CN109415762A - 通过多重扩增双重信号扩增的目标核酸序列的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过多重扩增双重信号扩增的目标核酸序列的检测方法(multiple amplification nested signal amplification；MANSA)，尤其涉及一种通过利用哑铃形寡核苷酸的目标核酸序列的第1次扩增反应以及第2次信号扩增反应而对目标核酸序列进行扩增以及检测的方法。本发明能够对非常有限的试料内的多个目标核酸序列进行检测且不会出现假阳性。

Description

通过多重扩增双重信号扩增的目标核酸序列的检测方法
技术领域
本发明涉及一种通过多重扩增双重信号扩增的目标核酸序列的检测方法(multiple amplification nested signal amplification；MANSA)，尤其涉及一种通过利用哑铃形寡核苷酸的目标核酸序列的第1次扩增反应以及第2次信号扩增反应而对目标核酸序列进行扩增以及检测的方法。
背景技术
目前，研究人员们为了获得遗传基因试料而最普遍使用的方法为利用DNA聚合酶的聚合酶连锁反应法。在聚合酶连锁反应中所使用的寡核苷酸被设计成与模板DNA的相反一侧的链结合。上述方法虽然具有能够通过在设计时对可与目标DNA结合的寡核苷酸的长度以及碱基序列进行任意调节而仅对目标遗传基因中的所需片段进行准确扩增的优点，但同时还具有因为通过一次反应只能对一个目标遗传基因进行扩增而在需要扩增的目标遗传基因数量较多时必须反复执行相同作业的缺点。
为了解决如上所述的缺点，开发出了通过将2种以上的目标遗传基因以及与各个目标遗传基因对应的引物混合成一个而执行聚合酶连锁反应的方法，同时还开发出了用于对引物的退火特异性进行改善的诸多方法。例如，包括降落PCR(Don et al.,1991)、热启动PCR(DAquila et al.,1991)、巢式PCR(Mullis and Faloona,1987)以及增效PCR(Ruanoetal.,1989)等。除此之外，还有一种利用多种增强剂化合物对PCR的特异性进行改善的方法，如上所述的增强剂化合物中包括能够提升有效结合反应温度的化学物质、DNA结合蛋白、工业上可用的反应物质等。但是，并不是所有的PCR方法都能够成功获得所需要的产物，而且在不同的结合温度条件下对如上所述的添加物进行测试是需要耗费很多时间和精力的庞大工程。虽然如上所述的解决方案能够为引物退火特异性的改善做出一定的贡献，但是上述方法仍然不能从源头上解决PCR扩增中所使用的引物所导致的问题，如非特异性生成物以及背景过高的问题。此外，因为能够成功地通过单次作业扩增的遗传基因数量只有3至4个且各个遗传基因之间的竞争或干扰效果、非特异性产物的扩增等缺点并没有得到改善，因此目前还无法满足实际应用的要求。
如上所述，为了执行多重聚合酶连锁反应以及等位基因特异性PCR，必须对目标遗传基因的条件进行优化，因此需要耗费大量的时间和精力并承受样品消耗，但是如上所述的优化条件却无法适用于其他遗传基因。为了克服上述问题，开发出了连接子聚合酶连锁反应(Linker PCR)或通过连接反应介导的聚合酶连锁反应(Ligation Mediated PCR)(参考：Journal of Clinical Microbiology,43(11):5622-5627,2005)等方法。但是，因为连接子聚合酶连锁反应需要将第一个管中的反应生成物的一部分转移到第二个管中继续进行反应的试验特性而可能会导致交叉污染的发生，同时因为连接反应介导的聚合酶连锁反应中需要利用多种类型的酶的复杂试验方法而会导致研究人员的困难，所以只有在一部分情况下才会使用如上所述的试验技法。
所以，需要开发出一种能够以低廉的成本对遗传基因进行扩增的技术。为了满足上述需求而开发出的技术，是一种通过单纯地对引物进行操作而使其在达到适当的PCR反应温度之前不会发生扩增的方法。作为上述方法的实例，包括大韩民国注册专利第649165号中所公开的发明。上述技术在第一个引物中追加插入了调节因子(regulator)片段。上述调节因子片段为聚脱氧肌苷连接子(polydeoxyinosine linker)，且构成上述调节因子片段的肌苷(inosine)为具有比构成典型引物的一般核苷酸即G、A、T、C低的Tm值的通用碱基(universal base)，因此在特定的温度下上述聚脱氧肌苷连接子能够形成“类泡沫结构(bubble like structure)”，从而防止引物被非特异性地结合到目标并借此对PCR的非特异性扩增进行抑制。虽然本技术的实现成本与上述的现有技术相比略有降低，但却具有需要在执行PCR时将第一个周期上的结合步骤温度(适当的PCR反应温度)以及第二个周期上的结合步骤温度调整为不同温度的不便。这是为了使被追加导入到引物中的序列能够从第二个PCR周期开始也参与到引发过程。虽然并不能说必须要求“适用不同的温度”，但可以说为了有效的PCR需要适用不同的温度。此外，上述技术受到的限制还包括，必须追加5'-端片段的预选任意核苷酸序列且上述核苷酸序列不得与目标的任何位置互补。这不仅会导致更多的不便，而且在不了解目标的所有遗传基因序列时并不能保证适用上述技术可以获得成功。因此，需要开发出比上述现有技术的成本更低且实现更为简单的全新的方法。
实时PCR因为能够实时地对扩增产物进行测定且能够更加精确地执行定量分析而被广泛使用。作为与实时PCR相关的现有专利文献，包括美国专利第5,210,015号、第5,538,848号以及第6,326,145号。虽然现有的实时PCR方法具有能够同时执行扩增以及检测的均相测定(homogeneous assay)方式的优点，但是因为荧光指示分子的种类受限，因此能够同时进行检测的目标核酸序列的数量也将受到限制。能够实时地对目标核酸序列进行检测的现有的热循环仪(thermocycler)最多能够同时检测5-plex，因此能够同时进行检测的目标核酸序列的数量也将受到限制，而且为了对大容量的试料进行分析，需要耗费较多的时间并额外配备价格高昂的实时监控装置。
