CN1197976C - 基因多态性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因多态性检测方法，可用于单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失、微卫星分析等。本方法是首先设计两对引物，其中一对为通常PCR引物，用于扩增含有基因多态性位点的DNA片段；另一对为锚定引物，用于判断基因多态性的类型。再将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，在单管中进行PCR扩增反应，并使扩增反应产生与基因多态性相对应的DNA扩增产物，然后以凝胶电泳法、或毛细管电泳法、或微流控芯片法，或高效液相色谱法等分离技术检测，根据扩增产物中DNA片段的多少及链长判断基因多态性的类型。为提高延伸反应的特异性，在锚定引物的3’端区域人为地引入一个与模板不互补的碱基。

Description

基因多态性检测方法

技术领域

本发明属于一种快速检测基因组中基因多态性(如单碱基多态性、单碱基插入或缺失)的方法，具体说是一种通过设计不同的引物，在单管中进行PCR扩增反应，并使扩增反应产生与基因多态性相对应的DNA扩增产物，然后用电泳或色谱的方法进行分离，根据扩增产物中DNA片段的多少及链长判断基因多态性的类型。

背景技术

基因多态性系指人类基因组中存在的基因序列的差异，其中单个核苷酸的差异是基因多态性的最主要形式。正常人和不同个体的核苷酸序列都有一定差异，它决定了不同人种和群体的差异，以及不同人群疾病易感性和药物治疗敏感性的差异^[1]。因此，基因多态性尤其是单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)是一个具有高度稳定性的遗传学标记，可以成为寻找疾病相关基因，进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础^[2]。目前，对SNP的检测方法多种多样，传统的方法有限制性酶切片段长度多态性(RFLP)^[3]、单链构象多态性(SSCP)^[3]、等位基因特异性扩增(ASA)^[4，5]和质谱法^[6]等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但应用上也有些不足^[7]，有些检测过程繁琐，有些需两步PCR扩增反应，有些需使用两管PCR反应分别测定SNP的两种等位基因等。用于SNP分析的DNA芯片技术^[8]是近年来新开发的一种高通量DNA序列变异检测工具，其优点是快速、高效，但缺点是仪器复杂，不易推广。在上述方法中，等位基因特异性扩增法是检测点突变较快捷的一种方法，但此方法的实验条件要求较高，需严格控制，否则易出现假阳性。最近发展了许多采用单管PCR反应同时测定两种等位基因系统中已知SNP的方法，包括引物竞争性扩增法^[9]，多颜色荧光标记PCR法^[10]，四引物PCR法^[11]及重叠PCR等位基因特异性放大法等^[12]。后两种方法是在一次PCR扩增反应中，采用四种引物，即一对通用外引物进行PCR扩增；外加一对等位基因特异性引物进行SNP种类的判定。最后用电泳法进行片段的分离，根据PCR扩增产物中特异性片段的长度确定SNP的类型。采用这两种方法进行临床应用时，仍然需要优化许多实验参数。然而，在很多情况下仅考虑PCR反应的条件和反应的浓度还不够，并且费时，成本也相应提高。其主要问题是外引物PCR产物的浓度远远大于内引物SNP特异性扩增产物的浓度，无法根据电泳条带判断SNP的种类并且有特异性低的缺点。

发明内容

本发明的目的就是为了解决现有单管四引物基因多态性分析法存在的缺点，提出一种成本低、易于操作、特异性高、不需复杂优化步骤就能快速完成基因多态性测定的方法。

本发明的技术解决方案：

一种用于快速检测基因多态性的方法，具有如下特征：(a)根据所测样本靶序列设计两对引物，其中一对为锚定引物；(b)将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，进行PCR扩增反应；(c)以适当的方法检测扩增产物中链长不同的DNA片断；(d)根据反应产物中DNA片断的多少及其长短判断基因多态性的类型。

