KR20220117277A - 질량 세포분석 시약 및 신호 증폭 방법 - Google Patents
질량 세포분석 시약 및 신호 증폭 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220117277A KR20220117277A KR1020227024128A KR20227024128A KR20220117277A KR 20220117277 A KR20220117277 A KR 20220117277A KR 1020227024128 A KR1020227024128 A KR 1020227024128A KR 20227024128 A KR20227024128 A KR 20227024128A KR 20220117277 A KR20220117277 A KR 20220117277A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sbp
- mass
- mass tag
- polymer
- tag
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 238000012083 mass cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 39
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 206
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 79
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 79
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 45
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 38
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 claims 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 73
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 60
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 37
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 36
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 23
- DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N Tetrazine Chemical compound C1=CN=NN=N1 DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 20
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 20
- ZUHQCDZJPTXVCU-UHFFFAOYSA-N C1#CCCC2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 Chemical compound C1#CCCC2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZUHQCDZJPTXVCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 19
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 18
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 15
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 14
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 14
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 14
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 14
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 14
- URYYVOIYTNXXBN-OWOJBTEDSA-N trans-cyclooctene Chemical compound C1CCC\C=C\CC1 URYYVOIYTNXXBN-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 12
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 12
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 12
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910052735 hafnium Inorganic materials 0.000 description 11
- VBJZVLUMGGDVMO-UHFFFAOYSA-N hafnium atom Chemical compound [Hf] VBJZVLUMGGDVMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 11
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 11
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 10
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 10
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 10
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 6
- ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N cyclooctyne Chemical class C1CCCC#CCC1 ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N pyridazine Chemical compound C1=CC=NN=C1 PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 4
- 150000004905 tetrazines Chemical class 0.000 description 4
- STNZNCWQNMGRIM-UHFFFAOYSA-N 2-benzyl-1,4,7,10-tetrakis-(4-methylphenyl)sulfonyl-1,4,7,10-tetrazacyclododecane Chemical group C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N1CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)CC(CC=2C=CC=CC=2)N(S(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)CC1 STNZNCWQNMGRIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 3
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 150000001925 cycloalkenes Chemical class 0.000 description 3
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 3
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 3
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 3
- 238000000095 laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ZJJAWGLRWHRNGC-UHFFFAOYSA-N 1,2-dimethoxy-1-azacyclooct-7-yne Chemical compound COC1CCCCC#CN1OC ZJJAWGLRWHRNGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MDAXKAUIABOHTD-UHFFFAOYSA-N 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane Chemical compound C1CNCCNCCCNCCNC1 MDAXKAUIABOHTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GKSFVIWCGXWBRG-UHFFFAOYSA-N 2-(5,6-didehydro-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[8]annulen-1-yl)acetic acid Chemical compound C1#CCCCCC2=C1C=CC=C2CC(=O)O GKSFVIWCGXWBRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IELMMGIVWJNLEX-UHFFFAOYSA-N 3,3-difluorocyclooctyne Chemical compound FC1(F)CCCCCC#C1 IELMMGIVWJNLEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical compound NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910004613 CdTe Inorganic materials 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 125000005262 alkoxyamine group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000010560 atom transfer radical polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002336 glycosamine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- UOKZUTXLHRTLFH-UHFFFAOYSA-N o-phenylhydroxylamine Chemical compound NOC1=CC=CC=C1 UOKZUTXLHRTLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000007152 ring opening metathesis polymerisation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 2
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 2
- GWIKYPMLNBTJHR-UHFFFAOYSA-M thiosulfonate group Chemical group S(=S)(=O)[O-] GWIKYPMLNBTJHR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABTDBGOGTZYEND-JTQLQIEISA-N (2s)-3-(1h-indol-3-yl)-2-(sulfanylamino)propanoic acid Chemical group C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)O)NS)=CNC2=C1 ABTDBGOGTZYEND-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTJMXYRLEDBSLT-UHFFFAOYSA-N 1,2,4,5-tetrazine Chemical compound C1=NN=CN=N1 HTJMXYRLEDBSLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHDPRTQPPWIEJG-UHFFFAOYSA-N 1-methylcyclopropene Chemical compound CC1=CC1 SHDPRTQPPWIEJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 2-Oxazoline Chemical compound C1CN=CO1 IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQIHLPGWBOBPSG-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7,10-tris(2-amino-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetamide Chemical compound NC(=O)CN1CCN(CC(N)=O)CCN(CC(N)=O)CCN(CC(N)=O)CC1 FQIHLPGWBOBPSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GTACSIONMHMRPD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(benzenesulfonamido)ethylsulfanyl]-2,6-difluorophenoxy]acetamide Chemical compound C1=C(F)C(OCC(=O)N)=C(F)C=C1SCCNS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 GTACSIONMHMRPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVOVSXGZALWAFS-UHFFFAOYSA-N 3,6,10,13,16,19-hexazabicyclo[6.6.6]icosane Chemical compound C1NCCNCC2CNCCNCC1CNCCNC2 NVOVSXGZALWAFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 4-Hydroxycinnamate Natural products OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 description 1
- VSMDINRNYYEDRN-UHFFFAOYSA-N 4-iodophenol Chemical compound OC1=CC=C(I)C=C1 VSMDINRNYYEDRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 4-nitrophenyl phosphate(2-) Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N Acetovanillone Natural products COC1=CC(C(C)=O)=CC=C1O DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710130081 Aspergillopepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031007 Cytosolic non-specific dipeptidase Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000078511 Microtome Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJOFOAGOORYPLM-UHFFFAOYSA-N N-benzyl-2H-tetrazin-3-amine Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)NN1NN=CC=N1 SJOFOAGOORYPLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVMWIXWOIGJRGE-UHFFFAOYSA-N NP(O)=O Chemical compound NP(O)=O BVMWIXWOIGJRGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSTJTERVFDMVOD-UHFFFAOYSA-N OS(P)(=O)=O Chemical compound OS(P)(=O)=O MSTJTERVFDMVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XRICQUGWKQNRNJ-UHFFFAOYSA-N [2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)acetyl]sulfanyl acetate Chemical compound CC(=O)OSC(=O)CN1C(=O)CCC1=O XRICQUGWKQNRNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001413 acetanilide Drugs 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- LDPIQRWHBLWKPR-UHFFFAOYSA-N aminoboronic acid Chemical compound NB(O)O LDPIQRWHBLWKPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000010539 anionic addition polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 125000000656 azaniumyl group Chemical group [H][N+]([H])([H])[*] 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 125000005620 boronic acid group Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N carbonothioic O,S-acid Chemical compound OC(S)=O HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010538 cationic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012711 chain transfer polymerization Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- UVSNFZAOYHOOJO-UHFFFAOYSA-N chembl1343456 Chemical compound OC1=CC=C2N=NNC2=C1 UVSNFZAOYHOOJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N chloric acid Chemical compound OCl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005991 chloric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- WJTCGQSWYFHTAC-UHFFFAOYSA-N cyclooctane Chemical group C1CCCCCCC1 WJTCGQSWYFHTAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004914 cyclooctane Substances 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- NHFQNAGPXIVKND-UHFFFAOYSA-N dbco-maleimide Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O NHFQNAGPXIVKND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVFZXPZWVJMYPX-UHFFFAOYSA-N dbco-peg4--maleimide Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCNC(=O)CCOCCOCCOCCOCCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O VVFZXPZWVJMYPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- BJAJDJDODCWPNS-UHFFFAOYSA-N dotp Chemical compound O=C1N2CCOC2=NC2=C1SC=C2 BJAJDJDODCWPNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000004993 emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229920001002 functional polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071870 hydroiodic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920000587 hyperbranched polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 238000012308 immunohistochemistry method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000000613 inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000013033 iniferter Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001871 ion mobility spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000000370 laser capture micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 238000010550 living polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001507 metal halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000005309 metal halides Chemical class 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- JFNLZVQOOSMTJK-KNVOCYPGSA-N norbornene Chemical compound C1[C@@H]2CC[C@H]1C=C2 JFNLZVQOOSMTJK-KNVOCYPGSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002990 phenothiazines Chemical class 0.000 description 1
- MEUIIHOXOWVKNP-UHFFFAOYSA-N phosphanylformic acid Chemical compound OC(P)=O MEUIIHOXOWVKNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical compound NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 description 1
- 108010077051 polycysteine Proteins 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- FBBHPHRBJLLIFM-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium-1-carboxylate Chemical compound [O-]C(=O)[N+]1=CC=CC=C1 FBBHPHRBJLLIFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007151 ring opening polymerisation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000001518 sector field mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008137 solubility enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical compound NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N sulfamide Chemical compound NS(N)(=O)=O NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1429—Signal processing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/02—Details
- H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
- H01J49/0459—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components for solid samples
- H01J49/0463—Desorption by laser or particle beam, followed by ionisation as a separate step
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/02—Details
- H01J49/10—Ion sources; Ion guns
- H01J49/105—Ion sources; Ion guns using high-frequency excitation, e.g. microwave excitation, Inductively Coupled Plasma [ICP]
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Signal Processing (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measurement Of Radiation (AREA)
Abstract
영상 질량 세포분석에서 신호를 개선하기 위한 시약 및 방법이 본원에 기술된다. 양태는 다수의 표지 원자를 갖는 질량 태그, 배경을 감소시키고/시키거나 질량 태그된 특이적 결합 파트너(SBP)의 표적 결합을 유지하기 위한 질량 태그 및 추가 시약에 대한 화학적 변형, 및 복수의 질량 태그를 단일 SBP와 결합시키기 위한 체계를 포함한다. 이와 같이, 구현예는 하나 이상의 시약의 임의의 조합 및 이들의 용도를 포함한다. 본원의 시약, 키트, 및 방법은 영상 질량 세포분석을 포함하는 질량 세포분석에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 시약, 키트, 또는 방법은, 예를 들어 치료적 용도 또는 방사선 측정 검출을 위해, 다수의 방사성 동위원소를 표적 분석물에 전달하는 데 사용될 수 있다. 소정의 양태에서, 비-방사성 동위원소만이 질량 세포분석에 사용될 수 있다.
Description
영상 질량 세포분석(IMC)을 포함하여, 질량 세포분석은 질량 분광분석에 의한 질량 태그의 검출을 통해 표적 분석물의 고도로 다중화된 검출을 가능하게 한다. 질량 태그는 일반적으로 항체와 같은 특이적 결합 파트너(SBP)를 통해 표적 분석물과 연관된다. 질량 태그는 다른 질량 태그의 질량 표지 원자와 구별되는 표지 원자(예를 들어 풍부한 동위원소와 같은 단일 동위원소)의 하나 이상의 사본을 가질 수 있다. 표지 원자는 세포에 대해 내인성이 아닌 금속 동위원소일 수 있다.
대부분의 표지 원자는 공간 전하 효과 및 내인성 원자로부터 표지 원자의 분리와 같은 다양한 고려 사항으로 인해 질량 검출의 상류에서 소실될 수 있다. 이와 같이, 많은 질량 태그를 SBP와 연결하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 중합체 및/또는 나노입자 질량 태그는 배경 및 SBP의 결합에 영향을 미치는 다수의 독특한 공격(challenge)을 나타내는데, 이는 형광 기반 태그와 같은 다른 태그의 경우에는 없는 고려사항이다.
도 1은 표적 분석물의 발현에 대한 양성 세포와 음성 세포 간의 신호를 비교함으로써 배경에 대한 신호를 보여준다.
도 2는 IMC 이미지에서 에지 효과로서 표현된 비특이적 결합을 보여준다.
도 2는 IMC 이미지에서 에지 효과로서 표현된 비특이적 결합을 보여준다.
영상 질량 세포분석에서 신호를 개선하기 위한 시약 및 방법이 본원에 기술된다. 양태는 다수의 표지 원자를 갖는 질량 태그, 배경을 감소시키고/시키거나 질량 태그된 특이적 결합 파트너(SBP)의 표적 결합을 유지하기 위한 질량 태그 및 추가 시약에 대한 화학적 변형, 및 복수의 질량 태그를 단일 SBP와 결합시키기 위한 체계를 포함한다. 이와 같이, 구현예는 하나 이상의 시약의 임의의 조합 및 이들의 용도를 포함한다.
본원의 시약, 키트, 및 방법은 영상 질량 세포분석을 포함하는 질량 세포분석에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 시약, 키트, 또는 방법은, 예를 들어 치료적 용도 또는 방사선 측정 검출을 위해, 다수의 방사성 동위원소를 표적 분석물에 전달하는 데 사용될 수 있다. 소정의 양태에서, 비-방사성 동위원소만이 질량 세포분석에 사용될 수 있다.
질량 세포분석
본원에서 사용되는 바와 같이, 질량 세포분석은 생물학적 샘플에서 질량 태그를 검출하는 임의의 방법, 예컨대 단일 세포 해상도로 복수의 구별 가능한 질량 태그를 동시에 검출하는 방법이다. 질량 세포분석은 현탁 질량 세포분석 및 영상화 질량 세포분석(IMC)을 포함한다. 질량 세포분석은 레이저 방사, 이온 빔 방사, 전자 빔 방사, 및/또는 유도 결합식 플라즈마(ICP) 중 하나 이상에 의해 세포 샘플의 질량 태그를 분무하고 이온화할 수 있다. 질량 세포분석은 예컨대 비행 시간(TOF) 또는 자기 섹터 질량 분광분석(MS)에 의해, 단일 세포로부터 구별되는 질량 태그를 동시에 검출할 수 있다. 질량 세포분석의 예는, 세포를 흘려넣는 현탁 질량 세포분석, 및 예를 들어 레이저 용발(LA-ICP-MS)에 의해 또는 일차 이온 빔(예를 들어 SIMS의 경우)에 의해 세포 샘플(예를 들어 조직 절편)이 샘플링되는 ICP-MS 및 이미징 질량 세포분석을 포함한다.
질량 태그는 원소 분석 전에 샘플링되고, 분무되고, 이온화될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 질량 태그는 레이저 빔, 이온 빔, 또는 전자 빔과 같은 방사선에 의해 샘플링, 분무, 및/또는 이온화될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 질량 태그는 유도 결합 플라즈마(ICP)와 같은 플라즈마에 의해 분무되고 이온화될 수 있다. 현탁 질량 세포분석에서, 질량 태그를 포함하는 전체 세포를 ICP-TOF-MS와 같은 ICP-MS 내로 흘려넣을 수 있다. 영상 질량 세포분석에서, 방사선의 한 형태는 조직 샘플과 같이 질량 태그를 포함하는 고형 생물학적 샘플의 일부분(예를 들어 픽셀, 관심 영역)을 제거(및 임의로 이온화 및 분무)할 수 있다. IMC의 예는 질량 태그된 샘플의 LA-ICP-MS 및 SIMS-MS를 포함한다. 소정의 양태에서, 이온 광학장치는 질량 태그의 동위원소 이외의 이온을 고갈시킬 수 있다. 예를 들어, 이온 광학장치는 더 가벼운 이온(예를 들어 C, N, O)인 유기 분자 이온을 제거할 수 있다. ICP 응용에서, 이온 광학장치는 예컨대 고역 통과 사중극자 필터를 통해 Ar 및/또는 Xe와 같은 가스를 제거할 수 있다. 소정의 양태에서, IMC는 질량 태그(예: 질량 태그와 결합된 표적)의 이미지를 세포 해상도 또는 준세포 해상도로 제공할 수 있다.
형광 면역조직화학 방법과 유사하게, (영상 질량 세포분석을 포함하여) 질량 세포분석 워크플로우는 항체 및/또는 다른 특이적 결합 파트너로 염색하기 전에 세포(예: 조직)를 고정하고/하거나 투과화하는 것을 포함할 수 있다. 형광 방법과 대조적으로, 질량 세포분석에서 (예를 들어 세포에 내인성이 아닌 중금속을 포함하는) 질량 태그는 항체와 같은 특이적 결합 파트너를 통해 표적 분석물과 결합된다. 형광 현미경과 같은 영상 질량 세포분석은 항원 회수 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 샘플은 열과 같은 조건에 노출되어 표적 분석물이 SBP에 의해 결합되도록 노출된다. 결합되지 않은 SBP는 일반적으로 질량 분광분석에 의한 질량 태그의 검출 전에 세척을 통해 제거된다. 참고로, 원소 분석(예를 들어 방출 분광법 또는 X-선 분산 분광법)과 같은 다른 검출 방법 또한 본 출원의 범주에 포함된다.
질량 세포분석을 위한 추가 시약은 (예를 들어 저산소증, 단백질 합성, 세포 주기, 및/또는 세포 사멸과 같은 조건 하에서 침착되거나 결합되는) 금속 함유 바이오센서(들) 및/또는 화학적 성질에 기초하여 구조(예를 들어 DNA, 세포막, 층)에 결합하는 금속 함유 조직화학 화합물(들)을 포함한다. 추가로, 질량 태그(예를 들어 본 출원의 질량 태그 또는 다른 질량 태그)는 조합되어 고유한 바코드를 제공하여, 특정 샘플 또는 실험 조건을 다른 샘플 또는 실험 조건과 풀링하기 전에 표지할수 있다.
IMC에서, 조직 샘플은 예를 들어 1~10 μm 범위 이내의 두께를 갖는 절편일 수 있고, 예컨대 2~6 μm가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 수지-포매된 조직 블록으로부터 절단된 샘플과 같이 500 nm, 200 nm, 100 nm, 또는 50 nm 두께 미만의 초박형 절편이 사용될 수 있다. 이러한 절편을 준비하기 위한 기술은, 예를 들어, 탈수 단계, 고정, 포매, 투과화, 절편화 등을 포함하는 마이크로톰을 사용하는 IHC 분야에서 잘 알려져 있다. 따라서, 조직이 화학적으로 고정될 수 있고, 그런 다음 원하는 평면에서 절편이 제조될 수 있다. 동결 절단 또는 레이저 포획 미세 절개가 조직 샘플을 제조하는 데 사용될 수도 있다. 샘플은 예를 들어, 시약이 세포내 표적을 표지할 수 있도록 투과화될 수 있다. (예를 들어 가열에 의해) 항원을 회수한 후에도, SBP가 분석물에 접근하는 것은 입체적으로 방해될 수 있다. 이와 같이, SBP가 표적 분석물에 접근하는 것은 더 작은 SBP 및 소정의 질량 태그를 통해 가장 잘 허용될 수 있다.
RNA를 검출하기 위해, 본원에서 논의된 것과 같은 생물학적 샘플 내의 세포를 제조하여 본원에서 기술된 방법 및 장치를 사용하여 RNA 및 단백질 함량의 분석할 수 있다. 소정의 양태에서, 세포는 혼성화 단계 전에 고정되고 투과화된다. 세포는 고정된 및/또는 투과화된 상태로 제공될 수 있다. 세포는 포름알데히드, 글루타르알데히드와 같은 가교 고정제에 의해 고정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 세포는 에탄올, 메탄올 또는 아세톤과 같은 침전 고정제를 사용하여 고정될 수 있다. 세포는 세제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, Triton X-100), 폴리옥시에틸렌 (20), 소르비탄 모노라우레이트(Tween-20), 사포닌(양친매성 글리코시드 군), 또는 메탄올 또는 아세톤과 같은 화학물질에 의해 투과화될 수 있다. 소정의 경우에, 고정 및 투과화는 동일한 시약 또는 시약 세트로 수행될 수 있다. 고정 및 투과화 기술은 Jamur 등의 문헌["Permeabilization of Cell Membranes" (Methods Mol. Biol., 2010)]에서 논의되었다.
신호 증폭
질량 세포분석의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 신호 증폭은 30개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 200개 초과, 또는 500개 초과의 표지 원자(예를 들어 풍부한 동위원소)와 표적 분석물(즉, 특정 결합 파트너에 의해 결합된 표적 분석물의 단일 사례)을 결합시키는 것이다. 소정의 양태에서, 표지 원자는 란탄족 또는 전이 금속과 같은 중금속일 수 있다. 소정의 양태에서, 신호 증폭은 2, 5, 10 또는 20개 초과의 표적 분석물에 대해 수행될 수 있다. 소정의 양태에서, 신호 증폭은 SBP에 대한 질량 태그의 분지형 접합, 고감도 중합체, 대형 질량 태그 입자, 질량 태그 나노입자, 및/또는 혼성화 체계의 사용을 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 신호 증폭은 질량 태그 중합체를 사용한다.
본원에 기술된 바와 같이, 신호 증폭은 매우 많은 수의 표지 원자를 포함하는 질량 태그의 사용에 의해 및/또는 단일 표적 분석물과 더 많은 수의 질량 태그의 결합에 의한 (예를 들어 혼성화 기반 신호 증폭 및/또는 분지형 이종기능성 링커를 통한 SBP에 대한 질량 태그의 접합을 통한) 것일 수 있다. 소정의 양태에서, 단일 질량 태그는 30, 50, 100, 200, 500, 또는 1000개 초과의 표지 원자를 가질 수 있다. 소정의 양태에서, 질량 태그의 유체역학적 직경은 20 nm 미만, 15 nm 미만, 10 nm 미만, 5 nm 미만, 3 nm 미만, 또는 2 nm 미만과 같이 작을 수 있다. 유체역학적 직경은 1000 nm3 미만, 500 nm3 미만, 100 nm3 미만, 50 nm3 미만, 20 nm3 미만, 또는 10 nm3 미만일 수 있다. EM과 같은 기술을 사용해 크기를 식별할 수 있고, 광 산란을 사용해 본원에 기술된 질량 태그, 예컨대 더 큰 질량 태그의 유체 역학적 직경을 식별할 수 있다. 또한, 크기 배제 및 이온 교환(예: 음이온-교환) 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 방법을 사용하여 본원에 기술된 보다 질량 태그, 예컨대 더 작은 질량 태그의 특성을 분석할 수 있다.
신호 증폭에서의 초기 시도는 비특이적 결합(예: 높은 배경) 및 표적 분석물에 대한 SBP의 결합 파괴를 초래하였다. 질량 태그는 비특이적 결합을 초래할 수 있는데, 이는 중합체의 낮은 용해도, 생물분자 또는 슬라이드의 표면에 대한 중합체의 비특이적 결합, 및/또는 질량 태그에 결합된 SBP의 입체 장애로 인한 것일 수 있다. 이러한 문제는 (예를 들어 많은 수의 표지 원자를 가진) 더 큰 질량 태그의 경우 및/또는 비-란탄족 표지 원자를 갖는 질량 태그의 경우에 더 두드러질 수 있다. 본원에 기술된 시약 및 방법은 용해도에 영향을 미치고/미치거나 비특이적 결합을 초래할 수 있는 새로운 중합체(예를 들어 란탄화물에 사용되는 상이한 킬레이터를 갖는 중합체)를 필요로 할 수 있는 비-란탄족 질량 태그에 유용할 수 있다. 표적 분석물에 대한 SBP 결합 및/또는 낮은 비특이적 결합을 유지하면서 신호를 증폭시키기 위한 신호 증폭 기술이 본원에 보고된다. 소정의 양태에서, 신호 증폭은 낮은 배경을 유지하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배경(예: 표적 분석물을 발현하지 않는 세포 및/또는 세포 영역)으로부터 및/또는 (예를 들어 도 2에 도시된 것과 같은) 비특이적 반점 효과(punti effect) 및/또는 에지 효과와 같은 특징으로부터 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 신호가 유래될 수 있다. 소정의 양태에서, 높은 신호와 배경 간의 차이는 100 카운트 초과 또는 1000 카운트 초과일 수 있다. 소정의 양태에서, 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 또는 80% 초과의 표적 분석물이 신호 증폭 방법에 사용된 SBP에 결합될 수 있다.
란탄족 및 일부 비-란탄족 금속을 로딩하기 위한 킬레이터는 DOTA, DTPA, EDTA, PEPA, 및/또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 질량 태그 중합체는 DFO 및/또는 사르코파진(sarcophagine)과 같은 소정의 비란탄족을 우선적으로 킬레이트화하는 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
발명자들은 신호 증폭 및 배경이, 소정의 SBP가 상이한 질량 태그와 더 양호하게 페어링되도록, 질량 태그 중합체의 설계, SBP의 선택, 및 이들의 조합에 기초하여 가변적임을 발견하였다. 추가로, 본원에 기술된 신호 증폭을 제공하고 배경을 감소시키기 위한 일반적인 전략을 조합하여 신호 대 노이즈를 개선할 수 있다.
예를 들어, 도 1은 본원의 방법 및 시약에 의해 개선된 배경 대비 신호를 도시한 것으로서, 정상적으로 낮은 신호 및/또는 높은 배경을 갖는 비-란탄족 질량 태그의 경우(상단), 질량 태그의 유형 및 질량 태그가 부착된 항체의 농도를 기반으로 세포당 평균 신호가 20 내지 2000 카운트인 반면, 배경(표적 분석물에 대해 음성인 세포 유래의 신호)은 0 카운트에 가깝게 유지됨을 보여준다. 도시된 데이터는 현탁 질량 세포분석 데이터이지만, 이미징 질량 세포분석 데이터의 대한 유사한 분석이 수행될 수 있다.
또 다른 예에서, 도 2는 비-특이적 질량 태그 중합체 결합(좌측 이미지)에서의 에지 효과를 도시한 것으로서, 이는 본원의 방법 및 시약을 통해 감소된다(우측 이미지).
이종기능성 링커를 사용하여 분지형 질량 태그를 SBP에 접합시키기
질량 태그 중합체 및 특히 고감도 중합체를 개발하는 데에는 항체의 기능 보존과 높은 감도를 제공하는 표지화 정도 사이에서 세심하게 균형을 맞추는 것이 도움이 된다. 예를 들어, 이는 SBP와 같은 생체 분자(예: 항체)의 다수의 부착 부위에 저분자량 금속 킬레이트화 중합체를 부착하거나, 관심 생체 분자 상의 더 적은 부착 부위에 더 큰 금속 킬레이트화 중합체를 부착함으로써 달성될 수 있다. 소정의 양태에서, 다수의 질량 태그(예를 들어 질량 태그 중합체)는 분지형 접합을 통해, 예컨대 본원에 기술된 분지형 이종기능성 링커를 통해 SBP의 동일한 부착 부위에 부착된다.
소정의 양태에서, 항체의 아미노기를 통해 저분자량 질량 태그 중합체로 항체를 과도하게 표지하는 것은 접합체의 활성을 손상시켰다. 항체의 과변형은 항체의 특이성을 손상시킬 것이다. 그러나, 발명자들은 소수의 고분자량 중합체 사슬을 부착하는 것도 민감도 상실을 야기하고; 너무 큰 항체-중합체 접합체는 항체-중합체 접합체와 조직 내의 에피토프 사이에서 입체 장애를 초래할 수 있다는 것을 발견하였다. 분지형 이종기능성 링커는, 과변형을 통해 항체를 손상시키지 않으면서, 상당한 입체 장애 없이 더 많은 수의 질량 태그 중합체를 항체에 부착시킬 수 있게 한다. 링커는 관심 생체분자에 부착하기 위한 단일 반응기를 일단에 함유하고 중합체에 부착하기 위한 다중 반응 모이어티를 타단에 함유할 수 있다. 링커 분자는, 생체분자와 금속이 첨가된 중합체 사이의 공유 결합을 위한 반응성 말단기를 갖는 코어 구조로서 폴리 에틸렌 글리콜 또는 폴리(아미도아민) 계열 덴드리머 또는 분지형 PEG와 같은 용해도 강화 기를 함유할 수 있다.
이러한 전략을 통해 증폭된 신호, 감소된 입체 장애, 및 부위 특이적 접합을 갖는 접합체를 생성할 수 있을 것이다. 이전의 질량 태그 부착 전략으로는 티올 기 당 하나의 질량 태그만 부착할 수 있다. SBP는 질량 태그의 부착을 위한 제한된 수의 접합 부위만을 제공할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 유도체는 질량 태그가 접합될 수 있는 몇 개의 티올기 또는 아민기만을 제공할 수 있다. 티올 또는 아민 종결된 올리고뉴클레오티드는 하나의 이러한 기만을 제공할 수 있다.
소정의 양태에서, 복수의 질량 태그(예를 들어 질량 태그 중합체)는 SBP 상의 더 적은 수의 부착 부위에 접합될 수 있다. 예를 들어, (예를 들어 30개 미만, 또는 20개 미만의 표지 원자에 결합되었거나 이에 결합할 수 있는) 복수의 작은 분지형 질량 태그 중합체는 분지형 이종기능성 링커를 통해 단일 부착 부위에 부착될 수 있다. 이러한 더 작은 중합체는 (예를 들어 균일한 크기로) 합성하기가 더 용이할 수 있고, 질량 태그 중합체에 결합된 분지형 이종기능성 링커의 크기와 형상은 링커의 이종기능성 화학을 통해 조절할 수 있다.
대안적으로, 본원에 기술된 것과 같은 복수의 고감도 중합체는 단일 분지형 이종기능성 링커를 통해 결합될 수 있다. 예를 들어, 6개 이상의 질량 태그가 3개 이하의 부착 부위에 결합될 수 있거나, 4개 이상의 질량 태그가 2개의 부착 부위에 결합될 수 있거나, 2개 이상의 질량 태그가 단일 부착 부위에 결합될 수 있다. 예를 들어, 이종기능성 링커는 SBP 부착 부위에 결합하는 (예를 들어 공유 결합하는) 제1 기 및 질량 태그 상의 화학적으로 상이한 부착 부위에 결합하는 (예를 들어 공유 결합하는) 제2 기의 복수의 인스턴스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이종기능성 링커는 제2 기의 2, 3, 4개 또는 그 이상의 인스턴스로 분지될 수 있다.
분지형 이종기능성 링커는 (예를 들어 링커의 어느 단부의 부착 화학과도 반응하지 않는) 제3 유형의 화학을 통해 형성될 수 있다. 예를 들어, 분지형 이종기능성 링커는 알데히드 화학을 통해 형성될 수 있고, SBP에 부착하기 위한 티올 반응기를 가질 수 있고, 복수의 질량 태그에 부착하기 위한 클릭 화학기(예컨대, 스트레인 촉진 클릭 화학기)의 복수의 인스턴스를 가질 수 있다. 분지형 이종기능성 링커는 (질량 태그에 부착하기 위한) 제2 반응기에서 각각 종결되는 2개, 3개, 4개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 분지를 가질 수 있다.
이종기능성 링커는 2개의 상이한 부착 메커니즘을 갖는다. 제1 부착은 티올기 또는 아민기와 같은 SBP의 부착 부위에 결합하기 위한 것일 수 있다. 제2 부착 메커니즘은 예컨대 클릭 화학을 통해 질량 태그에 결합하기 위한 것일 수 있다. 분지형 이종기능성 링커는 제2 부착 화학을 위한 복수의 단부를 가질 수 있다. 분지형 이종기능성 링커에 의해 제공되는 분지화는 (예를 들어 30개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 표지 원자를 갖거나 이에 결합할 수 있는) 큰 질량 태그 중합체를 합성할 필요성을 감소시킬 수 있다. 결합은 예컨대 티올-반응 화학, 아민 반응 화학, 또는 클릭 화학(예컨대 스트레인 촉진 클릭 화학)을 통한 공유 결합일 수 있다. 결합은 예컨대 혼성화를 통하거나 친화도 상호작용(예를 들어 펩티드 서열과 같은 표적 분석물과 비오틴-아비딘 또는 항체 또는 이의 유도체의 상호작용)을 통한 비공유 결합일 수 있다.
분지형 이종기능성 링커의 부착 메커니즘 중 하나 또는 둘 다는 공유 부착 메커니즘일 수 있다. 소정의 양태에서, 이종기능성 링커는 티올-반응 제1 기(예: 말레이미드) 및 클릭 화학 반응 제2 기(예: TCO 또는 DBCO)의 복수의 인스턴스를 가질 수 있다. 항체는 티올기를 제시하기 위해 (예를 들어 TCEP에 의해) 환원될 수 있고, 이종기능성 링커의 제1 기와 반응할 수 있다. 소정의 양태에서, TCEP 환원은 항체 SBP를 더 작은 단편으로 최대한 절단하여, 조직 내 에피토프에 더 잘 도달할 수 있는 더 작고, 입체적으로 덜 방해받는 접합체를 생성한다. 복수의 질량 태그에 결합된 이러한 항체 단편은, 예컨대 FPLC에 반대되는 스핀 여과(spin filtration)에 의해, 정제하기가 더 용이할 수 있다. 각각이 클릭 화학 반응기(예를 들어 테트라진 또는 아지드)로 기능화된 복수의 질량 태그, 예컨대 질량 태그 중합체는 이종기능성 링커의 제2 기에 부착될 수 있다. 본 발명은 아지드-기능화된 MCP의 부위 특이적 부착을 위해 힌지 영역에서 다수의 DBCO 모이어티로 항체를 변형시키는 것을 포함한다. 분지형 이종기능성 링커의 사용은 2단계 접합 전략을 포함할 수 있는데, 여기서 항체의 힌지 영역에서의 이황화 결합이 부분적으로 감소되어 반응성 티올기를 생성하고, 이는 후속하여 분지형 다기능성 링커의 말레이미드 작용기와 반응한다. 그런 다음, 이종기능성 링커로부터 분지되는 아지드 또는 테트라진 작용화된 중합체는 구리를 사용하지 않는 클릭 화학 절차를 사용하여 DBCO 또는 TCO 모이어티에 부착될 수 있다. 유사하게, 상이한 다기능성 기 및 상이한 부착 화학을 설계하여, 신호 증폭 및 접합 효율의 개선이 요구되는 상이한 응용분야에 사용할 수 있다. 분지형 구조로서, 2세대 또는 3세대 덴드리머가 분지형 이종기능성 링커 상에 다수의 질량 태그 부착 부위를 도입하는 데 사용될 수도 있다.
소정의 양태에서, 분지형 이종기능성 링커의 부착 메커니즘은 비공유 부착 메커니즘일 수 있다. 예를 들어, 링커는 링커의 중합체 백본에 공유 결합된 분지화 올리고뉴클레오티드(예를 들어 동일하거나 유사한 서열의 단일 가닥 DNA)를 가질 수 있고, 질량 태그 올리고뉴클레오티드는 분지화 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 또는 간접적으로 혼성화될 수 있다. 이러한 혼성화는 분지형 이종기능성 링커에 결합된 SBP와 샘플을 접촉시킨 후에 수행될 수 있는데, 이는 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이 혼성화 체계가 상이한 표지 원자를 상이한 SBP에 대해 표적화할 수 있기 때문이다. 소정의 특정 양태에서, 분지형 이종기능성 링커를 SBP에 비공유 부착하는 것은 비오틴-아비딘과 같은 친화성 반응을 통하거나 일차 항체 SBP에 대한 이차 항체의 결합을 통해 이루어질 수 있다.
이종기능성 링커는 제1 기와 분지점 사이 및/또는 분지점과 제2 기 사이에서 긴 링커(예를 들어 5, 10, 또는 20개 초과의 반복 서브유닛)를 포함할 수 있다. 서브유닛은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 용해도 향상(예를 들어 극성) 서브유닛을 포함할 수 있다.
소정의 양태에서, SBP는 먼저 하나 이상의 이종기능성 링커에 부착될 수 있고, 그 후에 질량 태그가 부착된다. 이기능성 링커는, 나중에 부착될 수 있는 질량 태그에 의해 방해를 받지 않을 때, SBP 부착 부위에 더 잘 접근할 수 있다.
질량 태그 및/또는 링커의 접합
다양한 적합한 접합 수단이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 질량 태그는 예컨대 공유 결합(예를 들어 아민 화학, 티올 화학, 인산염 화학, 효소 반응, (예를 들어, 금속 할로겐화물과의) 산화 환원 반응, 및 친화성 중간체(예를 들어, 스트렙타비딘 또는 비오틴과), 또는 스트레인 촉진 클릭 화학 또는 금속-촉매 클릭 화학과 같은 클릭 화학의 형태)을 통해 생물학적으로 활성인 물질에 접합될 수 있다. 소정의 양태에서, 본원에 기술된 접합 방법은, 예컨대 혼성화 체계를 사용해 질량 태그된 올리고뉴클레오티드를 SBP-올리고뉴클레오티드 접합체와 간접적으로 결합시킬 때, 올리고뉴클레오티드를 SBP에 접합시키는 데 사용될 수 있다.
질량 태그는 예컨대 공유 결합(예를 들어 아민 화학, 티올 화학, 인산염 화학, 효소 반응, 또는 스트레인 촉진 클릭 화학 또는 금속-촉매 클릭 화학과 같은 클릭 화학의 형태)을 통해 생물학적으로 활성인 물질에 접합될 수 있다. 생물학적으로 활성인 물질은 친화도 시약(예를 들어 항체 또는 이의 단편, 앱타머, 렉틴 등) 또는 내인성 표적(예를 들어 DNA 또는 RNA) 또는 중간체(예를 들어 항체-올리고뉴클레오티드 중간체 및/또는 올리고뉴클레오티드의 혼성화 체계)에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 적절한 부착 화학은 (예를 들어 카보디이미드와의 반응과 같은) 카르복실-대-아민 반응 화학, (예를 들어 NHS 에스테르, 이미도에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 하이드록시메틸 포스핀 등과의 반응과 같은) 아민 반응 화학, (예를 들어 말레이미드, 할로아세틸(브로모- 또는 요오드-), 피리딜디설파이드, 티오설포네이트, 비닐설폰 등과의 반응가 같은) 설프하이드릴 반응 화학, (예를 들어 하이드라지드, 알콕시아민 등과의 반응과 같은) 알데히드 반응 화학, (예를 들어 이소티오시아네이트와의 반응과 같은) 하이드록실 반응 화학을 포함할 수 있다. 대안적인 부착 방법은 (예를 들어 DBCO-아지드 또는 TCO-테트라진에 의한) 스트레인 촉진 클릭 화학과 같은 클릭 화학을 포함한다.
중합체는 생물학적으로 활성인 물질에 결합하도록 관능화될 수 있다. 소정의 양태에서, 중합체는 티올 반응 화학, 아민 반응 화학, 또는 클릭 화학을 통해 관능화될 수 있다. 예를 들어, 중합체는 (예를 들어 TCEP 환원에 의해 감소되는 항체의 Fc 부분 상의 티올기에 부착하기 위한 말레이미드기를 통해) 티올 반응성을 위해 관능화될 수 있다. 접합 유형 및 접합 조건(예: 환원제의 농도)은 SBP의 무결성을 유지하기 위해 SBP의 유형을 기준으로 달라질 수 있다.
예를 들어, (예를 들어 금속 킬레이트화 펜던트 기와 같은 복수의 금속 결합 기를 포함하는) 중합체 질량 태그는 말레이미드와 같은 티올 반응성 기로 관능화될 수 있다. 소정의 양태에서, SBP는 중합체에 접합하기 위해 티올을 제공하도록 (예를 들어 TCEP 환원에 의해) 환원될 수 있는 시스테인을 포함할 수 있다. 그러나, SBP 상의 시스테인은 접근할 수 없거나, 시스테인의 파괴는 SBP의 친화도를 감소시킬 수 있거나, 환원 단계는 SBP의 친화도를 감소시킬 수 있다. 이러한 경우, SBP 상의 다른 작용기가 접합 전에 티올화될 수 있으며, 이는 티올 또는 시스테인을 이미 포함하는 SBP 상에서도 그러하다. 예를 들어, 재조합 항체는 (예를 들어 입체 장애를 감소시켜 결합을 개선하도록) 더 작게 설계될 수 있고, 따라서 Fc 영역에 접근 가능한 시스테인을 갖지 않을 수 있다. 이러한 경우, 아민은 예컨대 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트와 반응한 다음 50 mM 하이드록실아민 또는 하이드라진으로 아세틸기를 제거함으로써 간접적으로 티올화될 수 있다. 또 다른 예에서, 아민은 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트와 반응한 다음 DTT 또는 TCEP로 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 접합체를 환원시킴으로써 간접적으로 티올화될 수 있다. 환원은 2-피리딘티온 발색단을 방출하는데, 이는 티올화의 정도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 티올은 시스타민과의 EDAC-매개 반응에 이어서 DTT 또는 TCEP에 의한 이황화물의 환원에 의해 카르복시산기에 혼입될 수 있다. 마지막으로, 티올-무함유 단백질 중의 트립토판 잔기는 메르캅토트립토판 잔기로 산화된 다음, 요오드아세트아미드 또는 말레이미드를 포함하는 질량 태그에 접합될 수 있다. 소정의 양태에서, 전술한 티올화를 위한 환원 단계는 생략될 수 있거나 환원된 시스테인의 티올에 접합하는 데 필요한 것보다 덜 엄격할 수 있으므로, 말레이미드 관능화된 질량 태그 중합체는 티올화된 모이어티에 접합되고 SBP의 환원된 시스테인이 있지 않는다. 소정의 양태에서, 비-펩티드계 SBP(예컨대 올리고뉴클레오티드)는 더 탄력적일 수 있고, 접합은 25 mM 이상 또는 50 mM 이상의 TCEP 또는 DTT 농도에서의 환원을 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 비-펩티드계 SBP의 접합은 가열 또는 동결을 통한 변성과 같은 더 가혹한 온도 조건을 포함할 수 있다.
소정의 양태에서, SBP(예컨대, 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드)는 중합체 질량 태그 크기의 50% 이내와 같이 작을 수 있다. 이는 조직 침투를 더 용이하게 할 수 있고/있거나 입체 장애를 감소시킬 수 있지만, 여과 단계에서 질량 태그된 SBP의 정제를 복잡하게 만들 수 있다. 이와 같이, 질량 태그는 친화도 기반 정제를 허용할 수 있는 에피토프를 제시하도록 변형될 수 있다. 소정의 양태에서,
스트레인 촉진 반응과 같이 금속-촉매가 없는 다양한 상이한 클릭 화학 반응이 본 개시의 특정 양태에 따라 사용될 수 있다.
아지드와의 알킨 반응
제1 예는, 시클로옥틴 유도체와 아지드 사이의 스트레인 촉진 아지드-알킨 부가 환화(cycloaddition)와 같은 스트레인 알킨과 아지드 사이의 반응이다.
여기서, 시클로옥틴과 아지드의 반응은 R1 기와 R2 기를 공유 결합시킨다. 알킨 고리 스트레인을 감안하면, 유기 아지드와 환형 알킨(일반적으로 시클로옥틴)의 반응은 흔히 스트레인-촉진 아지드-알킨 부가 환화(SPAAC)로서 알려져 왔다. 본 개시의 소정의 양태에서, R1은 SBP일 수 있고, R2는 질량 태그일 수 있다. 대안적으로, R2는 SBP일 수 있고, R1은 질량 태그일 수 있다. 따라서, 본 개시의 일부 구현예에서, 상기 방법은 클릭 화학 반응을 사용하여 SBP를 질량 태그에 접합시키는 단계를 포함하되, 클릭 화학 반응은 아지드와 알킨의 반응이다.
시클로옥틴과 아지드의 반응은 상대적으로 느린 반응 동역학을 특징으로 하며, 과량의 시약 및 긴 인큐베이션 시간을 필요로 한다. 따라서, 반응성이 더 크지만 반응성을 훼손하지 않는 시클로알킨 유도체가 사용될 수 있다. 이에는 모노플루오르화 시클로옥틴(MOFO), 디플루오로시클로옥틴(DIFO), 디메톡시아자시클로옥틴(DIMAC), 디벤조시클로옥틴(DIBO), 디벤조아자시클로옥틴(DIBAC), 비아릴아자시클로옥티논(BARAC), 바이시클로노닌(BCN), 2,3,6,7-테트라메톡시-DIBO(TMDIBO), 설포닐화 DIBO(S-DIBO), 카르복시메틸모노벤조시클로옥틴(COMBO), 피롤로시클로옥신(PYRROC)이 포함된다. (디)벤조고리화된 시클로옥틴의 향상된 반응성은 일반적으로 다수의 sp2-혼성화 탄소에 의해 부여된 고리 변형의 증가에 의해 야기되는 것으로 이해된다. 예컨대 SBP 상의 아민(예를 들어 단백질(예: 항체 및 렉틴) 내 리신, 아르기닌, 및 히스티딘의 측쇄의 아민기 중 N-말단 아민기)에 접합하기 위해 (예를 들어 (IDT (IL, USA), Sigma Aldrich (MO, USA), 특히 Bio-Synthesis, Inc. (TX, USA)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 것과 같은) 아민 변형된 올리고뉴클레오티드 프로브에 접합하기 위해) NHS 에스테르로 (직접 또는 링커를 통해) 유도체화된 것들(예: 아미노 당 유도체 등)과 같은 많은 종류의 디벤조시클로옥틴(DBCO) 유도체가 본 개시에 사용될 수 있다. 대안적으로, DBCO 유도체는 말레이미드(예: 디벤조시클로옥틴-말레이미드; Sigma Aldrich 카탈로그 번호 760668, 또는 디벤조시클로옥틴-PEG4-말레이미드; Sigma Aldrich 카탈로그 번호 760676)로 (직접적으로 또는 링커를 통해) 유도체화될 수 있다. 말레이미드의 관능성은 DBCO를 질량 태그의 설프하이드릴기에 결합시키는 데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 알킨은 환형 알킨이고, 예를 들어 여기서 환형 알킨은 8원 고리의 일부이다. 환형 알킨은 변형될 수 있다. 때때로, 환형 알킨은 3개 이상의 고리를 포함하는 다중-고리 구조의 일부이며, 임의로 다중 고리 구조는 적어도 2개의 벤젠 고리를 포함한다. 일부 구현예에서, 환형 알킨은 디벤조시클로옥틴(DBCO)이다.
마찬가지로, 아지드는 아지도-dPEG8-NHS 에스테르, 아지도-dPEG12-NHS 에스테르(각각 Sigma Aldrich; 카탈로그 번호 QBD10503 및 QBD10505) 등과 같은 NHS 에스테르로 (직접적으로 또는 링커를 통해) SBP에 결합될 수 있다. NHS 에스테르를 통해, 아지드는 SBP 상의 아민(예를 들어 단백질(예: 항체 및 렉틴) 내 리신, 아르기닌, 및 히스티딘의 측쇄의 아민기 중 N-말단 아민기)에 결합될 수 있다(예를 들어 (IDT (IL, USA), Sigma Aldrich (MO, USA), 특히 Bio-Synthesis, Inc. (TX, USA)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 것과 같은) 아민 변형된 올리고뉴클레오티드 프로브에 접합될 수 있다). 대안적으로, 아지드 변형된 올리고뉴클레오티드/당류는 직접 (즉, 아지드 관능성을 별도의 NHS 에스테르를 통해 변형된 아미노에 부착할 필요없이) 합성될 수 있다. 아지드 성분도 질량 태그에 결합될 수 있다. 예를 들어, 중합화의 아조 개시제(azo initiator)가 종래의 중합화 반응에 사용될 수 있다. 아지드 종결된 폴리메타크릴레이트는 Sigma Aldrich로부터 입수할 수도 있다.
따라서, 본 개시의 소정의 양태는 질량 태그된 SBP를 생산하는 일련의 방법을 제공하며, 상기 방법은 SPAAC 반응을 통해 질량 태그와 SBP를 접합시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 알킨 관능화된 SBP 및 아지드 관능화된 질량 태그를 제공하는 단계, 및 알킨 관능화된 SBP를 아지드 관능화된 질량 태그와 반응시키는 단계, 예컨대 알킨 관능화된 SBP가 변형된 시클로알킨(예: DBCO)으로 관능화되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 아지드 관능화된 SBP 및 알킨 관능화된 질량 태그를 제공하는 단계, 및 아지드 관능화된 SBP를 알킨 관능화된 질량 태그와 반응시키는 단계, 예컨대 알킨 관능화된 질량 태그가 변형된 시클로알킨(예: DBCO)으로 관능화되는 단계를 포함한다. 후술하는 바와 같이, SBP와 알킨 또는 아지드 및/또는 질량 태그와 아지드 또는 알킨 사이에 스페이서가 제공될 수 있다.
본 개시의 소정의 양태는 또한 질량 태그된 SBP를 제공하며, 여기서 SBP 및 질량 태그는 알킨과 아지드(예컨대 변형된 시클로알킨과 아지드, 예를 들어 DBCO와 아지드)의 반응 산물을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 반응 산물은 금속이 없는 클릭 화학 반응, 예컨대 구리가 없는 클릭 화학 반응의 산물이다. 따라서, 본 개시의 소정의 양태는 질량 태그된 SBP를 제공하며, 여기서 SBP 및 질량 태그는 트리아졸을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 링커 내의 트리아졸기는 다중-고리 구조의 일부일 수 있다. 소정의 양태에서, 다중-고리 구조는 4개 이상의 고리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중-고리 구조는 3원 고리, 4원 고리, 5원 고리, 6원 고리, 7원 고리, 8원 고리, 9원 고리, 10원 고리 등일 수 있다. 소정의 양태에서, 다중-고리 구조는 2개 이상의 벤젠 고리를 포함할 수 있다. 구체적으로, 다중-고리 구조는 디벤조시클로옥텐기를 포함할 수 있다. 트리아졸기 및 디벤조시클로옥텐기는 임의의 배향일 수 있다. 예를 들어, 트리아졸기는 디벤조시클로옥텐기에 의해 SBP로부터 분리될 수 있다(이는 디벤조시클로옥텐기가 트리아졸기에 의해 질량 태그로부터 분리되게 됨을 의미함). 대안적으로, 디벤조시클로옥텐기는 트리아졸기에 의해 SBP로부터 분리될 수 있다(이는 트리아졸기가 디벤조시클로옥텐기에 의해 질량 태그로부터 분리되게 됨을 의미함).
후술하는 바와 같이, 질량 태그는 하나 이상의 표지 원자를 포함하고, 이는 질량 검출기에서 간단한 방식으로 SBP의 표적의 존재를 식별할 수 있게 한다. 그러나, 이는 표지화 요소를 태그 내에 이미 갖고 있는 질량 태그에 SBP가 접합될 것임을 의미하지는 않는다. 때때로, SBP는 하나 이상의 금속 표지 원자가 금속-킬레이트화 모이어티 상에 로딩되어 질량 태그를 형성하기 전에 금속 킬레이트화 모이어티에 접합되게 된다. 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 금속 킬레이트화 모이어티는 단일 금속 킬레이트화 기이거나, , 금속 킬레이트화 기가 2개 이상의 서브유닛에 부착된 중합체일 수 있다.
따라서, 본 개시의 소정의 양태는 금속 킬레이트화 모이어티에 접합된 SBP를 생산하는 일련의 방법을 제공하며, 상기 방법은 SPAAC 반응을 통해 금속 킬레이트화 모이어티와 SBP를 접합시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 알킨 관능화된 SBP 및 아지드 관능화된 금속 킬레이트화 모이어티를 제공하는 단계, 및 알킨 관능화된 SBP를 아지드 관능화된 금속 킬레이트화 모이어티와 반응시키는 단계, 예컨대 알킨 관능화된 SBP가 변형된 시클로알킨(예: DBCO)으로 관능화되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 아지드 관능화된 SBP 및 알킨 관능화된 금속 킬레이트화 모이어티를 제공하는 단계, 및 아지드 관능화된 SBP를 알킨 관능화된 금속 킬레이트화 모이어티와 반응시키는 단계, 예컨대 알킨 관능화된 금속 킬레이트화 모이어티가 변형된 시클로알킨(예: DBCO)으로 관능화되는 단계를 포함한다. 후술하는 바와 같이, SBP와 알킨 또는 아지드 및/또는 금속 킬레이트화 모이어티와 아지드 또는 알킨 사이에 스페이서가 제공될 수 있다.
SPAAC 반응은 생리학적 조건 하에서 수행될 수 있고, 이는 단백질(SBP와 관련된 섹션을 포함하여 이하 본원에 기술된 것과 같은 항체, 리간드, 수용체, 핵산 등을 포함함)과 같은 거대 생체분자와 양립할 수 있다. 생리학적 조건은 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS) 등과 같은 생물학적 완충액 또는 등장성 용액을 포함할 수 있다. 생리학적 조건은 대안적으로 또는 추가적으로 1℃ 내지 42℃, 4℃ 내지 37℃, 4℃ 내지 25℃, 10℃ 내지 37℃, 25℃ 내지 37℃ 등의 온도 범위를 포함할 수 있다. 생리학적 조건은 중성 pH, 5.5 내지 8.5의 pH, 6 내지 8의 pH, 6.5 내지 7.5의 pH 등을 포함할 수 있다. DBCO와 아지드 사이의 반응이 느린 공정일 수 있기 때문에, 비교적 긴 인큐베이션 시간이 바람직할 수 있다. 예를 들어, b)의 접합 단계는 4℃에서 4 내지 48시간, 4℃에서 10 내지 24시간, 4℃에서 18 내지 20시간, 실온에서 10분 내지 10시간, 실온에서 30분 내지 5시간, 실온에서 30분 내지 3시간, 37℃에서 5분 내지 5시간, 37℃에서 10분 내지 2시간 등 동안 수행될 수 있다.
본 개시의 소정의 양태는 또한, 질량 태그된 SBP의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 금속 킬레이트화 모이어티에 접합된 SBP를 제조하기 위한 이전 단락에 따른 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 금속 킬레이트화 모이어티(예: 중합체) 상에 금속을 로딩하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 소정의 양태는 또한 SBP-금속 킬레이트화 모이어티 접합체를 제공하며, 여기서 SBP와 금속 킬레이트화 모이어티는 알킨과 아지드(예컨대 변형된 시클로알킨과 아지드, 예를 들어 DBCO와 아지드)의 반응 산물을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 반응 산물은 금속이 없는 클릭 화학 반응, 예컨대 구리가 없는 클릭 화학 반응의 산물이다. 따라서, 본 개시의 소정의 양태는 SBP-금속 킬레이트화 모이어티 접합체를 제공하며, 여기서 SBP와 금속 킬레이트화 모이어티는 트리아졸을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 링커 내의 트리아졸기는 다중-고리 구조의 일부일 수 있다. 소정의 양태에서, 다중-고리 구조는 4개 이상의 고리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중-고리 구조는 3원 고리, 4원 고리, 5원 고리, 6원 고리, 7원 고리, 8원 고리, 9원 고리, 10원 고리 등일 수 있다. 소정의 양태에서, 다중-고리 구조는 2개 이상의 벤젠 고리를 포함할 수 있다. 구체적으로, 다중-고리 구조는 디벤조시클로옥텐기를 포함할 수 있다. 트리아졸기 및 디벤조시클로옥텐기는 임의의 배향일 수 있다. 예를 들어, 트리아졸기는 디벤조시클로옥텐기에 의해 SBP로부터 분리될 수 있다(이는 디벤조시클로옥텐기가 트리아졸기에 의해 금속 킬레이트화 모이어티로부터 분리되게 됨을 의미함). 대안적으로, 디벤조시클로옥텐기는 트리아졸기에 의해 SBP로부터 분리될 수 있다(이는 트리아졸기가 디벤조시클로옥텐기에 의해 금속 킬레이트화 모이어티로부터 분리되게 됨을 의미함).
트리아졸기를 포함하는 질량 태그된 SBP는 용액에서 안정적일 수 있다. 예를 들어, SBP-질량 태그는 용액 중에서 최대 1주일, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 5년 등 동안 안정적일 수 있다. SBP-질량 태그는 -20℃, 동결점 아래, 4℃, 10℃, 또는 실온의 (예를 들어 글리세롤을 포함하는) 용액 중에서 안정적일 수 있다. SBP가 항체인 경우, 안정성은 항체 친화도에 의해 측정될 수 있다.
일부 경우에, 클릭 화학 반응은 금속 촉매의 부재 하에 진행되며, 특히 클릭 화학 반응은 구리 또는 철의 부재 하에 진행된다. 일부 경우에, 클릭 화학 반응은 생리학적 조건 하에서 수행되고, 임의로 클릭 화학 반응은 6 내지 8의 pH에서 수행되는데, 예컨대 클릭 화학 반응은 (예를 들어 등장성) 완충액 중에서 수행된다.
때때로, 알킨은 SBP에 부착되고, 아지드는 질량 태그 또는 금속 킬레이트화 모이어티에 부착된다. 때때로, 아지드는 SBP에 부착되고, 알킬은 질량 태그 또는 금속 킬레이트화 모이어티에 부착된다. 때때로, 알킨이 SBP에 부착되는 경우, 이는 (임의로 스페이서를 통해) 링커 성분에 의해 부착된다. 때때로, 알킨이 질량 태그 또는 금속 킬레이트화 모이어티에 부착되는 경우, 이는 (임의로 스페이서를 통해) 링커 성분에 의해 부착된다. 때때로, 아지드가 SBP에 부착되는 경우, 이는 (임의로 스페이서를 통해) 링커 성분에 의해 부착된다. 때때로, 아지드가 질량 태그 또는 금속 킬레이트화 모이어티에 부착되는 경우, 이는 (임의로 스페이서를 통해) 링커 성분에 의해 부착된다.
테트라진과의 알켄 반응
제2 실시예는, 트랜스-시클로옥텐 유도체와 테트라진 사이의 스트레인 촉진 테트라진-알켄 부가 환화와 같은 변형된 알켄과 테트라진 사이의 반응이다.
여기서, 트랜스-시클로옥텐과 테트라진의 반응은 R1 기와 R2 기를 공유 결합시킨다. 알킨 고리 변형을 감안하면, 유기 테트라진과 환형 알켄(일반적으로는 트랜스-시클로옥텐)의 반응은 역 전자 요구 디엘-알더 부가 환화(iEDDA) 반응이다. 본 개시의 소정의 양태에서, R1은 SBP일 수 있고, R2는 질량 태그일 수 있다. 대안적으로, R2는 SBP일 수 있고, R1은 질량 태그일 수 있다.
3개의 상이한 가능한 테트라진 이성질체 중에서, 1,2,4,5-테트라진이 iEDDA 반응에 사용된다. 반응이 완료되면 N2 가스가 유일한 부산물로서 방출하는데, 이는 iEDDA 반응을 비가역적이면서 종래의 가역적 디엘-알더 반응보다 생체 표지화에 더 적합하게 만든다.
트랜스-시클로옥텐(TCO)은 현재 이러한 반응의 시약으로서 알려진 가장 반응성이 높은 환형 알켄 중 하나이다. 예를 들어 SPB 상의 아민(예: 리신)에 접합하기 위해 NHS 에스테르로 (직접적으로 또는 링커를 통해) 유도체화된 것과 같은 많은 종류의 유도체가 본 개시의 소정의 양태에서 사용될 수 있다. 대안적으로, TCO 유도체는 말레이미드(예를 들어 (IDT (IL, USA), Sigma Aldrich (MO, USA), 특히 Bio-Synthesis, Inc. (TX, USA)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 것과 같은) 아민 변형된 올리고뉴클레오티드 프로브에 접합하기 위한, 단백질(예: 항체 및 렉틴) 내 리신, 아르기닌, 및 히스티딘의 측쇄의 아민기 중 N-말단 아민기, 아미노 당 유도체 등)로 (직접적으로 또는 링커를 통해) 유도체화될 수 있다. 말레이미드의 관능성은 TCO를 질량 태그의 설프하이드릴기에 결합시키는 데 사용될 수 있다. 트랜스-바이시클로[6.1.0]노넨 유도체가 사용될 수도 있는데, 이 경우 치환은 시클로프로필 고리 상에서 일어난다. TCO보다 빠르지는 않지만, 메틸시클로프로펜, 바이시클로[6.1.0]노닌, 시클로옥틴, 및 노르보넨 또한 테트라진과 반응할 수 있다.
마찬가지로, 테트라진은 (예컨대 Sigma Aldrich로부터 입수 가능한) NHS 에스테르로 (직접적으로 또는 링커를 통해) SBP에 결합될 수 있다. NHS 에스테르를 통해, 테트라진은 SBP 상의 아민(예를 들어 단백질(예: 항체 및 렉틴) 내 리신, 아르기닌, 및 히스티딘의 측쇄의 아민기 중 N-말단 아민기)에 결합될 수 있다(예를 들어 (IDT (IL, USA), Sigma Aldrich (MO, USA), 특히 Bio-Synthesis, Inc. (TX, USA)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 것과 같은) 아민 변형된 올리고뉴클레오티드 프로브에 접합될 수 있다). 예를 들어 말레이미드 관능기를 또한 포함하는 테트라진 성분도 질량 태그에 결합될 수 있다. 폭넓게 적용되는 두 가지 주된 유형의 테트라진이 있다: 6-메틸-치환된 테트라진 및 6-수소-치환된 테트라진. 메틸-치환된 테트라진은 임의의 다른 생물 직교 반응 쌍(약 1000 M-1 s-1)보다 TCO 유도체와 더 빠른 반응 동역학을 여전히 제공하면서, 수성 매질에 용해될 때조차도 높은 안정성을 나타낸다. 또한, 이들은 매우 다양한 반응 조건을 견뎌낸다. 이로 인해 이들은 단백질 표지화와 같은 응용 분야에서 가장 적합한 선택이 되었다. 한 편, 수소-치환된 테트라진은 안정성이 낮고 가혹한 반응 조건을 잘 견디지 못하지만, 생체 내 영상화와 같은 응용 분야에 대해 매우 빠른 반응 동역학(최대 30000 M-1 s-1)을 제공한다. 테트라진은 3-(벤질아미노)-테트라진일 수 있다.
따라서, 본 개시의 소정의 양태는 질량 태그된 SBP를 생산하는 일련의 방법을 제공하며, 상기 방법은 변형된 알켄과 테트라진 사이의 역 전자 요구 디엘-알더 부가 환화 반응(이 다음에 N2가 제거된 상태에서 역-디엘-알더 반응이 이어짐)을 통해 질량 태그와 SBP를 접합하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 알켄 관능화된 SBP 및 테트라진 관능화된 질량 태그를 제공하는 단계, 및 알켄 관능화된 SBP를 테트라진 관능화된 질량 태그와 반응시키는 단계, 예컨대 알켄 관능화된 SBP가 변형된 시클로알켄(예: TCO)으로 관능화되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 테트라진 관능화된 SBP 및 알켄 관능화된 질량 태그를 제공하는 단계, 및 테트라진 관능화된 SBP를 알켄 관능화된 질량 태그와 반응시키는 단계, 예컨대 알켄 관능화된 질량 태그가 변형된 시클로알켄(예: TCO)으로 관능화되는 단계를 포함한다. 후술하는 바와 같이, SBP와 알켄 또는 테트라진 및/또는 질량 태그와 테트라진 또는 알켄 사이에 스페이서가 제공될 수 있다.
본 개시의 소정의 양태는 또한 질량 태그된 SBP를 제공하며, 여기서 SBP 및 질량 태그는 알켄과 테트라진, 예컨대 변형된 변형 시클로알켄과 및 테트라진(예: TCO와 테트라진)의 반응 산물을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 반응 산물은 금속이 없는 클릭 화학 반응, 예컨대 구리가 없는 클릭 화학 반응의 산물이다. 따라서, 본 개시의 소정의 양태는 질량 태그된 SBP를 제공하며, 여기서 SBP 및 질량 태그는 피리다진을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 링커 내의 피리다진기는 다중-고리 구조의 일부일 수 있다. 소정의 양태에서, 다중-고리 구조는 2개 이상의 고리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중-고리 구조는 3원 고리, 4원 고리, 5원 고리, 6원 고리, 7원 고리, 8원 고리, 9원 고리, 10원 고리 등일 수 있다. 소정의 양태에서, 다중-고리 구조는 6원 고리 및 8원 고리를 포함할 수 있다. 구체적으로, 다중-고리 구조는 사이클로로옥탄기를 포함할 수 있다. 피리다진기 및 시클로옥탄기는 임의의 배향일 수 있다. 예를 들어, 피리다진기는 시클로옥탄기에 의해 SBP로부터 분리될 수 있다(이는 시클로옥탄기가 피리다진기에 의해 질량 태그로부터 분리되게 됨을 의미함). 예를 들어, 시클로옥탄기는 피디다진기에 의해 SBP로부터 분리될 수 있다(이는 피리다진기가 시클로옥탄기에 의해 질량 태그로부터 분리되게 됨을 의미함).
SBP 및 SBP로서의 작은 모이어티
본원에서 사용되는 바와 같이, SBP는 특이적 결합 파트너(또는 특이적 결합 쌍)이다. SBP는 예를 들어 친화도(예: 3차 구조) 또는 혼성화를 통해 이의 표적 분석물에 비공유 결합될 수 있다. 따라서, 본 개시의 소정의 양태는 또한 SBP를 표지하기 위한 키트, 및 본원에 개시된 클릭 화학에 의해 생성된 질량 태그된 SBP의 키트도 제공하며, 임의로 키트는 질량 태그된 SBP를 비롯하여 표지화 시약을 함유하는 다른 표지화 원자, 예를 들어 DNA 인터컬레이터도 포함한다. 마찬가지로, 본 개시의 소정의 양태는 또한 본 개시의 질량 태그 SBP를 사용해 샘플을 표지하는 방법, 임의로 다수의 이러한 질량 태그된 SBP를 사용해 샘플을 표지하는 방법을 제공하며, 예를 들어 여기서 질량 태그된 SBP는 상이한 유형의 SBP, 예를 들어 항체 SBP(다수의 항체 SBP를 포함함), 핵산 SBP(다수의 핵산 SBP를 포함함), 렉틴(다수의 렉틴을 포함함), 당(다수의 당류를 포함함), 및 DNA 인터컬레이터(다수의 DNA 인터컬레이터를 포함함)를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시의 소정의 양태는 또한 샘플을 표지하기 위한 본 개시의 질량 태그 SBP의 용도, 임의로 샘플을 표지하기 위한 다수의 이러한 질량 태그된 SBP의 용도를 포함하며, 예를 들어 여기서 질량 태그된 SBP는 상이한 유형의 SBP, 예를 들어 항체 SBP(다수의 항체 SBP를 포함함), 핵산 SBP(다수의 핵산 SBP를 포함함), 렉틴(다수의 렉틴을 포함함), 당(다수의 당류를 포함함), 및 DNA 인터컬레이터(다수의 DNA 인터컬레이터를 포함함)를 포함한다. 따라서, 본 개시의 소정의 양태는 또한 본 개시에 따라 표지된 샘플, 예컨대 본 개시의 질량 태그된 SBP로 표지된 샘플, 임의로 다수의 이러한 질량 태그된 SBP로 표지된 샘플을 제공하며, 예를 들어 여기서 질량 태그된 SBP는 상이한 유형의 SBP, 예를 들어 항체 SBP(다수의 항체 SBP를 포함함), 핵산 SBP(다수의 핵산 SBP를 포함함), 렉틴(다수의 렉틴을 포함함), 당(다수의 당류를 포함함), 및 DNA 인터컬레이터(다수의 DNA 인터컬레이터를 포함함)를 포함한다.
소정의 양태에서, SBP는 항체(예를 들어 항체 단편 또는 합성 항체), 핵산 앱타머, 및 비-면역글로불린 단백질(예를 들어 아비딘), 펩티드(예를 들어 핵산에 결합하는 아연 핑거와 같은 단백질의 결합 도메인 또는 작은 펩티드 또는 분자에 결합하는 수용체 결합 도메인 등과 일치하거나 이로부터 유래된 것), 또는 이들의 상응하는 분석물 상의 유도체일 수 있다. 이러한 경우, SBP는 전통적인 항체보다 더 작은, 작은 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 작은 모이어티 SBP는 분자량이 50 kDa 미만, 30 kDa 미만, 20 kDa 미만, 10 kDa 미만, 또는 5 kDa 미만일 수 있다. 작은 모이어티 SBP는 본원에서 논의된 단점 없이 더 큰 질량 태그를 허용할 수 있다. 작은 모이어티 SBP는 세포 또는 조직를 더 잘 투과하여, 예를 들어 조직의 더 심층 염색을 가능하게 할 수 있다.
상이한 SBP는 접합 방법 및 질량 태그에 따라 상이한 영향을 받을 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 양태는 동일한 샘플의 분석에서 상이한 SBP에 대한 상이한 신호 증폭 방법을 사용하는 것을 포함한다. 상이한 SBP는 상이한 유형의 SBP(예를 들어 올리고뉴클레오티드 대 항체), 상이한 항체 이소형(IgM, 및 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b와 같은 상이한 이소형), 또는 표적 분석물이 상이한 동일한 SBP 유형일 수 있다. 상이한 접합 방법은, 티올-반응 화학을 사용해 SBP를 질량 태그에 접합시킬 때, 환원의 상이한 엄중도를 포함한다. 상이한 질량 태그는 (예를 들어 상이한 킬레이트화 기, 중합체 크기, 중합체 형상 및/또는 용해도 향상 기의 상이한 조성을 갖는) 상이한 고감도 중합체를 포함한다. 예를 들어, 더 높은 엄중도의 접합(예를 들어 환원)이 더 적은 부착 부위를 제시하는 SBP(예를 들어 티올기)에 사용될 수 있다. 본 출원의 키트는, (예를 들어 상이한 표지 원자를 갖는 것 이외에) 상이한 중합체 구조를 갖는 질량 태그에 접합된 복수의 상이한 SBP를 포함한다.
소정의 양태에서, (상이한 항체 면역글로불린 클래스를 포함하는) 상이한 SBP는 상이한 질량 태그에 접합될 수 있거나, 상이한 조건 하에서 화학적으로 동일하거나 유사한 질량 태그에 접합될 수 있다. 예를 들어, 티올-반응 화학이 사용될 때, 특정 항체는 (예를 들어 TCEP에 의한) 환원에 상이하게 반응할 수 있다. 이와 같이, 복수의 SBP는 상이한 접합 프로토콜에 의해 (잠재적으로 상이한 동위원소가 로딩된) 동일한 질량 태그 중합체 구조에 접합될 수 있다.
질량 태그된 작은 모이어티 SBP는 FPLC 이외의 방법, 예컨대 스핀 여과에 의해 정제될 수 있다. 소정의 양태에서, SBP에 결합된 질량 태그(또는 질량 태그의 총량)는 SBP 자체의 크기의 적어도 20%, 30%, 50%, 또는 80%일 수 있으며, 이는 스핀 여과를 가능하게 할 수 있다. 소정의 양태에서, 질량 태그된 항체는 스핀 여과에 의해 정제될 수 있다.
고감도 중합체를 포함하는 질량 태그 중합체
본원의 질량 태그는, 예를 들어 금속 킬레이트화 펜던트 기 상에 로딩되거나 중합체의 백본 내로 혼입된 복수의 표지 원자를 포함하는 중합체를 포함한다. 소정의 양태에서, 질량 태그된 중합체는 (예를 들어 질량 태그 중합체의 킬레이터 상에 로딩될 수 있거나, 질량 태그 중합체의 킬레이터 상에 이미 로딩된) 원소 또는 동위원소 조성물과 별도로 제공될 수 있다. 질량 태그된 중합체는 항체 또는 이의 단편과 같은 특정 결합 파트너(SBP)에 부착된 상태로 제공될 수 있다. 소정의 양태에서, 질량 태그 중합체는 (예를 들어 풍부화된 동위원소와 같은 단일 동위원소의) 10개 초과, 20개 초과, 30개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 또는 200개 초과의 표지 원자를 갖거나 (예를 들어 킬레이트화를 통해) 이에 결합할 수 있다. 고감도 중합체는 (예를 들어 평균적으로) 30개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 또는 200개 초과의 표지 원자를 갖거나 이에 결합할 수 있다.
고감도 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있다. 분지형 중합체는 (예를 들어 적어도 2세대, 3세대, 또는 4세대 분지를 포함하는) 수지상 중합체이거나 (예를 들어 중앙 코어로부터 확산되는 적어도 3개의 선형 중합체를 포함하는) 성상 중합체일 수 있다.
소정의 양태에서, 고감도 중합체는 금속 킬레이트화 펜던트 기에 추가하여 킬레이터를 갖지 않는 (예를 들어 PEG와 같은 극성 기를 갖는) 용해도 향상 펜던트 기를 포함할 수 있다.
다수의 (예를 들어 30 초과의) 표지 원자를 갖는 고감도 질량 태그 중합체(즉, 고감도 중합체)는 표적에 대한 SBP 결합의 입체 방해, SBP에 대한 불충분한 부착, 낮은 용해도, 및 샘플 또는 기저 기질에 대한 비특이적 결합을 포함하여 다수의 어려움을 제시할 수 있다. 소정의 양태에서, 다수의 표지 원자를 갖는 질량 태그 중합체는 이들 트레이드 오프 중 하나 이상을 감소시키거나 제거하기 위해 화학적 변형을 가질 수 있다.
소정의 양태에서, 질량 태그 중합체 내의 표지 원자의 밀도는 중합체의 단일 펜던트 기 내의 복수의 금속 킬레이트화 기들을 결합시킴으로써 증가될 수 있다.
소정의 양태에서, 고감도 중합체의 유체역학적 직경은 20 nm 미만, 15 nm 미만, 10 nm 미만, 5 nm 미만, 3 nm 미만, 또는 2 nm 미만과 같이 작을 수 있다. 유체역학적 직경은 1000 nm3 미만, 500 nm3 미만, 100 nm3 미만, 50 nm3 미만, 20 nm3 미만, 또는 10 nm3 미만일 수 있다.
입체 장애를 감소시키기 위해, 고감도 중합체는 긴 링커, 예컨대 선형 사슬을 따라 10개 초과, 20개 초과, 30개 초과, 또는 50개 초과의 화학적 결합을 포함하는 (표지 원자 또는 금속 킬레이트화 펜던트기가 없는) 링커에 의해 SBP로부터 이격될 수 있다.
용해도 향상 기(예를 들어 PEG 기와 같은 비-이온성 극성 기)는, 예를 들어 질량 태그 중합체가 5 초과, 10 초과, 또는 20 초과의 이러한 기를 갖도록 중합체 구조에 포함될 수 있다. 용해도 향상 기는 (예를 들어 금속 킬레이터를 포함하거나 금속 킬레이터가 없는) 링커, 중합체 백본, 및/또는 펜던트 기와 같은 선형 사슬을 따라 배열될 수 있다.
킬레이트제 자체는, 예를 들어 산성 기 또는 염기성 기의 첨가를 통해 (예를 들어 로딩되지 않았거나 중성 pH에 가깝게 로딩된) 전체 전하 균형에 영향을 미치거나, 배위결합 부위에 영향을 미치도록(예를 들어 적어도 6, 7, 또는 8개의 배위결합 부위를 갖도록) 변형되고/되거나 용해도 향상 기를 킬레이트화 기의 내부에 또는 이의 근위에(예를 들어, 10, 5, 또는 3개의 결합 미만으로) 혼입하도록 변형될 수 있다.
질량 태그 중합체의 크기는 균일할 수 있다. 예를 들어 중합체는 낮은 다분산도, 예컨대 1.5, 1.2, 또는 1.1 미만의 다분산 지수를 가질 수 있다. 이와 같이, 나노입자는 크기가 균일할 수 있다(예를 들어 1.5, 1.2, 또는 1.1 미만의 다분산 지수를 가질 수 있다).
중합체를 제공하는 단계는 생중합화에 의해 펜던트 기를 중합화하는 것을 포함할 수 있다. 생중합화(living polymerization)에서, 사슬 종결 반응 및 사슬 전달 반응은 없거나 최소일 수 있고, 사슬 개시 속도는 사슬 전파 속도보다 더 빠를 수 있다. 생성된 중합체 사슬은 전통적인 사슬 중합화에서 나타난 것보다 더 일정한 속도로 성장할 수 있고, 중합체 길이는 일정하게 유지될 수 있다(즉, 이들은 본원에 기술된 바와 같이 낮은 다분산 지수를 갖는다). 본원의 중합체를 제조하는 데 사용된 생중합화는 음이온 중합화, 조절된 라디칼 중합화(예를 들어 촉매 사슬 전달 중합화, 개시이동종결인자(iniferter) 매개 중합화, 안정한 유리 라디칼 매개 중합화(SFRP), 원자 전달 라디칼 중합화(ATRP), 가역적 첨가-분획화 사슬 전달(RAFT) 중합화, 및 요오드 전달 중합화), 양이온 중합화, 및/또는 개환 중합화(ring-opening polymerization) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 중합화된 펜던트 기는 킬레이터, 용해도 보조기(들), 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 중합체의 개별 펜던트기는 킬레이터, 용해도 보조기, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 중합체의 펜던트기는 중합화 후 킬레이터 및/또는 용해도 보조기(들)의 첨가를 위해 관능화될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 일부 펜던트 기는 중합화 전에 킬레이터 및/또는 용해도 보조 기를 포함할 수 있다.
중합체는 PGE화된 펜던트 기와 같은, 중합체의 용해도에 도움이 되는(예를 들어 이를 증가시키는) 펜던트 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 금속 동위원소가 로딩되기 전 및/또는 후에 중합체의 용해도에 도움이 되는 펜던트기를 포함하도록 변형될 수 있다. 여기서, 펜던트 기는 펜던트 기 상에 금속 동위원소를 로딩하기 전 및 후에 중합체의 용해도에 도움이 되는 친수성 기를 포함한다. 이와 같이, 중합체의 하나 이상의 펜던트 기는 (예를 들어 중합체의 용해도에 도움이 되는) 반복되는 친수성 기의 사슬을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배위성 펜던트 기는 친수성 기를 포함할 수 있고/있거나 친수성 기를 포함하는 펜던트 기와 별개일 수 있다. 반복되는 친수성 기의 사슬은 중합체의 배위성 펜던트 기의 배위 화학에 영향을 미치지 않을 수 있다. 친수성 기는 PEG 기를 포함할 수 있다. 도움을 받은 (예를 들어 증가된) 중합체의 용해도는 금속 동위원소를 용액에 로딩하는 데 도움을 줄 수 (예를 들어 이를 증가시킬 수) 있다.
소정의 양태에서, (예를 들어 킬레이터 및/또는 용해도 보조 기를 갖는) 펜던트 기는 백본이 중합화될 때 혼입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 펜던트기, 용해도 보조 기(예를 들어 사슬), 또는 둘 다는 중합체 백본에 의해, 예컨대 당업계에 공지된 임의의 부착 화학에 의해 제공된 작용기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 용해도 보조기를 갖는 (킬레이터는 없는) 펜던트기에 대한 킬레이터를 갖는 펜던트기의 비율을 얻기 위해 일정 비율의 킬레이터 대 용해도 보조기를 중합체에 첨가될 수 있다. 적절한 부착 화학은 (예를 들어 카르보디이미드와의 반응과 같은) 카르복실-아민 반응 화학, (예를 들어 NHS 에스테르, 이미도에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 하이드록시메틸 포스핀 등과의 반응과 같은) 아민 반응 화학, (예를 들어 말레이미드, 할로아세틸 (브로모- 또는 요오드-), 피리딜디설파이드, 티오설포네이트, 비닐설폰 등과의 반응과 같은) 설프히드릴 반응성 화학, (예를 들어 하이라지드, 알콕시아민 등과의 반응과 같은) 알데히드 반응 화학, (예를 들어 이소티오시아네이트와의 반응과 같은) 하이드록실 반응 화학을 포함한다. 대안적인 부착 방법은 (예를 들어 DBCO-아지드 또는 TCO-테트라진에 의한) 스트레인 촉진 클릭 화학과 같은 클릭 화학을 포함한다.
중합체는 용해도 보조기를 포함할 수 있으며, 이들 중 적어도 일부는 사슬로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용해도 보조기는 금속 원자와 배위결합하지 않을 수 있다. 중합체는 용해도에 도움을 주기 위해 (예를 들어 증가시키기 위해) PEG화될 수 있다. 예를 들어, 중합체는 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 또는 적어도 500개의 PEG 단위(예를 들어 PEG 기)를 포함할 수 있다. PEG 단위는 복수의 펜던트 기에 걸쳐 분포될 수 있으므로, 중합체의 다수의 펜던트 기가 PGE화될 수 있다. 예를 들어, 적어도 일부 펜던트 기는 5개 초과, 10개 초과, 20개 초과, 30개 초과, 또는 40개 초과의 PEG 단위를 포함할 수 있다(예를 들어 사슬로 구성될 수 있음). 중합체 상의 PEG 단위의 수는 금속 동위원소가 중합체 상에 로딩되는 것을 도울 수 (예를 들어 증가시킬 수) 있다. 소정의 양태에서, 중합체 상의 모든 펜던트 기의 50% 미만은 지르코늄 및/또는 하프늄을 킬레이트화하고, 중합체 상의 모든 펜던트 기의 50% 초과는 복수의 PEG 단위를 포함한다. 예를 들어, 중합체 상의 펜던트 기의 60% 미만 및 30% 초과, 예컨대 50% 미만 및 40% 초과는 킬레이터를 포함할 수 있다.
소정의 양태에서, 중합체의 PEG화는 PEG 단위의 사슬을 중합체의 펜던트기에 부착하는 것을 포함할 수 있다. 사슬은 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 또는 50개 이상의 PEG 단위를 포함할 수 있다. PEG화된 펜던트 기는 킬레이터를 포함할 수 있거나, 킬레이터를 포함하는 펜던트 기와 별개일 수 있다. 킬레이터 및 용해도 보조기(예: PEG)의 양, 분포, 및/또는 비율은 동위원소 조성물을 중합체에 로딩하는 데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 킬레이터 및 용해도 보조기(예: PEG)의 양, 분포, 및/또는 비율은 중합체 상에 로딩될 수 있는 동위원소 조성물(예: 조성물의 풍부화된 동위원소)의 양을 (예를 들어 최대치의 80%, 90%, 또는 95% 이내에서) 최대화할 수 있다. 중합체의 로딩은 본원에서 추가로 논의된다.
(예를 들어 생물학적 활성 물질에 로딩되기 전, 로딩된 후, 및/또는 이에 접합된 후) 중합체는 응집되지 않을 수 있다(예를 들어 잘 응집되지 않을 수 있다). 예를 들어, 중합체의 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 또는 실질적으로 전부가 응집되지 않을 수 있다. 중합체는 로딩되지 않을 수 있고, 동위원소 조성물과 함께 로딩될 수 있고/있거나, 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 활성 물질에 접합될 수 있다. 중합체는 본원에 기술된 바와 같은 용액일 수 있다. 예를 들어, 중합체의 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 또는 실질적으로 전부가 응집되지 않을 수 있다. (예를 들어 본원에 기술된 추가 성분과 함께) 키트로 제공된 중합체는 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년 동안 안정적일 수 있다.
본원의 중합체는 (예를 들어 중합체 백본 상의 반복 단위에 부착된) 임의의 적합한 수의 펜던트기, 예컨대 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100개 초과의 펜던트 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 2 내지 100개, 5 내지 80개, 10 내지 50개, 또는 20 내지 40개의 펜던트 기를 포함할 수 있다.
방법 및 키트는 동위원소 조성물을 중합체 상에 로딩하기 위한 금속 로딩 완충액을 포함할 수 있다. 금속 로딩 완충액은 본원의 중합체 상에 로딩되기 전에 동위원소 조성물 용액과 혼합될 수 있다. 금속 로딩 완충액는 (예를 들어 질산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 과염소산, 염산 및 염소산 중 하나 이상과 같은 강산을 포함하는) 산성 용액일 수 있다. 동위원소 조성물은 본원의 중합체 상에 로딩하기에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 로딩 완충액은 아세트산염(예: 아세트산 알칼리), 예컨대 아세트산암모늄, 아세트산나트륨, 및/또는 탄산염 또는 중탄산염과 같은 다른 알칼리와 쌍을 이룬 아세트산염을 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 중합체의 모든 킬레이트화 기가 포화되지 않도록, 예를 들어 중합체 용해도를 개선하고/하거나 배경을 감소시키거나 SBP 결합에 대한 영향을 감소시키기 위해, 금속이 로딩될 수 있다.
중합체용 킬레이터
본원에서 사용되는 킬레이터는 함께 금속 원자와 배위결합하는(예를 들어 안정적으로 배위결합하는) 일군의 리간드를 지칭한다. 킬레이터는 중합체의 펜던트 기 상에 존재할 수 있고/있거나 중합체 백본 내로 혼입될 수 있다. 소정의 양태에서, 킬레이터는 중합체의 펜던트 기에 포함된다.
소정의 양태에서, 중합체는 하이드록사메이트(하이드록삼산과 본원에서 상호 교환 가능하게 사용됨), 아자마크로사이클, 페녹시아민, 살로펜, 시클람, 및/또는 이들의 유도체(들)와 같은 리간드를 포함하는 하나 이상의 펜던트기를 포함할 수 있다. 중합체는 하이드록사메이트, 아자마크로사이클, 페녹시아민, 살로펜, 또는 시클람을 포함하는, 당업계에 알려진 킬레이터 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 본원의 킬레이터는 지르코늄 원자 또는 하프늄 원자 상에서 6개 이상, 6개 초과, 또는 8개 부위에서 배위결합 수 있다. 예를 들어, 킬레이터는 지르코늄 또는 하프늄 중 적어도 하나와 옥타-배위 착화물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 지르코늄 또는 하프늄 중 적어도 하나는 중합체의 펜던트 기와 옥타-배위 착화물을 형성할 수 있다.
소정의 양태에서, 중합체의 킬레이터는 DFO 및/또는 이의 유도체와 같은, 하이드록시메이트기를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 중합체는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 킬레이터 또는 이의 유도체와 같은 아자마크로사이클을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 킬레이터는 (예를 들어 지르코늄 또는 하프늄 동위원소와 함께 로딩되거나 이와 별도로 제공된) DOTAM, DOTP, 및 DOTA 중 하나를 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 킬레이터는 DOTA와 비교했을 때 지르코늄 또는 하프늄의 결합이 개선된 (및 잠재적으로 란탄족에 대한 결합이 감소된) DOTA 유도체이다. 예를 들어, DOTA 유도체는 지르코늄 및/또는 하프늄 원자 상의 8개 부위에서 배위결합할 수 있고, 임의로 지르코늄 및/또는 하프늄의 결합(예를 들어 안정적 결합)을 돕는 리간드들 사이에서 간격을 포함할 수 있다. 예를 들어, DOTA 유도체는 란탄족 동위원소와 비교했을 때 지르코늄 및/또는 하프늄에 대한 증가된 결합을 가질 수 있다.
나노입자 및 중합체 상에서의 나노입자 합성
나노미터 크기의 금속 클러스터와 같은 금속 나노입자는 고밀도의 표지 원자를 제공하지만 많은 단점을 갖는다. SBP에 부착되기 위해 불활성 표면과 나노입자의 관능화는 비-중첩적이며, 일반적으로 SBP에 대한 다수의 부착 부위를 생성하게 된다. 작은 나노입자(예를 들어 10 nm 미만 또는 5 nm 미만)의 합성은 어려울 수 있으며, 입체 장애, 부족한 용해도, 부족한 콜로이드 안정성(응집), 및 비특이적 결합을 초래한다. 금속 클러스터 나노입자의 합성은 어려울 수 있다(예를 들어 고온이 필요할 수 있고 합성 조건에 민감할 수 있음). 나노입자는 크기가 균일하지 않을 수 있다.
소정의 양태에서, 금속 나노입자는 유기 안정화제와 같은 안정화제가 존재하는 가운데 중간 정도의 온도(예를 들어 100℃ 미만, 50℃ 미만, 또는 37℃ 미만)에서 합성될 수 있다. 예를 들어, 금속 나노입자는 양자 점(quantum dot)일 수 있다. 소정의 양태에서, 유기 안정화제는 시스테인과 같은 티올기를 포함할 수 있다.
소정의 양태에서, 안정화제는 캡핑제로서 작용할 수 있다. 안정화제는 중합체 상에 있을 수 있고, 나노입자는 중합체 상에서 합성될 수 있다. 중합체의 크기는 나노입자의 크기를 제한(예를 들어 조절)할 수 있다. 입자는 안정화제의 다수의 인스턴스를 제시하는 선형 또는 분지형 부분을 포함할 수 있다. 입자는 (중합체 상에서 합성된 나노입자를 포함하는) 중합체를 단일 SBP에 부착하기 위한 부착기를 추가로 포함할 수 있다. 질량 태그는 낮은 다분산도, 예컨대 1.5, 1.2, 또는 1.1 미만의 다분산 지수를 가질 수 있다. 이와 같이, 나노입자는 크기가 균일할 수 있다(예를 들어 1.5, 1.2, 또는 1.1 미만의 다분산 지수를 가질 수 있다). 대부분의 나노입자는 작은 직경, 예컨대 1 내지 10 nm, 1 내지 5 nm, 1 내지 3 nm, 1 내지 2 nm, 2 내지 5 nm, 2 내지 3 nm의 직경을 가질 수 있다. 나노입자는 카드뮴 또는 텔루륨과 같은 복수의 동위원소를 갖는 요소일 수 있지만, (카드뮴 또는 텔루륨의 풍부화된 동위원소와 같은) 동위원소의 비-천연 조성을 가질 수 있다. 나노입자는 단분산일 수 있다. 소정의 양태에서, 중합체는 복수의 나노입자를 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 중합체 상에서 시딩 나노입자 성장 속도는 성장 속도보다 느릴 수 있다. 나노입자가 급속하게 성장하면 중합체 상의 안정화기를 소비할 수 있으므로, 중합체는 다른 중합체 상에서 성장하는 나노입자와 결합하지 않는다. 나노입자가 성장함에 따라 중합체는 분산되어, 다수의 중합체가 동일한 나노입자에 결합하는 속도를 감소시킬 수 있다. 소정의 양태에서, 미리 형성된(미리 시딩된) 나노입자는 중합체 상에서 나노입자가 성장하기 전에 중합체와 혼합될 수 있다. 소정의 양태에서, 중합체는 안정화제의 10 내지 10000, 10 내지 1000, 10 내지 100, 10 내지 50, 20 내지 500, 또는 20 내지 100개의 인스턴스를 가질 수 있다. 소정의 양태에서, 중합체는 안정화제의 10 미만, 또는 심지어 단일 인스턴스를 가질 수도 있고, 용액에 존재하는 안정화제는 중합체 상에서 나노입자를 성장시킬 수 있다. 중합체 상에서 나노입자를 합성하는 동안 중합체에 대한 동일하거나 상이한 안정화제가 용액으로 제공될 수 있다.
전술한 바와 같이, 작은 카드뮴(CdSe, CdS, 및 CdTe) 나노입자가 티올-알코올 안정화제 또는 티올-산 안정화제의 존재 하에 형성될 수 있다. 시스테인 안정화된 단분산 CdsS 나노입자의 합성에 이러한 나노입자가 시딩될 수 있다. 큰 폴리(시스테인) 중합체 상에서의 금 나노입자의 합성 및 결합은 균일한 크기, 단분산성, 또는 금 나노입자에 대한 안정화제 또는 캡핑제로서 작용하는 시스테인을 나타내지 않을 상태로 보고되어 왔다. 참고로, 이들 나노입자의 합성은 중간 정도의 온도에서 수행하였다.
양태는, 풍부화된 동위원소를 포함하고 폴리시스테인 중합체와 같은 티올 제시 중합체 상에서 합성된 Cd 또는 CdTe 나노입자; 및 SBP에 대한 질량 태그로서 이러한 나노입자의 용도를 포함한다. 소정의 양태에서, SBP 자체가 (예를 들어 환원된 항체에 의해 제시된) 티올기와 같은 안정화제를 제공할 수 있고, 나노입자는 SBP 상에서 직접 합성될 수 있다. 티올기가 SBP의 결합 부위에 근접하지 않은 경우, 직접 합성은 나노입자가 결합을 입체적으로 간섭하지 않게 할 수 있다.
신호 증폭을 위한 혼성화 체계
질량 태그된 올리고뉴클레오티드는 표적 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 또는 간접적으로 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드는 복수의 질량 태그된 올리고뉴클레오티드가 혼성화되어 신호를 증폭할 수 있는 스캐폴드를 제공할 수 있다. 따라서, 본원의 양태는 혼성화 기반 신호 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
표적 올리고뉴클레오티드는 세포에 내인성인 DNA 또는 RNA 분자(예컨대 코딩 RNA, 소형 간섭 RNA, 또는 마이크로 RNA)일 수 있다. 표적 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다. 표적 올리고뉴클레오티드는 알려진 특이적 서열(또는 알려진 특이적 서열과 상동인 서열)을 가질 수 있다. 소정의 양태에서, 항체 또는 이의 유도체와 같은 SBP는 표적 올리고뉴클레오티드에, 예컨대 알려진 서열을 포함하는 합성 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 이러한 경우, 항체 및 올리고뉴클레오티드 모두가 SBP로서 지칭될 수 있다.
샘플 내의 분석물에 SBP가 결합한 후, 복수의 질량 태그된 올리고뉴클레오티드는 제1 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 또는 간접적으로 혼성화될 수 있다. 혼성화는 분지형 또는 선형일 수 있다. 소정의 양태에서, 중합효소는 템플릿을 따라 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 추가적인 혼성화 부위를 제공할 수 있다. 질량 태그된 올리고뉴클레오티드는 단일 표지 원자를 포함할 수 있거나, 다수의 표지 원자를 포함하는 중합체를 포함할 수 있다. 질량 태그된 올리고뉴클레오티드는 중금속 원자와 같은 표지 원자를 올리고뉴클레오티드 자체의 화학 구조 내에 포함할 수 있다.
소정의 양태에서, 질량 태그된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 고감도 중합체 또는 나노입자로 질량 태그될 수 있다.
큰 질량 태그 입자
직관과는 반대로, (예를 들어 직경이 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 또는 1 um보다 더 큰) 큰 질량 태그 입자는 더 작은 입자(예를 들어 나노입자) 질량 태그에 비해 배경을 감소시킬 수 있고/있거나 SBP 결합의 파괴를 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 샘플 또는 기저 기질에 대한 질량 태그의 비-특이적 (및 비-공유) 결합은 질량 태그를 세척하여 결합되지 않은 태그를 제거하는 데 인가된 힘에 비해 더 큰 질량 태그 입자에서 감소될 수 있다. 구체적으로, 비특이적 결합은 입자의 표면적에 따라 커질 수 있는 반면, 질량 태그의 적극적 세척 하에 비특이적 결합을 파괴하는 힘은 질량 태그의 중량에 따라 더 커질 수 있다(입자 직경이 증가되었을 때의 표면적에 비해 기하급수적으로 커짐).
또한, SBP는 질량 태그에 결합하는 다수의 기를 제시할 수 있고(예컨대 복수의 티올기를 제시하는 환원된 항체), 입자 질량 태그는 다수의 SBP 부착기를 제공할 수 있다. 더 작은 질량 태그 입자(예를 들어 10 nm 미만, 50 nm 미만, 또는 100 nm 미만)는 이러한 SBP와 가교 결합될 수 있다. 대조적으로, 더 큰 질량 태그 입자(예를 들어 200 nm, 500 nm, 또는 1 um 초과)는 SBP 상에서 대부분의 부착기에 결합할 수 있고/있거나 다른 더 큰 질량 태그 입자가 동일한 SBP 분자에 결합하는 것을 입체 장애를 통해 방지할 수 있다.
큰 질량 태그 입자는 큰 나노입자, 금속 킬레이트기를 포함하는 분지형 또는 과다분지형 중합체 또는 매트릭스, 또는 금속 원자를 포획하는 중합체(예컨대, 폴리스티렌)와 같은 (예를 들어 SBP에 결합하기 위해 표면이 코팅/캡핑되고 관능화된) 콜로이드성 금속 클러스터를 포함할 수 있다.
차단 시약
차단 시약(즉, 하나 이상의 차단 시약)은 질량 태그 SBP의 비특이적 결합을 방지하는 데 사용될 수 있다. 차단 시약은, 현탁액 중의 세포 또는 고형 지지체 상의 세포 샘플, 예컨대 슬라이드 상의 조직 절편과 같은 세포 샘플에 첨가될 수 있다. 질량 태그 SBP는 차단 시약의 첨가 후에 세포 샘플에 첨가되고/되거나 차단 시약과 세포 샘플의 혼합물에 첨가될 수 있다. 소정의 양태에서, 사용되는 차단 시약의 농도(예: 몰 농도)는 질량 태그 SBP보다 과량(예컨대, 적어도 5, 10, 20, 50, 또는 100배의 양)일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 질량 태그 중합체(및 특히 고감도 중합체)는 약간의 배경(예를 들어 표적 분석물을 발현하지 않는 세포 상의 신호 및/또는 에지 효과 및 반점과 같은 인공적 특징)을 가질 수 있다.
전통적인 차단 시약은 혈청(예: BSA), 젤라틴, 마이크(또는 카제인 단백질)를 보통은 완충액 중 1% 초과 또는 심지어 5% 초과의 농도로 포함한다. 하나 이상의 전통적인 차단 시약에 대안적으로 또는 추가적으로, (예를 들어 SBP에 접합되지 않은) 하나 이상의 중합체 차단 시약이 사용될 수 있다. 중합체 차단 시약은 선형 또는 분지형 중합체일 수 있고, 극성 용해도 향상기 및/또는 하전된 기를 포함할 수 있다. 중합체 차단 시약은 본원에 기술된 고감도 중합체가 태그된 SBP의 비특이적 결합을 방지하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, (예를 들어 평균 30개 초과의 표지 원자를 갖는) 고감도 중합체는 더 적은 표지 원자를 갖는 중합체, 예컨대 조직 슬라이드의 표면(예를 들어 유리 표면)과 비교해 비특이적 결합을 증가시킬 수 있다.
소정의 양태에서, 중합체 차단 시약은 SBP에 부착된 질량 태그와 동일하거나 유사한 중합체 백본을 포함할 수 있고/있거나, (예를 들어 BSA와 같은 전통적인 차단 시약에 추가로) DOTA, DTPA, EDTA, 및/또는 이들의 유도체와 같은 금속 킬레이트화 기를 가질 수 있다. 중합체 차단 시약은 SBP에 결합되지 않은 (예를 들어 임의의 생체분자에 결합되지 않은) 중합체 질량 태그 또는 비특이적 생체분자(예컨대 올리고뉴클레오티드 랜도머(randomer))에 결합된 중합체 질량 태그이거나, 표적 분석물(예컨대 BSA)에 특이적으로 태그되지 않는 단백질일 수 있다. 중합체 질량 태그 차단 시약은 임의의 SBP에 대한 표지 원자로서 사용되지 않는 금속 동위원소, 예를 들어 검출 범위 밖에 있거나 이미 세포에 내인성인 동위원소와 함께 로딩될 수 있다. 중합체 질량 태그를 금속 동위원소와 함께 로딩하면 중합체 질량 태그를 SBP의 질량 태그와 화학적으로 유사하게 만들 수 있고, 질량 태그된 SBP와 유사한 방식으로 중합체 질량 태그를 비특이적으로 결합시킬 수 있다. 중합체 질량 태그로 차단하면 질량 태그된 SBP의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 소정의 양태에서, (예를 들어 질량 태그 중합체 상에 로딩된 금속의 질량 채널을 픽셀에 걸쳐 IMC에 의해 측정함으로써 결정했을 때) 중합체 질량 태그 차단 시약의 분포를 사용하여 질량 태그된 SBP의 보고된 양을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 질량 태그된 SBP로부터의 신호를 중합체 질량 태그 차단 시약으로부터의 신호로 정규화될 수 있다.
소정의 양태에서, 중합체 차단 시약은 킬레이트화 기를 포함하지 않는 하전된 중합체와 같은 친수성 중합체를 포함할 수 있다. 친수성 중합체는 극성 또는 하전된 작용기를 함유함으로써 수용성이 된다. 이 섹션 내에서, 대부분의 친수성 중합체는 이들의 구조의 화학별로 그룹화된다. 예를 들어, 아크릴계는 아크릴산, 아크릴아미드, 및 말레산 무수물 중합체 및 공중합체를 포함한다. 아민-작용성 중합체는 알릴아민, 에틸렌이민, 옥사졸린, 및 이들의 주쇄 또는 측쇄에 아민기를 함유하는 다른 중합체를 포함한다.
소정의 양태에서, 하전된 중합체는 복수의 음으로 하전된 기(및 임의로 순 음전하), 복수의 양전하된 기(및 임의로 순 양전하)를 가질 수 있거나, 쌍성이온성일 수 있다(예를 들어 서로 근위에 있고, 예컨대 서로 20, 10, 5, 3, 또는 2개의 결합 이내에 있고, 중성 pH에서 강산성 기/강염기성 기와 같은 양으로 하전된 기와 음으로 하전된 기 모두를 가질 수 있다). 쌍성이온성 중합체는 양으로 하전된 서브유닛과 음으로 하전된 서브유닛 모두의 공중합체일 수 있고, 하나 이상의 아크릴 단량체를 가질 수 있다. 쌍성이온성 중합체는 중합 양성 전해질(polyampholyte) 또는 폴리베타인(polybetaine)일 수 있다. 쌍성이온성 중합체는 쌍성이온성 기, 예컨대 암모니오포스페이트 (포스포베타인 또는 레시틴 유사체), 암모니오포스포네이트 (포스포노베타인), 암모니오포스피네이트 (포스피노베타인), 암모니오설포네이트 (설포베타인 메타크릴레이트와 같은 설포베타인), 암모니오설페이트, 암모니오카르복실레이트 (카르보- 또는 카르복시베타인), 암모니오설폰아미드, 암모니-설폰-이미드, 구아니디니오카르복실레이트 (아스파라긴 유사체), 피리디니오카르복실레이트, 암모니오(알콕시)디시아노에테놀레이트, 암모니오보로네이트, 설포니오카르복실레이트, 포스포니오설포네이트, 포스포니오카르복실레이트, 옥시피리딘 베타인을 포함할 수 있다.
적절한 친수성 중합체는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (PNIPAM) 및 폴리아크릴아미드 (PAM), 폴리(2-옥사졸린) 및 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리(아크릴산), 폴리메타크릴레이트 및 기타 아크릴 중합체, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올) (PVA) 및 공중합체, 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 공중합체, 및 다가전해질 및/또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. Sigma와 같은 공급자는 이러한 친수성 중합체의 광범위한 카탈로그를 제공한다.
이러한 중합체는 유리 라디칼 중합화(FRP), 단계-성장, 및/또는 개환 복분해 중합화(Ring-opening metathesis polymerization, ROMP)를 포함하는 복수의 중합화 기술에 의해 합성될 수 있다. 중합화는 상이한 단량체의 교번적인 혼입을 허용할 수 있다. 중합체 차단 시약은 염 또는 용액으로 제공될 수 있다.
하전된 중합체는 중합체 질량 태그와 유사한 화학적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 중합체 질량 태그의 킬레이트화 기는 금속과 결합되지 않는 경우 음전하를 가질 수 있고/있거나 금속이 로딩된 경우 약간의 양전하를 가질 수 있다. 금속이 로딩된 중합체 질량 태그는 금속이 로딩된 각각의 킬레이트화 기를 갖지 않을 수 있다(예를 들어 로딩 효율은 100% 미만, 예컨대 90% 미만, 80% 미만, 또는 70% 미만일 수 있다). 이와 같이, 금속이 로딩된 중합체 질량 태그는 하전된 기를 가질 수 있고, 쌍성이온성일 수 있다. 이와 같이, 하전된 중합체 차단 시약은 특정 중합체 질량 태그가 달리 비특이적으로 결합할 샘플 상의 표면(예를 들어 생체 분자의 특정 부류 및/또는 샘플 자체의 지지부)을 차단할 수 있다. 하전된 중합체 차단 시약은 저 농도로, 예컨대 10중량%, 5중량%, 1중량%, 0.5중량%, 또는 0.1중량% 미만의 농도로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 차단 시약은 질량 태그된 SBP의 비특이적 결합을 50% 초과, 75% 초과, 또는 90% 초과만큼 감소시킬 수 있다. 비특이적 결합의 감소는 동일한 질량 태그된 SBP를 갖는 2개의 연속 조직 절편을 염색하되, 하나의 절편만 차단한 상태로 염색하고, 질량 태그된 SBP로부터의 신호가 감소되는 면적을 평가함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 비특이적 결합이 특징적인 패턴(예를 들어 에지 효과 또는 반점)을 갖는 경우, 비특이적 결합의 감소는 패턴 발생 및/또는 강도의 감소로서 평가될 수 있다.
소정의 양태에서, 키트는 질량 태그(예를 들어 SBP에 임의로 부착된 태그) 및 본원에 기술된 중합체 차단 시약을 포함할 수 있다.
소정의 양태에서, (예를 들어 본원에서 논의된 바와 같은) 금속 나노입자는 질량 태그로서 사용될 수 있고, 본원에서 논의된 중합체 차단 시약으로 차단(예를 들어 부동태화)될 수 있다. 나노입자는 실리카 코팅된 란탄족이거나, 비-란탄족 금속 산화물 나노입자와 같은 비-란탄족 나노입자일 수 있다. 금속 나노입자 질량 태그(예를 들어 고형 금속 클러스터를 갖는 금속 나노입자)의 숙제는 SBP의 부착을 위한 표면 관능화, 샘플에 대한 비특이적 결합, SBP(예를 들어 항체 또는 이의 유도체)의 비특이적 흡착, 부족한 용해도, 및/또는 단분산성을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 중합체 차단 시약으로 금속 나노입자 질량 태그를 코팅하면 이러한 특성 중 하나 이상을 완화시킬 수 있다. 중합체 차단 시약은 표면 관능화 전에, 표면 관능화 도중에(예를 들어 중합체 차단 시약은 부착기를 포함하는 분자와 가교 결합되거나, 그 자체로 SBP의 부착기를 포함할 수 있음), 표면 관능화 후에(예를 들어 노출된 금속 클러스터 코어의 임의의 잔여 표면을 차단하기 위해), SBP 부착 전에(예를 들어 SBP의 비특이적 흡착을 감소시키기 위해), 및/또는 SBP 부착 후에(예를 들어 샘플에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위해) 나노입자에 첨가될 수 있다.
이차 친화도 SBP와의 조합
예를 들어, 상이한 종 유래의 일차 항체에 대한 상이한 이차 항체는 복수의 표적 분석물에 대한 신호 증폭을 허용할 수 있다. 이차 항체는 일차 항체의 Fc 부분 상에서 다수의 부위에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이차 SBP가 일차 SBP에 사용된 형광단 또는 다른 태그에 결합할 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 신호 증폭 방법은 상이한 SBP에 대해 상이하게 작용할 수 있고, 항체와 같은 특정 SBP의 상이한 유형에 대해서도 상이하게 작용할 수 있다. 이와 같이, 2차 SBP를 신호 증폭 방법을 위해 제조될 수 있고(또는 이에 사용될 수 있고), (예를 들어 낮은 배경 및 강한 신호를 결정하기 위해) 검증될 수 있고, 그런 다음 (예를 들어 상이한 실험에 걸쳐) 다양한 상이한 1차 SBP 분석물을 검출하는데 사용될 수 있다.
비오틴-아비딘이 이차 친화도로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘에 결합된 일차 SBP는 비오틴화된 질량 태그의 부착을 위한 4개의 부위를 제공하게 된다. 비오틴 및 아비딘의 유도체는 본 출원의 범주에 포함된다.
효소적 침착과의 조합
소정의 양태에서, SBP는 HRP와 같은 효소와 접합될 수 있다. 본원에 기술된 질량 태그, 예컨대 질량 태그 중합체(예를 들어 고감도 중합체)는 효소에 의해 불용성이 된/되거나 생물학적 샘플에 결합하도록 효소에 의해 변형된 수용성 기질에 접합될 수 있다. 소정의 양태에서, 효소적 절단은 기질을 불용성으로 만들어, 결합된 질량 태그를 침착시킬 수 있다. 적절한 효소는 산화-환원효소(예: 퍼옥시다아제), 인산분해효소(예: 알칼리 인산분해효소), 락타마아제(예: β-락타마아제), 및 갈락토시다아제(예: β-D-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제)를 포함한다. HRP 기질은 3,3'-디아미노벤지딘(DAB), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산](ABTS), o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD), 및 이들의 유도체를 포함한다. AP 기질은 니트로블루 테트라졸리움 염화물(NBT), 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP), 및/또는 p-니트로페닐 포스페이트(PNPP), 및 이들의 유도체를 포함한다. 글루코스 옥시다아제 기질은 니트로블루 테트라졸리움 염화물(NBT)을 포함한다. β-갈락토시다아제 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인도일-β-D-갈락토피라노시드(BCIG 또는 X-Gal)를 포함한다. 예를 들어, 효소는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 또는 이의 유도체일 수 있고, 기질은 티라미드 모이어티 또는 이의 유도체, 예컨대 금속-킬레이트화 티라미드 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 기질은 란탄족 또는 이의 동위원소와 같은 금속에 부착된 티라미드 모이어티 및 킬레이터(예컨대 DTPA, DOTA, 또는 이들의 유도체)를 포함하는 티라미드 유도체일 수 있다. 효소는 베타-갈락토시다아제(베타 Gal), 알칼리 인산분해효소(AP), 및/또는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)일 수 있다. 소정의 양태에서, 효소가 비활성화된 다음, 동일한 효소가 부착된 새로운 SBP가 (예를 들어 상이한 표지 원자를 가진) 상이한 질량 태그를 침착시키는 데 사용될 수 있다.
기질은 기질 상에 로딩될 금속(예를 들어 기질의 DTPA 또는 DOTA 킬레이터)과 별개로 제공될 수 있다. 대안적으로, 기질은 금속이 미리 로딩된 상태로 제공될 수 있다.
소정의 양태에서, 금속 킬레이트화(예: DTPA 또는 DOTA 변형된) 티라미드 유도체와 같은 기질은 (예를 들어 세포 또는 조직 샘플이 장착된 기질에 비특이적으로 접착되고/되거나 효소에 의한 침착을 방지하는) 응집체를 형성할 수 있다. 이러한 응집체는, 티라미드 유도체의 다수의 인스턴스가 티라미드 유도체의 다수의 인스턴스에 걸쳐 금속과 부분적으로 배위결합하는 경우에 형성될 수 있다. 이와 같이, 상응하는 효소가 태그된 샘플에 기질을 도포하기 전에(예를 들어 하루 미만 전에, 4시간 미만 전에, 2시간 미만 전에, 1시간 미만 전에, 또는 30분 미만 전에) 기질을 여과하여, 응집체를 제거할 수 있다. 티라미드 유도체는 1 kDa 미만일 수 있지만, 필터는 50 kDa 이상의 필터일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 금속(예를 들어 란탄족) 또는 이의 동위원소는, 상응하는 효소가 태그된 샘플에 기질을 도포하기 전에(예를 들어, 하루 미만 전에, 4시간 미만 전에, 2시간 미만 전에, 1시간 미만 전에, 또는 30분 미만 전에) 기질 상에 (예를 들어 기질의 DTPA 또는 DOTA와 같은 킬레이터 상에) 로딩될 수 있다.
소정의 양태에서, 증착 속도 및/또는 정도를 증가시키기 위해 촉매(즉, 인핸서)가 기질과 함께 첨가될 수 있다. 소정의 양태에서, 효소에 의한 기질의 증착을 조절된 방식으로 종결하기 위해 종결 시약이 (예를 들어 세척 완충액으로) 첨가될 수 있다. 촉매 및/또는 종결 시약을 사용하면 반응의 범위를 추가로 조절하여 신호 향상을 개선하고/하거나 표적을 더 양호하게 정량화할 수 있다. 소정의 양태에서, 종결 시약 또는 다른 시약은, 효소의 또 다른 인스턴스가 상이한 표적과 결합될 수 있고, 상이한 금속(예를 들어 란탄족) 또는 이의 동위원소를 포함하는 기질이 도포될 수 있도록 효소를 비활성화시킨다. 이와 같이, 효소적 증착은 상이한 금속(예를 들어 란탄족) 또는 이의 동위원소로 기질을 순차적으로 침착시킴으로써 다수의 상이한 표적에 대해 수행될 수 있다.
예를 들어, 티라미드 유도체의 HRP 침착을 위한 촉매는 라디칼 형성 속도를 증가시킬 수 있다(예를 들어 전자 매개체일 수 있음). 예를 들어, 6-하이드록시벤조트리아졸, p-요오드페놀과 같은 요오드페놀, p-쿠마르산과 같은 쿠마르산은 G. H. G. Thorpe 및 L. J. Kricka에 의해 문헌[Methods Enzymol. 1986; 133:331]에 기술되어 있고; 방향족 아민은 미국 특허 제4,279,950호에 기술되어 있고; 아세트아닐리드는 유럽 특허 출원 제603953호(1994)에 기술되어 있고; N-치환된 인도페놀 및 페노티아진, 및 인도페닐은 미국 특허 제5,171,668호에 기술되어 있고; 치환된 보론산은 미국 특허 제5,629,168호에 기술되어 있다. 이러한 매개체는, 예컨대 미국 특허 제7,803,573호에 의해 화학 발광을 위한 것으로 기술되었다. 소정의 양태에서, 촉매는 (퍼보레이트 또는 이소보레이트와 같은) 보레이트, 아세테이트 완충액, 및/또는 설폰산염 중 하나 이상을 포함하는 완충 용액에 적용될 수 있다.
소정의 양태에서, 수 분 이내의 상기 촉매 강화 반응에 사용하기 위한, 예를 들어 실온에서 또는 더 높은 온도에서 예컨대 5분 미만, 또는 3분 미만의 촉매화된 HRP 침착에 사용하기 위한 종결 시약이 제공될 수 있다. 종결 시약은 과산화수소수와 같은 과산화물은 HRP를 일시적으로 또는 영구적으로 불활성화하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 종결 시약은 아지드와 같은 라디칼 형성을 퀀칭하기 위한 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 마이크로파 처리, 온도 상승(예를 들어, 50℃ 초과, 예컨대 60℃ 초과), 또는 낮은 pH(예를 들어 pH 4 미만)와 같은 조건이 HRP를 일시적으로 또는 영구적으로 불활성화하도록 적용될 수 있다. 소정의 양태에서, 종결 시약은 세척 완충액에 적용될 수 있고/있거나 1분 이상 동안 인큐베이션될 수 있다. 소정의 양태에서, HRP에 접합된 다른 SBP가 종결 반응 후에 적용되어, 상이한 티라미드 유도체 질량 태그가 상이한 표적과 연속적으로 결합되는 다중화 반응을 허용할 수 있다. 질량 태그의 효소 기반 침착이 1회 이상 수행된 후, 복수의 상이한 질량 태그된 SBP를 이용한 다중화 및 동시 염색 단계가 수행될 수 있다. 그런 다음, 샘플을 LA-ICP-MS 또는 SIMS와 같은 영상 질량 분광분석에 의해 분석할 수 있다.
소정의 양태에서, 다중화는 HRP에 접합된 올리고뉴클레오티드를 항체와 같은 SBP에 접합된 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 또는 간접적으로 혼성화함으로써 이루어질 수 있다. 이는 HRP를 표적에 결합시키고, 새로운 질량 태그된 티라미드를 침착시키고, 불활성화한 다음, 새로운 올리고뉴클레오티드-HRP 접합체로 반복하는 더 빠른 시퀀스를 가능하게 할 수 있다. 이러한 시스템에서, 복수의 올리고뉴클레오티드-SBP가 조기에 샘플에 동시 도포될 수 있다. 혼성화를 통해 HRP를 표적과 결합시키는 것은 항체 염색보다 더 빠를 수 있고, 이어지는 불활성화 단계 후 샘플에 가해지는 손상에 민감하지 않을 수 있다.
따라서, 효소 침착을 위한 키트는 티라미드 또는 이의 유도체와 같은 기질, 및 란탄족 또는 이의 동위원소와 같은 금속을 포함할 수 있다. 금속은 기질 상에 미리 로딩될 수 있거나, 기질 상에 로딩되도록 별도로 제공될 수 있다. 소정의 양태에서, 키트는 질량 태그 티라미드 유도체를 제공할 수 있고, 전술한 바와 같은 촉매 시약, 종결 시약, 완충액, 및/또는 필터를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 논의된 추가의 성분을 본원의 다른 실시예에서 추가로 포함할 수 있다.
이중 태그화
영상 질량 세포분석을 위한 신호 증폭은 형광 태그화와 조합되어, 형광 현미경에 의한 관심 영역의 식별 및/또는 질량 세포분석 이미지와 형광 이미지의 공동등록을 가능하게 할 수 있다. 소정의 양태에서, SBP는 본원에 기술된 바와 같이 질량 태그될 수 있고 형광단 태그에 부착될 수도 있다. 이러한 이중 태그화는 SBP 상의 동일한 부착기에 부착된 동일한 링커를 통해 이루어질 수 있다.
단일 분자 검출
소정의 양태에서, 신호 증폭은 한 번에 단일 SBP의 검출을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 고감도, 고해상도, 및 빠른 픽셀 획득 속도를 제공하는 영상 질량 세포분석 기기는 신호 증폭 시약 및/또는 본원에 기술된 방법을 사용해 태그된 단일 SBP 질량의 검출을 가능하게 할 수 있다. 이와 같이, 신호 증폭 질량 태그는 동위원소의 표적 바코드(고유한 조합)를 포함함으로써, 표적 다중성을 극적으로 증가시킬 수 있다. 동위원소의 조합은 혼합물에서 자연적으로 발생하지 않는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 상이한 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 20개의 상이한 동위원소 중 6개의 고유한 조합을 갖는 표적 바코드 질량 태그는 20C6의 순열에 의한 38,760개의 고유한 바코드를 허용하는데, 이들 중 어느 하나는 상이한 SBP를 태그하는 데 사용될 수 있다. 또한, 표적 바코드화된 SBP는 상이한 동위원소 비율에 기초하여 구별될 수 있다. 소정의 양태에서, 표적 바코드화된 질량 태그는 동위원소의 고유한 조합을 함께 제공하는 질량 태그된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 체계일 수 있다.
키트
질량 세포분석을 위한 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 전술한 성분의 임의의 조합이 키트로 제공될 수 있다. 키트는 질량 태그(예를 들어 중합체 질량 태그), 동위원소 조성물, 동위원소 조성물이 로딩된 중합체, 별도로 제공되는 중합체 및 동위원소 조성물, 또는 동위원소 조성물이 로딩되고 항체에 접합된 중합체를 포함할 수 있다.
키트는 동위원소 조성물을 중합체 상에 로딩하고/하거나 로딩된 중합체를 생물학적 활성 물질에 결합시키기 위한 임의의 추가 성분(예를 들어 완충액, 필터 등)을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 키트는 질량 세포분석을 위한 추가 시약, 예컨대 완충액, 표준, 세포 바코드, 및/또는 상이한 질량의 중 원자를 포함하는 시약(예를 들어 생물학적 활성 물질에 부착되거나, 생물학적 활성 물질에 부착되도록 제공된 질량 태그)을 포함할 수 있다.
키트는 전술한 동위원소 조성물과 별개이며 이와 구별 가능한(예를 들어 상이한 질량의 풍부화된 동위원소를 갖는) 추가 동위원소 조성물을 포함할 수 있다. 추가 동위원소 조성물은 지르코늄, 하프늄, 및/또는 란탄족 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 란탄족을 (예를 들어 안정적으로) 킬레이트화하지만 지르코늄 또는 하프늄은 킬레이트화하지 않는 복수의 펜던트기를 포함하는 추가 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 소정의 양태에서, 키트는 구별되는 동위원소 조성물이 로딩된 중합체에 공유 결합된 복수의 항체(예를 들어 상이한 표적에 대한 항체)를 포함할 수 있다. 이러한 항체 집합체는 단일 패널에 함께 제공될 수 있다. 패널은 용액으로 제공되거나, 10질량% 미만, 5질량% 미만, 4질량% 미만, 3질량% 미만, 2질량% 미만, 또는 1질량% 미만의 수분을 포함하는 동결건조된 혼합물로 제공될 수 있다.
Claims (39)
- 적어도 하나의 표적 분석물의 신호 증폭을 이용한 질량 세포분석 방법으로서, 상기 방법은
샘플 내의 표적 분석물에 결합하는 SBP와 세포 샘플을 접촉시키는 단계;
100개 초과의 표지 원자를 SBP에 의해 결합된 표적 분석물과 결합시켜 신호를 증폭시키는 단계;
질량 분광분석에 의해 표지 원자를 검출하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 표지 원자의 배경은 10% 미만인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SBP는 질량 태그에 접합되는, 방법.
- 제3항에 있어서, 질량 태그는 금속 킬레이트화 금속기를 포함하는 중합체 질량 태그인, 방법.
- 제4항에 있어서, 질량 태그는 고감도 중합체이고, 고감도 중합체는 30개 초과의 표지 원자를 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 질량 태그는 나노입자 질량 태그인, 방법.
- 제6항에 있어서, 나노입자 질량 태그는 중합체 차단 시약으로 부동태화되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 복수의 질량 태그가 분지형 이종기능성 링커를 통해 SBP에 부착되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 질량 태그는 30개 미만의 표지 원자에 결합된, 또는 이에 결합할 수 있는 저 분자량 질량 태그 중합체인, 방법.
- 제9항에 있어서, 이종기능성 링커는 클릭 화학에 의해 SBP 또는 질량 태그에 부착되는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, SBP에 접합되지 않는 중합체 차단 시약으로 세포 샘플을 차단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 중합체 차단 시약은 금속이 첨가된 킬레이트화 기를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 중합체 차단 시약은 양으로 하전된 기 및/또는 음으로 하전된 기를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SBP는 소 모이어티 SBP인, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭은 혼성화 체계를 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 신호 증폭은 질량 태그된 올리고뉴클레오티드를 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 또는 간접적으로 혼성화하는 것을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 표적 분석물에 결합된 항체 또는 이의 유도체에 접합된 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 초과의 상이한 표적 분석물에 대한 신호 증폭 단계를 추가로 포함하되, 상이한 표적 분석물과 결합된 표지 원자는 질량 분광분석에 의해 구별될 수 있는, 방법.
- 제18항에 있어서, 표적 분석물 중 적어도 하나는 단백질인, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 표적 분석물 중 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 동일한 표적 분석물에 결합하는 복수의 SBP는 동일한 큰 질량 태그 입자에 접합되는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 신호 증폭 키트.
- 질량 세포분석을 위한 신호 증폭 키트로서,
30개 초과의 표지 원자를 포함하거나 30개 초과의 표지 원자에 결합할 수 있는 질량 태그를 포함하되,
질량 태그는 SBP에 부착되거나 SBP에 부착되도록 기능화되는, 키트. - 제23항에 있어서, 분지형 이종기능성 링커를 추가로 포함하는, 키트.
- 제24항에 있어서, 분지형 이종기능성 링커는 질량 태그에 부착하기 위한 클릭 화학기의 다수의 인스턴스를 포함하는, 키트.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 복수의 질량 태그가 분지형 이종기능성 링커에 의해 SBP의 동일한 부착 부위에 부착되는, 키트.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 차단 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 태그는 SBP에 부착되는, 키트.
- 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 태그의 복수의 인스턴스가 분지형 이종기능성 링커를 통해 하나의 부착 부위에서 SBP에 부착되는, 키트.
- 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 태그는 금속 킬레이트화 기를 포함하는 고감도 중합체인, 키트.
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 동위원소 조성물을 추가로 포함하는, 키트.
- 제31항에 있어서, 동위원소 조성물은 동위원소가 풍부화된 것인, 키트.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 동위원소 조성물은 질량 태그 상에 로딩될 수 있는, 키트.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 동위원소 조성물은 질량 태그 상에 로딩되는, 키트.
- 제34항에 있어서, 질량 태그는 SBP에 부착되는, 키트.
- 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 혼성화 기반 신호 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 키트.
- 신호 증폭 SBP를 제조하는 방법으로서,
분지형 이종기능성 링커를 SBP 상의 하나 이상의 부착 부위에 부착하는 단계;
복수의 질량 태그를 분지형 이종기능성 링커에 부착하는 단계를 포함하되,
분지형 이종기능성 링커를 SBP에 부착하는 것은 질량 태그를 분지형 이종기능성 링커에 부착하는 것과 다른 수단에 의한 것인, 방법. - 제37항에 있어서, 분지형 이종기능성 링커를 SBP 또는 질량 태그에 부착하는 것은 클릭 화학에 의한 것인, 방법.
- 제37항에 있어서, 질량 태그는 적어도 30개의 표지 원자를 포함하는 고감도 중합체인, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962949805P | 2019-12-18 | 2019-12-18 | |
| US62/949,805 | 2019-12-18 | ||
| PCT/US2020/066012 WO2021127435A1 (en) | 2019-12-18 | 2020-12-18 | Mass cytometry reagents and methods for signal amplification |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220117277A true KR20220117277A (ko) | 2022-08-23 |
Family
ID=76478010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227024128A KR20220117277A (ko) | 2019-12-18 | 2020-12-18 | 질량 세포분석 시약 및 신호 증폭 방법 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230236105A1 (ko) |
| EP (1) | EP4077416A4 (ko) |
| JP (1) | JP2023507386A (ko) |
| KR (1) | KR20220117277A (ko) |
| CN (1) | CN115135680A (ko) |
| CA (1) | CA3162257A1 (ko) |
| WO (1) | WO2021127435A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023049276A1 (en) * | 2021-09-23 | 2023-03-30 | Standard Biotools Canada Inc. | Spatial barcoding for suspension mass cytometry |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10048417A1 (de) * | 2000-09-29 | 2002-04-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Verbindungen mit verzweigtem Linker |
| US7332613B2 (en) * | 2003-06-06 | 2008-02-19 | President And Fellows Of Harvard College | Capture and release based isotope tagged peptides and methods for using the same |
| EP2021793B1 (en) * | 2006-05-27 | 2017-04-26 | Fluidigm Canada Inc. | Polymer backbone element tags |
| WO2012003478A2 (en) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Ventana Medical Systems, Inc. | Detecting targets using mass tags and mass spectrometry |
| WO2016090356A1 (en) * | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Fluidigm Canada Inc. | Mass cytometry imaging |
| CA3029183A1 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Fluidigm Canada Inc. | Systems, methods and compositions for simultaneous detection of rna and protein by mass spectrometry |
| WO2018194755A1 (en) * | 2017-04-17 | 2018-10-25 | University Of Southern California | Method to generate biocompatible dendritic polymers for analyte detection with multimodal labeling and signal amplification |
| CA3081543A1 (en) * | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Fluidigm Canada Inc. | Reagents and methods for elemental imaging mass spectrometry of biological samples |
| EP3784768A4 (en) * | 2018-04-27 | 2022-01-19 | Fluidigm Canada Inc. | MASS SPECTROMETRY REAGENTS AND METHODS FOR BASIC IMAGING OF BIOLOGICAL SAMPLES |
| EP3850334A4 (en) * | 2018-09-10 | 2022-06-01 | Fluidigm Canada Inc. | FUSED REFERENCE PARTICLE BASED NORMALIZATION FOR IMAGING MASS SPECTROMETRY |
-
2020
- 2020-12-18 WO PCT/US2020/066012 patent/WO2021127435A1/en unknown
- 2020-12-18 JP JP2022537268A patent/JP2023507386A/ja active Pending
- 2020-12-18 US US17/786,163 patent/US20230236105A1/en active Pending
- 2020-12-18 EP EP20903075.8A patent/EP4077416A4/en active Pending
- 2020-12-18 CA CA3162257A patent/CA3162257A1/en active Pending
- 2020-12-18 CN CN202080096927.3A patent/CN115135680A/zh active Pending
- 2020-12-18 KR KR1020227024128A patent/KR20220117277A/ko active Search and Examination
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023507386A (ja) | 2023-02-22 |
| US20230236105A1 (en) | 2023-07-27 |
| EP4077416A1 (en) | 2022-10-26 |
| CN115135680A (zh) | 2022-09-30 |
| CA3162257A1 (en) | 2021-06-24 |
| WO2021127435A1 (en) | 2021-06-24 |
| EP4077416A4 (en) | 2023-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Balthasar et al. | Preparation and characterisation of antibody modified gelatin nanoparticles as drug carrier system for uptake in lymphocytes | |
| US10036708B2 (en) | Solution phase homogeneous assays | |
| RU2566714C2 (ru) | Иммунохимическое определение одиночных мишеней | |
| JP3524401B2 (ja) | 酵素抗体複合体およびその製造方法 | |
| JP2000500733A (ja) | 相互作用分子結合体 | |
| US20090325171A1 (en) | Vesicles for use in biosensors | |
| JPH06509167A (ja) | ジビニルスルホンに由来する成分を含んで成る水溶性ポリマーベース試薬及び抱合体 | |
| JP3781934B2 (ja) | 酵素−タンパク質複合体 | |
| Lee et al. | Nanoparticle-enabled multiplexed Electrochemical Immunoassay for detection of Surface Proteins on Extracellular vesicles | |
| KR20220117277A (ko) | 질량 세포분석 시약 및 신호 증폭 방법 | |
| WO1998047000A2 (fr) | Procede et reactif de mise en evidence d'un materiel biologique cible | |
| EP1448991A2 (en) | Activated enzyme-linked detection systems for detecting and quantifying nucleid acids, antigens, antibodies and other analytes | |
| SG172498A1 (en) | Platinum nanoparticle label mediated deposition of platinum catalyst for ultrasensitive electrochemical immunosensors | |
| EP3126832A1 (fr) | Contrôles pour la mise en oeuvre de procédés d'analyse multiplexe | |
| US11899012B2 (en) | Single-chain polymer-based target receptors for use in electrochemical detection of target analytes | |
| EP1563304B1 (fr) | Procede de fixation d une proteine sur un polymere a base de pyrrole et son utilisation pour la fabrication d un capteur | |
| EP1247096B1 (fr) | Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe | |
| JP2007279028A (ja) | 孔を有する生体物質構造体及びその製造方法、並びに、それを用いた生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及びセンサーチップ | |
| EP2173904A1 (en) | Nanoassembled complexes of nucleic acids, avidin and polymers, use and preparation thereof | |
| WO2016027021A1 (fr) | Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes | |
| FR3110971A1 (fr) | Procédé et système pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon | |
| WO2024072822A2 (en) | Dispersing and wetting agents and compositions and methods of use thereof | |
| FR2817968A1 (fr) | Dispositif de capture d'une molecule cible | |
| JPS61263928A (ja) | 補体成分と物質の結合物及びその製造法 | |
| JPH05219990A (ja) | 診断試験キット及びペルオキシダーゼ標識より得られるシグナルの調節剤を用いる特異的バインディングアッセイ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |