KR20200068738A

KR20200068738A - 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물

Info

Publication number: KR20200068738A
Application number: KR1020207015112A
Authority: KR
Inventors: 박재진; 김민서
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-06-15
Also published as: EP3719142A4; JP7175326B2; US11634760B2; US20210002696A1; CN111511925B; CN111511925A; WO2019107893A2; JP2021509821A; WO2019107893A3; KR102371222B1; EP3719142A2

Abstract

본 발명은 표적핵산의 존재 하에서 임의의 대리표적이 함께 증폭되도록 유도하는 표적핵산 검출 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 표적핵산이 존재할 경우, 표적핵산과 임의의 대리표적 간의 융합 증폭산물(fusion amplicon)이 생성되도록 유도하며, 상기 융합 증폭산물을 증폭하여 표적핵산 검출의 고효율 및 고민감도를 구현하는 방법 및 상기 방법 구현을 위한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 표적핵산 검출 방법은 중합효소연쇄반응 산물의 염기서열 일부를 임의로 조정할 수 있으며, 결과적으로 표적핵산 염기서열에 대한 의존도가 최소화되어 만약 구아닌/시토신 비중이 지나치게 높아 해당 부위 검출이 어려운 표적핵산이라고 하더라도 이에 대한 검출을 효과적으로 수행할 수 있으며, 상기 대리표적의 표적핵산 상보적 염기서열 부위와 증폭 프라이머 상보적 염기서열 부위 사이에 임의의 염기서열을 삽입할 수 있으므로, 이러한 임의의 염기서열 부위와 혼성화하는 범용(universal) 프로브를 제작함으로써, 표적핵산의 염기서열이 변경되더라도 상기 범용 프로브는 계속 사용이 가능한 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 표적핵산 검출 방법은 상기 대리표적의 주입량을 조절하여 쉽게 표적핵산 검출의 민감도만을 독립적으로 조정할 수 있으며, 진단제품 개발 시 민감도의 최적화 과정에서 검출 효율이 변동되는 것을 최소화할 수 있어 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암진단, 유전관련 진단, 유전형질 진단, 감염균의 진단, 약제내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종판별 등에 유용하다.

Description

표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물

본 발명은 표적핵산(target nucleic acid) 염기서열에 대한 의존도를 최소화 할 수 있는 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 검출 민감도(sensitivity)를 증가시키는 과정에서 표적핵산 증폭 효율의 변화를 최소화 할 수 있는 표적핵산 증폭방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적핵산이 존재할 경우, 표적핵산과 임의의 대리표적(surrogate target) 간의 융합 증폭산물(fusion amplicon)이 생성되도록 유도하며, 상기 융합 증폭산물을 증폭하여 표적핵산 증폭의 고효율 및 고민감도를 구현하는 방법, 상기 표적핵산과 임의의 대리표적 간의 융합 증폭산물 생성 과정에서 대리표적의 주입량만을 조절하여 표적핵산 검출 민감도를 효과적으로 조정하는 방법 및 상기 방법 구현을 위한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)용 조성물에 관한 것이다.

지구상 모든 생명체가 가진 유전정보는 각 개체가 지닌 고유한 속성의 근원이 되며 이는 핵산(DNA 또는 RNA) 이라는 물질에 아데닌(A; adenine), 구아닌(G; guanine), 시토신(C; cytosine), 티민(T; thymine), 우라실(U; uracil)의 염기가 배열된 순서로 기록된다. 따라서 이러한 염기의 순서(염기서열)를 밝히거나 확인하는 일은 생명체의 속성을 확인하고 내재된 대사 기작을 이해하기 위한 과정이 될 수 있다.

최근 생명체의 특정 염기서열을 검출 또는 확인하는 방법을 통해 생명체의 존재 여부 또는 그 속성을 확인하는 분자진단(molecular diagnostics)법이 널리 활용되고 있다. 의학적으로 활용되는 분자진단의 대표적인 예로 인간의 암 발생과 관계된 유전자 돌연변이(mutation)를 검출하거나 인간에게 발생할 수 있는 감염 질환의 원인 병원체를 검출하는 것이 있고, 그 외 식품에 존재하는 유해 미생물을 검출하는 검사 역시 분자진단에 속한다.

특정 염기서열을 특이적으로 확인하기 위한 분자진단의 여러 기법 중 대다수가 핵산 중합효소(DNA polymerase)를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용한다. 상기 중합효소연쇄반응은 특정 염기서열 부위를 포함하는 표적핵산(target nucleic acid)에 특이적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 1쌍의 프라이머(primer) 및 상기 프라이머를 시발체로 하여 표적핵산을 주형으로 중합효소연쇄반응을 일으킬 수 있는 내열성(thermo-stable) 핵산 중합효소를 포함한 조성물, 그리고 상기 조성물에 정해진 온도를 단계적이고 반복적으로 부여할 수 있는 장치(thermal cycler)를 통해 이루어진다. 또한 상기 중합효소연쇄반응을 통한 분자진단은 대량으로 형성된(증폭된) 표적핵산 내 특정 염기서열을 실시간으로 검출하기 위해 핵산 결합 염료(nucleic acids-binding dye) 또는 프로브(probe)를 활용하는데, 이러한 것들을 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)이라 부른다(Higuchi, R. et al., Biotechnology 1992. 10:413-417, Higuchi, R. et al., Biotechnology 1993. 11:1026-1030).

현재까지의 대다수 분자진단 방법들은 상기 중합효소연쇄반응을 통해 표적핵산의 존재 여부 또는 그 속성을 확인하면서 해당 표적핵산을 직접 증폭하는 방식을 사용해왔다. 표적핵산 증폭에는 1쌍 이상의 프라이머가 사용되며, 상기 프라이머는 반드시 표적핵산과 상보적이어야 하므로 임의로 염기서열을 조정할 수 있는 기회가 많지 않았다. 그러한 이유로 표적핵산의 염기서열 특성이 분자진단의 성능에 직접적인 영향을 주었고, 만약 표적핵산이 높은 구아닌/시토신 비중(G/C content)을 가지고 있으면 2차구조(secondary structure) 형성 및 지나치게 높은 융해온도(melting temperature)를 나타내게 되어 상기 중합효소연쇄반응 시의 증폭 효율이 크게 감소하였으며, 진단 제품 개발의 주요 장애요소로 지적되었다(McDowell, D. G. et al., Nucleic Acids Res. 1998. 26:3340-3347).

게다가, 현재까지의 많은 분자진단 방법들은 상기 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 표적핵산의 존재 여부 또는 그 속성을 확인하면서 형광 신호를 발생시킬 수 있는 프로브를 활용해왔다. 상기 프로브 또한 표적핵산을 증폭하는 프라이머와 마찬가지로 표적핵산에 상보적인 염기서열을 가지고 있어야 하며, 이로 인해 표적핵산을 변경할 경우 프로브도 반드시 변경해야 하는 비효율적 측면이 있었다. 만약 표적 특이적인 프로브가 아닌 핵산 결합 염료를 사용하여 중합효소연쇄반응 산물을 검출할 경우, 표적핵산 변경에 따라 핵산 결합 염료를 변경할 필요는 없지만, 상기 핵산 결합 염료가 표적핵산의 염기서열을 구별하지 못하므로, 표적 특이적 검출에 한계가 존재하는 문제점이 있는 실정이다.

또한, 표적핵산의 증폭 효율은 실시간 중합효소연쇄반응에서 증폭곡선(amplification curve)의 기울기로 평가할 수 있고, 표적핵산 검출 민감도는 증폭곡선으로부터 산출된 Ct (cycle threshold) 값으로 나타내질 수 있는데, 현재까지의 대다수 분자진단 방법들은 상기 표적핵산의 증폭 효율 또는 검출 민감도를 최적화하면서 주로 프라이머의 염기서열이나 주입량만을 조절할 수밖에 없었기에 상기 증폭 효율과 검출 민감도를 독립적으로 조정하는 것이 어려워 최적화에 많은 시간과 비용이 소요되는 단점이 있었다. 즉, 프라이머의 염기서열이나 주입량이 변하였을 때 상기 증폭 효율과 검출 민감도가 동시에 변하며, 이 때문에 검출 민감도를 향상시키는 과정에서 증폭 효율을 컨트롤하는 것이 어려워 많은 시행착오가 요구되었다.

이에, 본 발명자들은 표적핵산의 성질에 제한받지 않으면서 표적핵산을 증폭할 수 있는 방법 및 핵산 증폭 효율에 미치는 영향을 최소화하면서 표적핵산 증폭의 민감도(sensitivity)를 효과적으로 증가시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 표적핵산과 혼성화 하는 탐색 프라이머; 표적핵산과 결합하는 서열 및 임의의 서열을 포함하는 대리표적(surrogate target); 및 대리표적을 증폭할 수 있는 증폭 프라이머를 이용하여 융합 증폭산물(fusion amplicon)을 생성하는 방법으로 PCR을 수행할 경우, 표적핵산에 대한 의존도가 최소화 될 뿐만 아니라, 고민감도와 고효율로 표적핵산을 증폭할 수 있고, 또한 상기 대리표적의 양을 조절하면 표적핵산 증폭 민감도만을 독립적으로 쉽게 조정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 표적핵산에 대한 의존도를 최소화할 수 있는 표적핵산의 증폭방법 및 핵산 증폭 효율에 미치는 영향을 최소화하면서 표적핵산 증폭 민감도(sensitivity)를 효과적으로 조정할 수 있는 표적핵산 증폭방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 표적핵산에 대한 의존도를 최소화할 수 있으며 표적핵산 증폭 민감도를 효과적으로 조정할 수 있는 표적핵산 증폭용 중합효소연쇄반응(PCR) 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) i) 표적핵산과 혼성화(hybridization)할 수 있는 한 개 이상의 탐색 프라이머(primer); ii) 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열을 포함하는 한 개 이상의 대리표적(surrogate target); 및 iii) 상기 대리표적을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 증폭 프라이머를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 융합 증폭산물(fusion amplicon)의 존재 여부를 판별하는 단계를 포함하는 표적핵산 증폭방법을 제공한다.

본 발명은 또한, i) 표적핵산과 혼성화할 수 있는 한 개 이상의 탐색 프라이머; ii) 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열을 포함하는 한 개 이상의 대리표적; 및 iii) 상기 대리표적을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 증폭 프라이머를 포함하는 표적핵산 증폭용 중합효소연쇄반응 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 구현에 필요한 구성물 및 구성물 간 혼성화 관계를 도시한 것으로, (a)는 탐색 프라이머와 대리표적이 동일한 표적핵산 가닥에 결합하는 경우를, (b)는 탐색 프라이머와 대리표적이 서로 다른 표적핵산 가닥에 결합하는 경우를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 구현에 사용될 수 있는 대리표적의 구조들을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명을 통한 실시예에서 얻어지는 융합 증폭산물(a)과 일반적인 중합효소연쇄반응에서 얻어지는 증폭산물(b)을 비교하여 도시한 것이다.
도 4는 본 발명을 통한 실시예에서, 융합 증폭산물을 형성하는 가능한 기작 중 하나를 도시한 것으로, (a)는 표적핵산과 탐색 프라이머, 대리표적 및 증폭 프라이머 간 혼성화 관계를 도시한 것이고, (b)는 증폭 프라이머에 의해 대리표적의 반대편 핵산 가닥이 합성되는 것을 나타내며, (c)와 (d)는 (b)에서 합성된 상기 대리표적의 반대편 핵산 가닥이 표적핵산에 결합 후 신장(extension)되는 것을 나타내고, (e)와 (f)는 (d)에서 합성된 상기 신장된 대리표적의 반대편 가닥에 탐색 프라이머가 결합 후 신장되는 것을 의미하며, (g)는 (d) 및 (f)에서 합성된 상기 신장된 대리표적의 반대편 가닥 및 탐색 프라이머 신장 가닥에 또다른 탐색 프라이머 및 증폭 프라이머가 결합하여 합성이 진행되는 과정을 반복 수행하는 것을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명을 통한 실시예에서, 융합 증폭산물을 형성하는 가능한 기작 중 하나를 도시한 것으로, (a)는 표적핵산과 탐색 프라이머, 대리표적 및 증폭 프라이머 간 혼성화 관계를 도시한 것이고, (b)는 표적핵산에 결합한 탐색 프라이머 및 대리표적에 결합한 증폭 프라이머가 신장되어 새로운 핵산 가닥을 합성하는 것을 나타내며, (c)는 (b)에서 합성한 탐색 프라이머와 증폭 프라이머 신장 가닥이 분리된 후 서로 간에 혼성화가 일어나 융합 증폭산물 생성이 시작되는 것을 의미하고, (d)는 생성이 완료된 융합 증폭산물을 의미하며, (e)는 (d)에서 생성된 융합 증폭산물에 또다른 탐색 프라이머 및 증폭 프라이머가 결합하여 합성이 진행되는 과정을 반복 수행하는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명을 통한 실시예에서, 융합 증폭산물을 형성하는 가능한 기작 중 하나를 도시한 것으로, (a)는 표적핵산과 탐색 프라이머, 대리표적 및 증폭 프라이머 간 혼성화 관계를 도시한 것이고, (b)는 표적핵산에 결합한 탐색 프라이머 및 대리표적에 결합한 증폭 프라이머가 신장되어 새로운 핵산 가닥을 합성하는 것을 나타내며, (c)와 (d)는 (b)에서 합성된 증폭 프라이머 신장 가닥이 또다른 표적핵산에 결합한 후 추가 신장되는 것을 의미하고, (e)와 (f)는 (d)에서 추가 신장된 증폭 프라이머 신장 가닥에 탐색 프라이머가 결합 후 신장되는 것을 의미하며, (g)는 (d) 및 (f)에서 합성된 상기 증폭 프라이머 신장 가닥 및 탐색 프라이머 신장 가닥에 또다른 탐색 프라이머 및 증폭 프라이머가 결합하여 합성이 진행되는 과정을 반복 수행하는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명을 통한 실시예에서, 융합 증폭산물을 형성하는 가능한 기작 중 하나를 도시한 것으로, (a)는 표적핵산과 탐색 프라이머, 대리표적 및 증폭 프라이머 간 혼성화 관계를 도시한 것이고, (b)는 표적핵산에 결합한 탐색 프라이머 및 대리표적이 신장되어 새로운 핵산 가닥을 합성하는 것을 나타내며, (c)와 (d)는 (b)에서 합성된 대리표적 신장 가닥에 또다른 탐색 프라이머가 결합 후 신장되는 것을 나타내고, (e)는 (b) 및 (d)에서 합성된 상기 대리표적 신장 가닥 및 탐색 프라이머 신장 가닥에 또다른 탐색 프라이머 및 증폭 프라이머가 결합하여 합성이 진행되는 과정을 반복 수행하는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 구현에 사용될 수 있는 길잡이 프라이머의 역할을 도시한 것이다. 길잡이 프라이머는 탐색 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산 표적부위의 양을 증가시킴으로써 미량의 표적핵산이 존재하는 조건에서 융합 증폭산물 생성을 촉진할 수 있다.
도 9는 본 발명을 통한 실시예에서, 인간 유전체 내 상피세포 성장인자 수용체(EGFR; Epidermal growth factor receptor) 유전자의 증폭 및 검출 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명을 통한 실시예에서, 길잡이 프라이머를 이용한 인간 유전체 내 상피세포 성장인자 수용체 유전자의 증폭 및 검출 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명을 통한 실시예에서, 다양한 형태의 대리표적을 이용한 인간 유전체 내 상피세포 성장인자 수용체 유전자의 증폭 및 검출 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명을 통한 실시예에서, 구아닌/시토신 비중이 상대적으로 높은 인간 유전체 내 HRAS 유전자의 증폭 결과를 도시한 것으로, 본 발명의 표적핵산 증폭 방법(A)과 통상의 표적핵산 증폭 방법(B)을 비교한 것이다.
도 13은 본 발명을 통한 실시예에서, 구아닌/시토신 비중이 상대적으로 높은 인간 유전체 내 HRAS 유전자의 증폭 및 검출 결과를 도시한 것으로 본 발명의 표적핵산 증폭 방법(A)과 통상의 표적핵산 증폭 방법(B)을 비교한 것이다.
도 14는 본 발명을 통한 실시예에서, 인간 유전체 내 상피세포 성장인자 수용체 유전자 검출의 민감도 조정 결과를 도시한 것으로, 본 발명의 민감도 조정 방법(A) 및 통상의 민감도 조정 방법(B)을 비교한 것이다.
도 15는 본 발명을 통한 실시예에서, 인간 유전체 내 EGFR 유전자와 HRAS 유전자의 다중 증폭 및 검출 결과를 도시한 것으로, EGFR 유전자 표적의 주입량이 HRAS 유전자 표적 대비 더 많은 조건(A)과 HRAS 유전자 표적의 주입량이 EGFR 유전자 표적 대비 더 많은 조건(B)에서 본 발명의 표적핵산 증폭 방법과 통상의 표적핵산 증폭 방법을 비교한 것이다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 표적핵산의 의존도를 최소화 한 상태에서 표적핵산을 증폭할 수 있는 지를 확인하고자 하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인간 EGFR 유전자의 exon 20, codon 790 인근 부분에 대하여, 표적핵산 센스(sense) 가닥(strand)에 결합할 수 있는 탐색 프라이머(primer), 탐색 프라이머의 다운스트림(downstream)에 해당하는 표적핵산 서열에 상보적인 서열 및 임의의 서열을 포함하는 대리표적(surrogate target) 및 대리표적의 임의의 서열 일부에 결합할 수 있는 증폭 프라이머를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.

그 결과, 인간 EGFR 유전자의 exon 20, codon 790 인근 부위와 대리표적의 융합 증폭산물(fusion amplicon)이 정상적으로 형성되어 검출용 프로브(probe)를 통해 상기 융합 증폭산물이 검출됨을 확인할 수 있었고(도 9), 표적핵산 안티센스(antisense) 가닥에 결합할 수 있는 길잡이 프라이머를 추가로 투입한 결과, 인간 EGFR 유전자 검출의 민감도(sensitivity)가 반응 당 10 copies 수준으로, 매우 고민감도의 검출이 가능함을 확인하였다(도 10).

본 발명의 또다른 일 실시예에서는 구아닌/시토신(G/C)의 평균적인 함량이 높아 통상의 중합효소연쇄반응 방법으로는 증폭이 어려운 인간 HRAS 유전자의 exon 2, codon 12~13 인근 부분에 대하여, 표적핵산의 센스 가닥에 결합하는 탐색 프라이머, 탐색 프라이머의 다운스트림에 해당하는 표적핵산 서열의 안티센스 가닥에 상보적인 서열 및 임의의 서열을 포함하는 대리표적, 대리표적의 임의의 서열 일부와 동일한 서열을 가지는 증폭 프라이머 및 표적핵산 안티센스 가닥에 결합할 수 있는 길잡이 프라이머를 주입하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

그 결과, 대리표적 및 증폭 프라이머가 포함되지 않은 통상의 방법과 비교하여 더 높은 증폭 효율 및 정확도로 HRAS 유전자 exon 2, codon 12~13 부분을 검출할 수 있었다(도 13).

또한 본 발명에서는 표적핵산 검출 민감도를 임의로 조정할 때 핵산 증폭 효율에 대한 영향을 최소화할 수 있는지 확인하고자 하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 EGFR 유전자의 exon 20, codon 790 인근 부분에 대하여, 표적핵산 센스 가닥에 결합할 수 있는 탐색 프라이머, 탐색 프라이머의 다운스트림에 해당하는 표적핵산 서열에 상보적인 서열 및 임의의 서열을 포함하는 다양한 양(0.01 fmole, 0.1 fmole, 1 fmole, 10 fmole)의 대리표적, 대리표적의 임의의 서열 일부에 결합할 수 있는 증폭 프라이머 및 표적핵산 안티센스 가닥에 결합할 수 있는 길잡이 프라이머를 주입하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

그 결과, 통상의 방법에서 프라이머의 농도의 증감으로 표적핵산 검출 민감도를 조정하는 경우 핵산 증폭 효율도 함께 변화하는 것과는 대조적으로 대리표적의 주입량 조절로 표적핵산 검출 민감도를 조정하는 경우 핵산 증폭 효율이 일정하게 유지되는 양상을 확인할 수 있었다(도 14).

따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) i) 표적핵산과 혼성화(hybridization)할 수 있는 한 개 이상의 탐색 프라이머(primer); ii) 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열을 포함하는 한 개 이상의 대리표적(surrogate target); 및 iii) 상기 대리표적을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 증폭 프라이머를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 융합 증폭산물(fusion amplicon)의 존재 여부를 판별하는 단계를 포함하는 표적핵산의 증폭방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 “표적핵산”은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종(species), 아종(subspecies), 또는 변종(variant) 유래의 유전자 염기서열 또는 동일 종 내 유전자 돌연변이를 포함한다. 이는 genomic DNA와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 표적핵산은 중합효소연쇄반응을 위한 조건 하에서 탐색 프라이머, 길잡이 프라이머, 대리표적과 혼성화하며, 프로브(probe)도 표적핵산의 일부 또는 전부와 혼성화될 수 있다.

본 발명에서 용어 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.

본 발명에서 용어 “탐색 프라이머”는 표적핵산과 혼성화하여 중합효소연쇄반응을 통해 상기 융합 증폭산물을 형성 및 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.

본 발명에서 용어 “증폭 프라이머”는 상기 대리표적이 탐색 프라이머와 표적핵산의 같은 가닥에 혼성화 할 경우, 대리표적의 임의의 서열 일부와 혼성화하여 중합효소연쇄반응을 통해 상기 융합 증폭산물을 형성 및 증폭할 수 있는 프라이머를 의미하며, 상기 대리표적이 탐색 프라이머와 표적핵산의 반대 가닥에 혼성화 할 경우, 대리표적의 임의의 서열 일부와 동일한 서열로서, 상기 융합 증폭산물을 형성 및 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.

본 발명에서 상기 증폭 프라이머는 증폭 하고자 하는 표적 핵산이 여러 종류일 경우, 하나의 증폭 프라이머로 여러 종류의 표적을 한꺼번에 증폭 시킬 수 있는 유니버셜 프라이머로서의 기능을 수행할 수 있다. 즉, 일반 다중 PCR은 검출하고자 하는 타겟 (target) 숫자만큼 정방향 및 역방향 프라이머를 쌍으로 만들어서 동시에 사용해야 하는데 비해, 본 발명의 방법은 여러 개의 다중 표적 DNA를 동시에 검출하는 실시간 PCR 과정에서 정방향 프라이머(탐색 프라이머)만 검출하고자 하는 타겟 숫자만큼 사용하고 역방향 프라이머(증폭 프라이머)는 유니버셜 프라이머로서 1개만 사용해도 됨으로써, 여러 타겟을 동시에 검출하고자 할 때 작은 수의 프라이머만을 사용해도 되기 때문에 PCR의 복잡성 및 PCR 효율의 편차가 감소된다.

본 발명에서 용어 “융합 증폭산물”은 탐색 프라이머와 대리표적, 증폭 프라이머에 의해 형성 및 증폭되며 표적핵산의 일부와 대리표적의 전부 또는 일부 염기서열이 융합된 형태의 산물을 의미한다. 바람직한 실시예에서 융합 증폭산물의 형성은 핵산 중합 효소의 5’-3’ exonuclease 또는 flap endonuclease 활성에 의해 유도될 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위는 탐색 프라이머의 다운스트림(downstream)에 존재하며, 상기 탐색 프라이머의 다운스트림은 탐색 프라이머가 표적핵산과 결합한 후, PCR을 통해 신장(extension)되는 방향인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 대리표적은 상기 탐색 프라이머와 쌍을 이루는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 대리표적은 필요한 경우 프라이머로서의 기능을 하지 않기 위해 당업자에게 공지된 모든 방법을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열이 대리표적의 3‘말단 또는 5’말단에 위치하거나, 또는 대리표적의 3‘말단에 핵산중합이 억제되는 작용기 또는 염기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산중합이 억제되는 작용기 또는 염기는 아민기(amine group), 인산기(phosphate group), 알킬기(alkyl group), 알케인-다이올(alkane-diol), 포스포로사이오에이트(phophorothioate), 바이오틴(biotin), 비염기성 링커(non-nucleotide linker), C3-18 스페이서(C3-18 spacer), 디-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(di-deoxynucleotide triphosphate, ddNTP), 역방향 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(inverted deoxynucleotide triphosphate, inverted dNTP) 및 역방향 디-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(inverted di-deoxynucleotide triphosphate, inverted ddNTP)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 탐색 프라이머, 대리표적 및 증폭 프라이머는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), LNA (locked nucleic acid) 및 PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나 또는 이들의 혼합으로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대리표적은 표적핵산과 혼성화할 수 있으면서 탐색 프라이머와 증폭 프라이머를 통해 융합 증폭산물 형성을 유도하는 핵산이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 10 내지 500개의 염기서열 길이로 제작된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20 내지 150개의 염기서열 길이로 제작된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 대리표적의 표적핵산과 결합하는 부분과 임의의 서열의 길이 비율은 6:4 내지 2:8인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 대리표적의 표적핵산과 결합하는 부분은 40 내지 80℃의 융해온도(Tm; melting temperature)를 가지는 10 내지 50개 길이의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 대리표적의 임의의 서열은 10 내지 100개 길이의 염기서열일 수 있으며, 표적핵산과의 상보성이 없도록 임의로 정해지거나 표적핵산의 종(species)과는 다른 종 유래의 유전체 염기서열로부터 정해지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 대리표적은 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 스페이서의 길이는 1 내지 100개의 염기서열일 수 있고, 더욱 바람직하게는 2 내지 20개의 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 스페이서의 GC 비율은 30%이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5~30%일 수 있고, 가장 바람직하게는 1~10%인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 스페이서는 대리표적에 포함되어 있는 임의의 서열 중에서 증폭 프라이머가 혼성화 하거나 증폭 프라이머가 포함하는 서열을 제외한 서열을 의미하고, 대리표적의 표적핵산과의 혼성화 부위 및 증폭 프라이머가 혼성화 하거나 증폭 프라이머가 포함하는 서열 부위 간 지나친 인접 또는 겹침(overlap)을 방지하는 기능을 하며, 필요한 경우 융합 증폭산물의 GC 비율을 조절하는 기능을 하고, 또한 필요한 경우 상기 스페이서에 결합 가능한 프로브를 이용하여 표적핵산 염기서열이 변경되더라도 동일한 프로브로 검출을 수행하도록 하는 기능을 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 스페이서가 존재하지 않는 대리표적의 경우, 증폭 효율이 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 대리표적은 탐색 프라이머가 혼성화 하는 표적핵산과 같은 가닥 또는 반대 가닥에 혼성화 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 증폭산물의 길이는 50bp 내지 1kbp 인 것을 특징으로 할 수 있고, GC 비율은 35 내지 65%일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40 내지 60%인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 탐색 프라이머는 상기 대리표적에 대한 상보성이 없으며, 대리표적과 혼성화하지 않거나 일부가 혼성화되더라도 핵산 합성 신장이 일어나지 않는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭 프라이머는 표적핵산에 대한 상보성이 없으며, 표적핵산과 혼성화하지 않거나 일부가 혼성화되더라도 핵산 합성 신장이 일어나지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 융합 증폭산물의 존재유무를 판별하는 단계는 상기 융합 증폭산물에 결합 가능한 핵산 결합 염료(nucleic acids-binding dye) 또는 프로브(probe)를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 결합 염료는 인터칼레이팅(intercalating) 물질 또는 DNA 마이너 그루브(minor groove) 결합 물질이면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide), 사이버그린 1(SYBRⓡ Green I), 사이버그린 골드(SYBRⓡ Gold), 에바그린(EvaGreen), 요프로-1(YO-PRO-1), 사이토(SYTO), 베보(BEBO) 및 벡스토(BEXTO)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

PNA (Peptide nucleic acid, 펩티드핵산)는 핵산 염기가 당-인산 골격이 아닌 펩티드 골격에 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다.

PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산 분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 장기 보관이 용이한 장점이 있다.

PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다.

즉, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하며, 1개의 뉴클레오티드 부정합(nucleotide mismatch)에도 융해온도(Tm) 값이 보통 15~20℃ 가량 차이 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP (single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del (insertion/deletion) 등의 염기서열 변화를 검출할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, 융합 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 융합 증폭산물 내 임의의 염기서열 및 표적핵산 염기서열과 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 양 말단에 리포터(reporter)와 소광자(quencher)가 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 프로브는 리포터와 소광자 간 거리가 가까울 때에는 신호 발생이 억제되다가 리포터와 소광자 간 거리가 멀어지면서 신호 세기가 증가한다. 일반적으로 상기 프로브가 상보적 염기서열과 혼성화하였을 때에 리포터와 소광자 간 거리가 가장 멀어지므로 신호 발생 또는 신호 세기 증가를 통해 특정 염기서열을 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), 탐라(TAMRA), 이클립스(Eclipse), DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 융합 증폭산물의 검출은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 이루어지며, 이때 융합 증폭산물의 증폭에 따른 증폭곡선(amplification curve)만을 수득하여 Ct (cycle threshold) 값을 측정하거나, 중합효소연쇄반응 후 융해곡선(melting curve)만을 수득하여 프로브에 의한 융해 피크(melting peak)를 측정하거나, 또는 증폭곡선과 융해곡선을 모두 수득하여 두 결과를 종합하여 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

시료 내 표적핵산이 존재하여 융합 증폭산물이 일찍 증폭될수록, 검출 프로브에 의한 신호 발생량이 일찍 증가하므로 threshold에 도달하는 cycle 수가 줄어들어 Ct 값이 적게 측정되고, 이를 이용하여 표적핵산의 유무를 확인할 수 있다. 또한 융해곡선 분석은 일반적으로 실시간 중합효소연쇄반응의 핵산 증폭 과정 이후에 진행되며, 시료의 온도를 저온(25~55℃ 수준)으로 떨어뜨린 후에 고온(75~95℃ 수준)까지 1 내지 10초당 0.3 내지 1℃씩 증가시키거나 또는 시료의 온도를 고온으로 올린 후에 저온까지 1 내지 10초당 0.3 내지 1℃씩 감소시키면서 신호 패턴을 측정한다. 융합 증폭산물이 증폭된 경우, 상기 융해곡선 분석을 통해 융합 증폭산물과 결합한 프로브의 융해 온도(melting temperature, Tm) 부근에서 신호 패턴 변화가 나타나며, 이를 융해 피크(melting peak)로 분석하여 융합 증폭산물을 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 탐색 프라이머가 혼성화하는 표적핵산 가닥의 반대편 가닥에 혼성화하는 길잡이 프라이머를 추가로 주입하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 탐색 프라미어가 표적핵산의 센스(sense) 가닥과 혼성화할 경우, 길잡이 프라이머는 안티센스(antisense) 가닥과 혼성화하는 것을 의미한다.

본 발명에서 길잡이 프라이머는 상기 탐색 프라이머와 한 쌍을 이루어 일정한 표적핵산 부위의 양을 증가시키는 효과가 있다. 길잡이 프라이머는 상기 대리표적에 대한 상보성이 없으며, 대리표적에 혼성화되지 않거나 일부가 혼성화되더라도 핵산 합성 신장이 일어나지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 길잡이 프라이머의 주역할은 표적핵산이 극미량 존재하는 조건 하에서 표적핵산의 양(copy 수)을 증가시킴으로써 융합 증폭산물의 생성율을 증대시키는 것이다.

본 발명에서 상기 길잡이 프라이머를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응(PCR)은 다음의 두 단계로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다:

1) ‘표적핵산 증폭 단계’로서, 상기 탐색 프라이머와 길잡이 프라이머가 쌍을 이루어 주된 합성반응을 이끄는 단계; 및

2) ‘융합 증폭산물 증폭 단계’로서, 상기 탐색 프라이머 및 대리표적, 증폭 프라이머가 작용하여 융합 증폭산물이 주로 증폭되도록 유도하는 단계.

본 발명에서 상기 단계의 세분화는 주로 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 단계적이고 반복적인 온도 변화(thermal cycling) 중 각 요소들 간 혼성화를 유도하는 단계(annealing step)의 온도를 특별하게 조정함으로써 구현된다. 바람직하게는 상기 표적핵산 증폭 단계에서 annealing step 온도를 높게 설정하고 더불어 상기 탐색 프라이머와 길잡이 프라이머의 융해 온도(melting temperature, Tm) 또한 높게 설정하여 탐색 프라이머와 길잡이 프라이머에 의한 표적핵산 증폭이 우선적으로 나타나도록 할 수 있으며, 상기 융합 증폭산물 증폭 단계에서 annealing step의 온도를 낮추고 상기 증폭 프라이머와 대리표적 내 표적핵산 결합 부위의 융해 온도를 낮게 설정함으로써 융합 증폭산물의 증폭이 일어나도록 유도할 수 있다. 이때 상기 길잡이 프라이머의 양을 제한하면 상기 표적핵산 증폭 단계에서 길잡이 프라이머가 대부분 소진되기 때문에, 결과적으로 각 단계별 필요한 구성요소들만이 반응에 참여하는 방식의 2단계 중합효소연쇄반응을 완성할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, i) 표적핵산과 혼성화(hybridization)할 수 있는 한 개 이상의 탐색 프라이머(primer); ii) 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열을 포함하는 한 개 이상의 대리표적(surrogate target); 및 iii) 상기 대리표적을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 증폭 프라이머를 포함하는 표적핵산 증폭용 중합효소연쇄반응(PCR) 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 탐색 프라이머가 혼성화하는 표적핵산 가닥(strand)의 반대편 가닥에 혼성화 하는 길잡이 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 탐색 프라이머가 표적핵산의 센스(sense) 가닥과 혼성화할 경우, 길잡이 프라이머는 안티센스(antisense) 가닥과 혼성화하는 것을 의미한다.

본 발명에서 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biological sample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 인간, 포유류 및 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는 표적핵산 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 표적핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기, 대리표적과 프라이머를 포함하는 용기 및 상기 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.

상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 인간 상피세포 성장인자 수용체(EGFR; Epidermal growth factor receptor) 유전자의 증폭 및 검출

1.1 프라이머, 대리표적 및 프로브 제작

인간 EGFR 유전자는 체내 신호전달체계에서 기능하는 막 단백질 및 수용체 단백질을 암호화하고 있으며, EGFR 유전자에 돌연변이가 생긴 경우 암이 유발될 수 있다고 알려져 있다(Zhang, H. et al., J. Clin. Invest. 2007. 117:2051-2058).

상기 기술한 인간 EGFR 유전자를 본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 효과적으로 증폭하고 검출하기 위하여, EGFR 유전자의 exon 20, codon 790 인근의 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐색 프라이머 1, 대리표적 1을 설계하였고, 상기 대리표적 1에 혼성화할 수 있는 증폭 프라이머 1을 설계하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 또한 설계된 프라이머들 및 대리표적을 통해 생성 및 증폭되는 융합 증폭산물을 검출할 수 있도록 프로브 1을 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 1과 표 2에 개시하였다.

상기 대리표적 1은 56 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며 5‘말단과 3’말단에는 각각 6 염기서열 길이의 티민(T)과 6 염기서열 길이의 아데닌(A)이 존재하여 대리표적이 프라이머로써 직접적으로 기능하는 것을 방지하였다. 상기 대리표적 1의 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 EGFR 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1과 상보적인 특성을 가진다.

상기 프로브 1은 10 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터인 [ROX]가 각각 부착되어 있고, PNA와 [ROX] 사이에는 [O linker]와 [K (lysine)]을 연결하여 제작하였다. 상기 프로브 1은 상보적 염기서열을 가진 상기 융합 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 융합 증폭산물을 검출할 수 있다.

상기 프로브 1은 상기 대리표적 1의 일부와 동일한 염기서열을 가지는데, 이를 통하여 프로브 1은 대리표적 1에 직접 혼성화하지 않고, 다만 대리표적 1에 상기 증폭 프라이머 1이 혼성화하여 생성된 핵산중합 산물에 혼성화할 수 있다. 그러나 중합효소연쇄반응(PCR) 내 상기 대리표적 1의 주입량이 매우 적기 때문에, 단순히 대리표적 1에 상기 증폭 프라이머 1이 혼성화하여 생성된 핵산중합 산물에 상기 프로브 1이 혼성화하는 것만으로는 증폭곡선 상의 검출 가능한 수준의 신호가 방출되지 않는다. 상기 프로브 1에 의해서 증폭곡선 상의 검출 가능한 수준의 신호 방출이 일어나기 위해서는 상기 대리표적 1의 염기서열 일부를 포함한 상기 융합 증폭산물의 생성이 일어나야하며, 융합 증폭산물에 상기 탐색 프라이머 1과 상기 증폭 프라이머 1이 혼성화하여 융합 증폭산물을 증폭시킴으로써, 프로브 1이 혼성화하는 핵산중합 산물의 양이 크게 증가해야 한다.

1.2 융합 증폭산물 생성 및 확인

약 10,000 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물을 형성하도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 1과 30 pmole의 증폭 프라이머 1, 10 fmole의 대리표적 1, 2 pmole의 프로브 1을 포함한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제조하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소(DNA polymerase)와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 45 cycle의 denaturation [95℃, 10초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다. 상기 매 cycle 마다 ROX channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

중합효소연쇄반응 이후에는, 반응 산물에 대한 융해곡선을 도출하기 위해 denaturation [95℃, 5분] - annealing [35℃, 5분] - melting [35 --> 75℃, 0.5℃ 간격] 과정을 거쳤고, 이때 melting 단계에서 측정된 형광값을 분석하여 융해 피크 결과를 도출하였다.

그 결과, 약 10,000 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되었고, 표적핵산이 존재하지 않는 조건에서는 형광 신호 상승이 나타나지 않아 두 조건을 명확하게 구별할 수 있었다. 또한 표적핵산이 존재하는 조건에서는 56℃ 전후에서 매우 높은 융해 피크가 나타나는 반면, 표적핵산이 존재하지 않는 조건에서는 56℃ 전후에서 융해 피크가 관찰되더라도 그 높이가 현저하게 낮아 융해곡선 상의 융해 피크 높이 차이를 통해서도 두 조건을 구별할 수 있었다(도 9).

실시예 2. 길잡이 프라이머를 포함한 인간 상피세포 성장인자 수용체 유전자의 증폭 및 검출

2.1 길잡이 프라이머 합성

상기 기술한 인간 EGFR 유전자를 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 통해 고민감도로 검출하기 위하여, 상기 탐색 프라이머 1, 대리표적 1, 증폭 프라이머 1, 프로브 1과 더불어 EGFR 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 길잡이 프라이머 1을 설계 및 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 3과 표 4에 개시하였다.

2.2 길잡이 프라이머를 포함한 융합 증폭산물 생성 및 확인

약 10~10,000 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물을 형성하도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 1과 30 pmole의 증폭 프라이머 1, 0.5 pmole의 길잡이 프라이머 1, 10 fmole의 대리표적 1, 2 pmole의 프로브 1을 포함한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제조하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [64℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 30 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다. 상기 두 번째 단계에서 매 cycle 마다 ROX channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

그 결과, 약 10~10,000 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 모든 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되었고, 표적핵산이 존재하지 않는 조건에서는 형광 신호 상승이 나타나지 않아 두 조건을 명확하게 구별할 수 있었다. 또한 표적핵산이 존재하는 조건에서는 56℃ 전후에서 매우 높은 융해 피크가 나타나는 반면, 표적핵산이 존재하지 않는 조건에서는 56℃ 전후에서 융해 피크가 관찰되더라도 그 높이가 현저하게 낮아 융해곡선 상의 융해 피크 높이 차이를 통해서도 두 조건을 구별할 수 있었다(도 10).

실시예 3. 다양한 형태의 대리표적을 통한 인간 상피세포 성장인자 수용체 유전자의 증폭 및 검출

3.1 프라이머, 대리표적 및 프로브 제작

상기 기술한 인간 EGFR 유전자를 다양한 형태의 대리표적을 통해 효과적으로 증폭하고 검출하기 위하여, EGFR 유전자의 exon 20, codon 790 인근의 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐색 프라이머 2, 대리표적 1, 대리표적 2, 대리표적 3, 길잡이 프라이머 1을 설계하였고, 상기 대리표적 1 또는 2에 혼성화할 수 있으며 상기 대리표적 3의 일부 염기서열과 동일한 염기서열의 증폭 프라이머 1을 설계하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 또한 설계된 프라이머들 및 대리표적을 통해 생성 및 증폭되는 융합 증폭산물을 검출할 수 있도록 프로브 2를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 5과 표 6에 개시하였다.

상기 대리표적 2는 50 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며 3’말단에 6 염기서열 길이의 아데닌(A)이 존재하여 대리표적이 프라이머로써 직접적으로 기능하는 것을 방지하였다. 상기 대리표적 2의 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 EGFR 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1과 상보적인 특성을 가진다.

상기 대리표적 3은 44 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 EGFR 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1과 동일한 염기서열인 특성을 가진다.

상기 프로브 2는 12 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터인 [FAM]이 각각 부착되어 있고, PNA와 [FAM] 사이에는 [K]를 연결하여 제작하였다. 상기 프로브 2는 상보적 염기서열을 가진 상기 융합 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 융합 증폭산물을 검출할 수 있다.

3.2 융합 증폭산물 생성 및 확인

약 100 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물을 형성하도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 2와 30 pmole의 증폭 프라이머 1, 4 pmole의 프로브 2를 포함한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제조하였고, 추가적으로 대리표적 1, 대리표적 2, 대리표적 3 중 한 가지를 선택하여 10 fmole을 주입하거나, 대리표적 2와 3을 10 fmole씩 함께 주입하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소(DNA polymerase)와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

대리표적 1의 경우, 도 5와 도 6에 도시된 메커니즘을 포함한 과정들을 통해 융합 증폭산물을 형성할 수 있으며, 대리표적 2의 경우, 도 4에 도시된 메커니즘을 포함한 과정들을 통해 융합 증폭산물이 형성되고, 대리표적 3의 경우, 도 7에 도시된 메커니즘을 포함한 과정들을 통해 융합 증폭산물 생성이 가능하다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [64℃, 30초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다. 상기 두 번째 단계에서 매 cycle 마다 FAM channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

그 결과, 약 100 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 모든 증폭 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되었고, 표적핵산이 존재하지 않는 조건에서는 형광 신호 상승이 나타나지 않아 두 조건을 명확하게 구별할 수 있었다. 또한 표적핵산이 존재하는 조건에서는 52℃ 전후에서 매우 높은 융해 피크가 나타나는 반면, 표적핵산이 존재하지 않는 조건에서는 융해 피크가 관찰되지 않아 이를 통해서도 두 조건을 구별할 수 있었다(도 11).

실시예 4. 인간 HRAS 유전자 내 구아닌/시토신 고비중(high GC content) 영역의 증폭

4.1 프라이머, 대리표적 및 프로브 제작

인간 HRAS 유전자는 세포 내 신호 전달 체계에 관여하는 단백질을 암호화하며, HRAS 유전자의 코돈(codon) 12, 13, 61에 해당하는 부위의 돌연변이(mutation)는 다양한 암 발생과 연관되어 있다고 알려져 있다(Rajasekharan, S. K. and Raman, T. Cent. Eur. J. Biol. 2013. 8:609-624).

상기 기술한 인간 HRAS 유전자의 exon 2 codon 12, 13 부위는 평균적인 구아닌/시토신 비중(G/C content)이 70%에 가까울 정도로 높아 통상의 중합효소연쇄반응(PCR) 방법으로는 고효율 증폭이 어려울 수 있기 때문에, 이를 본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 효과적으로 증폭하고 검출하기 위하여, HRAS 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐색 프라이머 3, 대리표적 4, 길잡이 프라이머 2를 설계하였고, 상기 대리표적 4에 혼성화할 수 있는 증폭 프라이머 2를 설계하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 또한 설계된 프라이머들 및 대리표적을 통해 생성 및 증폭되는 융합 증폭산물을 검출할 수 있도록 프로브 3를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 7와 표 8에 개시하였다.

상기 대리표적 4는 56 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며 5‘말단과 3’말단에는 각각 6 염기서열 길이의 티민(T)과 6 염기서열 길이의 아데닌(A)이 존재하여 대리표적이 프라이머로써 직접적으로 기능하는 것을 방지하였다. 상기 대리표적 4의 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 HRAS 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 2와 상보적인 특성을 가진다.

상기 프로브 3은 9 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자인 [Dabcyl] 2개가 [K (lysine)]을 통해 연결된 형태가, C 말단에는 리포터인 [ROX]가 각각 부착되어 있고, PNA와 [ROX] 사이에는 [O linker]와 [K]을 연결하여 제작하였다. 또한 상기 프로브 3의 염기서열 중 [^]으로 표시된 부분에는 양의 전하를 띠는 작용기(glutamate)를 PNA backbone에 연결하여, 본래 전하를 띠지 않는 PNA backbone에 전하를 도입해 제작하였다. 상기 프로브 3은 상보적 염기서열을 가진 상기 융합 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 융합 증폭산물을 검출할 수 있다.

상기 프로브 3의 염기서열은 상기 탐색 프라이머 3, 증폭 프라이머 2, 대리표적 4, 및 길잡이 프라이머 2 중 어느 것과도 상보적이지 않으며, 다만 상기 길잡이 프라이머 2에 의한 표적핵산의 증폭산물 가닥 및 상기 대리표적 4의 염기서열 일부를 포함한 융합 증폭산물 중 증폭 프라이머 2에 의한 증폭산물 가닥에 상보적인 특징을 가진다. 그러나 상기 길잡이 프라이머 2의 주입량이 매우 적고, 길잡이 프라이머와 쌍을 이루는 탐색 프라이머 3의 주입량이 상대적으로 더 많기 때문에 상기 길잡이 프라이머 2에 의한 표적핵산의 증폭산물 가닥에 상기 프로브 3이 혼성화되는 것만으로는 검출 가능한 수준의 신호를 방출하지 못한다. 반면 상기 융합 증폭산물을 증폭하는 증폭 프라이머 2는 주입량이 매우 크고, 쌍을 이루는 탐색 프라이머 3의 주입량이 상대적으로 더 적기 때문에 융합 증폭산물 중 증폭 프라이머 2에 의한 증폭산물 가닥에 상기 프로브 3이 혼성화 되면 효과적으로 신호를 방출할 수 있고, 이를 통하여 융합 증폭산물만을 선택적으로 검출할 수 있다.

4.2 융합 증폭산물 생성 및 확인

약 25 ng의 추출된 인간 유전체 DNA가 존재하는 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물을 형성하도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 3과 30 pmole의 증폭 프라이머 2, 0.5 pmole의 길잡이 프라이머 2, 10 fmole의 대리표적 4, 4 pmole의 프로브 3을 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [64℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다. 상기 두 번째 단계에서 매 cycle 마다 ROX channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

또한 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 이용한 HRAS exon 2, codon 12, 13 부위 검출과의 성능을 비교하기 위해 대조군인 통상의 중합효소연쇄반응을 이용한 동일 부위 검출을 함께 수행하였으며, 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에서 대리표적 4 및 증폭 프라이머 2를 배제하고, 길잡이 프라이머 2의 주입양을 30 pmole로 증가시킨 대조군용 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다.

대조군용 중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 50 cycle의 denaturation [95℃, 10초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였고, 매 cycle 마다 ROX channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

그 결과, 약 25 ng의 추출된 인간 유전체 DNA가 존재하는 조건에서 구아닌/시토신 함량이 높은 HRAS exon 2, codon 12, 13 부위의 증폭 효율이 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 이용했을 때 확연히 더 높게 나타남을 확인하였다. 즉, 상기 대리표적 4 및 증폭 프라이머 2를 포함하여 상기 융합 증폭산물을 형성하는 방법으로 표적핵산을 검출하는 방법은 표적핵산을 직접 증폭하여 검출하는 통상의 방법 대비 구아닌/시토신 함량이 높은 핵산을 검출하는데 있어서 증폭곡선의 기울기가 약 1.5배가량 더 가파르게 증가하였고, 증폭곡선의 높이도 더 높게 나타났다(도 12). 상기 증폭곡선의 기울기는 서로 다른 2개의 형광값 threshold에 따른 2개의 Ct 값 간 차이를 통해 계산하였으며 그 결과를 표 9에 개시하였다.

실시예 5. 인간 HRAS 유전자 내 구아닌/시토신 고비중(high GC content) 영역의 증폭 및 검출

5.1 프라이머, 대리표적 및 프로브 제작

구아닌/시토신 비중(G/C content)이 높아 통상의 중합효소연쇄반응(PCR) 방법으로는 증폭 및 검출이 어려운 인간 HRAS 유전자의 exon 2 codon 12, 13 부위를 본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 효과적으로 증폭하고 검출하기 위하여, HRAS 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐색 프라이머 3, 대리표적 5, 대리표적 6, 길잡이 프라이머 2를 설계하였고, 상기 대리표적 5 및 대리표적 6에 혼성화할 수 있는 증폭 프라이머 1을 설계하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 또한 설계된 프라이머들 및 대리표적을 통해 생성 및 증폭되는 융합 증폭산물을 검출할 수 있도록 프로브 3를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 10과 표 11에 개시하였다.

상기 대리표적 5는 50 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 HRAS 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1의 염기서열과 동일한 특성을 가진다.

상기 대리표적 6은 60 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 HRAS 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1의 염기서열과 동일한 특성을 가진다.

상기 프로브 3의 염기서열은 상기 탐색 프라이머 3, 증폭 프라이머 1, 대리표적 5, 대리표적 6, 및 길잡이 프라이머 2 중 어느 것과도 상보적이지 않으며, 다만 상기 길잡이 프라이머 2에 의한 표적핵산의 증폭산물 가닥 및 상기 대리표적 5 또는 대리표적 6의 염기서열 일부를 포함한 융합 증폭산물 중 증폭 프라이머 1에 의한 증폭산물 가닥에 상보적인 특징을 가진다. 그러나 상기 길잡이 프라이머 2의 주입량이 매우 적고, 길잡이 프라이머와 쌍을 이루는 탐색 프라이머 3의 주입량이 상대적으로 더 많기 때문에 상기 길잡이 프라이머 2에 의한 표적핵산의 증폭산물 가닥에 상기 프로브 3이 혼성화되는 것만으로는 검출 가능한 수준의 신호를 방출하지 못한다. 반면 상기 융합 증폭산물을 증폭하는 증폭 프라이머 1은 주입량이 매우 크고, 쌍을 이루는 탐색 프라이머 3의 주입량이 상대적으로 더 적기 때문에 융합 증폭산물 중 증폭 프라이머 1에 의한 증폭산물 가닥에 상기 프로브 3이 혼성화 되면 효과적으로 신호를 방출할 수 있고, 이를 통하여 융합 증폭산물만을 선택적으로 검출할 수 있다.

5.2 융합 증폭산물 생성 및 확인

약 25 ng의 추출된 인간 유전체 DNA가 존재하는 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물을 형성하도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 3과 30 pmole의 증폭 프라이머 1, 0.5 pmole의 길잡이 프라이머 2, 50 fmole의 대리표적 5 또는 대리표적 6, 4 pmole의 프로브 3을 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 5분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [64℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다.

중합효소연쇄반응 이후에는, 반응 산물에 대한 융해곡선을 도출하기 위해 denaturation [95℃, 5분] - annealing [25℃, 5분] - melting [25 --> 75℃, 0.5℃ 간격] 과정을 거쳤고, 이때 melting 단계에서 측정된 ROX channel의 형광값을 분석하여 융해 피크 결과를 도출하였다.

또한 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 이용한 HRAS exon 2, codon 12, 13 부위 검출과의 성능을 비교하기 위해 대조군인 통상의 중합효소연쇄반응을 이용한 동일 부위 검출을 함께 수행하였으며, 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에서 대리표적 5, 대리표적 6 및 증폭 프라이머 1을 배제하고, 길잡이 프라이머 2를 포함한 대조군용 프라이머의 주입양을 30 pmole로 증가시킨 대조군용 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다. 사용된 대조군용 프라이머들의 염기서열을 표 12에 개시하였다.

대조군용 중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 5분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [64℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다.

또한 본 발명의 표적핵산 증폭 방법 및 대조군용 중합효소연쇄반응을 통한 HRAS exon 2, codon 12, 13 부위 검출의 위양성(false-positive) 발생 여부를 알아보기 위해 약 25 ng의 추출된 인간 유전체 DNA가 존재하는 조건과 더불어 표적핵산이 주입되지 않은 조건(No template control (NTC))도 함께 테스트하였다.

그 결과, 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 사용한 경우, 인간 유전체 DNA가 주입된 조건에서 구아닌/시토신 함량이 높은 HRAS exon 2, codon 12, 13 부위의 증폭 및 검출이 정상적으로 이루어졌으며, 표적핵산이 주입되지 않은 조건에서는 융해 곡선 상의 융해 피크가 형성되지 않아 위양성이 없음을 확인하였다. 이때 융합 증폭산물 내 표적핵산 염기서열 부위의 구아닌/시토신 함량은 63.1%로 높았으나 대리표적 5 및 대리표적 6의 임의의 염기서열을 통해 융합 증폭산물 전체의 구아닌/시토신 함량이 각각 55.8%, 52.4%로 낮아짐을 확인하였다. 반면 대조군인 통상의 중합효소연쇄반응을 이용한 경우, 각각 63.1%, 68.4%, 69.8%의 구아닌/시토신 함량을 나타내는 3종의 증폭산물을 생성하여 표적핵산 검출을 시도하였으나 상당수의 위양성이 나타나 검출 결과를 신뢰하기 어려웠고(증폭산물 1, 증폭산물 2를 통한 표적핵산 검출 시), 융해 피크가 나타내는 융해온도가 정상 범위를 벗어나거나(증폭산물 2를 통한 표적핵산 검출 시), 융해 피크가 비정상적으로 형성되어(증폭산물 3을 통한 표적핵산 검출 시) 결과적으로 목표했던 표적핵산 증폭 및 검출이 어려움을 확인하였다(도 13).

실시예 6. 인간 상피세포 성장인자 수용체 유전자 검출의 민감도 조정

6.1 프라이머, 대리표적 및 프로브 제작

상기 기술한 인간 EGFR 유전자를 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 통해 검출하되 증폭 효율에 대한 영향을 최소화 하면서 민감도를 임의로 조정하기 위하여, EGFR 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 탐색 프라이머 4, 대리표적 7, 길잡이 프라이머 1과 더불어 상기 대리표적 7에 특이적으로 혼성화될 수 있는 증폭 프라이머 3 및 상기 대리표적 7의 염기서열 일부를 포함하여 생성되는 융합 증폭산물에 특이적으로 혼성화될 수 있는 프로브 2를 설계 및 제조하였다(프라이머 및 대리표적 제조사: Integrated DNA Technologies, Inc., USA, 프로브 제조사: PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 13과 표 14에 개시하였다.

상기 대리표적 7은 52 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며 5‘말단과 3’말단에는 각각 6 염기서열 길이의 티민(T)과 6 염기서열 길이의 아데닌(A)이 존재하여 대리표적이 프라이머로써 직접적으로 기능하는 것을 방지하였다. 상기 대리표적 7의 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 EGFR 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 3과 상보적인 특성을 가진다.

6.2 대리표적 주입량 조절에 따른 융합 증폭산물 생성 및 증폭 확인

약 1,000,000 개(copy)의 표적핵산이 존재하는 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물을 형성하되, Ct 값으로 대표되는 표적핵산 검출 민감도가 조정되도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 4와 30 pmole의 증폭 프라이머 3, 0.5 pmole의 길잡이 프라이머 1, 4 pmole의 프로브 2을 포함한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물에 0.01~10 fmole의 각기 다른 양의 대리표적 7이 주입되도록 제조하였다. 즉, 본래 10 fmole의 양으로 주입되던 상기 대리표적 7을 1배, 0.1배, 0.01배, 0.001배 희석하여 각각 10 fmole, 1 fmole, 0.1 fmole, 0.01 fmole이 주입되도록 제조하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [64℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [58℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다. 상기 두 번째 단계에서 매 cycle 마다 FAM channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

또한 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 이용한 상기 EGFR 유전자의 검출 민감도 조정 성능을 비교하기 위하여 대조군인 통상의 중합효소연쇄반응을 이용한 동일 부위 검출 및 민감도 조정을 함께 수행하였으며, 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에서 대리표적 7 및 증폭 프라이머 3을 배제하고 1.5 pmole의 탐색 프라이머와 30 pmole의 길잡이 프라이머를 1배, 0.5배, 0.25배, 0.1배, 0.01배로 희석 후 주입하여 대조군용 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다.

대조군용 중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 50 cycle의 denaturation [95℃, 10초] - annealing [58℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였고, 매 cycle 마다 FAM channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.

그 결과, 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 이용한 경우 상기 대리표적 7의 주입량 감소에 따라 증폭곡선의 상승이 일정하게 지연됨으로써 Ct 값이 점차 증가하는 모습으로 민감도가 조정되는 것을 관찰하였고, 증폭곡선의 상승이 지연됨에도 증폭곡선의 기울기는 거의 일정하게 유지되어 증폭 효율에 미치는 영향이 최소화됨을 확인하였다. 반면 탐색 프라이머와 길잡이 프라이머의 주입량을 조절한 대조군인 통상의 방법에서는 증폭곡선의 상승이 지연되는 현상이 비슷하게 나타나나 증폭곡선의 상승이 지연됨에 따라 증폭곡선의 기울기가 크게 낮아지는 모습이 관찰되었고, 이를 통해 통상의 방법에서는 민감도 조정이 증폭 효율에 큰 영향을 줄 뿐 아니라 프라이머의 주입량을 크게 감소시킬 경우 표적핵산 증폭이 전혀 일어나지 않을 수 있음을 확인하였다(도 14).

실시예 7. 인간 상피세포 성장인자 수용체 유전자와 HRAS 유전자의 다중 증폭 및 검출

7.1 프라이머, 대리표적 및 프로브 제작

상기 기술한 인간 EGFR 유전자와 HRAS 유전자를 효과적으로 동시 증폭 및 검출하기 위하여, EGFR 유전자의 exon 20, codon 790 인근의 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐색 프라이머 2, 대리표적 2, 대리표적 3, 길잡이 프라이머 1을 설계하였고, 상기 대리표적 2에 혼성화할 수 있으며 대리표적 3의 일부 염기서열과 동일한 염기서열의 증폭 프라이머 1을 설계하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 또한 설계된 프라이머들 및 대리표적들을 통해 생성 및 증폭되는 융합 증폭산물을 검출할 수 있도록 프로브 2를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 그리고 HRAS 유전자의 exon 2 codon 12, 13 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐색 프라이머 5, 대리표적 8, 대리표적 9, 길잡이 프라이머 2를 설계하였고, 상기 대리표적 8에 혼성화할 수 있으며 대리표적 9의 일부 염기서열과 동일한 염기서열의 증폭 프라이머 1을 설계하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., USA). 또한 설계된 프라이머들 및 대리표적들을 통해 생성 및 증폭되는 융합 증폭산물을 검출할 수 있도록 프로브 3을 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머, 대리표적 및 프로브의 염기서열을 표 15과 표 16에 개시하였다.

상기 대리표적 8은 48 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며 3’말단에 6 염기서열 길이의 아데닌(A)이 존재하여 대리표적이 프라이머로써 직접적으로 기능하는 것을 방지하였다. 상기 대리표적 8의 염기서열 중 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 HRAS 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1과 상보적인 특성을 가진다.

상기 대리표적 9는 42 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 인간 HRAS 유전자의 표적 염기서열과 상보적이며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 상기 증폭 프라이머 1과 동일한 염기서열인 특성을 가진다.

7.2 융합 증폭산물 생성을 통한 다중 검출

약 1,000,000개(copy)의 인간 EGFR 유전자 표적과 10개, 100개, 1,000개, 10,000개, 또는 100,000개의 인간 HRAS 유전자 표적을 혼합하거나, 약 1,000,000개의 인간 HRAS 유전자 표적과 10개, 100개, 1,000개, 10,000개, 또는 100,000개의 인간 HRAS 표적을 혼합한 조건에서 상기 의도한 융합 증폭산물 형성을 통해 EGFR 유전자 표적과 HRAS 유전자 표적을 동시 검출할 수 있도록 1.5 pmole의 탐색 프라이머 2, 1.5 pmole의 탐색 프라이머 5, 30 pmole의 증폭 프라이머 1, 0.5 pmole의 길잡이 프라이머 1, 0.5 pmole의 길잡이 프라이머 2, 10 fmole의 대리표적 2, 10 fmole의 대리표적 3, 10 fmole의 대리표적 8, 10 fmole의 대리표적 9, 4 pmole의 프로브 2, 4 pmole의 프로브 3을 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다. 상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산 중합효소와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl₂), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.

중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 15분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [64℃, 30초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - annealing [60℃, 20초] - extension [72℃, 20초]으로 수행하였다.

중합효소연쇄반응 이후에는, 반응 산물에 대한 융해곡선을 도출하기 위해 denaturation [95℃, 5분] - annealing [35℃, 5분] - melting [35 --> 75℃, 0.5℃ 간격] 과정을 거쳤고, 이때 melting 단계에서 측정된 FAM channel과 ROX channel의 형광값을 분석하여 융해 피크 결과를 도출하였다.

그 결과, 본 발명의 표적핵산 증폭 방법을 이용한 경우 복수의 표적핵산이 불균등하게 혼합된 조건, 즉, HRAS 유전자 표적의 양이 EGFR 유전자 표적의 양 대비 1/10, 1/100, 1/1,000, 1/10,000 수준으로 매우 적은 조건 또는 EGFR 유전자 표적의 양이 HRAS 유전자 표적의 양 대비 1/10, 1/100, 1/1,000, 1/10,000 수준으로 매우 적은 조건에서도 두 표적을 완전하게 동시 검출해냄을 관찰하였다. 반면 대조군인 통상의 방법에서는 다량으로 주입된 유전자 표적의 검출은 수월하였으나 상기 다량으로 주입된 유전자 표적과 혼합된 소량의 유전자 표적의 동시 검출은 불안정한 모습을 나타내었다(도 15).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따른 표적핵산 증폭방법은 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 염기서열 일부를 임의로 조정할 수 있으며, 결과적으로 표적핵산 염기서열에 대한 의존도가 최소화되어 만약 구아닌/시토신 비중(G/C content)이 지나치게 높아 해당 부위 증폭이 어려운 표적핵산이라고 하더라도 이에 대한 증폭을 효과적으로 수행할 수 있으며, 상기 대리표적(surrogate target)의 표적핵산 상보적 염기서열 부위와 증폭 프라이머 상보적 염기서열 부위 사이에 임의의 염기서열을 삽입할 수 있으므로, 이러한 임의의 염기서열 부위와 혼성화하는 범용(universal) 프로브(probe)를 제작함으로써, 표적핵산의 염기서열이 변경되더라도 상기 범용 프로브는 계속 사용이 가능한 장점이 있으므로, 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암진단, 유전관련 진단, 유전형질 진단, 감염균의 진단, 약제내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종판별 등에 유용하다.

더불어 본 발명에 따른 표적핵산 증폭방법은 상기 대리표적의 주입량을 조절하여 표적핵산 증폭의 민감도를 쉽게 조정하면서도 그러한 조정이 증폭 효율에 미치는 영향을 최소화할 수 있으므로 진단 제품 개발 시 최적화 과정을 더 효율적으로 수행할 수 있다.

전자파일 첨부하였음.

SEQUENCE LISTING <110> PANAGENE INC. <120> A Method for Amplifying Target Nucleic Acid and Composition for Amplifying Target Nucleic Acid <130> PP-B2128 <150> KR 10-2017-0161453 <151> 2017-11-29 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> T790M-dFP23 <400> 1 ctccaccgtg cagctca 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> T790M-dFP29 <400> 2 acctccaccg tgcagctca 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> HRASe2_dRP10 <400> 3 agcgcactct tgcccac 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> T790M-dFP14 <400> 4 gccgcctgct gggcatc 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> HRASe2_dRP19 <400> 5 ggtcagcgca ctcttgcc 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> DES1-dFP11 <400> 6 catcaggagc agttacgaag 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> DES1-dFP9 <400> 7 aaccttagca cgaatagcg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> DES1-dRP6 <400> 8 gctgttgctt ccgctattc 19 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> T790M-dAT22:DES1-dAT-sF11 <400> 9 ttttttctgg actatgtccg ggaacacagg cttcgtaact gctcctgatg aaaaaa 56 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> T790M-dAT26:DES1-dAT-sF11 <400> 10 ctggactatg tccgggaaca caggcttcgt aactgctcct gatgaaaaaa 50 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> T790M-dAT_AS6:DES1-dAT-sF11 <400> 11 catcaggagc agttacgaag cctgtgttcc cggacatagt ccag 44 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> HRASe2_dAT-AS4:DES1-dAT-sF9 <400> 12 ttttttatat tccgtcatcg ctcctcagga ccgctattcg tgctaaggtt aaaaaa 56 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> HRASe2_dAT17:DES1-dAT-sF11 <400> 13 catcaggagc agttacgaag aataatgatg tgaggagcga tgacggaata 50 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> HRASe2_dAT18:DES1-dAT-sF11 <400> 14 catcaggagc agttacgaag aataatgatg aataatgatg tgaggagcga tgacggaata 60 <210> 15 <211> 52 <212> DNA <213> T790M-dAT4:DES1-dAT-sR6 <400> 15 ttttttcagc tcatgccctt cggctaggaa tagcggaagc aacagcaaaa aa 52 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> "HRASe2_dAT-AS16:DES1-dAT-sF11 " <400> 16 atattccgtc atcgctcctc ggcttcgtaa ctgctcctga tgaaaaaa 48 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> HRASe2_dAT14:DES1-dAT-sF11 <400> 17 catcaggagc agttacgaag ccgaggagcg atgacggaat at 42 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> T790M-dRP6 <400> 18 gctatcccag gagcgcagac c 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> HRASe2_dFP16 <400> 19 tgtgggtttg cccttcagat gg 22 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> T790M-dDP1_22-sF11 <400> 20 cacaggcttc 10 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> T790M-DP-chi3 <400> 21 ctcatcatgc ag 12 <210> 22 <211> 9 <212> DNA <213> G12S_4_AS <400> 22 caccgctgg 9 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> HRASe2_dFP24 <400> 23 tgaggagcga tgacggaata 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> HRASe2_dFP26 <400> 24 cctgtaggag gaccccgg 18

Claims

다음의 단계를 포함하는 표적핵산 증폭방법:
(a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
(b) i) 표적핵산과 혼성화(hybridization)할 수 있는 한 개 이상의 탐색 프라이머(primer);
ii) 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열을 포함하는 한 개 이상의 대리표적(surrogate target); 및
iii) 상기 대리표적을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 증폭 프라이머;
를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 융합 증폭산물의 존재 여부를 판별하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위는 탐색 프라이머의 다운스트림(downstream)에 존재하며, 상기 탐색 프라이머의 다운스트림은 탐색 프라이머가 표적핵산과 결합한 후, PCR을 통해 신장(extension)되는 방향인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 대리표적은 3‘말단에 핵산중합이 억제되는 작용기 또는 염기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제3항에 있어서, 상기 핵산중합이 억제되는 작용기 또는 염기는 아민기(amine group), 인산기(phosphate group), 알킬기(alkyl group), 알케인-다이올(alkane-diol), 포스포로사이오에이트(phophorothioate), 바이오틴(biotin), 비염기성 링커(non-nucleotide linker), C3-18 스페이서(C3-18 spacer), 디-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(di-deoxynucleotide triphosphate, ddNTP), 역방향 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(inverted deoxynucleotide triphosphate, inverted dNTP) 및 역방향 디-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(inverted di-deoxynucleotide triphosphate, inverted ddNTP)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 탐색 프라이머, 대리표적 및 증폭 프라이머는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), LNA (locked nucleic acid) 및 PNA(peptide nucleic acid) 중 어느 하나 또는 이들의 혼합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제5항에 있어서, 상기 대리표적은 10 내지 500개의 염기서열 길이로 제작된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제6항에 있어서, 상기 대리표적은 20 내지 150개의 염기서열 길이로 제작된 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제6항에 있어서, 상기 대리표적은 1 내지 100개의 염기서열 길이로 제작된 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제6항에 있어서, 상기 대리표적은 2 내지 20개의 염기서열 길이로 제작된 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제8항에 있어서, 상기 스페이서의 GC 비율은 30% 이하인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 대리표적은 탐색 프라이머가 혼성화 하는 표적핵산과 같은 가닥 또는 반대 가닥에 혼성화 하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 증폭 프라이머는 대리표적의 임의의 서열과 같거나, 임의의 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 융합 증폭산물의 길이는 50bp 내지 1kbp 이며, GC 비율은 35 내지 65%인 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 융합 증폭산물의 존재유무를 판별하는 단계는 상기 융합 증폭산물에 결합 가능한 핵산 결합 염료(nucleic acids-binding dye) 또는 프로브(probe)를 사용하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제14항에 있어서, 상기 핵산 결합 염료는 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide), 사이버그린 1(SYBRⓡ Green I), 사이버그린 골드(SYBRⓡ Gold), 에바그린(EvaGreen), 요프로-1(YO-PRO-1), 사이토(SYTO), 베보(BEBO) 및 벡스토(BEXTO)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제14항에 있어서, 상기 융합 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제16항에 있어서, 상기 융합 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 대리표적의 임의의 서열에 결합하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제16항에 있어서, 상기 융합 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 소광자(quencher)가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제18항에 있어서, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제18항에 있어서, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), 탐라(TAMRA), 이클립스(Eclipse), DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 탐색 프라이머가 혼성화 하는 표적핵산 가닥의 반대 가닥과 혼성화 하는 길잡이 프라이머를 추가로 주입하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭방법.
i) 표적핵산과 혼성화(hybridization)할 수 있는 한 개 이상의 탐색 프라이머(primer);
ii) 상기 탐색 프라이머가 결합하지 않는 표적핵산 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산에 결합하지 않는 임의의 서열을 포함하는 한 개 이상의 대리표적(surrogate target); 및
iii) 상기 대리표적을 증폭할 수 있는 한 개 이상의 증폭 프라이머;
를 포함하는 표적핵산 증폭용 PCR 조성물.
제22항에 있어서, 상기 조성물은 탐색 프라이머가 혼성화하는 표적핵산 가닥과 반대편 가닥과 혼성화하는 길잡이 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 증폭용 PCR 조성물.