CN117701689A - 多重pcr反应体系 - Google Patents

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葛志琪
胡莞尔
赵雨航
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Abstract

本发明提供了一种单管超多重的PCR检测引物探针的设计方法、反应体系以及基于所述方法和反应体系的多重靶标检测试剂盒。

Description

多重PCR反应体系
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是属于核酸扩增和检测领域。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如感染性疾病的诊断、基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。
目前在qPCR平台应用较多的引物探针设计方式主要为TaqMan水解探针法，其工作原理主要是利用了一条能与模板特异性结合且两端分别标记荧光基团(供体)和淬灭基团(受体)的寡核苷酸探针，同时在探针的上游和下游分别设计一条特异性PCR引物。在PCR反应开始之前，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，TaqMan探针一端的荧光基团发射的荧光信号被另一端的淬灭基团吸收，从而使得荧光信号不被仪器检测到；而PCR扩增开始后，TaqMan探针与模板特异性结合，当DNA聚合酶(Taq酶)在延伸到探针结合模板的位点时，其5'-3’核酸外切酶活性会将TaqMan探针切断，使得探针上标记的荧光基团远离淬灭基团，不再形成FRET结构，因此荧光基团发射的信号能够被仪器检测到。但是如果要在同一反应体系中实现多重靶标的PCR检测，需要设计多条标记不同波长的荧光基团的TaqMan水解探针，而且受到检测仪器的荧光通道数量的限制，目前最多只能实现4-6重不同靶标的检测。
为实现超多重PCR检测，现有技术通常会将PCR检测技术与其它方法结合起来，例如PCR与杂交芯片结合，以不同的扩增产物长度进行多重靶标检测。如专利文献CN107090519A所公开的“呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒”，是利用了核酸分子杂交的原理，将针对各靶标的单链探针按特定顺序排列固定于基因芯片上，形成探针阵列，再将待测的多重PCR产物与其杂交，使得靶标扩增产物与芯片上的探针杂交并发出荧光信号。该方法虽然能同时检测20种呼吸道病原体，但是基因芯片制备工艺复杂，价格昂贵，不利于临床推广开展，而且过程繁琐，需要经过多个开盖、清洗的步骤，易造成污染导致结果出现假阳性。
又如专利文献CN103074450B所公开的“一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法”，利用了PCR扩增与毛细管电泳结合的方式，将PCR扩增产物取出并进行毛细管电泳分析，将获得的图谱与标准图谱对比从而判断腹泻致病菌的种类。该方法在使用PCR扩增检测设备以外，还需要使用毛细管电泳设备进行产物分析，使得检测成本大大增加，也不利于临床推广使用。
因此，临床急需一种能够进行多重核酸分子检测的方法，能够快速、简便、低成本地用于检测多种临床常见的病原微生物，无创的出生缺陷筛查，单核苷酸多态性分析，甲基化分析，基因突变，基因分型等领域。
发明内容
本发明要解决的问题是在单管反应中实现检测并区分多种不同靶标，并且在存在多种特异性引物的情况下避免了因为引物二聚体产生假阳性信号。本发明提供了一种单管超多重的PCR检测引物探针的设计方法、反应体系以及基于所述方法和反应体系的多重靶标检测试剂盒。
第一方面，本发明提供了用于PCR检测靶序列的组合物，所述组合物包括检测探针，所述检测探针包括检测序列结合区，检测基团以及阻断区，
所述检测序列结合区与检测序列或其部分互补，
所述检测探针的检测序列结合区在与检测序列特异性结合后，所述检测序列扩增大于等于0个nt，获得检测序列扩增产物，
所述检测序列结合区不包含与所述靶序列互补或相同的序列，
如果所述检测探针与所述检测序列的结合位点在所述阻断区的下游，所述阻断区阻断检测序列的继续延伸，
所述检测探针上的检测基团在检测探针与检测序列或检测序列扩增产物杂交条件下发出的信号与检测探针未与检测序列扩增产物杂交条件下发出的信号不同。
在一些实施方案中，所述检测序列不包含靶序列或其部分，或与靶序列或其部分互补的序列。
所述组合物还包含辅助探针，所述辅助探针包括检测序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与靶序列或其部分互补的序列。
在一些实施方案中，所述组合物包含针对n条靶序列的n个辅助探针和m条检测探针，其中1≤n≤20，1≤m≤n。
优选地，所述n个辅助探针包含的检测序列彼此不同。
优选地，所述每个检测探针上包含与至少两种检测序列或其部分互补的检测序列结合区以及延伸序列，所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。不同检测探针的情况下，扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度可以相同。在一些实施方案中，所述杂交体可以为双链体。
在一些实施方案中，所述组合物包含针对n条靶序列的n个辅助探针和1条检测探针，所述检测序列结合区包含针对n种检测序列的≥n个检测序列结合域。在1条检测探针的情况下，不同的扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度不同。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。
所述检测探针上各检测序列结合域可以任何顺序排列(例如第一检测序列结合域可以位于第二检测序列结合域的上游(5’端)或下游(3’端)，类似地，可以任何顺序排列其他的检测序列结合域(例如，根据需要第三检测序列结合域，第四检测序列结合域，第五检测序列结合域....第20检测序列结合域)。
检测探针上各检测序列结合域可以任何形式排列，例如，各检测序列结合域可以直接连接的形式排列，可以连接序列连接的形式排列，或者检测序列结合域之间也可以存在重叠的形式排列。在一些实施方案中，以部分或全部重叠的形式排列检测序列结合域，其中在检测序列结合域彼此之间以全部重叠的形式排列时，只要对应的检测序列与所述的检测序列结合域有几个碱基的错配即可。
所述阻断区(blocking region)，用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。阻断区，可以是以Spacer C3，Spacer C8(Octanediol)，Spacer 9/TEG，Spacer C12，Spacer 18/HEG，THF(四氢呋喃)/dSapcer(Abasic site)进行修饰，使相应位点被封闭，从而阻止延伸反应。阻断区，也可以为聚合酶酶阻断基团，具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端，但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一些实施方案中，阻断基团选自乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一些实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。
如果阻断区位于所述检测探针与所述检测序列的结合位点的下游，所述检测探针与所述检测序列结合后，检测序列继续延伸直至延伸至检测序列的5’端。
在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区中的一部分检测序列结合域位于所述阻断区的上游或跨过阻断区，另一部分检测序列结合域位于所述阻断区的下游，检测序列与检测探针的相应检测序列结合域结合后，一部分检测序列延伸到检测探针的5’末端，另一部分延伸到阻断区。
在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区中的所有检测序列结合域位于所述阻断区的上游或跨过阻断区，检测序列与检测探针的相应检测序列结合域结合后，检测序列延伸到检测探针的5’末端。
在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区中的所有检测序列结合域位于所述阻断区的下游，检测序列与检测探针的相应检测序列结合域结合后，检测序列延伸到检测探针的阻断区。
在一些实施方案中，所述检测探针为线性检测探针或具有发夹结构的检测探针。
在一些实施方案中，所述组合物还包含分别针对n条靶序列的n条上游寡核苷酸序列，所述上游寡核苷酸序列包含与相应靶序列互补的序列，并且所述上游寡核苷酸序列在与靶序列杂交后，位于辅助探针的上游远端，或位于辅助探针的上游邻近，或与辅助探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列。
优选地，所述上游寡核苷酸序列为特异于靶序列的上游引物或者特异于靶序列的上游探针。
所述组合物还包含分别针对n条靶序列的n条下游寡核苷酸序列，所述下游寡核苷酸序列包含与相应靶序列互补的序列；并且，当与所述靶序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的下游。
