JP6050820B2 - 改良された対立遺伝子特異的ｐｃｒのためのｇ−クランプの使用 - Google Patents

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Description

本発明は、核酸増幅の分野、そして特に対立遺伝子特異的増幅の分野に関する。
核酸の対立遺伝子特異的増幅は、標的配列の増幅及び分析を同時に可能にする。対立遺伝子特異的増幅は、標的核酸がその配列中に変更（多形性）を有する１又は複数の亜集団を有することが疑われる場合に一般的に使用される。DNA多形性は、DNAプロファイル解析（法医学、父系判定、器官移植のための組織のタイプ分け）、遺伝子マッピング、及び希少変異の検出、例えば正常なDNAを有する細胞の背景における癌細胞中に存在する希少変異、において使用される。
好首尾な対立遺伝子増幅においては、標的核酸の所望のバリアント（variant）は増殖され、他のバリアントは、少なくとも検出可能なレベルでは増幅されない。典型的な対立遺伝子特異的増幅測定は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含み、この場合少なくとも１つのプライマーが疑われる多形を有する領域に対して相補的である。対立遺伝子特異的プライマーの設計では、多形の或るバリアントが存在する場合にのみプライマーの延長が生ずるようにされる。その最も単純な形態において、対立遺伝子特異的プライマーは、標的中の多形ヌクレオチドの所望のバリアントに対して相補的な３'−末端ヌクレオチドを有する。しばしば、プライマーの３'−末端における１個のミスマッチが、標的配列の不所望のバリアントの増殖を妨げるために十分である。しかしながら、異なる3'−末端配列間で増幅の特異性は大きく異なり、幾つかのミスマッチはポリメラーゼによる延長を効果的に阻止し、他はそうではない。米国特許5,639,611号を参照のこと。
対立遺伝子の差別化の成功は、DNAポリメラーゼによるミスマッチしたプライマーの延長の不可能性に依存する。DNAポリメラーゼの前記の不可能性は、最大の選択性を達成するために反応条件を調節することにより、変更することができる。それにも拘わらず、対立遺伝子特異的PCRの貧弱な選択性は、多くの多形配列について問題を残す。
特異性を増加するための一つのアプローチは、内部ミスマッチを有するヌクレオチド又はヌクレオチドを有する増幅プライマーを操作（engineering）することを含む。このアプローチは幾つかの系において好結果が得られることが証明されている。米国特許第5,137,806を参照のこと。
特異性を増加するための他のアプローチは、プライマーの化学修飾を含む。例えば、プライマー中の幾つかのヌクレオチドのデオキシリボースのある種の２'−Ｃ及び４'−Ｃ修飾は、ポリメラーゼによる対立遺伝子の差別化を増強する。Gaster, J. and Marx, A. (2005) Chem. Eur. J. 11:1861-1870を参照のこと。他の研究において、プライマー中のヌクレオチドの一つにおける非天然ピリミジン塩基、特にピリミジン環の６−位における種々の置換を有するシュードイソシチジン（pseudoisocytidine）の使用により、対立遺伝子の差別化が増強されることが見出された。米国特許第7,408,051を参照のこと。
リアルタイム対立遺伝子特異的PCRの文脈において、測定の選択性は、マッチした鋳型とミスマッチ鋳型との間の閾サイクル数（threshold cycle number；Ct）中の相違として評価されうる。より大きな相違は、ミスマッチ鋳型の増幅におけるより大きな遅れを示し、そしてそれ故に対立遺伝子間のより大きな差別化を示す。修飾されたデオキシリボースが１サイクルと14サイクルとの間のCtの相違をもたらすことが示されている。シュードイソシチジン（pseudoisocytidine）の使用が、ミスマッチ鋳型の増幅における７サイクルの遅れをもたらした。この程度の差別化は、サンプルが鋳型の数個のバリアントを含み、そのすべてが増幅について競争するような多くの用途において不十分である。しばしば、ミスマッチ鋳型はマッチした鋳型より非常に多くの量で存在する。
例えば、組織サンプルにおいて、細胞の小部分のみが悪性であり、そして対立遺伝子特異的増幅測定の標的とされる変異（マッチした鋳型）を担持する可能性がある。正常細胞中に存在する鋳型が非効果的に増幅され、しかし圧倒的な数の正常細胞が増幅の遅れを克服し、そして変異鋳型のいずれの利点も消し去るであろう。野生型鋳型の存在下で稀な変異を検出するためには、対立遺伝子特異的増幅測定の特異性は改良される必要がある。
プライマーの対立遺伝子特異性を増強する多くの方法が提案されている。しかしながら、多くの臨床的に意味のある核酸標的のために、PCRの特異性の欠如の問題が残る。したがって、対立遺伝子特異的プライマーの設計への新たなアプローチが必要である。
Ｇ−クランプは、３環アミノエトキシ−フェノキサジン−２'−デオキシシチジンであって、シトシン類自体であり、図１に示される。Ｇ−クランプは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、へリックス内の相補的グアニンのWatson-Crick面及びHoogsteen面の両方を同時に認識する。したがって、Ｇ−クランプを含むオリゴヌクレオチドは、相補的DNA鎖及びRNA鎖にハイブリダイズした場合、螺旋の熱的安定性及びミスマッチ差別化を増強した。増強された親和性及び特異性のこれらの性質は、核酸をベースとする診断及びアンチセンス法によるRNAの配列特異的標的化の分野において注目される。Ｇ−クランプ及び関連するピリミジン誘導体の他の性質は、米国特許第6,414,127号、米国特許第6,951,931号、米国特許第7,511,125号及び米国特許第RE39,324号に記載されている。
第１の観点において、本発明は、標的配列のバリアントの対立遺伝子特異的増幅方法に関し、当該標的は複数のバリアント配列の形態で存在し、この方法は、
（ａ）第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを、標的配列の少なくとも１つのバリアントにハイブリダイズさせ、ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして前記第二のオリゴヌクレオチドは、標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な少なくとも１つの選択的ヌクレオチドを有し、ここで、前記第二のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含み；
（ｂ）前記第二のオリゴヌクレオチドを核酸ポリメラーゼにより延長し、ここで、当該核酸ポリメラーゼは、当該第二のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つの選択的ヌクレオチドに対して相補的な標的配列のバリアントにハイブリダイズする場合、当該第二のオリゴヌクレオチドを効果的の延長することができ、そして当該第二のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つの選択的ヌクレオチドに対して相補的でない標的配列のバリアントにハイブリダイズする場合、実質的に非効果的に延長するものである；
