DE69026844T2

DE69026844T2 - Lösliches Molekül, das mit ICAM-1 verwandt, aber davon verschieden ist

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Publication number: DE69026844T2
Application number: DE69026844T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Branford Ct 06405 Greve; Alan Old Saybrook Ct 06475 Mcclelland
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1989-01-24
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2010-01-13
Also published as: FI900331A0; IE74144B1; AU4876790A; NO900155L; DK0379904T3; DE69026844D1; PT92920A; JP3080631B2; AU641134B2; ATE137799T1; EP0379904A1; FI100601B; EP0379904B1; IL93119A0; NZ232203A; IE900257L; ES2087091T3; NO900155D0; GR3020481T3; KR100202435B1

Description

Die Erfindung betrifft eine lösliche Form des interzellulären Adhäsionsmoleküles (sICAM-1) sowie die sICAM-1-kodierende DNA-Sequenz. sICAM-1 und ICAM-1 sind sich darin wesentlich ähnlich, daß sie die ersten 442 NH&sub2;- terminalen Aminosäuren der extrazellulären Domäne gemeinsam haben. Jedoch unterscheidet sich SICAM-1 von ICAM-1 am C-Terminus, und diese Veränderungen verleihen sICAM-1 die Löslichkeit. Man weiß, daß ICAM-1 die Anhaftung vieler Zelltypen, einschließlich Endothelialzellen, an Lymphocyten, die das Lymphocyten-Funktions-assoziierte Antigen-1 (LFA-1) exprimieren, vermittelt. ICAM-1 hat die Fähigkeit zur direkten Bindung von LFA-1. Es gibt auch Belege für eine LFA-1-vermittelte Anhaftung, die nicht über ICAM-1 erfolgt. Zusätzlich hat ICAM-1 die Fähigkeit zur Bindung sowohl von LFA-1 als auch von humanem Rhinovirus. Es hat die Eigenschaft zur Inhibierung einer Infektion von Rhinovirus und Coxsackie-A-Viren. Es kann zur Aufhebung der Adhäsion von Zellen, vermittelt durch ICAM-1-Bindung einschließlich der ICAM- 1/LFA-1-Bindung, verwendet werden und ist daher zur Behandlung von Entzündung, Transplantatabstoßung, LFA-1-exprimierenden Tumoren und anderen Prozessen geeignet, bei denen die Zelladhäsion beteiligt ist. Auf Grundlage der wesentlichen Ähnlichkeit der extrazellulären Domänen von ICAM-1 und sICAM-1 hat sICAM-1 die für ICAM-1 identifizierten Eigenschaften.
Der Human-Rhinovirus-Hauptrezeptor (HRR) wurde transfektiert, identifiziert, gereinigt und rekonstituiert, wie in den ebenfalls anhängigen europäischen Patentanmeldungen EP-A2-0 319 815 und EP-A1-0 362 531 beschrieben. Es wurde gezeigt, daß dieser Rezeptor identisch mit dem zuvor beschriebenen Zelloberflächenprotein ICAM-1 ist. Die europäischen Patentanmeldungen 0 289 949 und 0 365 837 beschreiben ein Membran-assoziiertes Zelladhäsionsmolekül (ICAM-1) , welches die Anhaftung vieler Zelltypen, einschließlich von Endothelialzellen, an LFA-1-enthaltende Lymphocyten vermittelt. Diese Patentanmeldungen geben eine Übersicht über die gegenwärtige Forschung in dem Bereich der interzellulären Adhäsionsmoleküle. Es ist wichtig festzustellen, daß die Erfinder spezifisch nach einer alternativ gesplicten mRNA für ICAM-1 gesucht haben und keine identifizierten. ICAM-1 wurde zunächst aufgrund seiner Rolle bei der Adhäsion von Leukocyten an T- Zellen identifiziert (Rothiem R. et al., J. Immunol, 137: 1270-1274 (1986)), von der gezeigt wurde, daß sie durch die heterotypische Bindung von ICAM-1 an LFA-1 vermittelt wird (Marlin et al., Cell 51: 813-819 (1987)). Die Primärstruktur von ICAM-1 hat gezeigt, daß sie homolog zu den zellulären Adhäsionsmolekülen Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) und Mylein-Associated Glycoprotein (MAG) sind, und hat zur Vermutung geführt, daß es ein Mitglied der Immunglobulin-Supergenfamilie ist (Simmons et al., Nature 331: 624-627 (1988); Staunton et al., Cell 52: 925-933 (1988). Die