CN115135680A - 用于信号放大的质谱细胞术试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于改善成像质谱细胞术中的信号的试剂和方法。各方面包括具有大量标记原子的质量标签、对质量标签的化学修饰和额外的试剂以减少背景和/或保持质量标记的特异性结合配偶体(SBP)的目标结合，以及用于将多个质量标签与单个SBP缔合的方案。因此，实施方案包括一种或多种试剂的任何组合及其用途。本文的试剂、试剂盒和方法可用于质谱细胞术，包括成像质谱细胞术。在一些方面，试剂、试剂盒或方法可用于将大量放射性同位素递送至目标分析物，例如用于治疗用途或放射性检测。在某些方面，仅非放射性同位素可用于质谱细胞术。
Description
背景技术
质谱细胞术(包括成像质谱细胞术(IMC))通过质谱检测质量标签实现了目标分析物的高度多重检测。质量标签通常通过诸如抗体的特异性结合配偶体(SBP)与目标分析物缔合。质量标签可以具有标记原子(例如单一同位素，诸如富集同位素)的一个或多个拷贝，所述标记原子不同于其他质量标签的质量标记原子。标记原子可以是非细胞内源的金属同位素。
由于各种考虑，诸如空间电荷效应和标记原子与内源原子的分离，大部分标记原子可能在质量检测的上游丢失。因此，可能需要将多个质量标签与SBP缔合。然而，聚合物和/或纳米粒子质量标签呈现出许多影响背景和SBP结合的独特挑战，而这些挑战对于其他标签(诸如基于荧光的标签)来说是不需要考虑的。
附图说明
图1通过比较对目标分析物表达呈阳性和阴性的细胞之间的信号显示背景上的信号。
图2显示在IMC图像中表示为边缘效应的非特异性结合。
具体实施方式
本文描述了用于改善成像质谱细胞术中的信号的试剂和方法。各方面包括具有大量标记原子的质量标签、对质量标签的化学修饰和额外的试剂以减少背景和/或保持质量标记的特异性结合配偶体(SBP)的目标结合，以及用于将多个质量标签与单个SBP缔合的方案。因此，实施方案包括一种或多种试剂的任何组合及其用途。
本文的试剂、试剂盒和方法可用于质谱细胞术，包括成像质谱细胞术。在一些方面，试剂、试剂盒或方法可用于将大量放射性同位素递送至目标分析物，例如用于治疗用途或放射性检测。在某些方面，仅非放射性同位素可用于质谱细胞术。
质谱细胞术
如本文所用，质谱细胞术是检测生物样品中的质量标签的任何方法，诸如以单细胞分辨率同时检测多个可区分的质量标签。质谱细胞术包括悬浮质谱细胞术和成像质谱细胞术(IMC)。质谱细胞术可以通过激光辐射、离子束辐射、电子束辐射和/或电感耦合等离子体(ICP)中的一种或多种来对细胞样品的质量标签进行原子化和离子化。质谱细胞术可以同时检测来自单个细胞的不同质量标签，诸如通过飞行时间(TOF)或磁扇形质谱(MS)。质谱细胞术的实例包括悬浮质谱细胞术(其中细胞流入ICP-MS中)以及成像质谱细胞术(其中例如通过激光消融(LA-ICP-MS)或通过一次离子束(例如对于SIMS)对细胞样品(例如组织切片)进行采样)。
在元素分析之前，可以对质量标签进行采样、原子化和离子化。例如，生物样品中的质量标签可以通过诸如激光束、离子束或电子束的辐射进行采样、原子化和/或离子化。替代地或另外，质量标签可以被等离子体(诸如电感耦合等离子体(ICP))原子化和离子化。在悬浮质谱细胞术中，包括质量标签的全细胞可以流入ICP-MS，诸如ICP-TOF-MS中。在成像质谱细胞术中，一种形式的辐射可以去除(并且任选地离子化和原子化)固体生物样品的部分(例如，像素、感兴趣区域)，诸如包括质量标签的组织样品。IMC的实例包括质量标记的样品的LA-ICP-MS和SIMS-MS。在某些方面，离子光学器件可以耗尽除质量标签的同位素以外的离子。例如，离子光学器件可以去除较轻的离子(例如，C、N、O)、有机分子离子。在ICP应用中，离子光学器件可诸如通过高通四极过滤器去除诸如Ar和/或Xe的气体。在某些方面，IMC可以提供具有细胞或亚细胞分辨率的质量标签(例如，与质量标签缔合的目标)的图像。
类似于荧光免疫组织化学方法，质谱细胞术(包括成像质谱细胞术)工作流程可以包括在用抗体和/或其他特异性结合配偶体染色之前进行细胞(例如，组织)固定和/或透化。与荧光方法相反，在质谱细胞术中，质量标签(例如，包含非细胞内源的重金属)通过诸如抗体的特异性结合配偶体与目标分析物缔合。像荧光显微术一样，成像质谱细胞术可以包括抗原回收步骤，其中将样品暴露于诸如热的条件下，以暴露目标分析物以用于通过SBP结合。未结合的SBP通常在质谱检测质量标签之前被洗掉。值得注意的是，诸如元素分析(例如，发射光谱或X射线散射光谱)的其他检测方法也在本申请的范围内。
用于质谱细胞术的额外试剂包括含金属的生物传感器(例如，在诸如缺氧、蛋白质合成、细胞周期和/或细胞死亡的条件下沉积或结合的生物传感器)和/或基于化学性质结合于结构(例如，DNA、细胞膜、层)的含金属的组织化学化合物。此外，质量标签(例如，本申请的质量标签或其他质量标签)可以被组合以提供独特的条形码，以便在与其他样品或实验条件汇集之前标记特定的样品或实验条件。
在IMC中，组织样品可以是例如厚度在1-10μm范围内的切片，诸如可以使用2-6μm。在一些情况下，可以使用厚度小于500nm、200nm、100nm或50nm的超薄切片，例如从树脂包埋的组织块上切下的样品。制备这种切片的技术在IHC领域是众所周知的，例如使用切片机，包括脱水步骤、固定、包埋、透化、切片等。因此，可以用化学方法固定组织，然后可在所需的平面上制备切片。冷冻切片或激光捕获显微解剖也可用于制备组织样品。样品可以被透化，例如允许用于标记细胞内目标的试剂。即使在抗原修复(例如，通过加热)之后，SBP对分析物的接近也可能受到空间阻碍。因此，较小的SBP和某些质量标签可以最好地允许SBP接近其目标分析物。
为了检测RNA，可以使用本文描述的方法和装置制备本文讨论的生物样品中的细胞以用于分析RNA和蛋白质含量。在某些方面，细胞在杂交步骤之前被固定和透化。细胞可以固定和/或透化形式提供。细胞可通过交联固定剂固定，诸如如甲醛、戊二醛。替代地或另外，细胞可使用沉淀固定剂固定，诸如乙醇、甲醇或丙酮。细胞可通过去污剂透化，诸如聚乙二醇(例如，Triton X-100)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20)、皂甙(一组两性糖苷)或化学品，诸如甲醇或丙酮。在某些情况下，可以用相同的试剂或试剂组进行固定和透化。Jamur等人在"Permeabilization of Cell Membranes"(Methods Mol.Biol.,2010)中讨论了固定和透化技术。
信号放大
如本文在质谱细胞术的上下文中所使用，信号放大是(例如，富集同位素的)超过30个、超过50个、超过100个、超过200个或超过500个标记原子与目标分析物(即，由特异性结合配偶体结合的目标分析物的单个实例)的缔合。在某些方面，标记原子可以是重金属，诸如镧系元素或过渡金属。在某些方面，可以对超过2个、5个、10个或20个目标分析物进行信号放大。在某些方面，信号放大可以包括使用质量标签与SBP、高灵敏聚合物、大质量标签粒子、质量标签纳米粒子和/或杂交方案的分支缀合。在某些方面，信号放大使用质量标签聚合物。
如本文所述，信号放大可以通过使用包含大量标记原子的质量标签和/或通过将大量质量标签与单一目标分析物缔合(诸如通过基于杂交的信号放大和/或质量标签通过分支杂官能接头与SBP缀合)。在某些方面，单个质量标签可以具有超过30个、50个、100个、200个、500个或1000个标记原子。在某些方面，质量标签的流体动力学直径可能较低，诸如小于20nm、小于15nm、小于10nm、小于5nm、小于3nm或小于2nm。流体动力学直径可以小于1000nm3、小于500nm3、小于100nm3、小于50nm3、小于20nm3或小于10nm3。诸如EM的技术可用于鉴定尺寸，并且光散射可用于鉴定质量标签(诸如本文所述的较大质量标签)的流体动力学直径。此外，包括尺寸排阻和离子交换(例如，阴离子交换)色谱的色谱方法可用于表征质量标签，例如本文所述的较小质量标签。
信号放大的最初尝试导致了SBP与目标分析物的非特异性结合(例如，高背景)和破坏的结合。质量标签可能引起非特异性结合，这可能是由于聚合物的低溶解度、聚合物与生物分子或载玻片表面的非特异性结合和/或与质量标签结合的SBP的空间位阻。对于较大质量标签(例如，具有大量标记原子)和/或对于具有非镧系元素标记原子的质量标签，这个问题可能更明显。本文描述的试剂和方法对于非镧系元素质量标签可能是有价值的，这可能需要新的聚合物(例如，具有用于镧系元素的不同螯合剂的聚合物)，其可能影响溶解度和/或导致非特异性结合。本文报道了在保持SBP与目标分析物结合和/或低非特异性结合的同时放大信号的信号放大技术。在某些方面，信号放大可以包括保持低背景。例如，少于20％、少于10％、少于5％或少于1％的信号可能来自背景(例如，不表达目标分析物的细胞和/或细胞区域)和/或来自诸如非特异性点和/或边缘效应的特征(例如，如图2所示)。在某些方面，高信号与背景之间的差异可以大于100个计数或大于1000个计数。在某些方面，超过10％、超过20％、超过50％或超过80％的目标分析物可以被信号放大方法中使用的SBP结合。
用于负载镧系元素和一些非镧系元素金属的螯合剂可以包括DOTA、DTPA、EDTA、PEPA和/或其衍生物。替代地，质量标签聚合物可以包括优先螯合某些非镧系元素的螯合剂，诸如DFO和/或石竹碱(sarcophagine)。
发明人已经发现，基于质量标签聚合物的设计、SBP的选择及其组合，信号放大和背景是可变的，使得某些SBP与不同质量标签更好地配对。此外，本文描述的用于提供信号放大和减少背景的一般策略可以被组合以改善信噪比。
