DE69822242T2

DE69822242T2 - Neisseria gonorrhoae-spezifische Oligonucleotide

Info

Publication number: DE69822242T2
Application number: DE1998622242
Authority: DE
Inventors: Judith Barbara Weiss
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2018-04-15
Also published as: DE69822242D1; EP0872561A2; EP0872561B1; US6090557A; JPH1118785A; EP0872561A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und der Nucleinsäurechemie. Genauer gesagt betrifft sie Verfahren und Reagenzien zum Amplifizieren von Nucleinsäuren von Neisseria gonorrhoeae. Die Erfindung hat daher Anwendungen beim Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, allgemein im Gebiet der medizinischen Diagnostik und im Gebiet der Molekularbiologie.
Neisseria gonorrhoeae ist der Verursacher der Gonorrhoe, einer der am häufigsten gemeldeten bakteriellen Infektionen in den Vereinigten Staaten.
Miyada und Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5: 327–335, U.S.-Patent Nr. 5.256.536 und U.S.-Patent Nr. 5.525.717 beschreiben den Nachweis von N. gonorrhoeae unter Verwendung einer DNA-Sonde, die von einem genomischen Fragment enthaltend einen offenen Leserahmen (ORF 1) mit signifikanter Homologie mit der Sequenz des Cytosin-DNA-Methyltransferasegens von N. gonorrhoeae (M. Ngo PII) abgeleitet wurde. Es wurde gezeigt, dass von dieser Sequenz abgeleitete Sonden mit gereinigter DNA aus 105/106-N. gonorrhoeae-Stämmen hybridisierten, wenn sie im „Dot-Blot"-Format getestet wurden. Kreuzreaktivität mit anderen Neisseria-Arten wurde nur mit N. mucosa beobachtet, jedoch wurde diese Kreuzreaktivität durch einen Waschschritt mit hoher Stringenz eliminiert.
Die Erfindung der Verfahren zum Amplifizieren spezifischer Sequenzen von Nucleinsäuren insbesondere der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) macht den schnellen Nachweis von Nucleinsäuren möglich, die in einer Menge in einer Probe vorhanden sind, die zuvor eine nicht nachweisbar geringe Menge war (siehe U.S.-Patente Nr. 4.683.195, 4.683.202 und 4.965.188). Die Entwicklung und die Anwendung der PCR werden ausführlich in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel werden eine Reihe von die PCR betreffenden Themen diskutiert bei PCR Technology – principles and applications for DNA amplification, 1989, (Hrsg. H. A. Erlich) Stockton Press, New York, PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (Hrsg. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego und PCR Strategies, 1995, (Hrsg. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego. Kommerzielle Anbieter wie Perkin Elmer (Norwalk, CT) vertreiben PCR-Reagenzien und veröffentlichen PCR-Protokolle.
Seit der ursprünglichen Beschreibung der Amplifizierung von Nucleinsäuren wurden verschiedene auf Primer basierende Nucleinsäure-Amplifizierungsverfahren beschrieben, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Ligase-Kettenreaktion (LCR, Wu und Wallace, 1989, Genomics 4, 560–569 und Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193), Polymerase-Ligase-Kettenreaktion (Barany, 1991, PCR Methods and Appl. 1: 5–16) Gap-LCR (PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 90/01069), Reparatur-Kettenreaktion (Europäische Patentveröffentlichung Nr. 439.182 A2), 3SR (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177, Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874–1878, PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/08800 A) und NASBA (U.S.-Patent Nr. 5.130.238). Ein Überblick über die Amplifizierungssysteme wird bei Abramson und Myers, 1993 Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47, bereitgestellt.
Purohit und Silver, U.S.-Patent Nr. 5.550.040 und EP 0 630 971 beschreiben den Nachweis von N. gonorrhoeae unter Verwendung eines PCR-Amplifizierungs-/Nachweis-Tests. Basierend auf einem Vergleich der DNA-Sequenzen von verschiedenen in der Literatur beschriebenen Stämmen von N. gonorrhoeae wurden Primer so konstruiert, dass eine 201 Nucleotide umfassende Zielsequenz innerhalb der von Miyada und Born vorstehend bereitgestellten Sequenz vermehrt wird. Die Primer amplifizierten die Zielsequenzen aller geprüfter Stämme von N. gonorrhoeae, obwohl auch die DNA von einigen Stämmen von N. mucosa vermehrt wurde. Das amplifizierte Produkt wurde anschließend mit einer für N. gonorrhoeae spezifischen Sonde hybridisiert, um die gewünschte Spezifität zu erhalten. Im resultierenden Amplifizierungs-/Nachweistest wurde beobachtet, dass alle geprüften Stämme von N. gonorrhoeae ohne Kreuzreaktivität mit nicht von N. gonorrhoeae stammender DNA nachgewiesen werden konnten. Der Primer SS02, der in den vorstehend angegebenen Patenten beschrieben wird, ist identisch mit der SEQ ID NO: 5, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
Mit N. gonorrhoeae infizierte Patienten sind oftmals auch mit Chlamydia trachomatis infiziert. Die im '040-Patent beschriebenen N. gonorrhoeae-Primer wurden in Verbindung mit Primern für die Vermehrung von C. trachomatis verwendet, um Zielsequenzen von beiden Organismen in einer einzigen Amplifizierungsreaktion zu amplifizieren. Die gemeinsame Amplifizierungsreaktion gefolgt von getrennten artspezifischen Hybridisierungsreaktionen bildeten die Basis eines Amplifizierungs-/Nachweis-Tests, der in der Lage war, eine Infektion mit N. gonorrhoeae, C. trachomatis oder beiden nachzuweisen und zu unterscheiden.
Der AMPLICOR^® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)-Test, der im Handel bei Roche Diagnostics Systems, Inc. (Branchburg, NJ) erhältlich ist, ist ein in vitro-Test für den qualitativen Nachweis von Chlamydia trachomatis und/oder Neisseria gonorrhoeae in klinischen Proben, der auf dem im '040-Patent beschriebenen Test basiert. Siehe die Produktbeilage des AMPLICOR^® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)-Tests.
Konventionelle Verfahren der Molekularbiologie und der Nucleinsäurechemie, welche innerhalb des Fachwissens liegen, werden in der Literatur in Gänze erklärt. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984), Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg., 1984) und eine Serie, nämlich Methods in Enymology (Academic Press, Inc.).
Man hat entdeckt, dass im Handel erhältliche Nachweis-Tests basierend auf der mutmaßlichen Cytosin-DNA-Methyltransferase Gensequenz (hier „Ng-CDMT" genannt), offengelegt von Miyada und Born, vorstehend, eine unerwartet hohe Rate falsch-positiver Ergebnisse von bestimmten klinischen Proben ergibt, insbesondere von Rachenabstrichen. Weiterhin, wurde ermittelt, dass die Ursache der falsch-positiven Ergebnisse unerwartet die Gegenwart von zumindest einem Anteil der N. gonorrhoeae-spezifischen Zielsequenz des Ng-CDMT Gens in einigen anderen Isolaten der Art Neisseria als N. gonorrhoeae ist.
Es wurde eine Anzahl von Neisseria-Isolaten in menschlichen Rachenproben und einigen Genitalproben entdeckt, identifiziert und charakterisiert, welche die falsch-positiven Ergebnisse verursachten. Eine biochemische Analyse der Isolate identifizierte sie als andere Neisseria-Arten als N. gonorrhoeae, vorrangig N. subflava oder N. cinerea. Es wurde zuvor angenommen, dass Neisseria-Arten außer N. gonorrhoeae, einschließlich N. subflava und N. cinerea, nicht die Ng-CDMT Gensequenz enthalten, und es wurde nun bestätigt, dass die Mehrzahl der Isolate nicht die Ng-CDMT Gensequenz enthält. Die Anwesenheit der Ng-CDMT Gensequenz in einer Minderheit der Isolate der Neisseria-Arten außer N. gonorrhoeae stellt ein Problem für die auf der Ng-CDMT Gensequenz basierenden Nachweistests dar, welches zuvor nicht erkannt wurde. Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für dieses Problem bereit.
Die Nucleotidsequenz eines Teils des Ng-CDMT Gens wurde ausgehend von einer Anzahl neu entdeckter Isolate von anderen Neisseria-Arten als N. gonorrhoeae bestimmt, welche die Ng-CDMT Gensequenz enthalten. Die Gensequenzen, die in diesen neu entdeckten Isolaten enthalten sind, enthalten geringe Unterschiede im Vergleich zur entsprechenden Ng-CDMT Gensequenz aus N. gonorrhoeae. Die Unterschiede in der Nucleotidsequenz, welche die Ng-CDMT-Gensequenz in den neu entdeckten Isolaten von der Ng-CDMT Gensequenz von N. gonorrhoeae unterscheiden, sind auf eine kleine Zahl von Positionen begrenzt und sind innerhalb der Isolate konserviert. Die Entdeckung dieser Unterschiede in der Nucleotidsequenz und der örtlichen Begrenztheit der Unterschiede ist ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Oligonucleotide, welche durch selektive Hybridisierung unter geeignet stringenten Bedingungen die Ng-CDMT-Gensequenz von N. gonorrhoeae von der entsprechenden Ng-CDMT-Gensequenz, die sich in den neu entdeckten Isolaten findet, unterscheiden. Die Oligonucleotide können als Hybridisierungssonden oder vorzugsweise als Amplifizierungsprimer verwendet werden. Die Verwendung der Oligonucleotide ermöglicht eine signifikante Verringerung der falsch-positiven Ergebnisse in Amplifizierungs-/Nachweis-Tests für N. gonorrhoeae, welche auf die Ng-CDMT-Gensequenz zielen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zum Amplifizieren einer Region des Ng-CDMT-Gens von N. gonorrhoeae, wobei die Verfahren die Ausführung einer Amplifizierungsreaktion unter Verwendung von Primern (oder Oligonucleotiden für die Ligierung) umfassen, einschließlich eines Oligonucleotides der vorliegenden Erfindung.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Kits, welche ein Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung enthalten, vorzugsweise zur Verwendung als Amplifizierungsprimer. Diese Kits können zusätzliche Reagenzien wie die Nachweissonden oder eine oder mehrere Amplifizierungsreagenzien, z. B. Polymerase, Puffer und Nucleosidtriphosphate enthalten.
Um das Verstehen der Erfindung zu erleichtern, werden nachfolgend einige Begriffe definiert.
Die Begriffe „Nucleinsäure" und „Oligonucleotid" beziehen sich auf Polydesoxyribonucleotide (enthalten 2-Desoxy-D-Ribose), auf Polyribonucleotide (enthalten D-Ribose) und auf jede andere Art eines Polynucleotids, welches ein N-Glycosid einer Purin- oder einer Pyrimidin-Base oder einer modifizierten Purin- oder Pyrimidin-Base ist. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung in der Länge zwischen den Begriffen „Nucleinsäure" und „Oligonucleotid" und diese Begriffe werden untereinander austauschbar eingesetzt. Diese Begriffe beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher beinhalten die Begriffe sowohl doppel- und einzelsträngige DNA, als auch doppel- und einzelsträngige RNA.
Oligonucleotide können mit einem geeigneten Verfahren hergestellt werden, einschließlich zum Beispiel Klonierung und Restriktion von geeigneten Sequenzen und direkte chemische Synthese mit einem Verfahren wie dem Phosphotriesterverfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99, dem Phosphodiesterverfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151, dem Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862 und dem Festphasenverfahren des U.S.-Patents Nr. 4.458.066. Eine Übersicht über die Syntheseverfahren wird bei Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3): 165–187 bereitgestellt.
Der Begriff „Hybridisierung" betrifft die Entstehung einer Duplexstruktur durch zwei einzelsträngige Nucleinsäuren durch die komplementäre Basenpaarung. Eine Hybridisierung kann zwischen zwei vollständig komplementären Nucleinsäuresträngen oder zwischen „im Wesentlichen komplementären" Nucleinsäuresträngen, die geringfügige Regionen mit Unterschieden enthalten, auftreten. Bedingungen, unter denen nur vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren, werden als „stringente Hybridisierungsbedingungen" oder „sequenzspezifische Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Stabile Duplexstrukturen aus im Wesentlichen komplementären Sequenzen können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen erreicht werden; der Grad der geduldeten Unterschiede kann durch eine geeignete Anpassung der Hybridisierungsbedingungen erreicht werden. Der Fachmann für Nucleinsäureverfahren kann die Stabilität der Duplexstruktur empirisch ermitteln, indem er eine Anzahl von Variablen einschließlich zum Beispiel die Länge und Basenpaarkonzentration der Oligonucleotide, die Jonenstärke und das Auftreten von fehlgepaarten Basenpaarungen betrachtet und die auf dem Fachgebiet bereitgestellten Anleitungen befolgt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York und Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 26 (3/4): 227–259.).
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das in der Lage ist, selektiv mit einer Zielnucleinsäure unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Die Sonde wird eine „hybridisierende Region" enthalten, die zur Zielsequenz exakt oder im Wesentlichen komplementär ist und sie wird an einer variablen Stelle zur Zielsequenz exakt komplementär sein. Ein Hybridisierungstest, der unter Verwendung der Sonde unter ausreichend stringenten Bedingungen durchgeführt wird, ermöglicht den selektiven Nachweis einer spezifischen Zielsequenz. Für die Verwendung in einem Hybridisierungstest zur Unterscheidung von einzelnen Nucleotidunterschieden in der Sequenz ist die Region, an welche die Sonde hybridisiert, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 35 Nucleotide lang. Ein Fachmann wird erkennen, dass im Allgemeinen das exakte Komplement einer Sonde als Sonde genauso nützlich ist.
Der Begriff "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das in der Lage ist, als Initiationspunkt für die DNA-Synthese zu dienen, unter Bedingungen bei denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, angeschaltet wird, d. h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Agens zur Polymerisation (d. h. DNA-Polymerase oder „reverse" (umgekehrte) Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Der Primer wird eine „hybridisierende Region" enthalten, die zur Zielsequenz exakt oder im Wesentlichen komplementär ist und er wird an einer variablen Stelle zur Zielsequenz exakt komplementär sein. Eine Amplifizierung, bei der die Primerverlängerung unter ausreichend stringenten Bedingungen durchgeführt wird, erlaubt die selektive Amplifizierung einer spezifischen Zielsequenz. Zur Verwendung in einer sequenzspezifischen Amplifizierungsreaktion zur Unterscheidung von einzelnen Nucleotidveränderungen in der Sequenz ist die mit dem Primer hybridisierende Region vorzugsweise etwa 15 bis etwa 35 Nucleotide lang. Da die Primerverlängerung am 3'-Ende des Oligonucleotids stattfindet, ist die variable Stelle vorzugsweise am 3'-Ende des Primers gelegen, um die Sequenzunterscheidung zu erleichtern.
