JP2015180193A - 次世代シーケンシングの標的濃縮用の高速ハイブリダイゼーション - Google Patents
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Abstract
【解決手段】二価カチオンの塩と緩衝剤とを約100〜約600mMの範囲の濃度で含み、前記塩及び前記緩衝剤が約2.5:1〜約60:1のモル比で存在する核酸ハイブリダイゼーション用の組成物、並びに標的核酸及びベイト核酸と前記組成物とを接触させて、ハイブリダイゼーション混合物を形成するステップと、前記ハイブリダイゼーション混合物を第1の温度で第1の期間変性させるステップと、前記混合物を第2の温度で第2の期間ブロッキングするステップと、前記混合物をインキュベートするステップを1回又は複数回繰り返すステップとを含む、標的核酸とベイト核酸とを核酸ハイブリダイゼーションする方法。
【選択図】なし
Description
一態様において、本発明は、核酸ハイブリダイゼーション用の組成物又は緩衝液を提供する。ハイブリダイゼーション組成物又は緩衝液は、約100mM〜約600mMの範囲(例えば、約150mM〜500mM、200mM〜400mM、250mM〜350mM、100mM、120mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、及び600mM)の濃度を有する二価カチオンの塩と、体積排除/増粘剤と、緩衝剤とを含有する。様々な二価カチオン塩、体積排除/増粘剤、及び緩衝剤を用いることができる。塩及び緩衝剤は、約2.5:1〜約60:1の範囲(例えば、2.5:1〜30:1、2.5:1〜15:1、2.5:1〜5:1、2.5:1、5:1、8:1、10:1、12:1、15:1、及び20:1)のモル比で存在する。
本発明による緩衝液組成物は、従来の核酸ハイブリダイゼーションのための濃度よりも高濃度の二価カチオンの塩を含有する。従来のハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーションのためのプロセスは、引用することによって本明細書の一部をなすものとする、J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2nd Ed., 1989, vol. 1-3に記載されている。一般に、従来のハイブリダイゼーションのための条件には、(1)高イオン強度の溶液、(2)制御された温度、並びに(3)キャリアDNA及び界面活性剤及び二価カチオンのキレート剤の存在下、が含まれる。
本発明による緩衝液組成物は、体積排除/増粘剤を含有する。本明細書において用いる場合、「体積排除/増粘剤」は、周囲の環境から水分子を誘引及び保持する良好な能力を有する、不活性な粘弾性剤のことをいう。この水誘引−保持能力のために、体積排除/増粘剤は、ハイブリダイゼーション溶液中の利用可能な核酸及びプローブ/ベイトの濃度を人為的に上昇させ、非特異的結合部位を飽和させることによりハイブリダイゼーション効率を上昇させることができる。
本発明の緩衝液組成物は、緩衝剤を含有する。本発明の組成物のpHは、約6.0〜約11.0の範囲内、例えば、約7〜約9、約7.5〜約8.5、又は約8.0に制御することができる。緩衝剤は、約6.0〜約11.0の少なくとも1つのpKa値及び/又はpKb値を有する、あらゆる有機又は無機、酸又は塩基、及びそれらのアルカリ金属塩を含んでいてもよい。緩衝剤は、2つ以上のpKa値及び/又はpKb値を有していてもよい。緩衝剤は、示された範囲内のそのpKa値及び/又はpKb値の少なくとも1つを有することができる。
本発明による緩衝液組成物は、様々な核酸ハイブリダイゼーション反応プロトコルに使用することができる。例としては、溶液中ハイブリダイゼーション、担体に基づくハイブリダイゼーション、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、並びに膜、マイクロアレイ及び細胞/組織スライド上でのin situハイブリダイゼーションが挙げられる。したがって、そのようなプロトコルのための、反応時間及び温度、サーマルサイクリングプロファイル、ハイブリダイゼーションプローブ/ベイトの配列及び濃度、検出剤(例えば、色素、酵素、放射性同位元素、及びフルオロフォア)は、一般に、変更することなく本発明の緩衝液組成物とともに使用することができる。よって、本発明の緩衝液組成物又は以下に記載する関連する濃縮形態はプロトコルに好適な1又は複数の更なる成分を含んでいてもよい。
本発明の緩衝液組成物は、核酸ハイブリダイゼーション反応の分野において常識であるように、標的、プローブ、ベイト、ブロッキング剤、湿潤剤、及びハイブリダイゼーション促進因子を含むその他の試薬の添加に適応するために、濃縮ストック溶液として調製してもよい。緩衝液組成物は、すべての成分が、所望の終濃度よりも2倍〜20倍高い濃度、例えば、5倍高い、又は10倍高い濃度で存在する濃縮液として調製することができる。
本開示の別の態様において、核酸プローブ又はベイトのセットと標的核酸の集団とをハイブリダイズさせる方法が提供される。ハイブリダイズさせる方法は、核酸と本発明のハイブリダイゼーション緩衝液組成物とを接触させるか又は混合するステップと、結果として生じた混合物を、異なっていても同一であってもよい2つのハイブリダイゼーション温度でインキュベートするステップとを含む。
1. ボルテックスミキサでDynal(Invitrogen)磁気ビーズを勢いよく再懸濁させる。Dynalビーズは保管中に沈む。
2. 各ハイブリダイゼーションサンプルについて、50μLのDynal磁気ビーズをストリップチューブ/96ウェルプレートに添加する。
3. ビーズを洗浄する。
a. 200μLのSureSelect Binding緩衝液(Agilent Technologies, Inc)を添加する。
b. ピペット操作により10回上下させることによりビーズを混合する。
c. チューブを96ウェル磁気スタンドに入れる。
d. 5分間待機し、そして上清を取り出して捨てる。
e. ステップaからステップdを繰り返し、合計3回洗浄する。
4. ビーズを200μLのSureSelect Binding緩衝液に再懸濁させる。
1. インキュベーションの後、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、そして室温で短時間遠心して液体を収集する。各サンプルについての全ハイブリダイゼーション混合物を、対応する洗浄済みの用意ができたDynal MyOneT1ストレプトアビジンビーズ溶液に添加し、そしてストリップチューブ/プレートを3回〜5回反転させて混合する。ハイブリッド−キャプチャー/ビーズ溶液をニューテーター(Nutator)又は振盪機上で30分間室温でインキュベートする。プレート中でサンプルが適切に混合していることを確実にする。
2. 96ウェルプレート中の1ウェルあたり200μLをアリコートとすることにより、洗浄緩衝液#2を65℃で予熱する(3回の洗浄のために1つのハイブリダイゼーション反応あたり3ウェル)。ウェルにキャップをし、そしてサーマルサイクラーを用いて65℃でインキュベートしつつ、ハイブリダイゼーションサンプルをニューテーター又は振盪機上で30分間置く。
3. ハイブリッド−キャプチャー/ビーズ溶液を30分後に短時間遠心沈殿させる。
4. ビーズ及び緩衝液を磁気分離器で分離し、そして上清を取り出す。
5. ピペット操作により8回〜10回上下させることによりビーズを200μLの洗浄緩衝液#1に再懸濁させ、次いでボルテックスミキサ上で8秒間高速で混合する。
6. ビーズを洗浄する。
a. ビーズ及び緩衝液を96ウェル磁気スタンドで1分間かけて分離させ、そして上清を取り出す。
b. 200μLの予熱した洗浄緩衝液#2を添加する。ゆっくりとピペット操作により10回上下させ、ビーズを再懸濁させる。ピペット操作により洗浄緩衝液を上下させて緩衝液を直接ペレット化したビーズに分注すると、それらはより高速に再懸濁される。
c. ウェルにキャップをする。ホットトップを使用してサーマルサイクラー上で10分間65℃でサンプルをインキュベートする。
d. ステップaからステップcを繰り返し、合計3回洗浄する。
e. すべての洗浄緩衝液#2が確実に除去されるようにする。
f. 23μLのヌクレアーゼ非含有水を添加し、5秒間ボルテックスしてビーズを再懸濁させ、そしてPCRステップへと進む。
1. ストリップチューブ/プレートを磁気スタンド上で2分間置くことにより、Dynal MyOneT1ストレプトアビジンビーズを捕捉後の増幅反応液から除去する。次いで、50μLのPCR反応液を取り出し、新しいストリップチューブ/プレートに入れる。Dynal MyOneT1ストレプトアビジンビーズはここで捨てることができる。
2. 60μLの均質なAMPure XPビーズを捕捉後増幅反応液のそれぞれに添加する。勢いよくピペット操作により20回上下させることによりよく混合する。ビーズが均一に混合されることを確実にするよう確認する。ビーズは均質に一色であるべきであり、液体の層が存在してはならない。
3. チューブを5分間室温でインキュベートする。
4. チューブを96ウェル磁気スタンド中に置く。溶液が清澄となるよう5分間待機する。磁気スタンド中のチューブを攪乱してはならない。
5. 清澄となった溶液を慎重に捨てる。ビーズを全く取り出さないことを確実にする。
6. チューブを磁気スタンド中に維持し続けながら、200μLの70%エタノールを各サンプルウェル中に分注する。
7. 70%エタノールを1分間放置して、すべての攪乱されたビーズを沈ませ、次いでエタノールを除去する。合計2回の洗浄のために、ステップ6及びステップ7を1回繰り返す。エタノールを可能な限り多く除去することを確実にする。
8. 蓋を開けて37℃で1分間〜3分間サーマルサイクラー上でサンプルを乾燥する。ビーズを過剰に乾燥させてはならない。
9. 25μLのヌクレアーゼ非含有水を添加する。ボルテックスによりよく混合する。ビーズを短時間遠心沈降させ、そして2分間室温でインキュベートする。
10. 溶液が清澄となるまで、サンプルを96ウェル磁気スタンド上に2分間置く。25μLの上清を新しいLoBindチューブに取り出す。
単一のシーケンシングレーンにおいて多重とすることができるインデックス化されたライブラリの数は、研究設計に必要なシーケンシングデータの量とともに、使用するプラットフォームの出力仕様によって決定される。プラットフォームの能力及び1サンプルあたりに必要とされるシーケンシングデータの量に応じて、1レーンあたり混合することができるインデックスの数を計算する。
