WO2022062120A1 - 多重核酸检测方法、组合及试剂盒 - Google Patents

多重核酸检测方法、组合及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多重核酸检测的方法、组合及试剂盒。该方法包括：一种多重核酸检测的方法，包括以下步骤：将含有第一引物组和第一探针的组合与来自受试者的样本进行混合；对所述样本中可能存在的靶序列进行扩增；在对应的检测通道内对扩增后产物进行熔解曲线分析；以及根据熔解曲线分析的结果，判断是否存在靶标中的一种或更多种。

Description

多重核酸检测方法、组合及试剂盒 技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及多重靶标熔解曲线检测的解决方案。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如感染性疾病的诊断、基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。
目前在qPCR平台应用较多的引物探针设计方式主要为TaqMan水解探针法，其工作原理主要是利用了一条与能模板特异性结合且两端分别标记荧光基团(供体)和淬灭基团(受体)的寡核苷酸探针，同时在探针的上游和下游分别设计一条特异性PCR引物。在PCR反应开始之前，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，TaqMan探针一端的荧光基团发射的荧光信号被另一端的淬灭基团吸收，从而使得荧光信号不被仪器检测到；而PCR扩增开始后，TaqMan探针与模板特异性结合，当DNA聚合酶(Taq酶)在延伸到探针结合模板的位点时，其5-3’核酸外切酶活性会将TaqMan探针切断，使得探针上标记的荧光基团远离淬灭基团，不再形成FRET结构，因此荧光基团发射的信号能够被仪器检测到。
随着PCR技术的应用越来越广泛，同时对高通量、快速检测的需求日益增加，常常希望在同一反应体系实现多重靶标的PCR检测，通常，采用设置多条标记不同波长的荧光基团的TaqMan水解探针的方式来进行多重检测，但视检测仪器的荧光通道数量而定，这样的方式最多只能检测4重左右的不同靶标。
为实现超多重的PCR检测，现有技术通常会将PCR检测技术与其它方法结合起来。有报道将PCR检测技术与杂交芯片结合，用以不同的扩增产物长度进行多重靶标检测。如中国专利CN107090519A公开了一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒的方法，其利用了核酸分子杂交的原理，将针对各靶标的单链探针按特定顺序排列固定于基因芯片上，形成探针阵列，再将待测的多重PCR产物与其杂交，使得靶标扩增产物与芯片上的探针杂交并发出荧光信号。虽然该方法能同时检测20种呼吸道病原体，但是基因芯片制备工艺复杂，价格昂贵，不利于临床推广开展，而且过程繁琐，需要经过多个开盖、清洗的步骤，易造成污染导致结果出现假阳性。
还有报道将PCR检测技术与毛细管电泳结合，用以不同的扩增产物长度进行多重靶标检测。如中国专利CN103074450A公开了一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法，其利用了PCR扩增与毛细管电泳结合的方式，将PCR扩增产物取出并进行毛细管电泳分析，将获得的图谱与标准图谱对比从而判断腹泻致病菌的种类。然而，该方法在使用PCR扩增检测设备以外，还需要使用毛细管电泳设备进行产物分析，使得检测成本大大增加，不利于临床推广使用。
因此，临床上急需一种能够高效、低成本进行多重分子检测的方法，从而能够快速、有效检测多种临床常见的靶标如细菌、病毒、基因突变等。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人对qPCR检测技术的引物和探针设计进行研究，提出新的多重靶标检测的解决方案，从而实现了本发明。
据此，在第一方面，本发明提供了一种多重靶标检测的方法，包括以下步骤：
将含有第一引物组和第一探针的组合与来自受试者的样本进行混合；
对所述样本中可能存在的靶序列进行扩增；
在对应的检测通道内对扩增后产物进行熔解曲线分析；以及
根据所述熔解曲线分析的结果，判断是否存在靶标中的一种或更多种，
其中，所述第一引物组包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下游引物，
其中，所述第一靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第一信号检测区；所述第一靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区，
其中，所述第二靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第二信号检测区；所述第二靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区，
其中，所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
并且其中，所述第一探针的全部或部分序列与所述第一信号检测区相同，且所述第一探针的全部或部分序列与所述第二信号检测区相同，从而能够在使用所述第一引物组进行扩增后，对所述扩增的产物进行扩增(退火并延伸)；所述第一探针带有第一检测基团和第二检测基团，在整合至双链结构后，所述第一检测基团和第二检测基团能够因此产生信号的变化。
可以理解，在PCR扩增过程中，针对不同靶标的引物对与各自的靶序列特异性结合并延伸产生预扩增产物，随后探针可与预扩增产物互补配对并继续进行PCR扩增，将第一检测基团与第二检测基团整合入所产生的双链扩增产物中，使得信号发生变化，可被仪器检测到。待PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，携带有第一检测基团和第二检测基团的PCR产物双链将在一定温度下解链，使得信号发生变化，可被仪器检测到。结合探针所携带的检测基团类型与各靶标的PCR产物的不同熔解温度，实现多重靶标检测。
在本发明第一方面的一个变型中，第一靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区；第一靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第一信号检测区，
并且其中，第二靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区；第二靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第二信号检测区。
本发明第一方面的另一个变型中，第一靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第一信号检测区；第一靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区，
并且其中，第二靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区；第二靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第二信号检测区。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括对所检测靶标进行定量的步骤。例如，可通过检测实时荧光信号对靶标进行定量。
在优选的实施方式中，本发明的组合进一步含有第二引物组和第二探针，
其中，第二引物组包括针对第三靶标的上游引物和下游引物，以及针对第四靶标的上游引物和下游引物，
其中，所述第三靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第三信号检测区；所述第四靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的所述第四信号检测区；
其中，所述第三和第四信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
并且其中，所述第二探针的全部或部分序列与所述第三信号检测区相同，且所述第二探针的全部或部分序列与所述第四信号检测区相同，从而能够在使用第二引物组进行扩增后，对所述扩增的产物进行扩增(退火并延伸)；所述第二探针携带有第三检测基团和第四检测基团，在整合至所述双链结构后，所述第三检测基团和第四检测基团能够因此产生信号的变化，并且所述第二探针所产生的信号与所述第一探针所产生的信号的类型(如波长)不同。
可以理解，采用以上方式可以在一个检测通道中，检测第一探针对应的信号并进行熔解曲线分析，从而判断第一引物组所对应的靶标是否存在；同时，可以在另一个检测通道中，检测第二探针对应的信号并进行熔解曲线分析，从而判断第二引物组所对应的靶标是否存在。
类似地，本发明的组合还可以进一步包括第三探针，甚至第四探针，从而在各自不同的检测通 道中，检测它们对应的第三引物组、第四引物组所针对的靶标。
在一些实施方式中，第一方面的组合中的每个引物组可含有针对三种、四种或更多种靶标的上游引物和下游引物对，这些上游引物或下游引物设置有各自的信号检测区；在每个引物组中，对应的探针能够对该引物组的扩增产物进行扩增(退火并延伸)，而不能对其它引物组的扩增产物进行扩增(退火并延伸)。
