CN117070669A - 新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒，本发明通过SARS‑CoV‑2分离毒株基因组序列，设计了多对叠瓦式PCR扩增引物，可以与目前所有类型的新型冠状病毒基因组序列进行结合，加上高效逆转录体系和高保真Tag酶扩增体系，对于污水样本中少量RNA也可以方便快速的扩增出新型冠状病毒全基因组，并且能够完美对接二代测序建库试剂和三代测序平台，得到新型冠状病毒全基因组序列。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒作为RNA病毒，本身容易发生变异，并且随着在新冠病毒感染的一次次大爆发，感染的人数越来越多，变异也越来越频繁，不同的类型的毒株有着不同的免疫逃逸能力，为了能够更好预防下一次的新冠感染爆发，对于免疫逃逸能力较强的新型冠状病毒类型进行监测越来也有必要，研究发现新型冠状病毒不仅仅可以通过飞沫和接触传播，同时也可以通过排泄物进入排水系统，许多地区也都在废水中检测到了新型冠状病毒，表明在废水中幸存下来的病毒可能是接下来最大的传播源，然而人们对于污水系统中分布特征知之甚少，这些信息对于追踪病毒传播的来源，以及评估基于废水的流行病学以监测社区感染比较重要。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种用于检测新型冠状病毒全基因组的引物组，所述引物组包括长度为15到40个核苷酸的核酸序列；
进一步，所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-181中的任意几组所示。
进一步，所述引物组包括使用标记物质标记。
进一步，所述标记物质包括荧光物质、放射性同位素或酶。
进一步，所述荧光物质包括TAMRATTM、Alexa555、Alexa647、花青染料系列的Cy3、Cy5、荧光素。
进一步，所述放射性同位素包括32P、33P、35S。
进一步，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
进一步，所述引物组包括至少一个修饰核苷酸。
进一步，所述修饰核苷酸包括2'-修饰核苷酸或5-甲基胞嘧啶。
进一步，所述2'-修饰核苷酸包括2'-O-甲基修饰核苷酸或2'-氟修饰核苷酸。
进一步，所述5-甲基胞嘧啶包括5-甲基-脱氧胞嘧啶。
进一步，所述5-甲基-脱氧胞嘧啶包括5-Me-dC、5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。
进一步，所述引物组中如果存在除了3'末端胞嘧啶以外的胞嘧啶，则每个胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。
本发明的第二方面提供了一种用于检测新型冠状病毒全基因组扩增引物组，所述引物组是在本发明第一方面所述的引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。
本发明的第三方面提供了一种扩增新型冠状病毒核酸序列的引物组，所述引物组包括：
(1)与本发明第一方面、第二方面所述的引物组互补的核酸序列；
(2)在严格条件下与(1)所述的核酸序列杂交的核酸序列。
本发明的第四方面提供了一种检测新型冠状病毒全基因组的产品，所述产品包括本发明第一方面、第二方面、第三方面所述的引物组。
进一步，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶。
进一步，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
进一步，所述试剂盒还包括反转录的反应体系。
进一步，所述反转录的反应体系包括引物。
进一步，所述引物为随机引物。
进一步，所述试剂盒还包括荧光色素。
进一步，所述试剂盒还包括说明书。
本发明的第五方面提供了一种新型冠状病毒核酸序列的扩增方法，所述方法包括使用本发明第一方面、第二方面、第三方面所述的引物组，或本发明第四方面所述的产品进行扩增反应。
进一步，所述扩增反应通过包括LCR、NASBA、SDA、TMA、bDNA、PCR方法进行。
进一步，所述扩增反应通过PCR方法进行。
进一步，所述扩增反应在相似的扩增条件下进行。
本发明的第六方面提供了一种检测样品中新型冠状病毒的方法，所述方法包括使用本发明第一方面、第二方面、第三方面所述的引物组、本发明第四方面所述的产品或根据本发明第五方面所述的方法进行扩增，获得扩增产物，使用扩增产物进行测序。
进一步，所述样品包括人体样品、环境样品，所述人体样品为离体的人体样品。
进一步，所述人体样品包括血液、唾液、尿液。
进一步，所述环境样品包括水源。
进一步，所述水源包括污水。
进一步，所述污水包括废水处理厂、河道、下水道系统中的污水。
进一步，所述方法为非诊断目的的方法。
本发明的第七方面提供了一种检测新型冠状病毒的文库，所述文库包括本发明第一方面、第二方面、第三方面所述的引物组。
本发明的第八方面提供了本发明第一方面、第二方面、第三方面所述的引物组在制备扩增或检测新型冠状病毒核酸序列的产品中的应用。
本发明的第九方面提供了本发明第一方面、第二方面、第三方面所述的引物组或本发明第四方面所述的产品在非诊断目的的检测新型冠状病毒中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过SARS-CoV-2分离毒株基因组序列，设计了多对叠瓦式PCR扩增引物，可以与目前所有类型的新型冠状病毒基因组序列进行结合，加上高效逆转录体系和高保真Tag酶扩增体系，对于污水样本中少量RNA也可以方便快速的扩增出新型冠状病毒全基因组，并且能够完美对接二代测序建库试剂和三代测序平台，得到新型冠状病毒全基因组序列。
附图说明
图1是新型冠状病毒捕获扩增的核酸样本基因组信息图；
图2是新型冠状病毒全基因组扩增后在污水样本中的新型冠状病毒毒株序列信息图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒全基因组的引物组，所述引物组包括长度为15到40个核苷酸的核酸序列。
所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-181所示。
所述引物组包括使用标记物质标记。
在本发明中，核酸序列或核酸分子是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括但不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成的(例如化学合成的)DNA或RNA。核酸可以是双链(ds)或单链(ss)的。当核酸是单链时，可以是正义链或反义链。核酸可以包括天然核苷酸(例如A、T/U、C和G)，可以包含天然核苷酸的类似物，例如标记的核苷酸。
在本发明中，引物组与引物可以互换使用，引物是指短的核酸分子，本发明公开的引物长度在15到40个核苷酸之间。可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的。
靶核酸分子是指打算对其进行检测、定量、定性检测或其组合的核酸分子。核酸分子不是必须处于纯化的形式。各种不同的其它核酸分子也可以与靶核酸分子共存。例如，靶核酸分子可以是意在对其进行扩增的特异性核酸分子。如果需要，靶核酸分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法来进行，例如使用可商购的纯化试剂盒等。在一个实施方案中，靶核酸分子是新型冠状病毒核酸序列。
在本发明中，所述标记物质包括但不限于荧光物质、放射性同位素或酶。
其中，荧光物质包括但不限于TAMRATTM、Alexa555、Alexa647、花青染料系列的Cy3、Cy5、荧光素。
放射性同位素包括但不限于32P、33P、35S。
酶包括但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
用标记物质标记的本发明所涉及的引物中，标记物质可以与引物直接结合，也可以经由连接体结合。作为连接体，只要是在该领域中通常使用的连接体即可，具体而言，例如，优选1～3个碱基的核酸，更优选1～3个碱基的DNA，进一步优选2个碱基的DNA，尤其优选腺嘌呤(A)-腺嘌呤(A)这2个碱基。
作为用荧光物质标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出根据本身公知的方法将用荧光素标记的核苷酸掺入到引物中的方法等。
作为用放射性同位素标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出通过掺入用放射性同位素标记的核苷酸来标记的方法等。具体而言，可举出随机引物法、缺口平移法、基于T4多核苷酸激酶的5’末端标记法、基于末端脱氧核苷酸转移酶的3’末端标记法等。所述引物组包括至少一个修饰核苷酸。
作为用酶标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与要标记的引物直接共价结合的直接标记法等。
所述引物组包括至少一个修饰核苷酸。
在本发明中，修饰核苷酸包括但不限于2'-修饰核苷酸或5-甲基胞嘧啶。其中，2'-修饰核苷酸包括但不限于2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟修饰的寡核苷酸；5-甲基胞嘧啶包括但不限于5-甲基-脱氧胞嘧啶；5-甲基-脱氧胞嘧啶包括但不限于5-Me-dC，5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。在一些实施方案中，所述引物可以包括两个或更多个修饰核苷酸。两个或更多个修饰核苷酸可以具有相同或不同的修饰。在一些实施方案中，所述引物组可以包括一个或多个5-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶包括。所述引物组可以具有0、1、2、3、4、5、6、7、8或更多的2'-O-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸，5-甲基胞嘧啶或其组合。
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒全基因组扩增引物组，所述引物组是在上述引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。
在本发明中，简并碱基包括但不限于，不遵循沃森-克里克碱基对规则而是可以结合四种规范碱基A、T/U、C、G中的至少两种，但不是所有四种的核苷酸碱基。简并碱基也可以称为摆动碱基，这些术语在本发明中可互换使用。
本发明提供了一种检测新型冠状病毒全基因组的产品，所述产品包括上述引物组。
本发明提供了一种扩增新型冠状病毒核酸序列的引物组，所述引物组包括：
(1)与上述引物组互补的核酸序列；
(2)在严格条件下与(1)所述的核酸序列杂交的核酸序列。
在本发明中，互补的核酸序列是由双链DNA或RNA链由碱基对的两条互补链构成。当一个核酸分子的碱基与另一个核酸分子的碱基形成氢键时，发生了互补性结合。一般来说，碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互补，而胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)互补。例如，一个ssDNA分子的序列5'-ATCG-3'可以与另一个ssDNA的3'-TAGC-5'成键，形成dsDNA。在该例子中，序列5'-ATCG-3'与3'-TAGC-5'反向互补。核酸分子甚至在每个分子的所有碱基没有完全形成氢键的情况下，也可以彼此互补。例如，与互补核酸序列的杂交可以在不同严紧性的条件下发生，其中互补链将在某些但不是所有的核苷酸位点处结合。
在本发明中，严格条件是指形成特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。例如，可以举出如下条件：相对于由SEQ ID NO.1-181所示的序列组成的DNA具有高同一性性(同一性为90％以上，优选为95％以上)的DNA和由与SEQ ID NO.1-181所示的序列所组成的DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交的条件。通常是指在低于完全杂交的熔解温度(Tm)约5℃～约30℃、优选为约10℃～约25℃的温度下形成杂交的情况。关于严格条件，可以使用J.Sambrook等在Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)，特别是11.45节“ConditionsforHybridization of Oligonucleotide Probes”中所记载的条件等。
在本发明中，杂交意指两条完全或部分互补的核酸序列在特定的杂交试验条件下以平行或反平行的方向结合在一起，从而形成具有双链区的稳定结构的能力。这种双链结构的两条组成链(有时被称为杂交链)通过氢键结合在一起。尽管这些氢键最常见形成于单个核酸链上含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间，但碱基配对还可以在不是这些“经典”对的成员的碱基之间形成。非规范碱基配对在本领域中是众所周知的。(参见，例如，R.L.P.Adams等人，《核酸的生物化学(TheBiochemistry of the Nucleic Acids)》)(第11版，1992)。
本发明提供了一种检测新型冠状病毒全基因组的产品，所述产品包括上述引物组。
所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒。
在本发明中，适合量的一种或多种引物被提供在一个或多个容器中，或固定在基质上，引物可以被提供成悬浮在水溶液中，或例如作为冷冻干燥的或冻干的粉末。其中，提供有核酸的容器可以是任何能够容纳所提供的形式的常规容器，例如微量离心管、安瓿瓶或瓶。试剂盒可以包含标记的或未标记的、用于检测消化道病毒核苷酸序列的探针。
在某些应用中，一个或多个引物(如上所述)，可以预先测量好的单次使用量提供在独立的、典型情况下用后即可抛弃的管或相当的容器中。使用这样的设置，用于测试消化道病毒的存在的样品，可以加入到独立的管中，直接进行扩增。
试剂盒中提供的核酸引物的量，可以是任何适合的量，可以依赖于产品所针对的靶市场。例如，如果试剂盒适用于研究或临床应用，提供的每种核酸引物的量，可以是足够引发几个PCR扩增反应的量。确定适合的量的一般性指导，可以在Innis等、Sambrook等和Ausubel等的文献中发现。试剂盒可以包含两个以上的引物，以便于较大量消化道病毒核苷酸序列的PCR扩增。
在某些实施方案中，试剂盒可以含有执行PCR扩增反应所必需的反应试剂，包括DNA样品制备试剂、用于PCR的酶、缓冲液、Mg2+和脱氧核糖核苷酸(dNTPs)。
其中，PCR的酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
所述DNA聚合酶包括但不限于Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段。
dNTP是为了进行基于PCR的DNA扩增的核苷源，dATP、dGTP、dCTP、dTTP这4种是必要的。另外，关于dNTP，可使用为了用于热启动法而进行了化学修饰的物质，例如可使用TriLink BioTechnologies，Inc.制CleanAmpTM dNTP。
在基于PCR的DNA扩增中，Mg2+是必要的。作为Mg2+源，包括但不限于MgCl2、MgSO4等。
所述试剂盒还包括荧光色素。
在本发明中，可使用多种已知的荧光色素。例如，可举出使用具有标识功能的嵌入剂(intercalator)的方法、使用在相对扩增的DNA序列特异性地杂交的核苷酸上结合荧光物质的探针的方法等。作为嵌入剂，可举出作为不饱和型荧光色素的溴化乙锭、SYBRGreenI、作为饱和型荧光色素的Resolight(Roche公司制)、EvaGreen(Biotim公司制)。优选的嵌入剂为作为不饱和型荧光色素的SYBR Green I、作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight，更优选为作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight。对于使用量而言，按照使用的荧光色素的制造销售厂商的推荐。
所述试剂盒还包括说明书，说明书可以包括关于获得样品、处理样品的指导。
此外，试剂盒中可包含作为PCR的阳性对照而使用的细菌的基因组DNA、作为阴性对照而使用的无菌水。
实施本发明时，作为另外的必要的器具，可举出移液器、移液器用枪头、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物学的实验中广泛使用的器具类，作为装置类，可举出PCR、净化台、管用离心机等在分子生物学的实验中广泛使用的仪器。
本发明提供了一种新型冠状病毒核酸序列的扩增方法，所述方法包括使用上述引物组，或上述产品进行扩增反应。
在本发明中，所述扩增反应通过包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、分支DNA信号扩增(bDNA)、聚合酶链式反应(PCR)的方法进行。
所述扩增反应在相似的扩增条件下进行。
本发明实施例部分提供了扩增条件的示例性实施方案。然而，在此所使用的术语“扩增条件”涉及适合于获得靶的可检测量的温度和/或孵育时间。因此，术语“相似的扩增条件”意指若是期望，可以对各靶在相似的温度下进行化验。术语“相似的扩增条件”还指若是期望，可以对各靶在相似的孵育时间下进行化验。在一些情况下，术语“相似的扩增条件”还涉及扩增循环的次数。然而，本领域内熟知，循环的次数并不总是严格的。例如，一些样品可以在其他样品之前被移除或被留下进行附加扩增循环。在其他情况下，术语“相似的扩增条件”还涉及所使用的缓冲液和扩增试剂(酶、核苷酸、盐等)的性质。术语“相似的扩增条件”还指条件(例如,时间、缓冲液、循环次数、温度等)可以稍微改变或可以相同。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例
1、实验材料
具体的实验材料见表1。
表1实验材料
2、实验方法
(1)样本类型：废水处理厂、河道、下水道系统等，以上标本经过核酸提取后可用于新型冠状病毒核酸的提取。
(2)提取的新型冠状病毒进行qPCR检测，Ct值低于33的核酸样品可以继续进行以下的操作，用于测序检测；如果病毒提取后不直接进行检测，也可储存-70℃备用，但要避免反复冻融。
(3)先配置20μl的逆转录反应体系(表2)，对提取的RNA进行核酸逆转录形成cDNA链。
表2逆转录反应体系
| 组分 | 体积 |
| SuperScript IV VILO MIX | 4μl |
| RNA核酸 | 16μl |
(4)程序设定
具体程序见表3。
表3实验程序
| 程序 | 温度 | 时间 |
| 1 | 25℃ | 10min |
| 2 | 50℃ | 10min |
| 3 | 85℃ | 5min |
(5)采用设定好的引物进行对CDNA链进行扩增，进行扩增体系配置(表4).
表4扩增体系
(6)依据设计好的引物，并且搭配高保真的扩增酶，设定了一套适合的反应程序热盖温度：105℃(表5).
表5反应程序
(7)将分别用引物1和引物2进行扩增后的产物混合到一起，进行磁珠纯化后，就可以直接进行后续的测序文库构建过程。
3、实验结果
具体的引物序列如表6所示。
表6引物序列
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使用了本发明试剂盒进行新型冠状病毒捕获扩增后，能够看到核酸样本的全部基因组信息，证明了试剂盒设计的引物能够完全覆盖新型冠状病毒的全部基因组(图1)。
使用了本发明试剂盒进行新型冠状病毒核酸全基因组扩增后，结果分析得出了病毒毒株序列的信息，证明了试剂盒能够对污水中的多个新型冠状病毒的核酸进行了捕获，而不是只针对单一的一种病毒核酸(图2)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测新型冠状病毒全基因组的引物组，其特征在于，所述引物组包括长度为15到40个核苷酸的核酸序列；
优选的，所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-181中的任意几组所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括使用标记物质标记；
优选的，所述标记物质包括荧光物质、放射性同位素或酶；
优选的，所述荧光物质包括TAMRATTM、Alexa555、Alexa647、花青染料系列的Cy3、Cy5、荧光素；
优选的，所述放射性同位素包括32P、33P、35S；
优选的，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶；
优选的，所述引物组包括至少一个修饰核苷酸；
优选的，所述修饰核苷酸包括2'-修饰核苷酸或5-甲基胞嘧啶；
优选的，所述2'-修饰核苷酸包括2'-O-甲基修饰核苷酸或2'-氟修饰核苷酸；
优选的，所述5-甲基胞嘧啶包括5-甲基-脱氧胞嘧啶；
优选的，所述5-甲基-脱氧胞嘧啶包括5-Me-dC、5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶；
优选的，所述引物组中如果存在除了3'末端胞嘧啶以外的胞嘧啶，则每个胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。
3.一种用于检测新型冠状病毒全基因组扩增引物组，其特征在于，所述引物组是在权利要求1或2所述的引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。
4.一种扩增新型冠状病毒核酸序列的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
(1)与权利要求1-3任一项所述的引物组互补的核酸序列；
(2)在严格条件下与(1)所述的核酸序列杂交的核酸序列。
5.一种检测新型冠状病毒全基因组的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-4任一项所述的引物组；
优选的，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒；
优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶；
优选的，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶；
优选的，所述试剂盒还包括反转录的反应体系；
优选的，所述反转录的反应体系包括引物；
优选的，所述引物为随机引物；
优选的，所述试剂盒还包括荧光色素；
优选的，所述试剂盒还包括说明书。
6.一种新型冠状病毒核酸序列的扩增方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述的引物组，或权利要求5所述的产品进行扩增反应；
优选的，所述扩增反应通过包括LCR、NASBA、SDA、TMA、bDNA、PCR方法进行；
优选的，所述扩增反应通过PCR方法进行；
优选的，所述扩增反应在相似的扩增条件下进行。
7.一种检测样品中新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述的引物组、权利要求5所述的产品或根据权利要求6所述的方法进行扩增，获得扩增产物，使用扩增产物进行测序；
优选的，所述样品包括人体样品、环境样品，所述人体样品为离体的人体样品；
优选的，所述人体样品包括血液、唾液、尿液；
优选的，所述环境样品包括水源；
优选的，所述水源包括污水；
优选的，所述污水包括废水处理厂、河道、下水道系统中的污水。
8.一种检测新型冠状病毒的文库，其特征在于，所述文库包括权利要求1-4任一项所述的引物组。
9.权利要求1-4任一项所述的引物组在制备扩增或检测新型冠状病毒核酸序列的产品中的应用。
10.权利要求1-4任一项所述的引物组或权利要求4所述的产品在检测新型冠状病毒中的应用。
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