1. それぞれのインデックスでタグ付けされたサンプルがプール中で等モル量で存在するようにライブラリを合わせる。各ライブラリについて、使用されるインデックス化されたサンプルの量を決定するために下記式を使用する。
インデックスの体積=V(f)×C(f)/{#×C(i)}
(式中、V(f)は、プールの所望の最終体積であり、
C(f)は、プール中のすべてのDNAの所望の終濃度であり、
#は、インデックスの数であり、及びC(i)は、各インデックス化サンプルの初濃度である。)
上記のように、標的化次世代シーケンシング技術のための主な障壁及び律速ステップは、迅速かつ対費用効果の高い様式で、ゲノム、ミトコンドリア及びその他の形態のDNAにわたって散在している標的化エクソン領域又は標的化イントロン領域を選択的に捕捉及び濃縮する初期段階のステップであった。上記で開示される緩衝液により、核酸ハイブリダイゼーションをはるかにより速く完了することが可能となり、それにより、標的化次世代シーケンシング全体を高速化するために用いることができる。
本発明の更に別の態様において、上記のハイブリダイゼーション組成物又はその濃縮緩衝液と、本明細書に記載する組成物及び方法を用いてハイブリダイゼーションアッセイを行うための説明書とを含むキットが提供される。説明書は、本開示の方法、組成物、又はそれらの両方を含む。一つの実施形態において、キットは、上記で開示される1又は複数の更なる作用剤を有するハイブリダイゼーション組成物を更に含み、好ましくは、pHは、例えば、pH6.0〜11.0に維持され、pHは好ましくは、そのpH範囲にて有用な緩衝能を有する緩衝液を用いて維持される。
「核酸」は、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノムDNA)、RNA分子(例えば、mRNA)、又はDNA類似体若しくはRNA類似体のことをいう。DNA類似体又はRNA類似体は、ヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖DNAであるのが好ましい。
本実施例において、上記のハイブリダイゼーション緩衝液及び方法を使用して、標的化次世代シーケンシングの解析のためにヒトゲノムDNAからの標的化エクソン領域を選択的に捕捉及び濃縮した。
Claims (10)
- 核酸ハイブリダイゼーション用の組成物であって、約100mM〜約600mMの範囲の濃度を有する二価カチオンの塩と緩衝剤とを含み、前記塩及び前記緩衝剤が約2.5:1〜約60:1のモル比で存在する組成物。
- 約0.002重量%〜約15重量%の範囲の濃度を有する体積排除/増粘剤を更に含む請求項1に記載の組成物。
- 前記緩衝剤が、約10mM〜約40mMの範囲の濃度を有する請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、及びカドミウムからなる群から選択される請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記体積排除/増粘剤が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシエチルメチルセルロース(HEMC)、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチセルロース、及びヒドロキシルメチルセルロースからなる群から選択される請求項2〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記体積排除/増粘剤が、デキストラン及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される請求項2〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝剤が、Tris、HEPES、TAPS、Tricine、Bicine、Bis−Tris、NaOH、KOH、TES、EPPS、及びMOPSからなる群から選択される請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- ハイブリダイゼーション溶液を調製するための濃縮緩衝液であって、2倍〜20倍の範囲の希釈により、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物がもたらされる濃縮緩衝液。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物又は濃縮緩衝液と、そのための包装材とを含む核酸ハイブリダイゼーション用のキット。
- 標的核酸及びベイト核酸と、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物とを接触させて、ハイブリダイゼーション混合物を形成するステップと、
前記ハイブリダイゼーション混合物を第1の温度で第1の期間変性させるステップと、
前記混合物を第2の温度で第2の期間ブロッキングするステップと、
前記混合物を、(i)第3の温度で第3の期間、及び次いで、(ii)第4の温度で第4の期間、インキュベートするステップと、
前記インキュベートするステップを1回又は複数回繰り返すステップと
を含む、標的核酸とベイト核酸とを核酸ハイブリダイゼーションする方法。
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