CN117866951A - 多重pcr反应体系 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单管超多重的PCR检测引物探针组的设计方法、反应体系以及基于所述方法和反应体系的多重靶标检测试剂盒。

Description

多重PCR反应体系

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是属于核酸扩增和检测领域。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如感染性疾病的诊断、基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。

目前在qPCR平台应用较多的引物探针设计方式主要为TaqMan水解探针法，其工作原理主要是利用了一条能与模板特异性结合且两端分别标记荧光基团(供体)和淬灭基团(受体)的寡核苷酸探针，同时在探针的上游和下游分别设计一条特异性PCR引物。在PCR反应开始之前，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，TaqMan探针一端的荧光基团发射的荧光信号被另一端的淬灭基团吸收，从而使得荧光信号不被仪器检测到；而PCR扩增开始后，TaqMan探针与模板特异性结合，当DNA聚合酶(Taq酶)在延伸到探针结合模板的位点时，其5'-3’核酸外切酶活性会将TaqMan探针切断，使得探针上标记的荧光基团远离淬灭基团，不再形成FRET结构，因此荧光基团发射的信号能够被仪器检测到。但是如果要在同一反应体系中实现多重靶标的PCR检测，需要设计多条标记不同波长的荧光基团的TaqMan水解探针，而且受到检测仪器的荧光通道数量的限制，目前最多只能实现4-6重不同靶标的检测。

为实现超多重PCR检测，现有技术通常会将PCR检测技术与其它方法结合起来，例如PCR与杂交芯片结合，以不同的扩增产物长度进行多重靶标检测。如专利文献CN107090519A所公开的“呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒”，是利用了核酸分子杂交的原理，将针对各靶标的单链探针按特定顺序排列固定于基因芯片上，形成探针阵列，再将待测的多重PCR产物与其杂交，使得靶标扩增产物与芯片上的探针杂交并发出荧光信号。该方法虽然能同时检测20种呼吸道病原体，但是基因芯片制备工艺复杂，价格昂贵，不利于临床推广开展，而且过程繁琐，需要经过多个开盖、清洗的步骤，易造成污染导致结果出现假阳性。

又如专利文献CN103074450B所公开的“一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法”，利用了PCR扩增与毛细管电泳结合的方式，将PCR扩增产物取出并进行毛细管电泳分析，将获得的图谱与标准图谱对比从而判断腹泻致病菌的种类。该方法在使用PCR扩增检测设备以外，还需要使用毛细管电泳设备进行产物分析，使得检测成本大大增加，也不利于临床推广使用。

因此，临床急需一种能够进行多重核酸分子检测的方法，能够快速、简便、低成本地用于检测多种临床常见的病原微生物，无创的出生缺陷筛查，单核苷酸多态性分析，甲基化分析，基因突变，基因分型等领域。

发明内容

本发明要解决的问题是在单管反应中实现检测并区分多种不同靶标，并且在存在多种特异性引物的情况下避免了因为引物二聚体产生假阳性信号。本发明提供了一种单管超多重的PCR检测引物探针的设计方法、反应体系以及基于所述方法和反应体系的多重靶标检测试剂盒。

第一方面，本发明提供了用于PCR检测靶序列的组合物，所述组合物包括检测探针和引物组，所述引物组包含第一引物，第二引物和辅助引物，

所述检测探针包括第一结合区A’,检测序列结合区H和检测基团，

所述第一引物或第二引物包含与所述检测探针的第一结合区A’部分或全部互补的序列A，

所述第一引物或第二引物包含辅助结合区X和与所述检测探针的检测序列结合区H部分或全部相同的序列h1，

所述辅助引物包含与所述辅助结合区X部分或全部相同的序列x，与所述h1的互补序列相结合并延伸的序列h2，和阻断区，

所述第一结合区A’，检测序列结合区H，序列A和序列h1不与靶序列或其任意片段互补或相同，

所述辅助结合区X不与所述检测探针或其任意片段相同。

所述第一引物和第二引物互为正向引物和反向引物。

在一些实施方案中，所述辅助引物上的阻断区位于序列h2的上游。

在一些实施方案中，所述辅助引物上的阻断区位于序列h2的上游，并且位于序列x的下游。

在一些实施方案中，所述检测序列结合区H与检测序列或其部分互补，并且所述检测序列不包含辅助结合区X的反向互补序列X’或其部分序列。

在一些实施方案中，所述第一引物和第二引物还分别包含与靶序列相结合的靶序列结合区，所述靶序列结合区是靶特异性序列，与待扩增的靶序列特异性结合。

在一些实施方案中，所述检测序列包含与所述检测探针的第一结合区A’部分或全部互补的序列A，靶序列或其互补序列，以及与检测探针的检测序列结合区H部分或全部互补的序列h2’。

在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区H在与检测序列特异性结合后，所述检测序列扩增大于等于0个nt，获得检测序列扩增产物。

所述检测探针不包含与所述靶序列互补或相同的序列。

所述检测序列结合区H不包含与所述靶序列互补或相同的序列。

优选地，所述检测探针还包含阻断区，如果所述检测探针与检测序列的结合位点在所述阻断区的下游，所述阻断区阻断检测序列的继续延伸。

优选地，所述检测探针还包含3’末端的第二阻断区，所述第二阻断区阻止检测探针3’端的延伸。

所述检测探针上的检测基团在检测探针与检测序列或检测序列扩增产物杂交条件下发出的信号与检测探针未与检测序列或检测序列扩增产物杂交条件下发出的信号不同。

在一些实施方案中，所述组合物包含针对n条靶序列的n组引物组和m条检测探针，其中1≤n≤20，1≤m≤n。所述n组引物组中的引物在不同引物组之间可以彼此相同或不同。

优选地，所述每个检测探针上包含与至少两种检测序列或其部分互补的检测序列结合区，所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。

不同检测探针的情况下，检测序列扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度可以相同。

在一些实施方案中，所述第一引物为正向引物，所述第二引物为反向引物。

在一些实施方案中，所述正向引物包含与所述检测探针的第一结合区A’部分或全部互补的序列A；所述反向引物包含辅助结合区X和与所述检测探针的检测序列结合区H部分或全部相同的序列h1。

在一些实施方案中，反向引物上的序列h1及辅助引物上的序列h2与检测探针上的相应检测序列结合域相对应。

在一些实施方案中，所述n组引物组中n种反向引物及n种辅助引物与n种靶序列相对应，其中，每种反向引物上的序列h1及对应的辅助引物上的序列h2与检测探针上的相应检测序列结合域相对应。

不同检测探针的情况下，检测序列或检测序列扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度可以相同。在一些实施方案中，所述杂交体可以为双链体。

在一些实施方案中，所述组合物包含针对n条靶序列的n组引物组和1条检测探针，所述检测序列结合区包含针对n种检测序列的≥n个检测序列结合域。在1条检测探针的情况下，不同的检测序列扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度不同。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。

所述检测探针上各检测序列结合域可以任何顺序排列(例如第一检测序列结合域可以位于第二检测序列结合域的上游(5’端)或下游(3’端)，类似地，可以任何顺序排列其他的检测序列结合域(例如，根据需要第三检测序列结合域，第四检测序列结合域，第五检测序列结合域....第20检测序列结合域)。