例如，图1显示了通过主题方法和试剂改善的背景上的信号，包括对于通常具有低信号和/或高背景的非镧系元素质量标签(顶行)，其显示基于质量标记的抗体的浓度和质量标签的类型，每个细胞的平均信号在20个计数与2000个计数之间，而背景(来自对目标分析物呈阴性的细胞的信号)保持接近0个计数。虽然显示的数据来自悬浮质谱细胞术，但是可以进行成像质谱细胞术数据的类似分析。
在另一实例中，图2显示了通过主题方法和试剂(右图)减少的非特异性质量标签聚合物结合的边缘效应(左图)。
使用杂官能接头将分支质量标签与SBP缀合
质量标签聚合物的发展，特别是高灵敏度聚合物的发展，得益于在保留抗体官能性和产生高灵敏度的标记程度之间的小心平衡。例如，这可以通过将低分子量金属螯合聚合物连接至生物分子，诸如SBP(例如抗体)的多个连接位点，或将较大的金属螯合聚合物连接至感兴趣的生物分子上的较少连接位点来实现。在某些方面，多个质量标签(例如，质量标签聚合物)通过分支缀合，诸如通过本文所述的分支杂官能接头，连接至SBP的相同连接位点。
在某些方面，通过抗体的氨基用低分子量质量标签聚合物过度标记抗体会损害缀合物的活性。抗体的过度修饰会损坏其特异性。然而，发明人发现，连接少量高分子量聚合物链也会引起灵敏度降低；太大的抗体-聚合物缀合物可能导致其与组织中的表位之间的空间位阻。分支杂官能接头可以允许将大量质量标签聚合物连接至抗体，而不会由于过度修饰而损坏抗体并且没有明显的空间位阻。接头可以在一端含有单反应基团以连接至感兴趣的生物分子，并且在另一端含有多个反应部分以连接至聚合物。连接分子可以含有溶解度增强基团(诸如基于聚乙二醇或聚(酰胺基胺)的树枝状聚合物或分支PEG)作为具有反应性端基的核心结构以用于生物分子与负载金属的聚合物之间的共价键。
这种策略将允许我们产生具有放大的信号、减少的空间位阻和位点特异性缀合的缀合物。以前的质量标记策略可以仅允许每个巯基连接一个质量标签。SBP可能仅提供有限数量的缀合位点用于质量标签的连接。例如，抗体或其衍生物可以仅提供几个巯基或胺基，质量标签可以与这些基团缀合。硫醇或胺封端的寡核苷酸可以仅提供一个这样的基团。
在某些方面，多个质量标签(例如，质量标签聚合物)可以与SBP上较少数量的连接位点缀合。例如，多个小分支质量标记的聚合物(例如，结合或能够结合少于30个或少于20个标记原子)可以通过分支杂官能接头连接至单个连接位点。这种更小的聚合物可能更容易合成(例如，以均匀的尺寸)，并且与质量标签聚合物结合的分支杂官能接头的尺寸和形状可以通过接头的杂官能化学来控制。
替代地，如本文所述，多种高灵敏度聚合物可以通过单个分支杂官能接头结合。例如，6个或更多个质量标签可以结合于3个或更少个连接位点，4个或更多个质量标签可以在2个连接位点处结合，或2个或更多个质量标签可以在单个连接位点处结合。例如，杂官能接头可包含结合(例如，共价结合)SBP连接位点的第一基团和结合(例如，共价结合)质量标签上不同化学连接位点的第二基团的多个实例。例如，杂官能接头可以分支成第二基团的2个、3个、4个或更多个实例。
分支杂官能接头可以通过第3种化学类型(例如，不与接头任一端的连接化学反应)形成。例如，可以通过醛化学形成分支杂官能接头，并且可以具有用于连接至SBP的硫醇反应性基团，并且可以具有用于连接至多个质量标签的点击化学基团(诸如应变促进的点击化学基团)的多个实例。分支杂官能接头可以具有2个、3个、4个、至少2个、至少3个或至少4个分支，每个分支终止于第二反应性基团(用于连接至质量标签)。
杂官能接头具有两种不同的连接机制。第一种连接可以用于结合SBP的连接位点，诸如硫醇或胺基。第二种连接机制可以用于结合质量标签，诸如通过点击化学。分支杂官能接头可以具有用于第二连接化学的多个末端。由分支杂官能接头提供的分支可以减少合成大质量标签聚合物(例如，具有或能够结合超过30个、超过50个或超过100个标记原子)的需求。结合可以是共价结合，诸如通过硫醇反应化学、胺反应化学或点击化学(诸如应变促进的点击化学)。结合可以是非共价的，诸如通过杂交或通过亲和相互作用(例如，生物素-亲和素或抗体或其衍生物与目标分析物(诸如肽序列))。
分支杂官能接头的一种或两种连接机制可以是共价的。在某些方面，杂官能接头可具有巯基反应性第一基团(例如，马来酰亚胺)和点击化学反应性第二基团的多个实例(例如，TCO或DBCO)。抗体可以被还原(例如，通过TCEP)以呈现巯基，并且与杂官能接头的第一基团反应。在某些方面，TCEP还原将抗体SBP切割成更小的片段，从而使得更小的、空间位阻更小的缀合物能够更好地到达组织中的表位。与多个质量标签结合的这种抗体片段可能更容易纯化，诸如通过与FPLC相反的自旋过滤。多个质量标签(诸如质量标签聚合物，每个都用点击化学反应性基团(例如，四嗪或叠氮化物)官能化)可以连接至杂官能接头的第二基团。本发明涉及在铰链区用多个DBCO部分修饰抗体以用于叠氮官能化MCP的位点特异性连接。使用分支杂官能接头可能涉及两步缀合策略，其中抗体铰链区处的二硫键被部分还原以产生反应性巯基，其随后与分支多官能接头的马来酰亚胺官能团反应。然后，使用无铜点击化学程序，从杂官能接头分支的叠氮化物或四嗪官能化聚合物可以连接至DBCO或TCO部分。类似地，可以设计其他多官能团和不同的连接化学并用于需要改善信号放大、缀合效率的不同应用中。作为分支结构，第2代或第3代树枝状聚合物也可以用于在分支杂官能接头上引入多个质量标签连接位点。
在某些方面，分支杂官能接头的连接机制可以是非共价的。例如，接头可以具有共价结合至接头的聚合物主链上的分支寡核苷酸(例如，具有相同或相似序列的单链DNA)，质量标记的寡核苷酸可以直接或间接与分支寡核苷酸杂交。这种杂交可以在样品与结合于分支杂官能接头的SBP接触之后进行，因为杂交方案可以将不同的标记原子靶向不同的SBP，如本文进一步所讨论。在某些方面，分支杂官能接头与SBP的非共价连接可以通过亲和反应进行，例如生物素-亲和素或二级抗体与一级抗体SBP的结合。
杂官能接头可以在第一基团与分支点之间和/或分支点与第二基团之间包括长接头(例如，超过5个、10个或20个重复亚单元)。亚单元可以包括溶解度增强(例如，极性)亚单元，诸如聚乙二醇(PEG)。
在某些方面，SBP可以首先连接至一个或多个杂官能接头，然后连接质量标签。当不受随后可连接的大量标签的阻碍时，杂官能接头可更好地接近SBP连接位点。
质量标签和/或接头的缀合
各种合适的结合方法是本领域中已知的例如，质量标签可以与生物活性材料缀合，诸如通过共价结合(例如，胺化学、硫醇化学、磷酸盐化学、酶反应、氧化还原反应(诸如与金属卤化物)、亲和中间体(例如，链霉亲和素或生物素)或点击化学的形式，诸如应变促进的点击化学或金属催化的点击化学)。在某些方面，本文所述的缀合方法可用于将寡核苷酸与SBP缀合，诸如当杂交方案用于将质量标记的寡核苷酸与SBP-寡核苷酸缀合物间接缔合时。
质量标签可以诸如通过共价结合(例如，胺化学、硫醇化学、磷酸盐化学、酶促反应或点击化学的形式，诸如应变促进的点击化学或金属催化的点击化学)与生物活性材料缀合。生物活性材料可以是亲和试剂(诸如抗体或其片段、适体、凝集素等)或与内源目标(例如，DNA或RNA)或中间体(例如，抗体-寡核苷酸中间体和/或寡核苷酸的杂交方案)杂交的寡核苷酸探针。如本文所述，合适的连接化学可包括羧基-胺反应化学(例如，诸如与碳二亚胺的反应)、胺反应化学(例如，诸如与NHS酯、亚氨基酯、五氟苯基酯、羟甲基膦等的反应)、巯氢基反应化学(例如，诸如与马来酰亚胺、卤乙酰基(溴-或碘-)、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯砜等的反应)、醛反应化学(例如，诸如与酰肼、烷氧基胺等的反应)、羟基反应化学(例如，诸如与异硫氰酸酯的反应)。替代的连接方法包括点击化学，诸如应变促进的点击化学(诸如通过DBCO-叠氮化物或TCO-四嗪)。
聚合物可以被官能化以结合生物活性材料。在某些方面，聚合物可以通过硫醇反应化学、胺反应化学或点击化学官能化。例如，聚合物可以针对硫醇反应性被官能化(例如，通过马来酰亚胺基团连接至例如通过TCEP还原被还原的抗体的Fc部分上的硫醇基团)。缀合的类型和缀合条件(例如，还原剂的浓度)可以根据SBP的类型而不同，以保持SBP的完整性。
例如，聚合物质量标签(例如，包含多个金属结合基团，诸如金属螯合侧基)可以用巯基反应性基团(诸如马来酰亚胺)官能化。在某些方面，SBP可以包含半胱氨酸，其可以被还原(例如，通过TCEP还原)以提供用于与聚合物缀合的硫醇。然而，SBP上的半胱氨酸可能是不可接近的，半胱氨酸的破坏可能降低SBP的亲和力，或还原步骤可能降低SBP的亲和力。在这种情况下，SBP上的其他官能团可以在缀合之前被硫醇化，即使在已经包含硫醇或半胱氨酸的SBP上也是如此。例如，重组抗体可以设计得更小(例如，减少空间位阻并从而改善结合)，并且因此在Fc区上可能没有可接近的半胱氨酸。在这种情况下，胺可以被间接硫醇化，诸如通过与乙酰硫代乙酸琥珀酰亚胺酯反应，然后用50mM羟胺或肼去除乙酰基。在另一实例中，胺可以通过与3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯反应，然后用DTT或TCEP还原3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基缀合物而被间接硫醇化。还原释放2-吡啶硫酮发色团，其可用于确定硫醇化的程度。替代地，硫醇可以通过EDAC介导的与胱胺的反应，然后用DTT或TCEP还原二硫化物而在羧酸基团处并入。最后，无硫醇蛋白质中的色氨酸残基可以被氧化成巯基色氨酸残基，然后可使其与包含碘乙酰胺或马来酰亚胺的质量标签缀合。在某些方面，针对硫醇化所述的还原步骤可以省略，或可以没有与还原的半胱氨酸的硫醇缀合所需的步骤严格，使得马来酰亚胺官能化的质量标签聚合物与硫醇化部分缀合，而不是在SBP的还原的半胱氨酸处。在某些方面，基于非肽的SBP(诸如寡核苷酸)可能更有弹性，并且缀合可包括在等于或大于25mM或等于或大于50mM的TCEP或DTT浓度下的还原。在某些方面，基于非肽的SBP的缀合可以包括更苛刻的温度，诸如通过加热或冷冻变性。
