DE69532984T2

DE69532984T2 - Verfahren zur Koamplifikation einer Zielnukleinsäure unter Versendung eines Volumenabscheidungsmittel in der Reaktionszusammensetzung, Testsatz und Testvorrichtung

Info

Publication number: DE69532984T2
Application number: DE69532984T
Authority: DE
Inventors: John Wesley Williamson Backus
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2015-09-15
Also published as: CA2158486A1; EP0702090B1; PT702090E; EP0702090A2; DE69532984D1; DK0702090T3; ATE266102T1; JPH08103300A; US5705366A; EP0702090A3; JP3802110B2; CA2158486C; ES2219655T3

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren für die gemeinsame Vervielfältigung von zwei oder mehr doppelsträngigen Nukleinsäuren unter Verwendung eines Volumenausschlußmittels in dem Reaktionsgemisch, und wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eines Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist. Es betrifft auch eine Reaktionszusammensetzung, ein Testkit und eine Testvorrichtung, die für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist.
Hintergrund der Erfindung
Der Nachweis von Nukleinsäuren ist in den letzten Jahren als Mittel für den frühen Nachweis genomischer Merkmale, infektiöser Agentien und verschiedener Organismen, die in sehr kleinen Mengen in einer menschlichen oder tierischen Probe vorhanden sind, angewachsen. Die Nachweisverfahren beruhen normalerweise auf dem Konzept der Komplementarität wobei DNA-Stränge durch Wasserstoffbrückenbindungen und andere Kräfte zwischen den komplementären Nukleotiden (die als Nukleotidpaare bekannt sind) zusammengebunden werden.
Ein DNA-Molekül ist normalerweise recht stabil aber die Stränge können unter bestimmten Bedingungen wie durch Hitze getrennt oder denaturiert werden. Die denaturierten Stränge werden nur mit einem anderen Strand reassoziieren, der eine komplementäre Nukleotidssequenz aufweist.
Umfangreiche Untersuchungen sind durchgeführt worden, um Wege zu finden um nur wenige Moleküle eine DNA nachzuweisen. Verschiedene Verfahren sind bekannt und sind für nahezu ein Jahrzehnt verwendet worden, um die Zahl der Nukleinsäuren in einer Probe für den Nachweis zu vervielfältigen oder stark zu multiplizieren. Solche Vervielfältigungsverfahren umfassen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = „Polymerase chain reaction"), die Ligase-Kettenreaktion (LCR = „Ligase chain reaction") und andere, die weniger entwickelt sind.
Die PCR ist die bekannteste und beinhaltet die Hybridisierung von Primern an die Stränge einer Zielnukleinsäure in der Gegenwart eines DNA-Polymerisierungsmittels und von Deoxyribonukleotidtriphosphaten unter geeigneten Bedingungen. Das Ergebnis ist die Bildung eines Primerverlängerungsprodukts über mehrere Zyklen und die exponentielle Vervielfältigung der Zahl der ursprünglichen Zielstränge. Weitere Details über die PCR können unter Zuhilfenah me der US-A-4,683,195 (Mullis et al.), der US-A-4,683,202 (Mullis) und der US-A-4,965,188 (Mullis et al.) erhalten werden.
Menschliche und tierische Proben enthalten viele verschiedene Nukleinsäuren von denen einige für die Person oder das Tier endogen (oder natürlich) sind und andere die aufgrund irgendeines anormalen Zustands wie durch die Gegenwart eines infektiösen Mittels oder eines onkogenen Zustands hergestellt werden. Solche Nukleinsäure sind üblicherweise im Vergleich zu endogenen Nukleinsäuren in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden. Sie werden manchmal als Nukleinsäuren „niedriger Kopienzahl" bezeichnet. Im Vergleich dazu sind die endogenen Nukleinsäuren üblicherweise in hohen Konzentrationen vorhanden und können als Nukleinsäuren „hoher Kopienzahl" bezeichnet werden. Ein solches Beispiel ist die menschliche β-Globin DNA.
Häufig werden bei der Verwendung von PCR zwei oder mehr Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, zum selben Zeitpunkt in demselben Reaktionsbehälter vervielfältigt. Dies wird hierin als „gemeinsame Vervielfältigung" bezeichnet. Dieses Verfahren erfordert es, daß für jede Nukleinsäure, die vervielfältigt werden soll, Primer gleichzeitig in dem Behälter vorhanden sind.
Wenn sowohl Zielnukleinsäuren hoher und niedriger Kopienzahl vervielfältigt werden, wird in solchen Situationen häufig die Vervielfältigung der Nukleinsäure niedriger Kopienzahl behindert. Dies liegt an der Sättigung des vervielfältigenden Enzyms (wie einer DNA-Polymerase) durch die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl während der späteren Zyklen der Vervielfältigung. Falsch negative Ergebnisse im Hinblick auf die Gegenwart der Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl sind wahrscheinlich mit möglicherweise schweren Auswirkungen.
Für die PCR sind verschiedene Lösungen für dieses Problem vorgeschlagen worden, die die Anpassung der Konzentration der Primer, der Verwendung von Primergruppen mit spezifischen Schmelztemperaturen (Tm) oder Kombinationen davon umfassen. Die Anpassung der Primerverhältnisse ist im Stand der Technik als „Primerverzerrung" der PCR-Ausbeute bezeichnet worden und erfordert eine Verringerung der Konzentration der Primer für die Zielnukleinsäuren hoher Kopienzahl. Mit diesem Ansatz wird nur eine bescheidende Kontrolle des Verfahrens erreicht.
Ein weiterer Ansatz für die gemeinsame Vervielfältigung war es, die Temperatur der Anlagerung in der PCR so anzupassen, daß sich die Primer für die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl in einem geringeren Ausmaß anlagern als die für die Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl. Dieses Ansatz birgt auch ein Problem. Der T_m-Unterschied zwischen den Primerpaaren muß relativ groß sein, bevor eine gute Modulation der PCR im Hinblick auf die unterschiedlichen Ausbeuten für die Nukleinsäuren hoher und niedriger Kopienzahl ausgeübt werden kann. Die exakten T_m können nicht berechnet werden (obwohl sie abgeschätzt werden können) und müssen daher gemessen werden. Dies erfordert einen hohen Grad des Aufwands und eine beachtenswerte Mühe.
Alle diese Ansätze um die gemeinsame Vervielfältigung zu beeinflussen, erfordern, daß die Zielnukleinsäuresequenzen der hohen und der niedrigen Kopienzahl bekannt sind.
Andernfalls kann das Hinzufügen zu den Primern- oder dem Verlängerungsschritt in späteren PCR-Zyklen die DNA-Polymerasesättigung durch die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl verringern und die Vervielfältigungseffizienz erhöhen. Diese Lösung weist jedoch eine beschränkte Verwendbarkeit in Situation auf, bei denen viele Nukleinsäuren, die in verschiedenen Konzentrationen vorhanden sind, gleichzeitig vervielfältigt werden.
Es ist bekannt, daß die Hybridisierungsrate der Nukleinsäuren in der Gegenwart von Volumenausschlußmitteln wie Dextransulfat oder Polyethylenglycol aufgrund des Ausschlusses von Nukleinsäuren aus dem Lösungsvolumen, das durch diese Mittel besetzt wird, erhöht wird [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Seite 9.50, 1989, und US-A-5,106,730 (Van Ness et al.)]. Dieser Ausschlußeffekt erhöht die effektive Konzentration der Nukleinsäuren in der Lösung wodurch die Hybridisierungsrate erhöht wird. Daher werden solche Materialen routinemäßig zu Reaktionsgemischen hinzugefügt, um weniger bevorzugte Reaktion vorwärts zu „treiben". Beispielsweise werden sie zu Reaktionsgemischen hinzugefügt, um die Ligasereaktion „voran zu treiben", US-A-5,185,243 (Ullman et al.) und US-A-5,194,370 (Berninger et al.).
Während jedoch die Hybridisierungsraten durch Volumenausschlußmittel erhöht werden, wird ihre Wendung durch Sambrook et al. nicht empfohlen, wenn nicht die Rate der Hybridisierung normal langsam ist oder die Nukleinsäure in der Reaktion geschwindigkeitsbegrenzend ist. Andernfalls ist es bekannt, daß die Mittel manchmal zu hohen Hintergründen führen und daß die sich ergebende Lösung aufgrund hoher Viskosität schwieriger zu handhaben sind. Daher würde der Stand der Technik nahelegen, daß Volumenausschlußmittel auf bestimmte Hybridisierungsmittel beschränkt sind und wie die oben erwähnten Patente zeigen, werden sie in der Praxis nur bei Gelegenheiten verwendet, bei den nicht bevorzugte Reaktionen vorwärts „getrieben" werden müssen, da sie andernfalls nicht mit vertretbaren Geschwindigkeiten ablaufen würden. Sugimoto et al., Analytical Biochemistry, Ausgabe 211, 1993, 170–172 zeigen ein Verfahren für die gemeinsame Vervielfältigung zweier Zielnukleinsäuren, wobei eine davon im Hinblick auf die andere in verschiedenen Verhältnissen (umfassend eine „niedrige Kopienzahl") vorhanden ist.
Es wäre wünschenswert eine schnelle und effiziente Vervielfältigung einer oder mehrerer Zielnukleinsäuren zu erreichen, wenn sie in der Gegenwart von einer oder mehreren anderen Zielnukleinsäuren gemeinsam vervielfältigt werden in einer Weise, die die oben erwähnten Probleme ausräumt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die oben erwähnten Probleme werden durch ein Verfahren für die gemeinsame Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren ausgeräumt, wobei das Verfahren mindestens 15 erste Vervielfältigungszyklen umfaßt, wobei jeder erste Vervielfältigungszyklus die aufeinanderfolgenden Schritte:

A) das Erhitzen eines Reaktionsgemisches aus zwei oder mehr Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte bei einer ersten Temperatur T₁ zur Denaturierung der Stränge der Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte,
B) das Primen der denaturierten Stränge mit einer Gruppe von Primern, die spezifisch für und hybridisierbar mit den entgegengesetzten Strängen jeder Zielnukleinsäure, die vervielfältigt werden soll, sind, durch Abkühlen auf eine zweite Temperatur T₂ und
C) entweder als Fortsetzung des Schritts B) oder in einem getrennten Schritt das Bilden eines Primerverlängerungsproduktes in einem Reaktionsgemisch aus PCR-Reagenzien durch die Inkubation bei einer dritten Temperatur T₃ umfaßt, vorausgesetzt, daß, wenn das Primen und das Bilden des Primerverlängerungsproduktes im selben Schritt ausgeführt wird T₂ und T₃ gleich sind,

Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren für die gemeinsame Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren und den Nachweis von einer oder mehr Zielnukleinsäuren zur Verfügung wobei das Verfahren mindestens 15 erste Vervielfältigungszyklen umfaßt, wobei jeder erste Vervielfältigungszyklus die aufeinanderfolgenden Schritte:

A) das Erhitzen eines Reaktionsgemisches aus zwei oder mehr Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte auf eine erste Temperatur T₁ zur Denaturierung der Stränge der Zielnukleinsäure oder ihrer Primerverlängerungsprodukte,
B) das Primen der denaturierten Stränge mit einer Gruppe von Primern, die spezifisch für und hybridisierbar mit dem entgegengesetzten Strängen jeder Zielnukleinsäure, die amplifiziert werden soll, sind, durch Abkühlen auf eine zweite Temperatur T₂,
C) entweder als Fortsetzung des Schritts B) oder in einem separaten Schritt das Bilden von Primerverlängerungsprodukten in einem Reaktionsgemisch aus PCR-Reagenzien durch Inkubation bei einer dritten Temperatur T₃ unter der Voraussetzung, daß, wenn das Primen und die Primerverlängerungsproduktbildung im selben Schritt ausgeführt werden T₂ und T₃ gleich sind, wobei das Reaktionsgemisch in mindestens einem der ersten Vervielfältigungszyklen mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht-ionischen polymeren Volumenausschlußmittels umfaßt, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Ko pienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und
D) nach dem letzten ersten Vervielfältigungszyklus das Nachweisen einer oder mehrerer der Primerverlängerungsprodukte als Hinweis auf eine oder mehrere der Zielnukleinsäuren umfaßt.

Darüber hinaus ein Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und wobei das Verfahren eine Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung verwendet, die auf einen pH von etwa 7,5 bis etwa 9 gepuffert ist, welche:
ein oder mehrere Primergruppen,
eine thermostabile DNA-Polymerase,
eine Vielzahl von dNTP's und
mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht-ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels,
umfaßt.
Ein Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und wobei das Verfahren ein Testkit verwendet, das einzeln verpackt:

a) eine Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung, die auf einem pH von etwa 7,5 bis etwa 9 gepuffert ist und die: ein oder mehrere Primergruppen, eine thermostabile DNA-Polymerase, eine Vielzahl von dNTP's und mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht-ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels, umfaßt und
b) ein Fängermittel, das ein Oligonukleotid, das auf einem wasserunlöslichem Substrat immobilisiert ist, umfaßt,

Des weiteren ein Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und wobei das Verfahren eine in sich geschlossene Testvorrichtung verwendet, die in getrennten Abteilungen:

a) eine Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung, die auf einen pH von etwa 7,5 bis 9 gepuffert ist und die: eine oder mehrere Primergruppen, eine thermostabile DNA-Polymerase, eine Vielzahl von dNTP's und mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht-ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels, umfaßt und
b) ein Fängermittel, das ein Oligonukleotid, das auf einem wasserunlöslichen Substrat immobilisiert ist, umfaßt,

Die vorliegende Erfindung stellt ein sehr schnelles und effizientes Verfahren für die bevorzugte Vervielfältigung einer Nukleinsäure in einem Gemisch aus einer oder mehreren Nukleinsäuren, die gemeinsam amplifiziert werden, zur Verfügung. Die Erfindung wird verwendet, um vorzugsweise Zielnukleinsäuren niedriger Kopienzahl anstelle von Zielnukleinsäuren hoher Kopienzahl zu vervielfältigen und nachzuweisen. In solchen Fällen wird die Behinderung der Vervielfältigung der Zielnukleinsäuren niedriger Kopienzahl durch die Zielnukleinsäuren hoher Kopienzahl verringert. In anderen Fällen kann die Erfindung verwendet werden, um die Vervielfältigung einer Zielnukleinsäure gegenüber anderen aus verschiedenen Gründen zu beeinflussen.
Die Vorteile dieser Erfindung werden durch die Aufnahme eines wasserlöslichen oder wasserschwellbaren, nicht-ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels in dem Vervielfälti gungsreaktionsgemisch in mindestens einem Vervielfältigungszyklus erreicht. Die Gegenwart dieses Mittel erlaubt es dem Verwender wirksam die Menge des Primers zu verringern, der für die effiziente Vervielfältigung der Nukleinsäuren notwendig ist, wobei die Verringerung dann die Beeinflussung des Verfahrens erlaubt, so daß eine Nukleinsäure bevorzugt vervielfältigt wird. So kann der Primer dann als geschwindigkeitsbegrenzende Reagenz verwendet werden.
Zusätzlich erhöht das Volumenausschlußmittel auch die Geschwindigkeit der Renaturierung des Vervielfältigungsreaktionsprodukts was die Vervielfältigungseffizienz für Zielnukleinsäuren hoher Kopienzahl im Vergleich zu Nukleinsäuren niedriger Kopienzahl weiter verringert.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Konzentration jedes in der Vervielfältigung verwendeten Primers im Vergleich zu üblichen Mengen recht niedrig. Diese niedrige Menge wird aufgrund der Gegenwart des Volumenausschlußmittels möglich und erlaubt eine noch weitere Beeinflussung der gemeinsamen Vervielfältigung mehrerer Zielnukleinsäuren.
Im Hinblick auf die Leere im Stand der Technik insbesondere Sambrook et al. würde man Volumenausschlußmittel in Vervielfältigungsverfahren nicht verwenden, da die Hybridisierungsraten in diese Verfahren recht schnell sind und die Zielnukleinsäuren nicht in geschwindigkeitsbegrenzenden Mengen vorhanden sind. Darüber hinaus würde man erwarten das die Mittel alle nicht bevorzugten Reaktionen „vorantreiben" würden und eine beachtenswerte Menge unerwünschten Produkts erzeugen würden. Dies scheint bei der vorliegenden Erfindung nicht der Fall zu sein. Die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellten Vorteile wurden daher nicht erwartet.
Die Vervielfältigungsverfahren dieser Erfindung werden unter den Bedingungen, die als „hoch stringenten" bekannt sind, ausgeführt, was bedeutet, daß die Primer unter einer stringenten Temperatur, pH und anderen Reaktionsbedingungen in einer relativ schnellen Weise spezifisch an die interessierenden Zielnukleinsäurestränge hybridisieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die allgemeinen Grundlagen und Bedingungen für die Vervielfältigung und den Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion sind gut bekannt, die Details davon werden in einer Vielzahl von Publikationen, die die US-A-4,683,195, US-A- 4,983,202 und US-A-4,965,188 (oben erwähnt) umfassen, zur Verfügung gestellt. Daher sollte ein Fachmann im Hinblick auf die Lehre im Stand der Technik und die spezifisch hierin zur Verfügung gestellte Lehre keine Schwierigkeit bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung durch die Durchführung der hierin gelehrten Anpassungen, um zwei oder mehr Nukleinsäuren, von denen eine vorzugsweise eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist, gemeinsam zu vervielfältigen, haben.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Vervielfältigung und den Nachweis einer oder mehrerer spezifischer Nukleinsäuresequenzen, die in einer oder mehreren Zielnukleinsäuren niedriger Kopienzahl in einer Probe vorhanden sind, gleichzeitig, mit der Vervielfältigung einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen, die in einer oder mehreren Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl vorhanden sind, gerichtet. Im allgemeinen ist eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl in einer Probe in einer Menge von weniger als etwa 10^–16 mol/l vorhanden, die Menge kann jedoch größer sein, wenn die Nukleinsäuren hoher Kopienzahl in viel größeren Mengen vorhanden sind beispielsweise mit mindestens 1000-fach größerer Konzentration. Zielnukleinsäuren hoher Kopienzahl sind die, die normalerweise mit Genen mit einer einzigen Kopie in Verbindung stehen, während Zielnukleinsäuren niedriger Kopienzahl die sind, die im allgemeinen mit infektiösen Agentien, Krebs und anderen pathologischen Zuständen in einem Mensch oder einem Tier in Verbindung stehen.
Zusätzlich kann die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl als „positive Kontrolle" in einem Testverfahren verwendet werden. Durch die Beeinflussung der Effizienz der PCR der Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl kann die positive Kontrolle nur nachweisbar sein, wenn die PCR effizient ausgeführt wurde, wodurch die Wahrscheinlichkeit falsch negativer Ergebnisse verringert wird. In solchen Fällen kann die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl mit dem 10-fachen oder mehr-fachen der Konzentration der Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl vorhanden sein.
Proben können zelluläre oder virale Materialien, Haar, Körperflüssigkeiten oder andere Materialen, die genetische DNA oder RNA enthalten, die nachgewiesen werden kann, umfassen. Zielnukleinsäuren können aus verschiedenen Quellen, die Plasmide und natürlich auftretende DNA aus jeder Quelle (wie Bakterien, Hefe, Viren, Pflanzen, höhere Tiere oder Menschen) umfassen. Sie kann aus verschiedenen Geweben, die Blut, periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC = „peripheral blood mononuclear cells"), andere Gewebematerialien oder andere im Stand der Technik bekannte Quellen unter Verwendung bekannter Verfahren umfassen, erhalten werden. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere für die gemeinsame Vervielfältigung und den Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die in genomischer DNA, bakterieller DNA, proviraler DNA, Pilz-DNA, viraler RNA, die in bakteriell oder viral infizierten Zellen gefunden wird, nützlich. Zusätzlich sind Nukleinsäuresequenzen, die mit Krebsmakern in Verbindung stehen, unter Verwendung der vorliegenden Erfindung vervielfältigbar und nachweisbar.
Die Bakterien, die nachgewiesen werden können, umfassen sind aber nicht beschränkt auf Bakterien die im menschlichen Blut gefunden werden Salmonella spp., Chlamydia ssp., Neisseria ssp., Shigella ssp., und Mycobacterium ssp.. Viren, die nachweisbar sind, umfassen sind aber nicht beschränkt auf Herpes Simplex Viren, Epstein Barr Virus, menschlicher Cytomegalovirus, menschlicher Papillomavirus, Hepatitisviren und Retroviren wie HTLV-I, HTLV-II, HIV1 und HIV2. Tierische parasitäre Einzeller, Hefen und Schimmel sind auch nachweisbar. Andere nachweisbare Spezies würden dem Fachmann ohne weiteres erkennbar sein. Die Erfindung ist insbesondere für den Nachweis der Gegenwart von DNA, die mit einer retroviral DNA (HIV1 oder HIV2) oder einer Mycobakteriumspezies assoziiert ist, nützlich. Am meisten bevorzugt wird sie verwendet, um DNA nachzuweisen, die mit HIV1, proviralem HIV1, HIV2 oder proviralem HIV2 in Verbindung steht.
Ein „PCR-Reagenz" bezeichnet jedes der Reagienzen, die im allgemeinen der PCR verwendet werden, namentlich eine Gruppe von Primern für die gegenüberliegenden Stränge jeder Zielnukleinsäure, eine DNA-Polymerase, einen DNA-Polymerasecofaktor und zwei oder mehr Deoxyribonukleosid-5'-trisphosphate (dNTP's).
Der Begriff „Primer" bezeichnet eine Oligonukleotid ob natürlich auftretend oder synthetisch hergestellt, das dazu in der Lage ist als Initationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, in denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist (das ist die Matrize), induziert wird. Solche Bedingungen umfassen die Gegenwart anderer PCR-Reagenzien und einer geeigneten Temperatur und eines pHs. Üblicherweise sind solche Bedingungen die, die im Stand der Technik als „hoch stringente" Bedingungen bekannt sind, so daß die nicht-spezifische Vervielfältigung minimiert wird. Die Primer müssen lang genug sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in der Gegenwart der DNA-Polymerase zu indizieren. Die genaue Länge jedes Primers wird abhängig von der erwogenen Verwendung, der Komplexität der Zielsequenz, der Reak tionstemperatur und der Quelle des Primers abhängen. Im allgemeinen werden die in dieser Erfindung verwendeten Primer zwischen 10 bis 60 Nukleotide aufweisen.
Primer können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren und Gerätschaften, die beispielsweise einen ABI-DNA-Synthesizer (von Applied Biosystems erhältlich) oder einem Biosearch 8600 Serie oder 8800 Serie Synthesizer (von Milligen-Biosearch, Inc. erhältlich) umfassen, und mit bekannten Verfahren für ihre Verwendung (beispielsweise wie in US-A-4,965,188, oben erwähnt, beschrieben) hergestellt werden. Natürlich vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert sind, sind auch nützlich (wie durch Restriktionsendonukleaseverdau). Im allgemeinen wird für jede Zielnukleinsäure eine Gruppe von mindestens zwei Primern verwendet. Somit kann eine Vielzahl von Primergruppen gleichzeitig verwendet werden, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren zu vervielfältigen. Zusätzlich kann eine Gruppe von Primern ein Gemisch aus Primern für eine gegebene Zielnukleinsäure umfassen.
Die DNA-Polymerasen sind als Enzyme gut bekannt, die die Deoxynukleosidmonophosphatmoleküle esterifizieren und an das 3' Hydroxydende des Primers über eine Phoshpodiesterverknüpfung an den Primer anfügen, wobei die Synthese Matrizen gesteuert ist. Nützliche DNA-Polymerase umfassen beispielsweise die E. coli DNA-Polymerase I, die T4 DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, die reverse Transkriptase und andere im Stand der Technik bekannte.
Die DNA-Polymerase ist vorzugsweise „thermostabil" was bedeutet, daß sie im allgemeinen bei hohen Temperaturen, die für die Denaturierung der DNA-Stränge verwendet werden, stabil ist. Insbesondere werden thermostabilen DNA-Polymerasen bei den hohen Temperaturen, die in der PCR verwendet werden, nicht wesentlich inaktiviert. Solche Temperaturen werden abhängig von einer Anzahl von Reaktionsbedingungen, die pH, Salzkonzentrationen und andere im Stand der Technik bekannte Bedingungen umfassen, variieren.
Über eine Anzahl thermostabiler DNA-Polymerasen ist im Stand der Technik berichtete worden, die die umfassen, die im Detail in US-A-4,965,188 (oben erwähnt) und US-A-4,889,818 (Gelfand et al.) erwähnt werden, die hierin durch Verweis aufgenommen werden. Besonders nützliche Polymerasen sind die, die aus verschiedenen Thermus Bakterienspezies, wie Thermus aquaticus, Thermus filiformis, Thermus flavus oder Thermus thermophilus erhalten wer den. Andere nützliche thermostabile Polymerasen werden aus einer Vielzahl anderer mikrobieller Quellen, die Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. und die, die in WO-A-98/06691 (am 27. Juli 1989 publiziert) beschrieben sind, umfassen, erhalten. Einige nützliche Enzyme sind kommerziell erhältlich. Eine Vielzahl von Techniken für die Isolierung natürlich-auftretender Polymerasen auf Organismen sind bekannt. Klonierung und andere synthetische Verfahren für die Herstellung von Polymerasen unter Verwendung rekombinanter Techniken sind auch aus dem oben zitierten Stand der Technik, der das Gelfand et al. Patent umfaßt, bekannt.
Ein DNA-Polymerasecofaktor bezeichnet eine nicht-Proteinverbindung auf die das Enzym für seine Aktivität angewiesen ist. Eine Anzahl solcher Materialien sind im Stand der Technik bekannt, die Mangan- und Magnesiumsalze umfassen. Nützliche Co-Faktoren umfassen sind aber nicht begeschränkt auf Mangan- und Magnesiumchloride, -sulfate, -azetate und -fettsäuresalze. Die Chloride, Sulfate und Azetate sind bevorzugt und die Magnesiumchloride und -sulfate sind am meisten bevorzugt.
Für die PCR werden auch zwei oder mehr Deoxyribonukleosid-5'-trisphosphate wie dATP, dCTP, dGTP, dTTP und dUTP benötigt. Analoge wie dITP und 7-Deaza-dGTP sind auch nützlich. Vorzugsweise werden die vier üblichen Trisphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in der PCR verwendet.
In der Ausführung der Erfindung ist auch ein Antikörper, der für die DNA-Polymerase spezifisch ist, nützlich, wobei der Antikörper die enzymatische Aktivität bei Temperaturen unter 50°C behindert wobei der Antikörper aber bei höheren Temperaturen deaktiviert wird. Beispielhafte monoklonale Antikörper, die diese Eigenschaften aufweisen, sind in US-A-5,338,671 (von Scalice et al.), das hierin durch Verweis aufgenommen wird, beschrieben. Antikörperfragmente können anstelle des Gesamtmoleküls verwendet werden, wenn sie äquivalente Eigenschaften aufweisen.
Eine typische PCR-Reaktionsmischung enthält mindestens eine oder mehrere Primergruppen für die Zielnukleinsäuren, eine thermostabile DNA-Polymerase (wie oben definiert), eine Vielzahl von dNTP's (wie die üblichen dNTP's) und ein oder mehrere wasserlösliche oder wasserschwellbare, nicht-ionische, polymere Volumenausschlußmittel.
Darüber hinaus sind sie nicht-ionisch, wodurch aus dem Schutzbereich dieser Erfindung kationische, anionische oder amphotäre Materialien, die die PCR negativ beeinflussen können, ausgeschlossen sind.
Die Volumenausschlußmittel sind polymer, was bedeutet, daß sie üblicherweise aus einer Mehrzahl von sich wiederholenden Einheiten bestehen und im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 20000 Dalton aufweisen, wobei ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 3000 bis 12000 Dalton bevorzugt ist.
Nützliche Materialklassen, die als Volumenausschlußmittel in der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen sind aber nicht beschränkt auf Polyether, Reaktionsprodukte einfacher Zucker, wie Dextrose oder Glukose, mit Epichlorhydrin, Polysaccharide, Polyakrylate und ähnliche Materialien, die ohne weiteres für den Fachmann erkennbar sind.
Polyether sind bevorzugt. Sie können im allgemeinen durch die Formel: H-(-O-R-)_n-H wiedergegeben werden, wobei R ein Alkylen mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen und n eine gerade Zahl von 15 bis 1000 (Grundlage ist das Durchschnittesgewicht) bedeutet. Beispielsweise kann R 1,2-Ethylen, 1,2-Propylen, 2-Hydroxy-1,3-propylen, 3-Hydroxy-1,2-propylen, 1,4-Butylen, 1,3-Butylen, 1,2 Hexylen und andere divalente Alkylengruppen bedeuten, die ohne weiteres für den Fachmann erkennbar sind. Vorzugsweise ist R 1,2-Ethylen oder 1,2-Propylen wie in Poly(ethylenoxid) oder Poly(propylenoxid), die üblicherweise als Poly(ethylenglycol) bzw. Poly(propylenglycol) bekannt sind.
In der erwähnten Formel gibt die ganze Zahl „n" das durchschnittliche Molekulargewicht der Verbindung geteilt durch das Molekulargewicht der monomeren Einheit wieder. Für die bevorzugten Verbindungen, die in den vorangehenden Paragraph erwähnt worden sind, betragen die durchschnittlichen Molekulargewichte mindestens etwa 1.000, vorzugsweise mindestens etwa 2.000 und im allgemeinen bis zu etwa 20.000. Ein Fachmann kann ohne weiteres die geeignete Zahl „n" der Einheiten für eine gegebene Verbindung und ein Verbindungsgewicht bestimmen. Im allgemeinen ist n einer gerade Zahl von 15 bis 1000. Wie bei der Definition des Molekulargewichts verwendet bezeichnet der Begriff „etwa" eine Varianz von ±10%.
Von der Definition der Polyether eingeschlossen sind Kondensationsprodukte aus Ethylenoxid, Propylenoxid oder anderen Alkylenoxiden oder verschiedene Reste wie Diole, Triole, Zucker oder Säuren, die Polyglycidole umfassen. Solche Materialien sind im Stand der Technik als nicht-ionische oberflächenaktive Substanzen oder Detergentien bekannt und können in der vorliegenden Erfindung unter der Voraussetzung nützlich sein, daß die erforderlichen Wasserlöslichkeits- oder Wasserschwellbarkeitsparameter erreicht werden.
Nicht-ionische Polysaccharide, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Dextran, Glycogen und andere dem Fachmann ohne weiteres ersichtliche.
Beispiele nützlicher Polyakrylate umfassen sind aber nicht beschränkt auf Poly(hydroxyethylacrylat), poly(2,3-dihydroxypropylacrylat) und andere, die für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind.
Die PCR-Reagenzien, die hierin beschrieben sind, werden in geeigneten Konzentrationen, um eine Vervielfältigung der Zielnukleinsäure zu erreichen, zur Verfügung gestellt und in der PCR verwendet. Die Minimalmenge der DNA-Polymerase beträgt im allgemeinen mindestens etwa 1 Einheit/100 μl Lösung, wobei von etwa 4 bis etwa 25 Einheiten/100 μl bevorzugt ist. Eine „Einheit" ist hierin als die Menge der Enzymaktivität definiert, die für die Aufnahme von 10 nmol Gesamtnukleotide (dNTP's) in eine sich verlängernden Nukleinsäurekette in 30 Minuten bei 74°C erforderlich ist. Die Konzentration jedes Primers beträgt mindestens etwa 0,025 μmol/l und weniger als etwa 1 μmol/l wobei etwa 0,05 bis etwa 0,2 μmol/l bevorzugt sind. Alle Primer sind in etwa derselben Menge (mit einer Variation von 10% für jeden) vorhanden. Der Co-Faktor ist im allgemeinen in einer Menge von etwa 1 bis etwa 15 mmol/l vorhanden und jedes dNTP ist im allgemeinen in dem Reaktionsgemisch mit von etwa 0,15 bis etwa 3,5 mmol/l vorhanden. Das Volumenausschlußmittel ist in einer Menge von mindestens etwa 4 Gew.-% vorhanden, wobei Mengen im Bereich von etwa 6 bis 12 Gew.-% bevorzugt sind. Wie bei der Definition der Mengen der Materialien verwendet bezeichnet der Begriff „etwa" eine Variation von ±10% der angegebenen Menge.
Die PCR-Reagenzien können einzeln zur Verfügung gestellt werden oder in einer gepufferten Lösung, die ein pH im Bereich von 7 bis etwa 9 aufweist, unter Verwendung jedes geeigneten Puffers zur Verfügung gestellt werden. Somit kann ein Reaktionsgemisch für die PCR eine Gruppe von Primern für jede Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl, eine Gruppe von Primern für jede Nukleinsäure hoher Kopienzahl, geeignete dNTP's, eine thermostabile DNA-Polymerase, ein Co-Faktor für die DNA-Polymerase, ein oder mehrere Volumenausschlußmittel und jedes andere Zusatzmittel, das ein Fachmann für die Vervielfältigung oder den letztlichen Nachweis der Zielnukleinsäuren als nützlich ansehen würde, enthalten.
Eine Zielnukleinsäure kann aus einer Vielzahl von Quellen wie oben erwähnt erhalten werden. Im allgemeinen muß sie in irgendeiner Weise extrahiert werden, um sie für den Kontakt mit Primern und anderen Reaktionsmaterialien verfügbar zu machen. Dies bedeutet üblicherweise die Entfernung unerwünschter Proteine und zellulären Materials aus der Probe in einer geeigneten Weise. Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, die die umfassen, die durch Laure et al. in The Lancet, S. 538–540 (3. September 1988), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 280–281 (1982), Gross-Belland et al., in Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973) und US-A-4,965,188 (oben erwähnt) beschrieben wurden. Die Extraktion von DNA aus Gesamtblut oder Komponenten davon sind beispielsweise in EP-A-0 393 744 (am 24. Oktober 1990 publiziert), Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (9), S. 5759–5763 (1981), Saiki et al., Bio/Technology, 3, S. 1008–1012 (1985) und US-A-5,231,015 (Cummins et al.) beschrieben. Das jeweilige Extraktionsverfahren ist für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich.
Da die Zielnukleinsäure, die vervielfältigt und nachgewiesen werden soll, üblicherweise in doppelsträngiger Form vorliegt, müssen die zwei Stränge getrennt werden (das bedeutet denaturiert) bevor das Primen stattfinden kann. Dies kann während des Extraktionsprozeß stattfinden aber bevorzugt findet es in einem getrennten Schritt danach statt. Das Erhitzen auf eine geeignete Temperatur (hierin als „erste Temperatur" oder T₁ bezeichnet) ist ein bevorzugtes Mittel für die Denaturierung. Im allgemeinen liegt die erste Temperatur im Bereich von etwa 85 bis etwa 100°C für eine angemessene Zeit beispielsweise von 1 bis etwa 240 Sekunden (vorzugsweise 1 bis etwa 40 Sekunden). Dieser anfängliche Denaturierungsschritt kann auch in dem ersten Vervielfältigungszyklus eingeschlossen sein. In solchen Fällen kann die Denaturierung im ersten Zyklus länger sein (beispielsweise bis zu 240 Sekunden) während spätere Zyklen viel kürzere Denaturierungsschritte aufweisen (beispielsweise bis zu 30 Sekunden).
Die denaturierten Stränge werden dann mit den geeigneten Primergruppen durch das Abkühlen des Reaktionsgemisch auf eine zweite Temperatur, T₂, die im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 55 bis etwa 77°C liegt, geprimt. Es ist erwünscht, daß die Abkühlung so schnell wie möglich durchgeführt wird, aber mit dem gegenwärtig bekannten Geräten findet dies normalerweise über einen Zeitraum von etwa 5 bis etwa 40 Sekunden und bevorzugter von etwa 5 bis etwa 20 Sekunden statt. Vorzugsweise wird T₂ als: (TmH – 15)°C ≤ T2 ≤ (TmH + 5)°Cdefiniert, wobei T_mH die Schmelztemperatur der Primer für die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist.
Sobald die denaturierten Stränge abgekühlt werden wird das Reaktionsgemisch, das die PCR-Reagenzien enthält, bei einer dritten Temperatur, T₃ im allgemeinen für 1 bis etwa 120 Sekunden und vorzugsweise für von 1 bis etwa 80 Sekunden, um die Bildung von Primerverlängerungsprodukten zu bewirken. Im allgemeinen wir die dritte Temperatur als: (TmH – 15)°C ≤ T3 ≤ (TmH + 15)°Cdefiniert und liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 65 bis etwa 70°C. Vorzugsweise liegt sie im Bereich von etwa 62 bis etwa 70°C.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die zweite und die dritte Temperatur dieselbe und liegt innerhalb des Bereiches von 62 bis etwa 70°C. Somit wird das Primen und die Primerverlängerung vorzugsweise in demselben Schritt ausgeführt.
Jeder Primer für die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl weist auch eine Schmelztemperatur auf, die hierin als T_mH bezeichnet wird. Üblicherweise beträgt der Unterschied zwischen T_mL und T_mH von 0 bis etwa 8°C und sowohl T₂ und T₃ sind üblicherweise niedriger als T_mL oder T_mH oder gleich zu entweder T_mL oder T_mH. T_mL ist die Schmelztemperatur der Primer für die Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl.