ことを含んで成る、ことを特徴とする。
第２の観点において、本発明は、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットに関し、当該標的は複数のバリアント配列の形態で存在し、このキットは、
（ａ）前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的である第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な少なくとも１つの選択的ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチド、ここで当該第二のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含む；
ことを特徴とする。
第３の観点において、本発明は、標的配列の対立遺伝子特異的増幅を実施するためのオリゴヌクレオチドに関し、当該標的は複数のバリアント配列の形態で存在し、このオリゴヌクレオチドは、
（ａ）前記標的配列の１又は複数のバリアントの部分に対して少なくとも部分的に相補的な配列；
（ｂ）前記標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な少なくとも１つの選択的ヌクレオチド；
（ｃ）少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチド；
を含んで成る。
第４の観点において、本発明は、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のための反応混合物に関し、当該標的は複数のバリアント配列の形態で存在し、この混合物は、
（ａ）前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的である第一のオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、しかし標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な少なくとも１つの選択的ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチド、ここで当該第二のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含む；
を含んで成る。
図１は、デオキシグアニンとデオキシシチジンとの間（Ａ）及びデオキシグアニンとＧ−クランプとの間（Ｂ）の水素結合相互作用を示す。 図２Ａは、野生型ヒトEGFR遺伝子のコード配列（配列番号：１）を示す。 図２Ｂは、野生型ヒトEGFR遺伝子のコード配列（配列番号：１）を示す。 図２Ｃは、野生型ヒトEGFR遺伝子のコード配列（配列番号：１）を示す。
定義
特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明を記載し、そして特許請求するに当たり、下記の定義が使用されよう。
用語「核酸」は、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体など）を意味し、そしてデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、DNA-RNAハイブリド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー（aptamer）、ペプチド核酸（PNA）、PNA-DNAコンジュゲート、PNA-RNAコンジュゲート、などを含み、線状に又は分枝状に相互の共有結合したヌクレオチドを含む。核酸は、典型的には１本鎖又は２本鎖であり、そして一般にホスホジエステル結合を含むであろう。
但し、幾つかの場合には核酸類似体が含まれ、これは他の主鎖を含み、これには例えば、ホスホルアミド（phosphoramide）（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 及び米国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、О−メチルホスホロアミダイト（ O-methylphophoroamidite）連結（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、並びにペプチド核酸主鎖及び連結（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895を参照のこと）が含まれる。
他の類似体核酸には、正に荷電した主鎖を有するもの（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）、非−イオン性主鎖を有するもの（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号及び第4,469,863号）及び非−リボース主鎖を有するものが含まれ、米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号に記載されているものが含まれる。１又は複数の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義に含まれ（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176を参照のこと）、そして類似体も、例えばRawls, C & E News Jun. 2, 1997, page 35に記載されている。リボース−ホスフェート主鎖のこれらの修飾は、標識のごとき追加の成分の付加を促進するため、又は生理的環境における上記のような分子安定性及び半減期を変更するために行われるであろう。
核酸中に典型的に見出される天然の複素環塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）に加えて、ヌクレオチド類似体にはまた、例えばSeela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されているような非天然核酸塩基も含まれるであろう。ヌクレオチド類似体において使用される或る種の塩基は、融解温度（melting temperature；Tm）調節剤として機能する。例えば、これらの幾つかには７−デアザプリン類（7-deazapurines）（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピラゾロ［3,4-d]ピリミジン、プロピニル-dN（例えば、プロピニル-dU、プロピニル-dC等）等が含まれる。米国特許第5,990,303号を参照のこと。他の代表的な複素環塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシチジン；５−フルオロシチジン；５−クロロシチジン；５−イオドシチジン；５−ブロモシチジン；５−メチルシチジン；５−プロピニルシチジン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−イオドウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル、等が含まれる。
「ヌクレオシド」は、糖成分又は糖成分の機能的同等物（例えば炭素環）に共有結合した塩基又は塩基性基（少なくとも１つの同素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール環、及び／又はこれらに類するもの）を含む核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖成分を含む場合、塩基は、典型的には糖成分の１−位に結合する。上記の通り、塩基は、天然塩基でも非−天然塩基でもよい。ヌクレオシドの例にはリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド及び炭素環式ヌクレオシドが含まれる。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのエステル、例えば、ヌクレオシドの糖成分の５'−位に共有結合した１個、２個、３個又はそれより多くのリン酸基を有するヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
「プリンヌクレオチド」は、プリン塩基を含むヌクレオチドを意味し、他方「ピリミジンヌクレオチド」は、ピリミジン塩基を含むヌクレオチドを意味する。
「Ｇ−クランプ」は、シトシン類似体、９−（アミノエトキシ）−フェノキサジン−２'−デオキシシチジンを意味し、そして米国特許第6,414,127号に開示されている。
「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個、しかし典型的には５〜50個のヌクレオチド、そして更に典型的には15個と35個のヌクレオチドを含む核酸ポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは一般に、オリゴヌクレオチドの最終的な機能及び用途を含む様々な要因に依存する。オリゴヌクレオチドは当業界において知られている任意の適当な方法により調製することができ、それらの方法には、例えば、適切な配列のクローニング及び制限酵素消化、又は直接的な化学合成、例えば、Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル法、Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法、Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホルアミダイト法、Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191のトリエステル法、自動合成法、米国特許第4,458,066号の固体支持法、又は当業界において知られている他の任意の方法が含まれる。
「プライマー核酸」又は「プライマー」は、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、そしてヌクレオチド導入生物触媒を用いての鎖延長又は伸長を可能にするオリゴヌクレオチドである。ときにはプライマーの他の長さが使用されるが、プライマーは典型的には15〜35ヌクレオチドである。短いプライマー核酸は一般に、鋳型核酸との十分に安定なハイブリド複合体を形成するために、一層低い温度を用いる。鋳型核酸のサブ配列に対して少なくとも部分的に相補的であるプライマー核酸は、典型的には、延長が起こるように鋳型核酸とハイブリダイズするのに十分である。しかしながら、延長の成功には、プライマーの３'−末端における一層高い相補性（すなわち、鋳型との一層少ないミスマッチ）が必要である。プライマー核酸は、所望により、放射線的、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的技法により検出可能な標識を導入することにより、標識することができる。
「延長されたプライマー」は、１又は複数のヌクレオチドが付加されているプライマーを意味する。「プライマー延長」は、プライマーに追加のヌクレオチドを加える酵素の作用である。
「鋳型核酸」、「鋳型」又は「標的」は、それに対してプライマー核酸がハイブリダイズすることができる核酸を意味し、プライマー核酸は適当な条件下で延長される。核酸増幅の文脈において、「標的」は好ましくは、２本鎖核酸の領域であり、少なくとも２つのプライマー配列及び介在配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列から成る。標的はまた、１つのプライマー及び第二のプライマーと部分的に同一な配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列から成る１本鎖核酸であることができる。鋳型核酸は、単離された核酸断片として存在することができ、又はより大きな核酸断片の部分であることもできる。
標的核酸は、本質的にあらゆる源、例えば、培養された微生物、培養されていない微生物、複雑な生物学的混合物、組織、血清、古くからの若しくは貯蔵された組織若しくはサンプル、環境単離物などに由来することができ、またはそれらから単離することができる。更に、場合によっては、鋳型核酸には、cDNA、RNA、ゲノムDNA、クローン化されたゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、酵素的に断片化されたDNA若しくはRNA、化学的に断片化されたDNA若しくはRNA、物理的に断片化されたDNA若しくはRNA等が含まれ、又はこれらに由来する。鋳型核酸はまた、当業界において知られている技法を用いて化学的に合成することもできる。
本明細書において使用する場合、「遺伝子」は、生物学的機能に関連するDNAの任意のセグメントを意味する。したがって、遺伝子には、コード配列、及び場合によってはコード配列の発現のために必要な制御配列が含まれる。
核酸は、例えばヌクレオチド導入生物触媒により、核酸の３'−末端位おいて追加のヌクレオチドが導入される場合、「延長」又は「伸長」される。
「成分」又は「基」は、何物か、例えば分子、が分割されてできる部分（例えば、官能基、置換基など）を意味する。例えば、ヌクレオチドは典型的には、塩基の基（base group）（例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、または類似体）、糖成分、及び１又は複数のリン酸基を含む。
「対立遺伝子特異的プライマー」は、鋳型核酸の幾つかのバリアントにハイブリダイズすることができるが、しかし、鋳型核酸のバリアントのいずれかとのみハイブリダイズした場合にポリメラーゼによる延長を可能にするプライマーである。鋳型核酸の他のバリアントについては、プライマー−鋳型ハイブリドは、ポリメラーゼにより延長されず、又は非−効果的に延長される。
核酸は、例えばヌクレオチド導入生物触媒により、核酸の３'−末端位おいて追加のヌクレオチドが導入される場合、「延長」又は「伸長」される。