检测探针上各检测序列结合域可以任何形式排列，例如，各检测序列结合域可以直接连接的形式排列，可以连接序列连接的形式排列，或者检测序列结合域之间也可以存在重叠的形式排列。在一些实施方案中，以部分或全部重叠的形式排列检测序列结合域，其中在检测序列结合域彼此之间以全部重叠的形式排列时，只要对应的检测序列与所述的检测序列结合域有几个碱基的错配即可。

所述阻断区(blocking region)，是任意可以阻滞碱基延伸的物质；优选为用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。阻断区，可以是以Spacer C3，Spacer C8(Octanediol)，Spacer 9/TEG，Spacer C12，Spacer 18/HEG，THF(四氢呋喃)/dSapcer(Abasic site)进行修饰，使相应位点被封闭，从而阻止延伸反应。阻断区，也可以为聚合酶酶阻断基团，具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端，但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一些实施方案中，阻断基团选自乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一些实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。

辅助引物上的阻断区可以阻断检测序列上延伸出序列x的反向互补序列x’或其部分序列。序列x的反向互补序列x’或其部分序列不与探针结合，从而避免下游引物二聚体的形成。

在一些实施方案中，如果所述检测探针上的阻断区位于所述检测探针与所述检测序列的结合位点的下游，所述检测探针与所述检测序列结合后，检测序列继续延伸直至延伸至检测探针的5’端。

在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区中的一部分检测序列结合域位于所述阻断区的上游或跨过阻断区，另一部分检测序列结合域位于所述阻断区的下游，检测序列与检测探针的相应检测序列结合域结合后，一部分检测序列延伸到检测探针的5’末端，另一部分延伸到阻断区。

在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区中的所有检测序列结合域位于所述阻断区的上游或跨过阻断区，检测序列与检测探针的相应检测序列结合域结合后，检测序列延伸到检测探针的5’末端。

在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区中的所有检测序列结合域位于所述阻断区的下游，检测序列与检测探针的相应检测序列结合域结合后，检测序列延伸到检测探针的阻断区。

在一些实施方案中，所述检测探针为线性检测探针或具有发夹结构的检测探针。

在一些实施方案中，所述检测探针的3’末端设有第二阻断区，所述第二阻断区可以阻止检测探针3’端的延伸。

在一些实施方案中，所述正向引物F从5’端至3’端依次包括序列A和靶序列结合区。

在一些实施方案中，所述检测探针与正向引物F的退火温度为TmA，所述检测探针与辅助引物的互补序列的退火温度为TmH，所述正向引物与靶序列的退火温度为Tmb1，所述辅助引物与靶序列的退火温度为Tmb2；在一些具体实施方式中，所述TmA＜Tmb1和TmA＜Tmb2，和/或TmH＜Tmb1和TmH＜Tmb2。

在一些实施方案中，所述第一结合区A'与正向引物的序列A互补。

优选地，所述正向引物的序列A是不与靶序列或其任意的片段配对结合的自由设计序列，并且与检测探针的第一结合区A'部分或全部互补。

优选地，所述正向引物的序列A与靶序列结合区之间有0-20个碱基的间隔。

优选地，所述正向引物的长度为20-80个碱基。

优选地，所述正向引物的靶序列结合区的Tm值为40℃-80℃，更优选50℃-80℃。

优选地，所述正向引物的靶序列结合区的GC含量为20％-80％，更优选40％-80％。

优选地，所述正向引物的序列A的长度为5-65个碱基长度，或5-35个碱基长度。

优选地，所述正向引物的序列A的Tm值为40℃-80℃。

优选地，所述正向引物的序列A的GC含量为30％-80％，优选40％-80％。

在一些实施方案中，所述检测序列结合区H的某个检测序列结合域与某个反向引物的序列h1，或某个辅助引物R0的序列h2具有部分或全部相同的序列。

在一些实施方案中，所述反向引物R从5’端至3’端依次包括辅助结合区X，序列h1和靶序列结合区。

在一些实施方案中，所述反向引物R上序列h1与靶序列结合区之间可以有0-20个碱基间隔。

所述序列h1是不与任何靶序列配对结合的自由设计序列。

在一些实施方案中，所述辅助引物R0从5’端至3’端依次包括序列x，阻断区和序列h2。

所述序列h2是不与任何靶序列配对结合的自由设计序列。

在一些实施方案中，所述反向引物的长度为20-80个碱基。

在一些实施方案中，所述反向引物的靶序列结合区的Tm值为40℃-80℃，优选50℃-80℃。

在一些实施方案中，所述反向引物的靶序列结合区的GC含量为20％-80％，优选40-80％。

在一些实施方案中，所述反向引物的序列h1的长度为5-65个碱基；优选5-30个碱基。

在一些实施方案中，所述反向引物的序列h1的Tm值为30℃-80℃，优选40℃-80℃。

在一些实施方案中，所述反向引物的序列h1的GC含量为20％-80％，优选40％-80％。

在一些实施方案中，所述反向引物的辅助结合区X的长度为5-75个碱基；优选5-40个碱基。

在一些实施方案中，所述反向引物的辅助结合区X的Tm值为40℃-80℃。

在一些实施方案中，所述反向引物的辅助结合区X的GC含量为40％-80％。

所述反向引物的序列h1与靶序列结合区之间有0-20个碱基间隔。

在一些实施方案中，所述辅助引物的长度为15-80个碱基。

在一些实施方案中，所述辅助引物的序列h2的长度为3-65个碱基。

在一些实施方案中，所述辅助引物的序列h2的Tm值为30℃-80℃，优选40℃-80℃。

在一些实施方案中，所述辅助引物的序列h2的GC含量为20％-80％，优选40％-80％。

在一些实施方案中，所述辅助引物的序列x的长度为5-75个碱基；优选5-40个碱基。

在一些实施方案中，所述辅助引物的序列x的Tm值为40℃-80℃。

在一些实施方案中，所述辅助引物的序列x的GC含量为40％-80％。

在一些实施方案中，在没有待扩增靶标存在时，探针的第一结合区A’与正向引物的序列A全部或部分互补结合，探针的其他部分呈单链状态，由于分子柔性造成单链柔性探针呈卷曲状；或者探针的其他部分呈二级结构，此时第一检测基团和第二检测基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高。

在一些实施方案中，所述检测探针的长度为15-800个碱基长度，优选15-600个碱基长度，优选15-400个碱基长度，优选15-160个碱基长度，优选25-100个碱基长度。

在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区H的长度为10-500个碱基长度，优选10-400个碱基长度，优选10-100个碱基长度。

所述检测探针的第一结合区A’的长度为5-65个碱基长度，或5-35个碱基长度。

优选地，所述第一结合区A’的Tm值为30℃-80℃，优选为40℃-80℃。

优选地，所述第一结合区A’的GC含量为30％-80％，优选为40％-80％。

优选地，所述第一结合区A’设计在检测探针的5’端或3’端，与正向引物的A序列全部或部分互补。

在一些实施方案中，所述检测序列结合域的长度为5-65个碱基长度。

优选地，所述检测序列结合域的Tm值为30℃-80℃，优选为40℃-80℃。

优选地，所述检测序列结合域的GC含量为20％-80％，优选为40％-80％。

在一些实施方案中，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，其中所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。