在一些实施方案中，所有上游寡核苷酸序列和所有下游寡核苷酸序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列，并且所述组合物还包含通用引物，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补序列。
在一些实施方案中，所述检测探针的长度为15-800个碱基长度，15-600个碱基长度，15-400个碱基长度，15-160个碱基长度。
在一些实施方案中，所述检测探针的检测序列结合区的长度为10-500个碱基长度，10-400个碱基长度，10-100个碱基长度。
在一些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针，检测基团包括报告基团和淬灭基团。
在一些实施方案中，所述报告基团为荧光基团，所述淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团。
在一些实施方案中，所述检测序列包含靶序列或其部分，或与靶序列或其部分互补的序列。
在一些实施方案中，所述组合物包含检测探针和第一引物组，所述第一引物组包括互为正向引物和反向引物的第一引物和第二引物，
所述检测探针包括第一结合区A’，检测序列结合区H和第一阻断区，如果所述检测探针与所述检测序列的结合位点在所述阻断区的下游，用于阻断检测序列沿检测探针的延伸，
优选地，所述第一引物包括与所述检测探针的第一结合区A’部分或全部互补的序列A，所述第二引物包括与所述检测探针的检测序列结合区H部分或全部相同的序列h，
所述第一结合区A’，检测序列结合区H，序列A和序列h不与靶序列或其任意片段互补或相同，
优选地，所述检测探针上的检测基团位于所述第一阻断区的下游。所述检测基团使得检测探针与检测序列或检测探针与检测序列扩增产物杂交前后产生信号变化。
在一些实施方案中，如果阻断区位于所述检测探针与所述检测序列的结合位点的下游，所述检测探针与所述检测序列结合后，检测序列继续延伸直至延伸至检测序列的5’端。
在一些实施方案中，所述检测探针包括：
一个检测序列结合区H和一个第一结合区A’(A’-H；H-A’)；或
两个检测序列结合区H和一个第一结合区A’，两个检测序列结合区H分别位于第一结合区A’的两侧(H-A’-H)；或
一个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，两个第一结合区A’分别位于检测序列结合区H的两侧(A’-H-A’)；或
两个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，所述检测序列结合区H和第一结合区A’间隔排列(H-A’-H-A’或A’-H-A’-H)。
在一些实施方案中，所述组合物包含针对n条靶序列的m条检测探针，和n个第一引物组，其中1≤n≤20，1≤m≤n。
在一些实施方案中，所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。不同检测探针的情况下，扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度可以相同。
在一些实施方案中，所述组合物包含1条检测探针，所述检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。在1条检测探针的情况下，不同的扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度不同。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。
其中，各检测序列结合域以直接连接的形式排列，以连接序列连接的形式排列，或以存在重叠的形式排列。其中，在检测序列结合域彼此之间以全部重叠的形式排列时，只要对应的检测序列与所述的检测序列结合域有几个碱基的错配即可。
在一些实施方案中，所述检测探针上各检测序列结合域可以任何顺序排列(例如第一检测序列结合域可以位于第二检测序列结合域的上游(5’端)或下游(3’端)，类似地，可以任何顺序排列其他的检测序列结合域(例如，根据需要第三检测序列结合域，第四检测序列结合域，第五检测序列结合域....第20检测序列结合域)。
在一些实施方案中，检测探针上各检测序列结合域可以任何形式排列，例如，各检测序列结合域可以直接连接的形式排列，可以连接序列连接的形式排列，或者检测序列结合域之间也可以存在重叠的形式排列。优选地，以重叠的形式排列检测序列结合域。其中，在检测序列结合域彼此之间以全部重叠的形式排列时，只要对应的检测序列与所述的检测序列结合域有几个碱基的错配即可。
在一些实施方案中，所述检测探针的3’末端设有第二阻断区，所述第二阻断区可以阻止检测探针3’端的延伸。
所述阻断区(blocking region)，用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。阻断区，可以是以Spacer C3，Spacer C8(Octanediol)，Spacer 9/TEG，Spacer C12，Spacer 18/HEG，THF(四氢呋喃)/dSapcer(Abasic site)进行修饰，使相应位点被封闭，从而阻止延伸反应。阻断区，也可以为聚合酶酶阻断基团，具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端，但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一些实施方案中，阻断基团选自乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一些实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。
在一些实施方案中，所述第一引物和所述第二引物的双链扩增产物中的一条单链扩增产物作为检测序列扩增产物，其包括序列A和与所述检测探针的检测序列结合区H的某个检测序列结合域部分或全部互补的序列h’。
在一些实施方案中，所述检测探针的长度为15-800个碱基长度，优选地，所述检测探针的长度为20-100个碱基长度。
在一些实施方案中，所述检测探针的第一结合区A’的长度为5-65个碱基长度，或5-35个碱基长度。
优选地，所述第一结合区A’的Tm值为30℃-80℃，优选为40℃-80℃。
优选地，所述第一结合区A’的GC含量为30％-80％，优选为40％-80％。
优选地，所述第一结合区A’设计在检测探针的5’端或3’端，与第一引物的A序列全部或部分互补。
优选地，所述检测探针的3’末端设有第二阻断区，
所述第二阻断区可以阻止检测探针3’端延伸。
在一些实施方案中，所述检测序列结合区H的长度为10-500个碱基长度，10-400个碱基长度，10-100个碱基长度。
在一些实施方案中，所述检测序列结合域的长度为5-65个碱基长度。
优选地，所述检测序列结合域的Tm值为30℃-80℃，优选为40℃-80℃。
优选地，所述检测序列结合域的GC含量为20％-80％，优选为40％-80％。
在一些实施方案中，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，其中所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。
优选地，所述第二检测基团与所述第一检测基团间隔3-140埃的位置。
优选地，所述第一检测基团和第二检测基团均位于第一结合区A'上，或均位于检测序列结合区H上，或分别位于第一结合区A'和检测序列结合区H上。
在一些实施方案中，所述第一引物还包括靶序列结合区，并且，所述第二引物还包括靶序列结合区。
优选地，所述第一引物从5’端至3’端依次包括序列A和靶序列结合区。
优选地，所述靶序列结合区是靶特异性序列，与待扩增的靶序列特异性结合。
在一些实施方案中，所述检测探针与第一引物的退火温度为TmA，所述检测探针与第二引物的互补序列的退火温度为TmH，所述第一引物与靶序列的退火温度为Tmb1，所述第二引物与靶序列的退火温度为Tmb2；在一些具体实施方式中，所述TmA＜Tmb1和TmA＜Tmb2，和/或TmH＜Tmb1和TmH＜Tmb2。
在一些实施方案中，所述第一结合区A'与第一引物的序列A互补。
优选地，所述第一引物的序列A是不与靶序列或其任意的片段配对结合的自由设计序列，并且与检测探针的第一结合区A'部分或全部互补。
优选地，所述第一引物的序列A与靶序列结合区之间有0-20个碱基的间隔。
优选地，所述第一引物的长度为20-80个碱基。
优选地，所述第一引物的靶序列结合区的Tm值为40℃-80℃。
优选地，所述第一引物的靶序列结合区的GC含量为20％-80％。
优选地，所述第一引物的序列A的长度为5-65个碱基长度，或5-35个碱基长度。
优选地，所述第一引物的序列A的Tm值为40℃-80℃。
优选地，所述第一引物的序列A的GC含量为30％-80％。
在一些实施方案中，所述检测序列结合区H的某个检测序列结合域与第二引物的序列h具有部分或全部相同的序列。
在一些实施方案中，所述第二引物从5’端至3’端依次包括序列h和靶序列结合区。
优选地，所述靶序列结合区是靶特异性序列，与待扩增的靶序列特异性结合。优选地，所述第二引物的序列h的GC含量为20％-80％。
在一些实施方案中，在没有待扩增靶标存在时，检测探针的第一结合区A’与第一引物的序列A全部或部分互补结合，检测探针的其他部分呈单链状态，由于分子柔性造成单链柔性检测探针呈卷曲状或由于二级结构造成折叠状，此时第一检测基团和第二检测基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高。
在一些实施方案中，在进行PCR扩增时，第一引物与第二引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条第一单链预扩增产物(S1)作为检测序列，其包含序列A，靶序列，以及序列h的互补序列h’；所述检测探针的检测序列结合区H与第一单链预扩增产物的序列h的互补序列h’互补配对，所述检测探针的第一结合区A’与所述第一单链预扩增产物的序列A互补配对,所述作为检测序列的第一单链预扩增产物的3’端可继续延伸大于等于0个碱基到检测探针(P)的5’端或第一阻断区，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列作为检测探针(P)与检测序列的扩增产物，即完成以单链预扩增产物(S1)为引物，以检测探针(P)为模板的二次扩增，得到二次扩增双链产物。
检测探针由单链变为双链状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变长，产生可被仪器检测到的信号。
在一些实施方案中，通过荧光通道进行靶序列扩增的鉴定，或者通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定，或者通过荧光通道+熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。
优选地，通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。具体地，在PCR扩增后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针与检测序列的扩增产物形成的双链产物在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针由双链变为单链，使得检测基团之间的距离发生变化，产生可被仪器检测到的信号。
由于熔解曲线分析时，检测到的是检测探针(P)与检测序列的扩增双链产物的熔解温度，因此可以通过调整反向引物(R)的序列h的序列和长度，以得到与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域部分反向互补或全部反向互补的单链预扩增产物(S1)，从而调整检测探针(P)与检测序列的扩增双链产物的熔解温度，例如调整序列h的长度或序列，或调整序列h与检测探针(P)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域的反向互补的位置，进而增高或降低检测探针(P)与检测序列的二次扩增双链产物的熔解温度。
在一些实施方案中，所述检测探针引物组包含针对n条靶序列的n个第一引物组和m条检测探针，其中1≤n≤20，1≤m≤n；
不同检测探针的碱基序列不同，并且检测探针上的检测基团不同，
所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。
针对同一检测探针的所有第一引物组扩增不同的靶序列得到的检测序列扩增产物与所述检测探针形成的杂交体的退火温度彼此不同。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。
优选地，针对同一检测探针的所有第一引物组扩增不同的靶序列得到的检测序列扩增产物与所述检测探针形成的杂交体的退火温度的彼此差值△Tm为4～12℃。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。
优选地，所有第一引物所包括的靶序列结合区彼此不同，和/或所有第二引物所包括的靶序列结合区彼此不同。
在一些实施方案中，所述检测探针引物组包含针对n条靶序列的n个第一引物组和m条检测探针，其中1≤n≤20，1≤m≤n，
所述m条检测探针包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。
在一些实施方案中，所述检测探针引物组包含针对n条靶序列的n个第一引物组和一条检测探针，其中1≤n≤20，
所述检测探针包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域。
其中，各检测序列结合域以直接连接的形式排列，以连接序列连接的形式排列，或以存在部分或全部重叠的形式排列。其中，在检测序列结合域彼此之间以全部重叠的形式排列时，只要对应的检测序列与所述的检测序列结合域有几个碱基的错配即可。
在一些实施方案中，针对n条靶序列设计n条检测探针，然后利用荧光通道对n条靶序列的扩增进行鉴定。在这样的实施方案中，所述n条检测探针为柔性检测探针。
柔性检测探针，即在单链状态因分子柔性使其成卷曲状或因二级结构使其成折叠状，而在杂交或退火延伸形成双链状态后，因氢键作用而使其固定为较为刚性的双螺旋结构。所述柔性检测探针可选自由以下项组成的组：在单链状态下因分子柔性成卷曲状的寡核苷酸、在单链状态下能够形成发夹结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成茎环结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成假结结构的寡核苷酸，和在单链状态下能够形成三螺旋结构的寡核苷酸。
在一些实施方案中，针对n条靶序列仅仅设计一条或数条通用的检测探针，然后利用熔解曲线对n条靶序列的扩增进行鉴定。在这样的实施方案中，通过调整第二引物的序列h的序列和/或长度，和/或调整第一引物的序列A的序列和/或长度以得到与检测探针的检测序列结合区H的相应检测序列结合域部分或全部互补，以及与第一结合区A’部分或全部互补的第一单链预扩增产物的序列A和序列h的互补序列，从而调整检测探针与第一单链扩增产物形成的双链产物的熔解温度。
在没有待测靶序列存在时，检测探针(P)的第一结合区(A’)与正向引物(F)的序列A反向互补，检测探针(P)的其他部分呈单链状态；而当待测靶序列存在时，正向引物(F)与反向引物(R)分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，检测探针(P)的3’端的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域与单链预扩增产物(S1)3’端的序列h的反向互补序列(h’)互补配对，检测探针5’端的第一结合区(A’)与单链预扩增产物(S1)，也就是检测序列的5’端的序列A反向互补配对，单链预扩增产物(S1)，也就是检测序列的3’端可继续延伸大于等于0个碱基到检测探针(P)的5’端或第一阻断区，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1)与检测探针的检测序列结合区相结合的序列h’为引物，以检测探针(P)为模板的二次扩增，得到检测探针(P)与检测序列的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团此时由于检测探针部分或全部从单链到双链的变化使得距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在PCR结束后，进行熔解曲线分析时，在一定温度下，检测探针(P)与检测序列的二次扩增双链产物发生解链，使得带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P)变为单链状态，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离变短，荧光共振能量转移效率升高，使得荧光信号再次发生变化，可用于熔解曲线分析。
优选地，通过调整序列A和/或序列h的长度或序列，或调整序列A和/或序列h的互补序列与检测探针的第一结合区A’和/或检测序列结合区H的相应检测序列结合域互补的位置，进而提高或降低检测探针与检测序列的扩增产物形成的双链产物的熔解温度。
这样的实施方案可以在单管中实现超多重PCR，或数字PCR，而且有效避免了引物二聚体的形成。
第二方面，本发明提供了用于PCR检测的反应体系，所述反应体系包括第一方面的组合物。
第三方面，本发明提供了用于PCR检测的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一方面的组合物或第二方面的反应体系。
第四方面，本发明提供了用于PCR检测的方法，所述方法包括利用第一方面的组合物，第二方面的反应体系或第三方面的检测试剂盒进行PCR的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(1)在允许杂交的条件下，将检测样品与上游寡核苷酸序列和辅助探针进行反应；
(2)在允许切割辅助探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸内切酶活性和/或5'核酸外切酶活性的酶反应；
(3)在允许杂交的条件下，将步骤(2)的产物与检测探针进行反应；
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶反应；
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述靶序列是否存在于所述检测样品中。
优选地，在允许核酸杂交的条件下，将检测样品与上游寡核苷酸序列、辅助探针和下游寡核苷酸序列接触，从而，以靶序列为模板，以上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物，进行扩增，产生靶核酸序列，提高所述方法的灵敏度。
