JPH08103300A - 核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置 - Google Patents
核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置Info
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- JPH08103300A JPH08103300A JP7236899A JP23689995A JPH08103300A JP H08103300 A JPH08103300 A JP H08103300A JP 7236899 A JP7236899 A JP 7236899A JP 23689995 A JP23689995 A JP 23689995A JP H08103300 A JPH08103300 A JP H08103300A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ２種以上の標的核酸を迅速且つ効率的に同時
増幅すること。 【解決手段】 少なくとも１５回の一次増幅サイクルを
含む２種以上の標的核酸を同時増幅する方法。前記一次
増幅サイクルの各々は、Ａ）２種以上の標的核酸又はそ
れらのプライマー伸長生成物の反応混合物を変性するた
めに加熱する工程、Ｂ）冷却することによって、増幅す
べき各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダ
イズ可能な一組のプライマーで前記変性鎖をプライミン
グする工程及びＣ）ＰＣＲ試薬の反応混合物中でプライ
マー伸長生成物を形成させる工程を逐次工程として含
む。前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前
記反応混合物は、非イオン性で高分子量の体積排除剤を
含む。
増幅すること。 【解決手段】 少なくとも１５回の一次増幅サイクルを
含む２種以上の標的核酸を同時増幅する方法。前記一次
増幅サイクルの各々は、Ａ）２種以上の標的核酸又はそ
れらのプライマー伸長生成物の反応混合物を変性するた
めに加熱する工程、Ｂ）冷却することによって、増幅す
べき各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダ
イズ可能な一組のプライマーで前記変性鎖をプライミン
グする工程及びＣ）ＰＣＲ試薬の反応混合物中でプライ
マー伸長生成物を形成させる工程を逐次工程として含
む。前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前
記反応混合物は、非イオン性で高分子量の体積排除剤を
含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、反応混合物中に体
積排除剤(volume exclusion agent)を使用して２種以上
の二本鎖核酸を迅速に同時増幅する方法に関する。本発
明はまた、本発明の方法を実施する上で有用な反応組成
物、試験キット及び試験装置にも関する。
積排除剤(volume exclusion agent)を使用して２種以上
の二本鎖核酸を迅速に同時増幅する方法に関する。本発
明はまた、本発明の方法を実施する上で有用な反応組成
物、試験キット及び試験装置にも関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、核酸の検出は、ヒトや動物の被検
体中に非常に少量で存在する染色体の特徴、感染性因子
及び各種生物を早期に検出するための手段として成長し
ている。検出手順は、通常、（ヌクレオチド対として知
られている）相補的ヌクレオチド間の水素結合やその他
の力によって２本のＤＮＡ鎖が一緒に結合する相補性の
概念に基づくものである。ＤＮＡ分子は、通常はかなり
安定であるが、その鎖は、加熱などの特定の条件によっ
て分離又は変性させることができる。変性された鎖は、
相補的配列を有する別のヌクレオチド鎖とのみ再会合す
る。
体中に非常に少量で存在する染色体の特徴、感染性因子
及び各種生物を早期に検出するための手段として成長し
ている。検出手順は、通常、（ヌクレオチド対として知
られている）相補的ヌクレオチド間の水素結合やその他
の力によって２本のＤＮＡ鎖が一緒に結合する相補性の
概念に基づくものである。ＤＮＡ分子は、通常はかなり
安定であるが、その鎖は、加熱などの特定の条件によっ
て分離又は変性させることができる。変性された鎖は、
相補的配列を有する別のヌクレオチド鎖とのみ再会合す
る。
【０００３】分子数の非常に少ないＤＮＡを検出するた
めの方法を見い出すため、多大な研究が行われている。
検出のために被検体中の核酸数を増幅する又は大幅に複
製する各種の手法が知られており、ほぼ１０年間にわた
り用いられている。このような増幅技法には、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）、その他開発の遅れている方法、が含まれる。ＰＣ
Ｒ法が最もよく知られている方法であって、ＤＮＡ重合
剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸を存在させて適
当な条件下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイ
ズさせる工程を含む。複数回のサイクルを通してプライ
マー伸長生成物が形成され、最初の標的鎖の数が指数的
に増加することになる。ＰＣＲに関する詳細は、米国特
許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第
４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，
９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されてい
る。
めの方法を見い出すため、多大な研究が行われている。
検出のために被検体中の核酸数を増幅する又は大幅に複
製する各種の手法が知られており、ほぼ１０年間にわた
り用いられている。このような増幅技法には、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）、その他開発の遅れている方法、が含まれる。ＰＣ
Ｒ法が最もよく知られている方法であって、ＤＮＡ重合
剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸を存在させて適
当な条件下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイ
ズさせる工程を含む。複数回のサイクルを通してプライ
マー伸長生成物が形成され、最初の標的鎖の数が指数的
に増加することになる。ＰＣＲに関する詳細は、米国特
許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第
４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，
９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されてい
る。
【０００４】ヒトや動物の被検体は、多種多様な核酸を
含有し、ヒトや動物に内因する（又は天然の）ものもあ
れば、感染性因子の存在や発ガン性条件といった何らか
の異常な条件が原因となって発生するものもある。通
常、こうした核酸は内因性の核酸よりも非常に低濃度で
存在する。これらを「コピー数の少ない」核酸と呼ぶこ
とがある。対照的に、内因性の核酸は高濃度で存在する
ことが普通であり、これらを「コピー数の多い」核酸と
称する場合がある。このような核酸の一例として、ヒト
β−グロブリンＤＮＡが挙げられる。
含有し、ヒトや動物に内因する（又は天然の）ものもあ
れば、感染性因子の存在や発ガン性条件といった何らか
の異常な条件が原因となって発生するものもある。通
常、こうした核酸は内因性の核酸よりも非常に低濃度で
存在する。これらを「コピー数の少ない」核酸と呼ぶこ
とがある。対照的に、内因性の核酸は高濃度で存在する
ことが普通であり、これらを「コピー数の多い」核酸と
称する場合がある。このような核酸の一例として、ヒト
β−グロブリンＤＮＡが挙げられる。
【０００５】ＰＣＲ法を実施すると、被検体中に存在す
る２種以上の核酸が同じ反応容器内で同時に増幅される
ことがよくある。このことを本明細書では「同時増幅」
と称することとする。この方法では、増幅すべき核酸の
各々に対するプライマーを容器内に同時に存在させなけ
ればならない。このような状況下でコピー数の少ない標
的核酸とコピー数の多い標的核酸を共に増幅させると、
コピー数の少ない標的核酸の増幅が阻害されることが多
い。この原因は、増幅サイクルの後の方でコピー数の多
い標的核酸によって増幅酵素（例、ＤＮＡポリメラー
ゼ）が飽和するためである。コピー数の少ない標的核酸
の存在については偽陰性という結論になりやすく、重大
な結果をもたらす恐れがある。
る２種以上の核酸が同じ反応容器内で同時に増幅される
ことがよくある。このことを本明細書では「同時増幅」
と称することとする。この方法では、増幅すべき核酸の
各々に対するプライマーを容器内に同時に存在させなけ
ればならない。このような状況下でコピー数の少ない標
的核酸とコピー数の多い標的核酸を共に増幅させると、
コピー数の少ない標的核酸の増幅が阻害されることが多
い。この原因は、増幅サイクルの後の方でコピー数の多
い標的核酸によって増幅酵素（例、ＤＮＡポリメラー
ゼ）が飽和するためである。コピー数の少ない標的核酸
の存在については偽陰性という結論になりやすく、重大
な結果をもたらす恐れがある。
【０００６】こうしたＰＣＲにまつわる問題に対して
は、プライマー濃度を調節する方法、特殊な融解温度
（Ｔm ）を示すプライマー組を使用する方法、或いはこ
れらを組み合わせた方法をはじめとする様々な解決策が
提案されている。プライマー比率を調節する方法を当該
技術分野ではＰＣＲ収率を「プライマーバイアスする」
と呼び、コピー数の多い標的核酸に対するプライマーの
濃度を低下させる必要がある。この方法では、プロセス
を適当にしか制御することができない。
は、プライマー濃度を調節する方法、特殊な融解温度
（Ｔm ）を示すプライマー組を使用する方法、或いはこ
れらを組み合わせた方法をはじめとする様々な解決策が
提案されている。プライマー比率を調節する方法を当該
技術分野ではＰＣＲ収率を「プライマーバイアスする」
と呼び、コピー数の多い標的核酸に対するプライマーの
濃度を低下させる必要がある。この方法では、プロセス
を適当にしか制御することができない。
【０００７】別の同時増幅方法は、コピー数の多い標的
核酸に対するプライマーがコピー数の少ない標的核酸に
対するプライマーよりもアニールの程度が低くなるよう
に、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を調節する方法で
ある。この方法にも問題がある。プライマー対の間のＴ
m 差が比較的大きくなければ、コピー数の多い標的核酸
とコピー数の少ない標的核酸との収率の差に基づいてＰ
ＣＲを良好に変調することはできない。正確なＴm を
（概算は可能であるが）計算することはできないため、
これを測定する必要がある。これは多大な労力を要し、
大変である。
核酸に対するプライマーがコピー数の少ない標的核酸に
対するプライマーよりもアニールの程度が低くなるよう
に、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を調節する方法で
ある。この方法にも問題がある。プライマー対の間のＴ
m 差が比較的大きくなければ、コピー数の多い標的核酸
とコピー数の少ない標的核酸との収率の差に基づいてＰ
ＣＲを良好に変調することはできない。正確なＴm を
（概算は可能であるが）計算することはできないため、
これを測定する必要がある。これは多大な労力を要し、
大変である。
【０００８】これらの同時増幅を変調するための方法
は、いずれもコピー数の多い標的核酸とコピー数の少な
い標的核酸の配列が知られていることが必要である。別
法として、ＰＣＲの後の方のサイクルにおけるプライミ
ング工程又は伸長工程の時間を延長することによって、
コピー数の多い標的核酸によるＤＮＡポリメラーゼの飽
和を最小限に抑え、増幅効率を向上させることができ
る。しかしながら、この解決策は、様々な濃度で存在す
る多種多様な核酸が同時に増幅される状況でしか有用で
はない。
は、いずれもコピー数の多い標的核酸とコピー数の少な
い標的核酸の配列が知られていることが必要である。別
法として、ＰＣＲの後の方のサイクルにおけるプライミ
ング工程又は伸長工程の時間を延長することによって、
コピー数の多い標的核酸によるＤＮＡポリメラーゼの飽
和を最小限に抑え、増幅効率を向上させることができ
る。しかしながら、この解決策は、様々な濃度で存在す
る多種多様な核酸が同時に増幅される状況でしか有用で
はない。
【０００９】硫酸デキストランやポリエチレングリコー
ルなどの体積排除剤の存在下では、こうした剤が占める
溶液の体積から核酸が排除されるために、核酸のハイブ
リダイゼーション速度がかなり増加することが知られて
いる〔Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, page 9.50, 1989 、及び米国特許第５，１０
６，７３０号明細書(Van Ness ら) 〕。この排除効果が
溶液中の核酸の有効濃度を高めることにより、ハイブリ
ダイゼーション速度が増加する。こうして、これらの物
質は望ましくない逆反応を前方へ「推進する」ために反
応混合物へ日常的に添加されている。例えば、これらを
反応混合物へ添加してリガーゼ反応を「推進する」こと
が米国特許第５，１８５，２４３号(Ullman ら) 及び同
第５，１９４，３７０号(Berningerら) 明細書に記載さ
れている。
ルなどの体積排除剤の存在下では、こうした剤が占める
溶液の体積から核酸が排除されるために、核酸のハイブ
リダイゼーション速度がかなり増加することが知られて
いる〔Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, page 9.50, 1989 、及び米国特許第５，１０
６，７３０号明細書(Van Ness ら) 〕。この排除効果が
溶液中の核酸の有効濃度を高めることにより、ハイブリ
ダイゼーション速度が増加する。こうして、これらの物
質は望ましくない逆反応を前方へ「推進する」ために反
応混合物へ日常的に添加されている。例えば、これらを
反応混合物へ添加してリガーゼ反応を「推進する」こと
が米国特許第５，１８５，２４３号(Ullman ら) 及び同
第５，１９４，３７０号(Berningerら) 明細書に記載さ
れている。
【００１０】しかしながら、ハイブリダイゼーション速
度は体積排除剤によって増加するが、ハイブリダイゼー
ションの速度が通常遅い場合、又は核酸が反応において
律速する場合を除いて、Sambrookらはそれらの使用を薦
めてはいない。また、これらの剤は時として高いバック
グラウンドをもたらすこと、さらには得られた溶液の粘
度が高くなるためにその取扱いがより一層困難になるこ
とが知られている。こうして、当該技術分野では、体積
排除剤は特定のハイブリダイゼーション条件に限定され
るべきであるとされており、また上記特許明細書が示す
ように、実際には逆反応を前方へ「推進させる」場合に
のみ体積排除剤が用いられている。というのは、そうし
なければ反応が適当な速度で起こらないからである。
度は体積排除剤によって増加するが、ハイブリダイゼー
ションの速度が通常遅い場合、又は核酸が反応において
律速する場合を除いて、Sambrookらはそれらの使用を薦
めてはいない。また、これらの剤は時として高いバック
グラウンドをもたらすこと、さらには得られた溶液の粘
度が高くなるためにその取扱いがより一層困難になるこ
とが知られている。こうして、当該技術分野では、体積
排除剤は特定のハイブリダイゼーション条件に限定され
るべきであるとされており、また上記特許明細書が示す
ように、実際には逆反応を前方へ「推進させる」場合に
のみ体積排除剤が用いられている。というのは、そうし
なければ反応が適当な速度で起こらないからである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】１種以上の標的核酸
を、１種以上の別の標的核酸の存在下で同時増幅させた
場合に、上記の問題が解決されるように迅速且つ効率的
に増幅する方法が望まれる。
を、１種以上の別の標的核酸の存在下で同時増幅させた
場合に、上記の問題が解決されるように迅速且つ効率的
に増幅する方法が望まれる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の問題は、少なくと
も１５回の一次増幅サイクルを含む２種以上の標的核酸
を同時増幅する方法であって、前記一次増幅サイクルの
各々が、 Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生
成物の反応混合物を、前記標的核酸又はそれらのプライ
マー伸長生成物の鎖を変性するために第一温度Ｔ1 に加
熱する工程、 Ｂ）第二温度Ｔ2 まで冷却することによって、増幅すべ
き各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイ
ズすることができる一組のプライマーで前記変性された
鎖をプライミングする工程、及び Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
第三温度Ｔ3 におけるインキュベーションによってＰＣ
Ｒ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸
長生成物形成工程とを同一工程で実施する場合にはＴ2
とＴ3 は同じである〕、を逐次工程として含み、そして
前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前記反
応混合物が、非イオン性で高分子量の体積排除剤を約４
重量％以上含む、核酸の同時増幅方法によって解決され
た。
も１５回の一次増幅サイクルを含む２種以上の標的核酸
を同時増幅する方法であって、前記一次増幅サイクルの
各々が、 Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生
成物の反応混合物を、前記標的核酸又はそれらのプライ
マー伸長生成物の鎖を変性するために第一温度Ｔ1 に加
熱する工程、 Ｂ）第二温度Ｔ2 まで冷却することによって、増幅すべ
き各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイ
ズすることができる一組のプライマーで前記変性された
鎖をプライミングする工程、及び Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
第三温度Ｔ3 におけるインキュベーションによってＰＣ
Ｒ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸
長生成物形成工程とを同一工程で実施する場合にはＴ2
とＴ3 は同じである〕、を逐次工程として含み、そして
前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前記反
応混合物が、非イオン性で高分子量の体積排除剤を約４
重量％以上含む、核酸の同時増幅方法によって解決され
た。
【００１３】本発明はまた、少なくとも１５回の一次増
幅サイクルを含む２種以上の標的核酸を同時増幅して前
記標的核酸の１種以上を検出する方法であって、前記一
次増幅サイクルの各々が、 Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生
成物の反応混合物を、前記標的核酸又はそれらのプライ
マー伸長生成物の鎖を変性するために第一温度Ｔ1 に加
熱する工程、 Ｂ）第二温度Ｔ2 まで冷却することによって、増幅すべ
き各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイ
ズすることができる一組のプライマーで前記変性された
鎖をプライミングする工程、及び Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
第三温度Ｔ3 におけるインキュベーションによってＰＣ
Ｒ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸
長生成物形成工程とを同一工程で実施する場合にはＴ2
とＴ3 は同じである〕、を逐次工程として含み、その
際、前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前
記反応混合物が、非イオン性で高分子量の体積排除剤を
約４重量％以上含み、そして Ｄ）最後の一次増幅サイクル終了後、前記標的核酸の１
種以上を示すものとして前記プライマー伸長生成物の１
種以上を検出する工程、を含む、核酸の同時増幅／検出
方法をも提供する。
幅サイクルを含む２種以上の標的核酸を同時増幅して前
記標的核酸の１種以上を検出する方法であって、前記一
次増幅サイクルの各々が、 Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生
成物の反応混合物を、前記標的核酸又はそれらのプライ
マー伸長生成物の鎖を変性するために第一温度Ｔ1 に加
熱する工程、 Ｂ）第二温度Ｔ2 まで冷却することによって、増幅すべ
き各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイ
ズすることができる一組のプライマーで前記変性された
鎖をプライミングする工程、及び Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
第三温度Ｔ3 におけるインキュベーションによってＰＣ
Ｒ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸
長生成物形成工程とを同一工程で実施する場合にはＴ2
とＴ3 は同じである〕、を逐次工程として含み、その
際、前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前
記反応混合物が、非イオン性で高分子量の体積排除剤を
約４重量％以上含み、そして Ｄ）最後の一次増幅サイクル終了後、前記標的核酸の１
種以上を示すものとして前記プライマー伸長生成物の１
種以上を検出する工程、を含む、核酸の同時増幅／検出
方法をも提供する。
【００１４】さらに本発明は、一組以上のプライマー
と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰ
と、約４重量％以上の非イオン性で高分子量の体積排除
剤とを含み、ｐＨを約７．５〜約９に緩衝化された増幅
反応用組成物を提供する。また、本発明は、ａ）一組以
上のプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、複数
種のｄＮＴＰと、約４重量％以上の非イオン性で高分子
量の体積排除剤とを含み、ｐＨを約７．５〜約９に緩衝
化された増幅反応用組成物、及び ｂ）水不溶性担体に固定されたオリゴヌクレオチドを含
む捕捉試薬が個別に包装されて含まれている試験キット
をも提供する。
と、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰ
と、約４重量％以上の非イオン性で高分子量の体積排除
剤とを含み、ｐＨを約７．５〜約９に緩衝化された増幅
反応用組成物を提供する。また、本発明は、ａ）一組以
上のプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、複数
種のｄＮＴＰと、約４重量％以上の非イオン性で高分子
量の体積排除剤とを含み、ｐＨを約７．５〜約９に緩衝
化された増幅反応用組成物、及び ｂ）水不溶性担体に固定されたオリゴヌクレオチドを含
む捕捉試薬が個別に包装されて含まれている試験キット
をも提供する。
【００１５】さらに本発明は、ａ）一組以上のプライマ
ーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰ
と、約４重量％以上の非イオン性で高分子量の体積排除
剤とを含み、ｐＨを約７．５〜約９に緩衝化された増幅
反応用組成物、及び ｂ）水不溶性担体に固定されたオリゴヌクレオチドを含
む捕捉試薬を別々の区分室に含む自蔵式(self-containe
d)試験装置であって、前記区分室は、前記試験装置内に
おいて、前記増幅反応用組成物が増幅後に前記試験装置
を開放することなく前記捕捉試薬と接触されうるように
連結されている自蔵式試験装置をも提供する。
ーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰ
と、約４重量％以上の非イオン性で高分子量の体積排除
剤とを含み、ｐＨを約７．５〜約９に緩衝化された増幅
反応用組成物、及び ｂ）水不溶性担体に固定されたオリゴヌクレオチドを含
む捕捉試薬を別々の区分室に含む自蔵式(self-containe
d)試験装置であって、前記区分室は、前記試験装置内に
おいて、前記増幅反応用組成物が増幅後に前記試験装置
を開放することなく前記捕捉試薬と接触されうるように
連結されている自蔵式試験装置をも提供する。
【００１６】本発明は、ある核酸を、同時増幅されてい
る他の１種以上の核酸の混合物中で優先的に増幅するた
めの非常に迅速で効率のよい方法を提供するものであ
る。例えば、本発明を利用して、増幅されたコピー数の
多い標的核酸の中でコピー数の少ない標的核酸を優先的
に増幅して検出することができる。このような場合、コ
ピー数の多い標的核酸によるコピー数の少ない標的核酸
の増幅阻害は低減される。他の場合として、本発明を利
用して、様々な理由のためにある種の標的核酸の増幅を
他の核酸の中で操作することができる。
る他の１種以上の核酸の混合物中で優先的に増幅するた
めの非常に迅速で効率のよい方法を提供するものであ
る。例えば、本発明を利用して、増幅されたコピー数の
多い標的核酸の中でコピー数の少ない標的核酸を優先的
に増幅して検出することができる。このような場合、コ
ピー数の多い標的核酸によるコピー数の少ない標的核酸
の増幅阻害は低減される。他の場合として、本発明を利
用して、様々な理由のためにある種の標的核酸の増幅を
他の核酸の中で操作することができる。
【００１７】本発明の利点は、少なくとも１回の増幅サ
イクルにおいて増幅反応混合物中に水溶性又は水膨潤性
の非イオン性で高分子量の体積排除剤を含ませることに
よって実現される。この剤の存在によって、ユーザーは
核酸の効率的な増幅に必要なプライマーの量を削減する
ことができ、ひいてはこの削減によってある種の核酸が
優先的に増幅されるように工程を操作することが可能に
なる。こうして、プライマーを速度制限反応体として使
用することができる。
イクルにおいて増幅反応混合物中に水溶性又は水膨潤性
の非イオン性で高分子量の体積排除剤を含ませることに
よって実現される。この剤の存在によって、ユーザーは
核酸の効率的な増幅に必要なプライマーの量を削減する
ことができ、ひいてはこの削減によってある種の核酸が
優先的に増幅されるように工程を操作することが可能に
なる。こうして、プライマーを速度制限反応体として使
用することができる。
【００１８】さらに、体積排除剤は、増幅反応生成物の
再生速度を増加し、コピー数の少ない標的核酸に対して
コピー数の多い標的核酸の増幅効率をさらに低下させ
る。好ましい実施態様では、増幅に用いられる各プライ
マーの濃度は常用のレベルよりもかなり低い濃度であ
る。こうした低濃度でも可能である理由は、体積排除剤
が存在するからであり、これにより複数種の標的核酸の
同時増幅をさらに操作することができる。
再生速度を増加し、コピー数の少ない標的核酸に対して
コピー数の多い標的核酸の増幅効率をさらに低下させ
る。好ましい実施態様では、増幅に用いられる各プライ
マーの濃度は常用のレベルよりもかなり低い濃度であ
る。こうした低濃度でも可能である理由は、体積排除剤
が存在するからであり、これにより複数種の標的核酸の
同時増幅をさらに操作することができる。
【００１９】当該技術分野の教示、特にSambrookらの教
示を鑑みれば、それらの増幅方法ではハイブリダイゼー
ション速度がかなり高く、また標的核酸は速度制限量で
は存在しないので、増幅方法に体積排除剤を使用する者
はいないであろう。その上、これらの剤は望ましくない
すべての反応を「推進」し、望ましくない生成物を相当
量発生させてしまうと予想されるであろう。これは本発
明の場合には当てはまらないようである。従って、本発
明により得られる利点は予想できなかった。
示を鑑みれば、それらの増幅方法ではハイブリダイゼー
ション速度がかなり高く、また標的核酸は速度制限量で
は存在しないので、増幅方法に体積排除剤を使用する者
はいないであろう。その上、これらの剤は望ましくない
すべての反応を「推進」し、望ましくない生成物を相当
量発生させてしまうと予想されるであろう。これは本発
明の場合には当てはまらないようである。従って、本発
明により得られる利点は予想できなかった。
【００２０】本発明の増幅手法は、「ストリンジェンシ
ーの高い」として知られている条件下で実施される。す
なわち、プライマーは、ストリンジェントな温度、ｐＨ
及びその他の反応条件下で比較的迅速に興味のある標的
核酸鎖に特異的にハイブリダイズすることを意味する。
ーの高い」として知られている条件下で実施される。す
なわち、プライマーは、ストリンジェントな温度、ｐＨ
及びその他の反応条件下で比較的迅速に興味のある標的
核酸鎖に特異的にハイブリダイズすることを意味する。
【００２１】ポリメラーゼ連鎖反応を利用して核酸を増
幅及び検出するための一般原理及び条件についてはよく
知られている。その詳細については、米国特許第４，６
８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第
４，９６５，１８８号明細書（上記）をはじめとする多
くの文献に記載されており、本明細書ではそのすべてを
参照することにより取り入れることとする。当該技術分
野における教示と本明細書に記載した特別な教示とを鑑
みれば、当業者であれば本明細書に記載に従い本発明を
実施して、一方がコピー数の少ない標的核酸である２種
以上の核酸を同時増幅することは容易である。
幅及び検出するための一般原理及び条件についてはよく
知られている。その詳細については、米国特許第４，６
８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第
４，９６５，１８８号明細書（上記）をはじめとする多
くの文献に記載されており、本明細書ではそのすべてを
参照することにより取り入れることとする。当該技術分
野における教示と本明細書に記載した特別な教示とを鑑
みれば、当業者であれば本明細書に記載に従い本発明を
実施して、一方がコピー数の少ない標的核酸である２種
以上の核酸を同時増幅することは容易である。
【００２２】本発明は、好ましくは、被検体中の１種以
上のコピー数の少ない標的核酸中に存在する１種以上の
特異的核酸配列を、１種以上のコピー数の多い標的核酸
中に存在する１種以上の核酸配列を同時に増幅させなが
ら、増幅して検出することに関する。被検体中に存在す
るコピー数の少ない標的核酸の量は約１０-16 モル濃度
未満であることが一般的ではあるが、しかしながら、そ
の量は、コピー数の多い核酸がはるかに多量に、例えば
１０００倍以上の濃度で、存在する場合には、さらに多
くなることもある。一般に、コピー数の多い標的核酸は
単コピー遺伝子に関連しているものである一方、コピー
数の少ない標的核酸はヒトや動物における感染性因子、
ガン、その他病理状態に関連しているものである。
上のコピー数の少ない標的核酸中に存在する１種以上の
特異的核酸配列を、１種以上のコピー数の多い標的核酸
中に存在する１種以上の核酸配列を同時に増幅させなが
ら、増幅して検出することに関する。被検体中に存在す
るコピー数の少ない標的核酸の量は約１０-16 モル濃度
未満であることが一般的ではあるが、しかしながら、そ
の量は、コピー数の多い核酸がはるかに多量に、例えば
１０００倍以上の濃度で、存在する場合には、さらに多
くなることもある。一般に、コピー数の多い標的核酸は
単コピー遺伝子に関連しているものである一方、コピー
数の少ない標的核酸はヒトや動物における感染性因子、
ガン、その他病理状態に関連しているものである。
【００２３】さらに、アッセイではコピー数の多い標的
核酸を「陽性対照」として使用することができる。コピ
ー数の多い標的核酸のＰＣＲ効率を変調することによ
り、ＰＣＲが効率的に行われた場合にのみ陽性対照は検
出可能となるので、偽陰性の可能性が低下する。このよ
うな場合、コピー数の多い標的核酸は、コピー数の少な
い標的核酸の１０倍以上の濃度で存在することができ
る。
核酸を「陽性対照」として使用することができる。コピ
ー数の多い標的核酸のＰＣＲ効率を変調することによ
り、ＰＣＲが効率的に行われた場合にのみ陽性対照は検
出可能となるので、偽陰性の可能性が低下する。このよ
うな場合、コピー数の多い標的核酸は、コピー数の少な
い標的核酸の１０倍以上の濃度で存在することができ
る。
【００２４】被検体は、細胞、ウイルス、毛髪、体液又
は検出可能な遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する他の材
料であることができる。標的核酸は、プラスミドや、
（細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物又はヒトなど
の）何らかのソースから得られる天然ＤＮＡ又はＲＮＡ
をはじめとする様々なソースから得ることができる。そ
れは、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、他の組織
材料又は当該技術分野で知られている他のソースをはじ
めとする様々な組織から周知の方法で抽出されることが
できる。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、プロウ
イルスＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌
若しくはウイルスに感染された細胞中のＤＮＡ若しくは
ＲＮＡ、に存在する核酸配列の同時増幅及び検出に特に
有用である。さらに、本発明を利用して、癌マーカーに
係わる核酸配列を増幅し検出することも可能である。
は検出可能な遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する他の材
料であることができる。標的核酸は、プラスミドや、
（細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物又はヒトなど
の）何らかのソースから得られる天然ＤＮＡ又はＲＮＡ
をはじめとする様々なソースから得ることができる。そ
れは、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、他の組織
材料又は当該技術分野で知られている他のソースをはじ
めとする様々な組織から周知の方法で抽出されることが
できる。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、プロウ
イルスＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌
若しくはウイルスに感染された細胞中のＤＮＡ若しくは
ＲＮＡ、に存在する核酸配列の同時増幅及び検出に特に
有用である。さらに、本発明を利用して、癌マーカーに
係わる核酸配列を増幅し検出することも可能である。
【００２５】検出可能な細菌には、ヒトの血液中にある
細菌、サルモネラ(Salmonella)種、クラミジア(Chlamyd
ia) 種、淋菌(Neisseria) 種、シゲラ(Shigella)種及び
マイコバクテリウム(Mycobacterium) 種が含まれるが、
これらに限定はされない。検出可能なウイルスには、単
純ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、ヒ
トサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝
炎ウイルス並びにＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩ
Ｖ１及びＨＩＶ２のようなレトロウイルスが含まれる
が、これらに限定はされない。原生動物の寄生虫、酵母
及びカビもまた検出可能である。当業者であればその他
の検出可能な種は明らかである。本発明は、レトロウイ
ルスＤＮＡ（ＨＩＶ１やＨＩＶ２）又はマイコバクテリ
ウム種に関連したＤＮＡの存在を検出するのに特に有用
である。本発明を、ＨＩＶ１、プロウイルスＨＩＶ１、
ＨＩＶ２又はプロウイルスＨＩＶ２に関連したＤＮＡの
検出に使用することが最も好ましい。
細菌、サルモネラ(Salmonella)種、クラミジア(Chlamyd
ia) 種、淋菌(Neisseria) 種、シゲラ(Shigella)種及び
マイコバクテリウム(Mycobacterium) 種が含まれるが、
これらに限定はされない。検出可能なウイルスには、単
純ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、ヒ
トサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝
炎ウイルス並びにＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩ
Ｖ１及びＨＩＶ２のようなレトロウイルスが含まれる
が、これらに限定はされない。原生動物の寄生虫、酵母
及びカビもまた検出可能である。当業者であればその他
の検出可能な種は明らかである。本発明は、レトロウイ
ルスＤＮＡ（ＨＩＶ１やＨＩＶ２）又はマイコバクテリ
ウム種に関連したＤＮＡの存在を検出するのに特に有用
である。本発明を、ＨＩＶ１、プロウイルスＨＩＶ１、
ＨＩＶ２又はプロウイルスＨＩＶ２に関連したＤＮＡの
検出に使用することが最も好ましい。
【００２６】「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに一般に用い
られるすべての試薬、すなわち、各標的核酸の対向鎖に
対する一組のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、Ｄ
ＮＡポリメラーゼコファクターと、２種以上のデオキシ
リボヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）とを意
味する。「プライマー」とは、核酸鎖（すなわち、鋳
型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導され
る条件下に置かれた場合にその合成開始点として作用し
うる天然の又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味す
る。このような条件には、他のＰＣＲ試薬の存在並びに
好適な温度及びｐＨが含まれる。通常、このような条件
は、非特異的増幅が最小限に抑えられるような「ストリ
ンジェンシーの高い」条件として知られている条件であ
る。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長
生成物の合成を引き起こすに十分な長さを有する必要が
ある。各プライマーの正確なサイズは、使用法、標的配
列の複雑さ、反応温度及びプライマーの出所によって変
わる。一般に、本発明で用いられるプライマーは、ヌク
レオチドを１０〜６０個有するものである。
られるすべての試薬、すなわち、各標的核酸の対向鎖に
対する一組のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、Ｄ
ＮＡポリメラーゼコファクターと、２種以上のデオキシ
リボヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）とを意
味する。「プライマー」とは、核酸鎖（すなわち、鋳
型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導され
る条件下に置かれた場合にその合成開始点として作用し
うる天然の又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味す
る。このような条件には、他のＰＣＲ試薬の存在並びに
好適な温度及びｐＨが含まれる。通常、このような条件
は、非特異的増幅が最小限に抑えられるような「ストリ
ンジェンシーの高い」条件として知られている条件であ
る。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長
生成物の合成を引き起こすに十分な長さを有する必要が
ある。各プライマーの正確なサイズは、使用法、標的配
列の複雑さ、反応温度及びプライマーの出所によって変
わる。一般に、本発明で用いられるプライマーは、ヌク
レオチドを１０〜６０個有するものである。
【００２７】プライマーは、多数の出所から入手するこ
と、或いは、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍより入手可能）又はＢｉｏ
ｓｅａｒｃｈ ８６００シリーズ若しくは８８００シリ
ーズの合成機（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社より入手可能）をはじめとする周知の技法及び装置並
びにそれらの使用方法（例えば、上記の米国特許第４，
９６５，１８８号明細書に記載されている）を利用して
合成することができる。また、生物学的ソースから単離
された天然のプライマー（例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）も有用である。一般には、各標的核酸に対
し、少なくとも２種のプライマーからなる一組が用いら
れる。こうして、複数組のプライマーを同時に使用し、
複数種の標的核酸を増幅することができる。さらに、一
組のプライマーが、ある特定の標的核酸に対するプライ
マー混合物を含むこともできる。
と、或いは、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍより入手可能）又はＢｉｏ
ｓｅａｒｃｈ ８６００シリーズ若しくは８８００シリ
ーズの合成機（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社より入手可能）をはじめとする周知の技法及び装置並
びにそれらの使用方法（例えば、上記の米国特許第４，
９６５，１８８号明細書に記載されている）を利用して
合成することができる。また、生物学的ソースから単離
