CN115916999A - 用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法 - Google Patents

用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于使用靶向RNA耗竭进行空间分析的方法。

Description

用于使用靶向RNA耗竭进行空间分析的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月22日提交的美国临时专利申请号63/014,054的优先权，其通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含一个序列表，该序列表已在光盘上提交并特此通过引用整体并入。所述序列表名为47706-0200WO1.txt，大小为2,776,333字节，创建于2021年3月24日。
背景技术
由于不同细胞内不同的分析物水平(例如基因和/或蛋白表达)，在受试者组织内的细胞具有在细胞形态和/或功能方面的差异。细胞在组织内的具体位置(例如，细胞相对于相邻细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响例如细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为和信号传递并与组织中的其它细胞串扰。
以前已经研究过空间异质性，所使用的技术仅提供在完整组织或部分组织的背景下少数分析物的数据，或提供单个细胞的大量分析物数据，但未能提供关于单个细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中的位置的信息。
不希望的RNA(例如，核糖体RNA)在生物样品的总核酸库中占相当大的比例，其可以与感兴趣的靶分析物的杂交竞争。在某些情况下，不希望的RNA能够与随机序列、聚腺苷酸序列、和甚至基因特异性捕获序列杂交，从而产生干扰靶分析物结合的增加的背景信号。
减少不希望的RNA分子的背景信号的一种选择是在空间阵列基因表达方案的逆转录步骤中添加耗竭探针。可以设计耗竭探针以平铺(tile)各种类型的不希望的RNA分子(例如，核和线粒体RNA分子)。在该情况下，通过平铺rRNA分子，所述分子在很大程度上被抑制免于与空间捕获阵列的相互作用。但是，一个缺点是，当添加耗竭探针时，相当一部分rRNA可能已经与阵列相互作用，从而限制了它们的效用。因此，需要除去这样的不希望的RNA。
RNA模板化连接(RTL)是多个寡核苷酸与在附近的分析物或相邻序列杂交、然后连接寡核苷酸以产生连接产物的过程。在杂交和连接之后，产生了DNA-RNA杂交复合物，其包括目标分析物(例如，RNA)和连接的探针(由DNA或DNA/RNA组合制成)。RTL利用核糖核酸酶(例如，RNA酶H)消化DNA-RNA杂交复合物，将连接的探针释放到下游应用，诸如空间阵列探针杂交和测序。在此，申请人已经确定，也可以添加不希望的RNA探针并与不希望的RNA杂交。此外，因为不希望的RNA探针/不希望的RNA复合物产生DNA-RNA杂交复合物，相同的核酸内切酶步骤可以消化分析物也可以消化不希望的RNA。因为仍然需要除去这些不希望的RNA，所以这种方案简化了可能影响核酸完整性和功能的多个酶促步骤的必要性。
发明内容
本发明涉及从核酸样品中耗竭不希望的RNA的方法。本发明可用于从耗竭了RNA的核酸样品制备cDNA，例如从固定的石蜡包埋的(FFPE)组织样品制备cDNA。
在一个方面，本文提供了一种用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含：(a)使所述生物样品与第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和多个不希望的RNA耗竭探针接触，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，该结构域能够结合捕获探针的捕获结构域，且其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；(b)使所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与所述分析物杂交；(c)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子杂交；(d)连接所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸，由此产生与所述分析物基本上互补的连接的探针；(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物并且从所述分析物释放所述连接的探针；(f)使所述连接的探针的捕获探针结合结构域与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；和(g)确定(i)与所述捕获结构域特异性地结合的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸在3’末端处包含至少两个核糖核酸碱基。
在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸进一步包含功能序列。在某些实施方案中，所述功能序列是引物序列。
在某些实施方案中，所述第二探针寡核苷酸在5’末端处包含磷酸化的核苷酸。
在某些实施方案中，所述方法进一步包含提供与所述捕获探针结合结构域相互作用的捕获探针结合结构域阻断部分。
在某些实施方案中，所述方法进一步包含在步骤(f)之前从所述捕获探针结合结构域释放所述捕获探针结合结构域阻断部分。
在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包含聚腺苷酸(聚A)序列或其互补序列。
在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域阻断部分包含聚尿苷序列、聚胸苷序列或二者。
在某些实施方案中，从所述聚A序列释放所述聚尿苷序列包含使所述连接的探针变性或使所述连接的探针与核酸内切酶或核酸外切酶接触。
在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包含与所述捕获探针的捕获结构域的全部或部分互补的序列。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包含简并序列。
在某些实施方案中，所述连接步骤包含使用酶促连接或化学连接来连接所述第一和第二探针寡核苷酸。在某些实施方案中，所述酶促连接利用连接酶。
在某些实施方案中，所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rn12)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。在某些实施方案中，所述连接酶是T4 RNA连接酶2(Rnl2)连接酶。
在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸是DNA探针。在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针是DNA探针。
在某些实施方案中，所述步骤(b)和(c)各自产生RNA：DNA杂交体。
在某些实施方案中，步骤(e)包含使所述不希望的RNA耗竭探针与核糖核酸酶接触。
在某些实施方案中，所述核糖核酸酶是RNA酶H。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H1。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H2。在某些实施方案中，所述RNA酶H是热稳定的RNA酶。
在某些实施方案中，所述方法进一步包含在步骤(f)之前扩增所述连接的探针。在某些实施方案中，步骤(b)和(c)基本上同时进行。
在一个方面，本文提供了一种用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含：(a)使所述生物样品与基质接触，所述基质包含多个附着的捕获探针，其中所述多个中的一个捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域；和多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；(b)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；(d)使所述分析物与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；(e)使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针的3’末端以产生延伸的捕获探针；和(f)扩增延伸的捕获探针以产生核酸。
在某些实施方案中，本文提供了用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，进一步包含确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
在一个方面，本文提供了一种用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含：(a)使所述生物样品与多个不希望的RNA耗竭探针接触，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；(b)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；(d)使多个核酸与多个靶寡核苷酸探针接触，其中所述多个核酸中的一个核酸包含(i)所述空间条形码或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的部分序列或其互补序列；且所述多个靶寡核苷酸探针中的一个靶寡核苷酸探针包含：结构域，其特异性地结合(i)所述空间条形码的全部或部分或其互补序列，和/或(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列或其互补序列，和分子标签；(e)使用基质富集特异性地结合所述核酸的靶寡核苷酸探针的复合物，所述基质包含特异性地结合所述分子标签的试剂；和(f)确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
在某些实施方案中，所述方法进一步包含产生所述多个核酸，包含：(a)使所述生物样品与基质接触，所述基质包含多个附着的捕获探针，其中所述多个中的一个捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域；(b)使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针的3’末端以产生延伸的捕获探针；和(c)扩增延伸的捕获探针以产生所述核酸。
在某些实施方案中，所述靶寡核苷酸探针的结构域包含共约40个核苷酸至约160个核苷酸。
在某些实施方案中，所述分子标签包含一个部分。在某些实施方案中，所述部分是抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、生物素或荧光团。
在某些实施方案中，所述分子标签包含小分子、核酸或碳水化合物。
在某些实施方案中，所述分子标签在所述靶寡核苷酸探针中位于所述结构域的5’或3’侧。
在某些实施方案中，所述特异性地结合所述分子标签的试剂包含一种蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白是抗体。
在某些实施方案中，所述特异性地结合所述分子标签的试剂包含核酸。在某些实施方案中，所述核酸是DNA。
在某些实施方案中，所述特异性地结合所述分子标签的试剂包含小分子。
在某些实施方案中，来自所述生物样品的所述分析物与疾病或病症相关。在某些实施方案中，来自所述生物样品的所述分析物包含突变。在某些实施方案中，来自所述生物样品的所述分析物包含单核苷酸多态性(SNP)。在某些实施方案中，来自所述生物样品的所述分析物包含三核苷酸重复。
在某些实施方案中，所述生物样品是组织样品。
在某些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织样品、新鲜的或冷冻的组织样品。在某些实施方案中，所述组织样品是FFPE组织样品，且所述组织样品是去交联的。
在某些实施方案中，将所述生物样品预先染色。在某些实施方案中，使用苏木精和曙红(H&E)将所述生物样品预先染色。在某些实施方案中，使用免疫荧光法或免疫组织化学法将所述生物样品预先染色。
在某些实施方案中，所述方法进一步包含使所述生物样品与透化试剂接触。
在某些实施方案中，所述生物样品是透化过的生物样品，其已经用透化试剂透化过。
在某些实施方案中，所述透化试剂选自有机溶剂、去污剂和酶或它们的组合。在某些实施方案中，所述透化试剂是肽链内切酶或蛋白酶。在某些实施方案中，所述肽链内切酶是胃蛋白酶或蛋白水解酶K。
在某些实施方案中，所述确定步骤包含扩增特异性地结合所述捕获结构域的所述连接的探针的全部或部分。
在某些实施方案中，所述扩增是等温的。在某些实施方案中，所述扩增不是等温的。
在某些实施方案中，扩增产物包含(i)特异性地结合所述捕获结构域的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列。
在某些实施方案中，所述确定步骤包含测序。
在某些实施方案中，所述分析物是RNA。在某些实施方案中，所述RNA是mRNA。
在一个方面，本文提供了一种用于富集空间阵列中的靶核酸的方法，其包含(a)向所述空间阵列添加多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述空间阵列中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；(b)使不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；和(d)扩增剩余的核酸以富集所述靶核酸。
在一个方面，本文提供了一种用于耗竭空间阵列中的不希望的RNA分子的方法，其包含(a)向所述空间阵列添加多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述空间阵列中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；(b)使不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；和(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物以耗竭所述不希望的RNA分子。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针是DNA探针。
在某些实施方案中，所述杂交步骤包含使所述DNA探针与所述不希望的RNA分子杂交，这产生RNA：DNA杂交体。
在某些实施方案中，所述除去步骤包含使所述不希望的RNA耗竭探针与核糖核酸酶接触。
在某些实施方案中，所述核糖核酸酶是RNA酶H。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H1。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H2。在某些实施方案中，所述RNA酶H是热稳定的RNA酶。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的所述不希望的RNA分子的全部或部分序列基本上互补。
在某些实施方案中，至少一个不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子的序列的基本上一个或多个部分特异性地杂交。
在某些实施方案中，至少一个不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子的基本上整个全长序列特异性地杂交。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子是转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)或其任意组合。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子是线粒体RNA、核RNA或细胞质RNA。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针进一步包含捕获部分。在某些实施方案中，所述除去步骤包含使用特异性地结合所述捕获部分的捕获部分结合剂。
在某些实施方案中，所述捕获部分是抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、生物素或荧光团。在某些实施方案中，所述捕获部分是生物素。
在某些实施方案中，所述捕获部分包含小分子、核酸或碳水化合物。
在某些实施方案中，所述捕获部分位于所述不希望的RNA耗竭探针中的结构域的5’或3’侧。
在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的捕获部分结合剂包含蛋白。
在某些实施方案中，所述蛋白是抗体。在某些实施方案中，所述蛋白是抗生蛋白链菌素。
在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包含核酸。在某些实施方案中，所述核酸是DNA。
在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包含小分子。
在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂附着至基质。
在某些实施方案中，所述基质是珠子。在某些实施方案中，所述珠子是磁珠。在某些实施方案中，所述捕获部分是生物素且所述捕获部分结合剂是抗生蛋白链菌素。在某些实施方案中，所述抗生蛋白链菌素附着至磁珠，所述磁珠允许从所述生物样品中通过磁性除去不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物。
在某些实施方案中，所述捕获探针能够与如本文中所述的连接的探针杂交。
在某些实施方案中，所述捕获探针进一步包含功能序列。在某些实施方案中，所述功能序列是引物序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述捕获探针进一步包含独特分子序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述捕获探针进一步包含额外的引物结合序列或其互补序列。
在一个方面，本文提供了一种试剂盒，其包含(a)包含多个捕获探针的阵列；(b)多个探针寡核苷酸，其包含第一探针寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，该结构域能够结合所述捕获探针的捕获结构域；(c)多个酶，所述酶包含核糖核酸酶和连接酶；和(d)关于使用所述试剂盒的说明书。
在某些实施方案中，所述核糖核酸酶是RNA酶H。
在某些实施方案中，所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。在某些实施方案中，所述连接酶是T4 RNA连接酶2(Rnl2)连接酶。
在因特网上可得到的和在本说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请和信息通过引用并入本文，达到如同每篇单独的出版物、专利、专利申请或信息项目被明确地且单独地指出通过引用并入的相同程度。如果通过引用并入的出版物、专利、专利申请和信息项目与在说明书中包含的公开内容相矛盾，则本说明书意图替代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
在以范围方式描述值的情况下，应当理解，该描述包括在这样的范围内的所有可能的子范围的公开内容，以及落入这样的范围内的具体数值，不管具体数值或具体子范围是否被明确说明。
当参考项目集合使用时，术语“每个”意图识别所述集合中的单个项目，但不一定指代所述集合中的每个项目，除非明确地另外说明，或除非使用的上下文另外明确指出。
本文描述了本公开内容的特征的各种实施方案。但是，应当理解，这样的实施方案仅作为例子提供，并且本领域技术人员在不脱离本公开内容的范围的情况下可以做出多种变化、改变和替换。还应当理解，本文描述的具体实施方案的各种替代方案也是在本公开内容的范围内。
附图说明
以下附图解释了本公开内容的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意以任何方式限制所附权利要求的范围。在附图中相同的参考符号指示相同的元件。
图1是显示如本文所述的带条形码的捕获探针的一个例子的示意图。
图2是说明可切割的捕获探针的示意图，其中被切割的捕获探针可以进入非透化的细胞并结合样品内的靶分析物。
图3是示例性的多路化的带空间条形码的特征的示意图。
图4是一种示例性的分析物捕获试剂的示意图。
图5是描绘特征固定化的捕获探针524和分析物捕获试剂526之间的示例性相互作用的示意图。
图6A、6B和6C是说明如何可以在基于阵列的系统中利用抗生蛋白链菌素细胞标签来产生带空间条形码的细胞或细胞内容物的示意图。
图7显示了说明用于原位核糖体RNA耗竭的示例性的、非限制性的、非穷举性的步骤的示意性工作流程。
图8A显示了说明用于核糖体耗竭(RD)的示例性工作流程的示意图。
图8B显示了一幅H&E染色图像以及一幅18S rRNA染色图像。没有进行核糖体耗竭。
图8C显示了一幅H&E染色图像以及一幅18S rRNA染色图像。使用被设计成阻断细胞质RNA(18S、28S、5S和5.8S)和线粒体RNA(16S和12S)的RD探针进行核糖体耗竭。
图8D显示了使用聚A探针的一幅H&E染色图像以及一幅mRNA染色图像。没有进行核糖体耗竭。
图8E显示了使用聚A探针的一幅H&E染色图像以及一幅mRNA染色图像。使用被设计成阻断细胞质RNA(18S、28S、5S和5.8S)和线粒体RNA(16S和12S)的RD探针进行核糖体耗竭。
图9A显示了正常的和核糖体耗竭的小鼠嗅球(MOB)组织之间的基因-基因散布图。使用被设计成阻断细胞质RNA(18S、28S、5S和5.8S)和线粒体RNA(16S和12S)的RD探针进行核糖体耗竭。
图9B显示了正常的和核糖体耗竭的儿童期脑癌(PNET)组织之间的基因-基因散布图。使用被设计成阻断细胞质RNA(18S、28S、5S和5.8S)和线粒体RNA(16S和12S)的RD探针进行核糖体耗竭。
图9C显示了正常的和核糖体耗竭的脂肪(adipose、fat)组织之间的基因-基因散布图。使用被设计成阻断细胞质RNA(18S、28S、5S和5.8S)和线粒体RNA(16S和12S)的RD探针进行核糖体耗竭。
图10显示了说明正常的或核糖体耗竭的组织的MT-RNR1或MT-RNR2的基因表达水平的组织图。使用被设计成阻断细胞质RNA(18S、28S、5S和5.8S)和线粒体RNA(16S和12S)的RD探针进行核糖体耗竭。
图11显示了正常的或核糖体耗竭的组织中每个基因的UMI。所述组织包括脂肪(adipose、fat)、小鼠嗅球(MOB)、MOB-181218和儿童期脑癌(PNET)组织。
图12显示了正常的和核糖体耗竭的组织之间的检测率对比。所述组织包括脂肪(adipose、fat)、小鼠嗅球(MOB)、MOB-181218和儿童期脑癌(PNET)组织。
图13A显示了来自正常组织的7个簇的Seurat分簇的组织图。
图13B显示了来自核糖体耗竭组织的7个簇的Seurat分簇的组织图。
图14A显示了与图13A中的组织图对应的Seurat分簇的tSNE图。
图14B显示了与图13B中的组织图对应的Seurat分簇的tSNE图。
图15显示了来自正常组织的7个簇(来自图14A的相同簇)的组织图。
图16显示了来自核糖体耗竭的组织的7个簇(来自图14B的相同簇)的组织图。
图17A显示了来自正常组织的8个簇的组织图，对应于图17B中的tSNE图中的Seurat簇。两个箭头指示簇1和5(也用数字指示)。
图17B显示了Seurat分簇的tSNE图，对应于图17A中指示的组织图。两个箭头指示簇1和5(也用数字指示)。
图18A显示了来自核糖体耗竭的组织的8个簇的组织图，对应于图18B中的tSNE图中的Seurat簇。两个箭头指示簇3和4(也用数字指示)。
图18B显示了Seurat分簇的tSNE图，对应于图18A中指示的组织图。两个箭头指示簇3和4(也用数字指示)。
图19A-19D显示了对照样品(样品1和2)和核糖体耗竭样品(样品3和4)的H&E染色图像和基因表达热图。图19B-19D分别显示了样品1-4的Penk、Doc2g和Kctd12的基因表达热图。
图20A-20D显示了对照样品(样品1和2)和核糖体耗竭样品(样品3和4)的基因表达热图。图20A和20B分别显示了管家基因Actb和Gapdh的基因表达热图。图20C和20D分别显示了核糖体耗竭探针的两种靶标mt-Rnr1和mt-Rnr2的基因表达热图。
具体实施方式
I.介绍
本文中公开了方法和组合物，其预期使用靶向RNA耗竭除去一种或多种不希望的RNA分子(例如，核糖体RNA和/或线粒体RNA)以减小样品中不希望的RNA分子的集合和浓度，所述不希望的RNA分子干扰期望的靶标检测(例如，mRNA的检测)。为了实现耗竭，设计了与一种或多种不希望的RNA分子杂交的一种或多种探针。例如，在一个实施方案中，可以将探针施用至选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交的生物样品，从而减小样品中rRNA的集合和浓度。在这里，将这种类型的RNA耗竭与空间分析技术相结合，以确定生物样品中的一种或多种分析物的丰度和/或位置。通过除去不希望的RNA减少对期望的靶标检测的干扰的能力会提高
空间分析技术的效率和灵敏度+y。例如，由于存在于样品中的不希望的RNA(例如，向下选择的RNA)的减少，捕获探针向样品的随后或同时应用可以导致改善的其它类型的RNA(例如，mRNA或RNA模板化连接的产物)的捕获。
本文所述的空间分析方法和组合物可以在高空间分辨率为生物样品中的多种分析物提供大量分析物和/或表达数据，同时保留天然空间背景。空间分析方法和组合物可以包括，例如，使用捕获探针，其包括空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的定位或位置的信息的核酸序列)和捕获结构域，该捕获结构域能够结合由细胞产生的和/或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白和/或核酸)。空间分析方法和组合物还可以包括使用具有捕获结构域的捕获探针，所述捕获结构域捕获用于间接检测分析物的中间试剂。例如，所述中间试剂可以包括与中间试剂相关的核酸序列(例如，条形码)。因此，中间试剂的检测指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析方法和组合物的非限制性方面描述于美国专利号10,774,374，10,724,078，10,480,022，10,059,990，10,041,949，10,002,316，9,879,313，9,783,841，9,727,810，9,593,365，8,951,726，8,604,182，7,709,198，美国专利申请公开号2020/239946，2020/080136，2020/0277663，2020/024641，2019/330617，2019/264268，2020/256867，2020/224244，2019/194709，2019/161796，2019/085383，2019/055594，2018/216161，2018/051322，2018/0245142，2017/241911，2017/089811，2017/067096，2017/029875，2017/0016053，2016/108458，2015/000854，2013/171621，WO 2018/091676，WO 2020/176788，Rodriques等人，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等人，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等人，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等人，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等人，BMC Biol.15∶50，2017；和Gupta等人，Nature Biotechnol.36∶1197-1202，2018；Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide(Visium空间基因表达试剂盒用户指南)(例如，Rev C，日期为2020年6月)，和/或Visium SpatialTissue Optimization Reagent Kits User Guide(Visium空间组织优化试剂盒用户指南)(例如，Rev C，日期为2020年7月)，它们二者可在10x Genomics Support Documentation网站得到，并且可以在本文中以任何组合使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其它非限制性方面。
可以在本公开内容中使用的一些通用术语可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的(I)(b)部分中找到。通常，“条形码”是标签或标识符，其传达或能够传达信息(例如，关于样品中的分析物、珠子和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的一部分，或独立于分析物。条形码可以附着至分析物。特定条形码相对于其它条形码可以是独特的。出于本公开内容的目的，“分析物”可以包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地表示感兴趣的分析物。
分析物可以大致归类为两组之一：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的例子包括、但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白、糖蛋白(N-连接的或O-连接的)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白的酰胺化变体、蛋白的羟基化变体、蛋白的甲基化变体、蛋白的泛素化变体、蛋白的硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒附件、病毒糖蛋白、病毒刺突等)，细胞外和细胞内蛋白、抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，所述分析物可以定位于亚细胞位置，包括，例如，细胞器，例如，线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、细胞内囊泡、细胞外囊泡、液泡、溶酶体等。在某些实施方案中，分析物可以是肽或蛋白，包括、但不限于抗体和酶。分析物的其它例子可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的(I)(c)部分中找到。在某些实施方案中，可以间接检测分析物，诸如通过检测中间试剂，例如，连接的探针(例如，连接产物)或分析物捕获试剂(例如，寡核苷酸-缀合抗体)，诸如本文描述的那些。
“生物样品”通常得自受试者，用于使用多种技术中的任一种进行分析，所述技术包括、但不限于活组织检查、外科手术和激光捕获显微术(LCM)，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其它生物材料。在某些实施方案中，生物样品可以是组织切片。在某些实施方案中，生物样品可以是固定的和/或染色的生物样品(例如，固定的和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性实施例包括组织学染色剂(例如，苏木精和/或曙红)和免疫学染色剂(例如，荧光染色剂)。在某些实施方案中，可以对生物样品(例如，固定的和/或染色的生物样品)进行成像。在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的(I)(d)部分中也描述了生物样品。
在某些实施方案中，将生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可以促进分析物捕获。示例性的透化试剂和条件描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的(I)(d)(ii)(13)部分或示例性实施方案部分。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基质上的特征阵列，其中每个特征都与阵列上的独特空间位置相关联。转移的分析物的后续分析包括确定分析物的身份和分析物在生物样品中的空间位置。基于分析物在阵列上结合(例如，直接地或间接地)的特征以及该特征在阵列内的相对空间位置，确定分析物在生物样品中的空间位置。
“捕获探针”表示能够捕获(直接地或间接地)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在某些实施方案中，所述捕获探针是核酸或多肽。在某些实施方案中，所述捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获结构域)。在某些实施方案中，捕获探针可以包括切割结构域和/或功能结构域(例如，引物结合位点，诸如用于下一代测序(NGS))。
图1是显示如本文所述的示例性捕获探针的示意图。如显示的，捕获探针102任选地通过切割结构域103(诸如二硫键接头)与特征101偶联。所述捕获探针可以包括对后续处理有用的功能序列104。功能序列104可以包括测序仪特异性的流动池附着序列(例如，P5或P7序列)的全部或部分、测序引物序列(例如，R1引物结合位点、R2引物结合位点)的全部或部分或它们的组合。所述捕获探针还可以包括空间条形码105。所述捕获探针还可以包括独特分子标识符(UMI)序列106。尽管图1显示空间条形码105位于UMI序列106的上游(5’)，但应当理解，其中UMI序列106位于空间条形码105的上游(5’)的捕获探针也适合用于用在本文所述的任何方法中。所述捕获探针还可以包括捕获结构域107以促进靶分析物的捕获。所述捕获结构域可以具有与核酸分析物的序列互补的序列。所述捕获结构域可以具有与本文描述的连接的探针互补的序列。所述捕获结构域可以具有与存在于分析物捕获试剂中的捕获手柄序列互补的序列。所述捕获结构域可以具有与夹板寡核苷酸互补的序列。除了具有与捕获探针的捕获结构域互补的序列外，这样的夹板寡核苷酸还可以具有核酸分析物的序列、与本文描述的连接的探针的一部分互补的序列和/或本文描述的捕获手柄序列。
通常可以为了与多种不同的测序系统(例如，Ion Torrent Proton或PGM、Illumin测序仪器、PacBio、Oxford Nanopore等)中的任一种的相容性及其要求来选择功能序列。在某些实施方案中，可以为了与非商业化的测序系统的相容性来选择功能序列。可以为其使用合适的功能序列的这样的测序系统和技术的例子包括(但不限于)Ion Torrent Proton或PGM测序、Illumin测序、PacBio SMRT测序和Oxford Nanopore测序。此外，在某些实施方案中，可以为了与其它测序系统(包括非商业化的测序系统)的相容性来选择功能序列。
在某些实施方案中，空间条形码105和功能序列104对于附着至给定特征的所有探针是共同的。在某些实施方案中，附着至给定特征的捕获探针的UMI序列106不同于附着至给定特征的不同捕获探针的UMI序列。
图2是说明可切割的捕获探针的示意图，其中被切割的捕获探针可以进入非透化的细胞并结合样品中的分析物。捕获探针201含有切割结构域202、细胞穿透肽203、报告分子204和二硫键(-S-S-)。205代表捕获探针的所有其它部分，例如空间条形码和捕获结构域。
图3是示例性的多路化的带空间条形码的特征的示意图。在图3中，特征301可以偶联至带空间条形码的捕获探针，其中特定特征的带空间条形码的探针可以具有相同的空间条形码，但具有不同的捕获结构域，所述捕获结构域被设计为将该特征的空间条形码与超过一种靶分析物关联。例如，一个特征可以偶联至四种不同类型的带空间条形码的捕获探针，每种类型的带空间条形码的捕获探针都具有空间条形码302。与该特征相关的一种类型的捕获探针包括与被设计用于捕获mRNA靶分析物的聚(T)捕获结构域303组合的空间条形码302。与该特征相关的第二种类型的捕获探针包括与用于gDNA分析的随机N-聚体捕获结构域304组合的空间条形码302。与该特征相关的第三种类型的捕获探针包括与捕获结构域组合的空间条形码302，所述捕获结构域与感兴趣的分析物捕获试剂305的捕获手柄序列互补。与该特征相关的第四种类型的捕获探针包括与捕获结构域组合的空间条形码302，所述捕获结构域可以特异性地结合可在CRISPR测定(例如，CRISPR/Cas9)中起作用的核酸分子306。虽然在图3中仅显示了四种不同的捕获探针-条形码构建体，但是可以定制捕获探针条形码构建体用于分析与核酸相关并能够与这样的构建体结合的任何给定分析物。例如，图3所示的方案还可以用于同时分析本文公开的其它分析物，包括、但不限于：(a)mRNA、谱系追踪构建体、细胞表面或细胞内蛋白和代谢物、以及gDNA；(b)mRNA、可接近的染色质(例如，ATAC-seq、DNase-seq和/或MNase-seq)细胞表面或细胞内蛋白和代谢物、以及扰动剂(例如，如本文中所述的CRISPR crRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内蛋白和/或代谢物、条形码标记剂(例如，本文描述的MHC多聚体)和免疫细胞受体(例如，T细胞受体)的V(D)J序列。在某些实施方案中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)或任意其它已知的扰动剂。参见，例如，WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(b)(例如，子部分(i)-(vi))。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(d)(ii)中描述的那些。
在某些实施方案中，使用任何适当的多路技术，诸如在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(IV)中描述的那些，可以检测(例如，同时或依次)来自生物样品的超过一种分析物类型(例如，核酸和蛋白)。
在某些实施方案中，使用一种或多种分析物捕获试剂可以进行一种或多种分析物(例如，蛋白分析物)的检测。本文中使用的“分析物捕获试剂”表示与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，附着至基质或特征的捕获探针)相互作用以鉴定分析物的试剂。在某些实施方案中，所述分析物捕获试剂包括：(i)分析物结合部分(例如，其结合分析物)，例如，抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)捕获手柄序列。本文中使用的术语“分析物结合部分条形码”表示与分析物结合部分相关或以其它方式鉴定分析物结合部分的条形码。本文中使用的术语“分析物捕获序列”或“捕获手柄序列”表示被构造为与捕获探针的捕获结构域杂交、结合、偶联或以其它方式相互作用的区域或部分。在某些实施方案中，捕获手柄序列与捕获探针的捕获结构域互补。在某些情况下，分析物结合部分条形码(或其部分)可能能够从分析物捕获试剂除去(例如，切割)。
图4是由分析物结合部分404和分析物结合部分条形码结构域408组成的示例性分析物捕获试剂402的示意图。示例性分析物结合部分404是能够与分析物406结合的分子，并且分析物捕获试剂能够与带空间条形码的捕获探针相互作用。分析物结合部分可以以高亲和力和/或高特异性结合分析物406。分析物捕获试剂可以包括分析物结合部分条形码结构域408、核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，后者可以与捕获探针的捕获结构域的至少一部分或全部杂交。分析物结合部分条形码结构域408可以包含本文所述的分析物结合部分条形码和捕获手柄序列。分析物结合部分404可以包括多肽和/或适体。分析物结合部分404可以包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
图5是描绘特征固定化的捕获探针524和分析物捕获试剂526之间的示例性相互作用的示意图。特征固定化的捕获探针524可以包括空间条形码508以及功能序列506和UMI510，如本文别处所述。捕获探针还可以包括能够结合分析物捕获试剂526的捕获结构域512。分析物捕获试剂526可以包括功能序列518、分析物结合部分条形码516和能够结合捕获探针524的捕获结构域512的捕获手柄序列514。分析物捕获试剂还可以包括允许捕获试剂条形码结构域516与分析物结合部分522偶联的接头520。
图6A、6B和6C是说明可以如何在基于阵列的系统中利用抗生蛋白链菌素细胞标签来产生带空间条形码的细胞或细胞内容物的示意图。例如，如在图6A中所示，肽结合的主要组织相容性复合物(MHC)可以单独与生物素(β2m)相关联并结合至抗生蛋白链菌素部分，使得抗生蛋白链菌素部分包含多个pMHC部分。这些部分中的每一个可以与TCR结合，从而抗生蛋白链菌素通过多重MHC/TCR结合相互作用与靶T细胞结合。多重相互作用协同作用，并可以显著提高结合亲和力。这样的提高的亲和力可以改善T细胞的标记，并且还可以降低标记从T细胞表面解离的可能性。如在图6B中所示，捕获试剂条形码结构域601可以用抗生蛋白链菌素602修饰并与生物素化的MHC 603的多个分子接触，使得生物素化的MHC 603分子与抗生蛋白链菌素缀合的捕获试剂条形码结构域601偶联。所得到的是带条形码的MHC多聚体复合物605。如在图6B中所示，捕获试剂条形码结构域序列601可以将MHC鉴定为其相关标记，并且还包括任选的功能序列诸如与其它寡核苷酸杂交的序列。如在图6C中所示，一种实施例寡核苷酸是捕获探针606，其包含互补序列(例如，对应于C C C的rGrGrG)、条形码序列和其它功能序列，例如UMI、衔接子序列(例如，包含测序引物序列(例如，R1或部分R1(“pR1”)、R2)、流动池附着序列(例如，P5或P7或其部分序列))等。在某些情况下，捕获探针606可以首先与特征(例如，凝胶珠子)相关联并从特征中释放。在其它实施方案中，捕获探针606可以与MHC-寡核苷酸复合物605的捕获试剂条形码结构域601杂交。然后可以在引物延伸反应中延伸杂交的寡核苷酸(间隔物C C C和间隔物rGrGrG)，使得产生包含对应于两个空间条形码序列(与捕获探针相关的空间条形码和与MHC-寡核苷酸复合物相关的条形码)中的每一个的序列的构建体。在某些情况下，对应序列中的一个或两个可以是捕获探针606或捕获试剂条形码结构域601中的原始序列的互补序列。在其它实施方案中，捕获探针和捕获试剂条形码结构域连接在一起。所得构建体可以任选地进一步加工(例如，以添加任何额外的序列和/或用于清理)并进行测序。如本文别处所述，源自捕获探针606空间条形码序列的序列可以用于鉴定特征，且源自捕获试剂条形码结构域601上的空间条形码序列的序列可以用于鉴定结合在细胞表面上的特定肽MHC复合物604(例如，当使用MHC-肽文库筛选免疫细胞或免疫细胞群体时)。
分析物捕获试剂的另外描述可以见于WO 2020/176788的部分(II)(b)(ix)和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(b)(viii)。
存在至少两种方法将空间条形码与一个或多个邻近细胞相关联，使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容物鉴定为与特定空间位置相关联。一种方法是促进分析物或分析物代理(例如，中间试剂)离开细胞并朝向空间条形码阵列(例如，包括带空间条形码的捕获探针)。另一种方法是从阵列上切割带空间条形码的捕获探针并促进带空间条形码的捕获探针朝向和/或进入生物样品或在其表面上。
在某些情况下，捕获探针可以构造为引发、复制并因此从模板(例如，DNA或RNA模板，诸如分析物或中间试剂(例如，连接的探针(例如，连接产物)或分析物捕获试剂)或其部分)或其衍生物产生任选地带条形码的延伸产物(关于延伸的捕获探针，参见，例如，WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(b)(vii))。在某些情况下，捕获探针可以构造为与模板(例如，DNA或RNA模板，诸如分析物或中间试剂或其部分)形成连接的探针(例如，连接产物)，由此产生充当模板代理的连接产物。
本文中使用的“延伸的捕获探针”表示具有添加到捕获探针的末端(例如，3’或5’末端)的额外核苷酸从而延伸捕获探针的总长度的捕获探针。例如，“延伸的3’末端”表示额外核苷酸被添加到捕获探针的最3’核苷酸以延伸捕获探针的长度，例如，通过用于延伸核酸分子的聚合反应，包括通过聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在某些实施方案中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3’末端添加核酸序列，该核酸序列与特异性地结合捕获探针的捕获结构域的分析物或中间试剂的核酸序列互补。在某些实施方案中，使用逆转录延伸捕获探针。在某些实施方案中，使用一种或多种DNA聚合酶延伸捕获探针。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码的序列。
在某些实施方案中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如，通过DNA测序)的量。在某些实施方案中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链式反应)的模板。
在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(a)中描述了空间分析方法的其它变体，在某些实施方案中包括成像步骤。捕获的分析物(和/或中间试剂或其部分)的分析，例如，包括样品移出、捕获探针的延伸、测序(例如，切割的延伸的捕获探针的测序和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、在阵列上测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方案)、时域分析和/或邻近捕获，描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(g)。一些质量控制措施也描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(h)。
空间信息可以提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定疾病或障碍的一种或多种生物标志物(例如，诊断、预后和/或用于确定治疗功效)；鉴定用于治疗疾病或障碍的候选药物靶标；将受试者鉴定(例如，诊断)为患有疾病或障碍；鉴定受试者的疾病或障碍的阶段和/或预后；将受试者鉴定为具有增加的发展疾病或障碍的可能性；监测受试者的疾病或障碍的进展；确定治疗受试者的疾病或障碍的功效；确定治疗对疾病或障碍有效的患者亚群；修改患有疾病或障碍的受试者的治疗；选择参加临床试验的受试者；和/或为患有疾病或障碍的受试者选择治疗。
空间信息可以提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达图样(例如，在健康的和/或患病的组织中)；鉴别紧密靠近的多个分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白；肿瘤微环境的表征；肿瘤免疫应答的表征；细胞类型及其在组织中的共定位的表征；组织内遗传变异的鉴定(例如，基于与特定疾病或障碍生物标志物相关的基因和/或蛋白表达图样)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基质作为支持物起作用用于将捕获探针直接或间接附着至阵列特征。“特征”是一个实体，其作为在空间分析中使用的各种分子实体的支持物或存储库。在某些实施方案中，阵列中的一些或全部特征为了分析物捕获而被官能化。示例性的基质描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(c)。阵列的示例性特征和几何属性可以见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)。
通常，当使生物样品与包括捕获探针的基质(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基质上的捕获探针的基质，或具有包含捕获探针的特征(例如，珠子、孔)的基质)接触时，分析物和/或中间试剂(或其部分)可以被捕获。本文中使用的使生物样品与基质“接触”表示任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价地或非共价地结合(例如，杂交))。捕获可以主动(例如，使用电泳)或被动(例如，使用扩散)实现。分析物捕获进一步描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(e)中。
在某些情况下，通过将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附着和/或引入至生物样品(例如，生物样品中的细胞)，可以进行空间分析。在某些实施方案中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入至生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。在某些实施方案中，在将具有条形码的分子附着和/或引入至生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单个细胞或细胞群以进行分析。一些这样的空间分析方法描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(III)中。
在某些情况下，通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸，可以进行空间分析。在某些情况下，例如，可以使用RNA模板化连接(RTL)进行空间分析。之前已经描述过RTL的方法。参见，例如，Credle等人，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，诸如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在某些情况下，寡核苷酸是DNA分子。在某些情况下，寡核苷酸之一在3’末端处包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一个寡核苷酸在5’末端处包括磷酸化的核苷酸。在某些情况下，两个寡核苷酸之一包括捕获结构域(例如，聚A序列、非均聚序列)。在与分析物杂交之后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接的探针(例如，连接产物)。在某些情况下，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在某些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，连接的探针(例如，连接产物)从分析物释放。在某些情况下，使用核酸内切酶(例如，RNA酶H)释放连接的探针(例如，连接产物)。释放的连接的探针(例如，连接产物)然后可以被阵列上的捕获探针(例如，代替分析物的直接捕获)捕获，任选地被扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选丰度。
在空间信息分析期间，获得与分析物相关的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可以用于提供关于分析物在生物样品中的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在某些实施方案中，特定捕获探针和它们捕获的分析物与基质上特征阵列中的特定位置相关联。例如，特定空间条形码可以在阵列制造之前与特定阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可以与特定阵列位置信息一起存储(例如，在数据库中)，使得每个空间条形码独特地映射到特定的阵列位置。
可替换地，特定空间条形码可以在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置，使得在每个位置，仅存在一种类型的空间条形码，由此空间条形码与阵列的单个特征独特地相关联。在必要的情况下，可以使用本文所述的任何方法对阵列进行解码，使得空间条形码与阵列特征位置独特地相关联，并且可以如上所述存储该映射。
当在空间信息分析期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，通过参考存储的将每个空间条形码与阵列特征位置独特关联的信息，可以确定捕获探针和/或分析物的位置。以此方式，特定捕获探针和捕获的分析物与特征阵列中的特定位置相关联。每个阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标志物)的位置。因此，每个特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
一些示例性的空间分析工作流程描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的示例性实施方案部分中。参见，例如，WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的以“在本文描述的工作流程的某些非限制性实施例中，可以将样品浸入......(In some non-limiting examples of the workflows described herein，the sample can be immersed...)”开头的示例性实施方案。还参见，例如，VisiumSpatial Gene Expression Reagent Kits User Guide(Visium空间基因表达试剂盒用户指南)(例如，Rev C，日期为2020年6月)，和/或Visium Spatial Tissue OptimizationReagent Kits User Guide(Visium空间组织优化试剂盒用户指南)(例如，Rev C，日期为2020年7月)。
在某些实施方案中，可以使用专用硬件和/或软件执行空间分析，诸如在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的部分(II)(e)(ii)和/或(V)中描述的任何系统，或在WO 2020/123320的“用于成像的对照载玻片(Control Slide for Imaging)”、“使用对照载玻片和基质的方法(Methods of Using Control Slides and Substratesfor)”、“使用对照载玻片和基质进行成像的系统(Systems of Using Control Slides andSubstrates for Imaging)”、和/或“样品和阵列对齐设备和方法(Sample and ArrayAlignment Devices and Methods)”、“信息标记(Informational labels)”部分中描述的一种或多种装置或方法中的任一种。
用于执行空间分析的合适系统可以包括部件，诸如用于容纳生物样品的室(例如，流动池或可密封的流体密封室)。生物样品可以被固定在例如生物样品容器中。一个或多个流体室可以通过流体导管连接到室和/或样品容器，并且可以通过流体泵、真空源或连接到流体导管的其它装置(其产生压力梯度以驱动流体流)将流体递送到室和/或样品容器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管以调节试剂从蓄池到室和/或样品容器的流动。
系统可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(例如，显示器)和存储单元(例如，固态存储介质，诸如，但不限于，磁的、光学的或其它固态的、持久性的、可写的和/或可重写的存储介质)。控制单元可以任选地通过网络连接到一个或多个远程装置。控制单元(及其组件)通常可以执行本文描述的任何步骤和功能。在系统连接到远程装置的情况下，远程装置(或多个装置)可以执行本文描述的任何步骤或特征。系统可以任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。系统还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED的、基于二极管的、激光器)、具有特征的基质、捕获在基质上的来自生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可以任选地包括在一种或多种有形存储介质和硬件组件(诸如专用集成电路)中编码和/或实现的软件指令。在由控制单元(和尤其是电子处理器)或集成电路执行时，软件指令可以使控制单元、集成电路或执行软件指令的其它组件执行本文所述的任何方法步骤或功能。
在某些情况下，本文描述的系统可以检测(例如，配准图像)阵列上的生物样品。检测阵列上的生物样品的示例性方法描述于PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请系列号16/951,854。
在将分析物从生物样品转移到基质上的特征阵列之前，可以使生物样品与阵列对齐。生物样品与包括捕获探针的特征阵列的对齐可以促进空间分析，这可以用于检测生物样品中在不同位置内的分析物存在和/或水平的差异，例如，以生成分析物的存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维和/或三维图的示例性方法描述于PCT申请号2020/053655中，并且空间分析方法通常描述于WO 2020/061108和/或美国专利申请系列号16/951,864中。
在某些情况下，使用一种或多种基准标志物，例如，出现在产生的图像中的放置在成像系统视野中的物体，可以将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对齐，如WO2020/123320、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请系列号16/951，843的“基质属性(Substrate Attributes)”部分、“用于成像的对照载玻片(Control Slide for Imaging)”部分中所述。基准标志物可以被用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基质、以确定基质上的样品或阵列相对于基准标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
II.靶向RNA耗竭
靶向RNA耗竭可以耗竭或除去一种或多种不希望的RNA分子(例如，核糖体RNA和/或线粒体RNA)，从而减少样品中可能干扰期望靶标检测(例如，mRNA检测)的不希望的RNA分子的集合和浓度。为了实现耗竭，设计了与一种或多种不希望的RNA分子杂交的一种或多种探针。例如，在一个实施方案中，可以将探针施用至选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交的生物样品，从而减小样品中rRNA的集合和浓度。在一个实施方案中，可以将探针施用至与线粒体RNA(mtRNA)选择性杂交的生物样品，从而减少样品中mtRNA的集合和浓度。由于在样品中存在的不希望的RNA(例如，向下选择的RNA)的减少，捕获探针向样品的随后或同时应用可以导致改善的对其它类型RNA的捕获。
用于使用靶向RNA耗竭来鉴定生物样品中的分析物(例如，本文描述的任何分析物)的位置的方法的一个非限制性实施例包括：(a)使所述生物样品与多个不希望的RNA耗竭探针(例如，本文描述的任何不希望的RNA耗竭探针)接触，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与在生物样品中的不希望的RNA分子(例如，本文描述的任何不希望的RNA分子)的全部或部分序列基本上互补；(b)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交(例如，使用本文描述的用于使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交的任何方法)；(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物(例如，使用本文描述的用于除去多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物的任何方法)；(d)使所述生物样品与基质(例如，本文描述的任何基质)接触，所述基质包含多个附着的捕获探针(例如，本文描述的任何捕获探针)，其中所述多个中的一个捕获探针包括(i)空间条形码(例如，本文描述的任何空间条形码)和(ii)特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域(例如，本文描述的任何捕获结构域)；(e)使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针的3’末端以产生延伸的捕获探针；和(f)扩增(例如，使用本文描述的任何扩增方法)所述延伸的捕获探针以产生核酸。
用于使用RNA模板化连接和靶向RNA耗竭的鉴定分析物在生物样品中的位置的方法的一个非限制性实施例包括：(a)使所述生物样品与第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和多个不希望的RNA耗竭探针接触，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包括能够结合捕获探针的捕获结构域的捕获探针结合结构域，且其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；(b)使所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与所述分析物杂交；(c)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子杂交；(d)连接所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸，由此产生与所述分析物基本上互补的连接的探针；(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物并且从所述分析物释放所述连接的探针；(f)使所述连接的探针的捕获探针结合结构域与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；和(g)确定(i)与所述捕获结构域特异性地结合的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
使用不希望的RNA耗竭探针的本文描述的方法的一个非限制性实施例显示在图7中。使生物样品与不希望的RNA耗竭探针701(例如，核糖体耗竭探针)接触，其中不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA分子702(例如，rRNA)杂交703。RNA耗竭探针可以连接在一起，或没有连接在一起。使用RNA酶H 705酶促地消化704与不希望的RNA耗竭探针结合的不希望的RNA。用RNA酶H处理会产生消化的不希望的RNA 706。在将RNA耗竭探针与RNA-模板连接组合的某些实施方案中，在图7中描述的方法可以在RTL探针(例如，RHS和LHS探针)与靶mRNA的杂交和连接反应之前或同时发生。RNA耗竭方法的RNA：DNA杂交体的RNA的RNA酶H消化可以与为RNA模板化连接反应产生的靶mRNA：DNA探针杂交体的mRNA的消化同时发生。在某些实施方案中，在图7中描述的方法还可以在任何空间分析方法中进行，这将受益于不希望的RNA种类的除去。例如，本文描述的RNA耗竭也可以与捕获探针对mRNA的直接捕获结合使用。
在耗竭不希望的RNA后，样品将含有感兴趣的RNA靶标(例如，mRNA靶标)的富集群体。在某些实施方案中，在耗竭不希望的RNA后，不希望的RNA占在样品中的总RNA的小于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或其中的任何范围(即，与没有经历耗竭步骤的样品相比，小于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或其中的任何范围)。结果，感兴趣的RNA靶标的富集群体可以占在样品中的总RNA的至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％或其中的任何范围。
(a)不希望的RNA分子
本文中使用的术语“不希望的RNA分子”或“不希望的RNA”表示作为从生物样品中耗竭的靶标的不希望的RNA。在某些实施方案中，不希望的RNA的例子包括、但不限于信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA(mtRNA)、转移RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)和病毒RNA。在某些实施方案中，所述不希望的RNA可以是转录物(例如，存在于组织切片中)。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)、tRNA-衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA-衍生的RNA(srRNA)或线粒体RNA(mtRNA)。在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子包括添加(例如，转染)到样品中的RNA分子(例如，小干扰RNA(siRNA))。所述不希望的RNA可以是双链RNA或单链RNA。在不希望的RNA是双链的实施方案中，在耗竭之前将其加工为单链RNA。在某些实施方案中，所述不希望的RNA可以是环状RNA。在某些实施方案中，所述不希望的RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。在某些实施方案中，所述不希望的RNA来自大肠杆菌。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子是rRNA。在某些实施方案中，所述rRNA是真核rRNA。在某些实施方案中，所述rRNA是细胞质rRNA。在某些实施方案中，所述rRNA是线粒体rRNA。细胞质rRNA包括，例如，28S、5.8S、5S和18S rRNA。线粒体rRNA包括，例如，12S和16S rRNA。所述rRNA也可以是原核rRNA，其包括例如5S、16S和23SrRNA。rRNA的序列是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地在序列数据库诸如GenBank中找到或者可以在文献中找到。例如，人18S rRNA的序列可以在GenBank中作为登记号M10098找到，并且人28SrRNA作为登记号M11167找到。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子是线粒体RNA。线粒体RNA包括，例如，12S rRNA(由MT-RNR1编码)和16S rRNA(由MT-RNR2编码)、编码电子传递链蛋白(例如，NADH脱氢酶、辅酶Q-细胞色素c还原酶/细胞色素b、细胞色素c氧化酶、ATP合酶或humanin)的RNA、以及tRNA(由MT-TA、MT-TR、MT-TN、MT-TD、MT-TC、MT-TE、MT-TQ、MT-TG、MT-TH、MT-TI、MT-TL1、MT-TL2、MT-TK、MT-TM、MT-TF、MT-TP、MT-TS1、MT-TS2、MT-TT、MT-TW、MT-TY或MT-TV编码)。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA是转移RNA(tRNA)。在某些实施方案中，所述不希望的RNA可以是特定mRNA。例如，可能合乎需要的是，除去通常大量存在的细胞转录物。因此，所述不希望的mRNA可以包括、但不限于ACTB、GAPDH和TUBB。tRNA和特定mRNA的其它序列是本领域技术人员众所周知的，并且可以容易地在序列数据库诸如GenBank中找到或者可以在文献中找到。
在某些实施方案中，mRNA不是不希望的RNA探针所耗竭的靶标。在某些实施方案中，一种或多种不希望的RNA耗竭探针不具有将与真核mRNA的聚A尾巴杂交的聚-dT。在另一个特定实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针靶向人18S或人28S rRNA并与其特异性杂交。在例如美国申请公开号2011/0111409 A1(其通过引用并入本文)中解释了靶向人18S和人28S rRNA的全长序列的不希望的RNA耗竭探针的序列的例子。
在某些实施方案中，所述一种或多种不希望的RNA分子是单一种类的RNA。例如，在某些实施方案中，所述一种或多种不希望的RNA分子仅与核糖体RNA分子杂交。在某些实施方案中，所述一种或多种不希望的RNA分子仅与线粒体RNA分子杂交。在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子可以是两个或更多个种类的RNA的组合。在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子是本文描述的不希望的RNA分子之一的RNA片段。在某些实施方案中，所述不希望的RNA分子是本文描述的不希望的RNA分子之一的全长RNA分子。
(b)不希望的RNA耗竭探针的设计
在某些实施方案中，所述一种或多种不希望的RNA耗竭探针是DNA探针。在某些实施方案中，所述DNA探针包括单链DNA寡核苷酸，其具有与不希望的RNA部分地或完全地互补的序列和与不希望的RNA特异性地杂交。在某些实施方案中，所述一种或多种不希望的RNA耗竭探针与一种或多种不希望的RNA分子具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补性。在某些实施方案中，所述一种或多种不希望的RNA耗竭探针与一种或多种不希望的RNA分子具有100％(即，完全)互补性。
在某些实施方案中，本文中使用的探针已经描述于Morlan等人，PLoS One.2012；7(8)：e42882中，其通过引用整体并入。在某些实施方案中，本文中使用的探针已经描述于美国申请公开号2011/0111409中，其通过引用整体并入。在某些实施方案中，本文中使用的探针已经描述于Adiconis等人，Nat Methods.2013年7月；10(7)：623-9中，其通过引用整体并入。
可以通过本领域已知的技术产生DNA探针。例如，在某些实施方案中，通过化学合成、通过重组核酸分子的体外表达或通过重组核酸分子的体内表达来产生DNA探针。不希望的RNA耗竭探针也可以通过不希望的RNA的扩增产生，例如，RT-PCR、不对称PCR或滚环扩增。
在某些实施方案中，本文中公开的靶向RNA耗竭的方法包括多个不希望的RNA耗竭探针。在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针包括与一种或多种不希望的RNA分子互补或基本上互补的序列。本文提供的方法可以应用于单个不希望的RNA分子或多个不希望的RNA分子。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针是约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000或约5000个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，单个不希望的RNA耗竭探针跨不希望的RNA的整个长度。在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针具有不与不希望的RNA互补的区域，只要这样的序列基本上不影响不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA的特异性杂交。在某些实施方案中，所述耗竭探针不是连续的，因此尽管它们可能在一段不希望的RNA上共同杂交，但在各个耗竭探针之间可能存在间隙。例如，在某些实施方案中，靶向不希望的RNA的RNA耗竭探针沿着不希望的RNA的长度间隔至少一个、至少两个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少60个核苷酸。因此，可能存在多个RNA耗竭探针，它们将沿着不希望的RNA分子的长度或部分沿着不希望的RNA分子的长度彼此相邻或不相邻地杂交。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针与可检测标记、光学标记和/或如本文中所述的标记相关(例如，与其缀合)。在某些情况下，所述可检测标记是放射性同位素、荧光的或化学发光的部分、以及酶或配体，其可以用于检测或确认探针已与靶序列杂交。可检测标记可以是本身可直接检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化化学底物化合物或组合物的化学改变，所述化学底物化合物或组合物是可直接检测的。可以定性检测可检测标记(例如，光学地或光谱地)，或者可以使用本领域已知的和/或本文中公开的方法对其量化。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括两种或更多种不希望的RNA耗竭探针的集合。在某些实施方案中，不希望的RNA耗竭探针的集合包括约100nM、约200nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM或约1000nM的每种RNA耗竭探针。在某些实施方案中，不希望的RNA耗竭探针的集合包括约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM或约10μM或更多的每种RNA耗竭探针。在某些实施方案中，RNA耗竭探针的集合中RNA耗竭探针的浓度取决于特定RNA耗竭探针所靶向的不希望的RNA的相对丰度。例如，核糖体转录物18S和28S在组织样品中可能非常丰富。在这种情况下，靶向18S和/或28S的RNA耗竭探针可以以比在集合中存在的其它RNA耗竭探针更高的浓度存在于不希望的RNA耗竭探针的集合中。
在某些实施方案中，RNA耗竭探针包括SEQ ID NO：1-195中任一个的核酸序列。在某些实施方案中，RNA耗竭探针的集合包括两种或更多种探针，每种探针具有选自SEQ IDNO：1-195中任一个的核酸序列。
(c)不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA分子的杂交
在某些实施方案中，一种或多种不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA杂交。在某些实施方案中，一种或多种不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA分子的序列的一个或多个部分杂交。在某些实施方案中，一种或多种不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA分子的完整序列杂交。杂交可以发生在具有与探针寡核苷酸100％互补的序列的不希望的RNA处。在某些实施方案中，杂交可以发生在具有与探针寡核苷酸至少(例如，至少约)80％、至少(例如，至少约)85％、至少(例如，至少约)90％、至少(例如，至少约)95％、至少(例如，至少约)96％、至少(例如，至少约)97％、至少(例如，至少约)98％或至少(例如，至少约)99％互补的序列的靶标处。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针可以与不希望的RNA序列的全部或部分互补，且因此，可能存在与不希望的RNA特异性地杂交的超过一种不希望的RNA探针。例如，可能存在与不希望的RNA特异性地杂交的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不希望的RNA耗竭探针。在某些实施方案中，所述不希望的RNA具有三级结构且所述不希望的RNA耗竭探针可以与不希望的RNA序列的暴露部分互补。
在某些实施方案中，一种或多种不希望的RNA耗竭探针可以与不希望的RNA杂交，使得不希望的RNA的完整序列的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％被不希望的RNA耗竭探针杂交。
在某些实施方案中，至少一个不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA的基本上整个全长序列特异性地杂交。本文中使用的“基本上整个全长序列”表示全长序列的小于100％，但是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或其中的任何范围。在某些实施方案中，多个不希望的RNA耗竭探针特异性地结合靶RNA的基本上整个全长序列。在另一个实施方案中，多个DNA探针与靶RNA的整个全长序列或其部分以相邻或非连续方式特异性地结合。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA分子特异性杂交并产生RNA：DNA杂交体。本文中使用的“特异性地杂交”表示，相对于存在于核酸样品中的其它核酸，特定DNA探针能够与靶RNA(例如，rRNA)杂交的状态。在某些情况下，DNA探针首先通过本领域已知的方法(例如，通过加热或在碱性条件下)变性成单链DNA，并然后通过本领域也已知的方法与靶RNA杂交，例如，通过在靶RNA存在下冷却加热的DNA。在某些情况下，双链DNA探针在被添加到生物样品之前被加热以实现变性为单链。在某些情况下，DNA探针作为单链DNA分子产生，在这种情况下不需要变性。DNA探针与RNA特异性杂交的条件是本领域普通技术人员众所周知的，并且应当理解，这些条件可以根据因素而变化，所述因素包括探针的GC含量和长度、杂交温度、杂交试剂或溶液的组成、以及所寻求的杂交特异性的程度。
在某些实施方案中，然后从核酸样品中耗竭RNA：DNA杂交体。例如，在某些实施方案中，使用特异性靶向RNA：DNA杂交体的核糖核酸酶(RNA酶)来耗竭RNA：DNA杂交体。在某些实施方案中，使用RNA酶H来特异性地水解RNA：DNA杂交体中的RNA，从而使RNA降解。然后剩余的DNA可用于与另一种不希望的RNA序列杂交。
在某些情况下，在产生RNA：DNA杂交体后，不再采取进一步的步骤来除去杂交体(例如，不会发生如下所述的核糖核酸酶消化)。因此，在某些情况下，杂交用于“阻断”单链不希望的RNA分子(例如，rRNA)与靶向例如聚A尾巴或其它感兴趣的靶标的探针序列相关联(例如，抑制其结合)。因此，在某些方面，本文公开的空间检测方法在存在RNA：DNA杂交体的情况下发生。在产生但未除去RNA：DNA杂交体的情况下，相对于未产生杂交体的情况，感兴趣的RNA分子的检测会增加。在某些情况下，与未产生杂交体的情况相比，感兴趣的靶RNA分子的检测增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1.5倍、约2.0倍、约2.5倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.0倍、约4.5倍、约5.0倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多。
(d)除去多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物。
(i)核糖核酸酶消化
在某些实施方案中，除去不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物。在某些实施方案中，所述除去步骤包括RNA酶H的添加。在某些实施方案中，所述除去步骤包括使所述不希望的RNA耗竭探针与核糖核酸酶(例如，RNA酶H)接触。在某些实施方案中，所述核糖核酸酶是核糖核酸内切酶。在某些实施方案中(例如，在RNA模板化连接的情况下)，核糖核酸内切酶也用于从分析物释放探针。在某些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I中的一种或多种、或其任意组合。在某些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是RNA酶H。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H1、RNA酶H2或其任意组合。在某些实施方案中，所述RNA酶H是热稳定的RNA酶H。热稳定的RNA酶H可以商业获得，包括，例如，HybridaseTM(Lucigen，Middleton，WI)。
在某些实施方案中，所述RNA酶H在32℃至95℃之间的温度范围内降解来自RNA：DNA杂交体的RNA(例如，使用热稳定的RNA酶H)。在某些实施方案中，所述RNA酶H在32℃至60℃之间的温度范围内降解来自RNA：DNA杂交体的RNA。在某些实施方案中，所述RNA酶H在37℃至60℃之间的温度范围内降解来自RNA：DNA杂交体的RNA。在另一个实施方案中，RNA酶H在约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃或约64℃的温度降解来自RNA：DNA杂交体的RNA。
在某些实施方案中，将杂交步骤和用RNA酶H的RNA降解重复超过一次。在某些情况下，将杂交步骤和RNA降解步骤重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次或更多。在某些情况下，使用本文中公开的和本领域已知的方法和溶液(例如，PBS、PBST)在每个步骤之间进行洗涤步骤。
在某些实施方案中，所述核糖核酸酶可以通过透化试剂灭活，例如将生物样品同时灭活和透化。在某些情况下，所述透化试剂是本领域已知的有机溶剂、交联剂、去污剂和酶中的一种或多种。在某些情况下，所述透化试剂是肽链内切酶或蛋白酶。在某些情况下，所述肽链内切酶是胃蛋白酶。在某些情况下，所述肽链内切酶是蛋白水解酶K。在某些情况下，将所述核糖核酸酶热灭活。例如，在某些情况下，将所述核糖核酸酶(例如，除了热稳定的RNA酶H)在65℃热灭活。
在某些实施方案中，未与不希望的靶RNA杂交的DNA探针，或在RNA酶H降解来自RNA：DNA杂交体的RNA后已经释放的探针，可以在RNA分离的各个阶段通过DNA降解酶或本领域众所周知的其它技术除去。在某些实施方案中，所述DNA降解酶是在5′到3′方向消化DNA的核酸外切酶。在某些实施方案中，所述DNA降解酶不消化附着在基质上的捕获探针。在某些实施方案中，所述DNA降解酶是RecJ核酸外切酶。RecJ核酸外切酶在5′-3′方向降解单链DNA(ssDNA)，并可以参与同源重组和错配修复。在某些情况下，RecJ核酸外切酶分离自大肠杆菌。在某些实施方案中，DNA降解酶可以被本文公开的透化试剂灭活。
(ii)不希望的RNA-耗竭探针复合物的除去
在某些实施方案中，使用除了添加RNA酶H之外的方法除去包括不希望的RNA耗竭探针和不希望的RNA的DNA：RNA复合物。在某些情况下，所述不希望的RNA耗竭探针包括捕获部分。如在本文中公开的，不希望的RNA耗竭探针的捕获部分附着至(例如，缀合至)不希望的RNA耗竭探针的核酸序列。在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针包括一个或多个捕获部分。在某些实施方案中，所述捕获部分包括如本文中所述的标记。在某些实施方案中，所述标记用于鉴定和除去不希望的RNA耗竭探针，无论它们是否与不希望的RNA分子杂交。在某些情况下，使用所述标记，可以从生物样品中分离和除去RNA耗竭探针(包括与不希望的RNA形成复合物的不希望的RNA耗竭探针)。在某些实施方案中，所述标记与不希望的RNA耗竭探针直接相关联(即，缀合)。可检测标记可以是本身可直接检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化化学底物化合物或组合物的化学改变，所述化学底物化合物或组合物是可直接检测的。可检测标记可以适用于小规模检测和/或适用于高通量筛选。因此，合适的可检测标记包括、但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光的化合物、生物发光的化合物和染料。
在某些实施方案中，所述捕获部分包括小分子。在某些实施方案中，所述捕获部分包括核酸。在某些实施方案中，所述核酸是单链的。在某些实施方案中，所述核酸是双链的。在某些实施方案中，所述核酸是RNA。在某些实施方案中，所述核酸是DNA。在某些实施方案中，所述捕获部分包括碳水化合物。在某些实施方案中，所述捕获部分位于不希望的RNA耗竭探针中的结构域的5’侧。在某些实施方案中，所述捕获部分位于不希望的RNA耗竭探针中的结构域的3’侧。
在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包括蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白是抗体。在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包含核酸。在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包含小分子。在某些实施方案中，特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂附着至基质。在某些实施方案中，所述基质是珠子。在某些实施方案中，所述基质是孔。在某些实施方案中，所述基质是载玻片。在某些实施方案中，所述基质是磁珠，例如顺磁颗粒，使得不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物或单独的不希望的RNA耗竭探针可以通过磁方式从生物样品中除去，例如通过稀土磁体或其它磁性装置。
在某些实施方案中，所述捕获部分是生物素。在某些实施方案中，生物素分子在3’末端处与不希望的RNA耗竭探针直接相关联(即，缀合)。在某些实施方案中，生物素分子在5’末端处与不希望的RNA耗竭探针直接相关联(即，缀合)。在某些实施方案中，所述生物素分子可以与抗生物素蛋白分子相关联(例如，缀合)，从而允许下拉不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物或不希望的RNA耗竭探针。在某些实施方案中，且如下文公开的，所述生物素分子可以与抗生蛋白链菌素分子相关联(例如，缀合)，使得缀合至生物素分子的不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物或不希望的RNA耗竭探针可以被抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白捕获并从生物样品中耗竭。
(e)使用靶向RNA耗竭的原位空间RNA模板化连接(RTL)
在某些情况下，所述不希望的RNA耗竭探针用于原位空间RNA模板化连接(RTL)的背景下(例如，与其同时)。在RTL的背景下，可以同时除去不希望的RNA。在某些情况下，可以同时添加RTL探针寡核苷酸和不希望的RNA耗竭探针。在RTL探针连接后，将核酸内切酶诸如RNA酶H添加到样品中。RNA酶H消化RNA分析物和不希望的RNA。在某些情况下，至少一种RTL探针包括探针捕获序列诸如聚A序列、寡-d(T)序列或特定捕获序列(在靶向RNA分析的背景下)。作为该过程的结果，不希望的RNA分子(例如，rRNA；mtRNA)被消化，并因此不能干扰下游应用诸如在本文中公开的基于空间阵列的过程中发生的聚A序列或其互补序列的探针捕获。
在本公开内容的一个特征中，提供了用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含(a)使所述生物样品与第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和多个不希望的RNA耗竭探针接触；(b)使所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与所述分析物杂交；(c)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子杂交；(d)连接所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸，由此产生与所述分析物基本上互补的连接的探针；(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物并且从所述分析物释放所述连接的探针；(f)使所述生物样品与基质接触，其中所述捕获探针附着至所述基质，其中所述捕获探针包含空间条形码和捕获结构域；(g)使所述连接的探针的捕获探针结合结构域特异性地结合所述捕获结构域；和(h)确定(i)与所述捕获结构域特异性地结合的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
在某些实施方案中，本文中公开的方法包括一个或多个探针寡核苷酸(例如，RTL探针)与感兴趣的靶分析物(例如，RNA；例如，mRNA)的杂交。在某些实施方案中，所述方法包括2、3、4种或更多种探针寡核苷酸的杂交。在某些实施方案中，所述方法包括两种探针寡核苷酸的杂交。在某些实施方案中，所述探针寡核苷酸包括与分析物互补或基本上互补的序列。例如，在某些实施方案中，每个探针寡核苷酸包括与感兴趣的mRNA(例如，与感兴趣的mRNA的序列的一部分)互补或基本上互补的序列。本文提供的方法可以应用于两个或更多个探针寡核苷酸与单个核酸分子的杂交。在某些实施方案中，每个靶分析物包括第一靶区域和第二靶区域。在某些情况下，所述方法包括提供多个第一探针寡核苷酸和多个第二探针寡核苷酸。在某些情况下，第一探针寡核苷酸与核酸的第一靶区域杂交。在某些情况下，第二探针寡核苷酸与核酸的第二靶区域杂交。
在某些情况下，所述多个第一探针寡核苷酸的第一探针寡核苷酸的第一探针寡核苷酸序列可以包含第一反应性部分。所述多个第一探针寡核苷酸的一个或多个第一探针寡核苷酸可以包含相同的第一探针寡核苷酸序列和/或相同的第二探针寡核苷酸序列。所述多个第二探针寡核苷酸可以各自包含第三探针寡核苷酸序列，其与所述多个核酸分子的一个核酸分子的第二靶区域的序列互补。所述多个第二探针寡核苷酸可以进一步包含第四探针寡核苷酸序列。所述多个第二探针寡核苷酸的第二探针寡核苷酸的第三探针寡核苷酸序列可以包含第二反应性部分。所述多个第二探针寡核苷酸的第二探针寡核苷酸的一个或多个探针寡核苷酸可以包含相同的第三探针寡核苷酸序列，和/或，如果存在的话，相同的第四探针寡核苷酸序列。所述多个第一探针寡核苷酸的第一探针寡核苷酸的第一探针寡核苷酸序列可以与所述多个核酸分子的一个核酸分子的第一靶区域杂交。所述多个第二探针寡核苷酸的第二探针寡核苷酸的第三探针寡核苷酸序列可以与所述多个核酸分子的一个核酸分子的第二靶区域杂交。分别与所述多个核酸分子的一个核酸分子的第一和第二靶区域杂交的第一和第三探针寡核苷酸序列可以彼此邻近，使得所述第一探针寡核苷酸序列的第一反应性部分邻近所述第三探针寡核苷酸序列的第二反应性部分。与所述多个核酸分子的核酸分子杂交的第一和第二探针寡核苷酸的第一和第二反应性部分可以反应以提供多个探针寡核苷酸-连接的核酸分子。
在某些实施方案中，所述探针寡核苷酸之一包括聚A序列或其互补序列。在某些情况下，所述聚A序列或其互补序列位于探针寡核苷酸之一的5′端上。在某些情况下，所述聚A序列或其互补序列位于探针寡核苷酸之一的3′端上。在某些实施方案中，一种探针寡核苷酸包括简并或UMI序列。在某些实施方案中，所述UMI序列对特定靶标或一组靶标是特异性的。在某些情况下，所述UMI序列或其互补序列位于探针寡核苷酸之一的5′端。在某些情况下，所述UMI序列或其互补序列位于探针寡核苷酸之一的3′端。
在某些情况下，所述多个核酸分子的一个核酸分子的第一和第二靶区域彼此邻近。在某些实施方案中，所述第一和第二探针寡核苷酸结合相同转录物上的互补序列。在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸所结合的互补序列彼此相距1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125或约150个核苷酸。可以在连接之前首先填充探针寡核苷酸之间的间隙，例如使用与以下物质组合的dNTP：聚合酶诸如Mu聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶和/或任意组合、其衍生物和变体(例如，经工程改造的突变体)。在某些实施方案中，当第一和第二探针寡核苷酸被一个或多个核苷酸彼此分开时，脱氧核糖核苷酸用于延伸和连接第一和第二探针寡核苷酸。
在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与相同转录物上的分析物杂交。在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与相同外显子上的分析物杂交。在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与不同外显子上的分析物杂交。在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与作为易位事件的结果的分析物杂交(例如，在癌症背景下)。本文提供的方法使得可能鉴定改变一种或两种探针寡核苷酸的杂交率的选择性剪接事件、易位事件和突变(例如，单核苷酸多态性、插入、缺失、点突变)。
在某些实施方案中，本文公开的第一和/或第二探针包括：在3’末端处的至少两个核糖核酸碱基；一个功能序列；在5’末端处的一个磷酸化的核苷酸；和/或一个捕获探针结合结构域。在某些实施方案中，所述功能序列是引物序列。所述捕获探针结合结构域是与捕获探针中存在的特定捕获结构域互补的序列。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包括聚A序列。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包括聚尿苷序列、聚胸苷序列或它们的组合。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包括随机序列(例如，随机六聚体或八聚体)。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域与检测感兴趣的特定靶标的捕获探针中的捕获结构域互补。在某些实施方案中，提供了与捕获探针结合结构域相互作用的捕获探针结合结构域阻断部分。在某些实施方案中，捕获探针结合结构域阻断部分包括与捕获探针结合结构域互补或基本上互补的序列。在某些实施方案中，捕获探针结合结构域阻断部分阻止捕获探针结合结构域结合捕获探针(在其存在时)。在某些实施方案中，在捕获探针结合结构域(例如，存在于连接的探针中)与捕获探针结合之前除去捕获探针结合结构域阻断部分。在某些实施方案中，捕获探针结合结构域阻断部分包含聚尿苷序列、聚胸苷序列或它们的组合。
在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸与分析物杂交且第二探针寡核苷酸与在第一探针寡核苷酸附近的分析物杂交。杂交可以发生在具有与探针寡核苷酸100％互补的序列的靶标处。在某些实施方案中，杂交可以发生在具有与探针寡核苷酸至少(例如，至少约)80％、至少(例如，至少约)85％、至少(例如，至少约)90％、至少(例如，至少约)95％、至少(例如，至少约)96％、至少(例如，至少约)97％、至少(例如，至少约)98％或至少(例如，至少约)99％互补的序列的靶标处。杂交之后，在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸被延伸。杂交之后，在某些实施方案中，所述第二探针寡核苷酸被延伸。例如，在某些情况下，第一探针寡核苷酸与在第二寡核苷酸探针上游的靶序列杂交，而在其它情况下，第一探针寡核苷酸与在第二寡核苷酸探针下游的靶序列杂交。
本文中公开的方法包括添加本文描述的不希望的RNA探针。在某些情况下，所述不希望的RNA探针与所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸同时加入。在某些情况下，所述不希望的RNA探针在所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸之前加入。在某些情况下，所述不希望的RNA探针在所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸之后加入。
在某些实施方案中，本文中公开的方法包括在使所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸和/或不希望的RNA探针杂交之后的洗涤步骤。所述洗涤步骤除去任何未结合的寡核苷酸且可以使用本领域已知的任何技术执行。在某些实施方案中，将预杂交缓冲液用于洗涤样品。在某些实施方案中，使用磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，执行多个洗涤步骤以除去未结合的寡核苷酸。例如，减少在生物样品中存在的未杂交探针的量是有利的，因为它们可能干扰下游应用和方法。
在某些实施方案中，在探针寡核苷酸(例如，第一和第二探针寡核苷酸)与靶分析物杂交之后，探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)连接在一起，从而产生单个连接的探针，其与靶分析物互补。如本文所述，可以酶促地或化学地进行连接。例如，使第一和第二探针寡核苷酸与分析物的第一和第二靶区域杂交，并且对探针寡核苷酸进行核酸反应以将它们连接在一起。例如，可以使用连接酶(例如，T4 RNA连接酶(Rnl2)、SplintR连接酶或T4 DNA连接酶)对探针进行酶促连接反应。关于KOD连接酶的描述，参见，例如，Zhang L.，等人.；Archaeal RNA ligase from thermoccocus kodakarensis fortemplate dependent ligation RNA Biol.2017；14(1)：36-44。
在某些实施方案中，在连接反应期间添加腺苷三磷酸(ATP)。DNA连接酶催化的带切口DNA底物的密封首先通过ATP水解被活化，导致AMP基团向酶的共价添加。在与DNA双链体中的切口位点结合后，连接酶将该AMP转移到在切口处的磷酸化的5’末端，从而形成5′-5′焦磷酸酯键。最后，连接酶催化在切口的3′-末端处的OH基团对该焦磷酸酯键的攻击，从而将其密封，然后释放连接酶和AMP。如果连接酶在3′攻击之前从底物脱离，例如，由于酶的过早AMP重新加载，则5′AMP留在5′-末端处，从而阻断进一步的连接尝试。在某些情况下，在连接反应期间以约1μM、约10μM、约100μM、约1000μM或约10000μM的浓度添加ATP。
在某些情况下，在连接过程中添加有助于探针寡核苷酸的连接的辅因子。在某些情况下，所述辅因子包括镁离子(Mg2+)。在某些情况下，所述辅因子包括锰离子(Mn2+)。在某些情况下，以MgCl2的形式加入Mg2+。在某些情况下，以MnCl2的形式加入Mn2+。在某些情况下，MgCl2的浓度是约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。在某些情况下，MnCl2的浓度是约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。
在某些实施方案中，所述探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)可以各自包含反应性部分，使得在与靶标杂交并暴露于适当连接条件后，探针寡核苷酸可以彼此连接。在某些实施方案中，包括反应性部分的探针寡核苷酸被化学连接。例如，能够与核酸分子的第一靶区域杂交的探针寡核苷酸可以包含第一反应性部分，并且能够与核酸分子的第二靶区域杂交的探针寡核苷酸可以包含第二反应性部分。当第一和第二探针寡核苷酸与核酸分子的第一和第二靶区域杂交时，所述第一和第二反应性部分可以彼此邻近。探针的反应性部分可以选自由叠氮化物、炔烃、硝酮(例如，1，3-硝酮)、应变烯烃(例如，反式-环烯烃诸如环辛烯或氧杂降冰片二烯)、四嗪、四唑、碘化物、硫代酸酯(例如，硫代磷酸酯)、酸、胺和磷酸酯组成的非限制性集合。例如，第一探针寡核苷酸的第一反应性部分可以包含叠氮化物部分，并且第二探针寡核苷酸的第二反应性部分可以包含炔烃部分。第一和第二反应性部分可以反应以形成连接部分。第一和第二反应性部分之间的反应可以是例如环加成反应诸如应变促进的叠氮化物-炔烃环加成、铜催化的叠氮化物-炔烃环加成、应变促进的炔烃-硝酮环加成、第尔斯-阿尔德反应、[3+2]环加成、[4+2]环加成或[4+1]环加成；硫醇-烯反应；亲核置换反应；或其它反应。在某些情况下，探针的末端使用生物正交点击化学连接在一起，从而有效地将探针锁定在靶标周围。参见Rouhanifard等人，NatBiotechnol.2018年11月12日；10.1038/nbt.4286，其通过引用整体并入。在某些情况下，第一和第二反应性部分之间的反应可以产生三唑部分或异噁唑啉部分。第一和第二反应性部分之间的反应可以包括使反应性部分经受合适的条件诸如合适的温度、pH或压力，并为反应提供一种或多种试剂或催化剂。例如，第一和第二反应性部分之间的反应可以由铜催化剂、钌催化剂或应变物种(诸如二氟辛炔、二苄基环辛炔或联芳基氮杂环辛炔酮)催化。与核酸分子的第一靶区域杂交的第一探针寡核苷酸的第一反应性部分和与核酸分子的第二靶区域杂交的第三探针寡核苷酸的第二反应性部分之间的反应可以连接第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸以提供连接的探针。因此，第一和第二反应性部分的反应可以包含化学连接反应诸如铜催化的5’叠氮化物到3’炔烃的“点击”化学反应以在两个探针寡核苷酸之间形成三唑键。在其它非限制性实施例中，碘化物部分可以与硫代磷酸酯部分化学连接以形成硫代磷酸酯键，酸可以与胺连接以形成酰胺键，和/或磷酸酯和胺可以连接以形成氨基磷酸酯键。
在某些实施方案中，在连接第一和第二探针寡核苷酸以产生连接的探针后，连接的探针从分析物释放。在该方法的这个阶段，(1)连接的探针被产生并与分析物杂交，并且(2)不希望的RNA探针与不希望的RNA杂交。为了从分析物释放连接的探针，使用核糖核酸内切酶。核糖核酸内切酶诸如RNA酶H特异性地切割RNA：DNA杂交体中的RNA。因此，不仅RNA酶H切割连接的探针与分析物的杂交(释放连接的探针)，RNA酶H也会切割不希望的RNA。在某些实施方案中，所述连接的探针被酶促释放。在某些实施方案中，使用核糖核酸内切酶从分析物释放探针。在某些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是一种或多种RNA酶H。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H1或RNA酶H2。
在某些实施方案中，在从探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)产生连接的探针之后，生物样品被透化。在某些实施方案中，使用蛋白酶发生透化。在某些实施方案中，所述蛋白酶是肽链内切酶。可以使用的肽链内切酶包括、但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰基肽链内切酶(GluC)、ArgC、肽基-asp肽链内切酶(ApsN)、肽链内切酶LysC和肽链内切酶LysN。在某些实施方案中，所述肽链内切酶是胃蛋白酶。
在某些实施方案中，所述连接的探针包括捕获探针结合结构域，其可以与捕获探针(例如，直接地或间接地固定化在基底上的捕获探针)杂交。在某些实施方案中，本文提供的方法包括使所述生物样品与基质接触，其中所述捕获探针附着至所述基质(例如，直接地或间接地固定化至基质)。在某些实施方案中，所述捕获探针包括空间条形码和捕获结构域。在某些实施方案中，所述连接的探针的捕获探针结合结构域特异性地结合所述捕获结构域。在连接的探针与捕获探针杂交之后，所述连接的探针在3’末端处被延伸以产生捕获探针的附加组件(例如，空间条形码)的副本。在某些实施方案中，本文提供的连接的探针的捕获方法包括生物样品的透化，使得捕获探针可以更容易地与捕获的连接的探针杂交(即，与不透化相比)。在某些实施方案中，可以将逆转录(RT)试剂添加到透化过的生物样品中。与RT试剂一起的温育可以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化的mRNA)产生带空间条形码的全长cDNA。可以将第二链试剂(例如，第二链引物、酶)添加到载玻片上的生物样品中以启动第二链合成。
所得的cDNA可以从捕获探针模板变性并转移(例如，转移到干净的试管中)用于如本文描述的扩增和/或文库构建。带空间条形码的全长cDNA可以在文库构建之前通过PCR进行扩增。然后可以对cDNA进行酶促片段化和大小选择，以优化cDNA扩增子大小。P5、P7、i7和i5可以用作样品索引，且TruSeq Read 2可以通过末端修复(End Repair)、A加尾(A-tailing)、衔接子连接(Adaptor Ligation)和PCR而添加。然后可以使用TruSeq Read 1和TruSeq Read 2作为测序引物位点，使用配对末端测序对cDNA片段进行测序。
在某些实施方案中，使所述生物样品与不希望的RNA耗竭探针和RTL探针(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)基本上同时接触。在某些实施方案中，使生物样品在不希望的RNA耗竭探针之后与RTL探针(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)接触。
在某些实施方案中，在RTL探针(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)与分析物之间的杂交和在不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA之间的杂交基本上同时发生。在某些实施方案中，在不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA之间的杂交发生之后，发生在RTL探针(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)与分析物之间的杂交。
在某些实施方案中，除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物和从所述分析物释放所述连接的探针的步骤基本上同时发生。在某些实施方案中，在从所述分析物释放所述连接的探针之前，发生除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物的步骤。
在某些实施方案中，当不希望的RNA耗竭探针和不希望的RNA杂交以形成RNA：DNA杂交体时，RTL探针(例如，第一和第二探针寡核苷酸)和分析物(例如，靶mRNA)基本上同时杂交以形成RNA：DNA杂交体。在某些实施方案中，核糖核酸酶(例如，RNA酶H)消化RNA：DNA杂交体的RNA链，其中RNA链包括分析物和不希望的RNA分子。
使用RNA模板化连接(RTL)的靶向RNA捕获的详细描述已经公开在美国申请号62/952,736中，其全部内容通过引用并入本文。
(f)使用靶寡核苷酸探针的杂交的靶向分析物捕获
在某些实施方案中，一种或多种靶寡核苷酸探针被设计为靶向并杂交多种核酸(例如，制备的空间文库；例如，制备的cDNA文库)。在这种情况下，在靶向一种或多种感兴趣的靶核酸之前，在某些实施方案中，所述生物样品首先与如本文中所述的不希望的RNA耗竭探针接触。在某些实施方案中，形成与不希望的RNA分子杂交的不希望的RNA耗竭探针的复合物。在某些实施方案中，核糖核酸酶(例如，RNA酶H)消化RNA：DNA杂交体的RNA链，其中RNA链是不希望的RNA分子(例如，rRNA)。
在某些实施方案中，本文中公开了耗竭生物样品中的不希望的RNA的方法，且包括首先使所述生物样品与多个不希望的RNA耗竭探针接触，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；和除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物。在除去不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物之后，可以进行分析物的鉴定。
在某些情况下，为了从样品(其不希望的RNA分子被耗竭)产生分析物的非特异性文库，所述方法(在不希望的RNA耗竭后)包括使所述分析物与多个捕获探针杂交，每个捕获探针包括空间条形码和特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域。在某些实施方案中，使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针以产生延伸的捕获探针。在模板产生之后，可以使用本文公开的方法扩增捕获探针/分析物复合物以产生cDNA文库。
在RNA耗竭后，可以分析特定靶分析物。例如，在本文公开的一个实例中，靶寡核苷酸探针是“小组”的一部分，该“小组”包括数百或数千个对某些背景特异性的寡核苷酸探针。例如，一组寡核苷酸可以检测在癌症期间、在免疫失调期间、在神经发育和疾病进展期间失调的或在相同途径中起作用的分析物。小组和特定的寡核苷酸公开在美国申请号62/970,066、62/929,686、62/980,124和62/980,116中，它们中的每一篇通过引用整体并入。
在某些情况下，所述靶寡核苷酸探针与靶分析物杂交，并然后选择性富集它们，例如通过本文公开的扩增和/或下拉方法。在某些实施方案中，所述靶寡核苷酸探针不包括附着至所述序列的部分(即，靶寡核苷酸探针是裸靶寡核苷酸探针)。在某些情况下，所述寡核苷酸探针与一个或多个部分相关联。在某些实施方案中，所述部分是生物素。在某些实施方案中，生物素分子在3’末端处与靶寡核苷酸探针直接相关联(即，缀合)。在某些实施方案中，生物素分子在5’末端处与靶寡核苷酸探针直接相关联(即，缀合)。在某些实施方案中，且如下文公开的，生物素分子可以与抗生物素蛋白分子相关联(例如，缀合)，从而允许下拉分析物。在某些实施方案中，且如下文公开的，生物素分子可以与抗生蛋白链菌素分子相关联(例如，缀合)，从而允许下拉分析物。在下拉感兴趣的分析物后，可以扩增得到的分析物，从而产生富集的分析物文库。“富集”表示与未经历下拉步骤的相同分析物文库的样品相比，靶分析物的浓度增加。
(g)靶向RNA耗竭的方法
本文提供了用于鉴定分析物(例如，本文描述的任何分析物)在生物样品中的位置的方法，所述方法包括(a)使所述生物样品与基质接触，所述基质包含多个附着的捕获探针，其中所述多个中的一个捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)特异性地结合捕获探针捕获结构域的捕获结构域；(b)使所述生物样品与第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和多个不希望的RNA耗竭探针接触(例如，本文描述的任何不希望的RNA耗竭探针)，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域(例如，本文描述的任何捕获探针结合结构域)，其能够结合捕获探针(例如，本文描述的任何捕获探针)的捕获结构域(例如，本文描述的任何捕获结构域)，且其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与在生物样品中的不希望的RNA分子(例如，本文描述的任何不希望的RNA分子)的全部或部分序列基本上互补；(c)使所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与所述分析物杂交；(d)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子杂交(例如，使用本文描述的用于使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交的任何方法)；(e)连接所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸，由此产生连接的探针(例如，使用本文描述的任何连接方法)，其与所述分析物基本上互补；(f)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物(例如，使用本文描述的用于除去多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物的任何方法)和从所述分析物释放所述连接的探针(例如，使用本文描述的用于从所述分析物释放所述连接的探针的任何方法)；(g)使所述连接的探针的捕获探针结合结构域特异性地结合所述捕获结构域；和(h)确定(i)与所述捕获结构域特异性地结合的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
本文提供了用于鉴定分析物(例如，本文描述的任何分析物)在生物样品中的位置的方法，所述方法包括(a)使所述生物样品与基质(例如，本文描述的任何基质)接触，所述基质包含多个附着的捕获探针(例如，本文描述的任何捕获探针)，其中所述多个中的一个捕获探针包含(i)空间条形码(例如，本文描述的任何空间条形码)和(ii)特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域(例如，本文描述的任何捕获结构域)；(b)使所述生物样品与多个不希望的RNA耗竭探针(例如，本文描述的任何不希望的RNA耗竭探针)接触，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与在生物样品中的不希望的RNA分子(例如，本文描述的任何不希望的RNA分子)的全部或部分序列基本上互补；(c)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交(例如，使用本文描述的用于使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交的任何方法)；(d)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物(例如，使用本文描述的用于除去多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物的任何方法)；(e)使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针的3’末端以产生延伸的捕获探针；和(f)扩增(例如，使用本文描述的任何扩增方法)所述延伸的捕获探针以产生核酸。
本文提供了用于鉴定分析物(例如，本文描述的任何分析物)在生物样品中的位置的方法，所述方法包括(a)使所述生物样品与多个不希望的RNA耗竭探针(例如，本文描述的任何不希望的RNA耗竭探针)接触，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与在生物样品中的不希望的RNA分子(例如，本文描述的任何不希望的RNA分子)的全部或部分序列基本上互补；(b)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交(例如，使用本文描述的用于使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交的任何方法)；(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物(例如，使用本文描述的用于除去多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物的任何方法)；(d)使多个核酸与多个靶寡核苷酸探针接触(例如，本文描述的任何靶寡核苷酸探针)，其中：所述多个核酸中的一个核酸包含(i)空间条形码(例如，本文描述的任何空间条形码)或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的部分序列或其互补序列；且所述多个靶寡核苷酸探针中的一个靶寡核苷酸探针包含：结构域，其特异性地结合(i)所述空间条形码的全部或部分或其互补序列，和/或(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列或其互补序列，和分子标签；(e)使用基质富集特异性地结合所述核酸的靶寡核苷酸探针的复合物，所述基质包含特异性地结合所述分子标签的试剂(例如，本文描述的任何试剂)；和(f)确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
在某些情况下，在使用蛋白-DNA分子作为靶探针的背景下使用不希望的RNA耗竭探针。在某些情况下，所述不希望的RNA耗竭探针可以用在本文描述的任何空间分析方法中。例如，如本文所公开的，在与核酸分子相关的抗体或其抗原结合片段的存在下，不希望的RNA耗竭探针可以与不希望的RNA分子杂交。在某些情况下，可以使用抗体或其抗原结合片段将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)以特定方式偶联(例如，相关联；缀合)抗体或其抗原结合片段，所述特定方式促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)向生物样品(例如，细胞；例如细胞的表面)的附着。在某些情况下，所述不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA分子杂交，从而不允许不希望的RNA分子与所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子杂交。在某些情况下，与其中没有产生不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA的杂交体的情况相比，感兴趣的分析物的检测增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1.5倍、约2.0倍、约2.5倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.0倍、约4.5倍、约5.0倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多。
在某些情况下，所述不希望的RNA耗竭探针是RNA分子。在某些情况下，所述RNA分子与缀合至蛋白(例如，抗体)的DNA分子杂交，其中所述抗体与感兴趣的蛋白结合。所述RNA分子与缀合至蛋白(例如，抗体)的DNA分子互补。在某些情况下，执行以下步骤：抗体-DNA分子与感兴趣的蛋白结合；RNA分子(即RNA耗竭探针)与DNA分子杂交，从而阻断其它核酸与DNA分子杂交。
在某些情况下，在使RNA分子与DNA分子杂交之后，所述抗体与感兴趣的蛋白结合。在后一种情况下，在一个实施方案中，在抗体-DNA分子与感兴趣的蛋白结合之前，所述RNA分子与抗体-DNA分子形成复合物。在抗体与蛋白杂交之后，可以添加RNA酶H以将RNA分子从DNA分子上切割下来，使得DNA分子可以自由地与本文描述的任何空间捕获阵列杂交。
(h)预杂交方法
(i)成像和染色
在添加探针(例如，不希望的RNA耗竭探针和/或RTL探针)之前，在某些情况下，可以使用多种染色剂和染色技术对生物样品进行染色。在某些情况下，所述生物样品是在载玻片上的切片(例如，5μm切片、7μm切片、10μm切片等)。在某些情况下，所述生物样品在放置到载玻片上之后被干燥。在某些情况下，在42℃干燥生物样品。在某些情况下，干燥发生约1小时、约2、小时、约3小时，或直到切片变得透明。在某些情况下，可以将生物样品干燥过夜(例如，在室温在干燥器中)。
在某些实施方案中，可以使用任意数目的生物染色剂对样品进行染色，所述生物染色剂包括、但不限于吖啶橙、Bismarck棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或番红。在某些情况下，本文公开的方法包括对生物样品进行成像。在某些情况下，样品成像发生在生物样品脱氨基之前。在某些情况下，使用已知的染色技术，包括Can-Grunwald、吉姆萨、苏木精和曙红(H&E)、Jenner氏、Leishman、Masson氏三色、Papanicolaou、Romanowsky、银、苏丹、Wright和/或过碘酸Schiff(PAS)染色技术，可以对样品染色。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定后进行。在某些情况下，所述染色剂是H&E染色剂。
在某些实施方案中，可以使用如本文别处所述的可检测标记(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光的化合物、生物发光的化合物和染料)对生物样品进行染色。在某些实施方案中，使用仅一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在某些实施方案中，染色包括生物染色技术诸如H&E染色。在某些实施方案中，染色包括使用荧光缀合抗体鉴定分析物。在某些实施方案中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术对生物样品进行染色。例如，可以如下制备生物样品：使用一种技术(例如，H&E染色和亮视野成像)进行染色和成像，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微术)对同一生物样品进行染色和成像。
在某些实施方案中，可以将生物样品脱色。将生物样品的脱色或褪色方法是本领域已知的，并且通常取决于应用于样品的染色剂的性质。例如，H&E染色可以通过在HCl或任何其它酸(例如，硒酸、硫酸、氢碘酸、苯甲酸、碳酸、苹果酸、磷酸、草酸、琥珀酸、水杨酸、酒石酸、亚硫酸、三氯乙酸、氢溴酸、盐酸、硝酸、正磷酸、砷酸、亚硒酸、铬酸、柠檬酸、氢氟酸、亚硝酸、异氰酸、甲酸、硒化氢、钼酸、乳酸、乙酸、碳酸、硫化氢或它们的组合)中洗涤样品来脱色。在某些实施方案中，脱色可以包括在酸(例如，HCl)中的1、2、3、4、5次或更多次洗涤。在某些实施方案中，脱色可以包括将HCl添加到下游溶液(例如，透化溶液)中。在某些实施方案中，脱色可以包括在酸(例如，HCl)溶液中溶解所公开方法中使用的酶(例如，胃蛋白酶)。在某些实施方案中，在用酸对苏木精脱色后，可以向脱色溶液中添加其它试剂以升高pH用于其它应用。例如，可以向酸脱色溶液中添加SDS以与单独的酸脱色溶液相比升高pH。作为另一个例子，在某些实施方案中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光法染色剂应用于样品。使用诸如通过还原剂处理来切割二硫键和去污剂洗涤、离液盐处理、抗原回收溶液处理和酸性甘氨酸缓冲液处理等技术，可以除去这样的染色剂。用于多路化染色和脱色的方法描述在例如Bolognesi等人，J.Histochem.Cytochem.2017；65(8)：431-444，Lin等人，Nat Commun.2015；6：8390，Pirici等人，J.Histochem.Cytochem.2009；57：567-75，和Glass等人，J.Histochem.Cytochem.2009；57：899-905，它们中的每一篇的整个内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，免疫荧光法或免疫组织化学法方案(直接和间接染色技术)可以作为本文呈现的示例性空间工作流程的部分或附加部分来执行。例如，根据本文所述的方法可以固定组织切片。可以将生物样品转移至阵列(例如，捕获探针阵列)，其中使用免疫荧光法方案探测分析物(例如，蛋白)。例如，可以将样品再水合、阻断和透化(3X SSC、2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNA酶抑制剂在4℃持续10分钟)，然后用荧光一级抗体染色(1：100在3XSSC、2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNA酶抑制剂中，在4℃持续30分钟)。可以对生物样品进行洗涤、加盖玻片(在甘油+1U/μl RNA酶抑制剂中)、成像(例如，使用共聚焦显微镜或其它能够进行荧光检测的装置)、洗涤和处理(根据本文所述的分析物捕获或空间工作流程)。
在某些情况下，可以将甘油溶液和盖玻片添加到样品中。在某些情况下，所述甘油溶液可以包括复染剂(例如，DAPI)。
本文中使用的抗原回收缓冲液可以改善IF/IHC方案中的抗体捕获。抗原回收的示例性方案可以是预热抗原回收缓冲液(例如，至95℃)，将生物样品浸入加热的抗原回收缓冲液中持续预定的时间，然后从抗原回收缓冲液中取出生物样品并洗涤生物样品。
在某些实施方案中，优化透化对于鉴定细胞内分析物可能是有用的。透化优化可以包括透化试剂的选择、透化试剂的浓度和透化持续时间。在本文别处讨论组织透化。
在某些实施方案中，在标记生物样品的准备过程中阻断阵列和/或生物样品会降低抗体与阵列和/或生物样品的非特异性结合(减低背景)。某些实施方案提供了可以在施用标记之前和/或期间施加的阻断缓冲液/阻断溶液，其中所述阻断缓冲液可以包括阻断剂和任选的表面活性剂和/或盐溶液。在某些实施方案中，阻断剂可以是牛血清白蛋白(BSA)、血清、明胶(例如，鱼明胶)、奶(例如，脱脂奶粉)、酪蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、生物素阻断剂、过氧化物酶阻断剂、左旋咪唑、Camoy氏溶液、甘氨酸、赖氨酸、硼氢化钠、滂胺天蓝、苏丹黑、锥虫蓝、FITC阻断剂和/或乙酸。阻断缓冲液/阻断溶液可以在对生物样品进行标记(例如，应用荧光团缀合的抗体)之前和/或期间应用至阵列和/或生物样品。
(ii)制备用于探针应用的样品
在某些情况下，将生物样品脱石蜡。可以使用本领域已知的任意方法实现脱石蜡。例如，在某些情况下，用包括二甲苯和各种浓度的乙醇的一系列洗涤液处理生物样品。在某些情况下，脱石蜡方法包括用二甲苯处理(例如，每次5分钟洗涤三次)。在某些情况下，所述方法还包括用乙醇处理(例如，100％乙醇，洗涤两次，每次10分钟；95％乙醇，洗涤两次，每次10分钟；70％乙醇，洗涤两次，每次10分钟；50％乙醇，洗涤两次，每次10分钟)。在某些情况下，在乙醇洗涤之后，可以用去离子水洗涤生物样品(例如，洗涤两次，每次5分钟)。可以理解，本领域技术人员可以调整这些方法以优化脱石蜡。
在某些情况下，生物样品是去交联的。在某些情况下，将生物样品在含有TE缓冲液(包含Tris和EDTA)的溶液中去交联。在某些情况下，TE缓冲液是碱性的(例如，在约9的pH)。在某些情况下，去交联发生在约50℃至约80℃。在某些情况下，去交联发生在约70℃。在某些情况下，去交联在70℃发生约1小时。在即将去交联之前，可以用酸(例如，0.1M HCl，约1分钟)处理生物样品。在去交联步骤之后，可以洗涤生物样品(例如，用1x PBST)。
在某些情况下，制备用于探针应用的生物样品的方法包括对样品进行透化。在某些情况下，使用磷酸盐缓冲液对生物样品进行透化。在某些情况下，所述磷酸盐缓冲液是PBS(例如，1x PBS)。在某些情况下，所述磷酸盐缓冲液是PBST(例如，1x PBST)。在某些情况下，将透化步骤进行多次(例如，3次，每次5分钟)。
在某些情况下，制备用于探针应用的生物样品的方法包括平衡和阻断生物样品的步骤。在某些情况下，使用杂交前(pre-Hyb)缓冲液进行平衡。在某些情况下，所述杂交前缓冲液不含RNA酶。在某些情况下，所述杂交前缓冲液不含牛血清白蛋白(BSA)、溶液如Denhardt氏溶液或其它可能被核酸酶污染的生物材料。
在某些情况下，将平衡步骤进行多次(例如，2次，每次5分钟；3次，每次5分钟)。在某些情况下，将生物样品用阻断缓冲液阻断。在某些情况下，所述阻断缓冲液包括载体诸如tRNA，例如酵母tRNA诸如来自酿酒酵母(例如，终浓度为10-20μg/mL)。在某些情况下，阻断可以执行5、10、15、20、25或30分钟。
任何前述步骤都可以针对性能进行优化。例如，可以改变温度。在某些情况下，在室温进行预杂交方法。在某些情况下，4℃进行预杂交方法(在某些情况下，改变本文提供的时间范围)。
(i)使探针杂交
在某些实施方案中，本文描述的方法包括在靶向RNA捕获之前或同时使不希望的RNA耗竭探针杂交，其包括使第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸(例如，探针对)杂交。在某些情况下，用于靶向RNA捕获的第一和第二探针寡核苷酸各自包括与感兴趣的分析物的一个或多个序列(例如，一个或多个靶序列)基本上互补的序列。在某些实施方案中，所述第一探针和所述第二探针结合彼此完全相邻(即，没有核苷酸间隙)或在同一转录物上的互补序列。
在某些情况下，所述方法包括探针组的杂交，其中探针对在介质中的浓度为约1至约100nM。在某些情况下，探针对的浓度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500nM。在某些情况下，探针对的浓度为5nM。在某些情况下，在杂交(Hyb)缓冲液中稀释探针组。在某些情况下，探针组在Hyb缓冲液中的浓度为5nM。
在某些情况下，探针杂交(例如，使不希望的RNA耗竭探针和/或第一和第二探针寡核苷酸杂交)发生在约50℃。在某些情况下，探针杂交的温度范围为从约30℃至约75℃、从约35℃至约70℃或从约40℃至约65℃。在某些实施方案中，所述温度是约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃。在某些情况下，探针杂交发生约30分钟、约1小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或更长时间。在某些情况下，探针杂交在50℃发生约2.5小时。
在某些情况下，所述杂交缓冲液包括SSC(例如，1x SSC)或SSPE。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括甲酰胺或碳酸亚乙酯。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括一种或多种盐，如Mg盐例如MgCl2，Na盐例如NaCl，Mn盐例如MnCl2。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括Denhardt氏溶液、硫酸葡聚糖、聚蔗糖、PEG或其它杂交速率促进剂。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括载体诸如酵母tRNA、鲑鱼精DNA和/或λ噬菌体DNA。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括一种或多种阻断剂。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括RNA酶抑制剂。在某些情况下，所述杂交缓冲液可以包括BSA、序列特异性的阻断剂、非特异性的阻断剂、EDTA、RNA酶抑制剂、甜菜碱、TMAC或DMSO。在某些情况下，杂交缓冲液可以进一步包括去污剂诸如吐温、Triton-X 100、肌氨酰和SDS。在某些情况下，所述杂交缓冲液包括无核酸酶的水、DEPC水。
在某些实施方案中，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸所结合的互补序列彼此相距1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。探针寡核苷酸之间的间隙可以在连接之前先进行填充，使用例如Mu聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶和/或其任何组合、衍生物和变体(例如，经工程改造的突变体)。在某些实施方案中，当第一和第二探针寡核苷酸被一个或多个核苷酸彼此隔开时，核苷酸连接在第一和第二探针寡核苷酸之间。在某些实施方案中，当第一和第二探针寡核苷酸被一个或多个核苷酸彼此隔开时，脱氧核糖核苷酸连接在第一和第二探针寡核苷酸之间。
在某些情况下，杂交之后，用杂交后洗涤缓冲液洗涤生物样品。在某些情况下，所述杂交后洗涤缓冲液包括SSC、酵母tRNA、甲酰胺、碳酸亚乙酯和无核酸酶的水中的一种或多种。
进一步提供了关于探针杂交的其它实施方案。
(i)杂交温度
在某些实施方案中，描述的方法利用在连接位点处包括脱氧核糖核酸(而不是严格利用核糖核苷酸)的寡核苷酸。在本文描述的方法中利用脱氧核糖核酸会产生更均匀的效率，其对于各种应用而言可以容易地控制且是灵活的。在某些实施方案中，不希望的RNA耗竭探针在连接位点处包括脱氧核糖核酸(而不是严格利用核糖核苷酸)。在某些实施方案中，第一探针寡核苷酸和/或第二探针寡核苷酸在连接位点处包括脱氧核糖核酸(而不是严格利用核糖核苷酸)。
在一个非限制性实施例中，本文中公开的方法包括使所述生物样品与多个寡核苷酸(例如，不希望的RNA耗竭探针和/或RTL探针)接触，包括不希望的RNA耗竭探针、第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)，其中所述不希望的RNA耗竭探针包括与不希望的RNA的至少一部分基本上互补的序列，其中第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)分别与分析物中存在的第一序列和分析物中存在的第二序列互补；在第一温度使不希望的RNA耗竭探针、第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与分析物杂交；在第二温度使不希望的RNA耗竭探针和第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与第三寡核苷酸(例如，夹板寡核苷酸)杂交，使得第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)彼此邻接；将第一寡核苷酸(例如，第一探针)连接到第二寡核苷酸(例如，第二探针)以产生连接产物；使所述生物样品与基质接触，其中捕获探针固定化在基质上，其中所述捕获探针包括空间条形码和捕获结构域；允许所述连接产物特异性地结合所述捕获结构域；和确定(i)特异性地结合所述捕获结构域的连接产物的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置；其中所述第一寡核苷酸(例如，所述第一探针)、所述第二寡核苷酸(例如，所述第二探针)和所述第三寡核苷酸是DNA寡核苷酸，且其中所述第一温度是比所述第二温度更高的温度。
在某些实施方案中，所述不希望的RNA耗竭探针、第一寡核苷酸(例如，所述第一探针)和/或所述第二寡核苷酸(例如，所述第二探针)在第一温度与分析物杂交。在某些实施方案中，所述第一温度范围为从约50℃至约75℃、从约55℃至约70℃或从约60℃至约65℃。在某些实施方案中，所述第一温度是约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃。
在某些实施方案中，在使不希望的RNA耗竭探针、第一寡核苷酸(例如，第一探针)和/或第二寡核苷酸(例如，第二探针)与分析物杂交的步骤之后，进行洗涤步骤以除去未结合的寡核苷酸(例如，探针)。可以使用本文所述的任何洗涤方法和溶液进行洗涤步骤。
在某些实施方案中，在使第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与分析物杂交的步骤之后，将第三寡核苷酸(例如，夹板寡核苷酸)添加到分析物。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸是寡核苷酸。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸包括与第一探针寡核苷酸的部分(例如，未与分析物杂交的第一探针的部分(例如，辅助序列))至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的序列。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸包括与第一寡核苷酸的部分(例如，第一探针)100％互补的序列。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸包括与第二探针寡核苷酸的部分(例如，未与分析物杂交的第二探针的部分(例如，辅助序列))至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的序列。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸包括与第二寡核苷酸(例如，第二探针)的部分100％互补的序列。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸在互补部分与第一寡核苷酸(例如，第一探针)杂交。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸在互补部分与第二寡核苷酸(例如，第二探针)杂交。
在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸在第二温度与第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)杂交。在某些实施方案中，所述第二温度低于第一和第二寡核苷酸(例如，第一和第二探针)结合分析物的第一温度。在某些实施方案中，所述第二温度范围为从约15℃至约35℃、从约20℃至约30℃或从约25℃至约30℃。在某些实施方案中，所述第一温度是约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃或约35℃。包括第三或夹板寡核苷酸的方法已经描述于美国专利公开号2019/0055594A1中，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，在使第三寡核苷酸与分析物杂交的步骤之后，进行洗涤步骤以除去未结合的第三寡核苷酸。可以使用本文所述的任何洗涤方法和溶液进行洗涤步骤。在某些实施方案中，在洗涤步骤之后，第一和第二寡核苷酸(例如，第一和第二探针)与分析物结合(例如，杂交)，并且第三寡核苷酸与第一和第二寡核苷酸结合(例如，杂交)(例如，在第一和第二探针的未与分析物结合的部分处)。
在某些实施方案中，将所述第一寡核苷酸(例如，第一探针)、所述第二寡核苷酸(例如，所述第二探针)和所述第三寡核苷酸同时加入所述生物样品中。然后，在某些实施方案中，将温度调节至第一温度以允许所述第一寡核苷酸(例如，所述第一探针)和所述第二寡核苷酸(例如，所述第二探针)与生物样品中的分析物杂交。接着，将温度调节至第二温度以允许所述第三寡核苷酸与所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸杂交。
在第三寡核苷酸与第一探针和第二探针杂交的某些实施方案中，所述第一探针和第二探针与分析物中不直接相邻的靶序列杂交，所述第三寡核苷酸被延伸以填充第一探针和第二探针之间的间隙。在某些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸探针之一(例如，第一探针)。
在某些实施方案中，进行连接步骤。可以使用本文所述的任何方法进行连接。在某些实施方案中，所述步骤包括连接第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)，从而形成连接产物。在某些实施方案中，所述第三寡核苷酸充当寡核苷酸夹板以促进第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)的连接。在某些实施方案中，连接是化学连接。在某些实施方案中，连接是酶促连接。在某些实施方案中，所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
(ii)杂交缓冲液
在某些实施方案中，在杂交缓冲液中使不希望的RNA耗竭探针、第一探针和/或第二探针与分析物杂交。在某些情况下，所述杂交缓冲液含有甲酰胺。在其它情况下，所述杂交缓冲液不含甲酰胺。甲酰胺对人不友好，并且已知它具有健康危害性。在化学上，它会随着时间的推移而氧化，从而影响试剂储存期限，并且最重要的是影响试剂的功效。因此，本文所述的方法可以包括不含甲酰胺的缓冲液，包括不含甲酰胺的杂交缓冲液。
在某些实施方案中，所述不含甲酰胺的杂交缓冲液是盐水-柠檬酸钠(SSC)杂交缓冲液。在某些实施方案中，所述SSC以从约1x SSC至约6x SSC(例如，约1x SSC至约5x SSC、约1x SSC至约4x SSC、约1x SSC至约3x SSC、约1x SSC至约2x SSC、约2x SSC至约6x SSC、约2x SSC至约5x SSC、约2x SSC至约4x SSC、约2x SSC至约3x SSC、约3x SSC至约5x SSC、约3x SSC至约4x SSC、约4x SSC至约6x SSC、约4x SSC至约6x SSC、约4x SSC至约5x SSC或约5x SSC至约6x SSC)存在于SSC杂交缓冲液中。在某些实施方案中，所述SSC以从约2x SSC至约4x SSC存在于SSC杂交缓冲液中。在某些实施方案中，可以使用SSPE杂交缓冲液。
在某些实施方案中，所述SSC杂交缓冲液包含溶剂。在某些实施方案中，所述溶剂包含碳酸亚乙酯而不是甲酰胺(2020，Kalinka等人，Scientia Agricola 78(4)：e20190315)。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以从约10％(w/v)至约25％(w/v)(例如，约10％(w/v)至约20％(w/v)、约10％(w/v)至约15％(w/v)、约15％(w/v)至约25％(w/v)、约15％(w/v)至约20％(w/v)或约20％(w/v)至约25％(w/v))存在于SSC杂交缓冲液中。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以从约15％(w/v)至约20％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以约10％(w/v)、约11％(w/v)、约12％(w/v)、约13％(w/v)、约14％(w/v)、约15％(w/v)、约16％(w/v)、约17％(w/v)、约18％(w/v)、约19％(w/v)、约20％(w/v)、约21％(w/v)、约22％(w/v)、约23％(w/v)、约24％(w/v)或约25％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以约13％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。
在某些实施方案中，所述SSC杂交缓冲液是在从约40℃至约60℃(例如，约40℃至约55℃、约40℃至约50℃、约40℃至约45℃、约45℃至约60℃、约45℃至约55℃、约45℃至约50℃、约50℃至约60℃、约50℃至约55℃或约55℃至约60℃)的温度。在某些实施方案中，所述SSC杂交缓冲液是在从约45℃至约55℃或本文描述的任何子范围的温度。在某些实施方案中，所述SSC杂交缓冲液是在约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃或约60℃的温度。在某些实施方案中，所述SSC杂交缓冲液是在约50℃的温度。
在某些实施方案中，所述SSC杂交缓冲液进一步包含载体、促聚物(crowder)或添加剂中的一种或多种。可以被包含在杂交缓冲液中的载体的非限制性例子包括：酵母tRNA、鲑鱼精DNA、λ噬菌体DNA、糖原和胆固醇。可以被包含在杂交缓冲液中的分子促聚物的非限制性例子包括：聚蔗糖、葡聚糖、Denhardt氏溶液和PEG。可以被包含在杂交缓冲液中的添加剂的非限制性例子包括：结合阻断剂、RNA酶抑制剂、Tm调节剂和用于松弛二级核酸结构的佐剂(例如，甜菜碱、TMAC和DMSO)。此外，杂交缓冲液可以包括去污剂诸如SDS、吐温、Triton-X 100和肌氨酰(例如，N-月桂酰基肌氨酸钠盐)。熟练的技术人员会理解，用于核酸杂交的缓冲液可以包括许多能够增强杂交反应的不同化合物。
(j)洗涤
在某些实施方案中，本文中公开的方法也包括洗涤步骤。洗涤步骤除去任何未结合的探针。可以在本文公开的方法中的任何步骤之间进行洗涤步骤。例如，可以在向生物样品添加探针(例如，本文描述的不希望的RNA探针和/或RTL探针对中的任一种)之后进行洗涤步骤。由此，游离的/未结合的探针被洗掉，只留下与分析物和/或不希望的RNA(例如，rRNA)杂交的探针。在某些情况下，在本文公开的方法之间发生多个(即，至少2、3、4、5或更多个)洗涤步骤。可以以本领域已知的和由本领域技术人员确定的时间(例如，1、2、3、4或5分钟)和温度(例如，室温；4℃)进行洗涤步骤。
在某些情况下，使用洗涤缓冲液进行洗涤步骤。在某些情况下，所述洗涤缓冲液包括SSC(例如，1x SSC)。在某些情况下，所述洗涤缓冲液包括PBS(例如，1x PBS)。在某些情况下，所述洗涤缓冲液包括PBST(例如，1x PBST)。在某些情况下，所述洗涤缓冲液还可以包括甲酰胺或是不含甲酰胺的。
本文提供了关于洗涤步骤的其它实施方案。
(i)不含甲酰胺的洗涤缓冲液
在某些实施方案中，在杂交和/或连接不希望的RNA耗竭探针之后，从阵列除去一种或多种未杂交的不希望的RNA耗竭探针。在某些实施方案中，在连接第一探针和第二探针之后，从阵列除去一种或多种未杂交的第一探针、一种或多种未杂交的第二探针、或二者。在某些实施方案中，在连接第一探针、第二探针和第三寡核苷酸之后，从阵列除去一种或多种未杂交的第一探针、一种或多种未杂交的第二探针、或一种或多种第三寡核苷酸或所有以上。
在某些实施方案中，将预杂交缓冲液用于洗涤样品。在某些实施方案中，使用磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，执行多个洗涤步骤以除去未结合的寡核苷酸。
在某些实施方案中，除去包括在不含甲酰胺的洗涤缓冲液中从阵列洗涤一种或多种未杂交的探针(例如，不希望的RNA耗竭探针、第一探针、第二探针和第三寡核苷酸)。
在某些实施方案中，所述不含甲酰胺的洗涤缓冲液是SSC洗涤缓冲液。在某些实施方案中，SSC以从约0.01x SSC至约1x SSC(例如，约0.01x SSC至约0.5x SSC、0.01x SSC至约0.1x SSC、约0.01x SSC至约0.05x SSC、约0.05x SSC至约1x SSC、约0.05x SSC至约0.5xSSC、约0.05x SSC至约0.1x SSC、约0.1x SSC至约1x SSC、约0.1x SSC至约0.5x SSC或约0.5x SSC至约1x SSC)存在于SSC洗涤缓冲液中。在某些实施方案中，SSC以约0.01x SSC、约0.02x SSC、约0.03x SSC、约0.04x SSC、约0.05x SSC、约0.06x SSC、约0.07x SSC、约0.08xSSC、约0.09x SSC、约0.1x SSC、约0.2x SSC、约0.3x SSC、约0.4x SSC、约0.5x SSC、约0.6xSSC、约0.7x SSC、约0.8x SSC、约0.9x SSC或约0.1x SSC存在于SSC洗涤缓冲液中。在某些实施方案中，SSC以约0.1x SSC存在于SSC洗涤缓冲液中。
在某些实施方案中，所述SSC洗涤缓冲液包含去污剂。在某些实施方案中，所述去污剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些实施方案中，SDS以从约0.01％(v/v)至约0.5％(v/v)(例如，约0.01％(v/v)至约0.4％(v/v)、约0.01％(v/v)至约0.3％(v/v)、约0.01％(v/v)至约0.2％(v/v)、约0.01％(v/v)至约0.1％(v/v)、约0.05％(v/v)至约0.5％(v/v)、约0.05％(v/v)至约0.4％(v/v)、约0.05％(v/v)至约0.3％(v/v)、约0.05％(v/v)至约0.2％(v/v)、约0.05％(v/v)至约0.1％(v/v)、约0.1％(v/v)至约0.5％(v/v)、约0.1％(v/v)至约0.4％(v/v)、约0.1％(v/v)至约0.3％(v/v)、约0.1％(v/v)至约0.2％(v/v)、约0.2％(v/v)至约0.5％(v/v)、约0.2％(v/v)至约0.4％(v/v)、约0.2％(v/v)至约0.3％(v/v)、约0.3％(v/v)至约0.5％(v/v)、约0.3％(v/v)至约0.4％(v/v)或约0.4％(v/v)至约0.5％(v/v))存在于SSC洗涤缓冲液中。在某些实施方案中，所述SDS以约0.01％(v/v)、约0.02％(v/v)、约0.03％(v/v)、约0.04％(v/v)、约0.05％(v/v)、约0.06％(v/v)、约0.07％(v/v)、约0.08％(v/v)、约0.09％(v/v)、约0.10％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)或约0.5％(v/v)存在于SSC洗涤缓冲液中，在某些实施方案中，所述SDS以约0.1％(v/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。在某些实施方案中，肌氨酰可以存在于SSC洗涤缓冲液中。
在某些实施方案中，所述SSC洗涤缓冲液包含溶剂。在某些实施方案中，所述溶剂包含甲酰胺或碳酸亚乙酯。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以从约10％(w/v)至约25％(w/v)或本文描述的任何子范围存在于SSC洗涤缓冲液中。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以从约15％(w/v)至约20％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。在某些实施方案中，碳酸亚乙酯以约16％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
在某些实施方案中，所述SSC洗涤缓冲液是在从约50℃至约70℃(例如，约50℃至约65℃、约50℃至约60℃、约50℃至约55℃、约55℃至约70℃、约55℃至约65℃、约55℃至约60℃、约60℃至约70℃、约60℃至约65℃或约65℃至约70℃)的温度。在某些实施方案中，所述SSC洗涤缓冲液是在从约55℃至约65℃的温度。在某些实施方案中，所述SSC洗涤缓冲液是在约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃的温度。在某些实施方案中，所述SSC洗涤缓冲液是在约60℃的温度。
在某些实施方案中，所述方法包括释放连接产物，其中在洗涤阵列以除去一种或多种未杂交的第一和第二探针之后进行释放。
(k)连接
在某些实施方案中，在探针寡核苷酸(例如，第一探针、第二探针和/或第三寡核苷酸)与分析物杂交之后，可以将探针(例如，第一探针、第二探针和/或第三寡核苷酸)连接在一起，从而产生包括与分析物互补的一种或多种序列的单个连接产物。在某些实施方案中，在不希望的RNA耗竭探针的杂交之后，可以将不希望的RNA耗竭探针连接在一起。如本文所述，可以酶促地或化学地进行连接。
在某些情况下，所述连接是使用连接酶(例如，T4 RNA连接酶(Rnl2)、SplintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶)的酶促连接反应。关于KOD连接酶的描述，参见，例如，Zhang等人；RNA Biol.2017；14(1)：36-44，其通过引用整体并入。在酶促连接反应之后，可以认为探针(例如，第一探针、第二探针和/或第三寡核苷酸)被连接。
在某些实施方案中，聚合酶催化连接产物的互补链的合成，从而产生双链连接产物。在某些情况下，所述聚合酶是DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述聚合酶具有5’至3’聚合酶活性。在某些实施方案中，所述聚合酶具有用于校对的3’至5’核酸外切酶活性。在某些实施方案中，所述聚合酶具有用于校对的5’至3’聚合酶活性和3’至5’核酸外切酶活性。
在某些实施方案中，所述探针(例如，第一探针、第二探针和/或第三寡核苷酸)可以各自包含反应性部分，使得在与靶标杂交并暴露于适当连接条件后，探针寡核苷酸可以彼此连接。在某些实施方案中，包括反应性部分的探针寡核苷酸被化学连接。例如，能够与核酸分子的第一靶区域(例如，第一靶序列或第一部分)杂交的第一探针可以包含第一反应性部分，并且能够与核酸分子的第二靶区域(例如，第二靶序列或第二部分)杂交的第二探针寡核苷酸可以包含第二反应性部分。当第一和第二探针与核酸分子的第一和第二靶区域(例如，第一和第二靶序列)杂交时，第一和第二反应性部分可以彼此邻近。探针的反应性部分可以选自由叠氮化物、炔烃、硝酮(例如，1，3-硝酮)、应变烯烃(例如，反式-环烯烃诸如环辛烯或氧杂降冰片二烯)、四嗪、四唑、碘化物、硫代酸酯(例如，硫代磷酸酯)、酸、胺和磷酸酯组成的非限制性集合。例如，第一探针的第一反应性部分可以包含叠氮化物部分，且第二探针的第二反应性部分可以包含炔烃部分。第一和第二反应性部分可以反应以形成连接部分。第一和第二反应性部分之间的反应可以是例如环加成反应诸如应变促进的叠氮化物-炔烃环加成、铜催化的叠氮化物-炔烃环加成、应变促进的炔烃-硝酮环加成、第尔斯-阿尔德反应、[3+2]环加成、[4+2]环加成或[4+1]环加成；硫醇-烯反应；亲核置换反应；或其它反应。在某些情况下，第一和第二反应性部分之间的反应可以产生三唑部分或异噁唑啉部分。第一和第二反应性部分之间的反应可以包括使反应性部分经受合适的条件诸如合适的温度、pH或压力，并为反应提供一种或多种试剂或催化剂。例如，第一和第二反应性部分之间的反应可以由铜催化剂、钌催化剂或应变物种(诸如二氟辛炔、二苄基环辛炔或联芳基氮杂环辛炔酮)催化。与核酸分子的第一靶区域(例如，第一靶序列或第一部分)杂交的第一探针的第一反应性部分和与核酸分子的第二靶区域(例如，第一靶序列或第一部分)杂交的第三探针寡核苷酸的第二反应性部分之间的反应可以连接第一探针和第二探针以提供连接的探针。连接后，第一和第二探针可以被认为是连接的。因此，第一和第二反应性部分的反应可以包含化学连接反应诸如铜催化的5’叠氮化物到3’炔烃的“点击”化学反应以在两个探针寡核苷酸之间形成三唑键。在其它非限制性实施例中，碘化物部分可以与硫代磷酸酯部分化学连接以形成硫代磷酸酯键，酸可以与胺连接以形成酰胺键，和/或磷酸酯和胺可以连接以形成氨基磷酸酯键。
在某些情况下，在连接缓冲液中进行连接。在对含有二核糖的探针上进行探针连接的情况下，所述连接缓冲液可以包括T4 RNA连接酶缓冲液2、酶(例如，RNL2连接酶)和不含核酸酶的水。在DNA探针上进行探针连接的情况下，所述连接缓冲液可以包括Tris-HClpH7.5、MnCl2、ATP、DTT、替代流体(例如，甘油)、酶(例如，SplintR连接酶)和无核酸酶的水。
在某些实施方案中，所述连接缓冲液包括另外的试剂。在某些情况下，所述连接缓冲液包括在连接反应期间添加的腺苷三磷酸(ATP)。DNA连接酶催化的带切口DNA底物的密封首先通过ATP水解被活化，导致AMP基团向酶的共价添加。在与DNA双链体中的切口位点结合后，连接酶将该AMP转移到在切口处的磷酸化的5’末端，从而形成5′-5v焦磷酸酯键。最后，连接酶催化在切口的3′-末端处的OH基团对该焦磷酸酯键的攻击，从而将其密封，然后释放连接酶和AMP。如果连接酶在3′攻击之前从底物脱离，例如，由于酶的过早AMP重新加载，则5′AMP留在5′-末端处，从而阻断进一步的连接尝试。在某些情况下，在连接反应期间以约1μM、约10μM、约100μM、约1000μM或约10000μM的浓度添加ATP。
在某些实施方案中，在连接过程中添加有助于探针寡核苷酸的连接的辅因子。在某些情况下，所述辅因子包括镁离子(Mg2+)。在某些情况下，所述辅因子包括锰离子(Mn2+)。在某些情况下，以MgCl2的形式加入Mg2+。在某些情况下，以MnCl2的形式加入Mn2+。在某些情况下，MgCl2的浓度是约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。在某些情况下，MnCl2的浓度是约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。
在某些实施方案中，所述连接产物包括捕获探针捕获结构域，其可以结合捕获探针(例如，直接或间接固定化在基质上的捕获探针)。在某些实施方案中，本文提供的方法包括使所述生物样品与基质接触，其中所述捕获探针附着至所述基质(例如，直接地或间接地固定化至基质)。在某些实施方案中，所述连接的探针的捕获探针捕获结构域特异性地结合捕获结构域。
在连接后，在某些情况下，用连接后洗涤缓冲液洗涤生物样品。在某些情况下，所述连接后洗涤缓冲液包括SSC(例如，1x SSC)、碳酸亚乙酯或甲酰胺和不含核酸酶的水中的一种或多种。在某些情况下，在该阶段在约50℃至约70℃洗涤生物样品。在某些情况下，在约60℃洗涤生物样品。
(i)在第二探针上的包括预腺苷酸化的5’磷酸酯的连接
本文提供了用于确定靶核酸在生物样品中的位置的方法，其包括：(a)使所述生物样品与包含多个捕获探针的基质接触，其中所述多个捕获探针中的一个捕获探针包含捕获结构域和空间条形码；(b)使所述生物样品中的靶核酸与第一探针和第二探针杂交，其中所述第一探针从3’至5’包含：与捕获结构域基本上互补的序列，和与靶核酸中的第一序列基本上互补的序列，并且在其5’末端具有预腺苷酸化的磷酸酯基团；第二探针包含与靶核酸中的第二序列基本上互补的序列；(c)通过使用不需要腺苷三磷酸即具有连接酶活性的连接酶，将第二探针的3’末端连接到第一探针的5’末端以产生连接产物；(d)从靶核酸释放连接产物，并使连接产物的捕获结构域特异性地结合至捕获探针的捕获结构域；和(e)确定(i)对应于连接产物的序列全部或部分或其互补序列，和(ii)对应于空间条形码的序列的全部或部分或其互补序列，和使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定靶核酸在生物样品中的位置。
在某些情况下，不需要腺苷三磷酸即具有连接酶活性的连接酶(例如，热稳定的5’AppDNA/RNA连接酶、截短的T4 RNA连接酶2(trRnl2)、截短的T4 RNA连接酶2K227Q、截短的T4 RNA连接酶2KQ、小球藻病毒PBCV-1 DNA连接酶和它们的组合)。关于T4 RNA连接酶和截短的T4 RNA连接酶的描述，参见，例如，Nichols等人，“RNA Ligases,”Curr.Protocol.Molec.Biol.84(1)：3.15.1-.4(2008)；Viollet等人，“T4 RNA Ligase2Truncated Active Site Mutants：Improved Tools for RNA Analysis,”BMCBiotechnol.11：72(2011)；和Ho等人，“Bacteriophage T4 RNA Ligase 2(gp24.1)Exemplifies a Family of RNA Ligases Found in All Phylogenetic Domains，”PNAS99(20)：12709-14(2002)，其特此通过引用整体并入。热稳定的5’AppDNA/RNA连接酶是一种属于连接酶家族的酶，其催化ssRNA或ssDNA的3’末端与5’-腺苷酸化的ssDNA或5’-腺苷酸化的ssRNA的连接。截短的T4 RNA连接酶2是一种属于连接酶家族的酶，其催化dsRNA切口和ssRNA与ssRNA的连接。当与RNA互补序列退火时，它还可以将RNA或DNA的3’末端连接到5’-pDNA，当与DNA互补序列退火时，它可以以降低的效率将RNA的3’末端连接到5’-pRNA。截短的T4 RNA连接酶2K227Q是一种属于连接酶家族的酶，其催化ssRNA的3’末端与5’腺苷酸化的ssDNA和5’腺苷酸化的ssRNA的连接。与截短的T4 RNA连接酶2相比，它具有副产物的减少。截短的T4 RNA连接酶2KQ是一种属于连接酶家族的酶，其催化ssRNA的3’末端与5’腺苷酸化的ssDNA和5’腺苷酸化的ssRNA的连接。它是ssRNA与预腺苷酸化的衔接子的连接的优选选项，并且与截短的T4 RNA连接酶2相比具有副产物的减少。
在某些实施方案中，所述T4 RNA连接酶包含K227Q突变。参见Viollet等人，“T4RNA Ligase 2Truncated Active Site Mutants：Improved Tools for RNA Analysis，”BMC Biotechnol.11，其特此通过引用整体并入。
在某些情况下，在连接过程中添加有助于第一和第二探针的连接的辅因子。在某些情况下，所述辅因子包括镁离子(Mg2+)。在某些情况下，所述辅因子包括锰离子(Mn2+)。在某些情况下，以MgCl2的形式加入Mg2+。在某些情况下，以MnCl2的形式加入Mn2+。在某些情况下，MgCl2的浓度是约1mM至约10mM。在某些情况下，MnCl2的浓度是约1mM至约10mM。
在某些情况下，在约6.5至约9.0、约6.5至约8.0、或约7.5至约8.0范围内的pH发生连接。
在某些实施方案中，所述连接缓冲液包括酶储存缓冲液。在某些实施方案中，所述酶储存缓冲液包括甘油。在某些实施方案中，所述连接缓冲液补充有甘油。在某些实施方案中，所述甘油以15％v/v的总体积存在于连接缓冲液中。
(1)透化和释放连接产物
在某些实施方案中，本文提供的方法包括透化步骤。在某些实施方案中，使用蛋白酶发生透化。在某些实施方案中，所述蛋白酶是肽链内切酶。可以使用的肽链内切酶包括、但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰基肽链内切酶(GluC)、ArgC、肽基-asp肽链内切酶(ApsN)、肽链内切酶LysC和肽链内切酶LysN。在某些实施方案中，所述肽链内切酶是胃蛋白酶。在某些实施方案中，在使所述生物样品与不希望的RNA耗竭探针接触的同时或之前，将生物样品透化。在某些实施方案中，在使所述生物样品与不希望的RNA耗竭探针接触之后，将生物样品透化。在某些实施方案中，在使所述生物样品与不希望的RNA耗竭探针接触之后，但是在接触阵列之前，将生物样品透化。在某些实施方案中，在使所述生物样品与不希望的RNA耗竭探针接触之后，但是在接触第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸之前，将生物样品透化。在某些实施方案中，在产生连接产物(例如，通过连接与分析物中的相邻序列杂交的第一探针和第二探针)之后，将生物样品透化。在某些实施方案中，在以下步骤同时或之前将生物样品透化：使生物样品与第一探针和第二探针接触，使第一探针和第二探针与分析物杂交，通过连接第一探针和第二探针产生连接产物，和从分析物释放连接的产物。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括生物样品的透化，使得捕获探针可以更容易地结合捕获的连接的探针(即，与无透化相比)。在某些实施方案中，可以将逆转录(RT)试剂添加到透化过的生物样品中。与RT试剂一起的温育可以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化的mRNA)产生带空间条形码的全长cDNA。可以将第二链试剂(例如，第二链引物、酶)添加到载玻片上的生物样品中以启动第二链合成。
在某些情况下，所述透化步骤包括将透化缓冲液应用于生物样品。在某些情况下，所述透化缓冲液包括缓冲液(例如，Tris pH 7.5)、MgCl2、肌氨酰去污剂(例如，月桂酰肌氨酸钠)、酶(例如，蛋白水解酶K)和不含核酸酶的水。在某些情况下，在37℃执行透化步骤。在某些情况下，执行透化步骤约20分钟至2小时(例如，约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时或约2小时)。在某些情况下，执行释放步骤约40分钟。
在某些实施方案中，在产生连接产物之后，连接产物从分析物释放。在某些实施方案中，使用核糖核酸内切酶从分析物释放连接产物。在某些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I。在某些实施方案中，所述核糖核酸内切酶是RNA酶H。RNA酶H是当与DNA杂交时特异性地水解RNA的磷酸二酯键的核糖核酸内切酶。RNA酶H是存在于许多不同生物体中的保守核糖核酸酶家族的组成部分。RNA酶H有两个主要类别：RNA酶H1和RNA酶H2。逆转录病毒RNA酶H酶类似于原核RNA酶H1。所有这些酶都有一个共同特征，即它们能够切割RNA：DNA异源双链体的RNA组分。在某些实施方案中，所述RNA酶H是RNA酶H1、RNA酶H2、或RNA酶H1或RNA酶H2。在某些实施方案中，所述RNA酶H包括但不限于来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的RNA酶HII、来自掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshi)的RNA酶HII、来自Thermococcus litoralis的RNA酶HT、来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的RNA酶HT、来自大肠杆菌的RNA酶HT或来自大肠杆菌的RNA酶HII。
在某些情况下，使用释放缓冲液执行释放步骤。在某些情况下，所述释放缓冲液包括缓冲液(例如，Tris pH 7.5)、酶(例如，RNA酶H)和无核酸酶的水中的一种或多种。在某些情况下，在37℃执行释放步骤。在某些情况下，执行释放步骤约20分钟至2小时(例如，约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时或约2小时)。在某些情况下，执行释放步骤约30分钟。
在某些情况下，所述释放步骤发生在所述透化步骤之前。在某些情况下，所述释放步骤发生在所述透化步骤之后。在某些情况下，所述释放步骤与所述透化步骤同时发生(例如，在同一缓冲液中)。
(m)生物样品
本文公开的方法可以对任何类型的样品进行。在某些实施方案中，所述样品是新鲜组织。在某些实施方案中，所述样品是冷冻样品。在某些实施方案中，将所述样品预先冷冻。在某些实施方案中，所述样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品。
可以从其获得生物样品的受试者可以是健康的或无症状的个体、具有或疑似具有疾病(例如，癌症)的个体或对疾病有易感性的个体，和/或需要治疗或疑似需要治疗的个体。在某些情况下，所述生物样品可以包括一个或多个患病的细胞。患病的细胞可以具有改变的代谢性能、基因表达、蛋白表达和/或形态特征。疾病的例子包括炎症性障碍、代谢障碍、神经系统障碍和癌症。在某些情况下，所述生物样品包括癌症或肿瘤细胞。癌细胞可以来源于实体瘤、血液系统恶性肿瘤、细胞系，或作为循环肿瘤细胞获得。在某些情况下，所述生物样品是异质样品。在某些情况下，所述生物样品是包括肿瘤或癌细胞和/或间质细胞的异质样品。
在某些情况下，所述癌症是乳腺癌。在某些情况下，所述乳腺癌是三重阳性的乳腺癌(TPBC)。在某些情况下，所述乳腺癌是三重阴性的乳腺癌(TNBC)。
在某些情况下，所述癌症是结肠直肠癌。在某些情况下，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤、唾液腺癌、肾癌、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌或头或颈癌的一种类型。在某些实施方案中，所治疗的癌症是结缔组织增生性黑素瘤、炎症性乳腺癌、胸腺瘤、直肠癌、肛门癌或外科手术可治疗的或非外科手术可治疗的脑干神经胶质瘤。在某些实施方案中，所述受试者是人。
FFPE样品通常是高度交联和碎片化的，且因此这种类型的样品允许使用常规检测技术进行有限的RNA回收。在某些实施方案中，本文提供的靶向RNA捕获方法比其它方法(例如，利用寡-dT捕获和mRNA的逆转录的方法)更少地受与FFPE固定相关的RNA降解的影响。在某些实施方案中，本文提供的方法能够灵敏地测量感兴趣的特定基因，所述基因否则可能会被全转录组方案遗漏。
在某些情况下，FFPE样品被染色(例如，使用H&E)。本文公开的方法与H&E兼容，将允许覆盖转录组分析的形态学背景。但是，根据需要，当需要细胞核的位置时，一些样品可能仅用核染色剂染色，诸如仅用苏木精而不用曙红染色样品。
在某些实施方案中，可以将生物样品(例如，组织切片)用甲醇固定，用苏木精和曙红染色，并成像。在某些实施方案中，固定、染色和成像在一种或多种探针与样品杂交之前发生。在样品成像之后和在对样品进行透化之前，本文描述的任何工作流程的某些实施方案可以进一步包括脱色步骤(例如，苏木精和曙红脱色步骤)。例如，可以通过进行一个或多个(例如，一、二、三、四或五个)洗涤步骤(例如，使用包括HCl的缓冲液进行的一个或多个(例如，一、二、三、四或五个)洗涤步骤)来进行脱色。所述图像可以用于将空间基因表达图样映射回生物样品。透化酶可以用于直接在载玻片上透化生物样品。
在某些实施方案中，在添加靶探针寡核苷酸之前，将FFPE样品脱石蜡、透化、平衡和阻断。在某些实施方案中，使用二甲苯脱石蜡。在某些实施方案中，脱石蜡包括用二甲苯多次洗涤。在某些实施方案中，脱石蜡包括用二甲苯多次洗涤，然后用多轮分级酒精除去二甲苯，然后用水洗涤样品。在某些方面，所述水是去离子水。在某些实施方案中，平衡和阻断包括在杂交前缓冲液中温育样品。在某些实施方案中，所述杂交前缓冲液包括酵母tRNA。在某些实施方案中，透化样品包括用磷酸盐缓冲液洗涤样品。在某些实施方案中，所述缓冲液是PBS。在某些实施方案中，所述缓冲液是PBST。
(n)确定连接产物的序列
根据上文所述的任何方法联合一般基于细胞的空间分析方法，在来自样品的分析物(例如，mRNA分子)或连接产物已经与捕获探针杂交或以其它方式相关联之后，分析由杂交/结合产生的带条形码的构建体。
在某些实施方案中，在使生物样品与包括捕获探针的基质接触之后，可以任选地进行除去步骤以从基质除去生物样品的全部或部分。在某些实施方案中，所述除去步骤包括生物样品细胞的酶促和/或化学降解。例如，所述除去步骤可以包括用酶(例如，蛋白水解酶，例如，蛋白水解酶K)处理生物样品以从基质除去生物样品的至少一部分。在某些实施方案中，所述除去步骤可以包括组织的消融(例如，激光消融)。
在某些实施方案中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，所述方法包含：(a)任选地对基质上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基质上的生物样品(例如，给其提供包含透化试剂的溶液)；(c)使生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个中的一个捕获探针捕获生物分析物；(d)使不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA杂交；(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；(f)使所述分析物与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；和(g)分析所述捕获的生物分析物，由此空间检测所述生物分析物；其中所述生物样品全部或部分地从所述基质除去。
在某些实施方案中，不从基质除去生物样品。例如，在从基质释放捕获探针(例如，结合到分析物的捕获探针)之前，不从基质除去生物样品。在某些实施方案中，这样的释放包含从基质上切割捕获探针(例如，通过切割结构域)。在某些实施方案中，这样的释放不包括从基质释放捕获探针(例如，可以制备与分析物结合的捕获探针的拷贝，且该拷贝可以从基质释放，例如，通过变性)。在某些实施方案中，在它从基质释放之后在分析结合到捕获探针的分析物之前，不从基质除去生物样品。在某些实施方案中，在从基质除去捕获探针期间和/或在它从基质释放之后在分析结合到捕获探针的分析物期间，生物样品保留在基质上。在某些实施方案中，在捕获探针的拷贝(例如，互补序列)的除去(例如，通过变性)期间，生物样品保留在基质上。在某些实施方案中，可以在不对生物样品进行细胞(例如，透化过的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如，激光消融)的情况下进行对结合到来自基质的捕获探针的分析物的分析。
在某些实施方案中，不从基质除去生物样品的至少一部分。例如，在从基质释放捕获探针(例如，与分析物结合的捕获探针)和/或分析从基质释放的与捕获探针结合的分析物之前，生物样品的一部分可以保留在基质上。在某些实施方案中，在分析结合到来自基质的捕获探针的分析物之前，不对生物样品的至少一部分进行细胞(例如，透化过的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如，激光消融)。
在某些实施方案中，本文提供了用于空间检测来自生物样品(例如，存在于生物样品中)的分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，其包括：(a)任选地对基质上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基质上的生物样品(例如，给其提供包含透化试剂的溶液)；(c)使生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个中的一个捕获探针捕获生物分析物；(d)使不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA杂交；(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；(f)使所述分析物与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；和(g)分析所述捕获的生物分析物，由此空间检测所述生物分析物；其中所述生物样品未从所述基质除去。
在某些实施方案中，本文提供用于空间检测来自生物样品的感兴趣的生物学分析物的方法，其包括：(a)对在基质上的生物样品进行染色和成像；(b)给在基质上的生物样品提供包含透化试剂的溶液；(c)使所述生物样品与基质上的阵列接触，其中所述阵列包含一种或多种捕获探针，从而允许一种或多种捕获探针捕获感兴趣的生物学分析物；(d)使不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA杂交；(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；(f)使所述分析物与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；和(g)分析所述捕获的生物分析物，由此空间检测所述感兴趣的生物学分析物；其中所述生物样品未从所述基质除去。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括对生物样品中的感兴趣区域进行空间转录组分析。在某些实施方案中，一种或多种捕获探针包括捕获结构域。在某些实施方案中，一种或多种捕获探针包含独特分子标识符(UMI)。在某些实施方案中，一种或多种捕获探针包含切割结构域。在某些实施方案中，所述切割结构域包含被尿嘧啶-DNA糖基化酶、脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶(APE1)、U尿嘧啶-特异性的切除试剂(用户)和/或核酸内切酶VIII识别和切割的序列。在某些实施方案中，一种或多种捕获探针不包含切割结构域并且不从阵列切割。
在某些实施方案中，捕获探针可以被延伸(“延伸的捕获探针”，例如，如本文所述)。例如，延伸捕获探针可以包括从捕获的(杂交的)RNA生成cDNA。该过程涉及合成杂交的核酸的互补链，例如，基于捕获的RNA模板(与捕获探针的捕获结构域杂交的RNA)生成cDNA。因此，在延伸捕获探针的初始步骤(例如，cDNA生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如，RNA)充当延伸(例如，逆转录)步骤的模板。在某些实施方案中，在使不希望的RNA耗竭探针与不希望的RNA杂交和除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物之后，延伸捕获探针。
在某些实施方案中，使用逆转录延伸捕获探针。例如，逆转录包括使用逆转录酶从RNA(例如，信使RNA)合成cDNA(互补或拷贝DNA)。在某些实施方案中，当组织仍在原位时进行逆转录，从而产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在某些实施方案中，使用一种或多种DNA聚合酶延伸捕获探针。
在某些实施方案中，捕获探针的捕获结构域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸的互补链的引物，例如，DNA聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如，DNA和/或cDNA)分子包含捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如DNA聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。
在某些实施方案中，产生全长DNA(例如，cDNA)分子。在某些实施方案中，“全长”DNA分子表示整个捕获的核酸分子。但是，如果核酸(例如，RNA)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始RNA长度不同。在某些实施方案中，延伸的探针(例如，第一链cDNA分子)的3’末端被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3’末端。这可以使用单链连接酶诸如T4 RNA连接酶或CircligaseTM(可得自Lucigen，Middleton，WI)实现。在某些实施方案中，模板转换寡核苷酸用于延伸cDNA以产生全长cDNA(或尽可能接近全长eDNA)。在某些实施方案中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3’末端杂交的部分双链DNA分子)可以使用双链连接酶(诸如T4 DNA连接酶)连接到延伸的探针(例如，第一链cDNA)分子的3’末端。适用于连接步骤的其它酶是本领域已知的，并且包括例如Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、热球菌属(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTMDNA连接酶，NewEngland Biolabs)、Amp连接酶TM(可得自Lucigen，Middleton，WI)和SplintR(可得自NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)。在某些实施方案中，将多核苷酸尾巴(例如，聚A尾巴)掺入在延伸的探针分子的3’末端。在某些实施方案中，使用末端转移酶活性酶掺入多核苷酸尾巴。
在某些实施方案中，在扩增和/或分析(例如，序列分析)之前处理双链的延伸的捕获探针以除去任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，诸如核酸外切酶，或纯化柱。
在某些实施方案中，将延伸的捕获探针扩增以产生足以进行分析(例如，通过DNA测序)的量。在某些实施方案中，延伸的捕获探针的第一链(例如，DNA和/或cDNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链式反应)的模板。
在某些实施方案中，所述扩增反应使用包括亲和基团的引物将亲和基团掺入到延伸的捕获探针(例如，RNA-cDNA杂交体)上。在某些实施方案中，所述引物包括亲和基团，且所述延伸的捕获探针包括亲和基团。所述亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。
在某些实施方案中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以偶联至对亲和基团特异性的基质。在某些实施方案中，所述基质可以包括抗体或抗体片段。在某些实施方案中，所述基质包括抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，且所述亲和基团包括生物素。在某些实施方案中，所述基质包括麦芽糖，且所述亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在某些实施方案中，所述基质包括麦芽糖结合蛋白，且所述亲和基团包括麦芽糖。在某些实施方案中，只要延伸的探针的拷贝未固定化到基质，则扩增延伸的捕获探针可以起到从基质表面释放延伸的探针的作用。
在某些实施方案中，释放延伸的捕获探针或其互补序列或扩增子。从基质表面释放延伸的捕获探针或其互补序列或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在某些实施方案中，通过核酸切割和/或通过变性(例如，通过加热使双链分子变性)从阵列释放延伸的捕获探针或其互补序列。
在某些实施方案中，通过物理方式从基质的表面(例如，阵列)释放延伸的捕获探针或其互补序列或扩增子。例如，当延伸的捕获探针被间接固定化在阵列基质上(例如，通过与表面探针杂交)时，可以足以破坏延伸的捕获探针和表面探针之间的相互作用。用于破坏核酸分子之间的相互作用的方法包括本领域已知的使双链核酸分子变性。用于释放DNA分子(即剥离延伸探针的阵列)的直接方法是使用干扰双链分子的氢键的溶液。在某些实施方案中，通过施加至少85℃(例如，至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99℃)的加热的溶液(诸如水或缓冲液)来释放延伸的捕获探针。在某些实施方案中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从基质释放延伸的捕获探针。
在延伸的捕获探针包括切割结构域的某些实施方案中，通过切割从基质表面释放延伸的捕获探针。例如，可以通过本文所述的任何方法切割延伸的捕获探针的切割结构域。在某些实施方案中，在扩增延伸的捕获探针的步骤之前，例如通过切割延伸的捕获探针中的切割结构域，从基质表面释放延伸的捕获探针。
在某些实施方案中，可以使与延伸的捕获探针互补的探针与基质接触。在某些实施方案中，当探针与基质接触时，生物样品可以与基质接触。在某些实施方案中，可以在使基质与探针接触之前从基质中除去生物样品。在某些实施方案中，可以使用可检测标记(例如，本文所述的任何可检测标记)标记探针。在某些实施方案中，可以洗掉没有与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)的探针。在某些实施方案中，可以在基质上检测到与延伸的捕获探针互补的探针(例如，成像，本文所述的任何检测方法)。
在某些实施方案中，与延伸的捕获探针互补的探针可以为约4个核苷酸至约100个核苷酸长。在某些实施方案中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可以为约10个核苷酸至约90个核苷酸长。在某些实施方案中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可以为约20个核苷酸至约80个核苷酸长。在某些实施方案中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可以为约30个核苷酸至约60个核苷酸长。在某些实施方案中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可以为约40个核苷酸至约50个核苷酸长。在某些实施方案中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可以为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98和约99个核苷酸长。
在某些实施方案中，约1至约100个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约1至约10个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约10至约100个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约20至约90个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约30至约80个探针(例如，可检测探针)可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约40至约70个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约50至约60个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。在某些实施方案中，约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98和约99个探针可以与基质接触且与延伸的捕获探针特异性地结合(例如，杂交)。
在某些实施方案中，所述探针可以与单个分析物(例如，单个基因)互补。在某些实施方案中，所述探针可以与一种或多种分析物(例如，基因家族中的分析物)互补。在某些实施方案中，所述探针(例如，可检测探针)可以用于与疾病(例如，癌症、阿尔茨海默氏病、帕金森病)相关联的一组基因。
在某些情况下，可以扩增或拷贝分析物和捕获探针，从而产生多个cDNA分子。在某些情况下，可以扩增或拷贝连接的探针和捕获探针，从而产生多个cDNA分子。在某些实施方案中，cDNA可以从捕获探针模板变性并转移(例如，至干净的试管中)用于扩增和/或文库构建。可以在文库构建之前通过PCR扩增带空间条形码的cDNA。然后可以对cDNA进行酶促片段化和大小选择，以就cDNA扩增子大小进行优化。用于在测序流动池(Illumina测序仪器)上捕获扩增子的P5和P7序列可以被附加到扩增子，i7和i5可以用作样品索引，且TruSeq Read2可以通过末端修复(End Repair)、A加尾(A-tailing)、衔接子连接(Adaptor Ligation)和PCR而添加。然后可以使用TruSeq Read 1和TruSeq Read 2作为测序引物位点，使用配对末端测序对cDNA片段进行测序。额外的序列针对Illumina测序仪器或利用那些序列的测序仪器；但是，熟练的技术人员会理解，其它测序仪器或技术所使用的额外或替代序列也同样适用于上述方法。
在某些实施方案中，通过与捕获探针或分析物捕获试剂(如上文所述，其与细胞表面杂交、结合或相关联，或引入细胞中)杂交直接对样品进行条形码化，可以对完整样品进行测序。
多种不同的测序方法可以用于分析带条形码的分析物(例如，分析物和/或连接产物)。一般而言，测序的多核苷酸可以是例如核酸分子诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA或DNA/RNA杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。
多核苷酸的测序可以通过各种系统进行。更一般而言，使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如，数字PCR和微滴数字PCR(ddPCR)、定量PCR、实时PCR、多路PCR、基于PCR的单重方法、乳液PCR)和/或等温扩增，可以进行测序。用于对遗传物质进行测序的方法的非限制性例子包括、但不限于DNA杂交方法(例如，DNA印迹法)、限制性酶消化方法、Sanger测序方法、下一代测序方法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和Polony测序)、连接方法和微阵列方法。
(o)试剂盒
在某些实施方案中，本文还提供了试剂盒，其包括一种或多种试剂以检测本文所述的一种或多种分析物。在某些情况下，所述试剂盒包括包含多个捕获探针的基质，所述捕获探针包含空间条形码和捕获结构域。在某些情况下，所述试剂盒包括多个探针(例如，第一探针、第二探针、一个或多个跨越探针和/或第三寡核苷酸)。
用于执行本文所述的任何方法的试剂盒的一个非限制性实施例包括：(a)包含多个捕获探针的基质，所述捕获探针包含空间条形码和捕获结构域；(b)一个系统，其包含：多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；和(c)关于执行前述权利要求中任一项所述的方法的说明书。
用于执行本文所述的任何方法的试剂盒的一个非限制性实施例包括：(a)包含多个捕获探针的基质，所述捕获探针包含空间条形码和捕获结构域；(b)一个系统，其包含：第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，该结构域能够结合捕获探针的捕获结构域，且其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；和(c)关于执行前述权利要求中任一项所述的方法的说明书。
在本文所述的任何试剂盒的某些实施方案中，所述试剂盒包括在其5’末端包含预腺苷酸化的磷酸酯基团的第二探针和在3’末端包含至少两个核糖核酸碱基的第一探针。
实施例
实施例1.原位空间RTL(RNA模板化连接)核糖体耗竭的工作流程
其他人已经报道了核糖体探针设计及其从纯化的总RNA中进行核糖体耗竭的应用。参见Morlan等人，“Selective depletion of rRNA enables whole transcriptomeprofiling of archival fixed tissue.”PloS one 7.8(2012)；美国专利申请公开号20110111409 A1；美国专利申请号62/860,993；和Adiconis等人，“Comparative analysisof RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.”Nature methods10.7(2013)：623；它们中的每一篇整体通过引用并入本文。在这里，RNA耗竭程序被纳入生物样品中RNA模板化连接的工作流程中，其中用于耗竭的核糖体RNA未经纯化，而是位于样品诸如组织中。
作为一个非限制性实施例，且如在图7中所示，可以使用包含mRNA和核糖体RNA(rRNA)的生物组织样品来执行RNA耗竭程序，其中rRNA将从样品中耗竭。可以同时加入多个核糖体耗竭探针以与rRNA特异性杂交，从而形成RNA：DNA双链体结构。核糖体耗竭探针可以设计为与rRNA分子的完整或部分序列杂交。杂交之后，可以加入RNA酶H以消化杂交的RNA：DNA双链体的RNA链，使得rRNA可以被消化。然后可以透化生物样品以释放连接的RTL探针。在该实施例中，靶mRNA的捕获也可以与rRNA耗竭方法同时进行。为了同时进行rRNA耗竭和靶mRNA捕获，可以将两种RTL探针(即，LHS和RHS探针)与rRNA耗竭探针同时应用于样品。在杂交反应过程中允许探针与其靶标杂交，且连接步骤将RTL探针连接在一起，随后用RNA酶H消化形成的DNA：RNA杂交体中的RNA，从而在释放RTL连接产物的同时消化rRNA和耗竭那些分子。可以将样品透化，从而使RTL连接产物与附着至载玻片的多个捕获探针接触。连接的RTL探针可以扩散并结合附着至载玻片表面的捕获探针，其中所述捕获探针包含与RHS连接产物上的序列互补的序列。杂交之后，捕获探针的3’末端可以使用连接的RTL探针作为模板进行延伸。然后可以收集延伸的和连接的RTL探针用于下游文库制备和随后的空间表达分析。
作为另一个非限制性实施例，可以将RNA耗竭探针添加到生物样品中以与不希望的RNA分子特异性地杂交。然后可以添加RNA酶H以消化杂交的RNA：DNA双链体的RNA链，从而可以消化不希望的RNA分子。RNA耗竭探针也可以使用RecJ核酸外切酶除去。然后可以对生物样品进行如本文描述的空间分析工作流程。
实施例2.原位核糖体耗竭增加临床样品中空间转录组的mRNA捕获
一般而言，可以通过在透化组织样品之前添加rRNA特异性探针来进行核糖体耗竭。如在图8A中所示，核糖体耗竭探针(RD探针)可以特异性地杂交rRNA分子并抑制其与基质上的捕获探针的非特异性结合，从而增加临床样品中空间转录组的mRNA捕获。在除去rRNA分子后，可以通过本文描述的任何透化方法透化组织样品。核糖体耗竭探针被设计成阻断细胞质18S、28S、5S和5.8S rRNA、以及线粒体16S和12S rRNA。对于这些组实验，核糖体耗竭探针包括SEQ ID NO：1-195的核酸序列。将核糖体耗竭探针(例如，SEQ ID NO：1-195)合并到一个集合中，该集合包括在IDTE缓冲液(10mM Tris，0.1mM EDTA，pH 7.5-8.0)中的2μM浓度的每种探针。对于空间转录组分析，在逆转录(RT)步骤中，将H2O(166.3μl)替换为等同体积(166.3μl)的在IDTE缓冲液中的合并的核糖体耗竭探针。RT反应混合物中每种核糖体耗竭探针的最终浓度为约1μM。
如在图8B-8C中所示，使用本文所述的探针的核糖体耗竭降低了组织样品中的18SrRNA水平。图8D-8E的结果还表明核糖体耗竭增加了聚腺苷酸特异性的探针与mRNA的结合。
评估了核糖体耗竭对基因表达的影响。在正常组织和核糖体耗竭的组织样品之间对比了基因表达水平。分析了小鼠嗅球(MOB)、儿童期脑肿瘤(PNET)和脂肪组织，并将结果分别显示在图9A-9C中。结果表明，大多数基因在核糖体耗竭后表现出相似的表达水平，如R2值所指示的。分别编码线粒体12S和16S rRNA的MT-RNR1和MT-RNR2在核糖体耗竭的组织样品中表现出降低的表达水平。
指示线粒体12S和16S rRNA的基因表达水平的组织图显示在图10中。两种rRNA分子在组织中的核糖体耗竭后呈现出降低的表达水平。如在图11-12中所示，在脂肪(adipose、fat)、小鼠嗅球(MOB)、MOB-181218和儿童期脑癌(PNET)组织中，在组织核糖体耗竭中观察到每个基因更多的UMI、以及增加的检测率。
分别在图13A和图13B中在正常组织和核糖体耗竭的组织之间对比了不同的Seurat簇的空间表达图样。结果表明，核糖体耗竭的组织样品表现出比正常组织样品更清晰的图样(参见，例如，图13A-B)。对图14A-14B中的正常组织和核糖体耗竭的组织的分析显示，在tSNE图中，与正常组织样品相比，来自核糖体耗竭组织的每个Seurat簇呈现出在Seurat簇之间更清晰的边界，表明改善的数据集质量。来自图14A(正常组织)和图14B(核糖体耗竭组织)的每个Seurat簇的空间表达图样分别显示在图15和图16中。这些结果表明，核糖体耗竭提高了本文描述的空间基因表达分析方法的整体分析能力和准确性。
另一个实施例显示在图17A-17B和图18A-18B中，它们进一步支持了上述结论。在正常组织样品(参见图17A-17B)中，簇1和5(由箭头指示)在组织样品的基本上分开的区域上具有高表达水平(图17A)。但是，这两个簇在tSNE图中呈现出相互渗透的图样(参见图17B，由箭头指示)。相反，在核糖体耗竭的组织样品(参见图18A)中的簇3和4(由箭头指示)也具有分开的表达图样，但在tSNE图中呈现更清晰的边界(图18B，由箭头指示)。因此，核糖体耗竭改善了整体数据集质量，以反映更准确的空间基因表达图样。
在空间转录组工作流程中使用核糖体耗竭探针的另一个实施例显示在图19-21中，所述图提供了总体基因表达和一组示例性单个基因的数据，将对照样品与核糖体耗竭的样品进行了对比。如上面所指出的，195个核糖体耗竭探针(例如，SEQ ID NO：1-195的核糖体耗竭探针)中的每一个以1μM终浓度被包含在空间转录组RT反应混合物中。如在图19A-19D中所示，核糖体耗竭改善了对示例性mRNA分子子集(包括Perk、Doc2g和Kctd12，分别见图19B-19D)的检测。由于核糖体耗竭探针的集合包括靶向MT-RNR1和MT-RNR2的探针，因此通过对比持家基因(例如，Actb和Gapdh)的检测与MT-RNR1和MT-RNR2的检测来确认不希望的RNA的耗竭。如在图20A-20D中所示，当样品暴露于核糖体耗竭探针时，持家基因的检测没有变化，但是MT-RNR1和MT-RNR2的检测减少。此外，总体基因表达不受空间转录组工作流程中包含核糖体耗竭探针的影响。对照样品和核糖体耗竭的样品之间的总体基因表达的对比显示所有对比的显著相关性(Pearson氏r＞0.97；p＜2.2e-16))。因而，如上面所指出的，该数据表明，通过改进mRNA分子的捕获，并同时不限制总体基因表达的分析，被包含在空间转录组工作流程中的核糖体耗竭探针提高了空间基因表达图样的分辨率。
其它实施方案
应当理解，尽管已经结合其详细说明描述了本发明，但是前述说明书意在只是说明性的，并且不限制本发明的范围，本发明的范围由随后的权利要求的范围限定。其它方面、优点和改变是在下述权利要求的范围内。
序列表
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<110> 10x基因组学有限公司和空间转录组学公司（10x Genomics, Inc. andSpatial Transcriptomics AB）
<120> 用于使用靶向RNA耗竭进行空间分析的方法
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<150> 63/014,054
<151> 2020-04-22
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<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9345_18_19
<400> 19
ccaagaattt cacctctagc ggcgcaatac gaatgccccc ggccgtccct 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9346_18_20
<400> 20
cttaatcatg gcctcagttc cgaaaaccaa caaaatagaa ccgcggtcct 50
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9347_18_21
<400> 21
attccattat tcctagctgc ggtatccagg cggctcgggc ctgctttgaa 50
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9348_18_22
<400> 22
cactctaatt ttttcaaagt aaacgcttcg ggccccgcgg gacactcagc 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9349_18_23
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taagagcatc gagggggcgc cgagaggcaa ggggcgggga cgggcggtgg 50
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<400> 24
ctcgcctcgc ggcggaccgc ccgcccgctc ccaagatcca actacgagct 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9351_18_25
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ttttaactgc agcaacttta atatacgcta ttggagctgg aattaccgcg 50
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<213> 人工
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<213> 人工
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<213> 人工
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tttcgtcact acctccccgg gtcgggagtg ggtaatttgc gcgcctgctg 50
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<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9355_18_29
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9356_18_30
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ccctgattcc ccgtcacccg tggtcaccat ggtaggcacg gcgactacca 50
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<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9357_18_31
<400> 31
tcgaaagttg atagggcaga cgttcgaatg ggtcgtcgcc gccacggg 48
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9358_18_32
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gcgtgcgatc ggcccgaggt tatctagagt caccaaagcc gccggcgccc 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9359_18_33
<400> 33
gccccccggc cggggccgga gaggggctga ccgggttggt tttgatctga 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9360_18_34
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taaatgcacg catccccccc gcgaaggggg tcagcgcccg tcggcatgta 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
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<400> 35
ttagctctag aattaccaca gttatccaag taggagagga gcgagcgacc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9362_18_36
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9363_18_37
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ccgtgcgtac ttagacatgc atggcttaat ctttgagaca agcatatgct 50
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<212> DNA
<213> 人工
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tggcttaatc tttgagacaa gcatatgcta ctggcaggat caaccaggta 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9365_28_1
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gacaaaccct tgtgtcgagg gctgactttc aatagatcgc agcgagggag 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9366_28_2
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ctgctctgct acgtacgaaa ccccgaccca gaagcaggtc gtctacgaat 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9367_28_3
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ggtttagcgc caggttcccc acgaacgtgc ggtgcgtgac gggcgaggg 49
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9368_28_4
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gcggccgcct ttccggccgc gccccgtttc ccaggacgaa gggcactccg 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9369_28_5
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caccggaccc cggtcccggc gcgcggcggg gcacgcgccc tcccgcggcg 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9370_28_6
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9371_28_7
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gctatccgag gccaaccgag gctccgcggc gctgccgtat cgttcgcctg 50
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<213> 人工
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9373_28_9
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ttcgccccat tggctcctca gccaagcaca tacaccaaat gtctgaacct 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9374_28_10
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gcggttcctc tcgtactgag caggattacc atggcaacaa cacatcatca 50
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9375_28_11
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gtagggtaaa actaacctgt ctcacgacgg tctaaaccca gctcacgttc 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9376_28_12
<400> 50
cctattagtg ggtgaacaat ccaacgcttg gcgaattctg cttcacaatg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9377_28_13
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9378_28_14
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ttggccgcca caagccagtt atccctgtgg taacttttct gacacctcct 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9379_28_15
<400> 53
gcttaaaacc caaaaggtca gaaggatcgt gaggccccgc tttcacggtc 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9380_28_16
<400> 54
tgtattcgta ctgaaaatca agatcaagcg agcttttgcc cttctgctcc 50
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9381_28_17
<400> 55
acgggaggtt tctgtcctcc ctgagctcgc cttaggacac ctgcgttacc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
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<400> 56
gtttgacagg tgtaccgccc cagtcaaact ccccacctgg cactgtcccc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9383_28_19
<400> 57
ggagcgggtc gcgcccggcc gggcgggcgc ttggcgccag aagcgagagc 50
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9384_28_20
<400> 58
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9385_28_21
<400> 59
gtagtggtat ttcaccggcg gcccgcaggg ccgcggaccc cgccccgggc 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9386_28_22
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ccctcgcggg gacaccgggg ggcgccgggg gcctcccact tattctaca 49
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9387_28_23
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cctctcatgt ctcttcaccg tgccagacta gagtcaagct caacagggtc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9388_28_24
<400> 62
ttctttcccc gctgattccg ccaagcccgt tcccttggct gtggtttcgc 50
<210> 63
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9389_28_25
<400> 63
tggatagtag gtagggacag tgggaatctc gttcatccat tcatgcgcgt 50
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9390_28_26
<400> 64
cactaattag atgacgaggc atttggctac cttaagagag tcatagttac 50
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9391_28_27
<400> 65
tcccgccgtt tacccgcgct tcattgaatt tcttcacttt gacattcaga 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9392_28_28
<400> 66
gcactgggca gaaatcacat cgcgtcaaca cccgccgcgg gccttcgcga 50
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9393_28_29
<400> 67
tgctttgttt taattaaaca gtcggattcc cctggtccgc accagttcta 50
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9394_28_30
<400> 68
agtcggctgc taggcgccgg ccgaggcgag gcgcgcgcgg aaccgcggcc 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9395_28_31
<400> 69
ccgggggcgg acccggcggg gggaccggcc cgcggcccct ccgccgcct 49
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9396_28_32
<400> 70
gccgccgccg ccgccgcgcg ccgaggagga ggggggaacg gggggcggac 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9397_28_33
<400> 71
gggccggggg gtagggcggg gggacgaacc gccccgcccc gccgcccg 48
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9398_28_34
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ccgaccgccg ccgcccgacc gctcccgccc ccagcggacg cgcgcgcgac 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9399_28_35
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cgagacgtgg ggtgggggtg gggggcgcgc cgcgccgccg ccgggctccc 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9400_28_36
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cgggggcggc cgcgacgccc gccgcagctg gggcgatcca cgggaagggc 50
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9401_28_37
<400> 75
ccggctcgcg tccagagtcc gcgccgccgc cggccccccg ggtccccggg 50
<210> 76
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9402_28_38
<400> 76
gcccccctcg cggggacctg cccccgccgg ccgccccggc ggccgccgcg 50
<210> 77
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9403_28_39
<400> 77
cggcccctgc cgccccgacc cttctccccc cgccgcgccc ccacgcggcg 50
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9404_28_40
<400> 78
ctcccccggg gaggggggag gacggggagc gggggagaga gagagagaga 50
<210> 79
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9405_28_41
<400> 79
gggcgcgggg tggggaggga gcgagcggcg cgcgcgggtg gggcggggga 50
<210> 80
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9406_28_42
<400> 80
gggccgcgag gggggtgccc cgggcgtggg ggggcgcgcg cctcgtcca 49
<210> 81
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9407_28_43
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gccgcggcgc gcgcccagcc ccgcttcgcg ccccagcccg accgacccag 50
<210> 82
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9408_28_44
<400> 82
cccttagagc caatccttat cccgaagtta cggatccggc ttgccgactt 50
<210> 83
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9409_28_45
<400> 83
cccttaccta cattgttcca acatgccaga ggctgttcac cttggagacc 50
<210> 84
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9410_28_46
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tgctgcggat atgggtacgg cccggcgcga gatttacacc ctctcccccg 50
<210> 85
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9411_28_47
<400> 85
gattttcaag ggccagcgag agctcaccgg acgccgccgg aaccgcgacg 50
<210> 86
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9412_28_48
<400> 86
ctttccaagg cacgggcccc tctctcgggg cgaacccatt ccagggcgcc 50
<210> 87
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9413_28_49
<400> 87
ctgcccttca caaagaaaag agaactctcc ccggggctcc cgccggcttc 50
<210> 88
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9414_28_50
<400> 88
tccgggatcg gtcgcgttac cgcactggac gcctcgcggc gcccatctcc 50
<210> 89
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9415_28_51
<400> 89
gccactccgg attcggggat ctgaacccga ctccctttcg atcggccgag 50
<210> 90
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9416_28_52
<400> 90
ggcaacggag gccatcgccc gtcccttcgg aacggcgctc gcccatctct 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9417_28_53
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caggaccgac tgacccatgt tcaactgctg ttcacatgga acccttctcc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9418_28_54
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acttcggcct tcaaagttct cgtttgaata tttgctacta ccaccaagat 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9419_28_55
<400> 93
ctgcacctgc ggcggctcca cccgggcccg cgccctaggc ttcaaggctc 50
<210> 94
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9420_28_56
<400> 94
accgcagcgg ccctcctact cgtcgcggcg tagcgtccgc ggggctccgg 50
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9421_28_57
<400> 95
gggcggggag cggggcgtgg gcgggaggag gggaggaggc gtggg 45
<210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9422_28_58
<400> 96
gggcggggga aggaccccac acccccgccg ccgccgccgc cgccgccctc 50
<210> 97
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9423_28_59
<400> 97
cgacgcacac cacacgcgcg cgcgcgcgcg ccgcccccgc cgctcccgtc 50
<210> 98
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9424_28_60
<400> 98
cactctcgac tgccggcgac ggccgggtat gggcccgacg ctccagcgcc 50
<210> 99
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9425_28_61
<400> 99
atccattttc agggctagtt gattcggcag gtgagttgtt acacactcct 50
<210> 100
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9426_28_62
<400> 100
tagcggattc cgacttccat ggccaccgtc ctgctgtcta tatcaaccaa 50
<210> 101
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9427_28_63
<400> 101
caccttttct ggggtctgat gagcgtcggc atcgggcgcc ttaacccggc 50
<210> 102
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9428_28_64
<400> 102
gttcggttca tcccgcagcg ccagttctgc ttaccaaaag tggcccacta 50
<210> 103
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9429_28_65
<400> 103
ggcactcgca ttccacgccc ggctccacgc cagcgagccg ggcttcttac 50
<210> 104
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9430_28_66
<400> 104
ccatttaaag tttgagaata ggttgagatc gtttcggccc caagacctct 50
<210> 105
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9431_28_67
<400> 105
aatcattcgc tttaccggat aaaactgcgt ggcgggggtg cgtcgggtct 50
<210> 106
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9432_28_68
<400> 106
gcgagagcgc cagctatcct gagggaaact tcggagggaa ccagctacta 50
<210> 107
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9433_28_69
<400> 107
gatggttcga ttagtctttc gcccctatac ccaggtcgga cgaccgattt 50
<210> 108
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9434_28_70
<400> 108
gcacgtcagg accgctacgg acctccacca gagtttcctc tggcttcgcc 50
<210> 109
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9435_28_71
<400> 109
ctgcccaggc atagttcacc atctttcggg tcctaacacg tgcgctcgtg 50
<210> 110
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9436_28_72
<400> 110
ctccacctcc ccggcgcggc gggcgagacg ggccggtggt gcgccctcgg 50
<210> 111
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9437_28_73
<400> 111
cggactggag aggcctcggg atcccacctc ggccggcgag cgcgccggcc 50
<210> 112
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9438_28_74
<400> 112
ttcaccttca ttgcgccacg gcggctttcg tgcgagcccc cgactcgcgc 50
<210> 113
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9439_28_75
<400> 113
acgtgttaga ctccttggtc cgtgtttcaa gacgggtcgg gtgggtagcc 50
<210> 114
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9440_28_76
<400> 114
gacgtcgccg ccgaccccgt gcgctcgctc cgccgtcccc ctcttcggg 49
<210> 115
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9441_28_77
<400> 115
gacgcgcgcg tggccccgag agaacctccc ccgggcccga cggcgcgacc 50
<210> 116
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9442_28_78
<400> 116
cgcccggggc gcactgggga cagtccgccc cgccccccga cccgcgcgcg 50
<210> 117
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9443_28_79
<400> 117
gcaccccccc cgtcgccggg gcgggggcgc ggggaggagg ggtgggagag 50
<210> 118
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9444_28_80
<400> 118
cggtcgcgcc gtgggagggg tggcccggcc cccccacgag gagacgccgg 50
<210> 119
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9445_28_81
<400> 119
cgcgcccccg cgggggagac ccccctcgcg ggggattccc cgcgggggtg 50
<210> 120
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9446_28_82
<400> 120
ggcgccggga ggggggagag cgcggcgacg ggtctcgctc cctcggcccc 50
<210> 121
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9447_28_83
<400> 121
gggattcggc gagtgctgct gccggggggg ctgtaacact cgggggggt 49
<210> 122
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9448_28_84
<400> 122
ttcggtcccg ccgcccccgc cgccgccgcc accgccgccg ccgccgccgc 50
<210> 123
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9449_28_85
<400> 123
cccgacccgc gcgccctccc gagggaggac gcggggccgg ggggcggaga 50
<210> 124
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9450_28_86
<400> 124
cgggggagga ggaggacgga cggacggacg gggccccccg agccaccttc 50
<210> 125
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9451_28_87
<400> 125
cccgccgggc cttcccagcc gtcccggagc cggtcgcggc gcaccgccgc 50
<210> 126
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9452_28_88
<400> 126
ggtggaaatg cgcccggcgg cggccggtcg ccggtcgggg gacggtcccc 50
<210> 127
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9453_28_89
<400> 127
cgccgacccc acccccggcc ccgcccgccc acccccgcac ccgccggagc 50
<210> 128
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9454_28_90
<400> 128
ccgccccctc cggggaggag gaggaggggc ggcgggggaa gggagggcgg 50
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9455_28_91
<400> 129
gtggaggggt cgggaggaac ggggggcggg aaagatccgc cgggccgccg 50
<210> 130
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9456_28_92
<400> 130
acacggccgg acccgccgcc gggttgaatc ctccgggcgg actgcgcgga 50
<210> 131
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9457_28_93
<400> 131
ccccacccgt ttacctctta acggtttcac gccctcttga actctctctt 50
<210> 132
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9458_28_94
<400> 132
caaagttctt ttcaactttc ccttacggta cttgttgact atcggtctcg 50
<210> 133
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9459_28_95
<400> 133
tgccggtatt tagccttaga tggagtttac cacccgcttt gggctgcatt 50
<210> 134
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9460_28_96
<400> 134
cccaagcaac ccgactccgg gaagacccgg gcgcgcgccg gccgctaccg 50
<210> 135
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9461_28_97
<400> 135
gcctcacacc gtccacgggc tgggcctcga tcagaaggac ttgggccccc 50
<210> 136
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9462_28_98
<400> 136
cacgagcggc gccggggagc gggtcttccg tacgccacat gtcccgcgcc 50
<210> 137
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9463_28_99
<400> 137
ccgcggggcg gggattcggc gctgggctct tccctgttca ctcgccgtta 50
<210> 138
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9464_28_100
<400> 138
ctgagggaat cctggttagt ttcttttcct ccgctgacta atatgcttaa 50
<210> 139
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9465_28_101
<400> 139
gactaatatg cttaaattca gcgggtcgcc acgtctgatc tgaggtcgcg 50
<210> 140
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9466_5.8_1
<400> 140
aagcgacgct cagacaggcg tagccccggg aggaacccgg ggccgcaagt 50
<210> 141
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9467_5.8_2
<400> 141
gcgttcgaag tgtcgatgat caatgtgtcc tgcaattcac attaattctc 50
<210> 142
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9468_5.8_3
<400> 142
gcagctagct gcgttcttca tcgacgcacg agccgagtga tccaccgcta 50
<210> 143
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9469_16_1
<400> 143
aaaccctgtt cttgggtggg tgtgggtata atactaagtt gagatgatat 50
<210> 144
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9470_16_2
<400> 144
catttacggg ggaaggcgct ttgtgaagta ggccttattt ctcttgtcct 50
<210> 145
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9471_16_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n为a、c、g、或t
<400> 145
ttcgtacagg gaggaatttg aangtagata gaaaccgacc tggattactc 50
<210> 146
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9472_16_4
<400> 146
cggtctgaac tcagatcacg taggacttta atcgttgaac aaacgaacct 50
<210> 147
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9473_16_5
<400> 147
ttaatagcgg ctgcaccatc gggatgtcct gatccaacat cgaggtcgta 50
<210> 148
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9474_16_6
<400> 148
aaccctattg ttgatatgga ctctagaata ggattgcgct gttatcccta 50
<210> 149
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9475_16_7
<400> 149
gggtaacttg ttccgttggt caagttattg gatcaattga gtatagtagt 50
<210> 150
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9476_16_8
<400> 150
tcgctttgac tggtgaagtc ttagcatgta ctgctcggag gttgggttct 50
<210> 151
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9477_16_9
<400> 151
gctccgaggt cgccccaacc gaaattttta atgcaggttt ggtagtttag 50
<210> 152
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9478_16_10
<400> 152
gacctgtggg tttgttaggt actgtttgca ttaataaatt aaagctccat 50
<210> 153
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9479_16_11
<400> 153
agggtcttct cgtcttgctg tgttatgccc gcctcttcac gggcaggtca 50
<210> 154
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9480_16_12
<400> 154
atttcactgg ttaaaagtaa gagacagctg aaccctcgtg gagccattca 50
<210> 155
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9481_16_13
<400> 155
tacaggtccc tatttaagga acaagtgatt atgctacctt tgcacggtta 50
<210> 156
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9482_16_14
<400> 156
gggtaccgcg gccgttaaac atgtgtcact gggcaggcgg tgcctctaat 50
<210> 157
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9483_16_15
<400> 157
actggtgatg ctagaggtga tgtttttggt aaacaggcgg ggtaagattt 50
<210> 158
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9484_16_16
<400> 158
gccgagttcc ttttactttt tttaaccttt ccttatgagc atgcctgtgt 50
<210> 159
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9485_16_17
<400> 159
tgggttgaca gtgagggtaa taatgacttg ttggttgatt gtagatattg 50
<210> 160
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9486_16_18
<400> 160
ggctgttaat tgtcagttca gtgttttaat ctgacgcagg cttatgcgga 50
<210> 161
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9487_16_19
<400> 161
ggagaatgtt ttcatgttac ttatactaac attagttctt ctatagggtg 50
<210> 162
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9488_16_20
<400> 162
atagattggt ccaattgggt gtgaggagtt cagttatatg tttgggattt 50
<210> 163
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9489_16_21
<400> 163
tttaggtagt gggtgttgag cttgaacgct ttcttaattg gtggctgctt 50
<210> 164
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9490_16_22
<400> 164
ttaggcctac tatgggtgtt aaatttttta ctctctctac aaggtttttt 50
<210> 165
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9491_16_23
<400> 165
cctagtgtcc aaagagctgt tcctctttgg actaacagtt aaatttacaa 50
<210> 166
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9492_16_24
<400> 166
gggatttaga gggttctgtg ggcaaattta aagttgaact aagattcta 49
<210> 167
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9493_16_25
<400> 167
tcttggacaa ccagctatca ccaggctcgg taggtttgtc gcctctacct 50
<210> 168
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9494_16_26
<400> 168
ataaatcttc ccactatttt gctacataga cgggtgtgct cttttagctg 50
<210> 169
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9495_16_27
<400> 169
ttcttaggta gctcgtctgg tttcgggggt cttagctttg gctctccttg 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9496_16_28
<400> 170
caaagttatt tctagttaat tcattatgca gaaggtatag gggttagtcc 50
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<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9497_16_29
<400> 171
ttgctatatt atgcttggtt ataatttttc atctttccct tgcggtacta 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9498_16_30
<400> 172
tatctattgc gccaggtttc aatttctatc gcctatactt tatttgggta 50
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<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9499_16_31
<400> 173
aatggtttgg ctaaggttgt ctggtagtaa ggtggagtgg gtttggggct 50
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<223> 合成探针 AG9500_12_1
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gttcgtccaa gtgcactttc cagtacactt accatgttac gacttgtctc 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9501_12_2
<400> 175
ctctatataa atgcgtaggg gttttagtta aatgtccttt gaagtatact 50
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<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9502_12_3
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tgaggagggt gacgggcggt gtgtacgcgc ttcagggccc tgttcaacta 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9503_12_4
<400> 177
agcactctac tcttagttta ctgctaaatc caccttcgac ccttaagttt 50
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<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9504_12_5
<400> 178
cataagggct atcgtagttt tctggggtag aaaatgtagc ccatttcttg 50
<210> 179
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<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9505_12_6
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ccacctcatg ggctacacct tgacctaacg tctttacgtg ggtacttgcg 50
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9506_12_7
<400> 180
cttactttgt agccttcatc agggtttgct gaagatggcg gtatataggc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9507_12_8
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tgagcaagag gtggtgaggt tgatcggggt ttatcgatta cagaacaggc 50
<210> 182
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9508_12_9
<400> 182
tcctctagag ggatatgaag caccgccagg tcctttgagt tttaagctgt 50
<210> 183
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9509_12_10
<400> 183
ggctcgtagt gttctggcga gcagttttgt tgatttaact gttgaggttt 50
<210> 184
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9510_12_11
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agggctaagc atagtggggt atctaatccc agtttgggtc ttagctattg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9511_12_12
<400> 185
tgtgttcaga tatgttaaag ccactttcgt agtctatttt gtgtcaactg 50
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9512_12_13
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gagtttttta caactcaggt gagttttagc tttattgggg agggggtgat 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
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<223> 合成探针 AG9513_12_14
<400> 187
ctaaaacact ctttacgccg gcttctattg acttgggtta atcgtgtgac 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9514_12_15
<400> 188
cgcggtggct ggcacgaaat tgaccaaccc tggggttagt atagcttagt 50
<210> 189
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9515_12_16
<400> 189
taaactttcg tttattgcta aaggttaatc actgctgttt cccgtggg 48
<210> 190
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9516_12_17
<400> 190
tgtggctagg ctaagcgttt tgagctgcat tgctgcgtgc ttgatgcttg 50
<210> 191
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9517_12_18
<400> 191
ttccttttga tcgtggtgat ttagagggtg aactcactgg aacggggatg 50
<210> 192
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9518_12_19
<400> 192
cttgcatgtg taatcttact aagagctaat agaaaggcta ggaccaaacc 50
<210> 193
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9519_5_1
<400> 193
aaagcctaca gcacccggta ttcccaggcg gtctcccatc caagtactaa 50
<210> 194
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9520_5_2
<400> 194
ccaggcccga ccctgcttag cttccgagat cagacgagat cgggcgcgtt 50
<210> 195
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成探针 AG9521_5_3
<400> 195
ttccgagatc agacgagatc gggcgcgttc agggtggtat ggccgtagac 50

Claims (100)

1.一种用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含：
(a)使生物样品与第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和多个不希望的RNA耗竭探针接触，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与所述分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，所述结构域能够结合捕获探针的捕获结构域，并且其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；
(b)使所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与所述分析物杂交；
(c)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子杂交；
(d)连接所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸，由此产生与所述分析物基本上互补的连接的探针；
(e)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物并且从所述分析物释放所述连接的探针；
(f)使所述连接的探针的捕获探针结合结构域与附着至基质的捕获探针的捕获结构域杂交；以及
(g)确定(i)与所述捕获结构域特异性地结合的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，以及使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一探针寡核苷酸在3’末端处包含至少两个核糖核酸碱基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一探针寡核苷酸进一步包含功能序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述功能序列是引物序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第二探针寡核苷酸在5’末端处包含磷酸化的核苷酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含提供与所述捕获探针结合结构域相互作用的捕获探针结合结构域阻断部分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法进一步包含在步骤(f)之前从所述捕获探针结合结构域释放所述捕获探针结合结构域阻断部分。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获探针结合结构域包含聚腺苷酸(聚A)序列或其互补序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述捕获探针结合结构域阻断部分包含聚尿苷序列、聚胸苷序列或二者。
10.根据权利要求9所述的方法，其中从所述聚A序列释放所述聚尿苷序列包含使所述连接的探针变性或使所述连接的探针与核酸内切酶或核酸外切酶接触。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获探针结合结构域包含与所述捕获探针的捕获结构域的全部或部分互补的序列。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获探针结合结构域包含简并序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中连接步骤包含使用酶促连接或化学连接来连接所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶促连接利用连接酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶2(Rnl2)连接酶。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸是DNA探针。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述不希望的RNA耗竭探针是DNA探针。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中步骤(b)和(c)各自产生RNA：DNA杂交体。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中步骤(e)包含使所述不希望的RNA耗竭探针与核糖核酸酶接触。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶H1。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶H2。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述RNA酶H是热稳定的RNA酶。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含在步骤(f)之前扩增所述连接的探针。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)基本上同时进行。
27.一种用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含：
(a)使所述生物样品与以下物质接触：
包含多个附着的捕获探针的基质，其中所述多个附着的捕获探针中的一个捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域；和
多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；
(b)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；
(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；
(d)使所述分析物与附着至所述基质的捕获探针的捕获结构域杂交；
(e)使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针的3’末端以产生延伸的捕获探针；以及
(f)扩增所述延伸的捕获探针以产生核酸。
28.根据权利要求27所述的方法，进一步包含确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列，以及使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
29.一种用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包含：
(a)使所述生物样品与多个不希望的RNA耗竭探针接触，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述生物样品中的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；
(b)使所述不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；
(c)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；
(d)使多个核酸与多个靶寡核苷酸探针接触，其中：
所述多个核酸中的一个核酸包含(i)空间条形码或其互补序列，和(ii)来自生物样品的分析物的部分序列或其互补序列；并且
所述多个靶寡核苷酸探针的一个靶寡核苷酸探针包含：
结构域，其特异性地结合(i)所述空间条形码的全部或部分或其互补序列，和/或(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列或其互补序列，和
分子标签；
(e)使用基质富集特异性地结合所述核酸的靶寡核苷酸探针的复合物，所述基质包含特异性地结合所述分子标签的试剂；和
(f)确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)来自所述生物样品的分析物的全部或部分序列，以及使用(i)和(ii)的确定的序列鉴定所述分析物在所述生物样品中的位置。
30.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法进一步包含产生所述多个核酸，包含：
(a)使所述生物样品与基质接触，所述基质包含多个附着的捕获探针，其中所述多个附着的捕获探针中的一个捕获探针包含(i)所述空间条形码和(ii)特异性地结合存在于所述分析物中的序列的捕获结构域；
(b)使用特异性地结合至所述捕获结构域的所述分析物作为模板延伸所述捕获探针的3’末端以产生延伸的捕获探针；以及
(c)扩增所述延伸的捕获探针以产生所述核酸。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的方法，其中所述靶寡核苷酸探针的结构域包含共约40个核苷酸至约160个核苷酸。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述分子标签包含部分。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述部分是抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、生物素或荧光团。
34.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述分子标签包含小分子、核酸或碳水化合物。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述分子标签在所述靶寡核苷酸探针中位于所述结构域的5’或3’侧。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述分子标签的所述试剂包含蛋白。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述蛋白是抗体。
38.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述分子标签的所述试剂包含核酸。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述核酸是DNA。
40.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述分子标签的所述试剂包含小分子。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中来自所述生物样品的所述分析物与疾病或病症相关。
42.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中来自所述生物样品的所述分析物包含突变。
43.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中来自所述生物样品的所述分析物包含单核苷酸多态性(SNP)。
44.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中来自所述生物样品的所述分析物包含三核苷酸重复。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述组织样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织样品、新鲜的或冷冻的组织样品。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述组织样品是FFPE组织样品，并且所述组织样品是去交联的。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中将所述生物样品预先染色。
49.根据权利要求48所述的方法，其中使用苏木精和曙红(H&E)将所述生物样品预先染色。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中使用免疫荧光法或免疫组织化学法将所述生物样品预先染色。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含使所述生物样品与透化试剂接触。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述生物样品是透化过的生物样品，其已经用透化试剂透化过。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述透化试剂选自有机溶剂、去污剂和酶或它们的组合。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述透化试剂是肽链内切酶或蛋白酶。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述肽链内切酶是胃蛋白酶。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述肽链内切酶是蛋白水解酶K。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包含扩增特异性地结合所述捕获结构域的所述连接的探针的全部或部分。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述扩增是等温的。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述扩增不是等温的。
60.根据权利要求58或59中任一项所述的方法，其中扩增产物包含(i)特异性地结合所述捕获结构域的所述连接的探针的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其互补序列。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包含测序。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述分析物是RNA。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
64.一种用于在空间阵列上富集靶核酸的方法，所述方法包含：
(a)在所述空间阵列上提供生物样品；
(b)向所述空间阵列添加多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述空间阵列上的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；
(c)使不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；
(d)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物；和
(e)扩增剩余的核酸以富集所述靶核酸。
65.一种用于在空间阵列上耗竭不希望的RNA分子的方法，所述方法包含：
(a)在所述空间阵列上提供生物样品；
(b)向所述空间阵列添加多个不希望的RNA耗竭探针，其中所述多个不希望的RNA耗竭探针中的一个不希望的RNA耗竭探针与所述空间阵列上的一个不希望的RNA分子的序列基本上互补；
(c)使不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA杂交；以及
(d)除去所述多个不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物以耗竭所述不希望的RNA分子。
66.根据权利要求27-65中任一项所述的方法，其中所述不希望的RNA耗竭探针是DNA探针。
67.根据权利要求66所述的方法，其中杂交步骤包含使所述DNA探针与所述不希望的RNA分子杂交，这产生RNA：DNA杂交体。
68.根据权利要求27-67中任一项所述的方法，其中除去步骤包含使所述不希望的RNA耗竭探针与核糖核酸酶接触。
69.根据权利要求27-69中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶H1。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶H2。
72.根据权利要求69所述的方法，其中所述RNA酶H是热稳定的RNA酶。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述不希望的RNA耗竭探针与所述生物样品中的所述不希望的RNA分子的全部或部分序列基本上互补。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中至少一个不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子的序列的基本上一个或多个部分特异性地杂交。
75.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中至少一个不希望的RNA耗竭探针与所述不希望的RNA分子的基本上整个全长序列特异性地杂交。
76.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述不希望的RNA分子是转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)或其任意组合。
77.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述不希望的RNA分子是线粒体RNA、核RNA或细胞质RNA。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述不希望的RNA耗竭探针进一步包含捕获部分，其中除去步骤包含使用特异性地结合所述捕获部分的捕获部分结合剂。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述捕获部分是抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、生物素或荧光团。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述捕获部分是生物素。
81.根据权利要求78所述的方法，其中所述捕获部分包含小分子、核酸或碳水化合物。
82.根据权利要求78-81中任一项所述的方法，其中所述捕获部分位于所述不希望的RNA耗竭探针中的结构域的5’或3’侧。
83.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述捕获部分的捕获部分结合剂包含蛋白。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述蛋白是抗体。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述蛋白是抗生蛋白链菌素。
86.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包含核酸。
87.根据权利要求86中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA。
88.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂包含小分子。
89.根据权利要求78-88中任一项所述的方法，其中特异性地结合所述捕获部分的所述捕获部分结合剂附着至基质。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述基质是珠子。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述珠子是磁珠。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述捕获部分是生物素并且所述捕获部分结合剂是抗生蛋白链菌素，其中所述抗生蛋白链菌素附着至磁珠，所述磁珠允许从所述生物样品中通过磁性除去不希望的RNA耗竭探针-不希望的RNA复合物。
93.包含多个捕获探针的空间阵列，其中所述捕获探针能够与根据权利要求1-26所述的连接的探针杂交。
94.根据权利要求93所述的空间阵列，其中所述捕获探针进一步包含功能序列，其中所述功能序列是引物序列或其互补序列。
95.根据权利要求94所述的空间阵列，其中所述捕获探针进一步包含独特分子序列或其互补序列。
96.根据权利要求95所述的空间阵列，其中所述捕获探针进一步包含额外的引物结合序列或其互补序列。
97.一种试剂盒，其包含
(a)包含多个捕获探针的阵列；
(b)多个探针寡核苷酸，其包含第一探针寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列基本上互补，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，所述结构域能够结合所述捕获探针的捕获结构域；
(c)多个酶，所述酶包含核糖核酸酶和连接酶；和
(d)关于使用所述试剂盒的说明书。
98.根据权利要求97所述的试剂盒，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H。
99.根据权利要求97或98所述的试剂盒，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
100.根据权利要求99所述的试剂盒，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶2(Rnl2)连接酶。
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