増幅測定は、もしそれが他の可能性ある生成物に対する１つの生成物の優越性（すなわち、大部分であるが、100％未満である）をもたらす場合、「選択的」又は「対立遺伝子選択的」である。測定は、標的配列の不所望の（ミスマッチの）バリアントの増幅が検出できる限り、「対立遺伝子選択的」として記述される。増幅測定に関し、「特異的」又は「対立遺伝子特異的」なる用語は、可能性ある生成物の１つが排他的に形成される場合に使用される。不所望の標的の増幅は検出できない場合の測定は、「対立遺伝子特異的」と称される。しかしながら、理解されるところによれば、検出の方法が一層選択的になるに従って、対立遺伝子特異的であると従来知られていた幾つかの測定が、対立遺伝子選択的となり、すなわち標的配列の不所望のバリアントの幾つかの増幅は検出可能となる。したがって、本発明の文脈において、「対立遺伝子特異的」なる用語は、厳密な対立遺伝子特異的増幅、及び対立遺伝子選択的増幅の両方を含む。
「遺伝子型」は、細胞若しくは対象物、または細胞若しくは対象物の群の全て又は部分に言及する。例えば、遺伝子型は、所与の遺伝子座に存在するか又はゲノム中に分配されている特定の変異及び／又は対立遺伝子（例えば、多形、例えば単一ヌクレオチド多形など）を含む。
「核酸ポリメラーゼ」は、核酸へのヌクレオチドの導入を触媒する酵素を意味する。核酸ポリメラーゼの例には、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ等が含まれる。
「熱安定性酵素」は、選択された時間にわたり上昇した温度にかけられた場合に、安定であり（すなわち破壊又は変性に対抗する）、十分な触媒活性を維持する酵素を意味する。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、２本鎖核酸の変性に必要な時間にわたり上昇した温度にかけられた場合に、それに続くプライマー延長反応を行うのに十分な活性を維持する。核酸の変性のために必要な加熱条件は当業界においてよく知られており、そして米国特許第4,683,202号及び第4,683,195号において例示されている。この明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のごとき温度循環反応における使用のために適当である。熱安定性核酸ポリメラーゼの例には、テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus；Taq）DNAポリメラーゼ、テルムス・スペーシス（Thermus sp）Z05ポリメラーゼ、テルムス・フラブス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ポリメラーゼ、例えばTMA-25ポリメラーゼ及びTMA-30ポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ等が含まれる。
「修飾された酵素」は、参照配列、例えば酵素の天然型若しくは野生型から少なくとも１個のモノマーが異なるアミノ酸ポリマーを含む酵素、又は酵素の他の修飾された形態を意味する。修飾の例には、モノマーの挿入、除去及び置換が含まれる。修飾された酵素にはまた、２以上の親に由来する、同定可能な成分配列（例えば、構造的又は機能的ドメイン）を有するキメラ酵素が含まれる。更に、修飾された酵素の定義には、参照配列の化学修飾を含むものも含まれる。修飾されたポリメラーゼの例には、G46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNAポリメラーゼ、Z05 DNAポリメラーゼ、ΔZ05ポリメラーゼ、ΔZ05-Goldポリメラーゼ、ΔZ05Rポリメラーゼ、E615G Taq DNAポリメラーゼ、E678G TMA-25ポリメラーゼ、E678G TMA-30ポリメラーゼ等が含まれる。
「5'→3'ヌクレアーゼ活性」又は「5'−3'ヌクレアーゼ活性」なる用語は、典型的には核酸鎖の合成に関連して、核酸鎖の５'末端からヌクレオチドを除去する核酸ポリメラーゼの活性を意味し、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼＩはこの活性を有するが、Klenow断片は有しない。
「5'−3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠くポリメラーゼ」は、Taq DNAポリメラーゼに比べて50％以下（例えば、＜25％、＜20％、＜15％、＜10％）の当該活性を有するポリメラーゼを意味する。5'−3'ヌクレアーゼ活性を測定する方法及び測定のための条件は当業界においてよく知られており、例えば、米国特許第5,466,591号を参照のこと。5'−3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠くDNAポリメラーゼの例には、大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow断片、Ｎ−末端の235アミノ酸を欠くテルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼ（Taq）（例えば、米国特許第5,616,494号に記載されており、一般に「Stoffelフラグメント」と称される）が含まれる。他の例には、5'−3'ヌクレアーゼ活性を担当するドメインを除去又は不活性化するために十分な除去（例えばＮ−末端除去）、変異、又は修飾を有する熱安定性DNAポリメラーゼが含まれ、例えば、米国特許第5,795,762号を参照のこと。
「3'→5'ヌクレアーゼ活性」若しくは「3'−5'ヌクレアーゼ活性」又は「プルーフリーディング活性」なる用語は、核酸鎖の３'末端からヌクレオチドを除去する、核酸ポリメラーゼの活性を意味する。例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIIIはこの活性を有するが、テルムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）(Taq) DNAポリメラーゼは有しない。
「忠実性」又は「複製の忠実性」は、鋳型依存重合の間に正しいヌクレオチドを導入する核酸ポリメラーゼの可能性である。複製の忠実性の文脈において、最初のヌクレオチド鎖に対する「正しいヌクレオチド」は、ワトソン−クリック塩基対合を介して鋳型ヌクレオチドに対合するヌクレオチドである。特定のポリメラーゼの複製の忠実性は、ポリメラーゼの３'−５'ヌクレアーゼ活性を通して最初のヌクレオチド鎖の３'−末端から正しくないヌクレオチドを除去することと正しいヌクレオチドを導入することの組合せに由来する。ヌクレオチドポリメラーゼの忠実性を測定するための種々の方法が、Tindall et al. (1988) "Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase", Biochemistry, 27:6008-6013に総説されている。典型的には、３'−５'ヌクレアーゼ（プルーフリーディング）能力を有するポリメラーゼは、プルーフリーディング活性を有しないポリメラーゼに比べて高い忠実性を有する。