された天然のプライマー（例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）も有用である。一般には、各標的核酸に対
し、少なくとも２種のプライマーからなる一組が用いら
れる。こうして、複数組のプライマーを同時に使用し、
複数種の標的核酸を増幅することができる。さらに、一
組のプライマーが、ある特定の標的核酸に対するプライ
マー混合物を含むこともできる。
【００２８】ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーに対し
てホスホジエステル結合することにより、デオキシヌク
レオシド一リン酸分子をエステル化しこれをプライマー
の３’−ヒドロキシ末端に付加する酵素としてよく知ら
れいる。この合成は鋳型依存性である。有用なＤＮＡポ
リメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼ、逆転写酵素、その他当該技術分野で知られている
ものが含まれる。
てホスホジエステル結合することにより、デオキシヌク
レオシド一リン酸分子をエステル化しこれをプライマー
の３’−ヒドロキシ末端に付加する酵素としてよく知ら
れいる。この合成は鋳型依存性である。有用なＤＮＡポ
リメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼ、逆転写酵素、その他当該技術分野で知られている
ものが含まれる。
【００２９】ＤＮＡポリメラーゼは、「耐熱性」である
ことが好ましい。耐熱性とは、ＤＮＡ鎖の変性に用いら
れる高温において一般に安定であることを意味する。よ
り詳細には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用
いられる高温において実質的には不活性化されない。こ
のような温度は、ｐＨ、塩濃度、その他当該技術分野で
知られている条件をはじめとする幾つかの反応条件によ
って変わる。
ことが好ましい。耐熱性とは、ＤＮＡ鎖の変性に用いら
れる高温において一般に安定であることを意味する。よ
り詳細には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用
いられる高温において実質的には不活性化されない。こ
のような温度は、ｐＨ、塩濃度、その他当該技術分野で
知られている条件をはじめとする幾つかの反応条件によ
って変わる。
【００３０】当該技術分野では幾つかの耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼが報告されており、米国特許第４，９６５，
１８８号明細書（上記）及び同第４，８８９，８１８号
明細書（Ｇｅｌｆａｎｄら）に詳細に記載されているも
のが含まれるが、本明細書ではこれらを参照することに
より取り入れることとする。特に有用なポリメラーゼ
は、Ｔｈｅｒｍｕｓ細菌種から得られるものであって、
例えばサーマス・アクラティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・フ
ラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）又はサーマス
・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）から得られるＤＮＡポリメラーゼである。他
の有用な耐熱性ポリメラーゼは、サーモコッカス・リテ
ラティス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌ
ｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓ
ｐ．及び国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−８９／０６６９１
号公報（１９８９年７月２７日公開）に記載されている
ものをはじめとする他の様々な微生物源から得られる。
有用な酵素の中には市販されているものもある。生物か
ら天然のポリメラーゼを単離するための技法がいくつか
知られている。また組換え技術によるポリメラーゼを調
製するためのクローニング法やその他の合成法も、Ｇｅ
ｌｆａｎｄらの特許をはじめとする先に引用した技術文
献から知られている。
リメラーゼが報告されており、米国特許第４，９６５，
１８８号明細書（上記）及び同第４，８８９，８１８号
明細書（Ｇｅｌｆａｎｄら）に詳細に記載されているも
のが含まれるが、本明細書ではこれらを参照することに
より取り入れることとする。特に有用なポリメラーゼ
は、Ｔｈｅｒｍｕｓ細菌種から得られるものであって、
例えばサーマス・アクラティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・フ
ラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）又はサーマス
・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）から得られるＤＮＡポリメラーゼである。他
の有用な耐熱性ポリメラーゼは、サーモコッカス・リテ
ラティス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌ
ｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓ
ｐ．及び国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−８９／０６６９１
号公報（１９８９年７月２７日公開）に記載されている
ものをはじめとする他の様々な微生物源から得られる。
有用な酵素の中には市販されているものもある。生物か
ら天然のポリメラーゼを単離するための技法がいくつか
知られている。また組換え技術によるポリメラーゼを調
製するためのクローニング法やその他の合成法も、Ｇｅ
ｌｆａｎｄらの特許をはじめとする先に引用した技術文
献から知られている。
【００３１】ＤＮＡポリメラーゼコファクターとは、酵
素活性に影響を与える非タンパク質化合物をさす。当該
技術分野では、マンガン塩やマグネシウム塩をはじめと
するこのような物質がいくつか知られている。有用なコ
ファクターとして、マンガン及びマグネシウムの塩化
物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩が含まれるが、これら
に限定はされない。塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好まし
い。最も好ましい塩は塩化マグネシウム及び硫酸マグネ
シウムである。
素活性に影響を与える非タンパク質化合物をさす。当該
技術分野では、マンガン塩やマグネシウム塩をはじめと
するこのような物質がいくつか知られている。有用なコ
ファクターとして、マンガン及びマグネシウムの塩化
物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩が含まれるが、これら
に限定はされない。塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好まし
い。最も好ましい塩は塩化マグネシウム及び硫酸マグネ
シウムである。
【００３２】ＰＣＲにはまた、デオキシリボヌクレオシ
ド−５’−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰのうちの２種以上が必要
である。ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰのようなアナ
ログも有用である。ＰＣＲでは、通常の４種類の三リン
酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を使
用することが好ましい。
ド−５’−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰのうちの２種以上が必要
である。ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰのようなアナ
ログも有用である。ＰＣＲでは、通常の４種類の三リン
酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を使
用することが好ましい。
【００３３】本発明の実施には、ＤＮＡポリメラーゼに
特異的な抗体であって、約５０℃未満の温度では該酵素
活性を阻害するがより高温では自身が不活性化される抗
体も有用である。このような特性を有する代表的なモノ
クローナル抗体が、米国特許第５，３３８，６７１号明
細書（Ｓｃａｌｉｃｅら）に記載されており、本明細書
ではこれを参照することにより取り入れることとする。
同等な特性を有するならば抗体フラグメントを完全分子
の代わりに使用してもよい。
特異的な抗体であって、約５０℃未満の温度では該酵素
活性を阻害するがより高温では自身が不活性化される抗
体も有用である。このような特性を有する代表的なモノ
クローナル抗体が、米国特許第５，３３８，６７１号明
細書（Ｓｃａｌｉｃｅら）に記載されており、本明細書
ではこれを参照することにより取り入れることとする。
同等な特性を有するならば抗体フラグメントを完全分子
の代わりに使用してもよい。
【００３４】典型的なＰＣＲ反応組成物は、標的核酸に
対する１種以上のプライマー組と、耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（上記）と、複数種のｄＮＴＰ（例、常用の４種
のｄＮＴＰ）と、そして１種以上の水溶性又は水膨潤性
の非イオン性で高分子量の体積排除剤とを最低でも含有
する。さらに、それらは非イオン性であるため、本発明
の範囲からはＰＣＲに悪影響を及ぼすカチオン性、アニ
オン性又は両性の物質は除外される。
対する１種以上のプライマー組と、耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（上記）と、複数種のｄＮＴＰ（例、常用の４種
のｄＮＴＰ）と、そして１種以上の水溶性又は水膨潤性
の非イオン性で高分子量の体積排除剤とを最低でも含有
する。さらに、それらは非イオン性であるため、本発明
の範囲からはＰＣＲに悪影響を及ぼすカチオン性、アニ
オン性又は両性の物質は除外される。
【００３５】体積排除剤は高分子、すなわち、典型的に
は複数の反復単位を含む。一般に、体積排除剤の平均分
子量は約１０００〜約２０，０００ダルトンであり、約
３０００〜約１２，０００ダルトンの範囲にあることが
好ましい。本発明を実施する上で体積排除剤として使用
することができる有用な種類の物質には、ポリエーテ
ル、単糖（例、デキストロースやグルコース）とエピク
ロロヒドリンとの反応生成物、多糖、ポリアクリレート
及び当業者であれば容易に想到しうる同等な物質が含ま
れるが、これらに限定はされない。
は複数の反復単位を含む。一般に、体積排除剤の平均分
子量は約１０００〜約２０，０００ダルトンであり、約
３０００〜約１２，０００ダルトンの範囲にあることが
好ましい。本発明を実施する上で体積排除剤として使用
することができる有用な種類の物質には、ポリエーテ
ル、単糖（例、デキストロースやグルコース）とエピク
ロロヒドリンとの反応生成物、多糖、ポリアクリレート
及び当業者であれば容易に想到しうる同等な物質が含ま
れるが、これらに限定はされない。
【００３６】ポリエーテルが好ましい。ポリエーテルは
一般に下式で表すことができる。 Ｈ−（−Ｏ−Ｒ−）n −Ｈ 上式中、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキレンであり、そ
してｎは１５〜１０００（重量平均基準）の整数であ
る。例えば、Ｒは、１，２−エチレン、１，２−プロピ
レン、２−ヒドロキシ−１，３−プロピレン、３−ヒド
ロキシ−１，２−プロピレン、１，４−ブチレン、１，
３−ブチレン、１，２−ヘキシレン、その他当業者であ
れば容易に想到しうる二価アルキレン基であることがで
きる。好ましくは、Ｒは、一般にポリ（エチレングリコ
ール）やポリ（プロピレングリコール）として知られて
いるポリ（酸化エチレン）やポリ（酸化プロピレン）に
あるような１，２−エチレン又は１，２−プロピレンで
ある。
一般に下式で表すことができる。 Ｈ−（−Ｏ−Ｒ−）n −Ｈ 上式中、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキレンであり、そ
してｎは１５〜１０００（重量平均基準）の整数であ
る。例えば、Ｒは、１，２−エチレン、１，２−プロピ
レン、２−ヒドロキシ−１，３−プロピレン、３−ヒド
ロキシ−１，２−プロピレン、１，４−ブチレン、１，
３−ブチレン、１，２−ヘキシレン、その他当業者であ
れば容易に想到しうる二価アルキレン基であることがで
きる。好ましくは、Ｒは、一般にポリ（エチレングリコ
ール）やポリ（プロピレングリコール）として知られて
いるポリ（酸化エチレン）やポリ（酸化プロピレン）に
あるような１，２−エチレン又は１，２−プロピレンで
ある。
【００３７】上記式において、整数「ｎ」は、その化合
物の重量平均分子量をそのモノマー単位分子量で割った
値を表している。先のパラグラフで記載した好ましい化
合物の平均分子量は約１０００以上、好ましくは約３０
００以上で且つ一般に最大で約２０，０００である。当
業者であれば、特定の化合物と化合物重量に対して適当
な「ｎ」個の単位を決めることは容易にできる。一般に
ｎは１５〜１０００の整数である。分子量を定義する際
の用語「約」は±１０％の変動を表す。
物の重量平均分子量をそのモノマー単位分子量で割った
値を表している。先のパラグラフで記載した好ましい化
合物の平均分子量は約１０００以上、好ましくは約３０
００以上で且つ一般に最大で約２０，０００である。当
業者であれば、特定の化合物と化合物重量に対して適当
な「ｎ」個の単位を決めることは容易にできる。一般に
ｎは１５〜１０００の整数である。分子量を定義する際
の用語「約」は±１０％の変動を表す。
【００３８】ポリエーテルの定義には、酸化エチレン、
酸化プロピレン若しくは他の酸化アルキレン又はポリグ
リシドールをはじめとするジオール、トリオール、糖若
しくは酸などの各種部分の縮合生成物も含まれる。この
ような物質は、非イオン界面活性剤又は洗剤として当該
技術分野では知られており、そして必要な水溶性又は水
膨潤性のパラメーターが満たされているならば、本発明
において有用となることができる。
酸化プロピレン若しくは他の酸化アルキレン又はポリグ
リシドールをはじめとするジオール、トリオール、糖若
しくは酸などの各種部分の縮合生成物も含まれる。この
ような物質は、非イオン界面活性剤又は洗剤として当該
技術分野では知られており、そして必要な水溶性又は水
膨潤性のパラメーターが満たされているならば、本発明
において有用となることができる。
【００３９】本発明を実施する上で有用な非イオン性多
糖にはデキストラン、グリコーゲン及びその他当業者で
あれば容易に想到しうるもの、が含まれる。有用なポリ
アクリレートの例として、ポリ（ヒドロキシエチルアク
リレート）、ポリ（２，３−ジヒドロキシプロピルアク
リレート）及びその他当業者であれば容易に想到しうる
ものが挙げられるが、これらに限定はされない。
糖にはデキストラン、グリコーゲン及びその他当業者で
あれば容易に想到しうるもの、が含まれる。有用なポリ
アクリレートの例として、ポリ（ヒドロキシエチルアク
リレート）、ポリ（２，３−ジヒドロキシプロピルアク
リレート）及びその他当業者であれば容易に想到しうる
ものが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４０】本明細書に記載したＰＣＲ試薬は、ＰＣＲ
において標的核酸を増幅するのに適した濃度で提供され
且つ用いられる。ＤＮＡポリメラーゼの最少量は、溶液
１００μｌ当たり、一般に約１単位以上、好ましくは約
４〜約２５単位である。ここで「単位」とは、７４℃に
おいて伸長している核酸中へ３０分間で１０ナノモルの
全ヌクレオシド（ｄＮＴＰ）を取り込ませるに必要な酵
素活性量として定義される。各プライマーの濃度は約
０．０２５μモル濃度以上、約１μモル濃度未満であ
り、中でも約０．０５〜約０．２μモル濃度が好まし
い。すべてのプライマーはほぼ同じ量（各々の変動が±
１０％以内）で存在する。反応混合物中、コファクター
は一般に約１〜約１５ミリモルの量で存在し、また各ｄ
ＮＴＰは一般に約０．１５〜約３．５ミリモルの量で存
在する。体積排除剤は、約４重量％以上の量で、好まし
くは約６〜約１２重量％の量で存在する。物質の量を定
義する際の用語「約」は、記載量に±１０％の変動が含
まれていることを意味する。
において標的核酸を増幅するのに適した濃度で提供され
且つ用いられる。ＤＮＡポリメラーゼの最少量は、溶液
１００μｌ当たり、一般に約１単位以上、好ましくは約
４〜約２５単位である。ここで「単位」とは、７４℃に
おいて伸長している核酸中へ３０分間で１０ナノモルの
全ヌクレオシド（ｄＮＴＰ）を取り込ませるに必要な酵
素活性量として定義される。各プライマーの濃度は約
０．０２５μモル濃度以上、約１μモル濃度未満であ
り、中でも約０．０５〜約０．２μモル濃度が好まし
い。すべてのプライマーはほぼ同じ量（各々の変動が±
１０％以内）で存在する。反応混合物中、コファクター
は一般に約１〜約１５ミリモルの量で存在し、また各ｄ
ＮＴＰは一般に約０．１５〜約３．５ミリモルの量で存
在する。体積排除剤は、約４重量％以上の量で、好まし
くは約６〜約１２重量％の量で存在する。物質の量を定
義する際の用語「約」は、記載量に±１０％の変動が含
まれていることを意味する。
【００４１】ＰＣＲ試薬は、個別に供給しても、また適
当な何らかの緩衝液を用いてｐＨを約７〜約９にした緩
衝化溶液として供給してもよい。こうして、ＰＣＲの反
応混合物は、コピー数の少ない標的核酸の各々に対する
一組のプライマーと、コピー数の多い標的核酸の各々に
対する一組のプライマーと、適当なｄＮＴＰと、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと、該ＤＮＡポリメラーゼのための
コファクターと、１種以上の体積排除剤と、そして標的
核酸の増幅やその後の検出に有用であると考えられる他
の何らかの添加物とを含むことができる。
当な何らかの緩衝液を用いてｐＨを約７〜約９にした緩
衝化溶液として供給してもよい。こうして、ＰＣＲの反
応混合物は、コピー数の少ない標的核酸の各々に対する
一組のプライマーと、コピー数の多い標的核酸の各々に
対する一組のプライマーと、適当なｄＮＴＰと、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと、該ＤＮＡポリメラーゼのための
コファクターと、１種以上の体積排除剤と、そして標的
核酸の増幅やその後の検出に有用であると考えられる他
の何らかの添加物とを含むことができる。
【００４２】上記のように、標的核酸は様々な出所源か
ら得られる。一般に、標的核酸は、プライマー、その他
の反応物質との接触に利用できるようにするため何らか
の方法で抽出されなければならない。このことは、通
常、望ましくないタンパク質や細胞物質を被検体から適
当な方法で除去することを意味する。当該技術分野で
は、ＬａｕｒｅらのＴｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，ｐｐ．５３
８−５４０（１９８８年９月３日）、Ｍａｎｉａｔｉｓ
らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．２８０−２８１
（１９８２）、Ｇｒｏｓｓ−ＢｅｌｌａｎｄらのＥｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，３２（１９７３）及
び米国特許第４，９６５，１８８号明細書（上記）に記
載されているものをはじめとする様々な方法が知られて
いる。全血又はその成分からＤＮＡを抽出する方法につ
いては、例えば、欧州特許出願公開第０ ３９３ ７４
４号公報（１９９０年１０月２４日公開）、Ｂｅｌｌら
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
８（９），ｐｐ．５７５９−５７６３（１９８１）、Ｓ
ａｉｋｉらのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，ｐ
ｐ．１００８−１０１２（１９８５）及び米国特許第
５，２３１，０１５号明細書（Ｃｕｍｍｉｎｓら）に記
載されている。本発明の実施では、特定の抽出法が重要
となることはない。
ら得られる。一般に、標的核酸は、プライマー、その他
の反応物質との接触に利用できるようにするため何らか
の方法で抽出されなければならない。このことは、通
常、望ましくないタンパク質や細胞物質を被検体から適
当な方法で除去することを意味する。当該技術分野で
は、ＬａｕｒｅらのＴｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，ｐｐ．５３
８−５４０（１９８８年９月３日）、Ｍａｎｉａｔｉｓ
らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．２８０−２８１
（１９８２）、Ｇｒｏｓｓ−ＢｅｌｌａｎｄらのＥｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，３２（１９７３）及
び米国特許第４，９６５，１８８号明細書（上記）に記
載されているものをはじめとする様々な方法が知られて