本发明与以往技术相比，具有以下优点：

(1)特异性高。因为对基因多态性引物进行了人工修饰。

(2)可同时测定多个基因多态性位点。

(3)低成本。因为可利用一个标记的通用引物完成各种基因多态性的测定。

(4)可用于等位基因频率的测定。因为本技术的特异性很好。

(5)检测手段灵活，既可用常规的凝胶电泳法又可用高通量的微流控芯片法，也可采用液相色谱法。

附图说明

图1是本发明的测定方法原理图。

图2是本发明的实际样品测定结果示意图。

图3是HPLC法测定等位基因频率的原理图。

图4是芯片电泳法测定SNP原理图。

具体实施方式

本发明由以下四步组成：(1)根据底物序列设计两对半引物，用于检测基因多态性；(2)PCR扩增反应；(3)用分离方法(如电泳)分析PCR扩增反应产物；

(4)进行基因多态性判定。

本发明的方法原理如图1所示。在图1中，以基因多态性中最常见的SNP为例阐述本方法的原理。假设基因组1中存在SNP位点2，其类型为3，即A/G型。加入引物4和5扩增含有SNP位点2的DNA片段，为了分析SNP位点3的类型，分别加入SNP特异性锚定引物6和7，引物6和7的5’端含有由若干个碱基组成的锚定部分，其3’端区域含有一个为提高延伸反应特异性的人工突变碱基。引物6的3’端为“T”，与底物链上的碱基“A”互补；引物7的3’端为“G”，与另一条底物链上的碱基“C”互补。

当SNP的类型为“A”时，引物6发生延伸反应，产生延伸产物DNA片段8，由于在反应混合物中含有引物9，其序列与引物6和7的锚定部分序列完全相同，所以引物9和引物5进行PCR扩增反应产生DNA片段10。而此时引物7的3’端为“G”，与底物上“T”不互补，故不产生延伸反应。在最终的反应产物中有由引物9和5产生的特异性扩增片段10和由引物4和5产生的PCR扩增片段11。经过电泳分析后出现两条带12和13，分别代表DNA片段11和10。

当SNP的类型为“G”时，锚定引物7发生特异性延伸反应，产生延伸产物DNA片段14，经引物9和4的扩增反应，产生DNA片段15；同样在最终的反应产物中有由引物4和5产生的PCR扩增片段11。所以经过电泳分析后，产生两条带12和16，12为由引物4和5产生的PCR产物11，16为由引物4和9产生的特异性扩增片段15。

当SNP为杂合子“A/G”时，PCR扩增结果产生三条带，在图1中如17中的电泳条带12，16和13所示，它们分别代表DNA片段10，15和11。

所以通过一次PCR扩增反应，就可以同时确定SNP的三种可能类型。可采用多种分离方法分析扩增产物，如凝胶电泳、高效液相色谱和微流控电泳芯片等，检测时可用荧光染料标记图1中引物9的5’端，也可用溴化乙淀或其它荧光嵌入试剂直接加入到PCR扩增产物中显色，当采用高效液相色谱检测时，也可根据DNA分子在260nm处的紫外吸收峰检测，具体细节见实施例。

本发明的关键点：

(1)为提高基因多态性特异性引物延伸反应的特异性、减少测定结果的假阳性，在SNP特异性引物的3’端区域人工引入了一个突变碱基。为使实验简单化，通常将特异性引物3’端倒数第三个碱基人工改变为与底物相一致的碱基。

(2)为提高特异性扩增产物的浓度和特异性，在SNP特异性引物的5’端附加一段由多个碱基组成的锚定部分，并用与锚定部分序列相同的引物共同进行基因多态性特异性片段的PCR扩增。

(3)合理设计PCR引物，使扩增反应产生长度不同、容易分离的基因多态性特异性片段。

实施例1：凝胶电泳法测定三磷酸腺苷结合盒转运子1基因(ABC1)中SNP位点I823M

ABC1基因突变者，人体细胞内低密度脂蛋白(LDL)浓度偏高，而高密度脂蛋白(HDL)相对偏低，人体则易发生多种心血管疾病，如动脉粥样硬化，高血压等。本实施例以其SNP位点I823M为例，研究本专利方法的适用性。首先设计一对引物可扩增含有I823M位点的DNA片段，引物对的序列为：P1：5’-agg atgtgt caa gga gga aat-3’和P2：5’-gaa gcc aag aca aca aag aaa-3’。由该对引物扩增的DNA片段链长为446个碱基，I823M位点距离DNA链两端的距离分别为200和247个碱基。

I823M位点的SNP种类为“A”和“G”，为了检测“A”和“G”，分别设计一对SNP特异性引物，其3′末端碱基终止于SNP位点，两引物分别与底物的两条链互补，分别用于测定“A”和“G”。为了提高引物延伸反应的特异性，减少假阳性结果，在特异性引物3′端倒数第3个碱基处人工引入一个与底物不匹配的碱基。将这两个SNP特异性引物分别记为SP₁和SP₂，其序列为，SP₁：5′-GCG GTCCCA AAA GGG TCA GT aac agc act tac ttt ctc ac-3’；SP₂：5′-GCG GTC CCA AAAGGG TCA GT gtt cca acc aga aga aga gat ta-3’，其中以下划线际记的单个碱基为人工引入的不匹配碱基，5’端大写字母表示的碱基为特异性引物的锚定部分，在PCR扩增反应时，另加入与该锚定部分序列完全一致的引物AP，用于提高扩增反应的特异性和特异性扩增反应产物的产率。

引物设计完成后，按照PCR反应的要求，在单管中进行PCR反应，即在含有引物的试管中加入人基因组DNA，DNA聚合酶、Mg⁺⁺、反应缓冲液、脱氧核糖核苷酸等组分，在PCR扩增仪上进行PCR反应，即先94℃变性2～10min，然后按下列条件进行25～45个循环反应：94℃，30～60s；48～60℃，30～60s；72℃40～120s，反应完成后，继续在72℃ 3～15min，最后于4℃保存。取适量(如5μl)在凝胶上电泳，然后用荧光染料(如溴化乙碇)染色DNA，在紫外光照射下检测电泳条带。根据DNA条带的分子量大小即可迅速判断SNP类型，如出现链长为446bp和220bp(200bp加上20个锚定碱基)两条带，则SNP类型为“G”；如出现链长为446bp和266bp(246bp加上20个锚定碱基)两条带，则SNP类型为“A”，如出现446bp、220bp和246bp三条带，则SNP类型为“A/G”杂合子。图2为用本方法测定三种不同样品的结果，条带18为引物P1和P2的PCR产物，19为对应于“A”型扩增片段，20对应于“G”型扩增片段。样品A和C分别为“G”型、“A”型，样品B为“A/G”杂合子型，与测序结果一致。在图2中，三个样品均出现条带18，该片段的链长为446bp，可用作分子量内控指标。进一步的研究表明，当特异性引物中不含有人工引入的不匹配碱基时，图2中三个样品均出现三条带，说明特异性不好。因此在特异性引物的3′端区域人工地引入一个不匹配碱基可大大提高反应的特异性。

实施例2：高效液相色谱法测定等位基因频率

本例采用高效液相色谱法测定等位基因的频率。随着人类对SNP与疾病关系认识的深入，迫切需要了解遗传信息的差异对疾病易感性与药物疗效和毒副作用的影响，通常的研究方法是分别测定具有一定个体数量的正常组与异常组之间单碱基多态性(SNP)的差异。如逐个样品分析，则工作量太大，采用测定两组样品之间等位基因频率则可以大大减少劳动力，也可节省时间和财力。本例先将两组中多个样品21分别等量混合均匀成样品22，然后进行四引物PCR扩增反应，取反应液23适量注入液相色谱仪分离，得峰24，25和26，分别对应于“G”型和PCR片段(其长度为24和25之和)，根据峰24和25的峰面积A24和25，分别按公式27和28计算“A”和“G”的出现频率，其测定方法原理如图3所示。

实施例3：芯片电泳法快速测定SNP

采用芯片电泳法可实现快速和微量分析，通常在较短的时间内可对小于10μl的样品进行测定，如采用集成化的芯片装置可实现多个样品的并行测定。测定原理如图4所示。仍以实施例1中的样品为例来说明，首先取基因组样品29，用本专利中的方法测定，即加入两个5′端带一锚定部分的SNP特异性引物及一个经生物素染料Cy-5标记的、且序列与SNP特异性引物中锚定部分完全一致的引物，进行扩增反应，产生扩增反应产物30，点样于芯片中的孔31，在孔31和34间加上电压，完成进样，然后于孔32和33之间施加电医进行分离，在分离通道35中填满液体凝胶溶液，以半导体激光为激发光源，并收集DNA片段所发射出的荧光，得到电泳图谱，如出现峰36(对应于本例样品SNP的“G”型)，则SNP的类型为“G”；如出现峰37(对应于本例样品SNP的“A”型)，则SNP的类型为“A”；如同时出现峰36和37，则为“A/G”型杂合子。

本例说明了用本专利的方法实现快速测定SNP的方法，从血液中基因组提取开始，进行PCR扩增反应，然后用芯片电泳检测，可望在三个小时之内完成。由于仅对锚定引物进行标记，所以可将其作为通用引物用于各种类型的SNP测定，也可以实现单管中多重SNP的同时测定。

参考文献

1 Davidson S.Research suggests importance of haplotypes over SNPs，Nature Biotechnol，2000，18：1134-1135.

2 Brookes AJ，The essence of SNPs.Gene，1999，234：177-186.

3 Gu W，Aguirre GD，Ray K. Detection of single-nucleotide polymorphisms.Biotechniques，1998，24：836-837.

4 Christy MW，Benjamin DC.Single tube genotyping of sickle cell anemia using PCR-based SNPanalysis.Nucleic Acids Res，2001，29(23)：e119

5 Sommer SS，Groszbach AR，Bottemama CDK.PCR amplification of specific alleles(PASA)is ageneral method for rapid detection known single-base changes.Biotechniques，1992，12：1152-1153.

6 Fei Z，Smith LM.Analysis of single nucleotide polymorphisms by primer extension and matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight masss pectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom，2000，14(11)：950-959.

7 Du WN，Sun HX，Fang FD.The research development of single nucleotide polymorphism.ActaAcademiae Medicinae Sinicae，2000，22(4)：392-394.

8 Fan JB CX，Halushka MK，Bemo A，et al.Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays.Genome Res，2000，10(6)：853-860.

9 Newton，C.R.，Graham，A.，Heptinstall，L.E.，Powell，S.J.Summers，C.，Kalsheker，N.，Smith，J.C.and Markham，A.F.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutationsystem(ARMS).Nucleic Acids Res，1989，17(7)，2503-2516.

10 Myakishev MV Khripin Y，Hu S，et al.，High-throughput SNP genotyping by allele-specific PCR withuniversal energy-transfer labeled primers.Genome Res，2001，11：163-169.

11 Ye S，Humphries S and Green F.Allele specific amplification by tetra-primer PCR.Nucleic Acids Res，1992，20：1152.

12 Liu Q，Thorland EC，Heit JA and Sommer SS.Overlapping PCR for Bidirectional PCR Amplification ofSpecific Alleles：A Rapid One-Tibe Method for Simultaneously Differentoating Homozygotes andHeterozygotes.Genome Res，1997，7：389-398.

Claims (4)

1.一种用于快速检测基因多态性的方法，其步骤如下：

(a)根据所测样本靶序列设计两对引物：一对引物用于扩增含有基因多态性位点的DNA片段，其中基因多态性位点距离该对引物的PCR扩增产物的两端必须相差若干碱基；一对是用于判断基因多态性类型的锚定引物对，由两部分组成，一部分碱基的序列与底物序列互补；另一部分为附加碱基，即在引物的5’端附加若干个与底物序列不互补的碱基作为锚定部分，其3’端序列与DNA模板序列完全互补或者含有一个与模板不互补的碱基，并且3’端碱基正好位于基因多态性位点上用以控制引物的延伸；

(b)将上述两对引物及一个与锚定引物对5’端附加碱基序列相同的通用引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，进行PCR扩增反应；

(c)以电泳分离法、微流控芯片法或者色谱分离法检测扩增产物中链长不同的DNA片断；

(d)根据反应产物中DNA片断的多少及其长短判断基因多态性的类型。

2根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的电泳分离法是凝胶电泳法或者毛细管电泳法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的色谱分离法是高效液相色谱法。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用荧光染料标记PCR扩增产物或者用荧光染料标记通用引物的5’端。

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