JP2023507386A - シグナル増幅のためのマスサイトメトリー試薬および方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、イメージングマスサイトメトリーにおけるシグナルを改善するための試薬および方法が説明される。態様には、多数の標識原子を有する質量タグ、質量タグに対する化学修飾、および質量タグ特異的結合パートナー(SBP)のバックグラウンドを低減し、および/または標的結合を維持する追加の試薬、ならびに複数の質量タグを単一のSBPと関連付けるためのスキームが含まれる。そのため、実施形態は、一つ以上の試薬およびその使用の任意の組み合わせを含む。本明細書の試薬、キット、および方法は、イメージングマスサイトメトリーを含む、マスサイトメトリーに使用され得る。一部の態様では、試薬、キット、または方法は、例えば、治療的使用または放射性検出のための、標的分析物への多数の放射性同位体の送達に使用され得る。特定の態様では、非放射性同位体のみが、マスサイトメトリーに使用され得る。【選択図】図1
Description
イメージングマスサイトメトリー(IMC)を含むマスサイトメトリーは、質量分析法によって質量タグを検出することによって、標的分析物の高度に多重化された検出を可能にする。質量タグは、典型的には、抗体などの特異的結合パートナー(SBP)を介して標的分析物と関連付けられる。質量タグは、他の質量タグの質量標識原子と区別される標識原子(例えば、濃縮同位体などの単一の同位体)の一つ以上のコピーを有してもよい。標識原子は、細胞に内因性ではない金属同位体であってもよい。
標識原子の大部分は、空間電荷効果および内因性原子からの標識原子の分離などの様々な考慮事項のために、質量検出の上流で失われ得る。そのため、質量タグとSBPとの関連付けが望まれ得る。しかしながら、ポリマーおよび/またはナノ粒子質量タグは、蛍光ベースのタグなどの他のタグに対する考慮事項ではない、SBPのバックグラウンドおよび結合に影響を与えるいくつかの固有の課題を提示する。
本明細書では、イメージングマスサイトメトリーにおけるシグナルを改善するための試薬および方法が説明される。態様には、多数の標識原子を有する質量タグ、質量タグに対する化学修飾、および質量タグ特異的結合パートナー(SBP)のバックグラウンドを低減し、および/または標的結合を維持する追加の試薬、ならびに複数の質量タグを単一のSBPと関連付けるためのスキームが含まれる。そのため、実施形態は、一つ以上の試薬およびその使用の任意の組み合わせを含む。
本明細書の試薬、キット、および方法は、イメージングマスサイトメトリーを含む、マスサイトメトリーに使用され得る。一部の態様では、試薬、キット、または方法は、例えば、治療的使用または放射性検出のための、標的分析物への多数の放射性同位体の送達に使用され得る。特定の態様では、非放射性同位体のみが、マスサイトメトリーに使用され得る。
マスサイトメトリー
本明細書で使用される場合、マスサイトメトリーは、単一細胞解像度で複数の区別可能な質量タグを同時に検出するなど、生物学的試料中の質量タグを検出する任意の方法である。マスサイトメトリーには、懸濁マスサイトメトリーおよびイメージングマスサイトメトリー(IMC)が含まれる。マスサイトメトリーは、レーザ放射、イオンビーム放射、電子ビーム放射、および/または誘導結合プラズマ(ICP)のうちの一つ以上によって、細胞試料の質量タグを原子化およびイオン化し得る。マスサイトメトリーは、飛行時間(TOF)または磁気セクタ質量分析法(MS)など、単一の細胞から別個の質量タグを同時に検出し得る。マスサイトメトリーの例としては、細胞がICP-MSに流れ込む懸濁マスサイトメトリー、および細胞試料(例えば、組織切片)が、例えば、レーザアブレーション(LA-ICP-MS)または一次イオンビーム(例えば、SIMS用)によってサンプリングされるイメージングマスサイトメトリーが挙げられる。
本明細書で使用される場合、マスサイトメトリーは、単一細胞解像度で複数の区別可能な質量タグを同時に検出するなど、生物学的試料中の質量タグを検出する任意の方法である。マスサイトメトリーには、懸濁マスサイトメトリーおよびイメージングマスサイトメトリー(IMC)が含まれる。マスサイトメトリーは、レーザ放射、イオンビーム放射、電子ビーム放射、および/または誘導結合プラズマ(ICP)のうちの一つ以上によって、細胞試料の質量タグを原子化およびイオン化し得る。マスサイトメトリーは、飛行時間(TOF)または磁気セクタ質量分析法(MS)など、単一の細胞から別個の質量タグを同時に検出し得る。マスサイトメトリーの例としては、細胞がICP-MSに流れ込む懸濁マスサイトメトリー、および細胞試料(例えば、組織切片)が、例えば、レーザアブレーション(LA-ICP-MS)または一次イオンビーム(例えば、SIMS用)によってサンプリングされるイメージングマスサイトメトリーが挙げられる。
質量タグは、元素分析の前に、サンプリング、原子化、およびイオン化されてもよい。例えば、生物学的試料中の質量タグは、レーザビーム、イオンビーム、または電子ビームなどの放射によってサンプリングされ、原子化され、および/またはイオン化されてもよい。別の方法として、または追加的に、質量タグは、プラズマ、例えば誘導結合プラズマ(ICP)によって、原子化およびイオン化されてもよい。懸濁マスサイトメトリーでは、質量タグを含む全細胞を、ICP-TOF-MSなどのICP-MSに流してもよい。イメージングマスサイトメトリーでは、放射線の形態は、質量タグを含む組織試料などの固体生物学的試料の一部分(例えば、画素、関心領域)を除去(および任意にイオン化および原子化)してもよい。IMCの例としては、質量タグ付けされた試料のLA-ICP-MSおよびSIMS-MSが挙げられる。特定の態様では、イオン光学は、質量タグの同位体以外のイオンを枯渇させ得る。例えば、イオン光学は、より軽いイオン(例えば、C、N、O)、有機分子イオンを除去し得る。ICP用途では、イオン光学は、ハイパス四重極フィルタを通してなど、Arおよび/またはXeなどのガスを除去し得る。特定の態様では、IMCは、細胞または細胞内の解像度を有する質量タグ(例えば、質量タグに関連付けられた標的)の画像を提供し得る。
蛍光免疫組織化学法と同様に、マスサイトメトリー(イメージングマスサイトメトリーを含む)のワークフローは、抗体および/または他の特異的結合パートナーとの染色前の細胞(例えば、組織)固定および/または透過化を含み得る。蛍光法とは対照的に、マスサイトメトリー質量タグ(例えば、細胞に内因性ではない重金属を含む)は、抗体などの特異的結合パートナーを介して標的分析物と関連付けられる。蛍光顕微鏡検査法と同様にイメージングマスサイトメトリーは、試料が熱などの条件に曝露されて、SBPによる結合のため標的分析物を曝露する、抗原賦活化ステップを含み得る。非結合SBPは、典型的には、質量分析によって質量タグを検出する前に洗浄される。注目すべきは、元素分析(例えば、放射分光法またはX線分散分光法)などの他の検出方法も、対象出願の範囲内である。
マスサイトメトリーのための追加の試薬には、金属含有バイオセンサー(複数可)(例えば、低酸素、タンパク質合成、細胞サイクルおよび/または細胞死などの条件下で堆積または結合されるもの)、および/または化学特性に基づいて構造(例えば、DNA、細胞膜、層)に結合する組織化学化合物(複数可)を含有する金属が含まれる。追加的に、特定の試料または実験条件を、他の試料または実験条件とプールする前に標識付けするため、質量タグ(例えば、対象出願のまたは他の質量タグ)を組み合わせて、固有のバーコードを提供してもよい。
IMCでは、組織試料は、2~6μmの間が使用され得るなど、例えば、1~10μmの範囲内の厚さを有する切片であってもよい。一部の事例では、樹脂包埋組織ブロックから切断された試料など、厚さ500nm、200nm、100nmまたは50nm未満の超薄切片が使用され得る。そのような切片を調製する技術は、例えば、脱水ステップ、固定、埋め込み、透過処理、切片作製など、マイクロトームを使用する、IHCの分野から周知である。したがって、組織は化学的に固定されてもよく、その後、切片を所望の平面に調製することができる。凍結切片またはレーザキャプチャマイクロダイセクションは、組織試料を調製するためにも使用され得る。試料は、例えば、細胞内標的の標識付けのための試薬の許容のために透過化されてもよい。(例えば、加熱による)抗原の賦活化後であっても、SBPによる分析物へのアクセスが立体的に妨げられ得る。そのため、より小さなSBPおよび特定の質量タグは、SBPがその標的分析物にアクセスすることを最も良く許容し得る。
RNAを検出するために、本明細書に記載される方法および装置を使用して、RNAおよびタンパク質含量の分析のために、本明細書で論じられる生物学的試料中の細胞を調製してもよい。特定の態様では、細胞は固定され、ハイブリダイゼーションステップの前に透過化される。細胞は、固定および/または透過化されて提供されてもよい。細胞は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの架橋固定剤によって固定されてもよい。別の方法として、または追加的に、細胞は、エタノール、メタノール、またはアセトンなどの沈殿固定剤を使用して固定されてもよい。細胞は、ポリエチレングリコール(例えば、トリトンX-100)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween-20)、サポニン(両親媒性グリコシドの群)、またはメタノールもしくはアセトンなどの化学物質などの洗剤によって透過化され得る。特定の事例では、固定および透過化は、同じ試薬または試薬のセットを用いて行われてもよい。固定および透過化技術は、Jamurらによって、「Permeabilization of Cell Membranes」(Methods Mol.Biol.,2010)で論じられている。
シグナル増幅
マスサイトメトリーとの関連で本明細書で使用される場合、シグナル増幅は、30個超、50個超、100個超、200個超、または500個超の標識原子(例えば、濃縮同位体)の、標的分析物(すなわち、特異的結合パートナーによって結合される標的分析物の単一インスタンス)との関連である。特定の態様では、標識原子は、ランタニドまたは遷移金属などの重金属であってもよい。特定の態様では、シグナル増幅は、2、5、10、または20を超える標的分析物に対して行われてもよい。特定の態様では、シグナル増幅は、質量タグのSBPへの分岐コンジュゲーション、高感受性ポリマー、大質量タグ粒子、質量タグナノ粒子、および/またはハイブリダイゼーションスキームの使用を含み得る。特定の態様では、シグナル増幅は、質量タグポリマーを使用する。
マスサイトメトリーとの関連で本明細書で使用される場合、シグナル増幅は、30個超、50個超、100個超、200個超、または500個超の標識原子(例えば、濃縮同位体)の、標的分析物(すなわち、特異的結合パートナーによって結合される標的分析物の単一インスタンス)との関連である。特定の態様では、標識原子は、ランタニドまたは遷移金属などの重金属であってもよい。特定の態様では、シグナル増幅は、2、5、10、または20を超える標的分析物に対して行われてもよい。特定の態様では、シグナル増幅は、質量タグのSBPへの分岐コンジュゲーション、高感受性ポリマー、大質量タグ粒子、質量タグナノ粒子、および/またはハイブリダイゼーションスキームの使用を含み得る。特定の態様では、シグナル増幅は、質量タグポリマーを使用する。
本明細書に記載されるように、シグナル増幅は、多数の標識原子を含む質量タグの使用、および/またはより多数の質量タグと単一の標的分析物との関連(例えば、分岐ヘテロ官能性リンカーを介したハイブリダイゼーションベースのシグナル増幅および/または質量タグのSBPへのコンジュゲーションなど)による場合がある。特定の態様では、単一の質量タグは、30個、50個、100個、200個、500個、または1000個を超える標識原子を有してもよい。特定の態様では、質量タグの流体力学的直径は、20nm未満、15nm未満、10nm未満、5nm未満、3nm未満、または2nm未満など、低くてもよい。流体力学的直径は、1000nm3未満、500nm3未満、100nm3未満、50nm3未満、20nm3未満、または10nm3未満であってもよい。EMなどの技術を使用してサイズを識別し、光散乱を使用して、本明細書に記載のより大きな質量タグなどの質量タグの流体力学的直径を識別してもよい。さらに、サイズ排除およびイオン交換(例えば、アニオン交換)としてクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー方法を使用して、本明細書に記載されるより小さい質量タグなどの質量タグを特徴付けてもよい。
シグナル増幅の初期の試みは、非特異的結合(例えば、高バックグラウンド)および標的分析物に対するSBPの結合の破壊をもたらした。質量タグは、非特異的結合を、ポリマーの溶解性が低いこと、ポリマーの生体分子またはスライドの表面への非特異的結合、および/または質量タグに結合されたSBPの立体障害の結果とし得る。こうした問題は、より大きな質量タグ(例えば、多数の標識原子を有する)、および/または非ランタニド標識原子を有する質量タグに対して、より顕著であり得る。本明細書に記載される試薬および方法は、溶解性に影響を及ぼす、および/または非特異的結合をもたらし得る新しいポリマー(例えば、ランタニドに使用される異なるキレート剤を有するポリマー)を必要とする場合がある、非ランタニド質量タグに有用であり得る。本明細書では、標的分析物へのSBP結合および/または低い非特異的結合を維持しながら、シグナルを増幅するためのシグナル増幅技術が報告される。特定の態様では、シグナル増幅は、低バックグラウンドを維持することを含み得る。例えば、シグナルの20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満は、バックグラウンド(例えば、標的分析物を発現しない細胞および/または細胞の領域)から、および/または非特異的なpunctiおよび/またはエッジ効果(例えば、図2に示すように)などの特徴からであり得る。特定の態様では、高シグナルとバックグラウンドとの間の差は、100を超えるかまたは1000カウントを超えてもよい。特定の態様では、標的分析物の10%超、20%超、50%超、または80%超が、シグナル増幅方法で使用されるSBPによって結合されてもよい。
ランタニドおよび一部の非ランタニド金属を装填するためのキレート剤には、DOTA、DTPA、EDTA、PEPAおよび/またはその誘導体が含まれ得る。別の方法として、質量タグポリマーは、DFOおよび/またはサルコファジンなどの特定の非ランタニドを優先的にキレートするキレート剤を含み得る。
発明者らは、シグナル増幅およびバックグラウンドは、特定のSBPが、異なる質量タグとより良好にペアリングするように、質量タグポリマーの設計、SBPの選択、およびそれらの組み合わせに基づいて可変であることを発見した。追加的に、本明細書に記載するシグナル増幅を提供するおよびバックグラウンドを低減するための一般的な戦略を組み合わせて、信号対雑音を改善することができる。
例えば、図1は、細胞当たりの平均シグナルが、質量タグ付き抗体の濃度および質量タグのタイプに基づいて20~2000カウントの間であるが、バックグラウンド(標的分析物に対して陰性細胞からのシグナル)は、0カウントに近いままであることを示す、通常、低シグナルおよび/または高バックグラウンド(上段)を有する非ランタニド質量タグに対するものを含む、対象の方法および試薬によって改善されるバックグラウンドの上のシグナルを示す。示されるデータは、懸濁性マスサイトメトリーからのものであるが、イメージングマスサイトメトリーデータの同様の分析を実施することができる。
別の実施例では、図2は、対象の方法および試薬(右の画像)を通して還元される、非特異的質量タグポリマー結合(左の画像)からのエッジ効果を示す。
ヘテロ官能性リンカーを使用したSBPへの分枝質量タグコンジュゲーション
質量タグポリマー、および特に高感度ポリマーの開発は、抗体の官能基の保存と、高感度をもたらす標識付けの程度との間の慎重なバランスから利益を得る。例えば、これは、低分子量金属キレートポリマーを、SBP(例えば、抗体)などの生体分子の複数の付着部位に付着させること、またはより大きな金属キレートポリマーを対象生体分子のより少ない付着部位に付着させることによって達成され得る。特定の態様では、複数の質量タグ(例えば、質量タグポリマー)は、本明細書に記載の分岐ヘテロ官能性リンカーを介してなど、分岐コンジュゲーションを介して、SBPの同じ付着部位に付着される。
質量タグポリマー、および特に高感度ポリマーの開発は、抗体の官能基の保存と、高感度をもたらす標識付けの程度との間の慎重なバランスから利益を得る。例えば、これは、低分子量金属キレートポリマーを、SBP(例えば、抗体)などの生体分子の複数の付着部位に付着させること、またはより大きな金属キレートポリマーを対象生体分子のより少ない付着部位に付着させることによって達成され得る。特定の態様では、複数の質量タグ(例えば、質量タグポリマー)は、本明細書に記載の分岐ヘテロ官能性リンカーを介してなど、分岐コンジュゲーションを介して、SBPの同じ付着部位に付着される。
特定の態様では、抗体のアミノ基を通した低分子量質量タグポリマーを用いた抗体の過剰標識は、コンジュゲートの活性を損なった。抗体の過剰修飾は、その特異性を損傷する。しかしながら、発明者らは、少数の高分子量ポリマー鎖の付着も感度の喪失を引き起こすこと、抗体-ポリマーコンジュゲートが大きすぎると、それと組織のエピトープとの間の立体障害につながる可能性があることを発見した。分岐ヘテロ官能性リンカーは、過剰修飾を介して抗体を損傷することなく、かつ顕著な立体障害なしに、より多数の質量タグポリマーを抗体に付着させることができる。リンカーは、対象生体分子に付着する一末端に一反応性基、およびポリマーに付着する他末端に複数の反応性部分を含有してもよい。リンカー分子は、生体分子と金属装填ポリマーとの間の共有結合のための反応性末端基を有するコア構造として、ポリエチレングリコールまたはポリ(アミドアミン)系デンドリマーまたは分岐PEGなどの溶解性強化基を含有してもよい。
この戦略により、増幅されたシグナルとのコンジュゲート、立体障害の低減、および部位特異的コンジュゲーションの生成が可能となる。以前の質量タグ付け戦略は、チオール基当たり一つの質量タグの付着のみを可能にし得る。SBPは、質量タグの付着のための限定された数のコンジュゲーション部位のみを提供し得る。例えば、抗体またはその誘導体は、質量タグがコンジュゲートされ得るわずかなチオール基またはアミン基のみを提供し得る。チオールまたはアミン末端オリゴヌクレオチドは、一つのそのような基のみを提供し得る。
特定の態様では、複数の質量タグ(例えば、質量タグポリマー)は、SBP上のより少数の付着部位にコンジュゲートされてもよい。例えば、複数の小さな分岐質量タグ付きポリマー(例えば、結合された、または結合することができる、30個未満または20個未満の標識原子)は、分岐ヘテロ官能性リンカーを介して単一の付着部位に付着されてもよい。こうしたより小さなポリマーは、(例えば、均一なサイズで)合成が容易であってもよく、質量タグポリマーに結合された分岐ヘテロ官能性リンカーのサイズおよび形状は、リンカーのヘテロ官能化学によって制御されてもよい。
別の方法として、本明細書に記載される複数の高感度ポリマーは、単一の分岐ヘテロ官能性リンカーを介して結合されてもよい。例えば、6つ以上の質量タグは、3つ以下の付着部位に結合されてもよく、4つ以上の質量タグは、2つの付着部位で結合されてもよく、または2つ以上の質量タグは、単一の付着部位で結合されてもよい。例えば、ヘテロ官能性リンカーは、SBP付着部位に結合する(例えば、共有結合する)第一の基と、質量タグ上の化学的に異なる付着部位に結合する(例えば、共有結合する)第二の基の複数のインスタンスとを含んでもよい。例えば、ヘテロ官能性リンカーは、第二の基を2、3、4またはそれ以上のインスタンスに分岐してもよい。
分岐ヘテロ官能性リンカーは、第三のタイプの化学(例えば、リンカーのいずれかの末端の付着化学と非反応性である)を介して形成されてもよい。例えば、分岐ヘテロ官能性リンカーは、アルデヒド化学を介して形成されてもよく、SBPへの結合のためのチオール反応基を有してもよく、複数の質量タグへの付着のためのクリックケミストリ基(歪み促進クリックケミストリ基など)の複数のインスタンスを有してもよい。分岐ヘテロ官能性リンカーは、それぞれ第二の反応基(質量タグへの付着のため)で終結する、2つ、3つ、4つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの分岐を有してもよい。
ヘテロ官能性リンカーは、二つの異なる付着機構を有する。第一の付着は、チオール基またはアミン基などのSBPの付着部位に結合するためのものであってもよい。第二の付着機構は、クリックケミストリを介してなど、質量タグに結合するためであってもよい。分岐ヘテロ官能性リンカーは、第二の付着化学のための複数の端部を有してもよい。分岐ヘテロ官能性リンカーによって提供される分岐は、大きな質量タグポリマー(例えば、30個超、50個超、または100個超の標識原子を有する、または結合することができる)を合成する必要性を低減し得る。結合は、チオール反応性化学、アミン反応性化学、またはクリックケミストリ(例えば、歪み促進クリックケミストリ)を介してなどの共有結合であってもよい。結合は、ハイブリダイゼーションを介して、または親和性相互作用(例えば、ペプチド配列などの標的分析物を有するビオチン-アビジンまたは抗体またはその誘導体など)を介してなど、非共有結合であってもよい。
分岐ヘテロ官能性リンカーの一方または両方の付着機構は、共有結合であってもよい。特定の態様では、ヘテロ官能性リンカーは、チオール反応性の第一の基(例えば、マレイミド)と、クリックケミストリ反応性の第二の基(例えば、TCOまたはDBCO)の複数のインスタンスとを有してもよい。抗体は、チオール基を提示するため(例えば、TCEPによって)還元されてもよく、ヘテロ官能性リンカーの第一の基と反応してもよい。特定の態様では、TCEP還元は、抗体SBPをより小さい断片に切断し、その結果、より小さく、より立体的に妨げられたコンジュゲートを、組織内のエピトープにより良く到達させることができる。複数の質量タグに結合されたかかる抗体断片は、FPLCに対向するスピン濾過などにより、より精製が容易であり得る。各々がクリックケミストリ反応基(例えば、テトラジンまたはアジド)で官能化された質量タグポリマーなどの複数の質量タグは、ヘテロ官能性リンカーの第二の基に付着されてもよい。本発明は、アジド機能性MCPの部位特異的付着のためのヒンジ領域での複数のDBCO部分を有する抗体の修飾を伴う。分岐ヘテロ官能性リンカーの使用は、二段階コンジュゲーション戦略を伴う場合があり、この戦略では、抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合が部分的に還元されて、反応性チオール基を産生し、その後、分岐多官能性リンカーのマレイミド官能基と反応する。次いで、ヘテロ官能性リンカーから分岐するアジドまたはテトラジン官能化ポリマーは、銅を含まないクリックケミストリ手順を使用して、DBCOまたはTCO部分に結合されてもよい。同様に、シグナル増幅の改善、コンジュゲーション効率が必要とされる様々な用途において、他の多官能基および異なる付着化学を設計および使用することができる=分岐構造として、分岐ヘテロ官能性リンカー上に複数の質量タグ付着部位の導入にも第2または第3世代のデンドリマーを使用できる。
特定の態様では、分岐ヘテロ官能性リンカーの付着機構は、非共有結合であってもよい。例えば、リンカーは、リンカーのポリマー主鎖に共有結合した分岐オリゴヌクレオチド(例えば、同一または類似の配列の一本鎖DNA)を有してもよく、質量タグ付けされたオリゴヌクレオチドは、直接的または間接的に、分岐オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされてもよい。そのようなハイブリダイゼーションは、分岐ヘテロ官能性リンカーに結合したSBPと試料を接触させた後に行われてもよい。なぜなら、ハイブリダイゼーションスキームは、本明細書でさらに論じるように、異なる標識原子を異なるSBPに標的化することができるからである。特定の態様では、分岐ヘテロ官能性リンカーのSBPへの非共有結合は、ビオチン-アビジンなどの親和性反応、または一次抗体SBPへの二次抗体の結合を介してもよい。
ヘテロ官能性リンカーは、第一の基と分岐点との間、および/または分岐点と第二の基との間、長いリンカー(例えば、5個、10個、または20個を超える反復サブユニット)を含んでもよい。サブユニットは、例えばポリエチレングリコール(PEG)などの溶解性強化(例えば、極性)サブユニットを含んでもよい。
特定の態様では、SBPは、まず一つ以上のヘテロ官能基リンカーに付着されてもよく、その後、質量タグが付着される。ヘテロ官能性リンカーは、後で付着することができる質量タグによって妨げられない場合に、SBP付着部位により良好にアクセスしてもよい。
質量タグおよび/またはリンカーのコンジュゲーション
様々な適切なコンジュゲーション手段が当該技術分野で既知である。例えば、質量タグは、共有結合(例えば、アミン化学、チオール化学、リン酸化学、酵素反応、レドックス反応(例えば、金属ハロゲン化物)、および親和性中間体(例えば、ストレプトアビジンまたはビオチン)、または歪み促進クリックケミストリまたは金属触媒クリックケミストリなどのクリックケミストリの形態を介して、生物学的活性材料にコンジュゲートされてもよい。特定の態様では、本明細書に記載のコンジュゲーション方法を使用して、たとえばハイブリダイゼーションスキームを使用して、質量タグ付きオリゴヌクレオチドをSBP-オリゴヌクレオチドコンジュゲートと間接的に関連付けるなど、オリゴヌクレオチドをSBPにコンジュゲートしてもよい。
様々な適切なコンジュゲーション手段が当該技術分野で既知である。例えば、質量タグは、共有結合(例えば、アミン化学、チオール化学、リン酸化学、酵素反応、レドックス反応(例えば、金属ハロゲン化物)、および親和性中間体(例えば、ストレプトアビジンまたはビオチン)、または歪み促進クリックケミストリまたは金属触媒クリックケミストリなどのクリックケミストリの形態を介して、生物学的活性材料にコンジュゲートされてもよい。特定の態様では、本明細書に記載のコンジュゲーション方法を使用して、たとえばハイブリダイゼーションスキームを使用して、質量タグ付きオリゴヌクレオチドをSBP-オリゴヌクレオチドコンジュゲートと間接的に関連付けるなど、オリゴヌクレオチドをSBPにコンジュゲートしてもよい。
質量タグは、共有結合(例えば、アミン化学、チオール化学、リン酸化学、酵素反応、または歪み促進クリックケミストリまたは金属触媒クリックケミストリなどのクリックケミストリの形態)を介してなど、生物学的活性材料にコンジュゲートされてもよい。生物学的活性材料は、親和性試薬(抗体またはその断片、アプタマー、レクチンなど)、または内因性標的(例えば、DNAまたはRNA)もしくは中間体(例えば、抗体-オリゴヌクレオチド中間体および/またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションスキーム)にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。本明細書に記載されるように、適切な付着化学は、カルボキシル-アミン反応性化学(例えば、カルボジイミドとの反応など)、アミン反応性化学(例えば、NHSエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィンとの反応など)、スルフヒドリル反応性化学(例えば、マレイミド、ハロアセチル(ブロモ-またはヨード-)、ピリジルジスルフィド、チオスルホン酸塩、ビニルスルホンとの反応など)、アルデヒド反応性化学(例えば、ヒドラジド、アルコキシアミンとの反応など)、ヒドロキシル反応性化学(例えば、イソチオシアネートとの反応など)を含み得る。付着の代替方法としては、歪み促進クリックケミストリ(例えば、DBCO-アジドまたはTCO-テトラジンによる)などのクリックケミストリが挙げられる。
ポリマーは、生物学的活性材料に結合するように官能基化されてもよい。特定の態様では、ポリマーは、チオール反応性化学、アミン反応性化学、またはクリックケミストリを介して官能基化されてもよい。例えば、ポリマーは、チオール反応性のために官能基化されてもよい(例えば、TCEP還元によって、例えば、還元される抗体のFc部分上のチオール基に付着するために、マレイミド基を介して)。コンジュゲーションのタイプ、およびコンジュゲーション条件(例えば、還元剤の濃度)は、SBPの完全性を維持するために、SBPのタイプに基づいて異なっていてもよい。
例えば、ポリマー質量タグ(例えば、金属キレートペンダント基などの複数の金属結合基を含む)は、マレイミドなどのチオール反応性基で官能基化されてもよい。特定の態様では、SBPは、還元され得る(例えば、TCEP還元によって)システインを含み、ポリマーへのコンジュゲーションのためのチオールを提供し得る。しかしながら、SBP上のシステインはアクセスできない場合があり、システインの崩壊は、SBPの親和性を減少させ得るか、または還元ステップは、SBPの親和性を減少させ得る。このような場合、SBP上の他の官能基は、すでにチオールまたはシステインを含むSBP上でさえも、コンジュゲーション前にチオール化されてもよい。例えば、組み換え抗体は、より小さくなる(例えば、立体障害を低減し、それによって結合を改善するため)ように設計されてもよく、したがって、Fc領域上にアクセス可能なシステインを有しない場合がある。このような場合、アミンは、スクシンイミジルアセチルチオアセテートとの反応、続いて、50mMのヒドロキシルアミンまたはヒドラジンによるアセチル基の除去などによって、間接的にチオール化され得る。別の例では、アミンは、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸との反応、その後、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルコンジュゲートをDTTまたはTCEPとの還元によって間接的にチオール化され得る。還元は、チオール化の程度を決定するために使用され得る2-ピリジンチオン発色団を放出する。別の方法として、チオールは、シスタミンとのEDAC媒介反応、その後、DTTまたはTCEPとジスルフィドとの還元によってカルボン酸基に組み込まれ得る。最後に、チオール遊離タンパク質中のトリプトファン残基は、メルカプトトリプトファン残基に酸化されてもよく、次いで、これはヨードアセトアミドまたはマレイミドを含む質量タグにコンジュゲートされてもよい。特定の態様では、チオール化について記載した還元ステップはスキップされてもよく、または還元されたシステインのチオールへのコンジュゲーションに必要とされるものよりも厳格でなくてもよく、その結果、マレイミド官能基化質量タグポリマーは、SBPの還元されたシステインではなく、チオール化部分にコンジュゲートされる。特定の態様では、非ペプチド系SBP(オリゴヌクレオチドなど)は、より弾性であり得、コンジュゲーションは、25mM以上または50mM以上のTCEPまたはDTT濃度での還元を含み得る。特定の態様では、非ペプチド系SBPのコンジュゲーションは、熱または凍結による変性など、より厳しい温度を含み得る。
特定の態様では、SBP(オリゴヌクレオチドまたはペプチドなど)は、ポリマー質量タグのサイズの50%以内など、小さくてもよい。これは、より良好な組織浸透および/または立体障害の低減をもたらすが、フィルタリングステップにおいて質量タグ付きSBPの精製を複雑にし得る。このように、質量タグは、親和性ベースの精製を可能にすることができるエピトープを提示するように修飾されてもよい。特定の態様では、
歪み促進反応などの様々な異なる金属触媒遊離クリックケミストリ反応を、本開示の特定の態様に従って使用することができる。
アジドとのアルキン反応
第一の例は、シクロオクチン誘導体とアジドとの間の歪み促進アジド-アルキン付加環化など、歪みアルキンとアジドとの間の反応である。
第一の例は、シクロオクチン誘導体とアジドとの間の歪み促進アジド-アルキン付加環化など、歪みアルキンとアジドとの間の反応である。
ここで、シクロオクチンとアジドとの反応は、R1およびR2基を共有結合する。アルキン環歪みを考慮して、有機アジドと環状アルキン、典型的にはシクロオクチンとの反応は、歪み促進アジド-アルキン付加環化(SPAAC)として一般的に知られるようになった。本開示の特定の態様では、R1はSBPであってもよく、R2は質量タグであってもよい。別の方法として、R2はSBPであってもよく、R1は質量タグであってもよい。したがって、本開示の一部の実施形態では、方法は、クリックケミストリ反応を使用してSBPを質量タグにコンジュゲートさせることを含み、クリックケミストリ反応は、アジドのアルキンとの反応である。
アジドとのシクロオクチンとの反応は、比較的遅い反応速度論により特徴付けられ、大過剰の試薬と長いインキュベーション時間を必要とする。したがって、より大きな反応性を有するが、反応性に妥協のないシクロアルキン誘導体を使用することができる。これらには、モノフッ素化シクロオクチン(MOFO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、ジベンゾアザシクロオクチン(DIBAC)、ビアリザシクロオクチノン(BRAC)、ビシクロノニン(BCN)、2,3,6,7-テトラメトキシ-DIBO(TMDIBO)、スルホニル化DIBO(S-DIBO)、カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン(COMBO)、ピロロシクロオクチン(PYRROC)を含む。(ジ)ベンゾアヌル化シクロオクチンの強化された反応性は、複数のsp2-ハイブリダイズドカーボンによって与えられる環歪みの増加によって引き起こされることが一般的に理解される。(直接的にまたはリンカーを介して)NHSエステルで誘導体化されたものなど、例えば、SBP上のアミンへのコンジュゲーション(例えば、タンパク質中のリジン、アルギニン、およびヒスチジン(例えば、抗体およびレクチン)の側鎖のアミン基のうちのN末端アミン基、アミノ修飾オリゴヌクレオチドプローブ(特にIDT(IL、USA)、Sigma Aldrich(MO、USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX、USA)から市販の)へのコンジュゲーション、アミノ糖誘導体など)など、本開示では、多くの種類のジベンゾシクロオチン(DBCO)誘導体を使用することができる。別の方法として、DBCO誘導体は、マレイミド(例えば、ジベンゾシクロオクチン-マレイミド、Sigma Aldrich カタログ番号760668、またはジベンゾシクロオクチン-PEG4-マレイミド、Sigma Aldrich カタログ番号760676)で誘導体化されてもよい(直接的にまたはリンカーを介して)。マレイミド官能基を使用して、DBCOを質量タグのスルフヒドリル基に結合することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、アルキンは、環状アルキンであり、例えば、環状アルキンは、8員環の一部である。環状アルキンは、歪み得る。場合によっては、環状アルキンは、3つ以上の環を含むマルチリング構造の一部であり、任意選択的に、マルチリング構造は、少なくとも二つのベンゼン環を含む。一部の実施形態では、環状アルキンはジベンゾシクロオクチン(DBCO)である。
同様に、アジドは、SBPに(直接的にまたはリンカーを介して)、アジド-dPEG8-NHSエステル、アジド-dPEG12-NHSエステルなど(Sigma Aldrichから市販の、それぞれカタログ番号QBD10503およびQBD10505)のNHSエステルで結合され得る。NHSエステルを介して、アジドは、SBP上のアミン(例えば、タンパク質中のリジン、アルギニン、およびヒスチジン(例えば、抗体およびレクチン)の側鎖のアミン基のN末端アミン基)、アミノ修飾オリゴヌクレオチドプローブ(特にIDT(IL、USA)、Sigma Aldrich(MO、USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX、USA)から市販の)へのコンジュゲーション、アミノ糖誘導体など)に結合され得る。別の方法として、アジド修飾されたオリゴヌクレオチド/糖は、直接合成されてもよい(すなわち、アミノ修飾に別個のNHSエステル反応を介してアジド官能基を付着する必要なく)。アジド成分はまた、質量タグに結合されてもよい。例えば、重合のアゾ開始剤は、従来の重合反応で使用され得る。アジド末端ポリメタクリレートはまた、Sigma Aldrichから市販されている。
したがって、本開示の特定の態様は、SPAAC反応を介して質量タグおよびSBPをコンジュゲートすることを含む、質量タグ付きSBPを生成する一連の方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、アルキン官能基化されたSBPおよびアジド官能基化された質量タグを提供するステップと、アルキン官能基化されたSBPをアジド官能基化された質量タグと反応させるステップと、を含み、例えば、アルキン官能基化されたSBPが、歪みシクロアルキン、例えば、DBCOで、官能基化される。一部の実施形態では、方法は、アジド官能基化されたSBPおよびアルキン官能基化された質量タグを提供するステップと、アジド官能基化されたSBPおよびアルキン官能基化された質量タグを反応させるステップと、を含み、例えば、アルキン官能基化された質量タグが、歪みシクロアルキン、例えば、DBCOで、官能基化される。以下に記載されるように、スペーサは、SBPとアルキンまたはアジド、および/または質量タグとアジドまたはアルキンとの間に提示されてもよい。
本開示の特定の態様はまた、質量タグ付きSBPを提供し、SBPおよび質量タグは、アルキンおよびアジド、例えば、DBCOおよびアジドなどの歪みシクロアルキンおよびアジドなどの反応生成物を含むリンカーによって接合される。一部の例では、反応生成物は、銅遊離クリックケミストリ反応などの金属遊離クリックケミストリ反応の生成物である。したがって、本開示の特定の態様は、質量タグ付きSBPを提供し、SBPおよび質量タグはトリアゾールを含むリンカーによって接合される。リンカー中のトリアゾール基は、マルチリング構造の一部であってもよい。特定の態様では、マルチリング構造は、4つ以上のリングを含んでもよい。例えば、マルチリング構造は、3員環、4員環、5員環、6員環、7員環、8員環、9員環、10員環などであってもよい。特定の態様では、マルチリング構造は、二つ以上のベンゼン環を含んでもよい。具体的には、マルチリング構造は、ジベンゾシクロオクテン基を含んでもよい。トリアゾール基およびジベンゾシクロオクテン基は、任意の配向であってもよい。例えば、トリアゾール基は、ジベンゾシクロオクテン基によってSBPから分離されてもよい(したがって、ジベンゾシクロオクテン基は、トリアゾール基によって質量タグから分離されることを意味する)。別の方法として、ジベンゾシクロオクテン基は、トリアゾール基によってSBPから分離されてもよい(したがって、トリアゾール基は、ジベンゾシクロオクテン基によって質量タグから分離されることを意味する)。
以下で説明するように、質量タグは、一つ以上の標識原子を含み、これは、質量検出器において、SBPの標的の存在識別を簡便に可能にする。しかしながら、SBPが、タグ内に既にある標識要素を有する質量タグにコンジュゲートされることはない。場合によっては、一つ以上の金属標識原子が金属キレート部分に装填されて質量タグを形成する前に、SBPが金属キレート部分にコンジュゲートされる。以下でより詳細に説明するように、金属キレート部分は、単一の金属キレート基であってもよく、または金属キレート基が二つ以上のサブユニットに付着されたポリマーであってもよい。
したがって、本開示の特定の態様は、金属キレート部分とSBPとを、SPAAC反応を介してコンジュゲートさせることを含む、金属キレート部分にコンジュゲートされたSBPを作製する一連の方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、アルキン官能基化されたSBPおよびアジド官能基化された金属キレート部分を提供するステップと、アルキン官能基化されたSBPをアジド官能基化された金属キレート部分と反応させるステップと、を含み、例えば、アルキン官能基化されたSBPは、歪みシクロアルキン、例えば、DBCOで官能基化される。一部の実施形態では、方法は、アジド官能基化されたSBPおよびアルキン官能基化された金属キレート部分を提供するステップと、アジド官能基化されたSBPおよびアルキン官能基化された金属キレート部分を反応させるステップと、を含み、例えば、アルキン官能基化された金属キレート部分は、歪みシクロアルキン、例えば、DBCOで官能基化される。以下に記載されるように、スペーサは、SBPとアルキンまたはアジド、および/または金属キレート部分とアジドまたはアルキンとの間に提示されてもよい。
SPAAC反応は、生理学的条件下で行われてもよく、タンパク質(SBPに関するセクションを含む、本明細書の以下に記載されるような抗体、リガンド、受容体、核酸などを含む)などのマクロ生体分子と適合性がある。生理学的条件は、等張溶液または生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの生物学的緩衝液を含み得る。生理学的条件は、別の方法としてまたは追加的に、1℃~42℃、4℃~37℃、4℃~25℃、10℃~37℃、25℃~37℃などの範囲の温度を含み得る。生理学的条件は、中性pH、5.5~8.5のpH、6~8のpH、6.5~7.5のpHなどを含み得る。DBCOとアジドとの間の反応は遅いプロセスであり得るため、比較的長いインキュベーション時間が好ましい場合がある。例えば、ステップb)のコンジュゲーションは、4℃で4~48時間、4℃で10~24時間、4℃で18~20時間、室温で10分~10時間、室温で30分~5時間、室温で30分~3時間、37℃で5分~5時間、37℃で10分~2時間、などの間で行われてもよい。
本開示の特定の態様はまた、前段落に従って方法を実施して、金属キレート部分にコンジュゲートされたSBPを作製することを含み、金属キレート部分、例えばポリマーに金属を装填するステップをさらに含む、質量タグ付きSBPを作製する方法を提供する。
本開示の特定の態様はまた、SBP-金属キレート部分コンジュゲートを提供し、SBPおよび金属キレート部分は、歪みシクロアルキンおよびアジド、例えば、DBCOおよびアジドなどのアルキンおよびアジドの反応生成物を含むリンカーによって接合される。一部の例では、反応生成物は、銅遊離クリックケミストリ反応などの金属遊離クリックケミストリ反応の生成物である。したがって、本開示の特定の態様は、SBP-金属キレート部分コンジュゲートを提供し、SBPおよび金属キレート部分はトリアゾールを含むリンカーによって接合される。リンカー中のトリアゾール基は、マルチリング構造の一部であってもよい。特定の態様では、マルチリング構造は、4つ以上のリングを含んでもよい。例えば、マルチリング構造は、3員環、4員環、5員環、6員環、7員環、8員環、9員環、10員環などであってもよい。特定の態様では、マルチリング構造は、二つ以上のベンゼン環を含んでもよい。具体的には、マルチリング構造は、ジベンゾシクロオクテン基を含んでもよい。トリアゾール基およびジベンゾシクロオクテン基は、任意の配向であってもよい。例えば、トリアゾール基は、ジベンゾシクロオクテン基によってSBPから分離されてもよい(したがって、ジベンゾシクロオクテン基は、トリアゾール基によって金属キレート部分から分離されることを意味する)。別の方法として、ジベンゾシクロオクテン基は、トリアゾール基によってSBPから分離されてもよい(したがって、トリアゾール基は、ジベンゾシクロオクテン基によって金属キレート部分から分離されることを意味する)。
トリアゾール基を含む質量タグ付きSBPは、溶液中で安定的であってもよい。例えば、SBP-質量タグは、最大1週間、1か月、6か月、1年、2年、5年などの間溶液中で安定的であり得る。SBP-質量タグは、-20℃の溶液中(例えば、溶液がグリセロールを含む)、凍結下、4℃、10℃、または室温で安定的であってもよい。SBPが抗体である場合、安定性は抗体親和性によって測定され得る。
一部の例では、クリックケミストリ反応は、金属触媒の非存在下で進行し、特に、クリックケミストリ反応は、銅または鉄の非存在下で進行する。一部の例では、クリックケミストリ反応は、生理学的条件下で行われ、任意選択で、クリックケミストリ反応は、6~8のpHで行われ、例えば、クリックケミストリ反応は、緩衝液中で行われ、例えば、緩衝液は等張性である。
場合によっては、アルキンはSBPに付着し、アジドは質量タグまたは金属キレート部分に付着する。場合によっては、アジドはSBPに付着し、アルキンは質量タグまたは金属キレート部分に付着する。場合によっては、アルキンがSBPに付着する場合、リンカー成分によって付着される(随意にスペーサを介して)。場合によっては、アルキンが質量タグまたは金属キレート部分に付着する場合、リンカー成分によって付着される(随意にスペーサを介して)。場合によっては、アジドがSBPに付着する場合、リンカー成分(任意選択でスペーサを介して)によって付着される。場合によっては、アジドが質量タグまたは金属キレート部分に付着する場合、リンカー成分(任意選択でスペーサを介して)によって付着される。
テトラジンとのアルケン反応
第二の例は、トランス-シクロオクテン誘導体とテトラジンとの間の歪み促進テトラジン-アルケン付加環化など、歪みアルケンとテトラジンとの間の反応である。
第二の例は、トランス-シクロオクテン誘導体とテトラジンとの間の歪み促進テトラジン-アルケン付加環化など、歪みアルケンとテトラジンとの間の反応である。
ここで、トランス-シクロオクテンとテトラジンとの反応は、R1およびR2基を共有結合する。オルキン環歪みを考慮すると、逆電子要請型Diels-Alder付加環化(iEDDA)における有機テトラジンと環状アルケン、典型的にはトランス‐シクロオクテンとの反応。本開示の特定の態様では、R1はSBPであってもよく、R2は質量タグであってもよい。別の方法として、R2はSBPであってもよく、R1は質量タグであってもよい。
三つの異なる可能性のあるテトラジン異性体の中で、1,2,4,5-テトラジンがiEDA反応に使用される。反応の完了は、唯一の副生成物としてN2ガスを放出し、iEDDA反応を不可逆的にし、従来の可逆的なDies-Alder反応よりもバイオ標識化により適したものにする。
トランス-シクロオクテン(TCO)は、現在、この反応における試薬として知られている最も反応性の高い環状アルケンの一つである。SBP(例えばリジン)上のアミンへのコンジュゲーションのためなど、NHSエステルで誘導体化された(直接的にまたはリンカーを介して)ものなど、多くの種類の誘導体が本開示の特定の態様において使用され得る。別の方法として、TCO誘導体は、マレイミド(例えば、タンパク質中のリジン、アルギニン、およびヒスチジン(例えば、抗体およびレクチン)の側鎖のアミン基のN末端アミン基)、アミノ修飾オリゴヌクレオチドプローブ(特に、IDT(IL、USA)、Sigma Aldrich(MO、USA)、Bio-Synthesis Inc.(TX、USA)から市販の)へのコンジュゲーション、アミノ糖誘導体など)と誘導体化(直接的にまたはリンカーを介して)されてもよい。マレイミド官能基を使用して、TCOを質量タグのスルフヒドリル基に結合することができる。トランス-ビシクロ[6.1.0]ノニン誘導体も使用でき、シクロプロピル環上で置換が生じる。TCOよりも迅速ではないが、メチルシクロプロペン、ビシクロ[6.1.0]ノニン、シクロオクチン、およびノルボルネンもテトラジンと反応することができる。
テトラジンは、同様に、NHSエステル(例えば、Sigma Aldrichから市販されている)を用いて(直接的にまたはリンカーを介して)SBPに結合されてもよい。NHSエステルを介して、テトラジンは、SBP上のアミン(例えば、タンパク質中のリジン、アルギニン、およびヒスチジン(例えば、抗体およびレクチン)の側鎖のアミン基のN末端アミン基、アミノ修飾オリゴヌクレオチドプローブ(特に、IDT(IL、USA)、Sigma Aldrich(MO、USA)、Bio-Synthesis,Inc.(TX、USA)から市販されている)へのコンジュゲーション、アミノ糖誘導体など)に結合され得る。テトラジン成分はまた、質量タグに結合されてもよく、例えば、成分はマレイミド官能基も含む。テトラジンには、広く適用されている、6-メチル置換テトラジンと6-水素置換テトラジンの二つの主なタイプがある。メチル置換テトラジンは、水性媒体に溶解した場合でも高い安定性を示すが、一方で、他の任意の生体直交反応対よりも速い反応速度とTCO誘導体とを提供する(約1000M-1s-1)。さらに、それらは幅広い反応条件に耐える。これにより、タンパク質標識などの用途に最適な選択肢となる。一方、水素置換テトラジンは、安定性が低く、苛酷な反応条件に対する耐性が低いが、インビボイメージングのような用途には極めて速い反応速度(最大30000M-1s-1)を提供する。テトラジンは、3-(ベンジルアミノ)-テトラジンであってよい。
したがって、本開示の特定の態様は、質量タグ付きSBPを生成する一連の方法を提供し、この方法は、歪みアルケンとテトラジンとの間の逆電子要請Diels-Alder付加環化反応を介して、質量タグおよびSBPをコンジュゲートすることを含む(これは、N2の除去下でレトロDiels-Alder反応が続く)。一部の実施形態では、方法は、アルケン官能基化されたSBPとテトラジン官能基化された質量タグとを提供するステップと、アルケン官能基化されたSBPをテトラジン官能基化された質量タグと反応させるステップと、を含み、例えば、アルケン官能基化されたSBPが、歪みシクロアルケン、例えばTCOで官能基化される。一部の実施形態では、方法は、テトラジン官能基化されたSBPとアルケン官能基化された質量タグとを提供するステップと、テトラジン官能基化されたSBPとアルケン官能基化された質量タグとを反応させるステップと、を含み、例えば、アルケン官能基化された質量タグが、歪みシクロアルケン、例えばTCOで官能基化される。後述するように、スペーサは、SBPとアルケンもしくはテトラジン、および/または質量タグとテトラジンもしくはアルケンとの間に提示されてもよい。
本開示の特定の態様はまた、質量タグ付きSBPを提供し、SBPおよび質量タグは、歪みシクロアルケンとテトラジン、例えばTCOとテトラジンなどの、アルケンとテトラジンとの反応生成物を含むリンカーによって接合される。一部の例では、反応生成物は、銅遊離クリックケミストリ反応などの金属遊離クリックケミストリ反応の生成物である。したがって、本開示の特定の態様は、質量タグ付きSBPを提供し、SBPおよび質量タグは、ピリダジンを含むリンカーによって接合される。リンカー中のピリダジン基は、マルチリング構造の一部であってもよい。特定の態様では、マルチリング構造は、2つ以上のリングを含んでもよい。例えば、マルチリング構造は、3員環、4員環、5員環、6員環、7員環、8員環、9員環、10員環などであってもよい。特定の態様では、マルチリング構造は、6員環および8員環を含んでもよい。具体的には、マルチリング構造は、シクロオクタン基を含んでもよい。ピリダジン基およびシクロオクタン基は、任意の配向であってもよい。例えば、ピリダジン基は、シクロオクタン基によってSBPから分離されてもよい(したがって、シクロオクタン基は、ピリダジン基によって質量タグから分離されることを意味する)。別の方法として、シクロオクタン基は、ピリダジン基によってSBPから分離されてもよい(したがって、ピリダジン基は、シクロオクタン基によって質量タグから分離されることを意味する)。
SBPおよびSBPとしての小規模な部分
本明細書で使用される場合、SBPは、特異的結合パートナー(または特異的結合対)である。SBPは、親和性(例えば、三次構造)またはハイブリダイゼーションを介してなど、その標的分析物を非共有結合してもよい。したがって、本開示の特定の態様はまた、標識SBPのためのキット、および本明細書に開示されるクリックケミストリによって生成された質量タグ付きSBPのキットも提供し、任意選択で、質量タグ付きSBPと、例えばDNAインターカレータなどの他の標識原子含有試薬を含むキットも提供する。同様に本開示の特定の態様はまた、本開示の質量タグ付きSBPを使用して試料を標識付けする方法を提供し、任意選択的に、複数のそのような質量タグ付きSBPを使用して試料を標識付けする方法であり、例えば、質量タグ付きSBPが、例えば、抗体SBP(複数の抗体SBPを含む)、核酸SBP(複数の核酸SBPを含む)と、レクチン(複数のレクチンを含む)、糖(複数の糖を含む)およびDNAインターカレータ(複数のDNAインターカレータを含む)などの、異なるタイプのSBPを含む。同様に本開示の特定の態様は、試料を標識付けするための複数のそのような質量タグ付きSBPの使用など、試料を標識付けするための本開示の質量タグ付きSBPの使用を含み、例えば、質量タグ付けされたSBPが、例えば、抗体SBP(複数の抗体SBPを含む)、核酸SBP(複数の核酸SBPを含む)、レクチン(複数のレクチンを含む)、糖(複数の糖を含む)およびDNAインターカレータ(複数のDNAインターカレータを含む)などの異なるタイプのSBPを含む。したがって、本開示の特定の態様はまた、本開示の質量タグ付けされたSBPで標識された試料など、任意で、複数のそのような質量タグ付きSBPで標識付けされた試料など、本開示に従って標識付けされた試料も提供し、例えば、質量タグ付きSBPが、例えば、抗体SBP(複数の抗体SBPを含む)、核酸SBP(複数の核酸SBPを含む)、レクチン(複数のレクチンを含む)、糖(複数の糖を含む)およびDNAインターカレータ(複数のDNAインターカレータを含む)など、異なるタイプのSBPを含む。
本明細書で使用される場合、SBPは、特異的結合パートナー(または特異的結合対)である。SBPは、親和性(例えば、三次構造)またはハイブリダイゼーションを介してなど、その標的分析物を非共有結合してもよい。したがって、本開示の特定の態様はまた、標識SBPのためのキット、および本明細書に開示されるクリックケミストリによって生成された質量タグ付きSBPのキットも提供し、任意選択で、質量タグ付きSBPと、例えばDNAインターカレータなどの他の標識原子含有試薬を含むキットも提供する。同様に本開示の特定の態様はまた、本開示の質量タグ付きSBPを使用して試料を標識付けする方法を提供し、任意選択的に、複数のそのような質量タグ付きSBPを使用して試料を標識付けする方法であり、例えば、質量タグ付きSBPが、例えば、抗体SBP(複数の抗体SBPを含む)、核酸SBP(複数の核酸SBPを含む)と、レクチン(複数のレクチンを含む)、糖(複数の糖を含む)およびDNAインターカレータ(複数のDNAインターカレータを含む)などの、異なるタイプのSBPを含む。同様に本開示の特定の態様は、試料を標識付けするための複数のそのような質量タグ付きSBPの使用など、試料を標識付けするための本開示の質量タグ付きSBPの使用を含み、例えば、質量タグ付けされたSBPが、例えば、抗体SBP(複数の抗体SBPを含む)、核酸SBP(複数の核酸SBPを含む)、レクチン(複数のレクチンを含む)、糖(複数の糖を含む)およびDNAインターカレータ(複数のDNAインターカレータを含む)などの異なるタイプのSBPを含む。したがって、本開示の特定の態様はまた、本開示の質量タグ付けされたSBPで標識された試料など、任意で、複数のそのような質量タグ付きSBPで標識付けされた試料など、本開示に従って標識付けされた試料も提供し、例えば、質量タグ付きSBPが、例えば、抗体SBP(複数の抗体SBPを含む)、核酸SBP(複数の核酸SBPを含む)、レクチン(複数のレクチンを含む)、糖(複数の糖を含む)およびDNAインターカレータ(複数のDNAインターカレータを含む)など、異なるタイプのSBPを含む。
特定の態様では、SBPは、抗体(抗体断片または合成抗体など)、核酸アプタマー、および非免疫グロブリンタンパク質(例えば、アビジン)、ペプチド(例えば、核酸または低分子ペプチドもしくは分子などを結合する受容体結合ドメインに結合する亜鉛フィンガなどのタンパク質の結合ドメインとの合致またはそれに由来)、またはそれらの対応する分析物上の誘導体であってもよい。このような場合、SBPは、従来の抗体よりも小さい、小さな部分であってもよい。例えば、小部分SBPは、分子量50未満、30未満、20未満、10未満、または5kDa未満であってもよい。小部分SBPは、本明細書で論じた欠点なしに、より大きな質量タグを可能にし得る。小部分SBPは、例えば、組織のより深い染色を可能にして、細胞または組織により良好に浸透し得る。
異なるSBPは、コンジュゲーション方法および質量タグによって異なって影響を受け得る。このように、本発明の態様は、同じ試料の分析における異なるSBPに対する異なるシグナル増幅方法の使用を含む。異なるSBPは、異なるタイプのSBP(例えば、オリゴヌクレオチド対抗体)、異なる抗体アイソタイプ(IgM、およびIgG1,IgG2a、およびIgG2bなどの異なるアイソタイプ)、または同じSBPタイプであっても異なる標的分析物であってよい。異なるコンジュゲーション方法には、チオール反応性化学を使用してSBPを質量タグにコンジュゲートする場合の異なる還元のストリンジェンシーが含まれる。異なる質量タグは、異なる高感度ポリマーを含む(例えば、異なるキレート基、ポリマーサイズ、ポリマー形状、および/または溶解性強化基の異なる組成物を有する)。例えば、より高いストリンジェンシーコンジュゲーション(例えば、還元)が、より少ない付着部位(例えば、チオール基)を呈するSBPに使用され得る。対象出願のキットは、異なるポリマー構造を有する(例えば、異なる標識原子を有することに加えて)質量タグにコンジュゲートされた複数の異なるSBPを含む。
特定の態様では、異なるSBP(異なる抗体免疫グロブリンクラスを含む)は、異なる質量タグにコンジュゲートされてもよく、または化学的に同一または類似の質量タグに異なる条件下でコンジュゲートされてもよい。例えば、チオール反応性化学を使用する場合、特定の抗体は、還元(例えば、TCEPによる)に対して異なる反応をし得る。このように、複数のSBPは、異なるコンジュゲーションプロトコルによって、同じ質量タグポリマー構造(異なる同位体で潜在的に装填される)にコンジュゲートされてもよい。
質量タグ付けされる小部分SBPは、スピン濾過など、FPLC以外の方法によって精製されてもよい。特定の態様では、SBPに結合された質量タグ(または質量タグの総量)は、SBP自体のサイズの少なくとも20%、30%、50%、または80%であってもよく、これはスピン濾過を可能にし得る。特定の態様では、質量タグ付き抗体は、スピン濾過によって精製されてもよい。
高感度ポリマーを含む質量タグポリマー
対象出願の質量タグは、例えば、金属キレートペンダント基に装填されるか、またはポリマー主鎖に組み込まれる、複数の標識原子を含むポリマーを含む。特定の態様では、質量タグ付きポリマーは、元素組成物または同位体組成物とは別個に提供されてもよい(例えば、質量タグポリマーのキレート剤上に装填され得るか、または質量タグポリマーのキレート剤上に既に装填される)。質量タグ付きポリマーは、抗体またはその断片などの特異的結合パートナー(SBP)に付着されて提供されてもよい。特定の態様では、質量タグポリマーは、10個超、20個超、30個超、50個超、100個超、または200個超の標識原子(例えば、濃縮同位体などの単一の同位体の)を有してもよく、または(キレート化を介して)結合することができる場合がある。高感度ポリマーは、30個超、50個超、100個超、または200個超の標識原子を有してもよく、または結合することができる(例えば、平均して)。
対象出願の質量タグは、例えば、金属キレートペンダント基に装填されるか、またはポリマー主鎖に組み込まれる、複数の標識原子を含むポリマーを含む。特定の態様では、質量タグ付きポリマーは、元素組成物または同位体組成物とは別個に提供されてもよい(例えば、質量タグポリマーのキレート剤上に装填され得るか、または質量タグポリマーのキレート剤上に既に装填される)。質量タグ付きポリマーは、抗体またはその断片などの特異的結合パートナー(SBP)に付着されて提供されてもよい。特定の態様では、質量タグポリマーは、10個超、20個超、30個超、50個超、100個超、または200個超の標識原子(例えば、濃縮同位体などの単一の同位体の)を有してもよく、または(キレート化を介して)結合することができる場合がある。高感度ポリマーは、30個超、50個超、100個超、または200個超の標識原子を有してもよく、または結合することができる(例えば、平均して)。
高感度ポリマーは、直鎖状または分岐状であり得る。分岐ポリマーは、樹状ポリマー(例えば、少なくとも第二、第三、または第四世代の分岐を含む)またはスターポリマー(例えば、中心コアから広がる少なくとも三つの直鎖状ポリマーを含む)であってもよい。
特定の態様では、高感度ポリマーは、金属キレートペンダント基に加えて、キレート剤を有しない溶解性強化ペンダント基(例えば、PEGなどの極性基を有する)を含んでもよい。
多数の(例えば、30個超)標識原子を有する高感度質量タグポリマー(すなわち、高感度ポリマー)は、標的へのSBP結合の立体障害、SBPへの付着不良、低溶解性、および試料または下にある基質への非特異的結合を含む、多くの困難を呈し得る。特定の態様では、多数の標識原子を有する質量タグポリマーは、これらのトレードオフのうちの一つ以上を低減または除去するための化学修飾を有し得る。
特定の態様では、質量タグポリマー中の標識原子の密度は、ポリマーの単一のペンダント基に複数の金属キレート基を結合することによって増加されてもよい。
特定の態様では、高感度ポリマーの流体力学的直径は、20nm未満、15nm未満、10nm未満、5nm未満、3nm未満、または2nm未満など、低くてもよい。流体力学的直径は、1000nm3未満、500nm3未満、100nm3未満、50nm3未満、20nm3未満、または10nm3未満であってもよい。
立体障害を低減するために、高感度ポリマーは、10個超、20個超、30個超、または50個超の化学結合を直線鎖に沿って含むリンカー(標識原子または金属キレートペンダント基を含まない)などの長いリンカーによって、SBPから間隔を置いてもよい。
溶解性強化基(例えば、PEG基などの非イオン性極性基)は、例えば、質量タグポリマーが、このような基の5個超、10個超、または20個超を有するように、ポリマー構造に含まれてもよい。溶解性強化基は、リンカー、ポリマー主鎖、および/またはペンダント基(例えば、金属キレート剤を含む、または金属キレート剤を含まない)などの直線鎖に沿って組織化され得る。
キレート剤自体は、酸または塩基基の添加、配位(例えば、少なくとも6、7または8つの配位部位を有するように)、および/またはキレート基の溶解性強化基(例えば、10個、5個または3個未満の結合を有する)内または近位に、その全体的な電荷バランス(例えば、中性pHの周りに装填されないか、または装填される)に影響を与えるように、修飾され得る。
質量タグポリマーのサイズは、均一であってもよい。例えば、ポリマーは、1.5、1.2、または1.1未満の多分散性指数など、低多分散度を有してもよい。このように、ナノ粒子は、サイズが均一であってもよい(例えば、1.5、1.2、または1.1未満の多分散性指数を有してもよい)。
ポリマーを提供することは、リビング重合によるペンダント基の重合を含み得る。リビング重合では、連鎖停止反応および連鎖移動反応は存在しないか、または最小限であってもよく、連鎖開始の速度は、連鎖伝播の速度よりも速くてもよい。結果として得られるポリマー鎖は、従来の連鎖重合で見られる速度よりも一定速度で成長してもよく、ポリマー長は一定に維持されてもよい(すなわち、本明細書に記載されるように、ポリマー長は低ポリ分散性指数を有する)。対象出願のポリマーを作製するために使用されるリビング重合は、アニオン重合、制御されたラジカル重合(例えば、触媒鎖移動重合、イニファータ媒介重合、安定遊離ラジカル媒介重合(SFRP)、原子移動ラジカル重合(ATRP)、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合、およびヨウ素移動重合)、カチオン重合、および/または開環重合のうちの一つ以上を含み得る。重合ペンダント基は、キレート剤、溶解性補助基(複数可)、またはその両方を含み得る。ポリマーの個々のペンダント基は、キレート剤、溶解性補助基、またはその両方を含み得る。ポリマーのペンダント基は、重合後のキレート剤および/または溶解性補助基(複数可)の添加のために官能基化されてもよい。別の方法としてまたは追加的に、少なくともいくつかのペンダント基は、重合前のキレート剤および/または溶解性補助基を含み得る。
ポリマーは、例えばペグ化ペンダント基などのポリマーの溶解性を支援する(例えば、増加させる)ペンダント基を含んでもよい。例えば、ポリマーは、金属同位体を装填する前および/または後にポリマーの溶解性を支援するペンダント基を含むように修飾されてもよい。ペンダント基には、ペンダント基への金属同位体の装填の前および後にポリマーの溶解性を支援する親水性基が含まれる。そのため、ポリマーの一つ以上のペンダント基は、親水性基の繰り返し鎖(例えば、ポリマーの溶解性を補助する)を含んでもよい。例えば、ペンダント基の調整には、親水性基を含んでもよく、および/または親水性基を含むペンダント基から分離してもよい。親水性基の繰り返し鎖は、ポリマーのペンダント基の調整の配位化学に影響を与えない場合がある。親水性基は、PEG基を含み得る。ポリマーの溶解性を支援(例えば、増加)すると、溶液中の金属同位体の装填を支援(例えば、増加)し得る。
特定の態様では、ペンダント基(例えば、キレート剤および/または溶解性補助基を有する)は、主鎖の重合時に組み込まれてもよい。別の方法としてまたは追加的に、ペンダント基、溶解性補助基(例えば、鎖)、またはその両方は、当技術分野で既知の任意の付着化学によってなど、ポリマー主鎖によって提供される官能基に付着されてもよい。例えば、溶解性補助基を有する(およびキレート剤を含まない)ペンダント基に対するキレート剤を有するペンダント基の比率を得るため、可溶性補助基に対するキレート剤の比をポリマーに添加してもよい。適切な付着化学は、カルボキシル-アミン反応性化学(例えば、カルボジイミドとの反応など)、アミン反応性化学(例えば、NHSエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィンとの反応など)、スルフヒドリル反応性化学(例えば、マレイミド、ハロアセチル(ブロモ-またはヨード-)、ピリジルジスルフィド、チオスルホン酸塩、ビニルスルホンとの反応など)、アルデヒド反応性化学(例えば、ヒドラジド、アルコキシアミンとの反応など)、ヒドロキシル反応性化学(例えば、イソチオシアネートとの反応など)を含み得る。付着の代替方法としては、歪み促進クリックケミストリ(例えば、DBCO-アジドまたはTCO-テトラジンによる)などのクリックケミストリが挙げられる。
ポリマーは、溶解性補助基を含んでもよく、少なくともその一部は鎖で組織化されてもよい。本明細書で使用される場合、溶解性補助基は、金属原子を配位させない場合がある。ポリマーは、溶解性を補助(例えば、増加)するためにペグ化されてもよい。例えば、ポリマーは、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、または少なくとも500個のPEGユニット(例えば、PEG基)を含んでもよい。PEGユニットは、ポリマーの複数のペンダント基がペグ化され得るように、複数のペンダント基にわたって分布され得る。例えば、少なくともいくつかのペンダント基は、5個超、10個超、20個超、30個超、または40個超のPEGユニット(例えば、鎖で組織される)を含んでもよい。ポリマー上のPEGユニットの数は、金属同位体のポリマーへの装填を支援(例えば、増加)し得る。特定の態様では、ポリマーキレートジルコニウムおよび/またはハフニウム上の全てのペンダント基の50%未満、およびポリマー上の全てのペンダント基の50%超は、複数のPEGユニットを含む。例えば、ポリマー上のペンダント基の50%未満であるが40%超などの、60%未満であるが30%超は、キレート剤を含み得る。
特定の態様では、ポリマーのペグ化は、PEGユニットの鎖をポリマーのペンダント基に付着させることを含み得る。鎖は、5個以上、10個以上、20個以上、30個以上、40個以上、または50個以上のPEGユニットを含んでもよい。ペグ化ペンダント基は、キレート剤を含んでもよく、またはキレート剤を含むペンダント基から分離してもよい。キレート剤および溶解性補助基(例えば、PEG)の量、分布、および/または比は、ポリマー上の同位体組成物の装填を支援し得る。例えば、キレート剤および溶解性補助基(例えば、PEG)の量、分布、および/または比は、ポリマー上に装填され得る同位体組成物(例えば、組成物の濃縮同位体)の量の最大化する(例えば、最大値の80%、90%、または95%以内である)ことができる。ポリマーの装填について、本明細書でさらに説明する。
ポリマー(例えば、装填前、装填後、および/または生物学的活性材料へのコンジュゲーション後)は、凝集されない場合がある(例えば、凝集を起こしにくい場合がある)。例えば、90%超、95%超、98%超、99%超、または実質的にすべてのポリマーは、凝集されない場合がある。ポリマーは、同位体組成物を装填されなくてもよく、装填されてもよく、および/または本明細書に記載の生物学的活性材料にコンジュゲートされてもよい。ポリマーは、本明細書に記載の溶液中にあってもよい。例えば、90%超、95%超、98%超、99%超、または実質的にすべてのポリマーは、凝集されない場合がある。キット内に提供されるポリマー(例えば、本明細書に記載される追加構成要素を有する)は、少なくとも1か月、少なくとも3か月、少なくとも6か月、または少なくとも1年間安定し得る。
対象出願のポリマーは、任意の適切な数のペンダント基(例えば、ポリマー主鎖上の反復ユニットに取り付けられる)、例えば、2個、5個、10個、20個、30個、40個、50個、および100個を超えるペンダント基を含み得る。例えば、ポリマーは、2~100、5~80、10~50、または20~40個のペンダント基を含み得る。
方法およびキットは、同位体組成物をポリマー上に装填するための金属装填緩衝液を含み得る。金属装填緩衝液は、対象出願のポリマー上に装填する前に、溶液中の同位体組成物と混合されてもよい。金属装填緩衝液は、酸性溶液(例えば、硝酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、塩酸、および塩素酸のうちの一つ以上などの強酸を含む)であってもよい。同位体組成物は、対象出願のポリマー上に装填するのに適した形態で提供されてもよい。別の方法としてまたは追加的に、装填緩衝液は、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩(例えば、酢酸アルカリ)、および/または炭酸塩または重炭酸塩などの別のアルカリと対の酢酸塩を含み得る。いくつかの態様では、金属は、ポリマーのキレート基をすべて飽和しないように、例えば、ポリマーの溶解性を改善するため、および/またはバックグラウンドまたはSBP結合への影響を減少させるために、装填されてもよい。
ポリマー用キレート剤
本明細書で使用される場合、キレート剤は、金属原子を一緒に配位(例えば、安定的に配位)するリガンドの群を指す。キレート剤は、ポリマーのペンダント基上に存在してもよく、および/またはポリマー主鎖に組み込まれてもよい。特定の態様では、キレート剤はポリマーのペンダント基に含まれる。
本明細書で使用される場合、キレート剤は、金属原子を一緒に配位(例えば、安定的に配位)するリガンドの群を指す。キレート剤は、ポリマーのペンダント基上に存在してもよく、および/またはポリマー主鎖に組み込まれてもよい。特定の態様では、キレート剤はポリマーのペンダント基に含まれる。
特定の態様では、ポリマーは、ヒドロキサマート(本明細書ではヒドロキサミン酸と交換可能に使用される)、アザマクロサイクル、フェノキシアミン、サロフェン、シクラム、および/またはその誘導体(複数可)などのリガンドを含む、一つ以上のペンダント基を含み得る。ポリマーは、ヒドロキサマート、アザマクロサイクル、フェノキシアミン、サルフェン、またはシクラムを含む、当該技術分野で既知のキレート剤、またはその誘導体を含んでもよい。特定の態様では、対象出願のキレート剤は、ジルコニウムまたはハフニウム原子上の6個以上の部位、6個超の部位、または8個の部位を配位することができる。例えば、キレート剤は、ジルコニウムまたはハフニウムのうちの少なくとも一つとオクタ配位錯体を形成し得る。例えば、ジルコニウムおよびハフニウムのうちの少なくとも一つは、ポリマーのペンダント基とのオクタ配位錯体を形成してもよい。
特定の態様では、ポリマーのキレート剤は、DFOおよび/またはその誘導体中などのヒドロキサマート基を含む。別の方法としてまたは追加的に、ポリマーは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)キレート剤またはその誘導体などのアザマクロサイクルを含んでもよい。特定の実施形態では、キレート剤は、DOTAM、DOTP、およびDOTA(例えば、ジルコニウムまたはハフニウム同位体と別々に装填されるか、または別々に提供される)のうちの一つを含み得る。特定の態様では、キレート剤は、DOTAと比較して、ジルコニウムまたはハフニウムの結合が改善された(および潜在的にはランタニドへの結合が低減された)DOTA誘導体である。例えば、DOTA誘導体は、ジルコニウムおよび/またはハフニウム原子上の8つの光景を配位してもよく、任意に、ジルコニウムおよび/またはハフニウムを結合(例えば、安定的結合)するのを補助するリガンド間の間隔を置くことを含んでもよい。例えば、DOTA誘導体は、ランタニド同位体と比較して、ジルコニウムおよび/またはハフニウムへの結合を増加させた可能性がある。
ポリマー上のナノ粒子およびナノ粒子合成
ナノメートルスケールの金属クラスターなどの金属ナノ粒子は、高密度の標識原子を提供するが、多くの欠点を有する。SBPへの付着のための不活性表面を有するナノ粒子の官能基化は、些細ではなく、通常、SBPに対する複数の付着部位をもたらす。小さなナノ粒子(例えば、10nm未満または5nm未満)の合成は困難であり、立体障害、溶解性不良、コロイド安定性不良(凝集)、および非特異的結合をもたらす。金属クラスターナノ粒子の合成は困難であり得る(例えば、高温を必要とし、合成条件に敏感であり得る)。ナノ粒子は、サイズが均一ではない場合がある。
ナノメートルスケールの金属クラスターなどの金属ナノ粒子は、高密度の標識原子を提供するが、多くの欠点を有する。SBPへの付着のための不活性表面を有するナノ粒子の官能基化は、些細ではなく、通常、SBPに対する複数の付着部位をもたらす。小さなナノ粒子(例えば、10nm未満または5nm未満)の合成は困難であり、立体障害、溶解性不良、コロイド安定性不良(凝集)、および非特異的結合をもたらす。金属クラスターナノ粒子の合成は困難であり得る(例えば、高温を必要とし、合成条件に敏感であり得る)。ナノ粒子は、サイズが均一ではない場合がある。
特定の態様では、金属ナノ粒子は、有機安定剤などの安定剤の存在下で、中程度の温度(例えば、100℃未満、50℃未満、または37℃未満)で合成されてもよい。例えば、金属ナノ粒子は、量子ドットであってもよい。特定の態様では、有機安定剤は、システインなどのチオール基を含み得る。
特定の態様では、安定剤は、キャッピング剤として作用し得る。安定剤はポリマー上にあってもよく、ナノ粒子はポリマー上で合成されてもよい。ポリマーのサイズは、ナノ粒子のサイズを制限(例えば、制御)してもよい。粒子は、安定剤の複数の例を提示する直線部分または分岐部分を含み得る。粒子は、ポリマー(ポリマー上で合成されたナノ粒子を含む)を単一のSBPに付着させるための付着基をさらに含み得る。質量タグは、1.5、1.2、または1.1未満の多分散性指数など、低多分散度を有してもよい。このように、ナノ粒子は、サイズが均一であってもよい(例えば、1.5、1.2、または1.1未満の多分散性指数を有してもよい)。ナノ粒子の大部分は、1~10nm、1~5nm、1~3nm、1~2nm、2~5nm、2~3nmの間の直径など、小さな直径を有し得る。ナノ粒子は、カドミウムまたはテルリウムなどの複数の同位体を有する要素のものである場合があるが、同位体の非天然組成物(カドミウムまたはテルリウムの濃縮同位体など)を有してもよい。ナノ粒子は、単分散であってもよい。特定の態様では、ポリマーは複数のナノ粒子を含んでもよい。特定の態様では、ポリマー上のナノ粒子成長の播種速度は、成長速度よりも遅くてもよい。ナノ粒子の急速な成長は、ポリマーが他のポリマー上で成長するナノ粒子と会合しないように、ポリマー上の安定化基を消費し得る。ポリマーは分散されて、成長する際に同じナノ粒子と会合する複数のポリマーの速度を減少させてもよい。特定の態様では、予め形成された(予め播種された)ナノ粒子は、ポリマー上のナノ粒子の成長前にポリマーと混合されてもよい。特定の態様では、ポリマーは、10~10000個の間、10~1000個の間、10~100個の間、10~50個の間、20~500個の間、または20~100個の間の安定剤の例を有し得る。特定の態様では、ポリマーは、10個未満、または単に安定剤の単一の例を有するだけでもよく、溶液中に存在する安定剤は、ポリマー上のナノ粒子成長を可能にし得る。ポリマーに対する同じまたは異なる安定剤が、ポリマー上のナノ粒子の合成中に溶液中に提供されてもよい。
前述したように、小さなカドミウム(CdSe、CdS、およびCdTe)ナノ粒子は、チオールアルコールまたはチオール酸安定剤の存在下で形成され得る。システイン安定化単分散CdsSナノ粒子の合成は、このようなナノ粒子を播種してもよい。大型ポリ(システイン)ポリマー上の金ナノ粒子の合成および会合は、金ナノ粒子の安定剤またはキャッピング剤として作用する均一なサイズ、単分散、またはシステインを示すことなく報告されている。注目すべきことに、これらのナノ粒子の合成は、中程度の温度で実施された。
態様は、濃縮同位体を含み、ポリシステインポリマーなどのチオール提示ポリマー上で合成されたCdまたはCdTeナノ粒子、およびSBPの質量タグとしてのかかるナノ粒子の使用を含む。特定の態様では、SBP自体は、チオール基(例えば、還元抗体によって提示される)などの安定化剤を提供してもよく、ナノ粒子は、SBP上で直接合成されてもよい。チオール基がSBPの結合部位の近位でない場合、直接合成により、ナノ粒子が結合と立体的に干渉しないようにすることができる。
シグナル増幅のためのハイブリダイゼーションスキーム
質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに直接的または間接的にハイブリダイズされてもよい。例えば、一つ以上の中間オリゴヌクレオチドは、複数の質量タグ付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、それによってシグナルを増幅することができる足場を提供し得る。したがって、対象出願の態様は、ハイブリダイゼーションベースのシグナル増幅のためのオリゴヌクレオチドを含む。
質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに直接的または間接的にハイブリダイズされてもよい。例えば、一つ以上の中間オリゴヌクレオチドは、複数の質量タグ付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、それによってシグナルを増幅することができる足場を提供し得る。したがって、対象出願の態様は、ハイブリダイゼーションベースのシグナル増幅のためのオリゴヌクレオチドを含む。
標的オリゴヌクレオチドは、細胞に内在するDNAまたはRNA分子(コードRNA、低分子干渉RNA、またはマイクロRNAなど)であってもよい。標的オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよい。標的オリゴヌクレオチドは、既知の特異的配列(または既知の特異的配列との相同性)を有してもよい。特定の態様では、抗体またはその誘導体などのSBPは、既知の配列を含む合成一本鎖DNAオリゴヌクレオチドなど、標的オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。このような場合、抗体およびオリゴヌクレオチドの両方は、SBPと呼ばれてもよい。
試料中の分析物へのSBPの結合後、複数の質量タグ付けオリゴヌクレオチドは、直接的または間接的に、第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。ハイブリダイゼーションは、分岐または直線であってもよい。特定の態様では、ポリメラーゼは、鋳型に沿って第一のオリゴヌクレオチドを延長して、追加のハイブリダイゼーション部位を提供し得る。質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、単一の標識原子を含んでもよく、または複数の標識原子を含むポリマーを含んでもよい。質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド自体の化学構造中に、重金属原子などの標識原子を含み得る。
特定の態様では、質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される高感度ポリマーまたはナノ粒子で質量タグ付けされてもよい。
大質量タグ粒子
直観とは対照的に、大質量タグ粒子(例えば、50nm超、100nm超、200nm超、500nm超、または1umの直径)は、より小さな粒子(例えば、ナノ粒子)質量タグと比較して、低減されたバックグラウンドおよび/またはSBP結合の崩壊をもたらし得る。
直観とは対照的に、大質量タグ粒子(例えば、50nm超、100nm超、200nm超、500nm超、または1umの直径)は、より小さな粒子(例えば、ナノ粒子)質量タグと比較して、低減されたバックグラウンドおよび/またはSBP結合の崩壊をもたらし得る。
例えば、質量タグの試料または下にある基質への非特異的(および非共有)結合は、除去された非結合タグに質量タグを洗浄することによって加えられる力と比較して、より大きな質量タグ粒子において減少され得る。具体的には、非特異的結合は、粒子の表面積でスケールされてもよく、一方、質量タグの活性洗浄下での非特異的結合を破壊する力は、質量タグの重量(増加した粒子直径で表面積と指数関数的に比較してスケールする)でよりスケールされてもよい。
さらに、SBPは、質量タグに結合する複数の基(例えば、複数のチオール基を提示する還元抗体など)を呈してもよく、粒子質量タグは、複数のSBP付着基を提供し得る。より小さな質量タグ粒子(例えば、10nm未満、50nm未満、または100nm未満)は、こうしたSBPと架橋され得る。比較すると、より大質量タグ粒子(例えば、200nm超、500nm超、または1um)は、SBP上の付着基の大部分に結合してもよく、および/または他の大質量タグ粒子の立体障害を介して同じSBP分子への結合を防止してもよい。
大質量タグ粒子は、大きなナノ粒子、分岐もしくは超分岐ポリマー、または金属キレート基を含むマトリクス、または金属原子を封入するポリマー(ポリスチレンなど)などのコロイド状金属クラスター(例えば、表面被覆/SBPへの結合のためにキャップおよび官能基化された表面を有する)を含み得る。
ブロッキング試薬
ブロッキング試薬(すなわち、一つ以上のブロッキング試薬)を使用して、質量タグ付きSBPの非特異的結合を防止してもよい。ブロッキング試薬は、懸濁液中の細胞などの細胞試料、またはスライド上の組織切片などの固体支持体上の細胞試料に添加することができる。質量タグ付きSBPは、ブロッキング試薬の添加後、および/またはブロッキング試薬との混合物で、細胞試料に添加されてもよい。特定の態様では、使用されるブロッキング試薬の濃度(例えば、モル濃度)は、質量タグ付きSBPの過剰(少なくとも5、10、20、50または100倍の量など)であってもよい。本明細書に記載されるように、質量タグポリマー(および特に高感度ポリマー)は、何らかのバックグラウンド(例えば、標的分析物を発現しない細胞上のシグナル、および/またはエッジ効果およびpunctiなどの人工的特徴など)を有してもよい。
ブロッキング試薬(すなわち、一つ以上のブロッキング試薬)を使用して、質量タグ付きSBPの非特異的結合を防止してもよい。ブロッキング試薬は、懸濁液中の細胞などの細胞試料、またはスライド上の組織切片などの固体支持体上の細胞試料に添加することができる。質量タグ付きSBPは、ブロッキング試薬の添加後、および/またはブロッキング試薬との混合物で、細胞試料に添加されてもよい。特定の態様では、使用されるブロッキング試薬の濃度(例えば、モル濃度)は、質量タグ付きSBPの過剰(少なくとも5、10、20、50または100倍の量など)であってもよい。本明細書に記載されるように、質量タグポリマー(および特に高感度ポリマー)は、何らかのバックグラウンド(例えば、標的分析物を発現しない細胞上のシグナル、および/またはエッジ効果およびpunctiなどの人工的特徴など)を有してもよい。
従来的なブロッキング試薬には、血清(例えば、BSA)、ゼラチン、マイク(またはカゼインタンパク質)、多くの場合、1%超またはさらに5%超の濃度の緩衝液が含まれる。別の方法として、または一つ以上の従来のブロッキング試薬に加えて、一つ以上のポリマーブロッキング試薬(例えば、SBPにコンジュゲートされていない)を使用してもよい。ポリマーブロッキング試薬は、直鎖状または分岐状のポリマーであってもよく、極性溶解性強化基および/または荷電基を含んでもよい。ポリマーブロッキング試薬は、本明細書に記載される高感度ポリマーでタグ付けされたSBPの非特異的結合を防止するために有用であり得る。例えば、高感度ポリマー(例えば、平均で30個を超える標識原子を有する)は、組織スライドの表面(例えば、ガラス表面)などへの標識原子が少ないポリマーと比較して、非特異的結合を増加させ得る。
特定の態様では、ポリマーブロッキング試薬は、SBPに付着された質量タグと同一または類似のポリマー主鎖を含んでもよく、および/またはDOTA、DTPA、EDTAおよび/もしくはその誘導体などの金属キレート基(例えば、BSAなどの従来のブロッキング試薬に加えて)を有してもよい。ポリマーブロッキング試薬は、例えば、任意の生体分子に結合されていないか、あるいは非特異的生体分子(オリゴヌクレオチドランダマーなど)、または標的分析物(BSAなど)に特異的にタグ付けしないタンパク質に結合された、SBPに結合されていないポリマー質量タグであってもよい。ポリマー質量タグブロッキング試薬は、任意のSBPの標識原子として使用されない金属同位体、例えば、検出範囲外の同位体、または細胞に既に内因性である金属同位体を装填することができる。金属同位体を有するポリマー質量タグの装填は、SBPの質量タグと化学的に類似させ、質量タグ付きSBPと類似した様式で非特異的に結合させ得る。ポリマー質量タグによるブロッキングは、質量タグ付きSBPの非特異的結合を低減し得る。特定の態様では、ポリマー質量タグブロッキング試薬の分布(例えば、IMCによって画素にわたって質量タグポリマー上に装填された金属の質量チャネルを測定することによって決定される)を使用して、質量タグ付きSBPの報告量を減少させてもよい。例えば、質量タグ付きSBPからのシグナルは、ポリマー質量タグブロッキング試薬からのシグナルに対して正規化されてもよい。
特定の態様では、ポリマーブロッキング試薬は、キレート基を含まない荷電ポリマーなどの親水性ポリマーを含み得る。親水性ポリマーは、極性または荷電官能基を含有し、水に可溶性である。このセクションでは、ほとんどの親水性ポリマーは、その構造の化学的性質によってグループ化される。例えば、アクリルは、アクリル酸、アクリルアミド、およびマレイン酸無水ポリマーおよびコポリマーを含む。アミン官能性ポリマーには、アリルアミン、エチレンイミン、オキサゾリン、およびそれらの主鎖または側鎖にアミン基を含有する他のポリマーが含まれる。
特定の態様では、荷電ポリマーは、複数の負電荷基(および任意に正味負電荷)、複数の正電荷基(および任意に正味正電荷)を有してもよく、または双性イオン性(例えば、互いの20、10、5、3または2つの結合内などの近接で、中性pHで、強い酸/塩基基などの正電荷基および負電荷基の両方を有する)、および任意に正味中性電荷を有してもよい。双性イオンポリマーは、正電荷と負電荷の両方のサブユニットのコポリマーであってもよく、一つ以上のアクリルモノマーを有してもよい。双性イオンポリマーは、ポリアンホリートまたはポリベタインであってもよい。双性イオンポリマーは、例えば、アンモニオリン酸塩(ホスホベタインまたはレシチン類似体)、アンモニオホスホネート(ホスホノベテイン)、アンモニオホスフィナート(ホスフィノベテイン)、アンモニオスルホン酸塩(スルホベタイン、例えばスフロベタインメタクリレート)、アンモニア硫酸塩、アンモニオカルボン酸塩(カルボ-またはカルボキシベタイン)、アンモニオスルホンアミド、アンモニ-スルホン-イミド、グアニジンカルボン酸塩(アスパラギン類似体)、ピリジニオカルボン酸塩、アンモニオ(アルコキシ)ジシアノエテノール酸塩、アンモニオボロン酸塩、スルホニオカルボン酸塩、ホスホニオスルホン酸塩、ホスホニオカルボン酸塩、オキシピリジンベタインなどの双性イオン基を含み得る。
適切な親水性ポリマーとしては、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)およびポリアクリルアミド(PAM)、ポリ(2-オキサゾリン)およびポリエチルエニミン(PEI)、ポリ(アクリル酸)、ポリメタクリレートおよびその他のアクリルポリマー、ポリ(エチレングリコール)およびポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)およびコポリマー、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)およびコポリマー、高分子電解質および/またはその誘導体が挙げられ得る。Sigmaなどのプロバイダは、このような親水性ポリマーの広範なカタログを提供している。
こうしたポリマーは、フリーラジカル重合(FRP)、ステップ成長、および/または環開放メタセシス重合(ROMP)を含む、複数の重合技術によって合成されてもよい。重合は、異なるモノマーの交互の組み込みを可能にし得る。ポリマーブロッキング試薬は、塩または溶液として提供されてもよい。
荷電ポリマーは、ポリマー質量タグと類似の化学特性を有し得る。例えば、ポリマー質量タグのキレート基は、金属と非結合のときに負電荷を有してもよく、および/または金属を装填したときにわずかな正電荷を有してもよい。金属を装填されたポリマー質量タグは、金属を装填された各キレート基を有しない場合がある(例えば、装填効率は100%未満、例えば90%未満、80%未満、または70%未満であり得る)。このように、金属を装填されたポリマー質量タグは、荷電基を有してもよく、双性イオンであってもよい。このように、荷電ポリマーブロッキング試薬は、特定のポリマー質量タグがそうでなければ非特異的に結合するであろう、試料上の表面(例えば、特定のクラスの生体分子および/または試料自体の支持)を遮断し得る。荷電ポリマーブロッキング試薬は、10重量%、5重量%、1重量%、0.5重量%、または0.1%未満などの低濃度で使用され得る。
本明細書で使用されるブロッキング試薬は、質量タグ付きSBPの非特異的結合を50%超、75%超、または90%超減少させ得る。非特異的結合の減少は、同じ質量タグ付きSBPで二つの連続組織切片を染色することによって決定されてもよく、一つの切片のみがブロックされ、質量タグ付きSBPからのシグナルが低減される領域の評価である。別の方法としてまたは追加的に、非特異的結合が特徴的なパターン(エッジ効果またはスポッティングなど)を有する場合、非特異的結合の減少は、パターンの発生および/または強度の減少として評価され得る。
特定の態様では、キットは、質量タグ(例えば、任意でSBPに付着される)および本明細書に記載のポリマーブロッキング試薬を含み得る。
特定の態様では、金属ナノ粒子(例えば、本明細書で論じるように)は、質量タグとして使用されてもよく、本明細書で論じるポリマーブロッキング試薬で遮断(例えば、不動態化)されてもよい。ナノ粒子は、シリカ被覆されたランタニド、または非ランタニド金属酸化物ナノ粒子などの非ランタニドナノ粒子であってもよい。金属ナノ粒子質量タグ(例えば、固体金属クラスターを有する金属ナノ粒子)の課題は、SBPの付着のための表面官能基化、試料への非特異的結合、SBPの非特異的吸着(抗体またはその誘導体など)、溶解性不良および/または単分散性を含み得る。本明細書に記載のポリマーブロッキング試薬による金属ナノ粒子質量タグの被覆は、これらの特性のうちの一つ以上を緩和し得る。ポリマーブロッキング試薬は、表面官能基化の前に、表面官能基化中に(例えば、ポリマーブロッキング試薬は、付着基を含む分子と架橋されてもよく、またはそれ自体が、SBPの付着のための基を含んでもよい)、表面官能基化後(例えば、金属クラスタコアの露出した任意の残留表面を遮断することと)、SBPの付着前(例えば、SBPの非特異的吸着を低減するため)、および/またはSBPの付着後に(例えば、試料への非特異的結合を低減すること)、ナノ粒子に添加されてもよい。
二次親和性SBPとの組合せ
例えば、異なる種由来の一次抗体に対する異なる二次抗体は、複数の標的分析物に対するシグナル増幅を可能にし得る。二次抗体は、一次抗体のFc部分に複数の部位を結合してもよい。別の方法として、二次SBPは、一次SBP上で使用される発蛍光団または他のタグに結合してもよい。
例えば、異なる種由来の一次抗体に対する異なる二次抗体は、複数の標的分析物に対するシグナル増幅を可能にし得る。二次抗体は、一次抗体のFc部分に複数の部位を結合してもよい。別の方法として、二次SBPは、一次SBP上で使用される発蛍光団または他のタグに結合してもよい。
本明細書で論じるように、シグナル増幅方法は、抗体などの特定のSBPの異なるタイプであっても、異なるSBPに対して異なって作用し得る。そのため、二次的SBPは、シグナル増幅法のために調製され(またはシグナル増幅法で使用され)、検証され(例えば、低バックグラウンドおよび強いシグナルを決定するため)、その後、(例えば、異なる実験にわたって)様々な異なる一次的SBP分析物を検出するために使用されてもよい。
ビオチン-アビジンは、二次的親和性として使用され得る。例えば、ストレプトアビジンに結合した一次SBPは、ビオチン化質量タグの付着のために4つの部位を提供する。ビオチンおよびアビジンの誘導体は、対象出願の範囲内である。
酵素沈着との組合せ
特定の態様では、SBPは、HRPなどの酵素とコンジュゲートされてもよい。質量タグポリマー(例えば、高感度ポリマー)などの本明細書に記載される質量タグは、酵素によって不溶化される、および/または酵素によって修飾されて生物学的試料に結合する水溶性基質にコンジュゲートされてもよい。特定の態様では、酵素的切断は、基質を不溶性にし、関連する質量タグの沈着をもたらし得る。適切な酵素としては、オキシド-レダクターゼ酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)、ホスファターゼ(例えば、アルカリホスファターゼ)、ラクタマーゼ(例えば、ベータ-ラクタマーゼ)、およびガラクトシダーゼ(例えば、ベータ-D-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ)が挙げられる。HRP基質には、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)、2,2’-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸](ABTS)、o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)、およびそれらの誘導体が含まれる。AP基質には、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)、および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、および/またはp-ニトロフェニルリン酸(NPPP)およびその誘導体が含まれる。グルコース酸化酵素基質には、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)が含まれる。ベータ-ガラクトシダーゼ基質には、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-ベータ-D-ガラクトピラノシド(BCIGまたはX-Gal)が含まれる。例えば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)またはその誘導体であってもよく、基質は、チラミド部分またはその誘導体、例えば金属キレートチラミド部分であってもよい。例えば、基質は、ランタニドまたはその同位体などの金属に結合されたチラミド部分およびキレート剤(DTPA、DOTAまたはその誘導体など)を含むチラミド誘導体であってもよい。酵素は、ベータ-ガラクトシダーゼ(ベータルGal)、アルカリホスファターゼ(AP)、および/またはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)であってもよい。特定の態様では、酵素は不活性化されてもよく、その後、同じ酵素を有する新しいSBPを使用して、異なる質量タグを沈着させてもよい(例えば、異なる標識原子を有する)。
特定の態様では、SBPは、HRPなどの酵素とコンジュゲートされてもよい。質量タグポリマー(例えば、高感度ポリマー)などの本明細書に記載される質量タグは、酵素によって不溶化される、および/または酵素によって修飾されて生物学的試料に結合する水溶性基質にコンジュゲートされてもよい。特定の態様では、酵素的切断は、基質を不溶性にし、関連する質量タグの沈着をもたらし得る。適切な酵素としては、オキシド-レダクターゼ酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)、ホスファターゼ(例えば、アルカリホスファターゼ)、ラクタマーゼ(例えば、ベータ-ラクタマーゼ)、およびガラクトシダーゼ(例えば、ベータ-D-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ)が挙げられる。HRP基質には、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)、2,2’-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸](ABTS)、o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)、およびそれらの誘導体が含まれる。AP基質には、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)、および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、および/またはp-ニトロフェニルリン酸(NPPP)およびその誘導体が含まれる。グルコース酸化酵素基質には、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)が含まれる。ベータ-ガラクトシダーゼ基質には、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-ベータ-D-ガラクトピラノシド(BCIGまたはX-Gal)が含まれる。例えば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)またはその誘導体であってもよく、基質は、チラミド部分またはその誘導体、例えば金属キレートチラミド部分であってもよい。例えば、基質は、ランタニドまたはその同位体などの金属に結合されたチラミド部分およびキレート剤(DTPA、DOTAまたはその誘導体など)を含むチラミド誘導体であってもよい。酵素は、ベータ-ガラクトシダーゼ(ベータルGal)、アルカリホスファターゼ(AP)、および/またはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)であってもよい。特定の態様では、酵素は不活性化されてもよく、その後、同じ酵素を有する新しいSBPを使用して、異なる質量タグを沈着させてもよい(例えば、異なる標識原子を有する)。
基質は、基質(例えば、基質のDTPAまたはDOTAキレート剤)上に装填される金属とは別個に提供されてもよい。別の方法として、基質は、金属を予め装填されて提供されてもよい。
特定の態様では、金属キレート(例えば、DTPAまたはDOTA修飾)チラミド誘導体などの基質は、凝集体(例えば、組織試料が載置される細胞または基質に非特異的に付着する、および/または酵素による沈着を防止する)を形成し得る。こうした凝集体は、チラミド誘導体の複数の例が、チラミド誘導体の複数の例にわたって金属を部分的に配位する場合に形成され得る。このように、基質は、凝集体が、基質を対応する酵素でタグ付けされた試料に付与する前に(例えば、1日未満前、4時間未満前、2時間未満前、1時間未満前、または30分未満前)除去されるように、濾過されてもよい。チラミド誘導体は、1kDa未満であってもよいが、フィルタは、50kDa以上のフィルタであってもよい。
別の方法としてまたは追加的に、金属(例えば、ランタニド)またはその同位体は、対応する酵素でタグ付けされた試料に基質を付与する前に(例えば、1日未満前、4時間未満前、2時間未満前、1時間未満前、または30分未満前)、基質(例えば、基質のDTPAまたはDOTAなどのキレート剤)に装填されてもよい。
特定の態様では、触媒(すなわち、エンハンサー)は、沈着の速度および/または範囲を増加させるために基質と共に添加されてもよい。特定の態様では、停止試薬を添加して(例えば、洗浄緩衝液中で)、制御された様式で酵素による基質の沈着を終了させてもよい。触媒および/または停止試薬の使用は、シグナル強調を改善するために、および/または標的のより良好な定量を提供するために、反応の範囲のさらなる制御を提供し得る。特定の態様では、酵素の別の例が、異なる標的と関連付けら得るように停止試薬または別の試薬は、酵素を不活化し、異なる金属(例えば、ランタニド)またはその同位体を含む基質が付与されてもよい。このように、酵素的沈着は、基質を異なる金属(例えば、ランタニド)またはその同位体で連続的に沈着することによって、複数の異なる標的に対して実施され得る。
例えば、チラミド誘導体のHRP沈着のための触媒は、ラジカル形成の速度を増加させ得る(例えば、電子メディエーターであってもよい)。例えば、6-ヒドロキシベンゾトリアゾール、p-ヨードフェノールなどのヨードフェノール、p-クーマル酸などのクーマル酸は、G.H.G.ソープおよびL.J.Kricka、Methods Enzymol.1986;133:331、米国特許第4,279,950号のaromatic amines、欧州特許出願第603953号(1994)のacetanilides、米国特許第5,171,668号のthe indophenols and phenothiazines N-substituted and indophenols、米国特許第5,629,168号に置き換えられたboronic acidsに記載されている。かかるメディエーターは、例えば、米国特許第7,803,573号にchemiluminescentについて記載されている。特定の態様では、触媒は、ホウ酸塩(過ホウ酸塩またはイソボレートなど)、酢酸緩衝剤および/またはスルホン酸塩のうちの一つ以上を含む緩衝溶液中に付与され得る。
特定の態様では、例えば、触媒HRP沈着の5分未満、または3分未満(例えば、室温でまたはより高い温度で)など、(例えば、上記の触媒強化反応の数分以内の使用のために)停止試薬が提供されてもよい。停止試薬は、HRPを一時的または永久的に不活化するのに充分な量で過酸化水素などの過酸化物を含んでもよい。別の方法としてまたは追加的に、停止試薬は、アジドなどのラジカル形成をクエンチする成分を含んでもよい。別の方法としてまたは追加的に、マイクロ波処理、温度上昇(例えば、摂氏60度超などの、摂氏50度超)、または低pH(例えば、pH4未満)などの条件を適用して、HRPを一時的または永久的に不活化してもよい。特定の態様では、停止試薬は、洗浄緩衝液中に付与されてもよく、および/または1分以上インキュベートされてもよい。特定の態様では、HRPにコンジュゲートされた別のSBPは、反応停止後に付与されてもよく、異なるチラミド誘導体質量タグが、異なる標的と連続的に関連付けられている多重化反応を可能にする。一つ以上の酵素ベースの質量タグの沈着の後、複数の異なる質量タグ付きSBPを用いた多重染色および同時染色ステップを実施することができる。次いで、試料は、LA-ICP-MSまたはSIMSなどのイメージング質量分析によって分析されてもよい。
特定の態様では、多重化は、HRPにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、抗体などのSBPにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドに直接的または間接的にハイブリダイズすることによってもよい。これにより、HRPを標的と関連付け、新しい質量タグ付きチラミドを沈着し、不活化し、次いで新しいオリゴヌクレオチド-HRPコンジュゲートで反復することが矢継ぎ早に可能となる。こうしたシステムでは、複数のオリゴヌクレオチド-SBPを、試料に同時より早く付与してもよい。ハイブリダイゼーションを介した標的とのHRPの関連付けは、抗体染色よりも速くてもよく、連続的な不活化工程後の試料に対する損傷に敏感でない場合がある。
したがって、酵素的沈着のためのキットは、例えばチラミドまたはその誘導体などの基質、ならびに例えばランタニドまたはその同位体などの金属を含み得る。金属は、基質上に予め装填されてもよく、または基質上に装填するために別々に提供されてもよい。特定の態様では、キットは、質量タグチラミド誘導体を提供してもよく、上述の触媒試薬、停止試薬、緩衝液、および/またはフィルタをさらに含み得る。キットはさらに、本明細書のその他の実施形態で論じた追加の構成要素を含んでもよい。
二重タグ付け
イメージングマスサイトメトリーのためのシグナル増幅は、蛍光タグ付けと組み合わせてもよく、蛍光顕微鏡による関心領域の識別および/または蛍光画像のマスサイトメトリー画像との共同登録を可能にする。特定の態様では、SBPは、本明細書に記載されるように質量タグ付けされ、フルオロフォアタグにも付着され得る。こうした二重タグ付けは、SBP上の同じ付着基に付着された同じリンカーを介してもよい。
イメージングマスサイトメトリーのためのシグナル増幅は、蛍光タグ付けと組み合わせてもよく、蛍光顕微鏡による関心領域の識別および/または蛍光画像のマスサイトメトリー画像との共同登録を可能にする。特定の態様では、SBPは、本明細書に記載されるように質量タグ付けされ、フルオロフォアタグにも付着され得る。こうした二重タグ付けは、SBP上の同じ付着基に付着された同じリンカーを介してもよい。
単一分子検出
特定の態様では、シグナル増幅は、一度に単一のSBPの検出を可能にし得る。例えば、高感度、高分解能、および速い速度の画素取得を提供するイメージングマスサイトメトリー機器は、シグナル増幅試薬および/または本明細書に記載の方法で質量タグ付けされた単一のSBPの検出を可能にし得る。このように、シグナル増幅質量タグは、標的多重化の劇的な増加を可能にする同位体の標的バーコード(固有の組み合わせ)を含んでもよい。同位体の組み合わせは、混合物において天然には生じない少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5つの異なる同位体を含み得る。例えば、20個の異なる同位体中6個の固有の組み合わせを有する標的バーコード付き質量タグは、20個が6個(38,760)の固有のバーコードを選択することを可能にし、それらのうちのいずれか一つを使用して、異なるSBPにタグを付けることができる。さらに、標的バーコード付きSBPは、同位体の異なる比に基づいて区別され得る。特定の態様では、標的バーコード付き質量タグは、共に、同位体の固有の組み合わせを提供する質量タグ付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションスキームであってもよい。
特定の態様では、シグナル増幅は、一度に単一のSBPの検出を可能にし得る。例えば、高感度、高分解能、および速い速度の画素取得を提供するイメージングマスサイトメトリー機器は、シグナル増幅試薬および/または本明細書に記載の方法で質量タグ付けされた単一のSBPの検出を可能にし得る。このように、シグナル増幅質量タグは、標的多重化の劇的な増加を可能にする同位体の標的バーコード(固有の組み合わせ)を含んでもよい。同位体の組み合わせは、混合物において天然には生じない少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5つの異なる同位体を含み得る。例えば、20個の異なる同位体中6個の固有の組み合わせを有する標的バーコード付き質量タグは、20個が6個(38,760)の固有のバーコードを選択することを可能にし、それらのうちのいずれか一つを使用して、異なるSBPにタグを付けることができる。さらに、標的バーコード付きSBPは、同位体の異なる比に基づいて区別され得る。特定の態様では、標的バーコード付き質量タグは、共に、同位体の固有の組み合わせを提供する質量タグ付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションスキームであってもよい。
キット
マスサイトメトリーのためのキットは、本明細書に記載される一つ以上の試薬を含み得る。上述の構成要素の任意の組み合わせは、キット内に提供されてもよい。キットには、質量タグ(例えば、ポリマーアスタグ)、同位体組成物、同位体組成物を装填されたポリマー、別々に提供されるポリマーおよび同位体組成物、または同位体組成物を装填され、抗体にコンジュゲートされたポリマーが含まれ得る。
マスサイトメトリーのためのキットは、本明細書に記載される一つ以上の試薬を含み得る。上述の構成要素の任意の組み合わせは、キット内に提供されてもよい。キットには、質量タグ(例えば、ポリマーアスタグ)、同位体組成物、同位体組成物を装填されたポリマー、別々に提供されるポリマーおよび同位体組成物、または同位体組成物を装填され、抗体にコンジュゲートされたポリマーが含まれ得る。
キットは、ポリマー上に同位体組成物を装填する、および/または装填されたポリマーを生物学的活性材料に結合するための任意の追加構成要素(例えば、緩衝液、フィルタなど)をさらに含み得る。別の方法として、または追加的に、キットは、緩衝液、標準、細胞バーコード、および/または異なる質量の重原子を含む試薬(例えば、生物学的に活性な材料に付着された、または生物学的に活性な材料に付着するために提供される質量タグ)などのマスサイトメトリーのための追加の試薬を含み得る。
キットは、上述の同位体組成物とは別個の、かつ区別可能な(例えば、異なる質量の濃縮同位体を有する)追加の同位体組成物を含んでもよい。追加の同位体組成物は、ジルコニウム、ハフニウム、および/またはランタニド同位体を含んでもよい。例えば、キットは、ランタニドをキレートする(例えば、安定的にキレートする)が、ジルコニウムまたはハフニウムではない、複数のペンダント基を含む追加のポリマーをさらに含み得る。特定の態様では、キットは、別個の同位体組成物を装填されたポリマーに共有結合した複数の抗体(例えば、異なる標的に対する)を含み得る。かかる抗体の集まりは、単一のパネルで一緒に提供されてもよい。パネルは、溶液中、または10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満の質量の水分を含む凍結乾燥混合物中に提供されてもよい。
Claims (39)
- 少なくとも一つの標的分析物のシグナル増幅を有するマスサイトメトリーの方法であって、
細胞試料中の標的分析物を結合するSBPと前記細胞試料を接触させることと、
100個超の標識原子をSBPによって結合された標的分析物と関連付けることによってシグナルを増幅することと、
質量分析によって前記標識原子を検出することと、を含む、方法。 - 前記標識原子のバックグラウンドが10%未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記SBPが質量タグにコンジュゲートされる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記質量タグが、金属キレート金属基を含むポリマー質量タグである、請求項3に記載の方法。
- 前記質量タグが、高感度ポリマーであり、前記高感度ポリマーが、30個超の標識原子を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記質量タグがナノ粒子質量タグである、請求項3に記載の方法。
- 前記ナノ粒子質量タグがポリマーブロッキング試薬で不動態化される、請求項6に記載の方法。
- 複数の質量タグが、分岐ヘテロ官能性リンカーを介してSBPに付着される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記質量タグが、30個未満の標識原子に結合される、または結合することができる低分子量質量タグポリマーである、請求項8に記載の方法。
- 前記分岐ヘテロ官能性リンカーが、クリックケミストリによってSBPまたは質量タグに付着される、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞試料をポリマーブロッキング試薬で遮断することをさらに含み、前記ポリマーブロッキング試薬がSBPにコンジュゲートされない、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマーブロッキング試薬が、金属を装填されたキレート基を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記ポリマーブロッキング試薬が、正電荷基および/または負電荷基を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記SBPが小部分SBPである、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- シグナル増幅がハイブリダイゼーションスキームを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- シグナル増幅が、一本鎖オリゴヌクレオチドへの質量タグ付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを直接的または間接的に含む、請求項15に記載の方法。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記標的分析物に結合された抗体またはその誘導体にコンジュゲートされた一本鎖DNAオリゴヌクレオチドである、請求項16に記載の方法。
- 5つ超の異なる標的分析物に対するシグナル増幅をさらに含み、異なる標的分析物と関連付けられた前記標識原子が、質量分析によって区別可能である、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的分析物のうちの少なくとも一つがタンパク質である、請求項18に記載の方法。
- 前記標的分析物のうちの少なくとも一つが、オリゴヌクレオチドである、請求項18または19に記載の方法。
- 同じ標的分析物を結合する複数のSBPが、同じ大質量タグ粒子にコンジュゲートされる、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~21のいずれか一項に記載の方法を実施するためのシグナル増幅キット。
- マスサイトメトリーのためのシグナル増幅キットであって、
30個超の標識原子を含むか、または30個超の標識原子を結合することができる質量タグを含み、
前記質量タグが、SBPに付着されるか、またはSBPへの付着のために官能化される、シグナル増幅キット。 - 分岐ヘテロ官能性リンカーをさらに含む、請求項23に記載のキット。
- 前記分岐ヘテロ官能性リンカーが、前記質量タグへの付着のためのクリックケミストリ基の複数の例を含む、請求項24に記載のキット。
- 複数の質量タグが、分岐ヘテロ官能性リンカーによってSBPの同じ付着部位に付着される、請求項24または25に記載のキット。
- ポリマーブロッキング試薬をさらに含む、請求項23~26のいずれか一項に記載のキット。
- 前記質量タグがSBPに付着される、請求項23~27のいずれか一項に記載のキット。
- 前記質量タグの複数の例が、分岐ヘテロ官能性リンカーを介して、一つの付着部位で前記SBPに付着される、請求項23~28のいずれか一項に記載のキット。
- 前記質量タグが、金属キレート基を含む高感度ポリマーである、請求項23~29のいずれか一項に記載のキット。
- 同位体組成物をさらに含む、請求項23~30のいずれか一項に記載のキット。
- 前記同位体組成物が、同位体的に濃縮される、請求項31に記載のキット。
- 前記同位体組成物が、前記質量タグ上に装填され得る、請求項31または32に記載のキット。
- 前記同位体組成物が、前記質量タグ上に装填される、請求項31または32に記載のキット。
- 前記質量タグが、SBPに付着される、請求項34に記載のキット。
- ハイブリダイゼーションベースのシグナル増幅のためのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項23~35のいずれか一項に記載のキット。
- シグナル増幅用SBPを調製する方法であって、
前記SBP上の一つ以上の付着部位に分岐ヘテロ官能性リンカーを付着することと、
複数の質量タグを前記分岐ヘテロ官能性リンカーに付着させることと、を含み、
前記分岐ヘテロ官能性リンカーの前記SBPへの付着が、前記分岐ヘテロ官能性リンカーへの前記質量タグの付着とは異なる手段による、方法。 - 前記分岐ヘテロ官能性リンカーの前記SBPまたは前記質量タグへの付着が、クリックケミストリによるものである、請求項37に記載の方法。
- 前記質量タグが、少なくとも30個の標識原子を含む高感度ポリマーである、請求項37に記載の方法。
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