实时PCR中最具代表性的TaqMan探针方式(美国专利第5,210,015号)以及自猝灭荧光探针方式(美国专利第5,723,591号)，具有因为双重标记探针的非特异性结合而导致假阳性结果的问题，因此实际上难以实现5-plex的检测且必须有熟练的技术以及技巧作为支持。因为现有的PCR方式需要同时执行扩增以及检测，因此实时PCR装置在高速处理(HighThroughput)能力有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题
所以，本发明的目的在于提供一种能够通过对常温状态下的非预期的PCR扩增进行抑制而实现热启动PCR的目标核酸序列的扩增以及检测方法。
此外，本发明的另一目的在于提供一种能够通过在对PCR进行扩增时使得从PCR产物的扩增优先于从初始模板的扩增而最终对PCR中的非特异性扩增进行抑制的目标核酸序列的扩增以及检测方法。
本发明的又一目的在于提供一种能够通过多重方式同时对多个目标核酸序列进行检测且能够在使用远少于现有的实时PCR方式的探针以及试料的前提下以更加优秀的灵敏度对多个目标核酸序列进行检测的方法。
技术方案
为了实现如上所述的目的，本发明提供一种包括下述步骤的利用哑铃结构寡核苷酸对目标核酸序列进行检测的方法。
(a)通过利用以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的第1次扩增反应而进行扩增的步骤：
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用引物以及荧光发生指示剂(fluorogenic reporter)的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
有益效果
适用本发明的方法不仅能够通过对常温状态下的非预期的PCR扩增进行抑制而实现热启动PCR，而且还能够通过在对PCR进行扩增时使得从PCR产物的扩增优先于从初始模板的扩增而最终对PCR中的非特异性扩增进行抑制。
此外，适用本发明的方法能够通过将哑铃结构寡核苷酸作为引物进行使用而通过单次的聚合酶连锁反应快速准确地同时对多个不同的遗传基因进行扩增。
进而，本发明能够以多重方式同时对多个目标核酸进行检测并根据分析目的对多个目标核酸序列进行分类和区分，且能够在使用远少于现有的实时PCR方式的探针以及试料的前提下以更加优秀的灵敏度对多个目标核酸序列进行检测。
此外，通过适用本发明的方法，能够在不执行现有的附加性的限制酶处理或碱基序列分析过程的情况下根据多重扩增双重信号扩增以及熔解曲线的熔解温度差异无误差且准确地同时检测出各种癌症遗传基因或抑制遗传基因是否发生变异。
现有的实时PCR方法需要标记探针或如发夹结构等复合变形的引物结构，而这会导致探针以及引物的设计、合成或序列的选择变得困难。但是，适用本发明的引物无需追加的标记探针或复杂变形的引物结构即可适用于目标扩增以及信号扩增，因此能够使实时PCR变得更加简单且容易。
现有的实时PCR方法难以完成引物或探针的设计以及优化，因此并不适合于多重测定。与此相反，本发明在实时PCR中无需追加的探针或复杂变形的引物结构即可根据目标扩增双重信号扩增以及熔解曲线的熔解温度差异准确地检测出目标核酸序列。
因此，可以说本发明在实时PCR分析方法的开发方面对时间以及成本效率进行了改善。
附图说明
图1是对利用适用本发明的多重扩增双重信号扩增对5个目标核酸序列进行扩增以及检测的过程进行图示的概要图。
图2至图7中图示了分别以不同浓度的目标核酸序列作为对象并利用适用本发明的方法进行扩增的结果(扩增曲线)。
图8中图示了在对不同浓度的目标核酸序列进行混合之后再利用适用本发明的方法进行扩增的结果(扩增曲线)。
图9中图示了在对不同浓度的目标核酸序列进行扩增之后再通过电泳分析进行确认的结果。
图10中图示了在对不同浓度的目标核酸序列进行混合之后再利用适用本发明的方法进行扩增并执行熔解曲线分析的结果。
图11至图16中图示了分别以不同浓度的目标核酸序列作为对象利用适用本发明的方法进行扩增之后再执行熔解曲线分析的结果。
具体实施方式
本发明提供一种不仅能够通过对常温状态下的非预期的PCR扩增进行抑制而实现热启动PCR，而且还能够通过在对PCR进行扩增时使得从PCR产物的扩增优先于从初始模板的扩增而最终对PCR中的非特异性扩增进行抑制的目标核酸序列的检测方法。
本发明人为了开发出能够通过单次的聚合酶连锁反应对多个遗传基因进行扩增的方法而进行了不懈的研究与努力，最终确认在制作需要进行扩增的遗传基因碱基序列的引物的过程中，为了形成哑铃结构(dumbbel structure)而使用由在5'-端追加了能够与3-5bp的3'-端互补结合的任意碱基序列以及用于对上述两个部分进行连接的3-5bp的通用碱基对的哑铃结构寡核苷酸构成的引物时，能够通过单次聚合酶连锁反应快速准确地同时对多个遗传基因进行扩增。本发明人开发出了通过利用上述哑铃结构寡核苷酸优先实施多重目标扩增而确保其扩增产物之后再通过双重信号扩增检测出目标核酸序列的技术。
因此，本发明提供一种能够在液体状态下利用多重扩增双重信号扩增(multipleamplification nested signal amplification)从DNA或核酸混合物检测出目标核酸序列的方法，这将通过如下所述的实施例以及权利要求书得到进一步明确。
在适用本发明的一实施形态中，本发明提供一种包括下述步骤的利用哑铃结构寡核苷酸对目标核酸序列进行检测的方法。
(a)通过利用以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的第1次扩增反应而进行扩增的步骤：