DNA-Sequenz der cDNA-Klone sind in obigen Veröffentlichungen von Simmons et al. und Staunton et al., supra beschrieben, aus denen die Aminosäuresequenz von ICAM-1 abgeleitet werden kann. Das ICAM-1-Molekül hat eine typisch hydrophobe Membran-überspannende Region, die 24 Aminosäuren enthält, und einen kurzen cytoplasmatischen Schwanz mit 28 Aminosäuren. Das ICAM-1 aus dem Stand der Technik ist ein unlösliches Molekül, das auf Zellmembranen durch Lyse der Zellen in einem nicht-ionischen Detergens solubilisiert wird. Die solubilisierte ICAM-1-Mischung im Detergens wird dann durch ein Säulenmatrixmaterial und dann durch eine monoklonale Antikörpersäulenmatrix zur Reinigung geleitet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt eine endogene alternativ gesplicte Molekülspezies von ICAM-1, bezeichnet als sICAM-1, zur Verfügung, die eine alternative mRNA-Sequenz zeigt, und die ohne Zusatz eines Detergens löslich ist (siehe Fig. 1).
Die Erfindung stellt das gereinigte und isolierte humane lösliche interzelluläre Adhäsionsmolekül (sICAM-1) mit der in Fig. 1 offenbarten Sequenz, oder ein funktionales Derivat davon, zur Verfügung, mit der Maßgabe, daß die 11 C-terminalen Aminosäuren, wie in Fig. 1 offenbart, unverändert bleiben, das im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist. sICAM-1 kann aus HeLa-, HE1- und primär transfektierten Zellen davon erhalten werden, dadurch gekennzeichnet, daß es in Gegenwart eines Detergens löslich ist und daß es das Translationsprodukt der mRNA-Sequenzen, wie in Fig. 1 gezeigt, ist. Dieses natürliche Produkt von Humanzellen hat den Vorteil, daß es aus den Zellen in löslicher Form ausgeschieden wird und nicht immunogen ist. Das natürliche lösliche Produkt unterscheidet sich vom natürlich unlöslichen Produkt darin, daß das lösliche Produkt eine neue Sequenz von 11 Aminosäuren am C-Terminus enthält und keine Membran-überspannende und cytoplasmatische Domänen, die in der unlöslichen Form vorliegen, umfaßt.
Die Erfindung stellt eine gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, kodierend sICAM-1 gemäß der in Fig. 1 offenbarten Sequenz, als auch eine Wirtszelle, die diese Sequenz kodiert, zur Verfügung.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Wiedergewinnung des löslichen interzellulären Adhäsionsmoleküls in im wesentlichen reiner Form zur Verfügung, umfassend die Schritte:
(a) Entfernen des Überstands von nicht-lysierten Zellen,
(b) Aufgeben des Uberstands auf eine Affinitätsmatrix, enthaltend immobilisierten Antikörper, der zur Bindung an sICAM-1 in der Lage ist, vorzugsweise Antikörper gegen ICAM-1 und sICAM-1, oder Derivate davon,
(c) Ermöglichen, daß das sICAM-1 sich an den Antikörper der Matrix bindet,
(d) Waschen der Affinitätsmatrix unter Entfernung ungebundener Kontaminanten und
(e) Wiedergewinnen des sICAM-1 in im wesentlichen reiner Form durch Elution des sICAM-1 von der Matrix.
Weitere Reinigung unter Verwendung einer Lectin oder Weizenkeim-Agglutininsäule kann vor oder nach dem Antikörpermatrixschritt erfolgen. Andere Reinigungsschritte könnten eine Größenausschlußchromatographie, Ionenchromatographie und Gelelektrophorese umfassen. Weitere Reinigung durch Geschwindigkeitssedimentation durch Saccharosegradienten kann eingesetzt werden. Der Antikörper, der zur Bindung an sICAM-1 in der Lage ist, könnte Antikörper gegen ICAM-1 oder HRR umfassen.
Die Erfindung umfaßt polyklonale und/oder monoklonale Antikörper gegen sICAM-1.
Die Erfindung umfaßt ferner Antikörper, vorzugsweise monoklonal spezifische für sICAM-1, die zur Bindung an sICAM-1-Molekül gemäß Anspruch 1 in der Lage sind, und die nicht zur Bindung an ICAM-1, aber vorzugsweise zur Bindung an die 11 Aminosäuresequenz am C-Terminus, wie in Fig. 1 gezeigt, in der Lage sind. Für ein Verfahren zur Herstellung von Peptidantiseren siehe Green et al., Cell 28: 477-487 (1982).