在一些实施方案中，在检测过程中，将n种上游引物、n种下游引物、n种辅助探针分别与对应的n种靶序列杂交(退火)；随后，在核酸聚合酶的作用下，所有的上游引物和下游引物分别被延伸，并且每一种上游引物(正向引物)的延伸导致对应的辅助探针(辅助探针)被具有5'核酸内切酶活性和/或5'核酸外切酶活性的酶切割，从而释放出辅助片段；随后，辅助片段分别杂交至检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生n种延伸产物；这n种延伸产物各自具有不同的长度，并且与检测探针一起形成了n种具有不同Tm值的杂交体。由此，通过熔解曲线分析，可确定具有特定Tm值的杂交体的存在，并进而可确定与该杂交体对应的靶核酸分子的存在。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。
因此，在本发明的方法中，可使用1种检测探针和n种辅助探针实现对n种靶核酸分子的检测。
在一些实施方案中，利用第一引物组与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条单链扩增产物包含序列A，靶序列，序列h的互补序列h’，作为检测序列；
所述单链扩增产物的A和h’与所述探针特异性结合后进行扩增，形成可被仪器检测的信号变化，根据信号的变化判断是否有靶序列的存在。
在一些实施方案中，在进行PCR扩增时，第一引物与第二引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条第一单链预扩增产物(S1)作为检测序列，其包含序列A，靶序列，以及序列h的互补序列h’；所述检测探针的检测序列结合区H与第一单链预扩增产物的序列h的互补序列h’互补配对，所述检测探针的第一结合区A’与所述第一单链预扩增产物的序列A互补配对,所述作为检测序列的第一单链预扩增产物的3’端可继续延伸大于等于0个碱基到检测探针(P)的5’端或第一阻断区，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列作为检测探针(P)与检测序列的扩增产物，即完成以单链预扩增产物(S1)与检测探针的检测序列结合区相结合的h’序列为引物，以检测探针(P)为模板的二次扩增，得到二次扩增双链产物。
检测探针由单链变为双链状态，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变长，产生可被仪器检测到的信号。
在没有待测靶序列存在时，检测探针(P)的第一结合区(A’)与正向引物(F)的序列A反向互补，检测探针(P)的其他部分呈单链状态；而当待测靶序列存在时，正向引物(F)与反向引物(R)分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，检测探针(P)的3’端的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域与单链预扩增产物(S1)3’端的序列h的反向互补序列(h’)互补配对，检测探针5’端的第一结合区(A’)与单链预扩增产物(S1)5’端的序列A反向互补配对，单链预扩增产物(S1)的3’端可继续延伸大于等于0个碱基到检测探针(P)的5’端或第一阻断区，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1)与检测探针的检测序列结合区相结合的序列h’为引物，以检测探针(P)为模板的二次扩增，得到检测探针(P)与检测序列的二次扩增双链产物，第一检测基团与第二检测基团此时由于检测探针部分或全部从单链到双链的变化使得距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在PCR结束后，进行熔解曲线分析时，在一定温度下，检测探针(P)与检测序列的二次扩增双链产物发生解链，使得带有第一检测基团与第二检测基团的检测探针(P)变为单链状态，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离变短，荧光共振能量转移效率升高，使得荧光信号再次发生变化，可用于熔解曲线分析。
在一些实施方案中，通过荧光通道进行靶序列扩增的鉴定，或者通过熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定，或者通过荧光通道+熔解温度曲线进行靶序列扩增的鉴定。
第五方面，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的反应体系或第三方面的检测试剂盒在进行PCR检测中的应用。
尤其是，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的反应体系或第三方面的检测试剂盒在进行单管超多重PCR检测中的应用。
第六方面，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的反应体系，第三方面的检测试剂盒或第四方面的方法在检测病原微生物，无创的出生缺陷筛查，单核苷酸多态性分析，甲基化分析，基因突变分析，或基因分型中的应用。
附图说明
图1显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV 45型质粒的阳性反应孔在ROX通道中形成Tm值为59℃的熔解峰。
图2显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV 16型质粒的阳性反应孔在FAM通道中形成Tm值为80℃的熔解峰。
图3显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV16，31，35，45型质粒的阳性反应孔分别在ROX通道中形成Tm值为80.2℃，75℃，69.4℃，59.4℃的熔解峰。
图4显示无模板对照孔无熔解峰，而加入非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变的阳性样本反应孔分别在CY5通道中形成Tm值为67.62℃的熔解峰(第一引物组为F6和R7)。
图5显示无模板对照孔无熔解峰，而加入非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变的阳性样本反应孔分别在CY5通道中形成Tm值为74.17℃的熔解峰(第一引物组为F6和R7)。
图6是一种实施方案的示意图。
图7是另一种实施方案的示意图。
图8显示了利用含阻断区的探针的多重检测结果。
图9显示了利用不含阻断区的探针的多重检测结果。
具体实施方案
以下所述的是本发明的优选实施方案，本发明所保护的不限于以下优选实施方案。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。
在本文中，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分，其可在退火或扩增条件下与引物进行退火。
在本文中，术语“上游引物”，也称正向引物，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；本发明中使用的术语“下游引物”，也称反向引物，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。其中，正链即有义链、正义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5’-3’，碱基序列和该基因mRNA基本相同；与该链结合的引物为反向引物；负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的正向和反向引物命名也可随之互换。
在本文中，术语“探针”是指用于检测靶标是否存在的经标记的寡核苷酸。
在本文中，“碱基互补配对”是指A与T、A与U和G与C等的对应关系互相以氢键相连的现象。相应地，“错配碱基”是指除“碱基互补配对”中所规定外的其他所有配对情形，如A与C、A与G、T与G，或T与C错配等。
所述阻断区(blocking region)，即，用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。阻断区，可以是以Spacer C3，Spacer C8(Octanediol)，Spacer 9/TEG，Spacer C12，Spacer 18/HEG，THF(四氢呋喃)/dSapcer(Abasic site)进行修饰，使相应位点被封闭，从而阻止延伸反应。阻断区，也可以为聚合酶酶阻断基团，具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端，但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一些实施方案中，阻断基团选自猝灭基团(如BHQ、MGB等)，乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一些实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。
实施方案一：
在本发明的方法中，使用检测探针和辅助探针来检测靶核酸分子的示例性实施方案。在该实施方案中，提供一种自淬灭检测探针(其携带荧光基团和淬灭基团)，并且针对靶核酸分子，设计并提供一条上游引物，一条下游引物，以及一条辅助探针；其中，辅助探针包含独特的检测序列，其能够与所述检测探针杂交。不同的检测序列与所述检测探针杂交的位置是独特的，但彼此可存在重叠区域。在检测过程中，上游引物、下游引物、辅助探针分别与对应的靶核酸分子杂交(退火)；随后，在核酸聚合酶的作用下，上游引物和下游引物分别被延伸，并且上游引物的延伸导致对应的辅助探针被具有5'核酸内切酶活性和/或5'核酸外切酶活性活性的酶切割，从而释放出检测序列；随后，检测序列杂交至检测探针上，并被核酸聚合酶延伸，从而产生延伸产物；不同的延伸产物与检测探针一起形成了具有不同Tm值的杂交体。由此，通过熔解曲线分析，可确定具有特定Tm值的杂交体的存在，并进而可确定与该杂交体对应的靶核酸分子的存在。在一些实施方案中，所述杂交体为双链体。
所述反应体系涉及以下步骤：
(1)提供1种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种正向引物、一种辅助探针和一种反向引物；
(2)将待检测的样品与所提供的检测探针，上游引物，辅助探针和下游引物，以及DNA聚合酶混合；
(3)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；
(4)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；
(5)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和
(6)任选地，重复步骤(3)-(5)一次或多次。
(7)在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，检测探针与检测序列的扩增产物形成的双链产物将在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的探针将变为单链状态，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。
优选的，本发明中所述的反应条件为：90℃-96℃预变性2-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环；35-95℃熔解曲线分析，升温速率为0.05℃/s，荧光信号采集。
更优选的，本发明中所述的反应条件为95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；40-95℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，荧光信号采集。
优选的，本发明中所述的反应体系中引物探针浓度分别是：正向引物的浓度为30nM-1000nM，反向引物的浓度为30nM-500nM，辅助探针浓度为150nM-1200nM，检测探针浓度为150nM-1200nM。
实施方案二：
当对病原靶标进行特异性扩增时，正向引物(F2)和反向引物(R2)扩增靶核酸得到双链预扩增子产物，其中一条单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列，检测序列结合区的相应检测序列结合域的反向互补序列h’；检测探针(P1)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域与其中一条单链预扩增产物(S1)的序列h的反向互补序列(h’)互补配对，检测探针(P1)的第一结合区A’与该单链预扩增产物(S1)5’端的序列A反向互补配对。单链预扩增产物(S1)的3’端可继续延伸到检测探针P1的第一阻断区，得到检测探针P1的部分反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1)为引物，以检测探针P1为模板的二次扩增，得到检测探针P1与检测序列的二次扩增产物。待PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针P1的二次扩增产物将在一定温度下解链，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。
所述反应体系涉及以下步骤：
(1)首先在PCR扩增反应的循环内，正向引物(F2)与反向引物(R2)可以特异性的扩增靶序列。扩增后，会得双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列和检测序列结合区的相应检测序列结合域的反向互补序列h’；检测探针(P1)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域与其中一条单链预扩增产物(S1)的序列h的反向互补序列(h’)互补配对，检测探针(P1)的第一结合区A’与该单链预扩增产物(S1)5’端的序列A反向互补配对，单链预扩增产物(S1)的3’端可继续延伸到检测探针(P1)的第一阻断区，得到检测探针(P1)的部分反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1)为引物，以检测探针(P2)为模板的二次扩增，得到检测探针(P1)的二次扩增产物。
(2)待PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针(P1)的二次扩增产物将在一定温度下解链，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。
所述的反应条件为：90℃-96℃预变性2-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环；35-95℃熔解曲线分析，升温速率为0.05℃/s，荧光信号采集。
更优选的，所述的反应条件为95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；40-95℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，荧光信号采集。
优选的，所述的反应体系中引物探针浓度分别是：正向引物(F2)的浓度为30nM-1000nM，反向引物(R2)的浓度为30nM-500nM，探针(P1)浓度为150nM-1200nM。
实施方案三：
当对靶序列进行特异性扩增时，正向引物(F)和反向引物(R)扩增靶核酸得到双链预扩增子产物，其中一条单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列，检测序列结合区的相应检测序列结合域的反向互补序列h’；检测探针(P1)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域与其中一条单链预扩增产物(S1)的序列h的反向互补序列(h’)互补配对，检测探针的第一结合区A’与该单链预扩增产物(S1)5’端的序列A反向互补配对。单链预扩增产物(S1)的3’端可继续延伸或直接杂交到检测探针(P1)的第一阻断区，得到检测探针(P1)的部分反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1)为引物，以探针(P1)为模板的二次扩增，得到检测序列的扩增产物。
待PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针(P1)的二次序列的扩增产物将在一定温度下解链，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，由于不同长度的二次扩增产物的熔解温度不同，因此可形成不同的熔解峰。
所述反应体系涉及以下步骤：
(1)首先在PCR扩增反应的循环内，正向引物(F)与反向引物(R)可以特异性的扩增靶核酸序列。扩增后，会得双链预扩增产物，其中一条单链预扩增产物(S1)的5’端到3’端依次是序列A，靶序列和序列h的反向互补序列(h’)，检测探针(P1)的检测序列结合区(H)的相应检测序列结合域与其中一条单链预扩增产物(S1)的序列h的反向互补序列(h’)互补配对，检测探针(P1)的第一结合区A’与该单链预扩增产物(S1)5’端的序列A反向互补配对，单链预扩增产物(S1)的3’端可继续延伸大于等于0个碱基到探针(P1)的第一阻断区或5’端，得到检测探针(P1)的部分反向互补序列，即完成以单链预扩增产物(S1)为引物，以检测探针(P1)为模板的二次扩增，得到检测序列的扩增产物。
(2)在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，检测探针(P1)的二次扩增产物将在一定温度下解链，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，由于不同长度的二次扩增双链产物的熔解温度不同，因此可形成不同的熔解峰。
优选的，所述的反应条件为：90℃-96℃预变性2-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环；可选的，40℃恒温孵育15秒，5个循环；35-95℃熔解曲线分析，升温速率为0.05℃/s，荧光信号采集。
更优选的，所述的反应条件为95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；可选的，40℃恒温孵育15秒，5个循环；40-95℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，荧光信号采集。
优选的，所述的反应体系中引物探针浓度分别是：正向引物(F1/F3/F4/F5/)的浓度分别为30nM-1000nM，反向引物(R1/R3/R4/R5)的浓度分别为30nM-500nM，探针(P1)浓度为150nM-1200nM。
本发明中所述技术方案与现有技术相比，其优点在于：
超多重检测：本发明所述方法可在单管反应中同时进行荧光通道与熔解温度两个维度的分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标；或使用不同的荧光通道，即可实现荧光通道数量与熔解温度特征之乘积的靶标种类检测，例如，当在一个荧光通道设置2个熔解温度检测点，如果有2个荧光通道，即可检测2x2的靶序列，从而实现更多重的检测；并且通过在检测探针上设置阻断区，可以缩短二次扩增产物的扩增长度，提高检测效率，可以有效设置不同靶标的熔解峰值，可以提高熔解温度(Tm值)的分辨率，进一步实现超多重检测。