Sonden und Primer können entweder vollständig aus dem Oligonucleotid der hybridisierenden Region bestehen oder sie können zusätzliche Eigenschaften enthalten, welche den Nachweis oder die Immobilisierung des Oligonucleotids erlauben, die jedoch die Hybridisierungseigenschaften der hybridisierenden Region nicht signifikant verändern. Zum Beispiel kann die an die Sonde hybridisierende Region an einen poly-T-„Schwanz" gebunden werden, welcher verwendet wird, um die Sonde zur Verwendung in einem umgekehrten „Dot-Blot"-Test an eine feste Unterlage zu immobilisieren. Primer können in ähnlicher Weise zusätzliche Eigenschaften enthalten, welche den Nachweis oder die Immobilisierung der Primer erlauben, die grundlegende Eigenschaft des Primer jedoch nicht verändern, nämlich als Initiationspunkt für die DNA-Synthese zu dienen. Zum Beispiel können Primer eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz am 5'-Ende enthalten, welche nicht mit der Zielnucleinsäure hybridisiert, jedoch die Klonierung des vermehrten Produkts erleichtert.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich ein „stromaufwärts"-Primer auf einen Primer, dessen Verlängerungsprodukt eine Untersequenz des codierenden Strangs ist. Ein „stromabwärts"-Primer bezieht sich auf einen Primer, dessen Verlängerungsprodukt eine Untersequenz des komplementären nicht-codierenden Strangs ist.
Die Begriffe „Zielsequenz", „Zielregion" und „Zielnucleinsäure" beziehen sich auf eine Region einer Nucleinsäure, welche amplifiziert, nachgewiesen oder anderweitig analysiert wird.
Der Begriff „variable Stelle" oder „variable Position" beziehen sich hier auf diejenigen Nucleotidpositionen innerhalb des Ng-CDMT Gens, an denen sich das vorhandene Nucleotid in Sequenzen von Organismen aus verschiedenen Quellen unterscheidet.
So wie es hier verwendet wird, ist ein Oligonucleotid „spezifisch" für eine Zielsequenz, wenn die Zahl der vorhandenen Unterschiede zwischen Oligonucleotid und Zielsequenz vorhanden Fehlpaarungen geringer ist, als die Zahl der vorhandenen Unterschiede zwischen Oligonucleotid und nicht-Zielsequenzen, welche in einer Probe vorhanden sein können. Es können Hybridisierungsbedingungen gewählt werden, unter denen stabile Duplexstrukturen nur dann entstehen, wenn die Zahl der vorhandenen Unterschiede nicht höher ist als die Zahl der vorhandenen Unterschiede zwischen dem Oligonucleotid und der Zielsequenz. Unter solchen Bedingungen kann das zielspezifische Oligonucleotid eine stabile Duplexstruktur nur mit einer Zielsequenz erzeugen. Daher ermöglicht die Verwendung eines zielspezifischen Primers unter geeignet stringenten Amplifizierungsbedingungen eine spezifische Amplifizierung solcher Sequenzen, welche die Zielprimer-Bindungsstellen enthalten. In ähnlicher Weise ermöglicht die Verwendung zielspezifischer Sonden unter geeignet stringenten Hybridisierungsbedingungen den Nachweis einer spezifischen Zielsequenz.
Der Begriff „Amplifizierungs-Reaktionsgemisch" bezieht sich auf eine Lösung, die Reagenzien enthält, die notwendig sind, um eine Amplifizierungsreaktion durchzuführen und typischerweise Primer, eine thermostabile DNA-Polymerase, dNTPs und ein divalentes Metallkation in einem geeigneten Puffer enthält. Ein Reaktionsgemisch wird als vollständig bezeichnet, wenn es alle Reagenzien enthält, die notwendig sind, um die Reaktion durchzuführen und als unvollständig, wenn es nur eine Teilmenge der notwendigen Reagenzien enthält. Es wird einem Fachmann verständlich sein, dass die Reaktionskomponenten routinemäßig aus Gründen der Zweckmäßigkeit, der Lagerstabilität oder um eine anwendungsabhängige Anpassung der Konzentrationen der Komponenten zu erlauben, als separate Lösungen aufbewahrt werden, wobei jede eine Teilmenge der gesamten Komponenten enthält und dass die Reaktionskomponenten vor der Reaktion kombiniert werden, um ein vollständiges Reaktionsgemisch zu erhalten und dass die Reaktionskomponenten vor der Reaktion kombiniert werden, um ein vollständiges Reaktionsgemisch herzustellen. Weiterhin wird es dem Fachmann verständlich sein, dass die Reaktionskomponenten für die Vermarktung separat verpackt werden und dass nützliche, im Handel erhältliche Kits eine beliebige Teilmenge der Reaktionskomponenten enthalten kann, welche die modifizierten Primer der Erfindung einschließen.
Der Begriff „das Komplement zu" oder „das exakte Komplement zu" einer gegebenen Nucleinsäure bezeichnet spezifisch diejenige Nucleinsäure, welche sowohl die gleiche Länge hat, als auch exakt komplementär zur gegebenen Nucleinsäure ist. Daher bezeichnet das Komplement einer Nucleinsäure eine einzelne einzigartig definierte Sequenz.
Die Gensequenz des mutmaßlichen Cytosin-DNA-Methyltransferase(Ng-CDMT)-Gens von N. gonorrhoeae wird in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Die Sequenz entspricht der ORF1-Sequenz, die vorstehend durch Miyada und Born bereitgestellt wird, jedoch mit Korrekturen in der Sequenz. Ein Sequenzierungsfehler in der Sequenz von Miyada und Born führte zu einer fälschlichen Identifizierung eines Stoppcodons stromaufwärts des eigentlichen Stoppcodons und infolgedessen wurde eine verkürzte Version des eigentlichen offenen Leserahmens berichtet. Die nachstehende Sequenz beinhaltet die ersten 1067 Basen des offenen Leserahmens.
Obwohl nur ein Strang (die codierende Sequenz) der Nucleinsäure in Tabelle 1 gezeigt wird, wird der Fachmann erkennen, dass SEQ ID NO: 1 eine Region doppelsträngiger genomischer Nucleinsäure identifiziert und dass die Sequenzen beider Stränge durch die bereitgestellte Sequenzinformation vollständig spezifiziert werden.
Tabelle 1 SEQ ID NO: 1
Die variablen Stellen innerhalb der SEQ ID NO: 1, welche verwendet werden können, um die Sequenz des Ng-CDMT Gens von N. gonorrhoeae zu unterscheiden, sind die Nucleotidpositionen 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683, 702. Diese variablen Positionen werden in Tabelle 1 hervorgehoben und unterstrichen dargestellt.
Die bestimmten abweichenden Nucleotide, die sich an den variablen Stellen innerhalb der zugehörigen Ng-CDMT Sequenz von einigen der neu entdeckten nicht-N. gonorrhoeae-Stämmen finden, werden in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Die gezeigten Sequenzvarianten sind für die meisten der neu entdeckten Stämme repräsentativ. Ein „–" zeigt an, dass das Nucleotid dasselbe wie in SEQ ID NO: 1 ist. Die gezeigten Sequenzen verdeutlichen die Konserviertheit der Sequenz innerhalb der nicht-N. gonorrhoeae-Stämme.
Tabelle 2 Nucleotidposition
Zusätzlich zu den vorstehend gezeigten repräsentativen Sequenzvariationen wurde ein einziges Isolat von N. s. flava entdeckt, welches eine Sequenz enthielt, die sich unter den vorstehenden variablen Positionen von SEQ ID NO: 1 nur an den Positionen 683 und 702 („A" beziehungsweise „G") unterschied. Wegen der geringen Häufigkeit dieses Isolats werden Oligonucleotide, die auf Basis der anderen variablen Positionen unterscheiden, das Auftreten von falsch-positiven Ergebnissen noch signifikant verringern.