Die Erfindung umfaßt auch eine Hybridomzellinie, die zur Produktion solcher Antikörper in der Lage ist.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der zur Bindung von sICAM-1 gemäß Anspruch 1 und nicht an sICAM-1 in der Lage ist, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen eines Peptid-Protein-Konjugats, wobei das Peptid- Protein-Konjugat spezifisch für mindestens einen Teil der einzelnen 11 Aminosäuresequenz ist, die im sICAM-1 gemäß Anspruch 1 vorliegt,
(b) Immunisieren eines Tieres mit dem Peptid-Protein-Konjugat,
(c) Boosten der Tiere und
(d) Gewinnen der Antiseren.
Die Antikörper sind in der Lage zur Bindung an sICAM-1 gemäß Anspruch 1 und nicht in der Lage zur Bindung an ICAM-1. Die Erfindung umfaßt die Hybridomzellinie, die einen Antikörper mit der gleichen Spezifität produziert, wobei der Antikörper von der Hybridomzellinie und nach dem Herstellungsverf ahren produziert wird.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur deutlichen Verminderung der Infektion von humanen Rhinoviren der Hauptrezeptorgruppe, umfassend den Schritt des in-Kontakt-bringens des Virus mit sICAM-1 oder einem funktionalen Derivat davon nach Anspruch 1.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Nukleotid und Aminosäuresequenz von sICAM-1.
Fig. 2 ist ein Vergleich der C-terminalen Regionen von sICAM-1 und ICAM-1. Die Nukleotid und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von ICAM-1 und sICAM-1 sind gezeigt, beginnend am Aminosäurerest 435. Punkte in der sICAM- 1-Sequenz bedeuten fehlende Nukleotide. Die Positionen der Stop-Codons in beiden Proteinen sind durch einen Stern angegeben.
Fig. 3 ist ein Vergleich der Struktur von sICAM-1 und ICAM-1. Die Membran-überspannende Region von ICAM-1 ist durch das gepunktete Rechteck und die cytoplasmatische Domäne durch das schraffierte Rechteck angedeutet. Der neue C-Terminus von sICAM-1 wird durch das durchgezogene Rechteck angedeutet. Die fünf vorhergesagten Domänen, die Homologie mit dem Immunglobulin zeigen, sind von 1 bis V numeriert.
Fig. 4 zeigt das ICAM-1-Gen und seine Expression in HRR-Tranfektanten. A: Southern-Blot von HeLa (Bahn 1), Ltk&supmin; (Bahn 2) und HE1 (Bahn 3) DNA, geschnitten mit Eco R1 und mit der Oligonukleotidsonde ICAM-1-Sonde untersucht; B: Northern-Blot von HeLa (Bahn 1), LTK&supmin; (Bahn 2) und HE1 (Bahn 3). poly A+ RNA, mit oligonukleotid ICAM-1-Sonde untersucht; C: PCR-Amplifikation von cDNA hergestellt aus HeLa (Bahn 1), Ltk (Bahn 2) und HE1 (Bahn 3) poly A+ RNA. Die verwendeten Primer stammten aus dem N-terminal und C-terminal kodierenden Regionen von ICAM-1 mit der Sequenz ggaattcATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC und ggaattcTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTGTT. Die Großbuchstaben bedeuten die ICAM-1-Sequenz, die Kleinbuchstaben die Restriktionsstellen-Linker. Bahnen 1 und 2. 72 Stunden Exposition; Bahn 3: 90 Stunden Exposition.
Fig. 5 zeigt ein Gel, das den Nachweis von ICAM-1 und sICAM-1-mRNA in HeLa und HE1-Zellen zeigt. PCR-Amplifizierung erfolgte auf 100 ng einzelsträngiger cDNA unter Verwendung der Primer-PCR 5,4 (CTTGAGGGCACCTACCTCTGTCGG) und PCR 3.4 (AGTGATGATGACAATCTCATACCG). Verlängerungen erfolgten bei 72ºC für 25 Zyklen und ein Zehntel des Produkts wurde auf einem 1 % Agarose/3 % NuSieve-Gel analysiert. Bahn 1, HeLa-cDNA; Bahn 2, HEL-cDNA; Bahn 3, LTK&supmin; -cDNA; Bahn 4, ICAM-1-Phagenkontrolle; Bahn 5, sICAM-1-Phagenkontrolle; Bahn 61 ICAM-1- + sICAM-1-Phagenkontrolle. Spezifische Amplifikationsprodukte von 105 bp und 86 bp sind durch die Pfeile angegeben.
