DE69412470T3

DE69412470T3 - Verfahren zur hla-b typisierung mittels spezifischer primer und probensätze

Info

Publication number: DE69412470T3
Application number: DE69412470T
Authority: DE
Inventors: Marc Andrien; Etienne Dupont; Rudi Rossau; Ilse De Canck
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-03-07
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2014-03-08
Also published as: DE69412470T2; ES2123775T3; AU6258594A; US5883238A; EP0689609B1; DK0689609T4; EP0689609A1; ATE169682T1; CA2158578A1; ES2123775T5; EP0689609B2; AU688307B2; JP4031028B2; JPH08507690A; CA2158578C; DK0689609T3; WO1994021818A1; DE69412470D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie auf Reagenzien zur Typisierung von DNA von HLA-B-Allelen.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Typisierung von DNA unter Verwendung spezifischer Primer- und Probensätze, durch welche die Unterscheidung von HLA-B-Allelen, insbesondere solchen, die durch serologische Mittel schwierig zu unterscheiden sind, ermöglicht wird.
Das menschliche Leukozytenantigen- (HLA) -System umfasst eine Reihe verbundener Gene auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6. Drei Klassen von Genen sind definiert: die Klasse-I-Antigene (HLA A, B, C), die aus einer nicht kovalent mit einem β2-Mikroglobulin verbundenen α-Kette bestehen und auf dem Chromosom 15 kodiert sind; den Klasse-II-Antigenen (DP, DQ, DR), welche aus einer α- und einer β-Kette bestehen; den Klasse III-Produkten, die den Komponenten des Komplementsystems entsprechen. Die Klasse-I- und Klasse-II-Antigene sind polymorphe Transmembran-Glykoproteine und teilen sich bei der Präsentation von Antigenen eine gemeinsame immunologische Rolle. Die auf die HLA-Klasse I eingeschränkte Präsentation von fremden Antigenen führt zu zytotoxischen T-Zellenrezeptoren in reifen T-Lymphozyten. Zusätzlich spielen die Klasse-I- und Klasse-II-Antigene eine wesentliche Rolle bei der Transplantationsimmunologie und bei der Empfindlichkeit gegenüber Autoimmunerkrankungen.
Ausgedehnte Polymorphien sind an den meisten Orten vorhanden. Angesichts der biologischen und medizinischen Bedeutung dieser Antigene ist eine hochempfindliche und schnelle Technik zur HLA-Typisierung erforderlich. Bislang wurden unterschiedliche Protokolle verwendet: serologische, zelluläre und auf DNA beruhende Restriktionsfragmentpolymorphie- (RFLP) und seit kurzem auch sequenzspezifische Oligonukleotid(SSO) -Hybridisierverfahren. Durch die DNA-Typisierung mittels Oligonukleotidhybri disierung wird die beste direkte Definition von HLA-Polymorphien bereitgestellt, welche einer vollständigen Sequenzanalyse nahekommt. Die Sequenzanalyse ist jedoch teuer und zeitaufwendig und daher nicht das Verfahren der Wahl für Routineanwendungen.
Polymorphien sind von grundlegender Bedeutung für die Funktion von HLA-Antigenen und meistens in Exons angeordnet, welche für die funktionell wichtigen extrazellulären Domänen kodieren.
Bei den Klasse-I-Genen sind die meisten Polymorphien in den Amino-endständigen α1- und α2-Domänen angeordnet. Die α3-Domäne ist eine hochkonservierte immunoglobulinartige Domäne. Eine Gesamtzahl von 40 HLA-A-, 64 HLA-B-, und 24 HLA-C-Allelen wurden identifiziert (Zemmour und Parham, Tissue Antigens, 40: 221 – 228, 1992). Eine Verschiedenheit zwischen unterschiedlichen Allelen tritt in bestimmten Bereichen der α1- und α2-Domäne auf. Es tritt ein Flickmuster mit kurzen Strecken von Homologie zwischen den unterschiedlichen Allelen auf. Genetische Mechanismen wie homologe Rekombination und Exon-Shuffling haben zu einem örtlich spezifischen Allel-Unterschied geführt (Parham et al., PNAS (USA) 85: 4005–4009, 1988).
Es wurden verschiedene Typisierverfahren entwickelt, um zwischen den unterschiedlichen Allelen der äußerst polymorphen Klasse-I- und Klasse-II-Orte zu unterscheiden. Nachstehend ist eine Übersicht über diese unterschiedlichen Typisierverfahren gegeben:
Serologie: Bei einem Mikrotoxizitätstest werden Antiseren für unterschiedliche HLA-Klasse-I- oder Klasse-II-Antigene mit lysierten gereinigten Lymphozyten inkubiert. Lysierte Zellen werden durch Eosin oder andere Farbstoffe gefärbt, während nicht-lysierte Zellen ungefärbt bleiben. Dieses Verfahren wird für die Klasse-I-A-, -B-, -C-Allele und Klasse-II-DR- und -DQ-Allele verwendet. DP-Allele können aufgrund des zu geringen Expressionsniveaus und einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Antiseren nicht typisiert werden. Die Reaktion für Klasse-II-Allele wird mit gereinigten B-Lymphozyten durchgeführt. Eine eingeschränkte Bestimmung von übertypisierten Allelgruppen ist ohne weitere Untertypisierung möglich. Drei Allele des HLA-C-Orts bleiben serologisch unbe stimmt. Da Epitope zum HLA-Molekül erfasst werden, ist die Unterscheidung zwischen den α- und β-Ketten unmöglich und wird das αβ-heterodimer identifiziert. Alloseren gegen Klasse-II-Moleküle sind oft durch die Anti-Klasse-I verunreinigt und müssen vor der Verwendung absorbiert werden. Kreuzreaktionen zwischen Allelen auf dem gleichen oder auf einem unterschiedlichen Ort treten auf, was die Analyse des Ergebnisses erschwert. Selbst wenn monoklonale Antikörper verwendet werden, ist das Problem der Kreuzreaktionen nicht gelöst. Obwohl es sich um ein sehr schnelles Verfahren (3 Stunden zur vollständigen Typisierung) handelt, sind unvollständige und fehlerhafte Ergebnisse die Hauptprobleme.
Zelluläre Verfahren: Es wurde eine Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) entwickelt, welche auf der wuchernden Antwort von T-Zellkulturen auf die Anregung durch bestrahlte homozygotische typisierende Zellen beruht. Die Wucherung wird mittels Einfügung von H-Thymidin gemessen. Dieses Verfahren wird für die HLA-Klasse-II-Typisierung von DR- und DQ-Allelen verwendet.
Die DP-Typisierung ist ebenfalls aufgrund des niedrigen Niveaus von dessen Membranexpression unmöglich. Durch diese Analysen werden die DW-Spezifitäten bestimmt, durch welche die serologischen Spezifitäten weiter unterteilt werden. Die HLA-DW-Spezifitäten werden durch DR- und DQ-Antigene bestimmt, sind aber fast immer mit einem bestimmten Allel auf dem DR- und DQ-Ort verbunden. Zur HLA-DP-Typisierung kann eine Sekundär-MLR durchgeführt werden. Diese Analyse beruht auf In-vitro-Sekundär- oder Erinnerungsantworten. Wenn Lymphozyten auf durch Bestrahlung angeregte Zellen angesprochen haben, gehen sie nach 10 Tagen Kultivierung von einer heftigen Zellexpansion zur Herstellung kleiner Lymphozyten über. Diese Zellen haben die Fähigkeit, in Kultur schneller und stärker auf durch Bestrahlung angeregte Zellen anzusprechen, welche typisiert werden müssen und das Antigen mit den ersten angeregten Zellen, welche die ursprüngliche positive Reaktion ergaben, teilen (Festenstein und Ollier, 1987). Obwohl diese Analyse sehr vollständig und korrekt ist, ist sie sehr zeitraubend und schwierig durchzuführen.
Es wurden unterschiedliche DNA-Typisierverfahren entwickelt, welche den Vorteil haben, nicht mit der Oberflächenexpression der Antigene verknüpft zu sein. Eine Übersicht über diese DNA-Typisierverfahren wird gegeben:
Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphie-(RFLP)-Verfahren:
Hochmolekulare DNA wird mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut, entsprechend der Größe durch Gelelektrophorese getrennt, auf Filter aufgetupft und an HLA DQA-, DQB-, DPB- oder DRB-cDNA-Proben hybridisiert. Für die unterschiedlichen Allele wird ein bestimmtes Bandenmuster erhalten. Es wurde eine Sequenzanalyse verwendet, um die unterschiedlichen Restriktionsortpolymorphien herauszufinden und die verschiedenen zu verwendenden Enzyme zu bestimmen. Dieses Verfahren weist jedoch einige Nachteile auf: Es werden große Mengen an hochmolekularer DNA benötigt, es können nicht viele Allele unterschieden werden, es müssen mehrere Restriktionsenzyme verwendet werden und es werden phänotypische unbedeutende spezifische Aminosäureunterschiede erfasst.
Polymeraseketten-Reaktions- (PCR) -Verfahren: Da die Sequenzen aller Klasse-II-Allele bekannt sind, können ortsspezifische Primer entwickelt werden, um die polymorphen Bereiche zu amplifizieren. Nach der Amplifizierung werden große Mengen spezifischer Sequenzen durch RFLP-Analyse oder SSO-Hybridisierung analysiert. Das PCR-Produkt kann durch verschiedene Restriktionsenzyme verdaut werden. Eine Alternative stellt das Hybridisierungsverfahren dar. Es werden sequenzspezifische Oligonukleotide (SSO) entwickelt. Die Hybridisierung kann in einem herkömmlichen Punktauftupfverfahren durchgeführt werden. PCR-Produkte werden kovalent an eine Membran gebunden und an ³²P-markierte SSO hybridisiert. Andere Markierverfahren sind möglich. Die Erfassung positiver Signale erfolgt durch Autoradiographie. Da alle SSOs eine unterschiedliche Länge sowie einen unterschiedlichen GC-Gehalt haben können, werden bei dem herkömmlichen Punktauftupfansatz gegebenenfalls für verschiedene SSOs unterschiedliche Hybridisierungstemperaturen benötigt.
Die herkömmlichen serologischen und zytologischen Typisiertechniken für HLA-Klasse-I-Antigene sind wohletabliert. Es können jedoch aufgrund der Spezifität der Antiseren, der Anwesenheit von Auto-Antikörpern oder Verunreinigung fehlerhafte Ergebnisse auftreten. Für HLA-B sind vornehmlich bei den folgenden Typen Typisierprobleme aufgetreten:
Die Identifizierung dieser schwierigen HLA-B-Typen wird durch ein auf DNA beruhendes Typisiersystem deutlich verbessert und beschleunigt. Dies wird einen vorteilhaften Einfluss auf die Erfolgsquote von Organ- und Knochenmarktransplantationen sowie der damit verbundenen Gesamtkosten zur Folge haben. Es gibt umfassende Beweise dafür, dass eine hohe Korrelation zwischen der Erfolgsquote von Transplantationen und der HLA-B-Verträglichkeit des Spenders und des Empfängers besteht.
Zusätzlich werden durch eine genauere HLA-B-Typisierung Krankheitsempfindlichkeits-Untersuchungen sowie gerichtsmedizinische Untersuchungen ebenfalls deutlich verbessert oder erleichtert.
Es sollte bemerkt werden, dass im Allgemeinen DNA-Typisierverfahren gegenüber einer serologischen Typisierung bevorzugt sein sollten, unter der Voraussetzung, dass ein einfaches, schnelles und zuverlässiges DNA-Typisierverfahren verfügbar ist. Dies ist darauf zurückzuführen, dass einige Unterschiede auf dem Untertypisierungsniveau (die durch DNA-Verfahren normalerweise erfassbar sind), durch die derzeitigen serologischen Typisierverfahren nicht erfasst werden könnten, obwohl durch diese Unterschiede eine Allograft-Abstoßung hervorgerufen werden kann (Fleischhauer et al., New Eng. J. Med. 323: 1818–1822, 1990).
Im Gegensatz zur erfolgreichen Anwendung der Molekularbiologie zur Definition von HLA-Klasse-II-Genen bleibt die Entwicklung der Klasse-I-Molekulartypisierung schwierig. Dies ist auf eine ausgeprägte Polymorphie, eine hohe Komplexität von Nukleotidsubstitutionen sowie die Anwesenheit verschiedener nicht-klassischer Klasse-I-Gene und Pseudogene, welche in diesem Bereich vorhanden sind, zurückzuführen. Klasse-I-Antigene zeichnen sich durch eine Kreuzreaktivität gegenüber unterschiedlichen Allelen aus, hauptsächlich innerhalb der durch HLA-A- und -B-Antigenen definierten serologischen kreuzreaktiven Gruppen (CREGs). Die HLA-A- und -B-Allele sind in jeweils fünf und zehn klassische CREG-Familien aufgeteilt. Bis jetzt wurden alle bekannten HLA-A-Spezifitäten sequenziert, was zur Definition von diese Kreuzreaktionen erklärenden Sequenzhomologien sowie der seit kurzem bestehenden Möglichkeit führte, die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer (SSP) zu verwenden. Im Gegensatz dazu zeichnen sich die HLA-B-Allele durch eine größere Polymorphie und ein höheres Niveau an Kreuzreaktivität aus. Zusätzlich wurde ein wesentlicher Teil der B-Allele bislang noch nicht sequenziert. Die Korrelation zwischen der Kreuzreaktivität und den DNA-Sequenzen ergibt manche Ungereimtheiten.
Die Anzahl von Veröffentlichungen, welche sich mit der PCR und DNA-Probentypisierung von Klasse-I-Allelen beschäftigen, sind im Vergleich zu denjenigen für die Klasse II eingeschränkt. Mit Ausnahme der Veröffentlichung von Yoshida et al. (1992, siehe oben), sind die Allele, welche den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, von diesen Untersuchungen nicht abgedeckt. Von Summers et al. (Hum. Immu nol. 32: 176–182, 1991) ist die Verwendung der PCR für Klasse-I-Allele zu Sequenzierzwecken beschrieben. Die Kombination der PCR mit klassischen Punkthybridisierungen mit Oligonukleotidproben zur Unterscheidung von B44-Allelen (B*4401, B*4402) wurde von Fleischhauer et al. beschrieben (N. Eng. J. Med. 323: 1818–1822, 1990).
Zwei Forschungsgruppen berichteten über die DNA-Typisierung und -Untertypisierung von HLA-B27-Allelen (Hill et al., The Lancet, 337: 640–642, 1991; Dominguez et al., Immunogenetics 36: 277–282, 1992). Von Hernandez-Vina et al. (Hum. Immunol. 33: 163–173, 1992) wurde ein Oligonukleotid-Typisierung im Anschluss an eine PCR-Amplifizierung für HLA-A2- und HLA-A28-Allele beschrieben; und ein allgemeinerer Typisieransatz für HLA-A-Allele unter Verwendung des hitzebeständigen Amplifikationssystems wurde kürzlich von Krausa et al. beschrieben (The Lancet, 341: 121–122, 1993).
Yoshida et al. (Hum. Immunol. 34: 257–266, 1992) kombinierten ebenfalls die PCR mit einem klassischen Punktauftupfverfahren und/oder einer Einzelstrang-Bestätigungspolymorphie-Analyse. Sie entwickelten PCR-Primer- und -Probenkombinationen zur Typisierung von 26 HLA-B-Spezifitäten. Ihr Typisieransatz beruht grundsätzlich auf der Verwendung einer unterschiedlichen Amplifikation mit Primern, welche zwischen den Bw4- und Bw6-Untertypen unterscheiden, und der Verwendung eines spezifischen 5'-endständigen HLA-B-Primers. Mit den beschriebenen Primer-Sätzen und -Proben unterschieden die Autoren die folgenden Allele nicht: B*5401, B*7801 und B*7901, die durch herkömmliche Verfahren ebenfalls schwierig zu typisieren sind. Weiterhin kann weder zwischen B*5201 und B*52012 noch zwischen B53- und B51-Allelen unterschieden werden, da Sequenzunterschiede zwischen diesen Allelen außerhalb des mit ihren Primern amplifizierten Bereiches liegen.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur DNA-Typisierung oder -Untertypisierung von einem oder mehreren HLA-B-Allelen mittels eines Hybridiserungsansatzes bereitzustellen.
Genauer ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur DNA-Typisierung und/oder -Untertypisierung derjenigen HLA-B-Allele gerichtet, deren entsprechende serologische Typisierverfahren Probleme bereiten oder unmöglich sind. Die vorherrschenden Allele, für welche das serologische Typisierverfahren Probleme bereitet, sind die folgenden:
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung von sequenzspezifischen Oligonukleotiden gerichtet, durch welche die DNA-Typisierung von HLA-B-Allelen möglich wird, deren serologisches Typisierverfahren Probleme bereitet und die beispielsweise aus der vorstehend genannten Liste ausgewählt sind.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung von sequenzspezifischen Primern gerichtet, mit welchen die DNA-Typisierung von HLA-B-Allelen möglich wird, deren serologisches Typisierverfahren Probleme bereitet und die beispielsweise aus der vorstehend angegebenen Liste ausgewählt sind.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Bereitstellung von Zusammensetzungen oder festen Trägern gerichtet, welche mindestens eines der vorstehend genannten sequenzspezifischen Oligonukleotide und/oder spezifischen Primer umfassen.
Genauer ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die Amplifizierung des Exons 2 einer spezifischen Untergruppe der HLA-B-Allele, welche den Allelen entspricht, deren serologisches Typisierverfahren Probleme bereitet, mittels bestimmter Primer (SPs) und eine nachfolgende Hybridisierung der amplifizierten Produkte an einen geeigneten Satz sequenzspezifischer Oligonukleotide (SSOs), welche den amplifizierten Bereich des HLA-B-Exons-2 abdecken, gerichtet.
Die vorliegend Erfindung ist auch auf die Bereitstellung von Baukästen (Kits) zur DNA-Typisierung von HLA-B-Allelen gerichtet, deren serologisches Typisierverfahren Probleme bereitet und die beispielsweise aus der vorstehend aufgeführten Liste ausgewählt sind.
Die vorstehenden Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst, indem neue Verfahren und Reagenzien bereitgestellt werden. Genauer werden die vorstehend genannten Bedürfnisse von der vorliegenden Erfindung erfüllt, indem ein bestimmter Satz spezifischer Primer (SPs) und sequenzspezifischer Oligonukleotide (SSOs) sowie Baukästen zur Durchführung der Verfahren bereitgestellt werden, was zusammen ein schnelles, einfaches und genaues System zur Typisierung der Allele der HLA-B-Gene ergibt.
Die neuartigen erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien können wiederum zur Entdeckung bislang unbekannter HLA-B-Allele führen, welche durch das vorliegende Verfahren ebenfalls typisiert und identifiziert werden können. Auch einige andere Typen (welche nicht in der vorstehenden Tabelle aufgeführt sind) wie B76, B77, B67 und B59 können serologische Typisierprobleme bereiten. Obwohl die Nukleinsäurensequenzen noch nicht bekannt sind, ist es manchmal möglich vorherzusagen, ob diese Spezifitäten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Ansatzes typisiert werden können oder nicht. Dies wird hier für B71 näher erläutert.
Der Ausdruck „Typisierung oder Untertypisierung" ist als Bestimmung und/oder Unterscheidung des in einer biologischen Probe vorhandenen Typs oder Untertyps zu verstehen. Mit Typ oder Untertyp sind alle Varianten zu verstehen, welche durch das Typisierverfahren unterscheidbar sind. Im Fall der Unterscheidung des Typs eines Allels wird durch das Typisierverfahren die Anwesenheit dieses spezifischen Allels bestimmt.
Die offiziell erkannten serologischen Typen (auch HLA-Spezifitäten genannt) und ihre entsprechenden Allele (wenn die Sequenz bekannt ist) sind in einer jährlich überarbeiteten Bezugsliste aufgeführt (Bodner et al., Tissue Antigens, 39: 161–173, 1992).
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Amplifizierung des Exons 2 einer möglicherweise in der Probe vorhandenen Untergruppe von HLA-B-Allelen mit bestimmten Sätzen von Amplifizierungsprimern (welche auch als SPs bezeichnet werden).
Nachfolgend werden die amplifizierten Produkte an einen geeigneten Satz von DNA-Proben hybridisiert (auch als SSOs bezeichnet), wonach die gebildeten Hybride erfasst und aus dem erzeugten Hybridisiermuster der HLA-B-Typ abgeleitet wird. Bei diesem Ansatz, welcher insbesondere auf die Identifizierung von Typen gerichtet ist, die mit serologischen Techniken schwierig zu unterscheiden oder überhaupt nicht zu unterscheiden sind, ist es besonders vorteilhaft, dass der 5'-End-Amplifizierungsprimer spezifisch den Bereich 30 bis 33 im Exon 2 der HLA-B-Allele erfasst (entsprechend der von Zemmour und Parham vorgegebenen Nummerierung, 1992). Entsprechend den von diesen Autoren angegebenen Sequenzdaten haben alle erfindungsgemäß bestimmbaren bekannten Allele folgende Sequenz an der Position 30 bis 33 im Exon 2: 5'-GCCA-3'. Daher werden durch einen auf diese Sequenz endenden amplifizierenden Primer alle gewünschten Allele amplifiziert und wird gleichzeitig die Amplifizierung des Exons 2 vieler anderer HLA-B-Allele (welche durch die entsprechende Sequenz 5'-TCCG-3' an der Position 30 bis 33 des Exons 2 ausgezeichnet sind) ausgeschlossen, wodurch der DNA-Typisieransatz be trächtlich vereinfacht wird. Das HLA-B-Exon 2 von Allelen, deren DNA-Sequenz bekannt ist (Zemmour und Parham, 1992) und die durch die Sequenz 5'-GCCA-3' an der Position 30 bis 33 ausgezeichnet sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Typisierung oder Untertypisierung von einem oder mehreren HLA-B-Allelen in einer Probe, die durch die Sequenz 5'-GCCA-3' an der Position 30 bis 33 des Exons 2 des HLA-B-Allels ausgezeichnet sind (gemäß der Nummerierung von Zemmour und Parham, 1992), und genauer auf ein Verfahren zur Unterscheidung von HLA-B-Typen, die serologisch schwierig zu unterscheiden sind, wie beispielsweise B54(22), B52(5), B7801, B62(15), B75(15), B71(70), B72(70), B46, B79, B53, B5102, B5103 und B58(17), wobei das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst:

– Möglicherweise Extraktion der Nukleinsäureprobe,
– Amplifizierung der Nukleinsäure der HLA-B-Allele, die durch die Sequenz 5'-GCCA-3' an der Position 30 bis 33 des Exons 2 des HLA-B-Allels ausgezeichnet sind, mit mindestens einem 5'-End-Amplifizierungsprimer, der aus der folgenden Liste ausgewählt ist: 5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEQ ID NR 1) oder Sequenzvarianten davon wie: 5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 2) 5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 3) oder anderen Sequenzvarianten, wobei diese Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden enthalten, mit der Maßgabe, dass die 3'-End-GCCA-Sequenz erhalten bleibt und diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B25P-Primer oder vorstehend aufgeführten Varianten veranlasst werden können, in Verbindung mit einem geeigneten 3'-End-Primer, der aus den gleichen Allelen wie die vorstehend definierten 5'-End-Primer ausgewählt wird, wobei die 5'- und 3'-End-Primer möglicherweise markiert sind; und
– Hybridisierung des amplifizierten Produktes, welches während oder nach der Amplifizierung möglicherweise markiert wird, bei geeigneten Bedingungen mit einer oder mehreren geeigneten Proben, welche aus dem Bereich 15 bis 261 des HLA-B-Exon-2-Bereichs ausgewählt sind, wobei die Nummerierung derjenigen von Zemmour und Parham, 1992, entspricht,
– Waschen bei geeigneten Waschbedingungen,
– Erfassung der gebildeten Hybride; und
– Ableitung des vorhandenen Allels aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.

Zur Durchführung des vorstehend veranschaulichten erfindungsgemäßen Verfahrens kann es notwendig sein, eine Extraktion einer Nukleinsäureprobe gemäß einer der aus dem Stand bekannten Techniken durchzuführen. Beim Fall der Extraktion von RNA ist die Erzeugung von cDNA notwendig; ansonsten wird cDNA oder genomische DNA extrahiert.
Der Ausdruck „Primer" bezieht sich auf eine einsträngige DNA-Oligonukleotidsequenz oder einen spezifischen Primer (SPs), welcher als Ausgangspunkt der Synthese eines Primerausdehnungsproduktes dienen kann, das komplementär zu dem zu kopierenden Nukleinsäurestrang ist. Die Länge und Sequenz des Primers muss derart sein, dass sie die Auslösung der Synthese der Ausdehnungsprodukte ermöglicht. Vorzugsweise umfasst der Primer etwa 5 bis 50 Nukleotide, bevorzugter etwa 10 bis 21 Nukleotide. Die spezifische Länge und Sequenz des Primers hängt von der Komplexität der erforderlichen DNA- oder RNA-Zielmoleküle ebenso wie von den Bedingungen der Verwendung des Primers wie Temperatur und Ionenstärke ab.
Die Tatsache, dass amplifizierende Primer nicht genau mit der entsprechenden Templatsequenz übereinstimmen müssen, um eine gute Amplifizierung zu gewährleisten, unter Voraussetzung, dass eine genaue Übereinstimmung an den letzten drei Nukleotiden am 3'-Ende des Primers erhalten bleibt, ist in der Literatur im großen Umfang dokumentiert (Kwok et al., Nucleic Acids Research 18: 999–1005, 1990; Sommer und Tautz, Nucleic Acids Research 17, 6749, 1989).
Der Begriff „Probe" bezieht sich auf einsträngige sequenzspezifische Oligonukleotide (SSOs), welche eine Sequenz haben, welche genau komplementär zur Zielsequenz des zu erfassenden Allels ist.
Vorzugsweise sind diese Proben etwa 5 bis 50 Nukleotide lang, bevorzugter etwa 10 bis 18 Nukleotide.
Die Ausdrücke „geeignete" Hybridisierungs- und Waschbedingungen beziehen sich auf die Tatsache, dass in den meisten Fällen die Proben nur an genau komplementäre Sequenzen hybridisierbar sind. Derartige Bedingungen sind in den Beispielen veranschaulicht. Beispielsweise betragen für die Probe 17 die bevorzugten Hybridisierungs- und Waschtemperaturen jeweils 54 °C und 58 °C, wenn 3M TMAC als Hybridisierungs- und Waschlösung verwendet wird. Im Allgemeinen müssen die Hybridisierungsbedingungen denjenigen des Stands der Technik entsprechen (beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Jedoch sollten diese Proben entsprechend der Hybridisierlösung (SSC, SSPE, usw.) bei ihrer geeigneten Temperatur hybridisiert werden, um eine ausreichende Spezifität zu erreichen (in den meisten Fällen sollen Unterschiede auf dem Niveau einer Einpunkt-Mutation unterschieden werden).
Die vorstehend genannten 5'-End-Primer werden als B25P-Primer bezeichnet.
Der Ausdruck „Probe" bezieht sich auf jede Quelle von biologischem Material wie beispielsweise Blutflecken, Haar, Gewebezellen oder periphere Blutzellen. Typische Proben können mononukleare periphäre Blutzellen (PBMNC), lymphoplastische Zelllinien (LCL), Haarzellen oder dergleichen einschließen. Die bevorzugte isolierte Nukleinsäure ist genomische DNA. Jedoch können auch zytoplasmische, zelluläre und poly(A) + RNA verwendet werden.
Der Ausdruck „Ableitung des vorhandenen Allels aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster" bezieht sich auf das zentrale Merkmal des erfindungsgemäßen HLA-B-Typisierverfahrens, welches die Identifizierung (auch als Bestimmung oder Unterscheidung bezeichnet) der in der Probe vorhandenen HLA-B-Allele durch Analyse des Bindungsmusters einer Palette von Oligonukleotidproben beinhaltet. Obwohl durch einzelne Proben ebenfalls eine nützliche Information bereitgestellt werden kann, ist die Variation von HLA-B-Allelen in der Natur verteilt, so dass eine spezifische Variante einzig durch eine Probe kaum zu identifizieren ist. Vielmehr wird, wie in den Beispielen gezeigt ist, die Identität eines Allels aus dem Bindungsmuster einer Palette von Oligonukleotidproben abgeleitet, die für unterschiedliche Segmente der verschiedenen HLA-B-Allele spezifisch sind. In Abhängigkeit von der Wahl dieser Oligonukleotidproben entspricht jedes bekannte Allel einem spezifischen Hybridisierungsmuster bei Verwendung einer spezifischen Probenkombination. In Abhängigkeit von der Wahl der Oligonukleotidproben kann jedes Allel auch von irgendeinem anderen mit den gleichen Primern amplifizierten Allel unterschieden werden. Durch den Vergleich des erzeugten Musters positiv hybridisierter Proben einer Probe, welche eine oder mehrere unbekannte HLA-B-Allele enthält, mit einem Vergleich erwarteter Hybridisierungsmuster, wie beispielsweise in Tabelle 1 gezeigt, wird die eindeutige Ableitung der in der Probe vorhandenen HLA-B-Allele möglich.
Da die Zielallele sich etwas in der Sequenz am 3'-Ende des Exons 2 unterscheiden (Zemmour und Parham, 1992), sollten verschiedene 3'-End-Primer mit einem 5'-End-Primer (B25P oder Varianten davon) kombiniert werden, um eine spezifische Amplifizierung aller Allele von Interesse zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein vorstehend definiertes Verfahren, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der folgenden 3'-End-Amplifizierungsprimer (B23) verwendet wird:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P 1, SEQ ID NR 4) oder Sequenzvarianten davon, wie:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEQ ID NR 5),
5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEQ ID NR 6),
oder anderen Sequenzvarianten, wobei die Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden enthalten, mit der Maßgabe, dass diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B23P1-Primer oder die vorstehend angegebenen Varianten B23P2 oder B23P3 herangezogen werden können, wobei die Primer möglicherweise mit einer entfernbaren Markierung wie Biotin versehen sind.
Wie angegeben werden diese Primer weiterhin jeweils als B23P1, B23P2 und B23P3 bezeichnet. Die Primer B23P1 und B23P2 erkennen den Bereich 241 bis 261 im HLA-B-Exon 2; Primer B23P3 erkennt den Bereich 219 bis 237 (Nummerierung gemäß Zemmour und Parham, 1992). Die Allele, deren DNA-Sequenz vollständig mit dem 3'-Ende der vorstehend genannten Primer übereinstimmt, sind in Tabelle 1 angegeben.
Aus diesen Daten kann gefolgert werden, dass zum Erreichen einer Amplifizierung aller HLA-B-Allele von Interesse die Amplifizierung mit dem Primersatz
B25P/B23P1
Zumindest mit einem der folgenden Sätze kombiniert werden sollte:
B25P/B23P2
oder
B25P/B23P3.
Aus den in Tabelle 1 gegebenen Daten kann ebenfalls gefolgert werden, dass manche Allele ausschließlich mit einem Primersatz und nicht mit einer der vorstehend ausgeführten Kombinationen amplifiziert werden. Beispielsweise werden neben anderen Allelen B*4601 oder B*7801 nur mit dem Primersatz B25P/B23P1 amplifiziert. Andererseits werden beispielsweise die Allele B*1503 oder B*5801 jeweils mit den Primersätzen B25P/B23P1 und B25P/B23P3 sowie B25P/B23P2 und B25P/B23P3 amplifiziert.
Es sollte ebenfalls erwähnt werden, dass aus den erhältlichen Sequenzdaten (Zemmour und Parham, 1992) andere 3'-End-Amplifizierungsprimer ausgewählt werden können, mit denen die Amplifizierung eines bestimmten Abschnitts des Exons 2 von HLA-B-Allelen erreicht werden kann, wenn diese mit dem 5'-End-Primer B25P oder Varianten davon kombiniert werden.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Amplifizierung mit den zwei Primersätzen der Wahl in unterschiedlichen Reaktionsröhren durchgeführt, und die amplifizierten Produkte werden, wie im Typisierschema in 1 angegeben, getrennt hybridisiert.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Amplifizierung mit den zwei Primersätzen der Wahl in unterschiedlichen Reaktionsröhren durchgeführt, und die amplifizierten Produkte werden nach der Amplifizierung vermischt und zusammen hybridisiert.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die verschiedenen beteiligten Primer (entweder B25P, B23P1 und B23P2 oder B25P, B23P1 und B23P3) vermischt und die Amplifizierung in einem einzigen Reaktionsrohr durchgeführt, wonach die amplifizierten Produkte zusammen hybridisiert werden.
Das verwendete Amplifizierungsverfahren kann entweder die PCR (Saiki et al., Science 239: 487–491, 1988), eine auf der Nukleinsäuresequenz beruhende Amplifizierung (NASBA; Guateli et al., PNAS (USA); 87: 1874–1878, 1990; Compton, Nature; 91–92, 1991), ein auf Transkription beruhendes Amplifizierungssystem (TAS, Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 1173–1177, 1989), die Strangersetzungs-Amplifizierung (SDA, Duck et al., Biotechniques 9: 142–147, 1990; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 392–396, 1992), die Amplifizierung mittels einer Qβ-Replikase (Lizardi et al., Bio/Technology 6: 1197–1202, 1988; Lomeli et al., Clin. Chem. 35: 1826–1831, 1989) oder jedes andere geeignete Verfahren sein, durch welches Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung einer Primerverlängerung amplifiziert werden können. Während der Amplifizierung können die amplifizierten Produkte auf Wunsch entweder unter Verwendung von markierten Primern oder durch Einfügung von markierten Nukleotiden markiert werden. Die Markierungen können Isotope (³²P, ³⁵S usw.) oder keine Isotope sein (Biotin, Digoxigenin, usw.).
Um die amplifizierten Allele voneinander zu unterscheiden, werden die amplifizierten Produkte an einen Satz von sequenzspezifischen DNA-Proben hybridisiert (welche auch als SSOs bezeichnet werden), welche Exon-2-Bereiche von HLA-B erkennen, die zwischen den ausgewählten Amplifizierungs-Primerbereichen angeordnet sind. Es können verschiedene Hybridisierformate, wie das herkömmliche Punkt-Auftropfformat, die Sandwich-Hybridisierung oder die Umkehrhybridisierung (wie das umgekehrte Punkt-Auftropfformat) verwendet werden. Ein bestimmter Satz DNA-Proben wurde ausgewählt, durch welche die Unterscheidung der Allele von Interesse voneinander und von anderen beschriebenen Allelen möglich ist, gleichgültig ob diese Allele im homozygotischen oder heterozygotischen Zustand vorliegen.
Für diesen Zweck wurden 20 grundlegende DNA-Probensequenzen identifiziert, welche so ausgestattet sind, dass sie wie in den Beispielen veranschaulicht bei einer TMAC- (Tetramethylammoniumchlorid) -Hybridisierung und Waschbedingungen wirksam sind. Die meisten dieser Proben erkennen die am meisten variablen Bereiche des Exons 2 von HLA-B und können zur Hybridisierung an mehr als ein HLA-B-Allel veranlasst werden.
Einige Proben wurden ausgewählt, weil sie Allel-spezifisch sind; diese Proben sind Probe 8 (SEQ ID NR 14), 12 (SEQ ID NR 18), und 16 (SEQ ID NR 22), welche jeweils ausschließlich an B*5401, B*4601 und B*7901 hybridisieren. Die von den verschiedenen Proben erkannten Bereiche sind in 2 schematisch dargestellt. In Tabelle 2 sind die Probensequenzen angegeben. Eine Erläuterung ist in Tabelle 1 gegeben. Weiterhin wurden die gleichen 20 grundlegenden Proben oder Varianten davon unter Hybridisier- und Waschbedingungen getestet, welche wie in Beispiel 5 und Tabelle 2 bis veranschaulicht für SSPE spezifisch sind. Wie aus Tabelle 2 bis ersichtlich, sind unter den verwendeten spezifischen SSPE-Pufferbedingungen 9 der ursprünglichen TMAC-getesteten Proben und einige der neuen Probenvarianten besonders bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein vorstehend definiertes Verfahren, wobei eine oder mehrere Hybridisierungsproben aus Tabelle 2 (SEQ ID NR 7 bis 26) ausgewählt sind.
Entsprechend der Hybridisierlösung (SSC, SSPE, TMAC usw.) sollten diese Proben genau bei ihrer geeigneten Temperatur hybridisiert werden, um eine ausreichende Spezifität zu erhalten (in den meisten Fällen sollen Unterschiede auf dem Niveau einer Einpunktmutation unterschieden werden). Auch die Änderung der Menge (Konzentration) der verwendeten Probe bezüglich zu anderen kann zum Erhalt spezifischerer Hybridisier-Ergebnisse vorteilhaft sein. Es sollte in diesem Zusammenhang bemerkt werden, dass im Gegensatz zu Pufferlösungen auf SSPE-Basis Proben der gleichen Länge unabhängig von ihrem GC-Gehalt in TMAC-Lösungen spezifisch bei etwa er gleichen Temperatur hybridisieren (Jacobs et al., Nucleic Acids Research 16: 4637–4650, 1988).
Bevorzugte grundlegende Proben werden unter Verwendung unterschiedlicher Hybridisier- und Waschpufferbedingungen in den erfindungsgemäßen Beispielen veranschaulicht. Die bevorzugten Proben sind in Anspruch 7 eingeschlossen.
Von den den erfindungsgemäßen Gegenstand bildenden Allelen können B*1501 und B*1504 nicht voneinander unterschieden werden, da diese Sequenzen im zweiten Exon genau gleich sind. Unterschiede zwischen beiden Allelen werden im 5'-Ende des Exons 3 gefunden (Zemmour und Parham, 1992). Aus dem gleichen Grund können B*5101 bis B*5104 nicht voneinander unterschieden werden. Auch bei diesen Allelen kann die Unterscheidung im Exon 3 erreicht werden (Zemmour und Parham, 1992). Daher schließt ein noch vollständigeres Typisiersystem eine Primer- und Probenkombination zur Unterscheidung zwischen Typen im Exon 3 ein.
Die vorstehend genannten DNA-Typisierverfahren, bei welchen das Primerpaar B25P/B23P2 verwendet und eine Hybridisierung mit SSOs 7 (SEQ ID NR 13) und 9 (SEQ ID NR 15) beobachtet wird, werden vorzugsweise zusätzlich und getrennt mit dem Primerpaar B25P und B23P1 und/oder B23P3-Primern durchgeführt. Für letztere Anwendung kann ein Primer mit der folgenden Sequenz:
5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3' B25PX1 (SEQ ID NR 53)
als Alternative für den B25P-Primer verwendet werden.
Wie in den Beispielen erläutert, wird durch diesen zusätzlichen Amplifizierungsschritt die Möglichkeit ausgeschlossen, dass eine zusätzliche Amplifizierung des HLA-AR-Pseudogens (wenn der Primer B23P2 verwendet wird) auftritt und somit ein genaueres HLA-B-Typisierverfahren ermöglicht.
Für den erfindungsgemäßen Zweck geeignete Prüfverfahren zur Erfassung von Hybriden, welche sich in einer Probe zwischen den Oligonukleotidproben und den Nukleinsäuresequenzen gebildet haben, können alle aus dem Stand der Technik bekannten Prüfformate umfassen. Beispielsweise kann die Erfassung erreicht werden, indem ein Punkt-Auftropfformat verwendet wird, die nicht-markierte amplifizierte Probe an eine Membran gebunden wird, die Membran mit mindestens einer markierten Probe unter geeigneten Hybridisier- und Waschbedingungen zusammengebracht wird, und die Anwesenheit der gebundenen Probe überwacht wird. Proben können mit Radioisotopen oder mit Markie rungen markiert werden, durch welche eine chromogene oder chemolumeniszente Erfassung möglich ist, wie beispielsweise mit Meerrettichperoxidase gekoppelte Proben.
Eine Alternative ist ein „umgekehrtes" Punkt-Auftropfformat, bei welchem die amplifizierte Sequenz eine Markierung enthält. Bei diesem Format werden die nicht-markierten Olgonukleotidproben an einen festen Träger gebunden und der markierten Probe unter geeigneten entsprechenden Hybridisier- und nachfolgenden Waschbedingungen ausgesetzt. Es ist selbstverständlich, dass auch jedes andere Prüfverfahren erfindungsgemäß verwendet werden kann, welches auf der Bildung eines Hybrids zwischen den Nukleinsäuren der Probe und der Oligonukleotidproben beruht.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst das Verfahren der Typisierung der HLA-B-Allele, welche in einer biologischen Probe enthalten sind, die Schritte des In-Kontakt-Bringens der von dem genetischen Material stammenden amplifizierten Kopien mit einem festen Träger, auf welchen die vorstehend definierten Proben zuvor immobilisiert worden sind.
Der Ausdruck „fester Träger" kann sich auf jedes Substrat beziehen, an welches eine Oligonukleotidprobe gekoppelt werden kann, mit der Maßgabe, dass sie ihre Hybridisiereigenschaften behält und der Hintergrundpegel an Hybridisierung niedrig bleibt. Gewöhnlich ist das feste Substrat eine Mikrotiterplatte, eine Membran, z. B. Nylon oder Nitrocellulose) oder eine kleine Kugel (Perle).
Vor dem Aufbringen auf die Membran oder die Fixierung kann es vorteilhaft sein, die Nukleinsäureprobe zu modifizieren, um die Fixierung zu erleichtern oder die Hybridisiereffizienz zu verbessern. Derartige Modifikationen können eine Homopolymer-Schwanzbildung, eine Kupplung mit unterschiedlichen reaktiven Gruppen wie aliphatischen Gruppen, NH₂-Gruppen, SH-Gruppen, Carbonsäuregruppen, oder eine Kupplung mit Biotin oder Haptenen einschließen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst das Verfahren der Typisierung von in einer biologischen Probe enthaltenen HLA-B-Allelen die Schritte des In-Kontakt-Bringens der von dem genetischen Material stammenden amplifizierten Kopien mit Oligonukleotidproben, welche als parallele Linien auf dem festen Träger immobilisiert wurden.
Gemäß dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden eine oder mehrere der vorstehend definierten Proben zur Immobilisierung und Einfügung in eine Umkehrphasenhybridisierprüfung verwendet, vorzugsweise für die Immobilisierung als parallele Linien auf einem festen Träger wie einem Membranstreifen, um gemäß dem vorstehend definierten Verfahren HLA-B-Allele zu typisieren.
Gemäß diesem vorteilhaften Verfahren werden die Proben in einem Linienprobenprüf- (LiPA) -Format immobilisiert. Dies ist ein umgekehrtes Hybridisierformat (Saiki et al., PNAS (USA); 86: 6230–6234, 1989), bei welchem Membranstreifen verwendet werden, auf die 20 oder mehr Oligonukleotidproben (einschließlich negativer oder positiver Kontroll-Oligonukleotide) vorzugsweise als parallele Linien aufgebracht werden. Die LiPA-Streifen werden wie von Stuyver et al. (J. Gen. Virol. 74: 1093–1102, 1993) beschrieben hergestellt.
Die Erfindung bezieht sich somit auch auf einen festen Träger, wie vorzugsweise einen Membranstreifen, welcher auf seiner Oberfläche eine oder mehrere der vorstehend definierten Proben trägt, die in Form von parallelen Linien an den Träger gekoppelt sind.
Das LiPA ist ein sehr schneller und anwenderfreundlicher Hybridisiertest. Ergebnisse können vier Stunden nach Beginn der Amplifizierung abgelesen werden. Nach der Amplifizierung, während der normalerweise eine nicht-isotopische Markierung in das amplifizierte Produkt eingefügt wird, und der basischen Denaturierung wird das amplifizierte Produkt mit den Proben auf der Membran in Kontakt gebracht und die Hybridisierung für etwa 1 bis 1,5 Stunden durchgeführt. Nach einem kurzen Waschen (10 bis 30 Minuten) wird der Erfassungsvorgang begonnen. Alle diese Schritte werden in den glei chen Hybridisiervorlagen durchgeführt, wodurch die Verweilzeit verringert wird. Aus dem erzeugten Hybridisiermuster können die vorhandenen HLA-B-Allele entweder mit bloßem Augen, jedoch vorzugsweise unter Verwendung einer Erfassungssoftware ermittelt werden. Das LiPA-Format ist vollständig kompatibel mit herkömmlich erhältlichen Abtastvorrichtungen, wodurch die automatische Interpretation der Ergebnisse sehr zuverlässig wird. All diese Vorteile machen das LiPA-Format zur Verwendung bei der HLA-Typisierung in einem Routinevorgang verwendbar. Das LiPA-Format sollte besonders vorteilhaft für die Typisierung derjenigen Allele sein, welche durch serologische Routinemittel schwierig zu typisieren sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erfassung und Identifizierung von neuartigen HLA-B-Allelen, welche sich von den bekannten HLA-B-Allelen unterscheiden, umfassend die Schritte:

– Ermittlung der in einer biologischen Probe vorhandenen HLA-B-Allele gemäß dem vorstehend definierten Verfahren,
– für den Fall, dass eine Probe beobachtet wird, welche nicht ein Hybridisiermuster erzeugt, das mit den in Tabelle 1 definierten kompatibel ist, Sequenzierung des Abschnitts der HLA-B-Exon-2-Sequenz, welche der abweichenden Hybridisierprobe des zu bestimmenden neuen HLA-B-Allels entspricht.

Mit dem erfindungsgemäßen Probensatz ist nicht nur die Unterscheidung von Allelen mit bekannten Sequenzen, sondern auch von Allelen mit bislang unbekannten Sequenzen möglich, wie in Beispiel 3 ausgeführt. Bei diesem Beispiel wird gezeigt, dass B71 unter Verwendung der Probe 13 von B72 (B*1503) unterschieden werden kann. Dies ist besonders vorteilhaft, da die Unterscheidung von B71 und B72 auf serologischer Grundlage problematisch ist.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen B72 (B*1503) und Nicht-B72-HLA-B-Allelen der B70-Gruppe (B70, B71, d. h. von B*1503 verschiedene Allele) unter Verwendung des vorstehend definierten Verfahrens, wobei die Nicht-B72-HLA-B-Allele durch die Tatsache gekennzeichnet sind, dass sie kein Hybrid mit mindestens einer der folgenden Proben bilden, welche mit dem B*1503-Allel hybridisieren (z. B. Probe 13 (SEQ ID NR 19), Probe 7 (SEQ ID NR 13), Probe 10 (SEQ ID NR 16), Probe 18 (SEQ ID NR 24) und Probe 19 (SEQ ID NR 25)).
Ist die Sequenz dieser neuen Allele einmal erhältlich, können neue Proben entwickelt werden, mit welchen eine spezifische Erfassung dieser neuen Allele möglich wird. Das Hinzufügen dieser Proben zum Satz der in Tabelle 1 aufgeführten 20 grundlegenden Proben verbessert somit das Unterscheidungsniveau und die Relevanz dieses Typisier-Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf ein amplifiziertes Produkt, das durch das Primer-Set B25P/B23P1 (SEQ ID NR 1 und 4) eines HLA-B-Allels erhalten wurde, welches einem bislang auf dem Nukleinsäuresequenzniveau noch nicht bestimmten B70-HLA-B-Typ entspricht und gemäß dem vorstehend definierten Verfahren bestimmt wurde, wobei das amplifizierte Produkt durch die Tatsache gekennzeichnet ist, das es ein Hybrid mit Probe 2 (SEQ ID NR 8, vgl. Tabelle 2) bildet, während es kein Hybrid mit Probe 13 (SEQ ID NR 19, vgl. Tabelle 2) unter den folgenden Bedingungen bildet:

– Vorhybridisierung der Membranen für 30 Minuten bei 54 °C in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 3M TMAC;
– Hybridisierung für eine Stunde bei 54 °C in der gleichen Lösung nach Zugabe von 3 pmol/ml DIG-verdauter einzelsträngiger Oligonukleotidprobe;
– zwei Waschschritte bei Raumtemperatur für 10 Minuten in 2 × SSPE, 0,1 % SDS;
– einem Waschschritt für 15 Minuten bei 58 °C in einer Hybridisierungslösung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Zusammensetzung, welche mindestens einen aus der folgenden Liste ausgewählten Oligonukleotid-amplifizierenden Primer umfasst:
5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEQ ID NR 1)
oder Sequenzvarianten davon, wie:
5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 2)
5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 3)
und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden, mit der Maßgabe, dass die 3'-End-GCCA-Sequenz erhalten bleibt und diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B25P-Primer oder die vorstehend ausgeführten Varianten davon veranlasst werden kann, möglicherweise in Kombination mit mindestens einem Primer der folgenden Liste:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P1, SEQ ID NR 4),
oder andere Sequenzvarianten davon, wie:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEQ ID NR 5),
5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEQ ID NR 6),
oder Sequenzvarianten davon, wobei die Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden enthalten, mit der Maßgabe, dass die Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B23P1-Primer oder die vorstehend ausgeführten Varianten B23P2 oder B23P3 davon veranlasst werden kann, wobei die Primer möglicherweise mit einer entfernbaren Markierung wie Biotin versehen sind und die Primersätze möglicherweise auf einem festen Träger immobilisiert sind.
Vorzugsweise enthalten solche Zusammensetzungen mindestens zwei oder mehrere Amplifizierungsprimer, welche aus dieser Liste ausgewählt sind. Noch bevorzugter wird der Amplifizierungsprimersatz B25P/B23P1 mit mindestens einem der folgenden Sätze kombiniert:
B25P/B23P2 oder B25P/B23P3.
Zusätzlich zu den vorstehend genannten Komponenten kann die Zusammensetzung auch mindestens einen der folgenden Primer umfassen:
5'-GACGACACG/CCT/ACTTCGTGA-3' B25PX1 (SEQ ID NR 53)
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Zusammensetzung, welche mindestens eine aus der folgenden Probenliste ausgewählte Oligonukleotidprobe umfasst:
SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 13, SEQ ID NR 18, SEQ ID NR 19, SEQ ID NR 21, SEQ ID NR 22, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 26, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28, SEQ ID NR 29, SEQ ID NR 30, SEQ ID NR 36, SEQ ID NR 39, SEQ ID NR 44, SEQ ID NR 45, SEQ ID NR 46, SEQ ID NR 49, SEQ ID NR 52.
Vorzugsweise enthalten derartige Zusammensetzungen mindestens zwei, drei oder mehrere dieser Proben.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Baukasten zur Typisierung von mindestens einem HLA-B-Allel aus einer biologischen Probe, in der es wahrscheinlich enthalten ist, umfassend die folgenden Komponenten:

– auf Wunsch mindestens einen aus den vorstehend definierten ausgewählten Amplifizierungsprimer,
– mindestens eine Probe, wobei die Probe vorzugsweise auf einem festen Substrat immobilisiert ist, noch bevorzugter auf ein und demselben Membranstreifen, und wobei die Proben aus den vorstehend definierten ausgewählt sind,
– einen Puffer oder zur Herstellung des Puffers notwendige Komponenten, welcher die durchzuführende Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Proben und dem amplifizierten Produkt ermöglicht;
– auf Wunsch eine Einrichtung zur Erfassung der durch die vorstehende Hybridisierung erhaltenen Hybride.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Baukasten zur Typisierung von mindestens einem HLA-B-Allel aus einer biologischen Probe, in welcher es wahrscheinlich enthalten ist, genauer einer Probe, welche wahrscheinlich serologisch schwierig zu unterscheidende HLA-B-Typen enthält, im Anschluss an die Amplifizierung der die in der Probe vorhandenen HLA-B-Allele kodierenden Nukleotide unter Verwendung einer oder mehrerer Primersatz-Kombinationen gemäß dem vorstehend definierten Verfahren, umfassend:

– mindestens eine Probe, wobei die Proben vorzugsweise auf einem festen Substrat und noch bevorzugter auf ein und demselben Membranstreifen immobilisiert und aus den vorstehend definierten ausgewählt sind,
– ein Puffer oder zur Herstellung des Puffers notwendige Komponenten, welcher die durchzuführende Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Proben und dem amplifizierten Produkt ermöglicht;
– eine Einrichtung zur Erfassung der aus der vorhergehenden Hybridisierung erhaltenen Hybride,
– gegebenenfalls auch eine automatisierte Abtast- und Interpretiervorrichtung zur Interpretation der Ergebnisse und Ableitung des vorhandenen Allels aus dem beobachteten Hybridisiermuster.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen und der Legenden der Tabellen
1: Schematische Wiedergabe des erfindungsgemäßen Typisieransatzes.
2: Anordnung der erfindungsgemäßen Primer und Proben auf einer das Exon 2 des HLA-B-Gens darstellenden Achse. Die Nummerierung entspricht der von Zemmour und Parham, 1992.
3: Ergebnisse der Amplifizierung (oberes Feld) und Punkt-Auftropfhybridisierung (unteres Feld), welche mit 13 Patientenproben und 7 Vergleichsproben erhalten wurden. Das Material wurde unter Verwendung des Primersatzes B25P/B23P1 amplifiziert, punktaufgetropft und mit den Proben 6 (SEQ ID NR 12) und 17 (SEQ ID NR 23) wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben hybridisiert.
4: Punkt-Auftropfhybridisierergebnisse, welche für 15 Proben (Nummer 1 bis 15) erhalten wurden, unter denen sich Proben befinden, welche B70-Allelvarianten und B46-Allele beherbergen.
Das amplifizierte Material wurde auf Nylonmembranen aufgetragen. Nachfolgend wurden diese Membranen mit SSO-Proben 13 (SEQ ID NR 19), 12 (SEQ ID NR 18), 15 (SEQ ID NR 21), 6 (SEQ ID NR 12) und 2 (SEQ ID NR 8) wie angegeben hybridisiert. Die Ergebnisse sind in den Beispielen SSO 3 und 4 diskutiert und in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 1: Amplifizierte HLA-B-Allele (Exon 2) mit den erfindungsgemäßen Primersätzen. Zudem ist die Anwesenheit der 3'-Endprimersequenz in den Allelen und das Hybridisierungsmuster mit dem Satz der 19 SSO-Proben angegeben.
Tabelle 2: Liste typisierender SSO-Proben für HLA-B-Allele.
Tabelle 2 bis: Liste typisierender SSO-Proben für HLA-B-Allele, welche auf ihre Verwendung bei einem Umkehrhybridisierungs-Linienprobenprüfungs- (LiPA) -Format getestet wurden. All diese Proben stammen von dem grundlegenden Satz von 20 SSOs ab, die in Tabelle 2 angegeben sind. Die bevorzugten Proben sind mit „+" gekennzeichnet.
Tabelle 3: Zusammenfassung der Hybridisierergebnisse, die mit 15 amplifizierten Proben erhalten wurden, welche mit 5 SSO-Proben wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben hybridisiert wurden. Vgl. 4.
Tabelle 4: Hybridisierergebnisse, welche mit einem LiPA-Streifen erhalten wurden, auf dem 20 Oligonukleotidproben immobilisiert wurden. Positive Hybridisiersignale, die nach der Hybridisierung mit dem jeweils nach der Amplifizierung 1 und 2 (vgl. Beispiel 6) erhaltenen Material erhalten wurden, sind mit „+" angegeben.
Abkürzungen

TMAC:

Tetramethylammoniumchlorid

SSO:

Sequenzspezifisches Oligonukleotid

DIG 11-ddUTP:

Digoxigenin-11-2',3'-didesoxy-uridin-5'-triphosphat

DIG:

Digoxigenin

AMPPD:

3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)-phenyl-1'-2-dioxetan

AP:

Alkalische Phosphatase

Beispiele
Beispiel 1: Spezifische Amplifizierung bestimmter HLA-B-Allele mit dem Primersatz B25P/B23P1
Beispielhaft wird die Amplifizierungsspezifität mit einem der Primersätze veranschaulicht. Wie in 3 veranschaulicht, wurden 12 Proben und 7 Vergleichsproben mit dem Primersatz B25P/B23P1 (SEQ ID NR 1 und 4) amplifiziert. Ausgehend von Zellmaterial wurde genomische DNA gemäß Standardprotokollen erhalten. Etwa 0,5 μg genomischer DNA wurden mit einem PCR-Puffer vermischt, der 12,5 pmol jedes Primers; 200 mM jeder dNTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden); 10 mM Tris-HCl (pH 8,5); 50 mM KCl; 1 mM MgCl₂; 0,01 % Gelatine; 0,025 % NP-40 und eine Einheit Taq (Thermus aquaticus) -DNA-Polymerase (Boehringer, Mannheim GmbH, BRD) enthielt und auf ein letztendliches Volumen von 50 μl mit doppelt destilliertem Wasser eingestellt worden war. Die Proben wurden für 10 Minuten auf 95 °C erhitzt und 35 PCR-Zyklen unterworfen, von denen jeder aus 94 °C für eine Minute, 55 °C für 30 Sekunden, 72 °C für eine Minute mit einer zehnminütigen letztendlichen Ausdehnung bei 72 °C in einem DNA-Thermezyklusgerät (Techne and Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT) bestand. Die Amplifizierungsprodukte wurden mittels einer 1,5 %-Agarose-Gelelektrophorese charakterisiert.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Bei allen Proben, in denen amplifizierbare Allele vorhanden waren, wurde eine bestimmte Bande von etwa 246 Basenpaaren, wie anhand der erhältlichen Sequenzdaten vorhergesagt, nach Anfärbung mit Ethidiumbromid beobachtet.
Die Proben 1, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 und 12 beherbergen das B*7801-Allel (in 1 als BSNA, BX1 oder Bte76 angegeben). In Probe 2 und 3 sowie in der Vergleichsprobe 15 findet sich ein B8-Allel (B*0801). Die Proben 16 bis 19 sind homozygotische Kontrollproben für jeweils B35, B55, B56 und B54. Bei den negativen Kontrollproben (13 und 14, welche jeweils die B*3701- und B*1801-Allele beherbergen) konnte keine Bande beobachtet werden. Diese Allele haben anstelle von 5'-GCCA-3' die 5'-TCCG-3'-Sequenz an der Position 30 bis 33 des Exons 2 (Zemmour und Parham, 1992).
Beispiel 2: Punkt-Auftropf-Typisierprüfung zur Erfassung der B78-Allele
Bei diesem Beispiel wird die spezifische Typisierung des B*7801-Allels unter Verwendung der Proben 6 und 17 (SEQ ID NR 12 und 23) beschrieben. Da B*7801 das einzige Allel ist, das mit beiden Proben (6 und 17) hybridisiert, kann das B*7801 von den anderen mit dem Primersatz B25P/B23P1 amplifizierten Allelen unterschieden werden.
Die sequenzspezifischen Oligonukleotidproben (SSOs) wurden chemisch synthetisiert und an ihrem 3'-Ende mit Digoxigenin-11-2'-3'-didesoxy-uridin-5'-triphosphat (DIG-11-ddUTP) und DNA-Desoxynukleotidylexotransferase markiert. Dreizehn Proben und sieben Vergleichsproben wurden mit dem Primersatz B25P/B23P1 wie in Beispiel 1 beschrieben amplifiziert.
Anschließend wurden 2 μl der PCR-Produkte auf Nylonmembranen (Hybond N Plus, Amersham, Buckinghamshire, GB) aufgetropft, durch Eintauchen der Filter in 0,4 N NaOH für fünf Minuten denaturiert und in 10 ml 10 × SSPE (physiologische Natriumphosphatase EDTA) für 15 Minuten neutralisiert. Nach dem Auftropfen wurden die Membranen für 30 Minuten bei 54 °C in 10 ml einer Hybridisierlösung vorhybridisiert, welche 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 3 M TMAC (Tetramethylammoniumchlorid, Janssen Chimica, Geel, Belgien) enthielt. Zur Hybridisierung wurden 3 pmol/ml DIG-markiertes SSO zur Vorhybridisierungslösung für eine Stunde bei 54 °C gegeben, ausgenommen das SSO-6 (SEQ ID NR 12) (52 °C). Zur Entfernung eines Probenüberschusses wurden die Filter zweimal in 2 × SSPE, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten und anschließend in der Hybridisierungslösung für 15 Minuten bei einer exakten Temperatur von 58 °C gewaschen, ausgenommen das SSO-6, das bei 54 °C gewaschen wurde.
Die nicht-isotopische Erfassung wurde durchgeführt, indem Anti-DIG-Alkalische Phosphatase (Fab-Fragmente, Anti-DIG-AP) verwendet wurde, und eine Sichtbarmachung wurde mit dem chemilumineszenten Substrat AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetan) erhalten. Die getrockneten Membranen wurden in einer Kassette für 15 bis 30 Minuten einem Röntgenstrahlfilm (X-Omat ARS, Kodak) ausgesetzt. Alle bei diesen Oligotypisierverfahren verwendeten Reagenzien wurden von Boehringer, Mannheim GmbH, BRD, bezogen. Die Ergebnisse sind in 3 veranschaulicht. Alle Proben, in denen ein Allel des B78-Typs vorhanden ist (BSNA, BX1 oder BTe76) hybridisieren eindeutig mit den Proben 6 und 17 (SEQ ID NR 12 und 23). Andere Proben (Nr. 2, 3, 7, 15, 16, 17, 18 und 19) hybridisieren entweder mit Probe 17 (SEQ ID NR 23) oder Probe 6 (SEQ ID NR 12), aber nicht mit beiden. Da die Proben 13 und 14 mit dem verwendeten Primersatz nicht amplifiziert werden, werden weder mit Probe 6 (SEQ ID NR 12) noch mit Probe 17 (SEQ ID NR 23) Hybridisiersignale beobachtet.
Beispiel 3: Typisierung und Untertypisierung von B70-Varianten
Bei diesem Beispiel wird die Typisierung und Untertypisierung von B70-Varianten veranschaulicht, indem 7 Proben verwendet werden, welche B70-Varianten beherbergen. Zudem wurden eine Leerprobe und 7 Nicht-B70-Proben als Vergleichsproben eingeschlossen (vgl. Tabelle 3). B71 und B72 sind Allele, welche Subtypen des breiten Antigens HLA-B70 sind. Die Sequenz des B72-Allels (B*1503) ist veröffentlicht (Zemmour und Parham, 1992); bis vor kurzem galt dies für die B71-Sequenz nicht. Keine monospezifischen B71- und B72-Reagenzien sind beschrieben, und die Anwesenheit anderer Antigene, vor allem von B35 und B62, erschwert die genaue serologische Zuordnung der B70-Varianten. Eine Unterscheidung zwischen den B70-Varianten kann mittels isoelektrischer Fokussierung erfolgen, doch dies ist bei einem Routineverfahren keine bevorzugte Technik.
Unter Verwendung des Primersatzes B25P/B32P1 (SEQ ID NR 1 und 4) und einer Kombination einiger erfindungsgemäßer Proben konnten die B72-Varianten von anderen B70-Varianten unterschieden werden. Hierbei sollte klargestellt werden, dass bislang noch nicht identifizierte andere Varianten als B71 und B72 vorkommen könnten.
Aus einem Satz bekanntermaßen B70-Allelvarianten beherbergender Proben (Proben 1 bis 6 und 8 in Tabelle 3) wurde DNA extrahiert und wie in Beispiel 1 beschrieben amplifiziert. Die amplifizierten Produkte wurden auf fünf Nylonmembranen aufgetragen, welche wie in Beispiel 2 beschrieben weiterbehandelt wurden. Diese Membranen wurden jeweils mit den folgenden Probensätzen hybridisiert: 2, 6, 12, 13 und 15 (SEQ ID NR 8, 12, 18, 19 und 21). Die mit diesen Proben erhaltenen Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. In allen Fällen konnte die B72-Variante (B*1503), welche in 4 der 7 B70-Proben vorhanden war, von B71 oder anderen möglichen Varianten unterschieden werden. B*1503 (B72) ist dadurch gekennzeichnet, dass es mit den Proben 2 und 13 (SEQ ID NR 8 und 19) hybridisiert, während sich andere B70-Varianten als unreaktiv mit Probe 13 (SEQ ID NR 19) erwiesen. Somit wird durch dieses Beispiel eindeutig die Möglichkeit der Unterscheidung zwischen Allelen selbst bei nicht-verfügbarer Sequenzinformation veranschaulicht.
Beispiel 4: Typisierung von B46-Varianten
Zwei B46-haltige Proben wurden unter Verwendung der gleichen Verfahren, der gleichen Primersätze und Probenkombinationen wie in Beispiel 3 beschrieben typisiert. In 4 und Tabelle 3 sind die Typisierergebnisse angegeben. Anhand der Anwesenheit der Probe 12 (SEQ ID NR 18) im Probenfeld kann B*4601 einfach aufgespürt und unzweideutig von anderen Allelen unterschieden werden. Von allen durch den Primersatz B25P/B23P1 amplifizierten Allelen (SEQ ID NR 1/4) ist B*4601 das einzige Allel, das mit Probe 12 (SEQ ID NR 18) hybridisiert.
Beispiel 5: Linienprobenprüfung (LiPA) und SSOs zur Typisierung von HLA-B-Allelen
Die bevorzugten Hybridisierungs- und Waschmedien für die Linienprüfung (LiPA) sind auf SSPE basierende Pufferlösungen. LiPA-Streifen wurden im Wesentlichen wie von Stuyver et al. (J. Gen. Virol. 74: 1093–1102, 1993) beschrieben hergestellt. Da in einem LiPA-Format alle Proben spezifisch unter den gleichen Hybridisier- und Waschbedingungen (der gleichen Salzkonzentration und Temperatur) reagieren sollten und der Wärmeschmelzpunkt des DNA:DNA-Hybrids in SSPE vom GC-Gehalt und der Probenlänge abhängt, ist bei einigen Proben die Modifikation der in Tabelle 2 aufgeführten Proben erforderlich, um von einem Puffersystem auf TMAC-Basis auf ein Puffersystem auf SSPE-Basis überzugehen.
Um die zur Verwendung in einem LiPA-Format am meisten geeigneten Proben auszuwählen, wurden viele Proben (aufgeführt in Tabelle 2 bis) synthetisiert, an ihren 3'-Enden unter Verwendung von TTP und terminaler Transferase verlängert und auf einem festen Träger (Nitrocellulosemembran) immobilisiert.
Diese Proben wurden mit einem Zielmaterial unter Verwendung der folgenden Hybridisier- und Waschbedingungen hybridisiert:

- Hybridisierung: 5 × SSPE/0,5 % SDS

55 °C

- Waschen: 2 × SSPE/0,1 % SDS

55 °C

(1 × SSPE ist 0,18 M NaCl, 0,01 M NaH₂PO₄, 1 mM EDTA (pH 7,2))

Die Proben, welche hinsichtlich der Spezifität und Empfindlichkeit unter den vorstehend genannten Bedingungen die besten Testergebnisse erbrachten, wurden zur weiteren Verwendung auf den LiPA-Streifen ausgewählt. Diese Proben wurden in Tabelle 2 bis als positiv (+) bewertet. Nur 9 der 20 in dem TMAC-Puffersystem verwendeten Proben (SEQ ID NR 7b, 11, 12, 13, 18, 19, 21, 23 und 24) konnten ohne Modifikation im auf SSPE basierenden System verwendet werden.
Durch diese Ergebnisse wird eindeutig bewiesen, dass leichte Modifikationen der Sequenzen der verwendeten Proben von Bedeutung sein können und eine sorgfältige Probenzubereitung für die Entwicklung eines zuverlässigen LiPA-Tests wesentlich ist.
Beispiel 6: Typisierung von repräsentativen homozygotischen Zelllinien unter Verwendung der LiPA-Streifen
Aufgrund der zusätzlichen Amplifizierung des HLA-AR-Pseudogens (wenn der Primer B23P2 verwendet wird) sind die Hybridisierergebnisse mit den Proben 7 (SEQ ID NR 13) und 9 (SEQ ID NR 15) nicht eindeutig, da im Pseudogen Sequenzen vorhanden sind, welche denjenigen der Probe 7 (SEQ ID NR 13) und 9 (SEQ ID NR 15) entsprechen.
Um den Ursprung eines schließlich positiven Hybridisierungssignals zu untersuchen, wurde eine zusätzliche Amplifizierung unter Verwendung mindestens eines der B23-Primer und eines Primers mit der folgenden Sequenz durchgeführt:
5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3' B25PX1 (SEQ ID NR 53)
Das erhaltene amplifizierte Produkt wurde nachfolgend mit einem Streifen hybridisiert, auf welchem mindestens Probe 7 und 9 immobilisiert waren.
Durch ein positives Hybridisiersignal für die Proben 7 und 9 in dieser Prüfung wird angezeigt, dass die Sequenzen von Proben 7 und/oder 9 in den HLA-B-Allelen der analysierten Probe vorhanden sind und daher die Proben 7 und/oder 9 als positiv bewertet werden sollten. Ein negatives Ergebnis bedeutet, dass diese Proben während der Interpretation der Ergebnisse nach der ersten Amplifizierung vernachlässigt werden sollten, da ihr positives Hybridisierungssignal vom Pseudogen und nicht vom HLA-B-Gen selbst stammte.
Die Hybridisierergebnisse, die mit einigen ausgewählten Proben (homozygotische Zelllinien A bis G) nach getrennter Amplifizierung mit den Primern B25P und B23P1/B23P2 (Amplifizierung 1) und mit den Primern B25PX1 und B23P1/B23P2 (Amplifizierung 2) erhalten wurden, sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Durch diese Ergebnisse wird gezeigt, dass für die Probe A das positive Hybridisiersignal für die Proben 7 und 9 von dem HLA-B-Allel stammt. Das gleiche gilt für das positive Signal, das mit der Probe 9 in den Proben E und F erhalten wurde.
Wenn die Ergebnisse nach den Amplifizierungsschritten 1 und 2 kombiniert werden, können die folgenden HLA-B-Allele mit Hilfe von Tabelle 1 ermittelt werden:

Probe Allel

A B*0801

B B*1501

C B*4001

D B*4601

E B*5101

F B*5301

G B*5701
Im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn zur Amplifizierung 2 der folgende Primersatz verwendet wird:
B25P und B23P1/B23P3.
Tabelle 1
Tabelle 1 (fortgeführt)
Tabelle 2 bis
Tabelle 3
Sequenzauflistung