いる。全血又はその成分からＤＮＡを抽出する方法につ
いては、例えば、欧州特許出願公開第０ ３９３ ７４
４号公報（１９９０年１０月２４日公開）、Ｂｅｌｌら
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
８（９），ｐｐ．５７５９−５７６３（１９８１）、Ｓ
ａｉｋｉらのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，ｐ
ｐ．１００８−１０１２（１９８５）及び米国特許第
５，２３１，０１５号明細書（Ｃｕｍｍｉｎｓら）に記
載されている。本発明の実施では、特定の抽出法が重要
となることはない。
【００４３】通常、増幅して検出されるべき標的核酸は
二本鎖形にあるため、この二本鎖を分離（すなわち、変
性）しなければプライミングは起こらない。プライミン
グは、抽出工程中に行うことができるが、好ましくはそ
の後の別工程で行う。好ましい変性手段は、好適な温度
（本明細書では「第一温度」又はＴ1 と称する）に加熱
することである。一般に、この第一温度は、適当な時
間、例えば１〜約２４０秒間（好ましくは１〜約４０秒
間）、約８５℃〜約１００℃の範囲とする。この初期変
性工程を最初の増幅サイクルに含めてもよい。このよう
な場合には、最初のサイクルにおける変性をより長時間
（例えば、最長で２４０秒間）とし、その後のサイクル
では変性を短時間（例えば、最長で３０秒間）としても
よい。
二本鎖形にあるため、この二本鎖を分離（すなわち、変
性）しなければプライミングは起こらない。プライミン
グは、抽出工程中に行うことができるが、好ましくはそ
の後の別工程で行う。好ましい変性手段は、好適な温度
（本明細書では「第一温度」又はＴ1 と称する）に加熱
することである。一般に、この第一温度は、適当な時
間、例えば１〜約２４０秒間（好ましくは１〜約４０秒
間）、約８５℃〜約１００℃の範囲とする。この初期変
性工程を最初の増幅サイクルに含めてもよい。このよう
な場合には、最初のサイクルにおける変性をより長時間
（例えば、最長で２４０秒間）とし、その後のサイクル
では変性を短時間（例えば、最長で３０秒間）としても
よい。
【００４４】次いで、変性された鎖を、適当な組合せの
プライマーを用いて、その反応混合物を一般に約５５〜
約７０℃の範囲にある第二温度Ｔ2 へ冷却することによ
りプライミングする。冷却はできるだけ迅速に行うこと
が望まれるが、現存の装置では、一般には約５〜約４０
秒間で、より好ましくは約５〜約２０秒間で行われる。
好ましくは、Ｔ2 は以下の式で規定される。 （ＴmH−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmH＋５）℃ 式中、ＴmHはコピー数の多い標的核酸に対するプライマ
ーの融解温度である。
プライマーを用いて、その反応混合物を一般に約５５〜
約７０℃の範囲にある第二温度Ｔ2 へ冷却することによ
りプライミングする。冷却はできるだけ迅速に行うこと
が望まれるが、現存の装置では、一般には約５〜約４０
秒間で、より好ましくは約５〜約２０秒間で行われる。
好ましくは、Ｔ2 は以下の式で規定される。 （ＴmH−１５）℃≦Ｔ2 ≦（ＴmH＋５）℃ 式中、ＴmHはコピー数の多い標的核酸に対するプライマ
ーの融解温度である。
【００４５】変性された鎖を冷却したら、ＰＣＲ試薬を
含有する反応混合物を第三温度Ｔ3において、一般には
１〜約１２０秒間、好ましくは１〜約８０秒間インキュ
ベートし、プライマー伸長生成物を形成させる。一般
に、第三温度は以下の式： （ＴmH−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmH＋１５）℃ で規定されるが、一般には約５５〜約７０℃、好ましく
は約６２〜約７０℃の範囲にある。
含有する反応混合物を第三温度Ｔ3において、一般には
１〜約１２０秒間、好ましくは１〜約８０秒間インキュ
ベートし、プライマー伸長生成物を形成させる。一般
に、第三温度は以下の式： （ＴmH−１５）℃≦Ｔ3 ≦（ＴmH＋１５）℃ で規定されるが、一般には約５５〜約７０℃、好ましく
は約６２〜約７０℃の範囲にある。
【００４６】最も好ましい実施態様では、第二温度と第
三温度を同じにし、そして約６２〜約７０℃の範囲とす
る。こうして、プライミングとプライマー伸長を、同じ
工程で行うことが好ましい。コピー数の多い標的核酸に
対する各プライマーは、本明細書でＴmHと表示した融解
温度を有する。通常、ＴmLとＴmHの差は０〜約８℃であ
り、そしてＴ2 とＴ 3 はどちらもＴmL若しくはＴmHより
も低いか又はＴmL若しくはＴmHのいずれかに等しいこと
が普通である。ＴmLは、コピー数の少ない標的核酸に対
するプライマーの融解温度である。
三温度を同じにし、そして約６２〜約７０℃の範囲とす
る。こうして、プライミングとプライマー伸長を、同じ
工程で行うことが好ましい。コピー数の多い標的核酸に
対する各プライマーは、本明細書でＴmHと表示した融解
温度を有する。通常、ＴmLとＴmHの差は０〜約８℃であ
り、そしてＴ2 とＴ 3 はどちらもＴmL若しくはＴmHより
も低いか又はＴmL若しくはＴmHのいずれかに等しいこと
が普通である。ＴmLは、コピー数の少ない標的核酸に対
するプライマーの融解温度である。
【００４７】本明細書で規定する融解温度は、プライマ
ーの半分が（鋳型のような）相補鎖から変性される温度
である。この融解温度の測定は、例えば、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉ
ｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ（第２版、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｗｏｒ
ｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９７
０，ｐｐ．８７６−７）に記載されているように２６０
ｎｍにおけるスペクトルをモニターすることによって、
紫外線淡色効果に基づいて、いくつかの標準方法で実施
することができる。融解温度の測定方法が異なると、同
じＤＮＡ分子でもその値に若干の差が生じることはある
が、これらの値が約２〜３℃よりも大きく変動すること
はまずない。その上、融解温度を測定するための方法が
一定であれば、ＴmLとＴmHの差が変動することはない。
ーの半分が（鋳型のような）相補鎖から変性される温度
である。この融解温度の測定は、例えば、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉ
ｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ（第２版、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｗｏｒ
ｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９７
０，ｐｐ．８７６−７）に記載されているように２６０
ｎｍにおけるスペクトルをモニターすることによって、
紫外線淡色効果に基づいて、いくつかの標準方法で実施
することができる。融解温度の測定方法が異なると、同
じＤＮＡ分子でもその値に若干の差が生じることはある
が、これらの値が約２〜３℃よりも大きく変動すること
はまずない。その上、融解温度を測定するための方法が
一定であれば、ＴmLとＴmHの差が変動することはない。
【００４８】融解温度は以下の式を用いて計算されるこ
とが好ましい。 Ｔm （℃）＝６７．５＋０．３４（％Ｇ＋Ｃ）−３９５
／Ｎ 上式中、ＧとＣは、オリゴヌクレオチド（すなわち、プ
ライマー）における、それぞれグアニンとシトシンのヌ
クレオチド数を表し、Ｎは全ヌクレオチド数を表す。こ
の計算式で得られる融解温度の値は、常用のＵＶ淡色効
果と常用のＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ製ダイオー
ドアレイ分光光度計（走査速度約＋１℃／分）を用い
て、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及びその他当業
者であれば容易に想到するもののような無機塩や有機塩
の１種以上をイオン強度約２０ミリモル以上で有する１
０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝液（ｐＨ８．５）にプライマーを含む溶液について
室温で実験的に求めた値とよく相関する。上記融解温度
式を決めるために用いられた溶液中でのプライマーとそ
の相補体の量は、約０．５〜約１．０のＯＤ単位の光学
濃度を与えるに十分な量とした。
とが好ましい。 Ｔm （℃）＝６７．５＋０．３４（％Ｇ＋Ｃ）−３９５
／Ｎ 上式中、ＧとＣは、オリゴヌクレオチド（すなわち、プ
ライマー）における、それぞれグアニンとシトシンのヌ
クレオチド数を表し、Ｎは全ヌクレオチド数を表す。こ
の計算式で得られる融解温度の値は、常用のＵＶ淡色効
果と常用のＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ製ダイオー
ドアレイ分光光度計（走査速度約＋１℃／分）を用い
て、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及びその他当業
者であれば容易に想到するもののような無機塩や有機塩
の１種以上をイオン強度約２０ミリモル以上で有する１
０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝液（ｐＨ８．５）にプライマーを含む溶液について
室温で実験的に求めた値とよく相関する。上記融解温度
式を決めるために用いられた溶液中でのプライマーとそ
の相補体の量は、約０．５〜約１．０のＯＤ単位の光学
濃度を与えるに十分な量とした。
【００４９】こうして、「一次」増幅サイクルは、上記
の変性工程、プライミング（又はアニーリング）工程及
びプライマー伸長工程を含む。一般に、本発明の実施で
は、このような一次増幅サイクルを１５回以上行うが、
そのサイクルの最大回数についてはユーザーの裁量に任
される。たいていは、１５〜５０回の一次増幅サイクル
が行われ、１５〜４０回のサイクルが好適である。一次
増幅サイクルの各サイクルは、一般に約２０〜約３６０
秒、好ましくは約３０〜約１２０秒、より好ましくは約
３０〜約９０秒のサイクル時間で行われる。しかしなが
ら、所望により、さらに長時間又は短時間のサイクル時
間を採用してもよい。
の変性工程、プライミング（又はアニーリング）工程及
びプライマー伸長工程を含む。一般に、本発明の実施で
は、このような一次増幅サイクルを１５回以上行うが、
そのサイクルの最大回数についてはユーザーの裁量に任
される。たいていは、１５〜５０回の一次増幅サイクル
が行われ、１５〜４０回のサイクルが好適である。一次
増幅サイクルの各サイクルは、一般に約２０〜約３６０
秒、好ましくは約３０〜約１２０秒、より好ましくは約
３０〜約９０秒のサイクル時間で行われる。しかしなが
ら、所望により、さらに長時間又は短時間のサイクル時
間を採用してもよい。
【００５０】本発明の方法は、上記の「一次」サイクル
のみを含むことができるが、別の実施態様として、上記
の少なくとも１５回の一次増幅サイクルの後に、１回以
上の「二次」増幅サイクルを含むことができる。このよ
うな二次サイクルは一次サイクルと同じ工程を使用して
行われるが、但し、各変性工程後に再生工程を導入して
からプライミング工程を行う。
のみを含むことができるが、別の実施態様として、上記
の少なくとも１５回の一次増幅サイクルの後に、１回以
上の「二次」増幅サイクルを含むことができる。このよ
うな二次サイクルは一次サイクルと同じ工程を使用して
行われるが、但し、各変性工程後に再生工程を導入して
からプライミング工程を行う。
【００５１】再生工程は、反応混合物を以下に規定され
る第四温度Ｔ4 に冷却することによって行われる。 （ＴmH＋５）℃≦Ｔ4 ≦ＴPH 式中、ＴPHは、コピー数の多い標的核酸の二本鎖の融解
温度である。一般に、Ｔ 4 は約６５〜約９０℃である。
Ｔ4 に到達させるのに要する時間はできるかぎり短くす
るが、最長で約４５秒間かけてもよい。また、上記温度
は約１５〜約１００秒間維持することができる。
る第四温度Ｔ4 に冷却することによって行われる。 （ＴmH＋５）℃≦Ｔ4 ≦ＴPH 式中、ＴPHは、コピー数の多い標的核酸の二本鎖の融解
温度である。一般に、Ｔ 4 は約６５〜約９０℃である。
Ｔ4 に到達させるのに要する時間はできるかぎり短くす
るが、最長で約４５秒間かけてもよい。また、上記温度
は約１５〜約１００秒間維持することができる。
【００５２】この方法では少なくとも５回の二次増幅サ
イクルを採用するが、その上限回数はユーザーの裁量に
任される。一つの実施態様では、この二次増幅サイクル
は５〜２０回が好ましく、また１５回のサイクルが最も
好ましい。二次増幅サイクルの各サイクルに要する時間
は約２０〜約３６０秒である。好ましいサイクル時間は
約３０〜約１２０秒である。
イクルを採用するが、その上限回数はユーザーの裁量に
任される。一つの実施態様では、この二次増幅サイクル
は５〜２０回が好ましく、また１５回のサイクルが最も
好ましい。二次増幅サイクルの各サイクルに要する時間
は約２０〜約３６０秒である。好ましいサイクル時間は
約３０〜約１２０秒である。
【００５３】後のサイクルにおいて、増幅反応に用いら
れるプライマーの有効Ｔm （融解温度）よりも数度高い
がコピー数の多い生成物の有効Ｔm 以下の温度で生成物
の再生工程を含めると、増幅生成物の再生が濃度依存様
式で可能となる。二次サイクルの比較的短い再生工程は
コピー数の少ない標的核酸のプライミング効率に実質的
な影響を及ぼすことはないが、コピー数の多い標的核酸
のプライミングを低下させる。
れるプライマーの有効Ｔm （融解温度）よりも数度高い
がコピー数の多い生成物の有効Ｔm 以下の温度で生成物
の再生工程を含めると、増幅生成物の再生が濃度依存様
式で可能となる。二次サイクルの比較的短い再生工程は
コピー数の少ない標的核酸のプライミング効率に実質的
な影響を及ぼすことはないが、コピー数の多い標的核酸
のプライミングを低下させる。
【００５４】本出願明細書において、ある特定の工程に
対する時間に用語「約」を付した場合は、その限界値に
ついて±１０％の幅があることを意味する。温度に用語
「約」を付した場合には、±５℃の幅があることを意味
する。
対する時間に用語「約」を付した場合は、その限界値に
ついて±１０％の幅があることを意味する。温度に用語
「約」を付した場合には、±５℃の幅があることを意味
する。
【００５５】増幅生成物の再生のような核酸のハイブリ
ダイゼーション反応の速度論は、ハイブリダイズされる
核酸の濃度に比例する。それゆえ、増幅生成物の濃度
が、例えば１０倍に増加すると、ハイブリダイゼーショ
ンの速度も１０倍に増加する（すなわち、再生に対する
ｔ1/2 が１０分の１に短縮される）。ハイブリダイゼー
ションの前進速度定数を５×１０6 モル-1秒-1と仮定す
ると、生成物濃度１０-8モルにおけるｔ1/2 は約１４
秒、また生成物濃度１０-9モルにおけるｔ1/2 は約１４
０秒となる。先に記載した体積排除剤を含めると、増幅
プライマー、標的核酸、プライマー伸長生成物及びＤＮ
Ａポリメラーゼといった反応する巨大分子を有効に増加
させることになる。この有効プライマー濃度の増加によ
って、増幅反応における絶対プライマー濃度を、増幅効
率を低下させることなく対応して低下させることができ
る。このように、本発明の好ましい実施では、効率損失
を伴わずにプライマー濃度をかなり低下させることがで
きる。
ダイゼーション反応の速度論は、ハイブリダイズされる
核酸の濃度に比例する。それゆえ、増幅生成物の濃度
が、例えば１０倍に増加すると、ハイブリダイゼーショ
ンの速度も１０倍に増加する（すなわち、再生に対する
ｔ1/2 が１０分の１に短縮される）。ハイブリダイゼー
ションの前進速度定数を５×１０6 モル-1秒-1と仮定す
ると、生成物濃度１０-8モルにおけるｔ1/2 は約１４
秒、また生成物濃度１０-9モルにおけるｔ1/2 は約１４
０秒となる。先に記載した体積排除剤を含めると、増幅
プライマー、標的核酸、プライマー伸長生成物及びＤＮ
Ａポリメラーゼといった反応する巨大分子を有効に増加
させることになる。この有効プライマー濃度の増加によ
って、増幅反応における絶対プライマー濃度を、増幅効
率を低下させることなく対応して低下させることができ
る。このように、本発明の好ましい実施では、効率損失
を伴わずにプライマー濃度をかなり低下させることがで
きる。
【００５６】本発明の増幅法は、反応混合物の温度を所
望の回数だけ制御して周期変動させるように連続自動式
で実施することが好ましい。このために開発された装置
がいくつかあり、当業者であれば周知である。また、一
次増幅サイクル及び二次増幅サイクルの両方についてプ
ログラム可能な装置を使用することも好ましい。
望の回数だけ制御して周期変動させるように連続自動式
で実施することが好ましい。このために開発された装置
がいくつかあり、当業者であれば周知である。また、一
次増幅サイクル及び二次増幅サイクルの両方についてプ
ログラム可能な装置を使用することも好ましい。
【００５７】この目的のための装置の一つが、米国特許
第４，９６５，１８８号明細書及び欧州特許出願公開第
０ ２３６ ０６９号公報にかなり詳しく記載されてい
る。一般に、この装置は、反応混合物を含有する複数の
反応管を保持するための熱伝導性容器と、加熱、冷却及
び温度維持するための手段と、増幅配列、温度及びタイ
ミングの変化を制御するための信号を発生する計算手段
とを含む。
第４，９６５，１８８号明細書及び欧州特許出願公開第
０ ２３６ ０６９号公報にかなり詳しく記載されてい
る。一般に、この装置は、反応混合物を含有する複数の
反応管を保持するための熱伝導性容器と、加熱、冷却及
び温度維持するための手段と、増幅配列、温度及びタイ
ミングの変化を制御するための信号を発生する計算手段
とを含む。
【００５８】欧州特許出願公開第０ ４０２ ９９４号
公報は、米国特許第５，０８９，２３３号明細書（Ｄｅ
ｖａｎｅｙ，Ｊｒら）に記載された装置を用いて処理す
ることができる有用な化学試験パックについて詳細に記
載しており、本明細書ではこれを参照することにより取
り入れることとする。その中には、本発明の方法に適し
た反復インターバルで（すなわち、サイクルにより）そ
の試験パックを加熱／冷却するための手段についても記
載されている。有用なＰＣＲ処理装置に関するさらなる
詳細は、当該技術分野の重要な文献から入手することが
でき、当業者であれば容易に確認することができる。
公報は、米国特許第５，０８９，２３３号明細書（Ｄｅ
ｖａｎｅｙ，Ｊｒら）に記載された装置を用いて処理す
ることができる有用な化学試験パックについて詳細に記
載しており、本明細書ではこれを参照することにより取
り入れることとする。その中には、本発明の方法に適し
た反復インターバルで（すなわち、サイクルにより）そ
の試験パックを加熱／冷却するための手段についても記
載されている。有用なＰＣＲ処理装置に関するさらなる
詳細は、当該技術分野の重要な文献から入手することが
でき、当業者であれば容易に確認することができる。
【００５９】上記の化学試験パックの他、本発明の方法
は、米国特許第４，９０２，６２４号明細書（Ｃｏｌｕ
ｍｂｕｓら）、同第５，１７３，２６０号明細書（Ｚａ
ｎｄｅｒら）、同第５，２２９，２９７号明細書（Ｓｃ
ｈｎｉｐｅｌｓｋｙら）に詳細に記載されているような
他の容器、及び当業者であれば明白なその他の適当な容
器においても実施することができる。本明細書ではこれ
らを参照することにより取り入れることとする。このよ
うな試験パックは自蔵式試験装置としても知られてお
り、本発明の方法で用いられる各種試薬のために区分さ
れた別個の室を有する。この区分室は、装置を開放しな
くても、試薬とアッセイ液とが適時捕捉試薬と接触でき
るように適当に連結されている。
は、米国特許第４，９０２，６２４号明細書（Ｃｏｌｕ
ｍｂｕｓら）、同第５，１７３，２６０号明細書（Ｚａ
ｎｄｅｒら）、同第５，２２９，２９７号明細書（Ｓｃ
ｈｎｉｐｅｌｓｋｙら）に詳細に記載されているような
他の容器、及び当業者であれば明白なその他の適当な容
器においても実施することができる。本明細書ではこれ
らを参照することにより取り入れることとする。このよ
うな試験パックは自蔵式試験装置としても知られてお
り、本発明の方法で用いられる各種試薬のために区分さ
れた別個の室を有する。この区分室は、装置を開放しな
くても、試薬とアッセイ液とが適時捕捉試薬と接触でき
るように適当に連結されている。
【００６０】増幅生成物の検出は、当該技術分野で周知
のように、米国特許第４，９６５，１８８号明細書（上
記）に記載されているサザンブロッティング法や、標識
されたプローブ又はプライマーを利用して行うことがで
きる。上記実施態様の別法として、増幅生成物を、その
プライマー伸長生成物の一方に対して相補的である標識
されたオリゴヌクレオチドを用いて検出することもでき
る。オリゴヌクレオチドに標識を付与する方法について
は周知である。有用な標識には、酵素、フェリチン、そ
の他磁性粒子、放射性同位元素、化学発光試薬（例、ル
ミノール）、ビオチン並びに各種蛍光助剤及び発色助剤
が含まれる。有用な酵素標識には、グルコースオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼ
が含まれる。各種標識用の基質や色素提供試薬、例えば
酵素、についても周知である。
のように、米国特許第４，９６５，１８８号明細書（上
記）に記載されているサザンブロッティング法や、標識
されたプローブ又はプライマーを利用して行うことがで
きる。上記実施態様の別法として、増幅生成物を、その
プライマー伸長生成物の一方に対して相補的である標識
されたオリゴヌクレオチドを用いて検出することもでき
る。オリゴヌクレオチドに標識を付与する方法について
は周知である。有用な標識には、酵素、フェリチン、そ
の他磁性粒子、放射性同位元素、化学発光試薬（例、ル
ミノール）、ビオチン並びに各種蛍光助剤及び発色助剤
が含まれる。有用な酵素標識には、グルコースオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼ
が含まれる。各種標識用の基質や色素提供試薬、例えば
酵素、についても周知である。
【００６１】好ましい実施態様では、検出用に酵素標識
（例、ペルオキシダーゼ）を使用し、そしてその標識に
より色素又は発光を提供する適当な組成物を使用する。
例えば、特に有用な比色定量用色素提供システムが米国
特許第５，０２４，９３５号明細書（ＭｃＣｌｕｎｅ
ら）に記載されている。その後、裸眼又は適当な分光光
度計若しくはルミノメーターによって検出する。
（例、ペルオキシダーゼ）を使用し、そしてその標識に
より色素又は発光を提供する適当な組成物を使用する。
例えば、特に有用な比色定量用色素提供システムが米国
特許第５，０２４，９３５号明細書（ＭｃＣｌｕｎｅ
ら）に記載されている。その後、裸眼又は適当な分光光
度計若しくはルミノメーターによって検出する。
【００６２】また、この方法に用いられる各プライマー
組のプライマーの一方を、特異的結合性部分で標識する
ことも可能である。この部分は、各種プライマーについ
て同じであっても異なってもよく、またその部分と特異
的に反応する特異的結合性レセプターが存在するための
いずれの分子を含むこともできる。特異的結合性対（そ
の一方が標識となりうる）の例として、ストレプトアビ
ジン／ビオチン、糖類／レクチン、抗体／ハプテン、抗
体／抗原、その他当業者であれば自明のもの、が挙げら
れる。その後、酵素、放射性同位元素又はその他上記の
もののようなオリゴヌクレオチドを検出できる適当な標
識部分とレセプター分子とを複合化させる。
組のプライマーの一方を、特異的結合性部分で標識する
ことも可能である。この部分は、各種プライマーについ
て同じであっても異なってもよく、またその部分と特異
的に反応する特異的結合性レセプターが存在するための
いずれの分子を含むこともできる。特異的結合性対（そ
の一方が標識となりうる）の例として、ストレプトアビ
ジン／ビオチン、糖類／レクチン、抗体／ハプテン、抗
体／抗原、その他当業者であれば自明のもの、が挙げら
れる。その後、酵素、放射性同位元素又はその他上記の
もののようなオリゴヌクレオチドを検出できる適当な標
識部分とレセプター分子とを複合化させる。
【００６３】各プライマー組の一方又は両方のプライマ
ーをビオチン（又はその等価な誘導体）で標識し、そし
て増幅生成物を、西洋ワサビペルオキシダーゼのような
酵素とストレプトアビジンとの複合体を用いて検出する
方法がより好ましい。本発明の不均質検出系では、増幅
生成物を何らかの水不溶性担体表面に捕捉し、そして反
応混合物中の他の物質を適当な方法、例えば、濾過、遠
心分離、洗浄、その他の分離方法、によって除去する。
ーをビオチン（又はその等価な誘導体）で標識し、そし
て増幅生成物を、西洋ワサビペルオキシダーゼのような
酵素とストレプトアビジンとの複合体を用いて検出する
方法がより好ましい。本発明の不均質検出系では、増幅
生成物を何らかの水不溶性担体表面に捕捉し、そして反
応混合物中の他の物質を適当な方法、例えば、濾過、遠
心分離、洗浄、その他の分離方法、によって除去する。
【００６４】捕捉プローブは、周知の結合技法（吸収反
応や共有反応を含む）によって、水不溶性の担体に結合
させることができる。このような技法の一つが、欧州特
許出願公開第０ ４３９ ２２２号公報（１９９１年９
月１８日発行）に記載されている。その他の方法が、例
えば、米国特許第４，７１３，３２６号（Ｄａｔｔａｇ
ｕｐｔａら）、同第４，９１４，２１０号（Ｌｅｖｅｎ
ｓｏｎら）及び欧州特許第０ ０７０ ６８７号（１９
８３年１月２６日発行）に記載されている。有用な分離
手段には、Ｐａｌｌ社より市販されているポリアミド微
多孔質膜のような膜による濾過が含まれる。
応や共有反応を含む）によって、水不溶性の担体に結合
させることができる。このような技法の一つが、欧州特
許出願公開第０ ４３９ ２２２号公報（１９９１年９
月１８日発行）に記載されている。その他の方法が、例
えば、米国特許第４，７１３，３２６号（Ｄａｔｔａｇ
ｕｐｔａら）、同第４，９１４，２１０号（Ｌｅｖｅｎ
ｓｏｎら）及び欧州特許第０ ０７０ ６８７号（１９
８３年１月２６日発行）に記載されている。有用な分離
手段には、Ｐａｌｌ社より市販されているポリアミド微
多孔質膜のような膜による濾過が含まれる。
【００６５】しかしながら、捕捉プローブ及び最終的な
ハイブリダイゼーション生成物を係留するためには、マ
イクロタイタープレート、試験管、ビーカー、磁性又は
高分子粒子、金属、セラミックス、ガラスウール、等を
はじめとする有用ないずれの固体担体でも使用すること
ができる。特に有用な材料は、捕捉プローブを共有結合
させるのに有用な反応性基を有する磁性粒子又は高分子
粒子である。このような粒子の大きさは一般に約０．０
０１〜約１０μｍである。このような材料の例について
は、米国特許第４，９９７，７７２号（Ｓｕｔｔｏｎ
ら）、同第５，１４７，７７７号（Ｓｕｔｔｏｎら）、
同第５，１５５，１６６号（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら）及
び同第４，７９５，６９８号（Ｏｗｅｎら）の明細書に
詳細に記載されており、本明細書ではこれらを参照する
ことにより取り入れることとする。
ハイブリダイゼーション生成物を係留するためには、マ
イクロタイタープレート、試験管、ビーカー、磁性又は
高分子粒子、金属、セラミックス、ガラスウール、等を
はじめとする有用ないずれの固体担体でも使用すること
ができる。特に有用な材料は、捕捉プローブを共有結合
させるのに有用な反応性基を有する磁性粒子又は高分子
粒子である。このような粒子の大きさは一般に約０．０
０１〜約１０μｍである。このような材料の例について
は、米国特許第４，９９７，７７２号（Ｓｕｔｔｏｎ
ら）、同第５，１４７，７７７号（Ｓｕｔｔｏｎら）、
同第５，１５５，１６６号（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら）及
び同第４，７９５，６９８号（Ｏｗｅｎら）の明細書に
詳細に記載されており、本明細書ではこれらを参照する
ことにより取り入れることとする。
【００６６】捕捉プローブは、ポリマーフィルム、メン
ブレン、濾紙、又は樹脂被覆紙若しくは未被覆紙のよう
な平らな担体に結合させてもよい。ポリマー粒子に結合
させた捕捉プローブを、このような平らな担体上に適当
な方法、例えば乾燥付着法、加熱融合付着法又は接着法
で固定化することもできる。捕捉プローブは、例えば、
本発明の自蔵式試験装置において平らな担体に結合させ
ることができる。このような材料の詳細については、欧
州特許出願第０ ４０８ ７３８号（１９９１年１月２
３日発行）、国際特許出願第ＷＯ９２／１６６５９号
（１９９２年１０月１日発行）及び米国特許第５，１７
３，２６０号（Ｓｕｔｔｏｎら）明細書に記載されてい
る。捕捉プローブは、適当な担体表面で、丸い付着物が
列をなした形や縞模様など、いずれの形状で配置されて
もよい。
ブレン、濾紙、又は樹脂被覆紙若しくは未被覆紙のよう
な平らな担体に結合させてもよい。ポリマー粒子に結合
させた捕捉プローブを、このような平らな担体上に適当
な方法、例えば乾燥付着法、加熱融合付着法又は接着法
で固定化することもできる。捕捉プローブは、例えば、
本発明の自蔵式試験装置において平らな担体に結合させ
ることができる。このような材料の詳細については、欧
州特許出願第０ ４０８ ７３８号（１９９１年１月２
３日発行）、国際特許出願第ＷＯ９２／１６６５９号
（１９９２年１０月１日発行）及び米国特許第５，１７
３，２６０号（Ｓｕｔｔｏｎら）明細書に記載されてい
る。捕捉プローブは、適当な担体表面で、丸い付着物が
列をなした形や縞模様など、いずれの形状で配置されて
もよい。
【００６７】本発明はまた、「均一」増幅法として知ら
れている、捕捉試薬を使用せずに標的核酸を同時検出す
る手法にも適用することができる。このようなアッセイ
の詳細は、欧州特許出願０ ４８７ ２１８号（１９９
２年５月２７日発行）及び同第０ ５１２ ３３４号
（１９９２年１１月１１日発行）に記載されているよう
に、当該技術分野では周知である。
れている、捕捉試薬を使用せずに標的核酸を同時検出す
る手法にも適用することができる。このようなアッセイ
の詳細は、欧州特許出願０ ４８７ ２１８号（１９９
２年５月２７日発行）及び同第０ ５１２ ３３４号
（１９９２年１１月１１日発行）に記載されているよう
に、当該技術分野では周知である。
【００６８】本発明の増幅反応組成物は、各種増幅アッ
セイに有用な試験キットの個別に包装される成分の一つ
として含まれることができる。このキットは、水不溶性
担体表面に固定化された捕捉試薬、洗浄液、抽出液、検
出試薬及びその他当業者であれば容易に想到できる材料
をはじめとする、本発明の方法に有用な他の試薬、溶
液、装置及び使用説明書を含むことができる。
セイに有用な試験キットの個別に包装される成分の一つ
として含まれることができる。このキットは、水不溶性
担体表面に固定化された捕捉試薬、洗浄液、抽出液、検
出試薬及びその他当業者であれば容易に想到できる材料
をはじめとする、本発明の方法に有用な他の試薬、溶
液、装置及び使用説明書を含むことができる。
【００６９】以下の実施例は、本発明の実施を説明する
ためのものであり、本発明を限定するものではない。特
に断らない限り、パーセントはすべて重量基準とした。
ためのものであり、本発明を限定するものではない。特
に断らない限り、パーセントはすべて重量基準とした。
【００７０】
【実施例】実施例についての材料および方法 実施例で用いたプライマーは、以下の配列を有するもの
とした。最初の２種はプロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡの
ｇａｇ領域に相補的であり、次の２種はヒトβ−グロブ
リン ＤＮＡに相補的である。 配列番号：１： ５′-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGA
AAT-３′ 配列番号：２： ５′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAA
TGC-３′ 配列番号：３： ５′-X-CAACTTCATC CACGTTCACC- ３′ 配列番号：４： ５′-ACACAACTGT GTTCACTAGC- ３′
とした。最初の２種はプロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡの
ｇａｇ領域に相補的であり、次の２種はヒトβ−グロブ
リン ＤＮＡに相補的である。 配列番号：１： ５′-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGA
AAT-３′ 配列番号：２： ５′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAA
TGC-３′ 配列番号：３： ５′-X-CAACTTCATC CACGTTCACC- ３′ 配列番号：４： ５′-ACACAACTGT GTTCACTAGC- ３′
【００７１】前記プライマー中、Ｘは、米国特許第 4,9
62,029号明細書（Levensonら）に記載された技法を用い
て、２つのアミノテトラエチレングリコール・スペーサ
ー基を介してオリゴヌクレオチドに付加された（ＤｕＰ
ｏｎｔ社製のビオチンホスホラミダイト由来の）ビオチ
ニル部分を表す。実施例で用いた捕捉プローブは、以下
の配列を有するものとした。第一はプロウイルスＨＩＶ
１ ＤＮＡ用であり、第二はヒトβ−グロブリン ＤＮ
Ａ用である。 配列番号：５： ５′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGA
ATGTATAGCCCTA C-Y- ３′ 配列番号：６： ５′-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTG
ACTC-Y-３′
62,029号明細書（Levensonら）に記載された技法を用い
て、２つのアミノテトラエチレングリコール・スペーサ
ー基を介してオリゴヌクレオチドに付加された（ＤｕＰ
ｏｎｔ社製のビオチンホスホラミダイト由来の）ビオチ
ニル部分を表す。実施例で用いた捕捉プローブは、以下
の配列を有するものとした。第一はプロウイルスＨＩＶ
１ ＤＮＡ用であり、第二はヒトβ−グロブリン ＤＮ
Ａ用である。 配列番号：５： ５′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGA
ATGTATAGCCCTA C-Y- ３′ 配列番号：６： ５′-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTG
ACTC-Y-３′
【００７２】「Ｙ」は、米国特許第４，９１４，２１０
号明細書（Levensonら）の教示に従い単一のアミンジオ
ール結合基に結合された２個のテトラエチレングリコー
ルスペーサーを表す。
号明細書（Levensonら）の教示に従い単一のアミンジオ
ール結合基に結合された２個のテトラエチレングリコー
ルスペーサーを表す。
【００７３】プライマー及び捕捉プローブは、既知の出
発物質と手順を採用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ、３本カラム式ＤＮＡ
合成機、標準ホスホラミダイト化学法及びＡＢＩ１μモ
ルスケールの高速サイクルプロトコールによって調製し
た。ヌクレオシド−３’−ホスホラミダイト及びヌクレ
オシド誘導化制御細孔ガラス担体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。すべての精製は、核
酸用精製カラムと続いて逆相ＨＰＬＣ技法によって行っ
た。
発物質と手順を採用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ、３本カラム式ＤＮＡ
合成機、標準ホスホラミダイト化学法及びＡＢＩ１μモ
ルスケールの高速サイクルプロトコールによって調製し
た。ヌクレオシド−３’−ホスホラミダイト及びヌクレ
オシド誘導化制御細孔ガラス担体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。すべての精製は、核
酸用精製カラムと続いて逆相ＨＰＬＣ技法によって行っ
た。
【００７４】捕捉プローブを形成するため、これらのプ
ローブを、従来の乳化重合法を用いてポリ〔スチレン−
コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕
（重量比95:5、平均直径１μｍ）から調製したポリマー
粒子（平均直径１μｍ）に共有結合させた。粒子を水に
懸濁させた懸濁液を、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸緩衝液（ 0.1モル，pH６）で洗浄し、そして固
形分が約10％となるように懸濁させた。洗浄した粒子の
試料（ 3.3mL）を希釈して、緩衝液中固形分が3.33％
（ 0.1モル）となるようにし、それを１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
（2.1mL, 84mg/mL, 水で調製）およびプローブ（ 983μ
Ｌ， 44.44OD/mL,ナノ純水で調製）と混合させた。得ら
れた懸濁液を水浴中50℃で約２時間断続的に混合しなが
ら加熱し、そして遠心分離した。次いで、（エチレンジ
ニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.0001モル）を含む
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（0.01
モル，pH８）で粒子を３回洗浄し、そしてそれに再懸濁
して固形分４％となるようにした。
ローブを、従来の乳化重合法を用いてポリ〔スチレン−
コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕
（重量比95:5、平均直径１μｍ）から調製したポリマー
粒子（平均直径１μｍ）に共有結合させた。粒子を水に
懸濁させた懸濁液を、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸緩衝液（ 0.1モル，pH６）で洗浄し、そして固
形分が約10％となるように懸濁させた。洗浄した粒子の
試料（ 3.3mL）を希釈して、緩衝液中固形分が3.33％
（ 0.1モル）となるようにし、それを１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
（2.1mL, 84mg/mL, 水で調製）およびプローブ（ 983μ
Ｌ， 44.44OD/mL,ナノ純水で調製）と混合させた。得ら
れた懸濁液を水浴中50℃で約２時間断続的に混合しなが
ら加熱し、そして遠心分離した。次いで、（エチレンジ
ニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.0001モル）を含む
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（0.01
モル，pH８）で粒子を３回洗浄し、そしてそれに再懸濁
して固形分４％となるようにした。
【００７５】米国特許第４，９４８，５６１号明細書
（Ｈｉｎｃｋｌｅｙら）に詳細に記載されているよう
に、緩衝液を用いて固形分０．２５％にまで希釈した捕
捉試薬（１．２μｌ）を、ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）
ディスポーザブル試験装置（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ社製）のテストウェルにおいて微多孔質膜（ＬＯＰＲ
ＯＤＹＮＥ（商品名）ポリアミド膜、平均孔径５μｍ、
Ｐａｌｌ社製）の画定された領域に適用して乾燥させ
た。
（Ｈｉｎｃｋｌｅｙら）に詳細に記載されているよう
に、緩衝液を用いて固形分０．２５％にまで希釈した捕
捉試薬（１．２μｌ）を、ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）
ディスポーザブル試験装置（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ社製）のテストウェルにおいて微多孔質膜（ＬＯＰＲ
ＯＤＹＮＥ（商品名）ポリアミド膜、平均孔径５μｍ、
Ｐａｌｌ社製）の画定された領域に適用して乾燥させ
た。
【００７６】ＰＣＲは、米国特許第５，０８９，２３３
号明細書（本明細書ではこれを参照することにより取り
入れることとする）に詳細に記載されている自動化され
たＫｏｄａｋ ＰＣＲ処理装置を用い、以下の実施例に
記載した加熱及び冷却プロトコールに従い実施した。
号明細書（本明細書ではこれを参照することにより取り
入れることとする）に詳細に記載されている自動化され
たＫｏｄａｋ ＰＣＲ処理装置を用い、以下の実施例に
記載した加熱及び冷却プロトコールに従い実施した。
【００７７】サーマス・アクアティカス（Thermus aqua
ticus ）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、従来の方
法を用いて入手した。グリセロール、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝液及びｄＮＴＰは、Sigma
Chemicalより入手した。
ticus ）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、従来の方
法を用いて入手した。グリセロール、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝液及びｄＮＴＰは、Sigma
Chemicalより入手した。
【００７８】常用の方法により８Ｅ５／ＬＡＶ細胞系統
からコピー数の少ない標的プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮ
Ａを抽出した。細胞を溶解しタンパク質を消化した後、
そのＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法で精製し
た。すなわち、細胞懸濁液にトリス飽和フェノール（７
５０μｌ）を加え、そしてフェノール／溶解物液を混合
して遠心分離法で分離した。次いで、その水相を新しい
２ｍｌのチューブに移した。この手順をクロロホルムイ
ソアミルアルコールを用いて繰り返した。その水層を
０．３モル酢酸ナトリウムにした。９５％の常温エタノ
ールを加えて−７０℃で１時間保存することにより核酸
を析出させた。次いで、プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡ
の濃度をＡ260 において測定し、そして実験用として、
ＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（１ミリモル）及び（エチレンジニトリロ）四酢酸
（０．１ミリモル）〕においてコピー数の異なる一連の
希釈液を調製した。
からコピー数の少ない標的プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮ
Ａを抽出した。細胞を溶解しタンパク質を消化した後、
そのＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法で精製し
た。すなわち、細胞懸濁液にトリス飽和フェノール（７
５０μｌ）を加え、そしてフェノール／溶解物液を混合
して遠心分離法で分離した。次いで、その水相を新しい
２ｍｌのチューブに移した。この手順をクロロホルムイ
ソアミルアルコールを用いて繰り返した。その水層を
０．３モル酢酸ナトリウムにした。９５％の常温エタノ
ールを加えて−７０℃で１時間保存することにより核酸
を析出させた。次いで、プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡ
の濃度をＡ260 において測定し、そして実験用として、
ＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（１ミリモル）及び（エチレンジニトリロ）四酢酸
（０．１ミリモル）〕においてコピー数の異なる一連の
希釈液を調製した。
【００７９】コピー数の多いヒトβ−グロブリン ＤＮ
Ａは、１細胞当たり２コピーのヒトβ−グロブリン遺伝
子を有すると考えられるヒト胎盤ＤＮＡ（０．５ｍｇ／
ｍｌ）において得られた。ロイコ色素分散体は、アガロ
ース（ 0.5％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフ
ェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニ
ル）イミダゾール・ロイコ色素（ 250マイクロモル）、
ジエチレントリアミン五酢酸（ 100マイクロモル）、
４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）、ポリ
ビニルピロリドン（ 112ミリモル）およびリン酸ナトリ
ウム，一塩基性，一水和物（10ミリモル）を含むものと
した。
Ａは、１細胞当たり２コピーのヒトβ−グロブリン遺伝
子を有すると考えられるヒト胎盤ＤＮＡ（０．５ｍｇ／
ｍｌ）において得られた。ロイコ色素分散体は、アガロ
ース（ 0.5％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフ
ェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニ
ル）イミダゾール・ロイコ色素（ 250マイクロモル）、
ジエチレントリアミン五酢酸（ 100マイクロモル）、
４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）、ポリ
ビニルピロリドン（ 112ミリモル）およびリン酸ナトリ
ウム，一塩基性，一水和物（10ミリモル）を含むものと
した。
【００８０】実施例で用いた複合体溶液は、市販のスト
レプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼの複
合体（Zymed Laboratories社）（ 126μL/L ）、カゼイ
ン（0.5％）およびメルチオレート（ 0.5％）をリン酸
緩衝塩化ナトリウム水溶液（リン酸ナトリウム２４ミリ
モル及び塩化ナトリウム７５ミリモル）に含むものとし
た。複合体の最終濃度は３１２ｎｇ／ｍｌとした。
レプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼの複
合体（Zymed Laboratories社）（ 126μL/L ）、カゼイ
ン（0.5％）およびメルチオレート（ 0.5％）をリン酸
緩衝塩化ナトリウム水溶液（リン酸ナトリウム２４ミリ
モル及び塩化ナトリウム７５ミリモル）に含むものとし
た。複合体の最終濃度は３１２ｎｇ／ｍｌとした。
【００８１】実施例で用いた洗浄溶液は、塩化ナトリウ
ム（ 373ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二
ナトリウム塩（ 2.5ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム
（38ミリモル）及びエチル水銀チオサリチル酸，ナトリ
ウム塩（25マイクロモル）を、リン酸ナトリウム，一塩
基性，一水和物緩衝液（25ミリモル，pH7.4 ）に含むも
のとした。反応混合物には「ＴＰ４」モノクローナル抗
体を使用した。この抗体は、サーマス・アクアティカス
（Thermus aquaticus ）由来のＤＮＡポリメラーゼに特
異的なものであって、米国特許第５，３３８，６７１号
明細書（上記）に詳細に記載されている。
ム（ 373ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二
ナトリウム塩（ 2.5ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム
（38ミリモル）及びエチル水銀チオサリチル酸，ナトリ
ウム塩（25マイクロモル）を、リン酸ナトリウム，一塩
基性，一水和物緩衝液（25ミリモル，pH7.4 ）に含むも
のとした。反応混合物には「ＴＰ４」モノクローナル抗
体を使用した。この抗体は、サーマス・アクアティカス
（Thermus aquaticus ）由来のＤＮＡポリメラーゼに特
異的なものであって、米国特許第５，３３８，６７１号
明細書（上記）に詳細に記載されている。
【００８２】実施例１〜４では、ポリメラーゼ連鎖反応
混合物（２００μｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カ
リウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリ
モル）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
（各１．５モル）、プライマー（各々０．１又は０．４
μモル）、ゼラチン（０．０１％）、上記ＤＮＡポリメ
ラーゼ（２００μｌ当たり８単位）、「ＴＰ４」モノク
ローナル抗体（ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比５
０：１）並びに体積排除剤として表示量のＰＥＧ−８０
００を含むものとした。
混合物（２００μｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カ
リウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリ
モル）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
（各１．５モル）、プライマー（各々０．１又は０．４
μモル）、ゼラチン（０．０１％）、上記ＤＮＡポリメ
ラーゼ（２００μｌ当たり８単位）、「ＴＰ４」モノク
ローナル抗体（ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比５
０：１）並びに体積排除剤として表示量のＰＥＧ−８０
００を含むものとした。
【００８３】以下の実施例５では、ＰＣＲ反応混合物
は、配列番号１と配列番号２を有するプライマーのみを
使用し、各プライマーの量を０．２μモルとし、そして
ＤＮＡポリメラーゼの量を２００μｌ当たり３２単位と
したことを除いては、上記と同じものとした。ＰＥＧ−
８０００のポリ（エチレングリコール）はＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手した。その分子量は約８０
００ダルトンである。硫酸デキストランは５Ｐｒｉｍｅ
＞３Ｐｒｉｍｅ社から入手した。
は、配列番号１と配列番号２を有するプライマーのみを
使用し、各プライマーの量を０．２μモルとし、そして
ＤＮＡポリメラーゼの量を２００μｌ当たり３２単位と
したことを除いては、上記と同じものとした。ＰＥＧ−
８０００のポリ（エチレングリコール）はＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手した。その分子量は約８０
００ダルトンである。硫酸デキストランは５Ｐｒｉｍｅ
＞３Ｐｒｉｍｅ社から入手した。
【００８４】残りの試薬および材料は、市販のものを使
用したか、または従来の方法を用いてEastman Kodak 社
で調製した。実施例１〜４：体積排除剤を使用したプロウイルスＨＩ
Ｖ１及びβ−グロブリンＤＮＡの高ストリンジェンシー
同時増幅 これらの実施例は、ストリンジェンシーの高い条件下
で、コピー数の多い標的核酸であるヒトβ−グロブリン
ＤＮＡの存在下、コピー数の少ない標的核酸であるプ
ロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡを増幅し検出するための異
なる数種類の増幅プロトコールを使用する本発明を例示
するものである。
用したか、または従来の方法を用いてEastman Kodak 社
で調製した。実施例１〜４：体積排除剤を使用したプロウイルスＨＩ
Ｖ１及びβ−グロブリンＤＮＡの高ストリンジェンシー
同時増幅 これらの実施例は、ストリンジェンシーの高い条件下
で、コピー数の多い標的核酸であるヒトβ−グロブリン
ＤＮＡの存在下、コピー数の少ない標的核酸であるプ
ロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡを増幅し検出するための異
なる数種類の増幅プロトコールを使用する本発明を例示
するものである。
【００８５】上記のＰＣＲ反応混合物（２００μｌ）
は、コピー数１０のプロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡと、
コピー数約１００万のヒトβ−グロブリン ＤＮＡと、
プライマー（４種類の各プライマーにつき０．１又は
０．４マイクロモル）とを含むものとした。対照用反応
混合物は、体積排除剤を含まなかったが、本発明の実施
で用いた混合物は１０％のＰＥＧ−８０００を含有し
た。対照Ａ〜Ｄのアッセイは、それぞれ実施例１〜４の
ＰＣＲプロトコールに従うものとした。
は、コピー数１０のプロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡと、
コピー数約１００万のヒトβ−グロブリン ＤＮＡと、
プライマー（４種類の各プライマーにつき０．１又は
０．４マイクロモル）とを含むものとした。対照用反応
混合物は、体積排除剤を含まなかったが、本発明の実施
で用いた混合物は１０％のＰＥＧ−８０００を含有し
た。対照Ａ〜Ｄのアッセイは、それぞれ実施例１〜４の
ＰＣＲプロトコールに従うものとした。
【００８６】実施例１では、ＰＣＲプロトコールは４０
回の一次増幅サイクルを含み、各サイクルは以下からな
るものとした。 １）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒
間）加熱して変性させる工程；及び ２）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程。実施例２のプロトコールは、各サイ
クルにおけるプライミング及び伸長工程を６０秒間実施
したことを除いて、実施例１と同様にした。
回の一次増幅サイクルを含み、各サイクルは以下からな
るものとした。 １）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒
間）加熱して変性させる工程；及び ２）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程。実施例２のプロトコールは、各サイ
クルにおけるプライミング及び伸長工程を６０秒間実施
したことを除いて、実施例１と同様にした。
【００８７】実施例３では、ＰＣＲプロトコールは、 １）各サイクルが、 Ａ）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒
間）加熱して変性させる工程；及び Ｂ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の一次増幅サイクル、並
びに ２）各サイクルが、 Ａ）９５℃で１５秒間加熱する工程；及び Ｂ）６４℃で６０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の二次増幅サイクルを含
むものとした。
間）加熱して変性させる工程；及び Ｂ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の一次増幅サイクル、並
びに ２）各サイクルが、 Ａ）９５℃で１５秒間加熱する工程；及び Ｂ）６４℃で６０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の二次増幅サイクルを含
むものとした。
【００８８】実施例４では、ＰＣＲプロトコールは、 １）各サイクルが、 Ａ）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒
間）加熱して変性させる工程；及び Ｂ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の一次増幅サイクル、並
びに ２）各サイクルが、 Ａ）９５℃で１５秒間加熱する工程； Ｂ）７５℃で３０秒間再生する工程；及び Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の二次増幅サイクルを含
むものとした。
間）加熱して変性させる工程；及び Ｂ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の一次増幅サイクル、並
びに ２）各サイクルが、 Ａ）９５℃で１５秒間加熱する工程； Ｂ）７５℃で３０秒間再生する工程；及び Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程を含む２０回の二次増幅サイクルを含
むものとした。
【００８９】増幅生成物の検出は、以下の方法で行っ
た。最終増幅反応混合物の一部（５μｌ）を、緩衝液
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリ
モル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化
マグネシウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１
％）〕（９５μｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュ
ベートし、核酸を変性させた。次いで、得られた溶液を
ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）試験装置（上記）に移し、
増幅された標的核酸を捕捉プローブに５０℃でハイブリ
ダイズできるようにした。
た。最終増幅反応混合物の一部（５μｌ）を、緩衝液
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリ
モル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化
マグネシウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１
％）〕（９５μｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュ
ベートし、核酸を変性させた。次いで、得られた溶液を
ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）試験装置（上記）に移し、
増幅された標的核酸を捕捉プローブに５０℃でハイブリ
ダイズできるようにした。
【００９０】次いで、試験装置のテストウェルを、上記
洗浄液（２５０μｌ）を用いて５５℃で洗浄した。室温
で、上記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体
液（５０μｌ）を各テストウェルに加えてその膜を透過
させた。２分後、テストウェルを２回洗浄した。
洗浄液（２５０μｌ）を用いて５５℃で洗浄した。室温
で、上記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体
液（５０μｌ）を各テストウェルに加えてその膜を透過
させた。２分後、テストウェルを２回洗浄した。
【００９１】上記のロイコ色素分散液（１００μｌ）を
各テストウェルに加え、そしてその装置を室温で２分間
インキュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の
溶液（１００μｌ）を加えて発色を停止させた。アッセ
イで得られた色素信号を、色濃度スケール０〜１０（最
高濃度）上で可視的に等級化した。ＰＥＧ−８０００を
含む場合と含まない場合とで、各種プライマー量につい
て得られたアッセイの結果を以下の表１に示す。明らか
に、ＤＮＡポリメラーゼの存在量が減少すると、体積排
除剤の存在によって増幅効率が増加している。この結果
は、実施例２及び実施例３において０．１μモルの各プ
ライマーを使用した場合に特に明白であるが、各ＰＣＲ
プロトコールで信号増加が認められた。
各テストウェルに加え、そしてその装置を室温で２分間
インキュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の
溶液（１００μｌ）を加えて発色を停止させた。アッセ
イで得られた色素信号を、色濃度スケール０〜１０（最
高濃度）上で可視的に等級化した。ＰＥＧ−８０００を
含む場合と含まない場合とで、各種プライマー量につい
て得られたアッセイの結果を以下の表１に示す。明らか
に、ＤＮＡポリメラーゼの存在量が減少すると、体積排
除剤の存在によって増幅効率が増加している。この結果
は、実施例２及び実施例３において０．１μモルの各プ
ライマーを使用した場合に特に明白であるが、各ＰＣＲ
プロトコールで信号増加が認められた。
【００９２】表１ アッセイ プライマー濃度（μモル） 色素信号 実施例１ ０．４ ０．５０ 実施例１ ０．１ ４．２５ 対照Ａ ０．４ ０．５０ 対照Ａ ０．１ １．２５ 実施例２ ０．４ ４．２５ 実施例２ ０．１ ７．５０ 対照Ｂ ０．４ １．５０ 対照Ｂ ０．１ ６．２５ 実施例３ ０．４ ４．５０ 実施例３ ０．１ ８．００ 対照Ｃ ０．４ ５．００ 対照Ｃ ０．１ ３．７５ 実施例４ ０．４ ４．５０ 実施例４ ０．１ ６．５０ 対照Ｄ ０．４ ２．５０ 対照Ｄ ０．１ ０
【００９３】実施例５：ＰＥＧと硫酸デキストランとの
比較 この実施例は、コピー数の少ない標的核酸のプロウイル
スＨＩＶ１ ＤＮＡを増幅して検出するＰＣＲにおいて
体積排除剤として使用するＰＥＧ−８０００と硫酸デキ
ストランとを比較するものである。同時増幅は実施しな
かったが、この実験は、ＰＣＲにおける体積排除剤とし
て硫酸デキストランが使用できないことを例示してい
る。同時増幅におけるＰＥＧの使用については実施例１
〜４に説明した通りである。
比較 この実施例は、コピー数の少ない標的核酸のプロウイル
スＨＩＶ１ ＤＮＡを増幅して検出するＰＣＲにおいて
体積排除剤として使用するＰＥＧ−８０００と硫酸デキ
ストランとを比較するものである。同時増幅は実施しな
かったが、この実験は、ＰＣＲにおける体積排除剤とし
て硫酸デキストランが使用できないことを例示してい
る。同時増幅におけるＰＥＧの使用については実施例１
〜４に説明した通りである。
【００９４】上記のＰＣＲ反応混合物（２００μｌ）
は、コピー数１２のプロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡと、
（バックグラウンドとして）コピー数約１００万のヒト
胎盤ＤＮＡと、プライマー（各々０．２マイクロモル）
とを含むものとした。対照用反応混合物は、ＰＥＧ−８
０００も硫酸デキストランも含まなかったが、他の混合
物は１〜１０％のＰＥＧ−８０００又は硫酸デキストラ
ンを含有した。
は、コピー数１２のプロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡと、
（バックグラウンドとして）コピー数約１００万のヒト
胎盤ＤＮＡと、プライマー（各々０．２マイクロモル）
とを含むものとした。対照用反応混合物は、ＰＥＧ−８
０００も硫酸デキストランも含まなかったが、他の混合
物は１〜１０％のＰＥＧ−８０００又は硫酸デキストラ
ンを含有した。
【００９５】ＰＣＲプロトコールは４０回の一次増幅サ
イクルを含み、各サイクルは以下からなるものとした。 １）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒
間）加熱して変性させる工程；及び ２）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程。
イクルを含み、各サイクルは以下からなるものとした。 １）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒
間）加熱して変性させる工程；及び ２）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）し
て伸長させる工程。
【００９６】増幅生成物の検出は、以下の方法で行っ
た。最終増幅反応混合物の一部（５μｌ）を、緩衝液
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリ
モル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化
マグネシウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１
％）〕（９５μｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュ
ベートし、核酸を変性させた。次いで、得られた溶液を
ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）試験装置（上記）に移し、
増幅された標的核酸を捕捉プローブに５０℃でハイブリ
ダイズできるようにした。
た。最終増幅反応混合物の一部（５μｌ）を、緩衝液
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリ
モル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化
マグネシウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１
％）〕（９５μｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュ
ベートし、核酸を変性させた。次いで、得られた溶液を
ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）試験装置（上記）に移し、
増幅された標的核酸を捕捉プローブに５０℃でハイブリ
ダイズできるようにした。
【００９７】次いで、試験装置のテストウェルを、上記
洗浄液（２５０μｌ）を用いて５５℃で洗浄した。室温
で、上記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体
液（５０μｌ）を各テストウェルに加えてその膜を透過
させた。２分後、テストウェルを２回洗浄した。
洗浄液（２５０μｌ）を用いて５５℃で洗浄した。室温
で、上記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体
液（５０μｌ）を各テストウェルに加えてその膜を透過
させた。２分後、テストウェルを２回洗浄した。
【００９８】上記のロイコ色素分散液（１００μｌ）を
各テストウェルに加え、そしてその装置を室温で２分間
インキュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の
溶液（１００μｌ）を加えて発色を停止させた。アッセ
イで得られた色素信号を、色濃度スケール０〜１０（最
高濃度）上で可視的に等級化した。ＰＥＧ−８０００又
は硫酸デキストランを含む場合と含まない場合とのアッ
セイの結果を以下の表２に示す。明らかに、ＰＥＧ−８
０００の存在によって増幅効率が増加したが、硫酸デキ
ストランの存在はＰＣＲを完全に阻害した。
各テストウェルに加え、そしてその装置を室温で２分間
インキュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の
溶液（１００μｌ）を加えて発色を停止させた。アッセ
イで得られた色素信号を、色濃度スケール０〜１０（最
高濃度）上で可視的に等級化した。ＰＥＧ−８０００又
は硫酸デキストランを含む場合と含まない場合とのアッ
セイの結果を以下の表２に示す。明らかに、ＰＥＧ−８
０００の存在によって増幅効率が増加したが、硫酸デキ
ストランの存在はＰＣＲを完全に阻害した。
【００９９】表２ 体積排除剤 色素信号 無 ４．５ １％ＰＥＧ−８０００ ６ ２％ＰＥＧ−８０００ ７．５ ４％ＰＥＧ−８０００ ８．５ ６％ＰＥＧ−８０００ ９ ８％ＰＥＧ−８０００ ８．５ １０％ＰＥＧ−８０００ ８．５ 無 ６．５ １％硫酸デキストラン ０ ２％硫酸デキストラン ０ ４％硫酸デキストラン ０ ６％硫酸デキストラン ０ ８％硫酸デキストラン ０ １０％硫酸デキストラン ０
【０１００】本発明をその好ましい態様を特に参照して
詳細に記載してきたが、変更および修正が本発明の精神
および範囲内で可能であることは理解されるであろう。
詳細に記載してきたが、変更および修正が本発明の精神
および範囲内で可能であることは理解されるであろう。
【０１０１】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡのプライマ
ー ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
ー ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
【０１０２】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡのプライマ
ー ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
ー ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
【０１０３】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：β−グロブリン ＤＮＡのプライマー ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 CAACTTCATC CACGTTCACC 20
【０１０４】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：β−グロブリン ＤＮＡのプライマー ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 ACACAACTGT GTTCACTAGC 20
【０１０５】配列番号：５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プロウイルスＨＩＶ１ ＤＮＡのプローブ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41
【０１０６】配列番号：６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：β−グロブリン ＤＮＡのプローブ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源：合成 直接の起源：合成 刊行物情報：米国特許第５，１４７，７７７号明細書 配列 CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C 31
Claims (20)
- 【請求項１】 少なくとも１５回の一次増幅サイクルを
含む２種以上の標的核酸を同時増幅する方法であって、
前記一次増幅サイクルの各々が、 Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生
成物の反応混合物を、前記標的核酸又はそれらのプライ
マー伸長生成物の鎖を変性するために第一温度Ｔ1 に加
熱する工程、 Ｂ）第二温度Ｔ2 まで冷却することによって、増幅すべ
き各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイ
ズすることができる一組のプライマーで前記変性された
鎖をプライミングする工程、及び Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
第三温度Ｔ3 におけるインキュベーションによってＰＣ
Ｒ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸
長生成物形成工程とを同一工程で実施する場合にはＴ2
とＴ3 は同じである〕、を逐次工程として含み、そして
前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前記反
応混合物が、非イオン性で高分子量の体積排除剤を約４
重量％以上含む、核酸の同時増幅方法。 - 【請求項２】 前記体積排除剤がポリエーテル、糖とエ
ピクロロヒドリンとの反応生成物、多糖及びポリアクリ
レートから成る群より選択される、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 前記体積排除剤が、下式： Ｈ−（Ｏ−Ｒ）n −Ｈ （上式中、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキレン基であ
り、ｎは１５〜１０００の整数である）で示されるポリ
エーテルである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記体積排除剤がポリ（エチレングリコ
ール）又はポリ（プロピレングリコール）である、請求
項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記体積排除剤の平均分子量が約１００
０〜約２０，０００ダルトンである、請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 前記体積排除剤が前記反応混合物中に約
４〜約１２重量％の量で存在する、請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】 前記標的核酸の少なくとも１種がコピー
数の少ない標的核酸であり、且つ前記標的核酸の少なく
とも１種が、前記コピー数の少ない標的核酸の約１００
０倍以上の濃度で存在すると予測されているコピー数の
多い標的核酸である、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 増幅すべき標的核酸に対する各プライマ
ー組の各プライマーが約０．０２５μモル濃度以上、約
１μモル濃度未満の同じ濃度で存在している、請求項１
記載の方法。 - 【請求項９】 前記各プライマー組の各プライマーが約
０．０５〜約０．２μモル濃度で存在している、請求項
８記載の方法。 - 【請求項１０】 少なくとも５回の二次増幅サイクルを
さらに含む請求項７記載の方法であって、前記二次増幅
サイクルの各々が前記工程Ａ〜Ｃを逐次反復する工程を
含むと共に、各二次増幅サイクルにおける工程Ａと工程
Ｂとの間に、反応混合物を、 （ＴmH＋５）℃≦Ｔ4 ≦ＴPH 〔式中、ＴmHはコピー数の多い標的核酸に対するプライ
マーの融解温度であり、ＴPHは前記コピー数の多い標的
核酸の二本鎖の融解温度である〕で規定される第四温度
Ｔ4 まで冷却して該温度で約１５〜約１２０秒間維持す
る工程を含む、請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】 工程Ｂと工程Ｃがすべてのサイクルで
同じであり、そしてＴ2 とＴ3 とが約６２〜約７０℃の
同じ温度である、請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 前記標的核酸の少なくとも１種に対し
て特異的なプライマーの一方又は両方がビオチン化され
ており、そして前記増幅された標的核酸の検出が、増幅
後に得られたビオチン化された鎖をこれに相補的な不溶
化オリゴヌクレオチドを用いて捕捉し、次いで検出可能
に標識されたストレプトアビジン複合体によって、前記
捕捉されたビオチン化された鎖を検出することによって
行われる、請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 前記オリゴヌクレオチドが磁性粒子又
は高分子粒子に固定化されている、請求項１２記載の方
法。 - 【請求項１４】 各一次増幅サイクルを約３０〜約１２
０秒間実施する、請求項１記載の方法。 - 【請求項１５】 少なくとも１５回の一次増幅サイクル
を含む２種以上の標的核酸を同時増幅して前記標的核酸
の１種以上を検出する方法であって、前記一次増幅サイ
クルの各々が、 Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生
成物の反応混合物を、前記標的核酸又はそれらのプライ
マー伸長生成物の鎖を変性するために第一温度Ｔ1 に加
熱する工程、 Ｂ）第二温度Ｔ2 まで冷却することによって、増幅すべ
き各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイ
ズすることができる一組のプライマーで前記変性された
鎖をプライミングする工程、及び Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
第三温度Ｔ3 におけるインキュベーションによってＰＣ
Ｒ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成さ
せる工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸
長生成物形成工程とを同一工程で実施する場合にはＴ2
とＴ3 は同じである〕、を逐次工程として含み、その
際、前記一次増幅サイクルの少なくとも一つにおける前
記反応混合物が、非イオン性で高分子量の体積排除剤を
約４重量％以上含み、そして Ｄ）最後の一次増幅サイクル終了後、前記標的核酸の１
種以上を示すものとして前記プライマー伸長生成物の１
種以上を検出する工程、を含む、核酸の同時増幅／検出
方法。 - 【請求項１６】 一組以上のプライマーと、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰと、約４重量％以
上の非イオン性で高分子量の体積排除剤とを含み、ｐＨ
を約７．５〜約９に緩衝化された増幅反応用組成物。 - 【請求項１７】 各プライマー組の各プライマーが約１
μモル濃度未満の同じ濃度で存在し、そして前記体積排
除剤が、ポリエーテル、糖とエピクロロヒドリンとの反
応生成物、多糖及びポリアクリレートから成る群より選
択され、約１０００〜約２０，０００ダルトンの平均分
子量を有し、且つ前記反応混合物中に約４〜約１２重量
％の量で存在する、請求項１６記載の組成物。 - 【請求項１８】 ａ）一組以上のプライマーと、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰと、約４重量
％以上の非イオン性で高分子量の体積排除剤とを含み、
ｐＨを約７．５〜約９に緩衝化された増幅反応用組成
物、及び ｂ）水不溶性担体に固定されたオリゴヌクレオチドを含
む捕捉試薬が個別に包装されて含まれている試験キッ
ト。 - 【請求項１９】 各プライマー組の各プライマーが約１
μモル濃度未満の同じ濃度で存在し、 前記体積排除剤が、ポリエーテル、糖とエピクロロヒド
リンとの反応生成物、多糖及びポリアクリレートから成
る群より選択され、約１０００〜約２０，０００ダルト
ンの平均分子量を有し、且つ前記反応混合物中に約４〜
約１２重量％の量で存在し、そして前記捕捉試薬が磁性
粒子又は高分子粒子を含む、請求項１８記載の試験キッ
ト。 - 【請求項２０】 ａ）一組以上のプライマーと、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰと、約４重量
％以上の非イオン性で高分子量の体積排除剤とを含み、
ｐＨを約７．５〜約９に緩衝化された増幅反応用組成
物、及び ｂ）水不溶性担体に固定されたオリゴヌクレオチドを含
む捕捉試薬を別々の区分室に含む自蔵式試験装置であっ
て、 前記区分室は、前記試験装置内において、前記増幅反応
用組成物が増幅後に前記試験装置を開放することなく前
記捕捉試薬と接触されうるように連結されている自蔵式
試験装置。
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004113242A (ja) * | 2002-09-24 | 2004-04-15 | Qiagen Gmbh | 核酸の強化された共増幅 |
| JP2006320217A (ja) * | 2005-05-17 | 2006-11-30 | Olympus Corp | マルチプレックスｐｃｒ法 |
| JP2008500831A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-01-17 | エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド | リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 |
| US8426134B2 (en) | 2002-02-21 | 2013-04-23 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8460875B2 (en) | 2002-02-21 | 2013-06-11 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8574846B2 (en) | 2002-02-21 | 2013-11-05 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8580507B2 (en) | 2005-07-25 | 2013-11-12 | Alere San Diego, Inc. | Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification |
| US8637253B2 (en) | 2006-05-04 | 2014-01-28 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US9057097B2 (en) | 2009-06-05 | 2015-06-16 | Alere San Diego Inc. | Recombinase polymerase amplification reagents and kits |
| JP2015180193A (ja) * | 2014-01-29 | 2015-10-15 | アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． | 次世代シーケンシングの標的濃縮用の高速ハイブリダイゼーション |
| JP5908840B2 (ja) * | 2010-09-22 | 2016-04-26 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びデバイス、キット |
| US9469867B2 (en) | 2009-05-20 | 2016-10-18 | Alere San Diego, Inc. | DNA glycosylase/lyase and AP endonuclease substrates |
| JP2020513749A (ja) * | 2016-12-19 | 2020-05-21 | クアンタム−エスアイ インコーポレイテッドＱｕａｎｔｕｍ−Ｓｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ | 分析するための分子の試料ウェル中へのローディング |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9819418D0 (en) * | 1998-09-07 | 1998-10-28 | Secr Defence | Amplification method |
| US6200757B1 (en) | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| JP2001029078A (ja) * | 1999-07-16 | 2001-02-06 | Shimadzu Corp | Ｒｎａ増幅法 |
| GB0114639D0 (en) * | 2001-06-15 | 2001-08-08 | Sec Dep Of The Home Department | Improvements in and relating to analysis of DNA |
| EP1411133B1 (en) * | 2002-09-24 | 2009-01-07 | Qiagen GmbH | Enhanced coamplification of nucleic acids |
| CA2560513A1 (en) | 2004-04-08 | 2005-12-01 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
| US20060099567A1 (en) * | 2004-04-08 | 2006-05-11 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
| CA2502549C (en) * | 2004-04-23 | 2016-02-16 | Becton, Dickinson And Company | Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids |
| EP2077337A1 (en) * | 2007-12-26 | 2009-07-08 | Eppendorf Array Technologies SA | Amplification and detection composition, method and kit |
| WO2012018639A2 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| EP2598660B1 (en) | 2010-07-26 | 2017-03-15 | Biomatrica, INC. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| CA2831140C (en) | 2011-04-07 | 2017-11-07 | Alere San Diego, Inc. | Monitoring recombinase polymerase amplification mixtures |
| EP2743353A1 (en) * | 2012-12-13 | 2014-06-18 | Alacris Theranostics GmbH | Interstitial amplification |
| US9725703B2 (en) | 2012-12-20 | 2017-08-08 | Biomatrica, Inc. | Formulations and methods for stabilizing PCR reagents |
| EP3154338B1 (en) | 2014-06-10 | 2020-01-29 | Biomatrica, INC. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
| JP6827048B2 (ja) | 2015-12-08 | 2021-02-10 | バイオマトリカ，インク． | 赤血球沈降速度の低下 |
| WO2018204810A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Quantum-Si Incorporated | Substrates having modified surface reactivity and antifouling properties in biological reactions |
| EP3802857A4 (en) * | 2018-06-07 | 2022-03-09 | BioFire Diagnostics, LLC | RAPID THERMOCYCLING PROCESSES |
| JP2022551523A (ja) | 2019-10-11 | 2022-12-09 | クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド | 気相における表面修飾 |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3798320A (en) * | 1970-09-18 | 1974-03-19 | South African Inventions | Precipitation of bacterial cells with polymers |
| US4302204A (en) * | 1979-07-02 | 1981-11-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Transfer and detection of nucleic acids |
| CA1180647A (en) | 1981-07-17 | 1985-01-08 | Cavit Akin | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
| US4766064A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit |
| US4813326A (en) | 1984-07-16 | 1989-03-21 | Yamaha Corporation | Method and apparatus for synthesizing music tones with high harmonic content |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4795698A (en) * | 1985-10-04 | 1989-01-03 | Immunicon Corporation | Magnetic-polymer particles |
| CA1339653C (en) | 1986-02-25 | 1998-02-03 | Larry J. Johnson | Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps |
| US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| US4997771A (en) | 1987-04-27 | 1991-03-05 | Schering Corporation | Method for measuring the BZ-1 receptor binding activity in a test sample or test compound |
| US5024935A (en) | 1987-12-18 | 1991-06-18 | Eastman Kodak Company | Dye-providing composition, diagnostic test kit and their use in method for ligand determination using peroxidase labeled-receptor |
| US4914210A (en) | 1987-10-02 | 1990-04-03 | Cetus Corporation | Oligonucleotide functionalizing reagents |
| US4962029A (en) | 1987-10-02 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate |
| US4902624A (en) | 1987-11-23 | 1990-02-20 | Eastman Kodak Company | Temperature cycling cuvette |
| US4886741A (en) * | 1987-12-09 | 1989-12-12 | Microprobe Corporation | Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization |
| IL88923A (en) | 1988-01-12 | 1995-07-31 | Hoffmann La Roche | Gene encoding a thermostable dna polymerase from thermus aquaticus said dna polymerase and its purification |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| US5229297A (en) * | 1989-02-03 | 1993-07-20 | Eastman Kodak Company | Containment cuvette for PCR and method of use |
| KR910700354A (ko) | 1989-02-03 | 1991-03-14 | 존 디. 후써 | 핵산 테스트 제품 및 이것을 이용해 미리 알고있는 핵산을 검출하는 방법 |
| US4948561A (en) | 1989-02-09 | 1990-08-14 | Eastman Kodak Company | Multiple level filter device and kit containing same |
| US5334499A (en) | 1989-04-17 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction |
| US5089233A (en) | 1989-06-12 | 1992-02-18 | Eastman Kodak Company | Processing apparatus for a chemical reaction pack |
| US5106730A (en) * | 1989-07-24 | 1992-04-21 | Microprobe Corporation | Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids |
| US5231015A (en) | 1989-10-18 | 1993-07-27 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme |
| CA2031659A1 (en) | 1990-01-26 | 1991-07-27 | John B. Findlay | Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods |
| US5194370A (en) * | 1990-05-16 | 1993-03-16 | Life Technologies, Inc. | Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences |
| JP2969222B2 (ja) | 1990-06-07 | 1999-11-02 | 清水建設株式会社 | 原子炉の生体遮蔽コンクリート壁の解体装置および原子炉の生体遮蔽コンクリート壁の解体工法 |
| US5155166A (en) | 1990-06-18 | 1992-10-13 | Eastman Kodak Company | Use of 1-(1-pyrrolidinylcarbonyl)pyridinium salts to attach compounds to carboxylated particles and a kit containing same |
| US5147777A (en) | 1990-06-18 | 1992-09-15 | Eastman Kodak Company | Biologically active reagents prepared from carboxy-containing polymer, analytical element and methods of use |
| US5173260A (en) | 1990-09-17 | 1992-12-22 | Eastman Kodak Company | Beads fused to a test device support |
| DE69128520T2 (de) | 1990-10-31 | 1998-07-09 | Tosoh Corp | Verfahren zum Nachweis oder Quantifizierung von Zielnukleinsäuren |
| IE913930A1 (en) * | 1990-11-13 | 1992-06-17 | Siska Diagnostics | Nucleic acid amplification by two-enzyme, self-sustained¹sequence replication |
| CA2083173A1 (en) | 1991-03-21 | 1992-09-22 | Leonard J. Seaberg | Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes |
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| EP0543484B1 (en) * | 1991-08-30 | 2001-01-31 | Research Development Corporation of Japan | A method of DNA amplification |
| US5338671A (en) | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| US5340728A (en) * | 1992-12-09 | 1994-08-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction |
| EP0648845B1 (en) * | 1993-07-08 | 2002-10-09 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Method for coamplification of two different nucleic acid sequences using polymerase chain reaction |
-
1994
- 1994-09-15 US US08/306,792 patent/US5705366A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-09-14 ES ES95306480T patent/ES2219655T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-14 PT PT95306480T patent/PT702090E/pt unknown
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- 1995-09-14 AT AT95306480T patent/ATE266102T1/de active
- 1995-09-14 EP EP95306480A patent/EP0702090B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-14 DK DK95306480T patent/DK0702090T3/da active
Cited By (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8945845B2 (en) | 2002-02-21 | 2015-02-03 | Alere San Diego Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US9309502B2 (en) | 2002-02-21 | 2016-04-12 | Alere San Diego Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US10036057B2 (en) | 2002-02-21 | 2018-07-31 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US9663820B2 (en) | 2002-02-21 | 2017-05-30 | Alere San Diego Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US10329602B2 (en) | 2002-02-21 | 2019-06-25 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US9340825B2 (en) | 2002-02-21 | 2016-05-17 | Alere San Diego, Inc. | Compositions for recombinase polymerase amplification |
| US8426134B2 (en) | 2002-02-21 | 2013-04-23 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US10947584B2 (en) | 2002-02-21 | 2021-03-16 | Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8460875B2 (en) | 2002-02-21 | 2013-06-11 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8574846B2 (en) | 2002-02-21 | 2013-11-05 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US10329603B2 (en) | 2002-02-21 | 2019-06-25 | Alere San Diego Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8962255B2 (en) | 2002-02-21 | 2015-02-24 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| JP2004113242A (ja) * | 2002-09-24 | 2004-04-15 | Qiagen Gmbh | 核酸の強化された共増幅 |
| JP4675558B2 (ja) * | 2002-09-24 | 2011-04-27 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 核酸の強化された共増幅 |
| JP2013102769A (ja) * | 2004-06-01 | 2013-05-30 | Alere San Diego Inc | リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 |
| JP2011103900A (ja) * | 2004-06-01 | 2011-06-02 | Asm Scientific Inc | リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 |
| JP2008188020A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-08-21 | Asm Scientific Inc | リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 |
| JP2008500831A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-01-17 | エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド | リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 |
| JP2006320217A (ja) * | 2005-05-17 | 2006-11-30 | Olympus Corp | マルチプレックスｐｃｒ法 |
| US10538760B2 (en) | 2005-07-25 | 2020-01-21 | Alere San Diego, Inc. | Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification |
| US8580507B2 (en) | 2005-07-25 | 2013-11-12 | Alere San Diego, Inc. | Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification |
| US11339382B2 (en) | 2006-05-04 | 2022-05-24 | Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US10093908B2 (en) | 2006-05-04 | 2018-10-09 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US8637253B2 (en) | 2006-05-04 | 2014-01-28 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US9896719B2 (en) | 2009-05-20 | 2018-02-20 | Alere San Diego Inc. | DNA glycosylase/lyase and AP endonuclease substrates |
| US9469867B2 (en) | 2009-05-20 | 2016-10-18 | Alere San Diego, Inc. | DNA glycosylase/lyase and AP endonuclease substrates |
| US9057097B2 (en) | 2009-06-05 | 2015-06-16 | Alere San Diego Inc. | Recombinase polymerase amplification reagents and kits |
| JP5908840B2 (ja) * | 2010-09-22 | 2016-04-26 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びデバイス、キット |
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