可以理解，熔解曲线分析过程中，依据不同的解链温度在每个检测通道中对每个引物组中对应的不同靶标进行区分。
调整扩增产物的解链温度在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可以通过调整信号检测区与靶序列结合区之间的间隔碱基长度(例如，添加一定数量的G/C碱基)，来区分不同靶标的扩增产物的解链温度；具体地，当间隔碱基数量增加时，熔解温度会相应上升；而当间隔碱基数量减少时，熔解温度会相应降低。
在第一方面的方法中，可在60-95℃的范围内进行熔解曲线分析。每个检测通道中，各靶标所对应的扩增产物的解链温度至少相差2℃。
此外，本发明的第一方面还提供了一种用于多重靶标检测的组合，包括：
第一引物组，其包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下游引物；和
第一探针，其全部或部分序列与第一信号检测区相同，且其全部或部分序列与第二信号检测区相同，从而能够在使用所述第一引物组对靶序列进行扩增后，对所述扩增的产物进行扩增(退火并延伸)；所述第一探针携带有第一检测基团和第二检测基团，所述第一检测基团和第二检测基团能够在整合至双链结构后产生信号的变化，
其中，所述第一信号检测区位于针对第一靶标的上游引物或下游引物的靶序列结合区的上游；所述第二信号检测区位于针对第二靶标的上游引物或下游引物的靶序列结合区的上游；所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对。
在本发明中，探针的长度可以是15-30nt。
在本发明中，包括信号检测区的上游引物或下游引物的长度可以是30-80nt。
在本发明中，未包括信号检测区的上游引物或下游引物的长度可以是15-30nt。
在一些实施方式中，第一方面的组合中，各引物组内的信号检测区彼此相同。例如，在第一引物组中，第一信号检测区与第二信号检测区相同。
在一些实施方式中，第一方面的组合中的各引物组内，靶序列结合区与位于其上游的信号检测区之间可间隔0-40nt。
在具体的实施方式中，本发明第一方面的探针上的第一检测基团和第二检测基团不位于3’末端。
在具体的实施方式中，本发明第一方面的探针上的第一检测基团与第二检测基团间隔5-25nt。
在第二方面，本发明提供了一种多重靶标检测的方法，包括以下步骤：
将含有第一引物组和第一探针的组合与来自受试者的样本进行混合；
对所述样本中可能存在的靶序列进行扩增；
在对应的检测通道内对扩增后产物进行熔解曲线分析；以及
根据所述熔解曲线分析的结果，判断是否存在靶标中的一种或更多种，
其中，所述第一引物组包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下游引物，
其中，所述第一靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第一信号检测区；所述第一靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区，
其中，所述第二靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第二信号检测区；所述第二靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区，
其中，所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
并且其中，所述第一探针的全部或部分序列与所述第一信号检测区相同，且所述第一探针的全部或部分序列与所述第二信号检测区相同，从而能够在使用所述第一引物组进行扩增后，与经扩增 的产物进行杂交；所述第一探针携带有第一检测基团和第二检测基团，在杂交后，所述第一检测基团和第二检测基团能够因此产生信号的变化，并且所述第一探针的3’末端不能作为引物延伸。
可以理解，在PCR扩增过程时，针对不同靶标的引物对与各自的靶序列特异性结合并延伸产生扩增产物，随后探针可与扩增产物杂交，使得第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，导致信号发生改变，从而被仪器检测到。
待PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，与扩增产物杂交的探针将在一定温度下熔解，并与产物链分开，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，使得信号发生改变，可被仪器检测到。结合探针所携带的第一检测基团类型与各靶标结合的探针的不同熔解温度，实现多重靶标检测。
在本发明第二方面的一个变型中，第一靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区；第一靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第一信号检测区，
并且其中，第二靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区；第二靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第二信号检测区。
本发明第二方面的另一个变型中，第一靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第一信号检测区；第一靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区，
并且其中，第二靶标的上游引物包括位于3’端的靶序列结合区；第二靶标的下游引物包括位于3’端的靶序列结合区以及位于所述靶序列结合区上游的第二信号检测区。
在优选的实施方式中，第二方面的组合进一步含有第二引物组和第二探针，
其中，第二引物组包括针对第三靶标的上游引物和下游引物，以及针对第四靶标的上游引物和下游引物，
其中，所述第三靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第三信号检测区；所述第四靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第四信号检测区；
其中，所述第三和第四信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
并且其中，所述第二探针的全部或部分序列与所述第三信号检测区相同，且所述第二探针的全部或部分序列与所述第四信号检测区相同，从而能够在使用所述第二引物组进行扩增后，与经扩增的产物进行杂交；所述第二探针的3’末端不能作为引物延伸；所述第二探针携带有第三检测基团和第四检测基团，在杂交后，所述第三检测基团和第四检测基团能够因此产生信号的变化，并且所述第二探针所产生的信号与所述第一探针所产生的信号的类型(如波长)不同。
可以理解，采用以上方式可以在一个检测通道中，检测第一探针对应的信号并进行熔解曲线分析，从而判断第一引物组所对应的靶标是否存在；同时，可以在另一个检测通道中，检测第二探针对应的信号并进行熔解曲线分析，从而判断第二引物组所对应的靶标是否存在。
类似地，本发明的组合还可以进一步包括第三探针，甚至第四探针，从而在各自不同的检测通道中，检测它们对应的第三引物组、第四引物组所针对的靶标。
在一些实施方式中，第二方面的组合中的每个引物组可含有针对三种、四种或更多种靶标的上游引物和下游引物对，这些上游引物或下游引物设置有各自的信号检测区；在每个引物组中，对应的探针能够与该引物组的扩增产物进行杂交，而不能与其它引物组的扩增产物进行杂交。
可以理解，熔解曲线分析过程中，依据不同的熔解温度在每个检测通道中对每个引物组中对应的不同靶标进行区分。
调整探针与扩增产物之间的熔解温度在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可通过在探针与信号检测区的互补序列之间的错配程度来区分不同靶标的扩增产物的解链温度；具体地，当本发明第二方面的探针与信号检测区的互补序列完全匹配时，熔解温度最高；而当探针与信号检测区的互补序列之间有错配碱基时，熔解温度降低。
在第二方面的方法中，可在45-85℃的范围内进行熔解曲线分析。每个检测通道中，各靶标所对应的扩增产物的解链温度至少相差2℃。
此外，本发明的第二方面还提供了一种用于多重靶标检测的组合，包括：
第一引物组，其包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下 游引物；和
第一探针，其全部或部分序列与第一信号检测区相同，且其全部或部分序列与第二信号检测区相同，从而能够与所述第一引物组的扩增产物进行杂交；所述第一探针携带有第一检测基团和第二检测基团，在杂交后，所述第一检测基团和第二检测基团能够因此产生信号的变化，并且所述第一探针的3’末端不能作为引物延伸，
其中，所述第一信号检测区位于针对第一靶标的上游引物或下游引物的靶序列结合区的上游；所述第二信号检测区位于针对第二靶标的上游引物或下游引物的靶序列结合区的上游；所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对。
在一些实施方式中，第一方面的组合中的各引物组内，靶序列结合区与位于其上游的信号检测区之间可间隔0-10nt。
在一些实施方式中，本发明的组合可进一步包括用于PCR反应的扩增试剂。
在一些实施方式中，本发明第二方面的探针上的第一检测基团或第二检测基团位于3’末端。
在一些实施方式中，本发明第二方面的探针的3’末端被封闭。可使用本领域熟知的方式来进行封闭，例如，可以在3’末端进行C3、C6、C9或C12间臂修饰；又例如，可以在3’末端进行ddC修饰。
在具体的实施方式中，本发明第二方面的探针上的第一检测基团能与第二检测基团间隔5-25nt。
本发明的方法和组合具有以下有益效果：
本发明允许在单管反应中同时进行检测通道与熔解温度两个维度的分析，从而能够检测检测通道数量乘以熔解温度特征的靶标数；
本发明的每个检测通道只使用1条探针，从而大大降低了PCR反应中的荧光背景，提高了反应灵敏度；
本发明的设计方式中，仅引物与靶序列互补配对，因此在靶序列存在较多高变异区时，如病毒或细菌基因组，本发明的包容性更好，设计难度更低；
本发明只需通过核酸扩增分析仪完成测试，无需借助额外的下游仪器辅助，也无需通过芯片或多个反应管分割反应，大大降低了仪器和耗材的成本和操作的复杂程度，同时在试剂中减少了探针的数量，大大降低了试剂成本，使得大规模推广成为可能；
本发明可在单个反应管中实现多重检测，对样本的消耗少，特别适合用于稀有样本的检测，可以大大提高加入检测反应的样本浓度，提高检测灵敏度；此外，由于能够实现单管反应，这为后续进行分子POCT类检测提供了可能；
本发明的方法在加样完成后即完全封闭，无需开盖进行后续检测，大大降低了对实验环境造成污染的可能性；
本发明对靶序列的长度要求非常低，从而能够提高短片段核酸检测时的灵敏度。
附图说明
图1为实施例2的多重靶标检测在FAM通道中ADV阳性的熔解曲线；
图2为实施例2的多重靶标检测在FAM通道中IBV阳性的熔解曲线；
图3为实施例2的多重靶标检测在ROX通道中MP阳性的熔解曲线；
图4为实施例2的多重靶标检测在ROX通道中SARS-CoV-2阳性的熔解曲线；
图5为实施例2的多重靶标检测在Cy5通道中RSV阳性的熔解曲线；
图6为实施例2的多重靶标检测在Cy5通道中IAV阳性的熔解曲线；
图7显示出实施例3在FAM通道中加入ADV、IBV阳性模板的反应孔中同时出现ADV和IBV的双熔解峰；
图8显示出实施例3在ROX通道中加入MP、SARS-CoV-2阳性模板的反应孔中同时出现MP和SARS-CoV-2的双熔解峰；
图9显示出实施例3在Cy5通道中加入RSV、IAV阳性模板的反应孔中同时出现RSV和IAV 的双熔解峰；
图10为实施例5的多重靶标检测在FAM通道中IBV阳性的熔解曲线；
图11为实施例5的多重靶标检测在FAM通道中IAV阳性的熔解曲线；
图12为实施例5的多重靶标检测在ROX通道中ADV阳性的熔解曲线；
图13为实施例5的多重靶标检测在ROX通道中RSV阳性的熔解曲线；
图14为实施例5的多重靶标检测在Cy5通道中MP阳性的熔解曲线；
图15为实施例5的多重靶标检测在Cy5通道中SARS-CoV-2阳性的熔解曲线；
图16显示出实施例6在FAM通道中加入IAV、IBV阳性模板的反应孔中同时出现IAV和IBV的双熔解峰；
图17显示出实施例6在ROX通道中加入ADV、RSV阳性模板的反应孔中同时出现ADV和RSV的双熔解峰；
图18显示出实施例6在Cy5通道中加入MP、SARS-CoV-2阳性模板的反应孔中同时出现MP和SARS-CoV-2的双熔解峰；
图19为实施例7的多重靶标检测在FAM通道中IBV阳性的熔解曲线；
图20为实施例7的多重靶标检测在FAM通道中IAV阳性的熔解曲线；
图21为实施例7的多重靶标检测在ROX通道中ADV阳性的熔解曲线；
图22为实施例7的多重靶标检测在ROX通道中RSV阳性的熔解曲线；
图23为实施例7的多重靶标检测在Cy5通道中MP阳性的熔解曲线；
图24为实施例7的多重靶标检测在Cy5通道中SARS-CoV-2阳性的熔解曲线；
图25显示出实施例8在FAM通道中加入IAV、IBV阳性模板的反应孔中同时出现IAV和IBV的双熔解峰；
图26显示出实施例8在ROX通道中加入ADV、RSV阳性模板的反应孔中同时出现ADV和RSV的双熔解峰；
图27显示出实施例8在Cy5通道中加入MP、SARS-CoV-2阳性模板的反应孔中同时出现MP和SARS-CoV-2的双熔解峰。
图28为实施例9的多重靶标检测在FAM通道中IBV阳性的熔解曲线；
图29为实施例9的多重靶标检测在FAM通道中IAV阳性的熔解曲线；
图30为实施例9的多重靶标检测在ROX通道中ADV阳性的熔解曲线；
图31为实施例9的多重靶标检测在ROX通道中RSV阳性的熔解曲线；
图32为实施例9的多重靶标检测在Cy5通道中RhV阳性的熔解曲线；
图33为实施例9的多重靶标检测在Cy5通道中MP阳性的熔解曲线；
图34为实施例9的多重靶标检测在Cy5通道中SARS-CoV-2阳性的熔解曲线；
图35为实施例9的在Cy5通道中加入RhV、MP、SARS-CoV-2阳性模板的反应孔中同时出现RhV、MP、SARS-CoV-2的三熔解峰；
图36为实施例9的多重靶标检测在VIC通道中GAPDH阳性的扩增曲线(上侧)和熔解曲线结果(下侧)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
本发明提供了一种多重核酸检测的方法，包括以下步骤：
将含有第一引物组和第一探针的组合与来自受试者的样本进行混合；
对所述样本中可能存在的靶序列进行扩增；
在对应的检测通道内对扩增后产物进行熔解曲线分析；以及
根据所述熔解曲线分析的结果，判断是否存在靶标中的一种或更多种，
其中，所述第一引物组包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下游引物，
其中，所述第一靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第一信号检测区；
其中，所述第二靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第二信号检测区；
其中，所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
并且其中，所述第一探针的全部或部分序列与所述第一和第二信号检测区相同，从而能够分别与所述第一和第二信号检测区的互补序列形成双链结构；所述第一探针携带有第一检测基团和第二检测基团，在整合至所述双链结构后，所述第一检测基团和第二检测基团能够因此产生信号的变化。
可以理解，针对每个待检测的靶标，本发明的方法提供了与之对应的引物对，每对引物上(上游引物或下游引物)提供有一个信号检测区，该信号检测区不与靶序列发生互补配对，但具有与本发明的探针全部或部分相同的序列。
在本文中，术语“核酸”是指核苷酸单体的单链和/或双链聚合物，包括但不限于通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物连接的2’-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。核酸中的核苷酸单体可称为“核苷酸残基”。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括但不限于核苷酸、和/或核苷酸类似物(如修饰的核苷酸)。核酸的大小通常从几个核苷酸残基到几千个核苷酸残基不等。其中“寡核苷酸”通常指长度相对较短(例如小于80)的核苷酸聚合物。除非另外指出，否则每当呈现核酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5’到3’的顺序。非另行指出，否则“A”表示腺嘌呤，“C”表示胞嘧啶，“G”表示鸟嘌呤，“T”表示胸腺嘧啶，并且“U”表示尿嘧啶。
根据本领域习惯用语，核酸的长度可以碱基对(缩写为“bp”)、核苷酸(缩写为“nt”)或千碱基(缩写为“kb”)来表示。
在本文中，“碱基互补配对”是指A与T、A与U和G与C等的对应关系互相以氢键相连的现象。相应地，“错配碱基”是指除“碱基互补配对”中所规定外的其他所有配对情形，如A与C、A与G、T与G，或T与C错配等。
在本文中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
在本文中，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分，其可在退火或扩增条件下与引物进行退火。
术语“杂交”表示两个核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体的形成。可以理解，并不要求它们在全长上具有100％互补性才可实现杂交。
在本文中，术语“上游引物”，也称正向引物，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；本发明中使用的术语“下游引物”，也称反向引物，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。其中，正链即有义链、正义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5’-3’，碱基序列和该基因mRNA基本相同；与该链结合的引物为反向引物；负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的正向和反向引物命名也可随之互换。
在本文中，“上游”、“位于/在……上游”、“上游具有……”等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近5’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有 一个或多个碱基的间隔。相应地，本文所用的术语“下游”、“位于/在……下游”、“下游具有……”等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近3’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。应了解，除另有说明外，在描述的核酸为双链核酸时，“上游”和“下游”的表示方法通常以正义链的5’端和3’端为准。
在本文中，术语“探针”是指用于检测靶标是否存在的经标记的寡核苷酸。
在本文中，可在严格条件实现杂交，“严格条件”可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件下，预期温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸，如DNA。虽然影响杂交的严格度的因素有多种，如温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，但本领域技术人员可通过适当选择这些要素得到类似的严格度。
在具体的实施方式中，本发明的探针可选自由以下项组成的组：在单链状态下因分子柔性成卷曲状的寡核苷酸、在单链状态下能够形成发夹结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成茎环结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成假结结构的寡核苷酸，和在单链状态下能够形成三螺旋结构的寡核苷酸。
在本文中，“在单链状态下因分子柔性成卷曲状的寡核苷酸”与“柔性探针”可以互换使用，在单链状态因分子柔性使其成卷曲状，而在杂交或退火延伸形成双链状态后，因氢键作用而使其固定为较为刚性的双螺旋结构，使得该寡核苷酸/探针上标记的检测基团之间的距离发生变化，从而产生可检测的信号。例如，可以参照US9845492的记载获得这样的寡核苷酸/探针。
本发明第二方面的探针也可称为杂交探针。
在一些实施方式中，本发明第一(三)检测基团和第二(四)检测基团的一者可以是荧光基团，另一者可以是淬灭基团或其它能与荧光基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的基团。
在示例性的实施方式中，通过荧光共振能量转移产生信号变化的基团可以是Cy3或Cy5，这是因为它们之间能够通过FRET作用产生荧光信号变化。
在本发明中，第一检测基团例如可选自以下项所组成的组：FAM、HEX、VIC、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5。
在本发明中，第二检测基团例如可选自以下项所组成的组：TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL和DDQI。
需要注意的是，本发明的探针能够与对应引物组的扩增产物发生退火并延伸或者发生杂交，探针上的检测基团因此被整合到因此产生的双链中。与单链形态相比，探针的双链形态使得位于检测基团之间的距离发生变化(增加)，而这种距离的变化并非是检测基团的水解或释放而引起的。
在一些实施方式中，本发明的组合可以为试剂盒，所述试剂盒还包括扩增试剂。
在本发明中，术语“扩增试剂”是指用于PCR的试剂，包括但不限于dNTP、DNA聚合酶、以及一些促进PCR反应的试剂，例如KCl、MgCl 2、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)等。
在本发明中，组合和试剂盒中的各组分可以单独分装的形式存在，或可以预先混合的形式存在。
在本发明中，“预变性”和“变性”的目的是破坏双链DNA上成对的互补碱基之间的氢键，从而允许双链分开成两条单链。例如，可以通过加热含有双链DNA混合物的方法来形成单链，如将混合物加热至90℃、92℃、95℃或98℃来解离双链DNA。解离完成后，将其冷却至室温或室温以下。又例如，单链的形成还可以通过改变溶液离子强度(例如，加入酸、碱、盐等)来破坏双链DNA之间的氢键，也可以采用酶(例如，解旋酶)来实现将双链DNA解离成单链DNA。
本发明中，上游引物和下游引物的Tm值可以为50℃-80℃，GC含量可以为40％-80％。
本发明中，探针的Tm值可以为50℃-80℃，GC含量可以为40％-80％。
在本发明的方法中，扩增步骤的具体反应条件例如可以是：90℃-96℃预变性5-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，45℃-75℃退火及延伸30-90秒，共进行3-10个循环；90℃-95℃变性10-60秒，45℃-75℃退火及延伸30-90秒，共进行35-50个循环。又例如，扩增步骤的具体反应条件可以是： 90℃-96℃预变性5-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，45℃-75℃退火及延伸30-90秒，共进行35-50个循环。
在一个具体的实施方式中，扩增步骤的具体反应条件可以是：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，61℃退火延伸15秒，共进行10个循环；94℃变性10秒，55℃退火延伸15秒，共进行40个循环。
在一个具体的实施方式中，扩增的具体反应条件可以是：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，60℃退火延伸15秒，共进行10个循环；94℃变性10秒，56℃退火延伸15秒，共进行40个循环。
在本发明的第一方面，扩增完成后的熔解曲线分析的反应条件例如可以是：90℃-96℃变性10-60秒，45℃-55℃退火60-120秒，50℃-95℃熔解曲线分析，升温速度0.02-0.1℃每秒。具体地，熔解曲线分析的反应条件可以是：94℃变性10秒，50℃退火90秒，65℃-95℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃。
在本发明的第二方面，扩增完成后的熔解曲线分析的反应条件例如可以是：90℃-95℃变性10-60秒，45℃-55℃退火60-120秒，45-85℃熔解曲线分析，升温速率为0.02-0.1℃每秒。具体地，熔解曲线分析的反应条件可以是：94℃变性10秒，50℃退火120秒，50-90℃熔解曲线分析，升温速率为0.03℃每秒。
在本发明的第一方面，在含有信号检测区的情况下，上游引物或下游引物在反应体系中的浓度例如可以为30nM-150nM，优选为30nM-120nM，更优选为40nM；否则，上游引物或下游引物在反应体系中的浓度例如可以为150nM-1200nM，优选为150nM-450nM，更优选为240nM。
在本发明的第一方面，探针在反应体系中的浓度例如可以为150nM-1200nM，优选为150nM-450nM，更优选为240nM。
在本发明的第二方面，在含有信号检测区的情况下，上游引物或下游引物在反应体系中的浓度例如可以为15nM-150nM，优选为30nM-90nM，更优选为45nM；否则，上游引物或下游引物在反应体系中的浓度例如可以为150nM-1500nM，优选为300nM-600nM，更优选为250nM。
在本发明的第二方面，探针在反应体系中的例如可以为150nM-1800nM，优选为300nM-900nM，更优选为250nM。
在本发明中，表述“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
在本发明中，待测样品可以选自由血清样本、血浆样本、全血样本、痰液样本、拭子样本、灌洗液样本、新鲜组织样本、福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)样本、尿液样本、细菌培养物、病毒培养物、细胞系培养物、人工合成的质粒样本及其组合中组成的组。
在一些实施方式中，本发明的方法可用于感染性病原体的检测。例如可检测呼吸道相关病原体的检测，包括但不限于检测选自以下项中的病原体中的一种或更多种：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
可以理解，在检测对象的靶标为RNA的情况下，在扩增步骤之前，本发明的方法进一步包括对RNA进行逆转录步骤。示例性的逆转录反应条件可以为40℃-60℃，1-30分钟。
实施例1 设计用于检测呼吸道相关病原体的引物组和柔性探针
为了验证本发明的组合在检测甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)、乙型流感病毒(Influenza B virus,IBV)、呼吸道合胞病毒和(Respiratory Syncytial Virus,RSV)、腺病毒(Adenovirus,ADV)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,MP)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的效果，设计了下表1中的引物和探针。
