DE69534624T2

DE69534624T2 - Transkripte des HLA-G-Gens des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC)-Klasse 1 und ihre Anwendungen

Info

Publication number: DE69534624T2
Application number: DE69534624T
Authority: DE
Inventors: Edgardo Delfino Carosella; Philippe Moreau; Eliane Gluckman; Marek Kirszenbaum
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2015-03-18
Also published as: FR2717498A1; US6291659B1; US5856442A; EP0677582B1; FR2717498B1; DE69534624D1; US20020052487A1; EP0677582A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Transkripte des HLA-G-Gens des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC)-Klasse I, die in den fötalen Trophoblasten und/oder den mononukleären zirkulierenden Zellen des Erwachsenen vorliegen, sowie auf ihre Anwendungen.
Die Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gliedern sich in mehrere Klassen, die Antigene der Klasse I (HLA-A, HLA-B und HLA-C), die drei globuläre Domänen (α1, α2 und α3) zeigen und deren α3-Domäne mit dem β2-Mikroglobulin assoziiert ist, die Antigene der Klasse II (HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR) und die Antigene der Klasse III (Komplement).
Die Antigene der Klasse I enthalten außer den vorgenannten Antigenen andere Antigene, die als nicht-klassische Antigene der Klasse I bezeichnet werden, und insbesondere die Antigene HLA-E, HLA-F und HLA-G; dieses letztgenannte wird insbesondere durch die extrazottigen Trophoblasten der normalen humanen Plazenta exprimiert.
Die Sequenz des Gens HLA-G (Gen HLA-6.0) wurde von GERAGHTY et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145–9149) beschrieben: es umfasst 4396 Basenpaare und weist eine Intron/Exon-Organisation auf, die homolog zu der der Gene HLA-A, -B und -C ist. Genauer ausgedrückt, dieses Gen umfasst acht Exons und ein nicht-translatiertes 3'UT-Ende, entsprechend: Exon 1: Signalsequenz, Exon 2: α1-Domäne, Exon 3: α2-Domäne, Exon 4: α3-Domäne, Exon 5: Transmembranregion, Exon 6: zytoplasmische Domäne I, Exon 7: zytoplasmische Domäne II, Exon 8: zytoplasmische Domäne III und 3'-nicht-translatierte Region (GERAGHTY et al., vorher zitiert, ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731–735). Jedenfalls unterscheidet sich das Gen HLA-G von anderen Genen der Klasse I dadurch, dass das Stoppcodon der Transkription im Raster mit der Ebene des zweiten Codons des Exon 6 lokalisiert ist; als Folge ist die zytoplasmische Region des Proteins, das durch dieses Gen HLA-6.0 codiert wird, deutlich kürzer als die der zytoplasmischen Regionen der Proteine HLA-A, -B und -C.
Im Gegensatz zu anderen Antigenen der Klasse I ist dieses Antigen HLA-G (Klone G 6.0 und BeWO.G7) nicht polymorph und werden nicht in anderen Zelltypen als den Trophoblasten exprimiert (ELLIS et al., J. Immunol. 1990, vorher zitiert).
Es wurden andere HLA-G-Klone isoliert (TAMAKI et al., Microbiol. Immunol., 1993, 37, 8, 633–640); insbesondere der HLA-G-Klon, 7.0E genannt, wurde aus einer japanischen Plazenta isoliert und seine Aminosäuresequenz erwies sich als identisch mit der der vorher genannten Klone G6.0 und BeWO.G7. Die Autoren dieses Artikels zeigen außerdem, dass eine bestimmte Heterogenität in den HLA-G-Genen vorliegen kann.
Diese Antigene HLA-G werden im Wesentlichen durch die zytotrophoblastischen Zellen der Plazenta exprimiert; jedenfalls wurde HLA-G-mRNA in den Geweben des Auges und in der fötalen Leber gefunden (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947–3951; deren Nummerierung derjenigen der Sequenz HLA 6.0, wie sie in SHUKLA et al., Nucleic Acids Research, 1990, 18, 8, 2189 beschrieben ist, entspricht).
Von den Antigenen HLA-G, die durch die Zytotrophoblasten exprimiert werden, wird angenommen, dass sie beim Schutz der Plazenta eine Rolle spielen (Fehlen einer Abstoßung). In dem Maße, wie das HLA-G-Antigen monomorph ist, kann es außerdem beim Wachstum oder der Funktion der Plazentazellen involviert sein (KOVATS et al., Science, 1990, 248, 220–223).
Andere Forschungen, die dieses nicht-klassische Antigen der Klasse I betreffen (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947–3951), haben gezeigt, dass das primäre Transkript des HLR-G-Gens auf verschiedene Weise gespleißt werden kann und wenigstens drei verschiedene reife mRNA produziert: das primäre Transkript von HLA-G liefert eine vollständige Kopie (G1) mit 1200 bp, ein Fragment mit 900 by (G2) und ein Fragment mit 600 by (G3).
Das Transkript G1 enthält das Exon 7 nicht und entspricht der von ELLIS et al. (vorher zitiert) beschriebenen Sequenz, d.h. es codiert für ein Protein, das eine Leadersequenz, drei externe Domänen, eine Transmembranregion und eine zytoplasmische Sequenz umfasst. Die G2-mRNA umfasst das Exon 3, d.h. sie codiert für ein Protein, in dem die Domänen α1 und α3 direkt verknüpft sind; die G3-mRNA enthält weder das Exon 3, noch das Exon 4, d.h. sie codiert für ein Protein, in dem die α₁-Domäne und die Transmembransequenz direkt verknüpft sind.
Das Spleißen, das zum Erhalt des Antigens HLA-G2 verwendet wird, bringt die Verknüpfung eines Adenins (A) (stammend aus der Domäne, die für α1 codiert) mit einer Sequenz AC (stammend aus der Domäne, die für α3 codiert) mit sich, was zur Bildung eines Codon AAC (Asparagin) anstelle des Codons GAC (Asparaginsäure) führt, dem man am Anfang der Sequenz begegnet, die für die α₃-Domäne in HLA-Gl codiert.
Das Spleißen, das zum Erhalt des HLA-G3 durchgeführt wurde, führt nicht zur Bildung eines neuen Codons in der Spleißzone.
Die Autoren dieses Artikels haben auch verschiedene exprimierte Proteine analysiert: die drei mRNA werden in der Zelllinie .221-G in Protein translatiert.
Die Autoren dieses Artikels schließen auf eine fundamentale Rolle von HLA-G beim Schutz der Plazenta gegenüber einer mütterlichen Immunantwort (Induktion einer Immuntoleranz). Allerdings wird präzisiert, dass die Rolle des Proteins G3, das die α₃-Domäne nicht enthält, nicht geklärt ist.
Die Komplexität des MHC und die Rolle des Antigens HLA-G in den Toleranzmechanismen haben die Erfinder dazu gebracht, wenigstens ein HLA-G-Transkript zu suchen, das gleichzeitig:

– im peripheren Blut leicht nachgewiesen werden könnte,
– fähig wäre, unter geeigneten Bedingungen ein zweckdienliches, vorzugsweise lösliches, Protein als Toleranzagens zu exprimieren,
– es möglich machen könnte, unreife Zellstämme zu selektionieren, die geeignet sind, in Knochenmarktransplantaten verwendet zu werden, und es auch möglich machen würden, in mütterlichem Blut fötale Zellen nachzuweisen, in denen dieses Gen exprimiert wird.

Folglich besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von Sequenzen, die aus einer mRNA des HLA-G-Gens stammen, die geeignet sind, die Gesamtheit der oben dargelegten Probleme zu lösen. Derartige Sequenzen finden insbesondere Anwendung:

– in der Abtrennung von fötalen Zellen in einer Probe mütterlichen Bluts,
– in einem Verfahren zur Anreicherung von Zellen unreifer Stämme, die zur Verwendung in Knochenmarkstransplantationen geeignet sind und
– in der spezifischen Abtrennung von mononukleären Zellen im Blutkreislauf,
– und bei der Zerstellung eines Immunmodulator-Medikaments.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein cDNA-Molekül, das von einer mRNA des humanen HLA-G-Gens des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aufeinander folgend von 5' nach 3' aus den folgenden Fragmenten des HLA-G-Gens besteht:

– dem Fragment, das für das Peptidsignal codiert (Exon 1),
– dem Fragment, das für die α1-Domäne codiert (Exon 2),
– dem Fragment, das für die α2-Domäne codiert (Exon 3),
– dem Fragment, das für die Transmembrandomäne TM codiert (Exon 5),
– dem Fragment, das für die zytoplasmische Domäne codiert (Exon 6), und
– dem nicht-translatierten 3'-Fragment (Exon 8), wobei das cDNA-Molekül HLA-G 3-5 oder nach den derzeit geltenden Bestimmungen HLA-G4 bezeichnet wird.

Eine derartige Sequenz umfasst insbesondere das Exon 4 nicht und weist die Gesamtheit der oben aufgezählten Eigenschaften auf und ist insbesondere in den mononukleären zirkulierenden Zellen des Erwachsenen detektierbar.
Unter mononukleären Sequenzen versteht man alle mononukleären Zellen des peripheren Bluts mit Ausnahme der Killerzellen (NK-Zellen und andere LGL (large granular lymphocytes)).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Fragment des cDNA-Moleküls, wie es oben definiert wurde, wobei das Fragment aufeinander folgend von 5' nach 3' aus:

– dem Fragment, das für die α2-Domäne codiert (Exon 3),
– dem Fragment, das für die Transmembrandomäne TM codiert (Exon 5),
– dem Fragment, das für die zytoplasmische Domäne codiert (Exon 6), und
– dem nicht-translatierten 3'-Fragment (Exon 8), besteht.

Gemäß der Erfindung weist eine derartige Sequenz, die für ein Protein codiert, in dem die α₂-Domäne und die Trans membransequenz HLA-G direkt verknüpft sind, die folgende SEQ ID NO: 1 auf:
in der X₁ für G oder A steht,
X₂ für C oder G steht,
X₃ für T oder C steht,
und die 0,43 kb umfasst.
In unerwarteter Weise wird ein derartiges Transkript sowohl in den Trophoblasten (erstes Drittel der Schwangerschaft) als auch in den beim Erwachsenen zirkulierenden mononukleären Zellen detektiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Transkriptionsprodukt des humanen HLR-G-Gens des MHC, das isoliert und gereinigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aufeinander folgend von 5' nach 3' aus den folgenden Fragmenten des HLA-G-Gens besteht:

– dem Fragment, das für das Peptidsignal codiert (Exon 1),
– dem Fragment, das für die α1-Domäne codiert (Exon 2),
– dem Fragment, das für die α2-Domäne codiert (Exon 3),
– dem Fragment, das für Transmembrandomäne TM codiert (Exon 5), und
– dem Fragment, das für zytoplasmische Domäne von HLA-G codiert (Exon 6).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Oligonukleotidfragment des cDNA-Moleküls gemäß der Erfindung, die das Exon 4 nicht umfassen; unter den Fragmenten, deren Nummerierung derjenigen der Sequenz HLA 6.0, wie sie in der vorher zitierten Literaturstelle von SHUKLA et al. beschrieben ist, entspricht, kann man nennen:

– GGA AGA GGA GAC ACCG GAA CA (SEQ ID NO: 2), G.257(+) genannt, die sich auf dem Niveau des Exon 2 befindet und dem Fragment 257–276 der genannten cDNA-Sequenz entspricht;
– CCA ATG TGG CTG AAC AAA GG (SEQ ID NO: 3), G.526(+) genannt, die sich auf dem Niveau des Exon 3 befindet und dem Fragment 526–545 der genannten cDNA-Sequenz entspricht;
– CCC CTT TTC TGG AAC AGG AA (SEQ ID NO: 4), die Sequenz, die G.1200(–) genannt wird und dem Fragment 1200–1219 der genannten cDNA-Sequenz entspricht;
– TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (SEQ ID NO: 5), die G.1225(–) genannt wird und dem Fragment 1225–1244 der cDNA-Sequenz entspricht;
– CAG CGC GCG GAG CAG TCT TC (SEQ ID NO: 6), die G.3.5(+) bezeichnet wird und der Verknüpfung Exon 3-Exon 5 der genannten cDNA-Sequenz entspricht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nucleotidsonden, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Nucleinsäuremolekülen und Fragmenten dieser, wie sie vorstehend defi niert sind, die mit Hilfe eines Markers, wie einem radioaktiven Isotop, einem geeigneten Enzym oder einem Fluorochrom markiert sind, bestehen.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der genannten Sonde weist sie die oben genannte erfindungsgemäße Sequenz ID NO: 6 auf, die für das Transkript spezifisch ist, und zwar ohne Exon 4.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der genannten Sonde weist sie die oben angegebene Sequenz ID NO: 4 auf; eine derartige Sonde ist dazu geeignet, alle Transkriptionsprodukte des humanen Gens HLA-G des MHC zu detektieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Primer, die geeignet sind, eine Nucleotidsequenz gemäß der Erfindung, wie sie oben definiert wurde (Sequenz ohne Exon 4), zu amplifizieren.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Primer umfasst ein bevorzugtes Primerpaar:

(1) GGA AGR GGA GAC ACCG GAA (SEQ ID NO: 2)
(2) TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (SEQ ID NO: 5).

Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Primer umfasst ein anderes bevorzugtes Primerpaar:

(3) CCA ATG TGG CTG AAC AAA GG (SEQ ID NO: 3)
(4) TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (SEQ ID NO: 5).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Proteine oder Peptidfragmente, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie durch die Nucleinsäuremoleküle oder die Fragmente dieser, wie sie oben definiert sind, codiert werden.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Peptid durch ein Fragment des Transkripts HLA-G4 codiert und entspricht der folgenden SEQ ID NO: 7:
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Peptide gemäß der Erfindung können sie durch Synthese erhalten werden.
Gemäß der Erfindung finden derartige Proteine oder Peptide Anwendung als Medikamente, insbesondere in immunmodulatorischen Zusammensetzungen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Selektion und Anreicherung von undifferenzierten hämotopoetischen Zellen (unreife Blutzellen oder Stammzellen), dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(a) Entnahme einer Probe, die gegebenenfalls unter peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Knochenmark ausgewählt wurde,
(b) Inkontaktbringen der Probe mit Antikörpern gegen CD34,
(c) Abtrennung der Komplexe Antigen-CD34-enthaltende Zellen-Anti-CD34-Antikörper;
(d) Durchführung einer RT-PCR in situ mit den in Stufe (c) erhaltenen Zellen in Gegenwart von mit Hilfe von Fluorochroms markierten Primern gemäß der Erfindung;
(e) Abtrennung der fluoreszierenden Zellen und
(f) Selektion der nicht-fluoreszierenden, unreifen, pluripotenten Zellen.

Die in (f) erhaltenen Zellen sind CD34⁺-HLA-G^–-Zellen, die völlig unreife Zellen sind. Ein derartiges Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, eine große Zahl von unreifen Stammzellen zu erhalten, die geeignet sind, als Implantate von Stammzellen verwendet zu werden.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des genannten Verfahrens wird das Primerpaar unter den Paaren (1)–(2) und (3)–(4), wie sie oben definiert wurden, ausgewählt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Detektion und Abtrennung von Zellen, die das Transkript HLA-G4 gemäß der Erfindung exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass es in situ die Durchführung einer RT-PCR umfasst, durch:
(a) Inkontaktbringen von Blutzellen mit einem markierten Primerpaar gemäß der Erfindung, das unter den Paaren (1)–(2) und (3)–(4), wie sie oben definiert wurden, selektioniert wurde, und
(b) Abtrennen der markierten Zellen durch jedes zweckdienliche Mittel, insbesondere durch Zytofluorometrie.
Die RT-PCR wird insbesondere in American J. Pathol., 1993, 143, 6, 1527–1534 beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Immunisierung eines geeigneten Tiers mit einem Protein oder einem Peptid gemäß der Erfindung hergestellt werden und dass sie unter den HLA-G-Proteinen einzig das Protein oder das Peptid gemäß der Erfindung erkennen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Abtrennung von kernhaltigen fötalen Zellen, ausgehend von einer mütterlichen Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(1) Inkontaktbringen der Probe aus mütterlichem Blut mit Antikörpern, die gegen die HLA-G-Proteine, wie sie oben definiert sind, gerichtet sind, und
(2) Abtrennung der erhaltenen Komplexe fötale Zellen-Antikörper.

Ein solches Verfahren ermöglicht das pränatale Screening von Fötusanomalien und insbesondere von chromosomalen Aberrationen oder genetischen Aberrationen und eine pränatale Bestimmung des Geschlechtes, ausgehend von zirkulierenden Fötuszellen, die in zuverlässiger Weise aus dem mütterlichen Blutkreislauf isoliert wurden, und zwar in dem Maße, wie nur diese fötalen Zellen Träger der genannten HLR-G-Proteine sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur spezifischen Abtrennung von zirkulierenden Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, dass es in situ die Durchführung einer RT-PCR umfasst, durch:
(a) Inkontaktbringen von Blutzellen mit einem markierten Primerpaar gemäß der Erfindung und
(b) Abtrennen der markierten Zellen (Zytofluorometrie...).
Ein solches Verfahren erlaubt es bei Bedarf außerdem, die mononukleären Zellen, die das HLA-G-Gen nicht exprimieren (insbesondere Killerzellen), von anderen mononukleären Zellen abzutrennen.
Außerdem exprimieren nur die NK-Zellen (oder Killerzellen), die mRNA von HLA-G nicht; dies zeigt, dass die Expressionsprodukte des HLA-G-Gens gegen die lytische Aktivität der NK-Zellen schützen. Außer den vorstehend genannten Ausführungsformen umfasst die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die sich aus der folgenden Beschreibung ableiten, die sich auf Beispiele zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bezieht.
Es muss jedoch selbstverständlich sein, dass die Beispiele lediglich zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung angeführt werden, für den sie keinerlei Beschränkung darstellen.
BEISPIEL 1: Transkript des gespleißten HLA-G-Gens ohne Exon 4
a) Erhalt der Erwachsenen-Zellen und der fö- talen Gewebe.

– Die Trophoblasten des ersten Drittels der Schwangerschaft werden als IVG (6. bis 10. Schwangerschaftswoche) erhalten.
– Fötale Leber des zweiten Drittels werden durch therapeutische Schwangerschaftsabbrüche erhalten (16 Schwangerschaftswochen).

Die Gewebe werden in PBS-Puffer gewaschen und die Throphoblasten oder die Leber werden unter dem Mikroskop identifiziert und in flüssigem Stickstoff gefroren.

– Proben von humanem peripherem Blut werden von Freiwilligen erhalten (normale Menschen).

Die mononukleären Zellen werden von den polynukleären durch Dichte-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque^®) abgetrennt und die mRNA der zwei Populationen wird isoliert.
Man erhält auch mononukleäre Zellen, die an Lymphozyten B angereichert sind, durch Immunabsorption an magnetischen Perlen, die mit Anti-CD19-Antikörpern überzogen sind (Dynabeads-Dynal/Biosys, Frankreich), und mononukleäre Zellen, die mit T-Lymphozyten angereichert sind, durch Trennung an Leuko-Pac^® (Fenwal Laboratories, USA).
Die Anreicherung ist für die B-Zellen etwa 90 % und für die T-Zellen etwa 87 %, wie es durch FACS-Analyse bestimmt wird: Bestimmung der Komplexe, die mit den Antikörpern gegen CD20 oder den Antikörpern gegen CD3, markiert mit FITC, und 1 × 10⁵ Zellen für jede Sub-Population, gebildet wurden.
b) Isolierung der RNA und Amplifikation durch RT-PCR:
Die Gesamt-mRNA wird ausgehend von 1 g gefrorenem Gewebe oder 2 × 10⁷ Zellen isoliert, wobei das Reagens RNA-Zol B^® (Bioprobe Systems, Frankreich) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird; die Qualität des erhaltenen Produkts wird durch Elektrophorese auf 1,5 denaturierendem Agarosegel bestätigt.
Die cDNA wird, ausgehend von 10 μg Gesamt-RNA, in Gegenwart von Oligo-dT-Primer und reverser Transkriptase M-MLV (Gibco-BRL, Life Technologies) durch Inkubation von 20 μl des Gemisches bei 42°C für 1 Stunde, dann bei 95°C für 5 Minuten, hergestellt.
Die PCR-Fragmente, die mit den verwendeten Primern erhalten werden können (siehe Tabelle I unten), sind in 1 dargestellt.
Um das Transkript G.3–5 (jetzt HLA-G4 genannt) gemäß der Erfindung (Fragment mit 0,43 kb) zu amplifizieren, verwendet man vorzugsweise die Primer G.526 und G.1225 (dargestellt durch die horizontalen Pfeile); die Sonde, die verwendet wird, um dieses amplifizierte Transkript zu detektieren, ist die Sonde G.3–5 (dargestellt durch eine dicke Linie).
Die vertikalen Pfeile geben die spezifischen Restriktionsstellen der Exons 3, 4 und 5 an, die zur Restriktionsanalyse der RT-PCR nützlich sind und in den Vektor pPCRII kloniert sind (B : BgII; St : StuI; Ss : SstI)
TABELLE I
Ex ist die Abkürzung für Exon
Um die Menge des nicht-spezifischen amplifizierten Produktes zu reduzieren, wird die Amplifikation unter Verwendung der "hot-start"-Technik durchgeführt: In einem Reaktionsröhrchen werden 200 μM jedes dNTP, 0,1 μg jedes Primers und eine AmpliWax^®-Pastille (Ceteus-Perkin Elmer, Frankreich) in 50 μl 1X PCR-Puffer bei 75°C für 5 Minuten inkubiert; in einem zweiten Röhrchen werden 2 μl RT-Lösung oder 1 μg genomische DNA und 3,5 E Taq-Polymerase (Cetus-Perkin Elmer) in 50 μl 1X PCR-Puffer 5 Minuten bei 95°C inkubiert.
Der Inhalt der zwei Röhrchen wird dann gemischt und 35 PCR-Zyklen unter den folgenden Bedingungen unterworfen:
94°C während 1 Minute,
61°C während 1 Minute,
72°C während 1 Minute 30.
Die letzte Verlängerungsstufe bei 72°C ist über 10 Minuten.
Die PCR-Produkte werden durch Elektrophorese an 1 %-Agarosegel analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt.
Die Spezifität der erhaltenen Produkte wird durch Alkali-Blotting der Fragmente (0,4 N NaOH) auf einer Nylonmembran (Hybond N⁺, Amersham, Frankreich) bestätigt, dann wird eine Hybridisierung im Puffer durchgeführt: 5X SSPE, 5X Denhardt, 0,5 % SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, und zwar während 2 h bei 55°C in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde G-1200, markiert mit ³²P ([γ–³²P] dATP) und eines Markierungskits für das 5'-Ende (Boehringer-Mannheim, Frankreich).
Es werden verschiedene Amplifikationskontrollen durchgeführt: RT-Reaktionsgemisch ohne die reverse Transkriptase M-MLV (RT^–) und PCR-Gemisch ohne cDNA-Matrize (Blindwert).
Im Übrigen werden positive Kontrollen mit überall vorkommenden Primern der Klasse I von HLA durchgeführt (siehe Tabelle I).
c) Resultate:

1. Mit den Primern G.526 und G.1225 werden zwei Fragmente (0,71 kb und 0,43 kb) nach Gelelektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid beobachtet, die mit der Sonde G1200 hybridisieren (siehe 1 und 2A und 2B).
2. Die RT-PCR der mRNA von fötaler Leber im zweiten Drittel zeigt keine Bande auf dem Gel, kein Hybridisierungs signal, während die Amplifikation mit Primern von HLA der Klasse I ein positives Signal mit sich bringt (2C). Die Amplifikation der genomischen DNA weist eine Bande mit ungefähr 2,2 kb entsprechend der genomischen Sequenz von HLA-G auf.
3. Das Fragment mit 0,71 kb entspricht dem vollständigen HLA-G-Transkript, während
4. das Fragment mit 0,43 kb einem Transkript entspricht, das das Exon 4 (→ 276 bp) (HLA-G4) nicht enthält.

Um die Abwesenheit des Exons 4 zu bestätigen, wird die Bande mit 0,43 kb abgeschnitten und nach dem folgenden Verfahren sequenziert:
Um Sequenzierungsmatrizen herzustellen, werden die PCR-Fragmente durch Elektrophorese an 4 % Polyacrylamidgel getrennt, ausgeschnitten und mit 0,5 M Ammoniumacetatpuffer und 5 mM EDTA eluiert und durch asymmetrische PCR reamplifiziert, so dass Einzelstrangprodukte gebildet werden.
Das reamplifizierte Produkt wird durch Extraktion in Phenol-Chloroform gereinigt, 2 Mal mit Ethanol präzipitiert, dann sequenziert, wobei der Sequenzierungskit T7 Sequenase 2.0 (USB/Touzard-Matignon, Frankreich) verwendet wird.
Darüber hinaus werden die Produkte der PCR in den Vektor pPCRII kloniert, indem der Kit TA Cloning System (Invitrogen, USA) verwendet wird, danach wird sequenziert.
Wie 3 zeigt, weist das Fragment mit 0,43 kb klar eine Verknüpfung zwischen dem Exon 3 und dem Exon 5 auf, die im Verlust des Exons 4 resultiert.
Darüber hinaus zeigt die Sequenzierung, dass das Transkript gemäß der Erfindung das Exon 7 nicht enthält; außerdem wird das Vorliegen eines Stoppcodons in Exon 6 beobachtet.
5. Beurteilung der Häufigkeit des HLA-G4-Transkripts:
Wie durch 2 nahe gelegt, ist die Hybridisierungsintensität der Bande mit 0,43 kb, die dem gespleißten Transkript entspricht, schwächer als die, die der vollständigen Kopie entspricht dies legt nahe, dass dieses Transkript in der mRNA-Gruppe von HLA-G weniger reichlich vorkommt.
Um die Mengen für diese zwei Transkripte zu beurteilen, werden die Produkte der PCR-Amplifikation der mRNA der Trophoblasten des ersten Drittels mit den Primern G.526-G1225 in den Vektor pPCRII, wie vorstehend genau beschrieben, kloniert.
Unter 260 Klonen, die durch Hybridisierung der Replikate analysiert wurden, entweder mit der Sonde G1200 oder mit der Sonde G.3–5, zeigen ungefähr 210 Klone eine positive Hybridisierung mit der Sonde G.1200 und nur ein Klon ist mit der Sonde G.3–5 positiv.
Dieser einzelne Klon wurde sequenziert, während fünf positive Klone mit der Sonde G.1200, die zufällig ausgewählt wurden, durch ihre Restriktionskarte gegenüber spezifischen Enzymen der Exons 3 und 4 analysiert wurden (siehe 1).
Ein Vergleich der Sequenzen zeigt, dass der mit der Sonde G.3–5 positive Klon das Exon 4 nicht enthält, während die fünf anderen Klone dem vollständigen Transkript entsprechen.
So kann die Häufigkeit des Transkripts gemäß der Erfindung bezüglich des Transkripts, das die vollständige Sequenz umfasst, mit etwa 1/200 bestimmt werden.
Die Selektion des Primers G.526 (spezifisch für das Exon 3) hat die Selektion eines Transkripts, das frei von Exon 4 ist, während der PCR-Amplifikation ermöglicht.
Das Fehlen von Exon 4 hat an der Spleißstelle ein Codon GAG (Glu) anstelle des Codons GAC (Asp) geschaffen, das man im vollständigen Transkript wieder findet.
Das Fehlen von Exon 4 schließt die α3-Domäne des entsprechenden abgeleiteten Proteins aus und verleiht dem Antigen HLA-G eine neue Struktur, die an der Oberfläche der trophoblastischen Zellen exprimiert werden kann.
In dieser Struktur sind die α2-Domäne und die Transmembranregion verbunden und können Konformationsmodifikationen des Oberflächenproteins induzieren.
Das genannte Protein kann insbesondere eine unterschiedliche Fähigkeit, an Peptide zu binden, zeigen.
BEISPIEL 2: Expression des vollständigen HLA-G-Transkripts oder des Transkripts ohne Exon 4 in den mononukleären peripheren zirkulierenden Zellen des Erwachsenen
4 zeigt die Resultate der PCR-Amplifikation, die mit den Primern G.257-G.1225, ausgehend von den cDNA-Matrizen der mononukleären peripheren Zelle, die vom Menschen (männliche Personen) erhalten wurden, erzielt wurden.
In Agarosegel wird eine Bande mit 1 kb beobachtet (4A); eine Hybridisierung mit der Sonde G.1200 zeigt eine Bande derselben Größe (4B).
Nach der cDNA-Sequenz entspricht diese Bande dem vollständigen HLA-G-Transkript.
Um die Produktion dieses Transkripts zu bestätigen, wird das Produkt der PCR in einen Vektor pPCRII kloniert, dann sequenziert, und zwar nach dem oben beschriebenen Verfahren.
Das Fragment mit 1 kb ist mit der HLA-G-Sequenz, die von SHUKLA et al. (Nucleic Acids Research, 1990, 18, 8, 2189) beschrieben wurde, vollständig homolog.
Die PCR-Amplifikation der cDNA, ausgehend von einer Population polynukleärer Zellen mit spezifischen HLA-G-Primern erzeugt eine Bande schwacher Intensität mit derselben Größe, 0,71 kb, wie die, die mit mononukleären Zellen beobachtet wird (Kontamination der polynukleären Fraktion durch mononukleäre Zellen).
Um die Zellspezifität der Expression des HLA-G-Gens bei den zirkulierenden Lymphozyten des Erwachsenen zu präzisieren, wurden die mononukleären Populationen abgetrennt, und es wurde eine PCR mit den spezifischen HLA-G-Primern an cDNA durchgeführt, welche, ausgehend von Sub-Populationen, die an T-Zellen oder an B-Zellen angereichert waren, erhalten wurde.
Eine Bande mit 1 kg wird für die Fraktionen der T-Zellen sowohl bei Agarosegel als auch durch Blotting nach Hybridisierung mit der Sonde G.1200 beobachtet (4A und 4B) (vollständiges Transkript).
Die Verwendung einer "hot-start"-PCR-Technik ermöglicht es, das Vorliegen von mRNA von HLA-G in den peripheren Lymphozyten des Erwachsenen zu beweisen, wobei dieses Transkript gleichzeitig in den B-Zellen und den T-Zellen vorliegt.
Alle alternativen Transkripte werden für die mononukleären Zellen des peripheren Bluts beobachtet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

cDNA-Molekül, das von einer mRNA des humanen HLA-G-Gens des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aufeinander folgend von 5' nach 3' aus den folgenden Fragmenten des HLA-G-Gens besteht: – dem Fragment, das für das Peptidsignal codiert, (Exon 1), – dem Fragment, das für die α₁-Domäne codiert, (Exon 2), – dem Fragment, das für die α₂-Domäne codiert, (Exon 3), – dem Fragment, das für die Transmembrandomäne TM codiert (Exon 5), – dem Fragement, das für die cytoplasmische Domäne codiert, (Exon 6), und – dem nicht-translatierten 3'-Fragment, (Exon 8), wobei das cDNA-Molekül HLA-G4 bezeichnet wird.
Fragment des cDNA-Moleküls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aufeinander folgend von 5' nach 3' aus: – dem Fragment, das für die α₂-Domäne codiert, (Exon 3), – dem Fragment, das für die Transmembrandomäne TM codiert, (Exon 5), – dem Fragment, das für die cytoplasmische Domäne codiert, (Exon 6), und – dem nicht-translatierten 3'-Fragment, (Exon 8), besteht.
Fragment nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich– net, dass es durch die Sequenz SEQ ID NO:1 definiert ist, die für ein Protein codiert, in dem die α₂-Domäne und die Transmembransequenz von HLA-G direkt verbunden sind.
Transkriptionsprodukt des humanen HLA-G-Gens des MHC, das isoliert und gereinigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aufeinander folgend von 5' nach 3' aus den folgenden Fragmenten des HLA-G-Gens besteht: – dem Fragment, das für das Peptidsignal codiert, (Exon 1), – dem Fragment, das für die α₁-Domäne codiert, (Exon 2), – dem Fragment, das für die α₂-Domäne codiert, (Exon 3), – dem Fragment, das für die Transmembrandomäne TM codiert, (Exon 5), und – dem Fragment, das für die cytoplasmische Domäne von HLA-G codiert, (Exon 6).
Fragment des cDNA-Moleküls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:2 definiert ist.
Fragment des cDNA-Moleküls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:3 definiert ist.
Fragment des cDNA-Moleküls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:4 definiert ist.
Fragment des cDNA-Moleküls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:5 definiert ist.
Fragment des cDNA-Moleküls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:6 definiert ist.
Nukleotidsonden, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Gruppe, bestehend aus den Nukleinsäuremolekülen oder Nukleinsäurefragmenten nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die mit Hilfe eines Markers wie einem radioaktiven Isotop, einem geeigneten Enzym oder einem Fluorochrom markiert sind, ausgewählt sind.
Sonde nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:6 nach Anspruch 9 gebildet wird.
Sonde nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:4 nach Anspruch 7 gebildet wird.
Primerpaare zur Amplifikation einer Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Gruppe, bestehend aus den Oligonukleotiden der Sequenz SEQ ID NO:2 bis 6 ausgewählt sind.
Primerpaar nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:2 nach Anspruch 5, gepaart mit dem Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:5 nach Anspruch 8 gebildet wird.
Primerpaar nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es durch das Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:3 nach Anspruch 6, gepaart mit dem Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO:5 nach Anspruch 8 gebildet wird.
Protein oder Peptidfragment, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz die ist, die durch das Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
Peptid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es durch die Sequenz SEQ ID NO:7 definiert ist.
Verfahren zur Selektion und Anreicherung von undifferenzierten hämatopoetischen Zellen (unreife Blutzellen oder Stammzellen), dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (a) gegebenenfalls Selektion einer Probe, die vorher entnommen worden war aus peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Knochenmark; (b) Inkontaktbringen der Probe mit Antikörpern gegen CD34; (c) Abtrennung der Komplex Antigen-CD34 enthaltende Zellen-Anti-CD34-Antikörper; (d) Durchführung einer RT-PCR in situ mit den in Stufe (c) erhaltenen Zellen in Gegenwart von mit Hilfe eines Fluorochroms markierten Primern, wie sie in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert sind; (e) Abtrennung der erhaltenen fluoreszierenden Zellen und (f) Selektion der nicht-fluoreszierenden, unreifen, pluripotenten Zellen.
Verfahren zur Detektion und Abtrennung von Zellen, die das Transkript nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimie ren, dadurch gekennzeichnet, dass es in situ die Durchführung einer RT-PCR umfasst, durch: (a) Inkontaktbringen von Blutzellen mit einem markierten Primerpaar, wie es in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert ist, und (b) Abtrennen der markierten Zellen durch jedes zweckdienliche Mittel.
Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Immunisierung eines geeigneten Tiers mit einem Protein nach Anspruch 16 oder einem Peptid nach Anspruch 17 hergestellt werden und dass sie unter den HLA-G-Proteinen einzig das Protein nach Anspruch 16 oder das Peptid nach Anspruch 17 erkennen.
Verfahren zur Abtrennung von kernhaltigen fötalen Zellen, ausgehend von einer mütterlichen Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (1) Inkontaktbringen der Probe aus mütterlichem Blut mit Antikörpern, die gegen die HLA-G-Proteine nach Anspruch 16 gerichtet sind, und (2) Abtrennung der erhaltenen Komplexe fötale Zellen-Antikörper.
Verfahren zur spezifischen Abtrennung von zirkulierenden Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, dass es in situ die Durchführung einer RT-PCR umfasst, durch: (a) Inkontaktbringen von Blutzellen mit einem markierten Primerpaar, wie es in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert ist, und (b) zweckdienliche Abtrennung der markierten Zellen.
Medikament, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein nach Anspruch 16 oder ein Peptid nach Anspruch 17 umfasst.
Immuntolerante Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein nach Anspruch 16 oder ein Peptid nach Anspruch 17, kombiniert mit einem Vehikel oder einem Träger, das/der unter pharmazeutischen Gesichtspunkten zweckdienlich ist, umfassen.