Die Schmelztemperatur wird hierin als die Temperatur definiert bei der die Hälfte aller Primer von einem komplementären Strang (wie der Matrize) denaturiert sind. Die Bestimmung der Schmelztemperatur kann unter Verwendung mehrerer Standardverfahren und auf Grund des ultravioletten Hypochromismuses erreicht werden, beispielsweise durch Überwachung des Spektrums bei 260 nm wie in Biochemistry – The Molecolar Basis of Cell Structure and Function, 2. Ausgabe, Lehninger, Worth Publishers, Inc., 1970, S. 876–7 beschrieben. Die verschiedenen Verfahren für die Bestimmung der Schmelztemperaturen können leichtverschiedene Werte für dasselbe DNA-Molekül ergeben, aber diese Werte sollten nicht mehr als um etwa 2 oder 3°C variieren. Darüber hinaus sollte der Unterschied zwischen T_mL und T_mH innerhalb eines gegebenen Verfahrens für die Bestimmung der Schmelztemperaturen nicht variieren.
Vorzugsweise werden die Schmelztemperaturen unter Verwendung der folgenden Formel: Tm (°C) = 67,5 + 0,34(%G + C) – 395/Nberechnet, wobei „G" und „C" die Zahl der Guanin- bzw. der Cytosinnukleotide wiedergibt und „N" die Gesamtzahl der Nukleotide in dem Oligonukleotid (das bedeutet in dem Primer) wiedergibt. Die Schmelztemperaturwerte, die durch diese Berechnung erhalten werden, korrelieren sehr gut mit den empirisch bei Raumtemperatur bestimmten Werten und der Verwendung des üblichen UV-Hypochromismuses und eines üblichen Hewlett-Packard Dioden Array Spektrophotometers (Abtastrate von etwa +1°C/min) für eine Lösung eines Primers in 10 mmol/l Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (pH 8,5) der eine Ionenstärke von mindestens etwa 20 mmol/l aufweist, die durch ein oder mehrere anorganische oder organische Salze wie Magnesiumchlorid, Natriumchlorid und andere die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind, zur Verfügung gestellt wird. Die Primermengen und ihr Komplement in der Lösung, die (das) verwendet wurde, um die erwähnte Schmelztemperaturformel zu bestimmen waren ausreichend, um eine optische Dichte von etwa 0,5 bis 1,0 OD-Einheiten zur Verfügung zu stellen.
Somit umfaßt ein „erster" Vervielfältigungszyklus die oben beschriebenen Denaturierungs-, Prim- (oder Anlagerungs-) und Primerverlängerungsschritte. Im allgemeinen werden mindestens 15 solcher ersten Vervielfältigungszyklen in der Ausführung dieser Erfindung durchgeführt, wobei die maximale Zahl der Zyklen im Ermessen des jeweiligen Nutzers liegt. In den meisten Fällen werden 15 bis 50 erste Vervielfältigungszyklen in dem Verfahren verwendet, wobei 15 bis 40 Zyklen bevorzugt sind. Jeder erste Vervielfältigungszyklus dauert im allgemeinen von etwa 20 bis etwa 360 Sekunden wobei eine Zykluszeit von etwa 30 bis etwa 120 Sekunden bevorzugt ist und von etwa 30 bis etwa 90 Sekunden noch bevorzugter ist. Wenn gewünscht können jedoch längere oder kürzere Zykluszeiten verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ausschließlich die erwähnten „ersten" Zyklen umfassen, aber in einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren mindestens 15 erste Vervielfältigungszyklen wie oben definiert umfassen gefolgt von einem oder mehreren „zweiten" Vervielfältigungszyklen. Solche zweiten Zyklen werden unter Verwendung der selben Schritte wie die ersten Zyklen ausgeführt mit dem Unterschied das ein Renaturierungsschritt nach jeden Denaturierungsschritt und vor dem Primschritt aufgenommen wird. Die Renaturierung wird durch das Abkühlen des Reaktionsgemisch auf eine vierte Temperatur, T₄, die als: (TmH + 5)°C ≤ T4 ≤ TPH definiert ist, zur Verfügung gestellt, wobei T_PH die Schmelztemperatur der Doppelstränge der Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist. Im allgemeinen beträgt T₄ von etwa 65 bis etwa 90°C. Die Zeit, die erforderlich ist, um T₄ zu erreichen ist so kurz wie möglich kann aber bis zu 45 Sekunden betragen und diese Temperatur kann für etwa 15 bis etwa 100 Sekunden beibehalten werden.
Mindestens 5 zweite Vervielfältigungszyklen werden in dem Verfahren verwendet mit einer oberen Grenze die im Ermessen des Benutzers liegt. Vorzugsweise umfaßt eine Ausführungsform des Verfahrens von 5 bis 20 zweite Zyklen, wobei 15 Zyklen am meisten bevorzugt sind. Die Zeit für jeden zweiten Zyklus reicht von etwa 20 bis etwa 360 Sekunden. Eine bevorzugte Zykluszeit beträgt von etwa 30 bis etwa 120 Sekunden.
Der Einschluß eines Erzeugnisrenaturierungsschritts in den späteren Zyklen bei einer Temperatur an oder unter der effektiven T_m (Schmelztemperatur) des Produktes hoher Kopienzahl aber mehrere Grade über der effektiven T_m der Primer die in der Vervielfältigungsreaktion verwendet werden, erlaubt die Denaturierung der Vervielfältigunsprodukte in einer konzentrationsabhängigen Weise. Der relativ kurze Renaturierungsschritt der zweiten Zyklen beeinflußt nicht wesentlich die Primeffizienz der Nukleinsäure niedriger Kopienzahl wird aber das Primen der Nukleinsäure hoher Kopienzahl verringern.
Wie in dieser Anmeldung verwendet, wenn er im Hinblick auf die Zeit für einen gegebenen Schritt verwendet wird, bezeichnet der Begriff „etwa" ±10% dieses Zeitlimits. Wenn im Hinblick auf Temperaturen verwendet bezeichnet der Begriff „etwa" ±5°C.
Die Kinetiken der Nukleinsäurehybridisierungsreaktionen wie die Renaturierung von Vervielfältigungsprodukten hängen linear von der Konzentration der hybridisierten Nukleinsäuren ab. Daher erhöht sich wenn sich beispielsweise die Konzentration des vervielfältigten Produkts um das 10-fache erhöht die Hybridisierungsrate auch um das 10-fache (und der T_½ für die Renaturierung verringert sich um das 10-fache). Unter der Annahme einer Geschwindigkeitskonstante für die Vorwärtsreaktion der Hybridisierung von 5 × 10⁶ (mol/l)^–1 sec^–1 würde die T_½ bei einer Produktkonzentration von 10^–8 mol/l etwa 14 Sekunden betragen und bei einer Produktkonzentration von 10^–9 mol/l 140 Sekunden. Die Aufnahme des Volumenausschlußmittels wie hierin beschrieben, führt zu einer wirksamen Erhöhung der reagierenden Makromoleküle wie der Vervielfältigungsprimer, der Zielnukleinsäuren, der Primervervielfältigungsprodukte und der DNA-Polymerase. Diese sich ergebende Erhöhung der wirksamen Primerkonzentration erlaubt eine entsprechende Verringerung der absoluten Primerkonzentration in der Vervielfältigungsreaktion ohne einen Verlust der Vervielfältigungseffizienz. Somit kann in der bevorzugten Ausführung der Erfindung die Primerkonzentration deutlich reduziert werden ohne eine Verringerung der Effizienz.
Das Vervielfältigungsverfahren dieser Erfindung wird vorzugsweise in einer andauernden, automatisierten Weise durchgeführt, so daß das Reaktionsgemisch in einer kontrollierten Weise für eine gewünschte Anzahl zwischen den Temperaturen zykliert. Eine Anzahl von Instrumenten ist für diesen Zweck entwickelt worden, wie es ein Durchschnittsfachmann wissen würde. Vorzugsweise wird das Instrument auch sowohl für die ersten als auch die zweiten Vervielfältigungszyklen programmierbar sein.
Ein solches Instrument für diesen Zweck ist mit gewissem Detail in US-A-4,965,188 und EP-A-0 236 069 beschrieben. Im allgemeinen umfaßt dieses Instrument einen Hitze-leitenden Behälter für das Halten einer Anzahl von Reaktionsröhren, die das Reaktionsgemisch enthalten, ein Mittel für das Erhitzen, das Kühlen und den Temperaturerhalt und ein Computermit tel, um Signale für die Kontrolle der Vervielfältigungssequenz, Änderungen in der Temperatur und die Zeiteinteilung zu erzeugen.
EP-A-0 402 994 stellt Details nützlicher chemischer Testverpackungen zur Verfügung, die unter Verwendung des in der US-A-5,089,233 (Devaney, Jr. et al.) beschriebenen Instruments verarbeitet werden können. Darin sind auch Mittel für das Heizen und Kühlen der Testverpackung in wiederholten Intervallen beschrieben (das bedeutet durch Zyklen), die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Weitere Details die nützliche PCR-Verarbeitungsvorrichtungen betreffen, können aus der beachtlichen Literatur aus dem Bereich erhalten werden und würden dem Fachmann ohne weiteres bekannt sein.
In den oben beschriebenen chemischen Testpackungen kann das Verfahren in anderen Behältern ausgeführt werden, wie in denen, die im größeren Detail in US-A-4,902,624 (Columbus et al.), US-A-5,173,260 (Zander et al.) und US-A-5,229,297 (Schnipelsky et al.) beschrieben sind und jedem anderen geeigneten Behälter, der ohne weiteres dem Fachmann erkenntlich ist. Solche Testpackungen sind auch als geschlossene Testvorrichtungen bekannt, die getrennte Abteilungen für verschiedene Reagenzien, die im Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, aufweisen. Die Abteilungen sind geeigneter Weise verbunden, so daß Reagenzien und Testlösungen mit dem Fängerreagenz zu geeigneten Zeitpunkten ohne das Öffnen der Vorrichtung in Kontakt gebracht werden können.
Der Nachweis der vervielfältigten Produkte kann unter Verwendung jedes bekannten Verfahrens erreicht werden, die Southern-Blotting-Verfahren wie in US-A-4,965,188 (oben erwähnt) beschrieben, umfassen oder durch die Verwendung markierter Sonden oder Primer wie es im Stand der Technik bekannt ist.
Alternativ zu den oben beschriebenen Ausführungsformen können die vervielfältigten Produkte unter Verwendung eines markierten Oligonukleotids nachgewiesen werden, das komplementär zu einem der Primerverlängerungsprodukte ist. Verfahren für die Anbringung von Markierungen an Oligonukleotiden sind gut bekannt. Nützliche Markierungen umfassen Enzyme, Ferritin und andere magnetische Teilchen, Radioisotope, chemiluminiszente Reagenzien (beispielsweise Luminol) Biotin und verschiedene Fluorogene und Chromogene. Nützliche Enzymmarkierungen umfassen Glukoseoxidase, Peroxidase und alkalische Phosphatase. Sub strate und Reagenzien, die Farbe zur Verfügung stellen, für verschiedene Markierungen wie Enzyme sind auch bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Enzymmarkierung (wie eine Peroxidase) für den Nachweis verwendet und eine geeignete Zusammensetzung für die zur Verfügungstellung eines Farbstoffs oder von Lichtemision wird mit der Markierung verwendet. Beispielsweise werden besonders nützliche colorimetische Systeme, die Farbe zur Verfügung stellen, in US-A-5,024,935 (McClune et al.) beschrieben. Der Nachweis wird dann unter Verwendung des nackten Auges oder mit geeigneten Spektrophotometern oder Luminometern erreicht.
Es ist auch möglich, daß ein Primer jeder in dem Verfahren verwendeten Primergruppe mit einer spezifischen Bindungsgruppe markiert ist. Diese Gruppe kann für die verschiedenen Primer gleich oder verschieden sein und jedes Molekül umfassen für das es einen spezifischen Bindungsrezeptor gibt, der spezifisch mit dem Rest reagiert. Beispiele solcher spezifischen Bindungspaare (von denen einer dann markiert werden kann) umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf Streptavidin/Biotin, Zucker/Lectin, Antikörper/Hapten, Antikörper/Antigen und andere die für den Fachmann ohne weiteres erkennbar sind. Das Rezeptormolekül wird dann mit einer geeigneten nachweisbaren Markierungsgruppe wie einem Enzym, einen Radioisotop oder anderen oben für die Oligonukleotide beschriebenen konjugiert.
Noch bevorzugter sind ein oder beide Primer jeder Primergruppe mit Biotin (oder einem äquivalenten Derivat davon) markiert und das vervielfältigte Produkt wird unter Verwendung eines Konjugats aus Streptavidin und einem Enzym wie Meerrettichperoxidase nachgewiesen.
In den heterogenen Nachweisverfahren dieser Erfindung wird das vervielfältigte Produkt auf einem wasserunlöslichen Substrat irgendeiner Art gefangen und die anderen Materialien des Reaktionsgemisches werden in geeigneter Weise wie durch Filtration, Zentrifugation, Waschen oder eine andere Trennungstechnik entfernt.