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用引物以及荧光发生指示剂(fluorogenic reporter)的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
适用本发明的方法，包括：(a)对生物学试料内目标核酸序列的第1次扩增反应；以及，(b)对第1次扩增产物的第2次扩增反应(信号扩增)以及对信号的检测反应。
在本发明中，首先通过第1次扩增反应仅对目标核酸序列进行扩增，然后再以上述扩增产物为模板对信号进行扩增。因此，将本发明与现有技术相比时的最大特征如下所述。通过在仅对目标核酸序列进行第1次扩增之后再对上述扩增产物进行第2次扩增(同时执行信号扩增)，能够借助于核酸外切酶实现信号扩增以及实时监控。以此为基础，本发明被命名为多重扩增双重信号扩增(“Multiple Amplification Nested SignalAmplification”)并简称为“MANSA”。
目标核酸的多重扩增，能够按照本行业公知的各种引物-相关核酸扩增方法实施。较佳地，目标核酸的扩增是按照PCR实施，而PCR方法已在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号以及第4,800,159号中进行公开。被多重扩增的目标核酸序列为DNA或RNA。上述核酸分子能够是双链或单链，较佳地为双链。当作为起始物料的核酸为双链时，将双链转化成单链或部分单链的形态为宜。对链进行分离的方法包括热、碱、甲酰胺、尿素以及、乙二醛、处理、酶法(例如解旋酶作用)以及结合蛋白质，但是并不限定于此。例如，对链的分离能够通过在80-105℃的温度下进行热处理而实现。当将mRNA作为起始物料进行使用时，必须在扩增前执行逆转录步骤，而在逆转录步骤中需要使用杂化到mRNA的聚A尾中的寡核苷酸dT引物、随机六聚体或与目标核酸序列互补的寡核苷酸。寡核苷酸dT引物是由dTMPs构成，在dT引物能够作为引物发挥作用的限度内，dTMPs中的一个或一个以上能够被替代成其他dNMPs。逆转录步骤能够通过具有RNase H活性的逆转录酶实现。在使用具有RNase H活性的酶的情况下，只要在注意反应条件的前提下进行选择，就能够避免个别的RNase H截断过程。
在本说明书中所使用的术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”是指天然或变形的单体或连锁(linkages)的线性低聚物，包括脱氧核苷酸以及核糖核苷酸，能够与目标核苷酸序列进行特异性杂化，可通过大自然或人工合成的方式获得。为了实现杂化的最高效率，寡核苷酸较佳地为单链。较佳地，寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸。本发明中的寡核苷酸，能够包括天然dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP以及dTMP)、核苷酸类似物或衍生物。此外，寡核苷酸还能够包括核糖核苷酸。例如，本发明中的寡核苷酸，能够包括：主体结构修饰的核苷酸，如肽核酸(PNA)(M.Egholm et al.,Nature,365:566-568(1993))、硫代磷酸酯DNA、二硫代磷酸酯DNA、氨基磷酸酯DNA、酰胺连接的DNA、MMI连接的DNA、2'-O-甲基RNA、α-DNA以及甲基膦酸酯DNA；糖基修饰的核苷酸，如2'-O-甲基RNA、2'-氟代RNA、2'-氨基RNA、2'-O-烷基DNA、2'-烯丙基DNA、2'-炔基DNA、己糖DNA、吡喃糖RNA以及失水己糖醇DNA；以及，碱基修饰的核苷酸，如C-5取代的嘧啶(取代基包括氟-、溴-、氯-、碘-、甲基-、乙基-、乙烯基-、甲酰基-、乙炔-、丙炔基-、炔基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)、具有C-7取代基的7-氮杂嘌呤(取代基为氟-、溴-、氯-、碘-、甲基-、乙基-、乙烯基-、甲酰基-、炔基-、链烯基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)、肌苷以及二氨基嘌呤。
在本说明书中所使用的术语“引物”是指寡核苷酸，在与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件，即，在核苷酸以及DNA聚合酶等聚合剂存在且温度以及pH值适当的条件下能够起到合成起始点的作用。为了实现扩增的最高效率，引物较佳地为单链。较佳地，引物为脱氧核苷酸。本发明中的引物，能够包括天然(naturally occurring)dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP以及dTMP)、修饰的核苷酸或非天然核苷酸。此外，引物还能够包括核糖核苷酸。
引物应达到能够在聚合剂存在的条件下对延伸产物的合成进行引发的足够的长度。适当的引物长度取决于如温度、应用领域以及引物的来源(source)等多种因素。
术语“退火”或“引发”是指寡脱氧核苷酸或核酸被添附(apposition)到模板核酸中的过程，在上述添附过程中聚合酶将使核苷酸发生聚合并在模板核酸或其中的一部分形成互补的核酸分子。在本说明书中所使用的术语“杂化(hybridization)”是指从互补的单链核酸形成双链核酸的过程。术语“退火”以及“杂化”并无差异，在本说明书中兼备混用。
在本说明书中所使用的术语“探针(probe)”是指包括与目标核苷酸序列实质性互补的片段的单链核酸分子。
在本发明中所使用的哑铃结构寡核苷酸能够起到通过杂化(退火)到目标核酸序列中而对目标核酸序列进行扩增的作用，具有以下述通式表示的结构。
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施。
在本发明中所使用的哑铃结构寡核苷酸，能够根据被分割片段分割的5'-低Tm特异性片段(5'-low Tm specificity portion)以及3'-高Tm特异性片段(3'-high Tmspecificity portion)而呈现出具有类型特异性的杂化特性，因此能够呈现出大幅提升的杂化特异性。
具体来讲，当哑铃结构寡核苷酸被退火到目标核酸序列时，其特异性并不像现有的引物一样取决于引物的整体长度，而是由相互分割的5'-低Tm特异性片段以及3'-高Tm特异性片段共同决定。因此，在哑铃结构寡核苷酸被退火到目标核酸序列中时，将以与现有的引物不同的方式(performance)完成退火，从而能够大幅度地提升退火的特异性。
在本发明所使用的哑铃结构寡核苷酸中，位于上述分割片段中的通用碱基应从由脱氧肌苷、肌苷、7-二硫唑嘌呤-2'-脱氧肌苷、2-硫唑嘌呤-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷以及上述碱基之组合构成的组中选择，较佳地为脱氧肌苷、肌苷或5-硝基吲哚，最佳地为脱氧肌苷。在适用本发明的较佳实现例中，上述分割片段包括连续的通用碱基。
在本发明所使用的哑铃结构寡核苷酸中，上述5'-低Tm特异性片段的长度小于3'-高Tm特异性片段的长度。上述5'-低Tm特异性片段较佳地具有3-15核苷酸或3-5核苷酸的长度。上述3'-高Tm特异性片段具有5-19核苷酸、6-18核苷酸或18-30核苷酸的长度。上述分割片段具有3-5核苷酸的长度。较佳地，上述5'-低Tm特异性片段具有3至5个核苷酸的长度，上述分割片段具有3至5个核苷酸的长度且上述3'-高Tm特异性片段具有18至30个核苷酸的长度。
在适用本发明的一实现例中，上述5'-低Tm特异性片段具有10-30℃的Tm。此外，上述3'-高Tm特异性片段具有50-65℃的Tm。上述分割片段较佳地具有3-10℃的Tm。
在适用本发明的一实现例中，上述3'-高Tm特异性片段能够具有与杂化的目标核酸序列完美互补的核苷酸序列。
在适用本发明的一实现例中，上述哑铃结构寡核苷酸的目标核酸序列的退火作业能够在50℃-65℃范围的温度下实施。
在适用本发明的一实现例中，上述目标核酸序列的第1次扩增，能够通过反复执行包括上述哑铃结构寡核苷酸的杂化、延伸以及变性过程的模板依赖性延伸反应过程而实现。
在适用本发明的一实现例中，上述扩增反应能够按照聚合酶连锁反应实施。
在适用本发明的方法的聚合酶连锁反应中能够使用多种类型的DNA聚合酶，其中包括E.coli DNA聚合酶I的“克列诺(Klenow)”片段、热稳定性DNA聚合酶以及噬菌体T7DNA聚合酶。较佳地，聚合酶为能够从多种类型的细菌菌种获得的热稳定性DNA聚合酶，包括水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄曲栖热菌(Thermus flavus)、嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)、以及强烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)。在实施聚合反应时，向反应容器供应过量的反应所需成分为宜。扩增反应所需成分的过量，是指扩增反应实质上不受到成分浓度限制的程度的量。将如Mg2+等辅因子、dATP、dCTP、dGTP以及dTTP以能够达到所期望扩增程度的量供应到反应混合物中为宜。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(a)的第1次扩增能够在扩增产物之间发生严重竞争之前为止进行扩增。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(b)所使用的荧光发生指示剂能够是SYBRGreen、SYTO 9、EvaGreen或LCGreen。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(b)所使用的引物能够是常规引物(conventional primer)或不同的哑铃结构寡核苷酸。在适用本发明的一实现例中，上述步骤(b)所使用的引物能够是与上述步骤(a)所使用的寡核苷酸相同的哑铃结构寡核苷酸。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(a)以及步骤(b)所使用的哑铃结构寡核苷酸相同且上述步骤(b)能够使寡核苷酸引发(oligonucleotide priming)实质性地倾向于偏好具有较高特异度的引物一侧。
在适用本发明的一实现例中，能够使上述步骤(a)以及步骤(b)所使用的寡核苷酸中的至少一个包含UTP核苷酸并通过UNG酶发生分解。
在适用本发明的一实现例中，能够使上述步骤(a)所使用的寡核苷酸中的至少一个包含UTP核苷酸并在上述步骤(a)之后通过UNG酶去除上述寡核苷酸，从而实质性地防止在第2次扩增中因为上述引物而导致的污染。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(a)能够在1至25个循环的范围内执行。在适用本发明的另一实现例中，上述步骤(a)能够在5至20个循环的范围内执行。在适用本发明的又一实现例中，上述步骤(a)能够在10至15个循环的范围内执行。但是，上述执行循环的范围能够由从业人员自由改变。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(b)的信号检测能够是通过在各个周期对从荧光指示剂生成的荧光信号进行测定并将其绘制(plotting)成扩增曲线的方式执行。例如，能够通过在上述扩增曲线中适用事先规定的阈值(threshold)而对目标核酸序列的存在与否进行确认。此外，上述扩增曲线还能够用于对目标核酸序列进行定量分析。例如，能够通过从上述扩增曲线测定出Ct(循环阈值，Cycle threshold)值而对样品内所存在的目标核酸序列的量进行确认。如上所述的目标核酸序列的定性以及定量分析属于本行业的公知知识。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(b)的信号检测能够通过熔解曲线分析(meltcurve analysis)而执行。上述熔解曲线分析属于本行业的公知知识。例如，能够通过在完成步骤(b)之后以一定的温度间隔提升最终产物温度的同时对荧光进行测定而绘制出熔融曲线。在适用本发明的一实现例中，能够以0.05℃至0.02℃范围内的分辨率生成上述熔解曲线。在适用本发明的另一实现例中，能够以小于0.02℃的分辨率生成上述熔解曲线。
因为现有的PCR方式需要同时执行扩增以及检测，因此在高速处理能力有限。例如，因为现有的实时PCR需要同时执行扩增以及检测，因此其检测过程需要约2小时的时间，但是因为本发明能够分开执行扩增以及检测，因此在仅执行检测时能够利用实时PCR装置在30分钟之内得到结果。
此外，本发明能够通过使用哑铃结构寡核苷酸而减少荧光双重标记探针的使用量，从而大幅度地减少分析成本并减少所使用的试料的量以及分析时间，同时还能够大幅度地改善检测的灵敏度。
进而，适用本发明的多重扩增双重信号扩增(MANSA)技术还因为反应时间较短且能够实时地对反应产物进行监测而降低在检查室的业务量，且多重聚合酶连锁反应还能够同时对多个遗传基因是否发生变异进行确认，而当将其作为试料进行使用时还能够排除在执行现有的实时聚合酶连锁反应的过程中使用微量的试料时因为假阴性而导致的错误。
本发明提供一种能够对核苷酸序列内的多种类型的核苷酸变异或SNP(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism)同时进行检测的方法。尤其是，本发明提供一种能够对核苷酸序列内的相同的碱基或相同的密码子中的变异同时进行检测的方法。
目前为止，还没有实质性地开发出能够仅通过简单的扩增反应(例如PCR)而对2种以上的核苷酸变异尤其是相同的碱基或相同的密码子中的2种以上的变异同时进行检测的方法。而本发明提供一种如上所述的能够仅通过简单的扩增反应同时对变异进行检测的实质性的方法。
在本发明中所使用的哑铃结构寡核苷酸，能够根据被分割片段分割的5'-低Tm特异性片段(5'-low Tm specificity portion)以及3'-高Tm特异性片段(3'-high Tmspecificity portion)而呈现出具有类型特异性的杂化特性，因此能够呈现出大幅提升的杂化特异性。
在本发明中，哑铃结构寡核苷酸的3'-高Tm特异性片段包括与核苷酸变异对应(corresponding)或互补(complementary)的核苷酸。在本发明中，当寡核苷酸与目标核苷酸序列中的有义链杂化时，3'-高Tm特异性片段包括与核苷酸变异互补的核苷酸，而当与反义链杂化时，包括与核苷酸变异对应的核苷酸。
在适用本发明的较佳实现例中，与上述核苷酸变异对应或互补的核苷酸位于3'-高Tm特异性片段的3'-端或从3'-端相隔1至2个碱基的位置，较佳地位于从3'-高Tm特异性片段的3'-端相隔1至2个碱基的位置。最佳地，与核苷酸变异对应或互补的核苷酸位于3'-高Tm特异性片段的中央(center)或中央附近(around the center)。例如，当3'-高Tm特异性片段从3'-端相隔1至2个碱基时，与核苷酸变异对应或互补的核苷酸位于与3'-高Tm特异性片段的5'-端同样相隔1至2个碱基的位置。
在上述寡核苷酸的3'-高Tm特异性片段中，当与核苷酸变异对应的核苷酸位于从3'-高Tm特异性片段的3'-端相隔1至2个碱基的位置，同时与其互补的核苷酸位于与3'-高Tm特异性片段的5'-端同样相隔1至2个碱基的位置时，能够得到如下所述的有利效果。
例如，在利用一般的引物对SNP进行检测时变异发生片段将位于3'-端，而此时在3'-端的碱基被退火或没有被退火到目标序列时(即错误匹配时)的Tm值不会有太大的差异。因此，即使是在错误匹配时也很有可能因为被退火而发生扩增反应并因此得到假阳性结果。与此相反，如果使变异发生片段位于偏向中间的位置，在变异发生片段没有被退火到目标序列时(即错误匹配时)的Tm值将呈现出一定程度的较大差异，但是大部分的热稳定性聚合酶在错误匹配的部分也会对聚合反应进行催化并因此导致假阳性结果。
而通过适用本发明，能够完美地解决如上所述的现有技术中所存在的问题。例如，当与核苷酸变异对应或互补的核苷酸位于3'-高Tm特异性片段中偏向中间的位置时，如果在意外的位置发生错误匹配，以3'-高Tm特异性片段而论时属于在结构的中央发生错误匹配的情况，因此其3'-高Tm特异性片段的Tm值与匹配时相比将出现大幅度的减少，而以引物的整体结构而论时属于在5'-端以及3'-端同时发生错误匹配的情况，因此热稳定性聚合酶将不会对聚合反应进行催化。所以，在错误匹配的情况下不会导致假阳性结果。
在适用本发明的另一实施形态中，本发明提供一种利用包括哑铃结构寡核苷酸的引物对对目标核酸序列进行检测的方法。上述方法包括如下所述的步骤。
(a)利用包括至少一个以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的引物对对目标核酸序列进行第1次扩增的步骤，上述第1次扩增包括引物杂化、引物延伸以及变性过程的至少两个循环，
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用引物对以及荧光发生指示剂(fluorogenic reporter)的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
适用本发明的方法，能够适用于对多重目标核酸序列进行检测。
在适用本发明的又一实施形态中，本发明提供一种利用包括哑铃结构寡核苷酸的2个以上的引物对对目标核酸序列进行检测的方法。上述方法包括如下所述的步骤。
(a)利用包括至少一个以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的2个以上的引物对对2个以上的目标核酸序列进行第1次扩增的步骤，上述第1次扩增包括引物杂化、引物延伸以及变性过程的至少两个循环，
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用2个以上的引物对以及荧光发生指示剂(fluorogenic reporter)的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
在适用本发明的一实现例中，上述步骤(a)以及步骤(b)所使用的寡核苷酸能够是用于对5个以上的目标核酸序列进行扩增的寡核苷酸，例如能够是5个引物对(正向以及逆向)和/或探针。
如上所述的2个实施形态，只是在所使用的寡核苷酸以及目标核酸序列的数量上存在差异，其整体构成与在上述内容中进行说明的一实施形态类似，所以将省略其详细的说明。
对本发明的特征进行总结如下。
第一，本发明与现有的实时PCR方式不同，是属于利用扩增产物对目标核酸的信号进行检测的方法，因此即使是在使用比现有的方式低几十甚至几百倍的Taq的情况下也能够有效地对目标核酸进行检测。因此，能够提供与现有的实时PCR产品相比更低价的产品。
第二，在现有的检查方法中需要对如病毒或细菌等病原体的感染与否进行检查时，需要为不同的检查准备不同的试料。即，需要分别准备用于病毒感染进行检查的试料、用于对细菌的感染与否进行检查的试料以及用于对霉菌感染进行检查的试料。而与此相反，本发明能够在一个反应管中对10余种以上的病毒、细菌以及霉菌等病原体的目标核酸序列同时进行扩增之后再利用上述扩增产物分别对病毒、细菌以及美军进行检查，或通过病毒/细菌、病毒/细菌/霉菌等多种组合对目标核酸序列进行检测。即，只需要单次的试料采集以及少量的试料即可进行多种不同的检查。
第三，现有的实时PCR采用的是在利用少量的目标核酸序列进行扩增的同时执行检测的方法，依赖于目标核酸序列的初始浓度。
而与此相反，本发明通过追加利用第1次扩增的产物在第2次检测过程中对目标核酸相关的信号进行扩增的过程，能够实现比现有的方法更加优秀的灵敏度。即，通过本发明能够实现与巢式PCR(nested PCR)类似的灵敏度改善效果。
第四，本发明能够在一个反应管中对多种类型的病毒、细菌以及霉菌等病原体的目标核酸序列同时进行扩增之后再利用上述扩增产物执行第1次筛选(分类)检查，并利用上述扩增产物对确认为感染阳性的病原体执行第2次判定鉴别(个体区别)检查。即，在第1次检查中执行用于对病毒、细菌或霉菌的感染与否进行检查的筛选检查，而在得到上述病毒的感染阳性判定结果时则能够在不追加执行扩增反应的情况下简单快速地判定是被哪一种病毒所感染。而与此相反，在现有的方法中即使是通过筛选而获得了病毒阳性结果，还需要单独执行用于对病毒核酸序列进行扩增的过程。本发明因为能够通过单次的扩增过程利用扩增产物执行多种不同的检查，因此能够节省单独扩增所需要的检查时间以及成本。
第五，在本发明中目标核酸序列的扩增反应是利用一般的扩增装置执行，其检测过程能够利用实时检测装置在30分钟之内完成。因此，在利用一般的扩增装置的情况下，只要准备好扩增的产物就能够每30分钟对96个(当实时检测装置为96孔时)试料进行检查。而与此相反，在利用现有的实时PCR方法对每96个试料进行检测时最少需要2小时30分钟。
接下来，将结合实施例对具有上述优点的适用本发明的多重扩增双重信号扩增(multiple amplification nested signal amplification；MANSA)技术进行详细的说明。
<实施例1>：利用适用本发明的方法对目标核酸序列进行检测
作为目标核酸序列，使用了塞卡病毒的基因组DNA。以上述塞卡病毒基因组DNA为基础，设计出了具有哑铃结构的正向(foward)以及逆向(reverse)引物。
在上述本发明中所使用的具有哑铃结构的引物基本上具有如通式1所示的结构，以极高的特异性与目标核酸序列进行了杂化。在如上所述的具有如通式1所示结构的引物中，5'-低Tm特异性片段以及3'-高Tm特异性片段是通过分割片段实现物理性以及功能性分割，而引物整体结构的杂化特异性是由5'-低Tm特异性片段以及3'-高Tm特异性片段共同调节。此外，通过使与核苷酸变异对应或与变异杂化的碱基位于3'-高Tm特异性片段的中央部分，在使错误匹配所导致的Tm值的差异变大的同时避免了在错误匹配时因为Taq聚合酶而导致的DNA合成。所使用的目标核酸序列以及引物序列如下述表1所示。
[表1]
将不同浓度的目标DNA(最终浓度为1ng、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag以及10ag)与5pmole的引物以及10μl的Type IT HRM反应混合物进行混合至20μl的最终体积，然后投入到热循环仪(ABI 9700,PerKinelmer)中。将上述反应混合物在95℃条件下进行10分钟的变性，接下来反复执行在95℃下30秒、65℃下60秒、72℃下60秒的过程15次，最终在72℃下进行5分钟的反应之后结束。
接下来，将包含上述反应混合物的管投入到实时热循环仪(Rotogene Q，Qiagen)中。将上述反应混合物在95℃条件下进行10分钟的变性，接下来反复执行在95℃下10秒、65℃下15秒、72℃下25秒的过程30次，最终对荧光信号的增加进行了检测。对指定时间间隔(predetermined time interval)下在各个循环中发生的信号进行了检测。
在图2中图示了上述之结果。
如图2所示，在极微量的模板中并没有出现目标核酸序列的荧光信号扩增。上述结果表明，目标模板与本发明的引物发生杂化或单链化的本发明的引物本身截断时并不会导致信号的扩增。此外，在目标核酸序列的不同浓度试验中，对1fg为止的目标核酸序列的荧光信号进行了确认。借此，可以确认在不对目标核酸序列进行扩增的情况下，反复执行利用适用本发明的引物的变性、杂化、截断以及延伸的方法而足以生成目标荧光信号，并借此通过实时信号扩增完成对目标核酸序列的检测。
<实施例2>：适用本发明的方法的PCR灵敏度
通过对塞卡病毒遗传基因的目标核酸序列进行检测，对利用适用本发明的引物的实时PCR灵敏度进行了确认。如图8所示，在利用从1ng开始连续稀释的塞卡病毒基因组DNA执行实时PCR时，即使是在稀释到10fg的情况下仍然检测到了目标核酸序列。
此外，在图9中图示了通过电泳分析对上述扩增产物进行分析的结果。如图9所示，可以确认所生成的扩增产物的量与初始目标核酸序列的浓度呈正比。
<实施例3>：利用适用本发明的引物的熔解温度曲线分析
本发明人在实时PCR反应条件下，对不同的DNA浓度适用反复执行变性、杂化、阶段以及延伸的方法之后，追加确认了适用本发明的引物是否能够生成对目标核酸序列进行检测所需的足够的信号。
为了执行上述评估试验，利用与实施例1相同的模板以及引物执行了实时目标信号扩增。将不同浓度的DNA(最终浓度为1ng、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag以及10ag)与5pmole的引物以及10μl的Type IT HRM反应混合物进行混合至20μl的最终体积，然后执行了实时目标信号扩增。将包含上述反应混合物的管投入到实时热循环仪(Rotogene Q，Qiagen)中。将通过上述过程获得的各个PCR产物1μl作为试料，利用Type-it HRM PCR试剂盒(Qiagen Inc.,Germantown,MD,USA)执行了实时聚合酶连锁反应。在添加约10ul的2XType-it HRM PCR反应混合物、0.1ul的APC引物混合液、9ul的蒸馏水之后执行了实时聚合酶连锁反应。上述Type-it HRM PCR反应混合物为荧光色素，其中包含EvaGreen。
实时聚合酶链反应时利用Rotor-gene Q(Qiagen Inc.,Germantown,MD,USA)在95度条件下进行10分钟的反应，接下来反复执行在95度下10秒、65度下15秒、72度下20秒的过程30次。最后，在聚合酶连锁反应结束之后以每秒约0.2度的速度将温度从77度提升至89度，同时对510nm的荧光波长进行了测定，从而通过熔解曲线分析对扩增产物的荧光强度变化进行了观察。
如图10所示，在极微量的模板中因为没有发生目标核酸序列的荧光信号扩增而没有出现熔解温度曲线。上述结果表明，目标模板与本发明的引物发生杂化或单链化的本发明的引物本身截断时并不会导致信号的扩增。此外，在不同的模板浓度中，对1fg为止的目标核酸序列的荧光信号进行了确认并以此为基础对熔解温度曲线进行了确认。此外如图16所示，通过不同模板浓度的熔解温度曲线分析，能够在1fg为止的目标核酸序列中对熔解温度曲线进行分析。
在上述内容中对本发明的特定部分进行了详细的说明，具有本行业一般知识的人员应能够理解上述具体说明仅为较佳的实现例，本发明的范围并不会因此而受到限定。所以，本发明的实质性的范围应通过所附的权利要求书及其等价物做出定义。

Claims (32)

1.一种利用哑铃结构寡核苷酸对目标核酸序列进行检测的方法，其特征在于，包括：
(a)通过利用以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的第1次扩增反应而进行扩增的步骤：
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用引物以及荧光发生指示剂的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
2.一种利用哑铃结构寡核苷酸对目标核酸序列进行检测的方法，其特征在于，包括：
(a)利用包括至少一个以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的引物对对目标核酸序列进行第1次扩增的步骤，上述第1次扩增包括引物杂化、引物延伸以及变性过程的至少两个循环，
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用引物对以及荧光发生指示剂的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
3.一种利用哑铃结构寡核苷酸对2种以上的目标核酸序列进行检测的方法，其特征在于，包括：
(a)利用包括至少一个以下述通式表示的哑铃结构寡核苷酸的2个以上的引物对对2个以上的目标核酸序列进行第1次扩增的步骤，上述第1次扩增包括引物杂化、引物延伸以及变性过程的至少两个循环，
通式：5'-A-B-C-3'
在上述通式中，上述A表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的5'-低Tm特异性片段，包括与上述C中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述B表示包含最少三个以上的通用碱基的分割片段，上述C表示具有与所杂化的上述目标核酸序列中的某一位置实质性互补的核苷酸序列的3'-高Tm特异性片段，包括与上述A中的某一位置实质性互补的核苷酸序列，上述A的Tm低于上述C的Tm，而在三个片段中上述分割片段的Tm最低，上述分割片段在上述A以及C被杂化到上述目标核酸序列的条件下形成非碱基对结构，上述杂化是在不会独立发生C杂化的条件下实施，以及，
(b)通过利用2个以上的引物对以及荧光发生指示剂的第2次扩增反应而对上述第1次扩增产物进行扩增，并从荧光发生指示剂检测出信号的步骤，而检测出上述信号代表目标核酸序列存在。
4.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述分割片段中的通用碱基为脱氧肌苷、肌苷、7-二硫唑嘌呤-2'-脱氧肌苷、2-硫唑嘌呤-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷或2'-F肌苷。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