荧光背景低：每个荧光通道只使用1条探针，即可通过扩增产物的不同熔解温度进行区分，大大降低了PCR反应中的荧光背景，提高了反应灵敏度；
熔解温度可调整：本发明所述方法是利用探针两端同时与扩增产物两端结合使探针拉伸发光，因此通过调整序列h的长度或序列，或调整序列h与检测探针(P)的检测信号结合区(H)的检测信号结合域的反向互补的位置，进而增高或降低与检测探针(P)形成的二次扩增双链产物的熔解温度；
包容性好：本发明所述引物探针设计方法与靶序列只有两部分互补配对，即正向引物(F)和反向引物(R)，相比Taqman水解探针法需要三部分与模板互补配对，在靶序列存在较多高变异区时，如病毒或细菌基因组，本发明所述引物探针设计方法的包容性更好，设计难度更低；
成本低：本发明所述方法只需通过荧光定量PCR在单管反应中完成检测，无需借助额外的下游仪器辅助，也无需通过芯片或多个反应管分割反应，大大降低了仪器和耗材的成本，同时在试剂中减少了荧光探针的数量，大大降低了试剂成本，使得大规模推广成为可能；
单管反应：对样本的消耗少，特别适合用于稀有样本的检测，可以大大提高加入检测反应的样本浓度，提高检测灵敏度，同时单管反应为后续进行免提取一管法检测提供了可能性；
操作简便：仅需使用荧光定量PCR仪进行检测，无后续步骤如毛细管电泳或核酸杂交等，同时配制简单，上机后无需操作；
不容易造成污染：本发明所述方法在加样完成后即完全封闭，无需开盖进行后续检测，大大降低了对实验环境造成污染的可能性；
灵敏度高：本发明所述方法对靶序列的长度要求非常低，当靶标类型是短片段核酸时，例如游离核酸时，更短的靶序列长度在检测中有更高的灵敏度；
适用范围广：本发明可适用于多种样本类型的核酸检测，包括血清样本、血浆样本、全血样本、痰液样本、拭子样本、灌洗液样本、新鲜组织样本、福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)，靶标如细菌、病毒、基因突变等，使得包括基层医院在内的临床单位能够快速的开展常见靶标的检测，如病原微生物感染检测等，辅助其它检测和确诊手段，更快速的为临床提供诊断证据和用药方案，减少患者精神负担和经济负担，达到精准医疗的目的。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
实施例1人乳头瘤病毒HPV 45型的单重检测
表1：探针引物
参见表1，正向引物F1(SEQ ID NO:3)为针对人乳头瘤病毒HPV 45型靶序列设计的特异性引物，F1全长35bp，其3’端第1至第20个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第12个碱基为序列A，与探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第1至12个碱基序列，即第一结合区A’，反向互补。
参见表1，反向引物R1(SEQ ID NO:2)为针对人乳头瘤病毒HPV 45型靶序列设计的特异性引物，R1全长34bp，其3’端第1至第18个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第13个碱基为序列h(h)，与探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第16至28个碱基(即探针的FRET区)序列相同。
反应体系包含以下表2所述的组分：
表2：反应体系
将反应缓冲液和引物探针预混液按照表2所述的反应体系混合，待测核酸模板为人乳头瘤病毒HPV 45型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后按50拷贝/反应与反应体系混合，同时设置无模板对照(NTC)，即用超纯水或1×TE Buffer代替核酸模板，然后进行PCR扩增以及熔解曲线分析。根据靶标在特定检测通道特征Tm值即可判读样本中是否存在HPV45型。
使用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测。其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、70mM(NH4)2SO4等。
所述试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
样本制备：
人乳头瘤病毒HPV 45型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R)对人乳头瘤病毒HPV 45型进行单独检测，以验证单重检测的能力。使用超纯水或1×TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表2中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；45-85℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图1显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV 45型质粒的阳性反应孔在ROX通道中形成Tm值为59℃的熔解峰。
实施例2人乳头瘤病毒HPV 16型的单重检测
表3：引物探针
参见表3，所述正向引物F2(SEQ ID NO:6)，为针对人乳头瘤病毒HPV 16型靶序列设计的特异性引物，F2全长37bp，其3’端第1至第19个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第15个碱基为序列A，与检测探针P2(SEQ ID NO:4)的5’端第1至15个碱基序列，即第一结合区A’反向互补；
参见表3，所述反向引物R2(SEQ ID NO：5)，为针对人乳头瘤病毒HPV16型靶序列设计的特异性引物，R2全长33bp，其3’端第1至第19个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第10个碱基为序列h，与探针P2(SEQ ID NO:4)的3’端第1至10个碱基序列相同。
人乳头瘤病毒HPV 16型检测反应体系包含以下表4所示的组分：
表4：反应体系
将反应缓冲液和引物探针预混液按照表4所述的反应体系混合，待测核酸模板为人乳头瘤病毒HPV16型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后按50拷贝/反应与反应体系混合，同时设置无模板对照(NTC)，即用超纯水或1×TE Buffer代替核酸模板，然后进行PCR扩增以及熔解曲线分析。根据靶标在特定检测通道特征Tm值即可判读样本中是否存在HPV 16型。
使用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测。其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、70mM(NH4)2SO4等。
所述试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
样本制备：人乳头瘤病毒HPV 16型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R)对人乳头瘤病毒HPV 16型进行单独检测，以验证单重检测的能力。使用超纯水或1×TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表4中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；50-90℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图2显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV 16型质粒的阳性反应孔在FAM通道中形成Tm值为80℃的熔解峰。
实施例3人乳头瘤病毒HPV16，31，35和45型的多重检测
表5：引物探针体系
参见表5，所述正向引物F1(SEQ ID NO:3)，F3(SEQ ID NO:7)，F4(SEQ ID NO:9)，F5(SEQ ID NO:11)，分别为针对人乳头瘤病毒HPV45，16，31，35型靶序列设计的特异性引物，全长分别为35bp，33bp，38bp，37bp，其5’端的第1至第12个碱基均为序列A，与检测探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第1至12个碱基序列，即第一结合区A’，反向互补；正向引物F1(SEQID NO:3)，F3(SEQ ID NO:7)，F4(SEQ ID NO:9)，F5(SEQ ID NO:11)的3’端的第1至第20，17，23，22个碱基分别为HPV45，16，31，35型的靶序列特异性引物。
参见表5，所述反向引物R1(SEQ ID NO：2)，R3(SEQ ID NO：8)，R4(SEQ ID NO：10)，R5(SEQ ID NO：12)，为针对人乳头瘤病毒HPV45，16，31，35型靶序列设计的特异性引物，全长分别为34bp，33bp，31bp，34bp。R1(SEQ ID NO：2)的5’端的第1至第13个碱基均为序列h(h)，序列与探针P1(SEQ ID NO:1)的5’端第16至28个碱基序列相同；另外3条R的5’端的第1至第10个碱基均为序列h，分别与检测探针P1(SEQ ID NO:1)3’端的第1至10个碱基，第11至20个碱基，第21至30个碱基序列相同；反向引物R1(SEQ ID NO：2)，R3(SEQ ID NO：8)，R4(SEQ ID NO：10)，R5(SEQ ID NO：12)的3’端的第1至第21，20，18，21个碱基分别为HPV45，16，31，35型的靶序列特异性引物。
多重检测反应体系包含以下表6所示的组分：
表6：反应体系
将反应缓冲液和引物探针预混液按照表6所述的反应体系混合，待测核酸模板为人乳头瘤病毒HPV16，31，35，45型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后按50拷贝/反应分别与反应体系混合，同时设置无模板对照(NTC)，即用超纯水或1×TEBuffer代替核酸模板，然后进行PCR扩增以及熔解曲线分析。根据靶标在特定检测通道特征Tm值即可判读样本中是否存在HPV待测型别。
使用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测。其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、70mM(NH4)2SO4等。
试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
样本制备：
人乳头瘤病毒HPV16，31，35，45型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R)对人乳头瘤病毒HPV16，31，35，45型进行检测，以验证多重检测的能力。使用超纯水或1×TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表4中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；45-85℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图3显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV16，31，35，45型质粒的阳性反应孔分别在ROX通道中形成Tm值为80.2℃，75℃，69.4℃，59.4℃的熔解峰。
实施例4：非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变的单重检测
引物探针体系：
表7：引物探针
参见表7，所述正向引物F6(SEQ ID NO:16)，为针对非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变靶序列设计的特异性引物，F6全长34bp，其3’端第1至第16个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第15个碱基为序列A，与探针P3(SEQ ID NO:13)的5’端第1至15个碱基序列即第一结合区A’反向互补；
参见表7，所述反向引物R6-R7(SEQ ID：14-SEQ ID：15)，皆为针对非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变序列设计的特异性引物，且靶序列结合区序列都是一样的；R6全长34bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第10个碱基与探针P3(SEQ ID NO:13)的3’端的第1至10个碱基序列相同；R7全长34bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第10个碱基与探针P3(SEQ ID NO:13)的3’端第21至30个碱基序列相同。
表8：反应体系
将反应缓冲液和引物探针预混液按照表8所述的反应体系混合，以合适的方法从待测样本中提取核酸加入到配制完成的反应体系中，然后进行PCR扩增以及熔解曲线分析。根据靶标在特定检测通道特征Tm值即可判读样本中病原体的类型。
使用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测。其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、70mM(NH4)2SO4等。
选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。采用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪。
样本制备：
使用非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变靶序列的样本作为阳性样本,分别用带有不同的信号检测区域序列的反向引物(R)对非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变靶序列进行单独检测，以验证单一病毒感染的检测能力。使用纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表8中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；94℃变性10秒，40℃退火延伸15秒，共进行10个循环；50-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。
以非小细胞肺癌EGFR 20号外显子为例，将检测探针上与检测序列互补的检测序列结合域设置在不同位置，可以通过调整下游引物序列，实现最终得到的检测序列扩增产物(即二次扩增产物)与检测探针的熔解曲线熔解峰不同。
图4显示无模板对照孔无熔解峰，而加入非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变的阳性样本反应孔分别在CY5通道中形成Tm值为67.62℃的熔解峰(以F6和R7为第一引物组)。
图5显示无模板对照孔无熔解峰，而加入非小细胞肺癌EGFR 20号外显子H773_V774insH突变的阳性样本反应孔分别在CY5通道中形成Tm值为74.17℃的熔解峰(以F6和R6为第一引物组)。
对比例含阻断区探针与无阻断区探针的多重检测对比
表9：引物探针体系
参见表9，所述正向引物F1(SEQ ID NO:3)，F4(SEQ ID NO:9)，F5(SEQ ID NO:11)，F7(SEQ ID NO:18)分别为针对人乳头瘤病毒HPV45，31，35，59型靶序列设计的特异性引物，其中F1(SEQ ID NO:3)，F4(SEQ ID NO:9)，F5(SEQ ID NO:11)同实施例3，不再赘述。正向引物F7(SEQ ID NO:18)全长33bp，其5’端的第1至第12个碱基均为序列A，与检测探针P1(SEQID NO:1)的5’端第1至12个碱基序列，即第一结合区A’，反向互补；其3’端的第1至第16个碱基为其靶序列特异性引物。
参见表9，所述反向引物R1(SEQ ID NO：2)，R4(SEQ ID NO：10)，R5(SEQ ID NO：12)，R8(SEQ ID NO：19)，为针对人乳头瘤病毒HPV45，31，35，59型靶序列设计的特异性引物，其中R1(SEQ ID NO：2)，R4(SEQ ID NO：10)，R5(SEQ ID NO：12)同实施例3，不再赘述。反向引物R8(SEQ ID NO：19)全长分别36bp，其5’端的第1至第10个碱基均为序列h(h)，与检测探针P1(SEQ ID NO:1)3’端的第1至10个碱基序列相同；其3’端的第1至第23个碱基分别为靶序列特异性引物。
设置两组多重反应体系，体系①使用的探针为P1(SEQ ID NO:1)，为含阻断区探针；体系②使用的探针为P4(SEQ ID NO:17)，为无阻断区探针，其它体系组分均相同，如表10所示，对比两组体系的检测性能。
表10：反应体系
体系①与体系②按照表10所示进行反应缓冲液与引物探针预混液混合。待测核酸模板为人乳头瘤病毒HPV31，35，45，59型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后按50拷贝/反应分别与反应体系混合，同时设置无模板对照(NTC)，即用超纯水或1×TE Buffer代替核酸模板，然后进行PCR扩增以及熔解曲线分析。根据靶标在特定检测通道特征Tm值即可判读样本中是否存在HPV待测型别。
使用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪及试剂耗材进行检测。其中2X PCR Reaction Buffer包括：3mM MgCl2、pH为8.3的30mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、70mM(NH4)2SO4等。
试剂盒的检测结果选用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪分析软件进行数据分析。
样本制备：
人乳头瘤病毒HPV31，35，45，59型质粒，由通用生物(安徽)股份有限公司合成，定量并稀释后作为阳性对照模板,用带有信号检测区域序列的反向引物(R)对人乳头瘤病毒HPV31，35，45，59型进行检测，以验证多重检测的能力。使用超纯水或1×TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表10中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；45-90℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图8为体系①(含阻断区探针)的多重检测结果，显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV45，35，31，59型质粒的阳性反应孔分别在ROX通道中形成Tm值为59℃，68.2℃，75℃，80.2℃的熔解峰，相邻熔解峰间的Tm差值分别为9.2℃，6.8℃，5.2℃。