Die Fängersonden können an die wasserunlöslichen Träger unter Verwendung bekannter Befestigungsverfahren (umfassend Adsorptions- und kovalente Reaktionen) befestigt werden. Eine solche Technik ist in EP-A-0 439 222 (am 18. September 1991 publiziert) beschrieben. Andere Techniken werden beispielsweise in US-A-4,713,226 (Dattagupta et al.), US-A-4,914,210 (Levenson et al.) und EP-B-0 070 687 (am 26. Januar 1983 publiziert) beschrieben. Nützliche Trennungsmittel umfassen die Filtration durch Membranen wie mikroporöse Polyamidmembranen, die kommerziell vom der Pall Corporation erhältlich sind.
Jeder nützliche feste Träger kann jedoch verwendet werden, um die Fängersonde und das letztlich Hybridisierungsprodukt zu verankern, die Mikrotiterplatten, Teströhrchen, Bechergläser, magnetische oder polymere Teilchen, Metalle, Keramiken, Glaswolle, um nur einige zu nennen, umfassen. Besonders nützliche Materialien sind magnetische oder polymere Teilchen die reaktive Gruppen aufweisen, die für die kovalente Befestigung von Fängersonden nützlich sind. Solche Partikel weisen üblicherweise von 0,001 bis etwa 10 μm auf. Weitere Details für Beispiele solcher Materialien werden in US-A-4,997,772 (Sutton et al.), US-A-5,147,777 (Sutton et al.), US-A-5,155,166 (Danielson et al.) und US-A-4,705,689 (Owen et al.) zur Verfügung gestellt. Die Fängersonde kann an einem flachen Träger wie an einem polymeren Film, Membranen, Filterpapieren oder Harz-beschichteten oder unbeschichteten Papier befestigt werden. Die an polymeren Teilchen befestigte Fängersonde kann auch auf flachen Trägern in einer geeigneten Weise beispielsweise als trockene Ablagerung immobilisiert werden oder durch Hitzefusion oder mit Klebstoffen angeheftet werden. Die Fängersonden können beispielsweise auf einem flachen Träger in der geschlossenen Testvorrichtung dieser Erfindung befestigt werden. Andere Details solcher Materialien werden in EP-A-0 408 738 (am 23. Januar 1993 publiziert), WO 92/16659 (am 1. Oktober 1992 publiziert) und US-A-5,173,260 (Sutton et al.) zur Verfügung gestellt.
Die Fängersonden können auf einem geeigneten Träger in jeder Anordnung beispielsweise in Reihen oder in runden Ablagerungen oder in Streifen angeordnet werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch in dem, was als „homogene" Vervielfältigungsverfahren bekannt ist, verwendet werden, bei denen mehrere Zielnukleinsäuren gleichzeitig ohne das Erfordernis für Fängerreagenzien gleichzeitig nachgewiesen werden. Die Details solcher Testverfahren sind im Stand der Technik, wie der EP-A-0 487 218 (am 27. Mai 1992 publiziert) und der EP-A-0 512 334 (am 11. November 1992 publiziert) bekannt.
Die Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung dieser Erfindung kann als eine einzeln verpackte Komponente eines Testkits, das für verschiedene Vervielfältigungstestverfahren nützlich ist, enthalten sein. Das Kit kann andere Reagenzien, Lösungen, Instrumente und Anleitungen die für das Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassend Fängerreagenzien, die auf einem wasserunlöslichen Substrat immobilisiert sind, Waschlösung, Extraktionslösung, Nachweisreagenzien und andere Materialien, die für den Fachmann ohne weiteres erkennbar sind, umfassen.
Die folgenden Beispiele sind umfaßt, um die Ausführung dieser Erfindung zu verdeutlichen und sind in keiner Weise limitierend gemeint. Alle Prozentangaben sind, wenn nicht anders vermerkt nach Gewicht.
Materialien und Verfahren für die Beispiele
Die in diesem Beispiel verwendeten Primer haben die folgenden Sequenzen. Die ersten zwei sind komplementär zur der gag-Region der proviralen HIV1-DNA und die zweiten zwei Primer sind zu der humanen β-Globin-DNA komplementär.
In den Primern bedeutet X eine Biotinylgruppe (abgeleitet aus einem Biotinphosphoramiditreagenz, DuPont), die an das Oligonukleotid durch zwei Aminotetraethylenglycol-Abstandshaltergruppen unter Verwendung der in US-A-4,962,029 (Levenson et al.) beschriebenen Technologie, angefügt wurden.
Die in den Beispielen verwendeten Fängersonden haben die folgenden Sequenzen, wobei die erste für die proviral HIV-DNA und die zweite für die humane β-Globin-DNA war:
"Y" stellt zwei Tetraethylenglycolabstandshalter dar, die mit einer einzelnen Amindiol-Verknüpfungsgruppe unter Verwendung der Lehre von US-A-4,914,210 (Levenson et al.) verbunden sind.
Die Primer und Fängersonden wurden unter Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und Verfahren unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 380B, 3 Säulen DNA- Synthesizers, üblicher Phosphoramiditchemie und des ABI 1 μl-Maßstabs, dem schnellen Zyklusprotokoll hergestellt. Nukleosid-3'-phosphoramidite und Nukleosid-derivatisierte Glasträger mit kontrollierter Porenweite wurden von Applied Biosystems erhalten. Alle Reinigungen wurden unter Verwendung einer Nukleinsäurereinigungssäule gefolgt von HPLC-Techniken mit umgekehrter Phase ausgeführt.
Um die Fängerreagenzien zu bilden, wurden die Sonden kovalent an polymeren Teilchen (1 μm Durchschnittsdurchmesser) befestigt, die unter Verwendung üblicher Emulsionpolymerisationsverfahren aus Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (95 : 5 Gewichtsverhältnis, 1 μm Durchschnittsdurchmesser) zubereitet wurden. Eine Suspension der Partikel in Wasser wurde mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 mol/l, pH 6) gewaschen und mit etwa 10% Feststoffen suspendiert. Eine Probe (3,3 ml) der gewaschenen Teilchen wurde in dem Puffer (0,1 mol/l wurde mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,1 ml von 84 mg/l Wasser) und der Probe (983 μl von 44,44 OD/ml Nanopure Wasser gemischt) auf 3,33% Feststoffe verdünnt. Die sich ergebende Suspension wurde unter periodischem Mischen und Zentrifugieren für 2 Stunden auf 50°C in einem Wasserbad erwärmt. Die Teilchen wurden dann dreimal mit Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (0,01 mol/l, pH 8), der (Ethylendinitrilo)tetraessigsäuredinatriumsalz (0,0001 mol/l) enthielt, gewaschen und dann darin mit 4% Feststoffen re-suspendiert.
Nach der Verdünnung mit Puffer auf 0,25% Feststoffe wurden die Fängerreagenzien (1,2 μl) auf die definierte Region der mikroporösen Membranen (LOPRODYNE^TM Polyamidmembran, 5 μm durchschnittlicher Porendurchmesser von der Pall Corp.) in den Testvertiefungen der wegwerfbaren Testvorrichtungen SURECELL^TM (erhältlich von Eastman Kodak Company), die im Detail in US-A-4,948,561 (Hinckley et al.) beschrieben sind, aufgetragen und getrocknet.
Die PCR wurde unter Verwendung eines automatisierten Kodak PCR-Prozessors, der im Detail in US-A-5,089,233, die hierin durch Verweis aufgenommen wird, beschrieben wird, unter Verwendung des Heiz- und Kühlprotokolls, das in den Beispielen unten beschrieben wird, ausgeführt. Die rekombinante DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus wurde unter Verwendung üblicher Verfahren erhalten.
Glycerin, Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer und die dNTP's wurden von Sigma Chemical erhalten.
Provirale HIV1-Ziel-DNA niedriger Kopienzahl wurde aus der 8E5/LAV Zelllinie unter Verwendung üblicher Verfahren extrahiert. Nach der Zellyse und dem Proteinverdau wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt: Tris-gesättigtes Phenol (750 μl) wurde zu der Zellsuspension hinzugefügt und die Phenol/Lysat-Lösungen wurden gemischt und durch Zentrifugation getrennt. Die wäßrige Phase wurde dann in ein frisches 2 ml Röhrchen überführt. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von Chloroform/Isoamylalkohol wiederholt. Die wäßrige Phase wurde auf 0,3 mol/l Natriumazetat gebracht. Die Nukleinsäuren wurden durch das Hinzufügen von 95% kalten Ethanol und dem Lagern bei –70°C für eine Stunde präzipitiert. Die Konzentration der proviralen HIV1-DNA wurde dann bei A₂₆₀ bestimmt und serielle Verdünnungen verschiedener Kopienzahl wurden in TE-Puffer [Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (1 mmol/l) und (Ethylendinitrilo)-tetraessigsäure (0,1 mmol/l)] für die experimentelle Verwendung zubereitet.
Die menschliche β-Globin-DNA hoher Kopienzahl wurde aus menschlicher Plazenta-DNA (0,5 mg/ml) erhalten, von der vermutet wird, das sie zwei Kopien des humanen β-Globin-Gens pro Zelle aufweist. Die Leuko-Farbstoffdispersion enthielt Agarose (0,5%), 4,5-bis(4-Dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol-Leukofarbstoff (250 μmol/l), Diethylentriaminpentaessigsäure (100 μmol/l), 4'-Hydroxyazetanilid (5 mmol/l), Polyvinylpyrrolidon (112 mmol/l) und Natriumphosphat, 1-basisch, 1-Hydrat (10 mmol/l).
Die Konjugatlösung, die in den Beispielen verwendet wurde, enthielt ein Konjugat (126 μl/l) aus Streptavidin und Meerrettichperoxidase, die aus kommerziellen Quellen (Zymed Laboratories, Inc.) erhalten wurde, Casein (0,5%) und Merthiolat (0,5%) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (24 mmol/l Natriumphosphat und 75 mmol/l Natriumchlorid). Die endgültige Konjugatkonzentration betrug 312 ng/ml.
Die in den Beispielen verwendete Waschlösung enthielt Natriumchlorid (373 mmol/l), (Ethylendinitrilo)tetraessigsäuredinatriumsalz (2,5 mmol/l), Decylnatriumsulfat (38 mmol/l) und Ethylmercurithiosalicylsäurenatriumsalz (25 μmol/l) in 1-basischem Natriumphosphat-1-Hydratpuffer (25 mmol/l, pH 7,4). Der monoklonale Antikörper „TP4" wurde in dem Reakti onsgemisch verwendet. Dieser Antikörper ist für die DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus spezifisch und wird im größeren Detail in US-A-5,338,671 (oben erwähnt) beschrieben.
Für die Beispiele 1–4 enthielt das Polymerasekettenreaktionsgemisch (200 μl) Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmol/l, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmol/l), Magnesiumchlorid (10 mmol/l), dATP, dCTP, dGTP und dTTP (1,5 mol/l von jedem), Primer (entweder 0,1 oder 0,4 μmol/l von jedem), Gelatine (0,01%), die bezeichnete DNA-Polymerase (8 Einheiten/200 μl), den monoklonalen Antikörper „TP4" (50 : 1 molares Verhältnis zu der DNA-Polymerase) und die angegebenen Mengen PEG-8000 als Volumenausschlußmittel.
Für das Beispiel 5 unten war das PCR-Reaktionsgemisch dasselbe mit der Ausnahme, daß nur die Primer, die die SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 aufwiesen, verwendet wurden, die Menge jedes Primers 0,2 mol/l betrug und die Menge der DNA-Polymerase 32 Einheiten/200 μl betrug.
PEG-8000, ein Poly(ethylenglycol), wurde von Sigma Chemicals erhalten. Es weißt ein Molekulargewicht von etwa 8000 Dalton auf.
Das Dextransulfat wurde von 5 Prime > 3 Prime, Inc. erhalten.
Der Rest der ergänzenden Materialien wurde unter Verwendung kommerzieller Quellen erhalten oder bei der Eastman Kodak Company unter Verwendung üblicher Verfahren zubereitet.
Beispiele 1–4 Hochstringente gemeinsame Vervielfältigung proviraler HIV1- und β-Globin-DNA unter Verwendung eines Volumenausschlußmittels
Diese Beispiele zeigen die Ausführung dieser Erfindung unter Verwendung mehrerer verschiedener Vervielfältigungsprotokolle, um eine Nukleinsäure niedriger Kopienzahl, provirale HIV1-DNA, in der Gegenwart einer Nukleinsäure hoher Kopienzahl, humane β-Globin-DNA, unter hochstringenten Bedingungen zu vervielfältigen und nachzuweisen.
Das oben beschriebene PCR-Reaktionsgemisch (200 μl) enthielt 10 Kopien proviraler HIV1-DNA und etwa 1 Million Kopien der humanen β-Globin-DNA und Primer (entweder 0,1 oder 0,4 μmol/l jeder der 4 Primer). Die Kontrollreaktionsgemische enthielten keine Volumenausschlußmittel während Gemische, die in der Ausführung dieser Erfindung verwendet wurden, 10% PEG-8000 enthielten. Die Kontrolltests A–D folgten jeweils dem PCR-Protokollen der Beispiele 1–4.
Im Beispiel 1 enthielt das PCR-Protokoll 40 erste Vervielfältigungszyklen, jeder Zyklus mit:

1) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden für die Denaturierung (195 Sekunden nur in dem ersten Zyklus) und
2) Primen (Anlagern) und Verlängerung bei 64°C für 30 Sekunden.

Das Protokoll des Beispiels 2 war zum Beispiel 1 ähnlich, mit dem Unterschied, daß die Primerverlängerungen in jedem Zyklus für 16 Sekunden ausgeführt wurden.
Im Beispiel 3 enthielt das PCR-Protokoll:

I) 20 erste Vervielfältigungszyklen, jeder Zyklus mit:
A) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden für die Denaturierung (195 Sekunden nur für den ersten Zyklus) und
B) Primen (Anlagern) Verlängerung bei 64°C für 30 Sekunden und
II) 20 zweite Vervielfältigungszyklen jeder Zyklus mit:
A) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden und
B) Primen (Anlagern) Verlängerung bei 64°C für 60 Sekunden.

Im Beispiel 4 enthielt das PCR-Protokoll:

I) 20 erste Vervielfältigungszyklen jeder Zyklus mit:
A) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden für die Denaturierung (195 Sekunden nur im ersten Zyklus) und
B) Primen (Anlagern) und Verlängerung bei 64°C für 30 Sekunden und
II) 20 zweite Vervielfältigunszyklen jeder Zyklus mit:
A) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden,
B) Denaturieren bei 75°C für 30 Sekunden und
C) Primern (Anlagern) und Verlängerung bei 64°C für 30 Sekunden.

Der Nachweis der Vervielfältigungsprodukte wurde in folgender Weise erreicht. Ein Teil (5 ml) des endgültigen Vervielfältigungsreaktionsgemischs wurde mit einer Pufferlösung [Tris(hydroxymethyl)aminomethan (10 mmol/l, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmol/l), Magnesiumchlorid (10 mmol/l) und Gelatine (0,01%)] (95 ml) gemischt und bei 95°C für 5 Minuten inkubiert, um die Nukleinsäuren zu denaturieren. Die sich ergebende Lösung wurde dann auf SURECELL^TM Testvorrichtungen (oben beschrieben) gegeben, so daß die vervielfältigten Zielnulcleinsäuren bei 50°C an die Fängersonden hybridisieren konnten.
Die Testvertiefungen der Testvorrichtungen wurden dann bei 55°C mit der erwähnten Waschlösung (250 μl) gewaschen. Die oben erwähnte Streptavidin-Peroxidasekonjugatlösung (50 μl) wurde dann zu jeder Testvertiefung hinzugefügt und es wurde ihr erlaubt bei Raumtemperatur durch die Membran hindurchzufließen. Nach zwei Minuten wurden die Testvertiefungen ein zweites Mal gewaschen.
Die oben erwähnte Leukofarbstoffdispersion (100 μl) wurde zu jeder Testvertiefung hinzugefügt und die Vorrichtung wurde bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert. Eine (100 μl) Natriumazidlösung (0,1%) wurde hinzugefügt, um die Farbentwicklung abzustoppen. Die sich ergebenden Farbsignale, die in den Testverfahren beobachtet wurden, wurden visuell auf einer Farbdichteskala von 0 bis 10 (höchste Dichte) bewertet.
Die Ergebnisse der Testverfahren für die verschiedenen Primermengen mit und ohne PEG-8000 werden unten in Tabelle I gezeigt. Es ist klar, daß in Gegenwart verringerter DNA-Polymerasemenge die Gegenwart des Volumenausschlußmittels die Effizienz der Vervielfältigung erhöhte. Dieses Ergebnis ist insbesondere offensichtlich, wenn 0,1 μmol/l jedes Primers in den Beispielen 2 und 3 verwendet wurden, obwohl mit jedem PCR-Protokoll ein Signalanstieg beobachtet wurde.
Tabelle I
Beispiel 5: Vergleich von PEG mit Dextransulfat
Dieses Beispiel vergleicht die Verwendung von PEG-8000 mit Dextransulfat als Volumenausschlußmittel in einer PCR, um eine Zielnukleinsäure, provirale HIV1-DNA, niedriger Kopienzahl zu vervielfältigen und nachzuweisen. Während die gemeinsame Vervielfältigung nicht durchgeführt wurde, zeigt dieses Experiment das Dextransulfat nicht als Volumenausschlußmittel in der PCR verwendet werden kann. Die Verwendung von PEG bei der gemeinsamen Vervielfältigung ist in den Beispielen 1–4 gezeigt worden.
Das oben beschrieben PCR-Reaktionsgemisch (200 μl) enthielt 12 Kopien proviraler HIV1-DNA und etwa 1 Million Kopien humaner plazentaler DNA (als Hintergrund) und Primer (0,2 μmol/l von jedem). Kontrollreaktionsgemische enthielten kein PEG-8000 oder Dextransulfat während andere Gemische 1–10% PEG-8000 oder Dextransulfat enthielten. Das PCR-Protokoll enthielt 40 erste Vervielfältigungszyklen, jeder Zyklus mit:

1) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden für die Denaturierung (195 Sekunden nur im ersten Zyklus) und
2) Primen (Anlagern) und Verlängerung bei 64°C für 30 Sekunden.

