CN114885610A - 使用rna模板化连接进行空间分析的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用RNA模板化的连接来检测感兴趣的分析物以探询样品中空间基因表达的方法。

Description

使用RNA模板化连接进行空间分析的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月23日提交的美国临时专利申请号62/952,736；2020年2月3日提交的美国临时专利申请号62/969,458；2020年10月2日提交的美国临时专利申请号63/087,061；以及2020年10月30日提交的美国临时专利申请号63/108,088的优先权。这些申请各自的内容通过引用全文纳入本文。
背景技术
组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为、信号转导，以及与组织中其它细胞的串扰。
先前人们曾利用技术对空间异质性进行过研究，这些技术通常提供完整组织或部分组织(例如组织切片)背景中少数分析物的数据，或提供来自个体、单个细胞的重要分析物数据，但无法提供关于来自原始生物样品(例如，组织)的单细胞位置的信息。
通常，对于生物样品中的特定分析物的靶向利用捕获探针，所述探针靶向常见的转录物序列，例如聚(A)mRNA样尾。然而，这种方法能够检测大量脱靶分析物。方法(例如RNA模板化连接)为不加区分地捕获常见转录物序列提供了一种替代方法。参见例如，Yeakley，PLoS One，25；12(5)：e0178302(2017)，其通过引用其全文方式纳入本文。然而，仍然需要开发一种目标分析物的常见转录物序列(例如，聚(A)mRNA样尾)捕获的替代方案，其能够检测整个转录组中的分析物，同时提供有关目标分析物的空间位置和丰度的信息。
发明内容
被靶RNA捕获(targeted RNA capture)是聚(A)mRNA捕获的一种有吸引力的替代方案，以用于探寻(interrogate)样品(例如，FFPE组织)中的空间基因表达。与聚(A)mRNA捕获相比，本文所述的被靶RNA捕获受与FFPE固定相关的RNA降解的影响较小，相较于依赖于寡聚dT捕获和mRNA逆转录的方法。如本文所述的进一步被靶RNA捕获允许对感兴趣的特定基因进行灵敏测量，这些基因在其它情况下可能会被全转录组学方法遗漏。被靶RNA捕获可用于捕获定义的一组感兴趣的RNA分子，或其也可用于全转录组水平，或介于两者之间的任何水平。当与本文公开的空间方法结合时，可以确定RNA靶标的位置和丰度。
一方面，本公开的特征在于一种用于确定生物样品中分析物位置的方法，其包括：(a)在包括多个捕获探针的阵列上提供生物样品，其中所述多个中的捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)将第一探针和第二探针与生物样品接触，其中第一探针和第二探针各自包含与分析物的序列基本互补的一个或多个序列，并且其中第二探针包含捕获探针捕获域；(c)使第一探针和第二探针杂交至分析物；(d)通过连接第一探针和第二探针产生连接产物；(e)从分析物释放连接产物；(f)使连接产物与捕获域杂交；和(g)确定(i)与捕获域结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并使用确定的(i)和(ii)的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。在一些情况下，所述方法包括确定生物样品中分析物的丰度和位置。在一些情况下，所述方法包括确定生物样品中某个位置处分析物的丰度。
在一些实施方式中，第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补。在一些实施方式中，第一探针和第二探针与分析物上彼此不相邻的多个序列杂交。
在一些实施方式中，所述方法还包括将第三探针与第一探针和第二探针杂交，其中第三探针包括与第一探针的部分基本互补的第一序列和与第二探针的部分基本互补的第二序列。在一些实施方式中，在第一温度进行第一探针和第二探针与分析物的杂交。在一些实施方式中，在第二温度进行第三探针与第一探针和第二探针的杂交。在一些实施方式中，第一温度是比第二温度更高的温度。在一些实施方式中，第一温度为约50℃至约75℃、约55℃至约70℃、或约60℃至约65℃。在一些实施方式中，第二温度为约15℃至约35℃、约20℃至约30℃、或约25℃至约30℃。在一些实施方式中，第一探针用DNA聚合酶延伸，从而填充第一探针和第二探针之间的间隙并产生延伸的第一探针。
在一些实施方式中，第一探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的序列。在一些实施方式中，第二探针还包括：(i)与分析物的第二靶序列基本互补的第一序列；(ii)接头序列；(iii)与分析物的第三靶序列基本互补的第二序列；和(iv)能够与捕获探针的捕获域结合的捕获探针捕获域。在一些实施方式中，分析物的第一靶序列与分析物的第二靶序列直接相邻。在一些实施方式中，第二靶序列不与分析物上的第三靶序列直接相邻。在一些实施方式中，第二靶序列和第三靶序列：(i)在分析物的不同外显子上，或(ii)位于分析物的相同外显子中但在分析物上不相邻。
在一些实施方式中，第二探针包括与分析物的第三靶序列基本互补的序列。在一些实施方式中，第一探针包括：(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列；(ii)接头序列；和(iii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，第二靶序列与第三靶序列直接相邻。在一些实施方式中，第一靶序列不与分析物上的第二靶序列直接相邻。在一些实施方式中，第一靶序列和第二靶序列：(i)在分析物的不同外显子上，或(ii)位于相同外显子中但在分析物上不直接相邻。
在一些实施方式中，接头序列包括总共约1个核苷酸至约100个核苷酸。在一些实施方式中，接头还包括用作鉴别分析物的代用物(proxy)的条形码序列。
在一些实施方式中，第一探针在3′末端包含至少两个核糖核酸碱基，并且其中第二探针在5′末端包含磷酸化核苷酸。
在一些实施方式中，产生连接产物包括使用酶促连接或化学连接连接(i)第一探针与第二探针或(ii)延伸的第一探针与第二探针，其中酶促连接利用连接酶。在一些实施方式中，连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
在一些实施方式中，第二探针在其5′末端包含预腺苷酸化的磷酸基团，并且其中第一探针在3′末端包含至少两个核糖核酸碱基。在一些实施方式中，产生连接产物的步骤包括使用不需要三磷酸腺苷来发挥连接酶活性的连接酶将第一探针的3′末端连接到第二探针的5′末端。在一些实施方式中，连接酶选自：热稳定的5′AppDNA/RNA连接酶、截短的T4RNA连接酶2、截短的T4 RNA连接酶2K227Q、截短的T4 RNA连接酶2KQ、小球藻病毒PBCV-1DNA连接酶，或其任何组合。
在一些实施方式中，第一探针还包括功能序列，其中功能序列是引物序列。
在一些实施方式中，所述方法还包括提供与捕获探针捕获域相互作用的捕获探针捕获域阻断部分。在一些实施方式中，该方法还包括在步骤(f)之前从捕获探针捕获域释放捕获探针捕获域阻断部分。在一些实施方式中，捕获探针捕获域包括聚腺苷酸化(聚(A))序列或其互补物。在一些实施方式中，捕获探针捕获域阻断部分包括聚尿苷序列、聚胸苷序列或两者。在一些实施方式中，从聚(A)序列释放聚尿苷序列包括使连接产物变性或使连接产物与核酸内切酶、核酸外切酶或核糖核酸酶接触。在一些实施方式中，捕获探针捕获域包括与捕获探针的全部或部分捕获域互补的序列。在一些实施方式中，捕获探针捕获域包括简并序列。
在一些实施方式中，第一探针和/或第二探针是DNA探针。
在一些实施方式中，第三探针是DNA探针。
在一些实施方式中，捕获探针捕获域阻断部分是DNA探针。
在一些实施方式中，释放步骤(f)包括从分析物去除连接的探针。
在一些实施方式中，(i)从分析物释放连接产物或(ii)从捕获域结合域释放捕获探针捕获域阻断部分的释放包括使连接的探针与核糖核酸内切酶接触。在一些实施方式中，核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I中的一种或多种。在一些实施方式中，RNA酶H包括RNA酶H1、RNA酶H2或RNA酶H1和RNA酶H2。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，组织样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品、新鲜或冷冻的组织样品。在一些实施方式中，组织样品是FFPE组织样品，并且组织样品是去交联的。在一些实施方式中，生物样品经预先染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用免疫荧光或免疫组织化学染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用苏木精和伊红染色。
在一些实施方式中，所述方法还包括使生物样品与透化剂接触，其中透化剂选自有机溶剂、去污剂和酶，或它们的组合。在一些实施方式中，透化剂选自下组：内肽酶、蛋白酶十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20、N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液、皂苷、TritonX-100TM和Tween-20TM。在一些实施方式中，内肽酶是胃蛋白酶或蛋白酶K。
在一些实施方式中，所述方法还包括在步骤(a)之前固定生物样品。在一些实施方式中，固定生物样品的步骤使用甲醇和丙酮中的一种或两种进行。
在一些实施方式中，分析物包括RNA。在一些实施方式中，RNA是mRNA。
在一些实施方式中，确定步骤包括扩增与捕获域特异性结合的全部或部分连接产物。在一些实施方式中，扩增产物包括(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或其互补物。在一些实施方式中，确定步骤包括测序。在一些实施方式中，测序步骤包括原位测序、Sanger测序法、下一代测序法和纳米孔测序。
在另一方面，本公开的特征在于一种试剂盒，其包括：(a)基材，其包含多个捕获探针，所述捕获探针包括空间条形码和捕获域；(b)系统，其包含：多个第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针各自包括与分析物基本互补的序列，并且其中第二探针包括捕获结合域；和(c)用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的指令。
另一方面，本公开的特征在于一种试剂盒，其包括：(a)包含多个捕获探针的阵列；(b)多个探针，其包括第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第二探针包括：(i)捕获探针捕获域，其能够与捕获探针的捕获域结合，和(ii)接头序列；(c)多个酶，其包括核糖核酸酶和连接酶；和(d)用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的指令。
另一方面，本公开的特征在于一种试剂盒，其包括：(a)包括多个捕获探针的阵列；(b)多个探针，其包括第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第一探针包括接头序列，其中第二探针包括捕获探针捕获域，其能够结合至捕获探针的捕获域；(c)多个酶，其包括核糖核酸酶和连接酶；和(d)用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的指令。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括在其5′末端包含预腺苷酸化磷酸基团的第二探针，和不需要三磷酸腺苷以发挥连接酶活性的连接酶。
另一方面，本公开的特征在于一种组合物，其包括：包含捕获探针的空间阵列，其中捕获探针包括空间条形码和捕获域；空间阵列上的生物样品，其中生物样品包括多种感兴趣的分析物；与分析物杂交并连接在一起的第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包括与分析物的相邻序列基本互补的序列，并且其中第一探针或第二探针之一包括捕获探针捕获域。
在一些实施方式中，组合物还包含RNA酶H酶。在一些实施方式中，组合物还包括连接酶。在一些实施方式中，不包括捕获探针捕获域的探针寡核苷酸包括功能域。
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利、专利申请或信息条目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。
术语“每个”提及一组物品时，意在鉴别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。
单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容中另有明确规定。例如，术语“(一个/种)细胞”包括一个/种或多个/种细胞，包括它们的混合物。“A和/或B”在本文中用于包括以下所有备选：“A”、“B”、“A或B”和“A和B”。
本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图简要说明
以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。
图1示出了示例性空间分析工作流。
图2是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。
图3是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的目标分析物。
图4是示例性多重空间条码化特征的示意图。
图5是示出阵列内的条码化特征的示例性布置的示意图。
图6是显示RNA模板化连接的示例性工作流程的示意图。
图7是显示用于在包括捕获探针的基材上捕获连接产物的示例性工作流程的示意图。
图8是显示包含接头序列的第一探针和第二探针的示例的示意图。
图9是显示包含接头序列的第二探针和第一探针的示例的示意图。
图10是显示第一探针、第二探针和跨越探针(spanning probe)的示例的示意图。
图11是显示使用第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸和第三探针寡核苷酸的RNA模板化连接的示例的示意图。
图12A-12E显示了化学介导的核酸连接的各种方法。图12A说明三唑键的形成。图12B说明硫代磷酸酯键的形成。图12C说明酰胺键的形成。图12D说明氨基磷酸酯键的形成。图12E说明偶联反应。
图13显示了示例性的RNA模板化连接工作流程。
图14显示了用于检测各种探针的富集PCR结果。R1＝运行1；R2＝运行2。(1)表示带有捕获探针的连接产物的条带。(2)、(3)和(4)代表非连接产物。
图15显示了多个条件和探针的各种组合的读数分数。
图16A-16B显示了特定探针组合的矩阵。
图17A-17C显示利用总探针寡核苷酸计数(图17A)、非特异性探针寡核苷酸计数(图17B)和基因特异性探针寡核苷酸计数(图17C)的小鼠脑组织中的基因表达模式。
图18A-18E显示了在小鼠脑组织中具有空间表达的靶基因。
图19A-19F显示利用总探针寡核苷酸计数(图19A)和基因特异性探针寡核苷酸(图19B-19F)的小鼠脑组织中的基因表达模式。
图20A显示了不同杂交条件下，中值独特分子标识符(UMI)/细胞对比平均读数/细胞。
图20B显示了不同杂交条件下，中值基因/细胞对比平均读数/细胞。
图21A显示了三重阳性乳腺癌组织样品的切片的苏木精染色。
图21B显示了不同条件下，中值UMI/细胞计数对比平均读数/细胞。
图21C显示了八个不同簇中斑点的t-SNE投影。
图21D显示与图21A相同的组织，其中不同的簇(n＝8个簇)表达于组织的不同区域中。
图21E显示雌激素受体(ESR1)的表达。
图21F显示雌激素受体孕酮受体(PGR)的表达。
图21G显示ERBB2(也称为HER2)的表达。
图22A显示了卵巢癌样品切片的苏木精染色。
图22B显示了不同条件下，中值UMI/细胞对比平均读数/细胞。
图22C显示与图25A相同的组织，其中不同的簇(n＝8个簇)表达于组织的不同区域中。
图22D显示了八个不同簇中斑点的t-SNE投影。
图23显示了不同去交联条件下的中值UMI/细胞对比读数/细胞。
图24显示了对于不同处理条件(RNA酶)，中值UMI/细胞对比读数/细胞(上图)和中值基因/细胞对比读数/细胞(下图)。
图25显示了对于不同处理条件(时间和温度)，中值UMI/细胞对比读数/细胞(上图)和中值基因/细胞对比读数/细胞(下图)。
发明详述
被靶向的RNA捕获是聚(A)mRNA捕获的一种有吸引力的替代方案，以用于探寻(interrogate)FFPE组织中的空间基因表达。与聚(A)mRNA捕获相比，靶向的RNA捕获受与FFPE固定相关的RNA降解的影响小于依赖于寡聚dT捕获和mRNA逆转录的方法；允许对特定的感兴趣基因进行灵敏测量(否则它们可能会被整个转录组学方法遗漏)；并且具有可扩展性，其中已证明探针靶向大部分的转录组。
本文所述的空间分析方法和组合物能以高空间分辨率提供生物样品内大量分析物和/或各种各样分析物的表达数据，同时保留天然空间背景信息。空间分析方法和组合物可以包括，例如，使用包括空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置或方位的信息的核酸序列)的捕获探针，和能够与细胞产生和/或其中存在的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获域。空间分析方法和组合物还可包括使用具有捕获域的捕获探针，其捕获用于间接检测分析物的中间物(intermediate agent)。例如，中间物可以包括与中间物相关联的核酸序列(例如，条形码)。因此，中间物的检测指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析的方法和组合物的非限制性方面描述于美国专利号10,774,374，10,724,078，10,480,022，10,059,990，10,041,949，10,002,316，9,879,313，9,783,841，9,727,810，9,593,365，8,951,726，8,604,182，7,709,198，美国专利申请公开号2020/239946，2020/080136，2020/0277663，2020/024641，2019/330617，2019/264268，2020/256867，2020/224244，2019/194709，2019/161796，2019/085383，2019/055594，2018/216161，2018/051322，2018/0245142，2017/241911，2017/089811，2017/067096，2017/029875，2017/0016053，2016/108458，2015/000854，2013/171621，WO 2018/091676，WO2020/176788，Rodriques等，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial GeneExpression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits UserGuide)(例如，Rev C，日期2020年7月)，两者均可得于10x基因组学有限公司(10xGenomics)支持文档网站，可以任意组合使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其它非限制性方面。
可以在本公开中使用的一些通用术语可以见于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663。通常，“条形码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接于分析物。特定条形码相对于其它条形码可能是独特的。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒附件、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其它示例可见于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663。在一些实施方式中，分析物可被间接检测，例如通过中间物的检测，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸偶联的抗体)，例如本文所述的那些。
通常从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(LCM)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方式中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方式中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性示例包括组织染色剂(例如，苏木精和/或伊红)和免疫染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方式中，可以对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些实施方式中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可以促进分析物的捕获。示例性透化剂和条件描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中分析物的空间位置。分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中分析物所结合(例如，直接或间接)的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针可包括裂解域和/或功能域(例如，引物结合位点，例如用于下一代测序(NGS))。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的那些。
在一些实施方式中，可采用任何合适的多重化技术(例如，描述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663)来检测(例如同时或依次检测)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)。
在一些实施方式中，可以使用一种或多种分析物捕获剂进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指某一物质，其与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，连接至基材或特征的捕获探针)相互作用以鉴别分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，其能结合至分析物)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式鉴别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其他方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些情况下，分析物结合部分条形码(或其部分)可能能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。分析物捕获剂的其它描述可见于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663。
存在将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的至少两种方法，从而使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种方法是促进分析物或分析物代用物(proxy)(例如，中间物)移出细胞并朝向空间条码化阵列(例如，包括空间条码化捕获探针)。在一些情况中，使聚集有捕获探针(如本文进一步描述)的空间条码化阵列与生物样品接触，并且生物样品被透化，使分析物从样品迁移到阵列。分析物与空间条码化阵列上的捕获探针相互作用。另一种方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。在一些情况下，可使聚集有捕获探针(如本文进一步描述)的空间条形码阵列与样品接触。使空间条码化捕获探针被裂解，然后与提供的生物样品中的细胞相互作用。这种相互作用可以是共价或非共价的细胞表面相互作用。该相互作用可以是由递送系统或细胞穿透肽促进的细胞内相互作用。一旦空间条码化捕获探针与特定细胞相关联，就可以任选地移出样品以进行分析。样品在分析前可以选择性地分离。一旦标记的细胞与空间条码化捕获探针相关联，就可以分析捕获探针以获得关于标记的细胞的空间解析信息。
在一些情况下，样品制备可包括将样品放置在载玻片上、固定样品和/或染色生物样品以进行成像。然后可使用亮场(对样品苏木精和伊红染色成像)和/或荧光(对特征成像)模式在阵列上对染色样品成像。可选地，样品可以在透化之前脱色。在一些实施方式中，随后从样品中释放分析物，并且形成空间条码化阵列的捕获探针杂交或结合释放的分析物。然后从阵列移出样品，并且从阵列中裂解捕获探针。然后在一种或两种模式中任选地对生物样品和阵列进行第二成像，同时将分析物逆转录成cDNA，并且制备扩增子文库并测序。然后在空间上叠加图像，以便关联空间鉴别的生物样品信息。当样品和阵列没有第二成像时，换而提供点坐标文件。点坐标文件替换第二成像步骤。此外，可以使用独特PCR衔接子来进行扩增子文库制备并测序。
在一些情况中，公开了另一个示例性工作流程，其利用基材上的空间条码化阵列，其中空间条码化捕获探针聚集在称为特征的区域。空间条码化捕获探针可以包括裂解结构域、一个或多个功能结构域、空间条形码、独特分子标识符和捕获域。空间条码化捕获探针还可以包括5′端修饰，用于可逆地附接到基材。空间条码化阵列与生物样品接触，并且通过应用透化试剂使样品透化。透化试剂可通过将阵列/样品组件放置在本体溶液(bulksolution)中来给予。或者，可经由抗扩散介质和/或物理屏障(例如盖)向样品给予透化试剂，其中样品夹在抗扩散介质和/或屏障与包含阵列的基材之间。使用本文公开的任何数量的技术将分析物迁移到空间条码化捕获阵列。例如，分析物迁移可以使用抗扩散介质盖和被动迁移进行。作为另一示例，例如，使用电泳转移系统，分析物迁移可以是主动迁移。一旦分析物接近空间条码化捕获探针，捕获探针可杂交或以其他方式结合目标分析物。可以任选地从阵列移出生物样品。
捕获探针可任选地从阵列裂解，并且捕获的分析物可通过进行逆转录酶第一链cDNA反应来被空间条码化。第一链cDNA反应可任选地使用模板转换寡核苷酸来进行。例如，模板转换寡核苷酸可与通过逆转录酶添加到cDNA 3′端的聚(C)尾以模板非依赖方式杂交。原始的mRNA模板和模板转换寡核苷酸可以从cDNA中变性，然后空间条码化捕获探针可以与cDNA杂交并可生成cDNA的互补物。然后可以纯化第一链cDNA并收集用于下游扩增步骤。可使用PCR扩增第一链eDNA，其中正向和反向引物侧接感兴趣的空间条形码和分析物区域，产生与特定空间条形码相关联的文库。在一些实施方式中，可以对文库制备进行定量和/或质量控制以验证文库制备步骤的成功。在一些实施方式中，cDNA包含合成测序(SBS)引物序列。对文库扩增子进行测序和分析以解码空间信息。
在一些情况下，捕获探针可以用于从模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物(例如，连接产物或分析物捕获剂)，或其一部分)，或其衍生物，引发、复制并由此产生任选条码化的延伸产物(参见，例如，WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663，关于延伸的捕获探针)。在一些情况下，捕获探针可以用于与模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物，或其部分)形成连接产物，由此产生用作模板代用物的连接产物。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。在一些情况下，捕获探针可以包括对后续处理有用的功能序列。在一些情况下，捕获探针可以通过接头可逆地附接到基材上。捕获探针可包括一个或多个功能序列，其可包括测序仪特异性流动池附连序列，例如P5或P7序列，以及功能序列，其可包括测序引物序列，例如R1引物结合位点，R2引物结合位点。在一些实施方式中，序列是P7序列，序列是R2引物结合位点。捕获探针还可包括空间条形码和/或独特的分子标识符和捕获域。捕获探针的不同序列不需要处于如本实施例中所示的顺序方式，但是捕获域应该被置于条形码上的位置，其中可发生捕获域的分析物捕获和延伸以建立分析物的拷贝。
图2是示出如本文所述的捕获探针的示例的示意图。如图所示，捕获探针202任选地通过例如二硫键接头的裂解域201耦合到特征203。捕获探针可包括对后续处理有用的功能性序列，例如功能性序列204，其可包括测序仪特异性流动池附接序列，例如P5或P7序列，以及功能性序列205，其可包括测序引物序列，例如R1引物结合位点。在一些实施方式中，序列204是P7序列，序列205是R1引物结合位点。空间条形码206可包括在捕获探针内以用于对目标分析物条码化。通常可选择功能性序列以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如离子激流质子(Ion Torrent Proton)或PGM、Illumina测序仪、PacBio、牛津纳米孔(Oxford Nanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序系统兼容。可使用适当功能性序列的此类测序系统和技术的示例包括(但不限于)离子激流质子或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和牛津纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可选择功能性序列以与其它测序系统兼容。
在一些实施方式中，空间条形码206、功能性序列204(例如，流动池附接序列)和205(例如，测序引物序列)可以是附接到给定特征的所有探针所共用的。空间条形码还可包括捕获域207以促进目标分析物的捕获。
在一些情况下，使用细胞穿透肽将捕获探针引入细胞。图3是说明包括细胞穿透肽的可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的分析物。捕获探针301包含裂解域302、细胞穿透肽303、报告分子304和二硫键(-S-S-)。305表示捕获探针的所有其他部分，例如，空间条形码和捕获域。
在一些情况下，本公开提供多重化的空间条码化特征。图4是示例性多重化的空间条码化特征的示意图。参照图4，特征401(例如，珠、载玻片或其它基材上的位置、载玻片或其它基材上的孔、载玻片或其它基材上的分区等)可以与空间条码化捕获探针偶联，其中特定特征的空间条码化探针可以具有相同的空间条形码，但具有不同的捕获域，其设计用于将特征的空间条形码与多于一种的目标分析物相关联。例如，特征可以耦合到四种不同类型的空间条码化捕获探针，每种类型的空间条码化捕获探针具有空间条形码402。与该特征相关联的一种类型捕获探针包括空间条形码402与聚(T)捕获域403的组合，其设计用于捕获mRNA目标分析物。与该特征相关联的第二类型捕获探针包括空间条形码402与用于gDNA分析的随机N-聚体捕获域404的组合。与该特征相关联的第三类型捕获探针包括联合与感兴趣的分析物捕获剂405互补的捕获域的空间条形码402。与该特征相关联的第四类型捕获探针包括空间条形码402与捕获探针组合，该捕获探针可特异性结合可在CRISPR分析(例如CRISPR/Cas9)中起作用的核酸分子406。虽然图4中仅示出了四种不同的捕获探针条码化构建体，但是捕获探针条码化构建体可被定制用于与核酸相关的任何给定分析物的分析，并且能够与这种构建体结合。例如，图4中所示的方案也可用于本文中所公开的其它分析物的同时分析，包括但不限于：(a)mRNA，谱系追踪构建体，细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及gDNA；(b)mRNA，可获得的染色质(例如，ATAC-seq，DNA酶-seq，和/或MNA酶-seq)细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，CRISPR-crRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，条码化标记剂(例如，本文所述的MHC多聚体)和免疫细胞受体(例如，T细胞受体)的V(D)J序列。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。
捕获探针的其它特征描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中，其各自通过引用其全文方式纳入本文。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的那些，其各自通过引用其全文方式纳入本文。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针的末端(例如，3′或5′末端)的附加核苷酸从而延伸捕获探针的总长度的捕获探针。例如，“延伸的3′端”表示附加的核苷酸被添加到捕获探针的最3′核苷酸以延伸捕获探针的长度，例如，通过用于延伸核酸分子的聚合反应，包括通过聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方式中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3′末端添加与特异性结合捕获探针的捕获域的分析物或中间物的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码序列。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如通过DNA测序)的量。在一些实施方式中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述了空间分析方法的其它变化形式，在一些实施方式中包括成像步骤。捕获的分析物(和/或中间物或其部分)的分析，例如，包括样品移出、捕获探针的延伸、测序(例如，裂解的延伸捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时域分析和/或邻近捕获，描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663。一些质量控制措施也描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
空间信息可以提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断、预后和/或用于确定治疗功效)；确定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；将对象鉴定(例如，诊断)为患有疾病或病症；鉴定对象的疾病或病症的阶段和/或预后；将对象鉴定为具有增加的发展疾病或病症的可能性；监测对象的疾病或病症的进展；确定治疗对象的疾病或病症的功效；确定治疗对疾病或病症有效的患者亚群；对患有疾病或病症的对象的治疗的修改；选择参加临床试验的对象；和/或为患有疾病或病症的对象选择治疗。
空间信息可以提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达概况(例如，在健康和/或患病组织中)；近距离鉴别多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；肿瘤微环境的表征；肿瘤免疫反应的表征；细胞类型的表征及其在组织中的共定位；组织内遗传变异的鉴定(例如，基于与特定疾病或障碍生物标志物相关的基因和/或蛋白质表达概况)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基材起到支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。“特征”是一个实体，作为空间分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。示例性基材描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。阵列的示例性特征和几何属性可见于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
图5描述了阵列中条码化特征的示例性排列。从左到右，图5示出了(左)包括六个空间条码化阵列的载玻片，(中)六个空间条码化阵列中的一个的放大示意图，显示了与生物样品有关的条码化特征的网格，以及(右)阵列的一个部分的放大示意图，显示阵列中多个特征的特定标识(标记为ID578、ID579、ID560等)。
通常，当将生物样品与包括捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基材上的捕获探针的基材，或具有包括捕获探针的特征(例如，基材上的珠、孔、区域)的基材)接触时，分析物和/或中间物(或其部分)可被捕获。如本文所用，使生物样品“接触”基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))。捕获可以主动(例如，使用电泳)或被动(例如，使用扩散)实现。分析物捕获进一步描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况下，可以通过将具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如肽、脂质或核酸分子)附连和/或引至生物样品(例如，引至生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。在一些实施方式中，在将具有条形码的分子附连和/或引至生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以进行分析。一些这样的空间分析方法描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况下，空间分析可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行。在一些情况下，例如，可以使用RNA模板连接(RTL)进行空间分析。RTL的方法之前已经描述过。参见例如Credle等，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，例如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况下，寡核苷酸是DNA分子。在一些情况下，寡核苷酸之一在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一寡核苷酸在5′末端包括磷酸化核苷酸。在一些情况下，两个寡核苷酸之一包括捕获域(例如，聚(A)序列、非均聚序列)。在与分析物杂交后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接产物。在一些情况下，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，连接产物从分析物释放出来。在一些情况下，利用核酸内切酶(例如，RNA酶H)释放连接产物。释放的连接产物然后可以被阵列上的捕获探针(例如，代替分析物的直接捕获)捕获，任选地被扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息分析期间，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于分析物在生物样品中的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方式中，特定捕获探针和它们捕获的分析物与基材上特征阵列中的特定位置相关联。例如，特定空间条形码可以在阵列制造之前与特定阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可以与特定阵列位置信息一起存储(例如，在数据库中)，从而使得每个空间条形码唯一地映射到特定的阵列位置。
或者，特定空间条形码可以在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置，从而使得在每个位置，仅存在一种类型的空间条形码，由此空间条形码与阵列的单个特征独特地相关联。必要时，可以使用本文所述的任何方法对阵列进行解码，以便空间条形码与阵列特征位置独特地相关联，并且可以如上所述存储该映射。
当在空间信息分析期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，可以通过参考存储的将每个空间条形码与阵列特征位置独特关联的信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以此方式，特定捕获探针和捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。各阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标志物)的位置。因此，各特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程描述于WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的以“在本文描述的工作流程的一些非限制性示例中，可以将样品浸入......”开头的示例性实施方式。还参见，例如，Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial GeneExpression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits UserGuide)(例如，Rev C，日期2020年7月)。
在一些实施方式中，可以使用专用硬件和/或软件执行空间分析，例如在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的任何系统，WO2020/123320中描述的或任何一个或多个装置或方法。
用于执行空间分析的合适系统可以包括部件，例如用于容纳生物样品的室(例如，流动池或可密封的流体密封室)。生物样品可以被固定在例如生物样品容器中。一个或多个流体室可以通过流体导管连接到室和/或样品容器，并且可以通过流体泵、真空源或连接到流体导管的其它装置(产生压强梯度以驱动流体流)将流体输送到室和/或样品容器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管以调节试剂从储器到室和/或样品容器的流动。
系统可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(例如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，例如但不限于，磁性、光学或其它固态、持久性、可写和/或可重写存储介质)。控制单元可以任选地通过网络连接到一个或多个远程设备。控制单元(及其组件)通常可以执行本文描述的任何步骤和功能。在系统连接到远程设备的情况下，远程设备(或多个设备)可以执行本文描述的任何步骤或特征。该系统可以任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。该系统还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基材、来自捕获在基材上的生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可以可选地包括在一种或多种有形存储介质和硬件组件(例如专用集成电路)中编码和/或实现的软件指令。软件指令在由控制单元(尤其是电子处理器)或集成电路执行时，可以使控制单元、集成电路或其它执行软件指令的组件执行本文所述的任何方法步骤或功能。
在一些情况下，本文描述的系统可以检测(例如配准图像)阵列上的生物样品。检测阵列上的生物样品的示例性方法描述于PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854。
在将分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对齐。生物样品和包括捕获探针的特征阵列的对齐可以促进空间分析，这可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，生成分析物的存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维和/或三维图的示例性方法描述于PCT申请号2020/053655中，空间分析方法一般描述于WO2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中。
在一些情况下，可以使用一个或多个基准标志物将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对齐，例如，放置在成像系统视野中的物体出现在产生的图像中，如WO2020/123320、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843中所述。基准标志物可被用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于基准标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
使用RNA模板化连接的RNA捕获
(a)一般背景
尽管可以使用全基因组测序和全外显子组测序等技术，但这些技术的缺点在于它们提供了大量信息并增加了实验成本。在人们更喜欢研究数量有限的分析物的情况下，本文提供了用于被靶RNA捕获的方法。捕获分析物的衍生物(例如，连接产物)提供了关于分析物检测的增强的特异性。这是因为需要对靶标特异的至少两种探针与靶标杂交以促进核酸的连接和最终捕获。
参考图1，在本公开的示例性实施方式中，提供了用于鉴别生物样品中分析物的位置的方法。在一些情况下，所述方法包括101使生物样品与空间条码化捕获探针阵列接触。在一些情况下，阵列在基材上并且阵列包括多个捕获探针，其中多个中的捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获域。将生物样品放置在阵列上后，生物样品102与第一探针和第二探针接触，其中第一探针和第二探针各自包含与分析物的序列基本互补的一个或多个序列，并且其中第二探针包含捕获探针捕获域；第一探针和第二探针103与分析物中的互补序列杂交。在杂交之后，产生包含第一探针和第二探针104的连接产物，并且连接产物从分析物释放。然后使释放的连接产物游离105以与阵列上探针的捕获域杂交。捕获后，(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物106可以被确定，然后可以使用(i)和(ii)的确定的序列107来鉴别分析物在生物样品中的位置。
参考图13，在另一个非限制性示例中，生物样品被脱蜡、染色和成像1301。在脱色和去交联1302之后，将探针添加到样品中并与分析物杂交1303。在一些情况下，探针是DNA探针。在一些情况下，探针是含二核糖的探针。探针被连接1304，然后使用核酸内切酶如RNA酶H释放1305。连接的探针被捕获探针捕获在阵列上1306，使用聚合酶延伸1307并变性1308。质量控制清理1309后，确定分析物的丰度和位置。
本文公开的方法的非限制性示例示于图6。在生物样品与包括多个捕获探针的基材接触，并与(a)具有靶杂交序列603和引物序列602的第一探针601和(b)具有靶杂交序列605和捕获域(例如，聚A序列)606的第二探针604接触之后，第一探针601和第二探针604与分析物607杂交610。连接酶621将第一探针连接620到第二探针，由此产生连接产物622。通过使用内切核糖核酸酶632消化分析物，使连接产物从分析物631释放630。样品被透化640并且连接产物641能够与基材上的捕获探针杂交。
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，该生物样品包括在其5′末端包含预腺苷酸化磷酸基团的第二探针，这使得连接能够利用不需要三磷酸腺苷以发挥连接酶活性的连接酶。
本文还提供了用于鉴定分析物在生物样品中的位置的方法，该生物样品除了第一和第二探针之外还包括一个或多个跨越探针。使用跨越探针(spanning probe)能在设计RTL探针时实现更大的灵活性，主要是通过增加分析物中可用作可选靶序列的序列。
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，包括优化的杂交、洗涤和释放步骤。
在一些实施方式中，如图7所示，连接产物701包括捕获探针捕获域702，其能结合至捕获探针703(例如，直接或间接固定在基材704上的捕获探针)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括将生物样品与基材704接触705，其中捕获探针703固定至基材(例如，直接或间接固定至基材)。在一些实施方式中，连接产物的捕获探针捕获域702与捕获域706特异性结合。捕获探针还可包括独特分子标识符(UMI)707、空间条形码708、功能序列709和裂解域710。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括生物样品的透化，从而使得捕获探针可以更容易地与捕获的连接探针结合(即，与无透化相比)。在一些实施方式中，可以将逆转录(RT)试剂添加到透化生物样品中。与RT试剂一起孵育可以延伸捕获探针711以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化mRNA)产生空间条码化全长cDNA 712和713。第二链试剂(例如，第二链引物、酶)可被添加到载玻片上的生物样品中以起始第二链合成。
在一些实施方式中，cDNA可以从捕获探针模板变性714并转移(例如，转移至干净的管中)用于扩增和/或文库构建。空间条码化的全长cDNA可以在文库构建之前通过PCR进行扩增715。然后可以对cDNA进行酶促片段化和大小选择，以优化cDNA扩增子的大小。P5716、i5717、i7718和P7719可作为样品索引，TruSeq读数2可通过末端修复、A-加尾、衔接子连接、PCR等方式添加。然后可以使用TruSeq读数1和TruSeq读数2作为测序引物位点，使用双端测序(paired-ended sequencing)对cDNA片段进行测序。
(b)用于RNA模板化连接的探针
本文提供的方法利用探针对(pair)(或组(set)；这些术语可互换)。在一些情况下，探针对被设计为使得各探针与分析物特异性的分析物序列杂交(例如，与整个基因组相比)。也即，在一些情况下，单个探针对可以对单种分析物具有特异性。
在其它实施方式中，可以设计探针以使一对探针中的一个是与特定序列杂交的探针。然后，可以设计另一个探针来检测感兴趣的突变。因此，在一些情况下，可以设计多个第二探针并且可以变化以使每个都与特定序列结合。例如，第二探针可以设计为与野生型序列杂交，而另一个第二探针可以设计为检测突变序列。因此，在一些情况下，探针组可以包括一个第一探针和两个第二探针(或反之亦然)。
另一方面，在一些情况下，可以设计探针以使其覆盖分析物的保守区域。因此，在一些情况下，探针(或探针对)可以与生物样品中的相似分析物杂交(例如，以检测保守的或相似的分析物)或不同生物样品(例如，跨不同物种)中的相似分析物杂交。
在一些实施方式中，探针组覆盖全部或几乎全部基因组(例如，人类基因组)。在探针组被设计为覆盖整个基因组(例如，人类基因组)的情况下，本文公开的方法可以无偏差方式(unbiased manner)检测分析物。在一些情况下，一个探针寡核苷酸对被设计为覆盖一种分析物(例如，转录物)。在一些情况下，设计多于一个探针寡核苷酸对(例如，包含第一探针和第二探针的探针对)以覆盖一种分析物(例如转录物)。例如，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个探针组可用于与单种分析物杂交。设计探针时要考虑的因素是单基因表达的变异(例如，SNP、突变)或多种同种型的存在。在一些情况下，探针寡核苷酸对不与整个分析物(例如，转录物)杂交，而是探针寡核苷酸对与整个分析物(例如，转录物)的部分杂交。
在一些情况下，在本文所述的方法中使用约5000、10,000、15,000、20,000或更多个探针寡核苷酸对(例如，包含第一探针和第二探针的探针对)。在一些情况下，在本文所述的方法中使用约20,000个探针寡核苷酸对
在一些情况下，RNA捕获是被靶RNA捕获(targeted RNA capture)。使用本文公开的方法的被靶RNA捕获允许检查来自整个转录组的RNA分析物的子集。在一些实施方式中，分析物的子集包括个体的靶标RNA。在一些实施方式中，分析物子集包括两种或更多种靶向RNA。在一些实施方式中，分析物子集包括由一种或多种靶向基因转录的一种或多种mRNA。在一些实施方式中，分析物子集包括一种或多种被靶基因的一种或多种mRNA剪接变体。在一些实施方式中，分析物子集包括生物样品中的非聚腺苷酸化RNA。在一些实施方式中，分析物子集包括检测生物样品中具有一种或多种单核苷酸多态性(SNP)的mRNA。
在一些实施方式中，分析物子集包括介导一组感兴趣基因表达的mRNA。在一些实施方式中，分析物子集包括共享等同或基本相似序列的mRNA，这些mRNA被翻译成具有相似官能团或蛋白质结构域的多肽。在一些实施方式中，分析物的子集包括不具有等同或基本相似序列的mRNA，这些mRNA被翻译成不共享相似官能团或蛋白质结构域的蛋白质。在一些实施方式中，分析物子集包括被翻译成在相同或相似生物途径中起作用的蛋白质的mRNA。在一些实施方式中，生物途径与病理疾病相关。例如，被靶RNA捕获可以检测癌症中过度表达或表达不足的基因。
在一些实施方式中，分析物子集包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约600、约700、约800、约900或约1000种分析物。
在一些情况下，本文公开的方法可以检测至少5,000、10,000、15,000、20,000或更多不同分析物的丰度和位置。
在一些实施方式中，通过本文提供的被靶RNA捕获方法检测的分析物子集包括一种或多种细胞的大部分转录组。例如，通过本文提供的被靶RNA捕获方法检测的分析物子集可以包括一种或多种细胞的转录组中存在的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多的mRNA。
在一些情况下，探针是DNA探针。在一些情况下，探针是含二核糖的探针。
探针和探针组的其它实施方式在本文中描述。
(i)第一探针
在一些实施方式中，本文所述的方法包括第一探针。如本文所用，“第一探针”可以指与分析物的全部或部分杂交并且可以连接到一个或多个其它探针(例如，第二探针或跨越探针)的探针。在一些实施方式中，“第一探针”可以与“第一探针寡核苷酸”互换使用。
在一些实施方式中，第一探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括与分析物杂交的脱氧核糖核酸，并且包括不是脱氧核糖核酸的寡核苷酸的部分。例如，在一些实施方式中，第一寡核苷酸的不是脱氧核糖核酸的部分是如本文所述的核糖核酸或任何其它非脱氧核糖核酸核酸。在第一探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第一探针与mRNA分子的杂交导致DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，第一探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在第一探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
