JP2009284783A - ハイブリダイゼーション用溶液の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーション等において、従来、必要であった精製工程を必要とせず、煩雑な操作やコスト増加を防ぎ、より短時間で結果を得ることが出来る方法等を提供する。
【解決手段】標識標的核酸を含む未精製標識標的核酸溶液と、ブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーとを混合するハイブリダイゼーション用溶液の調製方法であり、該ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬであること、該未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬであること等が好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】標識標的核酸を含む未精製標識標的核酸溶液と、ブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーとを混合するハイブリダイゼーション用溶液の調製方法であり、該ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬであること、該未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬであること等が好ましい。
【選択図】なし
Description
本発明は、核酸標識工程において生じる未反応試薬を除去せず、直接、核酸マイクロアレイ等のハイブリダイゼーションに用いることのできる試料調製法に関する。
例えば、核酸マイクロアレイは、１９９１年Stephen P. A. Fodor らによって発明され、一度に数百から数万種の遺伝子を解析することが出来るようになった（非特許化文献１）。その後、種々のタイプの核酸マイクロアレイが開発されてきた（非特許化文献２）。
染色体解析技術は、特定の染色液を用いて染色体を染色し、顕微鏡を用いてその染色パターンから遺伝子の欠失や過剰を検出する方法であり、Ｇ染色法やＱ染色法など種々の方法がある。
その後、ＦＩＳＨ（Fluorescence In Situ Hybridization）法やＦＩＳＨ法を基盤としたＣＧＨ（Comparative Genomic Hybridization）法やＳＫＹ（Spectral Karyotyping）法が開発された。
ＣＧＨ法は、染色体を対象にしてゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出する方法である。Joe Gray, Dan Pinkel, O-P Kallioniemiらによって開発された技術であり、その成果は1992年Science誌に報告された（非特許文献３）。しかし、その検出精度は、一般に５〜１０Ｍｂ以上にわたる大きな領域で染色体異常が起こっていないと検出することが出来ないなど種々の問題点があった（非特許化文献４）。
染色体解析技術は、特定の染色液を用いて染色体を染色し、顕微鏡を用いてその染色パターンから遺伝子の欠失や過剰を検出する方法であり、Ｇ染色法やＱ染色法など種々の方法がある。
その後、ＦＩＳＨ（Fluorescence In Situ Hybridization）法やＦＩＳＨ法を基盤としたＣＧＨ（Comparative Genomic Hybridization）法やＳＫＹ（Spectral Karyotyping）法が開発された。
ＣＧＨ法は、染色体を対象にしてゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出する方法である。Joe Gray, Dan Pinkel, O-P Kallioniemiらによって開発された技術であり、その成果は1992年Science誌に報告された（非特許文献３）。しかし、その検出精度は、一般に５〜１０Ｍｂ以上にわたる大きな領域で染色体異常が起こっていないと検出することが出来ないなど種々の問題点があった（非特許化文献４）。
シーケンサーの塩基レベルの解像度と、染色体分析が扱える５〜１０Ｍｂの解像度の間の数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノム構造異常を検出できるツールとして新しく登場したのが、アレイＣＧＨ法である（非特許文献５、６）。アレイＣＧＨ法は、発現解析などで使用される網羅的な解析を行うアレイとは異なり、ゲノムＤＮＡの断片、例えば、ＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosomes）クローンやＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosomes）クローンやオリゴヌクレオチドプローブを基板上にスポットすることで、これらの核酸を固体基板上に配置したアレイを使用する。患者等から採取した異常細胞および患者の正常部位や健常人から採取した正常細胞から、ＤＮＡを抽出し、それぞれ異なった蛍光物質で染色し、両者を混合後、核酸マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションを介して相互作用させ、相互作用した核酸が発する蛍光シグナルをスキャナーなどにより読み取り、正常細胞、異常細胞からの信号の強度比を比較することで、遺伝子のコピー数を検出する方法である。
従来、核酸マイクロアレイ用の試料を調製する際には、必ず精製操作を行う必要があった。例えば、蛍光標識した試料では、精製操作によって未反応の蛍光物質や酵素などを除去する必要があった。通常、精製操作は、二酸化ケイ素などの材料からなる核酸吸着性固定膜をカートリッジに固定したカラム法などによって行われるが、操作が煩雑であり、精製操作によって試料が核酸吸着性固定膜に吸着されてしまい、回収量が低下するなどの問題点があった。更に、精製操作として、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿を行うこともあり、その場合は、非常に多くの工程と長時間の操作を必要とした。核酸マイクロアレイ用の試料を調製する場合、例えば、蛍光標識されたＣＧＨアレイ用試料を調製する場合、蛍光標識された試料を２種類、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡ、デキストランおよびホルムアミドを主成分とするハイブリダイゼーション調製溶液、ｔＲＮＡ、ＳＤＳを混合する必要があり、精製工程を省略することにより、これらの合計液量はかなりの液量となり、その結果、蛍光標識された核酸の濃度が大幅に低下し、核酸マイクロアレイへのハイブリダイゼーション効率の低下から、核酸マイクロアレイの解析精度が著しく低下する問題点があった。この問題点を改善するために、一般的にエタノール沈殿やイソプロパノール沈殿が行われ、溶液中の溶媒をハイブリダイゼーション調製溶液と置き換える工程が行われている。例えば、非特許化文献５では、蛍光標識した核酸を２種混合し、ここにヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡを添加後、エタノール沈殿を行うことで、これらの溶媒をハイブリダイゼーション調製溶液と置換することで、標識された核酸の濃度低下を防いでいる。しかし、これらの方法は、カラム法と比較して非常に時間がかかり、熟練した操作が必要であると共に、一般的に精製度は低く、使用者の負担はかなり大きい。
S. P. A. FodorらScience 251, 767-773 (1991). 松永是 監修、バイオチップの最新技術と応用、シーエムシー出版(2004). A. Kallioniemi et al., Science, 258, 818-821 (1992). 稲澤譲治, 水口真希, 臨床検査, 49, 497-502 (2005). D. Pinkel et. al., Nat. Genet., 20, 207-211 (1998) 井本逸勢, 稲澤譲治, 細胞工学, 23, 355-361 (2004).
S. P. A. FodorらScience 251, 767-773 (1991). 松永是 監修、バイオチップの最新技術と応用、シーエムシー出版(2004). A. Kallioniemi et al., Science, 258, 818-821 (1992). 稲澤譲治, 水口真希, 臨床検査, 49, 497-502 (2005). D. Pinkel et. al., Nat. Genet., 20, 207-211 (1998) 井本逸勢, 稲澤譲治, 細胞工学, 23, 355-361 (2004).
本発明が解決しようとする課題は、核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーション等において、従来、標的核酸を蛍光物質などで標識した際や増幅した際に、未反応の蛍光物質やＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を除去する工程、すなわち精製工程が必要であったが、精製工程を必要としない方法を提供することで、煩雑な操作やコスト増加を防ぎ、より短時間で結果を得ることが出来る方法を提供することにある。さらに、本発明が解決しようとする課題は、精製工程を省くことで発生する試料等の液量の積算に基づく標識核酸の濃度低下による核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーション等による検出性能低下を、使用者の負担を増加させない方法で防ぐことにある。さらに、精製工程を省略することによって、遠心操作などプロトコールを機械によって自動化する際に困難となる工程を省略することも課題としている。
本発明では、核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーションにおいて、精製工程を省略しても十分な検出精度が出せる方法を見出し、本発明を完成するに至った。通常、標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液を調製する際に、バッファー、標識標的核酸、ブロック核酸、試薬などが添加されることで、試料液量の増加による標識標的核酸の濃度が低下する。よって、核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーションの検出性能が著しく低下する。この問題に対しても、本発明者らは、あらかじめハイブリダイゼーション用に調製したバッファーで溶媒置換したブロック核酸等を含むハイブリダイゼーションバッファーを準備し、この溶液と未精製標識標的核酸溶液とを混合することで、その溶媒増加量を大幅に減らすことができることを見出し、その結果、試料濃度の低下を最小限とし、検出性能の低下を防ぐことが可能となり、本発明を完成するに至った。
詳細は図１に示した。図１は、二色法で、精製を行った場合（図１（ａ））と精製を行っていない場合（図１（ｂ））の核酸マイクロアレイ等を用いるハイブリダイゼーション用の標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製方法の工程を示した。図１（ａ）は、非特許文献６の方法で、２種の未精製標識標的核酸溶液、ブロック核酸を混合し、エタノール沈殿を行った後に、ハイブリダイゼーションバッファーで沈殿物を溶解することで、標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液を調製する方法である。もし、この方法で、精製工程すなわちエタノール沈殿を省略すると、２種の未精製標識標的核酸溶液、ブロック核酸、ハイブリダイゼーション調製溶液の液量が合計され、ハイブリダイゼーション用溶液中の標識標的核酸の濃度が低下し、その結果、核酸マイクロアレイ等を用いるハイブリダイゼーション効率が著しく低下し、その検出性能が著しく低下する。そこで、本発明者らは図１（ｂ）に示す工程を行うことによって、この問題点を解決した。すなわち、例えば、あらかじめブロック核酸の溶媒をエタノール沈殿やカラム精製法によって精製して、ハイブリダイゼーションバッファーを準備しておき、２種の未精製標識標的核酸溶液とこのハイブリダイゼーションバッファーを混合し、標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液を得る方法である。ハイブリダイゼーションバッファーは、製造者が準備しておくことにより、使用者は、２種の未精製標識標的核酸溶液とキットに含まれているブロック核酸を含有するハイブリダイゼーションバッファーを混合するだけで標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液を得ることも出来る。
本発明者らが検討した結果、精製を行った標識標的核酸に対して、核酸切断工程、標識工程などで使用した試薬を１種類ずつ添加した標的核酸試料液を、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーション反応に適用した結果、酵素、ヌクレオチド、プライマーなどを過剰量添加しても核酸マイクロアレイのハイブリダイゼーションの結果にはほとんど影響を与えなかった。しかし、標識化合物、例えば、Ｃｙ３−ｄＣＴＰやＣｙ５−ｄＣＴＰを添加すると核酸マイクロアレイ上の蛍光バックグラウンド値が上昇した。それと同時に、標識核酸から由来する蛍光値も同程度上昇しており、データ処理する際には、標識核酸から由来する蛍光値からバックグラウンドの蛍光値を差し引くので、問題はなかった。以上のことから、核酸切断工程、標識工程などで使用した試薬を標識標的核酸試料液より除去・精製しなくても、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーション反応に与える影響は少ないと考えた。そこで、全く精製を行わない未精製標識標的核酸溶液を調製し、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーション反応に使用したところ、精製工程を行った標識標的核酸を用いた核酸マイクロアレイの結果と同等以上の性能を示すことがわかり、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成よりなるものである。
（１）標識標的核酸を含む未精製標識標的核酸溶液と、ブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーとを混合するハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（２）前記ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬである前記（１）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（３）未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬである前記（１）又は（２）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（４）ハイブリダイゼーションバッファーに、界面活性剤、排除体積効果を有する高分子化合物、標的核酸とプローブ核酸とで形成される複合体の融解温度を変化させる化合物、バックグラウンドノイズの低減作用を持つ核酸の中から選ばれる少なくとも1つが更に含有されている前記（１）〜（３）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（５）前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロック核酸を精製後、バッファー含有溶液に溶解することにより調製されたことを特徴とする前記（１）〜（４）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（６）前記ハイブリダイゼーション用溶液は、核酸マイクロアレイに対して使用することを特徴とする前記（１）〜（５）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（７）前記未精製標識標的核酸溶液を２種以上用いる前記（１）〜（６）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１）標識標的核酸を含む未精製標識標的核酸溶液と、ブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーとを混合するハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（２）前記ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬである前記（１）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（３）未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬである前記（１）又は（２）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（４）ハイブリダイゼーションバッファーに、界面活性剤、排除体積効果を有する高分子化合物、標的核酸とプローブ核酸とで形成される複合体の融解温度を変化させる化合物、バックグラウンドノイズの低減作用を持つ核酸の中から選ばれる少なくとも1つが更に含有されている前記（１）〜（３）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（５）前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロック核酸を精製後、バッファー含有溶液に溶解することにより調製されたことを特徴とする前記（１）〜（４）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（６）前記ハイブリダイゼーション用溶液は、核酸マイクロアレイに対して使用することを特徴とする前記（１）〜（５）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（７）前記未精製標識標的核酸溶液を２種以上用いる前記（１）〜（６）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（８）２種以上の未精製標識標的核酸溶液が、それぞれの標的核酸が異なる標識物質で標識されたことを特徴とする前記（７）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（９）２種以上の未精製標識標的核酸溶液が、それぞれの標的核酸が同一の標識物質で標識されたこと特徴とする前記（７）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１０）標的核酸を標識する標識物質が蛍光物質である前記（１）〜（９）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１１）前記ハイブリダイゼーション用溶液中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬである前記（１）〜（１０）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１２）前記ハイブリダイゼーション用溶液中の標識標的核酸濃度が０．５〜５００μｇ／ｍＬである前記（１）〜（１１）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１３）ブロック核酸が未濃縮ブロック核酸溶液を用いる前記（１）〜（１２）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１４）ブロック核酸がＣｏｔ−１ ＤＮＡである前記（１）〜（１３）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（９）２種以上の未精製標識標的核酸溶液が、それぞれの標的核酸が同一の標識物質で標識されたこと特徴とする前記（７）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１０）標的核酸を標識する標識物質が蛍光物質である前記（１）〜（９）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１１）前記ハイブリダイゼーション用溶液中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬである前記（１）〜（１０）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１２）前記ハイブリダイゼーション用溶液中の標識標的核酸濃度が０．５〜５００μｇ／ｍＬである前記（１）〜（１１）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１３）ブロック核酸が未濃縮ブロック核酸溶液を用いる前記（１）〜（１２）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
（１４）ブロック核酸がＣｏｔ−１ ＤＮＡである前記（１）〜（１３）のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
本発明の方法により、精製工程を省略しても、例えば核酸マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション試験等で十分な性能を持った結果を得ることが出来る。さらに、精製工程を省くことによって、プロトコールが単純化し、試薬の使用量を減らすことが可能であり、遠心機などの高価な器具を必要とせず、これらのコストを下げることができる。さらに、あらかじめブロック核酸及びバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーを調製しておくことで、使用者は精製工程を行うことなく、精製工程削除に由来する試料液量の増加による試料中の標識標的核酸濃度の低下が原因での核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーション試験等の性能低下が発生することなく、核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーション試験等に使用可能な試料を調製することが出来る。さらに、精製工程を省くことで、精製工程を行うことによる核酸吸着性固定膜からの標識標的核酸の脱着不可成分が発生せず、精製工程を行ったものと比較してより高濃度の標識標的核酸を核酸マイクロアレイ等を用いたハイブリダイゼーション試験等に使用することが出来、結果、精製工程を行ったハイブリダイゼーション試験結果と比較して、その性能も高めることができる。本発明によって、より簡便、短時間（従来比約７分の１）、低コストで、遺伝子の発現量、コピー数、疾病の診断を行うことが出来る。
本発明のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法で用いる未精製標識標的核酸溶液について説明するが、その前に、標的核酸について説明する。
本発明での標的核酸とは、例えば、核酸マイクロアレイ等を用いて、核酸の存在量やコピー数などを測定しようとしている標的細胞から抽出した核酸のことで、例えば、核酸マイクロアレイに結合したプローブ等によってハイブリダイゼーションされる側の核酸のことである。例えば、ＣＧＨアレイの場合、正常細胞から抽出した核酸、異常細胞、例えば、がん細胞から抽出した核酸を標的核酸と呼ぶ。
本発明での標的核酸とは、例えば、核酸マイクロアレイ等を用いて、核酸の存在量やコピー数などを測定しようとしている標的細胞から抽出した核酸のことで、例えば、核酸マイクロアレイに結合したプローブ等によってハイブリダイゼーションされる側の核酸のことである。例えば、ＣＧＨアレイの場合、正常細胞から抽出した核酸、異常細胞、例えば、がん細胞から抽出した核酸を標的核酸と呼ぶ。
本発明での標的細胞とは、例えば、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、コピー数などを測定しようとしている核酸を含有している分析対象の細胞のことで、核酸マイクロアレイに結合したプローブによってハイブリダイゼーションされる側の核酸を含有する細胞のことである。
標的細胞には、比較する細胞と比較される細胞も含まれている。例えば、比較する細胞を正常細胞、比較される細胞を異常細胞とすることも出来る。異常細胞とは、正常細胞に対して興味の対象となる遺伝子に何らかの変異を受けた遺伝子を持つ細胞のことであり、正常細胞とは、実質的に変異を受けていない細胞のことである。例えば、癌を発症していない患者から入手した正常細胞に対して、癌を発症した患者から入手した細胞を異常細胞と呼んでいる。また、薬品などの試薬を添加した細胞を異常細胞、薬品を添加していない細胞を正常細胞と呼ぶことも出来る。
標的細胞には、比較する細胞と比較される細胞も含まれている。例えば、比較する細胞を正常細胞、比較される細胞を異常細胞とすることも出来る。異常細胞とは、正常細胞に対して興味の対象となる遺伝子に何らかの変異を受けた遺伝子を持つ細胞のことであり、正常細胞とは、実質的に変異を受けていない細胞のことである。例えば、癌を発症していない患者から入手した正常細胞に対して、癌を発症した患者から入手した細胞を異常細胞と呼んでいる。また、薬品などの試薬を添加した細胞を異常細胞、薬品を添加していない細胞を正常細胞と呼ぶことも出来る。
本発明において、標的核酸を標的細胞から調製する際には、精製を行う必要がある。この場合には、後述する標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質など細胞溶解物がバックグラウンドノイズに大きな影響を与え、精製を行わなければ、核酸マイクロアレイ等を用いるハイブリダイゼーション試験の性能を著しく低下させる。
なお、本発明で言うところの精製とは、抽出、分離、分取と同異義語の意味で使用している。また、そのための手段として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を含むことが出来る。さらに、電気泳動法による精製も含めることが出来る。また、本発明では、溶媒置換も広い意味で精製と呼んでいる。
本発明では、標的細胞から標的核酸を調製する場合、２回の精製工程を行うことも出来る。本発明では、標的細胞からの精製工程、すなわち、１回目の精製工程として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出などを用いることが出来る。この中で、トリ酢酸セルロースをケン化して調製した核酸吸着性多孔質膜をカートリッジに保持させたＱｕｉｃｋＧｅｎｅシリーズ（富士フイルム株式会社）による精製が好ましい。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅシリーズを使用することで、低価格な機械を用いて、半自動的に標的核酸を調製することが出来るからである。さらに、もう一段の精製工程を行うこともできる。すなわち、調製した標的核酸の濃度や純度向上のための精製である。例えば、フェノール−クロロホルム抽出法や種々の沈殿法を用いた場合、その精製度は一般的にカラム法と比較して悪く、以降の工程に悪影響を及ぼしてしまう。２回目の精製法として、シリカなどの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を用いることが出来るが、この中で最も好適なのが、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）による精製法である。ＱｕｃｉｋＧｅｎｅ ＳＰ ｋｉｔの核酸吸着性多孔質膜は、シリカ系核酸吸着性多孔質膜と比較して非常に薄く、少量での核酸抽出に適しており、他の方法と比較して非常に高濃度の標的核酸を得ることが出来る。また、少量液量での精製が可能なエタノール沈殿法やイソプロパノール沈殿法と比較して、より高純度の標的核酸を得ることが出来、少量化かつ高濃度の標的核酸を得るのに適した方法である。また、本発明では、標的細胞から標的核酸を得る場合に、十分な濃度もしくは十分な精製度の標的核酸が得られれば、標的細胞から標的核酸を得るための精製工程は一回でも良い。
酵素処理、超音波処理、機械的破砕処理、化学的処理を行うことで、標的細胞から抽出した標的核酸の鎖長を短くすることも出来る。さらに、これらの処理を行った後、精製工程を行うことも、精製工程を省くこともできる。一般的に、標的核酸の鎖長を短くする工程を省くと、その核酸マイクロアレイ等を用いるハイブリダイゼーション試験の性能は悪化する。しかし、本発明では、後述の標識標的核酸の濃度などを最適に調製することで、これらの性能低下を防ぐことが可能である。酵素処理に使用する酵素としては、制限酵素を用いることが好ましい。制限酵素の種類は、何種類用いることも可能であるが、本発明では２種類以下を好適に用いることができる。三種類以上だと、制限酵素に用いる緩衝液の制限酵素間の最適条件をそろえるのが困難であると共に、酵素処理後の精製工程を省略した場合、例えば、後述の標識工程に酵素反応を用いる場合、その酵素との間で、最適条件を揃えることが困難だからである。
本発明で言うところの機械的破砕処理とは、一定の方向に対して（但し８の字型の様な運動も含む）、容器に対して往復運動を行うことを言う。この処理を行う際に、ガラス、ステンレスやジルコニアなどのボールを添加するとより処理が進行し、より核酸が切断されるので好適に用いることが出来る。また、超音波処理による切断も出来る。
また、標識標的核酸とは、標的核酸に対して標識を行った核酸のことである。
標識とは、検出可能な物質を標的核酸に対して結合させる行為であり、検出可能であれば、いかなるものも本発明の標的核酸に組み込むことが出来る。例えば、蛍光物質、無機化合物、タンパク質（ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)などで使用される酵素標識抗体など）、放射性同位元素、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）などを含むことが出来る。
蛍光物質としては、特に使用は限定しないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy3, Cy5, Cy7、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP,)、黄色蛍光タンパク(YFP)、赤色蛍光タンパク(RFP)、Alexa、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤 (4, 4'-bis(1", 1", 1", 2", 2", 3", 3"-heptafluoro-4", 6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o-terphenyl(BHHCT))、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、TAMRA、ROXなどを用いることが出来る。
標識とは、検出可能な物質を標的核酸に対して結合させる行為であり、検出可能であれば、いかなるものも本発明の標的核酸に組み込むことが出来る。例えば、蛍光物質、無機化合物、タンパク質（ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)などで使用される酵素標識抗体など）、放射性同位元素、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）などを含むことが出来る。
蛍光物質としては、特に使用は限定しないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy3, Cy5, Cy7、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP,)、黄色蛍光タンパク(YFP)、赤色蛍光タンパク(RFP)、Alexa、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤 (4, 4'-bis(1", 1", 1", 2", 2", 3", 3"-heptafluoro-4", 6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o-terphenyl(BHHCT))、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、TAMRA、ROXなどを用いることが出来る。
無機化合物としては、特に使用する素材は限定しないが、例えば、半導体無機材料で出来た量子ドットを挙げることが出来る。その例としては、シリカ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳｅのナノ微粒子を挙げることが出来る。この微粒子は、その粒径を変えることで、発する蛍光波長を変化させることが出来、直径２ｎｍでは青色、直径３ｎｍでは緑色、４ｎｍでは黄色、５ｎｍでは赤色となる。この様に、蛍光を検出しても良いし、その粒子の存在を検出しても良い。例えば、粒子の存在を検出する手段として、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）を用いることが出来る。
さらに、ジゴキシゲニン（Digoxigein：DIG）、ビオチンなども利用することも出来る。ビオチンを利用した例としては、標的核酸に結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することが出来る。
また、非酵素的に標識することも出来る。例えば、ULS arrayCGH LabelingKit（Kreatech Biotechnology BV社）なども用いることが出来る。
また、非酵素的に標識することも出来る。例えば、ULS arrayCGH LabelingKit（Kreatech Biotechnology BV社）なども用いることが出来る。
核酸マイクロアレイと標識核酸を用いるハイブリダイゼーション法では、単色法、二色法、あるいは多色法がある。
単色法は、別名、一色法と呼ばれる方法で、例えば１枚の核酸マイクロアレイもしくは一つのハイブリダイゼーション領域に対して、１種類の標識化合物で標識した実質的に１種類の標識標的核酸を用いる方法である。すなわち、正常細胞から抽出した標的核酸を１種類の標識化合物を用いて標識した標識標的核酸を調製した後、１枚のアレイ上でハイブリダイゼーションを行う。また、異常細胞から抽出した標的核酸を１つの標識化合物を用いて標識し標識標的核酸を調製した後、別のアレイ上でハイブリダイゼーションを行う。これら２枚のアレイから読み取った蛍光値からコピー数を算出する。この際、標識化合物は、同一のものを用いてもよいし、異なった標識化合物を用いても良い。
単色法は、別名、一色法と呼ばれる方法で、例えば１枚の核酸マイクロアレイもしくは一つのハイブリダイゼーション領域に対して、１種類の標識化合物で標識した実質的に１種類の標識標的核酸を用いる方法である。すなわち、正常細胞から抽出した標的核酸を１種類の標識化合物を用いて標識した標識標的核酸を調製した後、１枚のアレイ上でハイブリダイゼーションを行う。また、異常細胞から抽出した標的核酸を１つの標識化合物を用いて標識し標識標的核酸を調製した後、別のアレイ上でハイブリダイゼーションを行う。これら２枚のアレイから読み取った蛍光値からコピー数を算出する。この際、標識化合物は、同一のものを用いてもよいし、異なった標識化合物を用いても良い。
二色法とは、例えば１枚の核酸マイクロアレイもしくは１つのハイブリダイゼーション領域に対して、２種類の異なった試料由来の標識標的核酸を用いる方法である。ここで、標識標的核酸に結合させている標識化合物はそれぞれ異なっている。例えば、ＣＧＨアレイの場合、正常細胞から抽出した標的核酸を蛍光色素で標識した標識標的核酸を調製し、異常細胞から抽出した標的核酸を別の蛍光色素で標識した標識標的核酸を調製し、この両方を混合後、１枚のＣＧＨアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションを行うことで、コピー数を算出する。
多色法とは、１枚の核酸マイクロアレイに対して、３種類以上の異なった標識標的核酸を用いる方法である。標識標的核酸に結合させている標識化合物はすべて異なっており、３種類以上用いる。
多色法とは、１枚の核酸マイクロアレイに対して、３種類以上の異なった標識標的核酸を用いる方法である。標識標的核酸に結合させている標識化合物はすべて異なっており、３種類以上用いる。
標識法は、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を本発明では用いても良い。直接標識法とは、例えば、Ｃｙ−ｄｙｅを用いる場合、標的核酸を１本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Ｃｙ−ｄｙｅを結合させたヌクレオチド誘導体をヌクレオチドとともに混合しておき、１段階で標識標的核酸を合成する方法である。酵素が非天然型のヌクレオチド誘導体を取り込む際の取り込み効率が天然型のヌクレオチドよりも低いという問題点があるものの、工程が簡便であり、本発明でも好適に用いることが出来る。間接標識法とは、例えば、Ｃｙ−ｄｙｅを用いる場合、標的核酸を１本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、Ｃｙ−ｄｙｅが結合できる置換基を持ったヌクレオチド誘導体、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド誘導体と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、まず最初に、この置換基を持った標的核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介してＣｙ−ｄｙｅを結合させ、標識標的核酸を得る方法である。この方法は、工程が複雑な反面、アミノアリル基を結合させたヌクレオチド誘導体の立体構造が直説標的法で使用するＣｙ−ｄｙｅを結合させたヌクレオチド誘導体よりも、天然型のヌクレオチドと構造的に近く、標識化合物の取り込み効率が高く、本発明でも好適に用いることが出来る。
本発明では、前記標識法に用いられる方法として、ランダムプライマー法（プライマーエクステンション法）、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、末端標識法などを用いることが出来る。特に、本発明ではランダムプライマー法を好適に用いることが出来る。
ランダムプライマー法は、標的核酸に対して、数ｂｐ（塩基対）から十数ｂｐのランダムなプライマー核酸をハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼを用いて、増幅と標識とを同時に行い、標識標的核酸を合成する方法である。ニックトランスレーション法は、例えば、ＤＮａｓｅＩでニックを入れた２本鎖核酸に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、ＤＮＡを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼ活性により、標識標的核酸を合成する方法である。ＰＣＲ法は、２種類のプライマーを準備し、そのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことで、増幅と標識とを同時に行い、標識標的核酸を得る方法である。末端標識法は、５’末端を標識する方法では、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した標的核酸の５’末端に、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化反応で標識化合物を取り込ませる方法である。３’末端を標識する方法は、ターミナルトランスフェラーゼにより、標識化合物を標的核酸の３’末端に付加する方法である。
本発明で言うところの未精製標識標的核酸溶液とは、標的細胞から抽出した標的核酸に対して標識工程を行い、その後、精製を全く行わない標識標的核酸溶液のことである。精製を行わないので、標識工程によって添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが共存した核酸溶液である。さらに、未精製標識標的核酸溶液に対して、共存する酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ等）を失活させる目的で、加熱やＥＤＴＡ添加などの処理を行った後の核酸を含む溶液も本発明では未精製標識標的核酸溶液という。また、未精製とは、標的核酸を得たところから、標的核酸を標識化合物で標識し、得られた未精製標識標的核酸溶液と後述のブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーとを混合するまでの工程において、精製工程を行わないという意味であり、標的細胞から標的核酸を得る工程や、ブロック核酸の濃縮、ブロック核酸とハイブリダイゼーションバッファーとその他の試薬とを混合した溶液から、その液量を減少させる操作、例えば、精製もしくは溶媒置換による精製操作のことは含めないものとする。
未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度は、１〜１０００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、１０〜５００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、５０〜２５０μｇ／μＬである。
ハイブリダイゼーション用溶液中の標識標的核酸濃度は、０．５〜５００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、５〜２５０μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、２５〜１２５μｇ／ｍＬある。
未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度は、１〜１０００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、１０〜５００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、５０〜２５０μｇ／μＬである。
ハイブリダイゼーション用溶液中の標識標的核酸濃度は、０．５〜５００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、５〜２５０μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、２５〜１２５μｇ／ｍＬある。
なお、本発明では、未精製標識標的核酸溶液を使用しているので、２種以上の標的核酸を使用する方法、すなわち単色法を除く二色法以上の場合には、未精製標識標的核酸溶液を調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。これは、例えば、二色法で、正常細胞がＣｙ３、異常細胞がＣｙ５で標識した未精製標識標的核酸溶液を使用する場合、両者を混合する工程があり、この混合時に、溶液中に残存する酵素が存在していると、正常細胞がＣｙ５、異常細胞がＣｙ３で標識される副反応が生じてしまうからである。
本発明では、酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、ＥＤＴＡを添加する方法、５０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方もしくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がさらに好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
本発明では、酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、ＥＤＴＡを添加する方法、５０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方もしくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がさらに好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
次に、本発明のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法で用いるブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーについて説明する。
本発明で使用するブロック核酸とは、プローブ核酸中に存在する繰り返し配列に対してハイブリダイゼーションを介して被覆、すなわち、ブロックする作用を持った核酸のことで、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡやマウスＣｏｔ−１ ＤＮＡなどが使用されている。例えば、ＣＧＨアレイでＢＡＣクローンをプローブ核酸として用いた場合、これらのブロック核酸を用いなければ、ＣＧＨアレイから読み取ったハイブリダイゼーションの蛍光値は高くなるが、そのコピー数の差は小さくなる。
ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度は、０．１〜１０００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、１〜１００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、１０〜５０μｇ／ｍＬである。
また、ハイブリダイゼーション用溶液中のブロック核酸の濃度は、０．０５〜５００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、０．５〜５０μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、５〜２５μｇ／ｍＬである。
本発明で使用するブロック核酸とは、プローブ核酸中に存在する繰り返し配列に対してハイブリダイゼーションを介して被覆、すなわち、ブロックする作用を持った核酸のことで、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡやマウスＣｏｔ−１ ＤＮＡなどが使用されている。例えば、ＣＧＨアレイでＢＡＣクローンをプローブ核酸として用いた場合、これらのブロック核酸を用いなければ、ＣＧＨアレイから読み取ったハイブリダイゼーションの蛍光値は高くなるが、そのコピー数の差は小さくなる。
ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度は、０．１〜１０００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、１〜１００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、１０〜５０μｇ／ｍＬである。
また、ハイブリダイゼーション用溶液中のブロック核酸の濃度は、０．０５〜５００μｇ／ｍＬあることが望ましい。さらに好ましくは、０．５〜５０μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、５〜２５μｇ／ｍＬである。
また、本発明で言うところのハイブリダイゼーションバッファーは、標識標的核酸がプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを好適にする性質を持った溶液のことであり、プローブ核酸と標識標的核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する性質を持った溶液のことである。
バッファーとしては、ｐＨを一定に保つことが出来るものであれば、どの様な緩衝剤をも用いることが出来るが、生化学用に一般的に使用されているものが好ましい。例えば、ＳＳＣやグッド緩衝液を用いることが好ましい。グッドバッファーとしては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(N,N-bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane)、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperaxine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid）等が挙げられる。
本発明では、ハイブリダイゼーションバッファーとして、界面活性剤、排除体積効果を有する高分子化合物、標的核酸とプローブ核酸とで形成される複合体の融解温度を変化させる化合物、バックグラウンドノイズの低減作用を持つ核酸を含むことが好ましい。
排除体積効果有する高分子化合物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、特開２０００−３２５０９９号公報）やデキストラン硫酸が知られている。これらの物質を添加することで、その排除体積効果により、核酸が水和する水分子を囲い込むことで、核酸の濃度が増加し、結果としてハイブリダイゼーションの速度が早くなる。従って、これらの物質もハイブリダイゼーションバッファーに添加することが出来る。
排除体積効果有する高分子化合物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、特開２０００−３２５０９９号公報）やデキストラン硫酸が知られている。これらの物質を添加することで、その排除体積効果により、核酸が水和する水分子を囲い込むことで、核酸の濃度が増加し、結果としてハイブリダイゼーションの速度が早くなる。従って、これらの物質もハイブリダイゼーションバッファーに添加することが出来る。
標的核酸とプローブ核酸との融解温度（Ｔｍ，Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ）を変化させる化合物として、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＧｕＳＣＮ、ヨウ素などをハイブリダイゼーションバッファーに添加することが出来る。一般的に、ホルムアミド濃度が１％増加するごとに核酸の融解温度（Ｔｍ）を０．６℃低下させることが出来ると言われている。
これらの組成比、ハイブリダイゼーション温度などを制御することで、配列一致度の高い標識標的核酸はハイブリダイゼーション効率が高く、配列一致度の低い標識標的核酸はハイブリダイゼーション効率が低くなるように調製されている。
ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズなどを減少する作用がある核酸として、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙ ｄＡ、ｔＲＮＡなどの核酸成分は、非特異的なハイブリダイゼーションやプローブ核酸のハイブリダイゼーションやプローブ核酸の膜および基盤への吸着を防ぎ、それらの結果としてバックグランドを抑えることができる。これらの核酸をハイブリダイゼーションバッファーの一つの成分として用いることが出来る。
この他に本発明では、特開２００５−０８７１０９に記載されているように、ハイブリダイゼーションバッファーの組成の一つとして、リン脂質を用いることも出来る。これにより、ハイブリダイゼーションの時間を短縮することが出来る。
さらに、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）をハイブリダイゼーション調製溶液の一つの成分として、用いることもできる。この溶液も、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズを低減させることが出来る。
この他に本発明では、特開２００５−０８７１０９に記載されているように、ハイブリダイゼーションバッファーの組成の一つとして、リン脂質を用いることも出来る。これにより、ハイブリダイゼーションの時間を短縮することが出来る。
さらに、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）をハイブリダイゼーション調製溶液の一つの成分として、用いることもできる。この溶液も、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズを低減させることが出来る。
界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、また、ノニオン性界面活性剤を用いることも出来る。カチオン製界面活性剤としては、cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)、cetyltrimethylammonium chloride (CTACl)、tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB)、tetradecyltrimethylammonium chloride (TTACl)、dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB)、dodecyltrimethylammonium chloride (DTACl)、dodecylethyldimethylammonium bromide (DEDTAB)、decyltrimethylammonium bromide (D10TAB)、dodecyltriphenylphosphonium bromide (DTPB)、Guanidine Thiocyanate、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、アルキルピリジニウムクロリド等を用いることが出来る。また、アニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ステアリン酸ナトリウム、脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸トリエタノールアミン等を用いることが出来る。ノニオン性界面活性剤としては、digitonin、saponin、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル類(Triton X100やX114等)、Tween (20や40、60、80等)、N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide、N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide、Polyoxyethylene (9) Lauryl Ether、Octanoyl-N-methylglucamide、NP-40、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等を用いることが出来る。
アニオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるのが好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、バックグラウンドを効率よく抑えることが出来る。他に、Ｎ−ラウリルサルコシド、ラウリル硫酸リチウムなどが用いられている。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが好ましい。本発明では、これらの界面活性剤を使用することが出来る。
界面活性剤は、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズを減少させる作用を持つものとして知られている。
アニオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるのが好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、バックグラウンドを効率よく抑えることが出来る。他に、Ｎ−ラウリルサルコシド、ラウリル硫酸リチウムなどが用いられている。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが好ましい。本発明では、これらの界面活性剤を使用することが出来る。
界面活性剤は、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズを減少させる作用を持つものとして知られている。
例えば、核酸マイクロアレイ用のハイブリダイゼーション調製溶液の一般的な組成として、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡ、ポリＡ、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡのハイブリダイゼーション調製溶液が用いられる（細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ１ ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、村松正明、那波宏之監修）。例えば、ＣＧＨアレイの場合には、ハイブリダイゼーション調製溶液として、ホルムアミド、デキストラン硫酸、２０×ＳＳＣ、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、２０％ＳＤＳのハイブリダイゼーション調製溶液が用いられる（井本逸勢、稲澤譲治、細胞工学 Ｖｏｌ２３，ｐ３５５，２００４）。
さらに、４級アンモニウム塩であるベタインをハイブリダイゼーションバッファーの一つの成分として用いることも出来る。ベタインは、核酸の水素結合に関与し、非特異的なハイブリダイゼーションを抑える作用が報告されている(Biochemistry 32, 137-144(1993))。
さらに、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）もハイブリダイゼーションバッファーの一つの成分として用いることも出来る。(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1585-1588 (1985))。
また、市販されている、例えば、ExpressHyb (Clontech)、PerfectHyb (東洋紡績株式会社)、ULTRAhyb(Ambion)などをハイブリダイゼーションバッファーとして転用することも出来る。
さらに、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）もハイブリダイゼーションバッファーの一つの成分として用いることも出来る。(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1585-1588 (1985))。
また、市販されている、例えば、ExpressHyb (Clontech)、PerfectHyb (東洋紡績株式会社)、ULTRAhyb(Ambion)などをハイブリダイゼーションバッファーとして転用することも出来る。
従来、ハイブリダイゼーション用溶液の調製時には、標識標的核酸含有液、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡなどのブロック核酸含有液、バッファー、その他の試薬の混合により、その溶液量が加算される結果、多くなる。そこで、本発明者らが鋭意検討を行った結果、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡなどのブロック核酸含有液に含まれている溶媒を除去することを見出し、この問題点を解決するに至った。例えば、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーション反応の場合には、繰り返し配列をブロックするためにＣｏｔ−１ ＤＮＡを数十μｇ、市販品の多くは１μｇ／μＬの濃度なので、数十μＬの水溶液をハイブリダイゼーション用の試薬が混合された調製溶液と混合することになる。本発明では、あらかじめＣｏｔ−１ ＤＮＡなどのブロック核酸を精製工程によって濃縮した後、濃縮もしくは核酸吸着性固体に吸着したブロック核酸をバッファー含有溶液で溶解もしくは溶出させる操作を行っている。もし、この操作を行わなければ、未精製標識標的核酸含有溶液とハイブリダイゼーション用調製溶液とを混合したハイブリダイゼーションする直前の溶液の液量が大幅に増加し、標識標的核酸の濃度が大幅に低下し、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションの性能が大幅に低下する。
また、本発明で用いられるハイブリダイゼーションバッファーは、使用者（本発明の方法の実施者）自らが調製せずとも、本発明を実施するためのキット製造者等があらかじめ調製しておくこともでき、この態様が好ましい。
また、本発明で用いられるハイブリダイゼーションバッファーは、使用者（本発明の方法の実施者）自らが調製せずとも、本発明を実施するためのキット製造者等があらかじめ調製しておくこともでき、この態様が好ましい。
本発明で言うところのハイブリダイゼーション用溶液とは、ブロック核酸及びバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファー、未精製標識核酸溶液、およびその他の試薬を含むもののことを言い、加熱などの操作を行うことによって、直ちに、核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションを行うことの出来る溶液のことを言う。
本発明のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法は、前述の未精製標識標的核酸溶液とハイブリダイゼーションバッファーとを混合するものであるが、その混合方法としては特に限定されるものではない。
本発明のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法は、前述の未精製標識標的核酸溶液とハイブリダイゼーションバッファーとを混合するものであるが、その混合方法としては特に限定されるものではない。
本発明の方法は、すべての工程を手作業で行うこともできるし、部分的に自動化された機械で行うこともできるし、全工程を自動化された機械で行うこともできる。自動化を行うことにより、各工程の精度、例えば、分注精度や反応時間、反応温度を手作業と比較して正確に制御することが出来るので、ハイブリダイゼーションの精度が向上すると共に、面倒な作業をしなくてもよくなる。
本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液は、溶液によるハイブリダイゼーション、メンブランによるハイブリダイゼーション、核酸マイクロアレイによるハイブリダイゼーションのいずれにも適用することができるが、核酸マイクロアレイによるハイブリダイゼーションに適用するのが実用的であり好ましい。
本発明で言うところの、核酸マイクロアレイとは、固体材料表面にプローブ核酸を高密度に結合させたものを言う。固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料など、プローブ核酸が結合可能な材料であれば良く、特に限定はしない。さらに、ゲル状物質の内部にプローブ核酸を封じ込めたものも使用することが出来る。固体材料の形状も、平面状、突起状物の頂上、粒子状、細管の内部など、特に限定しない。本発明での核酸マイクロアレイは、スポッターなどによって製造されたＤＮＡマイクロアレイや半導体技術によって製造されたＤＮＡチップも含むものとする。
プローブ核酸は、試料とハイブリダイゼーション可能な核酸のことを指し、試料と完全にハイブリダイゼーションしても良く、部分的なハイブリダイゼーションでも良く、少なくとも試料核酸の塩基数で５０％以上ハイブリダイゼーションするものであれば良い。
プローブ核酸は、試料とハイブリダイゼーション可能な核酸のことを指し、試料と完全にハイブリダイゼーションしても良く、部分的なハイブリダイゼーションでも良く、少なくとも試料核酸の塩基数で５０％以上ハイブリダイゼーションするものであれば良い。
プローブ核酸は、化学合成した核酸、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosomes）、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosomes）ＰＡＣ（plant Artificial Chromosomes）、ＨＡＣ（Human Artificial Chromosomes）、ＴＡＣ（Transformation-competent Artificial Chromosomes）、Ｐ１、コスミドなどを使用することが出来る。さらに、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸をプローブ核酸として使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
プローブ核酸を固体基板上に結合させる方法は、ＧｅｎｅＣｈｉｐを代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、一ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のｐＨを変化させそのｐＨ変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてｃＤＮＡをスポットする方法などを用いることが出来る。スポット方式も、インクジェット方式、ピンアレイ方式などを用いることが出来る。
核酸マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションを読み取る方法として、本発明で最も好適に用いられる方法は、蛍光スキャナーを用いる方法である。標識標的核酸の標識化合物として蛍光物質を用いた場合に好適に用いられる。蛍光スキャナーとしては、例えば、ＦＬＡ−８０００（富士フイルム株式会社）やＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）などがある。さらに、微粒子を標識化合物として用いた場合には、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）なども用いることが出来る。さらに、標識化合物として、化学発光を用いた場合には、目で直接観察することも出来る。本発明でも、これらの方法を用いることが出来る。
本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液は、多検体マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに適用することもできる。
多検体マイクロアレイとは、１枚のマイクロアレイ上に２つ以上のハイブリダイゼーション部位を有する核酸マイクロアレイのことと本発明では定義している。ハイブリダイゼーションを行う部分は、互いにハイブリダイゼーション用溶液が混合しないようにしておくことが必要である。例えば、ハイブリダイゼーション部位間の距離を離しておくこともできる。また、ハイブリダイゼーション部位とそれ以外の部位との極性を変えておく、例えば、ハイブリダイゼーション部位は親水性にし、それ以外の部分を疎水性にしておく。また、ハイブリダイゼーション部分とそれ以外の部分との高さを変えることも出来る。例えば、ハイブリダイゼーション部位の材料の高さをハイブリダイゼーション部位以外の部分に対して低くしておくことや、ハイブリダイゼーション部位と関係のない部分をシールなどで貼ることにより、ハイブリダイゼーション部分を低くすることが出来る。ハイブリダイゼーション部位の数は、本発明では特に限定せず、多検体マイクロアレイの場合、２個以上であれば良い。また、ハイブリダイゼーション部位に固定化するプローブの種類、濃度、スポットの数、位置は同一であることが好ましいが、同一でなくとも、データ処理において補正が可能な場合もあるので、特に限定しない。例えば、単色法ＣＧＨアレイの場合、１つのスライドガラス上に正常細胞由来の核酸がハイブリダイゼーションする部分と異常細胞由来の核酸がハイブリダイゼーションする部分とを形成させておき、ハイブリダイゼーション後、両者のＬｏｇＲａｔｉｏ比を蛍光値から計算することによって、コピー数を算出することが出来る。また、多検体マイクロアレイは一般的に１つのハイブリダイゼーション部位が小さく標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の液量を減らすことが出来、使用する標的核酸の量も減らすことが可能であり、コストを大幅に下げることが出来ると共に、一度に多数のハイブリダイゼーションが行えるので、必要時間が大幅に低下し、その工程数も大幅に低下させることが出来る。
多検体マイクロアレイとは、１枚のマイクロアレイ上に２つ以上のハイブリダイゼーション部位を有する核酸マイクロアレイのことと本発明では定義している。ハイブリダイゼーションを行う部分は、互いにハイブリダイゼーション用溶液が混合しないようにしておくことが必要である。例えば、ハイブリダイゼーション部位間の距離を離しておくこともできる。また、ハイブリダイゼーション部位とそれ以外の部位との極性を変えておく、例えば、ハイブリダイゼーション部位は親水性にし、それ以外の部分を疎水性にしておく。また、ハイブリダイゼーション部分とそれ以外の部分との高さを変えることも出来る。例えば、ハイブリダイゼーション部位の材料の高さをハイブリダイゼーション部位以外の部分に対して低くしておくことや、ハイブリダイゼーション部位と関係のない部分をシールなどで貼ることにより、ハイブリダイゼーション部分を低くすることが出来る。ハイブリダイゼーション部位の数は、本発明では特に限定せず、多検体マイクロアレイの場合、２個以上であれば良い。また、ハイブリダイゼーション部位に固定化するプローブの種類、濃度、スポットの数、位置は同一であることが好ましいが、同一でなくとも、データ処理において補正が可能な場合もあるので、特に限定しない。例えば、単色法ＣＧＨアレイの場合、１つのスライドガラス上に正常細胞由来の核酸がハイブリダイゼーションする部分と異常細胞由来の核酸がハイブリダイゼーションする部分とを形成させておき、ハイブリダイゼーション後、両者のＬｏｇＲａｔｉｏ比を蛍光値から計算することによって、コピー数を算出することが出来る。また、多検体マイクロアレイは一般的に１つのハイブリダイゼーション部位が小さく標識標的核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の液量を減らすことが出来、使用する標的核酸の量も減らすことが可能であり、コストを大幅に下げることが出来ると共に、一度に多数のハイブリダイゼーションが行えるので、必要時間が大幅に低下し、その工程数も大幅に低下させることが出来る。
本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液を、マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに適用した後、各スポットの標識値を蛍光スキャナーなどで読み取った後、実質的に同一種、同一量の核酸プローブをスポットしたスポットの平均値を算出し、その核酸プローブの蛍光値とすることが出来る。これにより、例えば、ＣＧＨアレイの場合、そのＬｏｇＲａｔｉｏ比のバラツキが減少し、コピー数を正確に判定でき、さらには、癌等の診断精度が向上する。また、実質的に同一種、同一量の核酸プローブ群の内、最大値と最小値を除いた平均値を使用することも出来るし、核酸プローブ群の平均蛍光強度からある敷居値を除いたスポットの蛍光値を使用することも出来る。また、本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液を、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに適用する場合、使用することの出来る、実質的に同一種、同一量の核酸プローブのスポット数は、１つ以上あれば良く、スポット面積が許す限り多い方が好ましい。
本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液を、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに適用する場合、ダイスワップ法を用いることもできる。ダイスワップ法は、例えば、ＣＧＨアレイの場合、正常細胞をＣｙ３で、異常細胞をＣｙ５で標識した場合、これと反対に、正常細胞をＣｙ５で、異常細胞をＣｙ３で標識することにより、標識化合物による酵素の取り込み効率の異なりを補正する方法である。
また、本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液を、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに適用する場合、サブトラクション法によって、核酸マイクロアレイの精度を上げることも出来る。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（representational difference analysis）法、ＤｓＤＤ（Duplex-specific Direct Digestion）法等を用いることが出来る。
また、本発明の調製方法で得られたハイブリダイゼーション用溶液を、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションに適用する場合、サブトラクション法によって、核酸マイクロアレイの精度を上げることも出来る。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（representational difference analysis）法、ＤｓＤＤ（Duplex-specific Direct Digestion）法等を用いることが出来る。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
精製した標識標的核酸を用いた二色法ＣＧＨアレイ
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＦｅｍａｌｅ ＤＮＡを３μＬ（約０．８μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ，ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１ｕＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＦｅｍａｌｅ ＤＮＡを３μＬ（約０．８μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ，ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１ｕＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
＜精製標識標的核酸溶液の調製およびハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）を６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに移した後、混合し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を主成分とする７０％エタノール溶液を試料液量の３倍量、すなわち、３１５μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘ処理を１５秒間行った後、スピンダウン処理を行い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）のカートリッジＣＡＳに全量添加した。１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットしたＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液及び廃液容器ＷＴＳを捨て、新しい廃液容器ＷＴＳをカートリッジＣＡＳにセットした。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を主成分とする６０％エタノールからなる洗浄液を７５０μＬ、カートリッジＣＡＳに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液を捨て、もう一度、洗浄液７５０μＬをカートリッジに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。通過液と廃液容器を捨て、１．７ｍＬ容マイクロチューブを回収チューブとして、カートリッジにセットした。次に、２０％ＳＤＳを１８μＬ、水を４０μＬカートリッジに添加し、２４０秒間インキュベーションを行った後、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ及び回収チューブを遠心機から取り出し、カートリッジにＭＭ＃１（デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０×ＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、液量を７ｍＬとしたもの）溶液を２０μＬ添加し、２４０秒間インキュベーションを行った。これを、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。遠心機からカートリッジと回収チューブとを取り出し、カートリッジを捨て、２種の溶液の通過液を含む回収チューブ内の溶液を混合するために、Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）を６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに移した後、混合し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を主成分とする７０％エタノール溶液を試料液量の３倍量、すなわち、３１５μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘ処理を１５秒間行った後、スピンダウン処理を行い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）のカートリッジＣＡＳに全量添加した。１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットしたＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液及び廃液容器ＷＴＳを捨て、新しい廃液容器ＷＴＳをカートリッジＣＡＳにセットした。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を主成分とする６０％エタノールからなる洗浄液を７５０μＬ、カートリッジＣＡＳに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液を捨て、もう一度、洗浄液７５０μＬをカートリッジに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。通過液と廃液容器を捨て、１．７ｍＬ容マイクロチューブを回収チューブとして、カートリッジにセットした。次に、２０％ＳＤＳを１８μＬ、水を４０μＬカートリッジに添加し、２４０秒間インキュベーションを行った後、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ及び回収チューブを遠心機から取り出し、カートリッジにＭＭ＃１（デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０×ＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、液量を７ｍＬとしたもの）溶液を２０μＬ添加し、２４０秒間インキュベーションを行った。これを、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。遠心機からカートリッジと回収チューブとを取り出し、カートリッジを捨て、２種の溶液の通過液を含む回収チューブ内の溶液を混合するために、Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
ＣＧＨアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、１６遺伝子を４スポットずつスポットした、６４スポットの核酸マイクロアレイを用いた。
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへＣＧＨアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ，ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、ＣＧＨアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、ＣＧＨアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、ＣＧＨアレイを乾燥させた。
ＣＧＨアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、１６遺伝子を４スポットずつスポットした、６４スポットの核酸マイクロアレイを用いた。
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへＣＧＨアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ，ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、ＣＧＨアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、ＣＧＨアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、ＣＧＨアレイを乾燥させた。
ブロッキング後、沸騰水にＣＧＨアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノール、−２０℃の８５％エタノール、−２０℃の１００％エタノールに浸し、スピンドライヤーで１分間の遠心を行うことでＣＧＨアレイを乾燥させた。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜精製標識標的核酸溶液の調製およびハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１（蝶プラ工業株式会社）に入れ、３７℃で１６時間、恒温槽（ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ，ＨＢ−８０、タイテック株式会社）中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜精製標識標的核酸溶液の調製およびハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１（蝶プラ工業株式会社）に入れ、３７℃で１６時間、恒温槽（ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ，ＨＢ−８０、タイテック株式会社）中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
ハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣの溶液４５ｍＬを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然にスライドガラスから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたスライドガラスを、５０ｍＬのスミロンチューブ（住友ベークライト株式会社）に４５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液の中に入れ、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲの中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の中に入れ、恒温槽の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことでＣＧＨアレイを乾燥させた。
ハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣの溶液４５ｍＬを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然にスライドガラスから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたスライドガラスを、５０ｍＬのスミロンチューブ（住友ベークライト株式会社）に４５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液の中に入れ、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲの中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の中に入れ、恒温槽の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことでＣＧＨアレイを乾燥させた。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。結果は図２に示した。
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。結果は図２に示した。
未精製標識標的核酸溶液を用いた二色法ＣＧＨアレイ
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
比較例１の＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞と同様の方法で未精製標識標的核酸溶液を調製した。なお、比較例１と同様に、試料として、ＦｅｍａｌｅとＭａｌｅとを用い、ＦｅｍａｌｅはＣｙ３で、ＭａｌｅはＣｙ５で標識した。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
比較例１の＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞と同様の方法で未精製標識標的核酸溶液を調製した。なお、比較例１と同様に、試料として、ＦｅｍａｌｅとＭａｌｅとを用い、ＦｅｍａｌｅはＣｙ３で、ＭａｌｅはＣｙ５で標識した。
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液（ハイブリダイゼーションバッファー）の調製＞
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１） ６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れ、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を主成分とする７０％エタノール溶液を試料液量の３倍量、すなわち、１９５μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘ処理を１５秒間行った後、スピンダウン処理を行い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）のカートリッジＣＡＳに全量添加した。１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットしたＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液及び廃液容器ＷＴＳを捨て、新しい廃液容器ＷＴＳをカートリッジＣＡＳにセットした。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を主成分とする６０％エタノール水溶液から構成された洗浄液７５０μＬをカートリッジＣＡＳに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液を捨て、もう一度、洗浄液７５０μＬをカートリッジに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。通過液と廃液容器を捨て、１．７ｍＬ容マイクロチューブを回収チューブとして、カートリッジにセットした。次に、１８μＬの２０％ＳＤＳをカートリッジに添加し、２４０秒間インキュベーションを行った後、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ及び回収チューブを遠心機から取り出し、カートリッジにＭＭ＃１溶液を２０μＬ添加し、２４０秒間インキュベーションを行った。これを、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。遠心機からカートリッジと回収チューブとを取り出し、カートリッジを捨て、２種の溶液の通過液を含む回収チューブ内の溶液を混合するために、Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１） ６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れ、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を主成分とする７０％エタノール溶液を試料液量の３倍量、すなわち、１９５μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘ処理を１５秒間行った後、スピンダウン処理を行い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）のカートリッジＣＡＳに全量添加した。１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットしたＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液及び廃液容器ＷＴＳを捨て、新しい廃液容器ＷＴＳをカートリッジＣＡＳにセットした。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を主成分とする６０％エタノール水溶液から構成された洗浄液７５０μＬをカートリッジＣＡＳに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液を捨て、もう一度、洗浄液７５０μＬをカートリッジに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。通過液と廃液容器を捨て、１．７ｍＬ容マイクロチューブを回収チューブとして、カートリッジにセットした。次に、１８μＬの２０％ＳＤＳをカートリッジに添加し、２４０秒間インキュベーションを行った後、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ及び回収チューブを遠心機から取り出し、カートリッジにＭＭ＃１溶液を２０μＬ添加し、２４０秒間インキュベーションを行った。これを、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。遠心機からカートリッジと回収チューブとを取り出し、カートリッジを捨て、２種の溶液の通過液を含む回収チューブ内の溶液を混合するために、Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
＜ハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した２種の未精製標識標的核酸溶液を各２０μＬと、＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液（ハイブリダイゼーションバッファー）の調製＞で調製したＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液を３８μＬとを、１．７ｍＬ容マイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した２種の未精製標識標的核酸溶液を各２０μＬと、＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液（ハイブリダイゼーションバッファー）の調製＞で調製したＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液を３８μＬとを、１．７ｍＬ容マイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。
＜結果＞
結果は図３、図４に示した。
図３の０番から３５番目までが、常染色体、３６番から５９番目がＸ染色体、６０番目から６３番目がＹ染色体に由来する結果である。常染色体とＸ染色体とがはっきりと分かれており、ＣＧＨアレイとして十分な性能を持っている。
図４が常染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値と、Ｘ染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値との差を、精製を行った標識標的核酸と精製を行っていない標識標的核酸とを図示したものである。この差が大きいほど、ＣＧＨアレイとしては性能が良いことを示している。理論上は、Ｘ染色体と常染色体との差は、１．０になる。精製を行っていないものは、この差が０．６６７となり、精製を行ったものの結果、０．６３６に対して、約０．０３良くなった。
図１に精製を行った場合のプロトコール概略図（ａ）と精製を行わない場合のプロトコール概略図（ｂ）とを示した。精製を行わなかった分、プロトコールは簡略化され、プロトコール作業時間も短縮された。
以上のように、精製を行わないプロトコールは、プロトコールが簡略化すると共に、その性能が向上した。
結果は図３、図４に示した。
図３の０番から３５番目までが、常染色体、３６番から５９番目がＸ染色体、６０番目から６３番目がＹ染色体に由来する結果である。常染色体とＸ染色体とがはっきりと分かれており、ＣＧＨアレイとして十分な性能を持っている。
図４が常染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値と、Ｘ染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値との差を、精製を行った標識標的核酸と精製を行っていない標識標的核酸とを図示したものである。この差が大きいほど、ＣＧＨアレイとしては性能が良いことを示している。理論上は、Ｘ染色体と常染色体との差は、１．０になる。精製を行っていないものは、この差が０．６６７となり、精製を行ったものの結果、０．６３６に対して、約０．０３良くなった。
図１に精製を行った場合のプロトコール概略図（ａ）と精製を行わない場合のプロトコール概略図（ｂ）とを示した。精製を行わなかった分、プロトコールは簡略化され、プロトコール作業時間も短縮された。
以上のように、精製を行わないプロトコールは、プロトコールが簡略化すると共に、その性能が向上した。
精製した標識標的核酸を用いた単色法ＣＧＨアレイ
＜酵素分解ＤＮＡの調製＞
ＤＮＡ（Ｆｅｍａｌｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ製）試料１．５μｇを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れ、そこに制限酵素ＤｐｎＩＩ用Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬａｂｓ製）を１０μＬ、ＤｐｎＩＩ（ＢｉｏＬａｂｓ製）を３μＬ（３０Ｕ）加え、水を添加することによって全量を１００μＬとした。３７℃２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（ＡＳＴＥＣ製）にて酵素反応を行った。Ｍａｌｅ ＤＮＡについても同様に酵素分解反応を行った。
＜酵素分解ＤＮＡの精製＞
反応生成物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ製）を使用し、添付のプロトコールに従って精製を行った。抽出液量は、２８μＬとした。精製は、Ｆｅｍａｌｅ、Ｍａｌｅともに行った。
＜酵素分解ＤＮＡの調製＞
ＤＮＡ（Ｆｅｍａｌｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ製）試料１．５μｇを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れ、そこに制限酵素ＤｐｎＩＩ用Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬａｂｓ製）を１０μＬ、ＤｐｎＩＩ（ＢｉｏＬａｂｓ製）を３μＬ（３０Ｕ）加え、水を添加することによって全量を１００μＬとした。３７℃２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（ＡＳＴＥＣ製）にて酵素反応を行った。Ｍａｌｅ ＤＮＡについても同様に酵素分解反応を行った。
＜酵素分解ＤＮＡの精製＞
反応生成物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ製）を使用し、添付のプロトコールに従って精製を行った。抽出液量は、２８μＬとした。精製は、Ｆｅｍａｌｅ、Ｍａｌｅともに行った。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブに酵素分解処理Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２１μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌを３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加し、３０秒間攪拌した。
上記操作を酵素分解処理Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｆｅｍａｌｅと同じく、Ｃｙ３−ｄＣＴＰを用いた。
１．７ｍＬ容マイクロチューブに酵素分解処理Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを２１μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌを３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加し、３０秒間攪拌した。
上記操作を酵素分解処理Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｆｅｍａｌｅと同じく、Ｃｙ３−ｄＣＴＰを用いた。
＜精製標識標的核酸溶液の調製およびハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を５５μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）を６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに移した後、混合し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を主成分とする７０％エタノール溶液を試料液量の３倍量、すなわち、３１５μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘ処理を１５秒間行った後、スピンダウン処理を行い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）のカートリッジＣＡＳに全量添加した。１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットしたＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液及び廃液容器ＷＴＳを捨て、新しい廃液容器ＷＴＳをカートリッジＣＡＳにセットした。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を主成分とする６０％エタノールからなる洗浄液７５０μＬをカートリッジＣＡＳに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液を捨て、もう一度、洗浄液７５０μＬをカートリッジに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。通過液と廃液容器を捨て、１．７ｍＬ容マイクロチューブを回収チューブとして、カートリッジにセットした。次に、２０％ＳＤＳを１８μＬ、水を９μＬカートリッジに添加し、２４０秒間インキュベーションを行った後、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ及び回収チューブを遠心機から取り出し、カートリッジにＭＭ＃１溶液を２０μＬ添加し、２４０秒間インキュベーションを行った。これを、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。遠心機からカートリッジと回収チューブとを取り出し、カートリッジを捨て、２種の溶液の通過液を含む回収チューブ内の溶液を混合するために、Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
この処理を、Ｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液に対しても同様に行った。
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を５５μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）を６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに移した後、混合し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を主成分とする７０％エタノール溶液を試料液量の３倍量、すなわち、３１５μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘ処理を１５秒間行った後、スピンダウン処理を行い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰ ｋｉｔ（富士フイルム株式会社）のカートリッジＣＡＳに全量添加した。１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットしたＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液及び廃液容器ＷＴＳを捨て、新しい廃液容器ＷＴＳをカートリッジＣＡＳにセットした。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）を主成分とする６０％エタノールからなる洗浄液７５０μＬをカートリッジＣＡＳに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ通過液を捨て、もう一度、洗浄液７５０μＬをカートリッジに添加し、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。通過液と廃液容器を捨て、１．７ｍＬ容マイクロチューブを回収チューブとして、カートリッジにセットした。次に、２０％ＳＤＳを１８μＬ、水を９μＬカートリッジに添加し、２４０秒間インキュベーションを行った後、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。カートリッジ及び回収チューブを遠心機から取り出し、カートリッジにＭＭ＃１溶液を２０μＬ添加し、２４０秒間インキュベーションを行った。これを、１００００×ｇ、遠心時間１分間にセットした遠心機にカートリッジを入れ、室温下遠心処理を行った。遠心機からカートリッジと回収チューブとを取り出し、カートリッジを捨て、２種の溶液の通過液を含む回収チューブ内の溶液を混合するために、Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
この処理を、Ｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液に対しても同様に行った。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。ただし、単色法なので合計２枚のＣＧＨアレイを前処理した。
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。ただし、単色法なので合計２枚のＣＧＨアレイを前処理した。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜精製標識標的核酸溶液の調製およびハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の精製標識標的核酸の試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
別のＣＧＨアレイにＭａｌｅ ＤＮＡ由来の精製標識標的核酸の試料溶液を滴下し、上記と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
＜精製標識標的核酸溶液の調製およびハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の精製標識標的核酸の試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
別のＣＧＨアレイにＭａｌｅ ＤＮＡ由来の精製標識標的核酸の試料溶液を滴下し、上記と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。洗浄も、それぞれのアレイに対して行った。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたＣＧＨアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、それぞれのＣＧＨアレイに対してスキャニングを行ない、それぞれから得られた蛍光値を用いて、解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。図５に結果を示した。
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。洗浄も、それぞれのアレイに対して行った。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたＣＧＨアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、それぞれのＣＧＨアレイに対してスキャニングを行ない、それぞれから得られた蛍光値を用いて、解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。図５に結果を示した。
未精製標識標的核酸溶液を用いた単色法ＣＧＨアレイ
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブにＦｅｍａｌｅ ＤＮＡを３μＬ（０．７５μｇ）、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌを３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加し、３０秒間攪拌した。
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｆｅｍａｌｅと同じく、Ｃｙ３−ｄＣＴＰを用いた。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブにＦｅｍａｌｅ ＤＮＡを３μＬ（０．７５μｇ）、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌを３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加し、３０秒間攪拌した。
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｆｅｍａｌｅと同じく、Ｃｙ３−ｄＣＴＰを用いた。
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液（ハイブリダイゼーションバッファー）の調製＞
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を６．５μＬ、−２０℃のエタノールを１６７μＬ添加し、軽く混合した後、−８０℃で１０分間放置した。１０分後、１５０００ｒｐｍ、３０分、温度４℃に設定した遠心機を用いて、遠心処理を行った。３０分後、遠心機からマイクロチューブを取り出し、ピペットを用いてマイクロチューブ内の上清を吸い取り、捨てた。マイクロチューブ内の残存エタノールを乾燥除去するため、１０分間マイクロチューブのフタを開けたまま放置した。１０分後、２０％ＳＤＳを添加し、３０分間、沈殿物の溶解を促すために静置した。３０分後、沈殿物が完全に溶解するまで攪拌処理を行った。次に、ＭＭ＃１を２０μＬ添加し、溶液が均一になるまで攪拌処理を行った。この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）６５μＬを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を６．５μＬ、−２０℃のエタノールを１６７μＬ添加し、軽く混合した後、−８０℃で１０分間放置した。１０分後、１５０００ｒｐｍ、３０分、温度４℃に設定した遠心機を用いて、遠心処理を行った。３０分後、遠心機からマイクロチューブを取り出し、ピペットを用いてマイクロチューブ内の上清を吸い取り、捨てた。マイクロチューブ内の残存エタノールを乾燥除去するため、１０分間マイクロチューブのフタを開けたまま放置した。１０分後、２０％ＳＤＳを添加し、３０分間、沈殿物の溶解を促すために静置した。３０分後、沈殿物が完全に溶解するまで攪拌処理を行った。次に、ＭＭ＃１を２０μＬ添加し、溶液が均一になるまで攪拌処理を行った。この工程は、ユーザーが行うのではなく、キット製造者があらかじめ調製しておくことが好ましい。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。ただし、単色法なので合計２枚のＣＧＨアレイを前処理した。
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。ただし、単色法なので合計２枚のＣＧＨアレイを前処理した。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を２０μＬと＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液（ハイブリダイゼーションバッファー）の調製＞で調製したＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液を３８μＬとを混合した。この混合液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
別のＣＧＨアレイにＭａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を滴下し、上記と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を２０μＬと＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液（ハイブリダイゼーションバッファー）の調製＞で調製したＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液を３８μＬとを混合した。この混合液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
別のＣＧＨアレイにＭａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を滴下し、上記と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。洗浄も、それぞれのアレイに対して行った。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたＣＧＨアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、それぞれのＣＧＨアレイに対してスキャニングを行ない、それぞれから得られた蛍光値を用いて、解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。洗浄も、それぞれのアレイに対して行った。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたＣＧＨアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、それぞれのＣＧＨアレイに対してスキャニングを行ない、それぞれから得られた蛍光値を用いて、解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値をプロットした。
＜結果＞
結果は図６、図７に示した。
図６の０番から３５番目までが、常染色体、３６番から５９番目がＸ染色体、６０番目から６３番目がＹ染色体に由来する結果である。常染色体とＸ染色体とがはっきりと分かれており、ＣＧＨアレイとして十分な性能を持っている。
図７が常染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値と、Ｘ染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値との差を、精製を行った標識標的核酸と精製を行っていない標識標的核酸とを図示したものである。この差が大きいほど、ＣＧＨアレイとしては性能が良いことを示している。理論上は、Ｘ染色体と常染色体との差は、１．０になる。精製を行っていないものは、この差が０．５０１となり、精製を行ったものの結果、０．４８０に対して、約０．０２良くなった。
実施例１と同じく、精製を行わなかった分、プロトコールは簡略化され、プロトコール作業時間も短縮された。具体的には、非特許文献６に示された方法で本実施例と同様の実験を行った場合には、１週間以上かかるが、本発明者らの方法では、２１時間で全工程を終了させることが出来、従来法と比較して約７分の１に短時間化された。さらに、非特許文献６で示された工程数も本発明者らの方法と比較すると、約７０工程が約２０工程へと、約３分の１に短縮化された。
以上のように、精製を行わないプロトコールは、プロトコールが簡略化すると共に、その性能も向上した。
結果は図６、図７に示した。
図６の０番から３５番目までが、常染色体、３６番から５９番目がＸ染色体、６０番目から６３番目がＹ染色体に由来する結果である。常染色体とＸ染色体とがはっきりと分かれており、ＣＧＨアレイとして十分な性能を持っている。
図７が常染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値と、Ｘ染色体のＬｏｇＲａｔｉｏ値の平均値との差を、精製を行った標識標的核酸と精製を行っていない標識標的核酸とを図示したものである。この差が大きいほど、ＣＧＨアレイとしては性能が良いことを示している。理論上は、Ｘ染色体と常染色体との差は、１．０になる。精製を行っていないものは、この差が０．５０１となり、精製を行ったものの結果、０．４８０に対して、約０．０２良くなった。
実施例１と同じく、精製を行わなかった分、プロトコールは簡略化され、プロトコール作業時間も短縮された。具体的には、非特許文献６に示された方法で本実施例と同様の実験を行った場合には、１週間以上かかるが、本発明者らの方法では、２１時間で全工程を終了させることが出来、従来法と比較して約７分の１に短時間化された。さらに、非特許文献６で示された工程数も本発明者らの方法と比較すると、約７０工程が約２０工程へと、約３分の１に短縮化された。
以上のように、精製を行わないプロトコールは、プロトコールが簡略化すると共に、その性能も向上した。
未精製標識標的核酸溶液を用いた単色法ＣＧＨアレイ−１つの正常細胞の電子データを用いた場合の結果
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡのＣＧＨアレイの蛍光値を取得し、２個のＭａｌｅ ＤＮＡとの間でＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションを行った。本実施例は、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを電子データで供給するＤＮＡと仮定して実験を行った。すなわち、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡと１つめのＭａｌｅ ＤＮＡとの間でのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーション、およびＦｅｍａｌｅ ＤＮＡと２つめのＭａｌｅ ＤＮＡとのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションを行った。電子データで供給するＤＮＡとして、例えば、正常細胞由来のＤＮＡを用いることが出来る。
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡのＣＧＨアレイの蛍光値を取得し、２個のＭａｌｅ ＤＮＡとの間でＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションを行った。本実施例は、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを電子データで供給するＤＮＡと仮定して実験を行った。すなわち、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡと１つめのＭａｌｅ ＤＮＡとの間でのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーション、およびＦｅｍａｌｅ ＤＮＡと２つめのＭａｌｅ ＤＮＡとのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションを行った。電子データで供給するＤＮＡとして、例えば、正常細胞由来のＤＮＡを用いることが出来る。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
実施例２の＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞と同様の方法で未精製標識標的核酸溶液を調製した。ただし、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を１個、Ｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を２個準備した。いずれも、標識は、Ｃｙ３で行った。
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞
実施例２の＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞と同様の方法で調製した。ただし、３個準備した。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
実施例２の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。ただし、単色法であり、Ｆｅｍａｌｅ由来のＣＧＨアレイは１枚のみでよいので、合計３枚のＣＧＨアレイを前処理した。
＜ハイブリダイゼーション＞
実施例２の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイを１枚、Ｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイを２枚用いて行った。
実施例２の＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞と同様の方法で未精製標識標的核酸溶液を調製した。ただし、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を１個、Ｍａｌｅ ＤＮＡ由来の未精製標識標的核酸溶液を２個準備した。いずれも、標識は、Ｃｙ３で行った。
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞
実施例２の＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞と同様の方法で調製した。ただし、３個準備した。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
実施例２の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。ただし、単色法であり、Ｆｅｍａｌｅ由来のＣＧＨアレイは１枚のみでよいので、合計３枚のＣＧＨアレイを前処理した。
＜ハイブリダイゼーション＞
実施例２の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイを１枚、Ｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイを２枚用いて行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
実施例２の＜マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。洗浄も、それぞれのアレイに対して行った。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、それぞれのＣＧＨアレイに対してスキャニングを行った。Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイと一つ目のＭａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイの蛍光値からＬｏｇＲａｔｉｏを算出した。また、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイと二つ目のＭａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイの蛍光値からＬｏｇＲａｔｉｏを算出した。
実施例２の＜マイクロアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。洗浄も、それぞれのアレイに対して行った。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、それぞれのＣＧＨアレイに対してスキャニングを行った。Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイと一つ目のＭａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイの蛍光値からＬｏｇＲａｔｉｏを算出した。また、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイと二つ目のＭａｌｅ ＤＮＡ由来のＣＧＨアレイの蛍光値からＬｏｇＲａｔｉｏを算出した。
＜結果＞
結果は図８に示した。（ａ）はＦｅｍａｌｅ ＤＮＡと一つ目のＭａｌｅ ＤＮＡとのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションの結果を示すものであり、（ｂ）はＦｅｍａｌｅ ＤＮＡと二つ目のＭａｌｅ ＤＮＡとのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションの結果を示すものである。
両結果ともに、常染色体とＸ染色体とがはっきりと分かれており、ＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションは、十分な性能を持っていた。すなわち、比較する細胞由来のＤＮＡの内、共通に使用することが出来るＤＮＡがある場合には、それらの蛍光値の電子データのみを供給し、実験では、他方の比較する細胞由来のＤＮＡのみ実験し、蛍光値電子データと実験した細胞由来のＤＮＡとの間で解析を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏを算出し、そのコピー数を比較することが出来る。
より、具体的には、例えば、正常細胞由来のＤＮＡをキット製造元のメーカーが供給し、ユーザーが異常細胞、例えば、がん細胞から抽出したＤＮＡを用いてＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションを行い、電子化された正常細胞の蛍光値、異常細胞由来のＣＧＨアレイ上の蛍光値との間で解析を行ってＬｏｇＲａｔｉｏを算出し、コピー数を得ることが出来る。正常細胞由来の蛍光値を１つ用意しておけば、異常細胞由来のＣＧＨアレイは何枚でもそのコピー数を算出するのに使用することが出来る。この方法により、必要なＣＧＨアレイの枚数が最大半分となり、それらの試薬のコストも半分、プロトコールも半分に短縮化できる。
結果は図８に示した。（ａ）はＦｅｍａｌｅ ＤＮＡと一つ目のＭａｌｅ ＤＮＡとのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションの結果を示すものであり、（ｂ）はＦｅｍａｌｅ ＤＮＡと二つ目のＭａｌｅ ＤＮＡとのＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションの結果を示すものである。
両結果ともに、常染色体とＸ染色体とがはっきりと分かれており、ＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションは、十分な性能を持っていた。すなわち、比較する細胞由来のＤＮＡの内、共通に使用することが出来るＤＮＡがある場合には、それらの蛍光値の電子データのみを供給し、実験では、他方の比較する細胞由来のＤＮＡのみ実験し、蛍光値電子データと実験した細胞由来のＤＮＡとの間で解析を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏを算出し、そのコピー数を比較することが出来る。
より、具体的には、例えば、正常細胞由来のＤＮＡをキット製造元のメーカーが供給し、ユーザーが異常細胞、例えば、がん細胞から抽出したＤＮＡを用いてＣＧＨアレイを用いたハイブリダイゼーションを行い、電子化された正常細胞の蛍光値、異常細胞由来のＣＧＨアレイ上の蛍光値との間で解析を行ってＬｏｇＲａｔｉｏを算出し、コピー数を得ることが出来る。正常細胞由来の蛍光値を１つ用意しておけば、異常細胞由来のＣＧＨアレイは何枚でもそのコピー数を算出するのに使用することが出来る。この方法により、必要なＣＧＨアレイの枚数が最大半分となり、それらの試薬のコストも半分、プロトコールも半分に短縮化できる。
未精製標識標的核酸溶液を用いた多検体マイクロアレイの結果
＜多検体マイクロアレイの調製＞
図９に示したように、１枚のスライドガラスの上に２つのハイブリダイゼーション領域を設けた。スポットした遺伝子は、ＢＡＣライブラリーから選択した下記の遺伝子であり、これらをスポットした。この際、１種の遺伝子を４スポットずつスポットし、一つのハイブリダイゼーション領域に対して、１６遺伝子、合計６４スポットをスポットした。従って、１枚のスライドガラスには、１２８個のスポットをスポットした。
＜多検体マイクロアレイの調製＞
図９に示したように、１枚のスライドガラスの上に２つのハイブリダイゼーション領域を設けた。スポットした遺伝子は、ＢＡＣライブラリーから選択した下記の遺伝子であり、これらをスポットした。この際、１種の遺伝子を４スポットずつスポットし、一つのハイブリダイゼーション領域に対して、１６遺伝子、合計６４スポットをスポットした。従って、１枚のスライドガラスには、１２８個のスポットをスポットした。
RP11-007F10 (20p11.22), RP11-026H09 (20p12.3), RP11-100M22 (20p13), RP11-047O20 (20q11.21), RP11-625K22 (21q21.1), RP11-005N20 (21q22.11), RP11-113F01 (21q22.3), RP11-076E08 (22q11.23), RP11-079G06 (22q12.2), RP11-344N17 (Xp11.23), RP11-383C12 (Xq12), RP11-079C01 (Xq13.3), RP11-092B10 (Xq24), RP11-177A08 (Xq26.2), RP11-211L10 (Xq28), RP11-344D02 (Yp11.2)
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
比較例１の＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞と同様の方法で未精製標識標的核酸溶液、Ｃｙ３−ＦｅｍａｌｅとＣｙ５−Ｍａｌｅを得た。なお、両方とも２回実験できる量を準備した。
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞
実施例１の＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞と同様の方法でＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製した。なお、２本の溶液を調製した。
＜ハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した２種の未精製標識標的核酸溶液を各２０μＬ、＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞で調製したＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液を３８μＬ、１．７ｍＬ容マイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。
比較例１の＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞と同様の方法で未精製標識標的核酸溶液、Ｃｙ３−ＦｅｍａｌｅとＣｙ５−Ｍａｌｅを得た。なお、両方とも２回実験できる量を準備した。
＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞
実施例１の＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞と同様の方法でＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製した。なお、２本の溶液を調製した。
＜ハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した２種の未精製標識標的核酸溶液を各２０μＬ、＜Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液の調製＞で調製したＣｏｔ−１ ＤＮＡを含むＭＭ＃１溶液を３８μＬ、１．７ｍＬ容マイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの前処理＞と同様に行い、ＣＧＨアレイの前処理を行った。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下した。この際、ハイブリダイゼーション溶液は、それぞれ１つのハイブリダイゼーション領域に対して１本の溶液を使用した。その上にギャップカバーグラス（２４×２５ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）をそれぞれ載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下した。この際、ハイブリダイゼーション溶液は、それぞれ１つのハイブリダイゼーション領域に対して１本の溶液を使用した。その上にギャップカバーグラス（２４×２５ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）をそれぞれ載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ比をプロットした。
＜結果＞
結果を図１０に示した。なお、図は２つのＣＧＨアレイの内、一方のみのものを示した。
常染色体、Ｘ染色体、Ｙ染色体に由来する結果が分離できており、ＣＧＨアレイとして十分な性能を持っていた。
比較例１の＜ＣＧＨアレイの洗浄＞と同様の方法でＣＧＨアレイを洗浄した。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ比をプロットした。
＜結果＞
結果を図１０に示した。なお、図は２つのＣＧＨアレイの内、一方のみのものを示した。
常染色体、Ｘ染色体、Ｙ染色体に由来する結果が分離できており、ＣＧＨアレイとして十分な性能を持っていた。
〔ブロック核酸の精製（濃縮）も行わなかった場合の未精製標識標的核酸溶液を用いた二色法ＣＧＨアレイ〕
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容のマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＦｅｍａｌｅ ＤＮＡを３μＬ、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ，ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１ｕＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
＜未精製標識標的核酸溶液の調製＞
１．７ｍＬ容のマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＦｅｍａｌｅ ＤＮＡを３μＬ、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ，ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷処理を行った。１０×ｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１ｕＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
上記操作をＭａｌｅ ＤＮＡに対しても行い、以上の操作にて、２種の未精製標識標的核酸溶液を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しては、標識化合物として、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
＜未精製標識標的核酸溶液を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）を６５μＬ、ＭＭ＃１（デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０×ＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、液量を７ｍＬとしたもの）を２０μＬ、２０％ＳＤＳを１８μＬ、１．７ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、よく攪拌した。
Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｍａｌｅ ＤＮＡを標識した未精製標識標的核酸溶液を２０μＬ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 製品番号１５２７９−０１１）を６５μＬ、ＭＭ＃１（デキストラン硫酸（ＳＩＧＭＡ）を１ｇ、ホルムアミドを５ｍＬ、２０×ＳＳＣを１ｍＬ混合し、溶解後、液量を７ｍＬとしたもの）を２０μＬ、２０％ＳＤＳを１８μＬ、１．７ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、よく攪拌した。
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
ＣＧＨアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、１６遺伝子を４スポットずつスポットした、６４スポットのマイクロアレイを用いた。
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへＣＧＨアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ，ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、ＣＧＨアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、ＣＧＨアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、ＣＧＨアレイを乾燥させた。
ブロッキング後、沸騰水にＣＧＨアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノール、−２０℃の８５％エタノール、−２０℃の１００％エタノールに浸し、スピンドライヤーで１分間の遠心を行うことでＣＧＨアレイを乾燥させた。
ＣＧＨアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子を日本ガイシ株式会社にてスポットした、１６遺伝子を４スポットずつスポットした、６４スポットのマイクロアレイを用いた。
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへＣＧＨアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ，ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、ＣＧＨアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、ＣＧＨアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、ＣＧＨアレイを乾燥させた。
ブロッキング後、沸騰水にＣＧＨアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノール、−２０℃の８５％エタノール、−２０℃の１００％エタノールに浸し、スピンドライヤーで１分間の遠心を行うことでＣＧＨアレイを乾燥させた。
＜ハイブリダイゼーション＞
＜未精製標識標的核酸溶液を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、恒温槽（ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ，ＨＢ−８０、タイテック株式会社）中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜未精製標識標的核酸溶液を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した試料溶液を７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。この溶液を、ＣＧＨアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）（松浪硝子工業株式会社）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、３７℃で１６時間、恒温槽（ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ，ＨＢ−８０、タイテック株式会社）中に入れ、ハイブリダイゼーションを行った。
＜ＣＧＨアレイの洗浄＞
ハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣの溶液４５ｍＬを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然にスライドガラスから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたスライドガラスを、５０ｍＬのスミロンチューブ（住友ベークライト株式会社）に４５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲの中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の中に入れ、恒温槽の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことでマイクロアレイを乾燥させた。
ハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣの溶液４５ｍＬを入れたスミロンチューブに入れ、カバーグラスが自然にスライドガラスから剥がれ落ちるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたスライドガラスを、５０ｍＬのスミロンチューブ（住友ベークライト株式会社）に４５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲの中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の中に入れ、恒温槽の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容のスミロンチューブ中の４５ｍＬの２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことでマイクロアレイを乾燥させた。
＜データ取り込みとデータ処理＞
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値を計算した。
＜結果＞
結果を図１１に示した。Ｘ染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値と常染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値との差は、０．６５６となり、比較例１のＬｏｇＲａｔｉｏ差、０．６３６より若干良くなり、本実施例の結果は、ブロック核酸を含めたすべての核酸を未精製で行っても、精製標識標的核酸溶液、精製（濃縮）ブロック核酸と同程度以上の性能を示すことを示している。
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ値を計算した。
＜結果＞
結果を図１１に示した。Ｘ染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値と常染色体部分のＬｏｇＲａｔｉｏ値との差は、０．６５６となり、比較例１のＬｏｇＲａｔｉｏ差、０．６３６より若干良くなり、本実施例の結果は、ブロック核酸を含めたすべての核酸を未精製で行っても、精製標識標的核酸溶液、精製（濃縮）ブロック核酸と同程度以上の性能を示すことを示している。
Claims (14)
- 標識標的核酸を含む未精製標識標的核酸溶液と、ブロック核酸およびバッファーを含有するハイブリダイゼーションバッファーとを混合するハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 前記ハイブリダイゼーションバッファー中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬである請求項１記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 未精製標識標的核酸溶液中の標識標的核酸濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬである請求項１又は２記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- ハイブリダイゼーションバッファーに、界面活性剤、排除体積効果を有する高分子化合物、標的核酸とプローブ核酸とで形成される複合体の融解温度を変化させる化合物、バックグラウンドノイズの低減作用を持つ核酸の中から選ばれる少なくとも1つが更に含有されている請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロック核酸を精製後、バッファー含有溶液に溶解することにより調製されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 前記ハイブリダイゼーション用溶液は、核酸マイクロアレイに対して使用することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 前記未精製標識標的核酸溶液を２種以上用いる請求項１〜６のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- ２種以上の未精製標識標的核酸溶液が、それぞれの標的核酸が異なる標識物質で標識されたことを特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- ２種以上の未精製標識標的核酸溶液が、それぞれの標的核酸が同一の標識物質で標識されたこと特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 標的核酸を標識する標識物質が蛍光物質である請求項１〜９のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 前記ハイブリダイゼーション用溶液中のブロック核酸濃度が０．１〜１０００μｇ／ｍＬである請求項１〜１０のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- 前記ハイブリダイゼーション用溶液中の標識標的核酸濃度が０．５〜５００μｇ／ｍＬである請求項１〜１１のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- ブロック核酸が未濃縮ブロック核酸溶液を用いる請求項１〜１２のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
- ブロック核酸がＣｏｔ−１ ＤＮＡである請求項１〜１３のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用溶液の調製方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008138531A JP2009284783A (ja) | 2008-05-27 | 2008-05-27 | ハイブリダイゼーション用溶液の調製方法 |
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| JP2009284783A true JP2009284783A (ja) | 2009-12-10 |
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ID=41454605
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| JP2008138531A Pending JP2009284783A (ja) | 2008-05-27 | 2008-05-27 | ハイブリダイゼーション用溶液の調製方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP2009284783A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014018127A (ja) * | 2012-07-17 | 2014-02-03 | Nippon Meat Packers Inc | 核酸ハイブリダイゼーション用溶液 |
| JP2015180193A (ja) * | 2014-01-29 | 2015-10-15 | アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． | 次世代シーケンシングの標的濃縮用の高速ハイブリダイゼーション |
-
2008
- 2008-05-27 JP JP2008138531A patent/JP2009284783A/ja active Pending
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| JP2015180193A (ja) * | 2014-01-29 | 2015-10-15 | アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． | 次世代シーケンシングの標的濃縮用の高速ハイブリダイゼーション |
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