KR102441122B1 - 폴리머라제 활성 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 프라이머가 결합된 주형 DNA의 Tm 값 측정을 통해 폴리머라제의 활성에 대한 간단하면서도 정확하고 재현성있는 결과값을 얻을 수 있다. 따라서 본원에 따른 방법은 폴리머라제를 표적으로하는 항바이러스제, 또는 항박테리아제의 개발을 위해 예를 들면 화합물 라이브러리와 같은 대량의 화합물을 동시에 적용하여 단시간에 최적의 치료제 또는 치료제 후보물질을 선별할 수 있다.

Description

폴리머라제 활성 측정 방법 {Method for measuring polymerase activity}

본원은 폴리머라제 활성 측정과 관련된 기술이다.

폴리머라제는 바이러스, 박테리아, 진핵세포에서 발견되는 DNA 또는 RNA를 합성하는 효소이다.

폴리머라제는 세포의 증식을 위해 필수적인 효소로서, 박테리아 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 항바이러스, 항박테리아제를 개발을 위해, 폴리머라제 활성 억제제를 개발하고자 하는 노력이 이어져 왔다.

예를 들면 방사선 동위원소로 표지된 프라이머를 template에 결합시킨 후, 분석이 필요한 폴리머라제를 첨가하여 dNTP 편입 반응을 수행하여, 증가된 프라이머의 길이를 젤 분석을 통해 확인하는 방법이 있다(J Biol Chem. 1997 Oct 31;272(44):27919-30). 하지만 이는 방사선 동위원소와 복잡한 젤 분석이 필요한 단점이 있다. 또 다른 기술은 Activated Calf thymus DNA (DNase를 처리하여 nick과 gap이 발생한 Calf thymus DNA)를 방사선으로 표지된 dNTP 및 DNA 폴리머라제와 함께 반응시켜 편입된 dNTP의 양을 방사능 계측기(Scintilation counter)로 측정하는 방법이다. 하지만 방사선 동위원소의 사용과 계측기가 필요한 단점이 있다(J Virol. 1973 Nov;12(5):995-1005). 또 다른 기술은 DNA의 염기 사이에 끼어들어가는 염색약(intercalating dye)을 이용하여 복제된 dsDNA의 양을 측정하는 방법이나 측정 장비에 따라 편차가 커서 논문과 달리 실제 이용이 어려운 단점이 있다(J Virol. 1973 Nov;12(5):995-1005).

하지만 상기 방법은 단계가 복잡하고, 낮은 재현성을 인해, 약물 개발 등을 위해 대용량(high throughput) 스크리닝에 적합하지 않다. 따라서 측정방법이 간단하고, 사용방법에 있어 편리하며, 재현성이 높으면서도 대용량 약물 스크리닝에 적합한 폴리머라제 활성 측정 방법이 필요하다.

본원은 폴리머라제에 의해 합성되는 DNA의 Tm (융해온도, melting temperature) 변화를 통해, 특정 물질이 폴리머라제 활성을 갖고 있는지 여부를 판단할 수 있으며, 또한 정확하고 재현성 있게 폴리머라제의 활성의 정량적인 측정이 가능하다는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 인비트로에서 폴리머라제 활성이 있는지 여부의 판단 또는 활성 측정이 필요한 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성을 판단하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 단일가닥 DNA 주형의 3‘ 말단부터 시작해서 그 일부에 프라이머가 결합된 주형-프라이머 기질을 제공하는 제 1 단계; 상기 주형-프라이머 기질에 DNA 폴리머라제 활성의 판단이 필요한 시험 물질을 추가하고, dNTP의 존재 중에서 일정시간 동안 상기 기질의 상기 프라이머의 3‘ 말단으로부터 DNA 합성 반응을 수행하는 제 2 단계로, 상기 DNA 합성에 의해 상기 주형에 상보적인 dNTP가 상기 기질에 편입되어 이중가닥 DNA가 생성되고, 상기 생성된 이중가닥 DNA의 Tm (melting Temperature)를 측정하는 제 3 단계; 및 상기 Tm이 상기 시험 물질을 포함하지 않는 대조군과 비교하여 증가하는 경우, 상기 시험 물질을 DNA 폴리머라제 활성이 있는 것으로 판단하는 제 4 단계를 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서, 상기 제 4 단계 대신에 또는 이에 추가하여, 상기 Tm을 Tm에 따른 dNTP 합성량 표준 곡선에 대입하여, 상기 이중가닥으로 편입된 dNTP양을 측정하는 단계로, 상기 편입된 dNTP의 양은 시험물질의 폴리머라제의 활성 정도와 비례하는 것으로, 폴리머라제 활성의 정량 측정이 가능하다.

본원에 따른 일 구현예에서, 단일가닥 DNA 주형의 길이는 20nt 초과 50nt 미만이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 단일가닥 DNA 주형의 GC 비(ratio)는 65%이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 단일가닥 DNA 주형 길이 대 상기 프라이머의 길이의 비는 2:1이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 단일가닥 DNA 주형에 결합하는 상기 프라이머의 길이는 15 내지 30nt 내지 이고, 상기 단일가닥 DNA 주형의 GC 비(ratio)는 65% 이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 방법에 사용되는 주형 DNA의 서열은 CC TCC TGA GCG CAA GTA CTC CGT GTG GAT CGG CGG CTC CA로 표시되고, 상기 프라이머 DNA 서열은 TGG AGC CGC CGA TCC ACA CG; 또는 TGG AGC CGC CGA TCC ACA CGG AGT ACT TGC로 표시된다.

본원에 따른 폴리머라제 활성 측정 방법은 프라이머가 결합된 주형 DNA의 Tm 값 측정을 통해 폴리머라제의 활성 여부 또는 특정 조건에서 폴리머라제의 증폭 효율을 간단하게 측정 가능하여, 형광값의 세기를 측정하는 직접적인 방법과 비교하여, 방법에 사용되는 실시간 PCR 장비의 종류 및 해당 장비의 well 간 신호값 차이에 상관없이 보다 정확하고 재현성있는 결과값을 얻을 수 있다. 또한, Tm 값의 수치로 편입된 dNTP의 양을 계산 가능함으로써 보다 정량적인 측정이 가능하다는 장점이 있었다.

따라서 본원에 따른 방법은 예를 들면 폴리머라제를 표적으로하는 항바이러스제, 또는 항박테리아제의 개발을 위해 예를 들면 화합물 라이브러리와 같은 대량의 화합물을 동시에 적용하여, 폴리머라제의 활성을 억제하는 치료제 개발을 위해 단시간에 최적의 치료제 또는 치료제 후보물질을 선별할 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 폴리머라제 활성을 측정하는 모식도이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 방법에서 연장된 프라이머 길이에 따른 Tm 값 차이를 나타내는 결과이다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따른 방법에서 Tm 측정 그래프 (A) 및 Tm에 따른 합성된 DNA 양에 대한 그래프이다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따른 방법에서 Klenow 폴리머라제 활성 측정 결과이다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 방법에서 nTaq 폴리머라제 활성 측정 결과이다.
도 6은 본원의 일 구현예에 따른 방법에서 Klenow 폴리머라제 (A)와 nTaq 폴리머라제 (B)에 대한 활성 측정 결과 그래프이다.
도 7은 본원의 일 구현예에 따른 방법에서 Swine pol B에 대한 폴리머라제 활성 측정 결과이다.

본원은 폴리머라제에 의해 합성되는 DNA의 Tm (융해온도, melting temperature) 변화를 통해, 특정 물질이 폴리머라제 활성을 갖고 있는지 여부를 판단할 수 있으며, 또한 정확하고 재현성 있게 폴리머라제의 활성의 정량적인 측정이 가능하다는 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성을 판단하는 방법으로, 상기 방법은 단일가닥 DNA 주형의 3‘ 말단부터 시작해서 그 일부에 프라이머가 결합된 주형-프라이머 기질을 제공하는 제 1 단계; 상기 주형-프라이머 기질에 DNA 폴리머라제 활성의 판단이 필요한 시험 물질을 추가하고, dNTP의 존재 중에서 일정시간 동안 상기 기질의 상기 프라이머의 3‘ 말단으로부터 DNA 합성 반응을 수행하는 제 2 단계로, 상기 DNA 합성에 의해 상기 주형에 상보적인 dNTP가 상기 기질에 편입되어 이중가닥 DNA가 생성되고, 상기 생성된 이중가닥 DNA의 Tm (melting Temperature)를 측정하는 제 3 단계; 및 상기 Tm이 상기 시험 물질을 포함하지 않는 대조군과 비교하여 증가하는 경우, 상기 시험 물질을 DNA 폴리머라제 활성이 있는 것으로 판단하는 제 4 단계를 포함한다.

도 1은 본원 방법의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다. 단일가닥 DNA 주형의 3‘ 말단부터 시작해서 일부에 프라이머가 결합된 부분적 이중가닥 형태인 주형-프라이머 DNA로 이루어진 기질의 프라이머 3’ 말단에 폴리머라제에 의해 dNTP가 순차적으로 연결되어, 주형의 염기에 상보적인 dNTP가 편입되어 DNA 가닥으로 연결되면서 DNA가 합성되고, 합성된 DNA 가닥은 이중가닥(dsDNA)이 된다. 그 결과 주형-프라이머 DNA의 dsDNA 부분이 증가하게 되며, 이렇게 합성에 의해 생성되는 이중가닥 DNA의 Tm을 실시간 PCR 등의 장비를 이용하여 측정하게 되면 dsDNA의 길이가 증가함에 따라 Tm도 증가하는 원리이다. 이때 증가된 Tm 값에 따라 폴리머라제의 활성이 있는지 여부 또는 주형-프라이머에 편입된 dNTP의 양의 계산을 통해 폴리머라제의 활성 정량적 측정 또한 가능하다.

정량적 측정은 예를 들면 일정량의 폴리머라제 활성의 판단이 필요한 시험물질 예를 들면 2 ng을 사용한 경우 시험물질을 첨가하지 않은 대조군의 경우에 비해 Tm 변화하고, 이 경우, Tm이 69도에서 72도로 증가하는 경우, 도 3의 B에 나타낸 것과 같은 Tm에 따른 dNTP 합성량 표준 곡선에 대입하면 약 25 pmol의 dNTP가 프라이머의 3‘에 연결되었다고 계산해낼 수 있다. (계산식: 9.9968 x Tm(72도) -694.19 = 25.5796) 이때 총 5 pmol의 기질을 사용하였으므로 이를 다시 5로 나누면 하나의 기질 당 평균적으로 약 5 nt의 dNTP가 연결되었다는 것을 계산해 낼 수 있다. 동일한 방법으로, 5 ng의 효소를 첨가한 경우 Tm 값이 76.25도로 증가하였으며 이는 약 78 pmol의 dNTP 가 3’ 말단에 연결되었다고 계산해낼 수 있다. 이렇게 계산된 dNTP의 연결량을 첨가한 효소량과 함께 그래프로 나타낸 결과가 도 7에 나타나 있다. 시험물질의 양이 증가한 경우 dNTP 편입도 증가하였기 때문에, 서로 상이한 시험 물질의 폴리머라제의 활성 정도도 이런 방식으로 정량적으로 확인 할 수 있다.

본원에서 Tm에 따른 dNTP 합성량 표준 곡선이란 폴리머라제 활성 시험에 사용될 기질과 동일한 기질을 사용하여 다음과 같은 식으로 작성될 수 있다.

예를 들면 도 3의 B는 (실시예 1)을 참조하여 설명하면, 이를 위해 폴리머라제를 포함하지 않는 반응액에 [주형 40 + 프라이머 20]을 넣고 Tm을 측정하였으며, 이 결과는 도 3의 A의 핑크색 그래프로 나타냈다. 실험 결과 이의 Tm은 69.5도로 측정되었고. 향후 실험에서 [주형 40 + 프라이머 20]가 기질로 사용되는 경우, 도 3의 B 그래프에서 69.5도는 dNTP 합성이 전혀 없는 0 (Y 축)로 표시되었다. 다음으로 [주형 40 (동일) + 프라이머 30]을 섞은 반응액을 준비하고 Tm을 측정한다. 이 결과는 도 3의 A의 파란색 그래프이며 Tm은 75도로 측정되었다. [주형 40 + 프라이머 30]은 [주형 40 + 프라이머 20]과 서열이 완벽히 동일하면서 프라이머의 3‘ 쪽으로 정확히 10 nt 길어진 기질이다. 따라서 [주형 40 + 프라이머 20]을 기질로 사용할 경우 해당 기질의 프라이머 20의 3’에 10 nt가 길어진 반응물을 대신하는 표준 시료가 된다. 총 기질이 5 pmol 사용되었기 때문에 10 nt * 5 pmol = 50 pmol dNTP 편입을 나타낸다. 따라서 도 3의 B에 X 축 74.5도에 Y 축 50 pmol dNTP로 표시되었다. 마지막으로 [주형 40 + 프라이머 40]을 섞은 반응액을 준비하고 Tm을 측정하였다. 실험 방법은 [주형 40 + 프라이머 30]과 완전히 동일하고, 실험 결과 Tm 이 79.5도로 측정되었으며 [주형 40 + 프라이머 20]를 기질로 설정할 경우 여기에서 20 nt가 길어진 경우에 해당하기 때문에 20 nt * 5 pmol = 100 pmol dNTP incorporation이 되어서 도 3의 B의 X 축 79.5도 Y 축 100 pmol에 표시하였다. 이와 같은 과정을 통해 도 3의 B 표준 곡선을 작성하였다(y = 9.6668x -694.19).

또한 본원에 따른 방법은 DNA 폴리머라제 활성 여부의 판단이 필요한 시험 물질이 폴리머라제의 활성을 갖는지 여부의 판단에 사용된다. 이러한 시험 물질은 DNA 폴리머라제의 활성 여부의 판단이 필요한 생물학적 물질로, 예를 들면 특정 박테리아에 추출된 단백질 성분의 물질이다. 예를 들면, 기능이 알려지지 않은 유전자의 생화학적 활성이 무엇인지 판단하기 위해 폴리머라제 활성 측정법을 사용할 수 있다. 이 경우, 기능이 알려지지 않은 유전자를 포함하는 박테리아 추출물, 박테리아를 파쇄하여 컬럼크로마토그래피로 분획한 산물, 다단계 컬럼크로마토그래피로 95% 이상 순수하게 분리한 단백질 등이 사용될 수 있다. 특정 유전자와 해당 유전자 유래 단백질의 폴리머라제 활성의 연관성을 보다 설득력있게 설명하기 위해서 해당 유전자를 대장균에 도입하여 재조합 단백질을 정제한 뒤 폴리머라제 활성을 측정하는 방법을 사용하기도 한다.

또한 특정 바이러스가 폴리머라제를 보유하고 있는지 확인할 때에도 본 측정법을 사용할 수 있다. 해당 바이러스에 감염된 세포(박테리아, 동물, 또는 인체 유래물)를 감염되지 않은 세포와 함께 준비한 뒤, 해당 세포의 파쇄액, 파쇄액을 동일한 조건하에서 컬럼크로마토그래피로 분획 산물을 상호 비교하였을 때, 바이러스에 감염된 세포 추출물에서 감염되지 않은 세포 추출물에 비해 폴리머라제 활성이 높게 측정된다면 해당 바이러스는 폴리머라제 유전자 및 유전자 유래 단백질을 보유하고 있을 것이라고 판단할 수 있다.

또한 본원에 따른 방법은 앞서 언급한 바와 같이, 활성이 있는지 없는지 여부 판단에 추가하여, 또는 이 대신에, 폴리머라제 활성을 정량적으로 판단하는데 사용될 수 있다. 이중가닥으로 편입된 dNTP의 양은 폴리머라제 활성의 판단 또는 측정이 필요한 시험 물질의 폴리머라제의 활성 정도와 비례하기 때문에, 편입된 dNTP의 양을 계산할 수 있으며, 그 결과 동일한 농도의 상이한 시험물질을 이용하여 동일한 시간동안 진행된 합성반응에서 편입된 dNTP의 양에 따라 정량적 비교가 가능하다.

본원에서 “폴리머라제는” DNA 폴리머라제를 의미하며, 폴리머라제는 주형에 결합된 프라이머의 3‘ 말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드를 추가하는 방식으로 DNA를 복제하는 효소를 일컫는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “폴리머라제 활성”은 단위시간당 주형에 결합된 프라이머의 3‘ 말단에 합성된 뉴클레오타이드의 수로, 단위는 unit 이다. 일반적으로 1 unit은 activated calf thymus DNA를 기질로 하여 74도에서 30분 반응시 10 nmol의 dNTP를 첨가하는 효소의 양을 의미한다.

본원에서 Tm은 이중가닥 DNA의 절반(50%)이 단일 가닥 DNA로 분리되는 지점의 온도를 의미한다. Tm을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 다양한 방법이 본원에 적용될 수 있다. 일 구현예에서는 특히 실시간 PCR 장비를 이용하여 측정된다.

본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 “프로브”도 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장된다.

본원에서 단일가닥 DNA 주형은 단일가닥의 폴리뉴클레오타이드로 최적의 길이는 20 nt를 초과하는 50 nt 미만의 길이를 갖는다. 20 nt 이하인 경우는 37도에서 안정적인 이중가닥을 형성하기 어려우며, 또한 50 nt를 사용하였을 때에는 반응에 의해 생성된 이중가닥 부위가 Tm 값과 비례하지 않는다. 일 구현예에서는 30 nt 내지 49 nt, 40 nt 내지 49 nt, 특히 40 nt 길이의 주형이 사용된다.

또한 본원에서 단일가닥 폴리뉴클레오타이드인 DNA 주형을 구성하는 염기의 G(구아닌) 및 C(싸이토신)의 최적의 비는 안정적인 이중가닥을 형성하면서도 Tm 반응의 측정이 가능한 약 30~70% 이다. 일 구현예에서는 약 65% 이다.

GC의 비율이 높을수록 Tm 값이 높아지는데, 70%를 초과하면 이중가닥 형성 후 Tm 값과 폴리머라제 활성이 선형적인 관계가 형성되지 않고, 30% 보다 낮으면 안정적인 이중가닥이 형성되지 않아, Tm 측정 및 폴리머라제에 의한 뉴클레오타이드의 편입이 어렵다.

본원에 따른 방법에서 단일가닥 주형 DNA에 프라이머가 결합된 주형-프라이머가 기질로서 사용된다. 상기 기질에서 프라이머의 길이는 상기 주형의 길이보다 짧으며, 상기 프라이머의 3‘ 말단으로부터 DNA 합성 반응이 수행된다.

일 구현예에서 주형 대 프라이머의 베이스 길이는 약 2:1 이다. 2:1 보다 작은 경우, 예를 들어 주형이 길이가 40 nt 이고, 길이의 비가 2:0.5가 되면 프라이머의 길이가 10 nt가 되는 것이고 이럴 경우 37도에서 주형 DNA와 안정적인 이중가닥을 형성하지 못하여, 안정적인 합성이 일어나지 않는다. 또한 2:1 보다 큰 경우, 예를 들어 2:1.5가 되면 단일가닥의 길이가 30 nt가 되어서 실제 폴리머라제의 활성을 볼 수 있는 dNTP 연결의 window가 10 nt 밖에 되지 못하고, 이 경우 Tm의 차이 범위가 너무 좁아져서 정량적인 측정이 어려울 수 있다.

본원에 따른 방법에서 DNA 합성 및 Tm 측정 방법은 폴리머라제 활성 측정이 필요한 물질의 특징 및 합성 및 Tm 측정에 사용되는 장비, 시약 등에 따라 달라질 수 있으며, 당업자라면 조건을 적절하게 선택할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 DNA 합성 반응은 0.01~0.5 mM (each) dNTP, 0.5~5 mM MgCl₂, pH 7.0~9.5, 00 mM salt의 완충액에서 37℃에서 30분간 수행되고, Tm 측정은 실시간 PCR 장비 등을 이용해서 반응 종료 후에 온도를 55 부터 95℃까지 0.5℃/5초 단위로 증가하면서 측정될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 단일가닥 주형은 서열번호 1: CC TCC TGA GCG CAA GTA CTC CGT GTG GAT CGG CGG CTC CA로 표시되고, 프라이머는 서열번호 2: TGG AGC CGC CGA TCC ACA CG로 표시된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. dsDNA 길이와 Tm (Melting Temperature) 간의 상관관계 측정

도 1은 본원 방법의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다. 주형-프라이머 기질 DNA의 프라이머의 3’ 말단으로부터 폴리머라제 활성을 갖는 물질에 의해 주형에 상보적인 dNTP가 순차적으로 편입되어 DNA 가닥으로 연결되며, 이중가닥 (ds DNA)을 형성한다. 이 경우 주형-프라이머 DNA의 dsDNA 부분이 증가하게 되며, 해당 DNA를 실시간 PCR 장비 등을 이용하여 Tm을 측정하게 되면 증가된 dsDNA의 길이에 따라 증가된 Tm을 나타내게 된다. 이때 증가된 Tm 값에 따라 이중가닥으로 편입된(incorporated)된 dNTP의 양을 계산할 수 있다.

도 2는 표준 기질을 이용하여 Tm을 측정한 결과를 도식적으로 정리한 것이다. 이를 위해 주형에 완벽히 결합 가능한 20, 30, 및 40 nt의 3가지 길이의 프라이머 (프라이머 20: 5'-TGG AGC CGC CGA TCC ACA CG-3', 프라이머 30: 5'-TGG AGC CGC CGA TCC ACA CGG AGT ACT TGC-3', 프라이머 40: 5'-TGG AGC CGC CGA TCC ACA CGG AGT ACT TGC GCT CAG GAG G-3')를 화학적으로 합성하였다(제노텍, 대전). 이후 40 nt 길이의 주형 DNA (Template: 5'-CC TCC TGA GCG CAA GTA CTC CGT GTG GAT CGG CGG CTC CA-3')와 상기 각 프라이머를 결합(annealing) 시킨 후 Realtime PCR (CFX96 Real-Time PCR Detection System, Bio-rad, 미국) 장비를 이용하여 Tm 값을 측정하였다.

구체적으로 총 20μl의 반응액 P의 최종 조성은 다음과 같다; 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 200μM dNTP each 0.5X SYBR Green I, 0.1 mg/ml BSA. 여기에 상기 합성된 주형-프라이머 DNA를 5 pmole 씩 추가한 후 온도를 55℃ 부터 95℃까지 0.5℃/5초 단위로 증가시키면서 SYBR 으로부터 나오는 형광 세기를 측정하였다. Tm 값은 -Δ(RFU)/ΔT (RFU: 형광값의 세기, T: 측정온도)의 값이 최대가 되는 온도를 상기 실시간 PCR 장비에서 제공되는 소프트웨어(Bio-rad CFX manager)를 이용하여 계산하였다.

측정 결과는 도 3에 나타나 있다. 결합된 프라이머의 길이에 따라 Tm 값은 각각 프라이머의 길이가 20 nt 일 때 69.5℃, 30 nt 일 때 75℃, 40 nt 일 때 79.5℃로 확인되었다. 이는 이중가닥의 길이와 Tm 값은 선형적 상관관계(linear correlation)가 있음을 나타낸다.

실시예 2. Tm 값을 이용한 폴리머라제 활성 측정

실시예 2-1

Klenow 폴리머라제(엔지노믹스, 한국)와 nTaq DNA 폴리머라제(Taq 폴리머라제의 exonuclease 돌연변이 형태, 엔지노믹스, 한국)를 이용하여 이들 각각의 폴리머라제 활성을 측정하였다.

반응 버퍼는 실시예 1과 동일하며 실시예 1의 20 nt의 프라이머가 결합된 주형-프라이머 DNA를 기질로 사용하였다. 반응 조건은 다음과 같다; [폴리머라제 반응: 37℃에서 30분, 그 후 Tm 측정: 55 부터 95℃까지 0.5℃/5초 단위로 증가]. 각 효소의 양을 달리하여 실험한 결과가 도 4 및 도 5에 나타나 있다.

실험 결과, Klenow 폴리머라제의 경우에는 0.002 unit을 사용했을 때부터, nTaq 폴리머라제를 사용한 경우에는 0.01 unit을 사용했을 때부터 Tm이 유의미하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 측정된 Tm 값을 주형-프라이머 DNA를 사용하여 측정한 Tm 에 따른 dNTP 합성량 표준 곡선(실시예 1의 실험에 따라 진행된 도 3)에 대입하여 그래프로 표시한 결과가 도 6에 나타나 있다.

프라이머의 3’ end에 dNTP가 결합하면, dsDNA의 길이가 증가하고, Tm이 증가가 본 발명의 논리이다. 따라서 역으로 반응에 다른 요인이 작용하지 않는다면 Tm이 증가는 dsDNA 의 길이가 증가로 이어지고 3’ end에 dNTP가 결합한다. 결과적으로, Tm이 증가하면 활성이 있다고 말할 수 있다.

실험에 사용된 두 효소의 경우, 기질로 사용한 주형-프라이머 DNA에서는 프라이머의 길이가 30 nt 인 경우에 해당하는 75℃ 부근의 Tm 값에 해당하는 중간 산물을 거의 확인할 수 없었다. 이는 두 폴리머라제의 증폭 효율(processivity)이 매우 높아서 사용한 기질의 측정 범위인 20 nt 정도는 단일 결합 반응에서 모두 합성을 완료하기 때문인 것으로 추측된다.

Processivity 매우 높은 경우 단일 결합 반응에서 모두 증폭이 일어난다. 이 경우에는 On/Off 형태로 활성이 있다 없다 여부를 측정 가능하다. 실시예 4에서 Tm 이 69도(증폭 반응이 일어나지 않음)에서 78도로 증가(증폭반응이 일어남)하였다는 것을 통해 폴리머라제 활성이 있다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2-2 돼지 유래 폴리머라제 beta 효소의 활성 측정

미지의 DNA 폴리머라제를 대상으로 활성 측정 실험을 수행하기 위해 돼지에서 유래한 폴리머라제 beta (Sus scrofa (pig) DNA 폴리머라제 beta, POLB, Gene ID: 100526021)를 대장균에서 발현시켜 순수 분리정제하였다. 해당 효소는 C-terminal에 6xHistidine이 융합되도록 발현되었으며 Ni-NTA(Qiagen)와 SP-sepharose(GE) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제한 효소를 사용하여 폴리머라제 활성 측정 실험을 수행한 결과가 도 7에 나타나 있다.

실험 결과, 2 ng을 사용한 경우 효소를 첨가하지 않은 경우에 비해 Tm이 69도에서 72도로 증가하는 것을 알 수 있다. 이를 도 3의 B에 나타낸 표준 곡선에 대입하면 약 25 pmol의 dNTP가 연결되었다고 계산해낼 수 있다. (계산식: 9.9968 x Tm(72도) -694.19 = 25.5796) 총 5 pmol의 기질을 사용하였으므로 이를 다시 5로 나누면 하나의 기질 당 평균적으로 약 5 nt의 dNTP가 연결되었다는 것을 계산해 낼 수 있다. 동일한 방법으로, 5 ng의 효소를 첨가한 경우 Tm 값이 76.25 도로 증가하였으며 이는 약 78 pmol의 dNTP가 3’ end에 연결되었다고 계산해낼 수 있다. 이렇게 계산된 dNTP의 연결량을 첨가한 효소량과 함께 그래프로 나타낸 결과가 도 7에 나타나 있다. 효소의 양을 늘려주었을 때 dNTP 편입이 증가하였으므로 폴리머라제 의 활성을 정량적으로 확인할 수 있었다.

Tm 측정 방법을 통해 폴리머라제의 활성을 측정할 경우, 실시간 PCR 장비의 종류 및 해당 장비의 웰간 신호값 차이에 상관없이 보다 정확하고 정량적인 활성 측정이 가능하다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Enzynomics Co. Ltd. <120> Method for measuring polymerase activity <130> DP202003002P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template <400> 1 cctcctgagc gcaagtactc cgtgtggatc ggcggctcca 40 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tggagccgcc gatccacacg 20

Claims (7)

1. 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법으로,
   단일가닥 DNA 주형의 3‘ 말단부터 시작해서 그 일부에 프라이머가 결합된 주형-프라이머 기질을 제공하는 제 1 단계;
   상기 주형-프라이머 기질에 DNA 폴리머라제 활성 여부의 판단이 필요한 시험 물질을 추가하고, dNTP의 존재 중에서 일정시간 동안 상기 기질의 상기 프라이머의 3‘ 말단으로부터 DNA 합성 반응을 수행하는 제 2 단계로, 상기 DNA 합성에 의해 상기 주형에 상보적인 dNTP가 상기 기질에 편입되어 이중가닥 DNA가 생성되고,
   상기 생성된 이중가닥 DNA의 Tm (melting Temperature)를 측정하는 제 3 단계; 및
   상기 Tm이 상기 시험 물질을 포함하지 않는 대조군과 비교하여 증가하는 경우, 상기 시험 물질을 DNA 폴리머라제 활성이 있는 것으로 판단하는 제 4 단계를 포함하며,
   상기 단일가닥 DNA 주형의 길이는 20nt 초과 50nt 미만인, 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 제 4 단계 대신에 또는 이에 추가하여, 상기 Tm을 Tm에 따른 dNTP 합성량 표준 곡선에 대입하여, 상기 이중가닥으로 편입된 dNTP양을 측정하는 단계로, 상기 편입된 dNTP의 양은 시험물질의 폴리머라제의 활성 정도와 비례하는 것인, 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법.
   
3. 삭제
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 단일가닥 DNA 주형의 GC 비(ratio)는 65% 인, 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 단일가닥 DNA 주형 길이 대 상기 프라이머의 길이의 비는 2:1인, 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 단일가닥 DNA 주형에 결합하는 상기 프라이머의 길이는 15 내지 30 nt 내지 이고,
   상기 단일가닥 DNA 주형의 GC 비(ratio)는 65% 인, 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 주형 DNA의 서열은 서열번호 1의 서열로 표시되고,
   상기 프라이머 DNA 서열은 서열번호 2의 서열로 표시되는 것인, 인비트로에서 시험 물질의 DNA 폴리머라제의 활성여부를 판단하는 방법.

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