JP4675558B2 - 核酸の強化された共増幅 - Google Patents
核酸の強化された共増幅 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4675558B2 JP4675558B2 JP2003332155A JP2003332155A JP4675558B2 JP 4675558 B2 JP4675558 B2 JP 4675558B2 JP 2003332155 A JP2003332155 A JP 2003332155A JP 2003332155 A JP2003332155 A JP 2003332155A JP 4675558 B2 JP4675558 B2 JP 4675558B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- target nucleic
- amplification
- nucleic acids
- primer extension
- reaction mixture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 140
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 136
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 95
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 77
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims abstract description 59
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 57
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 49
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 82
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 67
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 21
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- -1 1,2-ethylene, 1,3-propylene, 1,2-propylene, 2-hydroxy-1,3-propylene, 3-hydroxy-1,2-propylene, 1,4-butylene Chemical group 0.000 claims description 11
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 9
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 4
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 3
- OWPUOLBODXJOKH-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl prop-2-enoate Chemical compound OCC(O)COC(=O)C=C OWPUOLBODXJOKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001311 Poly(hydroxyethyl acrylate) Polymers 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 claims 2
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 131
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 3
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N pentofuranose Chemical group OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035634 B-cell linker protein Human genes 0.000 description 2
- 101710083670 B-cell linker protein Proteins 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 101100044298 Drosophila melanogaster fand gene Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 2
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 2
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 2
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 101100335198 Pneumocystis carinii fol1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 2
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 108010037497 3'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000205192 Pyrococcus woesei Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 241000204103 Thermococcus fumicolans Species 0.000 description 1
- 241000522612 Thermococcus peptonophilus Species 0.000 description 1
- 241000246521 Thermococcus stetteri Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Chemical group 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013581 critical reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 108010046301 glucose peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000892 gravimetry Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012035 limiting reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002557 polyglycidol polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical group 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 150000004072 triols Chemical group 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本発明は、一般に、核酸化学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、共増幅(coamplification)反応、例えば、複合PCR反応の効率(performance)を高めるための方法に関する。
近年、ゲノムの特徴、病原菌、および、ヒト、植物、微生物または動物の被検物中に、ごく少量存在する様々な有機体の早期検出のための手段として、核酸の検出が開発されている。検出工程は、通常、それにより２つのＤＮＡ鎖が、相補性ヌクレオチド（ヌクレオチド対として知られている）間の水素結合および他の力によって一緒に結合する、相補性の概念に基づいている。
ＤＮＡ分子は、通常、きわめて安定であるが、その鎖は、加熱等の所定の条件によって、分離または変性され得る。変性された鎖は、相補的なヌクレオチド配列を有する別の鎖とだけ、再結合するであろう。
ほんのわずかなＤＮＡ分子を検出する方法を見出すために、多くの研究が行われてきた。検出用の被検物中でいくつかの核酸を増幅するか、または顕著に増加させるために、様々な工程が知られており、１０年以上にわたって用いられてきた。そのような増幅技術には、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）、リガーゼ・チェーン反応（ＬＣＲ）、およびあまり開発されていない他の方法が含まれる。
核酸配列の増幅のための両チェーン反応、特に、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）法、は、当分野で周知であり、米国特許第4,683,202号明細書（特許文献１）、米国特許第 4,683,195号明細書（特許文献２）、および米国特許第4,965,188号明細書（特許文献３）に開示されている。
ＰＣＲ増幅の各サイクルでは、二本鎖ターゲット配列が変性され、プライマーが、変性されたターゲットの各鎖へアニールされ、そして、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、プライマーが伸長される。増幅の特異性は、プライマーアニーリングとも呼ばれる、プライマーハイブリダイゼーションの特異性に依存する。プライマーは、ターゲット核酸配列の各鎖の３’末端で始まる配列と相補的であるか、または実質的に相補的であるように選択される。典型的なＰＣＲで用いられる高温下で、プライマーは、目的の(intended)ターゲット配列とだけハイブリダイズする。しかし、増幅反応混合物は、典型的には、プライマーハイブリダイゼーション特異性を保証するために必要な温度よりはるかに低温である室温で会合する(assembled)。そのようなあまりストリンジェントではない条件下で、プライマーは、他の一部だけ相補的な核酸配列と（または、他のプライマーとも）、非特異的に結合し、ターゲット配列とともに増幅し得る、望ましくない伸長生成物(extension products)の合成を起こし得る。非特異的プライマー伸長生成物の増幅は、所望のターゲット配列の増幅と競争することができ、そして、所望の配列の増幅の効率を大幅に低減し得る。非特異的増幅によって引き起こされる問題は、チョウ(Chou)ら、1992、核酸研究（Nucleic Acids Research） 20(7):1717-1723（非特許文献１）で更に議論されている。この文献の内容は、本明細書に開示として援用される。
非特異的増幅は、反応開始前に、非相補的ターゲット配列と結合したプライマーからの伸長生成物の形成を低減することによって低減され得る。“ホット−スタート(hot-start)”プロトコルと呼ばれる方法では、必要なハイブリダイゼーション特異性をもたらすのに充分な温度に温度を上げるまで、１つ以上の重要な(critical)試薬を、反応混合物に与えないでおく。このように、特異的プライマーハイブリダイゼーションを保証する反応条件にならない限り、反応混合物は、プライマー伸長を助けることができない。
ホット−スタート法は、初期の高温インキュベーション段階、および、加えないでおいた(missing)試薬を添加した後に、反応管を開くことによって、手動で行われ得る。しかし、手動のホット−スタート法は、多大な労力を要し、反応混合物の汚染の危険性を増大させる。反応成分を分離または単離するために、ワックスのような熱的に不安定な材料を使用するホット−スタート法は、米国特許第5,411,876号明細書（特許文献４）（この内容は、本明細書に開示として援用される）、および前記のチョウ(Chou)ら、１９９２年、に記載されている。これらの方法では、高温の前反応インキュベーションによって、熱的に不安定な材料を溶解することにより、試薬が溶解される。
非特異的増幅の問題に対する簡単かつ経済的な解決法をもたらす、プライマーに基づく増幅反応を用いて核酸を増幅するための方法および試薬は、従来から知られていた（例えば、米国特許第5,773,258 号明細書（特許文献５）および米国特許第6,183,998号明細書（特許文献６））。それらの方法は、高温で増幅反応混合物中でインキュベートすることによって再活性化され得る、可逆的に不活性化された熱安定性酵素を使用する。反応混合物の温度が、プライマーハイブリダイゼーション特異性を保証する温度まで上がらない限り、反応混合物は、プライマー伸長を補助しないので、非特異的増幅は、大幅に低減される。
ヒトおよび動物の被検物が、多くの異なる核酸を含んでいることから、別の問題が生じる。それら核酸のいくつかは、ヒトや動物に内在しているもの（天然のもの）であり、他は、病原菌または腫瘍形成条件の存在のような、ある異常な条件によって生み出される。そのような核酸は、通常、内在する核酸と比べて、非常に低い濃度で存在する。それらは、しばしば、“低コピー数(low copy number)”核酸と呼ばれる、それに対して、内在する核酸は、通常、高濃度で存在し、“高コピー数”核酸と呼ばれ得る。その例の１つは、ヒトβ−グロブリンＤＮＡである。しばしば、ＰＣＲ使用時に、被検物中に存在する２つ以上の核酸が、同じ反応容器中で同時に増幅される。これを、ここで“共増幅(co-amplification)”と言う。この方法は、増幅されるべき各核酸に対するプライマーが、容器中に同時に存在しなければならないことを要する。
低コピーターゲット核酸および高コピーターゲット核酸の両方を、このような状態で増幅するとき、低コピーターゲット核酸の増幅は、しばしば阻害される。これは、増幅の後期のサイクル中の高コピーターゲット核酸による酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の増幅の飽和に起因する。低コピーターゲット核酸の存在に対する偽陰性の(false negative)結果は、おそらく深刻な結論となるであろう。