优选地，所述第一检测基团与所述第二检测基团间隔3-240埃，优选间隔3-140埃。

优选地，所述第一检测基团和第二检测基团均位于第一结合区A'上，或均位于检测序列结合区H上，或分别位于第一结合区A'和检测序列结合区H上。

在一些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针，检测基团包括报告基团和淬灭基团。

在一些实施方案中，所述报告基团为荧光基团，所述淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团。

优选地，所述检测探针上的检测基团位于所述阻断区的下游。所述检测基团使得检测探针与检测序列或检测探针与检测序列扩增产物杂交前后产生信号变化。

在一些实施方案中，如果阻断区位于所述检测探针与所述检测序列的结合位点的下游，所述检测探针与检测序列结合后，所述检测序列继续延伸直至延伸至检测探针的5’端。

在一些实施方案中，所述检测探针包括：

一个检测序列结合区H和一个第一结合区A’(A’-H；H-A’)；或

两个检测序列结合区H和一个第一结合区A’，两个检测序列结合区H分别位于第一结合区A’的两侧(H-A’-H)；或

一个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，两个第一结合区A’分别位于检测序列结合区H的两侧(A’-H-A’)；或

两个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，所述检测序列结合区H和第一结合区A’间隔排列(H-A’-H-A’或A’-H-A’-H)。

所述检测序列结合区H和第一结合区A’可直接连接或部分重叠连接。

在一些实施方案中，在进行PCR扩增时，所述正向引物与所述反向引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条第一单链预扩增产物包含序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’和辅助结合区X的反向互补序列X’；随后，辅助引物结合到所述第一单链预扩增产物并延伸，产生一条第二单链预扩增产物，所述第二单链预扩增产物包含第一结合区A'，靶序列，序列h2，阻断区和序列x；然后，正向引物与所述第二单链预扩增产物结合并延伸，产生第三单链预扩增产物作为检测序列，所述第三单链预扩增产物包含序列A，靶序列，序列h2的反向互补序列h2’。

在一些实施方案中，所述第一单链预扩增产物从5’端到3’端包含序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’和辅助结合区X的反向互补序列X’；所述第二单链预扩增产物从5’端到3’端包含序列x，阻断区，序列h2，靶序列，和第一结合区A'；所述第三单链预扩增产物作为检测序列，从5’端到3’端包含序列A，靶序列，和序列h2的反向互补序列h2’。

所述检测探针的5’端的第一结合区A’与所述第三单链预扩增产物，即检测序列5’端的序列A结合，所述检测探针3’端的检测序列结合区H上的检测序列结合域与所述第三单链预扩增产物，即检测序列3’端的序列h2’结合，并以检测探针作为模板继续延伸大于等于0个碱基到检测探针的5’端或阻断区，得到检测探针的部分或全部反向互补序列作为检测探针与检测序列的扩增产物，即完成以第三单链预扩增产物为引物，以检测探针为模板的二次扩增，得到二次扩增双链产物。

检测探针由单链变为杂交体状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变长，产生可被仪器检测到的信号。

在一些实施方案中，通过荧光通道进行靶序列扩增的鉴定，或者通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定，或者通过荧光通道+熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。

优选地，通过荧光通道+熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。具体地，在PCR扩增后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针与检测序列的扩增产物形成的杂交体产物在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针由杂交体链变为单链，使得检测基团之间的距离发生变化，产生可被仪器检测到的信号。

由于熔解曲线分析时，检测到的是检测探针(P)与检测序列扩增产物的熔解温度，因此可以通过调整辅助引物(R0)的序列h2的序列和长度，以得到与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域部分反向互补或全部反向互补的二次扩增产物，从而调整检测探针(P)与检测序列的扩增产物的熔解温度，例如调整序列h2的长度或序列，或调整序列h2与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域的反向互补的位置，进而增高或降低检测探针(P)与检测序列的二次扩增产物的熔解温度。

在没有待测靶标存在时，检测探针的第一结合区A’与正向引物(F)的序列A反向互补；检测探针(P)的其他部分呈单链状态，由于分子柔性呈卷曲状，或者探针的其他部分呈二级结构，此时第一检测基团和第二检测基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高；而当待测靶标存在时，正向引物(F)与反向引物(R)分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物作为第一单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’,序列X的反向互补序列X’；反应继续进行，辅助引物R0结合到所述第一单链预扩增产物(S1)并延伸，产生第二单链预扩增产物(S2)，其5’端到3’端依次是序列x，扩增阻滞位点(C)，序列h2，靶序列，序列A的反向互补序列A’；正向引物(F)进一步可以与第二单链预扩增产物反向互补并延伸，产生第三单链预扩增产物(S3)，其5’端到3’端依次是序列A，靶序列，序列h2的反向互补序列h2’；产生第三单链预扩增扩增产物(S3)后，检测探针(P)的检测序列结合区H与第三单链预扩增产物(S3)3’端的序列h2’互补配对，检测探针的第一结合区A’与第三单链预扩增产物(S3)5’端的序列A反向互补配对，第三单链预扩增产物(S3)的3’端可以检测探针(P)为模板继续延伸大于等于0个碱基，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列，即完成以第三单链预扩增产物(S3)为引物，以检测探针(P)为模板的二次扩增，得到检测探针(P)的二次扩增产物；第一检测基团与第二检测基团距离发生变化，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在PCR结束后，进行熔解曲线分析时，在一定温度下，检测探针(P)的二次扩增产物发生解链，使得检测探针(P)的第一检测基团与第二检测基团距离发生变化，使得荧光信号再次发生变化，可用于熔解曲线分析。

这样的实施方案可以在单管中实现超多重PCR，或数字PCR，而且有效避免了下游引物二聚体的形成。

第二方面，本发明提供了用于PCR检测的反应体系，所述反应体系包括第一方面的组合物。

第三方面，本发明提供了用于PCR检测的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一方面的组合物或第二方面的反应体系。

第四方面，本发明提供了用于PCR检测的方法，所述方法包括利用第一方面的组合物，第二方面的反应体系或第三方面的检测试剂盒进行PCR的步骤。

在进行PCR扩增时，所述正向引物与所述反向引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条第一单链预扩增产物包含序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’和辅助结合区X的反向互补序列X’；随后，辅助引物(R0)结合到所述第一单链预扩增产物并延伸，产生一条第二单链预扩增产物，所述第二单链预扩增产物包含第一结合区A'，靶序列，序列h2，阻断区和序列x；然后，正向引物与所述第二单链预扩增产物结合并延伸，产生第三单链预扩增产物作为检测序列，所述第三单链预扩增产物包含序列A，靶序列，序列h2的反向互补序列h2’。

在一些实施方案中，所述第一单链预扩增产物从5’端到3’端包含序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’和辅助结合区X的反向互补序列X’；所述第二单链预扩增产物从5’端到3’端包含序列x，阻断区，序列h2，靶序列，和第一结合区A'；所述第三单链预扩增产物作为检测序列，从5’端到3’端包含序列A，靶序列，和序列h2的反向互补序列h2’。

所述检测探针的5’端的第一结合区A’与所述第三单链预扩增产物，即检测序列5’端的序列A结合，所述检测探针3’端的检测序列结合区H上的检测序列结合域与所述第三单链预扩增产物，即检测序列3’端的序列h2’结合，并以检测探针作为模板继续延伸大于等于0个碱基到检测探针的5’端或阻断区，得到检测探针的部分或全部反向互补序列作为检测探针与检测序列的扩增产物，即完成以第三单链预扩增产物为引物，以检测探针为模板的二次扩增，得到二次扩增产物。

检测探针由单链变为杂交体状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变长，产生可被仪器检测到的信号。

在一些实施方案中，通过荧光通道进行靶序列扩增的鉴定，或者通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定，或者通过荧光通道+熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。

优选地，通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。具体地，在PCR扩增后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针与检测序列的扩增产物形成的双链杂交体产物在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针由杂交体变为单链，使得检测基团之间的距离发生变化，产生可被仪器检测到的信号。

由于熔解曲线分析时，检测到的是检测探针(P)与检测序列的扩增产物的熔解温度，因此可以通过调整辅助引物的序列h2的序列和长度，以得到与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域部分反向互补或全部反向互补的二次扩增产物，从而调整检测探针(P)与检测序列的扩增产物的熔解温度，例如调整序列h2的长度或序列，或调整序列h2与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域的反向互补的位置，进而增高或降低检测探针(P)与检测序列的二次扩增双链产物的熔解温度。

在没有待测靶标存在时，检测探针的第一结合区A’与正向引物(F)的序列A反向互补；检测探针(P)的其他部分呈单链状态，由于分子柔性呈卷曲状，或者探针的其他部分呈二级结构，此时第一检测基团和第二检测基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高；而当待测靶标存在时，正向引物(F)与反向引物(R)分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物作为第一单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’,辅助结合区X的反向互补序列X’；反应继续进行，辅助引物R0结合到所述第一单链预扩增产物(S1)并延伸，产生第二单链预扩增产物(S2)，其5’端到3’端依次是序列x，扩增阻滞位点(C)，序列h2，靶序列，序列A的反向互补序列A’；正向引物(F)进一步可以与第二单链预扩增产物反向互补并延伸，产生第三单链预扩增产物(S3)，其5’端到3’端依次是序列A，靶序列，序列h2的反向互补序列h2’；产生第三单链预扩增扩增产物(S3)后，检测探针(P)的检测序列结合区H与第三单链预扩增产物(S3)3’端的序列h2’互补配对，检测探针的第一结合区A’与第三单链预扩增产物(S3)5’端的序列A反向互补配对，第三单链预扩增产物(S3)的3’端可以检测探针(P)为模板继续延伸大于等于0个碱基，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列，即完成以第三单链预扩增产物(S3)为引物，以检测探针(P)为模板的二次扩增，得到检测探针(P)的二次扩增产物；第一检测基团与第二检测基团距离发生变化，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在PCR结束后，进行熔解曲线分析时，在一定温度下，检测探针(P)的二次扩增产物发生解链，使得检测探针(P)的第一检测基团与第二检测基团距离发生变化，使得荧光信号再次发生变化，可用于熔解曲线分析。

在一些实施方案中，通过荧光通道进行靶序列扩增的鉴定，或者通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定，或者通过荧光通道+熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。

第五方面，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的反应体系或第三方面的检测试剂盒在进行PCR检测中的应用。

尤其是，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的反应体系或第三方面的检测试剂盒在进行单管超多重PCR检测或数字PCR检测中的应用。

第六方面，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的反应体系，第三方面的检测试剂盒或第四方面的方法在检测病原微生物，无创的出生缺陷筛查，单核苷酸多态性分析，甲基化分析，基因突变分析，或基因分型中的应用。

附图说明

图1显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV 59型质粒的阳性反应孔在CY5通道中形成Tm值为73.8℃的熔解峰。

图2显示无模板对照孔无熔解峰，加入HPV 16型质粒的阳性反应孔在HEX通道中形成Tm值为81.8℃的熔解峰，加入HPV 18型质粒的阳性反应孔在HEX通道中形成Tm值为77℃的熔解峰，加入HPV 52型质粒的阳性反应孔在HEX通道中形成Tm值为70.2℃的熔解峰。

图3显示在无反向辅助引物R0存在下，NTC反应在73℃左右出现大量非特异性熔解峰，是引物二聚体导致。

图4显示添加反向辅助引物R0后，NTC反应无非特异性熔解峰。

图5显示在无反向辅助引物R0存在下，HPV 59型在73℃出现特异性熔解峰；HPV 31型不仅在79℃出现特异性熔解峰，在73℃出现非特异性熔解峰；HPV58型不仅在82.6℃出现特异性熔解峰，也在73℃出现非特异性熔解峰。

图6显示了添加反向辅助引物R0后，HPV 59型、31型、58型仅分别在73℃、79℃、82.6℃出现特异性熔解峰，无非特异性杂峰。。

具体实施方案

以下所述的是本发明的优选实施方案，本发明所保护的不限于以下优选实施方案。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。

在本文中，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分，其可在退火或扩增条件下与引物进行退火。

在本文中，术语“正向引物”，也称上游引物，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；本发明中使用的术语“反向引物”，也称下游引物，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。其中，正链即有义链、正义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5’-3’，碱基序列和该基因mRNA基本相同；与该链结合的引物为反向引物；负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的正向和反向引物命名也可随之互换。

在本文中，术语“探针”是指用于检测靶标是否存在的经标记的寡核苷酸。

在本文中，“碱基互补配对”是指A与T、A与U和G与C等的对应关系互相以氢键相连的现象。相应地，“错配碱基”是指除“碱基互补配对”中所规定外的其他所有配对情形，如A与C、A与G、T与G，或T与C错配等。

所述阻断区(blocking region)，即任意可以阻滞碱基延伸的物质；优选为用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。阻断区，可以是以Spacer C3，Spacer C8(Octanediol)，Spacer 9/TEG，Spacer C12，Spacer 18/HEG，THF(四氢呋喃)/dSapcer(Abasic site)进行修饰，使相应位点被封闭，从而阻止延伸反应。阻断区，也可以为聚合酶酶阻断基团，具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端，但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一些实施方案中，阻断基团选自猝灭基团(如BHQ、MGB等)，乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一些实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。