「標識」は、分子に（共有結合により又は非−共有結合により）結合され、そして当該分子についての情報を提供することができる成分を意味する。標識の例には、蛍光標識、色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射能標識、質量変更基（mass-modifying group）、抗体、抗原、ビオチン、ヘパリン及び酵素（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼを含めての）が含まれる。
核酸増幅反応の文脈において、「ホットスタート」（hot start）は、１又は複数のプライマーの必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するのに十分に温度が上昇するまで、少なくとも１つの必須反応体を反応混合物から留保する（或いは、反応混合物中に当該反応体が存在する場合には当該反応体を不活性のままにする）プロトコールを意味する。「ホットスタート酵素」は酵素、典型的には、ホットスタートプロトコールにおいて「留保された」又は不活性な試薬として機能することができる核酸ポリメラーゼである。
「ワトソン−クリック塩基対合」又は単に「塩基対合」（base pairing）は、２本鎖核酸分子内の「従来的な」水素結合を意味する。ワトソン−クリック塩基対合は、アデニンとチミンの間、グアニンとシトシンの間、アデニンとウラシルの間、及びこれらの塩基の類似体の間の水素結合である。
「選択的ヌクレオチド」は、対立遺伝子特異的プライマー中にあって、当該プライマーに対立遺伝子選択性を与えるヌクレオチドである。選択的ヌクレオチドは、標的核酸の所望のバリアント中の対応するヌクレオチドに対して相補的であるが、当該標的核酸の不所望のバリアント中の対応するヌクレオチドに対しては相補的でない。プライマー中で、１個より多くのヌクレオチドが、標的核酸の所望のバリアント中のヌクレオチドに対して相補的であるが、当該標的核酸の不所望のバリアント中のヌクレオチドに対して相補的でないこともできる。しかしながら、選択的ヌクレオチドは、プライマーの特異性に影響を与えるプライマー中の位置に存在する。選択的ヌクレオチドは、それが標的核酸中に相補的パートナーを見つけるか否かに依存して、標的核酸の効果的な又は非効果的な増幅を可能にする。プライマーは、１個より多くの選択的ヌクレオチドを含むことができる。
「ここで、当該核酸ポリメラーゼは、当該第二のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つの選択的ヌクレオチドに対して相補的な標的配列のバリアントにハイブリダイズする場合、当該第二のオリゴヌクレオチドを効果的に延長することができ、そして当該第二のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つの選択的ヌクレオチドに対して相補的でない標的配列のバリアントにハイブリダイズする場合、実質的に非効果的に延長するものである」なる表現は、前記選択的ヌクレオチドが標的内と塩基対合を形成しない場合に比べて、当該選択的ヌクレオチドが標的と塩基対合を形成する場合に、ポリメラーゼによる第二のオリゴヌクレオチドの延長が効果的であることを意味する。
前記の通り、１つの観点において、本発明は、対立遺伝子特異的増幅の方法に関し、この方法は下記のことを含む：
（ａ）標的配列の少なくとも１つのバリアントを含む可能性のあるサンプルを提供し、
（ｂ）当該標的配列の１つより多くのバリアントに対して少なくとも部分的に相補的な第一のオリゴヌクレオチドを提供し、
（ｃ）当該標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、当該標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な選択的ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチドを提供し、ここで当該第二のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含み、
（ｄ）前記標的配列の少なくとも１つのバリアントへの前記第一の及び第二のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、
（ｅ）核酸ポリメラーゼによる前記オリゴヌクレオチドの延長のために適切な条件を提供し、ここで、当該核酸ポリメラーゼは、前記第二のオリゴヌクレオチドが前記標的配列のバリアントにハイブリダイズする（当該第二のオリゴヌクレオチドは当該バリアントについて前記相補的な選択的ヌクレオチドを有する）場合に、当該第二のオリゴヌクレオチドを延長することができ、そして前記第二のオリゴヌクレオチドが前記標的配列のバリアントにハイブリダイズする（当該第二のオリゴヌクレオチドは当該バリアントについて非−相補的な選択的ヌクレオチドを有する）場合に、実質的に延長することができない。
標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、当該標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な選択的ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチドは、「選択的オリゴヌクレオチド」、「選択的プライマー」又は「対立遺伝子選択的プライマー」と称される。本発明の選択的オリゴヌクレオチドは、10〜50、更に好ましくは15〜35ヌクレオチドを含んで成り、その殆どが標的配列の１つより多くのバリアント中の配列に対して相補的である。オリゴヌクレオチドの選択的ヌクレオチドは、標的配列の増幅されるべきバリアントに対して相補的であり、そして他のバリアントに対して相補的でない。
１つの態様において、選択的ヌクレオチドは３'−末端ヌクレオチドである。本発明の選択的オリゴヌクレオチドは１又は複数の「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドは、３'−末端ヌクレオチドに存在する。他の態様において、「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドは、３'−末端ヌクレオチドの上流の１及び５ヌクレオチド間に存在する。他の態様において、修飾された塩基ヌクレオチドは、３'−末端ヌクレオチドである。幾つかの態様において、「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドは、３'−末端及びオリゴヌクレオチド内の他の少なくとも１つの位置の両方に存在する。
本発明の対立遺伝子特異的プライマーは、当業界で知られているプライマーの設計の種々の観点を含むことができる。例えば、プライマーは、「サソリ」（scorpion）と称され、そしてWhitcombe et al., (1999) "Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence", Nature Biotech. 17:804-807に記載されている単分子プライマー−プローブ組合せの形態を採ることができる。本発明に従って設計される「サソリ」プライマーは、サソリの典型的な要素、すなわちプローブ部分、ステム−ループ部分、及びプライマー部分を含む。更に、本発明に従って設計されるサソリにおいて、プライマー部分は、変異体位置に対して相補的な３'末端を有する。本発明に従って設計されるサソリにおいて、プライマー部分は、本明細書に記載される１又は複数の「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの態様において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち鋳型変性の反復サイクル、鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング（ハイブリダイゼ―ション）、及び核酸ポリメラーゼによるプライマーの延長を含む。幾つかの態様において、アニーリング及び延長は同一の温度において生ずる。
幾つかの態様において、増幅反応はホットスタートプロトコールを含む。対立遺伝子特異的増幅の文脈において、ミスマッチ標的に対する対立遺伝子特異的プライマーの選択性は、ホットスタートプロトコールの使用により増強することができる。多くのホットスタートプロトコールが当業界で知られており、それらは例えば、必須試薬を反応混合物の残りから分離するワックスの使用（米国特許第5,411,876号）、抗体により可逆的に不活性化される核酸ポリメラーゼの使用（米国特許第5,338,671号）、活性部位に特異的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドにより非可逆的に不活性化される核酸ポリメラーゼの使用（米国特許第5,840,867号）、又は例えば、米国特許第5,677,152号及び第5,773,528号に記載されているような、可逆的化学修飾を有する核酸ポリメラーゼの使用である。
本願発明の幾つかの態様において、対立遺伝子特異的測定は、リアルタイムPCR測定である。リアルタイムPCR測定においては、増幅の測定値は、「閾値に対するサイクル」又はCt値である。早期のCt値は、閾値レベルの迅速な達成、そしてそれ故に一層効果的な増幅を反映する。後期のCt値は、非効果的な又は阻害された増幅を反映するであろう。対立遺伝子特異的リアルタイムPCR測定の文脈において、マッチした鋳型とミスマッチ鋳型との間のCt値の相違が、対立遺伝子間差別化又は測定の選択性の測定結果である。対立遺伝子特異的増幅測定は、当業界において知られている任意の適当な核酸ポリメラーゼを使用することができる。
対立遺伝子特異的PCR測定のため、任意の熱安定性核酸ポリメラーゼを使用することができる。ときには、プルーフ−リーディング（3'−5'−エキソヌクレアーゼ）活性を有しない酵素、例えばTaq DNAポリメラーゼを使用するのが望ましい。例えば米国特許第5,795,762号に記載されているように、5'−3'ヌクレアーゼ活性を実質的に又は完全に欠いている酵素を使用するのも望ましい。このような酵素の１例はΔZ05ポリメラーゼである。ときには、「ホットスタート」の可能性を有する酵素、例えば、米国特許第5,677,152号及び第5,773,528号に記載されているような可逆的に修飾された酵素を手にするのも望ましい。ホットスタート酵素の１例はΔZ05-Goldポリメラーゼである。
増幅生成物の検出は、当業界において知られている任意の方法により行うことができる。これらの方法には、標識されたプライマー及びプローブ、並びに種々の核酸結合色素の使用が含まれる。検出の手段は、標的配列の１つの変異体に特異的であってもよく、或いは標的配列の全てのバリアントに対して又はすべての２本鎖DNAに対してすら一般的であってもよい。非特異的検出方法は、標的の不所望の変異体の増幅が微少であり、そして当該方法の検出限界よりも低いと予測される場合に使用することができる。増幅生成物は、増幅が完結した後に、例えば、標識されていない生成物の電気泳動、及び核酸結合色素によるゲルの染色により検出することができる。
あるいは、増幅生成物は、合成の間の取込みにより又は標識されたプライマーの延長生成物であることにより、放射性又は化学的標識を担持することができる。電気泳動後又は電気泳動中に、標識された増幅生成物は、当業界において知られている適切な放射性又は化学的手段により検出することができる。電気泳動の後、生成物はまた、当業界において知られている方法のいずれか１つにより標識された標的特異的プローブにより検出することもできる。標識されたプローブはまた、電気泳動することなく、すなわち「ドットブロット」測定において、標的に適用することができる。
他の態様において、増幅生成物の存在は、均質測定（homogenous assay）、すなわち、発生して直ぐの生成物が増幅サイクル中に又は少なくとも同じ未開封のチューブ中で、そして増幅後処理を必要としないで検出される測定法において検出することができる。均質増幅測定は、例えば、米国特許第5,210,015号に記載されている。核酸介入（intercalating）色素を用いる均質増幅測定は、例えば、米国特許第5,871,908号及び第6,569,627号に記載されている。均質測定はまた、２種類の相互作用する蛍光物質により標識された蛍光プローブ、例えば、「分子ビーコン」プローブ（Tyagi et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14:303-308）又は蛍光標識されたヌクレアーゼプローブ（Livak et al., (1995) PCR Meth. Appl., 4:357-362）を用いることもできる。
これらの技法の幾つかの変法において、増幅生成物はまた、その固有の溶融温度を用いて同定することもできる。米国特許第5,871,908号及び第6,569,627号を参照のこと。増幅生成物はまた、「サソリ」（scorpion）と称する単分子プライマー−プローブ組合せを用いて検出することもできる。Whitcombe et al., (1999) "Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence", Nature Biotech, 17:804-807を参照のこと。サソリオリゴヌクレオチドのプライマー部分は、本発明に従って設計された対立遺伝子特異的プライマーであることができる。
他の観点において、本発明は標的配列の選択されたバリアントを特異的に又は選択的に増幅するための反応混合物を提供し、当該反応混合物は、前記標的配列の１以上のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的である第一のオリゴヌクレオチド、及び前記標的配列の１以上のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、しかし標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な選択的ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチドを含んで成り、ここで当該第二のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチド及び１以上の配列バリアント中に存在することが知られている標的核酸を含む。幾つかの態様において、反応混合物は更に、核酸の増幅のために一般に必要な試薬及び溶液を含んで成り、これらには核酸ポリメラーゼ、核酸前駆体、すなわちヌクレオシドトリホスフェート、及び核酸ポリメラーゼの活性の支持のために適当な有機及び無機イオンが含まれる。
他の観点において、本発明は、本発明に従って対立遺伝子特異的増幅を行なうためのキットを提供する。当該キットは一般に測定特異的成分、並びにDNA増幅測定を行なうために一般に必要とされる成分を含む。測定特異的成分として、本発明の対立遺伝子特異的増幅キットは、典型的には、前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的である第一のオリゴヌクレオチド、及び前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な選択的ヌクレオチドを有し、そして更に少なくとも１つの「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチド、並びに所望により対照核酸配列を含み、当該対照核酸配列は、キットに同封されるオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的である、対照標的配列の或る量の少なくとも１つのバリアントを含む。
幾つかの態様において、対照核酸配列の１以上のバリアントを含めることができる。或る態様においては、キットに含められる対照核酸配列の幾つかのバリアント間で、少なくとも１つのバリアントは、対立遺伝子選択的オリゴヌクレオチドの選択的ヌクレオチドに対して相補的である。核酸の増幅のために一般的に要求される要素として、本発明のキットは、典型的には、核酸ポリメラーゼ、核酸前駆体、例えばヌクレオシドトリホスフェート（デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート又はリボヌクレオシドトリホスフェート）、核酸のピロリン酸分解を最小にするためのピロホスファターゼ、増幅反応のキャリーオーバー汚染に対して保護するためのウラシルＮ−グリコシラーゼ（UNG）、増幅反応及び検出のために必要な作り置き試薬及び緩衝剤、並びに本発明の対立遺伝子特異的増幅を行なうための指示書を含む。
更に他の観点において、本発明は対立遺伝子特異的PCRにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の対立遺伝子特異的PCRにおける使用のための典型的なオリゴヌクレオチドは、10〜50、更に好ましくは15〜35のヌクレオチドを含み、それらの大部分が標的配列の１以上のバリアント中の配列に対して相補的である。しかしながら、オリゴヌクレオチドの選択的ヌクレオチドは標的配列の１つのバリアントに対して相補的であり、そして他のバリアントに対しては相補的でない。更に、本発明のオリゴヌクレオチドは、１又は複数の「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドは３'−末端ヌクレオチドに存在する。他の態様において、「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドは、３'−末端ヌクレオチドの上流１及び５ヌクレオチド間、又は例えば１，２若しくは３ヌクレオチドに存在する。幾つかの態様において、「Ｇ−クランプ」ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにおける３'−末端、及び任意の他の場所に存在する。
下記の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の範囲は特許請求の範囲に示される。
実施例１
ヒトEGFR遺伝子中の変異L858Rを検出するためのプライマー
この変異は、野生型EGFR遺伝子（配列番号：１）におけるヌクレオチドの変化2573Ｔ→Ｇから生ずる。野生型及び変異EGFR遺伝子（配列番号：２）の両者を検出するためのプライマー及びプローブは表１に示される。各増幅プライマー対における１つのプライマーは、変異体バリアントに対してマッチしており、そして３'−末端において野生型バリアントに対してミスマッチである。残りのプライマー及びプローブは、変異体及び野生型標的について共通である。
Figure 0006050820
各増幅反応につき、野生型ゲノムDNA（K562）は、反応当たり104コピーで存在した。線状化された変異体プラスミドDNAもまた、反応当たり104コピーで存在した。変異体プラスミドは、pUC19ベクター（IDTからのMinigenes；配列番号：15及び16として提供された）への500bpの挿入により調製された。各反応は、変異体又は野生型標的（104 コピー入力）の104 コピーを増幅した。マッチしたバリアントは、EGFR L858R変異配列を含む挿入部を有するプラスミドDNAであり、他方、ミスマッチしたバリアントはK562 gDNAであった。マッチしたプライマーは、修飾されていないか、或いは３'末端位おいて、又は３'末端から位置N-1若しくはN-2においてＧ−クランプ修飾される。
12 μLの反応物のそれぞれは、2.98% グリセロール、50mM Tris-HCl (pH 8.0)、80mM KCl、200μMずつの各dATP、dCTP 及びdGTP、400μM dUTP、0.2μM フォワードプライマー、0.2μM リバースプライマー、0.05μM 検出プローブ、2.5% DMSO、0.02% Pierce Tween 20、0.036% ナトリウムアジド、0.1mM EDTA、0.2U/μL ウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)、200nM NTQ21-46A アプタマー、40nM Z05 変異体ポリメラーゼ、並びに2.5mM 酢酸マグネシウム（0.09% ナトリウムアジドと共に）を含んだ。
増幅及び分析は、Roche LightCycler 480装置を用いて行なった。反応は次の温度プロフィールに委ねた：50℃にて５分間（UNG ステップ）、続いて95℃にて10秒間及び62℃にて30秒間の２サイクル、並びに93℃にて10秒間及び62℃にて30秒間の60サイクル。蛍光データを、最後の60サイクル中で各62℃段階の終わりに集めた。
１つの実験の結果を表２に示す。増幅の結果が、450-500 nm又は540-580nm波長間隔における蛍光の変化として表される。増幅の選択性は、マッチした標的とミスマッチ標的との間のCt値（ΔCt）の相違として測定される。各実験のΔCtが表２に示される。その結果が示すところによれば、標的のマッチした（変異体）バリアントが、ミスマッチ（野生型）バリアントに比べて選択的に増幅された。選択性は、プライマー中のヌクレオチドのＧ−クランプ修飾により増強された。
Figure 0006050820
実施例２
PIK3CA遺伝子の変異を検出するためのプライマー
各増幅プライマー対における１つのプライマーは、３'末端において、変異体バリアントにマッチし、そして野生型バリアントにミスマッチである。残りのプライマー及びプローブは、変異体標的及び野生型標的の両者に共通である。野生型ゲノムDNA（K562）は反応当たり104 コピーで存在した。線状化された変異体プラスミドDNAは反応当たり104 コピーで存在した。変異体プラスミドは、pUC19ベクター（MinigenesとしてIDTから提供された）への500bpの挿入により調製された。
プライマーは、修飾されないか、又はN-1からN-2のいずれかの塩基位置においてＧ−クランプ修飾される。幾つかの設計においては、Ｇ−クランプ修飾位置又はその近傍でプライマー配列に追加のミスマッチが導入される。
12 μLの反応物のそれぞれは、2.98% グリセロール、50mM Tris-HCl (pH 8.0)、80mM KCl、200μMずつのdATP、dCTP 及びdGTP、400μM dUTP、0.1μM フォワードプライマー、0.1μM リバースプライマー、0.05μM 検出プローブ、2.5% DMSO、0.02% Pierce Tween 20、0.036% ナトリウムアジド、0.1mM EDTA、0.2U/μL ウラシル-N-グリコシラーゼ（UNG）、 200nM NTQ21-46A アプトマー、40nM Z05 変異体ポリメラーゼ、並びに2.5mM 酢酸マグネシウム（0.09% ナトリウムアジドとともに）を含んだ。
増幅及び分析は、Roche LightCycler 480 装置を用いて行なわれた。反応は次の温度プロフィールに委ねられた：50℃にて５分間（UNG 段階）、これに続き95℃にて10秒間及び62℃にて30秒間の２サイクル、並びに93℃にて10秒間及び62℃にて30秒間の60サイクル。最後の60サイクル内の各62℃段階の終わりで、蛍光データが集められた。
１つの実験の結果を表３に示す。増幅の結果が、450-500 nm又は540-580nm波長間隔における蛍光の変化として表される。増幅の選択性は、マッチした標的とミスマッチ標的との間のCt値（ΔCt）の相違として測定される。各実験のΔCtが表３に示される。その結果が示すところによれば、標的のマッチした（変異体）バリアントが、ミスマッチ（野生型）バリアントに比べて選択的に増幅された。選択性は、変異体プライマー中のヌクレオチドのＧ−クランプ修飾により増強された。
Figure 0006050820

Claims (12)

  1. 標的配列のバリアントの対立遺伝子特異的増幅方法において、当該標的は複数のバリアント配列の形態で存在し、この方法は、
    （ａ）第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを、標的配列の少なくとも１つのバリアントにハイブリダイズさせ、ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして前記第二のオリゴヌクレオチドは、標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして３'−末端ヌクレオチドにおいて標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な少なくとも１つの選択的ヌクレオチドを有し、ここで、前記第二のオリゴヌクレオチドは３'−末端ヌクレオチドの上流の１ヌクレオチド及び５ヌクレオチドの間の位置に少なくとも１つの「G−クランプ」ヌクレオチドであってシトシン類似体を含んで成るものを含み；
    （ｂ）前記第二のオリゴヌクレオチドを核酸ポリメラーゼにより延長し、ここで、当該核酸ポリメラーゼは、当該第二のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つの選択的ヌクレオチドに対して相補的な標的配列のバリアントにハイブリダイズする場合、当該第二のオリゴヌクレオチドを効果的に延長することができ、そして当該第二のオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つの選択的ヌクレオチドに対して相補的でない標的配列のバリアントにハイブリダイズする場合、実質的に非効果的に延長するものである；
    ことを含んで成る、ことを特徴とする増幅方法。
  2. 段階（ｂ）におけるプライマー延長の生成物を検出する段階（ｃ）を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸ポリメラーゼが、Taq DNA ポリメラーゼ、Z05 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05 DNA ポリメラーゼ、及びΔZ05-Gold DNA ポリメラーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記核酸ポリメラーゼが３'−５'ヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記核酸ポリメラーゼが、Pfu DNA ポリメラーゼ及びテルマトガ・マリチマ（Thermatoga Maritima）ポリメラーゼから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 段階（ａ）における前記配列のバリアントが、ヒトPIK3CA又はEGFR遺伝子の変異である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第二のオリゴヌクレオチドが、配列番号：６及び７から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記「G−クランプ」ヌクレオチドが、９−（アミノエトキシ）−フェノキサジン−２’−デオキシシチジンである、請求項１に記載の方法。
  9. 標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットにおいて、当該標的は複数のバリアント配列の形態で存在し、このキットは、
    （ａ）前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的である第一のオリゴヌクレオチド；及び
    （ｂ）前記標的配列の１又は複数のバリアントに対して少なくとも部分的に相補的であり、そして３'−末端ヌクレオチドにおいて標的配列の唯一のバリアントに対して相補的な少なくとも１つの選択的ヌクレオチドを有する第二のオリゴヌクレオチド、ここで当該第二のオリゴヌクレオチドは３'−末端ヌクレオチドの上流の１ヌクレオチド及び５ヌクレオチドの間の位置に少なくとも１つの「G−クランプ」ヌクレオチドであってシトシン類似体を含んで成るものを含む；
    を含むキット。
  10. 核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシドトリホスフェート、当該核酸ポリメラーゼによる核酸の延長のために適当な緩衝剤、及び対立遺伝子特異的増幅のために１組の指示書を更に含む、請求項９に記載のキット。
  11. 前記第二のオリゴヌクレオチドが、配列番号：６及び７から成る群から選択される配列を含んで成る、請求項９に記載のキット。
  12. 前記「G−クランプ」ヌクレオチドが、９−（アミノエトキシ）−フェノキサジン−２’−デオキシシチジンである、請求項９に記載のキット。
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