在某些方面，SBP(诸如寡核苷酸或肽)可以很小，诸如在聚合物质量标签尺寸的50％内。这可以提供更好的组织穿透性和/或减少的空间位阻，但可能使过滤步骤中质量标记的SBP的纯化复杂化。因此，质量标签可以被修饰以呈现可允许基于亲和力的纯化的表位。在某些方面，
根据本公开的某些方面，可以使用各种不同的金属催化剂自由点击化学反应，诸如应变促进的反应。
炔烃与叠氮化物的反应
第一个实例是应变的炔烃与叠氮化物之间的反应，诸如环辛炔衍生物和叠氮化物之间的应变促进的叠氮化物-炔烃环加成。
这里，环辛炔和叠氮化物的反应共价连接R1和R2基团。鉴于炔烃环应变，有机叠氮化物与环状炔烃(通常为环炔烃)的反应通常被称为应力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)。在本公开的某些方面，R1可以是SBP，并且R2可以是质量标签。替代地，R2可能是SBP，并且R1可能是质量标签。因此，在本公开的一些实施方案中，所述方法包括使用点击化学反应将SBP与质量标签缀合，其中点击化学反应是叠氮化物与炔烃的反应。
环辛炔与叠氮化物的反应的特征在于相对较慢的反应动力学，并且需要大量过量的试剂和长的孵育时间。因此，可以使用具有更高反应性的环炔烃衍生物，但不会损害反应性。这些包括单氟化环辛炔(MOFO)、二氟环辛炔(DIFO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、二苯并环辛炔(DIBO)、二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)、二芳基氮杂环辛酮(BARAC)、双环壬炔(BCN)、2,3,6,7-四甲氧基-DIBO(TMDIBO)、磺酰化DIBO(S-DIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)、吡咯并环辛炔(PYRROC)。众所周知，(二)苯并环化环辛炔的增强反应性是由多个sp2杂化碳赋予的环应变的增加引起的。许多种类的二苯并环辛炔(DBCO)衍生物可用于本发明中，诸如用NHS酯(直接或通过接头)衍生的那些，诸如用于与SBP上的胺(例如蛋白质(例如抗体和凝集素)中的赖氨酸、精氨酸和组氨酸的侧链的胺基的N-末端胺基)缀合，与氨基修饰的寡核苷酸探针(可从IDT(IL,USA)、Sigma Aldrich(MO,USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX,USA)等商购获得)、氨基糖衍生物等缀合。替代地，DBCO衍生物可以用马来酰亚胺(例如，二苯并环辛炔-马来酰亚胺；Sigma Aldrich目录号760668，或二苯并环辛炔-PEG4-马来酰亚胺；SigmaAldrich目录号760676)(直接或通过接头)衍生。马来酰亚胺官能团可用于将DBCO偶联至质量标签的巯氢基。
因此，在一些实施方案中，炔烃是环状炔烃，例如其中环状炔烃是8元环的部分。环状炔烃可以是应变的。有时，环状炔烃是包含3个或更多个环的多环结构的部分，任选地，其中多环结构包含至少两个苯环。在一些实施方案中，环状炔烃是二苯并环辛炔(DBCO)。
叠氮化物同样可以用NHS酯(诸如叠氮基-dPEG8-NHS酯、叠氮基-dPEG12-NHS酯等)偶联至SBP(直接或通过接头)(可从Sigma Aldrich获得；目录号分别为QBD10503和QBD10505)。通过NHS酯，叠氮化物可以偶联至SBP的胺(例如，蛋白质(例如抗体和凝集素)中的赖氨酸、精氨酸和组氨酸的侧链的胺基的N-末端胺基)，与氨基修饰的寡核苷酸探针(可从IDT(IL,USA)、Sigma Aldrich(MO,USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX,USA)等商购获得)、氨基糖衍生物等缀合。替代地，叠氮化物修饰的寡核苷酸/糖可以直接合成(即，不需要通过单独的NHS酯反应将叠氮化物官能团连接至氨基修饰物)。叠氮化物组分也可以偶联至质量标签。例如，偶氮聚合引发剂可用于常规聚合反应中。叠氮化物封端的聚甲基丙烯酸酯也可从Sigma Aldrich获得。
因此，本公开的某些方面提供了一系列产生质量标记的SBP的方法，其包括通过SPAAC反应缀合质量标签和SBP。在一些实施方案中，所述方法包括提供炔烃官能化的SBP和叠氮化物官能化的质量标签，以及使炔烃官能化的SBP与叠氮化物官能化的质量标签反应的步骤，诸如其中炔烃官能化的SBP用应变的环炔烃(例如DBCO)官能化。在一些实施方案中，所述方法包括提供叠氮化物官能化的SBP和炔烃官能化的质量标签，以及使叠氮化物官能化的SBP与炔烃官能化的质量标签反应的步骤的，诸如其中炔烃官能化的质量标签用应变的环炔烃(例如DBCO)官能化。如下所述，在SBP与炔烃或叠氮化物和/或质量标签与叠氮化物或炔烃之间可以存在间隔基。
本公开的某些方面还提供了质量标记的SBP，其中SBP和质量标签通过接头接合，所述接头包含炔烃和叠氮化物的反应产物，诸如应变的环炔烃和叠氮化物，例如DBCO和叠氮化物。在一些情况下，反应产物是无金属点击化学反应的产物，诸如无铜点击化学反应。因此，本公开的某些方面提供了质量标记的SBP，其中SBP和质量标签通过包含三唑的接头接合。接头中的三唑基团可以是多环结构的部分。在某些方面，多环结构可以包含4个或更多个环。例如，多环结构可以是3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环等。在某些方面，多环结构可以包含两个或更多个苯环。具体地，多环结构可以包含二苯并环辛烯基团。三唑基团和二苯并环辛烯基团可以在任何方向。例如，三唑基团可以通过二苯并环辛烯基团与SBP隔开(因此意味着二苯并环辛烯基团将通过三唑基团与质量标签隔开)。替代地，二苯并环辛烯基团可以通过三唑基团与SBP隔开(因此意味着三唑基团将通过二苯并环辛烯基团与质量标签隔开)。
如下所述，质量标签包含一个或多个标记原子，其允许在质量检测器中以简单的方式鉴定SBP的目标的存在。然而，并不是SBP将与标记元素已经在标签中的质量标签缀合。有时，SBP将在一个或多个金属标记原子被负载到金属螯合部分上以形成质量标签之前与金属螯合部分缀合。如下文更详细的解释，金属螯合部分可以是单个金属螯合基团，或其可以是金属螯合基团已经连接至两个或更多个亚单元的聚合物。
因此，本公开的某些方面提供了一系列产生与金属螯合部分缀合的SBP的方法，其包括通过SPAAC反应缀合金属螯合部分和SBP。在一些实施方案中，所述方法包括提供炔烃官能化的SBP和叠氮化物官能化的金属螯合部分，以及使炔烃官能化的SBP与叠氮化物官能化的金属螯合部分反应的步骤，诸如其中炔烃官能化的SBP用应变的环炔烃(例如DBCO)官能化。在一些实施方案中，所述方法包括提供叠氮化物官能化的SBP和炔烃官能化的金属螯合部分，以及使叠氮化物官能化的SBP与炔烃官能化的金属螯合部分反应的步骤，诸如其中炔烃官能化的金属螯合部分用应变的环炔烃(例如DBCO)官能化。如下所述，在SBP与炔烃或叠氮化物和/或金属螯合部分与叠氮化物或炔烃之间可以存在间隔基。
SPAAC反应可以在生理条件下进行，并且与大生物分子，诸如蛋白质(包括抗体、配体、受体、核酸等，如下文所述，包括在与SBP相关的章节中)相容。生理条件可以包括等渗溶液或生物缓冲液，诸如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。生理条件可替代地或另外地包括范围介于1℃至42℃、4℃至37℃、4℃至25℃、10℃至37℃、25℃至37℃等的温度。生理条件可以包括中性pH、5.5至8.5的pH、6至8的pH、6.5至7.5的pH等。因为DBCO与叠氮化物之间的反应可能是一个缓慢的过程，所以相对长的孵育时间可能是优选的。例如，步骤b)的缀合可以在4℃下进行4小时至48小时，在4℃下进行10小时至24小时，在4℃下进行18小时至20小时，在室温下进行10分钟至10小时，在室温下进行30分钟至5小时，在室温下进行30分钟至3小时，在37℃下进行5分钟至5小时，在37℃下进行10分钟至2小时等。
本公开的某些方面还提供了一种制备质量标记的SBP的方法，所述方法包括执行根据前段所述的方法以产生与金属螯合部分缀合的SBP，并且还包括将金属负载于金属螯合部分(例如聚合物)上的步骤。
本公开的某些方面还提供了SBP-金属螯合部分缀合物，其中SBP和金属螯合部分通过接头接合，所述接头包含炔烃和叠氮化物的反应产物，诸如应变的环炔烃和叠氮化物，例如DBCO和叠氮化物。在一些情况下，反应产物是无金属点击化学反应的产物，诸如无铜点击化学反应。因此，本公开的某些方面提供了SBP-金属螯合部分缀合物，其中SBP和金属螯合部分通过包含三唑的接头接合。接头中的三唑基团可以是多环结构的部分。在某些方面，多环结构可以包含4个或更多个环。例如，多环结构可以是3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环等。在某些方面，多环结构可以包含两个或更多个苯环。具体地，多环结构可以包含二苯并环辛烯基团。三唑基团和二苯并环辛烯基团可以在任何方向。例如，三唑基团可以通过二苯并环辛烯基团与SBP隔开(因此意味着二苯并环辛烯基团可以通过三唑基团与金属螯合部分隔开)。替代地，二苯并环辛烯基团可以通过三唑基团与SBP隔开(因此意味着三唑基团可以通过二苯并环辛烯基团与金属螯合部分隔开)。
包含三唑基团的质量标记的SBP在溶液中可以是稳定的。例如，SBP-质量标签在溶液中可以稳定长达1周、1个月、6个月、2年、3年、5年等。SBP-质量标签在-20℃(例如，其中溶液包含甘油)、低于冰点、4℃、10℃或室温的溶液中可以是稳定的。当SBP是抗体时，可以通过抗体亲和力来测量稳定性。
在一些情况下，点击化学反应在没有金属催化剂的情况下进行，特别是其中点击化学反应在没有铜或铁的情况下进行。在一些情况下，点击化学反应在生理条件下进行，任选地，其中点击化学反应在6至8的pH下进行，例如其中点击化学反应在缓冲液中进行，例如其中缓冲液是等渗的。
有时，炔烃连接至SBP，并且叠氮化物连接至质量标签或金属螯合部分。有时，叠氮化物连接至SBP，并且炔烃连接至质量标签或金属螯合部分。有时，当炔烃连接至SBP时，其通过接头组分(任选通过间隔基)连接。有时，当炔烃连接至质量标签或金属螯合部分时，其通过接头组分(任选通过间隔基)连接。有时，当叠氮化物连接至SBP时，其通过接头组分(任选通过间隔基)连接。有时，当叠氮化物连接至质量标签或金属螯合部分时，其通过接头组分(任选通过间隔基)连接。
烯烃与四嗪的反应
第二个实例是应变的烯烃与四嗪之间的反应，诸如应变促进的反式-环辛烯衍生物与四嗪之间的四嗪-烯烃环加成。
这里，反式-环辛烯和四嗪的反应共价连接R1和R2基团。鉴于炔烃环应变，有机四嗪与环状烯烃(通常为反式-环辛烯)在逆电子需求Diels-Alder环加成(iEDDA)中的反应。在本公开的某些方面，R1可以是SBP，并且R2可以是质量标签。替代地，R2可能是SBP，并且R1可能是质量标签。
在三种不同的可能的四嗪异构体中，1,2,4,5-四嗪用于iEDDA反应。反应的完成释放出N2气体作为唯一的副产物，这使得iEDDA反应是不可逆的，并且比传统的可逆Diels-Alder反应更适合于生物标记。
反式-环辛烯(TCO)是目前已知的在此反应中作为试剂的最具反应性的环状烯烃中的一种。许多种类的衍生物可用于本公开的某些方面中，诸如用NHS酯(直接或通过接头)衍生的那些，诸如用于与SBP上的胺(例如赖氨酸)缀合。替代地，TCO衍生物可以用马来酰亚胺(例如，蛋白质(例如抗体和凝集素)中的赖氨酸、精氨酸和组氨酸的侧链的氨基的N-末端氨基)(直接或通过接头)衍生，与氨基修饰的寡核苷酸探针(可从IDT(IL,USA)、SigmaAldrich(MO,USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX,USA)等商购获得)、氨基糖衍生物等缀合。马来酰亚胺官能团可用于将TCO偶联至质量标签的巯氢基。也可以使用反式-双环[6.1.0]壬烯衍生物，其中取代发生在环丙基环上。甲基环丙烯、双环[6.1.0]壬炔、环辛炔和降冰片烯虽然没有TCO快，但也可以与四嗪反应。
四嗪同样可以用NHS酯(诸如可从Sigma Aldrich获得)(直接或通过接头)偶联至SBP。通过NHS酯，四嗪可以偶联至SBP上的胺(例如，蛋白质(例如抗体和凝集素)中的赖氨酸、精氨酸和组氨酸的侧链的胺基的N-末端胺基)，与氨基修饰的寡核苷酸探针(可从IDT(IL,USA)、Sigma Aldrich(MO,USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX,USA)等商购获得)、氨基糖衍生物等缀合。四嗪组分也可以偶联至质量标签，例如其中组分也包含马来酰亚胺官能团。有两种主要类型的四嗪被广泛应用：6-甲基取代的四嗪和6-氢取代的四嗪。甲基取代的四嗪即使溶解在水介质中也表现出高稳定性，同时仍然提供比任何其他生物正交反应对更快的与TCO衍生物的反应动力学(大约1000M-1s-1)此外，其能耐受各种反应条件。这使得其成为如蛋白质标签的应用的首选。另一方面，氢取代的四嗪表现出较低的稳定性和对苛刻反应条件的较低耐受性，但对于如体内成像的应用提供了极快的反应动力学(高达30000M-1s-1)。四嗪可以是3-(苄氨基)-四嗪。
因此，本公开的某些方面提供了一系列产生质量标记的SBP的方法，其包括通过应变的烯烃与四嗪之间的逆电子需求Diels-Alder环加成反应(随后是消除N2的逆Diels-Alder反应)将质量标签和SBP缀合。在一些实施方案中，所述方法包括提供烯烃官能化的SBP和四嗪官能化的质量标签，以及使烯烃官能化的SBP与四嗪官能化的质量标签反应的步骤，诸如其中烯烃官能化的SBP用应变的环烯烃(例如TCO)官能化。在一些实施方案中，所述方法包括提供四嗪官能化的SBP和烯烃官能化的质量标签，以及使四嗪官能化的SBP和烯烃官能化的质量标签反应的步骤，诸如其中烯烃官能化的质量标签用应变的环烯烃(例如TCO)官能化。如下所述，在SBP与烯烃或四嗪和/或质量标签与四嗪或烯烃之间可以存在间隔基。
本公开的某些方面还提供了质量标记的SBP，其中SBP和质量标签通过接头连接，所述接头包含烯烃和四嗪的反应产物，诸如应变的环烯烃和四嗪，例如TCO和四嗪。在一些情况下，反应产物是无金属点击化学反应的产物，诸如无铜点击化学反应。因此，本公开的某些方面提供了质量标记的SBP，其中SBP和质量标签通过包含哒嗪的接头接合。接头中的哒嗪基团可以是多环结构的部分。在某些方面，多环结构可以包含2个或更多个环。例如，多环结构可以是3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环等。在某些方面，多环结构可以包含6元环和8元环。具体地，多环结构可以包含环辛烷基团。哒嗪基团和环辛烷基团可以在任何方向。例如，哒嗪基团可以通过环辛烷基团与SBP隔开(因此意味着环辛烷基团将通过哒嗪基团与质量标签隔开)。替代地，环辛烷基团可以通过哒嗪基团与SBP隔开(因此意味着哒嗪基团将通过环辛烷基团与质量标签隔开)。
SBP和作为SBP的小部分
如本文所用，SBP是特异性结合配偶体(或特异性结合对)。SBP可以非共价结合其目标分析物，诸如通过亲和力(例如，三级结构)或杂交。因此，本公开的某些方面还提供了用于标记SBP的试剂盒，以及通过本文公开的点击化学产生的质量标记的SBP的试剂盒，任选地是包括质量标记的SBP以及其他含标记原子的试剂(例如DNA嵌入剂)的试剂盒。同样，本公开的某些方面还提供了使用本公开的质量标记的SBP标记样品的方法，任选地是使用多种这种质量标记的SBP标记样品的方法，例如其中质量标记的SBP包括不同类型的SBP，例如抗体SBP(包括多种抗体SBP)、核酸SBP(包括多种核酸SBP)、凝集素(包括多种凝集素)、糖(包括多种糖)和DNA嵌入剂(包括多种DNA嵌入剂)。类似地，本公开的某些方面包括使用本公开的质量标记的SBP来标记样品，诸如使用多种这种质量标记的SBP来标记样品，例如其中质量标记的SBP包括不同类型的SBP，例如抗体SBP(包括多种抗体SBP)、核酸SBP(包括多种核酸SBP)、凝集素(包括多种凝集素)、糖(包括多种糖)和DNA嵌入剂(包括多种DNA嵌入剂)。因此，本公开的某些方面还提供了根据本公开标记的样品，诸如用本公开的质量标记的SBP标记的样品，任选地是用多种这种质量标记的SBP标记的样品，例如其中质量标记的SBP包括不同类型的SBP，例如抗体SBP(包括多种抗体SBP)、核酸SBP(包括多种核酸SBP)、凝集素(包括多种凝集素)、糖(包括多种糖)和DNA嵌入剂(包括多种DNA嵌入剂)。
在某些方面，SBP可以是抗体(诸如抗体片段或合成抗体)、核酸适体和非免疫球蛋白蛋白(诸如亲和素)、肽(诸如匹配或衍生自蛋白的结合结构域，诸如结合核酸的锌指或结合小肽或分子的受体结合结构域等)或其相应分析物上的衍生物。在这种情况下，SBP可以是比传统抗体更小的小部分。例如，小部分SBP的分子量可以小于50kDa、小于30kDa、小于20kDa、小于10kDa或小于5kDa。小部分SBP可以允许较大的质量标签而没有本文讨论的缺点。小部分SBP可以更好地渗透细胞或组织，例如允许对组织进行更深的染色。
不同SBP可能不同地受缀合方法和质量标签的影响。因此，本发明的方面包括在同一样品的分析中对不同的SBP使用不同的信号放大方法。不同的SBP可以是不同类型的SBP(例如，寡核苷酸相比于抗体)，不同的抗体同种型(IgM，以及不同的同种型，如IgG1、IgG2a和IgG2b)，或相同的SBP类型但具有不同的目标分析物。当使用硫醇反应性化学将SBP与质量标签缀合时，不同的缀合方法包括不同的还原严格性。不同的质量标签包括不同的高灵敏度聚合物(例如，具有不同的螯合基团、聚合物尺寸、聚合物形状和/或溶解度增强基团的不同组成)。例如，更高严格性的缀合(例如，还原)可以用于呈现更少连接位点(例如，硫醇基团)的SBP。本申请的试剂盒包括与具有不同聚合结构(例如，除具有不同标记原子以外)的质量标签缀合的多种不同的SBP。
在某些方面，不同的SBP(包括不同的抗体免疫球蛋白类别)可以与不同的质量标签缀合，或可以在不同条件下与化学上相同或相似的质量标签缀合。例如，当使用硫醇反应性化学时，某些抗体可能对还原反应不同(例如，通过TCEP)。因此，多个SBP可以通过不同的缀合方案与相同的质量标签聚合物结构(可能负载有不同的同位素)缀合。
质量标签的小部分SBP可以通过除FPLC以外的方法(诸如通过自旋过滤)纯化。在某些方面，结合于SBP的质量标签(或质量标签的总量)可以是SBP本身尺寸的至少20％、30％、50％或80％，这可以允许自旋过滤。在某些方面，质量标记的抗体可以通过自旋过滤来纯化。
包括高灵敏度聚合物的质量标签聚合物
本申请的质量标签包括包含多个标记原子的聚合物，例如负载在金属螯合侧基上或并入聚合物的主链中。在某些方面，质量标记的聚合物可以与元素或同位素组合物(例如，其可以负载到质量标签聚合物的螯合剂上，或其已负载到质量标签聚合物的螯合剂上)分开提供。可以提供连接至诸如抗体或其片段的特异性结合配偶体(SBP)的质量标签聚合物。在某些方面，质量标签聚合物可以具有或能够(例如，通过螯合)结合超过10个、超过20个、超过30个、超过50个、超过100个或超过200个标记原子(例如，单一同位素的标记原子，诸如富集的同位素)。高灵敏度聚合物可以具有或能够结合(例如平均)超过30个、超过50个、超过100个或超过200个标记原子。
高灵敏度聚合物可以是线性的或分支的。分支聚合物可以是树枝状聚合物(例如，包含至少第二代、第三代或第四代分支)或星形聚合物(例如，包含至少三种从中央核延伸的线性聚合物)。
在某些方面，除了金属螯合侧基以外，高灵敏度聚合物可以包括不具有螯合剂的溶解度增强侧基(例如，具有极性基团，诸如PEG)。
具有大量(例如，超过30个)标记原子的高灵敏度质量标签聚合物(即，高灵敏度聚合物)可能存在许多困难，包括SBP与目标结合的空间位阻、与SBP的连接差、低溶解度以及与样品或底层底物的非特异性结合。在某些方面，具有大量标记原子的质量标签聚合物可以进行化学修饰，以减少或消除这些折衷中的一种或多种。
在某些方面，质量标签聚合物中标记原子的密度可以通过在聚合物的单个侧基中偶联多个金属螯合基团来增加。
在某些方面，高灵敏度聚合物的流体动力学直径可能较低，例如小于20nm、小于15nm、小于10nm、小于5nm、小于3nm或小于2nm。流体动力学直径可以小于1000nm3、小于500nm3、小于100nm3、小于50nm3、小于20nm3或小于10nm3。
为了减少空间位阻，高灵敏度聚合物可以通过长接头与SBP隔开，诸如沿着线性链包含超过10个、超过20个、超过30个或超过50个化学键的接头(不含标记原子或金属螯合侧基)。
聚合物结构中可以包括溶解度增强基团(例如，非离子极性基团，诸如PEG基团)，例如使得质量标签聚合物具有超过5个、超过10个或超过20个这样的基团。溶解度增强基团可以沿着线性链组织，诸如接头、聚合物主链和/或在侧基上(例如，其包含金属螯合剂或不含金属螯合剂)。
螯合剂本身可以被修饰以影响其总体电荷平衡(例如，在约中性pH下卸载或负载)，诸如通过添加酸或碱基团、配位(例如，以便具有至少6个、7个或8个配位位点)，和/或在螯合基团内或附近(例如，具有少于10个、5个或3个键)并入溶解度增强基团。
质量标签聚合物的尺寸可以是均匀的。例如，聚合物可以具有低多分散性，例如多分散性指数小于1.5、1.2或1.1。因此，纳米粒子的尺寸可以是均匀的(例如，可以具有小于1.5、1.2或1.1的多分散指数)。
提供聚合物可以包括通过活性聚合来聚合侧基。在活性聚合中，链终止和链转移反应可能不存在或很少，并且链引发的速率可能比链增长的速率更快。所得聚合物链可以比传统链聚合更恒定的速率增长，并且聚合物长度可以保持一致(即，其具有如本文所述的低多分散指数)。用于制备本申请的聚合物的活性聚合可以包括以下中的一种或多种：阴离子聚合、受控自由基聚合(诸如催化链转移聚合、引发剂介导的聚合、稳定自由基介导的聚合(SFRP)、原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合和碘转移聚合)、阳离子聚合和/或开环聚合。聚合的侧基可以包括螯合剂、增溶基团或两者。聚合物的单个侧基可以包括螯合剂、增溶基团或两者。聚合物的侧基可以被官能化，以便在聚合之后添加螯合剂和/或增溶基团。替代地或另外，在聚合之前，至少一些侧基可以包括螯合剂和/或增溶基团。
聚合物可以包括有助于(例如，增加)聚合物的溶解度的侧基，诸如聚乙二醇化的侧基。例如，聚合物可以被改性以包括侧基，所述侧基在负载有金属同位素之前和/或之后有助于聚合物的溶解度。其中侧基包括亲水基团，所述亲水基团在将金属同位素负载于侧基上之前和之后有助于聚合物的溶解度。因此，聚合物的一个或多个侧基可以包括重复亲水基团链(例如，其有助于聚合物的溶解度)。例如，配位侧基可以包括亲水基团和/或与包括亲水基团的侧基隔开。重复亲水基团链可能不会影响聚合物的配位侧基的配位化学。亲水基团可以包括PEG基团。聚合物的辅助(例如，增加的)溶解度可以有助于(例如，增加)金属同位素在溶液中的负载。
在某些方面，侧基(例如，具有螯合剂和/或增溶基团)可以在主链聚合时并入。替代地或另外，侧基、增溶基团(例如，链)或两者可以诸如通过本领域已知的任何连接化学连接至由聚合物主链提供的官能团。例如，可以将一定比例的螯合剂与增溶基团添加至聚合物中，以便获得具有螯合剂的侧基与具有增溶基团(不含螯合剂)的侧基的比例。合适的连接化学可包括羧基-胺反应化学(例如，诸如与碳二亚胺的反应)、胺反应化学(例如，诸如与NHS酯、亚氨基酯、五氟苯基酯、羟甲基膦等的反应)、巯氢基反应化学(例如，诸如与马来酰亚胺、卤乙酰基(溴-或碘-)、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯砜等的反应)、醛反应化学(例如，诸如与酰肼、烷氧基胺等的反应)、羟基反应化学(例如，诸如与异硫氰酸酯的反应)。替代的连接方法包括点击化学，诸如应变促进的点击化学(诸如通过DBCO-叠氮化物或TCO-四嗪)。
聚合物可以包括增溶基团，其中至少一些可以组织成链。如本文所用的增溶基团可以不与金属原子配位。聚合物可以被聚乙二醇化以有助于(例如，增加)溶解度。例如，聚合物可以包括至少50个、至少100个、至少200个或至少500个PEG单元(例如，PEG基团)。PEG单元可以分布在多个侧基上，使得聚合物的多个侧基可以被聚乙二醇化。例如，至少一些侧基可以包括超过5个、超过10个、超过20个、超过30个或超过40个PEG单元(例如，组织成链)。聚合物上PEG单元的数量可以有助于(例如，增加)金属同位素在聚合物上的负载。在某些方面，聚合物上少于50％的所有侧基螯合锆和/或铪，并且聚合物上超过50％的所有侧基包括多个PEG单元。例如，聚合物上少于60％但超过30％，诸如少于50％但超过40％的侧基可以包括螯合剂。
在某些方面，聚合物的聚乙二醇化可以包括将PEG单元链连接至聚合物的侧基。所述链可以包括5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、或50个或更多个PEG单元。聚乙二醇化的侧基可以包括螯合剂，或可以与包括螯合剂的侧基隔开。螯合剂和增溶基团(例如，PEG)的量、分布和/或比例可有助于同位素组合物在聚合物上的负载。例如，螯合剂和增溶基团(例如，PEG)的量、分布和/或比例可以最大化可以负载于聚合物上的同位素组合物(例如，组合物的富集同位素)的量(例如，在最大值的80％、90％或95％内)。本文将进一步讨论聚合物的负载。
聚合物(例如，在负载之前、负载之后和/或与生物活性材料缀合之后)可能不聚集(例如，可能不易于聚集)。例如，超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或基本上所有的聚合物可能不聚集。聚合物可以是未负载的，可以负载有同位素组合物，和/或可以与本文所述的生物活性材料缀合。如本文所述，聚合物可以在溶液中。例如，超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或基本上所有的聚合物可能不聚集。试剂盒中提供的聚合物(例如，具有本文所述的额外组分)可以稳定至少1个月、至少3个月、至少6个月或至少1年。
本申请的聚合物可以包括任何合适数量的侧基(例如，连接至聚合物主链上的重复单元)，例如超过2个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、100个侧基。例如，聚合物可以包括2个至100个、5个至80个、10个至50个或20个至40个侧基。
方法和试剂盒可包括用于将同位素组合物负载于聚合物上的金属负载缓冲液。在负载于本申请的聚合物上之前，金属负载缓冲液可以与溶液中的同位素组合物混合。金属装载缓冲液可以是酸性溶液(例如，包括强酸，诸如硝酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、盐酸和氯酸中的一种或多种)。同位素组合物可以适于负载于本申请的聚合物上的形式提供。替代地或另外，负载缓冲液可以包括乙酸盐(例如，碱金属乙酸盐)，诸如乙酸铵、乙酸钠，和/或与另一种碱配对的乙酸盐，诸如碳酸盐或碳酸氢盐。在某些方面，可以负载金属，以便不饱和聚合物的所有螯合基团，例如以提高聚合物溶解度和/或减少背景或对SBP结合的影响。
聚合物的螯合剂
本文所用的螯合剂是指一起配位(例如，稳定配位)金属原子的一组配体。螯合剂可以存在于聚合物的侧基上和/或并入聚合物主链中。在某些方面，螯合剂包括于聚合物的侧基中。
在某些方面，聚合物可以包括一个或多个侧基，所述侧基包括配体，例如异羟肟酸盐(本文中可与异羟肟酸互换使用)、氮杂大环、苯氧胺、萨罗汾(salophen)、环拉胺(cyclam)和/或其衍生物。聚合物可以包括本领域已知的螯合剂或其衍生物，其包括异羟肟酸盐、氮杂大环、苯氧胺、萨罗汾或环拉胺。在某些方面，本申请的螯合剂可以在锆或铪原子上配位六个或更多个、超过六个、或八个位点。例如，螯合剂可以与锆或铪中的至少一种形成八配位络合物。例如，锆和铪中的至少一种可以与聚合物的侧基形成八配位络合物。
在某些方面，聚合物的螯合剂包括异羟肟酸基团，诸如在DFO和/或其衍生物中。替代地或另外，聚合物可以包括氮杂大环，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)螯合剂或其衍生物。在某些实施方案中，螯合剂可以包括DOTAM、DOTP和DOTA中的一种(例如，负载有锆或铪同位素或与锆或铪同位素分开提供)。在某些方面，螯合剂是DOTA衍生物，与DOTA相比，其具有改善的锆或铪结合(以及潜在地减少的与镧系元素的结合)。例如，DOTA衍生物可以在锆和/或铪原子上配位八个位点，并且可以任选地包括有助于结合(例如，稳定结合)锆和/或铪的配体之间的间隔。例如，与镧系元素同位素相比，DOTA衍生物与锆和/或铪的结合增强。
纳米粒子和聚合物上的纳米粒子合成
金属纳米粒子(诸如纳米尺度的金属簇)提供了高密度的标记原子，但是具有许多缺点。具有惰性表面的纳米粒子的官能化以连接至SBP是很重要的，并且通常会产生SBP的多个连接位点。小纳米粒子(例如小于10nm或小于5nm)的合成可能是困难的，导致空间位阻、较差溶解度、较差胶体稳定性(聚集)和非特异性结合。金属簇纳米粒子的合成可能是困难的(例如，可能需要高温并且可能对合成条件敏感)。纳米粒子的尺寸可能不均匀。
在某些方面，金属纳米粒子可以在稳定剂(诸如有机稳定剂)的存在下在中等温度(例如，低于100摄氏度、低于50摄氏度或低于37摄氏度)下合成。例如，金属纳米粒子可以是量子点。在某些方面，有机稳定剂可以包含巯基，诸如半胱氨酸。
在某些方面，稳定剂可以充当封端剂。稳定剂可以在聚合物上，并且纳米粒子可以在聚合物上合成。聚合物的尺寸可以限制(例如，控制)纳米粒子的尺寸。所述粒子可以包括呈现多个稳定剂实例的线性或分支部分。所述粒子还可包括用于将聚合物(包括在聚合物上合成的纳米粒子)连接至单个SBP的连接基团。质量标签可以具有低多分散性，诸如多分散性指数小于1.5、1.2或1.1。因此，纳米粒子的尺寸可以是均匀的(例如，可以具有小于1.5、1.2或1.1的多分散指数)。大部分纳米粒子可以具有较小直径，诸如直径在1nm与10nm之间、1nm与5nm之间、1nm与3nm之间、1nm与2nm之间、2nm与5nm之间、2nm与3nm之间。纳米粒子可以是具有多种同位素的元素，诸如镉或碲，但是可以具有同位素的非天然组成(诸如镉或碲的富集同位素)。纳米粒子可以是单分散的。在某些方面，聚合物可以包括多个纳米粒子。在某些方面，接种在聚合物上生长的纳米粒子的速率可能比生长速率更慢。纳米粒子的快速生长可消耗聚合物上的稳定基团，使得所述聚合物不与在其他聚合物上生长的纳米粒子缔合。可以分散聚合物，以降低随着纳米粒子的生长，多种聚合物与相同纳米粒子缔合的速率。在某些方面，在聚合物上生长纳米粒子之前，可以将预先形成的(预先接种的)纳米粒子与聚合物混合。在某些方面，聚合物可以具有10个与10000个之间、10个与1000个之间、10个与100个之间、10个与50个之间、20个与500个之间或20个与100个之间的稳定剂实例。在某些方面，聚合物可以具有少于10个，或甚至仅单个稳定剂实例，并且溶液中存在的稳定剂可以使得纳米粒子能够在聚合物上生长。在聚合物上合成纳米粒子期间，可以在溶液中提供与聚合物相同或不同的稳定剂。
如前所述，在硫醇或硫醇酸稳定剂的存在下，可以形成小的镉(CdSe、CdS和CdTe)纳米粒子。半胱氨酸稳定的单分散CdsS纳米粒子的合成可以接种有这种纳米粒子。虽然已经报道了金纳米粒子在大的聚(半胱氨酸)聚合物上的合成和缔合，但没有显示出均匀的尺寸、单分散性或半胱氨酸作为金纳米粒子的稳定剂或阻断试剂。值得注意的是，在中等温度下进行这些纳米粒子的合成。
本发明的方面包括包含富集同位素并在诸如聚半胱氨酸聚合物的巯基呈递聚合物上合成的Cd或CdTe纳米粒子，以及这种纳米粒子作为SBP的质量标签的用途。在某些方面，SBP本身可以提供稳定剂，诸如巯基(例如，由还原的抗体提供)，并且纳米粒子可以直接在SBP上合成。如果巯基不靠近SBP的结合位点，直接合成可以防止纳米粒子在空间上干扰结合。
用于信号放大的杂交方案
质量标记的寡核苷酸可以直接或间接与目标寡核苷酸杂交。例如，一个或多个中间寡核苷酸可以提供支架，多个质量标记的寡核苷酸可以在所述支架上杂交，从而放大信号。因此，本申请的方面包括用于基于杂交的信号放大的寡核苷酸。
目标寡核苷酸可以是细胞内源的DNA或RNA分子(诸如编码RNA、小干扰RNA或微小RNA)。目标寡核苷酸可以是单链的。目标寡核苷酸可以具有已知的特定序列(或与已知的特定序列同源)。在某些方面，SBP(诸如抗体或其衍生物)可以与目标寡核苷酸缀合，诸如与包含已知序列的合成单链DNA寡核苷酸缀合。在这种情况下，抗体和寡核苷酸都可以称为SBP。
在SBP与样品中的分析物结合后，多个质量标记的寡核苷酸可以直接或间接与第一寡核苷酸杂交。杂交可以是分支的或线性的。在某些方面，聚合酶可以沿着模板延伸第一寡核苷酸，以提供额外的杂交位点。质量标记的寡核苷酸可以包括单个标记原子，或可以包括包含多个标记原子的聚合物。质量标记的寡核苷酸可以在寡核苷酸本身的化学结构中包括标记原子，诸如重金属原子。
在某些方面，质量标记的寡核苷酸可以用本文所述的高灵敏度聚合物或纳米粒子进行质量标记。
大质量标签粒子
与直觉相反，与较小粒子(例如，纳米粒子)质量标签相比，大质量标签粒子(例如，直径大于50nm、100nm、200nm、500nm或1μm)可提供减少的背景和/或SBP结合的破坏。
例如，与通过洗涤质量标签对去除的未结合标签施加的力相比，在较大的质量标签粒子中，质量标签与样品或下面的底物的非特异性(和非共价)结合可以减少。具体而言，非特异性结合可以与粒子的表面积成比例，而在质量标签的主动清洗下破坏非特异性结合的力可与质量标签的重量成比例增加(与粒子直径增加时的表面积相比，其成指数比例增加)。
此外，SBP可以呈现结合质量标签的多个基团(例如呈现多个巯基的还原抗体)，并且粒子质量标签可以提供多个SBP连接基团。较小质量的标签粒子(例如，小于10nm、小于50nm或小于100nm)可以与这种SBP交联。相比之下，较大质量标签粒子(例如，大于200nm、500nm或1μm)可以与SBP上的大部分连接基团结合和/或通过空间位阻阻止其他大质量标签粒子与相同SBP分子的结合。
大质量标签粒子可以包含胶体金属簇(例如，具有被涂覆/封端并被官能化以结合SBP的表面)，诸如大纳米粒子、包含金属螯合基团的分支或超支化聚合物或基质或捕集金属原子的聚合物(诸如聚苯乙烯)。
阻断试剂
阻断试剂(即一种或多种阻断试剂)可用于防止质量标记的SBP的非特异性结合。阻断试剂可以添加至细胞样品中，诸如悬浮液中的细胞或固体载体上的细胞样品，诸如载玻片上的组织切片。质量标记的SBP可以在添加阻断试剂之后和/或与阻断试剂混合之后添加至细胞样品中。在某些方面，所用阻断试剂的浓度(例如，摩尔浓度)可以超过质量标记的SBP(诸如至少5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的量)。如本文所述，质量标签聚合物(尤其是高灵敏度聚合物)可以具有一些背景(例如，诸如不表达目标分析物的细胞上的信号，和/或诸如边缘效应和点的人工特征)。
传统的阻断试剂包括血清(例如，BSA)、明胶、牛奶(或酪蛋白)，通常在缓冲液中的浓度超过1％，或甚至超过5％。替代地或除一种或多种传统阻断试剂以外，可以使用一种或多种聚合物阻断试剂(例如，其不与SBP缀合)。聚合物阻断试剂可以是线性或分支聚合物，并且可以包括极性溶解度增强基团和/或带电基团。聚合物阻断试剂可用于防止用本文所述的高灵敏度聚合物标记的SBP的非特异性结合。例如，与具有较少标记原子的聚合物相比，高灵敏度聚合物(例如，平均具有超过30个标记原子)可以增加非特异性结合，例如与组织载玻片的表面(例如，玻璃表面)的非特异性结合。
在某些方面，聚合物阻断试剂可以包括与连接至SBP的质量标签相同或相似的聚合物主链，和/或可以具有金属螯合基团(例如，除传统的阻断试剂(诸如BSA)以外)，诸如DOTA、DTPA、EDTA和/或其衍生物。聚合物阻断试剂可以是未与SBP结合的聚合物质量标签，例如未与任何生物分子结合或与非特异性生物分子(诸如寡核苷酸随机体)或不特异性标记目标分析物的蛋白质(诸如BSA)结合。聚合物质量标签阻断试剂可以负载有不被用作任何SBP的标记原子的金属同位素，例如检测范围之外的同位素或已经是细胞内源的同位素。用金属同位素负载聚合物质量标签可使其化学上类似于SBP的质量标签，并且允许其以类似于质量标记的SBP的方式非特异性结合。用聚合物质量标签阻断可以减少质量标记的SBP的非特异性结合。在某些方面，聚合物质量标签阻断试剂的分布(例如，通过IMC测量跨像素负载于质量标签聚合物上的金属的质量通道来确定)可用于减少质量标记的SBP的报道量。例如，来自质量标记的SBP的信号可以归一化为来自聚合物质量标签阻断试剂的信号。
在某些方面，聚合物阻断试剂可以包括不包括螯合基团的亲水聚合物，诸如带电的聚合物。亲水聚合物含有极性或带电的官能团，从而使其可溶于水。在本节中，大多数亲水聚合物按其结构的化学性质分组。例如，丙烯酸树脂包括丙烯酸、丙烯酰胺和马来酸酐聚合物和共聚物。胺官能聚合物包括烯丙胺、乙烯亚胺、噁唑啉和在主链或侧链上含有胺基的其他聚合物。
在某些方面，带电的聚合物可以具有多个带负电的基团(和任选的净负电荷)、多个带正电的基团(和任选的净正电荷)，或可以是两性离子型的(具有带正电和带负电的基团，诸如在中性pH下的强酸/强碱基团，例如，彼此非常接近，例如在20个、10个、5个、3个或2个键内)，和任选的净中性电荷。两性离子聚合物可以是带正电和带负电的亚单元的共聚物，并且可以具有一种或多种丙烯酸单体。两性离子聚合物可以是聚两性电解质或聚甜菜碱。两性离子聚合物可以包括两性离子基团，诸如铵磷酸根(磷酸甜菜碱或卵磷脂类似物)、铵膦酸根(膦酰基甜菜碱)、铵亚膦酸根(膦基甜菜碱)、铵磺酸根(磺基甜菜碱，诸如甲基丙烯酸磺基甜菜碱)、铵硫酸根、铵羧酸根(碳甜菜碱或羧基甜菜碱)、铵磺酰胺、铵磺酰亚胺、胍基羧酸根(天冬酰胺类似物)、吡啶羧酸根、铵(烷氧基)二氰基乙烯醇根、铵硼酸根、磺基羧酸根、磷基磺酸根、磷基羧酸根、氧吡啶甜菜碱。
合适的亲水聚合物可以包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和聚丙烯酰胺(PAM)、聚2-(噁唑啉)和聚乙烯亚胺(PEI)、聚(丙烯酸)、聚甲基丙烯酸酯和其他丙烯酸聚合物、聚(乙二醇)和聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)(PVA)和共聚物、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)和共聚物、聚电解质和/或其衍生物。诸如Sigma的供应商提供了这种亲水聚合物的广泛目录。
这种聚合物可以通过多种聚合技术合成，包括自由基聚合(FRP)、逐步增长和/或开环易位聚合(Ring-opening metathesis polymerization；ROMP)。聚合可以允许不同单体的交替并入。聚合物阻断试剂可以盐或溶液的形式提供。
带电聚合物可以具有与聚合物质量标签相似的化学特性。例如，当未与金属结合时，聚合物质量标签的螯合基团可以具有负电荷，和/或当负载有金属时，可以具有轻微的正电荷。负载有金属的聚合物质量标签可以不具有负载有金属的每个螯合基团(例如，负载效率可以小于100％，诸如小于90％、小于80％或小于70％)。因此，负载有金属的聚合物质量标签可以具有带电基团，并且可以是两性离子型的。因此，带电的聚合物阻断试剂可以阻断样品上的表面(例如，某些种类的生物分子和/或样品本身的载体)，否则特定的聚合物质量标签将非特异性地结合于所述表面。带电的聚合物阻断试剂可以低浓度使用，诸如小于10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％或0.1重量％。
本文所用的阻断试剂可将质量标记的SBP的非特异性结合减少超过50％、超过75％或超过90％。非特异性结合的减少可以通过用相同质量标记的SBP对两个连续的组织切片进行染色来确定，其中只有一个切片被阻断，并且评估来自质量标记的SBP的信号减少的区域。替代地或另外，当非特异性结合具有特征性模式(例如边缘效应或斑点)时，非特异性结合的减少可被评估为模式出现和/或强度的减少。
在某些方面，试剂盒可以包括质量标签(例如，任选地连接至SBP)和本文所述的聚合物阻断试剂。
在某些方面，金属纳米粒子(例如，如本文所讨论)可以用作质量标签，并且可以用本文所讨论的聚合物阻断试剂阻断(例如，钝化)。纳米粒子可以是二氧化硅涂覆的镧系元素，或非镧系元素纳米粒子，诸如非镧系元素金属氧化物纳米粒子。金属纳米粒子质量标签(例如，具有固体金属簇的金属纳米粒子)的挑战可能包括用于连接SBP的表面官能化、与样品的非特异性结合、SBP(诸如抗体或其衍生物)的非特异性吸附、较差溶解性和/或单分散性。用本文所述的聚合物阻断试剂涂覆金属纳米粒子质量标签可以减轻这些特性中的一种或多种。可以在表面官能化之前、在表面官能化期间(例如，聚合物阻断试剂可与包含连接基团的分子交联，或其本身可包括用于连接SBP的基团)、在表面官能化之后(例如，以阻断暴露的金属簇核的任何剩余表面)、在连接SBP之前(例如，以减少SBP的非特异性吸附)和/或在连接SBP之后(例如，以减少与样品的非特异性结合)，将聚合物阻断试剂添加至纳米粒子中。
与二级亲和力SBP组合
例如，来自不同物种的一级抗体的不同二级抗体可以允许对多种目标分析物进行信号放大。二级抗体可以结合一级抗体的Fc部分的多个位点。替代地，二级SBP可以结合于一级SBP上使用的荧光团或其他标签。
如本文所讨论，对于不同的SBP，甚至是不同类型的某种SBP(诸如抗体)，信号放大方法可能起不同的作用。因此，二级SBP可被制备用于(或用于)信号放大方法并被验证(例如，确定低背景和强信号)，然后被用于(例如，在不同的实验中)检测多种不同的一级SBP分析物。
生物素-亲和素可用作二级亲和力。例如，与链霉亲和素结合的一级SBP将提供4个用于连接生物素化质量标签的位点。生物素和亲和素的衍生物在本申请的范围内。
与酶沉积组合
在某些方面，SBP可以与酶(诸如HRP)缀合。本文所述的质量标签(诸如质量标签聚合物(例如，高灵敏度聚合物))可以与水溶性底物缀合，所述底物被酶变得不溶和/或被酶修饰以结合于生物样品。在某些方面，酶促裂解可使底物不溶，从而引起相关质量标签的沉积。合适的酶包括氧化还原酶(例如，过氧化物酶)、磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)、内酰胺酶(例如，β-内酰胺酶)和半乳糖苷酶(例如，β-D-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)。HRP底物包括3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸](ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)及其衍生物。AP底物包括氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和/或对硝基苯磷酸酯(PNPP)及其衍生物。葡萄糖氧化酶底物包括氯化硝基四氮唑蓝(NBT)。β-半乳糖苷酶底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(BCIG或X-Gal)。例如，酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)或其衍生物，并且底物可以是酪酰胺部分或其衍生物，诸如金属螯合的酪酰胺部分。例如，底物可以是包含酪酰胺部分和与金属(诸如镧系元素或其同位素)结合的螯合剂(诸如DTPA、DOTA或其衍生物)的酪酰胺衍生物。酶可以是β-半乳糖苷酶(Gal)、碱性磷酸酶(AP)和/或辣根过氧化物酶(HRP)。在某些方面，可以使酶失活，然后可以使用具有相同酶的新SBP来沉积不同的质量标签(例如，具有不同的标记原子)。
可以与待负载于底物上的金属分开提供底物(例如，底物的DTPA或DOTA螯合剂)。替代地，可以提供预负载有金属的底物。
在某些方面，底物(诸如金属螯合的(例如，DTPA或DOTA修饰的)酪酰胺衍生物)可以形成聚集体(例如，非特异性地粘附于细胞或组织样品固定于其上的底物，和/或防止酶的沉积)。如果酪酰胺衍生物的多个实例在酪酰胺衍生物的多个实例中部分配位金属，那么可能形成这种聚集体。因此，在将底物应用于用相应酶标记的样品之前(例如，之前不到一天、之前不到4小时、之前不到2小时、之前不到1小时或之前不到30分钟)，可以过滤底物，使得聚集体被去除。酪酰胺衍生物可以小于1kDa，但是过滤器可以是50kDa或更大的过滤器。
替代地或另外，在将底物应用于用相应酶标记的样品之前(例如，之前不到一天、之前不到4小时、之前不到2小时、之前不到1小时或之前不到30分钟)，可以将金属(例如，镧系元素)或其同位素负载于底物上(例如，负载于螯合剂，诸如底物的DTPA或DOTA上)。
在某些方面，催化剂(即，增强剂)可以沿着底物添加，以增加沉积的速率和/或程度。在某些方面，可以添加终止试剂(例如，在洗涤缓冲液中)以便以受控方式终止酶对底物的沉积。催化剂和/或终止试剂的使用可以提供对反应程度的进一步控制，以改善信号增强和/或提供更好的目标定量。在某些方面，终止试剂或另一种试剂使酶失活，使得酶的另一种实例可与不同的目标缔合，并且可以应用包含不同金属(例如，镧系元素)或其同位素的底物。因此，通过用不同的金属(例如镧系元素)或其同位素连续沉积底物，可以对多个不同的目标进行酶沉积。
例如，用于酪酰胺衍生物的HRP沉积的催化剂可以增加自由基形成的速率(例如，可以是电子介体)。例如，G.H.G.Thorpe和L.J.Kricka,Methods Enzymol.1986；133:331描述了6-羟基苯并三唑、碘酚(诸如对碘酚)、香豆酸(诸如对香豆酸)；美国专利第4,279,950号中的芳族胺；欧洲专利申请第603953号(1994年)中的乙酰苯胺；美国专利第5,171,668号中的靛酚和吩噻嗪N-取代和靛酚；在美国专利第5,629,168号中被取代的硼酸。这种介体已被描述用于化学发光，诸如通过美国专利第7,803,573号。在某些方面，催化剂可以应用于包含一种或多种硼酸盐(例如过硼酸盐或异硼酸盐)、乙酸盐缓冲液和/或磺酸盐的缓冲溶液中。
在某些方面，可以提供终止试剂(例如，在上述催化剂增强反应的几分钟内使用)，诸如催化HRP沉积的少于5分钟或少于3分钟(例如，在室温或更高温度下)。终止试剂可以包含过氧化物，诸如过氧化氢，其量足以暂时或永久地灭活HRP。替代地或另外，终止试剂可以包括淬灭自由基形成的组分，诸如叠氮化物。替代地或另外，可以应用诸如微波处理、温度升高(例如，高于50摄氏度，诸如高于60摄氏度)或低pH(例如，低于4的pH)的条件来暂时或永久地灭活HRP。在某些方面，终止试剂可以应用于洗涤缓冲液中和/或可以孵育一分钟或更多分钟。在某些方面，可以在终止反应后应用与HRP缀合的另一种SBP，从而允许多重反应，其中不同的酪酰胺衍生物质量标签与不同的目标缔合。在一轮或多轮基于酶的质量标签沉积后，可以用多个不同的质量标记的SBP进行多重和同时染色步骤。然后可以通过成像质谱分析样品，诸如通过LA-ICP-MS或通过SIMS。
在某些方面，多重化可以通过将与HRP缀合的寡核苷酸直接或间接与与SBP(诸如抗体)缀合的寡核苷酸杂交来进行。这可以允许将HRP与目标缔合，沉积新的质量标记的酪酰胺，灭活，然后用新的寡核苷酸-HRP缀合物重复的更快序列。在这个系统中，多个寡核苷酸-SBP可以较早地同时应用于样品。通过杂交使HRP与目标结合可能比抗体染色更快，并且在连续的灭活步骤后可能对样品的损坏不敏感。
因此，用于酶沉积的试剂盒可以包括底物，诸如酪酰胺或其衍生物，和金属，诸如镧系元素或其同位素。金属可以预先负载于底物上，或可以分开提供以负载于底物上。在某些方面，试剂盒可以提供质量标签酪酰胺衍生物，并且可以进一步包括如上所述的催化剂试剂、终止试剂、缓冲液和/或过滤器。试剂盒可进一步包括本文中的其他实施方案中所讨论的额外组分。
双重标记
用于成像质谱细胞术的信号放大可以与荧光标记组合，从而允许通过荧光显微术和/或荧光图像与质谱细胞术图像的共配准来鉴定感兴趣的区域。在某些方面，SBP可以如本文所述进行质量标记，并且也连接至荧光团标签。这种双重标记可以通过连接至SBP上的相同连接基团的相同接头来实现。
单分子检测
在某些方面，信号放大可以允许一次检测单个SBP。例如，提供高灵敏度、高分辨率和快速像素采集速率的成像质谱细胞术可以允许检测用信号放大试剂和/或本文所述方法标记的单个SBP质量。因此，信号放大质量标签可以包含同位素的目标条形码(独特组合)，从而允许目标多重性的显著增加。同位素的组合可以包括至少2种、至少3种、至少4种或至少5种并非天然存在于混合物中的不同同位素。例如，具有20种不同同位素中的6种的独特组合的目标条形码质量标签允许20种选择6(38,760)个独特的条形码，其中的任何一个都可用于标记不同的SBP。另外，可以基于不同的同位素比率来区分目标条形码SBP。在某些方面，目标条形码质量标签可以是一起提供同位素的独特组合的质量标记的寡核苷酸的杂交方案。
试剂盒
用于质谱细胞术的试剂盒可以包括一种或多种本文所述的试剂。可以在试剂盒中提供上述组分的任何组合。试剂盒可以包括质量标签(例如，聚合物质量标签)、同位素组合物、负载有同位素组合物的聚合物、分开提供的聚合物和同位素组合物或负载有同位素组合物并与抗体缀合的聚合物。
试剂盒可以进一步包括任何额外的组分(例如，缓冲液、过滤器等)以用于将同位素组合物负载于聚合物上和/或使负载的聚合物结合于生物活性材料。替代地或另外，试剂盒可以包括用于质谱细胞术的额外试剂，诸如缓冲液、标准物、细胞条形码和/或包括不同质量的重原子的试剂(例如，连接至生物活性材料的质量标签，或提供用于连接至生物活性材料的质量标签)。
试剂盒可以包括额外的同位素组合物，其与上述同位素组合物分开且可区分(例如，具有不同质量的富集同位素)。额外的同位素组合物可以包括锆、铪和/或镧系元素同位素。例如，试剂盒可以进一步包括额外的聚合物，所述聚合物包括螯合(例如，稳定螯合)镧系元素但不螯合锆或铪的多个侧基。在某些方面，试剂盒可包括共价结合于负载有不同同位素组合物的聚合物的多种抗体(例如，针对不同目标的抗体)。可以在单个组中一起提供这种抗体集合。组可以溶液或冻干混合物的形式提供，所述冻干混合物包括按质量计小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的水分。
Claims (39)
1.一种对至少一种目标分析物进行信号放大的质谱细胞术方法，所述方法包括：
使细胞样品与结合样品中的目标分析物的SBP接触；
通过将超过100个标记原子与由SBP结合的目标分析物缔合来放大信号；
通过质谱检测所述标记原子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述标记原子的背景小于10％。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述SBP与质量标签缀合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述质量标签是包含金属螯合金属基团的聚合物质量标签。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述质量标签是高灵敏度聚合物，其中所述高灵敏度聚合物包含超过30个标记原子。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述质量标签是纳米粒子质量标签。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述纳米粒子质量标签用聚合物阻断试剂钝化。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中多个质量标签通过分支杂官能接头连接至SBP。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述质量标签是结合或能够结合少于30个标记原子的低分子量质量标签聚合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述杂官能接头通过点击化学连接至SBP或质量标签。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其还包括用聚合物阻断试剂阻断所述细胞样品，其中所述聚合物阻断试剂不与SBP缀合。
12.如权利要求11所述的方法，其中包含螯合基团的聚合物阻断试剂负载有金属。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述聚合物阻断试剂包含带正电和/或带负电的基团。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述SBP是小部分SBP。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中信号放大包括杂交方案。
16.如权利要求15所述的方法，其中信号放大包括质量标记的寡核苷酸与单链寡核苷酸的直接或间接杂交。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述单链寡核苷酸是与结合于所述目标分析物的抗体或其衍生物缀合的单链DNA寡核苷酸。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其还包括针对超过5种不同目标分析物的信号放大，其中与不同目标分析物缔合的所述标记原子可通过质谱进行区分。
19.如权利要求18所述的方法，其中至少一种目标分析物是蛋白质。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中至少一种目标分析物是寡核苷酸。
21.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中结合相同目标分析物的多个SBP与相同大质量标签粒子缀合。
22.一种信号放大试剂盒，其用于执行如权利要求1至21中任一项所述的方法。
23.一种用于质谱细胞术的信号放大试剂盒，其包括：
包含超过30个标记原子或能够结合超过30个标记原子的质量标签，
其中所述质量标签连接至SBP或被官能化以连接至SBP。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其还包括分支杂官能接头。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述分支杂官能接头包含用于连接至所述质量标签的点击化学基团的多个实例。
26.如权利要求24或25所述的试剂盒，其中多个质量标签通过分支杂官能接头连接至SBP的相同连接位点。
27.如权利要求23至26中任一项所述的试剂盒，其还包括聚合物阻断试剂。
28.如权利要求23至27中任一项所述的试剂盒，其中所述质量标签连接至SBP。
29.如权利要求23至28中任一项所述的试剂盒，其中所述质量标签的多个实例通过分支杂官能接头在一个连接位点处连接至所述SBP。
30.如权利要求23至29中任一项所述的试剂盒，其中所述质量标签是包含金属螯合基团的高灵敏度聚合物。
31.如权利要求23至30中任一项所述的试剂盒，其还包括同位素组合物。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述同位素组合物是同位素富集的。
33.如权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述同位素组合物可负载于所述质量标签上。
34.如权利要求31或32所述的试剂盒，其中将所述同位素组合物负载于所述质量标签上。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述质量标签连接至SBP。
36.如权利要求23至35中任一项所述的试剂盒，其还包括用于基于杂交的信号放大的寡核苷酸。
37.一种制备信号放大SBP的方法，其包括：
将分支杂官能接头连接至所述SBP上的一个或多个连接位点；
将多个质量标签连接至所述分支杂官能接头；
其中所述分支杂官能接头与所述SBP的连接方式不同于质量标签与所述分支杂官能接头的连接方式。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述分支杂官能接头与所述SBP或所述质量标签的连接是通过点击化学进行的。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述质量标签是包含至少30个标记原子的高灵敏度聚合物。
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