表1
Figure PCTCN2020128663-appb-000001
Figure PCTCN2020128663-appb-000002
其中，上游引物1和下游引物1为针对腺病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物2和下游引物2为针对乙型流感病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物3和下游引物3为针对肺炎支原体靶序列设计的特异性引物；上游引物4和下游引物4为针对新型冠状病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物5和下游引物5为针对甲型流感病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物6和下游引物6为针对呼吸道合胞病毒靶序列设计的特异性引物。
其中，上述柔性探针经扩增延伸后，扩增产物的Tm值如下表2所示。
表2
Figure PCTCN2020128663-appb-000003
实施例2 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的单重检测
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，分别对各靶序列进行单独检测，以验证单一病毒感染的检测能力。使用纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照下表3中所述配比进行反应体系的配置。
表3
Figure PCTCN2020128663-appb-000004
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(苏州亚睿，MA-6000)的托盘中。所使用程序为：50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，61℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；94℃变性10秒，55℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火90秒，65-95℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃。
在没有待测靶标存在时，由于分子柔性造成单链柔性探针呈卷曲状，此时荧光基团和淬灭基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高；而当待测靶标存在时，上游引物和下游引物将特异性结合靶序列并延伸产生预扩增模板，使得柔性探针可以与预扩增模板配对并进行延伸，将荧光基团与淬灭基团整合入双链的PCR扩增产物中，由于单链到双链的变化影响了分子柔性，此时荧光基团与淬灭基团的距离变长，荧光共振能量转移效率降低，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到；在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析时，在一定温度下，双链的PCR扩增产物发生解链，使得带有荧光基团与淬灭基团的产物链变为单链状态，此时分子柔性恢复，荧光基团与淬灭基团之间的距离变短，荧光共振能量转移效率升高，使得荧光信号再次发生变化，可用于熔解曲线分析。
数据分析：
对熔解曲线的Tm值结果进行判读。图1-6为多重靶标检测中各呼吸道病原体阳性样本的熔解曲线图。
由图1-图6可知，加入ADV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为82.33℃的熔解峰；加入IBV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为76.87℃的熔解峰；加入MP阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为85.23℃的熔解峰；加入SARS-Cov-2阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为81.41℃的熔解峰；加入RSV阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为79.8℃的熔解峰；而加入IAV阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值 为85.27℃的熔解峰。
实施例3 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的多重检测
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，将表2中同一荧光通道的两种靶序列模板混合后进行检测，以验证病毒混合感染的检测能力。使用超纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表3中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(苏州亚睿，MA-6000)的托盘中。所使用程序为：50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，61℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；94℃变性10秒，55℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火90秒，65-95℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃。
数据分析：
对熔解曲线的Tm值对结果进行判读。
图7-9为多重靶标检测中各呼吸道病毒阳性样本的熔解曲线图。由图7-9可知，同时加入ADV、IBV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中同时出现ADV和IBV的双熔解峰；同时加入MP、SARS-Cov-2阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中同时出现MP和SARS-Cov-2的双熔解峰；而同时加入RSV、IAV阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中同时出现RSV和IAV的双熔解峰。由此，本发明的组合在检测这6种呼吸道相关病原体时，特异性良好，熔解曲线形态单一，且在同一通道中的两种阳性靶标的Tm值可以明显区分。
实施例4 设计用于检测呼吸道相关病原体的引物组和杂交探针
为了验证本发明的组合在检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的效果，设计了下表4中的引物和探针。
表4
Figure PCTCN2020128663-appb-000005
Figure PCTCN2020128663-appb-000006
其中，上游引物1'和下游引物1'为针对甲型流感病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物2'和下游引物2'为针对乙型流感病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物3'和下游引物3'为针对呼吸道合胞病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物4'和下游引物4'为针对腺病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物5'和下游引物5'为针对肺炎支原体靶序列设计的特异性引物；上游引物6'和下游引物6'为针对新型冠状病毒靶序列设计的特异性引物。
其中，杂交探针Tm值如下表5所示。
表5
Figure PCTCN2020128663-appb-000007
实施例5 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的单重检测
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，分别对各靶序列进行单独检测，以验证单一病毒感染的检测能力。使用纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表6中所述配比进行反应体系的配置。
表6
Figure PCTCN2020128663-appb-000008
Figure PCTCN2020128663-appb-000009
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(苏州亚睿，MA-6000)的托盘中。所使用程序为：50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；95℃变性10秒，56℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火120秒，50-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.03℃。