Der Nachweis der Vervielfältigungsprodukte wurde in der folgenden Weise erreicht. Ein Teil (5 ml) des endgültigen Vervielfältigungsreaktionsgemisches wurde mit einer Pufferlösung [Tris(hydroxymethyl)aminomethan (10 mmol/l, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmol/l), Magnesiumchlorid (10 mmol/l) und Gelatine (0,01%)] (95 ml) gemischt und bei 95°C für 5 Minuten inkubiert, um die Nukleinsäuren zu denaturieren. Die sich ergebende Lösung wurde dann auf SURECELL^TM Testvorrichtungen (oben beschrieben) gegeben, so daß die vervielfältigte Zielnukleinsäuren bei 50°C an die Fängersonden hybridisieren konnten.
Die Testvertiefungen der Testvorrichtungen wurden dann bei 55°C mit der erwähnten Waschlösung (250 μl) gewaschen. Die oben erwähnte Streptavidin-Peroxidasekonjugatlösung (50 μl) wurde dann zu jeder Testvertiefung hinzugegeben und es wurde ihr erlaubt bei Raumtemperatur durch die Membran hindurchzufließen. Nach zwei Minuten wurden die Testvertiefungen ein zweites Mal gewaschen.
Die oben erwähnte Leukofarbstoffdispersion (100 μl) wurde zu jeder Testvertiefung hinzugefügt und die Vorrichtung wurde bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert. Eine (100 μl) Natriumazidlösung (0,1%) wurde hinzugefügt, um die Farbentwicklung abzustoppen. Die sich ergebenden Farbsignale, die in den Testverfahren beobachtet wurden, wurden visuell auf einer Farbdichtenskala von 0 bis 10 (höchste Dichte) bewertet.
Die Ergebnisse des Testverfahren mit und ohne PEG-8000 oder Dextransulfat sind unten in Tabelle II gezeigt. Es ist klar das die Gegenwart von PEG-8000 die Effizienz der Vervielfältigung erhöhte, während die Gegenwart von Dextransulfat die PCR vollständig inhibiert.
Tabelle II

Claims

Verfahren für die gemeinsame Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei das Verfahren mindestens 15 erste Vervielfältigungszyklen umfaßt, wobei jeder erste Vervielfältigungszyklus die aufeinander folgenden Schritte: A) das Erhitzen eines Reaktionsgemisches aus zwei oder mehr Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte bei einer ersten Temperatur T1 zur Denaturierung der Stränge der Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte, B) das Primen der denaturierten Stränge mit einer Gruppe von Primen, die spezifisch für und hybridisierbar mit den entgegengesetzten Strängen jeder Zielnukleinsäure, die vervielfältigt werden soll, sind, durch Abkühlen auf eine zweite Temperatur T2 und C) entweder als Fortsetzung des Schritts B) oder in einem getrennten Schritt das Bilden eines Primerverlängerungsproduktes in einem Reaktionsgemisch aus PCR-Reagentien durch die Inkubation bei einer dritten Temperatur T3 umfaßt, vorausgesetzt, daß, wenn das Primen und das Bilden des Primerverlängerungsproduktes im selben Schritt ausgeführt werden, T2 und T3 gleich sind, wobei das Reaktionsgemisch in mindestens einem der ersten Vervielfältigungszyklen mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht-ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels umfaßt und wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Nukleinsäure hoher Kopienzahl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Volumenausschlußmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Polyether, einem Reaktionsprodukt eines Zuckers mit Epichlorhydrin, einem Polysaccharid und einem Polyakrylat.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Volumenausschlußmittel ein Polyether ist der die Formel: H-(O-R)_n-H aufweist, wobei R ein Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und n eine gerade Zahl von 15 bis 1000 bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Volumenausschlußmittel Poly(ethylenglycol) oder Poly(propylenglycol) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Volumenausschlußmittel ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 20.000 Dalton aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Volumenausschlußmittel in dem Reaktionsgemisch in einer Menge von etwa 4 bis etwa 12 Gew.-% vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Nukleinsäure eine Nukleinsäure hoher Kopienzahl ist, von der vermutet wird, daß sie mindestens mit der 1000-fachen Konzentration der Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jeder Primer jeder der Primergruppen für die Zielnukleinsäuren, die vervielfältigt werden sollen, in derselben Konzentration vorhanden ist, die mindestens etwa 0,025 und weniger als etwa 1 μmol/l beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei jeder Primer jeder der Primergruppen in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,2 μmol/l vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 7 des weiteren umfassend 5 weitere Vervielfältigungszyklen, wobei jeder weitere Zyklus aufeinander folgend die Wiederholung der Schritte A) bis C) umfaßt und des weiteren zwischen den Schritten A) und B) jedes weiteren Amplifikationszyklus das Reaktionsgemisch für von etwa 15 bis etwa 120 Sekunden auf eine vierte Temperatur T4 abgekühlt und dort gehalten wird, die durch: (TmH + 5)°C ≤ T4 ≤ TPH definiert ist, wobei T_mH die Schmelztemperatur der Primer für die Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und T_PH die Schmelztemperatur der Doppelstränge der Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte B) und C) für alle Zyklen dieselben sind und T2 und T3 dieselbe Temperatur, von etwa 62 bis etwa 70°C aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei einer oder beide Primer, der (die) für mindestens eine Nukleinsäure spezifisch ist (sind), biotinyliert ist (sind) und der Nachweis der vervielfältigten Zielnukleinsäure durch das Fangen des sich ergebenden vervielfältigten biotinylierten Stranges unter Verwendung eines ungelösten dazu komplementären Oligonukleotids und dem Nachweis des gefangenen biotinylierten Stranges mit einem nachweisbar markierten Streptavidinkonjugat ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Olignukleotid auf einem magnetischen oder einem Polymerpartikel immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jeder erste Vervielfältigungszyklus für etwa von 30 bis zu etwa 120 Sekunden ausgeführt wird.
Ein Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren und den Nachweis von einer oder mehr der Zielnukleinsäuren, wobei das Verfahren mindestens 15 erste Vervielfältigungszyklen umfaßt, wobei jeder erste Vervielfältigungszyklus aufeinander folgend die Schritte: A) das Erhitzen eines Reaktionsgemisches aus zwei oder mehr Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte auf eine erste Temperatur T1 zur Denaturierung der Stränge der Zielnukleinsäuren oder ihrer Primerverlängerungsprodukte, B) das Primen der denaturierten Stränge mit einer Gruppe von Primen, die spezifisch für und hybridisierbar mit dem entgegengesetzten Strängen jeder Zielnukleinsäure, die amplifiziert werden soll, sind durch Abkühlen auf eine zweite Temperatur T2, C) entweder als Fortsetzung des Schritts B) oder in einem separaten Schritt das Bilden von Primerverlängerungsprodukten in einem Reaktionsgemisch aus PCR-Reagentien durch Inkubation bei einer dritten Temperatur T3, unter der Voraussetzung, daß, wenn das Primen und die Primerverlängerungsproduktbildung im selben Schritt ausgeführt werden, T2 und T3 gleich sind, wobei das Reaktionsgemisch in mindestens einem der ersten Vervielfältigungszyklen mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht-ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels umfaßt, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure ein Ziel hoher Kopienzahl ist und D) nach dem letzten ersten Amplifikationszyklus das Nachweisen einer oder mehrere der Primerverlängerungsprodukte als Hinweis auf eine oder mehrere der Zielnukleinsäuren umfaßt.
Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und wobei das Verfahren eine Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung verwendet, die auf einen pH von etwa 7,5 bis etwa 9 gepuffert ist und: ein oder mehrere Primergruppen, eine thermostabile DNA-Polymerase, eine Vielzahl von dNTP's und mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht ionischen, polymeren Volumenausschlußmittels umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei: jeder Primer jeder der Primergruppen mit derselben Konzentration vorhanden ist, die weniger als etwa 1 μmol/l beträgt und das Volumenausschlußmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Polyether, einem Reaktionsprodukts eines Zuckers mit Epichlorhydrin, einem Polysaccharid und einem Polyakrylat, ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 20.000 Dalton aufweist und in dem Reaktionsgemisch in einer Menge von etwa 4 bis etwa 12 Gew.-% vorhanden ist.
Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopien zahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und wobei das Verfahren ein Test-Kit verwendet, das einzeln verpackt: a) eine Vervielfältigungsreaktionzusammensetzung, die auf einer pH von etwa 7,5 bis etwa 9 gepuffert ist und die: ein oder mehrere Primergruppen, eine thermostabile DNA-Polymerase, eine Vielzahl von dNPT's und mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht ionischen, polymeren Volumenausschlußmittel umfaßt und b) ein Fängermittel, das ein Oligonukleotide, das auf einem wasserlösliche Substrat immobilisiert ist, umfaßt, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei: jeder Primer jeder der Primergruppen mit derselben Konzentration von weniger als etwa 1 μmol/l vorhanden ist, das Volumenausschlußmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Polyether, einem Reaktionsprodukt eines Zuckers mit Epichlorhydrin, einem Polysaccharid und einem Polyakrylat, ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 20.000 Dalton aufweist und in dem Reaktionsgemisch in einer Menge von etwa 4 bis etwa 12 Gew.-% vorhanden ist und das das Fängermittel magnetische oder polymere Partikel umfaßt.
Verfahren für die gleichzeitige Vervielfältigung von zwei oder mehr Zielnukleinsäuren, wobei mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure niedriger Kopienzahl ist und mindestens eine Zielnukleinsäure eine Zielnukleinsäure hoher Kopienzahl ist und wobei das Verfahren eine in sich geschlossene Testvorrichtung verwendet, die in getrennten Abteilungen: a) eine Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung, die auf einen pH von etwa 7,5 bis etwa 9 gepuffert ist und die: ein oder mehrere Primergruppen, eine thermostabile DNA-Polymerase, eine Vielzahl von dNTP's und mindestens etwa 4 Gew.-% eines nicht ionischen polymeren Volumenausschlußmittels umfaßt und b) ein Fängermittel, das ein Oligonukleotid, das auf einem wasserunlöslichen Substrat immobilisiert ist, umfaßt, umfaßt, wobei die Abteilungen in der Testvorrichtung verbunden sind, so daß die Vervielfältigungsreaktionszusammensetzung nach der Vervielfältigung mit dem Fängermittel ohne das Öffnen der Testvorrichtung in Kontakt gebracht werden kann.