そのような共増幅反応が、定量的ＰＣＲのように、核酸分子の定量的測定のために行われる場合、同様の問題が生じる。定量的ＰＣＲおよび定量的逆転写ポリメラーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、生物学的試料中の特異的ＤＮＡまたはＲＮＡの量を決定するために使用される。その方法は、低処理量のゲルに基づく分析から、ゲル上の反応生成物の分離を必要としない（‘閉鎖管(closed tube)’フォーマット）、蛍光技術の使用へと発展した。ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡまたはｃＤＮＡの量は、その後、蛍光シグナルの増加に比例する。次いで、ＰＣＲ（リアルタイムまたはオンラインＰＣＲ）の各サイクルでの、またはＰＣＲ（終点検出）後の蛍光の分析によって、開始(starting)ＤＮＡの量が決定される。ほとんどの場合蛍光標識された配列特異的プローブを含むこれら蛍光技術は、ポストＰＣＲを必要としないので、迅速であり、そして、安価で行うことができる。これらの方法は、その後のアッセイを妨害し得るＰＣＲアンプリコン分子による実験の汚染も低減する。定量的ＰＣＲおよび定量的リアルタイムＰＣＲの背景は、フリーマン(Freeman), W.M.ら、1999、バイオテクニクス(Biotechniques)、26、112-125（非特許文献２）、および、ブスチン(Bustin), S.A.、2000、 J. Mol. Endocrinol.、25、169-193（非特許文献３）に記載されている。ほとんどの方法は、蛍光体(fluorophore)および消光体(quencher)の一部によって標識されたオリゴヌクレオチドの使用に基づいている。２つの部分が１００Å未満に分離されると、消光体は、蛍光共鳴エネルギー遷移（fluorescence resonance energy transfer；FRET）によって蛍光体の蛍光を減少させる（クレッグ(Clegg), R.M.、 1992、Methods Enzymol.、211、353-388（非特許文献４））。ＰＣＲ中、蛍光体と消光体は、蛍光の増加を引き起こす間隔で分離される。それが、分子ビーコン(beacons)またはスコーピオン(scorpion)プライマーによって生じるとともに、ターゲットＤＮＡへアニールする場合、５’−３’エキソヌクレアーゼアッセイとも呼ばれるオリゴヌクレオチドの開裂によって、または、オリゴヌクレオチドプローブの二次構造の変化によって、分離が起こる（近年、完成はしていないが、最近のプローブ技術に概説されている；ディデンコ(Didenko), V.D.、2001、バイオテクニクス(Biotechniques)、31、 1106-1121（非特許文献５）参照）。可変部遺伝子(variable gene)の量を検出するため、更に、比較的定常的であり、可変部遺伝子の定量のための参照として使用される遺伝子の検出のために、１つのプライマー／プローブセットを使用することができるため、２組の別々に標識された遺伝子特異的プローブによる定量的、リアルタイム、複合ＰＣＲは、有用である。低コピーターゲット核酸および高コピーターゲット核酸の両方を、１つの反応で増幅する場合、増幅の後期のサイクル中、高コピーターゲット核酸による増幅酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の飽和により、低コピーターゲット核酸の増幅が、高コピーターゲット核酸の増幅によって妨害されることがある。よって、そのようなアッセイの結果、定量は失敗するか、または不正確になり、異なる核酸試料間の比較を困難にする。これは、治療を受けている患者の血液中のウイルス量(viral load)の間違った評価のように、実験的または臨床的結果の解釈に劇的に影響を与え得る。
しかし、共増幅反応は、定量的ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲのように、増幅されるべき核酸が、様々なコピー数で存在しているという、反応に関する問題がない。反応パラメーターを限定するための様々な増幅生成物の競争によって、核酸試料に含まれる核酸分子の同時増幅が弱められることがある。そのような増幅は、例えば、短縦列反復配列（short tandem repeats；ＳＴＲｓ）、可変性縦列重複配列数（variable number tandem repeats；ＶＮＴＲｓ）、または一塩基変異多型（single nucleotide polymorphisms；ＳＮＰｓ）のような、遺伝的可変性を決定するための遺伝的マーカーの共増幅を含む。これらの遺伝的可変性の決定は、ドラッグデリバリー、薬理学、患者管理、集団遺伝学、例えば父系テスト（paternity testing）のためのゲノタイピング(genotyping)、科学捜査、病理学、および増殖分析(breeding analysis)のような、研究および診断用途に、ますます使用されている。
プライマーの濃度の調整、異なる量のポリメラーゼの使用、特殊化された反応緩衝液の調製、もしくは特異的な融点（Ｔm’ｓ）を有するプライマーセットの使用、またはこれらの組み合わせ、を含む、この問題に対する様々な解決法が、ＰＣＲについて提案されている。プライマー比の調整は、当分野では、プライマーによって、ＰＣＲ収率をバイアスすること、として知られており、高コピーターゲット核酸または優先的に増幅される核酸分子の濃度を減少させる必要がある。このアプローチによって、工程はすこしだけ制御される。
共増幅に対する別のアプローチは、高コピーターゲット核酸または優先的に増幅された核酸のためのプライマーが、低コピーターゲット核酸または非効率的に増幅された核酸のためのプライマーよりも少ない量でアニールするように、ＰＣＲにおけるアニーリングの温度を調整することである。このアプローチも、問題を有する。ＰＣＲが良好に調節されることにより、高コピー核酸および低コピー核酸の収率の違いが現れ得る前に、プライマー対の間のＴmの違いが比較的大きくなってしまう。Ｔm’ｓは、（概算することはできるが）、正確に算出することができないので、測定しなければならない。これは、多大な努力を必要とし、そして、かなり退屈である。
または、全サイクルにおけるＰＣＲでのプライミング(priming)または伸長段階の時間を増やすことにより、高コピーターゲット核酸またはより効率的に増幅された核酸によるＤＮＡポリメラーゼの飽和を最少化し、増幅効率を向上させることができる。しかし、この解決法は、様々な濃度で存在する多くの核酸が、同時に増幅される場合か、または、増幅生成物のサイズが大幅に異なる場合に、利用が制限される。
デキストランサルフェートやポリエチレングリコールのような体積排除剤(volume exclusion agents)の存在下では、体積排除剤によって占められた溶液の体積から、核酸が排除されることにより、核酸のハイブリダイゼーション速度が大幅に向上することが知られている（サンブロック(Sambrook)ら、"モレキュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)"、9.50ページ、1989（非特許文献６）、および米国特許第5,106,730号明細書(ファン・ネス(Van Ness)ら)（特許文献７））。この排除効果は、溶液中での核酸の有効濃度を増加させ、それにより、ハイブリダイゼーション速度が向上する。よって、そのような材料は、好ましくない反応を先に“進める”ために、反応混合物へ決まって添加される。例えば、それらは、リガーゼ反応を“進める”ために、反応混合物へ添加される（米国特許第5,185,243号明細書 (ウルマン(Ullman)ら)（特許文献８）および米国特許第5,194,370号明細書(ベーニンガー(Berninger)ら)（特許文献９））。
前述および後述のすべての特許、特許出願、および刊行物は、ここで開示として援用される。
米国特許第4,683,202号明細書
米国特許第 4,683,195号明細書
米国特許第4,965,188号明細書
米国特許第5,411,876号明細書
米国特許第5,773,258 号明細書
米国特許第6,183,998号明細書
米国特許第5,106,730号明細書
米国特許第5,185,243号明細書
米国特許第5,194,370号明細書
チョウ(Chou)ら、1992、核酸研究（Nucleic Acids Research） 20(7):1717-1723
フリーマン(Freeman), W.M.ら、1999、バイオテクニクス(Biotechniques)、26、112-125
ブスチン(Bustin), S.A.、2000、 J. Mol. Endocrinol.、25、169-193
クレッグ(Clegg), R.M.、 1992、Methods Enzymol.、211、353-388
ディデンコ(Didenko), V.D.、2001、バイオテクニクス(Biotechniques)、31、 1106-1121
サンブロック(Sambrook)ら、"モレキュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)"、9.50ページ、1989
上記のように、複合ＰＣＲ反応では、鋳型核酸へ非特異的に結合し得る多くの異なるプライマーが存在する。これは、ＰＣＲ反応物が、典型的には、プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを保証する温度よりはるかに低温である室温で会合することによるものである。そのようなプライマーの非特異的伸長は、アッセイの効率および感度を低下させる。なぜなら、非特異的に結合および伸長したプライマーによって引き起こされる、望ましくない反応が、反応の効率を劇的に低下させるからである。
また、反応中に多くの異なるプライマーが存在することにより、これらプライマーの少なくともいくつかが、更にお互いに相互作用する確率が高くなる。典型的には、そのような相互作用の生成物は、プライマー二量体と呼ばれる。プライマー二量体の存在は、反応の効率を劇的に低下させる。
多数のターゲットの効率的な共増幅（複合ＰＣＲ）は、すべての反応を同時に起こすことができる反応条件が選択され、かつ、すべての反応がお互いに最小限のみ影響を与え合う場合にだけ可能である。これは、各反応のプラトー相(plateau phase)が限定される場合にのみ可能である。ＰＣＲプラトーの高さの限定は、ＰＣＲプライマーの濃度を限定することによって達成され得る。しかし、プライマーの濃度の限定は、ＰＣＲアッセイの感度の低下を引き起こし得る。
上記の効果のいくつかは、上記のＰＣＲホットスタート技術の使用によって排除され得る。しかし、すべてのプライマーを等モル濃度で使用する共増幅反応（複合反応）において、いくつかの増幅生成物の収率が、他のものよりもはるかに低いことが、しばしば観察される。いくつかの増幅生成物は、ターゲットＤＮＡ配列の多数のコピーが反応内に存在する場合であっても、まったく検出され得ない。低濃度のプライマーが使用される場合、このことは一層顕著であり得て、お互いへの反応の影響を最小化することが求められる。生成物収率の大きな違いは、それらの対応するターゲット配列へのプライマーのハイブリダイゼーションおよびそのようなアニールされたプライマーの伸長の違いによるものである。生成物収率において、そのような違いが観察されると、研究者は、典型的には、同等の生成物収率が得られるように、プライマー濃度を適合させる必要がある。プライマーの最適モル比を確立することは、典型的には非常に困難である。
ＰＣＲの各サイクルにおけるプライマーのハイブリダイゼーションは、各ＰＣＲサイクルにおいて、アニーリング段階を劇的に延長することによって向上され得る。これは、複合ＰＣＲアッセイの全時間を劇的に長くし、利便性を低下させるので、望ましくなく、ほとんどの場合、受け入れられない。
従って、上記の問題を克服するように、１つ以上の他のターゲット核酸の存在下で共増幅する場合、１つ以上のターゲット核酸の迅速かつ効率的な増幅を達成することが望ましい。
上記の問題は、複合ＰＣＲ反応の効率を大幅に高める方法によって克服される。本発明は、複合ＰＣＲ反応の効率を高めるための方法および試薬を提供する。複合PCR増幅のためのそのような効率的な条件は、PCR反応中に、体積排除剤と組み合わせて、ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼを使用することを含んでいた。複合ＰＣＲへのプラスの効果は、一方では、プライマーの望ましくない非特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長またはプライマー二量体の形成を最少化することによって、ＰＣＲ効率を最大化する、ホット−スタート酵素の使用によるものである。他方で、体積排除剤の存在は、反応中のすべてのプライマーのハイブリダイゼーション速度を高める。反応中の体積排除剤の存在により、体積排除剤なしで、複合ＰＣＲ条件下（限定されたプライマー濃度）ではわずかな増幅しか示さないターゲットの生成物収率が大幅に増加する。
驚くべきことに、すべてのプライマーを等モル濃度で使用しても、複合ＰＣＲを行うことができることがわかった。本発明によれば、体積排除剤をホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いることにより、わずかな増幅しか示さないターゲットからの生成物収率を、許容できるレベルに増加させることができる。
記載した効果は、ホット−スタートポリメラーゼと体積排除剤の両方を組み合わせることによってのみ得ることができる。
従来技術は、共増幅反応における体積排除剤の使用のプラスの効果は、ターゲット核酸間でコピー数の大きな違い（米国特許第5,705,366号明細書に記載されているような約１０００倍の違い）が観察される、特定のハイブリダイゼーション条件に限定されると示唆していたので、観察された効果は、驚くべきものであった。しかし、驚くべきことに、ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと組み合わせた体積排除剤のＰＣＲ増強効果は、ターゲットが比較され得るコピー数（１０倍以下の違い）で存在する場合にも観察される。
図面の説明
図１および２は、８個の部分を有する(8-plex)ＰＣＲ生成物のアガロースゲル分析からのデータを示す。レーンは、左から右へ番号を付した。サイズ標準（１００ｂｐラダー、インビトロゲン(Invitrogen)）を、Ｍと付したレーンに載せた。
図１および２は、８個の部分を有する(8-plex)ＰＣＲ生成物のアガロースゲル分析からのデータを示す。レーンは、左から右へ番号を付した。サイズ標準（１００ｂｐラダー、インビトロゲン(Invitrogen)）を、Ｍと付したレーンに載せた。
ゲル写真は、ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ(HotStarTaq、キアゲン(Qiagen))を用いて行われた複製反応からのレーン１−８におけるデータ、および、ホット−スタートなしで標準的な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ、キアゲン(Qiagen))を用いて行われた反応のレーン９−１６におけるデータの両方を示す。
図１では、平均分子量３５０００〜４５０００ダルトンのデキストランなしで（レーン１＋２およびレーン９＋１０、０質量%デキストラン）、または、デキストランの濃度を増加させながら（レーン３＋４、１１＋１２：１質量%デキストラン、レーン５＋６、１３＋１４：３質量%デキストラン、レーン７＋８、１５＋１６：６質量%デキストラン）、反応を行った。
図２では、ＰＥＧ−８０００なしで（レーン１＋２およびレーン９＋１０、０質量% ＰＥＧ８０００）、または、ＰＥＧ８０００の濃度を増加させながら（レーン３＋４、１１＋１２：１質量% ＰＥＧ−８０００、レーン５＋６、１３＋１４：３質量% ＰＥＧ８０００、レーン７＋８、１５＋１６：６質量% ＰＥＧ８０００）、反応を行った。
写真の左側の矢印は、体積排除剤の存在下で反応が行われた場合、強度の大幅な増加を示す、ＰＣＲ生成物を示す。
比較のため、実施例１のアガロースゲル写真の写真濃度計分析のデータを、表２にまとめる。実施例２について示されたアガロースゲル写真からのデータを、表３に示す。
ポリメラーゼチェーン反応を使用する核酸の増幅および検出のための一般的な原理および条件は、きわめてよく知られており、その詳細は、US-A-4,683,195、 US-A-4,683,202およびUS-A-4,965,188（上記）（これらすべての内容は、本明細書に開示として援用される）を含む、多くの参考文献に記載されている。よって、従来技術の教示および本明細書に記載の特別な教示を考慮して、２つ以上の核酸（そのうちの１つは、好ましくは低コピーターゲット核酸であるか、または優先的に増幅される）を共増幅するために、本明細書で教示された調整を行うことにより、当業者であれば、何の困難もなく、本発明を実施することができるはずである。
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語を以下に定義する。
本明細書で使用される“隣接(adjacent)”という語は、鋳型核酸の相補鎖におけるプローブに対するプライマーの位置(positioning)を意味する。プライマーおよびプローブは、１〜約２０ヌクレオチドに、より好ましくは、約１〜１０ヌクレオチドに分離されることができ、または、重合に依存しない方法による検出に望ましいように、お互いに直接隣接することもできる。または、重合に依存する方法における使用のために、本方法が、本明細書で教示するようにＰＣＲ増幅および検出法において使用される場合、プライマー伸長が、プローブの開裂が起こるようにポリメラーゼの位置を定めるように、“隣接(adjacency)”は、増幅されるべき配列内のどこでも、プライマーの下流のどこでもあり得る。
本明細書で使用される“隣接(adjacent)”という語は、鋳型核酸の相補鎖におけるプローブに対するプライマーの位置(positioning)を意味する。プライマーおよびプローブは、１〜約２０ヌクレオチドに、より好ましくは、約１〜１０ヌクレオチドに分離されることができ、または、重合に依存しない方法による検出に望ましいように、お互いに直接隣接することもできる。または、重合に依存する方法における使用のために、本方法が、本明細書で教示するようにＰＣＲ増幅および検出法において使用される場合、プライマー伸長が、プローブの開裂が起こるようにポリメラーゼの位置を定めるように、“隣接(adjacency)”は、増幅されるべき配列内のどこでも、プライマーの下流のどこでもあり得る。
本明細書で使用される“ハイブリダイゼーション”または“アニーリング”という語は、相補的な塩基対による２つの一本鎖核酸による複製構造の形成を意味する。
ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸鎖の間で、または小さなミスマッチ領域を含む核酸鎖の間で起こり得る。核酸複製の安定性は、融点、または“Tm”によって測定される。Tmは、５０％の塩基対が解離する温度（所定のイオン強度およびｐH下で）である。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の発生率を含む、多くの可変性(variables)を経験的に考慮して、複製安定性を決定することができる。
ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸鎖の間で、または小さなミスマッチ領域を含む核酸鎖の間で起こり得る。核酸複製の安定性は、融点、または“Tm”によって測定される。Tmは、５０％の塩基対が解離する温度（所定のイオン強度およびｐH下で）である。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の発生率を含む、多くの可変性(variables)を経験的に考慮して、複製安定性を決定することができる。
完全に相補的な核酸鎖がハイブリダイズする条件を、“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”、または、“ストリンジェントなアニーリング条件”という。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当分野で周知である（例えば、サンブロック(Sambrook)ら、1985、モレキュラー・クローニング−ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク、を参照）。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおいて、特異的な配列に関するＴmより約５℃低くなるように選択される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７で少なくとも約０．２モル濃度であり、かつ、温度が少なくとも約６０℃である条件であろう。ハイブリダイゼーション条件の厳しさ(stringeny)を緩和することにより、配列ミスマッチが許容され得るであろう；許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適当な調整によって制御され得る。
本明細書で使用する“標識”という語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルをもたらすために使用することができ、かつ、核酸または蛋白質に付着することができる何らかの原子または分子を意味する。標識は、蛍光、放射能、比色計、重量測定、Ｘ線回折または吸収、質量分析、磁気、酵素活性等、によって検出可能なシグナルをもたらし得る。
本明細書で定義される“融点”という語は、プライマーの半分が、相補的な鎖（例えば鋳型）から変性される温度を意味する。いくつかの標準的な工程を用いて、紫外線ハイポクロミズム（hypochromism）に基づいて、例えば、バイオケミストリー(Biochemistry)−細胞構造および機能の分子基礎（The Molecular Basis of Cell Structure and Function）、第２版、レーニンガー、ワース・パブリッシャー社(Lehninger, Worth Publishers, Inc.)、1970, pp. 876-7、に記載の２６０ｎｍでのスペクトルの観察によって、融点の決定が行われ得る。様々な融点決定法から、同じＤＮＡ分子についてわずかに異なる値が得られ得るが、それらの値は、約２または３℃より大きくは異ならないはずである。更に、融点を決定するための所定の方法では、ＴmＬとＴmＨとの間の違いは、変わらないはずである。
本明細書で規定する、“５’−＞３’ヌクレアーゼ活性”または“５’−３’(5’ to 3’)ヌクレアーゼ活性”は、それによりヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端から連続的に取り除かれる、いくつかのＤＮＡポリメラーゼと伝統的に関連する５’−＞３’エキソヌクレアーゼ（即ち、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、この活性を有するのに対し、クレノウ(Klenow)フラグメントは有さない）、または、開裂により、５’末端からホスホジエステル結合（ヌクレオチド）が１つより多く生じる５’−＞３’エンドヌクレアーゼ活性、またはその両方を含む、鋳型特異的核酸ポリメラーゼの活性を意味する。
本明細書で使用する“核酸”および“オリゴヌクレオチド”という語は、検出されるべきプライマー、プローブ、およびオリゴマーフラグメントを意味し、かつ、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシーＤ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、および、プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるか、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基である、何らかの他のタイプのポリヌクレオチドの総称とするものとする。“核酸”および“オリゴヌクレオチド”とは、長さによって区別されるものではなく、これらの語は、互換性をもって使用されるであろう。これらの語は、分子の第一構造のみを意味する。よって、これらの語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに、二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。
“配列特異的プローブ”という語は、オリゴヌクレオチドに付着する蛍光体分子および消光体分子を含むプローブを意味する。本明細書で使用する、“消光(quenching)”または“蛍光エネルギー遷移”という語は、それにより、蛍光体分子および消光体分子が隣接する場合、蛍光体分子が励起する度に、励起状態のエネルギーの多くの部分が、消光体へ非発光的に(nonradiatively)遷移し、そこで、非発光的に消滅するか、または、蛍光体とは異なる発光波長で発光する工程を意味する。消光の効率が、蛍光体と消光体との近接度と強く相関することがよく知られている。即ち、２つの分子が近接するほど、消光効率は上昇する。消光が、レポーター分子と消光体分子との物理的近接度に強く依存する場合、消光体分子とレポーター分子が、お互いの少数のヌクレオチド内で、通常、約６−１６ヌクレオチドの分離によって、プローブと付着しているはずであると考えられていた。例えば、リー(Lee)ら、核酸研究(Nucleic Acids Research)、21: 3761-3766 (1993); メーグニー(Mergny)ら、核酸研究（Nucleic Acids Research）、22: 920-928 (1994); カルデュロ(Cardullo)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、 85: 8790-8794 (1988); クレッグ(Clegg)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、90: 2994-2998 (1993); オザキ(Ozaki)ら、核酸研究(Nucleic Acids Research)、20: 5205-5214 (1992);等。典型的には、この分離は、レポーター−消光体対の１つの部分がプローブの５’末端に付着し、他の部分が、６−１６ヌクレオチド離れた塩基に付着することによって達成される。
モノヌクレオチドが反応し、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’ホスフェートが、ホスホジエステル結合を介して、一方向で、その近くの３’酸素に付着するようにオリゴヌクレオチドを形成するので、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’ホスフェートが、モノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合しない場合、“５’末端”と呼ばれ、その３’酸素が、次のモノヌクレオチドペントース環の５’ホスフェートに結合しない場合、“３’末端”と呼ばれる。
オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、多くの因子および決定的な関数(ultimate function)またはオリゴヌクレオチドの用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、何らかの適当な方法によって調製され得る。そのような方法としては、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限、ならびに、ナラン(Narang)ら、1979、Meth. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル法; ブラウン(Brown)ら、1979、Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法;ベウケージ(Beaucage)ら、1981、Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホラミド(diethylphosphoramidite)法;および米国特許第4,458,066号のような方法による直接化学合成を挙げることができる。合成法の概説は、グッドチャイルド(Goodchild)、1990、バイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjugate Chemistry) 1(3):165-187に記載されている。
小さなミスマッチ領域を除いて相補的な２つの一本鎖核酸を、“実質的に相補的”と呼ぶ。実質的に相補的な配列の適当な複製は、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で達成され得る。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度、ミスマッチ塩基対の発生率、を含む多くの可変性を経験的に考慮して、複製安定性を決定することができる。
“ＰＣＲ試薬”という語は、ＰＣＲにおいて一般的に使用される何らかの試薬、即ち、各ターゲット核酸の対向する鎖に対する一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ共同因子(cofactor)、および２つ以上のデオキシリボヌクレオシドー５’−トリホスフェート（ｄＮＴＰ’ｓ）を意味する。
本明細書に記載のＰＣＲ試薬は、ターゲット核酸の増幅をもたらすために提供され、ＰＣＲにおいて適当な濃度で使用される。ＤＮＡポリメラーゼの最少量は、一般的に、溶液１００μｌ当たり少なくとも１単位であり、１００μｌ当たり約４〜約２５単位であることが好ましい。本明細書において、“単位”とは、１０ナノモルの全ヌクレオチド（ｄＮＴＰ’ｓ）を、７４℃、３０分で、伸長(extending)核酸鎖へ取り込むために必要とされる酵素活性の量と定義する。各プライマーの濃度は、少なくとも約０．０２５μモル濃度〜約１μモル濃度未満であり、約０．０５〜約０．２μモル濃度であることが好ましい。すべてのプライマーは、ほぼ同じ量で（各１０％以内の変動）存在する。共同因子は、一般的に、約１〜約１５ミリモル濃度の量で存在し、各ｄNTPは、一般的に、反応混合物中で約０．１５〜約３．５ミリモル濃度で存在する。体積排除剤は、少なくとも１質量パーセント、好ましくは約１〜約２０質量％の範囲の量で存在する。材料の量を規定する際に使用される“約”という語は、示した量の＋／−１０％の変動を意味する。
ＰＣＲ試薬は、個々に、または、何らかの適当な緩衝液を使用して、約７〜約９の範囲のｐＨを有する緩衝溶液と混合して、供給され得る。よって、ＰＣＲのための反応混合物は、低コピーターゲット核酸のような各ターゲット核酸のための一組のプライマー、各高コピーターゲット核酸のための一組のプライマー、任意の配列特異的プローブ、適当なｄＮＴＰ’ｓ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼのための共同因子、１つ以上の体積排除剤、および、ターゲット核酸の増幅または最終的な(eventual)検出に有用であると、当業者が考えるであろう何らかの他の付加物、を含み得る。
“プライマー”という語は、核酸鎖と相補的なプライマー伸長生成物の合成を引き起こす条件下で、即ち、適当な温度において、適当な緩衝液中で、４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび重合のための試薬（即ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。“ペプチド核酸”のようなオリゴヌクレオチドアナログは、プライマーとして作用することができ、本明細書で使用される“プライマー”の意味に含まれる。プライマーは、好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適当な長さは、目的とするプライマーの用途に依存するが、典型的には、６〜５０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、鋳型とともに十分安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般的に、より低温を要する。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分なほど相補的でなければならない。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として作用する、プライマーの基本的な性質は変えずに、プライマーの検出または固定を可能にする、更なる性質を有することができる。例えば、増幅された配列のクローニングに有用な制限酵素開裂部位をもたらすために、非相補的配列を、プライマーの末端に置くことができる。
“反応混合物”という語は、所定の反応を行うために必要な試薬を含む溶液を意味する。本明細書で使用される、増幅反応を行うために必要な試薬を含む溶液を意味する“増幅反応混合物”は、ターゲット核酸を増幅するために使用される様々な増幅試薬を含む水溶液を意味する。それら試薬は、プライマー、酵素、水性緩衝液、塩、ターゲット核酸、およびデオキシヌクレオシドトリホスフェート（従来型および非従来型の両方）を含む。状況に応じて、混合物は、完全または不完全反応混合物のいずれかであり得る。“ＰＣＲ反応混合物”は、典型的には、適当な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ’ｓ、および二価金属カチオンを含む。
反応混合物は、反応を可能にするのに必要なすべての試薬を含む場合、完全と呼ばれ、必要な試薬の一部(subset)しか含まない場合、不完全と呼ばれる。利便性、保存安定性のため、および、用途に応じて成分の濃度を個別に調製することを可能にするために、全成分の一部を含む反応成分を、慣例的に別々の溶液として保存し、更に、完全な反応混合物を調製するために、反応前に反応成分を混合することが、当業者に理解されるであろう。
本発明による典型的なＰＣＲ反応混合物は、ターゲット核酸のための一組以上のプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（上記）、複数のｄＮＴＰ’ｓ（例えば通常の４つのｄＮＴＰ’ｓ）、および１つ以上の水溶性または水膨潤性の非イオン性重合体体積排除剤、を最低限含む。
本明細書で使用する“プローブ”という語は、プローブ中の少なくとも１つの配列とターゲット領域中の配列との相補性により、ターゲット核酸中の配列と二重らせん構造(duplex structure)を形成する、標識されたオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ポリメラーゼチェーン反応を開始するために使用される配列（類）と相補的な配列を含まないことが好ましい。一般に、プローブの３’末端は、プローブがプライマー伸長生成物内に取り込まれることを妨げるために、“ブロックされる(blocked)”であろう。“ブロッキング(blocking)”は、非相補的な塩基を使用することによって、または、選択された部分によって、その後の検出のためのラベルとして、もしくは、標識に付着した核酸の捕獲部(capture)としても作用することにより、２つの(dual)目的に役立ち得る、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルへ、ビオチンまたはホスフェート基のような化学的な部分を加えることによって行われ得る。ブロッキングは、３’−ＯＨを取り除くことによって、または、ジデオキシヌクレオチドのような、３’−ＯＨを持たないヌクレオチドを使用することによっても行われ得る。
本明細書で使用する“プローブ”という語は、プローブ中の少なくとも１つの配列とターゲット領域中の配列との相補性により、ターゲット核酸中の配列と二重らせん構造(duplex structure)を形成する、標識されたオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ポリメラーゼチェーン反応を開始するために使用される配列（類）と相補的な配列を含まないことが好ましい。一般に、プローブの３’末端は、プローブがプライマー伸長生成物内に取り込まれることを妨げるために、“ブロックされる(blocked)”であろう。“ブロッキング(blocking)”は、非相補的な塩基を使用することによって、または、選択された部分によって、その後の検出のためのラベルとして、もしくは、標識に付着した核酸の捕獲部(capture)としても作用することにより、２つの(dual)目的に役立ち得る、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルへ、ビオチンまたはホスフェート基のような化学的な部分を加えることによって行われ得る。ブロッキングは、３’−ＯＨを取り除くことによって、または、ジデオキシヌクレオチドのような、３’−ＯＨを持たないヌクレオチドを使用することによっても行われ得る。
本明細書において使用される“ターゲット配列”および“ターゲット核酸配列”という語は、増幅および／または検出されるべきオリゴヌクレオチドの領域を意味する。ターゲット配列は、増幅のために使用される２つのプライマー配列の間にある。
“ターゲット核酸”は、プラスミドを含む様々な供給源から得られ得る核酸、および、何らかの供給源（例えば、バクテリア、酵母、ウイルス、植物、高等動物もしくはヒト）からの天然由来の(naturally occurring)ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。それは、血液、末梢血単核細胞（PBMC）、他の組織材料または当分野で既知の他の供給源を含む様々な組織から、既知の工程を用いて抽出され得る。ゲノムＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、プロウイルスＤＮＡ、菌性ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または、バクテリアもしくはウイルスに感染した細胞、動物細胞、植物細胞、もしくはヒト細胞において見出されるＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見出される核酸配列の共増幅および検出に、本発明は特に有用である。
ローレ(Laure)ら、The Lancet, pp. 538-540 (1988年9月3日)、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)：ラボラトリー・マニュアル(A Laboratorv Manual)、pp. 280-281 (1982)、グロス−ベランド(Gross-Belland)ら、Eur. J. Biochem.、36、32 (1973)、およびUS-A-4,965,188(上記)に記載のものを含む、様々な工程が、当分野で知られている。全血またはその成分からのＤＮＡの抽出は、例えば、EP-A-0 393 744、ベル(Bell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78(9)、pp. 5759-5763 (1981)、サイキ(Saiki)ら、バイオ／テクノロジー(Bio/Technology)、3、pp. 1008-1012 (1985)、およびUS-A-5,231,015(クミンス(Cummins)ら)に記載されている。特別な抽出工程は、本発明の実施に必須ではない。
増幅および検出されるべきターゲット核酸は、通常、二本鎖型なので、プライミングが行われ得る前に、二本鎖を分離（即ち、変性）しなければならない。これは、抽出工程中に行うことができるが、好ましくは、その後の分離段階で行う。適当な温度（“第一温度”という）への加熱は、変性のための好ましい手段である。一般に、適当な時間、例えば、１秒〜約２４０秒（好ましくは１秒〜約４０秒）の間、この第一温度は、約８５〜約１００℃の間である。この初期変性段階はまた、第一増幅サイクルに含まれ得る。そのような場合、変性は、第一サイクルにおいてより長く行われ得るのに対し（例えば、２４０秒まで）、その後のサイクルでは、かなり短い変性段階を行い得る（例えば、３０秒まで）。
“熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ”という語は、熱に対して比較的安定であり、かつ、ターゲット配列の核酸鎖の１つと相補的なプライマー伸長生成物を形成するために、ヌクレオシドトリホスフェートの重合に触媒作用を及ぼす酵素を意味する。その酵素は、プライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終了するまで、鋳型の５’末端に向かう方向に進行する。精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス(Thermus)属、ピロコッカス(Pyrococcus)属、サーモコッカス(Thermococcus)属、およびサーモトガ(Thermotoga)属、好ましくは、テルムス・アクアチクス(Thermus aquaticus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ピロコッカス・ウォエセイ(Pyrococcus woesei)、ピロコッカス(Pyrococcus) spec. (KOD1株)、ピロコッカス(Pyrococcus) spec. GB-D、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus Litoralis)、サーモコッカス(Thermococcus) sp. 9.度(degree). N-7、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritime)、ピロコッカス(Pyrococcus) spec. ES4 (エンデアボリ(endeavori))、ピロコッカス(Pyrococcus) spec. OT3 (ホリコシイ(horikoshii))、ピロコッカス・プロフンダス(Pyrococcus profundus)、サーモコッカス・ステッテリ(Thermococcus stetteri)、サーモコッカス(Thermococcus) spec. AN1 (ジリジイ(zilligii))、サーモコッカス・ペプトノフィルス(Thermococcus peptonophilus)、サーモコッカス・セレー(Thermococus celer)、および、サーモコッカス・フミコランス(Thermococcus fumicolans)、から選択され得る。“熱安定性酵素”という語は、熱に対して比較的安定な酵素を意味する。熱安定性酵素は、活性の不可逆的損失を受けることなく、典型的には５０℃より高温の、変更遺伝子群(modifier groups)を除去するために使用される高温インキュベーションに耐え得る。本発明の方法において使用可能な、改質された(modified)熱安定性酵素には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性リガーゼが含まれる。
“被検物(test specimen)”という語は、検出され得るゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む、細胞もしくはウイルス材料、髪、体液、または他の材料を意味する。
本明細書において使用される“上流”および“下流”という語は、ターゲット配列に沿ったプライマー結合部位の位置を意味する。上流プライマーは、ターゲット配列の非コード鎖とハイブリダイズし、それにより、ターゲット配列のコード鎖に続く増幅された配列の５’末端を形成する。同様に、下流プライマーは、ターゲット配列のコード鎖とハイブリダイズし、それにより、ターゲット配列の非コード鎖に続く増幅された配列の３’末端を形成する。
本明細書で定義される“体積排除剤”という語は、１つ以上の水溶性または水膨潤性の非イオン性重合体体積排除剤を意味する。
体積排除剤が重合体であるということは、それらが、典型的には複数の繰り返し単位を含むことを意味し、それらは、一般的に、約１０００〜約２，０００，０００ダルトンの平均分子量、好ましくは、約３０００〜約５００，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明を実施する際に体積排除剤として使用され得る、有用な種類の材料は、それらに限定されないが、ポリエーテル、単糖（例えばデキストロースまたはグルコース）とエピクロロヒドリンとの反応生成物、多糖類、ポリアクリレート、および当業者に容易に理解される類似の材料を含む。
本発明によれば、ポリエーテルが好ましい。それらは、一般に、以下の式によって表され得る。
式中、Ｒは、分岐または未分岐の、１〜６個の炭素原子の二価アルキレン架橋であり、ｎは、１５〜１０００の整数（重量平均に基づく）である。例えば、Ｒは、１，２−エチレン、１，３−プロピレン、１，２−プロピレン、２−ヒドロキシ−１，３−プロピレン、３−ヒドロキシ−１，２−プロピレン、１，４−ブチレン、１，３−ブチレン、１，２−へキシレン、および当業者に容易に理解されるであろう他の二価アルキレン基であり得る。好ましくは、Ｒは、ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（プロピレンオキシド）におけるように、１，２−エチレンまたは１，２−プロピレンであり、それらは、通常、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）としてそれぞれ知られている。
上記式中、整数“ｎ”は、単量体単位分子量で割った、化合物の重量平均分子量を表す。前記段落に記載の好ましい化合物の場合、平均分子量は、少なくとも約１０００であり、好ましくは少なくとも約３０００であり、そして、一般的には約２０，０００までである。当業者は、所定の化合物について、単位の適当な“ｎ”数および化合物の重量を、容易に決定することができる。一般に、ｎは、１５〜１０００の整数である。分子量を規定する際に使用される“約”という語は、＋／−１０％の変動を意味する。
体積排除剤は、１質量％〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、もっとも好ましくは１〜８質量％の量で使用される。
最も好ましいものは、約８０００の平均分子量を有するポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ８０００）であり、１質量％〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の量で使用される。
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、または、他のアルキレンオキシド、または、ポリグリシドールを含む、ジオール、トリオール、糖類もしくは酸類のような様々な部分の縮合生成物も、ポリエーテルの定義に含まれる。そのような材料は、非イオン界面活性剤または洗浄剤として、当分野で周知であり、必要とされる水溶性または水膨潤性パラメーターをもたらすので、本発明に有用であり得る。
本発明による別の好ましい体積排除剤は、デキストランである。デキストランは、バクテリアの副産物である；デキストラン高分子は、末端同士で結合した(end-to-end linked)グルカン基からなる。デキストランの生合成は、様々なバクテリアにおいて、特に、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans), ロイコノストク・メセンテロイドズssp.メセンテロイドズ(Leuconostoc mesenteroides ssp. Mesenteroides)、および、ロイコノストク・メセンテロイドズssp.デキストラニクム(Leuconostoc mesenteroides ssp. Dextranicum)において行われてきた。分子の加水分解を制限して分画することよって、異なる分子量のものを得ることができる。例えば、天然の高分子量デキストラン（Mr 1.5 x 104 − 5 x 107、α−Ｄ−グルコースから得られる）は、メタノールまたはアセトンによって沈殿させることにより精製した後、酸性条件下、約１００℃の温度で加水分解され、４０，０００〜６０，０００の範囲の分子量の画分が得られ得る[レムペ(Roempp)、Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie、Georg Thieme Verlag、シュトゥットゥガルト(Stuttgart)、2000、およびそこで引用されている文献]。
本発明の実施に有用な非イオン性多糖類には、グリコーゲンおよび当業者に容易に理解される他のものが含まれる。
有用なポリアクリレートの例には、それらに限定されないが、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（２，３−ジヒドロキシプロピルアクリレート）、および当業者に容易に理解される他のものが含まれる。
本発明の増幅法は、反応混合物の温度が、所望の回数にわたって制御されて循環するように、連続的かつ自動的に行われることが好ましい。当業者が知っているように、多くの装置は、この目的のために開発された。好ましくは、使用される装置は、第一および第二増幅サイクルの両方のためにプログラム可能でもあるであろう。
この目的のためのそのような装置の１つについて、いくつかの詳細が、US-A-4,965,188およびEP-A-0 236,069に記載されている。一般に、この装置は、反応混合物を含む多くの反応管を保持するための熱伝導性容器、加熱、冷却、および温度維持のための手段、ならびに、増幅配列、温度およびタイミングの変化を制御するためのシグナルを発生するためのコンピューティング(computing)手段を含む。
EP-A-0 402 994には、US-A-5,089,233(デバネイ(Devaney), Jr.ら)に記載の装置を用いて処理され得る有用な化学的テストパックの詳細が記載されている。その内容は、本明細書に開示として援用される。そこには、本発明の方法に適した、繰り返し間隔で（即ち、サイクルを通して）テストパックを加熱冷却するための手段も記載されている。更に、有用なＰＣＲ処理装置に関する詳細が、当分野の多くの文献に記載されており、当業者に容易に理解されるであろう。
その方法は、上記の化学的テストパックのほかに、US-A-4,902,624(コロンブス(Columbus)ら)、US-A-5,173,260(ザンダー(Zander)ら)、およびUS-A-5,229,297(シュニペルスカイ(Schnipelsky)ら)（これらすべての内容は、本明細書に開示として援用される）に、より詳細に記載されているような他の容器および当業者に容易に理解される何らかの他の適当な容器において行うことができる。そのようなテストパックは、本発明の方法で使用される様々な試薬のための別々の区画を有する、内蔵型テスト装置としても知られている。それら区画は、試薬およびアッセイ溶液が、装置を開放することなく、適当なときに捕獲試薬(capture reagent)と接触し得るように、適当に接続されている。
増幅された生成物の検出は、US-A-4,965,188（上記）に記載されているようなサザンブロッティング技術を含む、何らかの既知の方法を用いて、または、当分野で既知の標識されたプローブもしくはプライマーを用いることによって行われ得る。
上記の態様に代えて、増幅された生成物は、プライマー伸長生成物の１つと相補的な標識されたオリゴヌクレオチドを用いて検出され得る。オリゴヌクレオチドに標識を付けるための工程は、周知である。有用な標識には、酵素、フェリチンおよび他の磁気粒子、開裂し得るマスタグ(masstags)、放射性同位体、化学発光試薬（例えばルミノール）、ビオチンならびに様々なフルオロゲン(fluorogens)およびクロモゲンが含まれる。有用な酵素標識には、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる。酵素のような様々な標識のための基質および色素供給試薬も既知である。
臭化エチジウムまたはSYBR Green（商標）のようなインターカレーティング(intercalating)蛍光色素を用いて、かつ、蛍光標識された配列特異的プローブまたは蛍光標識されたプライマーを用いて、蛍光によって、ＰＣＲ生成物を検出することが好ましい。
その方法で使用される各プライマーセットのプライマーの１つを、特異的結合部分(specific binding moiety)によって標識することも可能である。この部分は、様々なプライマーについて同じでも異なっていてもよく、この部分と特異的に反応する特異的結合レセプターを有する何らかの分子を含み得る。特異的結合対（一方は標識であり得る）の例には、それらに限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチン、糖／レクチン、抗体／ハプテン、抗体／抗原、および、当業者に容易に理解される他のものが含まれる。次いで、レセプター分子は、酵素、放射性同位体、およびオリゴヌクレオチドについて先に記載した他のもののような、適当な検出可能な標識部と結合する。
より好ましくは、各プライマーセットのプライマーの一方または両方は、ビオチン（またはその対応する誘導体）によって標識され、そして、増幅された生成物は、ストレプトアビジンとホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素との結合を用いて検出される。
しかし、蛍光色素を有するプライマーが最も好ましい。
しかし、蛍光色素を有するプライマーが最も好ましい。
本発明の不均一検出系において、増幅された生成物は、何らかの水不溶性基質上に捕獲され、そして、反応混合物中のその他の材料は、濾過、遠心分離、洗浄または他の分離技術等の適当な方法によって除去される。
捕獲プローブは、既知の付着技術（吸着および共有反応(covalent reactions)）を用いて、水不溶性支持体に付着し得る。そのような技術の１つは、EP-A-0 439 222（１９９１年９月１８日公開）に記載されている。他の技術は、例えば、US-A-4,713,326(ダッタグプタ(Dattagupta)ら)、US-A-4,914,210(レベンソン(Levenson)ら)、およびEP-B-0 070 687（１９８３年１月２６日公開）に記載されている。有用な分離手段には、パル社(Pall Corporation)から市販されているポリアミド微小孔膜のような膜による濾過が含まれる。
しかし、何らかの有用な固体支持体は、捕獲プローブおよび最終的なハイブリダイゼーション生成物を固定するために使用され得る。それらには、いくつか例を挙げると、マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、磁気粒子または重合体粒子、金属、セラミック、およびグラスウールが含まれる。特に有用な材料は、捕獲プローブと共有結合するのに有用な反応基を有する磁気粒子または重合体粒子である。そのような粒子は、一般に、約０．００１〜約１０μｍである。そのような材料の例についての更なる詳細は、US-A-4,997,772(スットン(Sutton)ら)、US-A-5,147,777(スットン(Sutton)ら)、US-A-5,155,166(ダニエルソン(Danielson)ら)、およびUS-A-4,795,698(オーエン(Owen)ら)（これらすべての内容は、本明細書に開示として援用される）に記載されている。
捕獲プローブは、重合体フィルム、膜、濾紙、または樹脂被覆紙もしくは未被覆紙のような平坦な支持体に固定され得る。重合体粒子に固定された捕獲プローブは、適当な方法で、例えば、乾燥させた沈殿物として、そのような平坦な支持体上に固定することもでき、または、加熱溶融により、もしくは接着剤によって、接着させることもできる。捕獲プローブは、例えば、本発明の内蔵型テスト装置において、平坦な支持体に固定され得る。そのような材料の他の詳細は、EP-A-0 408 738(１９９１年１月２３日公開)、WO 92/16659(１９９２年１０月１日公開)、およびUS-A-5,173,260(スットン(Sutton)ら)に記載されている。
捕獲プローブは、例えば、円形の沈殿物の列またはストライプ等の何らかの配置で、適当な支持体上に配列され得る。
本発明は、捕獲試薬を必要とすることなく、多数のターゲット核酸が同時に検出される、“均一”増幅法として知られている方法でも使用され得る。そのようなアッセイの詳細は、当分野で既知であり、例えば、EP-A-0 487 218(１９９２年５月２７日公開)およびEP-A-0 512 334(１９９２年１１月１日公開)に記載されている。
本発明の増幅反応組成物は、様々な増幅アッセイに有用なキットの１つの個別に包装された成分として含まれ得る。そのキットは、水不溶性基質上に固定された捕獲試薬、洗浄溶液、抽出溶液、検出試薬、および当業者に容易に理解される他の材料を含む、本発明の方法において有用な他の試薬、溶液、装置および器具を含み得る。
上記問題は、２つ以上のターゲット核酸の共増幅のための方法によって克服される。その方法は、少なくとも１５回の第一増幅サイクルを含み、それぞれの第一増幅サイクルは、米国特許第5,705, 366号（その内容は本明細書に開示として援用される）に記載されているように、以下の連続的な段階を含む：
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得る、修飾されていないか、または修飾されている（例えば、蛍光体部を有する）プライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、および、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤およびＤＮＡポリメラーゼを含む。
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得る、修飾されていないか、または修飾されている（例えば、蛍光体部を有する）プライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、および、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤およびＤＮＡポリメラーゼを含む。
本発明は、更に、２つ以上のターゲット核酸の共増幅および１つ以上のターゲット核酸の検出のための方法を提供する。その方法は、少なくとも１５回の第一増幅サイクルを含み、それぞれの第一増幅サイクルは、以下の連続的な段階を含む：
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得るプライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤およびＤＮＡポリメラーゼを含む、ならびに、
Ｄ）最後の第一増幅サイクル後の、１つ以上のターゲット核酸の表示(indication)としての１つ以上のプライマー伸長生成物の検出。
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得るプライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤およびＤＮＡポリメラーゼを含む、ならびに、
Ｄ）最後の第一増幅サイクル後の、１つ以上のターゲット核酸の表示(indication)としての１つ以上のプライマー伸長生成物の検出。
更に、約７．５〜約９のｐＨへ緩衝液で処理される増幅反応組成物は：
１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、および
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、
を含む。
１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、および
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、
を含む。
更に、本発明は、以下の連続的な段階を含む方法を提供する：
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得る、修飾されていないか、または修飾されている（例えば、蛍光体部を有する）プライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、ならびに、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、を含む。
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得る、修飾されていないか、または修飾されている（例えば、蛍光体部を有する）プライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、ならびに、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、を含む。
本発明は、更に、２つ以上のターゲット核酸の共増幅および１つ以上のターゲット核酸の検出のための方法を提供する。その方法は、少なくとも１５回の第一増幅サイクルを含み、それぞれの第一増幅サイクルは、以下の連続的な段階を含む：
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得るプライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、を含む、ならびに、
Ｄ）各増幅サイクルまたは最後の第一増幅サイクル後の増幅サイクルにおける反応中の、１つ以上のターゲット核酸の表示としての１つ以上のプライマー伸長生成物の検出。
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得るプライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、を含む、ならびに、
Ｄ）各増幅サイクルまたは最後の第一増幅サイクル後の増幅サイクルにおける反応中の、１つ以上のターゲット核酸の表示としての１つ以上のプライマー伸長生成物の検出。
更に、約７．５〜約９のｐＨへ緩衝液で処理される増幅反応組成物は：
１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、ならびに
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、
を含む。
１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、ならびに
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、
を含む。
本発明のキットは、
ａ）任意に１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、および、
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、
を含む、約７．５〜約９のｐＨへ緩衝液で処理された増幅反応組成物、
ｂ）水不溶性基質上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬、
を、個別に包装された状態で、または、それら成分の全部または一部を含む混合物として含む。
ａ）任意に１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、および、
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、
を含む、約７．５〜約９のｐＨへ緩衝液で処理された増幅反応組成物、
ｂ）水不溶性基質上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬、
を、個別に包装された状態で、または、それら成分の全部または一部を含む混合物として含む。
更に、内蔵型テスト装置は、
ａ）１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、および、
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、
を含む、約７．５〜約９のｐＨへ緩衝液で処理された増幅反応組成物、ならびに、
ｂ）水不溶性基質上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬、
を、別々の区画中に含み、増幅後に、テスト装置を開放することなく、増幅反応組成物が捕獲試薬と接触し得るように、テスト装置中に接続されている。
ａ）１つ以上のプライマーセット、
熱安定性ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼ、
複数のｄＮＴＰ’ｓ、および、
１〜２０質量％、好ましくは１〜１５質量％、最も好ましくは１〜８質量％の非イオン性重合体体積排除剤、
を含む、約７．５〜約９のｐＨへ緩衝液で処理された増幅反応組成物、ならびに、
ｂ）水不溶性基質上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬、
を、別々の区画中に含み、増幅後に、テスト装置を開放することなく、増幅反応組成物が捕獲試薬と接触し得るように、テスト装置中に接続されている。
本発明は、ある核酸を、共増幅される１つ以上の他の核酸の混合物中で優先的に増幅するための、きわめて迅速かつ効率的な方法を提供する。例えば、本発明は、増幅された高コピーターゲット核酸に対して、低コピーターゲット核酸を優先的に増幅および検出するために用いることができる。そのような場合、高コピーターゲット核酸による低コピーターゲット核酸の増幅の阻害は、低減される。他の場合、本発明は、様々な理由から、他のターゲット核酸に対して、１つのターゲット核酸の増幅を操作するために使用され得る。更に別の例では、ＰＣＲ生成物の大きさやプライマー結合および伸長の効率の違いのような理由から、１つ以上のターゲット核酸の増幅が好ましい場合であっても、ターゲット核酸の共増幅を効率的に行うことができる。
少なくとも１つの増幅サイクルにおいて、増幅反応混合物内に水溶性または水膨潤性の非イオン性重合体体積排除剤を含むことによって、本発明の利点が得られる。この試薬の存在により、ユーザーが、核酸の効率的な増幅に要するプライマーの量を効率的に低減することができ、これにより、律速反応物質(rate limiting reactant)となり得るプライマー濃縮物の存在下で、または、等モルプライマー濃縮物の存在下でも、効率的に共増幅を行うことができる。
また、体積排除剤も、低コピーターゲット核酸と比べて高コピーターゲット核酸の増幅効率を更に低下させる、増幅反応生成物の再生速度を早める。
材料および方法
実施例１および２：実施例１および２において使用されるプライマーは、ネズミのゲノムの位置PKC、SLP-65、ILGFMAR、c-fos、N-ras、fas、CD19およびCD5に対して特異的であり、かつ、表１に記載の配列を有する：
実施例１および２：実施例１および２において使用されるプライマーは、ネズミのゲノムの位置PKC、SLP-65、ILGFMAR、c-fos、N-ras、fas、CD19およびCD5に対して特異的であり、かつ、表１に記載の配列を有する：
自動ＭＪリサーチＰＴＣ−２００サーモサイクラー(MJ Research PTC-200 Thermocycler)を用いて、ＰＣＲを行った。
ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼとして、HotStarTaq(キアゲン(QIAGEN)、ヒルデン(Hilden)、ドイツから市販されている)を使用した。このポリメラーゼは、米国特許出願第6,183,998号に対応する欧州特許出願第99 110 426号（これらの内容は、本明細書に開示として援用される）に従って得ることができる。鋳型としては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのマウスゲノムＤＮＡを使用した。
それらの反応は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．７、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、各ｄＮＴＰ、２．５Ｕの記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼならびにフォワード(forward)プライマーおよびリバース(reverse)プライマーそれぞれ０．２μＭを含む反応緩衝液中で行われた。
市販のＰＥＧ８０００（約８０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール）を、体積排除剤として使用した。
更に、３５，０００〜４５，０００ダルトンの平均分子量を有する、市販のデキストラン（乳酸菌メセンテロイドズ(Leuconostoc mesenteroides)由来、シグマ(Sigma)製）を使用した。
表２の上欄に、ホット−スタートポリメラーゼおよびデキストランを含む反応のＰＣＲ生成物収率の比較を示す。更に、異なる条件でのシグナル強度の増加（体積排除剤なしで得られたシグナルで体積排除剤を含むサンプルからのシグナルを割った比率）を示す。表２の下欄に、ホット−スタート法ではない方法の場合のデータを示す。
表３の上欄に、ホット−スタートポリメラーゼおよびＰＥＧ８０００を含む反応のＰＣＲ生成物収率の比較を示す。体積排除剤なしで得られたシグナルで体積排除剤を含むサンプルからのシグナルを割った、異なる条件でのシグナル強度の比率を示す。表２および表３における“Ｎ．Ｄ．”という表示は、生成物が得られなかったか、または、分析するのに十分なほど生成物が得られなかったため、“測定不能”であったことを意味する。
表３の上欄に、ホット−スタートポリメラーゼおよびＰＥＧ８０００を含む反応のＰＣＲ生成物収率の比較を示す。体積排除剤なしで得られたシグナルで体積排除剤を含むサンプルからのシグナルを割った、異なる条件でのシグナル強度の比率を示す。表２および表３における“Ｎ．Ｄ．”という表示は、生成物が得られなかったか、または、分析するのに十分なほど生成物が得られなかったため、“測定不能”であったことを意味する。
実施例３：
実施例３で使用した５’−３’ヌクレアーゼアッセイのためのプライマーおよび配列特異的プローブは、ヒトゲノムの位置CSBGおよびc-mycに対して特異的であった。配列を、表４に示す。プローブを、５’末端において蛍光色素で修飾し、３’末端において、５’末端に付着した色素の蛍光を強力に消光する非蛍光分子である、ブラック・ホール・クエンチャー(Black Hole Quencher)（商標）によって修飾した。更に、それらは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を妨げるために、３’−ＯＨの代わりに、３’末端に、ホスフェート基を含んでいた。ＣＳＢＧに対するプローブは、５’末端に、蛍光色素６−ＦＡＭを含んでおり、かつ、ブラック・ホール・クエンチャー１(Black Hole Quencher 1)（商標）が、３’末端に付着していた。c-mycに対するプローブは、５’末端に結合した色素HEXを含んでおり、かつ、ブラック・ホール・クエンチャー(Black Hole Quencher)（商標）１を、３’末端に含んでいた。
実施例３で使用した５’−３’ヌクレアーゼアッセイのためのプライマーおよび配列特異的プローブは、ヒトゲノムの位置CSBGおよびc-mycに対して特異的であった。配列を、表４に示す。プローブを、５’末端において蛍光色素で修飾し、３’末端において、５’末端に付着した色素の蛍光を強力に消光する非蛍光分子である、ブラック・ホール・クエンチャー(Black Hole Quencher)（商標）によって修飾した。更に、それらは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を妨げるために、３’−ＯＨの代わりに、３’末端に、ホスフェート基を含んでいた。ＣＳＢＧに対するプローブは、５’末端に、蛍光色素６−ＦＡＭを含んでおり、かつ、ブラック・ホール・クエンチャー１(Black Hole Quencher 1)（商標）が、３’末端に付着していた。c-mycに対するプローブは、５’末端に結合した色素HEXを含んでおり、かつ、ブラック・ホール・クエンチャー(Black Hole Quencher)（商標）１を、３’末端に含んでいた。
実施例３における反応は、反応化学として、QuantiTectプローブPCRキット（(キアゲン(QIAGEN))を用いて行われた。プライマー濃度０．２μＭの各フォワードおよびリバースプライマーならびに表４に示す配列特異的プローブ０．２μＭを使用した。
市販のＰＥＧ８０００（約８０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール）を、体積排除剤として使用した。
これらの結果から、共増幅反応において、体積排除剤とホット−スタートポリメラーゼとを組み合わせて使用すると、ＰＣＲ生成物の生成物収率が劇的に増加するか、または、ＰＣＲ効率が増加し、Ｃｔ値の低下をもたらすことが、明らかに示された。これは、体積排除剤なしでは、増幅が少ないことを示す。同じ効果は、HotStarTaq（キアゲン(QIAGEN)）のような、一時的に化学的に活性化されているホットスタート酵素ならびに抗体遮断(antibody-blocked)酵素（データは示さず）でも観察された。体積排除剤なしでも十分な収率が得られるＰＣＲ生成物における体積排除剤のマイナスの効果は認められなかった（表２および表３）。一方、ホット−スタートなしで標準的なＴａｑポリメラーゼ（キアゲン(Qiagen)）を含む試料のＰＣＲ効率は、体積排除剤の有無にかかわらず、増幅効率の低下を示した。実施例１および実施例２では、８つのＰＣＲ生成物の中の１つだけを、何とか検出することができた。
実施例および反応条件を以下に説明し、実際に使用する場合の本発明の工程を示す。これらの実施例は、ホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと組み合わせた場合にＰＣＲを特に改善する体積排除剤の複合的なＰＣＲ増強効果を示す。但し、以下に示す本発明の実施例は、説明目的のためにだけ示されたものであり、本発明の範囲を限定するものではない。前述の説明および以下の実施例を読んだ当業者は、請求項の範囲内で、本発明の様々な態様を理解するであろう。特に断りがない限り、すべてのパーセンテージは、質量パーセントである。
実施例
実施例１および２：
鋳型としてＮＩＨ３Ｔ３細胞からのマウスゲノムＤＮＡ１０ｎｇを使用して、区別できる大きさ（表３）のＰＣＲ生成物が得られる、ネズミのゲノムの位置PKC、SLP-65、ILGFMAR、c-fos、N-ras、fas、CD19、およびCD5（表３参照、８個の部分を有する(8-plex)ＰＣＲと呼ぶ）に対して特異的な８つの異なるプライマー対を含む反応において、複合ＰＣＲにおけるホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと体積排除剤との組み合わせの効果を研究した。ＰＣＲサイクルプロトコルは、初期変性／ホット−スタートポリメラーゼ活性化段階[HotStarTaq（キアゲン（QIAGEN））に対して１５分９５℃、標準的なTaqポリメラーゼ（キアゲン（QIAGEN））に対して２分９５℃]、および、３５サイクル（３０秒９４℃、４５秒６１℃、９０秒７２℃）、および、最終伸長段階（１５分６８℃）からなる。MJリサーチPTC-200サーモサイクラー(MJ Research PTC-200 thermocycler)において、ＰＣＲを行った。
実施例１および２：
鋳型としてＮＩＨ３Ｔ３細胞からのマウスゲノムＤＮＡ１０ｎｇを使用して、区別できる大きさ（表３）のＰＣＲ生成物が得られる、ネズミのゲノムの位置PKC、SLP-65、ILGFMAR、c-fos、N-ras、fas、CD19、およびCD5（表３参照、８個の部分を有する(8-plex)ＰＣＲと呼ぶ）に対して特異的な８つの異なるプライマー対を含む反応において、複合ＰＣＲにおけるホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと体積排除剤との組み合わせの効果を研究した。ＰＣＲサイクルプロトコルは、初期変性／ホット−スタートポリメラーゼ活性化段階[HotStarTaq（キアゲン（QIAGEN））に対して１５分９５℃、標準的なTaqポリメラーゼ（キアゲン（QIAGEN））に対して２分９５℃]、および、３５サイクル（３０秒９４℃、４５秒６１℃、９０秒７２℃）、および、最終伸長段階（１５分６８℃）からなる。MJリサーチPTC-200サーモサイクラー(MJ Research PTC-200 thermocycler)において、ＰＣＲを行った。
すべての反応を、最終体積５０μｌで行った。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．７、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、各ｄＮＴＰ、２．５Ｕの記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに、表１に示すフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ０．２μＭを含む反応緩衝液中で、複製反応を行った。更に、異なる濃度の体積排除剤を、反応に加えた。実施例１の反応は、記載したように平均分子量３５，０００〜４５，０００のデキストラン、０、１、３、または６質量%を更に含んでいた。実施例２の反応は、０、１、３、または６質量%のＰＥＧ−８０００を含んでいた。
各反応のアリコート（１０μｌ）を、１．３％アガロースゲル上で分析し、生成物収率を、デンシトメトリーによって求めた。最も高い生成物収率を示した試料を１００％とした。
実施例３：
２つの異なるプライマーセット、ならびに、ヒトゲノムの位置CSBGおよびc-myc（表５参照）に対する配列特異的プローブ、ならびに、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ１０ｎｇまたは１ｎｇを含む反応混合物中で、複合ＰＣＲにおけるホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと体積排除剤との組み合わせの効果を研究した。ＰＣＲ反応は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプローブＰＣＲキット(キアゲン(QIAGEN))を用いて行われ、０（基準）、１、３、または６質量%のＰＥＧ−８０００を含んでいた。実施例１および２から、標準的なＴａｑを用いるホット−スタート法ではない方法の使用は、複合ＰＣＲではうまくいかないことが明らかに示され、この実施例における実験は、ホットスタートポリメラーゼを用いて行った。
２つの異なるプライマーセット、ならびに、ヒトゲノムの位置CSBGおよびc-myc（表５参照）に対する配列特異的プローブ、ならびに、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ１０ｎｇまたは１ｎｇを含む反応混合物中で、複合ＰＣＲにおけるホット−スタートＤＮＡポリメラーゼと体積排除剤との組み合わせの効果を研究した。ＰＣＲ反応は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプローブＰＣＲキット(キアゲン(QIAGEN))を用いて行われ、０（基準）、１、３、または６質量%のＰＥＧ−８０００を含んでいた。実施例１および２から、標準的なＴａｑを用いるホット−スタート法ではない方法の使用は、複合ＰＣＲではうまくいかないことが明らかに示され、この実施例における実験は、ホットスタートポリメラーゼを用いて行った。
ＰＣＲサイクルプロトコルは、初期変性／ホット−スタートポリメラーゼ活性化段階[QuantiTectプローブPCRマスターミックスに含まれるホット−スタートポリメラーゼHotStarTaq（商標）に対して１５分９５℃]、および、４０サイクル（３０秒９４℃変性、６０秒６０℃の組み合わせたアニーリング／伸長段階）からなる。
複合ＰＣＲは、リアルタイム複合ＰＣＲとして、最終体積２０μｌ中で、７９００ＨＴシーケンスディテクションシステム(Sequence Detection System)（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)）および３８４ウェルブロックモジュールを用いて行われ、そして、反応中に、蛍光データを収集した。
この実施例において使用した配列特異的プローブは、各ＰＣＲサイクル中、そのターゲット配列とのハイブリダイゼーションにおいて、HotStarTaq（商標）の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって開裂される。本発明の使用は、このプローブに限定されない。ハイブリダイゼーションプローブズ(Hybridisation Probes)（ＦＲＥＴ−プローブズ(FRET-Probes)）、モレキュラービーコンズ(Molecular Beacons)、スコーピオンズ(Scorpions)、のような、当分野で既知のリアルタイムＰＣＲに適合する他の種類の配列特異的プローブ、またはやがて開発される(upcoming)新たなプローブ技術、の使用も、とり得る態様である。
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの開裂によって、プローブの５’末端に付いた蛍光色素の蛍光強度の増加をもたらす、蛍光色素と消光体分子との分離が引き起こされる。ＰＣＲ後、各ＰＣＲ生成物の増幅の後に、各色素の蛍光シグナルの変化が起こり得る。
増幅プロットと呼ばれる、ＰＣＲサイクル数に対する蛍光の変化を示す曲線を得るために、７９００ＨＴを備えたソフトウェアを使用した。ソフトウェアを使用して、２つの蛍光体のそれぞれに対して、閾値サイクル(threshold cycle)（Ｃｔ）を規定した。データ分析のために、受動的な(passive)参照色素を、“なし(none)”とした。
Ｃｔ値は、ＰＣＲ反応の効率および開始(starting)鋳型分子の数に関する測定値である。異なる実験条件を比較する場合、実験条件が改善されると、Ｃｔ値が低下する。実施例３の結果を、表５にまとめる。
この表５では、実施例３に記載の実験の、ＰＥＧ−８０００ありまたはなしで増幅された試料の閾値サイクル数（Ｃｔ値）が示されている。３つのＣｔ値の平均および変動係数を示す。
Ｃｖ：変動係数
Claims (16)
- 異なる配列組成を有し、かつ、比較され得るコピー数で存在し、最も低いコピー数と最も高いコピー数との差は最大で１０倍である、２つ以上のターゲット核酸の共増幅のための方法であって、少なくとも１５回の第一増幅サイクルを含み、各増幅サイクルは、以下の連続的な段階を含む、前記方法：
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得る、修飾されていないか、または修飾されているプライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、ならびに、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％の非イオン性重合体体積排除剤、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、および、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、を含む。 - 異なる配列組成を有し、かつ、比較され得るコピー数で存在し、最も低いコピー数と最も高いコピー数との差は最大で１０倍である、２つ以上のターゲット核酸の共増幅のための方法であって、少なくとも１５回の第一増幅サイクルを含み、各増幅サイクルは、以下の連続的な段階を含む、前記方法：
Ａ）ターゲット核酸またはそれらのプライマー伸長生成物の鎖の変性のための、２つ以上のターゲット核酸の反応混合物またはそれらのプライマー伸長生成物の、第一温度、Ｔ1、における加熱、ならびに、
Ｂ）第二温度、Ｔ2、に冷却することによる、増幅されるべき各ターゲット核酸の対向する鎖に特異的であり、かつ対向する鎖とハイブリダイズし得るプライマーのセットを用いる、変性された鎖のプライミング、ならびに、
Ｃ）段階Ｂ）の続きとして、または独立した段階における、第三温度、Ｔ3、におけるインキュベーションによる、ＰＣＲ試薬の反応混合物におけるプライマー伸長生成物の形成（但し、プライミングおよびプライマー伸長生成物の形成が同じ段階において行われる場合、Ｔ2およびＴ3は同じである）、
但し、第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物は、１〜２０質量％の非イオン性重合体体積排除剤、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、および、任意に、プライマー結合領域内で結合してハイブリダイゼーション後に蛍光シグナルを発生する配列特異的プローブ、を含む、ならびに、
Ｄ）各増幅サイクルまたは最後の第一増幅サイクル後の増幅サイクルにおける反応中の、１つ以上のターゲット核酸の表示としての１つ以上のプライマー伸長生成物の検出。 - 第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物が、非イオン性重合体体積排除剤を１〜１５質量％含む、請求項１または２に記載の方法。
- 第一増幅サイクルの少なくとも１つにおいて、反応混合物が、非イオン性重合体体積排除剤を１〜８質量％含む、請求項１または２に記載の方法。
- 体積排除剤が、ポリエーテル、糖とエピクロロヒドリンとの反応生成物、多糖、およびポリアクリレートからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 体積排除剤が、一般式：
のポリエーテルの群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - Ｒが、１，２−エチレン、１，３−プロピレン、１，２−プロピレン、２−ヒドロキシ−１，３−プロピレン、３−ヒドロキシ−１，２−プロピレン、１，４−ブチレン、１，３−ブチレン、または１，２−へキシレンを表すことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリ（エチレングリコール）であることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）が、１０００〜２００００００の範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）が、３０００〜５０００００の範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）が、８０００＋／−１０％の範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- 体積排除剤がデキストランであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- デキストランが、１０００〜２００００００の範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- デキストランが、３０００〜５０００００の範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- デキストランが、４００００〜６００００の範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- ポリアクリレートが、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）またはポリ（２，３−ジヒドロキシプロピルアクリレート）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20020021174 EP1403379A1 (en) | 2002-09-24 | 2002-09-24 | Enhanced coamplification of nucleic acids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004113242A JP2004113242A (ja) | 2004-04-15 |
| JP4675558B2 true JP4675558B2 (ja) | 2011-04-27 |
Family
ID=31970287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003332155A Expired - Lifetime JP4675558B2 (ja) | 2002-09-24 | 2003-09-24 | 核酸の強化された共増幅 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8067206B2 (ja) |
| EP (1) | EP1403379A1 (ja) |
| JP (1) | JP4675558B2 (ja) |
| AT (1) | ATE420208T1 (ja) |
| DE (1) | DE60325679D1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8030000B2 (en) | 2002-02-21 | 2011-10-04 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| US7399590B2 (en) | 2002-02-21 | 2008-07-15 | Asm Scientific, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| ES2718482T3 (es) * | 2004-06-01 | 2019-07-02 | Alere San Diego Inc | Kit para amplificación de recombinasa polimerasa |
| GB2424886A (en) | 2005-04-04 | 2006-10-11 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations |
| EP2829615B1 (en) | 2005-07-25 | 2018-05-09 | Alere San Diego, Inc. | Kit for multiplexing recombinase polymerase amplification |
| DK1915446T3 (en) | 2005-08-11 | 2017-09-11 | Synthetic Genomics Inc | IN VITRO RECOMBINATION PROCEDURE |
| WO2007032837A2 (en) * | 2005-08-11 | 2007-03-22 | The J. Craig Venter Institute | Method for in vitro recombination |
| AU2007298650B2 (en) | 2006-05-04 | 2013-10-17 | Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| EP2077337A1 (en) | 2007-12-26 | 2009-07-08 | Eppendorf Array Technologies SA | Amplification and detection composition, method and kit |
| WO2010135310A1 (en) | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Biosite Incorporated | Dna glycosylase/lyase and ap endonuclease substrates |
| EP2369325A1 (en) * | 2010-03-12 | 2011-09-28 | Eppendorf Ag | Array analysis for online detection |
| US9587268B2 (en) * | 2014-01-29 | 2017-03-07 | Agilent Technologies Inc. | Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08103300A (ja) * | 1994-09-15 | 1996-04-23 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics Inc | 核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置 |
| JP2000004878A (ja) * | 1998-05-29 | 2000-01-11 | Qiagen Gmbh | 熱安定性酵素の可逆性修飾の方法 |
| WO2000014218A1 (fr) * | 1998-09-08 | 2000-03-16 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede de synthese de l'adn |
| JP2000093175A (ja) * | 1998-09-21 | 2000-04-04 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2555589B1 (fr) * | 1983-11-30 | 1986-05-16 | Choay Sa | Nouveaux derives du dextrane a activites anticoagulante en anti-inflammatoire, leur procede de preparation et utilisation de ces derives en tant qu'anticoagulants et en tant que substituts du plasma sanguin |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4902624A (en) * | 1987-11-23 | 1990-02-20 | Eastman Kodak Company | Temperature cycling cuvette |
| US5459038A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Advanced Riverina Holdings, Ltd. | Determination of genetic sex in ruminants using Y-chromosome specific polynucleotides |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| US5229297A (en) * | 1989-02-03 | 1993-07-20 | Eastman Kodak Company | Containment cuvette for PCR and method of use |
| US5089233A (en) | 1989-06-12 | 1992-02-18 | Eastman Kodak Company | Processing apparatus for a chemical reaction pack |
| US5106730A (en) * | 1989-07-24 | 1992-04-21 | Microprobe Corporation | Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids |
| EP0515506B1 (en) * | 1990-02-16 | 2000-01-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improvements in the specificity and convenience of the polymerase chain reaction |
| US5194370A (en) * | 1990-05-16 | 1993-03-16 | Life Technologies, Inc. | Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences |
| US5173260A (en) * | 1990-09-17 | 1992-12-22 | Eastman Kodak Company | Beads fused to a test device support |
| US5773258A (en) * | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
| EP0989192A3 (en) * | 1998-09-21 | 2004-02-25 | Shimadzu Corporation | Method for synthesis of nucleic acids |
-
2002
- 2002-09-24 EP EP20020021174 patent/EP1403379A1/en not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-09-23 DE DE60325679T patent/DE60325679D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-23 AT AT03021423T patent/ATE420208T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-09-24 US US10/669,976 patent/US8067206B2/en active Active
- 2003-09-24 JP JP2003332155A patent/JP4675558B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08103300A (ja) * | 1994-09-15 | 1996-04-23 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics Inc | 核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置 |
| JP2000004878A (ja) * | 1998-05-29 | 2000-01-11 | Qiagen Gmbh | 熱安定性酵素の可逆性修飾の方法 |
| WO2000014218A1 (fr) * | 1998-09-08 | 2000-03-16 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede de synthese de l'adn |
| JP2000093175A (ja) * | 1998-09-21 | 2000-04-04 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004113242A (ja) | 2004-04-15 |
| ATE420208T1 (de) | 2009-01-15 |
| US8067206B2 (en) | 2011-11-29 |
| US20040115712A1 (en) | 2004-06-17 |
| DE60325679D1 (de) | 2009-02-26 |
| EP1403379A1 (en) | 2004-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3802110B2 (ja) | 核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置 | |
| JP3936798B2 (ja) | Ｒｎａ標的配列の増幅方法 | |
| CA2017522C (en) | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions | |
| US9476092B2 (en) | Late-PCR | |
| EP0519338B1 (en) | Improved methods for nucleic acid amplification | |
| US8361753B2 (en) | Phosphotriester-modified oligonucleotide primers for nucleic acid amplification | |
| JP5596684B2 (ja) | プルーフリーディング・プライマー伸長 | |
| US8399197B2 (en) | Methods for amplifying polymeric nucleic acids | |
| EP2379753A2 (en) | Single-cell nucleic acid analysis | |
| JP4675558B2 (ja) | 核酸の強化された共増幅 | |
| EP2256216A1 (en) | Assay system using a nuclease activity of a nucleic acid polymerase | |
| WO2020092134A1 (en) | Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers | |
| CN113832258A (zh) | 使用衰减型探针的核糖核酸扩增和检测 | |
| US20230167490A1 (en) | Pseudo-complementary bases in genotyping and nucleic acid sequencing | |
| EP0522884B1 (en) | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions | |
| CN115702250A (zh) | 使用循环探针的指数基数-3及以上的核酸扩增 | |
| CN117070669A (zh) | 新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒 | |
| EP1411133B1 (en) | Enhanced coamplification of nucleic acids | |
| JP4104657B2 (ja) | ポリヌクレオチド増幅の陽性コントロール | |
| EP1649065B1 (en) | Methods for amplifying polymeric nucleic acids | |
| EP1942196A2 (en) | Late-pcr | |
| EP3735476A1 (en) | Method for determining the presence or absence of m. tuberculosis, m. bovis and m. bovis bcg in a sample | |
| CN113785073A (zh) | 基于链分离温度利用dITP进行RNA靶标相比于DNA靶标的优先性/选择性扩增 | |
| AU2023222749A1 (en) | Exponential base-greater-than-base 2 nucleic acid amplification using high- and low-tm primers | |
| JP2004523221A (ja) | 部分相補的プローブを用いた遺伝子型分類 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060904 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090616 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090914 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091208 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100305 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100310 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100407 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100412 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100921 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101101 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20101221 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110118 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110126 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140204 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4675558 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |