DE3855634T2 - Innerhalb des alpha-Locus gelegenes T-Zell-Rezeptor-Gen und DNA-Konstruktionen - Google Patents

Description

• Identifizierung von Sequenzen, die spezifisch in T-Zellen exprimiert werden, und Verwendung der Sequenz bei der Expression eines putativen Rezeptors.
• Der Thymus ist bei höheren Vertebraten das Hauptorgan zur Differenzierung von T-Lymphozyten. Die Steuerung der Expression und des Zusammenbaus der Gene für den T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) muß mit den vielen selektiven und die Reifung betreffenden Ereignissen, die im Thymus stattfinden, im Zusammenhang stehen, da T-Zell-Vorläufer eine Vielzahl von Differenzierungsstufen durchlaufen. Bislang sind zwei unterschiedliche Typen von T- Zell-Antigen-Rezeptoren (TCR) identifiziert worden: das bei funktionellen Helfer- und zytotoxischen T-Zellen gefundene α:β- Heterodimer, und das kürzlich beschriebene γ:δ-Heterodimer. Beide Heterodimere werden unabhängig voneinander auf der Zelloberfläche unterschiedlicher T-Zell-Populationen in Assoziation mit den monomorphen CD3-Polypeptiden exprimiert.
• Über das α:β-Heterodimer ist viel berichtet worden. Es sind Sequenzen isoliert worden, die für jede der Untereinheiten des α:β-Heterodimers kodieren und zur Expression des α:β-TCRs verwendet worden sind. Darüber hinaus ist im Rahmen der die TCRs betreffenden Untersuchungen frühzeitig eine Sequenz aufgefunden worden, von der berichtet wurde, daß sie die γ-Untereinheit eines putativen, von dem α:β-Rezeptor verschiedenen TCR ist. Der γ:δ-Rezeptor scheint in mehrfacher signifikanter Hinsicht von dem α:β-Rezeptor verschieden zu sein. Der γ:δ-Rezeptor scheint keine MHC-beschränkte Zytotoxizität aufzuweisen. Der γ: δ-Rezeptor wird während der T-Zell-Ontogenie normalerweise vor dem Erscheinen des α:β-Rezeptors nachgewiesen. Aufgrund der wesentlichen Unterschiede zwischen dem γ:δ-Rezeptor und dem α: β-Rezeptor besteht ein erhebliches Interesse an der Möglichkeit, das γ:δ-Heterodimer als einen Rezeptor zu produzieren, welcher bei der Diagnose und Therapie eingesetzt werden kann, wie als Quelle von bindenden Proteinen, als ein Agonist oder Antagonist der T- Zell-Bindung, und als Hilfsmittel bei der Aufklärung der Mechanismen, die bei der Funktion und Ätiologie von T-Zellen beteiligt sind.
Relevante Literatur
• Das γ:δ-Heterodimer ist beschrieben von Brenner et al., Nature (1986) 322:145-149; Lew et al., Science (1986) 234:1401- 1405; Pardoll et al., Nature (1987) 326:79-81; Bluestone et al., Nature (1987) 326:82-84; Borst et al., Nature (1987) 325:683- 688; Moingeon et al., Nature (1987) 325:723-726. Das γ-Gen ist beschrieben von Saito et al., Nature (1984) 309:757-762; Sim et al., Nature (1984) 312:771-775.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es werden neue DNA-Sequenzen und Konstrukte zur Expression eines frühzeitig bei der Reifung von T-Zellen exprimierten Oberflächenproteins bereitgestellt, das als δ-Untereinheit des heterodimeren γ:δ-Rezeptors dienen kann. Die Konstrukte können ver wendet werden, um die γ- und die δ-Untereinheiten gleichzeitig in einem Wirt zu produzieren, welcher zur Expression des γ:δ-T- Zell-Rezeptors oder funktioneller Fragmente davon geeignet ist. Die DNA-Sequenz kann auch als Sonde verwendet werden.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Durch die vorliegende Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül für die δ-Kette des T-Zell-Antigen-Rezeptors bereitgestellt, wobei das Molekül umfaßt:
• (A) eine Nukleinsäure, die für eine δ-Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert, wobei die Nukleinsäure selektiv hybridisierbar ist mit
• (i) einer Sequenz von mindestens 12 aufeinderfolgenden Nukleotiden der in Figur 1 dargestellten Sequenz des Klons pλ12 vom Kodon 121 bis zum Kodon 273 einschließlich, oder
• (ii) einer dazu komplementären Sequenz, oder
• (B) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert, wobei die Sequenz in einer Nukleinsäure vorhanden ist, die für eine δ-Kette eines T- Zell-Antigen-Rezeptors kodiert, wobei die Nukleinsäure selektiv mit einer Sequenz hybridisierbar ist, wie sie oben unter (i) oder (ii) definiert ist.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ferner eine Wirtszelle bereitgestellt, die eine derartige Nukleinsäure enthält.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ferner ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines Peptids oder Polypeptids umfassend eine δ-Kette eines T-Zell-Rezeptors oder ein Fragment davon, bei dem man:
• (a) eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert, daß das δ-Peptid oder -Polypeptid des T- Zell-Rezeptors exprimiert wird, und
• (b) das resultierende δ-Peptid oder -Polypeptid des T-Zell- Rezeptors aus der Zellkultur isoliert.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ferner ein Verfahren bereitgestellt zum Erhalt eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein Peptid oder Polypeptid der δ-Kette eines T-Zell-Rezeptors kodiert, bei dem man:
• (a) eine Probe, die Nukleinsäuren enthält, welche für T- Zell-Proteine von Säugern kodieren, unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Definition in Teil (A)(i) oder (A)(ii) oben, kontaktiert, und
• (b) aus der Probe eine Nukleinsäure isoliert, welche mit der Nukleinsäuresequenz hybridisiert, und fakultativ
• (c) eine oder mehrere Manipulationen der isolierten Nukleinsäuresequenz durchführt.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ferner eine Nukleinsäuresonde bereitgestellt, welche eine Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der in Figur 1 dargestellten Sequenz des Klons pλ12 vom Kodon 121 bis zum Kodon 273 einschließlich umfaßt.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Es werden neue DNA-Sequenzen, Konstrukte und Expressionssysteme bereitgestellt, die mit einer Sequenz assoziiert sind und für ein Peptid kodieren, welches mit einem frühzeitigen Stadium der T-Zell-Reifung im Zusammenhang steht. Diese Sequenz ist 5' der JαCα-kodierenden Regionen lokalisiert, was auf systematische Umgruppierungen in frühen Thymozyten unter Verwendung von V-Gen-Segmenten der TCR-α-Familie hinweist, bevor irgendeine Cα-Message oder ein Protein nachgewiesen wird. Die RNA von diesem Locus wird in frühen Thymozyten und adulten CD4 -, CDB -Zellen, nicht jedoch in reifen T-Zell-Populationen in hoher Menge exprimiert.
• Die Sequenz scheint der Leader zu sein, wenn es zu Vα T Jα-Umgruppierungen kommt. Das Rearrangement an diesem Locus scheint spätestens am 14. Tag von fötalen Thymozyten einzutreten. Es scheint sich demgemäß um eine Umgruppierung zu handeln, die zur gleichen Zeit oder vielleicht kurz vor den TCR-β- und -γ-Genen erfolgt, s. Haars et al., J. Exp. Med. (1986) 164:1-24, und Born et al., Science (1986) 234:479-482. Die umgruppierten Banden werden am 18. und 19. Tag der Thymozyten-DNA intensiver und komplexer und schwächen sich bei reifen T-Zellen mehr ab.
• Das Gen kann in die drei Bereiche V, J und C unterteilt werden, wobei die V-Region mit der variablen Region von Immunglobulinen und der α-Untereinheit des α:β-TCRs, die J-Region mit der verknüpfenden (joming) Region, und die C-Region mit der konstanten Region analogisiert werden können. Die V-Region weist eine wesentliche Homologie mit der Vα-Region auf, und in ähnlicher Weise weist die J-Region Ähnlichkeit zu der Jα-Region auf.
• Die genomische Sequenz schließt eine konservierte heptamere (AGCTGTG) und nonamere Sequenz (GGTTTTTGG) ein, die durch 13 Nukleotide voneinander getrennt sind und 5' der nicht-umgruppierten J-Sequenz lokalisiert sind. An der 3'-Grenze existiert die konservierte RNA-Spleißsignalsequenz (GTAAGT). Ferner ist eine die V- und J-Regionen trennende D-Region vorhanden, um ein Exon bereitzustellen, welches die VDJ-kodierenden Regionen umfaßt. Es wird eine C-Region beobachtet, welche als Einzelkopie- Gen existiert. Sie ist etwa 13 Kb 3' vom J-Gensegment und etwa 70 Kb 5' von Cα lokalisiert. Es wird davon ausgegangen, daß die kodierende Sequenz für ein Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz ein Molekulargewicht von etwa 30,7 kD aufweist. Die Sequenz besitzt zwei potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen.
• Die für die C-Region kodierende Sequenz teilt mit jeder der zuvor beschriebenen TCR- oder Ig-Sequenzen kurze Regionen der Homologie und ist auf der Ebene der Aminosäuresequenz 9 bis 18 % homolog zu irgendeiner T-Zell-Rezeptor-Sequenz. Sie wahrt viele der Eigenschaften von T-Zell-Rezeptor-Genen durch ein zusätzliches Cystein nach der ersten Domäne, vermutlich zur Bildung eines Heterodimers, und durch Einschließen eines konservierten Lysinrests in der Transmembranregion, was ein Merkmal sämtlicher anderer konstanter T-Zell-Rezeptor-Regionen ist. Das Lysin kann für Interaktionen mit CD3-Polypeptiden wichtig sein. Sämtliche drei der bis heute charakterisierten CD3-Peptide verfügen in ihren angenommenen Transmembranregionen über einen konservierten Asparaginsäure- oder Glutaminsäurerest. Die C-Region besitzt einen relativ kurzen (14-15 Aminosäuren) hydrophoben C-Terminus (ausgehend vom konservierten Lysin gezählt) und ist hinsichtlich der Art und Weise, in der konservierte Sequenzen voneinander getrennt werden, der Situation bei Cα erheblich ähnlich. Dieses Gen wird in adulten abgeschwächten (dull) CD1-Zellen mit Hybridzellen gefunden.
• Gewünschte Konstrukte schließen gewöhnlich mindestens 8, gewöhnlich mindestens 12 Nukleotide des für die konstante Region kodierenden Bereichs oder nicht-kodierende flankierende Regionen ein, wobei die C-Region oder ein Fragment davon in korrekter Orientierung mit den J-, D- und V-Regionen verknüpft werden kann. Die Konstrukte können ferner heterologe DNA umfassen, wie einen Selektionsmarker, ein stabiles Replikationssystem, einen synthetischen Linker oder Polylinker, eine transkriptionelle Initiationsregion, eine transkriptionelle Terminationsregion oder dergleichen. Das die C-Region enthaltende Fragment umfaßt gewöhnlich weniger als etwa 10 kbp der Originalsequenz, welche das Fragment umfaßt, gewöhnlich weniger als etwa 5 kbp aufweist.
• Die angesprochene Nukleinsäuresequenz kann in vielfacher Weise verwendet werden. Die Sequenz kann als eine Sonde, insbesondere die C-Sequenz oder J-Sequenz, verwendet werden, um mRNA oder genomische DNA in zahlreichen T-Zellen zum Nachweis der Gegenwart der Sequenz zu identifizieren. Die Sonden umfassen normalerweise mindestens etwa 8 Basen, gewöhnlicher mindestens etwa 12 Basen, und können 50 Basen oder mehr umfassen. Gewöhnlich werden die Sonden eine Länge von etwa 1 kbp nicht überschreiten, wobei vorzugsweise eine Länge von etwa 0,5 kbp einer homologen Sequenz nicht überschritten wird. Die Sonden werden gewöhnlich markiert, was üblicherweise mit radioaktiven Isotopen geschieht, wobei verschiedene bekannte Techniken angewendet werden, wie eine Nick-Translation oder TdT-Extensionen mit radioaktiven Nukleotiden, oder dergleichen.
• Von für das interessierende Peptid kodierender mRNA erhaltene cDNAs können zur Expression des interessierenden Peptids eingesetzt werden. Die cDNA kann in einen geeigneten Expressionsvektor allein oder in Verbindung mit einem Gen insertiert werden, welches die ganze oder einen Teil der γ-Sequenz exprimiert, um einen δ:γ-TCR zu produzieren.
• Vielfältige Expressionsvektoren sind erhältlich für die Expression in einer großen Bandbreite von Wirten. Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirte stehen zur Expression zur Verfügung. Verwendbare Wirte schließen E. coli, B. subtilis, B. licheniformis, S. cervisiae, K. lactis, CHO-Zellen, Affennierenzellen, COS-Zellen, etc. ein.
• Für die Expression steht eine Vielzahl von Vektoren zur Verfügung, bei denen eine große Vielzahl von Transkriptions- Initiations-Regionen vorhanden sind. Üblicherweise schließen die Vektoren Expressionskassetten ein, die, in der Richtung der Transkription, eine transkriptionelle und transiationale Initiationsregion, eine Stelle zur Insertion eines Gens, das unter der Steuerung der Initiationsregion stehen soll, und eine translationale und eine die Transkription terminierende Region ein.
• Zusätzlich wird gewöhnlich ein Marker bereitgestellt, welcher die Selektion von Expressions-Wirtszellen erlaubt, die die Expressionskassette zur Expression des interessierenden Peptids enthalten, wobei die Expressionskassette entweder allein oder in Verbindung mit einer Expressionskassette für das Gen vorliegt, welches für die γ-Sequenz kodiert.
• Die für eine Selektion geeigneten Marker können Sequenzen, die komplementär zu einem negativen Hintergrund für das Gen sind, damit ein auxotropher Wirt prototroph wird, sowie Gene einschließen, die zu einer Antibiotikresistenz führen, wie einer Resistenz gegenüber Kanamycin, Chloramphenicol, Penicillin, G418, Tetracyclin, Gentamicin, etc. Beispielhafte Bezugnahmen schließen die US-Patente Nrn. 4 615 974, 4 615 980, 4 624 926 und 4 626 505 ein.
• Das Gen kann auf vielfältige Weise manipuliert werden, durch Entfernung der ganzen oder eines Teils der nicht-kodierenden Regionen an einem oder beiden 5'- oder 3'-Termini, durch in vitro-Mutagenese oder Primer-Reparatur, so daß ein oder mehrere Nukleotide verändert werden, um Restriktionsstellen einzuführen, unerwünschte Restriktionsstellen zu entfernen, ein oder mehrere Kodons zu verändern, durch terminale Extension, Ligation mit Adaptern oder Linkern, oder dergleichen. Die Sequenz kann daher nicht nur durch Anwendung der obigen Techniken, sondern auch durch Restriktion, Resektion, Ligation mit verschiedenen funktionellen Sequenzen, oder dergleichen modifiziert werden. Gewöhnlich wird die Sequenz nach jeder Manipulation kloniert und analysiert, um sicherzustellen, daß die erwünschte Sequenz erhalten worden ist. Die Analysen können eine Restriktionsanalyse, eine Sequenzierung, Elektrophorese, Southern-Hybridisierung, etc. einschließen.
• Der Expressionsvektor, der das interessierende Polypeptid entweder allein oder in Verbindung mit der für ein γ-Polypeptid kodierenden Sequenz enthält, kann in irgendeine der Vielzahl von Wirtszellen eingeführt werden, bei denen die vielfältigen regulatorischen Regionen und Replikationssysteme des Vektors funktionell sind. Die Transformation kann auf verschiedene Art in Abhängigkeit des bestimmten Replikationssystems erfolgen. In einigen Fällen kann es sein, daß das Replikationssystem in dem Wirt nicht funktionell ist, so daß gegenüber einer extrachromosomalen Lokalisierung eher eine Integration beabsichtigt wird. Die Vektoren können auf Plasmiden, Viren, Phagen, chromosomalen Replikationssystemen, z.B. auf Centromere in Verbindung mit einem ars, oder dergleichen basieren. Für Säuger-Expressionssysteme können Replikationssysteme aus SV40, Adenovirus, bovinem Papillomavirus, oder dergleichen eingesetzt werden, z.B. COS- Zellen mit SV40. Die transformierten Zellen können in einem geeigneten Medium für eine Expression der interessierenden Peptide kultiviert werden. In Abhängigkeit von dem bestimmten Wirt können die Peptide im Zytoplasma zurückgehalten oder in die Membran des Wirts transportiert werden, um zu membrangebundenen Proteinen zu werden.
• Die durch die interessierende Nukleinsäure kodierte Sequenz kann durch Entfernen von einer oder mehreren Regionen oder Teilen einer oder mehrerer Regionen modifiziert werden. Daher kann die VD-Region oder die VDJ-Region entweder allein oder in Verbindung mit der variablen Region des γ-Proteins isoliert werden. Auf diese Weise kann eine variable Region erhalten werden, welcher die gesamte oder ein Teil der konstanten Region fehlt. Die variable Region kann durch Entfernung der Signal-Leadersequenz manipuliert werden, oder die konstante Region durch Entfernung der Transmembransequenz, oder beides, um den Transport zur Membran zu verhindern und das Peptid im Zytoplasma zurückzuhalten. Alternativ kann die konstante Region mit einem Fremdprotein verbunden werden, um als Transportmechanismus für den Transport des Fremdproteins zur zytoplasmatischen Membran zu dienen. Die Verknüpfung verschiedener Fragmente ist in der Literatur ausgiebig beschrieben und kann auf verschiedene Art unter Verwendung von Linkem oder Adaptern erfolgen. Vgl. z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982; und US-Patent Nr. 4 617 384.
• Die Peptidprodukte können auf verschiedene Art verwendet werden. Die Rezeptoren können zur Bindung des komplementären Liganden eingesetzt werden. Die Bindung kann in diagnostischen Assays, Affinitätschromatographie, oder dergleichen Anwendung finden. Die Rezeptoren können verwendet werden, um mit T-Zellen in vitro oder in vivo zur Verhinderung ihrer Bindung an den komplementären Liganden zu kompetieren. Die interessierenden Peptide können verwendet werden, um T-Zellen zur Steigerung der Fähigkeit von T-Zellen zur Bindung an einen prädeterminierten Liganden zu transformieren. Die interessierenden Peptide können zur Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden, welche anschließend eingesetzt werden können, um eine bestimmte Untergruppe von T-Zellen zu isolieren oder zu entfernen, die mit dem interessierenden Peptid ein Idiotop oder Paratop gemeinsam haben. Die Antikörper können anschließend verwendet werden, um die Anwesenheit einer derartigen Untergruppe von T-Zellen im Blut eines Patienten nachzuweisen, wobei FACS oder andere Techniken angewendet werden, zur Inhibierung der Aktivität einer derartigen T-Zell-Unterklasse, oder dergleichen. Die Antikörper können in bekannter Weise in ein physiologisch akzeptables Medium wie z.B. PBS eingeführt werden, welches im allgemeinen etwa 0,165 mg Protein/ml aufweist.
• Die interessierenden Peptide und Nukleinsäuresequenzen können abgeleitet werden von jeder geeigneten Säugerquelle, wie von Nagern, Pferden, Rindern, Lagomorphen, Schafen, Schweinen, Primaten oder dergleichen.
• Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Beschränkung.
EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISE
• Es wurde eine Region identifiziert, die ungefähr 90 Kb 5' von Cα lokalisiert ist und in adulten, abgeschwächten CD1-, CD4&supmin;-, CD8&supmin;-Zellen und Hybridzellen systematische Umgruppierungen aufweist. Diese Rearrangements wurden zuerst nachgewiesen durch Anwendung der Puls-Feld-Gelelektrophorese (Schwartz und Cantor, Cell (1984) 37:67-75; Carle und Olson, Nucl. Acids. Res. (1984) 12:5647-5664), da sich der JαCα-Locus über mindestens 65 Kb erstreckt (Wenot et al., Nature (1985) 316:832-836; Hayday et al., ebd. (1985) 316:828-832). Zur detaillierteren Analyse der Umgruppierung wurde ein mit A bezeichnetes Fragment, das 60 Kb 5' von Cα lokalisiert ist, zur Isolierung von Cosmid-Klonen verwendet, die weiter in den 5'-Bereich hineinreichen.
• Das Fragment A ist eine für die J-Region der funktionellen TCR-α-Kette aus der Helfer-Hybridzelle 2B4 spezifische Oligonukleotidsonde. Sie wurde verwendet, um einen Phagenklon (λ12) zu isolieren, welcher die genomische kodierende Region von Jα 2B4 (Berker et al., Nature (1985) 317:430-434) aus einer B10.A genomischen Leber-Bibliothek enthält (Chien et al., Nature (1984) 309:322-326). Die Position von Jα 2B4 wurde kartiert auf etwa 65 Kb 5' von Cα. Anschließend wurde ein EcoRI-Fragment (Fragment A) aus λ12 verwendet, um eine Cosmid-Bibliothek abzusuchen, die von einer BALB/c-embryonalen DNA hergestellt wurde (Cory et al., EMBO J. (1985) 4:675-681). Positive Klone mit den Bezeichnungen cos 2 und cos 3 wurden isoliert und mit einzelnen und multiplen Restriktionsenzymspaltungen kartiert. Das sich am weitesten in den 5'-Bereich erstreckende EcoRI-Fragment aus cos 3 mit 2,85 Kb wurde zur Isolierung der mit cos 21 und cos 22 bezeichneten Klone verwendet. Das zur weiteren Analyse eingesetzte DNA-Fragment war ein 4,1 Kb großer Subklon von EcoRI bis Saci (pg4.l). Die Positionen von Jx und Cx wurden durch Restriktionsenzym-Kartierung, Southern-Analyse und DNA-Sequenzierung ermittelt.
• Die Southern-Analyse erfolgte wie nachfolgend dargelegt. 8 µg der mit EcoRI geschnittenen genomischen DNA aus adulter Leber (LV), 14 Tage alter fötaler Leber (FL), Gesamtthymozyten (THY), 14 Tage alten (D14) und 15 Tage alten (D15) fötalen Thymozyten wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, auf Nylonmembranen (Gene Screen, NEN Research Products) übertragen und mit pG4.1-DNA als Sonde abgesucht, welche durch Hexamer-Priming radioaktiv markiert wurde (Feinberg und Vogelstern, Anal. Biochem. (1983) 132:6-13). Der Blot wurde hybridisiert in 1 M NaCl, 50 mM Natriumphosphat, 50 % Formamid, 100 µg/ml Lachssperma-DNA, 4 x Denhardts und 10 % Dextransulfat bei 40 ºC, und gewaschen in 2 x SSPE und 0,2 x SSPE (20 x SSPE = 3,6 M NaCl, 0,2 M Na-Phosphat, pH-Wert 7,4, und 0,02 M EDTA) bei 55 ºC. Zwischen den Stämmen C57BL/6 und BALB/c wurden im Hinblick auf EcoRI-Spaltprodukte keine Unterschiede in dem Hybridisierungsmuster gefunden.
• Die Analyse wurde auf fötale Thymozyten-DNAs aus verschiedenen Tagen der Entwicklung ausgedehnt, um die Kinetiken dieses Vorganges der Umgruppierung zu verstehen. Die resultierenden Daten zeigen, daß es spätestens bei 14 Tage alten fötalen Thymozyten zu Umgruppierungen 5' vom Cα-Locus kommt. Demgemäß scheint er zur selben Zeit oder vielleicht kurz vor den TCR-β- und -γ- Genen umgruppiert zu werden (Born et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:2925-2929). Obgleich die rearrangierten Banden in 18 und 19 Tage alter Thymozyten-DNA intensiver und komplexer werden, verschwinden sie in reiferen T-Zellen. pG4.1 führt in Thermozyten-Gesamt-DNA zu einem ähnlichen Muster wie in dCD1- Zellen. Diese hybridisierenden Banden weisen jedoch in mit Cortison behandelten Thymozyten (wodurch reife Zellen selektiv angereichert werden (Anderson und Blomgren, Cell Immunol. (1920) 1:362-371)) eine geringere Intensität auf und sind in einer Präparation von T-Zellen der Milz bei Verwendung gleicher Mengen an DNA kaum nachweisbar. Mit dieser Beobachtung stimmt die Tatsache überein, daß lediglich eine Helfer-Hybridzelle (2B4) von 9 funktionellen T-Zellen und Hybridzellen eine einzelne Umgruppierung auf einem Chromosom bewahrt, während die 8 anderen diese Region offenbar deletiert haben.
• Um die Natur dieser Umgruppierungen zu ermitteln, wurde ein λ-Phage, der das rearrangierte Fragment (2B4.Exp) enthielt, aus einer genomischen 2B4-Bibliothek (Chin et al., oben) isoliert und mit pG4.1 verglichen. Die Restriktionsenzym-Kartierungen und die Sequenz der relevanten Subklone wurden erhalten. Diese Daten zeigen, daß es in pG4.1 ein Jα-ähnliches Element (Jx) gibt, und daß die in 2B4 beobachtete Umgruppierung das Ergebnis eines VDJverknüpfenden Ereignisses ist, bei dem Jx- und D-Elemente 5' von Jx beteiligt sind. Eine Sequenzanalyse dieser besonderen V-Region zeigt, daß sie sämtliche Aminosäuren enthält, die in Vα-Genen hochkonserviert sind, und daß sie zur selben Genfamilie wie das von Arden et al., (Nature (1985) 316:783-787) beschriebene Vα TA27 gehört, was durch eine Homologie auf der DNA-Ebene von 83 % und einer etwas geringeren (70 %) Aminosäure-Homologie gezeigt wird. Das Jx-Element besitzt viele der konservierten Sequenzen der veröffentlichten J-Regionen und hinsichtlich der Größe in besonderer Weise zusammengesetzten Jα-Gensegmenten und besitzt den C-terminalen Prolinrest, der mehr als der Hälfte der bekannten Jα's gemeinsam ist. Eine konservierte heptamere (AGCTGTG) und nonamere Sequenz (GGTTTTTTGG), welche durch 13 Nukleotide getrennt ist, ist 5' von der nicht-rearrangierten Jx- Sequenz (GTAAGT) lokalisiert. Das besondere VDJ-Rearrangement führt zu einer Verschiebung des Leserahmens zwischen den konservierten Sequenzen des Elementes der V-Region und denjenigen der J-Region, was bei Umgruppierungen von Immunglobulinen und T- Zell-Rezeptoren üblich ist und mit der Tatsache übereinstimmt, daß die Hybridzelle 2B4 ein funktionelles α:β-Heterodimer aufweist
• Um zu ermitteln, ob irgendein Transkript nachgewiesen werden kann, welches diese VDJx-Sequenz enthält, wurde der Subklon 2B4.Exp als Sonde in einer Northern-Analyse eingesetzt. Unter Bedingungen, bei denen das Jx-Element alleine hybridisieren kann, wurde gefunden, daß es verglichen mit der Menge von Cα in 2B4-RNA ungefähr zu 1/20 exprimiert wird, daß es jedoch in höherer Menge in der RNA von neugeboreren Thymozyten und einer adulten doppelt-negativen Zelle gebildet wird. Anschließend wurde eine 2B4 cDNA-Bibliothek ( 200 000 ursprüngliche Klone) abgesucht, und es wurde ein einzelner Klon isoliert, der das oben beschriebene VDJx-Exon enthält, welches mit einer neuen C-Region ("Cx) gespleißt war. Die für Cx kodierende Region existiert im Genom als Einzelkopie-Gen. Sie ist 13 Kilobasen 3' von dem Jx-Gensegment und 70 Kb 5' von Cα lokalisiert. Die genomische Organisation wurde durch Sequenzanalyse abgeleitet. Die Restriktionskarte dieses cDNA-Klons (pλ12) und dessen Sequenz sind in Figur 1 der begleitenden Zeichnungen dargestellt.
• Sämtliche DNA-Fragmente wurden in den Vektor pGEM-3 (von Promega Biotec) kloniert und sequenziert durch Anwendung des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens mit sowohl T7- als auch Sp6- Promotor-spezifischen Primern auf doppelsträngiger Plasmid-DNA (Chen und Seeburg, DNA (1985) 4:165-170). Sämtliche berichteten Sequenzen erfolgten für beide Stränge. Um das Sequenzieren zu erleichtern, wurden durch Behandlung mit Exo III und Mung Bean- Nuklease Deletionen aufweisende Subklone generiert (Henikoff, Gene (1984) 28:351-359). Die Positionen der variablen (V), J, konstanten (C) und der 3' nicht-translatierten Region (3'ut) des cDNA-Klons pλ12 sind angegeben. Die schattierten Regionen von pG4.1 und 2B4.Exp zeigen eine mittels DNA-Sequenzierung ermit telte Sequenzidentität. Die EcoRI-Stellen an den äußeren 5'- und 3'-Enden von pλ12 sind Stellen, die von den zur Klonierung verwendeten EcoRI-Linkern stammen. Mögliche N-verknüpfte Glykosylierungsstellen in den Aminosäuresequenzen sind durch "CHO" angegeben. Die konservierten heptameren und nonameren Sequenzen und RNA-Spleißsequenzen sind unterstrichen. Die Cysteinreste sind mit einem Dreieck gekennzeichnet. Die TA27 Vα-Sequenz (Arden et al., oben) ist der 2B4.Exp V-Region sehr ähnlich, und die Nukleotid- und Aminosäurehomologien sind durch Striche (-) kenntlich gemacht. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Klone 2B4.Exp.pλ12 sind ausgehend von dem wahrscheinlichen Punkt des Prozessierens am N-Terminus numeriert (Berke, oben); Arden et al, oben).
• Theroretisch beträgt das vorhergesagte Molekulargewicht dieses Proteins, wenn es sich um eine Leserahmen-gerechte mRNA handelt, ungefähr 30,7 kD. Die für die C-Region kodierende Sequenz hat mit jeder der zuvor beschriebenen TCR- oder Ig-Sequenzen kurze Homologieregionen gemeinsam und weist auf der Ebene der Aminosäuresequenz zu jedweder Sequenz eines T-Zell-Rezeptors eine Homologie von 9 bis 18 % auf. Sie bewahrt viele der Eigen schaften von T-Zell-Rezeptor-Genen mit einem zusätzlichen Cystein nach der ersten Domäne, vermutlich zur Heterodimer-Bildung, und schließt auch einen konservierten Lysinrest in der Transmembranregion ein, was ein Merkmal aller anderen konstanten Regionen des T-Zell-Rezeptors ist. Es ist vorgeschlagen worden, daß ein Lysin an dieser Position für Interaktionen mit CD3-Polypeptiden wichtig sein kann (Chien et al., Nature (1984) 312:31- 35). Diese Interaktion ist postuliert worden, da alle drei der bis heute charakterisierten CD3-Peptide in ihren mutmaßlichen Transmembranregionen über einen konservierten Asparaginsäureoder Glutaminsäurerest verfügen.
• Die neue Sequenz für die konstante Region des T-Zell-Rezeptors ist mit Immunglobulin- und anderen T-Zell-Rezeptor-Sequenzen nur schwach homolog (9-18 %). Diese schwache Homologie liegt auch bei der zuvor berichteten Cα-Sequenz vor und steht im Gegensatz zu den Sequenzen für die konstante Region von Cγ und Cβ, welche sehr viel enger mit Immunglobulinen verwandt sind (bis zu 40 % Homologie in der ersten Domäne). Es besteht daher die Möglichkeit, daß weder Cx noch Cα irgendeine Immunglobulin-ähnliche Faltung ausbilden, und daß für einen Teil des T-Zell-Rezeptormoleküls eine bestimmte andere Struktur oder Strukturen erforderlich sind.
• Eine faszinierende Ähnlichkeit zwischen Cx und Cα liegt darin, daß beide relativ kurze (14-15 Aminosäuren) hydrophobe C- Termini (gezählt von dem konservierten Lysin) aufweisen, wohingegen die korrespondierenden Regionen von Cγ und Cβ, welche jeweils nahe dem Ende des Moleküls drei geladene Reste aufweisen (Cβ endet mit "KKKNS" und Cγ endet mit "NEKKS"), viel länger sind (23 bzw. 25 Aminosäuren). Diese Unterschiede in den Beziehungen der Polypeptidsequenz können bei der Heterodimer-Bildung und der Interaktion mit den CD3-Polypeptiden wichtig sein. Ein weiteres Merkmal der Cx-Sequenz ist die Ähnlichkeit in der Art und Weise, wie Cx-konservierte Sequenzen von denjenigen von Cα getrennt sind, und die relative Disparität der Cγ- und Cβ-Organisation. Die vier konstanten Regionen des T-Zell-Rezeptors können anhand der konservierten Cystein (C)-, Lysin (K)- und Tryptophan (W)- Reste ausgerichtet werden. In den meisten Fällen sind die Abstände zwischen den Resten bei Cx und Cα sehr ähnlich, und sie sind bei γ und β sehr ähnlich. Die einzige Ausnahme dieser Beobachtung liegt in dem Abstand zwischen dem zweiten und dem dritten Cystein von Cα, welcher ungewöhnlich kurz ist. Ebenfalls interessant ist die Tatsache, daß γ und β beide 14 Aminosäure nach dem ersten konservierten Cysteinrest ein Tryptophan aufweisen, was ein Merkmal sämtlicher konstanter Immunglobulin- Regionen ist, wohingegen weder Cx noch Cα an dieser Position oder irgendwo in der Nähe ein Tryptophan aufweisen. Da bekannt ist, daß sich α und β miteinander paaren, scheinen Cx und Cγ eine äquivalente Paarung einzugehen. Eine natürliche Folge ist, daß α in der Lage sein könnte, mit γ zu paaren, oder daß sich die "x"-Kette mit β paart. Wenn diese letzte Möglichkeit zutrifft, kann dies zur Erklärung der offenbaren wechselseitigen Ausschlußregeln beitragen, nach denen diese beiden Genloci zu ar beiten scheinen.
• Um die Menge und die Verteilung der Expression der x-Kette zu ermitteln, wurde ein "Northern"-Blot mit RNA's aus unreifen und adulten Thymozytenpolulationen hergestellt und einer Hybridisierung mit Cx-, Cγ- und Cα-cDNA-Sonden ausgesetzt. Beide Cx und Cγ enthaltenden Sequenzen werden in der RNA einer adulten doppelt-negativen Zelle und in 15 Tage alten fötalen Thermozytenkulturen (kultiviert mit IL-4 und Tetradecylphorbolacetat) in großer Menge exprimiert, obgleich die Menge in neugeboreren Thymozyten etwas reduziert ist und sie in unfraktionierter adulter Thymus-RNA nach einer langen autoradiographischen Expositionsdauer nur schwach nachweisbar sind. Die Höhe der Expression im Gesamt-Thymus wird auf nicht mehr als ein 10tel derjenigen von adulten doppelt-negativen Zellen geschätzt. Demgegenüber ist Cα-mRNA in den kultivierten fötalen Thymozyten nicht vorhanden, in der RNA doppelt-negativer Zellen kaum nachweisbar, und ist in der RNA adulter Thymozyten klar vorhanden. Diese Daten stimmen mit den veröffentlichten Ergebnissen überein, da die doppeltnegative Zellpräparation nicht im Hinblick auf den CD1-Marker selektiert wurde.
• Es gibt zwei vorherrschende Größenklassen von Cx-spezifischer RNA in den Zellpopulationen; 2 Kb und 1,55 Kb (bestimmt durch Verwendung von 5,1 Kb und 2,0 Kb für ribosomale 28S und 18S als Marker). Unter Verwendung einer V-Region-Sonde wird eine Hybridisierung lediglich mit der Bande von 2,0 Kb nachgewiesen. Es wurden D-Elemente identifiziert, die 5' von Jx lokalisiert sind, und es wurden in einigen fötalen Thymozyten und in adulten doppelt-negativen Zell-Hybridomas DJx-Rearrangements beobachtet. In einer doppelt-negativen Hybridzelle, die lediglich über ein Chromosom verfügt, das ein DJ-Rearrangement enthält, ist lediglich die RNA von 1,55 Kb vorhanden. Dies deutet darauf hin, daß mindestens einige der Spezies von 1,55 Kb DJ-Transkripte sind. Diese Situation ist derjenigen ähnlich, die für das Gen der schweren Ig-Kette Cµ und für die Gene der β-Kette des TCR beobachtet wurde, wo mRNA, die mit Rearrangements unter Beteiligung von sowohl VDJ als auch DJ korrespondieren, in Klassen unterschiedlicher Größe transkribiert werden.
• Es wurde beobachtet, daß die Größe des Transkripts in der 2B4-Zelle 1,85 Kb beträgt. Dieses Ergebnis ist reproduzierbar und stimmt mit der Größe des isolierten cDNA-Klons überein. Eine Erklärung hierfür ist, daß dieser Befund auf einen Stamm-Polymorphismus zurückzuführen ist, da das 2B4-Transkript aus einem Chromosom des Stammes B10.A stammt (bei dem Fusionspartner BW5147 war diese Region aus beiden Chromosomen deletiert), und da die vorliegend analysierten Zellpopulationen entweder von BALB/c oder bei BALB/c x 129 F&sub1;'s kamen (erhalten von 3 Wochen altem Thymus von BALB/c x 129 F&sub1; durch Analyse gegenüber monoklonalem Anti-CD4- und GK1.5-Antikörper (erhältlich von Dr. A. Zlotnick)). Eine andere Erklärung beruht auf differentiellem Spleißen.
• Das beschriebene besondere Gen repräsentiert kein funktionelles Rearrangement, aber die strukturellen Elemente des Gens sind homolog zu hochkonservierten T-Zell-Rezeptor- und Immunglobulin-Sequenzen. Die Sequenz der C-Region des cDNA-Klons 2B4 wurde durch genomische Sequenzanalyse bestätigt. Da Cx ein Einzelkopie-Gen ist und die Organisation der Introns und Exons derjenigen der konstanten Regionen von Ig und TCR sehr ähnlich ist, ist es unwahrscheinlich, daß es sich um ein Pseudogen handelt. Darüber hinaus repräsentieren nahezu alle cDNA-Klone der γ-Kette von funktionellen Helfer- oder zytotoxischen T-Zellinien Transkripte von Verknüpfungs(joining)-Ereignissen außerhalb des Leserahmens, und funktionellem RNAs und Proteine sind in anderen Zelltypen nachweisbar. Da die isolierte cDNA vom T-Helfer-Hybridom 2B4 stammte, welches ein funktionelles α:β-Heterodimer aufweist, ist es vernünftig anzunehmen, daß, während in diesen Zellen eine nicht-funktionelle mRNA gebildet wird, Proteine, die die Cx-Sequenz aufweisen, in anderen T-Zell-Typen identifiziert werden.
• Eine funktionelle Version der beschriebenen Sequenz würde für ein Polypeptid von 30,7 kD mit zwei N-verknüpften Glykosylierungsstellen kodieren. Eine vollständig glykosylierte Form würde ungefähr 37 kD aufweisen. Diese Größe ist erheblich kleiner als die für das δ-Ketten-Protein der Maus berichtete, welches in seiner glykosylierten Form 45 kD aufweist und nach Behandlung mit Endo F eine Größe von 37 kD besitzt (Pardolly, oben). Kürzlich ist beobachtet worden, daß humane Cγ-Gene derart differentiell gespleißt werden können, daß sie ein bis drei Scharnier(hinge)-ähnliche Exons einschließen, welche zu beträchtlichen Veränderungen des geschätzten Molekulargewichts führen (Littman et al., Nature (1987) 326:85-88). Die 2B4-mRNA ist etwa 150 Nukleotide kürzer als die größere der beiden Cx Sequenzen enthaltenden Hauptspezies. Es scheint daher möglich zu sein, daß ein ähnliches Phänomen bei dem vorliegend beschriebenen Gen auftritt, und daß die hauptsächliche hochmolekulare Spezies, welche in Thymozyten gefunden wird, gegenüber der cDNA- Sequenz von 2B4 ein zusätzliches Exon oder zusätzliche Exons aufweisen. Eine zusätzliche Sequenz der kodierenden Region von 150 Nukleotiden würde zu einem unglykosylierten Molekulargewicht von 36,2 kD führen, was mit dem für die 8-Kette der Maus beobachteten nahezu identisch ist.
• Aus den obigen Ergebnissen ist offensichtlich, daß die neuen Nukleinsäuresequenzen zur Identifizierung unreifer T-Zellen in einer besonderen Stufe der Differenzierung verwendet werden können. Zusätzlich können diese Sequenzen bei DNA-Konstrukten eingesetzt werden, um die Expression des interessierenden Peptids selbst bereitzustellen, oder in Kombination mit anderen T-Zell-spezifischen Peptiden, insbesondere anderen, bei T-Zell-Rezeptoren beteiligten Peptiden, und insbesondere den β- und γ-Peptiden. Die interessierenden Peptide selbst oder in Kombination mit anderen Peptiden können bei der Bindung von Liganden in einer Vielzahl von Anwendungsbereichen eingesetzt werden, wie bei diagnostischen Immunoassays, Affinitätschromatographie, und dergleichen. Zusätzlich können die vorliegenden Peptide zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern eingesetzt werden, um zwei T-Zellen zu binden, welche kreuzreaktive Peptide aufweisen, um derartige spezifische T- Zellen zu aktivieren oder zu entfernen.
• Sämtliche Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung angeführt werden, zeigen den Kenntnisstand des Fachmanns auf dem die Erfindung betreffenden Gebiet. Sämtliche Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden vorliegend in demselben Umfang durch Bezugnahme eingeschlossen, als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung in besonderer Weise und individuell durch Bezugnahme eingeschlossen worden wäre.
• Obgleich die vorstehende Erfindung zum Zwecke eines besseren Verständnisses durch Veranschaulichung und Beispiele beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen ausgeführt werden können.

Claims (18)

1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül für die δ-Kette des T-Zell- Antigen-Rezeptors, wobei das Molekül umfaßt:

(A) eine Nukleinsäure, die für eine δ-Kette eines T-Zell- Antigen-Rezeptors kodiert, wobei die Nukleinsäure selektiv hybridisierbar ist mit

(i) einer Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der in Figur 1 dargestellten Sequenz des Klons pλ12 vom Kodon 121 bis zum Kodon 273 einschließlich, oder

(ii) einer dazu komplementären Sequenz, oder

(B) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fragment einer δ- Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert, wobei die Sequenz in einer Nukleinsäure vorhanden ist, die für eine δ- Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert, wobei die Nukleinsäure selektiv mit einer Sequenz hybridisierbar ist, wie sie oben unter (i) oder (ii) definiert ist.

2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül für die δ-Kette des T-Zell- Antigen-Rezeptors nach Anspruch 1, wobei das Molekül eine für ein Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die Sequenz mindestens 50 aufeinanderfolgende Nukleotide umfaßt, welche in einer Nukleinsäure gemäß Definition in Anspruch 1 vorhanden sind, die für eine δ-Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert.

3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül für die δ-Kette des T-Zell- Antigen-Rezeptors nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Molekül eine für ein Fragment einer δ-Kette eines T-Zell- Antigen-Rezeptors kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die Sequenz bis zu etwa 0,5 kbp einer Nukleinsäure gemäß Definition in Anspruch 1 umfaßt, die für eine δ-Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert.

4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül für die δ-Kette des T-Zell- Antigen-Rezeptors nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Molekül eine für ein Fragment einer δ-Kette eines T-Zell- Antigen-Rezeptors kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die Sequenz bis zu etwa 1 kbp einer Nukleinsäure gemäß Definition in Anspruch 1 umfaßt, die für eine δ-Kette eines T- Zell-Antigen-Rezeptors kodiert.

5. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches ein Fragment vom Klon 2B4.Exp gemäß Darstellung in Figur 1 oder vom Klon pλ12 gemäß Darstellung in Figur 1 oder von der zusammengesetzten Sequenz der Klone 2B4.Exp und pλ12 umfaßt.

6. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches eine mRNA oder eine cDNA ist.

7. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Molekül für eine oder mehrere Regionen und/oder für einen oder mehrere Teile von Regionen einer δ-Kette eines Säuger-T-Zell-Rezeptors kodiert.

8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, bei dem die Regionen und Teile von Regionen ausgewählt sind aus der variablen Region, der Diversitäts (diversity)-Region, der verknüpfenden (joining) Region, der konstanten Region und der nichtkodierenden Region.

9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, welches die gesamte oder einen Teil der konstanten Region umfaßt.

10. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches markiert ist.

11. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, welches ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt, wobei das Nukleinsäuremolekül eine DNA ist.

12. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11, welches ferner eine Nukleotidsequenz oder -sequenzen umfaßt, die die Expression des Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 regulieren.

13. Wirtszelle, die ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12 enthält.

14. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Polypeptids umfassend eine δ-Kette eines T-Zell-Rezeptors oder ein Fragment davon, kodiert von einem Nukleinsäuremolekül für die δ-Kette des T-Zell-Rezeptors gemäß Anspruch 1, bei dem man:

(a) eine Wirtszelle gemäß Anspruch 13 unter solchen Bedingungen kultiviert, daß das δ-Peptid oder -Polypeptid des T-Zell-Rezeptors exprimiert wird, und

(b) das resultierende δ-Peptid oder -Polypeptid des T-Zell- Rezeptors aus der Zellkultur isoliert.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Peptid eine oder mehrere Regionen und/oder einen oder mehrere Teile von Regionen einer δ-Untereinheit eines Säuger-T-Zell-Rezeptors umfaßt.

16. Verfahren zum Erhalt eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1, bei dem man:

(a) eine Probe, die Nukleinsäuren enthält, welche für T- Zell-Proteine kodieren, unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Definition in Anspruch 1, Teil (A)(i) oder (A)(ii), kontaktiert,

(b) aus der Probe eine Nukleinsäure isoliert, welche mit der Nukleinsäuresequenz hybridisiert, und fakultativ

(c) eine oder mehrere Manipulationen der isolierten Nukleinsäuresequenz durchführt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Manipulationen das Entfernen von einer oder mehreren Regionen und/oder Teilen von Regionen einer δ-Kette eines T-Zell-Antigen-Rezeptors einschließen.

18. Nukleinsäuresonde, welche eine Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der in Figur 1 dargestellten Sequenz des Klons pλ12 vom Kodon 121 bis zum Kodon 273 einschließlich umfaßt.