Fig. 6 ist ein Western-Blot, der die Synthese einer löslichen Form von ICAM-1-Protein durch HeLa- und HE1-Zellen zeigt. Er zeigt die Existenz einer Proteinspezies in dem Kulturüberstand von HeLa- und HE1-Zellen, die mit ICAM-1 verwandt sind. Äquivalente Aliquots von Zellysatoren und Kulturüberständen wurden durch SDS-PAGE abgetrennt, auf Nitrozellulose geblottet und mit einem Kaninchen-polyklonalen Antiserum gegen ICAM-1 untersucht, worauf ¹²&sup5;J-Protein A folgte; eine Spezies, die nahe an der Position von Membran-gebundenem ICAM-1 wanderte, wird sowohl im HeLa- als auch im HE1- Kulturüberstand beobachtet.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der geklonten sICAM-1- und ICAM-1-Plasmide.
7A. pHRR3 ist eine cDNA in gesamter Länge kodierend sICAM-1 erhalten nach PCR. Klone 19.1-3 und 4.5 sind Teil-cDNA-Klone, die sICAM-1, erhalten aus einer HE1-cDNA-Bank, in lambda-GT11 kodieren. Unter den Klonen ist eine schematische Angabe des sICAM-1-Moleküls wiedergegeben. S bedeutet das Signalpeptid und I bis V die IgG-homologen Domänen. Das durchgezogene Rechteck bedeutet den einzelnen 11-Aminosäure-C-Terminus.
7B. pHRR1 und pHRR2 sind ICAM-1-cDNA-Klone, erhalten durch PCR in voller Länge. Die übrigen ICAM-1-Klone wurden aus einer HEL-cDNA-Bank in lambda-GT11 erhalten. Unterhalb der Klone ist eine schematische Angabe des ICAM-1-Moleküls wiedergegeben, welche das Signalpeptid (S), die fünf IgG- homologen Domänen (I bis V), die Transmembranregion (TM) und die cytoplasmatische Domäne (C) zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Entdeckung eines löslichen natürlichen Bindungsliganden an die Rezeptorbindungsstelle von humanem Rhinovirus (HRV) und der auch an LFA-1 bindet. Dieses natürliche lösliche Molekül ist verwandt aber auch verschieden von den als "interzelluläres Adhäsionsmolekül-1" oder "ICAM-1" bezeichneten Molekül, das unlöslich ist, an die Zellmembran gebunden vorliegt und eine typische hydrophobe Membran-überspannende Region und einen kurzen cytoplasmatischen Schwanz besitzt. Das neue erfindungsgemäße Protein hat eine DNA-Sequenz, die einen wesentlichen Unterschied von der publizierten DNA-Sequenz für ICAM-1 umfaßt. sICAM-1 enthält den Großteil der extrazellulären Domäne von ICAM-1, welche die funktionalen Domänen für multiple Funktionen einschließlich der HRV- und LFA-1-Bindung umfaßt, ihm fehlen jedoch die Memoran-überspannenden und cytoplasmatischen Domänen. sICAM-1 behält die Fähigkeit zur Bindung an HRV und LFA-1 und wird in löslicher Form ausgeschieden. Die DNA-Sequenz für sICAM-1 enthält eine Deletion von 19 Basenpaaren vom Nukleotid 1465 bis 1483 gemäß der Numerierung von Staunten et al., supra (1988). Der Rest des sICAM-1-Klons stimmt mit der publizierten ICAM-1-Sequenz überein mit Ausnahme einer Substitution eines G für A an der Nukleotidposition 1462, welche Glu 442 in Lys, wie in Fig. 1 gezeigt, verändert. Die Sequenz der Aminosäurereste in einem Peptid ist gemäß der Standardnomenklatur, die bei Lehninger's Biochemistry, Worth Publishers, New York, NY (1970) bezeichnet. sICAM-1 ist ein natürliches Produkt von HeLa- und HE1-Zellen und anderen humanen Zellen, welche die Möglichkeit haben sollten, daran zu binden, und die Infektion von humanem Rhinovirus und Coxsackie-A-Viren zu inhibieren. Es hat auch die Eigenschaft der Bindung an LFA-1 und kann zur Aufhebung der Adhäsion von Zellen, vermittelt durch die ICAM-1/LFA-1-Bindung, eingesetzt werden und ist daher geeignet als ein Therapeutikum bei der Behandlung von Entzündung, Transplantatabstoßung, Suppression von LFA-1-exprimierenden