在一些实施方式中，所述方法包括第一探针，该第一探针包含与分析物的一个或多个序列基本互补的一个或多个序列。在一些实施方式中，第一探针包括与分析物中的第一靶序列基本互补的序列。在一些实施方式中，与分析物中的第一靶序列基本互补的第一探针的序列与分析物中的第一靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在一些实施方式中，第一探针包括具有约10个核苷酸至约100个核苷酸的序列(例如，具有约10个核苷酸至约90个核苷酸，约10个核苷酸至约80个核苷酸，约10个核苷酸至约70个核苷酸，约10个核苷酸至约60个核苷酸，约10个核苷酸至约50个核苷酸，约10个核苷酸至约40个核苷酸，约10个核苷酸至约30个核苷酸，约10个核苷酸至约20个核苷酸，约20个核苷酸至约100个核苷酸，约20个核苷酸至约90个核苷酸，约20个核苷酸至约80个核苷酸，约20个核苷酸至约70个核苷酸，约20个核苷酸至约60个核苷酸，约20个核苷酸至约50个核苷酸，约20个核苷酸至约40个核苷酸，约20个核苷酸至约30个核苷酸，约30个核苷酸至约100个核苷酸，约30个核苷酸至约90个核苷酸，约30个核苷酸至约80个核苷酸，约30个核苷酸至约70个核苷酸，约30个核苷酸至约60个核苷酸，约30个核苷酸至约50个核苷酸，约30个核苷酸至约40个核苷酸，约40个核苷酸至约100个核苷酸，约40个核苷酸至约90个核苷酸，约40个核苷酸至约80个核苷酸，约40个核苷酸至约70个核苷酸，约40个核苷酸至约60个核苷酸，约40个核苷酸至约50个核苷酸，约50个核苷酸至约100个核苷酸，约50个核苷酸至约90个核苷酸，约50个核苷酸至约80个核苷酸，约50个核苷酸至约70个核苷酸，约50个核苷酸至约60个核苷酸，约60个核苷酸至约100个核苷酸，约60个核苷酸至约90个核苷酸，约60个核苷酸至约80个核苷酸，约60个核苷酸至约70个核苷酸，约70个核苷酸至约100个核苷酸，约70个核苷酸至约90个核苷酸，约70个核苷酸至约80个核苷酸，约80个核苷酸至约100个核苷酸，约80个核苷酸至约90个核苷酸，或约90个核苷酸至约100个核苷酸的序列)。
在一些实施方式中，与分析物中的序列基本互补的第一探针的序列包括约5个核苷酸至约50个核苷酸的序列(例如，约5个核苷酸至约45个核苷酸，约5个核苷酸至约40个核苷酸，约5个核苷酸至约35个核苷酸，约5个核苷酸至约30个核苷酸，约5个核苷酸至约25个核苷酸，约5个核苷酸至约20个核苷酸，约5个核苷酸至约15个核苷酸，约5个核苷酸至约10个核苷酸，约10个核苷酸至约50个核苷酸，约10个核苷酸至约45个核苷酸，约10个核苷酸至约40个核苷酸，约10个核苷酸至约35个核苷酸，约10个核苷酸至约30个核苷酸，约10个核苷酸至约25个核苷酸，约10个核苷酸至约20个核苷酸，约10个核苷酸至约15个核苷酸，约15个核苷酸至约50个核苷酸，约15个核苷酸至约45个核苷酸，约15个核苷酸至约40个核苷酸，约15个核苷酸至约35个核苷酸，约15个核苷酸至约30个核苷酸，约15个核苷酸至约25个核苷酸，约15个核苷酸至约20个核苷酸，约20个核苷酸至约50个核苷酸，约20个核苷酸至约45个核苷酸，约20个核苷酸至约40个核苷酸，约20个核苷酸至约35个核苷酸，约20个核苷酸至约30个核苷酸，约20个核苷酸至约25个核苷酸，约25个核苷酸至约50个核苷酸，约25个核苷酸至约45个核苷酸，约25个核苷酸至约40个核苷酸，约25个核苷酸至约35个核苷酸，约25个核苷酸至约30个核苷酸，约30个核苷酸至约50个核苷酸，约30个核苷酸至约45个核苷酸，约30个核苷酸至约40个核苷酸，约30个核苷酸至约35个核苷酸，约35个核苷酸至约50个核苷酸，约35个核苷酸至约45个核苷酸，约35个核苷酸至约40个核苷酸，约40个核苷酸至约50个核苷酸，约40个核苷酸至约45个核苷酸，或约45个核苷酸至约50个核苷酸)。
在一些实施方式中，第一探针包括功能序列。在一些实施方式中，功能序列包括引物序列。
在一些实施方式中，第一探针在3′末端包含至少两个核糖核酸碱基。在这种情况下，第二探针寡核苷酸在5′末端包含磷酸化核苷酸。在一些实施方式中，第一探针在3′末端包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个核糖核酸碱基。
如图6所示，可称为LHS探针的第一探针601的非限制性示例包括功能序列602、与分析物607中的第一靶序列基本互补的序列603和3′末端的两个核糖核酸碱基。
在一些实施方式中，第一探针包括不与分析物杂交的辅助序列。在一些实施方式中，辅助序列可用于与其它探针杂交。
(ii)第二探针
在一些实施方式中，本文所述的方法包括第二探针。如本文所用，“第二探针”可以指与分析物的全部或部分杂交并且可以连接到一个或多个其它探针(例如，第一探针或跨越探针)的探针。在一些实施方式中，“第二探针”可以与“第二探针寡核苷酸”互换使用。本领域技术人员将理解，探针的顺序是任意的，因此本文公开的第一探针和/或第二探针的内容是可互换的。
在一些实施方式中，第二探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括与分析物杂交的脱氧核糖核酸，并且包括不是脱氧核糖核酸的寡核苷酸的部分。例如，在一些实施方式中，第二探针的不是脱氧核糖核酸的部分是如本文所述的核糖核酸或任何其它非脱氧核糖核酸核酸。在第二探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第二探针与mRNA分子的杂交导致DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，第二探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在第一探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
在一些实施方式中，所述方法包括第二探针，该第二探针包含与分析物的一个或多个序列基本互补的一个或多个序列。在一些实施方式中，第二探针包括与分析物中的第二靶序列基本互补的序列。在一些实施方式中，与分析物中的第二靶序列基本互补的第二探针的序列与分析物中的第二靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在一些实施方式中，第二探针包括具有约10个核苷酸至约100个核苷酸的序列(例如，具有约10个核苷酸至约90个核苷酸，约10个核苷酸至约80个核苷酸，约10个核苷酸至约70个核苷酸，约10个核苷酸至约60个核苷酸，约10个核苷酸至约50个核苷酸，约10个核苷酸至约40个核苷酸，约10个核苷酸至约30个核苷酸，约10个核苷酸至约20个核苷酸，约20个核苷酸至约100个核苷酸，约20个核苷酸至约90个核苷酸，约20个核苷酸至约80个核苷酸，约20个核苷酸至约70个核苷酸，约20个核苷酸至约60个核苷酸，约20个核苷酸至约50个核苷酸，约20个核苷酸至约40个核苷酸，约20个核苷酸至约30个核苷酸，约30个核苷酸至约100个核苷酸，约30个核苷酸至约90个核苷酸，约30个核苷酸至约80个核苷酸，约30个核苷酸至约70个核苷酸，约30个核苷酸至约60个核苷酸，约30个核苷酸至约50个核苷酸，约30个核苷酸至约40个核苷酸，约40个核苷酸至约100个核苷酸，约40个核苷酸至约90个核苷酸，约40个核苷酸至约80个核苷酸，约40个核苷酸至约70个核苷酸，约40个核苷酸至约60个核苷酸，约40个核苷酸至约50个核苷酸，约50个核苷酸至约100个核苷酸，约50个核苷酸至约90个核苷酸，约50个核苷酸至约80个核苷酸，约50个核苷酸至约70个核苷酸，约50个核苷酸至约60个核苷酸，约60个核苷酸至约100个核苷酸，约60个核苷酸至约90个核苷酸，约60个核苷酸至约80个核苷酸，约60个核苷酸至约70个核苷酸，约70个核苷酸至约100个核苷酸，约70个核苷酸至约90个核苷酸，约70个核苷酸至约80个核苷酸，约80个核苷酸至约100个核苷酸，约80个核苷酸至约90个核苷酸，或约90个核苷酸至约100个核苷酸的序列)。
在一些实施方式中，与分析物中的序列基本互补的第二探针的序列包括约5个核苷酸至约50个核苷酸的序列(例如，约5个核苷酸至约45个核苷酸，约5个核苷酸至约40个核苷酸，约5个核苷酸至约35个核苷酸，约5个核苷酸至约30个核苷酸，约5个核苷酸至约25个核苷酸，约5个核苷酸至约20个核苷酸，约5个核苷酸至约15个核苷酸，约5个核苷酸至约10个核苷酸，约10个核苷酸至约50个核苷酸，约10个核苷酸至约45个核苷酸，约10个核苷酸至约40个核苷酸，约10个核苷酸至约35个核苷酸，约10个核苷酸至约30个核苷酸，约10个核苷酸至约25个核苷酸，约10个核苷酸至约20个核苷酸，约10个核苷酸至约15个核苷酸，约15个核苷酸至约50个核苷酸，约15个核苷酸至约45个核苷酸，约15个核苷酸至约40个核苷酸，约15个核苷酸至约35个核苷酸，约15个核苷酸至约30个核苷酸，约15个核苷酸至约25个核苷酸，约15个核苷酸至约20个核苷酸，约20个核苷酸至约50个核苷酸，约20个核苷酸至约45个核苷酸，约20个核苷酸至约40个核苷酸，约20个核苷酸至约35个核苷酸，约20个核苷酸至约30个核苷酸，约20个核苷酸至约25个核苷酸，约25个核苷酸至约50个核苷酸，约25个核苷酸至约45个核苷酸，约25个核苷酸至约40个核苷酸，约25个核苷酸至约35个核苷酸，约25个核苷酸至约30个核苷酸，约30个核苷酸至约50个核苷酸，约30个核苷酸至约45个核苷酸，约30个核苷酸至约40个核苷酸，约30个核苷酸至约35个核苷酸，约35个核苷酸至约50个核苷酸，约35个核苷酸至约45个核苷酸，约35个核苷酸至约40个核苷酸，约40个核苷酸至约50个核苷酸，约40个核苷酸至约45个核苷酸，或约45个核苷酸至约50个核苷酸)。
在一些实施方式中，第二探针包括捕获探针捕获域序列。如本文所用，“捕获探针捕获域”是可以与捕获探针的捕获域特异性结合的序列、结构域或部分。在一些实施方式中，“捕获域捕获域”可以与“捕获探针结合域”互换使用。在一些实施方式中，第二探针从5′到3′包括序列：与分析物中的序列基本互补的序列和捕获探针捕获域。
在一些实施方式中，捕获探针捕获域包括聚(A)序列。在一些实施方式中，捕获探针捕获域包括聚尿苷序列、聚胸苷序列或两者。在一些实施方式中，捕获探针捕获域包括随机序列(例如，随机六聚体或八聚体)。在一些实施方式中，捕获探针捕获域与检测特定感兴趣靶标的捕获探针中的捕获域互补。在一些实施方式中，提供了与捕获探针捕获域相互作用的捕获探针捕获域阻断部分。在一些实施方式中，捕获探针捕获域阻断部分包括与捕获探针捕获域互补或基本互补的序列。在一些实施方式中，捕获探针捕获域阻断部分防止捕获探针捕获域在存在时结合捕获探针。在一些实施方式中，在将捕获探针捕获域(例如，存在于连接的探针中)与捕获探针结合之前，去除捕获探针捕获域阻断部分。在一些实施方式中，捕获探针捕获域阻断部分包括聚尿苷序列、聚胸苷序列或两者。在一些实施方式中，捕获探针捕获域序列包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，捕获探针结合域序列包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，捕获探针结合域序列包括至少25、30或35个核苷酸。
在一些实施方式中，第二探针在5′末端包括磷酸化核苷酸。5′末端的磷酸化核苷酸可用于连接反应以将第二探针连接至第一探针。
如图6所示，可称为RHS探针的第二探针604的非限制性示例包括与分析物607上的第二靶序列基本互补的序列605和捕获探针捕获域606。
在一些实施方式中，第二探针包括不与分析物杂交的辅助序列。在一些实施方式中，辅助序列可用于与其它探针杂交。
(iii)多探针
在一些实施方式中，本文公开的靶RNA捕获方法包括多探针寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法包括2、3、4或更多个探针寡核苷酸。在一些实施方式中，各探针寡核苷酸包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，各探针寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，各探针寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。
在一些情况下，多探针跨越不同的靶序列，并且进行多个连续连接步骤以确定分析物的位置和丰度。
在一些情况下，所述方法包括使用第一探针和多个第二探针(或反之亦然)，其中多个第二探针与不同的序列(例如，野生型与突变体序列、不同的同种型、剪接变体)杂交，以便确定分析物的序列。应理解，该方法可用于检测单突变(例如，点突变、SNP、剪接变体等)或可用于检测多核苷酸突变(例如，插入、缺失等)。
本文提供的方法可应用于单个核酸分子或多个核酸分子。分析包含核酸分子的样品的方法可包括：提供多个核酸分子(例如，RNA分子)，其中各核酸分子包含第一靶标区域(例如，第一靶序列)和第二靶标区域(例如，第二靶序列)、多个第一探针寡核苷酸和多个第二探针寡核苷酸。在一些情况下，多个核酸分子的核酸分子的一个或多个靶标区域可包含相同序列。多个核酸分子中的核酸分子的第一和第二靶标区域(例如，第一和第二靶标序列)可以彼此相邻。
(iv)具有接头序列的第一探针
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，其中该方法包括含有接头的第一探针和第二探针。使用一对探针，其中第一探针包括接头序列，这可以在设计RTL探针时实现更大的灵活性，主要是通过增加分析物中可用作任选靶序列的序列。
如本文所用，“接头序列”可以指探针上的一个或多个核酸序列(例如，位于与分析物杂交的序列之间的第一探针、第二探针或跨越探针、连接探针的分析物特异性序列的序列)。在一些实施方式中，接头包括与靶分析物的序列或第一探针、第二探针或跨越探针的分析物特异性序列基本上不互补的序列。在一些实施方式中，接头序列包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸，其中接头内的序列与靶分析物或第一探针、第二探针或跨越探针的分析物特异性序列基本上不互补。
在第一和/或第二探针包括接头序列的一些实施方式中，接头序列可包括总共约10个核苷酸至约100个核苷酸，或本文所述的任何子范围。
在一些实施方式中，接头序列包括用作鉴别分析物的代用物的条形码序列。在一些实施方式中，条形码序列是与分析物中的序列至少70％相同的序列(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、或至少99％相同)。在接头序列包括条形码序列的一些实施方式中，条形码序列位于接头序列的5′。在接头序列包括条形码序列的一些实施方式中，条形码序列位于接头序列的3′。在一些实施方式中，条形码序列位于两个接头序列之间。在这种情况下，侧接条形码序列的两个接头序列可被认为是相同接头序列的部分。
在第一和/或第二探针包括接头序列的一些实施方式中，接头序列可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例包括包含接头序列的第一探针和第二探针，其包括：(a)使生物样品与包含多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包括捕获域和空间条形码；(b)使生物样品与第一探针和第二探针接触，其中第一探针的部分和第二探针的部分与分析物的相邻序列基本互补，其中第一探针包括：(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列；(ii)接头序列；(iii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列；并且其中第二探针包括与分析物的第三靶序列基本互补的序列和能够结合捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域；(c)使第一探针和第二探针杂交至分析物；(d)连接第一探针和第二探针，由此产生连接产物；(e)从分析物释放连接产物；(f)将捕获探针结合域与捕获域杂交；和(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并且采用确定的(i)和(ii)的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例，其中该方法包括含有接头的第一探针并且第二探针可包括如图8所示的构成部分。第一探针801包括功能序列802、与分析物的第一靶序列804基本互补的第一序列803、接头序列805；和与分析物的第二靶序列807基本互补的第二序列806。第二探针808包括序列809，其与分析物的第三靶序列810基本互补，和捕获探针捕获域811，其能够结合至捕获探针的捕获域。
1)第一探针
第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列、接头序列和与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，第一探针从5′到3′包括：与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列、接头序列和与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针包括功能序列。在一些实施方式中，第一探针包括功能序列、与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列、接头序列和与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，功能序列包括引物序列。
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基。在一些实施方式中，第一探针在3′末端包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个核糖核酸碱基。
在第一探针包括接头的一些实施方式中，第一探针包括约10个核苷酸至约300个核苷酸的序列(例如，约10个核苷酸至约300个核苷酸，约10个核苷酸至约250个核苷酸，约10个核苷酸至约200个核苷酸，约10个核苷酸至约150个核苷酸，约10个核苷酸至约100个核苷酸，约10个核苷酸至约50个核苷酸，约50个核苷酸至约300个核苷酸，约50个核苷酸至约250个核苷酸，约50个核苷酸至约200个核苷酸，约50个核苷酸至约150个核苷酸，约50个核苷酸至约100个核苷酸，约100个核苷酸至约300个核苷酸，约100个核苷酸至约250个核苷酸，约100个核苷酸至约200个核苷酸，约100个核苷酸至约150个核苷酸，约150个核苷酸至约300个核苷酸，约150个核苷酸至约250个核苷酸，约150个核苷酸至约200个核苷酸，约200个核苷酸至约300个核苷酸，约200个核苷酸至约250个核苷酸，或约250个核苷酸至约300个核苷酸)。
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列。在一些实施方式中，第一探针的第一序列与分析物中的第一靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，与第一靶序列基本互补的第一探针的第一序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第一探针包括接头的一些实施方式中，第一探针包括与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，第一探针的第二序列与分析物中的第二靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，与第二靶序列基本互补的第一探针的第二序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在一些实施方式中，包括接头序列的第一探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，包括接头序列的第一探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，包括接头序列的第一探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在包括接头序列的第一探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第一探针与mRNA分子的杂交产生DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，包含接头序列的第一探针仅包含脱氧核糖核苷酸，并且在第一探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
2)第二探针
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第二探针包括与分析物的第三靶序列基本互补的序列和能够结合捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域。在第一探针包括接头的一些实施方式中，第二探针包括约10个核苷酸至约100个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第一探针包括接头的一些实施方式中，第二探针的序列与分析物中的第三个靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，与第三靶序列基本互补的第二探针的序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第一靶序列不与第二靶序列相邻。例如，第一靶序列和第二靶序列位于同一mRNA分子的不同外显子上。在另一个例子中，第一靶序列和第二靶序列位于同一mRNA分子的相同外显子上但不相邻。在一些情况下，第一探针和第二探针杂交至相隔至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个核苷酸的序列。
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第二靶序列与第三靶序列直接相邻。
在第一探针包括接头序列的一些实施方式中，第二探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在第二探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第二探针与mRNA分子的杂交导致DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，第二探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在第二探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
(v)具有接头的第二探针
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，其中该方法包括第一探针和包含接头序列的第二探针。使用一对探针，其中第二探针包括一个接头序列，其可以在设计RTL探针时实现更大的灵活性，主要是通过增加分析物中可用作可选靶序列的序列。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例，其中该方法包括第一探针和包含接头的第二探针，包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包括捕获域和空间条形码；(b)使生物样品与第一探针和第二探针接触，其中第一探针的部分和第二探针的部分与分析物的相邻序列基本互补，其中第一探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的序列，其中第二探针包括：(i)与分析物的第二靶序列基本互补的第一序列；(ii)接头序列；(iii)与分析物的第三靶序列基本互补的第二序列；和(iv)能够与捕获探针的捕获域结合的捕获探针结合域；(c)使第一探针和第二探针杂交至分析物；(d)连接第一探针和第二探针，由此产生连接产物；(e)从分析物释放连接产物；(f)将捕获探针结合域与捕获域杂交；和(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并使用(i)和(ii)的经确定序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例，其中该方法包括第一探针和含有接头的第二探针，可包括如图9所示的构成部分。第一探针901包括功能序列902和与分析物的第一靶序列904基本互补的序列903。第二探针905包括与分析物的第二靶序列907基本互补的第一序列906、接头序列908；和与分析物的第二靶序列910基本互补的第二序列909，和能够结合至捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域911。
1)第一探针
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的序列。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针包括功能序列。在一些实施方式中，第一探针包括功能序列和与分析物的第一靶序列基本互补的序列。在一些实施方式中，功能序列包括引物序列。在一些实施方式中，第一探针寡核苷酸从5′至3′包括：功能序列，和与第一靶序列基本互补的序列。
在接头位于第二探针上的一些实施方式中，第一探针包括约10个核苷酸至约100个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在其中第二探针包括接头序列的一些实施方式中，与分析物的第一靶序列基本互补的第一探针的序列与分析物中的第一靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％互补。在一些实施方式中，与第一靶序列基本互补的序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基。在一些实施方式中，第一探针在3′末端包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个核糖核酸碱基。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第一探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在第一探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第一探针与mRNA分子的杂交导致DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，第一探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在第一探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
2)第二探针
在接头位于第二探针上的一些实施方式中，第二探针包括(i)与分析物的第二靶序列基本互补的第一序列；(ii)接头序列(例如，本文所述的任何示例性接头序列)；(iii)与分析物的第三靶序列基本互补的第二序列；和(iv)能够结合捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域(例如，本文所述的任何示例性捕获探针捕获域)。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第二探针包括约10个核苷酸至约300个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第二探针包括与分析物的第二靶序列基本互补的第一序列。在一些实施方式中，第二探针的第一序列与分析物中的第二靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，与第二靶序列基本互补的第二探针的第一序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第二探针包括与分析物的第三靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，第二探针的第二序列与分析物中的第三靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，与第三靶序列基本互补的第二探针的第二序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第二靶序列不与mRNA分子中的第三靶序列相邻。例如，第二靶序列和第三靶序列位于同一mRNA分子的不同外显子上。在另一个例子中，第二靶序列和第三靶序列位于同一mRNA分子的相同外显子上但不相邻。
在第二探针包括接头序列的一些实施方式中，第一靶序列与第二靶序列直接相邻。
在一些实施方式中，包括接头序列的第二探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，包括接头序列的第二探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，包括接头序列的第二探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在包括接头序列的第二探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第二探针与mRNA分子的杂交产生DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，包含接头序列的第二探针仅包含脱氧核糖核苷酸，并且在第二探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
(vii)在第一探针第二探针上具有接头的探针组合
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，其中该方法包括包含接头序列的第一探针和包含接头序列的第二探针。使用一对探针，其中第一探针和第二探针均包含接头序列，这使得设计RTL探针具有更大的灵活性，主要是通过增加分析物中可用作可选靶序列的序列。
(c)包括第一探针、第二探针和跨越探针的探针组合
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，其中该方法包括第一探针、跨越探针和第二探针。使用跨越探针(spanning probe)能在设计RTL探针时实现更大的灵活性，主要是通过增加分析物中可用作可选靶序列的序列。在一些情况下，使用跨越探针也可用于探询跨越更大距离的变体(例如，剪接变体)，可以使用具有接头序列的第一或第二探针进行探询。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例，其中该方法包括第一探针、跨越探针和第二探针，其包括：(a)将生物样品与包括多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包括捕获域和空间条形码；(b)使生物样品与第一探针、第二探针和一个或多个跨越探针接触，其中第一探针与分析物的第一部分基本互补，其中第二探针与分析物的第二部分基本互补并且还包括捕获探针结合域，并且其中跨越探针包括：(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列，和(ii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列；(c)将第一探针、第二探针和跨越探针与分析物杂交；(d)连接第一探针、一个或多个跨越探针和第二探针，由此产生与分析物基本互补的连接产物；(e)从分析物释放连接产物；(f)将捕获探针结合域与捕获域杂交；和(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，和使用(i)和(ii)的经确定序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例，其中该方法包括第一探针、第二探针和跨越探针，可包括如图10所示的构成部分。第一探针1001包括功能序列1002、与分析物的第一部分1004基本互补的序列1003。跨越探针1005包括与分析物的第一靶序列1007基本互补的第一序列1006、接头序列1008和与分析物的第二靶序列1010基本互补的第二序列1009。第二探针1011包括与分析物的第二部分1013基本互补的序列1012和捕获探针捕获域1014。
(i)第一探针
在该方法包括跨越探针的一些实施方式中，第一探针包括与分析物的第一部分基本互补的序列。在一些实施方式中，第一探针的序列与分析物的第一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，与分析物的第一部分基本互补的第一探针的序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。在一些实施方式中，第一探针包括功能序列。在一些实施方式中，功能序列是引物序列。
在该方法包括跨越探针的一些实施方式中，第一探针在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基。在一些实施方式中，第一探针在3′末端包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个核糖核酸碱基。
在该方法包括跨越探针的一些实施方式中，第一探针从5′到3′包括：功能序列、与分析物的第一部分基本互补的序列、以及两个或更多个核糖核酸碱基。
在该方法包括跨越探针的一些实施方式中，第一探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第一探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在第一探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第一探针与mRNA分子的杂交导致DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，第一探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在第一探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
(ii)跨越探针
在该方法包括跨越探针的一些实施方式中，跨越探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列和与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，跨越探针包括与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列、功能序列和与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。在一些实施方式中，跨越探针从5′到3′包括：第一序列、功能序列和第二序列。在一些实施方式中，功能序列是接头序列。接头序列可包括总共约10个核苷酸至约100个核苷酸，或本文所述的子范围中的任何数量。
在一些实施方式中，功能序列包括条形码序列。在一些实施方式中，跨越探针可以包括接头和条形码序列。在这种情况下，接头序列可以位于条形码的两侧，条形码可以在接头序列的5′端，或者条形码可以在接头序列的3′端。在一些实施方式中，条形码序列侧接5′接头序列(例如，本文所述的任何示例性接头序列)和3′接头序列(例如，本文所述的任何示例性接头序列)。
在一些实施方式中，跨越探针从5′到3′包括：第一序列、5′接头序列、条形码、3′接头序列和第二序列。
在一些实施方式中，跨越探针包括约10个核苷酸至约300个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在一些实施方式中，跨越探针的第一序列与分析物的第一靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方式中，跨越探针的第二序列与分析物的第二靶序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在一些实施方式中，跨越探针的第一序列和跨越探针的第二序列与同一外显子内的序列基本互补。
在一些实施方式中，分析物的第一靶序列和分析物的第二靶位于同一外显子内。在这种情况下，第一靶序列和第二靶序列不直接相邻。
在一些实施方式中，跨越探针的第一序列和跨越探针的第二序列与同一基因的不同外显子内的序列基本互补。在一些实施方式中，分析物的第一靶序列和分析物的第二靶序列位于同一基因的不同外显子上。
在一些实施方式中，跨越探针包括能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，跨越探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，跨越探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在跨越探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，跨越探针与mRNA分子的杂交产生DNA:RNA杂交体。在一些实施方式中，跨越探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在跨越探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
(iii)第二探针
在所述方法包括跨越探针的一些实施方式中，第二探针包括与分析物的第二部分基本互补的序列和捕获探针捕获域(例如，本文所述的任何示例性捕获探针捕获域)。
在所述方法包括跨越探针的一些实施方式中，第二探针的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％与分析物的第二部分互补。在一些实施方式中，与分析物的第二部分基本互补的第二探针的序列可包括约5个核苷酸至约50个核苷酸或本文所述的任何子范围的序列。
在所述方法包括跨越探针的一些实施方式中，分析物的第一部分与第一靶序列直接相邻，和/或分析物的第二部分与第二靶序列直接相邻。在这种情况下，第一探针的序列与跨越探针的第一序列连接，第二探针的序列与跨越探针的第二序列连接。在一些实施方式中，跨越探针在3′末端包含至少两个核糖核酸，第一探针在3′末端包含至少两个核糖核酸，或两者皆有。在一些实施方式中，跨越探针在5′端包括磷酸化核苷酸，第二探针在5′端包括磷酸化核苷酸，或两者皆有。
在所述方法包括跨越探针的一些实施方式中，第二探针包括能够参与Watson-Crick类型或类似碱基对相互作用的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或合成核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，第二探针包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在第二探针包括脱氧核糖核苷酸的一些实施方式中，第二探针与mRNA分子的杂交导致DNA:RNA杂交。在一些实施方式中，第二探针仅包括脱氧核糖核苷酸并且在第二探针与mRNA分子杂交后产生DNA:RNA杂交体。
(iv)包括第一探针、第二探针和多跨越探针的探针组合
本文还提供了用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，其中所述方法包括第一探针、至少两个跨越探针和第二探针。使用两个或更多跨越探针可以在设计RTL探针时实现更大的灵活性，主要是通过增加分析物中可用作任选靶序列的序列。在一些情况下，使用两个或更多个跨越探针也可以用于探询跨越可以使用一个跨越探针进行探询的更大距离的变体(例如，剪接变体)。
用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法的非限制性示例，其中所述方法包括第一探针、两个或更多个跨越探针和第二探针，包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包括捕获域和空间条形码；(b)使生物样品与第一探针、第二探针和两个跨越探针接触，其中第一探针与分析物的第一部分基本互补，其中第二探针与分析物的第二部分基本互补并且还包括捕获探针结合域，并且其中第一跨越探针包括：(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列，和(ii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列；并且第二跨越探针包括(i)与分析物的第三靶序列基本互补的第三序列，和(ii)与分析物的第四靶序列基本互补的第四序列；(c)使第一探针、第二探针和跨越探针与分析物杂交；(d)连接第一探针、一个或多个跨越探针和第二探针，从而产生与分析物基本互补的连接产物；(e)从分析物释放连接产物；(f)使捕获探针结合域与捕获域杂交；和(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补序列，和，利用(i)和(ii)的确定的序列以鉴别分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，包括一个或多个跨越探针的方法包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个跨越探针。在这种情况下，一个或多个跨越探针包括(i)与分析物的第三靶序列基本互补的第三序列，和(ii)与分析物的第四靶序列基本互补的第四序列。
在所述方法包括两个(或更多个)跨越探针的一些实施方式中，第一靶序列位于第一外显子中，第二靶序列位于第二外显子中，并且第三靶序列和第四靶序列位于第三个外显子中。在所述方法包括两个(或更多个)跨越探针的一些实施方式中，第一靶序列位于第一外显子中，第二靶序列位于第二外显子中，并且第三靶序列位于第三外显子中，并且第四靶序列位于第四外显子中。在所述方法包括两个(或更多个)跨越探针的一些实施方式中，第一靶序列和第二靶序列位于第一外显子中，并且第三靶序列和第四靶序列位于第二外显子中。在所述方法包括两个(或更多个)跨越探针的一些实施方式中，第一靶序列和第二靶序列位于第一外显子中，并且第三靶序列位于第二外显子中，且第四靶序列位于第三外显子中。
在一些实施方式中，其中方法包括两个(或多个)跨越探针，所述方法包括：第一探针连接到跨越探针，跨越探针连接到一个或多个其它跨越探针，以及一个或多个其它跨越探针跨越寡核苷酸连接到第二探针，由此产生包括与分析物基本互补的一个或多个序列的连接产物。在一些实施方式中，其中方法包括两个(或多个)跨越探针，所述方法包括：第一探针连接到一个或多个其它跨越探针，一个或多个其它跨越探针连接到跨越探针，以及跨越探针连接到第二探针，由此产生包括与分析物基本互补的一个或多个序列的连接产物。
在一些实施方式中，各其它跨越探针可以包括功能序列(例如，本文所述的任何功能序列)。例如，各其它跨越探针可以包括接头序列(例如，本文描述的任何示例性接头序列)。在另一个示例中，各其它跨越探针可以包括条形码序列(例如，本文所述的任何示例性条形码序列)和接头序列(例如，本文所述的任何接头序列)。在其它跨越探针包括条形码和接头的一些实施方式中，接头序列可以侧接条形码，条形码可以在接头序列的5′，或者条形码可以在接头序列的3′。在一些实施方式中，条形码序列侧接5′接头序列(例如，本文所述的任何示例性接头序列)和3′接头序列(例如，本文所述的任何示例性接头序列)。在一些实施方式中，其它跨越探针可以从5′到3′包括：第一序列、5′接头序列、条形码、3′接头序列和第二序列。
(d)预杂交方法
(i)成像和染色
在添加探针之前，在一些情况下，可以使用多种染色剂和染色技术对生物样品进行染色。在一些情况下，生物样品是载玻片上的切片(例如，10μm切片)。在一些情况下，生物样品在放置到载玻片上之后被干燥。在一些情况下，生物样品在42℃干燥。在一些情况下，干燥发生约1小时、约2小时、约3小时，或直到切片变得透明。在一些情况下，可以将生物样品干燥过夜(例如，在室温的干燥器中)。
在一些实施方式中，可使用任意数量的生物染色剂对样品进行染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、霍氏染色剂、碘、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或藏红。在一些情况下，本文公开的方法包括对生物样品进行成像。在一些情况下，样品成像发生在生物样品脱氨基之前。在一些情况下，样品可以使用已知的染色技术染色，包括坎格伦瓦染色(Can-Grunwald)、姬姆萨染色(Giemsa)、苏木精和伊红(H&E)、哲纳尔氏染色(Jenner′s)、利什曼染色(Leishman)、马松(Masson′s)三色、巴氏(Papanicolaou)、罗曼落司基染色(Romanowsky)、银染(silver)、苏丹(Sudan)、瑞氏染色(Wright′s)和/或PAS染色法染色技术。PAS染色通常在甲醛或丙酮固定后进行。在一些情况下，染剂是H&E染剂。
在一些实施方式中，可以使用如本文他处所述的可检测标记物(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样品进行染色。在一些实施方式中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在一些实施方式中，染色包括生物染色技术，例如H&E染色。在一些实施方式中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物。在一些实施方式中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术对生物样品进行染色。例如，可以通过使用一种技术(例如，H&E染色和明场成像)进行染色和成像，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜)对同一生物样品进行染色和成像，来制备生物样品。
在一些实施方式中，生物样品可以脱色。生物样品的去污或脱色方法在本领域是已知的，并且通常取决于应用于样品的染色剂的性质。例如，H&E染色可通过在HCl或任何其它酸中洗涤样品来脱色(例如，硒酸、硫酸、氢碘酸、苯甲酸、碳酸、苹果酸、磷酸、草酸、琥珀酸、水杨酸、酒石酸、亚硫酸、三氯乙酸、氢溴酸、盐酸、硝酸、正磷酸、砷酸、亚硒酸、铬酸、柠檬酸、氢氟酸、亚硝酸、异氰酸、甲酸、硒化氢、钼酸、乳酸、乙酸、碳酸、硫化氢或其组合)。在一些实施方式中，脱色可以包括在酸(例如HCl)中的1、2、3、4、5或更多次洗涤。在一些实施方式中，脱色可包括将HCl添加到下游溶液(例如透化溶液)中。在一些实施方式中，脱色可包括在酸(例如HCl)溶液中溶解所公开方法中使用的酶(例如胃蛋白酶)。在一些实施方式中，在用酸对苏木精脱色后，可向脱色溶液中添加其他试剂以升高pH用于其他应用。例如，可以向酸脱色溶液中添加SDS以与单独酸脱色溶液相比升高pH。作为另一个示例，在一些实施方式中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂施用于样品。这些染色剂可以使用例如通过还原剂和洗涤剂洗涤处理的二硫键的裂解、潮变性盐处理、抗原回收溶液处理和酸性甘氨酸缓冲液处理等技术移除。例如，Bolognesi等，J.Histochem.Cytochem.2017；65(8)：431-444，Lin等，Nat Commun.2015；6：8390，Pirici等，J.Histochem.Cytochem.2009；57：567-75，和Glass等，J.Histochem.Cytochem.2009；57：899-905中描述了多重染色和脱色的方法，其全部内容通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，免疫荧光或免疫组织化学方案(直接和间接染色技术)可以作为本文呈现的示例性空间工作流程的部分或附加部分来执行。例如，可以根据本文所述的方法固定组织切片。可以将生物样品转移至阵列(例如，捕获探针阵列)，其中使用免疫荧光方案探测分析物(例如，蛋白质)。例如，可以对样品进行再水合、封闭和透化(3XSSC、2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNA酶抑制剂，4℃持续10分钟)，然后用荧光一抗染色(1∶100于3XSSC，2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNA酶抑制剂，4℃持续30分钟)。可对生物样品进行洗涤、加盖玻片(在甘油+1U/μl RNA酶抑制剂中)、成像(例如，使用共聚焦显微镜或其他能够进行荧光检测的装置)、洗涤和处理(根据本文所述的分析物捕获或空间工作流程)。
在一些情况下，可以将甘油溶液和盖玻片添加到样品中。在一些情况下，甘油溶液可以包括复染剂(例如，DAPI)。
如本文所用，抗原修复缓冲液可改善IF/IHC方案中的抗体捕获。抗原修复的示例性方案可以是预热抗原修复缓冲液(例如，至95℃)，将生物样品浸入加热的抗原修复缓冲液中持续预定时间，然后从抗原修复缓冲液中取出生物样品并洗涤生物样品。
在一些实施方式中，优化透化对于鉴定细胞内分析物可能是有用的。透化优化可以包括选择透化剂、透化剂的浓度和透化持续时间。组织透化在本文别处讨论。
在一些实施方式中，在标记(1abeling)生物样品的准备过程中封闭阵列和/或生物样品能降低抗体与阵列和/或生物样品的非特异性结合(减低背景)。一些实施方式提供了可以在施用标记物之前和/或期间施加的封闭缓冲液/封闭溶液，其中封闭缓冲液可以包括封闭剂和任选的表面活性剂和/或盐溶液。在一些实施方式中，封闭剂可以是牛血清白蛋白(BSA)、血清、明胶(例如鱼明胶)、牛奶(例如脱脂奶粉)、酪蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、生物素封闭剂、过氧化物酶封闭剂、左旋咪唑、卡诺伊溶液(Carnoy′s solution)、甘氨酸、赖氨酸、硼氢化钠、泮胺天蓝(pontamine sky blue)、苏丹黑、台盼蓝、FITC封闭剂和/或醋酸。封闭缓冲液/封闭溶液可以在对生物样品进行标记(例如，应用偶联了荧光团的抗体)之前和/或期间施用于阵列和/或生物样品。
(ii)样品制备供探针应用
在一些情况下，生物样品被脱蜡。脱蜡可以使用本领域已知的任何方法实现。例如，在一些情况下，生物样品用包括二甲苯和各种浓度的乙醇的一系列洗涤液处理。在一些情况下，脱蜡方法包括处理二甲苯(例如，每次5分钟洗涤3次)。在一些情况下，所述方法还包括用乙醇处理(例如，100％乙醇，每次洗涤两次，每次10分钟；95％乙醇，每次洗涤两次，每次10分钟；70％乙醇，每次洗涤两次，每次10分钟；50％乙醇，每次洗涤两次每次10分钟)。在一些情况下，在乙醇洗涤之后，可以用去离子水洗涤生物样品(例如，每次洗涤两次，每次5分钟)。可以理解，本领域技术人员可以调整这些方法以优化脱蜡。
在一些情况下，生物样品是去交联的。在一些情况下，生物样品在含有TE缓冲液(包括Tris和EDTA)的溶液中去交联。在一些情况下，TE缓冲液是碱性的(例如，在约9的pH下)。在一些情况下，去交联发生在约50℃至约80℃。在一些情况下，去交联发生在约70℃。在一些情况下，去交联在70℃发生约1小时。就在去交联之前，可以用酸(例如，0.1M HCl，约1分钟)处理生物样品。在去交联步骤之后，可以洗涤生物样品(例如，用1x PBST)。
在一些情况下，制备用于探针应用的生物样品的方法包括对样品进行透化。在一些情况下，使用磷酸盐缓冲液对生物样品进行透化。在一些情况下，磷酸盐缓冲液是PBS(例如，1x PBS)。在一些情况下，磷酸盐缓冲液是PBST(例如，1x PBST)。在一些情况下，透化步骤进行多次(例如，每次5分钟3次)。
在一些情况下，制备用于探针应用的生物样品的方法包括平衡和封闭生物样品的步骤。在一些情况下，使用杂交前(pre-Hyb)缓冲液进行平衡。在一些情况下，pre-Hyb缓冲液不含RNA酶。在一些情况下，pre-Hyb缓冲液不含牛血清白蛋白(BSA)、Denhardt氏溶液或其它可能被核酸酶污染的生物材料。
在一些情况下，平衡步骤进行多次(例如，2次，每次5分钟；3次，每次5分钟)。在一些情况下，生物样品用封闭缓冲液封闭。在一些情况下，封闭缓冲液包括运载体(例如tRNA)，例如来自啤酒酵母的酵母tRNA(例如，终浓度为10-20μg/mL)。在一些情况下，封闭可以执行5、10、15、20、25或30分钟。
任何前述步骤都可以针对性能进行优化。例如，可以改变温度。在一些情况下，预杂交方法在室温下进行。在一些情况下，预杂交方法在4℃进行(在一些情况下，改变本文提供的时间范围)。
(e)杂交探针
在一些实施方式中，本文提供的被靶RNA捕获的方法包括使第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸(例如，探针对)杂交。在一些情况下，第一和第二探针寡核苷酸各自包括与感兴趣分析物的一个或多个序列(例如，一个或多个靶序列)基本互补的序列。在一些实施方式中，第一探针和第二探针与彼此完全相邻(即，没有核苷酸间隙)或在同一转录物上的互补序列结合。
在一些情况下，所述方法包括探针组的杂交，其中探针对在培养基中的浓度为约1至约100nM。在一些情况下，探针对的浓度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500nM。在一些情况下，探针对的浓度为5nM。在一些情况下，探针组在杂交(Hyb)缓冲液中稀释。在一些情况下，探针组在Hyb缓冲液中的浓度为5nM。
在一些情况下，探针杂交发生在约50℃。在一些情况下，探针杂交的温度范围为约30℃至约75℃、约35℃至约70℃或约40℃至约65℃。在一些实施方式中，温度为约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃，约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃。在一些情况下，探针杂交发生约30分钟、约1小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或更长时间。在一些情况下，探针杂交在50℃发生约2.5小时。
在一些情况下，杂交缓冲液包括SSC(例如，1xSSC)或SSPE。在一些情况下，杂交缓冲液包括甲酰胺或碳酸亚乙酯。在一些情况下，杂交缓冲液包括一种或多种盐，例如Mg盐例如MgCl2、Na盐例如NaCl、Mn盐例如MnCl2。在一些情况下，杂交缓冲液包括Denhardt溶液、硫酸葡聚糖、聚蔗糖、PEG或其它杂交速率促进剂。在一些情况下，杂交缓冲液包括运载体，例如酵母tRNA、鲑鱼精子DNA和/或λ噬菌体DNA。在一些情况下，杂交缓冲液包含一种或多种阻断剂。在一些情况下，杂交缓冲液包括RNA酶抑制剂。在一些情况下，杂交缓冲液可以包括BSA、序列特异性阻断剂、非特异性阻断剂、EDTA、RNA酶抑制剂、甜菜碱、TMAC或DMSO。在一些情况下，杂交缓冲液还可包括去污剂，例如吐温、曲通-X100、肌氨酰和SDS。在一些情况下，杂交缓冲液包括无核酸酶水、DEPC水。
在一些实施方式中，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸结合的互补序列彼此相距1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。探针寡核苷酸之间的间隙可以在连接之前先进行填充，使用例如Mu聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶和/或其任何组合、衍生物和变体(例如，工程化突变体)。在一些实施方式中，当第一和第二探针寡核苷酸彼此隔开一个或多个核苷酸时，核苷酸连接在第一和第二探针寡核苷酸之间。在一些实施方式中，当第一和第二探针寡核苷酸彼此隔开一个或多个核苷酸时，脱氧核糖核苷酸连接在第一和第二探针寡核苷酸之间。
在一些情况下，杂交后，用杂交后洗涤缓冲液洗涤生物样品。在一些情况下，杂交后洗涤缓冲液包括SSC、酵母tRNA、甲酰胺、碳酸亚乙酯和无核酸酶水中的一种或多种。
进一步提供了关于探针杂交的其它的实施方式。
(i)杂交温度
在一些实施方式中，所述方法利用在连接位点处包括脱氧核糖核酸(而不是严格利用核糖核苷酸)的寡核苷酸。在本文描述的方法中使用脱氧核糖核酸产生更均匀的效率，其对于各种应用而言可以容易地控制和灵活。
在一个非限制性示例中，本文公开的方法包括将生物样品与包括第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)的多个寡核苷酸(例如，探针)接触，其中第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)分别与分析物中存在的第一序列和分析物中存在的第二序列互补；在第一温度将第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与分析物杂交；在第二温度将第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与第三寡核苷酸(例如，夹板寡核苷酸)杂交，从而使得第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)彼此邻接；将第一寡核苷酸(例如，第一探针)连接到第二寡核苷酸(例如，第二探针)以产生连接产物；使生物样品与基材接触，其中捕获探针固定在基材上，其中捕获探针包括空间条形码和捕获域；允许连接产物与捕获域特异性结合；和确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，和使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置；其中第一寡核苷酸(例如第一探针)、第二寡核苷酸(例如第二探针)和第三寡核苷酸是DNA寡核苷酸，并且其中第一温度是比第二温度更高的温度。
所述方法的一个非限制性示例示于图11。包括分析物1101的生物样品与第一探针1102和第二探针1103接触。第一探针1102和第二探针1103分别在第一靶序列1104和第二靶序列1105处与分析物杂交。第一探针和第二探针包括游离端1107-1110。如图11所示，第一和第二靶序列在分析物中不直接相邻。杂交后，未结合的第一和第二探针被洗去。然后，第三寡核苷酸1106分别在1108和1109处与第一和第二探针杂交。杂交后，第一探针被延伸1112并且产生包括第一探针序列和第二探针序列的连接产物。或者，作为延伸第一探针替代，第三寡核苷酸用于将第一探针和第二探针“结合”在一起。在这种情况下，通过第三寡核苷酸结合在一起的第一探针和第二探针可以被称为连接产物。连接产物然后与基材1111接触，并且连接产物结合到基材1111的捕获探针1113，于阵列上的不同空间位置。在一些实施方式中，生物样品在与第一探针和第二探针接触之前与基材1111接触。
在一些实施方式中，第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)在第一温度与分析物杂交。在一些实施方式中，第一温度范围为约50℃至约75℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃。在一些实施方式中，第一温度为约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃。
在一些实施方式中，在使第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与分析物杂交的步骤之后，进行洗涤步骤以去除未结合的寡核苷酸(例如，探针)。洗涤步骤可以使用本文所述的任何洗涤方法和溶液进行。
在一些实施方式中，在使第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与分析物杂交的步骤之后，将第三寡核苷酸(例如，夹板寡核苷酸)添加到分析物。在一些实施方式中，第三寡核苷酸是寡核苷酸。在一些实施方式中，第三寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
在一些实施方式中，第三寡核苷酸包括与第一探针寡核苷酸的部分(例如，未与分析物杂交的第一探针的部分(例如，辅助序列))至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的序列。在一些实施方式中，第三寡核苷酸包括与第一寡核苷酸的部分(例如第一探针)100％互补的序列。在一些实施方式中，第三寡核苷酸包括与第二探针寡核苷酸的部分(例如，未与分析物杂交的第二探针的部分(例如，辅助序列))至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的序列。在一些实施方式中，第三寡核苷酸包括与第二寡核苷酸(例如第二探针)的部分100％互补的序列。在一些实施方式中，第三寡核苷酸在互补部分与第一寡核苷酸(例如，第一探针)杂交。在一些实施方式中，第三寡核苷酸与第二寡核苷酸(例如，第二探针)在互补部分杂交。
在一些实施方式中，第三寡核苷酸在第二温度与第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)杂交。在一些实施方式中，第二温度低于第一和第二寡核苷酸(例如，第一和第二探针)结合分析物的第一温度。在一些实施方式中，第二温度在约15℃至约35℃、约20℃至约30℃或约25℃至约30℃的范围内。在一些实施方式中，第一温度为约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃或约35℃。包括第三，或夹板寡核苷酸的方法已在美国专利号2019/0055594A1中描述，其全部内容通过引用方式纳入本文。
在一些实施方式中，在第三寡核苷酸与分析物杂交的步骤之后，进行洗涤步骤以去除未结合的第三寡核苷酸。洗涤步骤可以使用本文所述的任何洗涤方法和溶液进行。在一些实施方式中，在洗涤步骤之后，第一和第二寡核苷酸(例如，第一和第二探针)结合至(例如，杂交到)分析物，并且第三寡核苷酸结合至(例如，杂交到)第一和第二寡核苷酸(例如，在第一和第二探针未与分析物结合的部分处)。
在一些实施方式中，第一寡核苷酸(例如，第一探针)、第二寡核苷酸(例如，第二探针)和第三寡核苷酸被同时添加到生物样品中。然后，在一些实施方式中，将温度调节至第一温度以允许第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)与生物样品中的分析物杂交。接着，将温度调节至第二温度以允许第三寡核苷酸与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交。
在第三寡核苷酸与第一探针和第二探针杂交的一些实施方式中，所述第一探针和第二探针与分析物中不直接相邻的靶序列杂交，第三寡核苷酸被延伸以填充第一探针和第二探针之间的间隙。在一些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸探针之一(例如，第一探针)。例如，如图11所示，第一探针1102延伸1112以填充第一探针1102和第二探针1103之间的间隙1114。
在一些实施方式中，进行连接步骤。可以使用本文所述的任何方法进行连接。在一些实施方式中，所述步骤包括连接第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)，形成连接产物。在一些实施方式中，第三寡核苷酸用作寡核苷酸夹板以促进第一寡核苷酸(例如，第一探针)和第二寡核苷酸(例如，第二探针)的连接。在一些实施方式中，连接是化学连接。在一些实施方式中，连接是酶促连接。在一些实施方式中，连接酶是T4RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
(ii)杂交缓冲液
在一些实施方式中，第一探针和第二探针在杂交缓冲液中与分析物杂交。在一些情况下，杂交缓冲液含有甲酰胺。在其它情况下，杂交缓冲液不含甲酰胺。甲酰胺对人类不友好，已知它具有健康危害性。在化学上，它会随着时间的推移而氧化，从而影响试剂的保质期，最重要的是影响试剂的功效。因此，本文所述的方法可包括不含甲酰胺的缓冲液，包括不含甲酰胺的杂交缓冲液。
在一些实施方式中，不含甲酰胺的杂交缓冲液是盐水-柠檬酸钠(SSC)杂交缓冲液。在一些实施方式中，SSC以约1xSSC至约6xSSC(例如，约1xSSC至约5xSSC、约1xSSC至约4xSSC、约1xSSC至约3xSSC、约1xSSC至大约2xSSC，大约2xSSC至大约6xSSC，大约2xSSC至大约5xSSC，大约2xSSC至大约4xSSC，大约2xSSC至大约3xSSC，大约3xSSC至大约5xSSC，大约3xSSC至约4xSSC，约4xSSC至约6xSSC，约4xSSC至约6xSSC，约4xSSC至约5xSSC，或约5xSSC至约6xSSC)存在于SSC杂交缓冲液中。在一些实施方式中，SSC以约2xSSC至约4xSSC存在于SSC杂交缓冲液中。在一些实施方式中，可以使用SSPE杂交缓冲液。
在一些实施方式中，SSC杂交缓冲液包含溶剂。在一些实施方式中，溶剂包含碳酸亚乙酯而不是甲酰胺(2020，Kalinka等，Scientia Agricola78(4)：e20190315)。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约10％(w/v)至约25％(w/v)(例如，约10％(w/v)至约20％(w/v))、约10％(w/v)至约15％(w/v)、约15％(w/v)至约25％(w/v)、约15％(w/v)至约20％(w/v)，或约20％(w/v)至约25％(w/v))存在于SSC杂交缓冲液中。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约15％(w/v)至约20％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约10％(w/v)、约11％(w/v)、约12％(w/v)、约13％(w/v)、约13％(w/v)、约14％(w/v)、约15％(w/v)、约16％(w/v)、约17％(w/v)、约18％(w/v)、约19％(w/v)/v)、约20％(w/v)，约21％(w/v)、约22％(w/v)、约23％(w/v)、约24％(w/v)或约25％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约13％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。
在一些实施方式中，SSC杂交缓冲液所处温度为约40℃至约60℃(例如，约40℃至约55℃、约40℃至约50℃、约40℃至约40℃约45℃、约45℃至约60℃、约45℃至约55℃、约45℃至约50℃、约50℃至约60℃、约50℃至约50℃约55℃，或约55℃至约60℃)。在一些实施方式中，SSC杂交缓冲液处于约45℃至约55℃或本文所述的任何子范围的温度。在一些实施方式中，SSC杂交缓冲液的温度为约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃，约48℃，约49℃，约50℃，约51℃，约52℃，约53℃，约54℃，约55℃，约56℃，约57℃℃、约58℃、约59℃或约60℃。在一些实施方式中，SSC杂交缓冲液的温度为约50℃。
在一些实施方式中，SSC杂交缓冲液还包含运载体、促聚物(crowder)或添加剂中的一种或多种。可包含在杂交缓冲液中的运载体的非限制性示例包括：酵母tRNA、鲑鱼精子DNA、λ噬菌体DNA、糖原和胆固醇。可包含在杂交缓冲液中的分子聚集物的非限制性示例包括：Ficoll、葡聚糖、Denhardt氏溶液和PEG。可包含在杂交缓冲液中的添加剂的非限制性示例包括：结合阻断剂、RNA酶抑制剂、Tm调节剂和用于松弛二级核酸结构的佐剂(例如甜菜碱、TMAC和DMSO)。此外，杂交缓冲液可以包括去污剂，例如SDS、吐温、曲通-X100和肌氨酰(例如，N-月桂酰肌氨酸钠盐)。本领域技术人员应理解，用于核酸杂交的缓冲液可包括许多能够增强杂交反应的不同化合物。
(f)洗涤
在一些实施方式中，本文公开的方法还包括洗涤步骤。洗涤步骤去除任何未结合的探针。洗涤步骤可以在本文公开的方法中的任何步骤之间进行。例如，可以在向生物样品添加探针之后进行洗涤步骤。由此，游离/未结合的探针被冲走，只留下与分析物杂交的探针。在一些情况下，在本文公开的方法之间发生多个(即，至少2、3、4、5或更多个)洗涤步骤。洗涤步骤可以以各时间(例如，1、2、3、4或5分钟)和温度(例如，室温；本领域已知且由本领域技术人员确定的4℃)进行。
在一些情况下，使用洗涤缓冲液进行洗涤步骤。在一些情况下，洗涤缓冲液包括SSC(例如，1xSSC)。在一些情况下，洗涤缓冲液包括PBS(例如，1xPBS)。在一些情况下，洗涤缓冲液包括PBST(例如，1xPBST)。在一些情况下，洗涤缓冲液还可包括甲酰胺或不含甲酰胺。
本文提供了关于洗涤步骤的附加实施方式。
(i)不含甲酰胺的洗涤缓冲液
在一些实施方式中，在连接第一探针和第二探针之后，从阵列移除一个或多个未杂交的第一探针、一个或多个未杂交的第二探针或两者。在一些实施方式中，在连接第一探针、一个或多个跨越探针和第二探针之后，从阵列移除一个或多个未杂交的第一、第二和/或跨越探针。在一些实施方式中，在连接第一探针、第二探针和第三寡核苷酸之后，从阵列移除一个或多个未杂交的第一探针、一个或多个未杂交的第二探针或一个或多个第三寡核苷酸或以上全部。
在一些实施方式中，预杂交缓冲液用于洗涤样品。在一些实施方式中，使用磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，进行多次洗涤步骤以去除未结合的寡核苷酸。
在一些实施方式中，移除包括在不含甲酰胺的洗涤缓冲液中从阵列洗涤一个或多个未杂交的探针(例如，第一探针、第二探针、跨越探针、其它跨越探针和第三寡核苷酸)。
在一些实施方式中，不含甲酰胺的洗涤缓冲液是SSC洗涤缓冲液。在一些实施方式中，SSC以约0.01xSSC至约1xSSC(例如，约0.01x SSC至约0.5x SSC，0.01x SSC至约0.1xSSC，约0.01x SSC至约0.05x SSC，约0.05x SSC至约1x SSC，约0.05x SSC至约0.5x SSC，约0.05x SSC至约0.1x SSC，约0.1x SSC至约1x SSC，约0.1x SSC至约0.5x SSC，或约0.5xSSC至约1x SSC)存在于SSC洗涤缓冲液中。在一些实施方式中，SSC以约0.01xSSC，约0.02xSSC，约0.03xSSC，约0.04xSSC，约0.05xSSC，约0.06xSSC，约0.07xSSC，约0.08xSSC，约0.09xSSC，约0.1xSSC，约0.2xSSC，约0.3xSSC，约0.4xSSC，约0.5xSSC，约0.6xSSC，约0.7xSSC，约0.8xSSC，约0.9xSSC，或约0.1xSSC存在于SSC洗涤缓冲液中。在一些实施方式中，SSC以约0.1x SSC存在于SSC洗涤缓冲液中。
在一些实施方式中，SSC洗涤缓冲液包含去污剂。在一些实施方式中，去污剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中，SDS以约0.01％(v/v)至约0.5％(v/v)(例如，约0.01％(v/v)至约0.4％(v/v)，约0.01％(v/v)至约0.3％(v/v)，约0.01％(v/v)至约0.2％(v/v)，约0.01％(v/v)至约0.1％(v/v)，约0.05％(v/v)至约0.5％(v/v)，约0.05％(v/v)至约0.4％(v/v)，约0.05％(v/v)至约0.3％(v/v)，约0.05％(v/v)至约0.2％(v/v)，约0.05％(v/v)至约0.1％(v/v)，约0.1％(v/v)至约0.5％(v/v)，约0.1％(v/v)至约0.4％(v/v)，约0.1％(v/v)至约0.3％(v/v)，约0.1％(v/v)至约0.2％(v/v)，约0.2％(v/v)至约0.5％(v/v)，约0.2％(v/v)至约0.4％(v/v)，约0.2％(v/v)至约0.3％(v/v)，约0.3％(v/v)至约0.5％(v/v)，约0.3％(v/v)至约0.4％(v/v)，或约0.4％(v/v)至约0.5％(v/v))存在于SSC洗涤缓冲液中。在一些实施方式中，SDS以约0.01％(v/v)，约0.02％(v/v)，约0.03％(v/v)，约0.04％(v/v)，约0.05％(v/v)，约0.06％(v/v)，约0.07％(v/v)，约0.08％(v/v)，约0.09％(v/v)，约0.10％(v/v)，约0.2％(v/v)，约0.3％(v/v)，约0.4％(v/v)，或约0.5％(v/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。在一些实施方式中，SDS以约0.1％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。在一些实施方式中，肌氨酰可存在于SSC洗涤缓冲液中。
在一些实施方式中，SSC洗涤缓冲液包含溶剂。在一些实施方式中，溶剂包括碳酸亚乙酯。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约10％(w/v)至约25％(w/v)或本文所述的任何子范围存在于SSC洗涤缓冲液中。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约15％(w/v)至约20％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。在一些实施方式中，碳酸亚乙酯以约16％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
在一些实施方式中，SSC洗涤缓冲液的温度为约50℃至约70℃(例如，约50℃至约65℃，约50℃至约60℃，约50℃至约50℃约55℃，约55℃至约70℃，约55℃至约65℃，约55℃至约60℃，约60℃至约70℃，约60℃至约65℃，或约65℃至约70℃)。在一些实施方式中，SSC洗涤缓冲液处于约55℃至约65℃的温度。在一些实施方式中，SSC洗涤缓冲液的温度为约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃或约70℃。在一些实施方式中，SSC洗涤缓冲液处于约60℃的温度。
在一些实施方式中，所述方法包括释放连接产物，其中释放在洗涤阵列以去除一个或多个未杂交的第一和第二探针之后进行。
(g)连接
在一些实施方式中，在探针寡核苷酸(例如，第一探针、第二探针、跨越探针、其它跨越探针和/或第三寡核苷酸)与分析物杂交之后，可使探针(例如，第一探针、第二探针、跨越探针、其它跨越探针和/或第三寡核苷酸)连接在一起，产生包括与分析物互补的一个或多个序列的单一连接产物。如本文所述，连接可以通过酶促或化学方式进行。
在一些情况下，连接是使用连接酶(例如，T4 RNA连接酶(Rnl2)、SplintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶)的酶促连接反应。关于KOD连接酶的描述请参见，例如Zhang等；RNA Biol.2017；14(1)：36-44，通过引用其全文方式纳入本文。在酶促连接反应之后，可以认为探针(例如，第一探针、第二探针、跨越探针、其它跨越探针和/或第三寡核苷酸)被连接。
在一些实施方式中，聚合酶催化连接产物的互补链的合成，产生双链连接产物。在一些情况下，聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶具有5′至3′聚合酶活性。在一些实施方式中，聚合酶具有用于校对的3′至5′外切核酸酶活性。在一些实施方式中，聚合酶具有用于校对的5′到3′聚合酶活性和3′到5′外切核酸酶活性。
在一些实施方式中，探针(例如，第一探针、第二探针、跨越探针、其它跨越探针和/或第三寡核苷酸)可各自包含反应部分，从而使得在与靶标杂交并暴露于适当的连接条件下时，探针寡核苷酸可以彼此连接。在一些实施方式中，包括反应部分的探针寡核苷酸被化学连接。例如，能够与核酸分子的第一靶区(例如，第一靶序列或第一部分)杂交的第一探针可以包含第一反应部分，并且能够与核酸分子的第二靶区(例如，第二靶序列或第二部分)杂交的第二探针寡核苷酸可以包含第二反应部分。当第一和第二探针与核酸分子的第一和第二靶区(例如，第一和第二靶序列)杂交时，第一和第二反应部分可以彼此相邻。探针的反应部分可以选自以下非限制性的组：叠氮化物、炔烃、硝酮(例如，1，3-硝酮)、受应力烯烃(例如，反式环烯烃，例如环辛烯或氧降冰片二烯)、四嗪、四唑、碘化物、硫代盐(例如硫代磷酸酯)、酸、胺和磷酸盐。例如，第一探针的第一反应部分可包含叠氮化物部分，而第二探针的第二反应部分可包含炔部分。第一和第二反应部分可以反应形成连接部分。第一和第二反应部分之间的反应可以是例如环加成反应，例如应力促进的叠氮化物-炔环加成、铜催化的叠氮化物-炔环加成、应力促进的炔-硝酮环加成、Diels-A1der反应、[3+2]环加成、[4+2]环加成或[4+1]环加成；硫醇-烯反应；亲核取代(substation)反应；或其它反应。在一些情况下，第一和第二反应部分之间的反应可产生三唑部分或异噁唑啉部分。第一和第二反应部分之间的反应可包括使反应部分经受合适的条件，例如合适的温度、pH或压强，并提供用于反应的一种或多种试剂或催化剂。例如，第一和第二反应部分之间的反应可以由铜催化剂、钌催化剂或受应力物质(例如二氟辛炔、二苄基环辛炔或二芳基氮杂环辛炔)催化。与核酸分子的第一靶区(例如，第一靶序列或第一部分)杂交的第一探针的第一反应部分和与核酸分子的第二靶区(例如，第一靶序列或第一部分)杂交的第三探针寡核苷酸的第二反应部分之间的反应可以连接第一探针和第二探针以提供连接的探针。连接后，第一和第二探针可被认为是连接的。因此，第一和第二反应部分的反应可以包括化学连接反应，例如铜催化的5′叠氮化物到3′炔“点击”化学反应，以在两个探针寡核苷酸之间形成三唑键。在其它非限制性示例中，碘化物部分可与硫代磷酸酯部分化学连接以形成硫代磷酸酯键，酸可与胺连接以形成酰胺键，和/或磷酸酯和胺可连接以形成氨基磷酸酯键。
图12A-12E说明代表性反应的示例。图12A显示炔部分1202和叠氮化部分1204在铜介导的环加成作用下反应形成三唑键1206的化学连接反应。图12B显示硫代磷酸酯基团1208与碘化物基团1210的化学连接反应以形成硫代磷酸酯键1212。图12C显示酸1214和胺1216形成酰胺键1218的化学连接反应。图12D显示磷酸酯部分1220和胺部分1222的化学连接反应以形成氨基磷酸酯键1224。图12E显示了两种物质1226和1228的偶联反应。
在一些情况下，连接在连接缓冲液中进行。在对含有二核糖的探针上进行探针连接的情况下，连接缓冲液可以包括T4 RNA连接酶缓冲液2、酶(例如，RNL2连接酶)和无核酸酶的水。在DNA探针上进行探针连接的情况下，连接缓冲液可以包括Tris-HCl pH7.5、MnCl2、ATP、DTT、替代液(例如，甘油)、酶(例如，SplintR连接酶)和无核酸酶的水。
在一些实施方式中，连接缓冲液包括其它试剂。在一些情况下，连接缓冲液包括在连接反应期间添加的三磷酸腺苷(ATP)。带切口DNA底物的DNA连接酶催化的密封首先通过ATP水解活化，导致AMP基团于酶的共价添加。在与DNA双链体中的切口位点结合后，连接酶将AMP转移到切口处的磷酸化5′-末端，形成5′-5′焦磷酸键。最后，连接酶催化切口3′端的OH基团对该焦磷酸键的攻击，从而将其密封，然后释放连接酶和AMP。如果连接酶在3′攻击之前与底物分离，例如归因于酶的过早AMP重新加载，则5′AMP留在5′末端，封闭进一步的连接企图。在一些情况下，在连接反应期间以约1μM、约10μM、约100μM、约1000μM或约10000μM的浓度添加ATP。
在一些实施方式中，在连接过程中加入有助于连接探针寡核苷酸的辅因子。在一些情况下，辅因子包括镁离子(Mg2+)。在一些情况下，辅因子包括锰离子(Mn2+)。在一些情况下，Mg2+以MgCl2的形式添加。在一些情况下，Mn2+以MnCl2的形式添加。在一些情况下，MgCl2的浓度为约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。在一些情况下，MnCl2的浓度为约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。
在一些实施方式中，连接产物包括捕获探针捕获域，其可以结合捕获探针(例如，直接或间接固定在基材上的捕获探针)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括将生物样品与基材接触，其中捕获探针固定于基材(例如，直接或间接固定于基材)。在一些实施方式中，连接探针的捕获探针捕获域特异性结合捕获域。
在一些情况下，连接后，用连接后洗涤缓冲液洗涤生物样品。在一些情况下，连接后洗涤缓冲液包括SSC(例如，1xSSC)、碳酸亚乙酯或甲酰胺和无核酸酶水中的一种或多种。在一些情况下，在该阶段在约50℃至约70℃洗涤生物样品。在一些情况下，生物样品在约60℃洗涤。
(i)包括预腺苷酸化5′磷酸盐的第二探针上的连接
本文提供了用于确定生物样品中靶核酸位置的方法，包括：(a)使生物样品与包含多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针的捕获探针包含捕获探针域和空间条形码；(b)将生物样品中的靶核酸与第一探针和第二探针杂交，其中第一探针从3′到5′包含：与捕获域基本互补的序列，和与靶核酸中的第一序列基本互补的序列，并且在其5′端具有预腺苷酸化的磷酸基团；第二探针包含与靶核酸中的第二序列基本互补的序列；(c)通过使用不需要三磷酸腺苷提供连接酶活性的连接酶，将第二探针的3′端连接到第一探针的5′端，以产生连接产物；(d)从靶核酸释放连接产物，并使连接产物的捕获域特异性结合至捕获探针的捕获域；和(e)确定(i)对应于连接产物的序列全部或部分，或其互补物，和(ii)对应于空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物，并使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别靶核酸在生物样品中的位置。
在一些情况下，不需要三磷酸腺苷以提供连接酶活性的连接酶(例如，热稳定的5′AppDNA/RNA连接酶、截短的T4 RNA连接酶2(trRnl2)、截短的T4 RNA连接酶2 K227Q、截短的T4 RNA连接酶2KQ、小球藻病毒PBCV-1 DNA连接酶，及其组合)。参见例如，Nichols等，“RNA连接酶(RNA Ligases)，”Curr.Protocol.Molec.Biol.84(1)：3.15.1-.4(2008)；Viollet等，“T4 RNA连接酶2截断的活性位点突变体：改进的RNA分析工具(T4 RNA Ligase 2Truncated Active Site Mutants：Improved Tools for RNA Analysis)，”BMCBiotechnol.11：72(2011)；和Ho等，“噬菌体T4 RNA连接酶2(gp24.1)举例说明了在所有系统发育域中发现的RNA连接酶家族(Bacteriophage T4 RNA Ligase 2(gp24.1)Exemplifies a Family of RNA Ligases Found in All Phylogenetic Domains)，”PNAS99(20)：12709-14(2002)，其均通过引用其全文方式纳入本文，以说明T4 RNA连接酶和截短的T4 RNA连接酶。热稳定5′AppDNA/RNA连接酶是一种属于连接酶家族的酶，其可催化ssRNA或ssDNA的3′端与5′-腺苷酸化ssDNA或5′-腺苷酸化ssRNA的连接。截短的T4 RNA连接酶2是一种属于连接酶家族的酶，其可催化dsRNA切口和ssRNA与ssRNA的连接。当与RNA互补体退火时，它还可以将RNA或DNA的3′端连接到5′-pDNA，当与DNA互补体退火时，它可以将RNA的3′端连接到5′-pRNA，但效率较低。截短的T4 RNA连接酶2K227Q是一种属于连接酶家族的酶，其可催化ssRNA的3′末端与5′腺苷酸化ssDNA和5′腺苷酸化ssRNA的连接。与截短的T4RNA连接酶2相比，它减少了副产物。截短的T4 RNA连接酶2KQ是一种属于连接酶家族的酶，其可催化ssRNA的3′末端与5′腺苷酸化ssDNA和5′腺苷酸化ssRNA的连接。它是ssRNA与预腺苷酸化衔接子连接的优选，且与截短的T4RNA连接酶2相比，具有减少的副产物。
