CN117866950A - 一种用于pcr检测的引物探针组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于PCR检测的引物探针组、试剂盒及其应用。本发明所述引物探针组可在单管反应中同时进行多重不分型检测，有效避免引物二聚体的产生和不平衡扩增。且利用所述引物探针进行多重PCR检测的方法荧光背景低、熔解温度可调整、包容性好、成本低、单管反应、操作简便、不容易造成污染、灵敏度高和适用范围广。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于PCR检测的引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如感染性疾病的诊断、基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。
目前在qPCR平台应用较多的引物探针设计方式主要为TaqMan水解探针法，其工作原理主要是利用了一条与能模板特异性结合且两端分别标记荧光基团(供体)和淬灭基团(受体)的寡核苷酸探针，同时在探针的上游和下游分别设计一条特异性PCR引物。在PCR反应开始之前，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，TaqMan探针一端的荧光基团发射的荧光信号被另一端的淬灭基团吸收，从而使得荧光信号不被仪器检测到；而PCR扩增开始后，TaqMan探针与模板特异性结合，当DNA聚合酶(Taq酶)在延伸到探针结合模板的位点时，其5-3’核酸外切酶活性会将TaqMan探针切断，使得探针上标记的荧光基团远离淬灭基团，不再形成FRET结构，因此荧光基团发射的信号能够被仪器检测到。但是在同一反应体系中，要实现多重靶标的PCR检测，需要设置多条标记不同波长的荧光基团的TaqMan水解探针，视检测仪器的荧光通道数量而定，最多只能实现4-6重不同靶标的检测。
为实现超多重的PCR检测，现有技术通常会将PCR检测技术与其它方法结合起来，例如PCR与杂交芯片结合，以不同的扩增产物长度进行多重靶标检测。如文献CN107090519A所公开的一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒的方法，利用了核酸分子杂交的原理，将针对各靶标的单链探针按特定顺序排列固定于基因芯片上，形成探针阵列，再将待测的多重PCR产物与其杂交，使得靶标扩增产物与芯片上的探针杂交并发出荧光信号。该方法虽然能同时检测20种呼吸道病原体，但是基因芯片制备工艺复杂，价格昂贵，不利于临床推广开展，而且过程繁琐，需要经过多个开盖、清洗的步骤，易造成污染导致结果出现假阳性。
又如文献CN103074450B所公开的一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法，利用了PCR扩增与毛细管电泳结合的方式，将PCR扩增产物取出并进行毛细管电泳分析，将获得的图谱与标准图谱对比从而判断腹泻致病菌的种类。该方法在使用PCR扩增检测设备以外，还需要使用毛细管电泳设备进行产物分析，使得检测成本大大增加，不利于临床推广使用。
因此，临床急需一种能够进行多重分子检测的方法，能够快速、简便、低成本地检测多种临床常见的靶标如细菌、病毒、基因突变等，使得包括基层医院在内的临床单位能够快速的开展常见靶标的检测，如病原微生物感染检测等，辅助其它检测和确诊手段，更快速的为临床提供诊断证据和用药方案，减少患者精神负担和经济负担，达到精准医疗的目的。
发明内容
本发明针对现有技术中在单管反应中检测并区分多种不同靶标物的方法的不足，提供了一种用于PCR检测的引物探针组、试剂盒及应用，利用所述引物探针组或包括至少2组所述引物探针组的引物探针组合物，可实现以下至少一种分析、检测：可在单管/单一反应体系中可进行熔解温度分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标物；还可进行荧光通道与熔解温度两个维度的分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标物；并使用不同的荧光通道，即可实现荧光通道数量与熔解温度特征之乘积的靶标物种类检测。进一步地，本发明还解决了不分型检测过程中因目的基因浓度不同而带来的扩增失衡，实现均衡扩增的目的。此外，本发明还可有效避免扩增过程中引物二聚体(dimer)的产生。
为此，本发明第一方面提供了一种用于PCR检测的引物探针组，其特征在于，其包括1种探针(P)、至少1种第一引物和至少2种第二引物；
所述第一引物包含靶标序列结合区1，所述靶标序列结合区1为能够与靶标序列特异性配对结合的序列；
所述探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列，其包括探针信号检测区(H)；所述探针(P)上修饰有检测基团；
所述至少2种第二引物彼此不同，各自独立地包含引物信号检测区(h)和靶标序列结合区2；其中，不同的所述第二引物中的靶序列结合区2为与不同靶标序列特异性配对结合的序列，不同的所述第二引物中的引物信号检测区(h)均为一段不与任何靶标序列配对结合，且与探针(P)的探针信号检测区(H)具有部分或全部相同的序列；不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同；
所述第一引物和第二引物分别与靶标特异性结合后产生预扩增产物，所述预扩增产物中含有一条具有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的单链预扩增产物，所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸≥0个碱基后形成双链产物，所述双链产物的形成引起探针信号变化；
不同的所述第二引物所形成的不同单链预扩增产物，与探针(P)结合后形成的不同双链产物的Tm值相近。
本发明中，Tm值为熔解温度。
本发明中，所述第一引物为正向引物(F)，所述第二引物为反向引物(R)；或
所述第一引物为反向引物(R)，所述第二引物为正向引物(F)。
本发明中，所述引物探针组中第一引物种类数小于等于第二引物种类数。
本发明中，所述第二引物的种类数决定所述引物探针组可检测的靶标种数。
本发明中，与探针(P)所形成的双链产物的Tm值相近是指不同单链预扩增产物与探针(P)所形成的双链产物的Tm值相差0～4℃，优选地，相差0～2℃，更优选地，相差0～1℃。
本发明中，“不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同”指的是不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列的碱基不同和/或长度不同，和/或，不同引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(P)的探针信号检测区(H)反向互补的位置不同。
调整所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列的碱基和/或长度，和/或，调整引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(P)的探针信号检测区(H)反向互补的位置，使得含有不同引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的不同单链预扩增产物与探针(P)结合形成不同的双链产物。每种第二引物的引物信号检测区(h)不能与其他第二引物的引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)形成完全的互补序列，减少了引物之间的竞争。
本发明可以通过调整第二引物的引物信号检测区(h)的序列和长度，和/或，调整引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(P)的探针信号检测区(H)反向互补的位置后，进而调整与探针(P)形成的双链产物的Tm值，进而使得与探针(P)所形成的不同双链产物的Tm值相近。
在本发明的一些实施方式中，所述第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列；
优选地，所述探针(P)还包括引物锚定区(A’)；所述引物锚定区(A’)为与所述第一引物的探针锚定区(A)互补的序列。
本发明中，所述引物锚定区(A’)起锚定作用，更有利于探针信号检测区(H)与探针信号检测区(H)结合。
所述“引物锚定区(A’)与第一引物的探针锚定区(A)互补”，是指两者可以正向互补，也可以反向互补，只要能互补配对即可。
所述“所述第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1”，是指探针锚定区(A)相对于靶标序列结合区1更靠近5’端，靶标序列结合区1相对于探针锚定区(A)更靠近3’端；5’端和探针锚定区(A)之间，和/或，探针锚定区(A)和靶标序列结合区1之间，和/或，靶标序列结合区1和3’端可以有碱基间隔，也可以没有。
在本发明的一些具体实施方式中，所述预扩增产物中含有一条从5’端至3’端依次包含所述探针锚定区(A)和所述引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的单链预扩增产物。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一引物包括：靶标序列结合区1，不包含探针锚定区(A)；所述探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列，其包括探针信号检测区(H)；不包括引物锚定区(A’)。
本发明的一些实施方式中，所述探针信号检测区(H)可以设计在探针(P)的5’端，也可以设计在探针(P)的3’端。
在本发明的一些实施方式中，所述探针(P)为1)～4)中的任意一种的结构；
1)所述探针(P)包括一个引物锚定区(A’)和一个探针信号检测区(H)；
2)所述探针(P)包括一个探针信号检测区(H)和两个引物锚定区(A’)，两个引物锚定区(A’)分别位于探针信号检测区(H)的两侧，两个引物锚定区(A’)的序列不同；
3)所述探针(P)包括一个引物锚定区(A’)和两个探针信号检测区(H)两个探针信号检测区(H)分别位于引物锚定区(A’)的两侧，两个探针信号检测区(H)的序列不同；
4)所述探针(P)包括两个引物锚定区(A’)和两个探针信号检测区(H)，所述引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)间隔排列，两个引物锚定区(A’)的序列不同，两个探针信号检测区(H)的序列不同。
优选地，所述探针(P)为结构3)。
在本发明中，探针(P)上引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)的关系包括如下：
①只含有探针信号检测区(H)，不含引物锚定区(A’)；对应地，上游引物(F)不含有探针锚定区(A)；
②含有1个探针信号检测区(H)和1个引物锚定区(A’)：二者的位置关系可以互换(A’-H或H-A’)，两者之间可以有碱基间隔，也可以没有；
③2个探针信号检测区(H)和1个引物锚定区(A’)：探针信号检测区(H)分布在引物锚定区(A’)的两边(A’-H-A’)；探针信号检测区(H)和1个引物锚定区(A’)之间可以有碱基间隔，也可以没有；
④2个引物锚定区(A’)和2个探针信号检测区(H)，所述引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)间隔排列(H-A’-H-A’或A’-H-A’-H)；探针信号检测区(H)和引物锚定区(A’)之间可以有碱基间隔，也可以没有。
在本发明的一些实施方式中，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化；优选地，所述第一检测基团与所述第二检测基团之间间隔3-250埃；优选地，间隔3-201埃；更优选地，间隔3-140埃；
和/或，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。
本发明中，所述第一检测基团和第二检测基团在探针上的位置，使得单链预扩增产物的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸≥0个碱基后形成后形成双链产物，只要该双链产物的形成，能够导致所述第一检测基团与第二检测基团的位置发生变化，即可引起探针产生可检测的信号变化。所述第一检测基团和所述第二检测基团的位置可以互换。针对不同情况可以对第一检测基团和第二检测基团在探针上的位置作不同限定以实现降低荧光背景的效果。例如：所述探针(P)从5’端至3’端依次包含引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)，所述探针(P)上的第一检测基团和第二检测基团在探针上的位置可以分别修饰在引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)之间。
在本发明的一些具体实施方式中，所述引物探针中的探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，所述探针(P)从5’端至3’端依次包含引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)；所述引物锚定区(A’)的序列与第一引物的探针锚定区(A)序列互补；在与第一检测基团间隔3-140埃的碱基位置修饰第二检测基团，其中所述第一检测基团可以为荧光报告基团，所述第二检测基团可以为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的修饰基团。
在本发明的一些具体实施方式中，所述引物探针中的探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，所述探针(P)从5’端至3’端依次包含探针信号检测区(H)和引物锚定区(A’)；所述引物锚定区(A’)的序列与第一引物的探针锚定区(A)序列互补；在与第一检测基团间隔3-140埃的碱基位置修饰第二检测基团，其中所述第一检测基团可以为荧光报告基团，所述第二检测基团可以为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的修饰基团。
在本发明的一些具体实施方式中，所述引物探针中的探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，所述探针(P)包括引物锚定区(A’)和2种探针信号检测区(H)；所述探针(P)从5’端至3’端依次包含探针信号检测区(H1)、引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H2)；所述引物锚定区(A’)的序列与第一引物的探针锚定区(A)序列互补；在与第一检测基团间隔3-140埃的碱基位置修饰第二检测基团，其中所述第一检测基团可以为荧光报告基团，所述第二检测基团可以为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的修饰基团。
本发明中，利用上述探针(P)对待测样本进行PCR检测的原理如下：使得2条单链预扩增产物的反向互补序列(h’)分别与探针(P)特异性结合后延伸≥0个碱基后分别形成双链产物，该双链产物的形成引起探针产生可检测的信号变化，可以实现多种不同靶标物检测，同时，可以实现减少了荧光探针的数量，大大降低了试剂成本。在本发明的一些实施方式中，所述探针(P)的3’端含有阻断区域。
本发明中，所述阻断区域(blocking region)具有防止探针(P)作为引物发生延伸的作用效果，用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。阻断区域，可以是3'OH以3'-Spacer C3、3'-Phosphat、3'-ddC、3'-Inverted End等进行修饰，使其3'OH被封闭，从而阻止其延伸反应。阻断区域，也可以为聚合酶酶阻断基团，具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一些实施方案中，阻断基团选自乙酰基、CH3、甘氨酰基、亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一些实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。
在本发明的一些实施方式中，至少1种所述第二引物的5’端含有延伸阻滞区(M)；
优选地，所述预扩增产物中含有一条具有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)和延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)的单链预扩增产物；所述延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)为不与探针(P)任意部分互补的序列。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列；所述探针锚定区(A)和所述靶标序列结合区1之间可以有碱基间隔，也可以没有；
所述探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列，其包括引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)；所述引物锚定区(A’)为与第一引物的探针锚定区(A)互补的序列；所述引物锚定区(A’)和所述探针信号检测区(H)之间可以有碱基间隔，也可以没有；
至少1种所述第二引物中从5’端至3’端依次包含延伸阻滞区(M)、引物信号检测区(h)和靶序列结合区2；所述延伸阻滞区(M)和引物信号检测区(h)之间、所述引物信号检测区(h)和所述靶序列结合区2之间可以有碱基间隔，也可以没有；
所述预扩增产物中含有一条从5’端至3’端依次包含所述探针锚定区(A)、靶序列、所述具有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)和所述延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)。
本发明中，所述第二引物的5’端不含有延伸阻滞区(M)时，得到的所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸≥0个碱基形成双链产物；
具体地，所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合不在探针(P)的5’末端，则特异性结合并延伸至(P)的5’末端，即延伸＞0个碱基，形成双链产物；该双链产物为二次扩增双链产物；
所述第二引物的5’端不含有延伸阻滞区(M)且得到的所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合在探针(P)的5’末端，则特异性结合并延伸0个碱基，形成双链产物；即特异性结合后杂交形成双链产物，该双链产物为杂交双链产物。
本发明中，所述第二引物的5’端含有延伸阻滞区(M)时，因延伸阻滞区(M)作用，得到的所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸0个碱基形成双链产物；即特异性结合后杂交形成双链产物，该双链产物为杂交双链产物。
上述延伸＞0个碱基和延伸0个碱基的情况中，所述二次扩增双链产物和杂交双链产物的形成均引起探针信号变化，进而产生可检测的信号变化。在本发明的一些具体的实施方式中，所述第一引物的第一序列的长度为20～80个碱基，其中靶序列结合区1的Tm值为50℃～80℃，GC含量为40％～80％；探针锚定区(A)的长度为6-35个碱基，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第二引物的长度为20～80个碱基，其中靶序列结合区2的Tm值为50℃～80℃，GC含量40％～80％；引物信号检测区(h)的长度为5～65个碱基，Tm值为40℃～80℃，GC含量为40％～80％。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述探针(P)的长度为30～100个碱基，其中引物锚定区(A’)的长度为6～35个碱基，Tm值为40℃～80℃，GC含量为40％～80％；探针信号检测区(H)的长度为5～65个碱基，Tm值为40℃～80℃，GC含量为40％～80％
在本发明的一些具体的实施方式中，本发明所述第一引物的长度为20-80个碱基，其中靶序列结合区1的Tm值为40℃-80℃，GC含量20％-80％；探针锚定区(A)长度为6-35个碱基，Tm值为40℃-80℃，GC含量30％-80％。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第二引物的长度为20-80个碱基，其中延伸阻滞区(M)长度为0-20bp；靶序列结合区2的Tm值为40℃-80℃，GC含量20％-80％；引物信号检测区(h)长度为5-65个碱基，Tm值为30℃-80℃，GC含量20％-80％。
在本发明的一些具体实施方式中，所述探针(P)的长度为20-100个碱基，其中引物锚定区(A’)长度为6-35个碱基，Tm值为40℃-80℃，GC含量30％-80％；更优选的，引物锚定区(A’)设计在探针(P)的5’端；探针信号检测区(H)长度为5-65个碱基，Tm值为30℃-80℃，GC含量20％-80％。
在本发明的一些实施方式中，所述第一引物中所述探针锚定区(A)与靶序列结合区1之间有0～20个碱基间隔；
在本发明的另一些实施方式中，所述第二引物中所述引物信号检测区(h)和靶序列结合区2之间有0～20个碱基间隔。
在本发明的一些具体实施方式中，所述引物探针组中的第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述靶标序列结合区1为能够与靶标序列特异性配对结合的序列，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，且其与探针(P)的引物锚定区(A’)的6-35个碱基具有互补的序列；所述探针锚定区(A)与所述靶标序列结合区1之间可以有0～20个碱基间隔。
在本发明的一些具体实施方式中，不同的所述第二引物中各自独立地包含从5’端至3’端依次包含延伸阻滞区(M)、引物信号检测区(h)和靶标序列结合区2，其中所述靶标序列结合区2为能够与靶标序列特异性配对结合的序列；不同的所述第二引物中的引物信号检测区(h)均为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，其与所述探针(P)的探针信号检测区(H)具有部分或全部相同的序列；不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同；所述引物信号检测区(h)与靶标序列结合区2之间可以有0～20个碱基间隔。
在本发明的一些优选的具体实施方式中，所述引物探针组包括：
1种第一引物，第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述靶标序列结合区1为能够与靶标序列特异性配对结合的序列，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，且其与探针(P)的引物锚定区(A’)的6-35个碱基具有反向互补的序列；所述探针锚定区(A)与所述靶标序列结合区1之间可以有0～20个碱基间隔；
1种探针(P)，所述引物探针中的探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，所述探针(P)从5’端至3’端依次包含引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)；所述引物锚定区(A’)的序列与第一引物的探针锚定区(A)序列互补；在与第一检测基团间隔3-140埃的碱基位置修饰第二检测基团，其中所述第一检测基团可以为荧光报告基团，所述第二检测基团可以为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的修饰基团；
3种第二引物，不同的所述第二引物中各自独立地包含从5’端至3’端依次包含引物信号检测区(h)和靶标序列结合区2，其中所述靶标序列结合区2为能够与靶标序列特异性配对结合的序列；不同的所述第二引物中的引物信号检测区(h)均为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，其与所述探针(P)的探针信号检测区(H)具有部分或全部相同的序列；不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同；所述引物信号检测区(h)与靶标序列结合区2之间可以有0～20个碱基间隔；
所述预扩增产物中含有一条从5’端到3’端依次是探针锚定区(A)、靶序列和引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的单链预扩增产物，所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合不在探针(P)的5’末端。
本发明中，利用上述引物探针对待测样本进行PCR检测的原理如下：
在PCR扩增时，引物探针中的第一引物与第二引物分别与靶序列特异性结合并扩增产生双链扩增产物，其中一条单链扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是探针锚定区(A)、靶序列和引物信号检测区(h)的反向互补区(h’)。
产生双链扩增产物后，探针(P)的探针信号检测区(H)与其中一条单链扩增产物(S1)3’端的引物信号检测区的反向互补序列(h’)互补配对，探针(P)的引物锚定区(A’)与其中一条单链扩增产物(S1)5’端的探针锚定区(A)互补配对，其中一条单链扩增产物(S1)的3’端可继续延伸，得到探针(P)的部分或全部反向互补序列，即完成以其中一条单链扩增产物(S1)为引物，以探针(P)为模板的扩增，得到与探针(P)形成的二次扩增双链产物。此时由探针(P)和其中一条单链预扩增产物(S1)形成部分或全部双链状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。
待PCR扩增结束后，升温，在温度变化的过程中，与探针(P)形成的二次扩增双链产物将在一定温度下解链，使得检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。仪器检测到的信号随温度变化呈现一条熔解曲线，当所述熔解曲线出峰位置的Tm值在待测样本中靶标物在特定检测通道的特征Tm值的范围内时，表明所述待测样本中含有靶标物；所述特定检测通道为所述探针(P)上的所述第一检测基团所对应的荧光通道，所述特征Tm值为探针(P)所形成的二次扩增双链产物的Tm值(探针(P)所形成的二次扩增双链产物的熔解温度)。
在本发明的另一些优选的具体实施方式中，所述引物探针组包括：
1种第一引物，第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述靶标序列结合区1为能够与靶标序列特异性配对结合的序列，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，且其与探针(P)的引物锚定区(A’)的6-35个碱基具有反向互补的序列；所述探针锚定区(A)与所述靶标序列结合区1之间可以有0～20个碱基间隔；
1种探针(P)，所述引物探针中的探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，所述探针(P)从5’端至3’端依次包含引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)；所述引物锚定区(A’)的序列与第一引物的探针锚定区(A)序列互补；在与第一检测基团间隔3-140埃的碱基位置修饰第二检测基团，其中所述第一检测基团可以为荧光报告基团，所述第二检测基团可以为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的修饰基团；
3种第二引物；不同的所述第二引物中各自独立地包含从5’端至3’端依次包含延伸阻滞区(M)、引物信号检测区(h)和靶标序列结合区2，其中所述靶标序列结合区2为能够与靶标序列特异性配对结合的序列；不同的所述第二引物中的引物信号检测区(h)均为一段不与任何靶标序列配对结合的自由设计序列，其与所述探针(P)的探针信号检测区(H)具有部分或全部相同的序列；不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同；所述引物信号检测区(h)与靶标序列结合区2之间可以有0～20个碱基间隔；
所述预扩增产物中含有一条从5’端到3’端依次是探针锚定区(A)、靶序列、引物信号检测区的反向互补序列(h’)和延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)的单链预扩增产物；所述延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)为不与探针(P)任意部分互补的序列。
本发明中，利用上述引物探针对待测样本进行PCR检测的原理如下：
在PCR扩增时，引物探针中的第一引物与第二引物分别与靶序列特异性结合并扩增产生双链扩增产物，其中一条单链扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是探针锚定区(A)、靶序列、引物信号检测区(h)的反向互补区(h’)和延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)。
产生双链扩增产物后，探针(P)的探针信号检测区(H)与其中一条单链扩增产物(S1)3’端的引物信号检测区的反向互补序列(h’)互补配对，探针(P)的引物锚定区(A’)与其中一条单链扩增产物(S1)5’端的探针锚定区(A)互补配对，其中一条单链单链预扩增产物(S1)中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸0个碱基形成双链产物，得到探针(P)的部分或全部反向互补序列，即完成以其中一条单链扩增产物(S1)为引物，以探针(P)为模板的杂交，得到与探针(P)形成的杂交双链产物。此时由探针(P)和其中一条单链预扩增产物(S1)形成部分或全部双链状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。
待PCR扩增结束后，升温，在温度变化的过程中，与探针(P)形成的杂交双链产物将在一定温度下解链，使得检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。仪器检测到的信号随温度变化呈现一条熔解曲线，当所述熔解曲线出峰位置的Tm值在待测样本中靶标物在特定检测通道的特征Tm值的范围内时，表明所述待测样本中含有靶标物；所述特定检测通道为所述探针(P)上的所述第一检测基团所对应的荧光通道，所述特征Tm值为探针(P)形成的杂交双链产物的Tm值(探针(P)形成的杂交双链产物的熔解温度)。
值得注意的是：本发明中的所述第一引物和第二引物的序列结构可以互换。例如，第一引物包含引物信号检测区(h)和靶标序列结合区，第二引物包含靶标序列结合区；或者，第一引物包含引物信号检测区(h)和靶标序列结合区，第二引物包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区；第一引物包含延伸阻滞区(M)、引物信号检测区(h)和靶标序列结合区，第二引物包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区。
在本发明的一些实施方式中，所述引物信号检测区(h)的Tm值同时小于第一引物中靶标序列结合区1的Tm值和第二引物中靶标序列结合区2的Tm值。
在本发明的另一些实施方式中，所述引物锚定区(A’)的Tm值大于所述引物信号检测区(h)的Tm值。
本发明中，通过将引物信号检测区(h)的Tm值以及引物锚定区(A’)的Tm值限定在上述范围内可以有效避免扩增过程中引物二聚体(dimer)的产生。
值得注意的是：即使扩增过程中产生dimer，也可以通过熔解曲线对dimer的信号进行区分，在更高的溶解温度下进行信号采集，则会采集不到dimer的信号。采用的具体方式是：单链预扩增产物的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合后并延伸≥0个碱基形成的双链产物产生的信号变化不同；所述“信号变化不同”，是指信号强弱不同和/或熔解温度不同。
本发明第二方面提供了上述用于PCR检测的引物探针组在制备用于多种不同靶标物检测的试剂中的应用。
本发明中，第二方面应用的具体内容见下述第三、第六、第七和第八方面。
本发明第三方面提供了一种用于PCR检测的试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的用于PCR检测的引物探针组；优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；更进一步优选地，当所述核酸模板为RNA时，所述扩增试剂还包括逆转录酶。
本发明第四方面提供了一种用于PCR检测的引物探针组合物，其包括至少1组上述的引物探针组。
在本发明的一些实施方式中，至少两个不同组的所述引物探针组共用1条探针(P)，不同组第二引物所形成的不同单链预扩增产物与探针(P)结合并延伸≥0个碱基后形成的不同双链产物的Tm值不相近，实现将不同组区分开。
在本发明的一些实施方式中，至少两个不同组的引物探针组的探针(P)不同，所述不同组的探针(P)序列不同；在某些实施例中，，不同组的所述探针(P)的序列和检测基团均不同。
在本发明中，至少两个不同组的引物探针组的探针(P)不同时，两组探针的序列不同，不同探针(P)形成的不同双链产物的Tm值不相近，实现将不同组区分开。Tm值不相近是指Tm值相差＞4℃。某些实施例中，某一组的探针(P)不会形成双链，即没有相应的Tm值，而某另一组的探针(P)可以形成双链，具有相应的Tm值，但这两组探针也属于“Tm值不相近”的情况。
在本发明中，至少两个不同组的引物探针组的探针(P)不同时，两组探针的序列和检测基团均不同，不同组的所述探针(P)的检测基团不同通过荧光通道将不同组区分开，也可以通过形成的双链产物的Tm值不相近(Tm值相差＞4℃)，进行区分开。
在本发明的一些实施方式中，不同组的所述第一引物中各自独立地包含与不同靶标序列特异性配对结合的靶标序列结合区1；
不同组的所述第二引物中各自独立地包含与不同靶标序列特异性配对结合的靶标序列结合区2。
优选地，不同组的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同。
本发明中，不同组第一引物的探针锚定区(A)可以相同，也可以不同。当不同组第一引物的探针锚定区(A)不同时，调整第一引物的探针锚定区(A)的序列和/或长度，和/或，调整不同第二引物的引物信号检测区(h)的序列和/或长度，和/或，调整探针锚定区(A)与探针(P)的引物锚定区(A’)互补的位置，和/或，引物信号检测区的反向互补序列(h’)与探针(P)的探针信号检测区(H)反向互补的位置，使得(后期)与不同组探针(P)形成的双链产物的熔解温度曲线能够彼此分开。
在本发明的一些实施方式中，不同组的探针(P)各自独立地选自1)～4)中的任意一种。
本发明第五方面上述用于PCR检测的引物探针组合物在制备用于多种不同靶标物检测的试剂中的应用。
本发明中，第二方面和第五方面的应用中多种不同靶标物为至少2种靶标物。
本发明中，第二方面和第五方面的应用中所述试剂为试剂盒。
本发明中，第五方面的应用的具体内容见下述第六、第七和第八方面。
本发明第六方面提供了一种用于PCR检测的试剂盒，其包括如本发明第三方面所述的用于PCR检测的引物探针组合物；优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；更进一步优选地，当所述核酸模板为RNA时，所述扩增试剂还包括逆转录酶。
在本发明的一些具体实施方式中，上述第三方面和第六方面用于PCR检测的试剂盒为用于PCR检测EGFR 19del(EGFR基因第19号外显子上发生的缺失激活突变)的试剂盒。
在本发明的一些具体实施方式中，上述第三方面和第六方面用于PCR检测的试剂盒为用于PCR检测EGFR 20ins(EGFR基因第20号外显子上发生的插入激活突变)的试剂盒。
本发明中，所述扩增试剂还可以包括一些促进PCR反应的试剂，例如KCl、MgCl2、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、(NH4)2SO4等。
本发明第七方面提供了一种利用如本发明第三方面或第六方面所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测的方法，其包括如下步骤：
S1，将第一引物、第二引物和探针(P)混合后形成引物探针预混液；
S2，将所述引物探针预混液与扩增试剂、待测样本混合，获得反应体系；
S3，对所述反应体系进行PCR扩增；
S4，分析是否有靶标物。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4包括如下步骤：
S4-1，获得步骤S3中PCR扩增所产生的信号变化，并根据信号变化判断待测样本中是否有靶标物；和/或
S4-2，对步骤S3中PCR扩增后的产物进行升温，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物。
上述PCR检测方法为荧光PCR的检测方法。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中获得的所述反应体系中所述第一引物的浓度为30nM-1000nM，所述第二引物的浓度为30nM-500nM，所述探针(P)的浓度为150nM-1200nM。
在本发明的一些实施方式中，核酸模板来自于血清样本、血浆样本、全血样本、痰液样本、拭子样本、灌洗液样本、新鲜组织样本、福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，当所述核酸模板为DNA时，所述PCR扩增的程序如下：
90℃～96℃预变性1～15分钟；90℃～95℃变性10～900秒，30℃～75℃退火及延伸10～600秒，1～50个循环；
优选地，所述PCR扩增的程序如下：90℃～96℃预变性1～15分钟；90℃～95℃变性10～60秒，50℃～75℃退火延伸15～90秒，35～50个循环；
某些实施例中，所述PCR扩增的程序如下：90℃-96℃预变性1-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环；90℃-95℃变性10-600秒，30℃-55℃恒温孵育10-600秒，1-50个循环。
本发明的一些实施方式中，步骤S3中，当所述核酸模板为RNA时，所述PCR扩增的程序如下：
50～60℃逆转录5～15分钟；90℃～96℃预变性2～15分钟；90℃～95℃变性10～60秒，50℃～75℃退火及延伸30～90秒，35～50个循环。
本发明的一些实施方式中，步骤S3中，当所述核酸模板为RNA时，所述PCR扩增的程序如下：
50～60℃逆转录5～15分钟；90℃～96℃预变性2～15分钟；90℃～95℃变性10～60秒，50℃～75℃退火及延伸30～90秒，35～50个循环；90℃～95℃变性10～600秒，30℃～55℃退火及延伸10～600秒，1～20个循环。
在本发明的一些具体实施方式中，步骤S3中，当所述核酸模板为RNA时，所述PCR扩增的程序如下：55℃逆转录15分钟；95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火及延伸30秒，共进行45个循环；94℃变性150秒，40℃退火及延伸300秒，1个循环。
在本发明的一些具体实施方式中，所述步骤S3包括如下步骤：
S3-1，将反应体系随机分配到500个以上的反应单元中，每个反应单元含有1个待测样本的靶标或不含有待测样本的靶标；和/或，
S3-2，对所有反应单元进行PCR扩增；
所述步骤S4包括如下步骤：
S4，获得步骤S3中PCR扩增后的每个反应单元的信号情况，并根据信号的有无判断是否有靶标物。
上述PCR检测方法为数字PCR的检测方法。
本发明第八方面提供了一种利用如本发明第三方面或第六方面所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测的方法，其包括如下步骤：
将所述第一引物和第二引物分别与靶标特异性结合，扩增后产生预扩增产物，所述预扩增产物中含有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)；
将所述引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸≥0个碱基后形成双链产物；
所述双链产物的形成引起探针产生可检测的信号变化，并根据信号变化判断待测样本中是否有靶标物；和/或
将所述双链产物进行升温，所述双链产物的解链引起探针产生可检测的信号变化，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物。
将增双链产物进行熔解曲线分析并判断待测样本中是否含有靶标物。
本发明将所述双链产物进行升温是指，将将所述双链产物温度进行升温升高至大于双链产物的Tm值。
在本发明的一些实施方式中，升温速率为0.05℃/s，35-95℃条件下采集荧光信号，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物；
在本发明的一些具体实施方式中，所述升温的速率为0.05℃/s，40-90℃条件下采集荧光信号，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物；优选地，所述升温的速率为0.05℃/s，将温度从40℃逐渐升温至90℃，升温过程实时采集荧光信号，升温结束后获得一条熔解曲线，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物；
在本发明的另一些具体实施方式中，所述升温的速率为0.05℃/s，56-90℃条件下采集荧光信号，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物；优选地，升温的速率为0.05℃/s，将温度从56℃逐渐升温至90℃，升温过程实时采集荧光信号，升温结束后获得一条熔解曲线，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物。
优选地，所述信号变化是指荧光信号的变化。例如，信号变化最大的温度在待测样本中靶标物在特定检测通道的探针(P)所形成的双链产物的Tm值的范围内时，表明所述待测样本中含有靶标物。
上述特定检测通道为所述探针(P)上的所述检测基团所对应的荧光通道。
上述信号变化最大的温度为出峰位置的Tm值。
在本发明的一些实施方式中，当获得的所述熔解曲线出峰位置的Tm值在待测样本中靶标物在特定检测通道的探针(P)所形成的双链产物的Tm值的范围内时，表明所述待测样本中含有靶标物；优选地，所述特定检测通道为所述探针(P)上的所述第一检测基团所对应的荧光通道。
在本发明的一些实施方式中，在没有待测靶标存在时，探针(P)的引物锚定区(A’)与第一引物中的探针锚定区(A)互补，探针(P)的其他部分呈单链状态或其他二级结构，此时第一检测基团和第二检测基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高；而当待测靶标存在时，第一引物与第二引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链扩增产物，以其中一条单链扩增产物(S1)为引物，以探针(P)为模板的二次扩增，得到与探针(P)形成的双链产物，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在PCR结束后，进行熔解曲线分析时，在一定温度下，与探针(P)形成的双链产物发生解链，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离变短，荧光共振能量转移效率升高，使得荧光信号再次发生变化，可用于熔解曲线分析。当检测到的熔解曲线出峰位置的Tm值在待测样本中靶标物在特定检测通道的特征Tm值的范围内时，表明所述待测样本中含有靶标物；所述特定检测通道为所述探针(P)上的所述第一检测基团所对应的荧光通道，所述特征Tm值为探针(P)所形成的双链产物的Tm值。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样本选自血清样本、血浆样本、全血样本、痰液样本、拭子样本、灌洗液样本、新鲜组织样本和福尔马林固定石蜡包埋组织中的任意一种。
在本发明的一些具体实施方式中，所述方法进行PCR扩增时采用的仪器和试剂耗材可以为上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材。
在本发明的另一些具体实施方式中，本发明的检测结果可以选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
本发明中，所述靶标物可以选自腺病毒(Adenovirus，ADV)、乙型流感病毒(Influenza A virus，IBV)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)、2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)、甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)和非小细胞肺癌等中的至少一种。
本发明第七方面和第八方面提供的PCR检测的方法为非疾病的诊断或治疗方法。
本发明的有益效果为：
(1)实现多重检测：本发明所述引物探针组或包括至少2组所述引物探针组的引物探针组合物，可在单管/单一反应体系中可进行熔解温度分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标物；还可进行荧光通道与熔解温度两个维度的分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标物；并使用不同的荧光通道，即可实现荧光通道数量与熔解温度特征之乘积的靶标物种类检测；
(2)实现均衡扩增：本发明提供的引物探针组，通过调整引物信号检测区(h)的长度或序列，和/或调整引物信号检测区(h)与探针(P)的探针信号检测区(H)反向互补的位置，进而使得与探针(P)形成的双链产物的熔解温度相近，不仅可实现多重不分型的检测目的，而且解决不分型检测过程中因目的基因浓度不同而带来的扩增失衡，实现均衡扩增的目的；
(3)提高扩增效率：本发明提供的引物探针组合物，不同引物的引物信号检测区(h)不同，降低了多重检测过程中的竞争情况，从而解决了因竞争导致扩增效率降低的问题，实现了更高的扩增效率；
(4)荧光背景低：每个荧光通道可只使用1条探针，即可通过扩增产物的不同熔解温度进行区分，大大降低了PCR反应中的荧光背景，提高了反应灵敏度；
(5)包容性好：本发明所述引物探针与靶标序列有两部分反向互补配对，即第一引物和第二引物，相比Taqman水解探针法需要三部分与模板反向互补配对，在靶标序列存在较多高变异区时，如病毒或细菌基因组，本发明所述引物探针组的包容性更好，设计难度更低；
(6)成本低：本发明可实现在单管/单一反应体系中完成多重检测，无需借助额外的下游仪器辅助，也无需通过芯片或多个反应管分割反应，大大降低了仪器和耗材的成本，同时在试剂中减少了荧光探针的数量，大大降低了试剂成本，使得大规模推广成为可能；
(7)样本消耗少：本发明可实现加一次样本即完成多重检测，对样本的消耗少，特别适合用于稀有样本的检测，可以大大提高加入检测反应的样本浓度，提高检测灵敏度；
(8)操作简便且不容易造成污染：本发明所述方法在加样完成后即完全封闭，无需开盖进行后续检测，不仅操作简便，并且大大降低了对实验环境造成污染的可能性；
(9)灵敏度高：本发明所述方法对靶序列的长度要求非常低，当靶标类型是短片段核酸时，例如游离核酸时，更短的靶序列长度在检测中有更高的灵敏度；
(10)适用范围广：本发明所述方法可适用于多种样本类型的核酸检测，包括血清样本、血浆样本、全血样本、痰液样本、拭子样本、灌洗液样本、新鲜组织样本、福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1为实施例1的多重PCR反应在CY5通道中20ins阳性的熔解曲线；
图2为实施例2的多重PCR反应在ROX通道中19del阳性的熔解曲线；
图3为实施例3的多重PCR反应在CY5通道中20ins阳性的熔解曲线；
图4为对比例1的多重PCR反应在CY5通道中20ins阳性的熔解曲线。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：肺癌EGFR 20ins(EGFR基因第20号外显子上发生的插入激活突变)的多重不分型PCR检测
(1)用于PCR检测肺癌EGFR 20ins(EGFR基因第20号外显子上发生的插入激活突变)的引物探针组的碱基序列如表1所示。
表1：引物探针组的碱基序列
所述正向引物F1-1(SEQ ID NO:5)，为针对EGFR 20ins靶序列设计的特异性引物，F1-1全长35bp，其3’端第1至第18个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第15个碱基，与探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第32至46个碱基序列反向互补；
所述反向引物R1-1、R2-1、R2-1(SEQ ID：2、SEQ ID：3、SEQ ID：4)，皆为针对EGFR20ins靶序列设计的特异性引物，且靶序列结合区2序列是不完全一样的；R1-1全长32bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第8个碱基与探针P1-1(SEQ ID NO:1)的3’端的第1至8个碱基序列相同；R2-1全长35bp，其3’端第1至第24个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第8个碱基与探针P1-1(SEQ ID NO:1)的3’端第1至8个碱基序列不完全相同，R25’端第5个碱基为错配碱基；R3-1全长28bp，其3’端第1至第18个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第7个碱基与探针P1-1(SEQ ID NO:1)的3’端第2至8个碱基序列相同；
当对靶标进行特异性扩增时，正向引物(F)和反向引物(R)扩增靶核酸得到双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物(S1-1)的5’端到3’端依次是探针锚定区(A)，靶序列和引物信号检测区(h)的反向互补区(h’)；探针(P1-1)的引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)可以与单链预扩增产物(S1)的5’端和3’端互补配对，且单链预扩增产物(S1-1)的3’端可以以探针(P-1)为模板，继续延伸，得到探针(P)的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团的距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在扩增结束后进行熔解曲线分析，这些产物在相近的熔解温度下解链，此时探针(P-1)的第一检测基团与第二检测基团的距离变化，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。
(2)利用上述引物探针对肺癌EGFR 20ins(EGFR基因第20号外显子上发生的插入激活突变)进行多重不分型PCR检测。
检测时采用的反应体系，包括上述引物探针、模板、DNA聚合酶以及反应缓冲液，进行靶标的特异性扩增以及荧光信号检测。其反应体系包含下步骤：
首先在PCR扩增反应的循环内，正向引物(F)与反向引物(R)可以特异性的扩增靶核酸序列。扩增后，产生预扩增产物，预扩增产物的其中一条单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是探针锚定区(A)，靶序列，引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)。
产生预扩增产物后，探针(P)的探针信号检测区(H)与单链预扩增产物(S1-1)3’端的引物信号检测区的反向互补序列(h’)互补配对，探针引物锚定区(A’)与单链预扩增产物(S1-1)5’端的探针锚定区(A)反向互补配对，单链预扩增产物(S1-1)的3’端可继续延伸，得到探针(P1-1)的部分或全部反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1-1)为引物，以探针(P1-1)为模板的二次扩增，得到探针(P-1)的二次扩增双链产物。
在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，这些产物在相近的熔解温度下解链，此时探针(P1的)第一检测基团与第二检测基团的距离变化，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。
在本实施例中检测时采用如表2所示的检测体系。
表2：肺癌EGFR 20ins多重不分型PCR检测体系
其中，配合上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测，其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mMdNTP、70mM(NH4)2SO4。
样本制备：使用EGFR 20ins靶序列的质粒作为阳性样本,分别用带有不同的信号检测区域序列的反向引物(R)对EGFR 20ins靶序列进行单独检测，以验证单一型别的检测能力。使用纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，针对3种阳性样本分别按照表2中所述配比进行反应体系的配置；3种阳性样本分别为：V769-D770insASV阳性模板、D770-N771insSVD阳性模板和H773-V774insNPH阳性模板。针对不同的阳性样本，除了核酸模板不同外，其他成分及加入量均相同，且核酸模板的加入量相同。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性1分钟；94℃变性15秒，58℃退火延伸30秒，共进行50个循环，不采光；94℃变性15秒，40℃退火延伸15秒，共进行5个循环；40-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光(温度从40℃逐渐升温至90℃，升温过程实时采集荧光信号，升温结束后获得一条熔解曲线；所述升温的速率为0.05℃/s)。
数据分析：
所述试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图1为实施例1的多重PCR反应在CY5通道中20ins(83.95℃/84.00℃/84.01℃)阳性的熔解曲线；①显示加入V769-D770insASV阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为83.95℃的熔解峰，Rm值(峰高)为256.49；②显示加入D770-N771insSVD阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为84.00℃的熔解峰，Rm值为232.81；③显示加入H773-V774insNPH阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为84.01℃的熔解峰，Rm值为226.23。
从图1可以看出，针对不同的靶标，在靶标加入量相同的情况下，采用本发明的引物探针组进行检测，得到的熔解峰的峰高及峰的位置趋于一致。即，采用本发明的引物探针组合物，对不同靶标的扩增效率几乎相当。也就是说，当进行多重检测时，即待测样本中含有多种靶标时，由于本发明提供的引物探针组合物可实现趋于一致的扩增效率，则可实现对不同靶标的均衡扩增。图1中，三个突变类型的熔解峰的峰位置趋于一致，可实现对EGFR20ins多个突变类型靶标的不分型检测。
说明采用本发明的引物探针设计方法，在进行不分型检测时，能够实现对不同浓度的目的基因实现均衡扩增，从而获得更准确的检测结果。
实施例2：肺癌EGFR 19del(EGFR基因第19号外显子上发生的缺失激活突变)的多重不分型PCR检测
(1)用于PCR检测肺癌肺癌EGFR 19del(EGFR基因第19号外显子上发生的缺失激活突变)的引物探针组的碱基序列如表1所示。
表3：引物探针组的碱基序列
上述引物探针中:
所述正向引物F1-2(SEQ ID NO:10)，为针对EGFR 19del靶序列设计的特异性引物，F1-2全长42bp，其3’端第1至第20个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第18个碱基，与探针P1-2(SEQ ID NO:6)的5’端第29至46个碱基序列反向互补；
所述反向引物R1-2(SEQ ID：7)，为针对EGFR 19del靶序列设计的特异性引物；R1-2全长45bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第2个碱基位延伸阻滞区(M)，其5’端的第3至第21个碱基为引物信号检测区(h)，与探针P1-2(SEQ ID NO:6)的5’端的第2至20个碱基序列相同；R2全长50bp，其3’端第1至第24个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第3个碱基位延伸阻滞区(M)，其5’端的第4至第23个碱基为引物信号检测区(h)，与探针P1-2(SEQ ID NO:6)的5’端的第4至23个碱基序列相同；R3全长55bp，其3’端第1至第22个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第4个碱基位延伸阻滞区(M)，其5’端的第5至第30个碱基为引物信号检测区(h)，与探针P1-2(SEQ ID NO:6)的5’端的第8至33个碱基序列相同；
当对靶标进行特异性扩增时，正向引物(F)和反向引物(R)扩增靶核酸得到预扩增产物，其中一条单链预扩增产物(S1-2)的5’端到3’端依次是探针锚定区(A)，靶序列，引物信号检测区(h)的反向互补区(h’)和延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)；探针(P1-2)的探针信号检测区(H)与其中一条单链预扩增产物(S1-2)的引物信号检测区的反向互补序列(h’)互补配对，探针的引物锚定区(A’)与该单链预扩增产物(S1)5’端的探针锚定区(A)反向互补配对，该单链预扩增产物(S1)-23’端的延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)不与探针(P1-2)任意部分互补，此时探针(P1-2)变为部分或全部双链状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到；在扩增结束后进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，探针(P1-2)与条单链预扩增产物(S1-2)形成的杂交双链产物将在一定温度下解链，此时探针(P1-2)的第一检测基团与第二检测基团距离发生变化，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。
在本实施例中检测时采用试剂盒包括：如表4所示的检测体系。
表4：肺癌EGFR 19del多重不分型PCR检测体系
| 试剂组分 | 浓度 |
| 2×PCR Reaction Buffer | 1× |
| DNA Polymerase | 2U |
| 探针(P1-2) | 500nM |
| 正向引物(F1-2) | 500nM |
| 反向引物(R1-2) | 100nM |
| 反向引物(R2-2) | 100nM |
| 反向引物(R3-2) | 100nM |
| 核酸模板 | 0.1ng～60ng |
| 超纯水 | 补至20μL |
其中，配合上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测，其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mMdNTP、70mM(NH4)2SO4。
样本制备：使用EGFR 20ins靶序列的质粒作为阳性样本,分别用带有不同的信号检测区域序列的反向引物(R)对EGFR 20ins靶序列进行单独检测，以验证单一型别的检测能力。使用纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表4中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性1分钟；94℃变性15秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环，不采光；将温度从56℃逐渐升温至90℃，升温过程实时采集荧光信号，升温结束后获得一条熔解曲线；所述升温的速率为0.05℃/s。
数据分析：
所述试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图2为实施例2的多重PCR反应在ROX通道中19del(66.46℃/65.89℃/65.78℃)阳性的熔解曲线；显示加入E746-A750del阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为66.46℃的熔解峰；显示加入E746-E749del阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为65.89℃的熔解峰。显示加入E746-P753 del阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为65.78℃的熔解峰。
从图2可以看出，针对不同的靶标，在靶标加入量相同的情况下，采用本发明的引物探针组进行检测，得到的熔解峰的峰高及峰的位置趋于一致。即，采用本发明的引物探针组合物，对不同靶标的扩增效率几乎相当。也就是说，当进行多重检测时，即待测样本中含有多种靶标时，由于本发明提供的引物探针组合物可实现趋于一致的扩增效率，则可实现对不同靶标的均衡扩增。图2中，三个突变类型的熔解峰的峰位置趋于一致，可实现对EGFR19del多个突变类型靶标的不分型检测。
实施例3
实施例3相对于实施例1除采用表5引物探针组合物而非表1引物探针组进行试验外，其余内容(包括反应体系、步骤等)都相同。
表5：引物探针组合物的碱基序列
上述引物探针组合物包括实施例1的引物探针组(P1-1、R1-1、R2-1、R3-1、F1-1)、下游引物R4和上游引物F2；
其中，所述正向引物F2(SEQ ID NO:12)，为针对EGFR S768I靶序列设计的特异性引物，F2全长38bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第15个碱基，与探针P1-1(SEQ ID NO:1)的5’端第32至46个碱基序列反向互补；
所述反向引物R4(SEQ ID：11)，为针对EGFR S768I靶序列设计的特异性引物，R4全长43bp，其3’端第1至第19个碱基为靶序列结合区，其5’端的第3至第21个碱基与探针P1-1(SEQ ID NO:1)的3’端第2至21个碱基序列相同。
结果：
图3为实施例3的多重PCR反应在CY5通道中20ins阳性的熔解曲线；①显示加入V769-D770insASV阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为83.95℃的熔解峰，Rm值为256.49；②显示加入D770-N771insSVD阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为84.00℃的熔解峰，Rm值为232.81；③显示加入H773-V774insNPH阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为84.01℃的熔解峰，Rm值为226.23。④显示加入S768I阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为70.34℃的熔解峰，Rm值为274.75。
此外，从图3可以看出，2组引物探针组(一组为P1-1、R1-1、R2-1、R3-1、F1-1；一组为P1-1、R4和F2)可以共用1条探针，但不同组的预扩增产物与探针形成的双链的Tm值存在差异，可以通过熔解曲线进行明显的区分(一组的Tm在84℃左右，一组的Tm在70℃左右)。并从图3可以看出，每个靶标的熔解峰的峰高较高，说明采用本发明的引物探针组具有很高的扩增效率，可以实现对不同靶标的均衡扩增。
对比例1
