CN104805180A - 用于下一代测序靶富集的快速杂交 - Google Patents

用于下一代测序靶富集的快速杂交 Download PDF

Info

Publication number
CN104805180A
CN104805180A CN201510037254.5A CN201510037254A CN104805180A CN 104805180 A CN104805180 A CN 104805180A CN 201510037254 A CN201510037254 A CN 201510037254A CN 104805180 A CN104805180 A CN 104805180A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hybridization
nucleic acid
dna
target
incubation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510037254.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104805180B (zh
Inventor
M·伯恩斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agilent Technologies Inc
Original Assignee
Agilent Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agilent Technologies Inc filed Critical Agilent Technologies Inc
Publication of CN104805180A publication Critical patent/CN104805180A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104805180B publication Critical patent/CN104805180B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及靶富集或利用杂交选择核酸的组合物和方法，其可被用于例如下一代测序。

Description

用于下一代测序靶富集的快速杂交
技术领域
本发明涉及用于快速核酸杂交的组合物和方法。具体地，其涉及在下一代测序中用于靶核酸富集和选择的杂交组合物和方法。
背景技术
核酸测序是分子生物学中一种最为广泛使用的工具。利用自动DNA测序仪发展快速灵敏的测序方法使现代分子生物学发生彻底变革。具体的，采用下一代测序技术对植物、病毒、细菌、真菌和动物的全基因组进行分析已成为可能。
下一代测序技术为基因组测序过程带来更高水平的效率。然而，虽然技术取得进步，全基因组测序仍伴随巨大的开销和工作量，这是由于相关的工作流程往往比较复杂、旷日持久且实施成本很高。此外，关于精确的样品制备、扩增和测序存在多种技术缺陷。因此，在短时间内对基因组快速测序的目标尚未实现。
下一代测序的实施与某些类型基因组DNA测序子(sequencer)(例如，外显子)靶富集的相关性使得技术人员将目光聚焦在那些靶上。利用这种靶向的下一代测序的变化，仅对感兴趣的基因组区域进行测序，其减少了成本并使每次研究能够分析更多样品从而令流程高效。降低测试的DNA量使得研究者有可能在实施实验中采用统计学上更相关的样品数目。
本领域已有多种用于靶富集的手段。最普遍使用的技术基于杂交捕获、PCR以及分子倒置探针。对于大的靶区域，杂交捕获效率最高。该方法的主要优势在于溶液中富集而非在微阵列上富集，其简化了操作并使所需DNA变少。溶液中捕获，如Agilent Technologies,Inc.的SureSelect Target Enrichment SystemTM，经常利用由DNA模板寡核苷酸文库转录而来的生物素化的RNA诱饵分子，这些分子是关键成分，同时也是成本的主要部分。见US 20100029498,Mertes et al.、Brief Funct Genomics 10:374-386、Gnirke et al.,Nat.Biotechnol.27:182-189以及Albert et al.,Nat.Methods 4:903-905。
然而，靶向的下一代测序技术非常耗费时间。对于靶向的下一代测序技术的成功实施而言，主要的瓶颈和速度限制步骤是在前端步骤中以快速和节约成本的方式选择性地捕获和富集散布在基因组、线粒体和其他形式的DNA中的靶外显子或内含子区域。事实上，目前选择性的杂交捕获过程通常需要16小时至超过70小时。见，例如US 20100029498和Agilent Technologies,Inc的SureSelect Target Enrichment SystemTM。因此，通常需要2-4天来生成一个准备用于测序的样品并需要更长时间来完成整个测序过程。
因此，用于下一代测序的快速靶富集或核酸选择的组合物和方法存在需求。
发明内容
本发明涉及用于核酸杂交的新型组合物、相关试剂盒以及相关的方法。这些组合物和方法与传统过程相比，使得技术人员能够快得多地完成预期的基因组DNA测序子的靶富集。
一方面，本发明的特征为一种用于核酸杂交的组合物(即，杂交组合物)。所述组合物包含浓度为约100mM至约600mM的二价阳离子盐(例如，约150-500mM、200-400mM、250-350mM、100mM、120mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM和600mM)以及缓冲剂。所述的盐和缓冲剂在组合物中的摩尔比为约2.5:1至约60:1(例如，2.5:1至30:1、2.5:1至20:1、2.5:1至15:1、10:1至20:1、2.5:1至5:1、2.5:1、5:1、8:1、10:1、12:1、15:1和20:1)。在组合物中，缓冲剂可以具有约10mM至约40mM的浓度(例如，15-35mM、20-30mM、20-40mM、20mM、25mM、30mM、35mM和40mM)。
所述二价阳离子可选自：镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子和镉离子。在一个实施方案中，所述二价阳离子是镁离子。
缓冲剂可选自：Tris、HEPES、TAPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、Bis-Tris、NaOH、KOH、TES、EPPS和MOPS。组合物的pH值可以为约7.0-11.0，例如，7.5-10.0、7.0-9.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0。
在优选的实施方案中，所述组合物还进一步包括体积-排除(volume-exclusion)/增稠作用剂。该体积-排除/增稠作用剂的浓度可以为约 0.002％至约15％w/w。所述作用剂可选自：羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟基甲基纤维素。在这种情况下，所述作用剂的浓度可以为约0.002％至约0.1％w/w(例如，约0.002％至约0.050％、0.004％至0.020％、约0.006％至0.012％以及约0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.010％、0.012％、0.015％和0.020％)。所述体积-排除/增稠作用剂也可选自葡聚糖和聚乙二醇(PEG)。并且在这种情况下，该作用剂的浓度可以为约1％至约15％w/w。
杂交组合物还可以进一步包括一种或多种额外的作用剂，选自：RNA酶抑制剂、阻断剂、诱饵核酸和靶核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸的浓度可以为在30-μl反应中约250-3000ng(例如，500-2000ng，和750-1500ng)，例如，8.3至100ng/μl(例如，16.7-66.7ng/μl和25-50ng/μl)。优选地，所述体积-排除/增稠作用剂和核酸以约0.2至120(例如，0.2-100、0.2-50、0.5-10和0.8-8.0)的比例存在。
在杂交组合物的一个实施方案中，所述盐是MgCl2，所述体积-排除/增稠作用剂是HPMC且所述缓冲剂是Tris，pH8.0。优选地，所述盐具有约308mM的浓度，HPMC具有约0.00834％的浓度；且缓冲剂具有约20mM的浓度。所述盐和作用剂在组合物中的摩尔比为约15.4:1。所述组合物可无单价阳离子或其盐。
上述缓冲组合物可以由浓缩的储液制备以便容纳其他试剂包括靶、探针、诱饵、阻断剂、润湿剂以及杂交增强因子的加入，这是核酸杂交反应领域的通常做法。相应地，本发明还提供用于制备上述的杂交组合物的缓冲浓缩液。该缓冲浓缩液可以为2-20X(例如，3-15X、4-10X、2X、3X、4X、5X、10X、15X和20X)的储液以便通过稀释系数为约2倍至20倍(例如，3-15倍、4-10倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍和20倍)的稀释获得上述的杂交组合物。在优选的实施方案中，缓冲浓缩液是5X储液且通过稀释系数为5倍的稀释获得上述杂交组合物。
本发明还提供了包含上述缓冲浓缩液或杂交组合物及其适合的包装材料的试剂盒。
按照本文公开，所述杂交组合物可被用于靶核酸和诱饵核酸的核酸杂交。相应地，本发明还提供了用于靶核酸和诱饵核酸的核酸杂交的方法。举例而言，所述方法包括下列步骤：使上述组合物接触靶核酸和诱饵核酸来形成杂 交混合物；在第一温度使杂交混合物变性第一时间段(例如，在95℃持续2-30分钟，如2、5、10、15、20、25或30分钟)；在第二温度封闭混合物第二时间(例如，在65℃持续5-30分钟，如5、10、15、20、25或30分钟)；在第三温度温育所述混合物第三时间段(i)进而在第四温度温育所述混合物第四时间段(ii)，并重复所述温育步骤一次或多次。在一个实施方案中，所述方法还进一步包括在重复步骤后在第五温度(例如，65℃)保持所述混合物。
所述诱饵核酸可以具有RNA或DNA序列。靶核酸可具有感兴趣的基因组DNA核酸。在一个实施方案中，靶核酸和诱饵核酸并非附着或附加于支持物之上。也就是说，与之相应的杂交是溶液杂交。
在该方法中，温育步骤可以实施任何次数的循环，取决于使用者对实验的设计、时间表和目的。合适的循环数实例包括20-100次、30-80次、40-70次以及50-60次。
在温育步骤中，第三温度和第四温度可以不同或相同。如果两个温度不同(例如，65℃和37℃)，在两个温度的持续时间可以例如分别为1分钟和3秒钟。取决于循环数目，温育步骤和重复步骤可以为25分钟至3小时或更短(例如，25分钟、26分钟、30分钟、1小时、1.5小时、2小时和2.5小时)。如果第三温度和第四温度相同，温育步骤和重复步骤的持续时间应该更长，如约1-4小时。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容将在下面的说明书中进行描述。本发明的其他特征、目的和优势从说明书和权利要求中显而易见。
附图说明
图1是生物分析仪电泳图，其表明常规的钠基杂交缓冲液经过24小时和1小时恒温温育的DNA捕获性能。
图2是生物分析仪电泳图，其表明本发明的快速杂交缓冲液和常规的钠基杂交缓冲液经过1小时循环温度温育和24小时恒温温育的DNA捕获性能。
图3是生物分析仪电泳图，其表明本发明的快速杂交缓冲液和常规的钠基杂交缓冲液经过1小时循环温度温育或1小时恒温温育的DNA捕获性能。
图4是生物分析仪电泳图，其表明钠基杂交缓冲液和镁基杂交缓冲液的比较。
图5中的表格表明在下一代测序中利用快速的镁基杂交缓冲液/两温度循 环温育捕获基因组DNA和通过常规方法捕获基因组DNA的性能参数。
具体实施方式
本发明至少部分上是基于以下意料不到的发现：与常规杂交缓冲液相比，具有非常高二价阳离子浓度的缓冲液使得技术人员能够通过溶液杂交快得多地捕获和富集断裂的基因组DNA。其还基于以下意料不到的发现：与在一种恒定温度下实施的常规杂交反应相比，通过重复地使杂交混合物经受两种不同的温度来实施杂交也使得技术人员能够快得多地捕获和富集断裂的基因组DNA。
1.组合物
一方面，本发明提供了用于核酸杂交的组合物或缓冲液。所述组合物或缓冲液包含浓度为约100mM至约600mM的二价阳离子盐(例如，约150-500mM、200-400mM、250-350mM、100mM、120mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM和600mM)、体积-排除/增稠作用剂、以及缓冲剂。可使用多种不同的二价阳离子盐、体积-排除/增稠作用剂和缓冲剂。所述盐和缓冲剂的摩尔比为约2.5:1至约60:1(例如，2.5:1至30:1、2.5:1至15:1、2.5:1至5:1、2.5:1、5:1、8:1、10:1、12:1、15:1和20:1)。
盐
根据本发明的缓冲组合物包含二价阳离子的盐，其浓度高于用于核酸杂交的常规浓度。常规的用于杂交的溶液和流程被描述于J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2nd Ed.,1989,vol.1-3中，其以参考文献并入本文。一般而言，常规的杂交条件包括(1)高离子强度溶液，(2)处于受控的温度，以及(3)存在载剂DNA和表面活性剂，以及二价阳离子的螯合剂。
一般而言，常规的核酸杂交缓冲液(如柠檬酸钠(SSC)缓冲液和磷酸钠-EDTA(SSPE)缓冲液)为钠基，且通常不含二价阳离子，如镁离子。某些缓冲液，如SSPE，甚至包含螯合剂(如EDTA)来隔离来自测试样品或其他来源的二价阳离子，使得这样的二价阳离子，即使在溶液中有任何残留，展示出的反应性也会减小。虽然一些文献指出镁离子在杂交过程中可以高效地使核酸 二倍体稳定化，但是如果被用于杂交反应中，镁离子通常以15mM或更低使用，以便减少非特异性杂交反应。见，例如，Springer et al.,Nucleic Acids Res.2010Nov；38(20):7343-51。
事实上，本领域的技术人员已知镁离子可通过稳定寡核苷酸和模板DNA的相互作用而影响寡核苷酸对模板DNA的退火，并由此增加非特异退火并生成不必要的产物。当非特异扩增发生时，通常需要降低Mg2+或加入EDTA来螯合Mg2+来增加扩增的准确性和特异性。见，例如，US专利7939645。按照本文公开，高浓度的二价阳离子盐可在核酸杂交中成功地用于捕获和富集断裂的基因组DNA而不牺牲其特异性，这是预料不到的。
本文所用的“盐”指离子化合物，其由阳离子和阴离子组成，从而使得产物为中性。本发明中用到的二价阳离子盐包括，但不局限于镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子和镉离子的盐。所述盐可以包括本领域技术人员知晓的二价阳离子的碳酸氢盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、溴化物、柠檬酸盐、乙酸盐、氰化物、氧化物或磷酸盐。更优选地，所述盐是氯化镁(MgCl2)、硫酸镁(MgSO4)、或硝酸镁(Mg(NO3)2)。此外，本发明所用的盐可以包括矿物盐的混合物或共混物。可被用于本发明的矿物盐的共混物包括MgCl2、MgSO4和Mg(NO3)2的任何组合。根据本发明可使用的盐浓度为约10至40mM，优选地为15-25mM，如20mM。
本文所用的术语“杂交”或“结合”指互补的(包括部分互补)多核苷酸链的配对(包括部分互补)。杂交和杂交的强度(例如，多核苷酸链之间结合的强度)受众多本领域熟知的因素影响，包括多核苷酸间的互补程度，相关条件的严格性，其受到如盐浓度、形成的杂交物的解链温度(Tm)、其他组分的存在、杂交链的摩尔浓度以及多核苷酸链的G:C含量等条件影响。当称一个多核苷酸与另一个多核苷酸“杂交”时，意为在这两个多核苷酸之间存在一定的互补、或这两个多核苷酸在高严格性条件下形成杂交物。当称一个多核苷酸不与另一个多核苷酸杂交时，其意为在这两个多核苷酸之间不存在序列的互补，或这两个多核苷酸在高严格性条件下不形成杂交物。
本文所用的术语“互补”指两个多核苷酸链的区域之间或相同的多核苷酸链的两个区域之间的序列互补的概念。已知多核苷酸的第一区域的腺嘌呤碱基能够同与该第一个区域反向平行的多核苷酸第二区域的碱基(如果该碱基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特定的氢键(“碱基对”)。类似的，已知第一多核苷 酸链的胞嘧啶碱基能够同与第一区域反向平行的第二多核苷酸链的碱基(如果该碱基是鸟嘌呤)进行碱基配对。如果当多核苷酸的第一区域与同一或另一不同多核苷酸的第二区域以反向平行的方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸能够与第二区域的碱基进行碱基配对，则这两个区域互补。因此，两个互补的多核苷酸并不需要在每一个核苷酸位置都碱基配对。“互补”指第一多核苷酸与第二多核苷酸100％或“完全”互补，且因此在每个核苷酸位点都形成碱基配对。“互补”也指并非100％互补(例如，90％，或80％或70％互补)的第一多核苷酸在一个或多个核苷酸位置包含错配核苷酸。在一个实施方案中，两个互补的多核苷酸能够在高严格性的杂交条件下彼此杂交。举例而言，对于膜杂交(例如，Northern杂交)，高严格性杂交条件被定义为使用放射性标记的探针，在65℃，在5xSSC,5xDenhardt's溶液，1％SDS中温育。对于膜杂交的严格冲洗操作如下：膜在室温的2xSSC/0.1％SDS以及65℃的0.2xSSC/0.1％SDS中冲洗，每次冲洗10分钟，并在胶片上曝光。
在实施方案中，完成杂交测定可花费约少于1小时(例如，约25分钟)至8小时的任何时间，其至少取决于杂交实验的类型和复杂性。“完成”意为实现靶核酸材料的理想杂交量，其依赖于实验者和靶材料两者。如以下的实施例所示，本方法和组合物在常规杂交参数失败的场合(例如在杂交时间为约1小时时)表现良好。本方法和组合物对于需至少25分钟(例如，1-3小时)完成的杂交，且更具体的是对于耗时约1-2小时的杂交表现特别好。
体积-排除/增稠作用剂 
根据本发明的缓冲液组合物包含体积-排除/增稠作用剂。本文所用的“体积-排除/增稠作用剂”指惰性的、粘弹性的作用剂，其具有良好的从周围环境吸引和保持水分子的能力。由于这种吸水-保水能力，所述作用剂能够人工增加杂交溶液中可利用的核酸和探针/诱饵浓度，并饱和非特异结合位点，从而增加杂交效率。
优选地，所述作用剂是粘弹性的高分子量聚合物，其能溶解于水溶液中并展示出热凝胶特性。即，当溶液加热至特定临界温度时，溶液凝结成非流动但半柔性的团块。一般情况下，特定的凝结温度与该作用剂的溶液浓度成反比。由于这些特性，作用剂在两种不同温度下展示出两种不同的粘弹性状态。相应地，当其被包括于杂交溶液中并被用于两温度(例如，65℃和37℃)循环温育杂交时，所述作用剂为靶核酸和捕获探针/诱饵提供两种不同的杂交 环境。
该两种粘弹性状态与由杂交温度的重复变化引发的对流运动一起显著增加了捕获探针/诱饵与特定靶核酸相遇的机会和可能性，从而增加特定杂交并形成特定的靶-探针/诱饵二倍体。此外，作用剂的“体积-排除”效果可通过人工增加可用的核酸和探针/诱饵在杂交溶液中的浓度进一步增强杂交效率。高浓度的二价阳离子可以稳定特定的靶-探针/诱饵双链体，同样对杂交效率有贡献。
制药产品中使用的各种赋形剂和制锭成分具有这些特性。因此它们可根据本发明用作缓冲液组合物中的体积-排除/增稠作用剂。体积-排除/增稠作用剂的实例包括甲基纤维素及其衍生物如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟基甲基纤维素。
缓冲剂
本发明的缓冲组合物包含缓冲剂。本组合物的pH可以控制在约6.0至约11.0，例如，约7至约9，约7.5至约8.5，或约8。所述缓冲剂可以是任何有机或无机酸或碱及其碱金属盐，具有至少一个为约6.0至约11.0的pKa值和/或pKb值。缓冲剂可以具有多于一个的pKa值和/或pKb值。缓冲剂可以具有至少一个在所述范围内的pKa值和/或pKb值。
本领域已知不同缓冲剂。本领域的技术人员可借鉴本公开来选择合适的缓冲剂并为他或她自己的测定量身设计缓冲组合物。在一些实例中，所述缓冲剂可以是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris或THAM)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPS或EPPS)，以及其他被称为“Good氏”的缓冲液。见，例如，Good et al.,1966,Biochemistry5(2):467–477；Good et al.,1972,Methods Enzymol.24:53–68；and Ferguson et al.,1980,Anal.Biochem.104:300–310。另外的实施例还包括3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸(Cacpdylate)、琥珀酸、Bis-Tris、NaOH和KOH。
其他适合的缓冲剂可以是，举例而言，吖啶、苯丙氨酸、别苏氨酸、正 戊胺、苯胺、N-烯丙基苯胺、4-溴苯胺、4-溴-N,N-二甲基苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺、3-氯-N,N-二甲基苯胺、3,5-二溴苯胺、N,N-二乙基苯胺、N,N-二甲基苯胺、N-乙基苯胺、4-氟苯胺、N-甲基苯胺、4-甲硫基苯胺、3-磺酸苯胺、4-磺酸苯胺、对茴香胺、精氨酸、天冬酰胺、甘氨酰天冬酰胺、D,L-天冬氨酸、氮丙啶、2-氨基乙苯、联苯胺、苯并咪唑、2-乙基苯并咪唑、2-甲基苯并咪唑、2-苯基苯并咪唑、2-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、苄胺、2-氨基联苯、番木鳖碱、1,4-二氨基丁烷、叔丁胺4-氨基丁酸、甘氨酰基-2-氨基-正丁酸、二甲胂酸、β-一氯三乙基铵-正丁酸、可待因、环己胺、胱氨酸、正癸胺、二乙胺、正十二烷基胺、1-麻黄素、1-氨基-3-甲氧基乙烷、1,2-双甲基氨基乙烷、2-氨基乙醇、乙二胺、乙二胺四乙酸、1-谷氨酸、α-单乙基葡萄糖胺酸、1-谷氨酰胺、1-谷胱甘肽、甘氨酸、N-乙酰基甘氨酸、二甲基甘氨酸、双甘氨肽、亮氨酰甘氨酸、甲基甘氨酸、苯基甘氨酸、N-正丙基甘氨酸、四双甘氨肽、谷氨酰胺、十六烷基胺(dexadecaneamine)、1-氨基庚烷、2-氨基庚烷、2-氨基己酸、DL-组氨酸、β-丙氨酰组氨酸、咪唑、1-氨基茚满、2-氨基异丁酸、异喹啉、1-氨基异喹啉、7-羟基异喹啉、1-亮氨酸、甘氨酰亮氨酸、甲硫氨酸、甲胺、吗啡、吗啉、1-氨基-6-羟基萘、二甲氨基萘、α-萘胺、β-萘胺、正甲基-α-萘胺、顺-新冰片基胺(neobornylamine)、尼古丁、正壬胺、十八烷胺、辛胺、鸟氨酸、罂粟碱、3-氨基戊烷、戊酸、亚精胺、菲啶、1,10-菲咯啉、2-乙氧基苯胺、3-乙氧基苯胺、4-乙氧基苯胺、α-甲基吡啶、β-甲基吡啶、γ-甲基吡啶、毛果芸香碱、哌嗪、反式-2,5-二甲基哌嗪、1-正丁基哌啶、1,2-二甲基哌啶、1-乙基哌啶、1-甲基哌啶、脯氨酸、羟基脯氨酸、1-氨基-2,2二甲基丙烷、1,2-二氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、1,2,3-三氨基丙烷、3-氨基丙酸、蝶啶、2-氨基4,6-二羟基喋啶、2-氨基4-羟基喋啶、6-氯喋啶、6-羟基-4-甲基喋啶、嘌呤、6-氨基嘌呤、2-二甲基氨基嘌呤、8-羟基嘌呤、2-甲基吡嗪、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶、吡啶、2-醛肟吡啶、2-氨基吡啶、4-氨基吡啶、2-苯甲基吡啶、2,5-二氨基吡啶、2,3-二甲基吡啶、2,4-二甲基吡啶、3,5-二甲基吡啶、2-乙基吡啶、甲氧基吡啶、4-甲基氨基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、1,2-二甲基吡咯烷、N-甲基吡咯烷、5-羟基喹唑啉、奎宁、3-羟基喹啉、8-羟基喹啉、8-羟基-5-磺基喹啉、6-甲氧基喹啉、2-甲基喹啉、4-甲基喹啉、5-甲基喹啉、丝氨酸、马钱子碱、牛磺酸、豆蔻酸胺、2-氨基噻唑、苏氨酸、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、2,4,6-三氨基-1,2,3-三嗪、三癸烷胺、三甲胺、色氨酸、酪氨酸、 酪氨酸胺、缬氨酸、它们的盐，以及它们的混合物。进一步适合的缓冲剂的实例可在例如US 20080207960和US 20060210997中找到，其内容作为参考文献并入本文。这些缓冲液或化合物通常且有利地为生物学惰性并不干扰生化反应。
附加组分
根据本发明的缓冲组合物可被用于多个核酸杂交反应方案。实例包括溶液杂交、基于支持物的杂交、例如，膜上的Northern、Southern和原位杂交，微阵列以及细胞/组织玻片。相应地，反应时间和温度、热循环方案、杂交探针/诱饵序列和浓度、用于这些方案的检测剂(例如，染料、酶、放射性同位素以及荧光团)一般可不加改变地与本发明的缓冲组合物一起使用。因此，如下文讨论的本发明的缓冲组合物或相关浓缩物形式可包括一种或多种适用于所述方案的附加组分。
这些附加组分的实例包括核苷酸、核酸聚合酶、引物、核酸模板、染料、杂交诱饵/探针、杂交增强因子、封闭剂/封闭物(如载剂核酸或蛋白质)、去污剂(例如，NP40)、表面活性剂、湿润剂和核酸酶抑制剂(例如，RNA酶抑制剂)。
2.缓冲浓缩物 
本发明的缓冲组合物可制备成浓缩储液以便容纳其他试剂包括靶、探针、诱饵、阻断剂、润湿剂和杂交增强因子的加入，这是核酸杂交反应领域的通常做法。缓冲组合物可以制备成浓缩物，其中所有组分与期望的最终浓度相比，为2倍至20倍的较高浓度，例如5倍高或10倍高的浓度。
本发明缓冲浓缩液的实例包括5X储液，其包含1540mM MgCl2.6H2O、0.0417％HPMC和100mM Tris(pH 8)。另一实例是2X储液，其包含616mM MgCl2.6H2O、0.01668％HPMC以及40mM Tris(pH 8)。另一实例是4X储液，其包含1232mM MgCl2.6H2O、0.03336％HPMC、以及80mM Tris(pH 8)。
3.杂交方法
另一方面，本公开提供了使一组核酸探针或诱饵与靶核酸群杂交的方法。该杂交方法包括如下步骤：使核酸与本发明的杂交缓冲组合物接触或组合；以及在两个杂交温度下温育所得到的混合物，这两个杂交温度可以不同或相同。
当两个温度不同时，两个温度间的差别应该大到(例如，5-40℃、20-35℃、 20℃、25℃、30℃和35℃)足够导致混合物中组分(例如，探针/诱饵和靶核酸)产生对流运动。在这种情况下，较高的温度可以为约55℃至约75℃(例如，60-70℃和65℃)且较低的温度可以为约30℃至约50℃(例如，35-45℃和37℃)。
按以上所述，温育/杂交的时间段可例如为约25分钟至超过8小时。该方法在速度和省时至关重要时特别令人满意。优选地，缓冲剂可选自一种或多种上文公开的缓冲剂，如在pH6和11的pH范围内具有缓冲能力的Tris。阳离子可以通过盐来提供，优选地选自一种或多种上文公开的盐及其组合。更优选地，杂交缓冲组合物可进一步包含一种或多种附加试剂，如体积-排除/增稠剂、RNA酶抑制剂、封闭剂和表面活性剂。
本发明的杂交方法可用于多种形式的核酸杂交，如溶液杂交以及在固体支持物上的杂交(例如，膜上的Northern、Southern和原位杂交、微阵列以及细胞/组织玻片)。特别是，本方法适用于在靶向的下一代测序中使用的用于某些类型的基因组DNA序列(例如，外显子)的靶富集的溶液杂交捕获。如以上所述，靶核酸的选择性捕获和富集已成为主要瓶颈和限速步骤，且常规的杂交方法不能提供令人满意的快速方法。本发明的杂交方法可与Agilent Technologies,Inc.,Illumina,Inc.,454Life Sciences,Life Technologies Corporation,Affymetrix,Inc.提供的系统和平台及其他联合用于靶向的下一代测序。
变性和封闭步骤可按本领域已知的标准、常规方法实施，但热循环杂交温育步骤是独特的。当用于本发明的杂交缓冲液时，杂交时间可减少至仅约25分钟。
本发明的方法和组合物使得技术人员可以通过，举例而言，缩短杂交流程，从而加快选择性捕获和靶核酸富集来克服本领域的问题。按照本文公开，本发明的方法和组合物几乎没有偏倚，并表现出良好的特异性、读数分布、序列覆盖范围以及用于下一代测序应用的可重复性。所述方法的一个实例包括如下步骤：
步骤1：在室温预温本发明的快速杂交缓冲液直至解冻并在室温保持直至准备好供使用。
步骤2：在室温设置封闭反应。向每12μL制备好的DNA样品(750-1500ng总DNA)中加入5μL封闭混合物。上下吹打混合。短暂离心。如果12μL样品 中的DNA超过1500ng，则使用更小的样品体积，并加入水至总体积为17μL的封闭反应。
步骤3：如下表所示设置SureCycler 8800热循环仪程序。开始程序并立即点击暂停(pause)按钮。这样做会在加热盖子的同时将封闭混合物加入至预先制备的基因组DNA片段文库中。
步骤4：点击开始(play)按钮恢复运行程序来在SureCycler 8800上实施加热程序。
循环程序：封闭和快速杂交温育
步骤5：当样品在SureCycler温育时，在冰上制备捕获诱饵混合物。
步骤6：稀释用于捕获的SureCycler RNA酶封闭剂：混合10μL RNA酶封闭剂(Agilent Technologies,Inc)和30μL水(1份RNA酶封闭剂:3份水)。
步骤7：通过根据下表加入稀释的SureSelect RNA酶封闭剂和SureSelectXT人全外显子V5诱饵(Agilent Technologies,Inc)至室温的快速杂交缓冲液中来制备杂交混合物。
V5外显子组杂交混合物  
组分 1个反应
1:3稀释的RNA酶封闭剂 2μL
SureSelectXT人全外显子V5诱饵 5μL
快速杂交缓冲液 6μL
全部 13μL
步骤8：当热循环达到处于65℃的第一杂交循环时，点击暂停按钮。此 时热循环仪保持在65℃。打开热循环仪盖并在每个相应的封闭反应中加入13μL杂交混合物。缓慢上下吹打8至10次将其混匀。此时杂交反应体积为30μL。
步骤9：用管帽封住管，关上盖，点击开始按钮来恢复程序，从而在热盖(hot top)激活的条件下运行循环杂交程序。
步骤10：制备磁珠(MyOne Streptavidin T1,Invitrogen)
1.在涡旋混合仪上猛烈重悬Dynal(Invitrogen)磁珠。Dynal珠在保存过程中会沉降。
2.针对每个杂交样品，加入50μL Dynal磁珠至管条/96孔板中。
3.冲洗磁珠： 
a.加入200μL SureSelect结合缓冲液(Agilent Technologies,Inc)。
b.通过上下吹打10次来混合磁珠。
c.将管子置于96孔磁性台。 
d.等待5分钟并清除和去掉上清。
e.重复步骤a至步骤d冲洗共三次。 
4.在200μL SureSelect结合缓冲液中重悬磁珠。
步骤11：利用链霉亲和素珠捕获杂交DNA。
1.温育后，将样品从热循环仪中移出并在室温短暂离心收集液体。将每个样品的全部杂交混合物加入相应的经冲洗的准备就绪的Dynal MyOneT1链霉亲和素珠溶液中，并上下倒置管条/板3至5次以混合。在章动器或摇床上室温温育杂交捕获/珠子溶液30分钟。确保样品在板中适当混合。
2.如下在65℃预温冲洗缓冲液#2：在96孔板中每孔等分200μL(每个杂交反应3个孔，用于3次冲洗)。盖好孔并当所述杂交样品在章动器或摇床上时利用热循环仪65℃温育30分钟。
3.30分钟后快速离心杂交-捕获/珠溶液。
4.在磁性分离器上分离珠子和缓冲液并除去上清。
5.在200μL冲洗缓冲液#1中上下吹打8-10次来重悬珠子，之后在高速涡旋混合仪上混合8秒。
6.冲洗珠子： 
a.在96孔磁性台上分离珠子和缓冲液1分钟并去除上清。
b.加入200μL预温的冲洗缓冲液#2。缓慢上下吹打10次来重悬珠子。 在上下吹打缓冲液时直接将缓冲液吹至成团的珠使其更快重悬。
c.将孔盖好。在具有热盖的热循环仪中以65℃温育样品10分钟。
d.重复步骤a至步骤c共3次冲洗。
e.确保冲洗缓冲液#2全部被去除。 
f.加入23μL不含核酸酶的水并涡旋5秒来重悬珠子，再进行PCR步骤。
步骤12：向每个23μL的结合捕获DNA的链霉素亲和性珠子样品中加入25μL SureSelectQXT Herculase II Master Mix(Agilent Technologies,Inc)。
步骤13：加入1μL合适的指示物，例如，两个P5i13或i14中的每一个和八个P7i1-i8中的一个(Agilent Technologies,Inc)。
步骤14：在SureCycler 8800上实施热程序。
捕获后PCR指示循环程序 
步骤15：AMPureXP珠的纯化
1.通过将管条/板放置在磁性台上2分钟来从捕获后的扩增反应中去除Dynal MyOneT1链霉亲和素珠子。之后将50μL PCR反应移至新管条/板。Dynal MyOneT1链霉亲和素珠子此时可弃去。
2.向每个捕获后扩增反应加入60μL均匀的AMPure XP珠子。通过剧烈上下吸吹20次将其混匀。检查并确保珠子均匀混合。所述珠子应该为均匀的同一颜色且不存在液体分层。
3.将管室温温育5分钟。
4.将管置于96孔磁性台上。等待5分钟使溶液澄清。不要干扰磁性台上的反应管。
5.小心除去澄清溶液。确保没有去除任何珠子。
6.继续将管保持在磁性台上，同时在每个样品孔中加入200μL 70％乙醇。
7.令70％乙醇静置1分钟使得任何受到干扰的珠下沉，之后去除乙醇。重复步骤6和步骤7一次使其共冲洗两次。确保尽可能多地去除乙醇。
8.在热循环仪上于37℃开盖干燥样品1-3分钟。不要过度干燥珠子。
9.加入25μL不含核酸酶的水。涡旋混匀。快速离心珠子并在室温温育2分钟。
10.将样品在96孔磁性台上放置2分钟直至溶液澄清。将25μL上清移至新的LoBind管。
此处有需要的话，实验可停止。在这种情况下，将板密封并在-20℃保存。
步骤16：利用2100Bioanalyzer High Sensitivity分析获取DNA样品。Bioanalyzer电泳分布应与图2-4相似。
步骤17:汇集样品用于多重测序。
可在单个测序道中多重化的指示物文库的数目取决于使用平台的输出规格以及实验设计所需的测序数据量。根据平台的容量和每个样品所需的测序数据量计算每道可合并的指示物数。
1.合并文库使得每个指示物标记的样品以等摩尔量存在于样品池(pool)中。对于每个文库，使用下列公式来确定使用的含指示物的样品的量。
其中V(f)是样品池的最终期望体积
C(f)是样品池中所有DNA的期望终浓度 
#是指示物数目，且C(i)是每个含指示物的样品的初始浓度。
下面的表格显示20μL终体积、10nM所需要的4个指示物标记的样品(不同浓度)及低TE的量的实例
2.调整汇集文库的最终体积至期望的终浓度。
4.用途
如上文所述，对于靶向的下一代测序技术而言，主要的瓶颈和限速步骤是在前端步骤中快速、节约成本地选择性捕获和富集散布在全基因组、线粒体和其他形式的DNA的靶外显子或靶内含子区域。上文公开的缓冲液使得技术人员可以更加快速地完成核酸杂交，从而加速整个靶向的下一代测序。
通常，捕获和扩增靶向的基因组DNA片段的流程如下：(1)从包含核酸的生物样品中提取DNA；(2)通过多种手段，包括机械、超声或酶的方式，断裂提取的DNA；(3)通过使DNA片段与具有互补DNA和/或RNA的探针或诱饵杂交，选择性地捕获靶向的DNA片段；(4)先洗掉未结合至杂交探针的DNA片段，而下一步中在适当条件下洗脱结合至杂交探针的DNA片段；(5)将捕获的DNA用于下游应用。
如果需要更大量的捕获DNA，可利用通用引物对实施聚合酶链式反应(PCR)来扩增捕获的DNA片段。具有特别设计的序列的通用DNA引物(也被称为衔接子或指示衔接子)在步骤(2)或步骤(4)之后被连接到所有DNA片段的5’-和3’-末端。或者，衔接子也可在步骤(2)中当提取的DNA被断裂时由装载了衔接子的转座酶来附接。详细的流程可见，例如，由Agilent Technologies,Inc.投入市场的SureSelect Target Enrichment SystemTM和US 20100029498。利用常规的杂交捕获流程，通常需要花费至少两天来完成步骤(1)-(4)。事实上，杂交步骤(例如，以上的步骤(3))本身通常花费的时间为约16小时至超过70小时。参见同上。
为捕获DNA片段，DNA和/或RNA诱饵/探针杂交发生于固体支持材料或液体溶液中。该捕获步骤(上述流程中的步骤3)对于整个流程是决定性的。捕获的特异性取决于杂交诱饵/探针的DNA或RNA序列。来自任何生物物种的基因组和线粒体DNA的任何预期区域的选择性捕获都需要节约成本且以较灵活的方式来实施杂交步骤。这些DNA和/或RNA诱饵/探针必须具有与感兴趣的生物物种基因组和线粒体DNA区域精确互补的序列。捕获容量(capacity)取决于可用于杂交的不同探针的数目和长度的组合。长度越长的探针需要越少的探针来覆盖相同的用于捕获的DNA区域。捕获的灵活性取决于探针生成的方式以及探针是置于固体支持材料还是混合在液体溶液中。这些 杂交DNA和/或RNA诱饵所具有选择性地捕获来自任何生物物种的全部外显子或外显子的任何子集，或基因组、线粒体和其他形式的DNA的任何期望的区域的整体容量和灵活性。为了在市场中具有竞争力，特异性、容量、灵活性和时效性需要以节约成本的方式来实现。
如本文公开的，核酸杂交选择性捕获步骤可在短至约1小时的时间期间内完成，因此，用于靶向的基因组DNA片段捕获和扩增的整个流程可在8小时内完成，相反地，在使用常规方式时花费两天或更多天。
5.试剂盒
本发明的另一方面中，提供了试剂盒，其包括上述探针组合物或其缓冲浓缩液、以及关于利用本文所述的组合物和方法实施杂交试验的使用说明。本公开的使用说明包括方法、组合物，或两者兼有。在一个实施方案中，试剂盒还包括具有如以上公开的一种或多种附加试剂的杂交组合物，且优选地，pH维持在例如pH6.0和11.0之间，且优选地采用具有在该pH范围内具有可用的缓冲能力的缓冲液。
所述组合物可被包装于瓶中，特别是包括可测量封口(measuring closure)的瓶子。该可测量封口提供了一种方便的方式来分配适当量的该组合物，特别是当将浓缩的组合物分配到较稀的溶液或混合物中时。优选地，所述瓶还包括回流斜槽，其可使组合物的分配更加容易且浪费或溢出更少。适合的瓶的非限制性实例描述于U.S.Pat.No.4,666,065、U.S.Pat.No.4,696,416和U.S.Pat.No.4,981,239中。
针对在靶向的下一代测序中的使用，试剂盒还可以进一步包括引物、接合体和其他用于系统中或与系统兼容的试剂以及由Agilent Technologies,Inc.,Illumina,Inc.,454Life Sciences,Life Technologies Corporation,Affymetrix,Inc及其他所提供的平台。为达到这个目的，一种或多种用于本文公开的方法和下一代测序的反应组分可以试剂盒的形式提供。在这种试剂盒中，适当量的一种或多种反应组分在一个或多个容器中提供或保持在基底上(例如，通过静电相互作用或共价键合)。
包含用于实施本文所述方法的试剂的试剂盒可以包括一种或多种上述组分。这些组分可以多种形式提供。举例而言，组分可悬浮于水溶液中或作为冷冻干燥或冻干的粉末、颗粒或珠子被提供。在后一种情况下，当复原时， 所述组分可形成完全的组分混合物供测定中使用。
试剂盒可以包含任何本文描述的组分的组合，它们的量至少足够一次测定，还可以进一步包括以具体形式记载的用于组分使用的使用说明。在一些应用中，一种或多种反应组分可以按照预先量好的单次使用量在单独的、通常是一次性的管或等同容器中提供。采用这样的安排，可将待富集以便确定靶核酸的存在的样品加入到单独的管中并直接实施扩增。试剂盒中提供的组分的量可以是任何适当的量，且依赖于产品针对的目标市场。确定适当的量的基本原则可见于，举例而言，Joseph Sambrook and David W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；and Frederick M.Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,2003。
本发明的试剂盒可包括用于实施本发明方法的任何数量的附加试剂或材料。这些材料包括，但不局限于：用于裂解细胞的试剂(包括缓冲液)或其他抑制不必要的核酸酶的试剂、用于确保反应组分作用正确的对照DNA、DNA断裂试剂(包括缓冲液)、扩增反应试剂(包括缓冲液、聚合酶和核苷酸)以及冲洗溶液。本发明的试剂盒可在任何温度提供。举例而言，对于包含在液体中的蛋白质组分或其复合物的试剂盒的保存，优选地在0℃以下提供和保持它们，优选地处于或低于-20℃，或以冷冻状态。
提供组分的容器可以是任何能够保持提供形式的常规容器，举例来说，微量离心管、安瓿、瓶、或积分检测装置，例如流体设备、盒、侧向流(lateral flow)，或其他类似装置。试剂盒可包括标记或未标记的用于富集或检测靶核酸的核酸探针/诱饵。在一些实施方案中，试剂盒还可以进一步包括用于在本文描述的任何方法中使用该组分的使用说明。典型的用于这样的试剂盒和系统的包装材料包括以多种组态中的一种(例如，在小瓶、微量滴定板孔、微阵列等中)保持反应组分或探针的固体基质(例如，玻璃、塑料、纸质、金属薄片、微粒子等)。
6.附加定义
“核酸”指DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)，或DNA或RNA类似物。DNA或RNA类似物可由核苷酸类似物合成。核酸分子可以是单链或双链，但优选为双链DNA。
本文所用的“诱饵”或“探针”序列指合成的长寡核苷酸或来自与感兴趣的 靶核酸互补的合成的长寡核苷酸(例如，由其生成)的寡核苷酸。在一些实施方案中，成套的诱饵序列来源于在微阵列中合成、裂解和从微阵列洗脱的寡核苷酸。在另一些实施方案中，诱饵序列通过核酸扩增方法生成，例如，利用人DNA或混合的人DNA样品集合作为模板。
诱饵序列优选地为长度为约70个核苷酸至1000个核苷酸的寡核苷酸，更优选地为长度为约100个核苷酸至300个核苷酸，更加优选地为长度为约130个核苷酸至230个核苷酸，且更加优选地为长度为约150个核苷酸至200个核苷酸。对于筛选外显子和短的靶，优选的诱饵序列长度是约40至1000个核苷酸的寡核苷酸，例如，100个至约300个核苷酸，更优选地约130个至约230个核苷酸，且更加优选的为约150个至约200个核苷酸的寡核苷酸。对于筛选与捕获诱饵的长度相比较长的靶如基因组区域，优选的诱饵序列长度的大小范围通常与用于上述短的靶的诱饵相同，不同之处在于无需仅为了最小化结合临近序列的目的而限制诱饵序列的最大长度。制备用于诱饵序列的较长寡核苷酸的方法为本领域公知。
如本文所用的术语“寡核苷酸”指短的多核苷酸，通常少于或等于300个核苷酸长(例如，长度为5至150个核苷酸，优选地为10至100个核苷酸，更优选地为15至50个核苷酸)。但是，本文所用的术语也意在包含更长或更短的多核苷酸链。“寡核苷酸”可与其他多核苷酸杂交，因此可作为探针用于检测多核苷酸，或作为引物用于延伸多核苷酸链。
在一些实施方案中，在诱饵序列组中的诱饵序列为RNA分子。由于RNA-DNA双倍体比DNA-DNA双倍体稳定，因此RNA分子优选地被用作诱饵序列，进而提供潜在的更好的核酸捕获。RNA诱饵序列可以利用任何本领域已知的方法合成，包括体外转录。如果采用生物素标记的UTP合成RNA，生成单链的生物素标记的RNA诱饵分子。在优选的实施方案中，RNA诱饵仅与双链DNA靶的一条链对应。本领域的技术人员会理解，这种RNA诱饵并非自身互补，因此作为杂交驱动者更加有效。在一些实施方案中，抗RNA酶的RNA分子由合成而来。这些分子及其合成为本领域公知。
本文所用的术语“靶核酸”或“靶”指包含待鉴定的靶核酸序列的核酸。靶核酸可以是单链或双链，且经常为DNA、RNA、DNA或RNA的衍生物及其组合。“靶核酸序列”、“靶序列”或“靶区域”意思是包括全部或部分单链核酸序 列的特定序列。靶序列可在核酸模板之内的任何形式的单链或双链核酸。模板可以是纯化的或分离的核酸，或未纯化或未分离的核酸。
靶或靶核酸通常在多核苷酸(通常为多核苷酸分析物)的一部分或全部中存在。对靶核苷酸序列的身份一般知晓到足以允许制备各种与靶材料可杂交的诱饵/探针序列的程度。靶材料通常包括约30至5000或更多个核苷酸，优选地50至1000个核苷酸，且更优选地200至500个核苷酸。靶材料通常是较大分子的一部分，或其可以基本上是整个分子，例如如上所述的多核苷酸。选择靶材料中核苷酸的最小数目来确保样品中靶多核苷酸的存在是样品中多核苷酸存在的特异性指标。靶材料中核苷酸的最大数通常由不同因素决定：其来源的多核苷酸长度、这种多核苷酸在分离过程中被剪切或其他过程破坏的可能性、制备用于分析的样品所需的任何流程(例如DNA模板转录为RNA)的效率，以及必要时靶核苷酸序列检测或/和扩增的效率。
本公开提供了多个数值范围。应该了解的是，也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，精确至下限单位的十分之一。每个在规定范围内任何规定值或中间值以及在该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的较小范围都包括在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括或排除在该范围内，且上下限之一或两者均不或两者均包含在较小范围内的各范围也包括在本发明之内，适用于在该规定范围中任何具体排除的限度。当记载的范围包括一个或两个界限的情况下，排除了这些界限之一或二者的范围也包括在本发明之内。
术语“约”通常指加上或减去标示数字的10％。举例而言，“约20”可以表明18至22的范围，且“约1”可以意为“0.9-1.1”。其它的“约”的意思可从文中显而易见，如四舍五入，因此例如“约1”可以意为0.5至1.4。
本文所用术语“接触”及其变形，当指任何成分的组合时，包括任何使得待接触的组分混入同一混合物(举例而言，被加入到相同腔室或溶液中)，且无须所述组分间的实际物理接触的过程。所述组分可以按任何顺序或任何组合(或子组合)进行接触，且包括一种或一些所述组分随后从混合物中顺序去除，任选地在添加其他所述的组分之前去除的情况。举例而言，“使A与B和C接触”包括下列任何或全部情形：(i)A与C混合，之后将B加入到该混合物中；(ii)A和B混合成混合物；B从该混合物中除去，之后将C加入到该混合物中；以及(iii)将A加入到B和C的混合物中。“使模板接触反应混合物” 包括以下的任何或全部情形：(i)将模板与反应混合物的第一组分接触，从而产生混合物，之后以任何顺序或组合将其他反应组合物加入至该混合物中；以及(ii)反应混合物在与模板混合之前已完全形成。
7.实施例
本实施例中，上述的杂交缓冲液和方法用于选择性捕获和富集来自人基因组DNA的靶外显子区域，用于靶向的下一代测序分析。
简言之，人基因组DNA(gDNA)样品采用本领域已知的方法断裂及末端修饰。之后，利用断裂和末端修饰的gDNA通过杂交和扩增实施靶富集。为达到这个目的，采用常规的钠基杂交缓冲液和两种镁基杂交缓冲液(A)和(B)进行比较。钠基杂交缓冲液包括5X SSPE、5X Denhardt’s、5mM EDTA和0.1％SDS。缓冲液(A)包括308mM MgCl2.6H2O和20mM Tris(pH 8)。缓冲液(B)与缓冲液(A)的不同之处仅在于缓冲液(B)还包括0.00834％HPMC。每种缓冲液通过与适当量的浓缩物和DNAs以及RNA诱饵混合由5X杂交缓冲液浓缩液制备。用于缓冲液(B)的5X缓冲液浓缩包括1540mM MgCl2.6H2O、0.0417％HPMC、以及100mM Tris(pH 8)。
杂交采用常规恒温(65℃)温育24小时或1小时，或者采用两种温度(65℃和37℃)循环温育1小时。两温度循环温育的程序如下表所示。
循环程序：封闭和快速杂交
之后分析来自杂交的捕获DNA的样品，根据制造商的指导使用DNA1000测定法(Agilent Technologies,Inc.)在2100Bioanalyzer上运行1μl的每个样品。Bioanalyzer电泳图如图1-4所示。
如图1所示，当采用常规的钠基杂交缓冲液以及恒温温育时，与1小时温育之后捕获的gDNA相比，24小时温育后捕获的gDNA的量高得多。这些 结果表明，当使用常规的钠基杂交缓冲液时，需要较长的温育时间(如24小时)以获得满意的DNA样品，较短的时间并不理想。
相反的是，当采用快速镁基杂交缓冲液(A)和两温度循环温育时，1小时杂交获得的捕获gDNA的量相当于甚至高于用常规钠基杂交缓冲液温育24小时后所获得的捕获gDNA的量。参见图2。这些结果表明缓冲液(A)和循环温育步骤比较高效。
事实上，当杂交1小时时，缓冲液(A)与常规钠基杂交缓冲液相比产生的捕获gDNA多得多。并且，当两温度循环温育与常规钠基杂交缓冲液组合使用时，同样可以提高捕获的gDNA量，但程度不如快速的镁基杂交缓冲液。参见图3。
更加令人惊讶的是，当杂交中包含HPMC时，捕获甚至更多gDNA。如图4所示，与使用常规钠基缓冲液在温育24小时之后所获得的捕获gDNA的量相比，使用包含HPMC的缓冲液(B)的两温度循环温育1小时导致的捕获gDNA的量几乎是其3倍。比较图2和4。这些结果表明，HPMC进一步提高了捕获效率。
将上述杂交缓冲液和温育程序捕获和富集的基因组DNA用于下一代测序分析中。所得到的性能参数(中靶率、重复率和覆盖率)列于如图5所示的表中。可以发现，对于使用快速镁基杂交缓冲液(B)和两温度循环温育所捕获的gDNA，其性能参数与通过常规方法所捕获的gDNA相当，或者优于通过常规方法所捕获的gDNA。
应该接受的是前文提到的优选的实施方案的实施例和说明书是说明性的，而不是限制权利要求所限定的本发明。如已经知道的，上面所述的许多特征的变化和组合可在不脱离权利要求所述的本发明情况下进行使用。这些变化并非认为脱离本发明的范围，且所有这些变化应被包括于所附权利要求的范围之内。本文引用的所有参考文献都以全文并入本文。

Claims (10)

1.用于核酸杂交的组合物，其包含浓度为约100mM至约600mM的二价阳离子盐、以及缓冲剂，其中所述盐和所述缓冲剂以约2.5:1至约60:1的摩尔比存在。
2.权利要求1所述的组合物，其还包含浓度为约0.002％至约15％w/w的体积-排除/增稠作用剂。
3.权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂具有约10mM至约40mM的浓度。
4.权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述二价阳离子选自：镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子和镉离子。
5.权利要求2-4中任一项所述的组合物，其中所述体积-排除/增稠作用剂选自：羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟基甲基纤维素。
6.权利要求2-5中任一项所述的组合物，其中所述体积-排除/增稠作用剂选自：葡聚糖和聚乙二醇(PEG)。
7.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂选自：Tris、HEPES、TAPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸、Bis-Tris、NaOH、KOH、TES、EPPS和MOPS。
8.用于制备杂交溶液的缓冲浓缩物，其通过2倍至20倍范围的稀释产生权利要求1-7中任一项所述的组合物。
9.用于核酸杂交的试剂盒，其包含权利要求1-8中任何一项所述的组合物或缓冲浓缩物及其包装材料。
10.用于靶核酸与诱饵核酸的核酸杂交的方法，其包括：
用权利要求1-7中任一项所述的组合物接触靶核酸和诱饵核酸来形成杂交混合物；
在第一温度使所述杂交组合物变性第一时段；
在第二温度封闭所述混合物第二时段；
(i)在第三温度温育所述混合物第三时段进而(ii)在第四温度温育所述混合物第四时段，及
重复所述温育步骤一次或多次。
CN201510037254.5A 2014-01-29 2015-01-23 用于下一代测序靶富集的快速杂交 Active CN104805180B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/167,513 2014-01-29
US14/167,513 US9587268B2 (en) 2014-01-29 2014-01-29 Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104805180A true CN104805180A (zh) 2015-07-29
CN104805180B CN104805180B (zh) 2020-02-11

Family

ID=52464153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510037254.5A Active CN104805180B (zh) 2014-01-29 2015-01-23 用于下一代测序靶富集的快速杂交

Country Status (4)

Country Link
US (2) US9587268B2 (zh)
EP (5) EP3252172A3 (zh)
JP (1) JP2015180193A (zh)
CN (1) CN104805180B (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI721929B (zh) 2013-08-05 2021-03-11 美商扭轉生物科技有限公司 重新合成之基因庫
WO2016126987A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
IL258164B (en) 2015-09-18 2022-09-01 Twist Bioscience Corp Methods to regulate the activity of proteins and cells and a method for the production of nucleic acids
WO2017053450A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
CN108603307A (zh) 2015-12-01 2018-09-28 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
WO2018038772A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized nucleic acid libraries
JP6871364B2 (ja) 2016-09-21 2021-05-12 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 核酸に基づくデータ保存
EA201991262A1 (ru) 2016-12-16 2020-04-07 Твист Байосайенс Корпорейшн Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез
KR102591300B1 (ko) * 2016-12-19 2023-10-20 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 분석을 위한 샘플 웰 내로의 분자의 로딩
SG11201907713WA (en) 2017-02-22 2019-09-27 Twist Bioscience Corp Nucleic acid based data storage
EP3595674A4 (en) 2017-03-15 2020-12-16 Twist Bioscience Corporation BANKS OF VARIANTS OF IMMUNOLOGICAL SYNAPSE AND THEIR SYNTHESIS
CN111566209A (zh) 2017-06-12 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 无缝核酸装配方法
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
US11407837B2 (en) 2017-09-11 2022-08-09 Twist Bioscience Corporation GPCR binding proteins and synthesis thereof
KR20240024357A (ko) 2017-10-20 2024-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
JP7054133B2 (ja) * 2017-11-09 2022-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 配列解析方法、配列解析装置、参照配列の生成方法、参照配列生成装置、プログラム、および記録媒体
US10936953B2 (en) 2018-01-04 2021-03-02 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage with sidewall electrodes
KR20210013128A (ko) 2018-05-18 2021-02-03 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 하이브리드화를 위한 폴리뉴클레오타이드, 시약 및 방법
GB201809627D0 (en) * 2018-06-12 2018-07-25 Biorelevant Com Ltd Methods for preparing buffer solutions suitable for in vitro drug dissolution testing, drug solubility testing and/or drug profiling
JP2021528646A (ja) * 2018-06-22 2021-10-21 ソマロジック・インコーポレーテッド 改良されたプロテオミクスマルチプレックスアッセイ
AU2020229349A1 (en) 2019-02-26 2021-10-14 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
SG11202109283UA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Twist Bioscience Corp Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation BARCODE-BASED NUCLEIC ACID SEQUENCE ARRANGEMENT
GB201914325D0 (en) 2019-10-04 2019-11-20 Babraham Inst Novel meethod
AU2021303154A1 (en) 2020-07-01 2023-01-05 Illumina, Inc. Nucleic acid capture, concentration, and purification
CN112375809A (zh) * 2020-11-19 2021-02-19 天津莱贝生物科技有限公司 一种杂交捕获试剂盒及利用该试剂盒进行杂交捕获的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766064A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit
EP1510577A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-02 Qiagen GmbH Method for magnetic bead isolation of nucleic acids
CN102084004A (zh) * 2008-05-27 2011-06-01 丹麦达科有限公司 杂交组合物和方法
WO2013046033A1 (en) * 2011-09-30 2013-04-04 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4696416A (en) 1984-09-28 1987-09-29 The Procter & Gamble Company Liquid product dispensing package with self draining feature employing drip concentrator
US4666065A (en) 1986-06-30 1987-05-19 The Procter & Gamble Company Liquid measuring and pouring device
US4886741A (en) * 1987-12-09 1989-12-12 Microprobe Corporation Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization
US4981239A (en) 1989-01-03 1991-01-01 The Procter & Gamble Company Container having a drain-back spout
GB9114180D0 (en) 1991-07-01 1991-08-21 Amersham Int Plc Enhancement of polynucleotide hybridisation
US5705366A (en) * 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
JP3911340B2 (ja) * 1998-04-08 2007-05-09 誠 鶴岡 オリゴヌクレオチドおよびベロ毒素遺伝子の検出試薬
EP1469009A2 (en) * 1998-05-21 2004-10-20 Isis Parmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides
JP2002515514A (ja) * 1998-05-21 2002-05-28 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの局所送逹のための組成物及び方法
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
US6261218B1 (en) * 1998-12-01 2001-07-17 The Dow Chemical Company Process and apparatus for making low molecular weight cellulose ethers
ES2225264T3 (es) * 1999-11-12 2005-03-16 Clinical Micro Sensors, Inc. Tecnicas de aceleracion de union para la deteccion de analitos.
US6977161B2 (en) * 2000-10-14 2005-12-20 Eragen Biosciences, Inc. Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
AU8033401A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Ascendia Ab Dna/rna-embedding medium and method of use
CN100385013C (zh) * 2000-10-14 2008-04-30 伊拉根生物科学公司 使用非标准碱基的固相支持体分析系统和方法
JPWO2002044708A1 (ja) 2000-11-29 2004-04-02 科学技術振興事業団 核酸の分析方法
US7189509B2 (en) * 2001-08-16 2007-03-13 Zhifeng Shao Analysis of gene expression profiles using sequential hybridization
CN100519758C (zh) 2002-09-20 2009-07-29 新英格兰生物实验室公司 核酸的解旋酶依赖性扩增
EP1403379A1 (en) * 2002-09-24 2004-03-31 QIAGEN GmbH Enhanced coamplification of nucleic acids
US7955795B2 (en) 2003-06-06 2011-06-07 Qiagen Gmbh Method of whole genome amplification with reduced artifact production
DE602004024034D1 (de) 2003-01-29 2009-12-24 454 Corp Nukleinsäureamplifikation auf basis von kügelchenemulsion
US7741033B2 (en) * 2003-05-13 2010-06-22 Trustees Of Boston College Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
US8426126B2 (en) 2004-03-18 2013-04-23 Applied Biosystems, Llc Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification
US20080226705A1 (en) * 2004-03-31 2008-09-18 Soltero Richard A Gel delivery system for oral administration of medicaments
US8911942B2 (en) * 2004-05-20 2014-12-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Single label comparative hybridization
EP1771476B1 (en) 2004-07-23 2014-12-10 Genentech, Inc. Crystallization of anti-vegf antibodies
US7867703B2 (en) 2004-08-26 2011-01-11 Agilent Technologies, Inc. Element defined sequence complexity reduction
US7618777B2 (en) 2005-03-16 2009-11-17 Agilent Technologies, Inc. Composition and method for array hybridization
WO2007081841A2 (en) 2006-01-06 2007-07-19 Stratagene California Reaction buffer composition for nucleic acid replication with packed dna polymerases
US20080171665A1 (en) * 2006-05-24 2008-07-17 Minor James M Programmed changes in hybridization conditions to improve probe signal quality
US20080207960A1 (en) 2007-02-28 2008-08-28 Eric Lin Methods, compositions, and kits for post-hybridization processing of arrays
JP2011502151A (ja) 2007-10-31 2011-01-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 蒸気拡散環境における結晶化条件のハイスループットスクリーニングのための装置及び方法
WO2009093409A1 (ja) * 2008-01-21 2009-07-30 Tokyo University Of Agriculture And Technology 新規マイコウイルス、植物病害真菌弱毒菌株、植物病害防除剤、マイコウイルス生産方法、植物病害真菌弱毒化方法、並びに植物病害防除方法
WO2009099602A1 (en) 2008-02-04 2009-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Selection of nucleic acids by solution hybridization to oligonucleotide baits
JP2009284783A (ja) * 2008-05-27 2009-12-10 Fujifilm Corp ハイブリダイゼーション用溶液の調製方法
US20110172105A1 (en) * 2008-06-04 2011-07-14 Salk Institute For Biological Studies GREPSEQ: An Almost Inexhaustible, Cost-Effective, High-Throughput Protocol for the Generation of Selector Sequences
US20090318305A1 (en) 2008-06-18 2009-12-24 Xi Erick Lin Methods for selectively capturing and amplifying exons or targeted genomic regions from biological samples
JP2010284159A (ja) * 2009-05-12 2010-12-24 Mitsubishi Rayon Co Ltd 特異性の高いプローブと、それを用いた核酸アレイ、及びその製造方法
US20130040294A1 (en) 2009-12-02 2013-02-14 Steen H. Matthiesen Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CA2877236C (en) * 2012-06-20 2021-03-09 Toray Industries, Inc. Method for detecting nucleic acid and nucleic acid detection kit
DK2872629T3 (da) * 2012-07-03 2019-12-09 Integrated Dna Tech Inc Tm-forstærkede blokeringsoligonukleotider og lokkemidler til forbedret target-berigesle og reduceret off-target-udvælgelse
CN111394444A (zh) * 2013-09-13 2020-07-10 生命技术公司 使用凝聚核酸颗粒的装置制备

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766064A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit
EP1510577A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-02 Qiagen GmbH Method for magnetic bead isolation of nucleic acids
US20080132694A1 (en) * 2003-08-29 2008-06-05 Ralf Himmelreich Method For Facilitating an Automated Isolation of a Biopolymer Using Magnetic Particles
CN102084004A (zh) * 2008-05-27 2011-06-01 丹麦达科有限公司 杂交组合物和方法
WO2013046033A1 (en) * 2011-09-30 2013-04-04 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GANG YAO等: "Molecular-beacon-based array for sensitive DNA analysis", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
RICHARD OWCZARZY等: "Predicting Stability of DNA Duplexes in Solutions Containing Magnesium and Monovalent Cations", 《BIOCHEMISTRY》 *
孙军主编: "《医学生物化学与分子生物学实验》", 30 April 2008, 武汉：华中科技大学出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104805180B (zh) 2020-02-11
JP2015180193A (ja) 2015-10-15
EP3252172A2 (en) 2017-12-06
EP3252172A3 (en) 2018-02-21
EP2902504A1 (en) 2015-08-05
US10093962B2 (en) 2018-10-09
US9587268B2 (en) 2017-03-07
EP3441480A1 (en) 2019-02-13
US20160017405A1 (en) 2016-01-21
US20150211047A1 (en) 2015-07-30
EP3581661A1 (en) 2019-12-18
EP3456845A1 (en) 2019-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104805180A (zh) 用于下一代测序靶富集的快速杂交
US11396672B2 (en) Composition and methods for detecting adenosine modifications
WO2016014409A1 (en) Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US20220389498A1 (en) Methods of producing nucleic acid libraries
KR20220044681A (ko) 샘플내 하나 이상의 표적 핵산 분석물을 검출하기 위한 키트, 및 이를 제조 및 이용하는 방법
Mukherjee et al. RNA immunoprecipitation to identify in vivo targets of RNA editing and modifying enzymes
CN107075584A (zh) Bcr‑abl抑制剂抗性相关突变的检测方法及使用该检测方法用于预测bcr‑abl抑制剂抗性的数据获得方法
US20230332215A1 (en) Methods for barcoding macromolecules in individual cells
JP2021104046A (ja) ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中検体から核酸を単離する方法
TW200404889A (en) Method of typing gene polymorphisms
US11254982B2 (en) Osmiumtetroxide-based conversion of RNA and DNA containing thiolated nucleotides
Simon et al. Principles and practices of hybridization capture experiments to study long noncoding RNAs that act on chromatin
JP2017175953A (ja) Ｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子検出用プローブ、ｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子検出用プローブセット、ｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子の検出方法及びｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子検出用キット
KR102441122B1 (ko) 폴리머라제 활성 측정 방법
JP2013532982A (ja) 任意の種類の注目される核酸配列に結合するタンパク質を単離するための新規な方法
JP2008507263A (ja) 単一の反応槽において処理される生体試料中に存在する、標的の核酸の標識及び精製方法
CA3167021A1 (en) Hybridization capture methods and compositions
WO2023239805A1 (en) In situ nucleic acid analysis using probe pair ligation
CN117925782A (zh) 一种用于核酸杂交的组合物及其应用
Ishizuka et al. Clipping of Telomere from Human Chromosomes Using a Chemistry‐Based Artificial Restriction DNA Cutter

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant