JP2019521716A - 多重増幅二重シグナル増幅によるターゲット核酸配列の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ターゲット核酸配列を下記一般式で表されるダンベル構造オリゴヌクレオチドを用いた1次増幅反応により増幅させる段階:
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして、
(b)前記1次増幅産物をプライマーおよび蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
(a)ターゲット核酸配列を下記一般式で表されるダンベル構造オリゴヌクレオチドを用いた1次増幅反応により増幅させる段階:
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして、
(b)前記1次増幅産物をプライマーおよび蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施される。
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして、
(b)前記1次増幅産物をプライマー対および蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして、
(b)前記1次増幅産物を二つ以上のプライマー対および蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
第一に、本発明は、従来のリアルタイムPCR方式とは異なって、増幅産物を用いてターゲット核酸のシグナルを検出する方法であって、従来の方式よりも数十あるいは数百倍以下のTaqを使用しても、効果的なターゲット核酸の検出が可能である。したがって、従来のリアルタイムPCR製品に比べて安い製品を供給することができる。
ターゲット核酸配列としてジカウイルスのゲノムDNAを使用した。前記ジカウイルス ゲノムDNAを基礎として、ダンベル構造を有する前方向(forward)および逆方向(reverse)プライマーをデザインした。
ジカウイルス遺伝子のターゲット核酸配列を検出することによって、本発明のプライマーを用いたリアルタイムPCR敏感度を確認した。図8に示されたように、1ngから始めて一連に希釈されたジカウイルスゲノムDNAを用いてリアルタイムPCRを実施する場合、10fgまで希釈させた場合にも、ターゲット核酸配列が検出された。
本発明者らは、リアルタイムPCR反応条件の下で、変性、ハイブリダイゼーション、切断および延長の繰り返しをDNA濃度別に適用させた場合、本発明のプライマーがターゲット核酸配列を検出するのに十分なシグナルを発生することができるか否かをさらに確認した。
Claims (32)
- ダンベル構造オリゴヌクレオチドを用いてターゲット核酸配列を検出する方法であって、
(a)ターゲット核酸配列を下記一般式で表されるダンベル構造オリゴヌクレオチドを用いた1次増幅反応により増幅させる段階:
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして
(b)前記1次増幅産物をプライマーおよび蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す段階を含む
ことを特徴とする方法。 - ダンベル構造オリゴヌクレオチドを用いてターゲット核酸配列を検出する方法であって、
(a)少なくとも一つの下記一般式で表されるダンベル構造オリゴヌクレオチドを含むプライマー対を用いてターゲット核酸配列を1次増幅させる段階であって、前記1次増幅は、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー延長および変性過程の少なくとも二つのサイクルを含み:
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして
(b)前記1次増幅産物をプライマー対および蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す段階を含む
ことを特徴とする方法。 - ダンベル構造オリゴヌクレオチドを用いて二つ以上のターゲット核酸配列を検出する方法であって、
(a)少なくとも一つの下記一般式で表されるダンベル構造オリゴヌクレオチドを含む二つ以上のプライマー対を用いて二つ以上のターゲット核酸配列を1次増幅させる段階であって、前記1次増幅は、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー延長および変性過程の少なくとも二つのサイクルを含み:
一般式:5’−A−B−C−3’
前記式で、前記Aは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する5’−低Tm特異性部位であって、前記Cの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記Bは、少なくとも3つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、前記Cは、ハイブリダイゼーションされる前記ターゲット核酸配列の一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3’−高Tm特異性部位であって、前記Aの一つの位置に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記AのTmは、前記CのTmより低く、前記分割部位は、3つの部位のうち最も低いTmを有し、前記分割部位は、前記AとCが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる条件の下で非塩基対の構造を形成し、前記ハイブリダイゼーションは、C単独によるハイブリダイゼーションが発生しない条件の下で実施され、そして
(b)前記1次増幅産物を二つ以上のプライマー対および蛍光発生レポータ(fluorogenic reporter)を用いた2次増幅反応により増幅させ、蛍光発生レポータからのシグナルを検出する段階であって、前記シグナルの検出は、ターゲット核酸配列の存在を示す段階を含む
ことを特徴とする方法。 - 前記分割部位内のユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、7−ジアザ−2’−デオキシイノシン、2−アザ−2’−デオキシイノシン、2’−OMeイノシンまたは2’−Fイノシンである
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシンである
請求項4に記載の方法。 - 前記分割部位は、ユニバーサル塩基を有するヌクレオチドの連続配列を含む
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記5’−低Tm特異性部位の長さは、3’−高Tm特異性部位の長さより長さが短い
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記3’−高Tm特異性部位は、ハイブリダイゼーションされるターゲット核酸配列に対して完全に相補的なヌクレオチド配列を有する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記5’−低Tm特異性部位は、3〜5個のヌクレオチド長さを有する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記分割部位は、少なくとも3〜5個のヌクレオチド長さを有する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記3’−高Tm特異性部位は、18〜30個のヌクレオチド長さを有する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記5’−低Tm特異性部位は、3〜5個のヌクレオチド長さを有し、前記分割部位は、3〜5個のヌクレオチド長さを有し、前記3’−高Tm特異性部位は、18〜30個のヌクレオチド長さを有する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記5’−低Tm特異性部位のTmは、10℃〜30℃である
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記3’−高Tm特異性部位のTmは、50℃〜65℃である
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記分割部位のTmは、3℃〜10℃である
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記アニーリングは、50℃〜65℃範囲の温度で実施する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)は、前記ダンベル構造オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、延長および変性過程を含む鋳型依存的延長反応の過程を繰り返すことによって行われる
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記増幅反応は、重合酵素連鎖反応により実施される
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)の1次増幅は、増幅産物間の深刻な競争が起こる前の時点まで増幅させる
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記蛍光発生レポータが、SYBR Green、SYTO 9、EvaGreenまたはLCGreenである
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(b)で使用されたプライマーが、ダンベル構造オリゴヌクレオチドである
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(b)に使用されたプライマーが、前記段階(a)に使用されたオリゴヌクレオチドと同じダンベル構造オリゴヌクレオチドである
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)および(b)に使用されたダンベル構造オリゴヌクレオチドが互いに同一であり、前記段階(b)で高い特異度を有するプライマーを好む側にオリゴヌクレオチドプライミング(oligonucleotide priming)が実質的に偏向するようにする
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)および(b)で使用されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つがUTPヌクレオチドを含むことによって、UNG酵素により分解され得る
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)で使用されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つがUTPヌクレオチドを含み、前記段階(a)の後にUNG酵素により前記オリゴヌクレオチドを除去して、前記プライマーによる2次増幅での汚染を実質的に防止する
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)が1〜25サイクルの範囲で行われる
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)が5〜20サイクルの範囲で行われる
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)が10〜15サイクルの範囲で行われる
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記段階(a)および(b)で使用されたオリゴヌクレオチドが、5個以上のターゲット核酸配列を増幅させるためのオリゴヌクレオチドである
請求項3に記載の方法。 - 前記段階(b)のシグナルの検出が、融解曲線分析(melt curve analysis)により行われる
請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 前記融解曲線が0.05℃〜0.02℃の範囲の解像度で生成される
請求項30に記載の方法。 - 前記融解曲線が0.02℃未満の解像度で生成される
請求項30に記載の方法。
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