对比例1相对于实施例1，除了3个反向引物R的序列不同外，其余内容(包括反应体系、步骤、以及探针和上游引物的序列等)都相同。该对比例1中3个反向引物R的靶序列结合区不同，但引物信号检测区(h)相同。
表6：引物探针组的碱基序列
结果：图4为对比例1的多重PCR反应在CY5通道中20ins阳性的熔解曲线；①显示加入V769-D770insASV阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中未形成熔解峰，表示V769-D770insASV阳性模板未检出；②显示加入D770-N771insSVD阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中形成Tm值为83.74℃的熔解峰，Rm值(峰高)为53.51；③显示加入H773-V774insNPH阳性模板的PCR反应孔在CY5通道中在CY5通道中未形成熔解峰，表示H773-V774insNPH阳性模板未检出。
针对不同的靶标，在靶标加入量相同的情况下，采用对比例1的引物探针组进行检测，有1个靶标(D770-N771insSVD)有峰值，被检测出来，但另两个靶标(V769-D770insASV和H773-V774insNPH)未检出。即，采用对比例1的引物探针组合物，对不同靶标的扩增效率不同。也就是说，当进行多重检测时，会因为靶标不同而造成扩增失衡的问题。
此外，通过对比图1(实施例1)和图4(对比例1)，可以看出，图4中被检测出的靶标的峰高(53.51)，明显小于图1中对应靶标的峰高(232.81)，也就是说，采用对比例1的引物探针设计方法，可能无法避免竞争的问题，其扩增效率明显低于实施例1中的引物探针设计方法。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (17)
1.一种用于PCR检测的引物探针组，其特征在于，其包括1种探针(P)、至少1种第一引物和至少2种第二引物；
所述第一引物包含靶标序列结合区1，所述靶标序列结合区1为能够与靶标序列特异性配对结合的序列；
所述探针(P)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列，其包括探针信号检测区(H)；所述探针(P)上修饰有检测基团；
所述至少2种第二引物彼此不同，各自独立地包含引物信号检测区(h)和靶标序列结合区2；其中，不同的所述第二引物中的靶序列结合区2为与不同靶标序列特异性配对结合的序列，不同的所述第二引物中的引物信号检测区(h)均为一段不与任何靶标序列配对结合，且与探针(P)的探针信号检测区(H)具有部分或全部相同的序列；不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同；
所述第一引物和第二引物分别与靶标特异性结合后产生预扩增产物，所述预扩增产物中含有一条具有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的单链预扩增产物，所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸≥0个碱基后形成双链产物，所述双链产物的形成引起探针信号变化；
不同的所述第二引物所形成的不同单链预扩增产物，与探针(P)结合后形成的不同双链产物的Tm值相近。
2.根据权利要求1项所述的引物探针组，其特征在于，所述第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列；
优选地，所述探针(P)还包括引物锚定区(A’)；所述引物锚定区(A’)为与所述第一引物的探针锚定区(A)互补的序列。
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述探针(P)为1)～4)中的任意一种结构；
1)所述探针(P)包括一个引物锚定区(A’)和一个探针信号检测区(H)；
2)所述探针(P)包括一个探针信号检测区(H)和两个引物锚定区(A’)，两个引物锚定区(A’)分别位于探针信号检测区(H)的两侧，两个引物锚定区(A’)的序列不同；
3)所述探针(P)包括一个引物锚定区(A’)和两个探针信号检测区(H)两个探针信号检测区(H)分别位于引物锚定区(A’)的两侧，两个探针信号检测区(H)的序列不同；
4)所述探针(P)包括两个引物锚定区(A’)和两个探针信号检测区(H)，所述引物锚定区(A’)和探针信号检测区(H)间隔排列，两个引物锚定区(A’)的序列不同，两个探针信号检测区(H)的序列不同。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化；优选地，所述第一检测基团与所述第二检测基团之间间隔3-250埃；优选地，3-201埃；更优选地，间隔3-140埃；
和/或，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述探针(P)的3’端含有阻断区域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的引物探针组，其特征在于，至少1种所述第二引物的5’端含有延伸阻滞区(M)；
优选地，所述预扩增产物中含有一条具有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)和延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)的单链预扩增产物；所述延伸阻滞区(M)的反向互补序列(M’)为不与探针(P)任意部分互补的序列。
7.权利要求1-6中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组在制备用于多种不同靶标物检测的试剂中的应用。
8.一种用于PCR检测的试剂盒，其包括如权利要求1-6中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组，优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；更进一步优选地，当所述核酸模板为RNA时，所述扩增试剂还包括逆转录酶。
9.一种用于PCR检测的引物探针组合物，其包括至少1组如权利要求1-6中任一项所述的引物探针组。
10.根据权利要求9所述的引物探针组合物，其特征在于，至少两个不同组的所述引物探针组共用1条探针(P)，不同组的第二引物所形成的不同单链预扩增产物与探针(P)结合并延伸≥0个碱基后形成的不同双链产物的Tm值不相近。
11.根据权利要求9或10所述的引物探针组合物，其特征在于，
至少两个不同组的引物探针组的探针(P)不同，所述不同组的探针(P)的序列不同，优选地，不同组的所述探针(P)的序列和检测基团均不同。
12.权利要求9-11中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组合物在制备用于多种不同靶标物检测的试剂中的应用。
13.一种用于PCR检测的试剂盒，其包括如权利要求9-11中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组合物，优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；更进一步优选地，当所述核酸模板为RNA时，所述扩增试剂还包括逆转录酶。
14.一种利用如权利要求8或13所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测的方法，其包括如下步骤：
S1，将第一引物、第二引物和探针(P)混合后形成引物探针预混液；
S2，将所述引物探针预混液与扩增试剂、待测样本混合，获得反应体系；
S3，对所述反应体系进行PCR扩增；
S4，分析是否有靶标物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：
S4-1，获得步骤S3中PCR扩增所产生的信号变化，并根据信号变化判断待测样本中是否有靶标物；和/或，
S4-2，对步骤S3中PCR扩增后的产物进行升温，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
所述步骤S3包括如下步骤：
S3-1，将反应体系随机分配到500个以上的反应单元中，每个反应单元含有1个待测样本的靶标或不含有待测样本的靶标；和/或，
S3-2，对所有反应单元进行PCR扩增；
和/或，所述步骤S4包括如下步骤：
S4，获得步骤S3中PCR扩增后的每个反应单元的信号情况，并根据信号的有无判断是否有靶标物。
17.一种利用如权利要求8或13所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测的方法，其包括如下步骤：
将所述第一引物和第二引物分别与靶标特异性结合，扩增后产生预扩增产物，所述预扩增产物中含有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)；
将所述引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(P)特异性结合并延伸≥0个碱基后形成双链产物；
所述双链产物的形成引起探针产生可检测的信号变化，并根据信号变化判断待测样本中是否有靶标物；
和/或，将所述双链产物进行升温，所述双链产物的解链引起探针产生可检测的信号变化，并根据信号变化判断待测样本中是否含有靶标物。
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