N. gonorrhoeae-spezifische Oligonucleotide
Ein Aspekt der Erfindung betrifft Oligonucleotide, die für N. gonorrhoeae spezifisch sind und die Ng-CDMT Gensequenz von N. gonorrhoeae von der entsprechenden Sequenz, die sich in den neu entdeckten Isolaten findet, unterscheidet. Die N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung sind Oligonucleotide, die exakt komplementär zu beiden Strängen der SEQ ID NO: 1 (Zielsequenz) in einer Region sind, die mindestens eine, vorzugsweise mehrere, der vorstehend identifizierten variablen Positionen umfasst. Aufgrund der Nähe der variablen Positionen zueinander, kann typischerweise ein Oligonucleotid gewählt werden, das vielfältige variable Stellen umfasst. Zum Beispiel umfasst der nachstehend beschriebene Amplifizierungsprimer JW80 (SEQ ID NO: 3) die Positionen 618, 621, 627, 630 und 636. Abhängig von der Zahl der variablen Positionen, die mit der hybridisierenden Region und der beabsichtigten Verwendung umfasst werden, haben die N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Länge von etwa 15 bis etwa 50 Nucleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden.
Die N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei Reaktionen, welche auf der selektiven Hybridisierung von Oligonucleotiden beruhen, um Nucleinsäuren von N. gonorrhoeae nachzuweisen oder zu identifizieren. Eine selektive Hybridisierung basiert auf dem Unterschied in der Stabilität von Hybridisierungsduplexstrukturen mit Ziel- und nicht-Ziel-Nucleinsäuresequenzen, die sich im Grad der Komplementarität unterscheiden. Unter ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen sind nur solche Duplexstrukturen stabil, die zwischen dem Oligonucleotid und den Zielsequenzen erzeugt werden. Die Anwesenheit von stabilen Hybridisierungsduplexstrukturen kann durch eine beliebige Anzahl von wohlbekannten Verfahren nachgewiesen werden, wie durch die Verwendung von markierten Oligonucleotiden, d. h. Sonden, oder durch die Fähigkeit, eine Primerverlängerungsreaktion oder Ligierungsreaktion wie in einer Amplifizierungsreaktion durchzuführen.
In einer alternativen Ausführungsform sind die N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen komplementär, d. h. sie enthalten nicht mehr als etwa drei Unterschiede zu jedem Strang der SEQ ID NO: 1 (die Zielsequenz) in einer Region, welche mindestens eine, vorzugsweise mehrere, der variablen Positionen umfasst und welche exakt komplementär zur Zielsequenz an einer oder mehreren umfassten variablen Positionen ist. Da Unterschiede, die an nicht-variablen Positionen auftreten, Unterschiede sowohl zu der N. gonorrhoeae-Zielsequenz als auch zu der nahe verwandten nicht-N. gonorrhoeae nicht-Zielsequenz sind, ist die Abweichung bei der Anzahl der Unterschiede in einer aus der Zielsequenz entstandenen Duplexstruktur und einer aus der entsprechenden nicht-Zielsequenz entstandenen Duplexstruktur dieselbe, wie wenn ein Oligonucleotid verwendet wird, das exakt komplementär zur Zielsequenz ist. In dieser Ausführungsform sind die Hybridisierungsbedingungen ausreichend milde, um die Erzeugung von stabilen Duplexstrukturen mit der Zielsequenz zu erlauben, während die Stringenz ausreichend gehalten wird, um die Entstehung von stabilen Duplexstrukturen mit nicht-Zielsequenzen zu verhindern. Unter solchen ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen wird ein Oligonucleotid, das im Wesentlichen zur N. gonorrhoeae-Zielsequenz in einer Region komplementär ist, die eine oder mehrere variable Positionen umfasst und die exakt komplementär zur Zielsequenz an beliebigen variablen Positionen ist, nur mit der Zielsequenz hybridisieren. Daher liegen Oligonucleotide, die im Wesentlichen zu jedem Strang der SEQ ID NO: 1 (die Zielsequenz) in einer Region komplementär sind, die mindestens eine der variablen Positionen umfasst und die an einer oder mehreren umfassten variablen Positionen exakt komplementär zur Zielsequenz sind, innerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung. Die Verwendung von im Wesentlichen komplementären anstelle von exakt komplementären Oligonucleotiden kann in Testformaten wünschenswert sein, in denen die Optimierung von Hybridisierungsbedingungen begrenzt ist. Da Sequenzunterschiede die Stabilität der Sonde/Ziel-Hybridierungsduplexstruktur verringern und daher die Hybridisierungsbedingungen verändern, die benötigt werden, um eine ausreichende Stringenz für das Testsystem bereitzustellen, kann der Einbau von Unterschieden bei der Entwicklung einer Sonde verwendet werden, um die Stabilität der Duplexstruktur anzupassen, wenn das Testformat die Anpassung der Hybridisierungsbedingungen nicht zulässt. Die Wirkung eines bestimmten eingeführten Unterschieds auf die Stabilität der Duplexstruktur ist wohlbekannt und die daraus folgende Stabilität der Duplexstruktur kann routinemäßig wie vorstehend beschrieben sowohl geschätzt als auch empirisch ermittelt werden.
N. gonorrhoeae-spezifische Oligonucleotide als Amplifizierungsprimer
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine sequenzspezifische Amplifizierung unter Verwendung eines N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotids der vorliegenden Erfindung als Primer durchgeführt. Die Amplifizierungsbedingungen werden so gewählt, dass die Amplifizierung nur dann auftritt, wenn die Zielsequenz in der Probe anwesend ist. Auf diese Art wird die Ng-CDMT Sequenz von N. gonorrhoeae durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifizierungsprodukts identifiziert. Der Nachweis eines amplifizierten Produkts kann durch ein beliebiges der auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren, wie die Analyse durch Gelelektrophorese, durchgeführt werden. Obwohl keine zusätzliche Sequenzanalyse des amplifizierten Produkts benötigt wird, wird der Nachweis vorzugsweise durch Sondenhybridisierung mit einer N. gonorrhoeae-spezifischen Sonde durchgeführt, um einen zusätzlichen Grad an Spezifität bereitzustellen.
Die Hybridisierungsspezifität der Primer ist eine kritische Eigenschaft der Primer, welche eine sequenzspezifische Amplifizierung ermöglicht. Im Allgemeinen ist das 3'-Ende, welches die Primerverlängerungsstelle ist, für die Primerspezifität kritischer, da ein Unterschied am 3'-Ende das 3'-Ende destabilisieren und mit der Primerverlängerung interferieren kann, obwohl der 5'-Anteil des Primers an die Zielsequenz hybridisiert ist. Daher ist es zur Unterscheidung von einzelnen Nucleotidveränderungen in der Sequenz und zur Maximierung der Fähigkeit, mehrfache Nucleotidveränderungen in der Sequenz zu unterscheiden, vorzuziehen, dass die Primersequenz an die Zielsequenz so hybridisiert, dass das 3'-Ende des Primers an oder nahe bei einer variablen Position hybridisiert. Anders ausgedrückt sollte die Region einer Zielsequenz, an die der Primer hybridisiert, vorzugsweise eine variable Position am oder nahe beim 5'-Ende der Region enthalten (das 3'-Ende des Primers bindet an das 5'-Ende der Region der Zielsequenz). Sequenzspezifische Amplifizierung und die Auswirkungen der Primerunterschiede werden beschrieben bei Ugozzoli et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 42–48; Kwok et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 999– 1005 und Kwok et al., 1994, PCR Methods and Applications 3S: 39–47.