Claims

Verfahren zur Typisierung oder Untertypisierung eines oder mehrerer HLA-B-Allele, die sich durch die Sequenz 5'-GCCA-3' an der Position 30 bis 33 des Exons 2 des HLA-B-Allels auszeichnen (gemäß der Nummerierung nach Zemmour und Parham, 1992), in einer Probe, und genauer auf ein Verfahren zur Unterscheidung von serologisch schwierig zu unterscheidenden HLA-B-Typen wie beispielsweise B54(22), B52(5), B7801, B62(15), B75(15), B71(70), B72(70), B46, B79, B53, B5102, B5103 und B58(17), umfassend zumindest die folgenden Schritte: (i) Gegebenenfalls Extraktion der Nukleinsäureprobe, (ii) Amplifizierung der Nukleinsäure der durch die Sequenz 5'-GCCA-3' an der Position 30 bis 33 des Exons 2 des HLA-B-Allels ausgezeichneten HLA-B-Allele mit mindestens einem aus der folgenden Liste ausgewählten 5'-End-Amplifizierungsprimer: 5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEQ ID NR 1) oder Sequenzvarianten davon wie: 5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 2) 5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 3) oder andere Sequenzvarianten, wobei die Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide enthalten, mit der Maßgabe, dass die 3'-End-5'-GCCA-3'-Sequenz erhalten bleibt und diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B25P-Primer oder vorstehend bezeichnete Varianten davon veranlasst werden können, in Kombination mit einem geeigneten 3'-End-Primer, der aus den gleichen Allelen, wie die vorstehend definierten 5'-End-Primer ausgewählt wird, wobei die 5'- und 3'-End-Primer gegebenenfalls markiert sind; und (iii) Hybridisierung des gegebenenfalls während oder nach der Amplifizierung markierten amplifizierten Produkts unter geeigneten Bedingungen mit einer oder mehreren geeigneten Proben, die aus dem Bereich 15 bis 261 des HLA-B-Exon-2-Bereichs, entsprechend der Nummerierung nach Zemmour und Parham, 1992, ausgewählt sind, (iv) Waschen unter geeigneten Waschbedingungen, (v) Erfassung der gebildeten Hybride; und (vi) Ableitung des vorhandenen Allels aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin mindestens einer der folgenden 3'-End-Amplifizierungsprimer verwendet wird: 5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P 1, SEQ ID NR 4) oder Sequenzvarianten davon wie: 5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEQ ID NR 5) 5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEQ ID NR 6) oder andere Sequenzvarianten, wobei die Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide enthalten, mit der Maßgabe, dass diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B23P1-Primer oder die vorstehend bezeichneten B23P2- oder B23P3-Varianten veranlasst werden können, wobei die Primer gegebenenfalls mit einer entfernbaren Markierung wie Biotin versehen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei zur Amplifizierung mindestens einer der folgenden Primerkombinationssätze verwendet wird: – B25P/B23P1 in Kombination mit B25P/B23P2, oder – B25P/B23P1 in Kombination mit B25P/B23P3.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Amplifizierungsreaktion mit den beiden Primersätzen der Wahl in verschiedenen Reaktionsbehältern durchgeführt wird und die amplifizierten Produkte getrennt hybridisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Amplifizierungsreaktion mit den beiden Primersätzen der Wahl in verschiedenen Reaktionsbehältern durchgeführt wird und die amplifizierten Produkte nach der Amplifizierung vermischt und zusammen hybridisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Primer der Wahl vermischt werden und die Amplifizierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsbehälter durchgeführt wird, wonach die amplifizierten Produkte zusammen hybridisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei eine oder mehrere Hybridisierungsproben aus der folgenden Liste ausgewählt werden: SEQ ID NR. 7, SEQ ID NR. 8, SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 11, SEQ ID NR. 12, SEQ ID NR. 13, SEQ ID NR. 14, SEQ ID NR. 15, SEQ ID NR. 16, SEQ ID NR. 17, SEQ ID NR. 18, SEQ ID NR. 19, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 21, SEQ ID NR. 22, SEQ ID NR. 23, SEQ ID NR. 24, SEQ ID NR. 25, SEQ ID NR. 26, wobei die Proben gegebenenfalls markiert sind; oder Derivatproben davon, die aliphatische NH₂-, SH- oder Carboxylgruppen enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltenen amplifizierten Produkte auf einem festen Träger immobilisiert und mit irgendeiner der zuvor markierten Proben gemäß Anspruch 7 in Berührung gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltenen und während oder nach der Amplifizierung markierten amplifizierten Produkte in Berührung mit einem festen Träger gebracht werden, auf welchem mindestens eine der Proben gemäß Anspruch 7 zuvor immobilisiert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltenen amplifizierten Produkte an Oligonukleotidproben hybridisiert werden, die in Form paralleler Linien auf Membranstreifen immobilisiert sind.
Verwendung einer oder mehrerer Proben gemäß Anspruch 7 zur Immobilisierung und Einfügung in eine Umkehrphasenhybridisierungsprüfung, vorzugsweise zur Immobilisierung in Form paralleler Linien auf einem festen Träger wie einem Membranstreifen, für die Typisierung von HLA-B-Allelen gemäß dem in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierten Verfahren.
Verfahren zur Erfassung und Identifizierung von neuen, sich von bekannten HLA-B-Allelen unterscheidenden HLA-B-Allelen, umfassend die Schritte: – Bestimmung des HLA-B-Typs, dem eine in einer biologischen Probe vorhandene Nukleinsäure zuzuordnen ist, gemäß dem in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierten Verfahren, – im Fall der Beobachtung einer Probe, die ein nicht mit den in Tabelle 1 definierten Hybridisierungsmustern kompatibles Hybridisierungsmuster erzeugt, Sequenzierung des Abschnitts der HLA-B-Exon-2-Sequenz, welcher der abweichend hybridisierenden Probe des zu bestimmenden neuen HLA-B-Allels entspricht.
Verfahren zur Unterscheidung zwischen B72 (B*1503)- und Nicht-B72-HLA-B-Allelen (B70, B71, d. h. von B*1503 verschiedenen Allelen) unter Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 12, wobei die Nicht-B72-HLA-B-Allele sich durch die Tatsache auszeichnen, dass sie kein Hybrid mit mindestens einer der mit dem B*1503-Allel hybridisierenden Proben bilden (beispielsweise Probe 13 (SEQ ID NR 19), Probe 7 (SEQ ID NR 13), Probe 10 (SEQ ID NR 16), Probe 18 (SEQ ID NR 24) und Probe 19 (SEQ ID NR 25)).
Ein amplifiziertes Produkt, das durch das Primer-Set B25P/B23P1 (SEQ ID NR 1 und 4) eines HLA-B-Allels erhalten wurde, welches dem B70-HLA-B-Typ entspricht und auf dem Niveau der Nukleinsäuresequenz nicht bestimmt, sondern gemäß dem Verfahren nach Anspruch 13 bestimmt wird, wobei das amplifizierte Produkt sich durch die Tatsache auszeichnet, dass es unter den nachstehenden Bedingungen ein Hybrid mit Probe 2 (SEQ ID NR 8), aber kein Hybrid mit Probe 13 (SEQ ID NR 19) bildet: – Vorhybridisierung der Membrane für 30 Minuten bei 54 °C in 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 3 M TMAC; – Hybridisierung für 1 h bei 54 °C in der gleichen Lösung nach Zugabe von 3 pmol/ml an DIG-markierter einzelsträngiger Oligonukleotidprobe; – zwei Waschschritte bei Raumtemperatur für 10 Minuten in 2 × SSPE, 0,1 % SDS; – ein Waschschritt bei 58 °C für 15 Minuten in der Hybridisierungslösung; wobei sich das Allel vom HLA-B-Allel B*1503 in mindestens einer Nukleotidposition in dem sich zwischen den Nukleotiden 192 bis 209 erstreckenden Bereich gemäß der Nummerierung von Zemmour und Parham, 1992, unterscheidet.
Zusammensetzung, umfassend mindestens einen der aus der folgenden Liste ausgewählten Amplifizierungsprimer: 5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P) oder Sequenzvarianten davon wie: 5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 2) 5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEQ ID NR 3) oder andere Sequenzvarianten, wobei die Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide enthalten, mit der Maßgabe, dass die 3'-End-GCCA-Sequenz erhalten bleibt und diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B25P-Primer oder vorstehend bezeichnete Varianten davon veranlasst werden können, gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem der Primer aus der folgenden Liste: 5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P1, SEQ ID NR 4) oder Sequenzvarianten davon wie: 5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEQ ID NR 5) 5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEQ ID NR 6) oder andere Sequenzvarianten davon, wobei die Sequenzvarianten Auslassungen und/oder Einfügungen und/oder Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide enthalten, mit der Maßgabe, dass diese Sequenzvarianten zur spezifischen Amplifizierung der gleichen HLA-B-Allele wie der B23P1-Primer oder die vorstehend bezeichneten B23P2- oder B23P3-Varianten veranlasst werden können, wobei die Primer gegebenenfalls mit einer entfernbaren Markierung wie Biotin versehen sind.
Zusammensetzung, umfassend mindestens eine aus der folgenden Probenliste ausgewählte Oligonukleotidprobe: SEQ ID NR. 11, SEQ ID NR. 13, SEQ ID NR. 18, SEQ ID NR. 19, SEQ ID NR. 21, SEQ ID NR. 23, SEQ ID NR. 24, SEQ ID NR. 26, SEQ ID NR. 27, SEQ ID NR. 28, SEQ ID NR. 29, SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 36, SEQ ID NR. 39, SEQ ID NR. 44, SEQ ID NR. 45, SEQ ID NR. 46, SEQ ID NR. 49, SEQ ID NR. 52.
Fester Träger, vorzugsweise ein Membranstreifen, der auf seiner Oberfläche eine oder mehrere Proben gemäß Anspruch 16 trägt, die in Form paralleler Linien an den Träger gekoppelt sind.
Baukasten zur Typisierung mindestens eines HLA-B-Allels aus einer biologischen Probe, in der es wahrscheinlich enthalten ist, umfassend die folgenden Komponenten: – mindestens einen aus den in Anspruch 15 genannten ausgewählten amplifizierenden Primern, – mindestens eine Probe, wobei die Proben vorzugsweise auf einem festen Substrat und noch bevorzugter auf ein und demselben Membranstreifen immobilisiert und aus den gemäß Anspruch 16 definierten ausgewählt sind, – ein Puffer oder zur Herstellung des Puffers notwendige Komponenten, durch welche die durchzuführende Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Proben und den amplifizierten Produkten ermöglicht wird; – auf Wunsch eine Einrichtung zur Erfassung der aus der vorstehenden Hybridisierung erhaltenen Hybride.
Baukasten zur Typisierung mindestens eines HLA-B-Allels aus einer biologischen Probe, in der es wahrscheinlich enthalten ist, genauer einer wahrscheinlich serologisch schwer zu unterscheidende HLA-B-Typen enthaltenden Probe, im Anschluss an die Amplifizierung der die in der Probe vorhandenen HLA-B-Allele kodierenden Nukleotide unter Verwendung einer oder mehrerer Primerkombinationssätze gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: – mindestens eine Probe, wobei die Proben vorzugsweise auf einem festen Substrat und noch bevorzugter auf ein und demselben Membranstreifen immobilisiert und aus den gemäß Anspruch 16 definierten ausgewählt sind, – ein Puffer oder zur Herstellung des Puffers notwendige Komponenten, durch welche die durchzuführende Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Proben und den amplifizierten Produkten ermöglicht wird; – eine Einrichtung zur Erfassung der aus der vorstehenden Hybridisierung erhaltenen Hybride, – gegebenenfalls auch eine automatisierte Abtast- und Interpretiervorrichtung zur Interpretation der Ergebnisse und Ableitung der vorhandenen Allele aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.