CN110050071A - 用于使用标记的核酸成像剂进行多路复用成像的改进方法 - Google Patents
用于使用标记的核酸成像剂进行多路复用成像的改进方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了进行多路复用成像的某些有利方式。
Description
说明书
技术领域
本申请总体涉及分析物(例如，靶)的检测和定量领域。
背景技术
荧光显微术是用于探索例如生物系统中的分子的有力工具。然而，可以可区别地且同时地可视化的不同种类的数量(即多路复用能力)受荧光团之间光谱重叠的限制。一些多路复用成像方法是已知的，但可能不足以产生足够强的信号，或者可能需要用于在被成像的靶之间切换的特定装置。因此，需要采用改进的扩增方法和在被成像的靶之间切换的附加装置的新的和改进的多路复用成像方法。
发明内容
根据描述，在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法包括：
(1)使待测试一种或多种靶存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)使样品与具有与核酸链的互补性的非线性扩增链接触，其中所述核酸链是对接链或引物链，
(4)任选地去除未结合的非线性扩增链，
(5)用滚环扩增以一个或两个步骤来扩增所述对接链，以及使所述样品和与所述对接链或经扩增的链具有互补性的标记成像链接触，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(7)去除所述结合的标记成像链，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或所述步骤(1)-(8)的任何子集。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法包括：
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体直接或间接地与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸是
(a)对接链，则任选地增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数目，或
(b)引物链，则任选地将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链，以及
(7)任选地消除(extinguishing)来自所述结合的标记成像链的信号；
(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或所述步骤(1)-(7)的任何子集。
在一些实施方案中，一种组合物包含：样品，所述样品与多于一种靶特异性结合配偶体结合，每种结合配偶体与核酸链结合；以及至少一条对接链，所述至少一条对接链直接或间接地与标记成像链稳定结合，其中所述核酸链是对接链或引物链，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合。
在一些实施方案中，一种组合物包含：
(1)标签，
(2)第一核酸结构域、第二核酸结构域和第三核酸结构域，其中每个核酸结构域的长度为1至9个核苷酸，
(3)第一连接部分，所述第一连接部分连接所述第一核酸结构域和所述第二核酸结构域，以及
(4)第二连接部分，所述第二连接部分连接所述第二核酸结构域和所述第三核酸结构域，
其中两个连接部分独立地选自(a)具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点，(b)可被核酸糖基化酶切割的接头，(c)非天然核苷酸，或(d)限制性位点或切口位点。
本发明的另外目的和优点将部分陈述在以下描述中，并且部分将从所述描述中显而易见或者可通过实践本发明来得知。所述目的和优点将借助在所附权利要求书中具体指出的要素和组合来实现和达到。
应当理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制权利要求。
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明了本发明的一个(几个)实施方案，并与描述一起用来解释本文所述的原理。
附图简述
图1A至图1E示出了经由靶识别部分将对接链附接至靶的方案。具体地，图1A示出了在没有信号扩增的情况下，将对接链附接至靶识别部分。图1B示出了在具有信号扩增的情况下，使用分支结构将对接链附接至靶识别部分，该分支结构可以使用诸如HCR的方法来产生。图1C示出了在具有信号扩增的情况下，使用线性结构将对接链附接至靶识别部分，该线性结构可以使用诸如RCA的方法来产生。图1D示出了改进的杂交链式反应(HCR)，其中对接位点(结构域b)附接至HCR的两个发夹中的一个发夹，从而允许将多个对接位点引入一个靶识别部分。图1E示出进行滚环扩增以将多个对接位点(结构域c-d)引入一个靶识别部分。在该图中使用以下参考标号。101：靶。102：靶识别部分。103：对接链。120：HCR反应的引物链，其附接至靶识别部分。121：HCR的一个发夹，其与对接位点附接。122：HCR的另一个发夹。123-126：顺序发夹装配反应。127：附接至靶识别部分的引物。128：可通过连接环化的线性模板。129：连接反应。130：使用具有链置换活性的DNA聚合酶进行引物延伸。131：多个对接位点。
图2示出了扩增且可移除的信号的顺序扩增、聚合和接枝化(dendrimerization)。
图3示出了扩增且可移除的信号的同时扩增、聚合和接枝化。
图4A至图4B示出了(A)对从HRP样酶进行顺序扩增的连续成像，和(B)对从HRP样酶进行顺序扩增的同时成像。
图5A至图5D示出了使用核酸降解酶去除成像链。(A)总体方案。(B)在成像链的对接链识别部分中存在单个脱氧尿苷(dU)核苷酸的实施方案。(C)在成像链的对接链识别部分中存在多个dU核苷酸的实施方案。(D)将dU核苷酸置于成像链的对接链识别部分与信号产生部分之间的连接内的实施方案。104：成像链。105：成像链的信号产生部分。106：靶识别部分与对接链之间的连接。107：到其他对接链的任选连接。120：附接的杂交链式反应(HCR)的引物链。201：dU，作为可以酶促降解的部分的示例。202：用于降解dU的酶促反应。203：降解反应的残余物自发地与对接链分离的过程。
图6A至图6F示出了使用聚合酶去除成像链。(A)将自引发发夹放置在成像链的3'端处；使用具有链置换活性的聚合酶(例如，phi29)去除成像链。(B)将自引发发夹放置在成像链的3'端处，所述成像链经由核酸杂交与信号产生部分连接；使用具有链置换活性的聚合酶去除成像链。(C)将自引发发夹放置在对接链的3'端处；使用具有链置换活性的聚合酶去除成像链。(D)将自引发发夹放置在成像链的3'端处；使用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶(例如，DNA聚合酶I)去除成像链。(E)将自引发发夹放置在对接链的3'端处；使用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶去除成像链。(F)用具有可延伸3'端的杂交双链体替代自引发发夹。301：自引发发夹。302：自引发发夹或具有可延伸3'端的杂交双链体由具有链置换活性的DNA聚合酶延伸的反应。303：经由杂交将信号产生部分引入成像链中的短寡核苷酸。304：自引发发夹或具有可延伸3'端的杂交双链体由具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶延伸的反应。305：具有可延伸的3'端的杂交双链体。306：靶识别部分与对接链之间的连接，其中该连接包括共价或非共价相互作用。
图7A至图7G提供扩增后的图像。图7A提供了说明用DNA交换和基于HRP的扩增在荧光成像与明视野成像之间切换的过程的示意图。图7B提供了用抗体-DNA缀合物和相应的荧光标记成像链标记的扁桃体组织细胞角蛋白的所得荧光图像。图7C提供了在DNA交换和基于HRP的生色扩增后在同一扁桃体组织中的细胞角蛋白的所得明视野免疫组织化学图像。图7D和图7E示出了在没有扩增(D，左)和具有滚环扩增(E，右)的情况下，从进行波形蛋白和DAPI染色的细胞样品获得的荧光信号。图7F提供了用抗体-DNA缀合物和相应的荧光标记成像链(F，左)标记的扁桃体组织细胞角蛋白的所得荧光图像。图7G的右侧示出了在对接链的HCR扩增以及相应的荧光标记成像链的杂交后，来自同一组织切片的荧光图像。在图7D和图7E中，图像显示DAPI核染色为蓝色的并且表现为通常位于细胞中心区域中的大致环状或豆形物体。DAPI使细胞核内的DNA染色，并被包含在图像中作为视野中存在细胞的证据。在没有扩增的情况下图7D中的波形蛋白染色(红色)较低，而在具有扩增的情况下图7E中的波形蛋白染色较明亮且更强烈。红色波形蛋白染色显示细丝状或细微染色主要在细胞核外。
图8示出了预先形成的非线性DNA链的使用，所述预先形成的非线性DNA链可以与对接链杂交以作为滚环聚合的起始点。
图9A至图9F和图9H至图9K示出了在交换成像实验期间在Cy5通道中获得的一系列图像，以用于重新探询样品中的靶。图9G示出了图9A至图9F的图像中的平均信号强度。
图10A至图10B示出了具有稳定结合的接近检测的示意图和结果。与图7D至图7E类似，图10A至图10B示出了细胞核内的DAPI(蓝色)染色。图10A还示出α-微管蛋白染色(绿色)主要在细胞核外。
图11A至图11C示出了在被设计用于评估脱靶交叉反应性的实验中的细胞染色。这些图也使用细胞核内的DAPI染色(蓝色)。α-微管蛋白染色(红色)强烈存在于图11A中，不存在于图11B中，并且微弱存在于图11C中。
图12A至图12D示出，通过使用USER或UDG，来自靶的信号可几乎完全被消除。
图13A至图13D示出了交换成像的各种实施方案，一些实施方案使用引物和中间链以及成像链和对接链。图13A示出了使用中间链(401)将成像链与通过靶识别部分与靶结合的对接链连接，而进行的DNA交换成像。图13B示出了使用引物链(404)来扩增与靶结合复合物相关的对接链的数目，其中所得的扩增产物(403)附接到多个对接位点(103)，并且可以直接或间接地经由如图所示的中间链，使用成像链来成像。图13C示出了使用用以引发杂交链式反应的引物链进行与靶相关的对接链的数目的扩增，以及通过添加成像链进行成像，所述成像链经由中间链与对接链结合。图13D示出了使用引物链作为用于连接和滚环扩增的模板来进行与靶相关的对接链的数目的扩增，然后加入成像链，所述成像链通过中间链与对接链结合以进行成像。
图14A至图14D示出使用核酸降解酶去除成像链的效率随序列设计而变化。在使用(图14B和图14D)和不使用(图14A和图14C)无碱基位点的情况下合成成像链。示出了在去除相应的荧光标记成像链之前(图14A至图14B，以30,000-强度标度示出)和之后(图14C至图14D，以2,000-强度标度示出)，用抗体-DNA缀合物标记的扁桃体组织中CD3的荧光图像。
图15A至图15F示出了交换成像的实施方案，其中使用四个用两种不同荧光团标记的成像链顺序地对四个靶进行成像，一次对两个靶进行成像。因此，图15示出了频谱和顺序多路复用的组合。
在所有附图和应用中使用以下参考标号：
具体实施方式
I.用于测试样品是否存在一种或多种靶的方法
本申请涉及用于使用一种或多种靶特异性结合配偶体来测试一种或多种靶的存在的改进方法和组合物。
交换成像是一种用于实现高多路复用能力，使得可以对同一样品上的多个靶进行成像的方法。交换成像的核心概念涉及以下步骤：(1)将不同的携带可解码信息的分子(称为对接链)附接到不同的靶特异性结合配偶体(诸如但不限于识别靶的抗体)，其中具有不同特异性(即，结合不同的靶)的靶特异性结合配偶体与不同的对接链连接，以及任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(2)使用一组分子(称为成像链)来标记对接链的子集，每个分子特异性地识别对接链并携带可观测部分，以及对靶的相应子集进行成像，(3)通过去除步骤2中使用的成像链的集合、从成像链中去除可观测部分、或使此类成像链上的可观测部分失活，来使来自结合的标记成像链的信号消除，以及(4)使用另一组成像链来标记对接链的另一个子集，每个成像链特异性地识别对接链并携带可观测部分，以及对靶的相应子集进行成像，(5)任选地，可以重复步骤3和4以将靶的多个子集可视化。最终用户将很容易理解，并非所有步骤都应在所有实验中重复。例如，在最后一轮成像中，不需要消除来自结合的标记成像链的信号，因为不会施加另外的成像链。
交换成像的一个非限制性示例是DNA交换免疫荧光，其中使用抗体作为靶识别分子来对靶蛋白或其他生物分子进行成像，使用DNA寡核苷酸作为对接链，并使用与对接链互补且用至少一个可观测部分(诸如荧光团)标记的DNA寡核苷酸作为成像链。在步骤3中，使来自结合的标记成像链的信号消除包括若干实施方案。在一些实施方案中，可以去除成像链，从成像链上去除标记，和/或使附接到成像链的标记失活。可以通过使用高温、低离子强度缓冲剂、变性剂(包括例如甲酰胺)、DNA解旋酶、DNA酶、链置换、化学切割、酶促切割、化学漂白、光致漂白和/或光化学漂白来使用这些各种方法。通过结合的标记成像链，我们旨在区分在一个点处与对接链结合的标记成像链与未与对接链结合的过量标记成像链。在使信号消除的过程期间，所谓结合的标记成像链可以保持与对接链结合，或者其可以不保持与对接链结合。
在一些实施方案中，对样品成像以检测结合的标记成像链检测了结合的标记成像链的存在。在一些实施方案中，对样品成像以检测结合的标记成像链检测了结合的标记成像链的存在、位置和/或数量。
可以与这些方法结合使用各种类型的成像。例如，成像可以包括具有物镜、照明和传感器的任何类型的显微术。在一些实施方案中，使用光学显微镜，包括宽视野、共焦(线和点扫描、转盘)、全内反射(TIR)、受激发射损耗(STED)、光片照明(包括格子光片照明)、结构照明(SIM)的荧光显微镜，扩展显微镜和电子显微镜进行成像。
A.扩增方法
在显微术中，在许多情况下(例如当靶的丰度较低时，当可允许的曝光时间较短，和/或当成像设备的灵敏度较低时)需要信号扩增。信号扩增提供了在DNA交换免疫荧光方面的优势。在传统的单重免疫荧光(其中仅分析一个靶)中，往往使用未缀合的一抗和荧光标记的二抗。因为二抗往往是多克隆的，所以多个二抗分子可以结合到一个一抗分子，从而导致信号的扩增。然而，在DNA交换免疫荧光中，在一些实施方案中，用户直接将DNA对接链标记为一抗，从而消除了通过使用多克隆二抗获得的此类信号扩增步骤。因此，在一些情况下，相对于传统免疫荧光，DNA交换免疫荧光可具有更低的信号强度。
因此，在一个实施方案中，使用扩增来改善多路复用的DNA交换免疫荧光中的信号强度。存在许多用于显微镜中的信号扩增的方法，但并非所有方法都可以应用于DNA交换免疫荧光。最熟知的方法中的一种方法涉及将靶识别分子(例如，抗体)(共价或非共价地)连接到可将不可观测的底物转化为可观测产物的酶。许多酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GO)、β-半乳糖苷酶(β-gal)，已被用于这些目的。此外，已经开发出一系列用于这些酶的生色、荧光和化学发光底物，诸如3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)，以及5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)。另一种在信号扩增中利用此类酶的策略是在靶(或靶附近的其他分子)与可观测的报道分子之间产生共价键。该策略例示为由Thermo Fisher和PerkinElmer等商业化的酪胺信号扩增(TSA)技术。然而，这些信号扩增方法都不与交换成像兼容，因为可观测的报道分子、酶/引物或底物永久地或在不具有可解码的对接链的情况下被带到靶的附近。已经报道了基于DNA的(即，可解码的)信号扩增方法，其中可观测的信号可以至少在原理上被去除(例如，Zimak等，Chembiochem 13(18):2722-8(2012)(PMID:23165916))。然而，此类方法涉及多轮操纵并且信号增益是适度的。
另一种类型的信号扩增涉及将靶识别分子(共价或非共价地)连接到聚合或枝化反应的引物分子。这种聚合反应的一个示例是滚环扩增(RCA)，其中RCA的引物与靶识别分子连接并转化为长重复的单链DNA。荧光分子可以经由荧光标记的核苷酸直接并入RCA产物中，或者作为荧光标记的寡核苷酸的一部分与RCA产物结合，该荧光标记的寡核苷酸被设计为与RCA产物杂交。此类聚合或枝化反应的其他示例包括基于支链DNA立足点(toehold)的链置换(Schweller等，PMCID:PMC3517005)、杂交链式反应(HCR)(Dirks等，2014,PMID:15492210,24712299)，以及类似的基于DNA发夹的枝化反应(Yin等，2008,PMID 18202654)，在此我们将该枝化反应称为HDR。诸如RCA、HCR和HDR的扩增方法的常见应用不包括用于交换成像的选项，但是可以是兼容的，如本文所述的改进所证明的。
在本文中，我们讨论了包括与交换成像兼容的信号扩增的实施方案。我们描述了一系列使信号扩增与交换成像兼容的实施方案。基于扩增产物是否可解码，这些实施方案可分为两类。例如，如果扩增产物含有对接链组分(例如单链DNA)，则可以将针对不同靶的许多(例如，>5种)抗体编程为产生具有不同对接链序列的此类产物，所述不同对接链序列可以稍后由具有互补序列的ssDNA分子解码。因此，这种扩增产物被认为是可解码的。在此类情况下，可以同时进行不同靶的信号扩增，然后进行不同扩增产物的同时和/或顺序成像。对不同靶进行的同时扩增可以被认为是多路复用扩增。
相比之下，当扩增产物是共价附接或非共价沉积在靶附近但不含有可与成像链相互作用的对接链的荧光团或标记物时，这些扩增产物被认为是不可解码的。例如，当负责信号扩增的酶是HRP时，产物是这样的化学发色团，该化学发色团不允许可以被许多充当成像链的分子特异性结合的许多变型。在此类情况下，可以顺序地进行不同靶的信号扩增，并且可以从样品中去除与已经扩增的靶连接的酶。如果可使用正交的酶-底物对，则可以同时对不可解码的扩增产物进行信号扩增。
因此，在一些实施方案中，方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸链是(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或者(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合(在(a)或(b)中，例如从而扩增可用的对接链的数量)，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，(7)任选地从对接链中去除结合的标记成像链，以及(8)任选地重复步骤(1)-(6)，或步骤(1)-(6)的任何子集。
通过与每个靶特异性结合配偶体相缔合的对接链，在此和整个申请中，申请人并非旨在要求在每个单一对接链上发生扩增，但该扩增通常如用户所需要的发生在与各种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链上(包括仅扩增一些参与检测靶A和B的对接链，而不扩增参与检测靶B的对接链)。扩增也可能是不完全的，诸如扩增仅在一些而不是所有参与检测给定靶的对接链的拷贝上发生。另外，扩增可以复制整个对接链，或者其可以仅复制足以结合成像链的对接链部分。
另外，在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，其中(1)中的核酸链为引物链或对接链，并且如果所述核酸链为引物链，则其与对接链连接，(4)任选地去除未结合的标记成像链，(5)对样品进行成像以检测结合的标记成像链并确定是否需要扩增(步骤(7))，(6)任选地从对接链上去除结合的标记成像链，(7)任选地增加与每个靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量(例如，通过多种手段对可用的对接链的数量进行扩增，所述多种手段包括但不限于对接链复合物的自装配、其他装配方法、支链和环状对接链等)，以及(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或步骤(1)-(7)的任何子集。
1.扩增
可解码的扩增产物。可解码扩增产物包括扩增产物是对接链的那些情况。在一个实施方案中，对接链不含可观测的标记。在一个实施方案中，对接链用作可观测标记(或成像链)的条形码。首先应该注意的是，可以在信号扩增反应期间将对接链或对接位点引入靶(图1b至图1c)，使得多个对接链附接到一个靶分子。在不受限制的情况下，至少有两种实现此的策略：(策略1)创建附接到支架的多个对接位点，该支架继而附接到靶识别部分(图1b)，以及(策略2)在附接到靶识别部分的一条长单链DNA上创建多个结合位点(图1c)。
可以使用RCA、HCR或HDR从与抗体连接的引物分子产生聚合物或树枝状聚合物产物。在一些实施方案中，产物可含有单链DNA结构域的许多(例如，多于2个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、100个等)拷贝，所述拷贝可用作对接链，并且因此由用作成像链的寡核苷酸识别。此类DNA结构域可为足够长的(例如，7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个或更多个核苷酸长，或能够在成像条件下结合其互补链，其中Kd<1nM)。对于RCA，这是定期实现的。对于HCR和HDR，如果需要的话，则可以在底物发夹的环或尾部处包含不参与链置换级联但构成成像链结合位点的部分或全部的DNA结构域。
在一个实施方案中，采用改进形式的杂交链式反应(HCR)来进行信号扩增，其中以交替方式将两个发夹(图1d的105和106)装配到引物链(图1d的104)上。两个发夹中的任一者或两者可携带对接位点(图1d的发夹105上的结构域b)。可以将数十至数百个发夹单元装配到一条引物链上，从而将数十至数百个对接位点包含在靶识别部分中。Pierce group已经证明了几对发夹序列(没有对接位点)能够进行成功的HCR反应。具有对接位点的发夹序列可以用相同的原理设计，但是可能需注意确保对接位点不与发夹的其余部分形成不希望的二级结构。
在另一个实施方案中，信号扩增涉及将靶识别分子(共价或非共价地)连接到聚合或枝化反应的引物分子。这种聚合反应的一个示例是滚环扩增(RCA，图1e)，其中RCA的引物与靶识别分子连接并转化为长重复的单链DNA。荧光分子可以经由荧光标记的核苷酸直接并入RCA产物中，或者作为荧光标记的寡核苷酸的一部分与RCA产物结合，该荧光标记的寡核苷酸被设计为与RCA产物杂交。
有许多用于进行RCA的方法，其中一种方法是首先确保缀合至靶识别部分的寡核苷酸(在此我们称之为‘引物’，图1e的111)具有可扩展的3'端。然后可以引入能够以环形方式与引物杂交的线性模板链(图1e的112)，其中该引物使模板的两个末端集合在一起，使得可以连接两个末端。接下来，使用连接酶(诸如例如T4DNA连接酶或CircLigaseTMssLigase)来连接两个末端以形成环。连接后，将引物与环状模板杂交。接下来，具有链置换活性的DNA聚合酶(例如，phi29、Bst、Vent(exo-))可以使引物沿着环形模板延伸多轮以产生串联重复。整个重复单元的一部分(结构域c-d，或图1e的115)可以作为成像链的对接位点(或对接链)。
替代的RCA方法涉及使用非线性扩增链或模板链，其中使缀合至靶识别部分的寡核苷酸(诸如对接链)与环状DNA模板(扩增链)杂交，然后用DNA聚合酶来延伸对接链以产生具有扩增链的反向互补体的串联重复(即经扩增的链或RCA产物)。扩增链与寡核苷酸缀合的靶识别部分的杂交可以在缀合至靶识别部分的寡核苷酸与样品接触之前(预装配或预杂交)或之后发生。
因此，在一些实施方案中，将至少一个寡核苷酸缀合的靶识别部分在引入样品之前与非线性扩增链杂交。当用户选择用扩增仪预装配抗体-DNA缀合物时，用于测试样品中是否存在一种或多种靶的方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同核酸链连接，并且其中至少一个核酸链与非线性扩增链杂交，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)用滚环扩增来扩增对接链(即，增加对接链的数目或引入多个对接链)以产生滚环扩增产物，(4)使样品和与对接链或滚环扩增产物具有互补性的标记成像链接触，(5)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，(6)任选地去除结合的标记成像链，以及(7)任选地重复步骤(1)-(7)或步骤(1)-(7)的任何子集。在该过程中，滚环扩增产物包含扩增链的反向互补体的串联重复。
在另一个实施方案中，成像链可以在RCA反应期间与RCA产物(例如，具有与靶识别部分连接的扩增链的反向互补体的串联重复)杂交。因此，在一些实施方案中，在与经扩增的链具有互补性的标记成像链的存在下，使用滚环扩增进行扩增。例如，可以使样品与缀合至靶识别部分的寡核苷酸接触，所述靶识别部分与扩增链预杂交，或者扩增链可以在后面的步骤中杂交。然后，可以在一个步骤中添加用于RCA反应的所有其他组分，包括蛋白质(例如DNA聚合酶，任选地为BSA)、核苷酸、缓冲溶液、盐和成像链。在一些实施方案中，用户可能希望防止成像链被扩增。这可以通过几种手段实现，所述手段包括但不限于采用在3'端上具有修饰的3'-修饰的成像链。例如，成像链上的3'修饰可包括标记(诸如荧光团)、经修饰的碱基、终止密码子或终止子、3'-O-修饰、双脱氧-C、双脱氧-G、双脱氧-A、双脱氧-T、反向核苷酸、消除3'羟基存在的任何修饰，或不与扩增链互补的3'端的单链延伸。
除了HCR和RCA之外，这种聚合或枝化反应的其他示例包括基于DNA发夹的枝化反应(HDR)(Yin等，2008,PMID 18202654)和立足点介导的链置换。
DNA链置换是用于DNA复合物的等温和动态交换的方法。可以基于对DNA杂交相互作用和热力学的理解来设计和有意地控制链置换，并且可以通过引入被称为“立足点结构域”的工程化处理来促进链置换。调节结合相互作用和交换杂交配偶体的能力产生了一系列潜在的信号扩增应用。
在另一个实施方案中，描述了可编码的基于酪胺的信号扩增产物。该方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)使样品与能够结合对接链的酶标记链接触，其中(1)中的所述核酸链是引物链或对接链，并且如果所述核酸链是引物链，则其与对接链连接，(5)任选地去除未结合的酶标记链，(4)使样品与酪胺结合的对接链接触，(5)将所述酪胺部分酶促转化为活化状态，其中所述活化状态导致酪胺结合的对接链与酶标记靶位点共价连接，(6)任选地猝灭所述酶促反应，(7)去除所述酶标记链，以及(8)任选地重复步骤3-8的子集。在一个实施方案中，酶连接的链是HRP连接的链。
在另一个实施方案中，方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与一种靶特异性结合配偶体接触，其中所述靶特异性结合配偶体与酶连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)使样品与酪胺结合的对接链接触，(4)将所述酪胺部分酶促转化为活化状态，其中所述活化状态导致酪胺结合的对接链与酶标记的靶位点共价连接，(5)猝灭所述酶促反应，以及(6)任选地重复步骤1-8的子集，其中引入具有不同特异性的靶特异性结合配偶体。在一个实施方案中，酶连接的靶特异性结合配偶体含有HRP。
如图2所示，可以顺序地进行多个靶的扩增。或者，可以同时进行多个靶的扩增(图3)。成像步骤可以在各轮扩增之间进行，或者在所有轮扩增之后进行。
不可解码的扩增产物。不可解码的扩增产物包括扩增产物是对成像链不具有特异性亲和力的可观测标记的那些情况。在一个实施方案中，不可解码的扩增产物可以是荧光团、发色染料或纳米颗粒。
在一个实施方案中，用于产生不可解码的扩增产物的方法包括：(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)使样品与能够结合对接链的酶标记链接触，其中(1)中的所述核酸链是引物链或对接链，并且如果所述核酸链是引物链，则其与对接链连接，(5)任选地去除未结合的酶标记链，(4)使所述样品与所述酶的底物接触，(5)允许进行酶促反应以产生扩增产物，(6)猝灭所述酶促反应，(7)对所述样品成像以检测是否存在一种或多种靶，(8)去除所述扩增产物，以及(9)重复步骤1-9的子集。可以使用的酶的示例包括HRP、AP、GO、β-gal。当酶与成像链(即能够结合对接链的链)连接时，可以进行顺序扩增和成像(图4)。图4a示出了用于顺序扩增和顺序成像的方法。在此，采用一种方法来在各轮成像之间去除扩增产物或使扩增产物失活。通过仔细选择底物可以去除扩增产物或使扩增产物失活。例如，可以使用HRP的生色底物，该生色底物可溶于样品友好的有机溶液(例如，3-氨基-9-乙基咔唑，其为醇溶性的，PMID 19365090)。在这种情况下，在对对接链缀合的抗体进行染色(图4a，步骤1)后，引入针对一种靶的成像链缀合的HRP和底物(图4步骤2)，并对样品进行成像，可以使用醇(例如，甲醇)来去除HRP产物并使用本文所述的任何方法或它们的组合来去除成像链。接下来可以引入针对另一种靶的成像链缀合的HRP，并重复该过程。
也可以使用TSA扩增方法，其中可以容易地漂白荧光团。例如，在酸性或碱性条件下过氧化氢可以容易地漂白许多花菁荧光团和Alexa荧光团(PMID：26399630)。或者，可以合成TSA染料，该TSA染料在酪胺与荧光团之间含有可切割的键。在这种情况下，可以通过切割该键和洗涤来使荧光团失活。
图4b示出了用于顺序扩增和同时成像的方法。在这种情况下，在对对接链缀合的抗体进行染色(图4b，步骤1)后，引入针对一种靶的成像链缀合的酶和底物(图4，步骤2，使用例如HRP和TSA)以生成扩增产物，可以在不去除扩增产物的情况下去除成像链缀合的酶，并重复针对多种靶的扩增多轮，然后以单个成像步骤对样品进行成像。
还可以使用RCA、HCR和HDR来在不解码扩增产物的情况下实现信号扩增。例如，在多重抗体染色后，可以添加仅支持一个靶子集的聚合/枝化并直接在扩增产物中掺入荧光染料(例如，在RCA的情况下经由荧光标记的核苷酸，并且在HCR和HDR的情况下经由荧光团标记的发夹底物)的试剂(在RCA的情况下为环状模板，并且在HCR和HDR的情况下为底物发夹)。在如上所述对该靶子集进行成像并通过漂白或切割使染料失活后，可以引入支持另一个靶子集的聚合/枝化并将荧光染料直接掺入扩增产物中的试剂。然后可以重复该过程。
甚至可以组合使用多种类型的信号扩增。例如，Gusev等报道了将滚环扩增与基于HRP的信号扩增(PMID:11438455)进行组合。
可以用可以直接或间接观察到的其他分子或部分来替代荧光团(该荧光团为经由DNA复合物或其他扩增方法引入靶中的)。这些分子或部分包括但不限于金属粒子、等离子体增强剂，以及蛋白质。
2.非线性扩增
非线性DNA模板可作为环形扩增链而用于信号扩增。可以与扩增方法分开地产生与对接链互补的环状寡核苷酸。例如，可以对模板DNA链进行非原位连接以形成DNA的环状链。在接触样品之前，可以使环状链与附接到靶特异性结合配偶体的对接链杂交。或者，可首先使用靶特异性结合配偶体来对样品进行染色，然后可将环状链引入样品中以与靶特异性结合配偶体上的对接链杂交。在形成复合物(其中环状链附接到与靶特异性结合配偶体连接的对接链)之后，可以进行滚环扩增(RCA)。该方法提供了某些优点，因为其可用于避免低效原位连接步骤的问题。
在一些情况下，可以使用扩增链。例如，在一些实施方案中，方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)使样品与具有与核酸链互补性的非线性扩增链接触，其中(1)中的核酸链是引物链或对接链，(4)任选地去除未结合的非线性扩增链，(5)用滚环扩增来扩增对接链(即，增加对接链的数量或引入多个对接链)，(6)使所述样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(7)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链，(8)去除所述结合的标记成像链，以及(9)任选地重复步骤(1)-(8)，或步骤(1)-(8)的任何子集。
在一些实施方案中，聚合酶可用于RCA。在一些情况下，标记的成像链是线性链。在一些情况下，非线性扩增链是环状链。在一些情况下，非线性扩增链是分支链。在一些情况下，非线性扩增链在连接后变为环状的。
在一些实施方案中，扩增产物可包含几何形状，诸如三角形、四边形、五边形、六边形等。
B.方法步骤的变化
存在各种用于实现多路复用成像的方式，包括在不同时间点使用扩增步骤扩增信号以及重复步骤以允许对多种靶进行成像或重新询问单个靶的选项。方法还可任选地包括在各个时间点消除信号图像。
1.在施加成像链之前扩增信号并且任选地消除来自结合的标记成像链的信号
在一些实施方案中，用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链为对接链或引物链，并且如果所述核酸为(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，以及(7)任选地消除来自结合的标记成像链的信号。在一些情况下，在步骤(4)之后和任选地执行步骤(5)之后，该方法还包括增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量。在一些实施方案中，该方法还包括在增加对接链的数量之后去除未结合的标记成像链。因此，在一些模式中，将用滚环扩增来扩增对接链与使样品和与经扩增的链具有互补性的标记成像链接触分开进行。经扩增的链是指扩增产物(有时也称为扩增产物或RCA产物(如果采用滚环扩增的话))。
在一些情况下，将样品安装到光学透明的支撑件上。在一些实施方案中，使用酶实现与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链数量的增加。例如，可以采用在上面的章节I.A中描述的酶方法。
1.在成像链存在下对信号进行扩增并任选地地消除来自结合的标记成像链的信号
在一些实施方案中，用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(4)其中所述核酸链为对接链或引物链，并且如果所述核酸为(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，其中所述扩增在成像链的存在下发生，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链，以及(7)任选地消除来自结合的标记成像链的信号。在一些情况下，在步骤(4)之后和任选地执行步骤(5)之后，该方法还包括增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量。在一些实施方案中，该方法还包括在增加对接链的数量之后去除未结合的标记成像链。
在一些情况下，将样品安装到光学透明的支撑件上。在一些实施方案中，使用酶实现与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链数量的增加。例如，可以采用在上面的章节I.A中描述的酶方法。
成像链可以与对接链具有互补性。成像链可以是用于滚环扩增的环状成像链。成像链可以是在对接链和连接酶存在下环化的成像链。在一些实施方案中，成像链可包含与对接链互补的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个区域。
2.一种用于测试安装到光学透明支撑件上的样品的方法
在一些实施方案中，用于测试安装到光学透明支持件上的样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链为对接链或引物链，并且任选地如果所述核酸为(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，其中在液体培养基或缓冲液中提供标记的成像链，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)任选地去除液体以产生无液体样品，(7)与第一支持件平行地固定第二光学透明材料，以及(8)对样品成像以检测结合的标记成像链。
在一些实施方案中，第二光学透明材料是玻璃或塑料。在一些情况下，第二光学透明材料距第一支撑件约5微米至5mm、50微米至500微米，或500微米至5mm。在一些情况下，使用直立式显微镜进行成像。
在一些实施方案中，任选地去除液体以产生无液体样品包括制备样品以进行储存，例如长期储存至少4小时、1天、3天、1周、2周或1个月。在一些实施方案中，任选地去除液体以产生无液体样品增加了样品处理的便利性，因为用户不需要保持样品水合。
通过任选地去除液体以产生无液体样品，这意味着去除样品中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的液体(即，先前在样品中并与其他样品组分(诸如样品本身、对接链、成像链等)缔合的液体)。在一些实施方案中，安装介质包括空气。在其他实施方案中，安装介质包括凝胶制剂中的安装介质。在一些实施方案中，安装介质包含作为液体开始但随着时间流逝变成凝胶或固体的制剂(诸如硬化材料、胶水、水泥，或其他光学透明和类似功能的材料)。
在其他实施方案中，样品中的液体可以用液体安装介质(诸如基于盐水的缓冲溶液(诸如PBS))代替。
安装介质可用于将样品保持在适当的位置、防止样品变干、更贴近地匹配您将使用的目的折射率、防止光漂白(当不需要时)，以及保存样品以进行长时间储存。安装介质的选择取决于样品类型、成像策略、使用哪种可观测部分，以及用户的目的(用户是否希望使样品水合或用户是否希望储存样品)。
在一些实施方案中，用于测试安装到光学透明支持件上的固定样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链为对接链或引物链，并且如果所述核酸为(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)任选地去除液体以产生无液体样品，(7)与第一支持件平行地固定第二光学透明材料，以及(8)对样品成像以检测结合的标记成像链。
在各种多个实施方案中，光学透明支撑件和平行于第一支撑件的第二光学透明材料可包括流动池。在各种多个实施方案中，平行包括完全平行的几何布置，以及相对于平行偏离至多1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°或10°的几何布置。
3.样品重新询问
在一些实施方案中，用户可能希望重新询问样品中相同的靶多次。当需要重新询问时，通过用相同的成像链进行另一轮成像来进行多路复用成像。因此，当用户期望对不同的靶成像时，成像链相对于所有其他标记成像链具有独特的核苷酸序列。当用户希望对同一靶进行多次成像时，重复步骤使用相对于所有其他标记成像链不具有独特核苷酸序列，而是具有与先前采用的成像链相同的序列的成像链。
因此，在一些实施方案中，方法包括(1)使待测试一种或多种靶的存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中核酸链是对接链或引物链，并且任选地如果所述核酸是(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和数量，(7)消除来自结合的标记成像链的信号，以及(8)重复步骤(3)-(6)或(3)-(7)，其中标记成像链任选地具有相对于所有其他标记的成像链独特的核苷酸序列。
4.频谱和顺序多路复用
存在两种用于在交换成像中创建多路复用的主要方法：频谱多路复用和顺序多路复用。光谱多路复用是指在单轮成像中使用不同标记(例如不同荧光团)的能力。光谱多路复用不需要在观察第二标签之前消除来自第一标签的信号。例如，在荧光团的情况下，可以使用不同激发波长的光来单独激发不同的荧光团。这不需要单独的成像轮次。顺序多路复用是指通过在第二轮成像之前消除来自第一轮成像的信号，来在多轮成像中使用相同标记(例如相同荧光团)的能力。光谱多路复用和顺序多路复用可以单独使用或彼此结合使用。然而，使用多于一种多路复用技术可以显著增加用户在特定实验期间能够可视化的靶的数量。
在一些实施方案中，用至少一些相同的荧光团进行多轮成像。例如，在第一轮成像中，靶A可以用标记X成像，靶B可以用标记Y成像，并且靶C可以用标记Z成像。作为下一步，可以消除来自这些标签的信号。然后，在第二轮成像中，靶D可以用标记X成像，靶E可以用标记Y成像，并且靶F可以用标记Z成像。项目在一些实施方案中，使用至少两个标签对至少两个靶进行成像，消除信号，然后使用相同标签中的至少一个标签对至少一个或多个靶进行成像，其中成像步骤可以以任何顺序执行。这意味着步骤的顺序可以颠倒，使得第一成像步骤包括对至少一个靶进行成像，消除信号，并且第二成像步骤包括对至少两个靶进行成像。
组合光谱多路复用和顺序多路复用可以增加用户执行成像的整体便利性并减少对被成像的样品的破坏。
C.稳定结合
在一些实施方案中，成像中使用的互补剂中的至少一些互补剂彼此稳定结合，并且在其他实施方案中，成像中使用的所有互补剂彼此稳定结合。在一些实施方案中，对接链稳定地与成像链结合。在一些实施方案中，扩增链稳定地与对接链结合。在一些实施方案中，扩增链稳定地与成像链结合。
在一些实施方案中，中间链稳定地与对接链结合。在一些实施方案中，中间链稳定地与扩增链结合。在一些实施方案中，中间链稳定地与成像链结合。在一些实施方案中，扩增链稳定地与成像链结合。在一些实施方案中，引物链稳定地与对接链结合。
在一些实施方案中，一种组合物包含：样品，所述样品与多于一种靶特异性结合配偶体结合，每种结合配偶体与对接链结合；以及至少一条对接链，所述至少一条对接链稳定地与标记成像链结合。
在一些实施方案中，稳定结合至少包括表2中所述时间的结合百分比。例如，表2包括至少30分钟的90％结合。这意味着在t＝0处结合的项目中，90％的项目保持结合至少30分钟。这也意味着实现了平衡，该平衡在任何一个时刻具有至少90％的对接链与成像链结合，并且不超过10％不结合。稳定结合可以包括一些分子解除结合且其他分子重新结合以实现群体结合百分比；其不要求至少90％永久结合，其仅要求在任何一个时刻至少90％结合。稳定结合还可包括，其中V是对应于用户实验所需时长的可变时间量，并且x表示在该时长内的结合百分比符合稳定结合：
例如，稳定结合可包括70％、80％或90％结合约5分钟至7天、10分钟至60分钟、20分钟至3小时、30分钟至24小时、3小时至24小时，或24小时至7天。
表2中的值适用于上面讨论的所有类型的稳定结合。这些测量可以在成像条件(在一些情况下为室温、中性pH和生理缓冲条件)下、在非反应性缓冲液洗涤之后，或在非酶促缓冲液洗涤之后进行。
在一些实施方案中，参与稳定结合的对接链、引物链或中间链包含30个核苷酸或更少个核苷酸，诸如约8个至30个核苷酸、10个至25个核苷酸，或10个至20个核苷酸。在一些实施方案中，参与稳定结合的成像链包含30个核苷酸或更少个核苷酸，诸如约8个至30个核苷酸、10个至25个核苷酸，或10个至20个核苷酸。在一些实施方案中，扩增链为约30个至60个核苷酸、20个至80个核苷酸、30个至70个核苷酸、30个至60个核苷酸或多于60个核苷酸。扩增反应的类型也可影响所需的扩增链的长度，其中例如杂交链式反应(HCR)所需的长度较长。本领域普通技术人员应认识到，由于亲和力差异，对接链、成像链和/或扩增链中的不同碱基的组成将影响每条链中所需的核苷酸数。温度也会影响所需的核苷酸数量。
1.具有稳定结合的邻近成像
在一些实施方案中，用户可以采用具有稳定结合的邻近成像。在一些实施方案中，组合物包含：(a)至少一种第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，该寡核苷酸包含半对接结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；(b)至少一种第二结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，该寡核苷酸包含半对接结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；其中(a)和(b)的稳定结构域彼此互补，并且其中(a)和(b)的半对接结构域可以线性组合以形成完全对接结构域；和(c)至少一种标记的成像链或中间链，其包含5'结构域、3'结构域和位于5'结构域与3'结构域之间的接头结构域，其中所述5'结构域与(a)的半对接结构域互补并且3'结构域与(b)的半对接结构域互补，并且其中所述标记的成像链或中间链能够稳定地与所述完全对接结构域结合并且如果使用中间链，则还提供标记的成像链。或者，可以使用中间链并且该中间链与对接链和成像链两者互补。也可以采用扩增。表2中列出的稳定性标准也适用于此上下文。
在一些实施方案中，当采用引物时，用户可以采用具有稳定结合的邻近成像。在一些实施方案中，组合物包含：(a)至少一种第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，该寡核苷酸包含半引物结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；(b)至少一种第二结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，该寡核苷酸包含半引物结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；其中(a)和(b)的稳定结构域彼此互补，并且其中(a)和(b)的半引物结构域可以线性组合形成完整的引物结构域；(c)至少一种能够稳定地与所述完整的引物结构域结合的对接链；以及(d)至少一种能够稳定地与对接链结合的标记成像链，或能够稳定地与对接链结合的中间链和能够稳定地与所述中间链结合的标记成像链。能够稳定地与完整引物结构域结合的对接链包括互补结合(非共价)和从同一核酸链延伸(共价结合)。在对接链与完整引物结构域非共价结合并具有互补核酸序列的实施方案中，对接链可包含5'结构域、3'结构域和位于5'结构域和3'结构域之间的接头结构域，其中5'结构域与(a)的半引物结构域互补，并且3'结构域与(b)的半引物结构域互补。在对接链共价结合的实施方案中，对接链可以通过核酸合成而从完整引物结构域延伸出来。另外或替代地，可以使用中间链并且该中间链与对接链和成像链两者互补。也可以采用扩增。表2中列出的稳定性标准也适用于此上下文。
D.对照实验和背景扣除
可以采用对照实验和背景扣除来进一步改进用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法的结果。这些方面都不是有用的实验所必需的；然而，两者都提高了多路复用的质量并且可以单独使用或彼此结合使用。
1.对照实验
可以在多路复用过程中的多个时间点处加入对照测量。在一些实施方案中，用于测试安装到光学透明支持件上的固定样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地如果所述核酸是(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地(诸如经由中间链)与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，(7)消除来自结合的标记成像链的信号，(8)通过使样品与具有与对接链或中间链(即，如果使用的话，则是实际存在于该方法中的中间链，而不是假设的中间链)不互补的核苷酸序列的标记成像链接触来进行对照步骤，(9)任选地去除未结合的标记成像链，(10)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，和(11)任选地消除来自结合的标记成像链的信号。
在一些实施方案中，用于测试安装到光学透明支持件上的固定样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地如果所述核酸是(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)通过使样品与具有与对接链或中间链(即，如果使用的话，则是实际存在于该方法中的中间链，而不是假设的中间链)不互补的核苷酸序列的标记成像链接触来进行对照步骤，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和/或数目，(7)消除来自结合的标记成像链的信号，(8)使样品与能够直接或间接地(例如经由中间链)与对接链结合的标记成像链接触，(9)任选地去除未结合的标记成像链，(10)对样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和/或数量，以及(11)任选地消除来自结合的标记成像链的信号。
在上述两个实施方案的任一者中，在一些情况下，该方法还包括重复步骤(4)-(11)。在一些实施方案中，用户不重复对照步骤。在其他实施方案中，用户将重复对照步骤以评定非互补结合。
在这些实施方案中的一些实施方案中，与重复步骤中使用的对接链互补的标记成像链任选地具有相对于至少一种其他标记成像链独特的核苷酸序列。
在一些实施方案中，使用对照实验来评定非互补链的交叉结合以确保在评定靶A、B和C(例如)的示例中，旨在与固定于靶A的靶特异性结合配偶体(抗A)的对接链(对接链A)结合的成像链(成像链A)不与固定于B的靶特异性结合配偶体(成像链B)的对接链相互作用，或测量其相互作用的程度。在此类实施方案中，重复过程可以评估成像链C与对接链A等的相互作用。在这些实施方案中，不一定重复互补链(与对接链A结合的成像链A)。
2.背景扣除
在贯穿本申请所讨论的任何实施方案中，该方法可以采用背景扣除。在一些实施方案中，该方法包括对样品进行成像以检测和/或测量背景信号，并从样品的图像中扣除背景信号以检测结合的标记成像链。此类背景信号可包括自发荧光和/或与不完全消除来自结合的标记成像链的信号相关的残余荧光。在一些方面，在样品成像之前测量背景信号以检测结合的标记成像链。在其他方面，在样品成像之后测量背景信号以检测结合的标记成像链。
E.用于消除来自结合的标记成像器链的信号的方法
可以使用各种方法来消除来自结合的标记成像链的信号，并且这可能是需要的，使得可以在多个成像链上使用相同类型的可检测部分(诸如荧光团)，以便实验在光谱上不受限制。
换句话说，去除成像链的集合或使成像链上的可观测部分失活允许进行光谱上不受限制的多路复用成像。一些用于多路复用成像的现有方法受到可用的荧光团或其他成像剂的颜色数量的限制。去除成像链、从成像链中去除标记或使可观测部分失活允许在单个实验中重复使用相同颜色的荧光团。在一些实施方案中，理想地，应当移除尽可能多的信号以确保尽可能低的背景以进行继续成像。在一些实施方案中，100％的现有信号产生部分被去除或破坏，而在一些实施方案中，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的现有信号产生部分被去除或破坏。
因此，消除来自标记成像链的信号包括用于去除直接或间接地与对接链结合的成像链、从成像链去除标记或使成像链上的标记失活的任何方法。
用于消除来自成像链的信号的所有方法也可以应用于对接链。在一些实施方案中，消除来自结合的标记成像链的信号涉及破坏对接链(或引物链)与靶识别部分之间的连接。在一些实施方案中，对接链包含光可切割的接头，该光可切割的接头可以光化学地切割(例如通过UV曝光、可见光、红外、近红外、x射线、微波、无线电波，或γ射线)。在一些实施方案中，对接链(或引物链)本身含有可被酶切割的部分。此类可酶促切割部分的示例包括但不限于核糖核苷酸，其可由多种RNA酶切割；脱氧尿苷，其可以由酶组合(诸如USER(NewEngland Biolabs))切割；以及限制性位点，其可以由序列特异性切口酶或限制性酶切割。在一些实施方案中，对接核酸包含脱氧尿苷，在脱氧尿苷中尿嘧啶基团可被尿嘧啶-DNA糖基化酶切割。在一些实施方案中，对接核酸包含无碱基位点，该无碱基位点可由内切核酸酶切割。
交换成像的一个非限制性示例是DNA交换免疫荧光，其中使用抗体作为靶识别分子来对靶蛋白或其他生物分子进行成像，使用DNA寡核苷酸作为对接链，并使用与对接链互补且用荧光团标记的DNA寡核苷酸作为成像链。用户可以通过使用高温、变性剂、DNA解旋酶、DNA酶和/或链置换来消除来自标记成像链的信号，或者可以通过化学切割、酶促切割，化学漂白，光学漂白和/或光化学漂白来去除成像链上的荧光团。
1.核酸降解酶
许多酶能够破坏核酸分子内的共价键。例如，一些糖基化酶能够从核苷酸的糖部分去除碱基，核酸内切酶能够切断核酸分子内的磷酸二酯桥内的键，而核酸外切酶能够类似地以顺序方式破坏核酸分子的5'或3'端的磷酸二酯桥。另一个示例包括DNA酶或脱氧核酶，具有能够切割核酸分子中磷酸二酯键的催化活性的寡核苷酸。所有这些类型的酶可以被设计用于成像链去除(图5)并且构成标记成像链的核酸的酶促切割、修饰或降解。
糖基化酶。如果糖基化酶能够特异性地去除参与对接链与成像链之间的碱基配对的碱基，则其可以降低两种链之间相互作用的强度。例如，可以使用脱氧尿苷(dU)代替成像链中的脱氧胸苷(dT)。dU可以与dT一样与对接链中的dA配对，但可以被尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG，可从New England Biolabs商购获得，目录号M0280S)特异性地去除。该反应将导致成像链上的无碱基位点。这种脱碱基位点可以被核酸内切酶VIII进一步切割。这将进一步促进成像链的残余物与对接链之间的分离。包含UDG和内切核酸酶VIII的酶共混物也是可商购的(例如，来自New England Biolabs，商品名为USER，目录号M5505S)。可在成像链中放置约1至20个、1至15个、1至10个或1至5个dU核苷酸。对于USER，dU可以以这样的方式放置：在去除U之后，残余物足够短(例如，短于或等于约9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸)，使得它们自发而迅速地解离。如果仅使用UDG(即，没有内切核酸酶VIII)，则去除dU单元可使链失去稳定到足以促进去除。去除dU后成像链与对接链之间的碱基对总数可少于或等于9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸。因此，在一些实施方案中，成像链或中间链可包含至少一个能够被USER切割的U。
残余物的序列以及温度将影响残余物应自发解离的时间有多短。例如，GC含量高的序列可能在较短长度时比另一较长的序列具有更高的结合亲和力。因此，在一些情况下，9聚体可能足以稳定结合，并且在其他情况下，9聚体可能足以解离。本领域普通技术人员可以评估在此处和在下文讨论的非天然核苷酸的切割中的序列、温度和亲和力。
限制性内切核酸酶和切口核酸内切酶。可以在对接链:成像链双链体中设计限制性位点。这允许使用相应的限制性内切核酸酶来切割此类限制性位点，这破坏靶与成像链的信号产生部分之间的连接。例如，Cas9(CRISPR相关蛋白9)是RNA引导的核酸内切酶，其可以通过在相应序列中工程化特异性识别位点而用于特异性切割对接链:成像链双链体。这导致两条链被切割，从而妨碍了对相应靶的重新询问。为了解决这个问题，可以使用仅切割一条链的切口核酸内切酶。例如，Cas9切口酶是Cas9酶，其被设计为仅包括一个活性切割位点，从而导致单链切割，同时保留Cas9的高特异性。可以以以下方式来设计限制性位点：仅切割成像链，并且携带信号产生部分的成像链的残余物足够短(例如，<7个核苷酸)以使其自发且快速地与对接链解离。具有位点特异性活性的内切核酸酶的其他示例包括但不限于：锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，以及脱氧核酶。
核糖核酸酶。可以制备成像链RNA核苷酸(也称为核糖核苷酸)中的一些或全部核苷酸，而不是DNA核苷酸(也称为脱氧核苷酸)。可用RNA酶去除此类RNA核苷酸。如果对接链由DNA核苷酸组成并且成像链含有RNA核苷酸，则DNA:RNA异源双链体中的这种RNA核苷酸可以用RNA酶H去除。
聚合酶。还可以通过使用具有链置换活性或5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶来去除成像链。例如，可以在由DNA制成的对接链的3'端处设计发夹结构。当引入具有链置换活性的DNA聚合酶(例如，Phi29、Bst、Vent)并提供合适的缓冲液和dNTP时，对接链的3'可以延伸，在此延伸期间成像链被置换(图6c)。也可以在成像链上设计自引发发夹(图6a至图6b)，该自引发发夹的信号产生部分可以直接附接到成像链(图6a)，或经由DNA杂交附接到成像链(图6b)。当引入具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如，DNA聚合酶I，Taq)并提供合适的缓冲液和dNTP，并且在对接链的3'端处设计自引发发夹时，3'端可以延长，在此延长期间成像链被降解(图6e)。如果在成像链的3'末端设计自引发发夹，则可以实现类似的效果(图6d)。注意，自引发发夹也可以用稳定的双链体代替(例如，图6f)。
切割非天然核苷酸。可以使用用作特定酶的底物的非天然核苷酸。例如，8-氧鸟嘌呤可由DNA糖基化酶OGG1切割。也可以将无碱基位点并入DNA链(诸如成像链)中，该无碱基位点可以被内切核酸酶切割。例如，1',2'-双脱氧核糖、dSpacer、脱嘌呤/脱嘧啶、四氢呋喃或无碱基呋喃可由内切核酸酶VIII切割。因此，在一些实施方案中，成像链或中间链可包含至少一个能够被核酸内切酶VIII切割的无碱基位点。在一些实施方案中，成像链或中间链可包含至少一个脱氧尿苷和至少一个能够被USER、UDG或内切核酸酶VIII切割的无碱基位点。也可以使用光可切割间隔子或RNA无碱基位点，诸如核糖间隔物(ribospacer)(rSpacer)或无碱基II修饰。可以采用其他对的非天然核苷酸及其配对酶。
因此，在一些实施方案中，组合物包含(1)标记，(2)第一核酸结构域、第二核酸结构域和第三核酸结构域，其中每个核酸结构域为约1至9个核苷酸(例如，约9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸)长，(3)连接第一核酸结构域与第二核酸结构域的第一连接部分，以及(4)连接第二核酸结构域与第三核酸结构域的第二连接部分，其中两个连接部分独立地选自(a)具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点，(b)可被核酸糖基化酶切割的接头，或(c)限制性位点或切口位点。在一些实施方案中，通过另外的连接部分来连接另外的核酸结构域。在一些实施方案中，至少一个连接部分是具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点(脱嘧啶)。在一些实施方案中，至少一个连接部分易于由内切核酸酶VIII切割。在一些实施方案中，核酸结构域包含DNA，并且在一些实施方案中，核酸结构域包含RNA。在一些方面，至少一个连接部分包含至少一个非天然核苷酸。在一些方面，至少一个连接部分包含8-氧鸟嘌呤。
在一些实施方案中，用于去除成像链的方法可以与扩增步骤组合。在一些实施方案中，用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体直接或间接地与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链为对接链或引物链，并且如果所述核酸为(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，其中标记成像链包含上面刚刚描述的组合物，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，(7)从对接链中去除结合的标记成像链，其中通过酶促切割、修饰或降解标记成像核酸来从对接链中去除标记成像链，以及(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或步骤(1)-(7)的任何子集。
在一些方面，通过对标记成像链进行酶促切割来去除标记成像核酸。
F.样品描述
1.样品类型
可以使用这些方法对各种类型的样品进行成像。在一些实施方案中，样品为固定样品。在一些实施方案中，样品是细胞、细胞裂解物、组织、组织裂解物，和/或整个生物体。在一些实施方案中，样品是细胞或组织样品、细胞或组织裂解物，或体液。在一些实施方案中，样品是组织，并且成像包括用于免疫染色的组织内多路复用。
样品可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
2.抗原修复
在一些实施方案中，用靶特异性结合配偶体对样品染色需要特定条件，并且并非所有靶特异性结合配偶体都在相同条件下与它们的抗原结合。这可能是因为它们的靶抗原在相同条件下不可用。因此，在一些实施方案中，用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)处理样品以暴露一种或多种先前不可用的靶，(2)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同核酸链连接，(3)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(4)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地如果所述核酸是(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(5)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(6)任选地去除未结合的标记成像链，(7)对样品进行成像以检测结合的标记成像链，(8)消除来自结合的标记成像链的信号，以及(9)任选地重复步骤(1)-(8)，每次(a)暴露一组不同的先前不可用靶，(b)使用一种或多种不同的靶特异性结合配偶体，以及(c)使用具有相对于至少一种其他标记成像链独特的核苷酸序列的标记成像链。
3.对靶及其在鉴定生物标志物方面的用途的说明
在一些实施方案中，该方法可用于鉴定生物标志物。在一些情况下，对样品进行成像并对这些样品进行数据分析。在一些实施方案中，使用针对各种靶的相应靶特异性结合配偶体来测试多种靶。在一些情况下，可以评定不同靶之间的关系；例如，用户可试图确定多种标志物与疾病状态的关系并得出以下结论：与不具有该生物标志物分布的健康组织相比，疾病样品具有升高的A水平、降低的B水平，以及在一定范围内的C水平。
在一些实施方案中，对至少10个、96个、100个、384个或500个样品进行成像并对折现样品进行数据分析。
在一些实施方案中，使用针对各种靶的相应靶特异性结合配偶体来测试至少5个、10个、15个、25个、30个、50个、75个或100个或更多个靶。
G.设备和软件
1.成像室，诸如流动池
在一些实施方案中，可以采用成像室。在一些情况下，成像室是没有入口且没有出口的固定室。在一些实施方案中，成像室具有单个入口/出口组合。在其他情况下，成像室允许流动并且被指定为流动池。流动池可以包括第一光学透明支撑件与第二光学透明材料(诸如玻璃或塑料盖玻片)的组合，以提供具有顶表面和底表面以及它们之间的流体流的流动池。如果使用第一和第二光学透明材料，则它们可以彼此平行放置。平行包括完全平行的几何布置，以及相对于平行偏离至多1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°或10°的几何布置。在一些实施方案中，第二光学透明材料紧邻第一光学透明材料，诸如约5微米至5mm，50微米至500微米，或500微米至5mm。
成像室还可包含第一光学透明支撑件和垫圈(也称为隔离件或间隔件)。垫圈可以在顶表面上开放到空气中，或者其可以是封闭的并且具有光学透明的顶表面。垫圈可以具有组合的入口/出口，或者其可以具有入口和出口两者。垫圈也可以没有出口。垫圈可以是塑料、橡胶、粘合剂。垫圈可包括CoverWell Chamber Gasket(Thermo Fisher)，其为用于直立和倒置显微镜(Bioscience Tools)的超薄密封室；或温育室(Grace Bio-Labs，包括HybriSlipTM杂交盖、HybriWellTM密封系统、CoverWellTM温育室、成像间隔件、SecureSealTM杂交室、FlexWellTM温育室、FastWellsTM试剂屏障，以及Silicone IsolatorsTM)。
在一些情况下，垫圈可与盖玻片一起使用，从而形成成像室或流动池的顶表面。
成像室，诸如但不限于流动池，可以是可重复使用的或一次性的。
因此，在一些实施方案中，用于测试安装到第一光学透明支撑件上的固定样品中一种或多种靶的存在的方法包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地如果所述核酸是(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物相缔合，(4)在成像室(诸如流动池)中，使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和/或数量，以及任选地移除成像室，(7)消除来自结合的标记成像链的信号，以及(8)重复步骤(4)-(6)或(4)-(7)，至少一次地使用任选地具有相对于至少一种其他标记成像链独特的核苷酸序列的标记成像链。
一种对安装到光学透明支撑件的固定样品进行成像的方法，包括(1)使样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，(3)其中所述核酸链为对接链或引物链，并且如果所述核酸为(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或(b)引物链，则将多于一个对接链与引物链相缔合，(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，(5)任选地去除未结合的标记成像链，(6)任选地去除液体以产生无液体样品，(7)将第二光学透明材料固定为在第一支撑件附近(即约5微米至5mm、50微米至500微米，或500微米至5mm)并与第一支撑件平行，以及(8)对样品进行成像以检测结合的标记成像链。
2.用于控制流体步骤的软件
在一些实施方案中，使用包括电子和/或气动和/或液压和/或电子-流体致动器和系统的流体系统来执行所有流体交换步骤。在某些情况下，通过软件来控制流体系统。在一些实施方案中，其中通过软件来自动控制流体系统，从而使步骤(1(使样品与靶特异性结合配偶体接触)和/或2(任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体)和/或3(增加对接链的数量，或扩增)和/或4(使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触)和/或5(任选地去除未结合的标记成像链)和/或7(任选地从对接链去除结合的标记成像链)与成像步骤(6)同步。
在一些实施方案中，通过软件来控制流体系统，从而使步骤(1和/或2和/或3和/或4和/或5，和/或7)与通过与成像软件通信进行的成像步骤(6)同步，其中参考先前段落中所述的步骤编号。
在一些实施方案中，在样品在成像装置上时执行所有流体步骤。在一些实施方案中，当样品在成像装置上时，参照先前两个段落所示的步骤编号来执行步骤4、5和7。
样品可以固定在一次性成像室(诸如流动池)或可重复使用的成像室(诸如流动池)中。
H.试剂盒
在一些实施方案中，组合物包含(1)一种或多种试剂，其包括但不限于与对接链连接的靶特异性结合配偶体，其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的对接链连接，标记成像链、缓冲液、扩增试剂和/或用于去除结合的成像链的试剂，(2)用于执行所有流体交换步骤的流体系统，用于控制流体系统和时间和/或使流体步骤与成像步骤同步的软件，(3)成像室(诸如流动池)，该成像室用于以至少一个光学透明的侧面固定到感兴趣的样品上以允许对该样品进行成像。在一些实施方案中，成像室(诸如流动池)是一次性的。
II.方法的组成部分
A.靶特异性结合配偶体
靶识别部分是指可用于检测靶分子的抗体和抗体样分子。抗体是指来自可以特异性识别靶分子的任何物种的任何免疫球蛋白。抗体样分子是指(A类)抗体的任何工程化的变体或片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、单个重链、双抗体等(抗体的抗原结合片段)；(B类)靶分子的任何已知的结合配偶体和这种结合配偶体的工程化变体；(C类)经由定向进化工程化的靶分子的任何结合配偶体(例如，肽和适体)；以及(D类)选择性地与靶(例如，感兴趣的酶的自杀底物)形成共价键的任何分子。
靶特异性结合配偶体可以在液体培养基或缓冲溶液中提供。
表3提供了靶和相应的靶识别部分的代表性列表。
表4提供了其他靶的列表。这些靶的抗体和其他已知的结合配偶体可用作靶识别部分。
B.对接链
在一些实施方案中，对接部分或对接链是核酸、蛋白质、肽，或化学化合物。已知许多蛋白质和蛋白质结构域与其他蛋白质、结构域或肽相互作用。一些最著名的结构域包括SH2、SH3和WD40域。在许多情况下，这些蛋白质和结构域的结合配偶体是已知的，并且可以被设计为具有所需的亲和力。例如，生物素和亲和素/链霉亲和素以足够的特异性相互作用。许多其他化学化合物，诸如地高辛、荧光素、他克莫司和雷帕霉素，也具有众所周知的结合配偶体。
在一些实施方案中，对接链包含核酸。在一些实施方案中，核酸是单链核酸，诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包含改变的磷酸酯骨架、改变的戊糖，和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，对接链共价地附接到成像链，并且在其他实施方案中非共价地附接到成像链。
在一些实施方案中，对接链包含单链核酸，并且可以为约5至20个核苷酸长、约8至15个核苷酸、或约10至12个核苷酸长。在一些实施方案中，对接链为约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个或20个核苷酸长。
对接链可以是独立元件，或者其可以是靶识别部分的一部分。例如，如果靶识别部分是抗体，则抗体的Fc结构域的一部分可以是对接链，并且可以使用结合Fc结构域的肽或蛋白质，诸如蛋白质A或蛋白质G。
对接链可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
C.成像链
在一些实施方案中，对接链可以是核酸链。在此类情况下，可观测部分或标记可以与成像部分缀合，该成像部分可以是与对接链互补的核酸链。换句话说，成像链特异性地结合对接链。在这种情况下，标记可以缀合至可为约5至20个核苷酸长、约8至15个、或约10至12个核苷酸长的成像部分。在一些实施方案中，成像部分为约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个或20个核苷酸长。
在一些实施方案中，成像链甚至更长，诸如20至80个核苷酸长，例如短于或等于80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个或30个核苷酸长。在采用成像链的发夹结构的实施方案中，成像链的长度可以比不使用发夹结构的长度长。
在一些实施方案中，成像部分与对接链之间的互补部分可以为约5至20个核苷酸长，约8至15个，或约10至12个核苷酸长。在一些实施方案中，成像部分与对接链之间的互补部分可为约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个或20个核苷酸长。
在一些实施方案中，核酸成像链包含单链核酸，诸如单链DNA、RNA，或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包含改变的磷酸酯骨架、改变的戊糖，和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，成像部分是蛋白质、肽或化学化合物，作为上文在上述章节II.B中讨论的对接链选项的配偶体。
在一些实施方案中，对接链可间接地与成像部分结合，诸如经由中间部分。例如，当对接链和成像部分是核酸时，可以使用包含核酸的中间部分，只要该中间部分具有与对接链互补的第一区域和与成像部分互补的第二区域即可。在该实施方案中，对接链不必与成像部分互补。中间部分可以仅用于桥接功能，或者其也可以用作扩增功能。
成像链可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
D.引物链
在一些情况下，靶特异性结合配偶体间接地(例如经由引物)连接到对接链。例如，当对接部分和成像部分包含核酸时，包含核酸的引物链可以用作对接链的结合位置(如果对接链具有与引物链互补的区域)，或者其可以用作引物以通过例如滚环扩增进行核酸合成。引物链也可用于在杂交链式反应扩增中启动一系列的结合事件。在引物用作用于扩增(诸如滚环扩增、杂交链式反应扩增)的位置的情况下，引物不一定与对接链互补。相反，其用作扩增的模板，并且通过扩增过程包括对接链。
在一些实施方案中，作为第一步骤将靶特异性结合配偶体和连接引物加入样品中，作为第二步骤加入对接链，以及作为第三步骤加入成像链。在另一实施方案中，不以分立步骤添加组分。可以在第一、第二和/或第三步骤之间添加洗涤步骤。
在一些实施方案中，引物链包含核酸。在一些实施方案中，核酸是单链核酸，诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包含改变的磷酸酯骨架、改变的戊糖，和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，引物链包含单链核酸，并且可以为约5至20个核苷酸长、约8至15个核苷酸、或约10至12个核苷酸长。在一些实施方案中，引物链为约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个核苷酸长。
引物链可以在液体培养基或缓冲溶液中提供。
E.中间链
在一些情况下，对接链通过中间部分(或中间链)与成像链结合。例如，当对接部分和成像部分包含核酸时，可以使用包含核酸的中间链，只要该中间链具有与对接链互补的第一区域和与成像链互补的第二区域即可。在此类实施方案中，对接链不必与成像部分互补。
在一些实施方案中，作为第一步骤将中间链加入到样品中，所述样品包含直接或间接地连接到对接链的靶特异性结合配偶体，以及作为第二步骤添加成像链。在另一个实施方案中，中间链和成像链不是以分立步骤添加的。在一些情况下，在单一步骤中加入之前，将中间链和成像链杂交在一起。
在一些实施方案中，中间链包含核酸。在一些实施方案中，核酸是单链核酸，诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包含改变的磷酸酯骨架、改变的戊糖，和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，中间链包含单链核酸，并且可以为约5至30个核苷酸长、约8至15个核苷酸、或约10至12个核苷酸长。在一些实施方案中，中间链为约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个、20个、25个或30个核苷酸长。
中间链可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
F.发夹形式的核酸
本文所述的任何线性核酸可任选地以发夹形式提供。这包括成像链、对接链、引物链和中间链。在发夹形式中，距发夹茎区末端至少1-5个核苷酸的区域可任选地仅包含G’和C’。该G/C区域被称为夹钳。G/C区域防止或减少发夹末端的磨损，以防止打开成线性DNA。
当用户希望使用具有链置换活性的聚合酶(例如，phi29)或具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶(例如，DNA聚合酶I)来破坏成像链与对接链之间的相互作用(直接或间接)时，可以在上下文中使用发夹。发夹也可用于限制单链核酸的不希望的结合。
G.标记
各种标记，也称为可观测部分，可与成像链结合。这些标记或可观测部分通过使得能够检测结合的成像链来帮助用户。当应用涉及检测结合的标记成像链时，该应用涉及检测由与成像链结合的标记或可观测部分产生的信号。
在一些实施方案中，可以采用任何可观测部分，并且在一些实施方案中，该部分是可光学观测的。该部分可以是信号吸收或信号发射的。在信号发射分子中，可以使用发荧光的分子，诸如有机小分子，包括但不限于荧光团，诸如但不限于荧光素、罗丹明、花青染料、Alexa染料、DyLight染料、Atto染料等等。
在一些实施方案中，可以采用有机聚合物，诸如p点。在一些实施方案中，可观测部分可以是生物分子，包括但不限于荧光蛋白或荧光核酸(包括荧光RNA，包括Spinach及其衍生物)。在一些实施方案中，可观测部分可以是包括Q点的无机部分。在一些实施方案中，可观测部分可以是通过散射(弹性或非弹性散射)操作的部分，为诸如纳米颗粒和表面增强拉曼光谱(SERS)报道分子(例如，4-巯基苯甲酸、2,7-巯基-4-甲基香豆素)。在一些实施方案中，可观测部分可以是化学发光/电化学发光的发光体，诸如钌络合物和萤光素酶。可观测部分可以产生光学信号、电磁信号(跨越整个电磁光谱)、原子/分子质量(例如可通过质谱法检测)、有形质量(例如，可通过原子力显微镜检测)，电流或电压。
实施例
实施例1：多种扩增模式
有多种扩增方法。该实施例展示了三种方法的使用，该三种方法包括使用HRP缀合物的酶促扩增(图7A至图7C)、滚环扩增(图7D至图7E)以及杂交链式反应(HCR)(图7F至图7G)。
对于基于HRP的扩增，将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)扁桃体组织切片在LabVision PT模块中使用R-Buffer A(Fisher Scientific)脱蜡和进行抗原恢复。将组织切片在3％BSA和0.2％Triton-X 100中封闭1.5小时。将组织切片用小鼠抗细胞角蛋白一抗在4℃下在湿度室中染色过夜。然后将组织切片用1x PBS洗涤，并在室温下用缀合至DNA对接链(D1)的山羊抗小鼠二抗染色2小时。将组织切片再次在1x PBS中洗涤，并进行DAPI染色。
使用荧光显微镜对DAPI和Cy5通道中的组织切片进行成像以用作空白。将成像链(I1-650)加入到制备的组织切片中，并使其在室温下杂交25分钟，该成像链包含红色荧光团，该红色荧光团附接至包含与对接链D1互补的结构域的DNA。洗涤切片以去除未结合的I1-650。然后，使用10x物镜在DAPI和Cy5通道中捕获荧光图像。参见图7B。
然后通过在室温下将10单位的USER酶施加到组织切片15分钟、用1x PBS洗涤、用30％甲酰胺温育组织样品5分钟、然后用1x PBS洗涤，来去除成像链I1-650。使用荧光显微镜来确认Cy5通道中荧光信号的完全去除。然后以10倍放大拍摄明视野图像作为空白。
为了放大用于明视野免疫组织化学检测的细胞角蛋白信号，将组织切片与成像链(I1-HRP)一起温育，所述成像链包含辣根过氧化物酶(HRP)酶，该HRP酶附接至包含与对接链D1互补的结构域的DNA。通过将组织切片浸没在1x PBS中来洗涤样品。然后，通过施加3,3'-二氨基联苯胺(DAB)发色团的溶液到样品中10分钟来进行生色信号放大。将样品在1xPBS中洗涤。最后，使用明视野照明对样品进行成像。图7C。
图7A至图7C示出了使用DNA交换以使得能够捕获同一样品的荧光和明视野(例如免疫组织化学)图像。虽然该实施例展示了使用HRP缀合的成像链进行生色信号放大，但是HRP缀合的成像链也可施加用于使用替代酶底物(例如酪胺)进行荧光信号放大。
在基于滚环扩增的单独扩增方法中，将培养的HeLa细胞用温热的3％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定，用0.1％硼氢化钠还原，用3％牛血清白蛋白和0.2％Triton-X 100封闭和透化，然后用抗波形蛋白的兔一抗染色过夜。
对于对照样品，将缀合至对接链(Gt-a-Rb-D1)的山羊抗兔抗体与细胞一起在室温下温育2小时，以作为二次染色步骤。洗涤对照样品后，将DAPI和100nM荧光标记的成像链加入样品中。收集对照孔的DAPI和Cy5通道中的荧光图像。图7D。
对经历滚环扩增的细胞样品进行以下程序。将缀合至对接链(Gt-a-Rb-D1)的山羊抗兔抗体用作连接的模板。在具有于1x连接缓冲液(NEB)中的125nM环状寡聚物(IDT DNA)、125nM Gt-a-Rb-D1、20U/μL T4连接酶(NEB)的PCR试管内制备连接溶液。将连接溶液在室温下温育两小时。连接后，将连接溶液在封闭缓冲液中1:5稀释，加入到细胞样品中，并使其在室温下温育2小时，然后在1x PBS中洗涤。
在单独的容器中，制备聚合酶溶液，该聚合酶溶液含有在1x聚合酶反应缓冲液(New England Biolabs)中的0.1mg/mL BSA、0.2mM dNTP和1U/μL phi29DNA聚合酶。将聚合酶溶液直接施加到制备用于RCA的细胞样品中。将样品与聚合酶溶液在30℃下温育1.5小时。用1x PBS洗涤细胞样品三次。加入DAPI以对细胞核进行染色。最后，在成像之前添加100nM荧光标记的成像链。在RCA之后收集DAPI和Cy5通道中的荧光图像。参见图7E。
在用于基于杂交链式反应进行扩增的单独方法中，将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)扁桃体组织切片在Lab Vision PT模块中使用R-Buffer A(Fisher Scientific)脱蜡和进行抗原恢复。将组织切片在3％BSA和0.2％Triton-X 100中封闭1.5小时。将组织切片用小鼠抗细胞角蛋白一抗在4℃下在湿度室中染色过夜。然后将组织切片用1x PBS洗涤，并在室温下用缀合至DNA对接链(D1)的山羊抗小鼠二抗染色2小时。将组织切片再次在1xPBS中洗涤，并进行DAPI染色。
使用荧光显微镜对DAPI和Cy5通道中的组织切片进行成像以用作空白。将成像链(I1-650)加入到制备的组织切片中并使其在室温下杂交25分钟，该成像链包含红色荧光团，所述红色荧光团附接至包含与对接链D1互补的结构域的DNA。洗涤切片以去除未结合的I1-650。然后，使用10x物镜在DAPI和Cy5通道中捕获荧光图像。参见图7F。
然后通过在室温下将10单位的USER酶施加到组织切片15分钟，用1x PBS洗涤，来去除成像链I1-650。使用荧光显微镜来确认Cy5通道中荧光信号的完全去除(数据未示出)。
去除成像链后，将包含I1序列的引物链在室温下与D1对接链(20nM)杂交30分钟。用1X PBS洗涤切片以洗涤未结合的引物链。并行地，在单独的微量离心管中将发夹链H1和H2-D2在5x SSX中稀释至1uM。将管加热并在90℃下保持5分钟，然后缓慢冷却至室温。然后汇集发夹并在含有0.1％Tween 20和10％硫酸葡聚糖的5X SSC中稀释至200nM。将该溶液加入组织切片并在室温下在温育室中温育过夜。然后用PBS 1x洗涤切片。最后，在成像之前添加100nM荧光标记的成像链I2。在HCR扩增之后收集DAPI和Cy5通道中的荧光图像。图7G，右。
实施例2：用预连接的环寡聚物进行扩增
在执行测定之前制备非线性DNA链。使用非线性DNA链提供的益处为其可以提高信号扩增的效率，特别是如果使用的信号扩增方法类似于滚环扩增(图8)。在该实施例中，经由连接步骤来制备环状DNA链。连接步骤中使用的DNA序列被称为环状寡聚物，其包括与成像链序列等效(即与对接链互补)的结构域。
将培养的HeLa细胞用温热的3％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定，用0.1％硼氢化钠还原，用3％牛血清白蛋白和0.2％Triton-X 100封闭和透化，然后用抗波形蛋白的兔一抗染色过夜。然后将缀合至对接链的山羊抗兔抗体(Gt-a-Rb-D1)用作二次染色，并使其在室温下温育2小时。
在具有于1x反应缓冲液(EpiCentre)中的0.5μM环状寡聚物(IDT DNA)、50μM ATP、2.5mM MnCl2、5U/μL CircLigase(目录号CL4111K，EpiCentre)的PCR管中制备连接溶液。将连接溶液置于热循环仪中1小时以在60℃温育。在连接后，在封闭缓冲液中制备连接溶液的1:4稀释液，将其加入到染色的细胞样品中，并温育25分钟以与抗体标记的靶复合物上的对接链杂交，然后在PBS中洗涤。
作为替代方法，可以进行连接步骤，然后用二抗缀合物对样品进行染色。在连接步骤后，将过量的连接溶液与抗体DNA缀合物杂交，使得连接的环状寡聚物的摩尔比比与抗体结合的对接链的摩尔比大至少两倍。在将连接的环状寡聚物与Gt-a-Rb-D1杂交后，将复合物加入到样品中并在室温下温育两小时作为二次染色步骤，然后在1x PBS中洗涤三次。
在单独的容器中，制备聚合酶溶液，该聚合酶溶液含有在1x聚合酶反应缓冲液(New England Biolabs)中的0.1mg/mL BSA、0.2mM dNTP和1U/μL phi29DNA聚合酶。将聚合酶溶液直接施加到固定细胞样品，所述固定细胞样品已经用一抗、二抗对接链缀合物染色并与连接的环状寡核苷酸杂交。将样品与聚合酶溶液在30℃下温育1.5小时。用1x PBS洗涤细胞样品三次。加入DAPI以对细胞核进行染色。最后，在成像之前添加100nM荧光标记的成像链。图8示出了预先形成的非线性DNA链的使用，所述预先形成的非线性DNA链可以与对接链杂交以作为滚环聚合的起始点。
实施例3：样品重新查询(0-A-0-A)
该实施例展示了使用交换成像重新查询样品中的靶的能力。其还表明，消除信号的酶促方法不会影响、改变或劣化样品的染色。
在该实施例中，将对接链(D1和D2)分别缀合至二抗山羊抗小鼠和山羊抗兔。将分别与D1和D2互补的成像链I1U和I2U用荧光染料(ATTO647N)进行标记。成像链I1U和I2U的序列包含几个尿嘧啶核碱基。酶或酶的混合物可切割碱基，从而导致对接成像双链体的去杂交，导致观察到的信号减少。
将培养的HeLa细胞用温热的3％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定，用0.1％硼氢化钠还原，用3％牛血清白蛋白和0.2％Triton-X 100在1X PBS中封闭和透化1.5小时。首先在4℃使用分别在小鼠和兔中培养的一抗抗微管蛋白与抗TOM20的混合物对细胞进行染色过夜。使用缀合至两种不同对接链的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(Gt-a-Ms-D1和Gt-a-Rb-D2)来在室温下进行二次染色2小时。加入DAPI以对细胞核进行染色。
将样品加载到具有荧光模块和Andor Zyla sCMOS相机的倒置Nikon Eclipse Ti显微镜(Nikon Instruments)上。显微镜配备有两个荧光滤光片组以对DAPI和荧光标记的成像链(Cy5通道)进行成像。
首先使用20x干物镜(Nikon,0.45NA)在DAPI和Cy5通道中对样品进行成像，以使用DAPI记录细胞并测量Cy5通道中的自发荧光信号(图9A)。向样品中加入100nM I1U溶液并温育15分钟。然后用1X PBS洗涤样品3次，并再次成像(图9B)。为了消除信号，将含有5个单位的USERTM、50mM乙酸钾、20mM tris-乙酸盐、10mM乙酸镁和100μg/ml BSA的溶液加入到样品中，并在室温下温育15分钟。然后用PBS 1x洗涤样品3次，并进行成像(图9C)。向样品中加入100nM I2U的溶液并温育15分钟。然后将样品用1X PBS洗涤3次，并进行成像(图9D)。如前消除信号，并再次对样品进行成像(图9E)。最后，向样品中加入100nM I1U溶液并温育15分钟。将样品用1X PBS洗涤3次，并进行成像(图9F)。
图9示出了在该实验期间在Cy5通道中获得的一系列图像。在图9A、图8C和图8E中，没有观察到信号。这些图像分别对应于：引入成像链之前、去除I1U之后，以及去除I2U之后。在加入成像链I1U后，观察到网状的微管(图8B，图8F)。图8D显示在添加I2U后存在线粒体。图9G表示图9A至图9F的图像中的平均信号强度。在图9C和图8E所示的两种情况下，信号降低超过98％。两轮交换后微管靶上的信号恢复超过95％，证明了在多次交换步骤后可靠地重新查询靶的能力。
图9A至图9F中的图像是通过手动将温育和洗涤溶液吸移进出成像室而获得的。交换成像工作流可以通过使用流动池和流体系统而自动化。
通过使用与显微镜的采集软件同步的流体系统，可以在各成像轮次之间自动执行成像链的杂交所需的流体步骤(注射、温育、洗涤)以及信号去除。
如上所述将HeLa细胞在流动池中培养、固定和染色，所述流动池可以适配在常规显微镜载物台上。首先使用20x干物镜(Nikon,0.45NA)在DAPI和Cy5通道中对样品进行成像，以使用DAPI记录细胞并测量Cy5通道中的自发荧光信号(图9，图像H)。将100nM I1U的溶液流入样品室并温育15分钟。然后将样品用1X PBS连续流动洗涤30秒，并再次成像(图9I)。接下来，将含有5个单位的USERTM、50mM乙酸钾、20mM tris-乙酸盐、10mM乙酸镁和100μg/mlBSA的溶液注入到流动池中，并温育15分钟。然后用PBS 1X洗涤样品30秒，并进行成像(图9J)。最后，将成像I1U的溶液再次注入流动池中，温育15分钟，用PBS洗涤30秒。对样品进行最后一次成像(图9K)。
实施例4：稳定结合的邻近检测
使用ThunderLink试剂盒(Innova Biosciences)将一对邻近探针(PL和PR)缀合至抗小鼠抗体。将培养的HeLa细胞用温热的3％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定，用0.1％硼氢化钠还原，用3％牛血清白蛋白和0.2％Triton-X 100封闭和透化，然后用抗α-微管蛋白的小鼠一抗染色。然后将固定的细胞用PL缀合的二抗和PR缀合的二抗的混合物染色，并洗涤以去除任何未结合的材料。样品中的大部分抗α-微管蛋白抗体应该接受至少一个分子的PL缀合的二抗和至少一个分子的PR缀合的抗体。为了检测邻近信号，将DAPI和100nM的成像链添加到样品中，并使用20倍的宽视野荧光显微镜、使用LED光源来对样品进行成像(图10A(上部小图))。
在阴性对照实验(图10，下部小图)中，将邻近探针中的一个缀合至脱靶抗兔二抗。将固定细胞用小鼠抗微管蛋白一抗、PL缀合的抗小鼠二抗和PR缀合的抗兔二抗进行染色。抗兔二抗不应与小鼠来源的一抗结合，因此邻近探针不应共定位，并且完整对接位点不能用于结合成像链。
如图10所示，仅当两个邻近探针与靶特异性结合时，微管结构才是明显的。对于标准荧光成像，荧光信号是稳定的。
实施例5：脱靶交叉反应性的对照实验
通过在暴露于非互补成像链序列之前和之后测量样品的信号强度来评估脱靶成像链与对接链之间的交叉反应性。
将培养的HeLa细胞固定，还原，封闭并透化，然后用抗α-微管蛋白的小鼠一抗染色。固定缓冲液由3％多聚甲醛和0.1％戊二醛组成。使用含有0.1％硼氢化钠的溶液来还原固定的细胞。使用含有3％牛血清白蛋白和0.2％Triton-X 100的溶液封闭和透化细胞1.5小时，然后进行一抗染色过夜。为了测试对接链A与成像链B和C的交叉反应性，将缀合至对接链A的抗小鼠抗体(a-Ms-Ad)加入到固定细胞样品中针对α-微管蛋白进行染色。在室温下在封闭缓冲液中进行a-Ms-Ad二次染色2小时，然后在1x PBS中洗涤三次。将DAPI染色剂加入所有孔中，并在具有20x物镜的Nikon荧光显微镜上在DAPI和Cy5通道中拍摄空白图像。
在记录空白图像后，制备成像链溶液。在该实施例中，成像链是部分双链的；成像链由通用结构域和非通用结构域组成，其中通用结构域与附接至荧光团的互补序列杂交，并且非通用结构域是单链的并且可用于与样品中的对接链相互作用。在该实施例中，通过基于DNA的桥来间接地在成像链中包含荧光团。在该实施例中，成像链中的非通用结构域与特定的对接链(例如对接链A、B、或C)互补。
将成像链A(Ai)、B(Bi)、或C(Ci)的100nM溶液加入分开的样品孔中并使其杂交10分钟。在成像链杂交后，用1x PBS洗涤样品三次。在具有20x物镜的Nikon荧光显微镜上对在DAPI和Cy5通道中的每个孔拍摄图像。选择与先前的空白图像相同的视野进行成像。
使用定制软件比较在添加成像链之前和之后每个样品的信号强度。使用DAPI通道对图像进行对齐，并制作掩模以从背景中分割单个细胞。计算Cy5通道的细胞区域内的平均荧光强度，并将其除以背景的平均强度以得到信噪比。将空白图像中获得的信噪比与添加成像链后获得的信噪比进行比较，以评估成像链Ai、Bi和Ci与对接链A之间的交叉反应性。
如图11所示，中靶成像链Ai清楚地显示用a-Ms-Ad染色的特定微管结构。图11还示出，Bi不与对接链A交叉反应，但是Ci与该对接链交叉反应。
实施例6：USER和subUSER
该实施例证明了使用酶促活性消除来自靶的信号的能力。在该实施例中，将对接链(D1)缀合至山羊抗小鼠二抗。用荧光染料(ATTO647N)对与D1互补的成像链I1U进行标记。成像链I1U含有几个尿嘧啶核碱基，该几个尿嘧啶核碱基可以由特定的酶促活性切割，从而使成像/对接链双链体失去稳定性，导致荧光信号的去除。
将培养的HeLa细胞用温热的3％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定，用0.1％硼氢化钠还原，用3％牛血清白蛋白和0.2％Triton-X 100在1x PBS中封闭和透化1.5小时。首先在4℃用在小鼠中培养的抗微管蛋白一抗对细胞进行染色过夜。使用缀合至D1的山羊抗小鼠二抗在室温下进行二次染色2小时。加入DAPI以对细胞核进行染色。
将样品加载到具有荧光模块和Andor Zyla sCMOS相机的倒置Nikon Eclipse Ti显微镜(Nikon Instruments)上。显微镜配备有两个荧光滤光片组以用于对DAPI和荧光标记的成像链进行成像(Cy5通道)。
将100nM I1U的溶液加入两个单独的样品中并温育15分钟。然后用1x PBS洗涤样品3次，并使用20x干物镜(Nikon，0.45NA)在DAPI和Cy5通道中进行成像(图12，图像A和C)。为了消除信号，将含有2个单位的USERTM、50mM乙酸钾、20mM tris-乙酸盐、10mM乙酸镁和100μg/ml BSA的溶液加入到一个样品中。向另一个样品中加入10单位尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)在20mM Tris-HCl、1mM DTT、1mM EDTA中的溶液。将两个样品在室温下温育15分钟。然后用PBS 1x洗涤样品3次，并进行成像(图12，针对USER的图像B和针对UDG的图像D)。
如图12所示，使用USER或UDG可几乎完全地消除信号。
实施例7：用USER切割成像链
如图14所示，信号可被消除的程度可取决于成像链架构和/或序列设计。在该实施例中，将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡，进行抗原恢复，封闭，并用缀合至对接链D1的抗CD3抗体染色。将与样品结合的D1对接链的数目通过RCA扩增，并用含有与D1互补的结构域并与荧光团连接的成像链进行标记。成像链含有几个尿嘧啶核碱基(图14A和图14C)或几个尿嘧啶核碱基和无碱基位点(图14B和图14D)。使用荧光显微镜收集图像以检测由标记的成像链结合的靶的存在(图14A至图14B)。
为了消除信号，加入含有USER的溶液，并将其与组织样品一起温育15分钟，然后进行洗涤步骤以去除切割的成像链。收集荧光图像以确认荧光信号的去除。如图14D所示，与图14C相比，除了成像链结构序列设计中的双脱氧尿苷之外无碱基位点的存在导致提高的去除效率。
实施例8：组合的多色和顺序检测
该实施例说明了使用交换成像以使用用不同光谱分离的荧光团功能化的成像链组检测多个靶的能力。
将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的扁桃体组织样品脱蜡，进行抗原恢复，封闭，并用DAPI以及分别缀合至对接链D1、D2、D3和D4的抗CD4、抗CD8、抗Ki67和抗细胞角蛋白抗体进行染色。通过RCA扩增经由抗体与样品结合的对接链(D1、D2、D3、D4)的数量。分别含有与D1、D2、D3和D4互补的结构域的成像链I1、I2、I3和I4还包含几个用于酶促去除的尿嘧啶碱基。将I1和I3用Atto565染料标记，而I2和I4用Atto647N标记。使用具有荧光模块和AndorZyla sCMOS相机的倒置Nikon Eclipse Ti显微镜(Nikon Instruments)对样品进行成像。显微镜配备有荧光滤光片组以用于对DAPI和荧光标记的成像链进行成像(TRITC和Cy5通道)。
在第一步骤中，通过在样品上温育I1和I2成像链的混合物25分钟，来使用这两种链对样品进行标记。洗去未结合的链，并在TRITC和Cy5通道中收集图像以检测分别用成像链I1和I2标记的靶CD4和CD8的存在(分别为图15B和图15C)。还收集DAPI图像以检测细胞核(图15A)。
然后使用含有USER的溶液消除信号，将含有USER的溶液与组织样品一起温育15分钟，然后进行洗涤步骤以去除切割的成像链。收集荧光图像以确认荧光信号的去除。
最后，使用成像链I3和I4的混合溶液再次标记样品，然后进行洗涤步骤以去除未结合的成像链。在TRITC和Cy5通道中获取荧光图像以检测Ki67和细胞角蛋白的存在(分别为图15E和图15F)。还收集DAPI图像(图15D)，并将其用于将四个靶的图像进行对齐和叠层。
实施例9：编号项目
以下编号项目提供了对本文的实施方案以及它们如何彼此相关的进一步描述。
项目1.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测试一种或多种靶存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(7)任选地从所述对接链中去除所述结合的标记成像链，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(6)，或其任何子集。
项目2.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测试一种或多种靶存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，其中(1)中的所述核酸链是引物链或对接链，并且如果所述核酸链是引物链，则其与对接链连接，
(4)任选地去除未结合的标记成像链，
(5)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链并确定是否需要扩增(步骤(7))，
(6)任选地从所述对接链中去除所述结合的标记成像链，
(7)任选地增加与每个靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集。
项目3.一种用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法，所述方法包括：
(1)使待测试一种或多种靶存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)使样品与具有与核酸链的互补性的非线性扩增链接触，其中所述核酸链是对接链或引物链，
(4)任选地去除未结合的非线性扩增链，
(5)用滚环扩增以一个或两个步骤来扩增所述对接链，以及使所述样品和与所述对接链或经扩增的链具有互补性的标记成像链接触，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(7)去除所述结合的标记成像链，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或所述步骤(1)-(8)的任何子集。
项目4.根据项目3所述的方法，其中聚合酶用于滚环扩增。
项目5.根据项目3-4中任一项所述的方法，其中在与所述样品接触之前，将所述非线性扩增链与连接到所述核酸链的所述靶特异性结合配偶体合并。
项目6.根据项目3-5中任一项所述的方法，其中将用滚环扩增来扩增所述对接链与使所述样品和与所述对接链或经扩增的链具有互补性的标记成像链接触分开进行。
项目7.根据项目3-6中任一项所述的方法，其中用滚环扩增扩增所述对接链在与使所述样品和与所述对接链具有互补性的标记成像链接触相同的步骤中发生，并且其中所述成像链任选地包含3'修饰以防止所述成像链的扩增。
项目8.根据项目3-5或7中任一项所述的方法，其中所述成像链是用于滚环扩增的环状成像链。
项目9.根据项目3-7中任一项所述的方法，其中所述成像链是在所述对接链和连接酶存在下环化的线性成像链。
项目10.根据项目3-9中任一项所述的方法，其中所述成像链或扩增链包含至少两个与所述对接链互补的区域。
项目11.根据项目3-10中任一项所述的方法，其中所述标记成像链为线性链。
项目12.根据项目3-11中任一项所述的方法，其中所述非线性扩增链为环状链。
项目13.根据项目3-12中任一项所述的方法，其中所述非线性扩增链在连接后变为环状的。
项目14.一种用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法，所述方法包括：
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体直接或间接地与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸是
(a)对接链，则任选地增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数目，或
(b)引物链，则任选地将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链，以及
(7)任选地消除(extinguishing)来自所述结合的标记成像链的信号；
(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或所述步骤(1)-(7)的任何子集。
项目15.根据项目14所述的方法，其中将所述样品安装到光学透明的支撑件上。
项目16.根据项目14-15中任一项所述的方法，其中在步骤(6)之后并且在任选地执行步骤(7)之后，所述方法还包括增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数目，以及重复步骤(4)、任选的(5)、(6)，以及任选的(7)。
项目17.根据项目14-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(3)中增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量或将多于一个对接链与所述引物链相缔合。
项目18.根据项目1-17中任一项所述的方法，其中使用酶实现与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链数量的增加，并且其中所述酶任选为聚合酶。
项目19.根据项目1-18中任一项所述的方法，其中通过使用酶来实现对未结合的标记成像链的酶促切割、修饰或降解，并且其中所述酶任选地为糖基化酶、限制性内切核酸酶、切口核酸内切酶、RNA酶，以及在非天然核苷酸处进行切割的酶。
项目20.一种用于测试安装到光学透明的支撑件上的样品中一个或多个靶的存在的方法，所述方法包括
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)任选地去除液体以产生无液体样品，
(7)与所述第一支撑件平行地固定第二光学透明材料，以及
(8)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链。
项目21.根据项目20所述的方法，其中所述第二光学透明材料是玻璃。
项目22.根据项目21所述的方法，其中所述第二光学透明材料是塑料。
项目23.根据项目20-22中任一项所述的方法，其中所述第二光学透明材料距所述第一支撑物5微米至5mm，50微米至500微米，或500微米至5mm。
项目24.根据项目20所述的方法，其中使用直立式显微镜进行所述成像。
项目25.一种用于测试安装到光学透明的支撑件上的固定样品中一个或多个靶的存在的方法，所述方法包括
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)任选地去除液体以产生无液体样品，
(7)与所述第一支撑件平行地固定第二光学透明材料，以及
(8)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链。
项目26.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测试一种或多种靶存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和数量，
(7)消除来自所述结合的标记成像链的信号，以及
(8)重复步骤(3)-(6)或(3)-(7)，其中标记成像链任选地具有相对于所有其他标记成像链独特的核苷酸序列。
项目27.一种组合物，所述组合物包含：
样品，所述样品与多于一种靶特异性结合配偶体结合，每种结合配偶体与核酸链结合；以及至少一种对接链，所述至少一种对接链直接或间接地与标记成像链稳定结合，其中所述核酸链是对接链或引物链，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合。
项目28.根据项目27所述的组合物，其中直接或间接地与标记成像链结合的所述对接链包含至少90％的结合30分钟。
项目29.根据项目27-28中任一项所述的组合物，其中所述
(a)对接链或
(b)对接链和任何中间链
为80个核苷酸或更少个核苷酸，70个、60个、50个、40个或30个核苷酸或更少个核苷酸。
项目30.根据项目27-29中任一项所述的组合物，其中所述成像链为60个核苷酸或更少个核苷酸。
项目31.一种组合物，其包含：
(a)采用半对接结构域的组合物，其中所述组合物包含(i)至少一种第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含连接到寡核苷酸的结合配偶体，所述寡核苷酸包含半对接结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；(ii)至少一种第二结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，所述寡核苷酸包含半对接结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；其中(a)(i)和(a)(ii)的所述稳定结构域彼此互补，并且其中(a)(i)和(a)(ii)的所述半对接结构域线性组合以形成完全对接结构域；和(iii)至少一种标记成像链或中间链，其包含5'结构域、3'结构域和所述位于5'结构域与所述3'结构域之间的接头结构域，其中所述5'结构域与(a)(i)的所述半结构域互补，并且所述3'结构域与(a)(ii)的所述半对接结构域互补，并且其中所述标记成像链或中间链稳定地与所述完全对接结构域结合，并且如果使用中间链，则还提供标记的成像链；或者
(b)采用半引物结构域的组合物，其中所述组合物包含(i)至少一种第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，该寡核苷酸包含半引物结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；(ii)至少一种第二结合配偶体-寡核苷酸缀合物，其包含与寡核苷酸连接的结合配偶体，该寡核苷酸包含半引物结构域、任选的稳定结构域和任选的间隔结构域；其中(b)(i)和(b)(ii)的稳定结构域彼此互补，并且其中(b)(i)和(b)(ii)的半引物结构域可以线性组合形成完整的引物结构域；(iii)至少一种能够稳定地与所述完整的引物结构域结合的对接链；以及(iv)至少一种能够稳定地与所述对接链结合的标记成像链，或能够稳定地与对接链结合的中间链和能够稳定地与所述中间链结合的标记成像链。
项目32.根据项目31所述的组合物，其中将至少一个成像链与完全对接结构域结合至少30分钟。
项目33.根据项目31所述的组合物，其中至少70％的与完全对接结构域结合的成像链保持结合至少30分钟。
项目34.根据项目31所述的组合物，其中至少90％的与完全对接结构域结合的成像链对非酶促缓冲液洗涤具有抗性。
项目35.一种用于测试安装到光学透明的支撑件上的固定样品中一个或多个靶的存在的方法，所述方法包括
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使所述样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，其中能够经由中间链(当使用时)进行间接结合，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(7)消除来自所述结合的标记成像链的信号，
(8)使所述样品与标记成像链接触，所述成像链具有与对接链或中间链(当使用时)不互补的核苷酸序列，
(9)任选地去除未结合的标记成像链，
(10)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链，以及
(11)任选地消除来自所述结合的标记成像链的信号。
项目36.一种用于测试安装到光学透明的支撑件上的固定样品中一个或多个靶的存在的方法，所述方法包括
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使所述样品与标记成像链接触，所述成像链具有与对接链或任何中间链(当使用时)不互补的核苷酸序列，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和/或数量，
(7)消除来自所述结合的标记成像链的信号。
(8)使所述样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，其中能够经由中间链(当使用时)进行间接结合，
(9)任选地去除未结合的标记成像链，
(10)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和/或数量，以及
(11)任选地消除来自所述结合的标记成像链的信号。
项目37.根据项目35或36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括重复步骤(4)-(11)。
项目38.根据项目35-37中任一项所述的方法，其中所述方法还包括重复用于检测另外的非互补成像链的结合的步骤。
项目39.根据项目35-38中任一项所述的方法，其中在所述重复步骤中使用的能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链任选地具有相对于至少一个其他能够直接或间接地与另一对接链结合的标记成像链独特的核苷酸序列。
项目40.一种组合物，所述组合物包含：
(1)标签，
(2)第一核酸结构域、第二核酸结构域和第三核酸结构域，其中每个核酸结构域的长度为1至9个核苷酸，
(3)第一连接部分，所述第一连接部分连接所述第一核酸结构域和所述第二核酸结构域，以及
(4)第二连接部分，所述第二连接部分连接所述第二核酸结构域和所述第三核酸结构域，
其中两个连接部分独立地选自(a)具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点，(b)可被核酸糖基化酶切割的接头，(c)非天然核苷酸，或(d)限制性位点或切口位点。
项目41.根据项目40所述的组合物，其中另外的核酸结构域通过另外的连接部分连接。
项目42.根据项目40-41中任一项所述的组合物，其中至少一个连接部分是具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点(脱嘧啶)。
项目43.根据项目40-42中任一项所述的组合物，其中至少一个连接部分易于由内切核酸酶VIII切割。
项目44.根据项目40-43中任一项所述的组合物，其中所述核酸结构域包含DNA。
项目45.根据项目40-44中任一项所述的组合物，其中所述核酸结构域包含RNA。
项目46.根据项目40-45中任一项所述的组合物，其中至少一个连接部分包含至少一种非天然核苷酸。
项目47.根据项目40-46中任一项所述的组合物，其中至少一个连接部分包含8-氧鸟嘌呤。
项目48.一种用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法，所述方法包括：
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体直接或间接地与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使所述样品与能够直接或间接与对接链结合的标记成像链接触，其中所述标记成像链包含根据项目34-41中任一项所述的组合物，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(7)从所述对接链中去除所述结合的标记成像链，其中通过对所述标记成像核酸进行酶促切割、修饰或降解，来从所述接链中去除所述标记的成像链，
(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或所述步骤(1)-(7)的任何子集。
项目49.根据项目48所述的方法，其中通过对所述标记成像链进行酶促切割来去除所述标记成像核酸。
项目50.一种用于测试样品中一种或多种靶的存在的方法，所述方法包括：
(1)处理所述样品以暴露一个或多个先前不可用的靶，
(2)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(3)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(4)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(5)使样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(6)任选地去除未结合的标记成像链，
(7)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(8)消除来自所述结合的标记成像链的信号，以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)，每次(a)暴露一组不同的先前不可用靶，(b)使用一种或多种不同的靶特异性结合配偶体，以及(c)使用具有相对于至少一种其他标记成像链独特的核苷酸序列的标记成像链。
项目51.一种用于测试安装到第一光学透明的支撑件上的固定样品中一个或多个靶的存在的方法，所述方法包括
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且任选地，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)在成像室(诸如流动池)中，使所述样品与能够直接或间接地与对接链结合的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对样品进行成像以检测结合的标记成像链的存在、位置和/或数量，
(7)消除来自所述结合的标记成像链的信号，以及
(8)至少一次地用标记成像链重复步骤(4)-(6)或(4)-(7)，所述标记成像链任选地具有相对于至少一种其他标记成像链独特的核苷酸序列。
项目52.根据项目51所述的方法，其中在成像步骤之后并且在重复步骤(4)-(6)或(4)-(7)之前移除所述成像室。
项目53.根据项目51-52中任一项所述的方法，其中成像室不允许流体流动，并且在成像步骤之后并且在重复步骤(4)-(6)或(4)-(7)之前移除所述成像室。
项目54.根据项目51-53中任一项所述的方法，其中所述流动池由第二光学透明材料形成。
项目55.根据项目54所述的方法，其中所述第二光学透明材料包括玻璃。
项目56.根据项目54所述的方法，其中所述第二光学透明材料包括塑料。
项目57.根据项目51-52中任一项所述的方法，其中所述成像室(诸如流动池)包括具有至少一个流体入口和/或出口端口的垫圈。
项目58.根据项目54-56中任一项所述的方法，其中所述流动池包括平行于所述第一光学透明支撑件的第二光学透明材料。
项目59.根据项目1-26、35-39或48-58中任一项所述的方法，其中使用包括电子和/或气动和/或液压和/或电子-流体致动器和系统的流体系统来执行所有流体交换步骤。
项目60.根据项目59所述的方法，其中所述流体系统由软件控制。
项目61.根据项目59所述的方法，其中通过软件来自动控制所述流体系统，从而使各步骤(1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或7)与所述成像步骤(6)同步，其中参考项目1中提供的编号。
项目62.根据项目59所述的方法，其中通过软件来控制所述流体系统，从而使各步骤(1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或7)与通过与所述成像软件通信进行的成像步骤(6)同步，其中参考项目1中提供的编号。
项目63.根据项目59-62中任一项所述的方法，其中在样品在所述成像装置上时执行所有流体步骤。
项目64.根据项目59-63中任一项所述的方法，其中参考项目1中提供的编号，在所述样品在所述成像装置上时执行步骤4、5和7。
项目65.根据项目59-64中任一项所述的方法，其中将所述样品固定在一次性成像室(诸如流动池)中。
项目66.根据项目59-65中任一项所述的方法，其中将所述样品固定在可重复使用的成像室(诸如流动池)中。
项目67.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(1)一种或多种试剂，包括但不限于与核酸链连接的靶特异性结合配偶体，其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接；标记成像链；缓冲液；扩增试剂；和/或用于去除结合的成像链的试剂，其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸链是对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或如果所述核酸是引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(2)用于执行所有流体交换步骤的流体系统，
用于控制所述流体系统和时间和/或使所述流体步骤与所述成像步骤同步的软件，
(3)将流动池以至少一个光学透明侧固定在感兴趣的样品上，以允许对所述样品进行成像。
项目68.根据项目67所述的试剂盒，其中所述流动池是一次性流动池。
项目69.根据项目1-26、35-39或48-66中任一项所述的方法，其中对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链检测了结合的标记成像链的存在。
项目70.根据项目1-26、35-39或48-66中任一项所述的方法，其中对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链检测了结合的标记成像链的存在、位置和/或数量。
项目71.根据项目70中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述样品进行成像以检测和/或测量背景信号，并从所述样品的所述图像中扣除所述背景信号以检测结合的标记成像链。
项目72.根据项目71所述的方法，其中所述背景信号包括自发荧光。
项目73.根据项目71-72中任一项所述的方法，其中所述背景包括与不完全消除来自所述结合的标记成像链的信号相关的残余荧光。
项目74.根据项目71-73中任一项所述的方法，其中在所述样品的所述成像之前测量所述背景信号以检测结合的标记成像链。
项目75.根据项目71-74中任一项所述的方法，其中在所述样品的所述成像之后测量所述背景信号以检测结合的标记成像链。
项目76.根据项目1-26、35-39或48-75中任一项所述的方法，其中所述样品是固定样品。
项目77.根据项目1-26、35-39或48-76中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞、细胞裂解物、组织、组织裂解物、体液，和/或整个生物体。
项目78.根据项目1-26、35-39或48-77中任一项所述的方法，其中所述方法可用于鉴定生物标志物。
项目79.根据项目78所述的方法，其中对至少96个样品进行成像并对这些样品进行数据分析。
项目80.根据项目78-79中任一项所述的方法，其中使用针对每种靶的相应靶特异性结合配偶体来测试至少15个靶。
项目81.根据项目1-26、35-39或48-80中任一项所述的方法，其中使用光学显微镜，包括宽场、共焦(线和点扫描，转盘)、全内反射(TIR)的荧光显微镜，受激发射损耗(STED)、光片照明、结构照明(SIM)和扩展显微镜来进行所述成像。
项目82.根据项目1-26、35-39或48-81中任一项所述的方法，其中直接或间接地与标记成像链结合的所述对接链包含至少90％的结合30分钟。
项目83.根据项目1-26、35-39或48-82中任一项所述的方法，其中所述靶特异性结合配偶体直接地连接到对接链。
项目84.根据项目1-26、35-39或48-83中任一项所述的方法，其中所述靶特异性结合配偶体通过引物链间接地连接到对接链。
项目85.根据项目1-26、35-39或48-84中任一项所述的方法，其中所述对接链直接地与所述成像链结合。
项目86.根据项1-26、35-39或48-85中任一项所述的方法，其中所述对接链与所述成像链具有互补性。
项目87.根据项目1-26、35-39或48-86中任一项所述的方法，其中对接链通过中间链间接地与所述成像链结合。
项目88.根据项目1-26、35-39或48-87中任一项所述的方法或根据项目67-68所述的试剂盒，其中所述成像链和/或所述中间链包含至少一个能够被USER切割的U。
项目89.根据项目1-26、35-39或48-88中任一项所述的方法或根据项目66-67和88所述的试剂盒，其中所述成像链和/或中间链包含至少一个无碱基位点。
项目90.根据项目1-25、34-38或47-89中任一项所述的方法或根据项目66-67和89所述的试剂盒，其中所述成像链和/或所述中间链包含发夹。
项目91.根据项目1-25、34-38或47-90中任一项所述的方法或根据项目目66-67或88-90所述的试剂盒，其中所述成像链和/或所述中间链包含具有夹钳的发夹。
项目92.根据项目1-25、34-38或47-91中任一项所述的方法，其中在同一成像步骤中使用至少两个标记对至少两个靶进行成像。
项目93.根据项目1-25、34-38或47-92中任一项所述的方法，其中在不同的成像步骤中使用相同标记对至少两个靶进行成像。
项目94.根据项目1-25、34-38或47-93中任一项所述的方法，其中使用至少两个标签对至少两个靶成像，消除所述信号，然后使用相同标签中的至少一个标签对至少一个或多个靶成像，其中所述成像步骤可以以任何顺序执行。
项目95.根据项目1-25、34-38或47-93中任一项所述的方法，其中消除来自所述结合的标记成像链的所述信号包括从所述靶特异性结合配偶体去除所述核酸链。
项目96.根据项目95所述的方法，其中去除所述核酸链包括对与所述靶特异性结合配偶体连接的所述核酸链进行酶促切割、修饰或降解。
项目97.根据项目97所述的方法，其中所述核酸链是对接链。
项目98.根据项目97所述的方法，其中所述核酸链是引物链。
项目99.根据项1-25、34-38或47-94中任一项所述的方法，其中如果与所述靶特异性结合配偶体连接的所述核酸链是引物链，则消除来自所述结合的标记成像链的所述信号包括去除来自所述引物链的所述对接链。
项目100.根据项目99所述的方法，其中移除所述对接链包括对所述对接链进行酶促切割、修饰或降解。
项目101.根据项目1-25、34-38或47-94中任一项所述的方法，其中消除来自所述结合的标记成像链的所述信号包括去除所述成像链。
项目102.根据项目1-25、34-38或47-94中任一项所述的方法，其中去除所述成像链包括对所述成像链进行酶促切割、修饰或降解。
项目103.根据项目1-25、34-38或47-94中任一项所述的方法，其中消除来自所述结合的标记成像链的所述信号包括从所述成像链中去除所述标记。
等同物
前述书面说明书足以使本领域技术人员能够实践这些实施方案。前面的描述和实施例详述了某些实施方案并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，实施方案可以以多种方式实践，并且应该根据所附权利要求及其任何等同物来解释。
如本文所用，术语“约”是指数值，包括例如整数、分数和百分比，而无论是否明确指出。术语“约”通常是指本领域普通技术人员认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的一系列数值(例如，所述范围的+/-5-10％)。当诸如至少和约的术语在数值或范围列表之前时，所述术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可包括舍入成最接近有效数字的数值。
Claims (30)
1.一种测试样品中一种或多种靶的存在的方法，所述方法包括：
(1)使待测试一种或多种靶存在的样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与具有与核酸链的互补性的非线性扩增链接触，其中所述核酸链是对接链或引物链，
(4)任选地去除未结合的非线性扩增链，
(5)用滚环扩增以一个或两个步骤来扩增所述对接链，以及使所述样品和与所述对接链或经扩增的链具有互补性的标记成像链接触，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记成像链，
(7)去除所述结合的标记成像链，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集。
2.如权利要求1所述的方法，其中聚合酶用于滚环扩增。
3.如权利要求1所述的方法，其中在与所述样品接触之前，将所述非线性扩增链与连接到核酸链的所述靶特异性结合配偶体合并。
4.如权利要求1所述的方法，其中将用滚环扩增来扩增所述对接链与使所述样品和与所述对接链或经扩增的链具有互补性的标记成像链接触分开进行。
5.如权利要求1所述的方法，其中用滚环扩增扩增所述对接链在与使所述样品和与所述对接链具有互补性的标记成像链接触相同的步骤中发生，并且其中所述成像链任选地包含3'修饰以防止所述成像链的扩增。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述成像链是用于滚环扩增的环状成像链。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述成像链或扩增链包含与所述对接链互补的至少两个区域。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述标记成像链为线性链。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述非线性扩增链为环状链。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述非线性扩增链在连接后变为环状。
11.一种测试样品中一种或多种靶的存在的方法，所述方法包括：
(1)使所述样品与一种或多种靶特异性结合配偶体接触，其中每种靶特异性结合配偶体直接或间接地与核酸链连接，并且其中具有不同特异性的靶特异性结合配偶体与不同的核酸链连接，
(2)任选地去除未结合的靶特异性结合配偶体，
(3)其中所述核酸链是对接链或引物链，并且如果所述核酸是
(a)对接链，则任选地增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数目，或
(b)引物链，则任选地将多于一个对接链与所述引物链相缔合，
(4)使所述样品与能够直接或间接地结合对接链的标记成像链接触，
(5)任选地去除未结合的标记成像链，
(6)对所述样品进行成像以检测结合的标记成像链，以及
(7)任选地消除来自所述结合的标记成像链的信号；
(8)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集。
12.如权利要求11所述的方法，其中在步骤(6)之后并且在任选地执行步骤(7)之后，所述方法还包括增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数目，以及重复步骤(4)、任选的(5)、(6)以及任选的(7)。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述方法包括在步骤(3)中增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量或将多于一个对接链与所述引物链相缔合。
14.如权利要求11所述的方法，其中使用酶实现与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链数量的增加，并且其中所述酶任选为聚合酶。
15.如权利要求11所述的方法，其中通过使用酶来实现对未结合的标记成像链的酶促切割、修饰或降解，并且其中所述酶任选地为糖基化酶、限制性内切核酸酶、切口核酸内切酶、RNA酶，以及在非天然核苷酸处进行切割的酶。
16.一种组合物，其包含：
样品，所述样品与多于一种靶特异性结合配偶体结合，每种结合配偶体与核酸链结合；以及至少一种对接链，所述至少一种对接链直接或间接地与标记成像链稳定结合，其中所述核酸链是对接链或引物链，如果所述核酸是
(a)对接链，则增加与每种靶特异性结合配偶体相缔合的对接链的数量，或
(b)引物链，则将多于一个对接链与所述引物链相缔合。
17.如权利要求16所述的组合物，其中直接或间接地与标记成像链结合的所述对接链包含至少90％的结合30分钟。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述
(a)对接链或
(b)对接链和任何中间链
为80个核苷酸或更少，70个、60个、50个、40个或30个核苷酸或更少。
19.如权利要求16所述的组合物，其中所述成像链为60个核苷酸或更少。
20.一种组合物，所述组合物包含：
(1)标签，
(2)第一核酸结构域、第二核酸结构域和第三核酸结构域，其中每个核酸结构域的长度为1至9个核苷酸，
(3)第一连接部分，所述第一连接部分连接所述第一核酸结构域和所述第二核酸结构域，以及
(4)第二连接部分，所述第二连接部分连接所述第二核酸结构域和所述第三核酸结构域，
其中两个连接部分独立地选自(a)具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点，(b)可被核酸糖基化酶切割的接头，(c)非天然核苷酸，或(d)限制性位点或切口位点。
21.如权利要求20所述的组合物，其中另外的核酸结构域通过另外的连接部分连接。
22.如权利要求20所述的组合物，其中至少一个连接部分是具有完整磷酸二酯骨架的无碱基位点(脱嘧啶)。
23.如权利要求20所述的组合物，其中至少一个连接部分易于由内切核酸酶VIII切割。
24.如权利要求20所述的组合物，其中所述核酸结构域包含DNA。
25.如权利要求20所述的组合物，其中所述核酸结构域包含RNA。
26.如权利要求20所述的组合物，其中至少一个连接部分包含至少一种非天然核苷酸。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述成像链和/或所述中间链包含至少一个能够被USER切割的U。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述成像链和/或中间链包含至少一个无碱基位点。
29.如权利要求1所述的方法，其中在同一成像步骤中使用至少两个标记对至少两个靶进行成像。
30.如权利要求1所述的方法，其中使用至少两个标签对至少两个靶成像，消除所述信号，然后使用相同标签中的至少一个对至少一个或多个靶成像，其中所述成像步骤可以以任何顺序执行。
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