Tumorzellen und anderen Prozessen, an denen Zelladhäsion beteiligt ist. Isoliertes und gereinigtes sICAM-1-Protein als Therapeutikum würde nicht die immunogenen Probleme, die mit Fremdproteinen assoziiert sind, aufweisen. Die Sekretion eines löslichen natürlich vorkommenden Proteins eliminiert die Probleme, die mit Produktion und Reinigung eines unlöslichen Zeilmembran-gebundenen Proteins einhergehen, da eine Zellyse nicht erforderlich ist und da kontinuierliche Kultur eingesetzt werden kann, wie auch vereinfachte Verfahren zur Reinigung und Isolierung von sICAM-1.
Nicht-humane Säugerzellinien, die das humane Hauptrhinovirus-Rezeptorgen exprimieren, wurden früher identifiziert und sind Gegenstand der anhängigen US-Patentanmeldungen Nr. 262570 und 262428, angemeldet am 25. Oktober 1988, und umfassen Bezugnahmen auf die ATCC-Hinterlegungen für die Zellinien. Der humane Hauptrhinovirusrezeptor wurde mit monoklonalen Antikörpern, die Rhinovirusinfektion inhibieren, identifiziert. Diese monoklonalen Antikörper erkannten ein 95-kd-Zelloberflächen-Glycoprotein auf Humanzellen und auf Maustransfektanten, die einen Rhinovirus-bindenden Phenotyp exprimieren. Gereinigtes 95-kd-Protein bindet an Rhinovirus in vitro. Die Proteinsequenz von dem 95-kd-Protein zeigt die Identität mit der von ICAM-1; ein cDNA-Klon, erhalten aus Maustransfektanten, der dem Rhinovirus- Rezeptor exprimiert, hatte dieselbe Sequenz wie für ICAM-1 publiziert, mit Ausnahme für das G anstelle von A, wie zuvor beschrieben. Es wurde daher geschlossen, daß der Rhinovirusrezeptor und ICAM-1 das gleiche Protein waren. Eine transfektierte Maus-L-Zellinie, bezeichnet HE1, wurde isoliert, die das HRR-Gen oder ICAM-1-Gen enthielt und exprimiert. Die ICAM-1-Terminoiogie wurde verwendet, obwohl es nun anerkannt ist, daß HRR und ICAM-1 austauschbar sind.
Eine Zufalls-geprimte cDNA-Bank wurde in lambda-GT11 auf HE1 poly A+ RNA hergestellt. Die Bank wurde zweifach unter Verwendung zweier Oligonukleotide, abgeleitet aus der publizierten Sequenz von ICAM-1 gescreent. Oligonukleotid ICAM-1 hat die Sequenz GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTGGGGCCGCAGGTCCAGTTC und Oligonukleot id ICAM-3 hat die Sequenz CGTTGGCAGGACAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGTGTTCT.
Es wurden acht positive Klone aus einem Screen erhalten, und sie wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. DNA-Sequenzierung von zwei der Klonen zeigte Identität mit der Publizierten ICAM-1-Sequenz. Die Sequenz des dritten Klons lambda 19.1-3 war deutlich unterschiedlich von den anderen beiden Klonen, dahingehend, daß eine Deletion von 19 bp vom Nukleotid 1465 bis 1483 nach der Numerierung von Staunton et al., supra auftrat. Die 19-bp-Deletion lag in der zweiten cDNA, lambda HE1-4,5 vor, und unabhängig davon bestätigt durch Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugter cDNA. Analyse der cDNA-Sequenz sagte das Auftreten einer sekretierten Form von ICAM-1 voraus, die durch einen alternativen Splicin-Mechanismus erzeugt wird. Western-Blot-Identifikation von sICAM-1 aus Kulturüberständen von HE1- und HeLa-Zellinien bestätigt, daß die sICAM-1-mRNA-Sequenz eine lösliche Form von ICAM-1 kodiert, die nicht mit der Zelloberfläche assoziiert, sondern in das Zellmedium freigesetzt wird. Eine alternativ gesplicte mRNA, die eine sekretierte Form eines weiteren Adhäsionsmoleküls (NCAM) erzeugt, wurde identifiziert (Giower et al., Cell 55:955-964 (1988)), obwohl in NCAM ein Exon in die mRNA eingebaut ist, wogegen in der vorliegenden Erfindung ein Exon aus der mRNA deletiert ist. Keine alternative mRNA-Sequenz für ICAM-1 war zuvor identifiziert worden (Staunton et al.)