上述通用碱基为脱氧肌苷。
6.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述分割片段包括具有通用碱基的核苷酸的连续序列。
7.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述5'-低Tm特异性片段的长度小于3'-高Tm特异性片段的长度。
8.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述3'-高Tm特异性片段具有与杂化的目标核酸序列完美互补的核苷酸序列。
9.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述5'-低Tm特异性片段具有3至5个核苷酸的长度。
10.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述分割片段具有至少3至5个核苷酸的长度。
11.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述3'-高Tm特异性片段具有18至30个核苷酸的长度。
12.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述5'-低Tm特异性片段具有3至5个核苷酸的长度，上述分割片段具有3至5个核苷酸的长度且上述3'-高Tm特异性片段具有18至30个核苷酸的长度。
13.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述5'-低Tm特异性片段的Tm为10℃-30℃。
14.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述3'-高Tm特异性片段的Tm为50℃-65℃。
15.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述分割片段的Tm为3℃-10℃。
16.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述退火作业是在50℃-65℃范围的温度下实施。
17.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)通过反复执行包括上述哑铃结构寡核苷酸的杂化、延伸以及变性过程的模板依赖性延伸反应过程而实现。
18.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述扩增反应按照聚合酶连锁反应实施。
19.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)的第1次扩增在扩增产物之间发生严重竞争之前为止进行扩增。
20.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述荧光发生指示剂为SYBR Green、SYTO 9、EvaGreen或LCGreen。
21.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(b)所使用的引物为哑铃结构寡核苷酸。
22.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(b)所使用的引物为与上述步骤(a)所使用的寡核苷酸相同的哑铃结构寡核苷酸。
23.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)以及步骤(b)所使用的哑铃结构寡核苷酸相同且上述步骤(b)能够使寡核苷酸引发实质性地倾向于偏好具有较高特异度的引物一侧。
24.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
使上述步骤(a)以及步骤(b)所使用的寡核苷酸中的至少一个包含UTP核苷酸并通过UNG酶发生分解。
25.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
使上述步骤(a)所使用的寡核苷酸中的至少一个包含UTP核苷酸并在上述步骤(a)之后通过UNG酶去除上述寡核苷酸，从而实质性地防止在第2次扩增中因为上述引物而导致的污染。
26.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)在1至25个循环的范围内执行。
27.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)在5至20个循环的范围内执行。
28.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)在10至15个循环的范围内执行。
29.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
上述步骤(a)以及步骤(b)所使用的寡核苷酸为用于对5个以上的目标核酸序列进行扩增的寡核苷酸。
30.根据权利要求1至权利要求3中的任一项所述的方法，其特征在于：
上述步骤(b)的信号检测通过熔解曲线分析而执行。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：
以0.05℃至0.02℃范围内的分辨率生成上述熔解曲线。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：
以小于0.02℃的分辨率生成上述熔解曲线。
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