Eine zusätzliche Sequenz, die eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym (Restriktionsstellen) enthält, kann dem 5'-Ende eines Primers hinzugefügt werden, ohne die Fähigkeit des Primers, verlängert zu werden, zu beinträchtigen. Die Restriktionsstelle, die in das amplifizierte Produkt eingebaut wird, erleichtert die Klonierung des amplifizierten Produkts zur Verwendung zum Beispiel bei der Sequenzierung (siehe U.S.-Patent Nr. 4.683.195). Typischerweise können Sequenzen mit einer Länge zwischen etwa 2 und etwa 10 Basen, die nicht komplementär zur Zielsequenz sind, an das 5'-Ende der primerhybridisierenden Region angefügt werden, ohne die Fähigkeit der Primer, eine spezifische Amplifizierung der Ng-CDMT Sequenz von N. gonorrhoeae zu katalysieren signifikant zu verändern. Die exakte Länge und Sequenz der angefügten 5'-terminalen Sequenzen wird durch die gewünschte Restriktionsstelle bestimmt. Ein Fachmann wird erkennen, dass eine geringfügige Optimierung der Amplifizierungsbedingungen abhängig von der hinzugefügten Sequenz notwendig sein kann. Ein Fachmann wird jedoch auch erkennen, dass für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren ein Primer, der mit einer zusätzlichen Sequenz am 5'-Ende, die eine Schnittstelle für eine Restriktionsenzym enthält, verlängert wurde, grundsätzlich gleichwertig mit einem nicht verlängerten Primer ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf ein bestimmtes Amplifizierungssystem beschränkt. Im Allgemeinen hängt die Spezifität der auf Primer basierenden Amplifizierungsreaktionen von der Spezifität der Primerhybridisierung ab. Daher können die N. gonorrhoeae-spezifischen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung die Spezifität einer beliebigen auf Primer basierenden Amplifizierungsreaktion einschließlich derjenigen Amplifizierungsverfahren, die in den im vorstehenden Abschnitt „Hintergrund" zitierten Literaturstellen beschrieben werden, verbessern. Wenn andere Systeme entwickelt werden, können diese Systeme von der erhöhten Spezifität der vorliegenden Oligonucleotide profitieren.
Bestimmte Oligonucleotide zur vorzugsweisen Verwendung als PCR-Amplifizierungsprimer werden nachstehend gezeigt. Die Primer stellen eine signifikante Verbesserung gegenüber zuvor beschriebenen Primern dar, dadurch dass sie zwischen der Ng-CDMT Sequenz von N. gonorrhoeae und den Ng-CDMT Sequenzen unterscheiden, die sich in denjenigen Isolaten von nicht-N. gonorrhoeae Arten von Neisseria finden, welche eine Ng-CDMT Sequenz enthalten. Die nachstehend gezeigten Oligonucleotide sind geeignet zur Verwendung als stromaufwärts-Primer in einer PCR. Es wird dem Fachmann klar sein, dass die exakten Komplemente dieser Oligonucleotide als stromabwärts-Primer in einer PCR nützlich sind und weiterhin, dass diese Oligonucleotide oder die exakten Komplemente davon auch als Hybridisierungssonden verwendet werden könnten, um die Ng-CDMT Sequenz von N. gonorrhoeae zu identifizieren. Die Nucleotidsequenzen der Primer werden nachstehend bereitgestellt, dargestellt von links nach rechts in der Orientierung von 5' nach 3'.
N. gonorrhoeae-spezifische Oligonucleotidprimer

JW79 (SEQ ID NO: 2) CATATGTAACAGCAGGTCAGGCC
JW80 (SEQ ID NO: 3) TAACAGCAGGTCAGGCCATATCC
JW87 (SEQ ID NO: 4) CGGTAAAACACGCCGTATGTTC

Diese jeweiligen vorstehend gezeigten Oligonucleotide werden mit geeigneten stromabwärts-Primern gepaart, wenn sie als stromaufwärts-Primer in einer PCR verwendet werden. Der jeweilige verwendete stromabwärts-Primer ist kein kritischer Aspekt der Erfindung. Geeignete stromabwärts-Primer können aus denjenigen ausgewählt werden, die in den zitierten Literaturstellen erwähnt werden oder sie können aus der SEQ ID NO: 1 konstruiert werden, indem die hierin bereitgestellte Anleitung dazu befolgt wird. Bestimmte bevorzugte stromabwärts-Primer zur Verwendung mit den vorstehenden stromaufwärts-Primern sind nachstehend gezeigt. Der Primer SS02 (SEQ ID NO: 5) wird im U.S.-Patent Nr. 5.550.040 beschrieben. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein beliebiges der im '040-Patent beschriebenen Oligonucleotide, so wie die Sonden-Sequenz oder das Komplement eines stromaufwärts-Primers, als stromabwärts-Primer verwendet werden kann. Die nachstehend gezeigten Sequenzen der stromabwärts-Primer JW wurden so gestaltet, dass eine verbesserte Spezifität und Sensitivität der Amplifizierung erhalten wird. Die Nucleotidsequenzen der stromabwärts-Primer werden nachstehend bereitgestellt, dargestellt von links nach rechts in der Orientierung von 5' nach 3'.
N. gonorrhoeae-spezifische stromabwärts-Primer

SS02 (SEQ ID NO: 5) AACAGCATTACCAATCTGGCGAC
JW88 (SEQ ID NO: 6) GACGTACTTCAGTTGTTGATCCG
JW89 (SEQ ID NO: 7) CGACGTACTTCAGTTGTTGATCCG
JW90 (SEQ ID NO: 8) CAGTTGTTGATCCGACAAACTCA

Amplifizierungen werden unter Bedingungen durchgeführt, welche die Amplifizierung der Ng-CDMT Gensequenzen von N. gonorrhoeae ermöglichen, jedoch ausreichend stringent sind, um die Amplifizierung von nicht-Zielsequenzen zu vermeiden. Bevorzugte Bedingungen für die Amplifizierungsreaktion werden in den Beispielen im U.S.-Patent Nr. 5.550.040 und in der Produktbeilage des AMPLICOR^® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)-Tests beschrieben. Die genauen Bedingungen sind kein kritischer Aspekt der Erfindung. Die Optimierung der Amplifizierungsbedingungen kann routinemäßig auf Basis der hierin bereitgestellten Anleitung durchgeführt werden.
Die Primer der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um entweder DNA oder RNA zu amplifizieren. Die Amplifizierung von RNA unter Verwendung einer „reversen" Transkriptions-/Polymerase-Kettenreaktion (RT PCR) ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und beschrieben in den U.S.-Patenten Nr. 5.322.770 und 5.310.652, Myers und Gelfand, 1991, Biochemistry 30 (31): 7661–7666 und Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31 (4): 882–886.
Verfahren zur Probenaufbereitung für die Amplifizierung von Nucleinsäuren aus N. gonorrhoeae werden in den Beispielen, im U.S.-Patent Nr. 5.550.040 und in der Produktbeilage des AMPLICOR^® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)-Tests beschrieben. Das jeweilige verwendete Verfahren ist kein kritischer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ein Fachmann kann geeignete Verfahren zur Probenaufbereitung basierend auf der hierin bereitgestellten Anleitung auswählen und optimieren. Ein geeignetes Probenaufbereitungskit für die Amplifizierung von DNA aus N. gonorrhoeae ist im Handel erhältlich als Teil des AMPLICOR^® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)-Tests.
Die Amplifizierungsprimer und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für eine beliebige Anwendung geeignet, bei der amplifizierte Nucleinsäuren verwendet werden. Zum Beispiel wird die Klonierung und/oder Sequenzierung von N. gonorrhoeae-Sequenzen durch die Verwendung der vorliegenden Primer erleichtert. Verfahren zum Nachweis von durch PCR amplifizierten Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Das Verfahren, das verwendet wird, um die amplifizierten Nucleinsäuren zu analysieren, ist kein kritischer Aspekt der Erfindung und ein beliebiges geeignetes Verfahren kann verwendet werden.
