CN103937899B - 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法 - Google Patents

用于基于aflp的高通量多态性检测的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103937899B
CN103937899B CN201410177894.1A CN201410177894A CN103937899B CN 103937899 B CN103937899 B CN 103937899B CN 201410177894 A CN201410177894 A CN 201410177894A CN 103937899 B CN103937899 B CN 103937899B
Authority
CN
China
Prior art keywords
joint
sequence
aflp
restriction fragment
connection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410177894.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103937899A (zh
Inventor
M·J·T·范艾克
A·P·索伦森
M·G·M·范施里克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keygene NV
Original Assignee
Keygene NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37834098&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN103937899(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Keygene NV filed Critical Keygene NV
Publication of CN103937899A publication Critical patent/CN103937899A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103937899B publication Critical patent/CN103937899B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

本发明涉及用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法，其用于高通量发现、检测和基因分型一个或多个样品中一个或多个遗传标记的方法，其包括步骤：限制性内切核酸酶消化DNA、接头‑连接、任选的预扩增、选择性扩增、混合集中扩增产物、测序具有足够冗余度的所述文库、聚簇分析，接着鉴定所述文库内和/或文库之间的遗传标记，并确定所述遗传标记的(共)显性的基因分型。本发明提供方法或策略，其组合AFLP的功效和一般适用性与某些高通量测序技术以建立一般可适用的多态性评分系统。在该策略中，也解决了抽样变异的问题，确保基因分型具有高精确度和最佳化数据集具有最少量的遗漏基因分型的概率。

Description

用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法
本申请是申请号为200680051561.8，申请日为2006年12月20日，发明名称为“用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及分子生物学和和遗传学领域。本发明涉及快速发现、检测和大规模基因分型核酸样品中或样品之间的多态性。鉴定的多态性可用作遗传标记。
背景技术
科学的、特别是医学的团体长期期望研究基因组DNA。基因组DNA在鉴定、诊断和治疗疾病比如癌症和阿尔茨海默病中起关键作用。除了疾病鉴定和治疗之外，基因组DNA的研究可在植物和动物繁殖努力中提供重要的优点，其可提供世界上对食品和营养品问题的答案。
已知许多疾病与特定的遗传组分、特别地与特定基因中的多态性相关。目前，大样品比如基因组的多态性的鉴定是一项艰巨和耗时的工作。然而，这样的鉴定对领域比如生物医学研究、开发药品、组织分型、基因分型和人口研究有很大的价值。
标记，即遗传标记，已被用作遗传分型方法很长时间，即将表型性状同DNA(基因)的特定部分的存在、不存在或量相连接。最多用途的遗传分型技术之一是AFLP，其已经使用了许多年，广泛适用于任何生物体(对于综述，参见Savelkoul等，J.Clin.Microbiol,1999,37(10),3083-3091；Bensch等，Molecular Ecology,2005,14,2899-2914)。
从AFLP技术在九十年代初期发明以来，已经发现AFLP技术(Zabeau&Vos,1993；Vos等人，1995)广泛用于植物育种及其它领域。这应归于AFLP的一些特征，其中最重要的是不需要现有序列信息以可重现的方式产生大量遗传标记。而且，选择性扩增(AFLP的基石)的原理保证了可以使扩增片段的数量符合检测系统的分辨率，与基因组大小或来源无关。
AFLP片段的检测通常通过在平板-凝胶上的电泳(Vos等人，1995)或毛细管电泳(van der Meulen等人，2002)进行。以这种方式评分的大多数AFLP标记表示(单一核苷酸)存在于用于AFLP模板制备的限制性内切酶识别位点或选择性AFLP引物覆盖的其旁侧核苷酸(flanking nucleotides)的多态性。其余的AFLP标记为在限制性片段的内部序列中出现的插入/缺失多态性和在小的限制性片段(<约100bp)中出现的单核苷酸取代的非常小的部分，对于这些片段，其可引起在两个等位基因之间可重现的迁移率变化；这些AFLP标记能被共显性地(co-dominantly)评分而不用必须依赖于带的强度。
因此，在典型的AFLP指纹图谱中，所述AFLP标记占扩增片段的小部分(小于50百分比，但通常小于20百分比)，而其余的通常被称为恒定的AFLP片段。然而，后者在凝胶评分过程中有用，因为它们起用于计算AFLP标记的片段迁移率和辅助定量用于共显性评分的标记的定位点的作用。目前，AFLP标记的共显性评分(纯合性或杂合性评分)只限于采集分离种群指纹的范围中。在没有联系的系的小组中，仅仅显性评分是可能的。
尽管由于在扩增和检测步骤中高倍增水平引起AFLP的通量非常高，速率限定步骤是电泳的分辨力。基于限制性内切酶组合(EC)、引物组合(PC)和迁移率，电泳允许独特鉴定大多数扩增片段，但理想地，所述检测系统应当能够测定扩增片段的全部序列以获得所有的多态性。
通过测序代替迁移率测定的检测将增加通量，因为：
1)将在大多数(或所有的)扩增片段中检测到位于内部序列的多态性；这将相当大地增加每个PC标记的数量。
2)由于AFLP标记和恒定的条带的共迁移不会引起AFLP标记损失。
3)共显性评分不依赖于定量带强度，且与个体指纹图谱的亲缘关系无关。
迄今为止，通过测序检测AFLP标记/序列还不是经济可行的，因为，包括其它的限制，Sanger双脱氧法测序技术及其它常规测序技术的费用限制。
因此，本发明的一个目标是提供基于测序来检测AFLP标记物或其它的遗传标记比如SNP标记的经济可行的方法。
与经由用于基因分型(即诊断)目的的测序来检测许多包含AFLP或SNP的片段进一步相关的重要问题是抽样变异问题。特别地，这指当分析许多片段和没有观察到特定片段时，人们不得不确定这不是由于没有在检测步骤中抽样涉及的片段，尽管它们存在于所述片段混合物中，因为这将引起标记的假阴性评分。该限制不能应用到电泳检测，因为在凝胶上位置信息是有用的。
因此，本发明的进一步的目标之一是提供解决抽样变异问题或至少减少由抽样变异引起的误差至可接受的最少值的方法。
发明内容
本发明人已经发现在用于高通量测序的某些调整的步骤中借助于AFLP的测序可以检测AFLP和SNP标记。因此，本发明提供方法或策略，其组合AFLP的功效和一般适用性与某些高通量测序技术以建立一般可适用的多态性评分系统。在该策略中，也解决了抽样变异的问题，确保基因分型具有高精确度和最佳化数据集具有最少量的遗漏基因分型的概率。
定义
在下述说明书和实施例中，使用了许多术语。为了提供对包括这类术语给出的范围的说明书和权利要求书清楚一致的理解，提供下述定义，除非本文另有定义，使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。将所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献公开的内容以其全部引入本文作为参考。
多态性：多态性指在种群中存在核苷酸序列的两种或多种变体。多态性可包括一个或多个碱基变化、插入、重复或缺失。多态性包括例如单一序列重复(SSR)和单一核苷酸多态性(SNP)，其为当单一核苷酸：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)被改变时出现的变异。变异通常必须出现在至少1％的种群中才被认为SNP。SNP构成例如90％的所有人类遗传变异，且沿着人类基因组的每100至300个碱基出现。每三个SNP中两个用胸腺嘧啶(T)取代了胞嘧啶(C)。在例如人类或植物的DNA序列中的变异可以影响它们怎样处理疾病、细菌、病毒、化学品、药物等。
核酸：根据本发明的核酸可包括任何嘧啶和嘌呤碱基的聚合物或低聚物，所述碱基分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，和腺嘌呤及鸟嘌呤(参见，Albert L.Lehninger,Principles of Biochemistry,at 793-800(Worth Pub.1982)，将其全部内容引入本文作为参考用于所有目的)。本发明考虑了脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核苷酸组分，和其任何化学变体，比如这些碱基的甲基化的、羟甲基化的或糖基化的形式等。所述聚合物或低聚物在组成上可以是异源的或同源的，且可以是从天然存在的来源分离的或可以是人工或合成产生的。而且，所述核酸可以是DNA或RNA或其混合物，且其可以以单链或双链形式永久或瞬间存在，所述双链形式包括同源双链、异源双链和杂交体状态。
复杂性降低：术语复杂性降低用于表示其中核酸样品比如基因组DNA的复杂性通过产生样品亚型而降低。该亚型可以是整体(即复合物)样品的代表，且优选可重现的亚型。可重现的在本文中指当使用相同方法降低相同样品的复杂性时，获得相同的或至少可比较的亚型。用于复杂性降低的方法可以是本领域已知的用于复杂性降低的任何方法。用于复杂性降低的方法的优选的实例包括例如(Keygene N.V.，荷兰；参见例如EP 0 534858、US6045994)，Dong公开的方法(参见例如WO 03/012118、WO 00/24939)，索引的链接(indexed linking)(Unrau等人，见下文)，接头-PCR(linker-PCR)(WO90/008821)和SALSA-PCR(WO00/23620)Schouten等人)等。本发明使用的复杂性降低法具有它们是可重现的共同点。可重现的指当相同样品以相同方式降低复杂性时，获得样品的相同亚型，与更随机的复杂性降低比如显微切割或使用mRNA(cDNA)相反，所述mRNA代表了在选择的组织中转录的基因组部分，且其重现性取决于组织的选择、分离时间等。
AFLP：AFLP指用于选择性扩增DNA的方法，其基于用一种或多种限制性内切酶消化核酸以提供限制性片段，连接接头(adaptors)至限制性片段，并用至少一个引物扩增所述接头-连接的限制性片段，所述引物与所述接头(部分)互补，(部份)互补于限制性内切酶的剩余部分，且进一步包含至少一个从A、C、T或G(或U，视情况而定)中随机选择的核苷酸。AFLP不需要任何现有的序列信息，且可以在任何起始DNA上进行。通常，AFLP包括下述步骤：
(a)用一种或多种特异性限制性内切酶消化核酸，特别是DNA或cDNA，以将DNA片段化成相应系列的限制性片段；
(b)连接由此得到的限制性片段与双链的合成寡核苷酸接头，其中一个末端适合于限制性片段的一个或两个末端，从而生成接头-连接的、优选标记的、起始DNA的限制性片段；
(c)在杂交条件下，将一个或多个在其3’-末端包含选择性核苷酸的寡核苷酸引物接触接头-连接的、优选标记的限制性片段；
(d)通过PCR或类似的技术扩增与引物杂交的接头-连接的、优选标记的限制性片段，以便进一步使杂交的引物沿着起始DNA的限制性片段与引物杂交的方向伸长；和
(e)检测、鉴定或回收由此获得的扩增的或伸长的DNA片段。
因此，AFLP提供接头-连接的片段的可重现的亚型。AFLP公开在EP 534858、US6045994和在Vos等人文章中。参照这些出版物可进一步了解关于AFLP的细节。AFLP通常用作复杂性降低技术和DNA指纹图谱技术。在AFLP作为指纹图谱技术的用途的内容中，已经发展了AFLP标记的概念。
AFLP标记：AFLP标记是扩增的接头-连接的限制性片段，其在使用AFLP(指纹图谱)、使用相同类的引物扩增的两种样品间不同。因而，可将存在或不存在该扩增的接头-连接的限制性片段作为与性状或表型相关的标记。在常规凝胶技术中，AFLP标记显示为以一定的迁移率位于凝胶中的条带。其它的电泳技术比如毛细管电泳可能不将此表示为条带，但该概念仍相同，即具有一定长度和迁移率的核苷酸。存在或不存在条带可以指示(或与其相关)存在或不存在表型。AFLP标记典型地包括在内切核苷酸酶限制位点中的SNP或选择性核苷酸。有时，AFLP标记可包括在限制性片段中的indel。
SNP标记：SNP标记为基于在某一位点鉴定的单核苷酸多态性的标记。SNP标记可以位于与AFLP标记相同的位置，但是SNP标记也可以位于限制性片段本身中。因而，SNP标记属包括AFLP标记种。
恒定的条带：在AFLP技术中恒定的条带为扩增的接头-连接的限制性片段，其在样品之间相对不变。因此，在AFLP技术中恒定的条带将在样品范围内表现在凝胶中大约相同位置，即具有相同的长度/迁移率。在常规AFLP中，这些典型地用于固定相应于凝胶中样品的泳道或用毛细管电泳检测的多种AFLP样品的电泳图谱。典型地，恒定的条带比AFLP标记提供的信息更少。然而，因为AFLP标记惯常包括在选择核苷酸或限制性位点中的SNP，恒定的条带可包括在限制性片段本身中的SNP，导致恒定的条带成为与AFLP标记互补的遗传信息的感兴趣的另一个来源。
选择性碱基：位于引物的3’末端，其包含与接头互补的部分，和与限制性位点的剩余部分互补的部分，所述选择性碱基随机选自A、C、T或G。通过用选择性碱基延伸引物，随后的扩增将仅获得接头-连接的限制性片段的可重现的亚型，即仅有可以使用含有所述选择性碱基的引物扩增的片段。可以将数目在1至10之间改变的选择性核苷酸加入到引物的3’末端。典型地，1-4足够了。两种引物均可包含可变数量的选择性碱基。通过每一个加入的选择性碱基，亚型以大约4的因子降低了亚型中扩增的接头-连接的限制性片段的量。典型地，在AFLP中使用的选择性碱基的数量由+N+M表示，其中一个引物载有N个选择性核苷酸，而另一个引物载有M个选择性核苷酸。因此，Eco/Mse+1/+2AFLP为如下的速记：用EcoRI和MseI消化起始DNA，连接适合的接头，并用一个定向到载有一个选择性碱基的EcoRI限制性位点的引物和另一个定向到载有2个选择性核苷酸的MseI限制型位点的引物扩增。
聚簇分析：术语“聚簇分析”指基于同样或类似核苷酸的短的或长的片段的存在比较两种或多种核苷酸序列。用于比对核苷酸序列的几种方法是本领域已知的，如下述进一步阐述的。有时，术语“装配”或“比对”作为同义词使用。
标记：可以加入到引物或包括在其序列或用作标记以提供独特标识符的短序列。这样的序列标识符可以是可变但确定长度的独特碱基序列，其特别地用于鉴定特定的核酸样品。例如，4bp标记允许4(4次方)＝256个不同的标记。典型的实例为ZIP序列，其为本领域已知的通常用于杂交的独特检测的标记(Iannone等，Cytometry 39:131-140，2000)。使用这样的标记，可以通过进一步的加工确定PCR样品的起点。在组合来源于不同核酸样品的加工产物的情况中，通常使用不同的标记鉴定不同的核酸样品。在本发明的情况下，加入独特序列标记有助于鉴定序列扩增产物群中个体植物的配位。可以使用多个标记。
标记：术语标记指将标记加入到核酸样品中，以便能够使其与第二个或进一步的核酸样品区别。标记可以例如通过在复杂性降低期间加入序列标识符或通过本领域已知的任何其它方式进行。这样的序列标识符可以例如是可变但确定长度的独特碱基序列，其特别地用于鉴定特定的核酸样品。其典型的实例是例如ZIP序列。使用这样的标记，可以通过进一步的加工确定样品的起点。在组合来源于不同核酸样品的加工产物的情况中，应当使用不同的标记鉴定不同的核酸样品。
标记的文库：术语标记的文库指标记的核酸的文库。
测序：术语测序指测定核酸样品例如DNA或RNA中核苷酸的顺序(碱基顺序)。
高通量筛选：高通量筛选通常缩写为HTS，是用于科学实验的方法，特别地与生物学和化学领域有关。通过组合现代机器人学及其它专门的实验室硬件，其允许研究人员同时有效地筛选大量样品。
限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶或限制酶为识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列(目标位点)，并且将在每个目标位点切割DNA分子双链的酶。
限制性片段：由限制性核酸内切酶消化产生的DNA分子被称为限制性片段。任何给出的基因组(或核酸，不考虑其起源)都将被特定的限制性核酸内切酶消化成分离的限制性片段。由限制性核酸内切酶裂解得到的DNA片段可以进一步用于各种技术，并可以例如用凝胶电泳检测。
凝胶电泳：为了检测限制性片段，可能需要基于大小的分级双链DNA分子的分析方法。用于获得这样的分级最通常使用的技术是(毛细管)凝胶电泳。DNA片段在这样的凝胶中运动的速率取决于其分子量；因此，当片段长度增加时移动距离减少。如果包括在图像中的片段的数量足够少，可以通过染色步骤例如银染色法或使用溴乙锭染色直接显影由凝胶电泳分级的DNA片段。DNA片段的可选地进一步的处理包括片段中可检测的标签，比如荧光团或放射性标签。
连接：由其中两个双链DNA分子共价结合在一起的连接酶催化的酶促反应被称为连接。通常，两个DNA链共价结合在一起，但也有可能通过化学或酶修饰所述链的一个末端阻止了两个链中一个的连接。在那种情况下，共价结合将仅仅出现在两个DNA链的一个中。
合成寡核苷酸：可以化学合成的、具有优选约10至约50个碱基的单链DNA分子被称为合成寡核苷酸。通常，这些合成DNA分子被设计成具有独特或期望的核苷酸序列，尽管有可能合成具有相关序列的分子家族，并且其在核苷酸序列内特定位置具有不同的核苷酸组分。术语合成寡核苷酸通常用来指具有设计的或期望的核苷酸序列的DNA分子。
接头：具有有限碱基对的短双链DNA分子，例如长度为约10至约30个碱基对，如此设计使其可以连接到限制性片段的末端。接头通常由两个具有彼此部分互补的核苷酸序列的合成寡核苷酸组成。当在适当条件下的溶液中混合所述两个合成寡核苷酸时，它们将彼此退火形成双链结构。在退火后，接头分子的一个末端被设计成使其适合限制性片段的末端，且可以与其连接；接头的另一个末端被设计成使其不能连接，但这不必是所述的情况(双连接的接头)。
接头-连接的限制性片段：已经被接头封端(capped)的限制性片段。
引物：通常术语引物指可以启动DNA合成的DNA链。DNA聚合酶不能在没有引物下新合成DNA：其只能延伸反应中的现有DNA链，其中互补链用作模板以指导要装配的核苷酸顺序。我们指在聚合酶链式反应(PCR)中作为引物的合成寡核苷酸分子。
DNA扩增：术语DNA扩增典型地用于表示使用PCR体外合成双链DNA分子。请注意，存在其它扩增方法，它们可以用于本发明中而不背离其要旨。
选择性杂交：涉及在严格的杂交条件下的杂交，在所述杂交条件下，核酸序列杂交至特定核苷酸目标序列比其杂交至非目标核苷酸序列到可检测的更大程度(例如，至少是背景的2倍)并到基本排除非目标核酸序列的程度。术语“严格条件”或“严格的杂交条件”包括提到的在其中将探针杂交至其目标序列比杂交至其它序列的可检测的程度更大(例如，是背景的至少2倍)的条件。严格条件是依赖序列的，其在不同的环境中不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以识别与探针100％互补(同源探测)的目标序列。可选地，可以调节严格条件以允许序列中的某些错配以便检测到较低的相似度(异源探测)。通常，探针小于约100个核苷酸长度，任选地仅仅50或25个核苷酸长度。典型地，严格条件为其中盐浓度为在pH 7.0至8.3下小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，和对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，和对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60℃的那些。严格条件也可以通过加入不稳定剂(destabilisingagent)比如甲酰胺获得。示例性的低严格条件包括在37℃的30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％的SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中杂交和在50至55℃的1*至2*SSC(20*SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃的40至45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交和在55至60℃的0.5*至1*SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃的50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交和在60至65℃的0.1*SSC中洗涤。特异性是典型地杂交后洗涤的功能，关键因素是后期洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以近似来自Meinkoth和+Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284(1984)的等式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M为一价阳离子的摩尔浓度，％GC为鸟苷和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分数，％甲酰胺为甲酰胺在杂交溶液中的百分数，和L为碱基对中杂种的长度。Tm为其中50％的互补目标序列杂交至完全匹配的探针的温度(在确定的离子强度和pH下)。对于1％的错配，Tm降低了约1℃；因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交到具有期望同一性的序列。例如，如果寻求具有>90％同一性的序列，Tm可以降低10℃。通常，对于特定的序列及其补链，在确定的离子强度和pH下，选择严格条件为比热熔点(Tm)低约5℃。然而，非常严格条件可以利用比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组合物和期望的Tm，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严格性方面的变化是固有描述的。如果期望的错配度引起小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，则优选增加SSC浓度以便可以使用较高的温度。核酸杂交的广泛指导可在Tijssen,LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation with NucleicAcid Probes,Part 1，2章“Overview of principles of hybridisation and thestrategy of nucleic acid probe assays",Elsevier,N.Y.(1993)；和CurrentProtocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel,等，编，Greene Publishing andWiley-Interscience,New York(1995)中找到。
附图说明
图1A：显示了根据本发明的退火到珠粒(‘454珠粒’)上的片段和用于预扩增两个胡椒系的引物的序列。‘DNA片段’表示在用限制性核酸内切酶消化后得到的片段，‘主基因接头’表示为用于产生文库的(磷酸化的)寡核苷酸引物提供退火位点的接头，‘KRS’表示标识符序列(标记)，‘454SEQ接头’表示测序接头，和‘454PCR接头’表示允许乳剂扩增(emulsion amplification)DNA片段的接头。所述PCR接头允许退火至珠粒和扩增，其可包含3’-T突出。
其中，用于预扩增PSP-11的引物组I
E01LKRS1 5’-CGTCAGACTGCGTACCAATTCA-3’[SEQ ID 1]
M15KKRS1 5’-TGGTGATGAGTCCTGAGTAACA-3’[SEQ ID 2]
用于预扩增PI201234的引物组II
E01LKRS2 5’-CAAGAGACTGCGTACCAATTCA-3’[SEQ ID 3]
M15KKRS2 5’-AGCCGATGAGTCCTGAGTAACA-3’[SEQ ID 4]
图1B：显示了用在复杂性降低步骤中的引物示意图。这样的引物通常包括如(2)指示的识别位点区域、如(1)指示的可包括标记区的恒定区和如(3)指示的在其3’-末端的选择性区域中的一个或多个选择性核苷酸。
图2A和图2B：显示了在1％琼脂糖凝胶上的DNA质量控制。其中，图2A为短的凝胶电泳；图2B为长的凝胶电泳。其中，1:1kb梯度；2：样品1，表示PSP11；3：样品2，表示PI201234；4:50ng DNA、5:100ng DNA、6:250ng DNA和7：500ng DNA分别表示用于评价样品1和样品2的DNA数量的50ng、100ng、250ng和500ng。
图2C和图2D：显示了使用Nanodrop分光光度法的DNA浓度测定。其中图2C是样品1浓度；图2D是样品2浓度。
图3A和图3B：显示了实施例3的中间体在1％琼脂糖凝胶上的DNA质量控制。图3A是短的凝胶电泳，图中数字表示：Nr.1-4：样品1、Nr.5-8：样品2、10:1kb、11:50ng、12:100ng、13:250ng。图3B是长的凝胶电泳，图中数字表示：Nr.1-4：样品1、Nr.5-8：样品2、10:1kb；11:50ng；12:100ng；13:250ng。
图4A和图4B：其中，图4A显示了序列数据加工流水线的流程图，即自测序数据产生到推定的SNP、SSR和indel的鉴定的步骤，经由在整理&标记中除去已知序列信息的步骤，通过该步骤得到整理的序列数据在聚簇分析和装配所述数据以得到重叠群和单元素(重叠群中不能装配的片段)后鉴定和评价推定的多态性。图4B进一步详述了采集(mining)多态性的方法，包括多态性采集和质量分配过程。
图5：显示了包含推定的单核苷酸多态性(SNP)的胡椒AFLP片段序列的多重对比“10037_CL989contig2”。请注意，SNP(用黑箭头表示)由存在于样品1(PSP11)的两个阅读(read)中的A等位基因和样品2(PI201234)中存在的G等位基因定义，样品1由名为顶端两个阅读的MSl标记的存在表示，样品2由名为底端两个阅读的MS2标记的存在表示。阅读名称显示在左面。该多重对比的共有序列为(5’-3’)：
TAACACGACTTTGAACAAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTAGAACA[A/G]TGTTGGTTTTGGTGCTAACTTCAACCCCACTACTGTTTTGCTCTATTTTTG。
图6：显示了基于观察到的每个基因座的阅读的数量的454基因型正确分类概率的图示。
具体实施方式
在第一个方面，本发明涉及用于高通量发现、检测和大规模基因分型一个或多个样品中一种或多种遗传标记的方法，其包括下述步骤：
(a)提供来自一种或多种样品的DNA；
(b)用至少一种限制性内切酶限制DNA以产生限制性片段；
(c)连接接头与限制性片段，产生接头-连接的限制性片段；
(d)任选地，用至少与接头互补的引物对扩增接头-连接的限制性片段，产生预扩增的接头-连接的限制性片段；
(e)用引物对扩增(任选地预扩增的)接头-连接的限制性片段，其中至少一个引物包含在引物5’端的标识符标记，以为每个样品产生接头-连接的限制性片段的标记扩增亚型文库；
(f)任选地，集中来源于多个样品的文库；
(g)使用高通量测序技术测序该文库；
(h)使用标识符标记聚簇分析每个文库的序列；
(i)通过比较文库内和/或文库之间聚簇分析的序列鉴定遗传标记。
(j)测定一个或多个文库中遗传标记的(共)显性的基因型，优选地对于所有的样品和对于所有鉴定的标记。
所述方法涉及发现、检测和基因分型一个或多个样品中的一个或多个遗传标记。在某些实施方案中，所述方法涉及目标遗传标记的有/没有评分。在某些实施方案中，所述方法涉及测定一个或多个样品的(共)显性的基因型的一个或多个遗传标记。这可能需要标准化观察到的样品之间标记-或标记等位基因序列的数量。
在所述方法的第一个步骤(a)中，提供DNA。这可通过本领域本身已知的方法完成。通常使用本领域常见的方法获得DNA的分离，所述方法比如从种群成员收集组织、DNA萃取(例如使用Q-Biogene快速DNA试剂盒)、定量和标准化以获得每种试样等量的DNA。所述DNA可以来自各种来源(基因组、RNA、cDNA、BAc、YAC等)和生物体(人类、哺乳动物、植物、微生物等)。可以混合集中分离的DNA。
所述DNA在步骤(b)中使用至少一种限制性核酸内切酶限制。根据情况，即基因组的大小，可以使用更多的核酸内切酶。在某些实施方案中，可以使用两种或多种核酸内切酶。对于大多数基因组，2种核酸内切酶足够了，因此，2种是最优选的。在某些实施方案中，特别是对于大的或复杂的基因组，可以使用更多核酸内切酶。优选地，核酸内切酶提供约为250-500bp的相对短的限制性片段，但这不是必需的。典型地，至少一种常见切割核酸内切酶是优选的，即具有4或5个碱基对识别序列的核酸内切酶是优选的。一种这样的酶是MseI，但大量其他的是市售可获得的，且可以使用。可以使用切割其识别序列外部的酶(IIs类型)，或者提供平末端限制性片段的酶。优选的组合使用一种少见的(6个和更多个碱基对识别序列，例如EcoRI)和一种常见的切割酶。
在限制所述混合集中的DNA后或者与其同时，将接头连接至所述限制性片段以提供接头-连接的限制性片段。可以使用一个或多个不同的接头，例如两个接头，一个正向接头，一个反向接头。可选地，对于所有的片段可以使用一个接头，或者可以使用一组接头，其在所述接头的突出端包含核苷酸变换以便提供索引接头(indexing linkers)，其可允许用于预选择步骤(Unrau等，Gene，1994，145，163-169)。可选地，在平末端限制片段的情况下，可以使用平末端接头。接头-连接是本领域所熟知的，且尤其公开在EP 534858中。AFLP技术的一个有用的变体使用非选择性核苷酸(即+0/+0引物)，其有时称为接头PCR。如同SalsaPCR一样，通过利用限制性内切酶提供选择步骤，不同的限制性内切酶获得不同的亚型。这有时也表示为预扩增，其中使用至少与所述接头互补且任选地也与所述限制性核酸内切酶的识别序列剩余部分互补的引物。预扩增可有助于(进一步)标准化来自各个样品的DNA的量，或增加DNA的总量以允许多种分析(即分开样品)和增加信噪比。预扩增也可用于引入允许在选择性扩增之前混合集中的标记。通过在引物的5’末端引入核苷酸标记(例如4bp)，可以标记用于不同样品的限制性片段，并且在该过程结束时可以通过使用标记来检索。
在任选的预扩增之后，在本发明方法的步骤(d)中用一对引物扩增接头-连接的限制性片段。引物之一与所述接头的至少部分互补，且可进一步与所述核酸内切酶的识别序列剩余的部分互补，和可进一步包含在其3’末端的(随机选择的)选择性核苷酸，与在EP534858中公开的类似。优选地，所述引物能够在严格杂交条件下选择性杂交。与上述类似，所述选择性扩增也可以用载有5’标记的引物进行，以鉴别所述样品的来源。结果是扩增的接头-连接的限制性片段的(标记的)亚型的文库。
此时，可以任选地混合集中由多个样品制备的文库中的选择性扩增的片段。这可能对寻求对某些组的样品特异性的标记有用，比如共享某些表型特征的那些。筛选混合集中的样品通常称为分组分析法(BSA；Michelmore,Paran和Kesseli,1991)。在某些实施方案中，还可以在采样阶段的DNA提取之前进行混合集中，减少DNA制品的数量。在PCR扩增之前，DNA的混合集中进一步有助于标准化DNA，以提供在用于测序文库中更平等的表示法(representation)。
现在，使用高通量测序技术测序选择性扩增的接头-连接的限制性片段的，任选混合集中的文库。
测序可以基本上通过本领域已知的任何方法进行，所述方法比如双脱氧链终止法(Sanger测序)。然而，优选和更有利地是使用高通量测序方法进行测序，比如在WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(所有的名称都为454Life Sciences)、Seo等，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:5488-93中公开的方法和Helios,Solexa,美国基因组学的技术等，将其引入本文作为参考。最优选的是使用在WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(所有的名称都为454Life Sciences)中公开的装置和/或方法进行，将其引入本文作为参考。目前公开的技术允许在单次运行中测序至多4千万个碱基，其比基于Sanger测序和使用现用的毛细管电泳仪器比如MegaBACE(GE Healthcare)或ABI 3700(xl)(Applied Biosystems)的竞争性技术快100倍和更加便宜。这将随着每次反应的阅读长度增加和/或平行反应次数增加而增加。所述测序技术大致包括下述5个步骤：1)片段化DNA和连接特定的接头，以建立单链DNA(ssDNA)的文库；2)退火ssDNA至珠粒，在油包水型微型反应器中乳化该珠粒，并进行乳剂PCR以扩增在珠粒上的单个ssDNA分子；3)选择/富集包含在其表面的扩增的ssDNA分子的珠粒；4)在中沉积载有DNA的珠粒；和5)通过产生焦磷酸盐光信号同时在100,000个池中测序。
在优选的实施方案中，所述测序包括下述步骤：
(1)退火测序-接头-连接的片段至珠粒，用单个片段退火每个珠粒；
(2)在油包水型微反应器中乳化所述珠粒，每个油包水型微反应器包括单个珠粒；
(3)进行乳剂PCR以扩增在珠粒表面上的接头-连接的片段；
(4)选择/富集包含扩增的接头-连接的片段的珠粒；
(5)将所述珠粒装填在池中，每个池包括单个珠粒；和
(6)产生焦磷酸盐信号。
在第一个步骤(1)中，将存在于所述接头连接的限制性片段中的接头退火到珠粒。如本文上述公开的，测序接头包括至少用于退火至珠粒的“关键”区域、测序引物区域和PCR引物区域。特别地，现在，扩增的接头-连接的限制性片段在其一个末端包含下述序列：5’-序列引物结合位点---标记---PCR引物序列-3’，而在其另一个末端存在可以是如下的片段：5’-珠粒退火序列---标记---接头特定的序列---限制性位点-特定的序列(任选的)---(随机)选择性序列(任选的)-3’。清楚地，序列引物结合位点和珠粒退火序列可以互换。现在，可以使用该珠粒退火序列退火片段至珠粒，该珠粒在该末端载有核苷酸序列。
因此，将修改的片段退火至珠粒，用单个修改的片段退火每个珠粒。向修改的片段的池中加入过量的珠粒以确保对于大多数珠粒而言每个珠粒有单个修改的片段退火(泊松分布)。.
在优选的实施方案中，为了进一步增加筛选的效率，将PCR产物直接扩增到用于测序的珠粒上是有益的。这可以用接头-加尾的PCR引物进行PCR来实现，所述PCR引物中在MseI(或其它限制性内切酶)侧的接头的一个链与结合至所述序列珠粒的寡核苷酸互补。
在下一步中，在油包水型微型反应器中乳化所述珠粒，每个油包水型微型反应器包括单个珠粒。PCR试剂存在于油包水型微型反应器中，使得PCR反应在微型反应器内发生。接着，破坏所述微型反应器，并富集包括DNA的珠粒(DNA阳性珠粒)。
在下一步中，将所述珠粒装填到池中，每个池包括单个珠粒。所述池优选地为PicoTiterTMPlate的一部分，其允许同时测序大量的片段。
在加入载有酶的珠粒后，使用焦磷酸测序确定所述片段的序列。在连续步骤中，在存在常规测序剂下，使PicoTiterTM Plate和所述珠粒以及其中的酶珠粒接受不同的脱氧核糖核苷酸，和在加入脱氧核糖核苷酸时，产生被记录的光信号。加入正确的核苷酸将产生可以检测到的焦磷酸测序信号。
焦磷酸测序本身是本领域已知的，且特别地公开在www.biotagebio.com；www.pyrosequencing.com/section technology中。所述技术进一步应用在如WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(所有的名称都为454Life Sciences)中，将其引入本文作为参考。
在测序后，可以整理从所述测序步骤中直接获得的片段的序列，优选电子的，以除去任何珠粒退火序列、测序引物、接头或引物-相关的序列信息。
典型地，在已经为任何加入的接头/引物序列进行整理的序列数据上进行比对或聚簇分析，即，仅仅使用来源于所述核酸样品的片段的序列数据和任选的标识符标记。
用于比较目的的比对序列的方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法公开在：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-244；Higgins and Sharp(1989)CABIOS5:151-153；Corpet等，(1988)Nucl.Acids Res.16:10881-90；Huang等，(1992)Computer Appl.inthe Biosci.8:155-65；和Pearson等，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-31,将其引入本文作为参考。Altschul等，(1994)Nature Genet.6:119-29(引入本文作为参考)给出了序列比对方法和同源性计算的详细说明。
NCBI基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)(Altschul等人，1990)可以从几个来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI,Bethesda,Md.)和因特网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx相联系。其可以从<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>进入。如何使用该程序测定序列同一性的说明在
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html>可获得。所述数据库优选地包括EST序列，目标种类的基因组序列和/或GenBank的非冗余序列数据库或类似的序列数据库。
可以如Shendure等，Science，Vol 309，Issue 5741，1728-1732公开的使用高通量测序方法。其实例为微电泳测序、杂交测序/通过杂交测序(SBH)、对扩增分子的环状阵列测序、对单分子的环状-阵列测序，非环状、单分子、实时方法，比如聚合酶测序、核酸外切酶测序、纳米通道(nanopore)测序。
现在可以确定遗传标记和/或对于遗传标记的样品的基因分型在所述文库中的存在。
本发明的方法可用于鉴定、检测基因型测定AFLP标记以及用于鉴定、检测和基因分型包含在恒定的条带中的SNP标记。
为了提供解决抽样差异问题的方法，该问题影响通过测序包含在多个片段文库中的等位(标记)片段来基因分型遗传标记的准确度，本发明人已发现优选地用足够的冗余度(深度)经由测序进行检测AFLP标记以采样所有扩增的片段至少一次，并通过统计学方式完成，其纠正了与所谓的基因分型的准确度有关的抽样变异的问题。而且，正如AFLP评分一样，在分离群体的内容中，在一个实验中同时评分母体个体将有助于测定统计学阈值，因为样品中所有可能的等位基因将以母体1或母体2评分。值得注意的是提出了抽样母体个体比分离群体的个体具有更高的冗余度。
因此，在某些实施方案中，所述标记的扩增的接头-连接的限制性片段的冗余度为至少6，优选至少7，更优选至少8和最优选至少9。在某些实施方案中，测定每个接头-连接的限制性片段的序列至少6倍，优选至少7倍，更优选至少8倍和最优选至少9倍(fold)。在某些实施方案中，如此选择冗余度，假定正确鉴定所述基因座恰是纯合的为50/50的全部概率，则正确识别所述基因座的概率大于95％、96％、97％、98％、99％、99.5％。
在某些实施方案中，样品的数量可以在1至100000间改变，这也主要取决于要分析的基因组的大小和选择性扩增片段的数量。通常，采用的测序技术的容量提供了在这方面最主要的限制因素。
实施例
如下例证所述方法：
1)根据Vos等人修改的试验设计制备AFLP模板，所述试验设计包括在限制和连接步骤之间在80℃热变性20分钟的步骤。在80℃孵育20分钟后，将限制性内切酶消化物冷却至室温，加入DNA连接酶。所述变性步骤引起限制性片段的互补链分离成至多120bp，以使没有接头连接至末端。结果，小于120bp的片段不会被扩增，因而实现了尺寸选择。
2)如果适用，如在常规AFLP中一样进行预扩增反应。
3)使用具有独特标识符标记的AFLP引物对在种群/实验中的每个样品进行最后的(选择性)扩增步骤，(使用独特4bp标识符序列：KIS)。所述KIS位于选择性AFLP引物的5’末端。与在用电泳的常规AFLP检测中所用的选择性碱基的数量相比较，使用一种额外的选择性核苷酸，例如在胡椒中，EcoRI/MseI的指纹图谱为+4/+3(凝胶检测+3/+3)和在玉米中，EcoRI/MseI的指纹图谱为+4/+4(凝胶检测+4/+3)。需要用经验确定采用的选择性核苷酸的数量；因此，可以使用与用于凝胶检测的选择性核苷酸相同数量的选择性核苷酸。该数量进一步取决于包括在实验中的样品的数量，因为按测序技术的当前现状，序列迹线的数量假定为固定在200,000，但这可以和可能增加。优选的起始点将获得每种试样文库的AFLP片段的10倍采样。
4)使根据步骤1-4制备的样品的集合进行经由454Life Sciences技术的测序。这是指个体AFLP片段在珠粒上克隆、PCR扩增和测序。预期产出200,000个100bp长度的序列。对于100个样品的集合，这等于平均2000个序列迹线/样品，可经由5’标记追踪样品nr。
5)假定当与凝胶检测使用的数目相比使用1个额外的选择性核苷酸时，每个PC扩增100个AFLP片段，其中百分之九十是恒定的条带，以每个片段20倍平均冗余度采样AFLP片段。然而，因为测序是不定向的且大多数条带为>200bp，对于各个片段末端，测序冗余度将稍高于10倍。
6)使用KRS标记聚簇分析每个试样的所有序列。给出10倍过量的抽样，这是指对于每种试样预期200个不同的序列迹线，代表200x100bp＝20kb序列/样品。当这些序列的百分之十来源于AFLP标记(即扩增1个等位基因，另一种在PCR反应中不存在)时，百分之九十(18kb)的序列来源于恒定的条带。
7)评分两个类型的遗传标记：
A)AFLP标记：这些是在一些样品中观察到，但在其他样品中不存在的序列。
对样品集合中序列频率的检查将揭示出该种类。根据在每个样品中存在/不存在这些序列的观察进行显性的评分。AFLP标记的可靠评分需要设定用其在试验中观察其它AFLP序列的频率的统计学阈值。即，如果在样品中观察到AFLP标记序列，则可以评分AFLP标记存在(显性基因)，但不存在评分的可靠性取决于(恒定的)AFLP片段的(平均)频率。需要统计学阈值水平，以便进行存在/不存在评分，其具有优选至少99.5％的准确度，取决于特定应用需要的可接受的水平。如果分析分离的种群及其母体，也可以通过定义所述标记序列的频率种类来共显性评分这些标记。后者可能实际上受到样品之间不同的AFLP标记的抽样变异的影响而变得复杂。
B)在恒定的AFLP片段中的(SN)多态性
这是最感兴趣的(和大量的)遗传标记的种类。主要的是将包含在恒定的AFLP片段内部序列中的SNP标记作为共显性SNP标记评分。再次，这优选地需要应用用于精确地点出存在或不存在等位基因的统计学阈水平。预期所述片段文库的10倍序列冗余度是足够的，但依赖于观察到的各个等位基因序列数量，需要统计分析法来确定SNP标记基因型的准确度。其基本原理是，当恒定的条带包含SNP且观察到一种等位基因例如5次，同时没有观察到(所述序列包含)其它等位基因时，高度可能的是所述样品对观察的等位基因是纯合的。因此，当观察到两个等位基因时，该样品被评分为对于SNP标记是杂合的，与其频率无关。
8)结果将是基因分型表，其包含(共)显性评分的AFLP标记和共显性评分的SNP的基因型，和用于校正所有标记的基因型的概率。可选地，产生数据集，其包含超过设定的统计学阈水平的基因型。
所述方法假定每种试样10倍过量的AFLP片段采样，获得18kb的恒定序列/样品和2kb的AFLP标记序列。
观察到的遗传标记的数量取决于研究的种质中的SNP比率。下面，以不同种质的SNP比率提供当采样20kb序列时，估计的遗传标记数量。AFLP标记/片段的平均长度假定为200bp：
表1、通过使用454Life sciences技术测序AFLP片段评分的遗传标记的期望数目，假定10倍过量的采样量、200000个序列迹线、百分之九十恒定的条带/百分之十AFLP标记，在各种SNP比率。
*当可以从两个末端测序AFLP片段时，观察的SNP的比例可以来源于相同的基因座。
重要的是应注意在表1中提供的数字是平均数，其可能在不同的引物组合之间不同。与常规AFLP分型类似，顶端引物组合(PC)的鉴定可提供每个PC较高量的标记。而且，为了获得所要求的准确度水平，在表1中列出的数字可以根据需要的过量采样所需的水平改变。
校正分类所述基因型的计算如下：
P(校正值)＝P(aa)+P(AA)+P(Aa)*[1-0.5*exp(n-1)]
其中P(aa)为具有基因型aa的种群的部分(在随附图表的图6中)，设定为0.25。P(AA)为具有基因型AA的种群的部分，设定为0.25。P(Aa)为具有基因型Aa的种群的部分(在图6和下表中，设定为0.5。n等于个体数量。
表
实施例1胡椒
通过利用AFLP主基因识别位点特异性引物，使用来自胡椒系PSP-11和PI201234的DNA产生AFLP产物。(这些AFLP引物基本上与常规AFLP引物相同，例如在EP 0 534 858中公开的，并且通常将包含识别位点区域、恒定区域和一个或多个在选择性区域的选择性核苷酸。)
在37℃，用限制性核酸内切酶EcoRI(5U/反应)和MseI(2U/反应)消化来自胡椒系PSP-11或PI201234的150ng的DNA 1小时，接着在80℃灭活10分钟。将双链的合成寡核苷酸接头与得到的限制性片段连接，其一个末端适合EcoRI和/或MseI限制性片段的一个或两个末端。将所述限制连接混合物稀释10倍，用EcoRI+1(A)和MseI+1(C)引物(设置I)预扩增(2)5微升的各个样品。在扩增后，在1％琼脂糖凝胶上检验两个胡椒样品的预扩增产物的性质。将该预扩增产物稀释20倍，然后用KRSEcoRI+1(A)和KRSMseI+2(CA)AFLP预扩增。在下述引物序列SEQ ID 1-4中，在KRS(标识符)区段加下划线，并粗体表示在3’-末端的选择性核苷酸。在扩增后，在1％琼脂糖凝胶上和通过EcoRI+3(A)和MseI+3(C)(3)AFLP指纹图谱(4)检验两个胡椒样品的预扩增产物的性质。分别在QiagenPCR柱(5)上纯化两个胡椒系的预扩增产物。在ND-1000分光光度计上测定所述样品的浓度。混合总共5微克的PSP-11和5微克的PI201234PCR产物，并测序。
用于预扩增PSP-11的引物组I
E01LKRS1 5’-CGTCAGACTGCGTACCAATTCA-3’[SEQ ID 1]
M15KKRS1 5’-TGGTGATGAGTCCTGAGTAACA-3’[SEQ ID 2]
用于预扩增PI201234的引物组II
E01LKRS2 5’-CAAGAGACTGCGTACCAATTCA-3’[SEQ ID 3]
M15KKRS2 5’-AGCCGATGAGTCCTGAGTAACA-3’[SEQ ID 4]
(1)EcoRl/MseI限制连接混合物
限制混合物(40ul/样品)
在37℃下孵育1小时
加入：
连接混合物(10μl/样品)
在37℃下孵育3小时
EcoRI-接头
91M35/91M36：*-CTCGTAGACTGCGTACC:91M35[SEQ ID 5]
±bio CATCTGACGCATGGTTAA:91M36[SEQ ID 6]
MseI-接头
92A18/92A19:5-GACGATGAGTCCTGAG-3:92A18[SEQ ID 7]
3-TACTCAGGACTCAT-5:92A19[SEQ ID 8]
(2)预扩增
预扩增(A/C):
预扩增热轮廓
以50μl的反应量进行选择性预扩增。在PE GeneAmp PCR System 9700中进行PCR，并且进行30轮以94℃变性30秒步骤开始，然后进行56℃60秒的退火步骤和72℃60秒的延伸步骤的轮廓。
EcoRI+1(A)1
E01L 92R11:5-AGACTGCGTACCAATTCA-3[SEQ ID 9]
MseI+1(C)1
M02k 93E42:5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3[SEQ ID 10]
预扩增A/CA:
以50μl的反应量进行选择性预扩增。在PE GeneAmp PCR System 9700中进行PCR，并且进行30轮以94℃30秒变性步骤开始，然后进行56℃60秒退火步骤和72℃60秒延伸步骤的轮廓。
(3)KRSEcoRI+1(A)和KRSMseI+2(CA)2
05F212E0lLKRSl CGTCAGACTGCGTACCAATTCA-3'[SEQ ID 11]
05F213E01LKRS2 CAAGAGACTGCGTACCAATTCA-3’[SEQ ID 12]
05F214M15KKRS1 TGGTGATGAGTCCTGAGTAACA-3'[SEQ ID 13]
05F215M15KKRS2 AGCCGATGAGTCCTGAGTAACA-3'[SEQ ID 14]
用粗体表示选择性核苷酸和对标记(KRS)加下划线
样品PSP11:E01LKRS1/M15KKRS1
样品PI120234:E01LKRS2/M15KKRS2
(4)AFLP试验设计
以20μl的反应量进行选择性预扩增。在PE GeneAmp PCR System 9700中进行PCR，并且进行13个从94℃30秒变性步骤开始，然后进行65℃30秒退火步骤，在该步骤具有每一个循环退火温度降低0.7℃的降落相，和72℃60秒延伸步骤的循环。在该轮廓后进行23轮的94℃30秒变性步骤，接着进行56℃30秒退火步骤，和72℃60秒延伸步骤的轮廓。
EcoRI+3(AAC)和MseI+3(CAG)
E32 92S02:5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3[SEQ ID 15]
M49 92G23:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3[SEQ ID 16]
(5)Qiagen柱
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)按Spin手册07/2002第18页纯化所述AFLP产物，并用ND-1000分光光度计测定其浓度。将总共5μg的+1/+2PSP-11 AFLP产物和5μg的+1/+2PI201234 AFLP产物置于一起，并溶于23.3μl的TE中。最后，得到具有浓度为430ng/μl+1/+2 AFLP产物的混合物。
序列文库制备和高通量测序
使用如由Margulies等人(Margulies等，Nature 437,pp.376-380和在线增刊)描述的454Life Sciences测序技术，使来自两个胡椒系的混合的扩增产物进行高通量测序。特别地，首先末端-抛光(polished)所述AFLP PCR产物，接着将其连接至接头，以促进乳剂-PCR扩增和随后的如Margulies和同事描述的片段测序。454接头序列、乳剂PCR引物、序列-引物和测序运行条件都如由Margulies和同事描述的。在454测序方法中琼脂糖珠粒上扩增的乳剂-PCR片段中的功能元件的线性顺序是图1A中举例说明的，如下：
454PCR接头-454序列接头-4bp AFLP引物标记1-AFLP引物序列1，包括选择性核苷酸-AFLP片段内部序列-AFLP引物序列2，包括选择性核苷酸，4bp AFLP引物标记2-454序列接头-454PCR接头-琼脂糖珠粒
通过454Life Sciences(Branford,CT；美国)进行两轮高通量454测序运行。
454测序运行数据处理。
使用生命信息学流水线(Keygene N.V.)处理由一个454测序运行得到的序列数据。特别地，将未加工454基础点出的(basecalled)序列阅读转化成FASTA格式，并使用BLAST算法检查标记的AFLP接头序列的存在。当与已知标记的AFLP引物序列高置信度匹配时，整理序列，修复限制性核酸内切酶位点，并分配适当的标记(分别为样品1EcoRI(ES1)、样品1MseI(MS1)、样品2EcoRI(ES2)或样品2MseI(MS2))。接着，使用基于全部序列同源性的megaBLAST方法聚簇分析比33个碱基大的所有整理的序列。然后，使用CAP3多重比对算法将簇装配成一个或多个重叠群和/或每个簇的单元素。检查包含超过一个序列的重叠群的序列错配，表示为推定的多态性。基于下述标准分配序列错配的性质评分：
*在重叠群阅读的数量
*观察的等位基因分布
上述两个标准形成用于分配给各个推定的SNP/indel的所谓的Q评分的基础。Q得分从0至1；0.3的Q得分可能只在观察到两个等位基因至少两次的情况下达到。
*在具有某一长度的均聚物中的位置(可调节的；缺省设置以避免具有3个碱基或更长的均聚物中的多态性)。
*在簇中的重叠群的数量。
*到最近邻的序列错配的距离(可调节的；对于某些种类的探测旁侧序列的基因分型测定很重要)
*样品1或样品2同观察到的等位基因群聚的水平；在推定的多态性和样品1和2的等位基因之间一致的、完美的群聚的情况下，多态性(SNP)表示为“精华”(elite)推定的多态性(SNP)。在发现方法使用两个纯合系的情况下，精华多态性被认为具有位于独特或低拷贝基因组序列的高概率。相反地，多态性与样品来源的弱群聚具有起于重叠群中非等位序列比对的假多态性的高风险。
使用MISA研究工具(MIcroSAtellelite鉴定工具；得自http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)鉴定包含SSR基序的序列
运行的所有统计显示在下表中。
表.针对胡椒中SNP发现的454测序运行的所有统计
*SNP/indel采集的标准如下：
无在两侧的12个碱基内Q得分大于0.1的相邻多态性，在3个或更多个碱基的均聚物中不存在。采集标准不考虑与样品1和2的一致的群聚，即，SNP和indel不是必需的精华推定的SNP/indel。
包含精华推定的单一核苷酸多态性的多重比对的实例显示在图5中。
实施例2∶玉米
通过利用AFLP主基因识别位点特异性引物，使用来自玉米系B73和M017的DNA产生AFLP产物。(这些AFLP引物基本上与常规AFLP引物相同，例如在EP 0 534 858中描述的，并且通常将包含识别位点区域、恒定区域和一个或多个在其3’-末端的选择性核苷酸。)。
在65℃，用限制性核酸内切酶TaqI(5U/反应)消化来自胡椒系B73或M017的DNA 1小时，并在37℃用MseI(2U/反应)消化1小时，接着在80℃灭活10分钟。将双链的合成寡核苷酸接头连接到得到的限制性片段，其一个末端适合TaqI和/或MseI限制性片段的一个或两个末端。
在10倍稀释的限制-连接混合物中进行具有+1/+1AFLP引物的AFLP预扩增反应(20μl/反应)。PCR轮廓∶20*(在94℃30s+在56℃60s+在72℃120s)。在20倍稀释的+1/+1TaqI/MseI AFLP预扩增产物上进行具有不同的+2TaqI和MseI AFLP主基因识别位点引物(下表，标记为粗体，对选择性核苷酸加下划线)的另外的AFLP反应(50μl/反应)。PCR轮廓∶30*(在94℃30s+在56℃60S+在72℃120s)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)按Spin手册07/2002第18页纯化所述AFLP产物，并用ND-1000分光光度计测定其浓度。将总共1.25μg的各自不同的B73+2/+2AFLP产物和1.25μg各自不同的M017+2/+2 AFLP产物置于一起，并溶于30μl TE中。最后，得到具有浓度为333ng/μl+2/+2 AFLP产物的混合物。
表
最后，混合集中4Pl-样品和4P2-样品，并浓缩。得到总量25μl的DNA产物和最终浓度400ng/μl(总共10μg)。中间体质量评价在图3A、图3B和下表中给出。
表 在Nanodrop上测量的DNA浓度
用454测序
通过如所描述的(Margulies等，2005.Genome sequencing in microfabricatedhigh-density picolitre reactors.Nature 437(7057):376-80.Epub 7月31,2005)454Life Sciences处理如上文描述制备的胡椒和玉米AFLP片段样品。
数据处理
处理流水线：
输入数据
接受每个运行的原始序列数据：
-200000-400000个阅读
-基础点出性质评分
整理和标记
分析这些序列数据中在阅读的起始和末端的主基因识别位点(KRS)的存在。这些KRS序列包括两个AFLP-接头和样品标志序列，并特异于在某些样品上的某些AFLP引物组合。通过BLAST鉴定这些KRS序列并整理，和修复限制性位点。用标记标出阅读用于鉴定KRS来源。基于长度选择整理的序列(最少33nt)以参与进一步的处理。
聚簇分析和装配
在各种选择的大小、整理的阅读上进行MegaBlast分析，以得到同源序列簇。连续将所有的簇与CAP3装配，得到装配的重叠群。从两个步骤鉴定出与任何其它的阅读不匹配的独特序列阅读。将这些阅读标记为单元集。进行本文之前描述的步骤的处理流水线显示在图4A中。
多态性采集和质量评价
来自装配分析得到的重叠群形成多态性检测的基础。在各个簇的比对中的每个“错配”为可能的多态性。定义选择标准以获得性质评分：
-每个重叠群的阅读数量
-每种试样“等位基因”的频率
-均聚物序列的出现
-相邻多态性的出现
将具有高于阈值的性质得分的SNP和indel鉴定为推定的多态性。对于SSR采集，我们使用MISA(MIcroSAtellite鉴定)工具
(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)。该工具鉴定具有预定义标准的二、三、四核苷酸和化合物SSR基序，并且概述了这些SSR的出现。
多态性采集和性质分配方法显示在图4B中。
结果
下表概述了来自2个针对组合的胡椒样品的454测序运行和2个针对组合的玉米样品的测序运行的序列的组合分析的结果。
*两个具有选择抗相邻SNP，至少12bp的旁侧序列和不出现大于3个核苷酸的均聚物序列。
实施例3.通过PCR扩增和Sanger测序的SNP确认
为了确认在实施例1中鉴定的推定的A/G SNP，使用旁侧PCR引物设计针对该SNP的序列标记的位点(STS)测定。PCR引物的序列如下：
引物_1.2f:5'-AAACCCAAACTCCCCCAATC-3’,[SEQ ID 33]和
引物_1.2r:
5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGACATCAGTAGTCACACTGGTA
CAAAAATAGAGCAAAACAGTAGTG-3'[SEQ ID 34]
请注意，引物1.2r包含M13测序引物结合位点和在其5引物末端的长度填充片段。使用如在实施例4中制备的PSP11和PI210234的+A/+CA AFLP扩增产物作为模板进行PCR扩增。PCR条件如下：
对于1个PCR反应，混合下述组分：
5μl 1/10稀释的AFLP混合物(约10ng/μl)
5μl 1pmol/μl引物1.2f(由500μM储备液直接稀释的)
5μl 1pmol/μl引物1.2r(由500μM储备液直接稀释的)
5μl PCR混合物-2μl 10x PCR缓冲液
-1μl 5mM dNTPs
-1.5μl 25mM MgCl2
-0.5μl H2O
5μl 酶混合物 -0.5μl 10x PCR缓冲液(Applied Biosystems)
-0.1μl 5U/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)
-4.4μl H2O
使用下述PCR轮廓：
循环1 2'； 94℃
循环2-34 20”； 94℃
30”； 56℃
2'30”； 72℃
循环35 7'； 72℃
∞； 4℃
使用TA克隆方法将PCR产物克隆到载体pCR2.1(TA克隆试剂盒；Invitrogen)中，并转化到INVαF’感受态大肠杆菌细胞。转化体接受蓝/白筛选。对于每一个PSP11和PI-201234，各自选择三个独立的白色转化体，并在液体选择培养基中过夜培养，用于质粒分离。
使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)分离质粒。接着，根据下述试验设计测序这些质粒的插入片段，并在MegaBACE 1000(Amersham)上分辨。检查得到的序列的SNP等位基因的存在。两个包含PI-201234插入片段的独立的质粒和1个包含PSP11插入片段的质粒包含预期的位于SNP两侧的一致序列。来源于所述PSP11片段的序列包含预期的A(下划线)等位基因，来源于PI-201234片段的序列包含预期的G等位基因(双下划线)：
PSP11(序列1)：(5'-3')
AAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTAGAACAATGTTGGTTTTGGTGCTAACTTCAACCCCACTACTGTTTTGCTCTATTTTTGT[SEQ ID 35]
PI-201234(序列1)：(5'-3')
AAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTAGAACAGTGTTGGTTTTGGTGCTAACTTCAACCCCACTACTGTTTTGCTCTATTTTTG[SEQ ID 36]
PI-201234(序列2)：(5'-3')
AAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTAGAACATGTTGGTTTTGGTGCTAACTTCAACCCCACTACTGTTTTGCTCTATTTTTG[SEQ ID 37]
该结果表明，推定的胡椒A/G SNP代表了使用设计的STS测定可检测到的真实的遗传多态性。
参考文献：
1.Zabeau,M.and Vos,P.(1993)Selective restriction fragmentamplification；a general method for DNA fingerprinting.EP 0534858-A1,B1,B2；USpatent 6045994.
2.Vos,P.,Hogers,R.,Bleeker,M.,Reijans,M.,van de Lee,T.,Hornes,M.,Frijters,A.,Pot,J.,Pelentan,J.,Kuiper,M.等，(1995)AFLP:a new technique for DNAfingerprinting.Nucl.Acids Res.,21,4407-4414.
3.M.van der Meulen,J.Buntjer,M.J.T.van Eijk,P.Vos,and R.van Schaik.(2002).Highly automatedfingerprint analysis on the MegaBACE capillarysequencer.Plant,Animal and Microbial Genome X,San Diego,CA,January 12-16,P228,pp.135.
4.Margulies et al.,2005.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactions.Nature advanced online publication 03959,August1.
5.R.W.Michelmore,I.Paran,and R.V.Kesseli.(1991).Identification ofmarkers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis:arapid method to detect markers in specific genomic regions by usingsegregating populations.Proc.Natl.Acad.Sci USA 88(21):9828-32.
6.Shendure等,2005.Accurate multiplex polony sequencing of an evolvedbacterial genome.Scienceexpress Report,August 4.

Claims (25)

1.高通量发现、检测和基因分型多个样品中一种或多种遗传标记的方法，包括下述步骤：
a)提供来自多种样品的DNA；
b)用至少一种限制性内切酶限制DNA以产生限制性片段；
c)连接接头与限制性片段，产生接头-连接的限制性片段；
d)用引物对扩增接头-连接的限制性片段，其中所述引物中的至少一个和至少部分接头互补，从而针对每个样品产生标记的扩增的接头连接的限制性片段的文库；
e)使用高通量测序技术测序该文库，并选择被测序至少6倍的扩增的接头-连接的限制性片段；
f)使用标识符标记鉴定文库内和/或文库之间的遗传标记；
g)测定文库中遗传标记的共显性基因型，
其中所述方法不用于人和动物疾病的诊断。
2.根据权利要求1所述的方法，其中遗传标记为AFLP标记或SNP标记。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中测序基于合成的测序。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中测序基于焦磷酸测序。
5.根据权利要求1所述的方法，其中测序在固体载体上进行的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述固体载体是珠粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其中测序包括下述步骤：
-退火扩增的接头-连接的限制性片段至珠粒，每个珠粒同单个接头-连接的片段退火；
-在油包水型微型反应器中乳化珠粒；每个油包水型微型反应器包括单个珠粒；
-进行乳剂PCR以在珠粒表面上扩增接头-连接的限制性片段；
-将珠粒装填在池中，每个池包括单个珠粒；和
-产生焦磷酸盐信号。
8.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少6。
9.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少7。
10.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少8。
11.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的平均冗余度为至少9。
12.根据权利要求1所述的方法，其中测定每个接头-连接的限制性片段的序列至少6倍。
13.根据权利要求1所述的方法，其中测定每个接头-连接的限制性片段的序列至少7倍。
14.根据权利要求1所述的方法，其中测定每个接头-连接的限制性片段的序列至少8倍。
15.根据权利要求1所述的方法，其中测定每个接头-连接的限制性片段的序列至少9倍。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在内切核苷酸酶限制和接头连接之间，通过变性步骤进行大小选择。
17.根据权利要求1所述的方法，其中DNA选自基因组DNA、cDNA、BAC、YAC、整体基因组扩增的DNA或PCR产物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中接头为双链的合成寡核苷酸接头，其具有一个适合于限制性片段的一个末端或两个末端的末端。
19.根据权利要求1所述的方法，其中DNA被两个限制性内切酶限制。
20.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个限制性内切酶是稀有的切割酶。
21.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个限制性内切酶为常见切割酶。
22.根据权利要求1所述的方法，其中引物包含1至10个核苷酸。
23.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用三个或更多个限制性内切酶的组合限制DNA。
24.权利要求1或2任一项所定义的方法用于AFLP和/或SNP标记序列的共显性评分的用途。
25.高通量测序方法用于多态性的检测、发现和基因分型、用于基因分型多个样品中一种或多种遗传标记的用途，包括步骤：
a)提供来自多种样品的DNA；
b)用至少一种限制性内切酶限制DNA以产生限制性片段；
c)将标记的接头与限制性片段连接，产生标记的接头-连接的限制性片段；
d)用引物对扩增标记的接头-连接的限制性片段，其中所述引物中的至少一个和至少部分接头互补，从而针对每个样品产生标记的扩增的接头-连接的限制性片段的文库；
e)使用高通量测序技术测序该文库，并选择被测序至少6倍的扩增的接头-连接的限制性片段；
f)使用标识符标记鉴定文库内和/或文库之间的遗传标记；
g)测定文库中遗传标记的共显性基因型，并将基因型用于基因分型目的，所述基因分型目的包括遗传作图、QTL定位、精细定位基因/特性、连锁不平衡作图、标记辅助的反交、遗传距离分析、发现与特性或表型有关的标记。
CN201410177894.1A 2005-12-22 2006-12-20 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法 Active CN103937899B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75259005P 2005-12-22 2005-12-22
US60/752,590 2005-12-22
CN200680051561.8A CN101374963B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680051561.8A Division CN101374963B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103937899A CN103937899A (zh) 2014-07-23
CN103937899B true CN103937899B (zh) 2017-09-08

Family

ID=37834098

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410177894.1A Active CN103937899B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法
CN200680051561.8A Active CN101374963B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680051561.8A Active CN101374963B (zh) 2005-12-22 2006-12-20 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法

Country Status (9)

Country Link
US (11) US8481257B2 (zh)
EP (5) EP3404114B1 (zh)
JP (1) JP5452021B2 (zh)
CN (2) CN103937899B (zh)
DK (3) DK2789696T3 (zh)
ES (3) ES2882401T3 (zh)
HK (1) HK1200497A1 (zh)
PL (1) PL2789696T3 (zh)
WO (1) WO2007073165A1 (zh)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5220597B2 (ja) 2005-06-23 2013-06-26 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ １つ又は複数の多型性を同定する方法およびその使用方法
CA2910861C (en) 2005-09-29 2018-08-07 Michael Josephus Theresia Van Eijk High throughput screening of mutagenized populations
EP3404114B1 (en) 2005-12-22 2021-05-05 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
JP2009047956A (ja) * 2007-08-21 2009-03-05 Sony Corp 撮像装置
EP2227557B1 (en) * 2007-11-27 2012-12-12 Vib Vzw Marker assisted directed evolution
EP2172565A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-07 Cyano Biotech GmbH Method of identifying and/or differentiating cyanophyta
WO2010064897A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Keygene N.V. Farmesene synthase
US20100227776A1 (en) * 2009-03-05 2010-09-09 The Ohio State University Rapid Genotyping of SNPs
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
CN101886132B (zh) * 2009-07-15 2013-09-18 北京百迈客生物科技有限公司 基于测序和bsa技术的性状相关的分子标记筛选方法
JP5799484B2 (ja) 2009-12-14 2015-10-28 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａマイクロアレイにおけるプローブ設計方法、当該方法により設計されたプローブを有するｄｎａマイクロアレイ
CN102656279A (zh) * 2009-12-17 2012-09-05 凯津公司 基于全基因组测序的限制性酶
DK2556171T3 (en) 2010-04-05 2015-12-14 Prognosys Biosciences Inc Spatially CODED BIOLOGICAL ASSAYS
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
EP2599877B1 (en) * 2010-06-30 2017-09-27 BGI Genomics Co., Limited New pcr sequencing method and use thereof in hla genotyping
CN102061526B (zh) * 2010-11-23 2014-04-30 深圳华大基因科技服务有限公司 一种DNA文库及其制备方法、以及一种检测SNPs的方法和装置
KR20140027915A (ko) 2010-12-01 2014-03-07 모르포시스 아게 단일 세포 내 생체 분자의 동시 검출
CN103261442B (zh) * 2010-12-02 2014-12-10 深圳华大基因医学有限公司 Hpv 精确分型的生物信息学分析的方法及系统
WO2012096579A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Keygene N.V. Paired end random sequence based genotyping
CN102181943B (zh) * 2011-03-02 2013-06-05 中山大学 一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP3246416A1 (en) 2011-04-15 2017-11-22 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
EP2980226A1 (en) * 2011-07-08 2016-02-03 Keygene N.V. Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays
US20150120210A1 (en) * 2011-12-29 2015-04-30 Bgi Tech Solutions Co., Ltd. Method and device for labelling single nucleotide polymorphism sites in genome
EP3434789A1 (en) 2012-01-13 2019-01-30 Data2Bio Genotyping by next-generation sequencing
DK3363901T3 (da) 2012-02-17 2021-02-22 Hutchinson Fred Cancer Res Sammensætninger og fremgangsmåder til præcis identificering af mutationer
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
WO2014029093A1 (zh) * 2012-08-23 2014-02-27 深圳华大基因科技有限公司 确定个体是否患有异常状态的方法及系统
CN102864498B (zh) * 2012-09-24 2014-07-16 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种长片段末端文库的构建方法
GB201217888D0 (en) 2012-10-05 2012-11-21 Univ Leuven Kath High-throughput genotyping by sequencing of single cell
EP2912468B1 (en) 2012-10-29 2018-09-12 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
EP2971130A4 (en) 2013-03-15 2016-10-05 Nugen Technologies Inc SEQUENTIAL SEQUENCING
CN111662960B (zh) 2013-06-25 2024-04-12 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
WO2015073711A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
CN104630202A (zh) * 2013-11-13 2015-05-20 北京大学 一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法
US10927408B2 (en) 2013-12-02 2021-02-23 Personal Genome Diagnostics, Inc. Method for evaluating minority variants in a sample
DK3901281T3 (da) 2015-04-10 2023-01-23 Spatial Transcriptomics Ab Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver
WO2017027653A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
CN106676095A (zh) * 2015-11-09 2017-05-17 中国科学院植物研究所 用于开发遗传标记的成套试剂和高通量测序开发遗传标记的方法
EP3187040A1 (en) 2015-12-30 2017-07-05 Vilmorin et Cie Resistance to tolcndv in melons
CN105695572B (zh) * 2016-02-02 2021-02-23 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法
ITUA20162640A1 (it) * 2016-04-15 2017-10-15 Menarini Silicon Biosystems Spa Metodo e kit per la generazione di librerie di dna per sequenziamento massivo parallelo
US10190155B2 (en) * 2016-10-14 2019-01-29 Nugen Technologies, Inc. Molecular tag attachment and transfer
CN106701949B (zh) * 2016-12-30 2019-09-17 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂
CA3049682C (en) 2017-01-20 2023-06-27 Sequenom, Inc. Methods for non-invasive assessment of genetic alterations
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
WO2019121603A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Keygene N.V. Chemical mutagenesis of cassava
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
AU2019351130A1 (en) 2018-09-27 2021-04-08 Grail, Llc Methylation markers and targeted methylation probe panel
US20220033879A1 (en) 2018-11-28 2022-02-03 Keygene N.V. Targeted enrichment by endonuclease protection
WO2020123320A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN113474466A (zh) 2019-02-21 2021-10-01 主基因有限公司 多倍体基因分型
CN114008213A (zh) * 2019-05-20 2022-02-01 阿瑞玛基因组学公司 用于增强基因组覆盖和保持空间邻近的邻接性的方法和组合物
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US20220243267A1 (en) * 2019-05-31 2022-08-04 North Carolina State University Compositions and methods related to quantitative reduced representation sequencing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021116371A1 (en) 2019-12-12 2021-06-17 Keygene N.V. Semi-solid state nucleic acid manipulation
JP2023506631A (ja) 2019-12-20 2023-02-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 共有結合で閉端された核酸分子末端を使用したｎｇｓライブラリー調製
ES2946357T3 (es) 2019-12-23 2023-07-17 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial usando ligación con molde de ARN
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4025692A2 (en) 2020-06-02 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20230407366A1 (en) 2020-10-06 2023-12-21 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4251761A1 (en) 2020-11-24 2023-10-04 Keygene N.V. Targeted enrichment using nanopore selective sequencing
EP4251750A1 (en) 2020-11-25 2023-10-04 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Ribosomal profiling in single cells
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2022144003A1 (zh) * 2020-12-31 2022-07-07 东科智生基因科技（北京）有限公司 一种用于高通量靶向测序的多重pcr文库构建方法
AU2022238446A1 (en) 2021-03-18 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
CN115131784B (zh) * 2022-04-26 2023-04-18 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种图像处理方法、装置、电子设备及存储介质

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US24939A (en) 1859-08-02 Improvement in sewing-machines
EP0124990B1 (en) 1983-04-28 1987-08-19 Flexible Steel Lacing Company Method and apparatus for riveting fasteners to a belt
JPH04504356A (ja) 1989-01-31 1992-08-06 ユニバーシティ オブ マイアミ 染色体ｄｎａの顕微解剖と増幅
WO1993006239A1 (en) 1991-09-24 1993-04-01 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: a general method for dna fingerprinting
US20100267023A1 (en) 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
AU1682595A (en) * 1994-01-21 1995-08-08 North Carolina State University Methods for within family selection in woody perennials using genetic markers
EG23907A (en) 1994-08-01 2007-12-30 Delta & Pine Land Co Control of plant gene expression
US6013445A (en) * 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
NZ298236A (en) * 1994-11-28 1999-01-28 Du Pont Primers for detecting genetic polymorphisms
US5565340A (en) * 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US6100030A (en) * 1997-01-10 2000-08-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of selective DNA fragment amplification products for hybridization-based genetic fingerprinting, marker assisted selection, and high-throughput screening
US6090556A (en) * 1997-04-07 2000-07-18 Japan Science & Technology Corporation Method for quantitatively determining the expression of a gene
PT981609E (pt) 1997-05-13 2002-03-28 Azign Bioscience A S Metodo para clonar arnm e para exibir transcritos expressos diferencialmente (dodet)
ES2290979T3 (es) 1997-12-15 2008-02-16 Csl Behring Gmbh Cebador marcado para uso en la deteccion de acidos nucleicos diana.
CA2273616A1 (en) 1998-06-08 1999-12-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for parallel screening of allelic variation
US6124201A (en) 1998-06-12 2000-09-26 Advanced Micro Devices, Inc. Method for manufacturing semiconductors with self-aligning vias
EP0976835B1 (en) 1998-07-29 2003-07-09 Keygene N.V. Method for detecting nucleic acid methylation using AFLPTM
US6232067B1 (en) 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6703228B1 (en) 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
WO2000023620A1 (en) 1998-10-16 2000-04-27 Keygene N.V. Method for the generation of dna fingerprints
ATE316152T1 (de) 1998-10-27 2006-02-15 Affymetrix Inc Komplexitätsmanagement und analyse genomischer dna
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
JP2002534098A (ja) 1999-01-06 2002-10-15 コーネル リサーチ ファンデーション インク． ゲノムシークエンシングにおける単一ヌクレオチドの多型の加速度的な同定およびクローンの整列化
US20040029155A1 (en) * 1999-01-08 2004-02-12 Curagen Corporation Method for identifying a biomolecule
AU775875B2 (en) 1999-01-12 2004-08-19 Quanam Medical Corporation Composition and methods for administration of water-insoluble paclitaxel derivatives
DE19911130A1 (de) * 1999-03-12 2000-09-21 Hager Joerg Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene
WO2000060124A2 (en) 1999-04-06 2000-10-12 Yale University Fixed address analysis of sequence tags
ES2298139T3 (es) * 1999-04-09 2008-05-16 Keygene N.V. Metodo para el analisis de mezclas de reaccion de aflp utilizando tecnicas de extension del iniciador.
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20020119448A1 (en) 1999-06-23 2002-08-29 Joseph A. Sorge Methods of enriching for and identifying polymorphisms
US20030204075A9 (en) * 1999-08-09 2003-10-30 The Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
WO2001021840A2 (en) * 1999-09-23 2001-03-29 Gene Logic, Inc. Indexing populations
US6287778B1 (en) 1999-10-19 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Allele detection using primer extension with sequence-coded identity tags
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
WO2001038572A1 (fr) 1999-11-19 2001-05-31 Takara Bio Inc. Methode d'amplification d'acides nucleiques
AU2001253063A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reverse genetic strategy for identifying functional mutations in genes of known sequence
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
WO2001088189A2 (en) 2000-05-15 2001-11-22 Keygene N.V. Microsatellite-aflp®
US7300751B2 (en) * 2000-06-30 2007-11-27 Syngenta Participations Ag Method for identification of genetic markers
ATE380883T1 (de) 2000-10-24 2007-12-15 Univ Leland Stanford Junior Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna
US7141364B1 (en) * 2001-03-29 2006-11-28 Council Of Scientific And Industrial Research Universal primers for wildlife identification
US20040053236A1 (en) 2001-03-30 2004-03-18 Mccallum Claire M. Reverse genetic strategy for identifying functional mutations in genes of known sequences
WO2002083911A1 (en) 2001-04-12 2002-10-24 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Production of plants with increased tolerance to drought stress or with increased transpiration
WO2002086163A1 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Karolinska Innovations Ab Methods for high throughput genome analysis using restriction site tagged microarrays
US20030096268A1 (en) 2001-07-06 2003-05-22 Michael Weiner Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
AU2002323509A1 (en) 2001-08-30 2003-03-18 Purdue Research Foundation Methods to produce transgenic plants resistant to osmotic stress
EP1288301A1 (en) 2001-08-31 2003-03-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Berlin Plant-derived resistance gene
US6902921B2 (en) 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US7504222B2 (en) 2001-10-31 2009-03-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
AU2002359436A1 (en) * 2001-11-13 2003-06-23 Rubicon Genomics Inc. Dna amplification and sequencing using dna molecules generated by random fragmentation
AU2003224789B2 (en) 2002-03-27 2007-03-15 Agrinomics, Llc Generation of plants with improved drought tolerance
US6815167B2 (en) 2002-04-25 2004-11-09 Geneohm Sciences Amplification of DNA to produce single-stranded product of defined sequence and length
US20070065816A1 (en) * 2002-05-17 2007-03-22 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US7108976B2 (en) * 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
WO2004001074A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Lynx Therapeutics, Inc. Method for detecting foreign dna in a host genome
EP1546345B1 (en) 2002-09-05 2007-03-28 Plant Bioscience Limited Genome partitioning
US20040157238A1 (en) 2002-09-20 2004-08-12 Quinn John J. Method for detection of multiple nucleic acid sequence variations
WO2004057017A2 (en) 2002-12-18 2004-07-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of small nucleic acids
JP2004208586A (ja) 2002-12-27 2004-07-29 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd Ｈｌａの検出
JP4690307B2 (ja) * 2003-01-10 2011-06-01 ケイヘーネ・エヌ・ブイ 物理的および遺伝的地図を統合するためのａｆｌｐに基づいた方法
ES2338654T5 (es) 2003-01-29 2017-12-11 454 Life Sciences Corporation Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas
CN103397082B (zh) * 2003-02-26 2017-05-31 考利达基因组股份有限公司 通过杂交进行的随机阵列dna分析
JP4888876B2 (ja) 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
WO2005002325A2 (en) 2003-06-24 2005-01-13 Agrinomics Llc Generation of plants with improved drought tolerance
DE602004032374D1 (de) 2003-06-24 2011-06-01 Agrigenetics Inc Erzeugung von pflanzen mit verbesserter toleranz gegenüber trockenheit
US7051935B2 (en) 2003-07-28 2006-05-30 Imageid Ltd. Color calibration for color bar codes
US7365179B2 (en) 2003-09-09 2008-04-29 Compass Genetics, Llc Multiplexed analytical platform
EP2316953A3 (en) 2003-10-20 2011-10-05 CropDesign N.V. Identification of novel E2F target genes and use thereof
CA2543786A1 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 Mmi Genomics, Inc. Methods and systems for inferring traits to manage non-beef livestock
JP2007525571A (ja) 2004-01-07 2007-09-06 ソレクサ リミテッド 修飾分子アレイ
US20050233354A1 (en) 2004-01-22 2005-10-20 Affymetrix, Inc. Genotyping degraded or mitochandrial DNA samples
DE602005018166D1 (de) 2004-02-12 2010-01-21 Population Genetics Technologi Genetische analyse mittels sequenzspezifischem sortieren
WO2006019407A2 (en) 2004-02-18 2006-02-23 The Trustees Of Boston University Method for detecting and quantifying rare mutations/polymorphisms
EP1574585A1 (en) 2004-03-12 2005-09-14 Plant Research International B.V. Method for selective amplification of DNA fragments for genetic fingerprinting
JP4809594B2 (ja) 2004-08-02 2011-11-09 東京エレクトロン株式会社 検査装置
FR2876479B1 (fr) 2004-10-11 2006-12-15 Parkeon Machine a pieces a receptacle de pieces de monnaie amovible
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
WO2006122215A2 (en) 2005-05-10 2006-11-16 State Of Oregon Acting By & Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays
JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2013-10-30 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
JP5220597B2 (ja) * 2005-06-23 2013-06-26 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ １つ又は複数の多型性を同定する方法およびその使用方法
WO2006137734A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Keygene N.V. Improved strategies for sequencing complex genomes using high throughput sequencing technologies
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
CA2910861C (en) 2005-09-29 2018-08-07 Michael Josephus Theresia Van Eijk High throughput screening of mutagenized populations
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
US8071310B2 (en) * 2005-11-14 2011-12-06 Keygene Nv Method for the high throughput screening of transposon tagging populations and massive parallel sequence identification of insertion sites
EP3404114B1 (en) 2005-12-22 2021-05-05 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
DK2002017T3 (en) 2006-04-04 2015-09-07 Keygene Nv High-capacity detection of molecular markers based on restriction fragments
CN101772888B (zh) 2007-08-06 2013-05-29 日本电波工业株式会社 音叉型晶体振子及其频率调整方法
US8362325B2 (en) 2007-10-03 2013-01-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
US20090124758A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Bridgestone Sports Co., Ltd. Golf ball
US20140051585A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Natera, Inc. Methods and compositions for reducing genetic library contamination
EP3004381A1 (en) 2013-06-07 2016-04-13 Keygene N.V. Method for targeted sequencing

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SNPs by AFLP(SBA):a rapid SNP isolation strategy for non-model organisms;NICOD J-C 等;《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》;20030301;第31卷(第5期);第1-5页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9328383B2 (en) 2016-05-03
PL2789696T3 (pl) 2016-06-30
HK1200497A1 (zh) 2015-08-07
EP2363504A1 (en) 2011-09-07
EP1966393A1 (en) 2008-09-10
DK2789696T3 (en) 2016-02-29
ES2882401T3 (es) 2021-12-01
US20090269749A1 (en) 2009-10-29
DK1966393T3 (da) 2012-10-08
WO2007073165A1 (en) 2007-06-28
US11008615B2 (en) 2021-05-18
EP2789696B1 (en) 2015-12-16
US20200181698A1 (en) 2020-06-11
US9777324B2 (en) 2017-10-03
US10106850B2 (en) 2018-10-23
CN103937899A (zh) 2014-07-23
US20150344946A1 (en) 2015-12-03
JP5452021B2 (ja) 2014-03-26
US9702004B2 (en) 2017-07-11
EP3404114A1 (en) 2018-11-21
US8815512B2 (en) 2014-08-26
US20160258013A1 (en) 2016-09-08
EP2789696A1 (en) 2014-10-15
US8481257B2 (en) 2013-07-09
JP2009520497A (ja) 2009-05-28
US20140315728A1 (en) 2014-10-23
US20150159217A1 (en) 2015-06-11
EP1966393B1 (en) 2012-07-25
US8911945B2 (en) 2014-12-16
DK3404114T3 (da) 2021-06-28
US20130059739A1 (en) 2013-03-07
ES2558124T3 (es) 2016-02-02
US9334536B2 (en) 2016-05-10
ES2391837T3 (es) 2012-11-30
EP3404114B1 (en) 2021-05-05
US20190144938A1 (en) 2019-05-16
CN101374963B (zh) 2014-06-04
US20140295428A1 (en) 2014-10-02
US9062348B1 (en) 2015-06-23
EP3045544A1 (en) 2016-07-20
CN101374963A (zh) 2009-02-25
US20170081718A1 (en) 2017-03-23
US20170356042A1 (en) 2017-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103937899B (zh) 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法
US11649494B2 (en) High throughput screening of populations carrying naturally occurring mutations

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1200497

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1200497

Country of ref document: HK