SICAM-1-CDNA-KLONE

Eine Zufalls-geprimte cDNA-Bank wurde in lambda-GT11 aus HE1 poly A+ durch Clontech Laboratories, Pab Alto, CA konstruiert. Die Bank wurde mit zwei 47-mer-Oligonukleotidsonden aus der Mitte der ICAM-1-kodierenden Sequenz gescreent. Ein positiver Klon, bezeichnet als 19.1-3, wurde isoliert, der ein Insert von 1,5 kb hatte; ein zweiter cDNA-Klon, bezeichnet als 4,5, der ein Insert von 1,25 kb hatte, wurde isoliert; und es wurde ein zusätzlicher cDNA-Klon pHRR-3 erhalten durch Subkionieren der Produkte der PCR- Amplifikation im Bluescript unter Verwendung des Perkin-Elmer/Cetus-DNA- Amplifikations-Systems, Perkin Elmer, Wellesley MA, wie in Fig. 4C, Bahn 3 gezeigt. Diese Klone zeigten einen signifikanten Unterschied gegenüber der publizierten ICAM-1-Sequenz. Sie alle enthielten eine Deletion von 19 Basenpaaren vom Nukleotid 1465 bis 1483 nach der Numerierung von Staunton et al., supra. Um direkt zu zeigen, daß die sICAM-mRNA in HE1-Zellen und HeLa- Zellen vorliegt, wurde ein PCR-Experiment unter Verwendung von Primern durchgeführt, die die 19-bp-Region flankieren, weiche in der sICAM-mRNA (Fig. 8) fehlt. Unter Verwendung dieser Primer ist das Produkt aus ICAM-1- mRNA 105 bp, wogegen das sICAM-1-Produkt 19 bp kürzer, d. h. 86 bp ist. Dieses Experiment zeigt, daß sowohl HE1-Zellen als auch HeLa-Zellen beide Formen der ICAM-1mRNA enthalten, wogegen die Kontroll-L-Zellen es nicht tun. Ein synthetisches Oligonukleotid, bezeichnet als PCR 3.2, mit der folgenden Sequenz: ggaattcTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT wurde zur Unterscheidung zwischen cDNA-Klonen, mit der 19-bp-Deletion von Klonen, die die 19-bp-Deletion nicht enthalten, verwendet. Die synthetischen Oligonukleotide binden nicht an cDNA-Klone, die die 19-bp-Deletion enthalten. Zusätzlich bestätigte die Teilsequenz der cDNA 19.1-3 und pHRR-3 die 19-bp-Deletion. Diese Daten weisen darauf hin, daß mindestens zwei verschiedene und unterschiedliche ICAM-1-Spezies in HE1-Zellen vorkommen: das unlösliche ICAM-1 aus dem Stand der Technik und die neue lösliche Form wie in der Erfindung beschrieben.
Die Sequenzen der deletierten (sICAM-1) und der nicht-deletierten (ICAM-1) Formen der interzellulären Adhäsionsmolekül-1-mRNA, dargestellt durch die cDNA-Klone, sind in Fig. 2 gezeigt. Die Sequenz am Punkt der Deletion ist AGGT, das mit einer RNA-Splice-Verknüpfung übereinstimmt. Das Entfernen der 19 Basen aus der mRNA verschiebt den Leserahmen und bewirkt, daß sich die beiden Polypeptidsequenzen am Aminosäurerest 443 unterscheiden. Die deletierte Form (sICAM-1) enthält zusätzliche 11 Reste, worauf ein im Rahmen liegendes Terminationscodon folgt. Daher besteht dieses Molekül aus 453 Aminosäuren im Vergleich zu 505 Aminosäuren für die nicht-deletierte Form. Beginnend mit dem N-Terminus von ICAM-1 hat sICAM-1 442 Aminosäuren mit ICAM-1 gemeinsam. Die deletierte Form (sICAM-1) enthält einen einzelnen 11 Aminosäure-C-Terminus, es fehlt ihm jedoch die Membran-überspannenden (24 Aminosäuren) und cytoplasmatischen Schwanz (28 Aminosäuren)- Domänen von ICAM-1, wie in Fig. 3 gezeigt.

ICAM-1-CDNA-KLONE

Es können eine Vielzahl von Verfahren zur Klonierung der Gene eingesetzt werden. Ein Verfahren ist die Verwendung von zwei teilweise überlappenden 47-mer-Oligonukleotidsonden. Diese beiden Sonden, bezeichnet als Oligonukleotid-ICAM-1 und Oligonukleotid-ICAM-3 wurden aus der publizierten ICAM-1-Sequenz synthetisiert. Das ICAM-1-Oligonukleotid wurde unter Erhalt einer hohen spezifischen Aktivität markiert und in einem Sourthern-Blot unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert. Wie in Fig. 4A gezeigt, wurde eine einzelne Bande von 4,4 kb in HeLa, HE1 und zwei primären HRR- transfektanten Zellinien nachgewiesen und fehlte in Ltk&supmin;-Zellen. Dieses Ergebnis bestätigt, daß die HRR-Transfektanten das humane ICAM-i-Gen enthalten. Die Größe des Fragments stimmt mit Simmons et al. überein, unterscheidet sich jedoch von Staunton et al., weil es wahrscheinlich einen Restriktionsstellen-Polymorphismus wiederspiegelt.
Das ICAM-1-Oligonukleotid wurde als Sonde in einem Northern-Blot von poly A+ RNA aus denselben Zellinien verwendet. Wie in Fig. 4B gezeigt, wurde eine mRNA von 3,3 kb in HeLa, HE1 und primär transfektierten Zellinien nachgewiesen, fehlt jedoch in Ltk&supmin; -Zellen. Das Signal in HE1-Zellen war viele Male stärker als die bei anderen Zellinien, was auf einen höheren mRNA-Spiegel in HE1-Zellen hinwies. Dies ist in Übereinstimmung mit den höheren Spiegeln an HRR (ICAM-1) Expression in HE1-Zellen. Eine zweite 2,4- kb-RNA wurde ebenfalls in HE1-Zellen nachgewiesen. Diese Daten bestätigen, daß humane ICAM-1-mRNA in HRR-Transfektanten exprimiert wird. Siehe Fig. 4B.
Das humane ICAM-1-Gen wurde aus der HE1-Transfektante unter Verwendung der Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifikation unter Einsatz des Perkin-Elmer/Seats DNA Amplification System, Perkin, Wellesley MA isoliert. Die PCR-Amplifikation erfolgte auf einzeisträngiger cDNA, hergestellt aus HeLa-, Ltd&supmin; - und HE1-RNA. Die Primer wurden aus den 5'- und 3'-kodierenden Regionen der publizierten ICAM-1-Sequenz hergestellt. ICAM-1-spezifische Amplifikationsprodukte wurden durch Hybridisierung eines Sourthern-Blots der PCR-Reaktionen unter Verwendung von ICAM-1-Oligonukleotid nachgewiesen.
Wie in Fig. 4C gezeigt, wurde eine einzelne Bande von ca. 1600 bp&sub1; die mit der vorhergesagten Größe übereinstimmt, aus HeLa-Zellen und HE1-Zellen amplifiziert, fehlt jedoch aus LTK&supmin;-Zellen. Das Amplifikationsprodukt wurde in Bluescript (Strategene, San Diego, CA) kloniert, und es wurden zwei unabhängige Klone, bezeichnet als PHRR1 und PHRR2 erhalten. Die komplette Sequenz von PHRR2 zeigt die 100%ige Identität mit der publizierten ICAM-1-kodierenden Sequenz mit Ausnahme der Veränderung eines einzelnen G in A, wie zuvor beschrieben.
Eine lambda-Gt11-Bank, hergestellt aus Zufalls-geprimter HE1-cDNA, wurde mit den ICAM-1- und ICAM-3-Sonden gescreent und es wurden acht positive Klone isoliert. Sechs Klone, wie in Fig. 7 gezeigt, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt und durch partielle DNA-Sequenzierung analysiert. Eine Gesamtzahl von ca. 1000 Nukleotiden der Sequenz, abgeleitet aus diesen Klonen, zeigte Identität mit der ICAM-1-Sequenz.

REINIGUNG UND ISOLIERUNG VON LÖSLICHEM PROTEIN

HeLa- und HE1-Zellen ließ man unter Standardbedingungen in DMEM (Dulbecco's Modified Essential Media) mit 10 % fetalem Rinderserum wachsen. Konditioniertes Medium aus diesen Zellen wird geerntet und zentrifugiert oder unter Entfernung von Zellen oder Zelltrümmern zentrifugiert. Das Zell- Membran-gebundene ICAM-1 ist im Überstand nicht vorhanden. Dieses Medium wird dann an monoklonaler Antikörper-Sepharoseharz absorbiert (monoklonale Antikörper c78.4A als ein Beispiel), wobei der Antikörper gegen ICAM-1 oder sICAM-1 gerichtet ist, und nicht-absorbierte Proteine werden vom Harz mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, wie Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Das gebundene sICAM-1 wird dann unter Bedingungen eluiert, die die native Konformation des Proteins bewahren, wie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung Ser. Nr. 262428, angemeldet am 25. Oktober 1988, beschrieben. Das sICAM-1 kann weiter durch Lectin-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration gereinigt werden.
In vitro aus cDNA, kodierend für sICAM, im Bluescript-Vektor (Strategene) transkribierte mRNA wurde in vitro translatiert. In Abwesenheit von mikrosomalen Membranen wurde ein nicht-glykosyliertes Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 52.000 Dalton erhalten; in Gegenwart von mikrosomalen Membranen wurde eine glykosylierte Spezies von 72.400 Dalton erhalten, die innerhalb der mikrosomalen Membran sequestriert wurde, was darauf hindeutet, daß das sICAM-Polypeptid korrekt translociert, prozessiert und von den mikrosomalen Membranen glykosyliert wird.
cDNA's, die tmICAM und sICAM im CDM8-Vektor kodieren (siehe B. und Aruffo A. PNAS 84:3365 (1987) wurden in COS-Zellen und Maus-L-Zellen unter Verwendung der DEAE-Dextran-Technik transfektiert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen nach zwei Verfahren analysiert: (1) FACS-Analyse mit Anti-ICAM- Mab (c78.4) für die Zellmembran-Expression von CIAM-Spezies und (2) metabolische Markierung, gefolgt von Immunabsorption mit Anti-ICAM-Mab von Zellüberständen und Zellysaten. Die Ergebnisse aus der metabolischen Markierung wiesen auf interzelluläre Akkumulation einer 68.000-Dalton-Spezies in sICAM-transfektierten Zellen, jedoch auf keine nachweisbare Sekretion von sICAM in den Überstand hin. Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit SICAM, das über den "regulierten" Sekretionsweg (R. B. Kelly, Science 230:25 (1985)) ausgeschieden wird.
Es wurden Antikörpersonden, spezifisch für sICAM und für ICAM-1 hergestellt. Die synthetischen Peptide S-PEP,

P P G M R L S S S L W (C),

abgeleitet aus einer einzelnen 11-Aminosäuresequenz am C-Terminus von sICAM, und P002, abgeleitet aus dem C-Terminus von ICAM-1,

G T P M K P N T Q A T P P (C),

wurden hergestellt und gereinigt; der C-terminale C-Rest in Klammern wurde angefügt, um die Kopplung der Peptide an Proteinträger zu ermöglichen. Das synthetische Peptid wurde an KLH (Keyhole Limpit Hemocyanin) nach Standardverfahren gekoppelt und das Konjugat an Kaninchen unter Herstellung von Anti-Peptid-Antiseren injiziert, von denen gezeigt wurde, daß sie spezifisch an ihre entsprechenden Peptidimmunogene binden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurden die folgenden Mikroorganismen bei der American Type Culture Collection hinterlegt:
eine Säugerzellinie HE-1 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 9592,
eine Säugerzellinie HRVRI (HRRI) mit der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 9593 und
eine Hybridomzellinie CIII 92.1A mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9594.

Claims

1. Humanes lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 mit der in Fig. 1 offenbarten Sequenz, oder ein funktionales Derivat davon, mit der Maßgabe, daß die in Fig. 1 offenbarten 11 C-terminalen Aminosäuren unverändert bleiben.

2. Interzelluläres Adhäsionsmolekül erhalten aus HeLa-, HE1- und primären Transfektanten-Zellen davon, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften,

(A) löslich bei Fehlen eines Detergens und

(B) Identität mit dem Translationsprodukt der in Fig. 1 gezeigten mRNA-Sequenzen.

3. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, gekennzeichnet durch die DNA-Sequenz kodierend für humanes lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekul-1, wie in Fig. 1 angegeben.

4. Wirtszelle enthaltend die DNA-Sequenz von Anspruch 3.

5. Verfahren zur Gewinnung des löslichen interzellulären Adhäsionsmolekül-1 nach Anspruch 1 in im wesentlichen reiner Form gekennzeichnet durch die Schritte:

(A) Entfernen des Überstands aus unlysierten Zellen.

(B) Aufgeben des Überstands auf eine Affinitätsmatrix, enthaltend immobilisierten Antikörper, der zur Bindung an sICAM-1 in der Lage ist, vorzugsweise Antikörper gegen ICAM-1 und sICAM-1 oder Derviate davon,

(C) Ermöglichen, daß das sICAM-1 sich an den Antikörper der Matrix bindet,

(D) Waschen der Affinitätsmatrix unter Entfernung ungebundener Kontaminanten, und

(E) Gewinnen des sICAM-1 in im wesentlicher reiner Form durch Elution des sICAM-1 von der Matrix.

6. Verfahren nach Anspruch 5, das ferner durch Aufgeben des Überstands auf eine Lectin- oder Weizenkeim-Agglutininsäule vor oder nachdem der Überstand auf die Antikörpersäule aufgegeben wird, gekennzeichnet ist.

7. Antikörper, vorzugsweise monoklonal, der zur Bindung an sICAM-1 nach Anspruch 1 in der Lage ist, und der nicht an unlösliches ICAM- 1 bindet, der vorzugsweise zur Bindung an die 11 Aminosäuresequenz des C- Terminus, wie in Fig. 1 gezeigt, in der Lage ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verminderung der Infektion von humanem Rhinovirus, umfassend das Protein der Ansprüche 1 oder 2.