N. gonorrhoeae-spezifische Oligonucleotide als Sonden
Jede der vorstehend beschriebenen variablen Positionen stellt einen einzelnen Basenpaarunterschied dar zwischen der Zielsequenz von N. gonorrhoeae und den nahe verwandten Sequenzen, die sich in den nicht-N. gonorrhoeae-Arten finden. Einzelne Basenpaarunterschiede in der Sequenz können durch differenzielle Hybridisierung der Oligonucleotidsonden nachgewiesen werden. Die an die Sonde hybridisierende Sequenz und die sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen werden so ausgewählt, dass ein einzelner Unterschied an der polymorphen Stelle die Hybridisierungsduplexstruktur ausreichend destabilisiert, so dass sie sich effektiv nicht ausbildet. Die Hybridisierungsbedingungen hängen von der exakten Größe und Sequenz der Sonde ab und können empirisch ausgewählt werden unter Verwendung der hierin und durch den Stand der Technik bereitgestellten Anleitung. Die Verwendung von Oligonucleotidsonden, zum Nachweis einzelner Basenpaarunterschiede wird bei Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278–282 beschrieben, was hier als Verweis eingebunden wird.
Der proportionale Unterschied in der Stabilität zwischen einer perfekt passenden und einer um eine Base fehlgepaarte Duplexstruktur hängt unter anderem von der Länge der hybridisierten Oligonucleotide ab. Duplexstrukturen, die aus kürzeren Sondensequenzen erzeugt werden, werden durch die Gegenwart eines Unterschieds proportional stärker destabilisiert. In der Praxis werden Oligonucleotide mit einer Länge zwischen 15 und 35 Nucleotiden für den sequenzspezifischen Nachweis bevorzugt. Weiterhin destabilisiert ein Unterschied an jedem Ende die Hybridisierungsduplexstruktur weniger als ein im Inneren vorkommender Unterschied, da die Enden eines hybridisierten Oligonucleotids aufgrund der thermischen Energie eine kontinuierliche zufällige Dissoziation und Wiedervereinigung durchlaufen. Zur Unterscheidung einer einzelnen Basenpaarveränderung in der Zielsequenz wird die Sondensequenz, die an die Zielstruktur hybridisiert, vorzugsweise so ausgewählt, dass die polymorphe Stelle in der inneren Region der Sonde vorkommt.
Der Unterschied in der Stabilität zwischen einer perfekt passenden und einer fehlgepaarten Hybridisierungsduplexstruktur hängt auch von der Anzahl der Unterschiede in der fehlgepaarten Hybridisierungsduplexstruktur ab. Wegen der Nachbarschaft der variablen Positionen werden solche Sonden konstruiert, welche mit Leichtigkeit vielfache Positionen umfassen und sind wegen des größeren Stabilitätsunterschieds bevorzugt. Der größere Stabilitätsunterschied erlaubt auch die Verwendung von längeren Hybridisierungssonden, was die Zielspezifität erhöht, während die Fähigkeit zur Unterscheidung gegenüber der nächsten nicht-Zielsequenz beibehalten wird. Sonden, die vielfache variable Positionen umfassen, können eine Länge von mindestens etwa bis zu 50 Nucleotiden haben.
Die vorstehenden Kriterien zur Auswahl einer Sondensequenz, die an SEQ ID NO: 1 hybridisiert, treffen auf die hybridisierende Region der Sonde, d. h. den Teil der Sonde zu, der an der Hybridisierung mit der Zielsequenz beteiligt ist. Eine Sonde kann an eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz wie einen poly-T-Schwanz zur Immobilisierung der Sonde gebunden werden, ohne dass die Hybridisierungseigenschaften der Sonde signifikant verändert werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass eine Sonde für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren, die an eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz gebunden ist, welche zur Zielsequenz nicht komplementär und daher nicht an der Hybridisierung beteiligt ist, grundsätzlich gleichwertig zur ungebundenen Sonde ist.
Vorzugsweise wird eine Nucleinsäuresequenz aus der Sequenz des Ng-CDMT Gens von N. gonorrhoeae, welche eine oder mehrere variable Positionen enthält, vor der Hybridisierung mit Oligonucleotidsonden unter geeignet stringenten Hybridisierungsbedingungen amplifiziert. Die Amplifizierung wird ausgeführt, um ausreichend Nucleinsäure für die Analyse durch Sondenhybridisierung bereitzustellen. In dieser Ausführungsform stellt die gleichzeitige Amplifizierung von verwandten nicht-Zielsequenzen kein Problem in dieser Ausführungsform dar, da die Sequenzspezifität durch den Schritt der Sondenhybridisierung gewährleistet wird. Daher sind jegliche Primer, die eine die variable Positionen umfassende Region des Ng-CDMT Gens von N. gonorrhoeae amplifizieren, geeignet.
Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäure
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhalten entweder die Amplifizierung einer Region des Ng-CDMT Gens, gefolgt vom Nachweis unter Verwendung einer N. gonorrhoeae-spezifischen Sonde der vorliegenden Erfindung oder die Amplifizierung einer Region des Ng-CDMT Gens unter Verwendung eines N. gonorrhoeae-spezifischen Primers der vorliegenden Erfindung, gefolgt vom Nachweis der amplifizierten Nucleinsäure, vorzugsweise unter Verwendung einer Sonde. Verfahren zum Nachweis der Zielnucleinsäure durch Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotidsonden sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Das jeweilige Format des Tests ist kein kritischer Aspekt der Erfindung. Geeignete Testformate zum Nachweis der Hybridisierung von Zielmolekül und Sonde schließen das „Dot-Blot"- und das umgekehrte „Dot-Blot"-Testformat ein.
In einem „Dot-Blot"-Format wird die amplifizierte Ziel-DNA auf einem festen Träger wie einer Nylonmembran immobilisiert. Man lässt den Komplex aus Membran und Zielmolekül mit der markierten Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen reagieren, die nicht hybridisierte Sonde wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt und die Membran wird auf die Anwesenheit von gebundener Sonde untersucht. Der „Dot-Blot"-Nachweis der durch PCR amplifizierten Produkte wird zum Beispiel bei Saiki et al., 1986, Nature 324: 163–166 und im U.S.-Patent Nr. 5.468.613 beschrieben.
Im umgekehrten „Dot-Blot"-Format werden die Sonden auf einem festen Träger wie einer Nylonmembran immobilisiert und die amplifizierte Ziel-DNA wird markiert. Die Ziel-DNA wird typischerweise während der Amplifizierung durch den Einbau von markierten Primern markiert. Einer der beiden oder beide Primer können markiert sein. Man lässt den Komplex aus Membran und Sonde mit der markierten amplifizierten Ziel-DNA unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen reagieren, nicht hybridisierte Ziel-DNA wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt und der Filter wird dann auf die Anwesenheit von gebundener Ziel-DNA untersucht. Umgekehrte „Dot-Blot"-Verfahren werden zum Beispiel bei Saiki et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230 und im U.S.-Patent Nr. 5.468.613 beschrieben.
Alternativ kann der umgekehrte „Dot-Blot"-Test durchgeführt werden, indem ein fester Träger verwendet wird, der eine Vielzahl von Stellen oder Vertiefungen zur Sondenhybridisierung aufweist. Zum Beispiel ist eine Mikrotiterplatte besonders bei klinischen Anwendungen der vorliegenden Verfahren im großen Maßstab nützlich. Sonden können in einer Mikrotiterplatte entweder durch passive Bindung oder durch ein Protein-Intermediat wie Serumalbumin (BSA), welches an der Mikrotiterplatte anhaftet, immobilisiert werden (siehe Tung et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 464–465). Umgekehrte „Dot-Blot"-Verfahren zum Nachweis einer amplifizierten N. gonorrhoeae-Sequenz, die in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden, werden im U.S.-Patent Nr. 5.550.040 und in der Produktbeilage des AMPLICOR^® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)-Tests beschrieben. Die Verwendung eines Mikrotiterplattentests wird in den Beispielen näher beschrieben.
Alternativ werden mit BSA konjugierte Sonden an magnetische Mikropartikel gebunden. Die gebundenen Sonden werden in Lösung mit dem markierten Amplifizierungsprodukt hybridisiert und die entstehenden Hybridisierungsduplexstrukturen werden magnetisch aus der Lösung entfernt. Die magnetisch immobilisierten Hybridisierungsduplexstrukturen werden dann wie in den vorstehenden Verfahren beschrieben nachgewiesen.
Ein anderes geeignetes, als 5'-Nuclease-Test bezeichnetes Testverfahren wird in den U.S.-Patenten Nr. 5.210.015 und 5.487.972 und bei Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280, beschrieben. Im 5'-Nuclease-Test werden markierte Nachweissonden, während der Amplifizierung zum Reaktionsgemisch zugegeben, welche so modifiziert wurden, dass die Sonden daran gehindert werden, als Primer für die DNA-Synthese zu dienen. Eine beliebige Sonde, die während jedes Syntheseschritts, d. h. während der Primerverlängerung, an die Ziel-DNA hybridisiert, wird durch die 5'- nach 3'-Exonucleaseaktivität der DNA-Polymerase, z. B. Taq-DNA-Polymerase, abgebaut. Das Abbauprodukt der Sonde wird dann nachgewiesen. Daher zeigt die Anwesenheit des Abbauprodukts der Sonde an, dass sowohl die Hybridisierung zwischen der Sonde und der Ziel-DNA, als auch die Amplifizierungsreaktion stattgefunden hat. Die U.S.-Patente Nr. 5.491.063 und 5.571.673 beschreiben verbesserte Verfahren zum Nachweis des Abbaus der Sonde, welcher gleichzeitig mit der Amplifizierung auftritt.
Die vorstehend beschriebenen Testformate verwenden typischerweise Oligonucleotide, um den Nachweis der Hybridduplexstrukturen zu erleichtern. Oligonucleotide können durch den Einbau einer Markierung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Verfahren nachweisbar ist, markiert werden. Nützliche Markierungen beinhalten ³²P, Fluoreszenzfarbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (wie sie üblicherweise in ELISAs verwendet werden), Biotin oder Haptene und Proteine für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind. Markierte Oligonucleotide der Erfindung können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden synthetisiert und markiert werden.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Amplifizierung von Nucleinsäure aus N. gonorrhoeae durch Beobachtung der Erhöhung der Gesamtmenge doppelsträngiger DNA im Reaktionsgemisch wird bei Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10: 413–417, Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026–1030 und in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 512.334 beschrieben. Der Nachweis der doppelsträngigen Ziel-DNA beruht auf der erhöhten Fluoreszenz, die Ethidiumbromid (EtBr) und andere DNA-bindende Farbstoffe aufweisen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Die DNA-bindende Markierung wird zum Amplifizierungsreaktionsgemisch gegeben. Eine Amplifizierung der Zielsequenz führt zu einer Erhöhung der Menge doppelsträngiger DNA, was zu einer nachweisbaren Erhöhung der Fluoreszenz führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, Multigefäß-Einheiten, nützliche Komponenten zur praktischen Durchführung des vorliegenden Verfahrens beinhaltend. Ein nützlicher Kit enthält Oligonucleotide der vorliegende Erfindung wie – abhängig von der beabsichtigten Verwendung – N. gonorrhoeae-spezifische Primer oder N. gonorrhoeae-spezifische Sonden. Andere wahlweise Komponenten des Kits beinhalten zum Beispiel Amplifizierungsreagenzien, wie ein Agens zur Katalyse der Synthese von Primerverlängerungsprodukten, die Substrat-Nucleosidtriphosphate, zur Markierung verwendete Mittel (zum Beispiel ein Avidin-Enzymkonjugat und Enzymsubstrat und Chromogen, wenn die Markierung Biotin ist), die geeigneten Puffer für die PCR oder Hybridisierungsreaktionen und Anweisungen zur Ausführung des vorliegenden Verfahrens.
Beispiel 1
Reaktionsprotokolle
Dieses Beispiel beschreibt die Reaktionsprotokolle für die Amplifizierung und den Nachweis von DNA aus N. gonorrhoeae, welche in den folgenden Beispielen verwendet wurden.
Probenvorbereitung
Rachenabstrichproben wurden wie folgt unter Verwendung des AMPLICOR^TM STD Abstrichproben-Sammel- und Transportkits (Roche Diagnostics Systems, Branchburg, NJ) gesammelt. Rachenabstrichproben wurden in ein Probentransportmedium (STM) bestehend aus 0,4% Natriumdodecylsulfat und 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 gegeben. Die Abstrichstäbchen wurden kräftig in STM für 15 Sekunden bewegt, die Flüssigkeit wurde gegen die Seite des Röhrchens ausgedrückt und die Abstrichstäbchen wurden entfernt.
Vor der Amplifizierung wurde die Probe für 10 Min auf 95°C erhitzt, um die Zellen zu lysieren, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit einem gleichen Volumen von Probenverdünnungslösung (SD) bestehend aus 20% Tween-20 (Polyoxyethylen-Monolaurylsorbitan), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,10% Natriumazid vermischt. Die Probe wurde dann für 5–10 Sekunden gevortext und bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten (aber nicht länger als 2 Stunden) belassen.
Proben von Zellen wurden vorbereitet wie es für die Rachenabstrichproben beschrieben wurde.
Gereinigte DNA-Proben wurden in einem gleichen Volumen STM und SD verdünnt und bei Raumtemperatur ohne Erhitzen belassen.
Amplifizierung
Jede Amplifizierung wurde durchgeführt, indem zwei Primerpaare verwendet wurden, um die gleichzeitige Amplifizierung von Nucleinsäuren aus Chlamydia trachomatis und N. gonorrhoeae zu ermöglichen. Die Primer CP24 und CP27, spezifisch für die Amplifizierung von DNA aus C. trachomatis, wurden bei allen Reaktionen eingeschlossen. Für die Amplifizierung von N. gonorrhoeae wurde ein Primerpaar verwendet, bestehend aus einem stromaufwärts-Primer ausgewählt aus SS01, JW79 (SEQ ID NO: 2) oder JW80 (SEQ ID NO: 3) zusammen mit dem stromabwärts-Primer SS02. Die Primer CP24, CP27, SS01 und SS02 werden in vollem Umfang im U.S.-Patent Nr. 5.550.040 beschrieben.
PCR-Amplifizierungen wurden in einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl ausgeführt, bestehend aus 50 μl Proben-DNA oder klinischen Proben, die zu 50 μl Reaktionsgemisch gegeben wurden. Die Endkonzentrationen in der Reaktion waren wie folgt:
25 pmol von jedem Primer
50 μM jeweils von dATP, dCTP und dGTP
150 μM dUTP
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,3
1,5 mM MgCl₂
10% Glycerin
5 U Taq-DNA-Polymerase
2 U Uracil-N-Glycosylase
Die Reaktionen wurden in einem GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt unter Verwendung der folgenden Thermocycler-Bedingungen:
Nachweis
Das amplifizierte Produkt wurde in Mikrotiterplattentests nachgewiesen unter Verwendung der C. trachomatis-spezifischen Sonde CP35 und der N. gonorrhoeae-spezifischen Sonde SS06-T5 unter Verwendung des hochstringenten Hybridisierungspuffers (4,0 M NaSCN) wie im U.S.-Patent Nr. 5.550.040 beschrieben. Signale (gemessen bei 450 nm), die geringer oder gleich 0,25 waren, wurden als negativ gewertet, Signale zwischen 0,25 und 1,0 wurden als uneindeutig gewertet und Signale, die größer als 1,0 waren, wurden als positiv gewertet.
Beispiel 2
Spezifität innerhalb der Gattung Neisseria
Um die Spezifität der Primerpaare zu prüfen, wurden Amplifizierungen unter Verwendung der gereinigten Ziel-DNA oder Verdünnungen von Zellen von verschiedenen Stämmen der Neisseria-Arten durchgeführt. Die Proben wurden in doppelt angelegten Reaktionen amplifiziert und in Hybridisierungstests in Mikrotiterplatten unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Protokolle geprüft. Proben von Zellen und gereinigte DNA-Proben enthielten mindestens 10⁶ Kopien der Ziel-DNA mit der Ausnahme, dass eine Probe von N. gonorrhoeae auch bei einer Konzentration von 100 Kopien pro Reaktion verwendet wurde.
Die folgenden Primerpaare wurden verglichen:

stromaufwärts-Primer stromabwärts-Primer

SSS01 SS02 (SEQ ID NO: 5)

JW79 (SEQ ID NO: 2) SS02 (SEQ ID NO: 5)

JW80 (SEQ ID NO: 3) SS02 (SEQ ID NO: 5)
Amplifizierte Proben wurden durch Hybridisierung mit der N. gonorrhoeae-spezifischen Sonde in einem Mikrotiterplattentest wie in Beispiel 1 beschrieben überprüft. Die Ergebnisse der Hybridisierungen werden in der nachstehenden Tabelle vorgestellt. Positive, uneindeutige und negative Signale werden mit „+", „+/–" beziehungsweise „–" bezeichnet.
Die Nomenklatur von N. subflava wurde nicht vollständig geklärt. Eine Klassifizierung, die immer noch in einigen derzeitigen Literaturstellen verwendet wird, sieht N. subflava, N. perflava und N. flava als separate Arten an. Seit 1974 wurden die Arten N. subflava, N. perflava und N. flava als Varianten einer einzelnen Art, nämlich N. subflava, neu klassifiziert. Diese Varianten von N. subflava werden als drei Biotypen von N. subflava charakterisiert (Biotyp subflava, Biotyp flava und Biotyp perflava), die biochemisch und mikrobiologisch unterschieden werden können. Die Nomenklatur von N. subflava, die in der Tabelle verwendet wird folgt dieser Konvention. Jene Isolate, für die der Biotyp nicht bestimmt wurde, werden als N. subflava bezeichnet.
N. gonorrhoeae wurde unter Verwendung aller drei Primerpaare nachgewiesen. Die erfolgreiche Amplifizierung von 100 Kopien des Zielmoleküls zeigt an, dass die Primer der vorliegenden Erfindung eine äquivalente Sensitivität liefert.
Bei Verwendung der Primer SS01 und SS02 (SEQ ID NO: 5) wurden falsch-positive Ergebnisse bei 2/5 der Stämme von N. cinerea und 5/15 der Stämme von N. subflava beobachtet. Die Verwendung von JW79 (SEQ ID No: 2) als den stromaufwärts-Primer eliminierte alle falsch-positiven Ergebnisse, obwohl ein uneindeutiges Ergebnis von einem der Isolate von N. subflava beobachtet wurde. Die Verwendung von JW80 (SEQ ID NO: 3) als den stromaufwärts-Primer eliminierte alle falsch-positiven Ergebnisse.
Beispiel 3
Spezifität mit Rachenabstrichproben
Von normalen Freiwilligen erhaltene Rachenabstrichproben wurden wie in Beispiel 1 beschrieben vorbereitet. Alle Proben waren frei von einer Infektion mit N. gonorrhoeae, was durch einen unabhängigen Test bestimmt wurde. Amplifizierungen wurden unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Primerkombinationen durchgeführt. Amplifizierte Proben wurden sowohl durch Gelelektrophorese als auch durch Hybridisierung mit den N. gonorrhoeae- und den C. trachomatis-spezifischen Sonden in Mikrotiterplattentests wie in Beispiel 1 beschrieben geprüft.
Alle Proben waren negativ für DNA aus C. trachomatis. Die aus den Hybridisierungen mit N. gonorrhoeae-spezifischen Sonden erhaltenen Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle vorgestellt. Positive, uneindeutige und negative Signale werden mit „+", „+/–" beziehungsweise „–" bezeichnet.
Unter Verwendung der Primer SS0l und SS02 (SEQ ID NO: 5) wurden falsch-positive Ergebnisse von 10/23 der klinischen Rachenabstrichproben beobachtet. Die Verwendung von JW79 (SEQ ID NO: 2) als den stromaufwärts-Primer eliminierte alle falsch-positiven Ergebnisse. Die Verwendung von JW80 (SEQ ID NO: 3) als den stromaufwärts-Primer eliminierte alle falsch-positiven Ergebnisse, obwohl ein uneindeutiges Ergebnis von einer Probe beobachtet wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Neisseria gonorrhoeae-spezifisches Oligonucleotid, wobei das Oligonucleotid aus einer Nucleotidsequenz mit einer Länge zwischen 15 und 50 Nucleotiden besteht, die im Wesentlichen komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement in einer Region, die eine Nucleotidposition umfasst, die ausgewählt ist aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702; und wobei die Sequenz exakt komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement an jeder Nucleotidposition, ausgewählt aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702, die von der Region umfasst sind, und wobei die Nucleotidsequenz nicht mehr als 3 Unterschiede zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement, umfasst von der Region, enthält.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid aus einer Nucleotidsequenz besteht, die exakt komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement in einer Region, die eine Nucleotidposition umfasst, die ausgewählt ist aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei die Region zwei Nucleotidpositionen umfasst, die ausgewählt sind aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei die Region eine 5'-terminale Position hat, die ausgewählt ist aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, das JW79 (SEQ ID NO: 2), JW80 (SEQ ID NO: 3) oder JW87 (SEQ ID NO: 4) ist.
Oligonucleotid-Primerpaar, bestehend aus einem Oligonucleotid nach Anspruch 5 und einem Oligonucleotid, das SS02 (SEQ ID NO: 5), JW88 (SEQ ID NO: 6), JW89 (SEQ ID NO: 7) oder JW90 (SEQ ID NO: 8) ist.
Kit zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Nucleinsäure, wobei der Kit ein Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Kit zum Amplifizieren von Neisseria gonorrhoeae-Nucleinsäure, wobei der Kit ein Paar von Oligonucleotid-Primern nach Anspruch 6 umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Nucleinsäure, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines Primerpaares, wobei das Primerpaar einen Neisseria gonorrhoeae-spezifischen Primer umfasst, der aus einer Nucleotidsequenz besteht, die im Wesentlichen komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement in einer Region, die eine Nucleotidposition umfasst, die ausgewählt ist aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702; und wobei die Sequenz exakt komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement an jeder Nucleotidposition, ausgewählt aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702, die von der Region umfasst sind, und wobei die Nucleotidsequenz nicht mehr als 3 Unterschiede zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement, umfasst von der Region, enthält; und (b) Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Nucleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Neisseria gonorrhoeae-spezifische Primer aus einer Nucleotidsequenz besteht, die exakt komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder deren Komplement in einer Region, die eine Nucleotidposition umfasst, die ausgewählt ist aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Region zwei Nucleotidpositionen umfasst, die ausgewählt sind aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Region eine 5'-terminale Position hat, die ausgewählt ist aus den Nucleotidpositionen Nummer 618, 621, 627, 630, 636, 653, 654, 669, 678, 681, 683 und 702.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Neisseria gonorrhoeae-spezifische Primer JW79 (SEQ ID NO: 2), JW80 (SEQ ID NO: 3) oder JW87 (SEQ ID NO: 4) ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Primerpaar aus einem Neisseria gonorrhoeae-spezifischen Primer, der JW79 (SEQ ID NO: 2), JW80 (SEQ ID NO: 3) oder JW87 (SEQ ID NO: 4) ist, und aus einem Primer, der SS02 (SEQ ID NO: 5), JW88 (SEQ ID NO: 6), JW89 (SEQ ID NO: 7) oder JW90 (SEQ ID NO: 8) ist, besteht.