在没有待测靶标存在时，杂交探针呈单链状态，此时荧光基团和淬灭基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高；而当待测靶标存在时，上游引物和下游引物将特异性结合靶序列并延伸产生扩增模板，使得杂交探针可以与扩增模板杂交，导致荧光基团与淬灭基团之间的距离发生变化，荧光共振能量转移效率改变，使得荧光信号发生变化，从而可被仪器检测到；在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析时，与扩增产物杂交中的杂交探针将在一定温度下解链并与产物链分开，使得荧光基团与淬灭基团之间的距离发生变化，此时荧光共振能量转移效率改变，导致荧光信号再次发生变化，从而被仪器检测到，可用于熔解曲线分析。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图10-15为多重靶标检测中各呼吸道病毒阳性样本的熔解曲线图。
由图10-15可知，加入IBV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为59.46℃的熔解峰；加入IAV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为73.42℃的熔解峰；加入ADV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为64.49℃的熔解峰；加入RSV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为73.10℃的熔解峰；加入MP阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为63.10℃的熔解峰；而加入SARS-CoV-2阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为74.48℃的熔解峰。
实施例6 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的多重检测
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，将表5中同一荧光通道的两种靶序列模板混合后进行检测，以验证病毒混合感染的检测能力。使用TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表6中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(苏州亚睿，MA-6000)的托盘中。所使用程序为：50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；95℃变性10秒，56℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火120秒，50-90℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.03℃。
数据分析：
对熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图16-18为多重靶标检测中各呼吸道病毒阳性样本的熔解曲线图。
由图16-18可知，同时加入IBV、IAV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中同时出现IBV和IAV的双熔解峰；同时加入ADV、RSV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中同时出现ADV和RSV的双熔解峰；而同时加入MP、SARS-CoV-2阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中同时出现MP和SARS-CoV-2的双熔解峰。由此，本发明的组合检测6种呼吸道相关病原体时，特异性良好，熔解曲线形态明显，且同一通道中的两种阳性靶标的Tm值可以显著区分。
实施例7 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的单重检测
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，分别对各靶序列进行单独检测，以验证单一病毒感染的检测能力。使用TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表6中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(上海宏石，
Figure PCTCN2020128663-appb-000010
)的托盘中。所使用程序为：50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；95℃变性10秒，56℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火120秒，50-90℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.03℃。
在没有待测靶标存在时，杂交探针呈单链状态，此时荧光基团和淬灭基团之间的距离较近，荧光共振能量转移的效率较高；而当待测靶标存在时，上游引物和下游引物将特异性结合靶序列并延伸产生扩增模板，使得杂交探针可以与扩增模板杂交，导致荧光基团与淬灭基团之间的距离发生变化，荧光共振能量转移效率改变，使得荧光信号发生变化，从而可被仪器检测到；在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析时，与扩增产物杂交中的杂交探针将在一定温度下解链并与产物链分开，使得荧光基团与淬灭基团之间的距离发生变化，此时荧光共振能量转移效率改变，导致荧光信号再次发生变化，从而被仪器检测到，可用于熔解曲线分析。
数据分析：
通过熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图19-24为多重靶标检测中各呼吸道病毒阳性样本的熔解曲线图。
由图19-24可知，加入IBV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为60.82℃的熔解峰；加入IAV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为72.36℃的熔解峰；加入ADV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为63.94℃的熔解峰；加入RSV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为72.65℃的熔解峰；加入MP阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为63.58℃的熔解峰；而加入SARS-CoV-2阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为74.18℃的熔解峰。
实施例8 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的多重检测
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，将表5中同一荧光通道的两种靶序列模板混合后进行检测，以验证病毒混合感染的检测能力。使用TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表6中所述配比进行反应体系的配置。
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(上海宏石，
Figure PCTCN2020128663-appb-000011
)的托盘中。所使用程序为： 50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；95℃变性10秒，56℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火120秒，50-90℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.03℃。
数据分析：
对熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图25-27为多重靶标检测中各呼吸道病毒阳性样本的熔解曲线图。
由图25-27可知在FAM通道中加入IAV、IBV阳性模板的反应孔中同时出现IAV和IBV的双熔解峰；在ROX通道中加入ADV、RSV阳性模板的反应孔中同时出现ADV和RSV的双熔解峰；而在Cy5通道中加入MP、SARS-CoV-2阳性模板的反应孔中同时出现MP和SARS-CoV-2的双熔解峰。由此，本发明的组合检测6种呼吸道相关病原体时，特异性良好，熔解曲线形态明显，且同一通道中的两种阳性靶标的Tm值可以显著区分。
实施例9 腺病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、鼻病毒、肺炎支原体和新型冠状病毒的多重检测
为了验证本发明的组合在检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒(Rhinovirus，RhV)、肺炎支原体和新型冠状病毒的效果，设计了下表7中的引物和探针。同时，在呼吸道相关病原体的检测中加入了质量监控，确保PCR过程没有系统性错误。所述的内部质控为一对针对人源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)设计的引物探针，该探针为水解探针，因此不会产生熔解曲线。
表7
Figure PCTCN2020128663-appb-000012
其中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、和新型冠状病毒的特异性引物探针如表4所示；肺炎支原体的下游引物如表4所示。其余引物探针如表7所示，其中，上游引物7'和下游引物7'为针对鼻病毒靶序列设计的特异性引物；上游引物8'、下游引物8'以及水解探针1为针对人源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)设计的特异性引物和探针；上游引物9'为针对肺炎支原体靶序列设计的特异性引物。
其中，杂交探针Tm值如下表8所示。
表8
Figure PCTCN2020128663-appb-000013
Figure PCTCN2020128663-appb-000014
样本制备：使用各靶序列的体外转录RNA作为阳性样本，分别对各靶序列进行单独检测，以验证单一病毒感染的检测能力。使用纯水作为无模板对照(NTC)。
反应配制：
样本准备完成后，按照表9中所述配比进行反应体系的配置。
表9
Figure PCTCN2020128663-appb-000015
PCR扩增及熔解曲线分析：
将PCR管盖封好后轻轻混匀样本，短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪(上海宏石，
Figure PCTCN2020128663-appb-000016
)的托盘中。所使用程序为：50℃，逆转录10分钟；95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火延伸15秒，共进行10个循环，不采光；95℃变性10秒，56℃退火延伸15秒，共进行40个循环，采光；94℃变性10秒，50℃退火120秒，50-90℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.03℃。
数据分析：
对熔解曲线的Tm值对结果进行判读。图28-35为多重靶标检测中各呼吸道病毒阳性样本的熔解曲线图。
由图28-35可知，加入IBV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为61.27℃的熔解峰；加入IAV阳性模板的PCR反应孔在FAM通道中形成Tm值为72.54℃的熔解峰加入ADV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为65.62℃的熔解峰；加入RSV阳性模板的PCR反应孔在ROX通道中形成Tm值为72.55℃的熔解峰；加入RhV阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为62.47℃的熔解峰；加入MP阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为68.47℃的熔解峰；而加入SARS-CoV-2阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中形成Tm值为74.75℃的熔解峰。加入RhV、MP、SARS-CoV-2阳性模板的PCR反应孔在Cy5通道中同时出现RhV、MP、SARS-CoV-2的三熔解峰。此外，由图36可知，加入GAPDH阳性模板的反应孔在VIC通道有明显的S型扩增曲线(上侧)，但不会出现熔解峰(下侧)。

Claims (20)

  1. 一种多重核酸检测的方法，包括以下步骤：
    将含有第一引物组和第一探针的组合与来自受试者的样本进行混合；
    对所述样本中可能存在的靶序列进行扩增；
    在对应的检测通道内对扩增后产物进行熔解曲线分析；以及
    根据所述熔解曲线分析的结果，判断是否存在靶标中的一种或更多种，
    其中，所述第一引物组包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下游引物，
    其中，所述第一靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第一信号检测区，
    其中，所述第二靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第二信号检测区，
    其中，所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
    并且其中，所述第一探针的全部或部分序列与所述第一和第二信号检测区相同，从而能够分别与所述第一和第二信号检测区的互补序列形成双链结构；所述第一探针携带有第一检测基团和第二检测基团，在整合至所述双链结构后，所述第一检测基团和第二检测基团能够因此产生信号的变化。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合进一步包括第二引物组和第二探针，
    所述第二引物组包括针对第三靶标的上游引物和下游引物，以及针对第四靶标的上游引物和下游引物，
    其中，所述第三靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第三信号检测区；所述第四靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的所述第四信号检测区，
    其中，所述第三和第四信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
    并且其中，所述第二探针的全部或部分序列与所述第三和第四信号检测区相同，从而能够分别与所述第三和第四信号检测区的互补序列形成双链结构；所述第二探针携带有第三检测基团和第四检测基团，在整合至所述双链结构后，所述第三检测基团和第四检测基团能够因此产生信号的变化，并且所述第二探针所产生的信号与第一探针所产生的信号对应不同的检测通道。
  3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一探针和第二探针选自由以下项组成的组：在单链状态下因分子柔性成卷曲状的寡核苷酸、在单链状态下能够形成发夹结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成茎环结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成假结结构的寡核苷酸，和在单链状态下能够形成三螺旋结构的寡核苷酸。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述第一检测基团和第二检测基团相距5-25个碱基，且不位于3’末端；并且所述第三检测基团和第四检测基团相距5-25个碱基，且不位于3’末端。
  5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一探针能够对第一引物组的扩增产物进行扩增，而不能对其它引物组的扩增产物进行扩增；第二探针能够对第二引物组的扩增产物进行扩增，而不能对其它引物组的扩增产物进行扩增。
  6. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述信号检测区与其所位于的引物上的靶序列结合区之间间隔0-40碱基。
  7. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一信号检测区与所述第二信号检测区相同。
  8. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述间隔被设计成使得所述第一探针的不同扩增产物具有不同的熔解温度；所述间隔被设计成使得所述第二探针的不同扩增产物具有不同的熔解温度。
  9. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述第一探针能够与第一引物组的扩增产物杂交，而不能与其他引物组的扩增产物进行杂交；所述第二探针能够与第二引物组的扩增产物杂交，而不能与其他引物组的扩增产物进行杂交；并且所述第一探针和所述第二探针的3’末端被设计成不能作为引物延伸。
  10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一探针和第二探针上的第一检测基团或第二检测基团位于其3’末端。
  11. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一探针和第二探针的3’末端被封闭。
  12. 根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述第一检测基团和第二检测基团相距5-25个碱基；并且所述第三检测基团和第四检测基团相距5-25个碱基。
  13. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述信号检测区与其所位于的引物上的靶序列结合区之间间隔0-10碱基。
  14. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一信号检测区和所述第二信号检测区被设计成使得它们的互补序列与所述第一探针的杂交产物具有不同的熔解温度；并且所述第三信号检测区和所述第四信号检测区被设计成使得它们的互补序列与所述第二探针的杂交产物具有不同的熔解温度。
  15. 一种用于多重核酸检测的组合，包括：
    第一引物组，其包括针对第一靶标的上游引物和下游引物，以及针对第二靶标的上游引物和下游引物；和
    第一探针，其全部或部分序列与第一和第二信号检测区相同，且能够分别与第一信号检测区和第二信号检测区的互补序列形成双链结构；所述第一探针携带有第一检测基团和第二检测基团，所述第一检测基团和第二检测基团能够在整合至所述双链结构后产生信号的变化，
    其中，所述第一信号检测区位于针对第一靶标的上游引物或下游引物的靶序列结合区的上游，所述第二信号检测区位于针对第二靶标的上游引物或下游引物的靶序列结合区的上游；所述第一和第二信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对。
  16. 根据权利要求15所述的组合，其中，所述组合进一步包括第二引物组和第二探针，
    所述第二引物组包括针对第三靶标的上游引物和下游引物，以及针对第四靶标的上游引物和下游引物，
    其中，所述第三靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的第三信号检测区；所述第四靶标的上游引物或下游引物包括位于靶序列结合区上游的所述第四信号检测区，
    其中，所述第三和第四信号检测区被设计成不与靶序列发生互补配对，
    并且其中，所述第二探针的全部或部分序列与所述第三和第四信号检测区相同，且能够分别与所述第三和第四信号检测区的互补序列形成双链结构；所述第二探针携带有第三检测基团和第四检测基团，所述第三检测基团和第四检测基团能够在整合至所述双链结构后产生可检测的信号变化；并且所述第二探针所产生的信号与第一探针所产生的信号类型不同。
  17. 根据权利要求15所述的组合，其中，所述第一探针和第二探针选自由以下项组成的组：在单链状态下因分子柔性成卷曲状的寡核苷酸、在单链状态下能够形成发夹结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成茎环结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成假结结构的寡核苷酸，和在单链状态下能够形成三螺旋结构的寡核苷酸。
  18. 根据权利要求15-17中任一项所述的组合，其中，所述第一探针能够对第一引物组的扩增产物进行扩增，而不能对其它引物组的扩增产物进行扩增；第二探针能够对第二引物组的扩增产物进行扩增，而不能对其它引物组的扩增产物进行扩增。
  19. 根据权利要求15-17中任一项所述的组合，其中，所述第一探针能够与第一引物组的扩增产物杂交，而不能与其他引物组的扩增产物进行杂交；所述第二探针能够与第二引物组的扩增产物杂交，而不能与其他引物组的扩增产物进行杂交；并且所述第一探针和所述第二探针的3’末端被设计成不能作为引物延伸。
  20. 一种试剂盒，包括权利要求1-9中任一项中所定义的引物组和探针。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023125552A1 (zh) * 2021-12-27 2023-07-06 迈克生物股份有限公司 对靶标核酸进行检测的方法
CN116356075A (zh) * 2021-12-27 2023-06-30 迈克生物股份有限公司 一种用于检测的引物探针、引物探针组及其应用
CN117730160A (zh) * 2022-06-17 2024-03-19 京东方科技集团股份有限公司 呼吸道靶标核酸多重检测引物及探针及试剂盒及使用方法
CN117701689A (zh) * 2022-09-14 2024-03-15 迈克生物股份有限公司 多重pcr反应体系

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090118490A1 (en) * 2005-01-03 2009-05-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Primer for nucleic acid detection
CN102242211A (zh) * 2011-07-08 2011-11-16 无锡锐奇基因生物科技有限公司 检测突变核酸序列的方法及试剂盒
CN103074450A (zh) 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法
CN103276094A (zh) * 2013-06-08 2013-09-04 瀚吉康生物科技（北京）有限公司 多重pcr检测方法及试剂盒
CN107090519A (zh) 2017-04-05 2017-08-25 苏州协云基因科技有限公司 呼吸道常见病原体多重rt‑pcr联合基因芯片检测试剂盒
US9845492B2 (en) 2009-12-21 2017-12-19 Seegene, Inc. TSG primer target detection

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3286329B1 (en) * 2015-04-23 2019-10-30 PathoFinder B.V. Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
CN105400778B (zh) * 2015-09-25 2019-01-04 深圳市疾病预防控制中心 同时检测10种致病性弧菌的试剂盒及检测方法
CN106868213A (zh) * 2017-03-21 2017-06-20 重庆迪安医学检验中心有限公司 一种基于熔解曲线法单管同时检测副流感病毒和冠状病毒的引物及其应用
CN107475446B (zh) * 2017-08-24 2020-12-11 复旦大学附属儿科医院 一种同时检测多种呼吸道病毒的多重pcr检测方法及其探针组和试剂盒
CN107828870A (zh) * 2017-11-16 2018-03-23 沈阳迪安医学检验所有限公司 一种利用分子信标探针熔解曲线法同时检测mthfr和mtrr基因多态性试剂盒及方法
CN109207640B (zh) * 2018-10-23 2023-06-02 深圳市亿立方生物技术有限公司 一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090118490A1 (en) * 2005-01-03 2009-05-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Primer for nucleic acid detection
US9845492B2 (en) 2009-12-21 2017-12-19 Seegene, Inc. TSG primer target detection
CN102242211A (zh) * 2011-07-08 2011-11-16 无锡锐奇基因生物科技有限公司 检测突变核酸序列的方法及试剂盒
CN103074450A (zh) 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法
CN103276094A (zh) * 2013-06-08 2013-09-04 瀚吉康生物科技（北京）有限公司 多重pcr检测方法及试剂盒
CN107090519A (zh) 2017-04-05 2017-08-25 苏州协云基因科技有限公司 呼吸道常见病原体多重rt‑pcr联合基因芯片检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PENGCHENG LIU ET AL.: "A novel multiplex PCR for virus detection by melting curve analysis", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 262, 26 September 2018 (2018-09-26), pages 56 - 60, XP085507636, DOI: 10.1016/j.jviromet.2018.09.010 *

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