＲＮＡ転移プロット実験から 高い説得力て導かれた確証を持っていなかった。特に、Ｊ７７４細胞は、その免 疫グロブリン−結合鎖がＩｇＨについての高アフィニチイ受容体のα鎖（３）と 相当な相同を示すところのＦｃ受容体を含むことが知られている。

しかし２本発明者は、用いた方法によりβ鎖についてｍＲＮＡを検出することか てきなかった。同様に、ＮＴＤリンパ細胞は、それらかＦｃ受容体を有しかつイ ムノプロット上のｍＡｂβ（ＪＲＫ）（１４）と反応する低分子量の成分を示す けれども、負の結果を与えた。勿論我々は、Ｆｃ受容体かβ様サブユニットを有 することを除外することがてきない。

Ｌ１叉皿ユｌユ １、１ｌａｓｔｏｖ　、に、Ｅ、　Ｆｒ１ｅｄｌａｎｄｅｒ　、Ｍ、＆　Ｂｌｏ ｂｅｌ　、Ｇ、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　：１０８．３？ −４３゜２、　Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｊ、Ｖ、、　Ｌｕ５ｔｅｒ、Ａ、Ｄ、、　Ｗｅ ｉｎｓｈａｎｋ、Ｒ，、Ｋｏｃｈａｎ。

Ｊ、、　　Ｐａｖｌａｖｅｃ、Ａ、、　　Ｐｏｒｔｎｏｙ、Ｄ、＾、、　　ｌ（ ｕｌｍｅｓ、Ｊ、、　　Ｐａｎ。

Ｙ、−Ｃ，Ｅ、　＆　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ、Ｊ、Ｃ，、（１９８６）　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３４．７１８−７２５゜ ３、　Ｋｉｎｅｔ、Ｊ、−Ｐ、、　Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｉｌ、、　Ｉｌａｋｉｍｉ 、Ｊ、　＆　Ｋｏｃｈａｎ　、Ｊ。

（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　２６．４６０５−４６１０゜４、　 　Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ａ、、　　丁ｅｐｌｅｅｒ、１．．　　Ｂｅｎｆｅｙ、Ｐ、 Ｎ、、　　Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｅ、Ｉｌ、、　Ｓｉｒａｇａｎｉｎａ、Ｉｌ 、Ｐ、　＆　Ｌｅｄｅｒ、Ｐ、　（１９８Ｂ）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５　、１９０７−１９１１゜５、 　Ｋｏｃｌ＋ａｎ、Ｊ、、　Ｐｅｔｔｉｎｅ、Ｌ、Ｆ、、　ｌｌａｋｉｍｉ、Ｊ 、、　Ｋ１５ｈｉ、に、、＆に１ｎｅｔ、Ｊ、−Ｐ、　（１９ＢＢ）　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６．３５８４゜６、　Ｍｅｔｚｇｅｒ　、Ｈ， 、Ｋｉｎｅｔ　、Ｊ、　−Ｐ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｍｏｎｔｆｏｒｔ　、Ｒ，。

Ｒｉｖｎａｙ　、Ｂ、、　＆　Ｗａｎｋ　、Ｓ、　Ａ、　（１９８：ｌ）　Ｐｒ ｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ匡組肚ｎｎ中、ｍ集Ｙａ＊ａｍｕｒａ　、　Ｙ、　＆　Ｔａ ｄａ　、　Ｔ。

（Ａｃａｄｅｓｉｃ　、０ｒｌａｎｄｏ、Ｆｌ）、　Ｖｏｌ、　Ｓ、　ｐｐ、　 ４９３−５０１゜７、　ＭｃＰｈａｕｌ、Ｍ、　＆　Ｂｅｒｇ、Ｉ’、　（１９ ８６）　Ｉ’ｒｏｅ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

８、　　Ｍｉｎａｍｉ　　、Ｙ、　　、　　Ｗｅｉｓｓｓａｎ　　、Ａ、Ｍ、　 　、　　５ａｓｅｌｓｏｎ　　、　　Ｌ、Ｅ、　　＆Ｋｌａｕｓｎｅｒ　　、Ｒ ，Ｄ、　　（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４、 　２１＋８８−２６９２゜ ９、　　Ａｌｃａｒａｚ　　、Ｇ、、ＫｉｎｅＬ、Ｊ、−Ｐ、、　　Ｌｉｕ　　 、Ｔ、−Ｙ、＆　　ＭｅＬｚｇｅｒ。

Ｉｌ、、（１９８７）Ｂｉｏｃｌ＋ｅｓｉｓｔｒ　　２６　．２５６９−２５７ ５゜］０．ＣＩ＋ｉｒｇｗｉｎ　　、Ｊ、Ｍ、、Ｐｒｚｙｂｙｉａ　　、Ａ、Ｅ 、、ＭａｃＤｏｎａｌｄ　　、Ｒ，１，。

＆　　ＲｕｔＬｅｒ　　、Ｗ、Ｊ、（１９７９）　　Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒ 　　　１８．５２９４−５２９９゜１１、　　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　、　　丁、 、　　Ｆｒ１Ｌｓｃｈ　　、　　Ｅ、　　Ｆ、、　　＆　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　 　、Ｊ。

（１９８２）　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：　　八　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒ　　　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　 　Ｌａｂ、、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　）Ｉａｒｂｏｒ　　。

ＮＹ）。

１２、　　Ｙｏｕｎｇ、Ｒ，Ｙ、＆　　Ｄａｖｉｅｓ　　、Ｒ，Ｄ、（１９８３ ）ｒ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳ八　８０．　１１９４−１１９８゜１コ、　　Ｃｏｎｔｒｅｒ ａｓ　　、Ｒ，、Ｃｂｅｒｏｕｔｒｅ　　、ＩＩｌ、　　Ｄｅｇｒａｖｅ　　、 Ｌ　　＆Ｆｉｅｒｓ　　、ｗ、（１９８２）　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 　Ｒｅｓ、１０　．６３５：ｌ−６３６２゜１４、　　Ｒｉｖｅｒａ　　、Ｊ、 、　　Ｋｉｎｅｔ　　、Ｊ、　　−Ｐ、、　　Ｋｉｎ　　、Ｊ、、　　Ｐｕｃｉ ｌｌｏ、Ｃ。

＆　Ｍｅｔｚｇｅｒ　、１１．（１９８８）　Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、、発刊 中。

１５、Ｐｅｒｅｚ−Ｍｏｎｔｆｏｒｔ　　、Ｒ，、Ｋｉｎｅｔ、Ｊ、−Ｐ、、＆ 　　ｋｌｅｔｚｇｅｒ、）１．。

（１９８３）　　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒ　　　２７　．５７２２−５７２３゜ １６、Ｃｒｏｗｌ、Ｒ，、Ｓｅａｍａｎｓ、Ｃ，、Ｌｏｍｅｄｉｃｏ、Ｐ、＆　 　ＭｃＡｎｄｒｅｗ、Ｓ。

（１９８５）　　εｒｎｅ　　３８　．３１−３８゜１７、Ｐｏｒｔｎｏｙ　　 、Ｄ、＾、、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　　、　　＾、Ｈ１，にｏｃｈａｎ　　、Ｊ、。

Ｒａｖｅｔｃｈ　、Ｊ、Ｖ、　＆　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ　、　Ｊ、仁（１９８６） 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　　２６１　．１４６９７−１４７０３゜１８、Ｈｏｌｏｗｋａ　 　、Ｄ、＆　　Ｍｅｔｚｇｅｒ　　、１１．（１９８２）Ｍｏ１．１ｗ＋＊ｕｎ ｏ１．１９゜２１９−２２７　　。

１９、Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｓ、Ｊ、Ｍ、、Ｌｉｕ、Ｔ、Ｙ、、Ｐｏｙ、Ｇ 、＆　　Ｍｅｔｚｇｅｒ。

Ｉｆ、　　（１９８０）Ｊ、［１ｉｏ１．ＣＩｕｅｓ、、２５５　．９０６０− ０９６６゜２０、Ｋｏｚａｋ　　、Ｍ、（＋９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ ｄＳ　Ｒｅｓ、、Ｉｓ　　、３２１−３５３゜ ２１、　　Ｅｎｇｌｅｍａｎ　　、　　Ｄ、Ｍ、　　、５ｔｅｉｔｚ　　、Ｔ、 　　Ａ、、＆　　Ｇｏｌｄｍａｎ　　、　　八。

（１９８６）　　Ａｎｎｕ、　　Ｒｅｓ、　　Ｂｉｏ　　ｈ　　ｓ、　　［ｌｉ ｏ　　ｈ　　ｓ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｉｓ。

３２１−３５３゜ ２２、　　Ｈｏｌｏｗｋａ、Ｄ、、　　Ｇｉｔｌｅｒ、Ｃ，、Ｂｅｒｃｏｖｉｃ ｉ、Ｔ、　　＆　　Ｍｅｔｚｇｅｒ。

Ｈ，（１４１８２）Ｎａｔｕｒｅ　　（Ｌｏｎｄｏｎ）２８９　．８０６−８０ ８゜２３、　　ＫｉｎｅＬ、Ｊ、−Ｐ、、Ｐｅｒｅｚ−ＭｏｎＬｆｏｒｔ　　、 Ｒ，＆　Ｍｅｔｚｇｅｒ、　　Ｈ。

（１９８３）　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　　２２　．５７２９−５７３２゜ ２４、Ｐｅｒｅｚ−Ｍｏｎｔｆｏｒｔ　　、Ｒ，、Ｆｅｗｔｒｌｌ　　、Ｃ，＆ 　　Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｉｔ。

（１９８３）　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　　２２　．５７３３−５７３３゜ ２５、　　Ｑｕａｒｔｏ　　、Ｒ，＆　Ｍｅｔｚｇｅｒ　　、１１．（１９８６ ）　　Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３゜１２１５−１２２３゜ ２６、　　Ｆｉｎｂｌｏｏｍ　　、Ｄ、　　＆　　Ｍｅｔｚｇｃｒ　　、Ｉｆ、 　　（１９８２）　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１：１０．　１４８９−１４９１　　。

残基数 鐙口 ｌ＋１１＋１ Ｎ１．ＯＯ−３Ｃｅ　　　　　１．０　　　　　　＋＋＋Ｃｅ　　　Ｃｈ　　　 Ｏ１１０へ　　　　ｒ＋＋Ｍ　　　　　ｃｏ　　　　　−■　　　　　ψ　　門 　　０　　ψ　　いψ　　　　ψ　　　　ト　　　　ト　　　　ω　　　　ロ　 　　　　■　　０　−　−　−ｎｔ冨　　　＊＊＊　　　　＊＊＊　　　　　＊ ＊＊　　　　　ｙａｓ履Ｆｉｑ−６ 残基数 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年４月１８日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４６２８ Ｚ発明の名称 免疫グロブリンＥのための高アフィニティー受容体のγサブユニットをコードす るｃＤＮＡ３、特許出願人 名称　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　東京都千代田区神田駿河台１の６お茶の水スクエアＢ館 １９９０年１２、特許 請求の範囲 １、ＦｃεＲ１のγサブユニット二量体の鎖に該当するアミノ酸配列をもつポリ ペプチドをコードしているＤＮＡ断片。

２、ベクターと請求項１記載のＤＮＡ断片を包含する組換えＤＮＡ分子。

３、請求項２記載の組換えＤＮＡ分子を包含する形質転換した有機体。

４、ＦｃεＲ１のγサブユニット二量体の鎖に該当するアミノ酸配列をもつポリ ペプチドを生産する方法であって： 該ポリペプチドが生産されるような条件下で請求項３記載の形質転換した有機体 を培養し、次いで該ポリペプチドを単離する方法。

５、ＦｃεＲ１のγサブユニット二量体の鎖に該当するアミノ酸配列をもつポリ ペプチドであって、請求項４記載の方法により製造されたポリペプチド。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．ＦｃεＲＩのγサブユニット二量体の鎖に該当するアミノ酸配列をもつポリ ペプチドをコードしているＤＮＡ断片。
2. ２．ＦｃεＲＩのγサブユニット二量体の鎖に該当するアミノ酸配列をもつポリ ペプチド。
3. ３．ベクターと請求項１記載のＤＮＡ断片を包含する紺換えＤＮＡ分子。
4. ４．請求項１記載の組換えＤＮＡ分子を包含する形質転換した有機体。
5. ５．ＦｃεＲＩのγサブユニット二量体の鎖に該当するアミノ酸配列をもつポリ ペプチドを生産する方法であって； 該ポリペプチドが生産されるような条件下で請求項４記載の形質転換した有機体 を培養し、次いで該ポリペプチドを単離する方法。
6. ６．免疫グロブリンＥのための高アフィニティー受容体のβサブユニットをコー ドしているＤＮＡ配列。