实施方案：

在本发明的方法中，当对病原靶标进行特异性扩增时，正向引物(F1)和反向引物(R1)扩增靶核酸得到双链预扩增产物，其中第一单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列，检测序列结合区的相应检测序列结合域的反向互补序列h1’，辅助结合区X的反向互补序列X’；反应继续进行，反向辅助引物(R0)结合到第一单链预扩增产物(S1)并延伸，产生第二单链预扩增产物(S2)，其5’端到3’端依次是序列x，扩增阻滞位点(C)，序列h2，靶序列，序列A的反向互补序列A’；正向引物(F1)进一步可以与第二单链预扩增产物(S2)反向互补并延伸，产生第三单链预扩增产物(S3)，其5’端到3’端依次是序列A，靶序列，序列h2的反向互补序列h2’。检测探针(P1)的5’端的第一结合区A’和3’端的检测序列结合区(H)可以与第三单链预扩增子(S3)的5’端的序列A和3’端的序列h2’互补配对，且第三单链预扩增子(S3)的3’端可以以检测探针(P1)为模板，继续延伸到检测探针(P1)的5’端，得到检测探针(P1)的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团此时由于单链到双链的拉伸变化使得距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在扩增结束后进行熔解曲线分析，检测探针(P1)的二次扩增双链产物在适当的的熔解温度(Tm)下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P1)将变为单链状态，再次发生荧光共振能量转移，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。

所述反应体系涉及以下步骤：

(1)首先在PCR扩增反应的循环内，正向引物(F1)、反向引物(R1)和辅助引物(R0)可以特异性的扩增靶核酸序列。扩增后，会得双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物(S3)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列和序列h2的反向互补序列h2’，检测探针(P1)的探针信号检测区(H)与其中一条单链预扩增产物(S3)的序列h2’互补配对，检测探针(P1)的第一结合区A’与该单链预扩增产物(S3)5’端的序列A反向互补配对，此时检测探针(P1)的第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。

(2)在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，检测探针(P1)与单链扩增子(S3)形成的双链产物将在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P1)将变为单链状态，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。

优选的，本发明中所述的反应条件为：90℃-96℃预变性2-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环；(可选的，90℃-95℃变性0-600秒，30℃-55℃恒温孵育10-600秒，1-50个循环)；35-95℃熔解曲线分析，升温速率为0.2℃/s，荧光信号采集。

更优选的，本发明中所述的反应条件为95℃预变性2分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；45-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.2℃，荧光信号采集。

优选的，本发明中所述的反应体系中引物探针浓度分别是：正向引物(F1)的浓度为30nM-1000nM，反向引物(R1)的浓度为30nM-100nM，辅助引物(R01)的浓度为30nM-500nM，检测探针(P1)浓度为150nM-1200nM。

本发明中所述技术方案与现有技术相比，其优点在于：

超多重检测：本发明所述方法可在单管反应中同时进行荧光通道与熔解温度两个维度的分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标；或使用不同的荧光通道，即可实现荧光通道数量与熔解温度特征之乘积的靶标种类检测，例如，当在一个荧光通道设置2个熔解温度检测点，如果有2个荧光通道，即可检测2x2的靶序列，从而实现更多重的检测；通过检测探针上设置阻断区，可以缩短二次扩增产物的扩增长度，提高检测效率，可以有效设置不同靶标的熔解峰值，可以提高熔解温度(Tm值)的分辨率，进一步实现超多重检测。在反向引物上设计辅助结合区x，可以有效避免因引物二聚体造成的假阳性信号。配合辅助引物R0上的阻断区可以阻断检测序列上延伸出辅助结合区x的反向互补序列x’或其部分序列(辅助结合区x的反向互补序列x’或其部分序列不与探针结合)，从而释放序列h2的反向互补序列h2’，进一步地，有效降低下游引物二聚体的形成概率；进一步提高超多重检测的准确性；

荧光背景低：每个荧光通道只使用1条探针，即可通过扩增产物的不同熔解温度进行区分，大大降低了PCR反应中的荧光背景，提高了反应灵敏度；

熔解温度可调整：本发明所述方法是利用探针两端同时与扩增产物两端结合使探针拉伸发光，因此通过调整序列h2的长度或序列，或调整序列h2与检测探针(P)的检测信号结合区(H)的检测信号结合域的反向互补的位置，进而增高或降低与检测探针(P)形成的二次扩增双链产物的熔解温度；

包容性好：本发明所述引物探针设计方法与靶序列只有两部分互补配对，即正向引物(F)和反向引物(R)，相比Taqman水解探针法需要三部分与模板互补配对，在靶序列存在较多高变异区时，如病毒或细菌基因组，本发明所述引物探针设计方法的包容性更好，设计难度更低；

成本低：本发明所述方法只需通过荧光定量PCR在单管反应中完成检测，无需借助额外的下游仪器辅助，也无需通过芯片或多个反应管分割反应，大大降低了仪器和耗材的成本，同时在试剂中减少了荧光探针的数量，大大降低了试剂成本，使得大规模推广成为可能；

单管反应：对样本的消耗少，特别适合用于稀有样本的检测，可以大大提高加入检测反应的样本浓度，提高检测灵敏度，同时单管反应为后续进行免提取一管法检测提供了可能性；

操作简便：仅需使用荧光定量PCR仪进行检测，无后续步骤如毛细管电泳或核酸杂交等，同时配制简单，上机后无需操作；

不容易造成污染：本发明所述方法在加样完成后即完全封闭，无需开盖进行后续检测，大大降低了对实验环境造成污染的可能性；

灵敏度高：本发明所述方法对靶序列的长度要求非常低，当靶标类型是短片段核酸时，例如游离核酸时，更短的靶序列长度在检测中有更高的灵敏度；

适用范围广：本发明可适用于多种样本类型的核酸检测，包括血清样本、血浆样本、全血样本、痰液样本、拭子样本、灌洗液样本、新鲜组织样本、福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)，靶标如细菌、病毒、基因突变等，使得包括基层医院在内的临床单位能够快速的开展常见靶标的检测，如病原微生物感染检测等，辅助其它检测和确诊手段，更快速的为临床提供诊断证据和用药方案，减少患者精神负担和经济负担，达到精准医疗的目的。

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

实施例1人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)59型的单重检测

表1：探针引物序列

上述引物探针中:

所述检测探针P1(SEQ ID NO:1)，全长60bp，其5’端的第1个至14个碱基为第一结合区A’，第17至31个碱基为探针的FRET区，第32个至第40个碱基为检测序列结合区H。

所述正向引物F1(SEQ ID NO:2)，为针对HPV 59型靶序列设计的特异性引物，F1全长38bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，与检测探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第1至14个碱基序列反向互补，为序列A；

所述反向引物R1(SEQ ID NO:3)，为针对HPV 59型靶序列设计的特异性引物，R1全长45bp，其3’端第1至第19个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基为辅助结合区(x)，序列为自由设计，不与靶序列、探针结合；其5’端的第15至第23个碱基，为序列h，与检测探针(P1)的检测序列结合区H的序列相同。

所述反向辅助引物R01(SEQ ID NO:4)，全长23bp，其5’端的第1至第14个碱基，为辅助结合区(X)，与反向引物R1(SEQ ID NO:3)的辅助结合区(x)序列相同；其5’端的第14位碱基T与第15位碱基C之间是扩增阻滞位点(C)，修饰C3 Spacer；其5’端的第15至第23个碱基为序列h，与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的序列相同。

反应体系包含以下组分：

表2：反应体系

将反应缓冲液和引物探针预混液按照表2所述的反应体系混合，待测核酸模板为人乳头瘤病毒HPV 59型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后按50拷贝/反应与反应体系混合，同时设置无模板对照(NTC)，即用超纯水或1×TE Buffer代替核酸模板，然后进行PCR扩增以及熔解曲线分析。根据靶标在特定检测通道特征Tm值即可判读样本中是否存在HPV 59型。

使用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测。其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl₂、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、70mM(NH₄)₂SO₄等。

所述试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。

样本制备：

人乳头瘤病毒HPV 59型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R1)及反向辅助引物(R01)对人乳头瘤病毒HPV 45型进行单独检测，以验证单重检测的能力。使用超纯水或1×TEBuffer作为无模板对照(NTC)。

PCR扩增及熔解曲线分析：

将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；45-85℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.2℃，采光。

数据分析：

通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图1显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV 59型质粒的阳性反应孔在CY5通道中形成Tm值为73.8℃的熔解峰。

实施例2人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)16型，18型，52型的多重检测

表3：引物探针

上述引物探针中:

所述检测探针P2(SEQ ID NO:5)，全长59bp，其5’端的第1个至14个碱基为引物锚定区(A’)，第18至32个碱基为检测探针的FRET区，第33个至第41个碱基为检测序列结合域H1，第42个至第50个碱基为检测序列结合域H2，第51个至第59个碱基为检测序列结合域H3。

所述正向引物F2(SEQ ID NO:6)，为针对HPV 16型靶序列设计的特异性引物，F2全长36bp，其3’端第1至第19个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，与检测探针P2(SEQ ID NO:5)的5’端第1至14个碱基序列反向互补，为序列A。

所述反向引物R2(SEQ ID NO:7)，为针对HPV 16型靶序列设计的特异性引物，R2全长46bp，其3’端第1至第20个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，为辅助结合区(x)，序列为自由设计，不与靶序列、检测探针结合；其5’端的第15至第23个碱基，为序列h3，与检测探针(P2)的检测序列结合域H3序列相同。

所述反向辅助引物R02(SEQ ID NO:8)，全长23bp，其5’端的第1至第14个碱基，为辅助结合区(x)，与反向引物R2(SEQ ID NO:6)的辅助结合区(x)序列相同；其5’端的第14位碱基T与第15位碱基G之间是扩增阻滞位点(C)，修饰C3 Spacer；其5’端的第15至第23个碱基为序列h3，与检测探针(P2)的检测序列结合域H3序列相同。

所述正向引物F3(SEQ ID NO:9)，为针对HPV18型靶序列设计的特异性引物，F3全长39bp，其3’端第1至第22个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，与检测探针P2(SEQ ID NO:5)的5’端第1至14个碱基序列反向互补，为序列A；

所述反向引物R3(SEQ ID NO:10)，为针对HPV 18型靶序列设计的特异性引物，R3全长46bp，其3’端第1至第22个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第12个碱基，为辅助结合区(x)，序列为自由设计，不与靶序列、检测探针结合；其5’端的第13至第21个碱基，为序列h2，与检测探针(P2)的检测序列结合域H2的序列相同。

所述反向辅助引物R03(SEQ ID NO:11)，全长21bp，其5’端的第1至第12个碱基，为辅助结合区(x)，与反向引物R3(SEQ ID NO:10)的辅助结合区(x)序列相同；其5’端的第12位碱基T与第13位碱基T之间是扩增阻滞位点(C)，修饰C3 Spacer；其5’端的第13至第21个碱基为序列h2，与检测探针(P2)的检测序列结合域H2的序列相同。

所述正向引物F4(SEQ ID NO:12)，为针对HPV 52型靶序列设计的特异性引物，F4全长40bp，其3’端第1至第23个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，与检测探针P2(SEQ ID NO:5)的5’端第1至14个碱基序列反向互补，为序列A；

所述反向引物R4(SEQ ID NO:13)，为针对HPV 52型靶序列设计的特异性引物，R3全长44bp，其3’端第1至第24个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第9个碱基，为辅助结合区(x)，序列为自由设计，不与靶序列、检测探针结合；其5’端的第10至第17个碱基，为序列h1，与检测探针(P2)的检测序列结合域H1序列相同。

所述反向辅助引物R04(SEQ ID NO:14)，全长17bp，其5’端的第1至第9个碱基，为辅助结合区(x)，与反向引物R4(SEQ ID NO:13)的辅助结合区(x)序列相同；其5’端的第9位碱基G与第10位碱基C之间是扩增阻滞位点(C)，修饰C3 Spacer；其5’端的第10至第17个碱基为序列h1，与检测探针(P2)的检测序列结合域H1序列相同。

当对病原靶标进行特异性扩增时，正向引物(F2/F3/F4)、反向引物(R2/R3/R4)和反向辅助引物(R02/R03/R04)分别扩增靶核酸得到HPV 16型/18型/52型的双链预扩增产物(S3)，其5’端到3’端依次是序列A，靶序列，序列h的反向互补序列(h’)，16型/18型/52型对应的h’分别不同。检测探针(P2)的5’端(A’)和3’端(H)可以与单链预扩增子(S3)的5’(A)端和3’端(h’)互补配对，且单链预扩增子(S3)的3’端(h’)可以以检测探针(P2)为模板，继续延伸到检测探针(P2)的5’端，得到检测探针(P2)的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团此时由于单链到双链的拉伸变化使得距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在扩增结束后进行熔解曲线分析，检测探针(P2)的二次扩增双链产物在适当的的熔解温度(Tm)下解链，不同的h’以检测探针(P2)为模板，继续延伸时产生的扩增子长度不同，因此会在不同熔解温度(Tm)下解链。解链时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P2)再次放生荧光共振能量转移，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。

表4：多重反应体系

样本制备：

人乳头瘤病毒HPV 16/18/52型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R2/R3/R4)及反向辅助引物(R02/R03/R04)对人乳头瘤病毒HPV 16/18/52型进行检测，以验证单管多重检测的能力。使用超纯水或1×TE Buffer作为无模板对照(NTC)。

PCR扩增及熔解曲线分析：

将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；60-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.2℃，采光。

数据分析：

通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图2显示无模板对照孔无熔解峰，加入HPV16型质粒的阳性反应孔在HEX通道中形成Tm值为81.8℃的熔解峰，加入HPV 18型质粒的阳性反应孔在HEX通道中形成Tm值为77℃的熔解峰，加入HPV 52型质粒的阳性反应孔在HEX通道中形成Tm值为70.2℃的熔解峰。

实施例3人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)59型，31型，58型的单管多重检测以及无反向辅助引物R0情况下的多重检测

表5：引物探针体系

上述引物探针中:

所述检测探针P1(SEQ ID NO:1)同实施例1，为本实施例3重体系的通用探针。其5’端的第32个至第40个碱基为探针信号检测域(H4)，第41个至第50个碱基为探针信号检测域(H5)，第51个至第60个碱基为探针信号检测域(H6)。