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图9为体系②(无阻断区探针)的多重检测结果，显示无模板对照孔无熔解峰，而加入HPV45，35，31，59型质粒的阳性反应孔分别在ROX通道中形成Tm值为74.2℃，77.4℃，80.6℃，83℃的熔解峰，相邻熔解峰间的Tm差值分别为3.2℃，3.2℃，2.4℃。

Claims (21)

1.用于PCR检测靶序列的组合物，所述组合物包括检测探针，所述检测探针包括检测序列结合区，检测基团以及阻断区，
所述检测序列结合区与检测序列或其部分互补，
所述检测探针的检测序列结合区在与检测序列特异性结合后，所述检测序列扩增大于等于0个nt，获得检测序列扩增产物，
所述检测序列结合区不包含与所述靶序列互补或相同的序列，
如果所述检测探针与所述检测序列的结合位点在所述阻断区的下游，所述阻断区阻断检测序列的继续延伸，
所述检测探针上的检测基团在检测探针与检测序列或检测序列扩增产物杂交条件下发出的信号与检测探针未与检测序列或检测序列扩增产物杂交条件下发出的信号不同。
2.根据权利要求1的组合物，所述检测序列不包含靶序列或其部分，或与靶序列或其部分互补的序列，
所述组合物还包含辅助探针，所述辅助探针包括检测序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与靶序列或其部分互补的序列。
3.根据权利要求2的组合物，所述组合物包含针对n条靶序列的n个辅助探针和m条检测探针，其中1≤n≤20，1≤m≤n，
优选地，所述n个辅助探针包含的检测序列彼此不同，
优选地，所述每个检测探针上包含与至少两种检测序列或其部分互补的检测序列结合区，所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域，
优选地，所述组合物包含针对n条靶序列的n个辅助探针和1条检测探针，并且所述检测序列结合区包含针对n种检测序列的≥n个检测序列结合域，其中各检测序列结合域以直接连接的形式排列，以连接序列连接的形式排列，或以存在部分或全部重叠的形式排列。
4.根据权利要求3的组合物，所述组合物还包含分别针对n条靶序列的n条上游寡核苷酸序列，所述上游寡核苷酸序列包含与相应靶序列互补的序列，并且所述上游寡核苷酸序列在与靶序列杂交后，位于辅助探针的上游远端，或位于辅助探针的上游邻近，或与辅助探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列，
优选地，所述上游寡核苷酸序列为特异于靶序列的上游引物或者特异于靶序列的上游探针。
5.根据权利要求4的组合物，所述组合物还包含分别针对n条靶序列的n条下游寡核苷酸序列，所述下游寡核苷酸序列包含与相应靶序列互补的序列；并且，当与所述靶序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的下游。
6.根据权利要求1的组合物，所述检测序列包含靶序列或其部分，或与靶序列或其部分互补的序列，
所述组合物包含检测探针和第一引物组，所述第一引物组包括互为正向引物和反向引物的第一引物和第二引物，
所述检测探针包括第一结合区A’，检测序列结合区H和第一阻断区，如果所述检测探针与所述检测序列的结合位点在所述第一阻断区的下游，所述第一阻断区用于阻断检测序列的延伸，
优选地，所述第一引物包括与所述检测探针的第一结合区A’部分或全部互补的序列A，所述第二引物包括与所述检测探针的检测序列结合区H部分或全部相同的序列h，
所述第一结合区A’，检测序列结合区H，序列A和序列h不与靶序列或其任意片段互补或相同，
优选地，所述检测探针上的检测基团位于所述第一阻断区的下游。
7.根据权利要求6的组合物，所述检测探针包括：
一个检测序列结合区H和一个第一结合区A’；或
两个检测序列结合区H和一个第一结合区A’，两个检测序列结合区H分别位于第一结合区A’的两侧；或
一个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，两个第一结合区A’分别位于检测序列结合区H的两侧；或
两个检测序列结合区H和两个第一结合区A’，所述检测序列结合区H和第一结合区A’间隔排列。
8.根据权利要求6的组合物，所述组合物包含针对n条靶序列的m条检测探针和n个第一引物组，其中1≤n≤20，1≤m≤n，
并且，所述m条检测探针至少包含与n种检测序列或其部分互补的检测序列结合域，
其中各检测序列结合域以直接连接的形式排列，以连接序列连接的形式排列，或以存在部分或全部重叠的形式排列。
9.根据权利要求6的组合物，所述检测探针的3’末端设有第二阻断区，以阻止检测探针3’端的延伸。
10.根据权利要求6的组合物，所述第一引物从5’端至3’端依次包括序列A和靶序列结合区；
所述第二引物从5’端至3’端依次包括序列h和靶序列结合区。
11.根据权利要求6的组合物，所述探针引物组包含针对n条靶序列的m条检测探针和n个第一引物组，其中1≤n≤20，1≤m≤n，
优选地，所述探针引物组包含一条检测探针，并且所有第一引物组扩增不同的靶序列得到的检测序列与检测探针杂交并扩增获得扩增产物，所述扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度彼此不同，
优选地，所有第一引物组扩增不同的靶序列得到的检测序列与检测探针杂交并扩增获得扩增产物，所述扩增产物与检测探针形成的杂交体的退火温度彼此差值△Tm为6～10℃，
优选地，所有第一引物所包括的靶序列结合区彼此不同，和/或所有第二引物所包括的靶序列结合区彼此不同。
12.反应体系，其包括权利要求1-11任一项的组合物。
13.检测试剂盒，其包括权利要求1-11任一项的组合物或权利要求12的反应体系。
14.检测方法，所述方法包括利用权利要求1-11任一项的组合物，权利要求12的反应体系或权利要求13的检测试剂盒进行PCR的步骤。
15.根据权利要求14的方法，所述方法包括：
(1)在允许杂交的条件下，将检测样品与上游寡核苷酸序列和辅助探针进行反应；
(2)在允许切割辅助探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸内切酶活性和/或5'核酸外切酶活性的酶反应；
(3)在允许杂交的条件下，将步骤(2)的产物与检测探针进行反应；
(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶反应；
(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述靶序列是否存在于所述检测样品中，
优选地，在允许核酸杂交的条件下，将检测样品与上游寡核苷酸序列、辅助探针和下游寡核苷酸序列进行反应，以靶序列为模板，以上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物，进行扩增，
优选地，将n种上游引物，n种下游引物，n种辅助探针分别与对应的n种靶序列杂交；随后，在核酸聚合酶的作用下，所有的上游引物和下游引物分别被延伸，并且每一种上游引物的延伸导致对应的辅助探针被具有5'核酸内切酶活性和/或5'核酸外切酶活性的酶切割，从而释放出辅助片段；然后，辅助片段分别杂交至检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生n种延伸产物；所述n种延伸产物与检测探针形成了n种具有不同Tm值的杂交体。
16.根据权利要求14的方法，所述方法利用第一引物组与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条作为检测序列，所述检测序列包含序列A，靶序列，序列h的互补序列h’；
所述检测探针与检测序列或检测探针与检测序列的扩增产物在未杂交和杂交条件下，形成被仪器检测的信号变化，来判断是否有靶序列的存在。
17.根据权利要求16的方法，所述方法包括将第一引物与第二引物分别与靶序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，所述双链预扩增产物的其中一条作为检测序列，所述检测序列包含序列A，靶序列，序列h的互补序列h’；所述检测探针的检测序列结合区H与所述检测序列的序列h的互补序列h’互补配对，所述检测探针的第一结合区A’与所述检测序列的序列A互补配对,所述作为检测序列的3’端可继续延伸大于等于0个nt到检测探针(P)的5’端或第一阻断区，得到检测探针(P)的部分或全部反向互补序列作为检测探针(P)与检测序列的扩增产物。
18.根据权利要求16的方法，所述信号变化是指荧光信号的变化，或者熔解温度曲线的变化；优选地，所述信号变化是指熔解温度曲线的变化。
19.权利要求1-11任一项的探针引物组，权利要求12的反应体系，权利要求13的检测试剂盒或权利要求14的检测方法在进行PCR检测中的应用。
20.权利要求19的应用，其是在进行单管超多重PCR或数字PCR检测中的应用。
21.权利要求1-11任一项的探针引物组，权利要求12的反应体系，权利要求13的检测试剂盒，或权利要求14-18任一项的方法在检测病原微生物，无创的出生缺陷筛查，单核苷酸多态性分析，甲基化分析，基因突变分析，或基因分型中的应用。
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