在一些实施方式中，T4 RNA连接酶包含K227Q突变。参见Viollet等，“T4 RNA连接酶2截短的活性位点突变体：改进的RNA分析工具(T4 RNA Ligase 2 Truncated ActiveSite Mutants：Improved Tools for RNA Analysis)，”BMC Biotechnol.11，其通过引用其全文方式纳入本文。
在一些情况下，在连接过程中添加有助于连接第一和第二探针的辅因子。在一些情况下，辅因子包括镁离子(Mg2+)。在一些情况下，辅因子包括锰离子(Mn2+)。在一些情况下，Mg2+以MgCl2的形式添加。在一些情况下，Mn2+以MnCl2的形式添加。在一些情况下，MgCl2的浓度为约1mM至约10mM。在一些情况下，MnCl2的浓度为约1mM至约10mM。
在一些情况下，连接在约6.5至约9.0、约6.5至约8.0或约7.5至约8.0范围内的pH发生。
在一些实施方式中，连接缓冲液包括酶储存缓冲液。在一些实施方式中，酶储存缓冲液包括甘油。在一些实施方式中，连接缓冲液补充有甘油。在一些实施方式中，甘油以15％v/v的总体积存在于连接缓冲液中。
(h)透化和释放连接产物
在一些实施方式中，本文提供的方法包括透化步骤。在一些实施方式中，使用蛋白酶发生透化。在一些实施方式中，蛋白酶是内肽酶。可以使用的内肽酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶(GluC)、ArgC、肽酰-天冬氨酸内肽酶(ApsN)、内肽酶LysC和内肽酶LysN。在一些实施方式中，内肽酶是胃蛋白酶。在一些实施方式中，在(例如，通过连接与分析物中相邻序列杂交的第一探针和第二探针)产生连接产物之后，生物样品被透化。在一些实施方式中，生物样品在以下步骤同时或之前被透化：使生物样品与第一探针和第二探针接触，将第一探针和第二探针与分析物杂交，通过连接第一探针和第二探针产生连接产物，和，从分析物释放连接产物。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括生物样品的透化，从而使得捕获探针可以更容易地与捕获的连接探针结合(即，与无透化相比)。在一些实施方式中，可以将逆转录(RT)试剂添加到透化生物样品中。与RT试剂一起孵育可以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化的mRNA)产生空间条码化的全长cDNA。第二链试剂(例如，第二链引物、酶)可被添加到载玻片上的生物样品中以起始第二链合成。
在一些情况下，透化步骤包括将透化缓冲液施加于生物样品。在一些情况下，透化缓冲液包括缓冲液(例如，Tris pH 7.5)、MgCl2、肌氨酰去污剂(例如，月桂酰肌氨酸钠)、酶(例如，蛋白酶K和无核酸酶的水。在一些情况下，透化步骤在37℃进行。在一些情况下，透化步骤进行约20分钟至2小时(例如，约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时或约2小时)。在一些情况下，释放步骤进行约40分钟。
在一些实施方式中，在产生连接产物之后，连接产物从分析物释放。在一些实施方式中，使用内切核糖核酸酶从分析物释放连接产物。在一些实施方式中，核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I。在一些实施方式中，核糖核酸内切酶是RNA酶H。RNA酶H是当与DNA杂交时特异性水解RNA的磷酸二酯键的核糖核酸内切酶。RNA酶H是存在于许多不同生物体中的保守核糖核酸酶家族的部分。RNA酶H有两个主要类别：RNA酶H1和RNA酶H2。逆转录病毒RNA酶H酶类似于原核RNA酶H1。所有这些酶都有一个共同特征，即它们能够裂解RNA:DNA异源双链体的RNA成分。在一些实施方式中，RNA酶H是RNA酶H1、RNA酶H2或RNA酶H1或RNA酶H2。在一些实施方式中，RNA酶H包括但不限于：来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的RNA酶HII、来自堀越火球菌(Pyrococcus horikoshi)的RNA酶HII、来自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的RNA酶HI、来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的RNA酶HI、来自大肠杆菌(E.coli)的RNA酶HI或来自大肠杆菌的RNA酶HII。
在一些情况下，使用释放缓冲液进行释放步骤。在一些情况下，释放缓冲液包括缓冲液(例如Tris pH 7.5)、酶(例如RNA酶H)和无核酸酶水中的一种或多种。在一些情况下，释放步骤在37℃进行。在一些情况下，释放步骤进行约20分钟至2小时(例如，约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时或约2小时)。在一些情况下，释放步骤进行约30分钟。
在一些情况下，释放步骤发生在透化步骤之前。在一些情况下，释放步骤发生在透化步骤之后。在一些情况下，释放步骤与透化步骤同时发生(例如，在同一缓冲液中)。
(i)封闭探针
在一些实施方式中，在向生物样品添加第二探针寡核苷酸之前阻断捕获探针捕获域。这可以防止捕获探针捕获域过早地与捕获域杂交。
在一些实施方式中，封闭探针用于阻断或修饰捕获探针捕获域的游离3′端。在一些实施方式中，封闭探针可以与第二探针的捕获探针捕获域杂交以遮蔽捕获探针捕获域的游离3′端。在一些实施方式中，封闭探针可以是发夹探针或部分双链探针。在一些实施方式中，第二探针的捕获探针捕获域的游离3′端可以通过化学修饰来阻断，例如添加叠氮甲基作为化学可逆的封端部分，从而使得捕获探针不包括游离的3′端。在第二探针与基材接触之前，阻断或修饰捕获探针捕获域，特别是在捕获探针捕获域的游离3′端进行阻断或修饰，能防止第二探针与捕获域杂交(例如，防止捕获探针捕获域的聚(A)对聚(T)捕获域的捕获)。在一些实施方式中，封闭探针可称为捕获探针捕获域封闭部分。
在一些实施方式中，可以可逆地去除封闭探针。例如，可以应用封闭探针来封闭捕获探针捕获域和/或捕获探针之一或两者的游离3′末端。阻断捕获探针捕获域和基材上的捕获探针之间的相互作用可以减少对捕获探针的非特异性捕获。在第二探针与分析物杂交并与第一探针、一个或多个跨越探针或第三寡核苷酸连接后，可以从捕获探针捕获域和/或捕获探针的3′端去除封闭探针，并且连接产物可以迁移到基材上的捕获探针并与之结合。在一些实施方式中，去除包括使来自捕获探针捕获域和/或捕获探针的封闭探针变性。在一些实施方式中，去除包括去除化学可逆的加帽部分。在一些实施方式中，去除包括用RNA酶(例如，RNA酶H)消化封闭探针。
在一些实施方式中，封闭探针是寡聚(dT)封闭探针。在一些实施方式中，寡聚(dT)封闭探针可具有15-30个核苷酸的长度。在一些实施方式中，寡聚(dT)封闭探针可具有10-50个核苷酸，例如，10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、20-25、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、30-50、30-45、30-40、30-35、35-50、35-45、35-40、40-50、40-45或45-50个核苷酸的长度。在一些实施方式中，可在不同温度(例如，4℃和37℃)下封闭分析物捕获剂。
(j)生物样品
本文公开的方法可以对任何类型的样品进行。在一些实施方式中，样品是新鲜组织。在一些实施方式中，样品是冷冻样品。在一些实施方式中，样品预先冷冻。在一些实施方式中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品。
可从中获得生物样品的对象可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，癌症)的个体或对疾病有预处置的个体，和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。在一些情况下，生物样品可包括一种或多种病变细胞。病变细胞可以具有改变的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征。疾病的例子包括炎症紊乱、代谢紊乱、神经系统紊乱和癌症。在一些情况下，生物样品包括癌症或肿瘤细胞。癌细胞可以来源于实体瘤、血液系统恶性肿瘤、细胞系，也可以以循环肿瘤细胞形式获得。在一些情况下，生物样品是异质样品。在一些情况下，生物样品是包括肿瘤或癌细胞和/或基质细胞的异质样品。
在一些情况下，癌症是乳腺癌。在一些情况下，乳腺癌是三阳性乳腺癌(TPBC)。在一些情况下，乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。
在一些情况下，癌症是结肠直肠癌。在一些情况下，癌症是卵巢癌。在某些实施方式中，癌症是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤、唾液腺癌、肾癌、基材细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌或头或颈癌的一种类型。在某些实施方式中，所治疗的癌症是促纤维增生性黑色素瘤、炎性乳腺癌、胸腺瘤、直肠癌、肛门癌，或可手术治疗或不可手术治疗的脑干胶质瘤。在一些实施方式中，对象是人。
FFPE样品通常是高度交联和碎片化的，因此此类样品允许使用传统检测技术进行有限的RNA回收。在某些实施方式中，本文提供的被靶RNA的捕获方法比其它方法(例如，利用寡聚-dT捕获和mRNA逆转录的方法)受与FFPE固定相关的RNA降解的影响较小。在某些实施方式中，本文提供的方法能够灵敏地测量感兴趣的特定基因，否则这些基因可能会被全转录组学方法遗漏。
在一些情况下，FFPE样品被染色(例如，使用H&E)。本文公开的方法与H&E兼容，将允许覆盖转录组学分析的形态学背景。然而，根据需要，当需要细胞核的定位时，一些样品可能仅用核染色剂染色，例如仅用苏木精而不用伊红染色样品。
在一些实施方式中，生物样品(例如组织切片)可以用甲醇固定，用苏木精和伊红染色，然后成像。在一些实施方式中，固定、染色和成像在一种或多种探针与样品杂交之前发生。在此描述的任何工作流程的一些实施方式可以还包括脱色步骤(例如，苏木精和伊红脱色步骤)，在样品成像之后和在对样品进行透化之前。例如，脱色可以通过进行一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或五个)洗涤步骤(例如，一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或五个)洗涤步骤使用包括HCl的缓冲液进行)。这些图像可用于将空间基因表达模式映射回生物样品。透化酶可用于直接在载玻片上透化生物样品。
在一些实施方式中，FFPE样品在添加靶标探针寡核苷酸之前被脱蜡、透化、平衡和封闭。在一些实施方式中，使用二甲苯脱蜡。在一些实施方式中，脱蜡包括用二甲苯多次洗涤。在一些实施方式中，脱蜡包括用二甲苯多次洗涤，然后用多轮分级酒精去除二甲苯，然后用水洗涤样品。在一些方面，水是去离子水。在一些实施方式中，平衡和封闭包括在pre-Hyb缓冲液中孵育样品。在一些实施方式中，pre-Hyb缓冲液包括酵母tRNA。在一些实施方式中，透化样品包括用磷酸盐缓冲液洗涤样品。在一些实施方式中，缓冲液是PBS。在一些实施方式中，缓冲液是PBST。
(k)连接产物序列的确定
根据上文所述任何方法联合一般基于细胞的空间分析方法，在来自样品的连接产物与捕获探针杂交或以其它方式联合之后，分析由杂交/联合产生的条码化构建体。
在一些实施方式中，在将生物样品与包括捕获探针的基材接触之后，可任选地进行移出步骤以从基材移出全部或部分生物样品。在一些实施方式中，移出步骤包括生物样品细胞的酶促和/或化学降解。例如，移出步骤可包括用酶(例如，蛋白酶，例如，蛋白酶K)处理生物样品以从基材去除生物样品的至少部分。在一些实施方式中，移出步骤可包括组织的消融(例如，激光消融)。
在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，该方法包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供一种包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个中的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测所述生物分析物；其中所述生物样品全部或部分地从所述基材移出。
在一些实施方式中，不从基材移出生物样品。例如，在从基材释放捕获探针(例如，结合到分析物的捕获探针)之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，这种释放包括从基材上裂解捕获探针(例如，通过裂解域)。在一些实施方式中，这种释放不包括从基材释放捕获探针(例如，可以制备与分析物结合的捕获探针的拷贝，且该拷贝可从基材释放，例如，通过变性)。在一些实施方式中，生物样品从基材释放后，在分析结合到捕获探针的分析物之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，在从基材移出捕获探针期间和/或在从基材释放后分析结合到捕获探针的分析物期间，生物样品保持在基材上。在一些实施方式中，在捕获探针(例如，互补体)的拷贝的去除(例如，通过变性)期间，生物样品保留在基材上。在一些实施方式中，可以在不使生物样品经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)的情况下进行对结合到来自基材的捕获探针的分析物的分析。
在一些实施方式中，至少部分生物样品不从基材被移出。例如，在从基材释放捕获探针(例如，与分析物结合的捕获探针)和/或分析从基材释放的与捕获探针结合的分析物之前，生物样品的部分可以保留在基材上。在一些实施方式中，在分析结合到来自基材的捕获探针的分析物之前，生物样品的至少部分不经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)。
在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，其包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供一种包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个中的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测所述生物分析物；其中所述生物样品未从基材移出。
在一些实施方式中，本文提供用于从生物样品空间检测感兴趣的生物分析物的方法，其包括：(a)在基材上对生物样品进行染色和成像；(b)向基材上的生物样品提供包含透化试剂的溶液；(c)使生物样品接触基材上的阵列，其中所述阵列包括一个或多个捕获探针，从而使所述一个或多个捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(d)分析所捕获的生物分析物，从而在空间上检测感兴趣的生物分析物；其中所述生物样品未从基材上移出。
在一些实施方式中，所述方法还包括对生物样品中的感兴趣区域进行空间转录组学分析。在一些实施方式中，一种或多种捕获探针包括捕获域。在一些实施方式中，一种或多种捕获探针包含独特的分子标识符(UMI)。在一些实施方式中，一种或多种捕获探针包含裂解域。在一些实施方式中，裂解域包含由尿嘧啶DNA糖基酶、无嘌呤/无嘧啶(AP)核酸内切酶(APE1)、U尿嘧啶特异性切除试剂(USER)和/或核酸内切酶VIII识别和裂解的序列。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针不包含裂解域并且不从阵列被裂解。
在一些实施方式中，捕获探针可以被延伸(“延伸的捕获探针”，例如，如本文所述)。例如，延伸捕获探针可以包括从捕获的(杂交的)RNA生成cDNA。该过程涉及合成杂交核酸的互补链，例如，基于捕获的RNA模板(与捕获探针的捕获域杂交的RNA)生成cDNA。因此，在延伸捕获探针的初始步骤(例如cDNA生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如RNA)充当延伸的模板(例如逆转录步骤)。
在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。例如，逆转录包括使用逆转录酶从RNA(例如信使RNA)合成cDNA(互补或拷贝DNA)。在一些实施方式中，当组织仍在原位时进行逆转录，产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。
在一些实施方式中，捕获探针的捕获域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸互补链的引物，例如，用于DNA聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如DNA和/或cDNA)分子包含捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如DNA聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。
在一些实施方式中，产生全长DNA(例如cDNA)分子。在一些实施方式中，“全长”DNA分子是指整个捕获的核酸分子。然而，如果核酸(例如RNA)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始RNA长度不同。在一些实施方式中，延伸的探针的3′端(例如第一链cDNA分子)被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3′端。这可以通过使用单链连接酶如T4 RNA连接酶或CircleGaseTM(可从威斯康星州米德尔顿的鲁慈根公司(Lucigen)购得)来实现。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸用于延伸cDNA以产生全长cDNA(或尽可能接近全长cDNA)。在一些实施方式中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3′端杂交的部分双链DNA分子)可以使用双链连接酶(例如T4 DNA连接酶)连接到延伸的探针的3′端，例如第一链cDNA分子。适用于连接步骤的其他酶的其他酶在本领域中是已知的，并且包括例如Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、热球菌属(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTM DNA连接酶，新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、AmpligaseTM(可从威斯康星州米德尔顿的鲁慈根公司(Lucigen)获得)和SplintR(可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室获得)。在一些实施方式中，多核苷酸尾(例如聚(A)尾)纳入延伸的探针分子的3′端。在一些实施方式中，使用末端转移酶活性酶纳入多核苷酸尾。
在一些实施方式中，处理双链延伸的捕获探针以在扩增和/或分析(例如序列分析)之前去除任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如核酸外切酶或纯化柱。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增以产生足以进行分析的量，例如通过DNA测序。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的第一链(例如，DNA和/或cDNA分子)用作扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在一些实施方式中，扩增反应使用包括亲和力基团的引物将亲和力基团纳入延伸的捕获探针(例如，RNA-cDNA杂交)上。在一些实施方式中，所述引物包括亲和基团，所述延伸的捕获探针包括亲和基团。亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。
在一些实施方式中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以耦合到亲和基团特异性的基材。在一些实施方式中，基材可包括抗体或抗体片段。在一些实施方式中，基材包括亲和素或链霉亲和素，并且亲和基团包括生物素。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖，亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖结合蛋白，亲和基团包括麦芽糖。在一些实施方式中，只要延伸的探针的拷贝未固定到基材，则扩增延伸的捕获探针可以起到从基材表面释放延伸的探针的作用。
在一些实施方式中，释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。从基材表面释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在一些实施方式中，通过核酸裂解和/或变性(例如通过加热使双链分子变性)从阵列释放延伸的捕获探针或其互补物。
在一些实施方式中，通过物理方式从基材的表面(例如阵列)释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。例如，当延伸捕获探针被间接固定在阵列基材上时，例如通过与表面探针杂交，能足以破坏延伸捕获探针和表面探针之间的相互作用。破坏核酸分子之间相互作用的方法包括本领域已知的使双链核酸分子变性。释放DNA分子(即剥离延伸探针阵列)的直接方法是使用干扰双链分子氢键的溶液。在一些实施方式中，通过施加加热的溶液(例如至少85℃的水或缓冲液，例如至少90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的水)来释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从基材释放延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针包括裂解域，延伸的捕获探针通过裂解从基材表面释放。例如，延伸的捕获探针的裂解域可以通过本文所述的任何方法裂解。在一些实施方式中，在扩增延伸的捕获探针的步骤之前，例如通过裂解延伸的捕获探针中的裂解域，从基材表面释放延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针可与基材接触。在一些实施方式中，当探针与基材接触时，生物样品可与基材接触。在一些实施方式中，生物样品可在用探针接触基材之前从基材中移除。在一些实施方式中，可使用可检测标记物(例如，本文所述的任何可检测标记物)标记探针。在一些实施方式中，不特异性结合(例如杂交)到延伸的捕获探针的探针可以被洗掉。在一些实施方式中，可以在基材上检测到与延伸的捕获探针互补的探针(例如，成像，本文所述的任何检测方法)。
在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针可为约4个核苷酸至约100个核苷酸长。在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可为约10个核苷酸至约90个核苷酸长。在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可为约20个核苷酸至约80个核苷酸长。在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可为约30个核苷酸至约60个核苷酸长。在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可为约40个核苷酸至约50个核苷酸长。在一些实施方式中，与延伸的捕获探针互补的探针(例如，可检测探针)可为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、和约99个核苷酸长。
在一些实施方式中，可将约1至约100个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约1至约10个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约10至约100个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约20至约90个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约30至约80个探针(例如，可检测探针)接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约40至约70个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约50至约60个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可将约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、和约99个探针接触到基材并特异性结合(例如，杂交)到延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，探针可与单个分析物(例如，单个基因)互补。在一些实施方式中，探针可与一个或多个分析物(例如，基因家族中的分析物)互补。在一些实施方式中，探针(例如，可检测探针)可用于与疾病(例如，癌症、阿尔茨海默病、帕金森病)相关联的一组基因。
在一些情况下，连接的探针和捕获探针可以被扩增或复制，产生多个cDNA分子。在一些实施方式中，cDNA可以从捕获探针模板变性并转移(例如，转移至干净的管中)用于扩增和/或文库构建。空间条码化的cDNA可以在文库构建之前通过PCR进行扩增。然后可以对cDNA进行酶促片段化和大小选择，以就cDNA扩增子的大小进行优化。用于在测序流动池(Illumina测序仪器)上捕获扩增子的P5和P7序列可被附加到扩增子上，i7和i5可被用作样品索引(sample index)，而TruSeq读数2可通过End Repair、A-加尾添加、衔接子连接和PCR被添加。然后可以使用TruSeq读数1和TruSeq读数2作为测序引物位点，使用双端测序(paired-ended sequencing)对cDNA片段进行测序。附加序列针对Illumina测序仪器或利用这些序列的测序仪器；然而，技术人员会理解，其它测序仪器或技术使用的附加或替代性序列也同样适用于上述方法。
在一些实施方式中，如上文所述，通过与与细胞表面杂交、结合或关联或引入细胞的捕获探针或分析物捕获剂杂交直接对样品进行条码化，可对完整样品进行测序。
多种不同的测序方法可用于分析条码化的分析物(例如，连接产物)。一般来说，测序的多核苷酸可以是例如核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA或DNA/RNA杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。
多核苷酸的测序可以通过各种系统进行。更一般地，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR和液滴数字PCR(ddPCR)、定量PCR、实时PCR、多重PCR、基于PCR的单重方法、乳液PCR)和/或等温扩增来进行测序。对遗传物质进行测序的方法的非限制性示例包括但不限于DNA杂交方法(例如，Southern印迹法)、限制性酶消化方法、桑格测序法、下一代测序法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和Polony测序)，连接法和微阵列法。
(l)试剂盒
在一些实施方式中，本文还提供包括一种或多种试剂以检测本文所述的一种或多种分析物的试剂盒。在一些情况下，所述试剂盒包括包含多个捕获探针的基材，所述捕获探针包含空间条形码和捕获域。在一些情况下，所述试剂盒包括多个探针(例如，第一探针、第二探针、一个或多个跨越探针和/或第三寡核苷酸)。
用于进行本文所述的任何方法的试剂盒的非限制性示例包括：(a)包含多个捕获探针的基材，所述捕获探针包含空间条形码和捕获域；(b)系统，其包括：多个第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针各自包含与分析物基本互补的序列，并且其中第二探针包含捕获结合域；和(c)用于执行前述权利要求中任一项所述方法的指令。
用于进行本文所述的任何方法的试剂盒的另一个非限制性示例包括：(a)包含多个捕获探针的阵列；(b)包含第一探针和第二探针的多个探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第二探针包含(i)捕获探针结合域，其能够与捕获探针的捕获域结合，和(ii)接头序列；(c)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和(d)用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的指令。
用于进行本文所述的任何方法的试剂盒的另一个非限制性示例包括：(a)包含多个捕获探针的阵列；(b)包含第一探针和第二探针的多个探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第一探针包含接头序列，其中第二探针包含捕获探针结合域，其能够与捕获探针的捕获域结合；(c)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和(d)用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的指令。
在本文所述的任何试剂盒的一些实施方式中，所述试剂盒包括在其5′末端包含预腺苷酸化磷酸基团的第二探针和在3′末端包含至少两个核糖核酸碱基的第一探针。
实施例
实施例1.使用RNA模板化连接对FFPE固定样品进行空间基因表达分析
其他人已经证明了原位连接。参见Credle等，Nucleic Acids Research，第45卷，第14期，2017年8月21日，页数e128，https：//doi.org/10.1093/nar/gkx471(2017)。然而，之前的方法利用了使用聚(A)尾的杂交，这导致了脱靶结合。此处，一个探针寡核苷酸上的聚(A)尾被切换到另一个序列。
作为概述，在FFPE固定的样品上进行RNA模板化连接的非限制性示例如图13中所述进行。FFPE固定的样品被脱蜡、染色(例如，H&E染色)并成像1301。将样品脱色(例如，使用HCl)并去交联1302。去交联后，用预杂交缓冲液(例如，不含第一和第二探针的杂交缓冲液)处理样品，将探针加入样品，杂交探针，并洗涤样品1303。将连接酶加入样品以连接杂交的探针以产生连接产物，然后洗涤样品1304。通过将生物样品与RNA酶H接触，探针从分析物释放出来1305。然后使样品透化以促进通过基材上的捕获探针捕获连接产物1306。与捕获探针杂交的连接产物随后被延伸1307。延伸的捕获探针被变性1308。对变性的、延伸的捕获探针进行索引，并在测序前对扩增的文库进行质量控制1309。
FFPE切片的小鼠脑组织切片被脱蜡，用PBST透化，并用pre-Hyb缓冲液平衡两次，每次5分钟。使用TE去交联试剂或PBS-吐温去交联试剂对样品进行去交联。对于TE去交联，各样品添加100μl TE缓冲液(pH 9.0)(Genemed 10-0046)。根据表1对用TE处理的样品进行热循环仪方案。
表1.去交联热循环仪方案
Figure BDA0003681894100000691
按照热循环仪方案，将载玻片放入金属盒中，并遵循表2中描述的方法。
表2.用HCl去交联*
Figure BDA0003681894100000692
*注：每一步都去除所有液体。
RTL探针被设计为与基因组中各感兴趣的分析物(例如，mRNA序列)的相邻序列杂交，所述感兴趣的分析物包括雌激素受体、孕激素受体和ERBB2，也称为HER2。此处，20,056个探针对(例如，RHS和LHS探针)被添加到各组织样品中以捕获19,490个不同的基因。各分析物的两个RTL探针(左侧(LHS)探针和右侧(RHS)探针(参见例如图6))被同时添加并在靶mRNA的相邻序列处杂交，形成RNA:DNA双链结构。去交联后，除去PBS-吐温并将DNA探针(各探针1nM)添加到杂交缓冲液中的组织样品中，用于使DNA探针与其各自的mRNA靶标杂交。杂交缓冲液包括SSC、甲酰胺或等同物、酵母tRNA作为运载体以及RHS和LHS DNA探针。
一个探针寡核苷酸(例如，RHS探针或3′探针)在其5′端包含非靶标功能序列，而另一个探针寡核苷酸(例如，LHS探针或5′探针)在其3′端包含非靶标聚A序列。将DNA探针添加到组织样品，并根据表3中描述的热循环仪方案在50℃孵育2小时30分钟。
表3.杂交方案
Figure BDA0003681894100000701
在50℃孵育2.5小时后，去除杂交缓冲液并洗涤组织两次，每次洗涤包括在50℃用预热至50℃的杂交后洗涤缓冲液洗涤5分钟。杂交后洗涤缓冲液(post-hyb缓冲液)包括：SSC、酵母tRNA和无核酸酶水。
为了如上所述连接在靶mRNA上相邻杂交的两个二核糖探针寡核苷酸，将各样品与RNL2 T4 DNA连接酶反应混合物(连接混合物)一起孵育。连接酶反应混合物包括：T4 RNA连接酶缓冲液(NEB B0293S)、RNL2连接酶和无核酸酶的水。
为了连接如上所述在靶mRNA上相邻杂交的两个DNA探针寡核苷酸，将连接缓冲液中的SplintR(NEB)添加至各样品。各样品的连接酶反应混合物包括：Tris-HCl(pH7.5)MnCl2 ATP、DTT、替代液、SplintR连接酶(NEB)和无核酸酶水。连接和洗涤步骤如表4所述进行。
DNA探针连接后，将组织样品在SSC/甲酰胺连接后洗涤缓冲液中于60℃洗涤两次，每次5分钟。
表4.连接方案
Figure BDA0003681894100000711
*连接后洗涤缓冲液(各样品)包括：SSC、甲酰胺或等同物，以及无核酸酶水。
添加RNA酶H以消化杂交的RNA:DNA双链体的RNA链。简言之，通过将样品与RNA酶H混合物在37℃孵育30分钟来消化DNA:RNA杂交体的RNA，其中RNA酶H混合物包括：RNA酶H缓冲液和RNA酶H。孵育后，同时保持在37℃，生物样品被透化以使用1.25mg/mL蛋白酶K释放连接的RTL探针。具体地，蛋白酶K溶液包括(各样品)：Tris(pH 7.5)、MgCl2、肌氨酰或SDS、蛋白酶K(酶)和无核酸酶的水。样品在蛋白酶K溶液中于37℃孵育至少5分钟。然后样品用2XSSC洗涤3次。
释放的、连接的DNA探针作为靶标mRNA的代用物，被允许通过RHS探针3′端的聚A尾与固定在空间阵列上的捕获探针上的捕获域杂交。捕获的连接探针被复制，使用捕获探针作为模板，并且延伸产物从空间阵列中释放出来。简言之，将组织与包含Kapa Hifi DNA聚合酶的第二链延伸混合物在53℃孵育25分钟。孵育后，从组织除去第二链延伸混合物，并用2X SSC洗涤组织。在各组织孔中添加KOH溶液，将组织在室温孵育10分钟以从空间阵列释放延伸产物，并将各组织孔中的上清液转移用于定量和文库制备。根据制造商的说明，使用qPCR和KAPA SYBR FAST qPCR预混液进行样品定量。简言之，KAPA SYBR预混液通过添加qPCR引物cDNA_F和qPCR引物sRNA_R2制备。热循环仪方案包括：98℃3分钟；30个循环，98℃5秒，和63℃30秒。对于文库制备，使用包含双索引引物和Amp Mix的Amp Mix对样品进行索引。然后对核酸进行测序和分析。
作为对照，同时进行实验，其中不添加连接酶，在RNA酶H处理之前添加胃蛋白酶，或在RNA酶H处理之后添加胃蛋白酶。
如图14-19所示，连接的探针对的空间表达突出了潜在的小鼠脑组织生理学。图14显示PCR结果，证明无论透化发生在RNA酶H处理之前还是之后，连接产物都被捕获和可扩增(阳性对照＝标准品，阴性对照＝减去连接酶)。箭头1指向代表所需的连接产物的PCR条带，而箭头2、3和4代表非连接产物。图15显示了作为各条件的总读数的部分被检测到的非特异性探针。图16A-B显示大多数探针组合是特异性的。箭头表示具有增加的背景的RHS探针，因此包括一些非特异性杂交。查看图17中的总计数，基因特异性LHS+RHS探针与组织足迹重叠(参见图17A-C，其中黑色圆圈表示组织足迹)。
此外，首先将对各种基因(例如Grp88、Penk、Plp1、Nptrx和Mpb2)具有特异性的探针添加至杂交缓冲液中的样品中，先在60℃保持30分钟，然后在45℃保持2小时(参见，例如，图18和图19)。当对靶标特异性UMI进行计数时，可以观察到更详细的表达模式。参见例如，图19B-19F。该分析表明，杂交时间越长，灵敏度越高。参考图18A-18E，白色圆圈表示报告指定基因表达的斑点。
与所讨论的2小时杂交相比较，进行过夜杂交。使用添加到各组织样品中以捕获21,604个不同基因的21,833个探针对(例如，RHS和LHS探针)对小鼠脑样品的分析表明，与阳性对照相比，过夜杂交，因此更长的杂交，导致更高的灵敏度(参见图20A-20B)。小鼠探针设计自靶标源自Appris(参见Rodriguez等，Nucleic Acids Research，46：D213-217，doi：10.1093/nar/gkx997(2018)，其通过引用其全文方式纳入本文)和GENCODE。所有探针对都是非重叠性的，并且通常每基因包括大约1个探针对。
实施例2.使用RNA模板化连接(RTL)对三重阳性乳腺癌(TPBC)进行空间基因表达分析
该实施例表明，可以对样品进行RTL，以便以无偏方式鉴别分析物丰度和空间位置。
检查了FFPE处理保存的两年之久的三重阳性(“TPBC”，HER2、雌激素受体和孕激素受体阳性)乳腺癌样品的分析物丰度和空间位置。通过以RNA模板化的连接方法用DNA探针探询TPBC样品。在连接步骤之前，TPBC组织样品按照既定的方案进行脱蜡和染色。例如，FFPE TPBC组织样品在水浴(40℃)中预热，切片(10μm)，在42℃干燥几个小时，然后室温放置在干燥器中过夜。干燥的切片组织通过在60℃烘烤脱蜡，通过一系列二甲苯和EtOH洗涤，在水中漂洗几次。漂洗后，按照既定方案用苏木精对脱蜡组织染色。染色的组织被成像，鉴别肿瘤和间质(stroma)的区域。参见图21A。
对组织进行去交联以去除样品中的甲醛交联，由此释放分析物用于RNA模板化连接。简言之，将组织样品与HCl溶液一起孵育1分钟，重复两次，总共3分钟。在HCl孵育后，将组织切片在70℃的TE pH 9.0中孵育1小时。去除TE并将组织在1x PBS-吐温中孵育15分钟。
RTL探针被设计为与基因组中各感兴趣的分析物(例如，mRNA序列)的相邻序列杂交，所述感兴趣的分析物包括雌激素受体、孕激素受体和ERBB2，也称为HER2。
探针设计自靶标源自Appris(参见Rodriguez等，Nucleic Acids Research，46：D213-217，doi：10.1093/nar/gkx997(2018)，其通过引用其全文方式纳入本文)和GENCODE。所有探针对都是非重叠性的，并且通常每基因包括大约1个探针对。
此处，将20,056个探针对(例如，RHS和LHS探针)添加到各组织样品中以捕获人类基因组中的19,490个不同基因，包括ESR1、PGR和HER2。各分析物的两个RTL探针(左侧(LHS)探针和右侧(RHS)探针(参见例如图6))被同时添加并在靶mRNA的相邻序列处杂交，形成RNA:DNA双链结构。
去交联后，将DNA探针(各探针1nm)添加到杂交缓冲液中的组织样品中，用于将DNA探针与其各自的mRNA靶标杂交。一个探针寡核苷酸(例如，RHS探针或3′探针)在其5′端包含非靶标功能序列，而另一个探针寡核苷酸(例如，LHS探针或5′探针)在其3′端包含非靶标聚A序列。简言之，将带有DNA探针的杂交缓冲液添加到组织样品中，并将组织在50℃孵育约21/2小时。去除杂交/DNA探针缓冲液，通过添加不含DNA探针的杂交后缓冲液洗涤组织，并在50℃孵育5分钟，总共进行3次杂交后洗涤。
为了如上所述连接在靶mRNA上相邻杂交的两个DNA探针寡核苷酸，将连接缓冲液中的SplintR(NEB)添加到各组织样品中，并将组织在37℃孵育60分钟。DNA探针连接后，将组织样品在SSC/甲酰胺连接后洗涤缓冲液中于60℃洗涤两次，每次5分钟。
然后，添加RNA酶H以消化杂交的RNA:DNA双链体的RNA链。简言之，通过将组织与RNA酶H在37℃孵育30分钟来消化DNA:RNA杂交体的RNA。然后将生物样品透化以释放连接的RTL探针并与附着在载玻片上的多个捕获探针接触。特别地，30分钟后，通过添加1.25mg/ml蛋白酶K对组织进行洗涤和透化，在37℃孵育至少5分钟，然后洗涤以去除蛋白酶。
释放的、连接的DNA探针作为靶标mRNA的代用物，被允许通过RHS探针3′端的聚A尾与捕获探针(固定在空间阵列上的捕获探针)上的捕获域杂交。捕获的连接探针被复制，使用捕获探针作为模板，并且延伸产物从空间阵列中释放出来。简言之，将组织与包含KapaHifi DNA聚合酶(Roche)的第二链延伸混合物在53℃孵育25分钟。孵育后，从组织除去延伸混合物，并用SSC洗涤组织。将KOH溶液添加至各组织孔中，将组织在室温孵育10分钟以从空间阵列释放延伸产物，然后转移各组织孔中的上清液进行定量、文库制备和在IlluminaNextSeq测序仪器上测序。
评估整个转录组有助于更好地了解TPBC异质性。例如，观察到使用20,056个探针对(例如，RHS和LHS探针)来捕获19,490个不同的基因，在各细胞的UMI数量与各细胞的基因数量方面显示出与阳性对照相当的结果(图21B)。与阵列杂交的各RTL连接探针的空间位置和丰度分析揭示了八(8)个不同的表达簇，表明差异基因表达和表达基因的位置可以使用RTL探针确定。参见图21C-21D。参考图21C，图中的各点都是阵列上的一个点。各点都被分配给一个簇，用黑色圆圈表示。在一些情况下，分配给簇的点位于图上指示的圆圈之外。参考图21D，阵列上的各点被分配给一个簇并且各簇部分地由圆圈指示。在一些情况下，点被分配到簇，但不在阵列上指定的圆圈内。最后，确定了个体分析物的表达。TPBC样品通常表现出雌激素受体、孕激素受体和ERRB2(HER2)水平升高。如图21E-21GA所示。
实施方式A1.一种用于确定分析物在生物样品中位置的方法，包括：
(a)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获域；
(b)使生物样品与第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸接触，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本互补的序列，并且其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针捕获域；
(c)在不含甲酰胺的杂交缓冲液中使第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与分析物杂交；
(d)连接第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸，由此产生连接产物；
(e)从分析物释放连接产物并使连接产物与捕获域杂交；和
(f)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并且使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
实施方式A2.如实施方式A1所述的方法，其中捕获探针还包含一个或多个功能域、独特的分子标识符、裂解域及其组合。
实施方式A3.如实施方式A1或A2所述的方法，其中所述阵列包括基材上的一个或多个特征。
实施方式A4.如实施方式A3所述的方法，其中一个或多个特征包括珠。
实施方式A5.如实施方式A3所述的方法，其中基材包括载玻片。
实施方式A6.如实施方式A1-A5中任一项所述的方法，其中所述不含甲酰胺的杂交缓冲液是盐水-柠檬酸钠(SSC)杂交缓冲液。
实施方式A7.如实施方式A6所述的方法，其中SSC以约1x SSC至约6x SSC存在于SSC杂交缓冲液中。
实施方式A8.如实施方式A6或A7所述的方法，其中SSC以约2x SSC至约4xSSC存在于SSC杂交缓冲液中。
实施方式A9.如实施方式A6-A8中任一项所述的方法，其中SSC杂交缓冲液包含溶剂。
实施方式A10.如实施方式A9所述的方法，其中溶剂包括碳酸亚乙酯。
实施方式A11.如实施方式A6-A10中任一项所述的方法，其中碳酸亚乙酯以约10％(w/v)至约25％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。
实施方式A12.如实施方式A6-A11中任一项所述的方法，其中碳酸亚乙酯以约15％(w/v)至约20％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。
实施方式A13.如实施方式A6-A12中任一项所述的方法，其中碳酸亚乙酯以约13％(w/v)存在于SSC杂交缓冲液中。
实施方式A14.如实施方式A6-A13中任一项所述的方法，其中SSC杂交缓冲液处于约40℃至约60℃的温度。
实施方式A15.如实施方式A6-A14中任一项所述的方法，其中SSC杂交缓冲液处于约45℃至约55℃的温度。
实施方式A16.如实施方式A6-A15中任一项所述的方法，其中SSC杂交缓冲液处于约50℃的温度。
实施方式A17.如实施方式A6-A16中任一项所述的方法，其中SSC杂交缓冲液还包含酵母tRNA、促聚物或添加剂中的一种或多种。
实施方式A18.如实施方式A1-A17中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的连接包括连接酶。
如实施方式A19.如实施方式A18所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、SplintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
实施方式A20.如实施方式A19所述的方法，其中所述连接酶是T4 DNA连接酶。
实施方式A21.如实施方式A1-A20中任一项的方法，还包括从阵列去除一个或多个未杂交的第一探针寡核苷酸、一个或多个未杂交的第二探针寡核苷酸或两者。
实施方式A22.如实施方式A21所述的方法，其中去除包括在不含甲酰胺的洗涤缓冲液中从阵列洗涤一个或多个未杂交的第一探针寡核苷酸、一个或多个未杂交的第二探针寡核苷酸或两者。
实施方式A23.如实施方式A21或A22所述的方法，其中不含甲酰胺的洗涤缓冲液是SSC洗涤缓冲液。
实施方式A24.如实施方式A21-A23中任一项所述的方法，其中SSC以约0.01x SSC至约1x SSC存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A25.如实施方式A21-A24中任一项所述的方法，其中SSC以约0.1x SSC存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A26.如实施方式A21-A25中任一项所述的方法，其中SSC洗涤缓冲液包含去污剂。
实施方式A27.如实施方式A26所述的方法，其中去污剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)。
实施方式A28.如实施方式A21-A26中任一项所述的方法，其中SDS以约0.01％(v/v)至约0.5％(v/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A29.如实施方式A21-A28中任一项所述的方法，其中SDS以约0.1％(v/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A30.如实施方式A21-A29中任一项所述的方法，其中SSC洗涤缓冲液包含溶剂。
实施方式A31.如实施方式A21-A30中任一项所述的方法，其中所述溶剂包含碳酸亚乙酯。
实施方式A32.如实施方式A21-A31中任一项所述的方法，其中碳酸亚乙酯以约10％(w/v)至约25％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A33.如实施方式A21-A32中任一项所述的方法，其中碳酸亚乙酯以约15％(w/v)至约20％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A34.如实施方式A21-A33中任一项所述的方法，其中碳酸亚乙酯以约16％(w/v)存在于SSC洗涤缓冲液中。
实施方式A35.如实施方式A21-A34中任一项所述的方法，其中SSC洗涤缓冲液处于约50℃至约70℃的温度。
实施方式A36.如实施方式A21-A35中任一项所述的方法，其中SSC洗涤缓冲液处于约55℃至约65℃的温度。
实施方式A37.如实施方式A21-A36中任一项所述的方法，其中SSC洗涤缓冲液处于约60℃的温度。
实施方式A38.如实施方式A1-A37中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的释放包括使连接产物与核糖核酸内切酶接触。
实施方式A39如实施方式A38所述所述的方法，其中所述核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I中的一种或多种。
实施方式A40.如实施方式A38或A39所述的方法，其中核糖核酸内切酶是RNA酶H。
实施方式A41.如实施方式A40所述的方法，其中RNA酶H包括RNA酶H1、RNA酶H2或两者。
实施方式A42.如实施方式A1-A41中任一项的方法，还包括使用连接产物作为延伸反应的模板延伸捕获探针的3′端。
实施方式A43.如实施方式A42所述的方法，其中延伸捕获探针的3′端包括逆转录分析物，从而产生与分析物互补的序列。
实施方式A44.如实施方式A43所述的方法，其中逆转录分析物包括逆转录酶。
实施方式A45.如实施方式A1-A44中任一项所述的方法，其中所述分析物是RNA。
实施方式A46.如实施方式A1-A45中任一项所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
实施方式A47.如实施方式A1-A46中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
实施方式A48.如实施方式A47所述的方法，其中组织样品是组织切片。
实施方式A49.如实施方式A1-A46中任一项所述的方法，其中所述生物样品是新鲜冷冻的生物样品。
实施方式A50.如实施方式A1-A46中任一项所述的方法，其中所述生物样品是固定的生物样品。
实施方式A51.如实施方式A41所述的方法，其中固定的生物样品是福尔马林固定的石蜡包埋的样品。
实施方式A52.如实施方式A1-A51中任一项所述的方法，其中所述方法还包括透化该生物样品。
实施方式A53.如实施方式A52所述的方法，其中透化生物样品发生在从分析物释放连接产物之前。
实施方式A54.如实施方式A52或A53所述的方法，其中透化生物样品包括内肽酶。
实施方式A55.如实施方式A1-A54中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在使生物样品与阵列接触之前扩增连接产物。
实施方式A56.如实施方式A1-A55中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的确定包括测序。
实施方式A57.如实施方式A1-A56中任一项所述的方法，其中所述方法还包括与捕获探针捕获域特异性结合的捕获探针捕获域封闭部分。
实施方式A58.如实施方式A1-A57中任一项的方法，还包括在使生物样品与阵列接触之前从捕获探针捕获域释放捕获探针捕获域封闭部分。
实施方式A59.如实施方式A1-A58中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含均聚序列。
实施方式A60.如实施方式A59所述的方法，其中捕获探针捕获域包含聚(A)序列。
实施方式B
实施方式B1.一种用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包括：
(a)使生物样品与包含多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包含捕获域和空间条形码；
(b)(b)使生物样品与第一探针和第二探针接触，其中第一探针的部分和第二探针的部分与分析物的相邻序列基本互补，
其中第一探针包含与分析物的第一靶序列基本互补的序列，
其中第二探针包括：
(i)与分析物的第二靶序列基本互补的第一序列；
(ii)接头序列；
(iii)与分析物的第三靶序列基本互补的第二序列；和
(iv)能够与捕获探针的捕获域结合的捕获探针捕获域；
(c)使第一探针和第二探针杂交至分析物；
(d)连接第一探针和第二探针，由此产生连接产物；
(e)从分析物释放连接产物；
(f)将捕获探针捕获域与捕获域杂交；和
(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并且使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
实施方式B2.如实施方式B1所述的方法，其中第二探针从5′到3′包含：第一序列、接头序列、第二序列和捕获探针捕获域。
实施方式B3.如实施方式B1-B2中任一项所述的方法，其中分析物的第一靶序列与分析物的第二靶序列直接相邻。
实施方式B4.如实施方式B1-B3中任一项所述的方法，其中第二靶序列不与分析物上的第三靶序列直接相邻。
实施方式B5.如实施方式B1-B4中任一项所述的方法，其中第二靶序列和第三靶序列在分析物的不同外显子上。
实施方式B6.如实施方式B1-B4中任一项所述的方法，其中第二靶序列和第三靶序列在分析物的相同外显子内但不直接相邻。
实施方式B7.如实施方式B1-B6中任一项所述的方法，其中接头序列包含总共约1个核苷酸至约100个核苷酸。
实施方式B8.如实施方式B7所述的方法，其中所述接头还包含用作鉴别分析物的代用物的条形码序列。
实施方式B9.一种用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包括：
(a)使生物样品与包含多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包含捕获域和空间条形码；
(b)使生物样品与第一探针和第二探针接触，其中第一探针的部分和第二探针的部分与分析物的相邻序列基本互补，
其中第一探针包括：
(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列；
(ii)接头序列；
(iii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列；和
其中第二探针包含与分析物的第三靶序列基本互补的序列和能够结合至捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域；
(c)使第一探针和第二探针杂交至分析物；
(d)连接第一探针和第二探针，由此产生连接产物；
(e)从分析物释放连接产物；
(f)将捕获探针捕获域与捕获域杂交；和
(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并且使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
实施方式B10.实施方式F9所述的方法，其中第二靶序列与第三靶序列直接相邻。
实施方式B11.如实施方式B9-B10中任一项所述的方法，其中第一探针从5′到3′包含：第一序列、接头序列和第二序列。
实施方式B12.如实施方式B9-B11中任一项所述的方法，其中第一探针还包含功能序列。
实施方式B13.如实施方式B13所述的方法，其中功能序列是引物序列。
实施方式B14.如实施方式B12或B13所述的方法，其中第一探针从5′到3′包含：功能序列、第一序列、接头序列和第二序列。
实施方式B15.如实施方式B9-B14中任一项所述的方法，其中第一靶序列不与分析物上的第二靶序列直接相邻。
实施方式B16.如实施方式B15所述的方法，其中第一靶序列和第二靶序列位于不同的外显子上。
实施方式B17.如实施方式B15所述的方法，其中第一靶序列和第二靶序列在同一外显子内但不直接相邻。
实施方式B18.如实施方式B9-B17中任一项所述的方法，其中接头序列包含总共约1个核苷酸至约100个核苷酸。
实施方式B19.如实施方式B18所述的方法，其中所述接头还包含用作鉴别分析物的代用物的条形码序列。
实施方式B20.一种用于鉴别分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包括：
(a)使生物样品与包含多个捕获探针的基材接触，其中多个捕获探针中的捕获探针包含捕获域和空间条形码；
(b)使生物样品与第一探针、第二探针和一个或多个跨越探针接触，
其中第一探针与分析物的第一部分基本上互补，
其中第二探针与分析物的第二部分基本互补并且还包含捕获探针捕获域，和
其中跨越探针包括：
(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列，和
(ii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列；
(c)将第一探针、第二探针和跨越探针与分析物杂交；
(d)连接第一探针、一个或多个跨越探针和第二探针，由此产生与分析物基本上互补的连接产物；
(e)从分析物释放连接产物；
(f)将捕获探针捕获域与捕获域杂交；和
(g)确定(i)与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分序列或其互补物，和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其互补物，并且使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
实施方式B21.如实施方式B20所述的方法，其中跨越寡核苷酸还包含功能序列。
实施方式B22.如实施方式B20或B所述的方法，其中跨越寡核苷酸从5′到3′包含：第一序列、功能序列和第二序列。
实施方式B23.如实施方式B20-B22中任一项所述的方法，其中功能序列包含接头序列。
实施方式B24.如实施方式B23所述的方法，其中接头序列包含总共约1个核苷酸至约100个核苷酸。
实施方式B25.如实施方式B20-B24中任一项所述的方法，其中功能序列包括条形码序列。
实施方式B26.如实施方式B25所述的方法，其中条形码序列包括用作鉴别分析物的代用物的序列。
实施方式B27.如实施方式B20-B26中任一项所述的方法，其中所述功能序列包含一个或多个接头序列和条形码序列。
实施方式B28.如实施方式B27所述的方法，其中功能序列包含侧接接头序列的条形码序列。
实施方式B29.如实施方式B20-B28中任一项所述的方法，其中接头序列包含总共约1个核苷酸至约100个核苷酸。
实施方式B30.如实施方式B20-B29中任一项所述的方法，其中跨越探针的第一序列和跨越探针的第二序列与同一外显子内的序列基本互补。
实施方式B31.如实施方式B30所述的方法，其中分析物的第一靶标序列和分析物的第二靶标位于同一外显子内。
实施方式B32.如实施方式B20-B29中任一项所述的方法，其中跨越探针的第一序列和跨越探针的第二序列与同一基因的不同外显子内的序列基本互补。
实施方式B33.如实施方式B32所述的方法，其中分析物的第一靶序列和分析物的第二靶序列位于同一基因的不同外显子上。
实施方式B34.如实施方式B20-33中任一项所述的方法，其中分析物的第一部分与第一靶序列直接相邻，和/或其中分析物的第二部分与第二靶序列直接相邻。
实施方式B35.如实施方式B20-B34中任一项所述的方法，其中跨越探针包含基于3′端的至少两个核糖核酸。
实施方式B36.如实施方式B20-B35中任一项所述的方法，其中跨越探针在5′末端包含磷酸化的核苷酸。
实施方式B37.如实施方式B20-B36中任一项所述的方法，其中所述一个或多个跨越探针包括一个跨越探针。
实施方式B38.如实施方式B20-B36中任一项所述的方法，其中所述一个或多个跨越探针包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个跨越探针。
实施方式B39.如实施方式B38所述的方法，其中一个或多个跨越探针包括：
(i)与分析物的第三靶序列基本互补的第三序列，和
(ii)与分析物的第四靶序列基本互补的第四序列。
实施方式B40.如实施方式B39所述的方法，其中第一靶序列位于第一外显子中，第二靶序列位于第二外显子中，并且第三靶序列和第四靶序列位于第三外显子中。
实施方式B41.如实施方式B39所述的方法，其中第一靶序列位于第一外显子中，第二靶序列位于第二外显子中，第三靶序列位于第三外显子中，第四靶序列位于第四外显子中。
实施方式B42.如实施方式B38-B41中任一项所述的方法，其中所述方法包括连接：
第一探针至跨越探针，
跨越探针至一个或多个其它跨越探针，并且
一个或多个其它跨越探针跨越寡核苷酸至第二探针，由此产生与分析物基本互补的连接产物。
实施方式B43.如实施方式B38-B42中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其它跨越探针寡核苷酸还包含功能序列。
实施方式B44.如实施方式B43所述的方法，其中功能序列包含(i)接头序列，(ii)条形码序列，或(ii)一个或多个接头和条形码序列。
实施方式B45.如实施方式B38-B44中任一项所述的方法，其中所述一个或多个其它跨越探针包含基于3′末端的至少两个核糖核酸。
实施方式B46.如实施方式B38-B45中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其它跨越探针在5′末端包含磷酸化的核苷酸。
实施方式B47.如实施方式B20-B46中任一项所述的方法，其中第一探针还包含功能序列。
实施方式B48.如实施方式B47所述的方法，其中功能序列是引物序列。
实施方式B49.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中第一探针在3′末端包含至少两个核糖核酸碱基。
实施方式B50.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述第二探针在5′末端包含磷酸化核苷酸。
实施方式B51.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法还包括提供与捕获探针捕获域相互作用的捕获探针捕获域封闭部分。
实施方式B52.如实施方式B51所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(f)之前从捕获探针捕获域释放捕获探针捕获域封闭部分。
实施方式B53.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含聚腺苷酸化(聚(A))序列或其互补物。
实施方式B54.如实施方式B53所述的方法，其中捕获探针捕获域封闭部分包含聚尿苷序列、聚胸苷序列或两者。
实施方式B55.如实施方式B52所述的方法，其中从聚(A)序列释放聚尿苷序列包括使连接产物变性或使连接产物与核酸内切酶或核酸外切酶接触。
实施方式B56.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含与所述捕获探针的捕获域的全部或部分互补的序列。
实施方式B57.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含简并序列。
实施方式B58.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述连接步骤包括使用酶促连接或化学连接。
实施方式B59.如实施方式B58所述的方法，其中酶促连接使用连接酶。
实施方式B60.如实施方式B59所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
实施方式B61.如实施方式B60所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶2(Rnl2)连接酶。
实施方式B62.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中第一探针、第二探针和一个或多个跨越探针是DNA探针。
实施方式B63.如实施方式B62所述的方法，其中步骤(b)和(c)各自产生RNA:DNA杂合体。
实施方式B64.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)基本上同时进行。
实施方式B65.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括FFPE样品。
实施方式B66.如实施方式B65所述的方法，其中组织样品是FFPE组织样品，并且组织样品是去交联的。
实施方式B67.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括组织切片。
实施方式B68.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括新鲜冷冻样品。
实施方式B69.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含活细胞。
实施方式B70.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述分析物包括RNA和/或DNA。
实施方式B71.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述分析物是RNA。
实施方式B72.如实施方式B71所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
实施方式B73.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述生物样品预先染色。
实施方式B74.如实施方式B73所述的方法，其中生物样品预先使用苏木精和伊红(H&E)染色。
实施方式B75.如实施方式B73或B74所述的方法，其中生物样品预先使用免疫荧光或免疫组织化学染色。
实施方式B76.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使生物样品与透化剂接触。
实施方式B77.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中释放步骤包括从分析物去除连接的探针。
实施方式B78.如实施方式B77所述的方法，其中释放步骤包括将连接的探针与核糖核酸内切酶接触。
实施方式B79.如实施方式B78所述的方法，其中核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I中的一种或多种。
实施方式B80.如实施方式B79所述的方法，其中RNA酶H包括RNA酶H1、RNA酶H2或RNA酶H1和RNA酶H2。
实施方式B81.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中确定步骤包括扩增与捕获域特异性结合的连接产物的全部或部分。
实施方式B82.如实施方式B81所述的方法，其中扩增是等温的。
实施方式B83.如实施方式B81所述的方法，其中扩增不是等温的。
实施方式B84.如实施方式B81-B83中任一项所述的方法，其中扩增产物包含(i)与捕获域特异性结合的连接产物的序列的全部或部分或其互补物，和(ii)空间条形码的序列的全部或部分，或其互补物。
实施方式B85.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括测序。
实施方式B86.如实施方式B85所述的方法，其中测序步骤包括原位测序。
实施方式B87.一种试剂盒，其包含：
(a)包含多个捕获探针的阵列；
(b)包含第一探针和第二寡核苷酸的多个探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第二探针包含(i)捕获探针捕获域，其能够结合至捕获探针的捕获域和(ii)接头序列；
(c)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和
(d)使用该试剂盒的说明。
实施方式B88.一种试剂盒，其包含：
(a)包含多个捕获探针的阵列；
(b)包含第一探针和第二寡核苷酸的多个探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第一探针包含接头序列，其中第二探针包含能够结合至捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域；
(c)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和
(d)使用该试剂盒的说明。
实施方式B89.一种试剂盒，其包括：
(a)包含多个捕获探针的阵列；
(b)包含第一探针和第二寡核苷酸的多个探针，其中第二探针包含能够与捕获探针的捕获域结合的捕获探针捕获域；
(c)多个跨越探针，其中多个跨越探针中的跨越探针包含第一序列、接头序列和第二序列，其中第一探针和跨越探针的第一序列与分析物的相邻序列基本互补，其中第二探针和跨越探针的第二序列与分析物的相邻序列基本互补；
(d)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和
(e)使用该试剂盒的说明。
实施方式B90.如实施方式B87-B89中任一项所述的试剂盒，其中核糖核酸酶是RNA酶H。
实施方式B91.如实施方式B87-B90中任一项所述的试剂盒，其中所述连接酶是T4RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
实施方式B92.如实施方式B91所述的试剂盒，其中所述连接酶是T4RNA连接酶2(Rnl2)连接酶。

Claims (68)

1.一种用于确定分析物在生物样品中位置的方法，包括：
(a)在包含多个捕获探针的阵列上提供生物样品，其中多个捕获探针中的捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获域；
(b)将第一探针和第二探针与生物样品接触，其中第一探针和第二探针各自包含与分析物的序列基本互补的一个或多个序列，并且其中第二探针包含捕获探针捕获域；
(c)使第一探针和第二探针杂交至分析物；
(d)通过连接第一探针和第二探针来产生连接产物；
(e)从分析物释放连接产物；
(f)使连接产物与捕获域杂交；和
(g)确定(i)与捕获域结合的连接产物的序列的全部或部分或其互补物，和(ii)空间条形码的序列的全部或部分或其互补物，并且使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴别分析物在生物样品中的位置。
2.如权利要求1所述的方法，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补。
3.如权利要求1所述的方法，其中第一探针和第二探针与分析物上彼此不相邻的序列杂交。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括使第三探针与所述第一探针和所述第二探针杂交，其中所述第三探针包含与所述第一探针的部分基本互补的第一序列，和与所述第二探针的部分基本互补的第二序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第一探针和所述第二探针与所述分析物杂交在第一温度进行。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中第三探针与第一探针和第二探针的杂交在第二温度进行。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一温度高于所述第二温度。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述第一温度为约50℃至约75℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述第二温度为约15℃至约35℃、约20℃至约30℃或约25℃至约30℃。
10.如权利要求3-9中任一项所述的方法，其中第一探针用DNA聚合酶延伸，由此填充第一探针和第二探针之间的间隙并产生延伸的第一探针。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含与所述分析物的第一靶序列基本互补的序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二探针还包括：
(i)与分析物的第二靶序列基本互补的第一序列；
(ii)接头序列；
(iii)与分析物的第三靶序列基本互补的第二序列；和
(iv)能够与捕获探针的捕获域结合的捕获探针捕获域。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述分析物的第一靶序列与所述分析物的第二靶序列直接相邻。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述第二靶序列不与所述分析物上的所述第三靶序列直接相邻。
15.如权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述第二靶序列和所述第三靶序列在(i)所述分析物的不同外显子上或(ii)位于所述分析物的相同外显子内但在所述分析物上不相邻。
16.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第二探针包含与所述分析物的第三靶序列基本互补的序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述第一探针包括：
(i)与分析物的第一靶序列基本互补的第一序列；
(ii)接头序列；和
(iii)与分析物的第二靶序列基本互补的第二序列。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中第二靶序列与第三靶序列直接相邻。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述第一靶序列不与所述分析物上的所述第二靶序列直接相邻。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中第一靶序列和第二靶序列在(i)分析物的不同外显子上或(ii)位于相同外显子内但在所述分析物上不直接相邻。
21.如权利要求11-20中任一项所述的方法，其中所述接头序列包含总共约1个核苷酸至约100个核苷酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述接头还包括用作鉴别所述分析物的代用物的条形码序列。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第一探针在3′端包含至少两个核糖核酸碱基，并且其中所述第二探针在5′端包含磷酸化核苷酸。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中产生连接产物包括使用酶促连接或化学连接将(i)第一探针与第二探针连接或(ii)延伸的第一探针与第二探针连接，其中酶促连接使用连接酶。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述连接酶是T4 RNA连接酶(Rnl2)、splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
26.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第二探针在其5′端包含预腺苷酸化的磷酸基团，并且其中所述第一探针在3′端包含至少两个核糖核酸碱基。
27.如权利要求26所述的方法，其中产生连接产物的步骤包括使用不需要三磷酸腺苷来提供连接酶活性的连接酶将第一探针的3′端连接到第二探针的5′端。
28.如权利要求27所述的方法，其中连接酶选自下组：热稳定的5′AppDNA/RNA连接酶、截短的T4 RNA连接酶2、截短的T4 RNA连接酶2K227Q、截短的T4 RNA连接酶2KQ、小球藻病毒PBCV-1DNA连接酶，或其任何组合。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述第一探针还包含功能序列，其中所述功能序列是引物序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，还包括提供与所述捕获探针捕获域相互作用的捕获探针捕获域封闭部分。
31.如权利要求30所述的方法，还包括在步骤(f)之前从捕获探针捕获域释放捕获探针捕获域封闭部分。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含聚腺苷酸化(聚(A))序列或其互补物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述捕获探针捕获域封闭部分包含聚尿苷序列、聚胸苷序列或两者。
34.如权利要求33所述的方法，其中从聚(A)序列释放聚尿苷序列包括使连接产物变性或使连接产物与核酸内切酶、核酸外切酶或核糖核酸酶接触。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含与所述捕获探针的捕获域的全部或部分互补的序列。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域包含简并序列。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中第一探针和/或第二探针是DNA探针。
38.如权利要求4-37中任一项所述的方法，其中所述第三探针是DNA探针。
39.如权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述捕获探针捕获域封闭部分是DNA探针。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述释放步骤(f)包括从所述分析物去除连接的探针。
41.如权利要求40所述的方法，其中(i)从分析物释放连接产物或(ii)从捕获域结合域释放捕获探针捕获域封闭部分包括使连接的探针与核糖核酸内切酶接触。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述核糖核酸内切酶是RNA酶H、RNA酶A、RNA酶C或RNA酶I中的一种或多种。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述RNA酶H包括RNA酶H1、RNA酶H2或RNA酶H1和RNA酶H2。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述组织样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品、新鲜或冷冻的组织样品。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述组织样品是FFPE组织样品，并且所述组织样品是去交联的。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述生物样品预先染色。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述生物样品预先使用免疫荧光或免疫组织化学染色。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述生物样品预先使用苏木精和伊红染色。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述生物样品与透化剂接触，其中所述透化剂选自有机溶剂、去污剂和酶，或它们的组合。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述透化剂选自下组：内肽酶、蛋白酶十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20、N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液、皂苷、TritonX-100TM和Tween-20TM。
52.如权利要求51所述的方法，其中内肽酶是胃蛋白酶或蛋白酶K。
53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)之前固定该生物样品。
54.如权利要求53所述的方法，其中使用甲醇和丙酮中的一种或两种进行固定生物样品的步骤。
55.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述分析物包括RNA。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
57.如权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括扩增与所述捕获域特异性结合的所述连接产物的全部或部分。
58.如权利要求57所述的方法，其中扩增产物包含(i)与捕获域特异性结合的连接产物的序列的全部或部分或其互补物，和(ii)空间条形码的序列的全部或部分或其互补物。
59.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括测序。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述测序步骤包括原位测序、桑格测序法、下一代测序法和纳米孔测序。
61.一种试剂盒，其包括：
(a)包含多个捕获探针的基材，所述捕获探针包含空间条形码和捕获域；
(b)一种系统，包括：多个第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针各自包含与分析物基本互补的序列，并且其中第二探针包含捕获结合域；和
(c)用于执行前述权利要求中任一项的方法的说明。
62.一种试剂盒，其包括：
(a)包含多个捕获探针的阵列；
(b)包含第一探针和第二探针的多个探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第二探针包含(i)捕获探针捕获域，其能够结合至捕获探针的捕获域和(ii)接头序列；
(c)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和
(d)用于执行前述权利要求中任一项的方法的说明。
63.一种试剂盒，其包括：
(a)包含多个捕获探针的阵列；
(b)包含第一探针和第二探针的多个探针，其中第一探针和第二探针与分析物的相邻序列基本互补，其中第一探针包含接头序列，其中第二探针包含能够结合至捕获探针的捕获域的捕获探针捕获域；
(c)包含核糖核酸酶和连接酶的多种酶；和
(d)用于执行前述权利要求中任一项的方法的说明。
64.如权利要求61-63中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含在其5′端包含预腺苷酸化磷酸基团的第二探针，以及不需要三磷酸腺苷以提供连接酶活性的连接酶。
65.一种组合物，其包含含有捕获探针的空间阵列，其中所述捕获探针包含空间条形码和捕获域、在所述空间阵列上的生物样品，其中所述生物样品包含多种感兴趣的分析物、与分析物杂交并连接在一起的第一探针寡核苷酸和与第二探针寡核苷酸，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本互补的序列，并且其中第一探针或第二探针中的一个包含捕获探针捕获域。
66.如权利要求65所述的组合物，其中所述组合物还包含RNA酶H酶。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述组合物还包含连接酶。
68.如权利要求67所述的组合物，其中不包含捕获探针捕获域的探针寡核苷酸包含功能域。
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