59型引物中的F1(SEQ ID NO:2)，R1(SEQ ID NO:3)，R01(SEQ ID NO:4)同实施例1，所述反向引物R1’(SEQ ID NO:15)为针对HPV 59型靶序列设计的特异性引物，R1’全长31bp，其3’端第1至第23个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第9个碱基，为序列h4，与检测探针(P1)的检测序列结合域H4序列相同。

所述正向引物F5(SEQ ID NO:16)，为针对HPV 31型靶序列设计的特异性引物，F5全长35bp，其3’端第1至第18个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，与检测探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第1至14个碱基序列反向互补，为序列A。

所述反向引物R5(SEQ ID NO:17)，为针对HPV 31型靶序列设计的特异性引物，R5全长48bp，其3’端第1至第23个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第12个碱基，为辅助结合区(x)，序列为自由设计，不与靶序列、检测探针结合；其5’端的第13至第22个碱基，为序列h5，与检测探针(P1)的检测序列结合域H5序列相同。

所述反向辅助引物R05(SEQ ID NO:18)，全长22bp，其5’端的第1至第12个碱基，为辅助结合区(x)，与反向引物R5(SEQ ID NO:17)的辅助结合区(x)序列相同；其5’端的第12位碱基T与第13位碱基G之间是扩增阻滞位点(C)，修饰C3 Spacer；其5’端的第13至第22个碱基为序列h5，与检测探针(P1)的检测序列结合域H5序列相同。

所述反向引物R5’(SEQ ID NO:19)为针对HPV 31型靶序列设计的特异性引物，R5’全长36bp，其3’端第1至第23个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第10个碱基，为序列h5，与检测探针(P1)的检测序列结合域H5序列相同。

所述正向引物F6(SEQ ID NO:20)，为针对HPV 58型靶序列设计的特异性引物，F6全长39bp，其3’端第1至第22个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第14个碱基，与检测探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第1至14个碱基序列反向互补，为序列A。

所述反向引物R6(SEQ ID NO:21)，为针对HPV 58型靶序列设计的特异性引物，R6全长44bp，其3’端第1至第22个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第9个碱基，为辅助结合区(x)，序列为自由设计，不与靶序列、检测探针结合；其5’端的第10至第19个碱基，为序列h6，与检测探针(P1)的检测序列结合域H6序列相同。

所述反向辅助引物R06(SEQ ID NO:22)，全长19bp，其5’端的第1至第9个碱基，为辅助结合区(x)，与反向引物R6(SEQ ID NO:21)的辅助结合区(x)序列相同；其5’端的第9位碱基G与第10位碱基T之间是扩增阻滞位点(C)，修饰C3 Spacer；其5’端的第10至第19个碱基为序列h6，与检测探针(P1)的检测序列结合域H6序列相同。

所述反向引物R6’(SEQ ID NO:23)为针对HPV 58型靶序列设计的特异性引物，R6’全长35bp，其3’端第1至第22个碱基为靶序列结合区；其5’端的第1至第10个碱基，为序列h6，与检测探针(P1)的检测序列结合域H63序列相同。

当对病原靶标进行特异性扩增时，正向引物(F1/F5/F6)、反向引物(R1/R5/R6)和反向辅助引物(R01/R05/R06)分别扩增靶核酸得到59型/31型/58型的双链预扩增产物(S3)，其5’端到3’端依次是探针锚定区(A)，靶序列，序列h的反向互补序列(h’)，59型/31型/58型对应的h’分别不同。检测探针(P1)的5’端(A’)和3’端(H)可以与单链预扩增子(S3)的5’(A)端和3’端(h’)互补配对，且单链预扩增子(S3)的3’端(h’)可以以检测探针(P1)为模板，继续延伸到检测探针(P1)的5’端，得到检测探针(P1)的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团此时由于单链到双链的拉伸变化使得距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在扩增结束后进行熔解曲线分析，检测探针(P1)的二次扩增双链产物在适当的的熔解温度(Tm)下解链，不同的h’以检测探针(P1)为模板，继续延伸时产生的扩增子长度不同，因此会在不同熔解温度(Tm)下解链。解链时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P1)再次放生荧光共振能量转移，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。

当体系内没有反向辅助引物R0时，对病原靶标进行特异性扩增时，正向引物(F1/F5/F6)和反向引物(R1’/R5’/R6’)扩增靶核酸得到双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是探针锚定区(A)，靶序列，序列h的反向互补序列(h’)。检测探针(P1)的5’端(A’)和3’端(H)可以与单链预扩增子(S1)的5’端(A)和3’端(h’)互补配对，且单链预扩增子(S1)的3’端可以以检测探针(P1)为模板，继续延伸到检测探针(P1)的5’端，得到检测探针(P1)的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团此时由于单链到双链的拉伸变化使得距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在扩增结束后进行熔解曲线分析，检测探针(P1)的二次扩增双链产物在适当的的熔解温度(Tm)下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P1)将变为单链状态，再次放生荧光共振能量转移，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。

反应体系配制：按照表6和表7进行反应体系配制，分别配制无反向辅助引物R0体系及有反向辅助引物R0体系。

表6无R0的多重反应体系

表7有R0的多重反应体系

样本制备：

人乳头瘤病毒HPV 59/31/58型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R1/R5/R6)及反向辅助引物(R01/R05/R06)对人乳头瘤病毒HPV 59/31/58型进行检测，或者直接用带有信号检测区域序列的反向引物(R1’/R5’/R6’)对人乳头瘤病毒HPV 59/31/58型进行检测，对比后者消除引物二聚体的能力。使用超纯水或1×TE Buffer作为无模板对照(NTC)。

PCR扩增及熔解曲线分析：

将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；55-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.2℃，采光。

数据分析：

图3显示，在无反向辅助引物R0存在下，NTC反应在73℃左右出现大量非特异性熔解峰，是引物二聚体导致。

图4显示，添加反向辅助引物R0后，NTC反应无非特异性熔解峰。

图5显示，在无反向辅助引物R0存在下，HPV 59型在73℃出现特异性熔解峰；HPV31型不仅在79℃出现特异性熔解峰，在73℃出现非特异性熔解峰；HPV58型不仅在82.6℃出现特异性熔解峰，也在73℃出现非特异性熔解峰。

图6显示，添加反向辅助引物R0后，HPV 59型、31型、58型仅分别在73℃、79℃、82.6℃出现特异性熔解峰，无非特异性杂峰。

Claims (18)

1.用于PCR检测靶序列的组合物，所述组合物包括检测探针和引物组，所述引物组包含第一引物，第二引物和辅助引物，

所述检测探针包括第一结合区A’,检测序列结合区H和检测基团，

所述第一引物或第二引物包含与所述检测探针的第一结合区A’部分或全部互补的序列A，

所述第一引物或第二引物包含辅助结合区X，和与所述检测探针的检测序列结合区H部分或全部相同的序列h1，

所述辅助引物包含与所述辅助结合区X部分或全部相同的序列x，与所述h1的互补序列相结合并延伸的序列h2，和阻断区，

所述第一结合区A’，检测序列结合区H，序列A和序列h1不与靶序列或其任意片段互补或相同，

所述辅助结合区X不与所述检测探针或其任意片段相同。

2.根据权利要求1的组合物，所述辅助引物上的阻断区位于序列h2的上游，和/或位于序列x的下游。

3.根据权利要求1的组合物，所述第一引物和第二引物还分别包含与靶序列相结合的靶序列结合区，并且所述检测探针不包含与所述靶序列互补或相同的序列。

4.根据权利要求1的组合物，所述检测探针还包含阻断区，如果所述检测探针与检测序列的结合位点在所述阻断区的下游，所述阻断区阻断检测序列的继续延伸，

优选地，所述检测探针还包含3’末端的第二阻断区，所述第二阻断区阻止检测探针3’端的延伸。

5.根据权利要求1的组合物，所述组合物包含针对n条靶序列的n组引物组和m条检测探针，其中1≤n≤20，1≤m≤n，

优选地，所述每个检测探针上包含与至少两种检测序列或其部分互补的检测序列结合区，所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域；

优选地，所述组合物包含针对n条靶序列的n组引物组和1条检测探针，所述检测序列结合区包含针对n种检测序列的≥n个检测序列结合域，

其中各检测序列结合域以直接连接的形式排列，以连接序列连接的形式排列，或以存在部分或全部重叠的形式排列。

6.根据权利要求1的组合物，所述第一引物或第二引物从5’端至3’端依次包括序列A和靶序列结合区，所述第一引物或第二引物从5’端至3’端依次包括辅助结合区X，序列h1和靶序列结合区。

7.根据权利要求1的组合物，所述第一引物为正向引物，

所述正向引物的长度为20-80个碱基，

所述正向引物的靶序列结合区的Tm值为40℃-80℃，优选50℃-80℃，

所述正向引物的靶序列结合区的GC含量为20％-80％，优选40％-80％，

所述正向引物的序列A的长度为5-65个碱基长度，优选5-35个碱基长度，

所述正向引物的序列A的Tm值为40℃-80℃，

所述正向引物的序列A的GC含量为30％-80％，优选40％-80％，

所述正向引物的序列A与靶序列结合区之间有0-20个碱基的间隔。

8.根据权利要求1的组合物，所述第二引物为反向引物，

所述反向引物的长度为20-80个碱基，

所述反向引物的靶序列结合区的Tm值为40℃-80℃，优选50℃-80℃，

所述反向引物的靶序列结合区的GC含量为20％-80％，优选40-80％，

所述反向引物的序列h1的长度为5-65个碱基，优选5-30个碱基，

所述反向引物的序列h1的Tm值为30℃-80℃，优选40℃-80℃，

所述反向引物的序列h1的GC含量为20％-80％，优选40％-80％，

所述反向引物的辅助结合区X的长度为5-75个碱基，优选5-40个碱基，

所述反向引物的辅助结合区X的Tm值为40℃-80℃，

所述反向引物的辅助结合区X的GC含量为40％-80％，

所述反向引物的序列h1与靶序列结合区之间有0-20个碱基间隔，

所述辅助引物的长度为15-80个碱基，

所述辅助引物的序列h2的长度为3-65个碱基，

所述辅助引物的序列h2的Tm值为30℃-80℃，优选40℃-80℃，

所述辅助引物的序列h2的GC含量为20％-80％，优选40％-80％，

所述辅助引物的序列x的长度为5-75个碱基,优选5-40个碱基，

所述辅助引物的序列x的Tm值为40℃-80℃,

所述辅助引物的序列x的GC含量为40％-80％。

9.根据权利要求1的组合物，所述检测探针的长度为15-800个碱基长度，优选15-600个碱基长度，优选15-400个碱基长度，优选15-160个碱基长度，优选25-100个碱基长度，

所述检测探针的检测序列结合区H的长度为10-500个碱基长度，优选10-400个碱基长度，优选10-100个碱基长度，

所述检测探针的第一结合区A’的长度为5-65个碱基长度，或5-35个碱基长度，

所述第一结合区A’的Tm值为30℃-80℃，优选为40℃-80℃，

所述第一结合区A’的GC含量为30％-80％，优选为40％-80％，

所述检测序列结合域的长度为5-65个碱基长度，

所述检测序列结合域的Tm值为30℃-80℃，优选为40℃-80℃，

所述检测序列结合域的GC含量为20％-80％，优选为40％-80％，

所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，所述第一检测基团与所述第二检测基团间隔3-240埃，优选3-140埃，

优选地，所述第一检测基团和第二检测基团均位于第一结合区A'上，或均位于检测序列结合区H上，或分别位于第一结合区A'和检测序列结合区H上，

优选地，所述检测基团包括报告基团和淬灭基团。

10.根据权利要求6的组合物，所述检测探针包括：

一个检测序列结合区H和一个第一结合区A’；或

两个检测序列结合区H和一个第一结合区A’，两个检测序列结合区H分别位于第一结合区A’的两侧；或

一个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，两个第一结合区A’分别位于检测序列结合区H的两侧；或

两个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，所述检测序列结合区H和第一结合区A’间隔排列。

11.反应体系，其包括权利要求1-10任一项的组合物。

12.检测试剂盒，其包括权利要求1-10任一项的组合物或权利要求11的反应体系。

13.检测方法，所述方法包括利用权利要求1-10任一项的组合物，权利要求11的反应体系或权利要求12的检测试剂盒进行PCR的步骤。

14.根据权利要求13的方法，所述方法包括：

(1)将所述第一引物与所述第二引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条第一单链预扩增产物包含序列A，靶序列，序列h1的反向互补序列h1’和辅助结合区X的反向互补序列X’；

(2)辅助引物结合到所述第一单链预扩增产物并延伸，产生一条第二单链预扩增产物，所述第二单链预扩增产物包含第一结合区A'，靶序列，序列h2，阻断区和序列x；

(3)第一引物与所述第二单链预扩增产物结合并延伸，产生第三单链预扩增产物作为检测序列，所述第三单链预扩增产物包含序列A，靶序列，序列h2的反向互补序列h2’；以及

(4)所述检测探针的5’端的第一结合区A’与所述第三单链预扩增产物的5’端的序列A结合，所述检测探针3’端的检测序列结合区H上的检测序列结合域与所述第三单链预扩增产物3’端的序列h2’结合，并以检测探针作为模板继续延伸大于等于0个碱基到检测探针的5’端或阻断区，得到检测探针的部分或全部反向互补序列作为检测探针与检测序列的扩增产物。

15.根据权利要求13的方法，其中通过荧光通道和/或熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定；

优选地，通过荧光通道和熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。

16.权利要求1-10任一项的探针引物组，权利要求11的反应体系，权利要求12的检测试剂盒或权利要求13-15任一项的检测方法在进行PCR检测中的应用。

17.权利要求16的应用，其是在进行单管超多重PCR或数字PCR检测中的应用。

18.权利要求1-10任一项的探针引物组，权利要求11的反应体系，权利要求12的检测试剂盒，或权利要求13-15任一项的检测方法在检测病原微生物，无创的出生缺陷筛查，单核苷酸多态性分析，甲基化分析，基因突变分析，或基因分型中的应用。