WO1998047000A2 - Procede et reactif de mise en evidence d'un materiel biologique cible - Google Patents

Procede et reactif de mise en evidence d'un materiel biologique cible Download PDF

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WO1998047000A2
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Abdelhamid Elaissari
David Duracher
Christian Pichot
François Mallet
Armelle Novelli-Rousseau
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Bio Merieux
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    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
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Definitions

  • the present invention relates to the field of highlighting or detecting a biological material, called target biological material, contained in a sample, by a process using a capture phase, and possibly a detection phase, according to which the said said is exposed. material at least at the capture phase, then the capture phase - target biological material complex formed, possibly with said detection phase, is detected.
  • biological material in particular, a protein or glycoprotein material such as an antigen, a hapten, an antibody, a protein, a peptide, an enzyme, a substrate, and fragments thereof. ; but also a nucleic material such as a nucleic acid (DNA or RNA), a nucleic acid fragment, a probe, a primer; a hormone.
  • a method of capturing a target protein having polyhistidine sequences, namely RNase A is known, according to which the high affinity of the imidazole group of histidine is used for metals. This process includes the following steps:
  • the target protein and a metal complexing agent namely N- (4-vinyl) acid - benzyl-i inodiacetic acid (VBIDA) are brought into contact with a metal, for obtaining a complex resulting from coordination bonds between the metal and the idazole groups of histidine, and from coordination bonds between the metal and the carboxylic groups of VBIDA, and - said functionalized silica particles are brought into contact with the complex formed above.
  • a metal complexing agent namely N- (4-vinyl) acid - benzyl-i inodiacetic acid (VBIDA)
  • Document US-A-4 246 350 describes a method for immobilizing an enzyme using a capture phase which consists of a macroporous polymer having complexing groups linked to a transition metal.
  • the disadvantage of such a capture phase results directly from the macroporous nature of the polymer. In fact, if this makes it possible to maximize the adsorption of the enzyme on the capture phase, it becomes disadvantageous when the enzyme is detected using a detection phase, because the proportion of enzyme adsorbed in the pores of the polymer will not be accessible during said detection phase.
  • a method of highlighting a target biological material using a capture phase such that it makes it possible to optimize the fixation of this material thereon, while reducing, even eliminating, any secondary reaction of adsorption of said material on said capture phase.
  • the interaction between the capture phase is specific, thus making it possible, during detection, to detect the proportion of biological material effectively fixed on the capture phase.
  • the process for highlighting a target biological material uses a capture phase having the following characteristics: it is in microparticulate form or in linear form. it consists of at least one first particulate or linear polymer, with an apparent hydrophilic character, and first complexing groups, covalently attached, the first complexing groups are linked by coordination to a first transition metal, the first transition metal is itself linked by chelation to a first biological entity which is capable of specifically recognizing the target biological material.
  • the capture phase defined above comprises a marker, to obtain a detection phase.
  • a detection phase which has the following characteristics: it is in microparticulate or linear form, it consists of at least one second particulate or linear polymer, with an apparent hydrophilic character and second complexing groups, the second complexing groups are linked by coordination to a second transition metal, the second transition metal is itself linked by chelation to a second biological entity capable of specifically recognizing the target biological material, and a marker, it includes a marker.
  • microparticulate means according to the invention in the form of particles with a size at most equal to 10 ⁇ m. Preferably they have a size not exceeding 5 ⁇ m.
  • the first and / or second particulate or linear polymer is advantageously a hydrophilic polymer, and in particular a functionalized polymer obtained by polymerization of a water-soluble monomer, of acrylamide, of an acrylamide derivative, of methacrylamide or of a methacrylamide derivative, of at least one crosslinking agent and of at least one functional monomer.
  • the water-soluble monomer is preferably chosen from N-isopropylacrylamide, N-ethylmethacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, Nn-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide, the monomer preferably being N-isopropylacrylamide (NIPAM).
  • Z represents H, a C1-C5 alkyl radical, the benzyl radical, -COOH, or -CO-NH-CH (CH 3 ) 2 ,
  • Y represents -CH 2 -COOH, -N (CH 2 -COOH) 2 , -N (CH-COOH) (CH 2 -COOH), or -N (CH 2 -CH 2 -NH 2 ) 2 , (CH 2 -COOH)
  • X represents -NH (CH 2 -CH 2 -), -N (CH 2 -CH 2 -) 2 , -N (CH 2 -COOH) (CH 2 -CH 2 -), or CH (COOH) -,
  • R represents a linear hydrocarbon chain, optionally interrupted by at least one heteroatom, such that O or N, m and p are each an integer which, independently of one another, is equivalent to 0 or 1, and n is an integer varying between 1 and 3.
  • the functional monomer is chosen from carboxylic acids, optionally nitrogenous, itaconic acid, acrylic derivatives and methacrylic derivatives.
  • the capture phase of the invention can be in microparticulate form or in linear form.
  • it may consist only of said particulate polymer, or it may have a particulate support such as an organic or inorganic, hydrophilic or hydrophobic core, coated with said first polymer in particulate and / or linear form.
  • Said core is advantageously chosen from the group comprising polystyrene, silica and metal oxides. It can also comprise a magnetic compound.
  • the capture phase can also include a flat support, covered in whole or in part by the first polymer in particulate and / or linear form.
  • the first and / or second preferred particulate polymer of the invention is poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) comprising complexing groups derived from itaconic acid or maleic anhydride -co- methylvinyl ether.
  • the first and / or second transition metal is advantageously chosen from zinc, nickel, copper, cobalt, iron, magnesium, manganese, lead, palladium, platinum and gold.
  • the contacting of the first biological entity with the capture phase and / or the bringing of the second biological entity into contact with the detection phase is carried out at a pH greater than or equal to the isoelectric point of said first and second biological entities, respectively.
  • biological entity is meant a biological material as defined above, in the isolated state, and having an affinity with the target biological material, to form with said material a complex of the antigen-antibody, enzyme-substrate, hormone-receptor type. , DNA-DNA, DNA-RNA, ...
  • the first biological entity is a protein.
  • it is the protein p24 or gpl60 of HIV, with a view to the detection in the serum of a patient of antibodies directed against one or the other of these proteins.
  • the first and / or second biological entity comprises a part capable of reacting with a transition metal, this part preferably consists of a region rich in histidine and / or cysteine.
  • the affinity sites of the biological entity for the transition metal ions advantageously consist of sites rich in amino acids chosen from histidine, cysteine, tyrosine, tryptophan and phenylalanine.
  • the sites can be in the form of sequences of said identical or different amino acids, contiguous or not, but neighboring.
  • sites can exist naturally in the biological entity, when it is protein in particular. Or they can be "reported” beforehand in the biological entity, in the form of a "tag", a definition of which is given below, according to techniques well known to those skilled in the art such as that used for the purification of proteins. by the IMAC (Immobilized Metal ion-Affinity Chromatography) process on resins (2,3).
  • IMAC Immobilized Metal ion-Affinity Chromatography
  • a “tag” can be defined as a reported amino acid sequence, that is to say added to the original biological entity, which is introduced in a privileged place of the original sequence where it is exposed in a relevant manner vis -in relation to its chelation with the transition metal.
  • This sequence contains amino acids chosen from those mentioned above and which are distributed to inside the sequence, either contiguously (in particular two contiguous aforementioned amino acids, preferably six contiguous aforementioned amino acids), or with a sufficient density (in particular 25%, preferably greater than or equal to 33%).
  • a "tag” which consists of a series of 6 contiguous histidine and / or cysteine residues.
  • the marker for the detection phase is advantageously chosen from the group consisting of an enzyme, biotin, iminobiotin, a fluorescent component, a radioactive component, a chemiluminescent component, an electrodensity component, a magnetic component, an antigen,. a hapten and an antibody.
  • the invention also relates to:
  • a phase for capturing a target biological material in microparticulate or linear form and consisting of at least one first particulate or linear polymer, with an apparent hydrophilic character and first complexing groups, the latter being linked by coordination to a first metal transition, which is itself linked to a first biological entity capable of recognizing the target biological material,
  • phase of detection of a target biological material in microparticulate or linear form and constituted by at least one second particulate or linear polymer, with an apparent hydrophilic character and second complexing groups, the latter being linked by coordination with a second transition metal, which is itself linked to a second biological entity capable of recognizing the target biological material, and a marker, - a reagent for revealing a target biological material, comprising a phase of capture and possibly a detection phase as defined above, each of the capture phase and the detection phase having the characteristics determined previously.
  • Figure 1 represents an isotherm of coupling of the AMVE polymer on particles of particulate polymer poly- (St-NIPAM -AEM).
  • Figure 2 represents the variation in the quantity of RH24 protein adsorbed on a poly- (St-NIPAM-AMVE) particulate polymer as a function of the pH and the salinity of the medium.
  • Figure 3 represents the quantity of RH24 protein complexed on a poly- (St-NIPAM-
  • AMVE as a function of the pH and the salinity of the medium and for a concentration of Zn 2+ ions of the order of 0.3 M.
  • NIPAM N-isopropylacrylamide
  • the V50 is recrystallized before use, as follows. The initiator is dissolved in a 60/40 mixture of water and acetone. The solution is filtered under vacuum with a yield of 30%.
  • the polymerization is continued for 5 hours under the same conditions.
  • the conversion rate of the polymerization is evaluated at 98%.
  • the functionalized polymer obtained has the following characteristics: the diameter of the particles, measured by dynamic light scattering, is 1500 nm,
  • the preparation consists: firstly, in synthesizing a poly- (St-NIPAM) polymer containing the basic monomers, namely styrene and NIPAM, according to a polymerization in a closed reactor, with 200 g of water , 18 g of styrene, 2 g of
  • NIPAM and 0.2 g of V50 then in a second step, to add, at a given degree of conversion, the functional monomer (AEM), alone or in the presence of the basic reagents, namely 5 g of NIPAM, 0 to 4% of AEM (compared to NIPAM), 0.122 g of V50 and
  • AMVE is used in solution in anhydrous DMSO in order to avoid hydrolysis of the anhydride functions by which the coupling reaction on the amino functions of the particulate polymers is possible.
  • the coupling reaction must be carried out in a basic medium in order to avoid the protonation of the amino functions of the polymers.
  • the buffer used is a borate buffer of pH 8.2 and ionic strength 10 -2 M.
  • the coupling medium must not exceed 10% by volume of DMSO.
  • the metal used (Zn 2+ ) is introduced into a solution of the polymer in order to obtain a concentration of metal ion in solution of 10 ⁇ 4 M.
  • the excess of metal cation which is in solution is eliminated by successive centrifugations.
  • FIG. 2 shows the adsorption of the RH24 protein on the poly- (St-NIPAM-AMVE) obtained according to Example 3. According to FIG. 2, it is observed that the absorption rate of RH24 is strongly dependent on the pH .
  • Figure 3 shows the results of complexation as a function of pH, for different ionic strengths and for constant concentrations of complexing ion (Zn 2+ ).

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Abstract

L'invention concerne un procédé de mise en évidence d'un matériel biologique cible contenu dans un échantillon, selon lequel on dispose d'une phase de capture, sous forme microparticulaire ou linéaire, et constituée par au moins un premier polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des premiers groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un premier métal de transition, qui est lui-même lié à une première entité biologique susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible; on met en contact ledit matériel biologique cible avec au moins la phase de capture; et on détecte le complexe phase de capture - matériel biologique cible, éventuellement avec une phase de détection, une phase de détection sous forme microparticulaire ou linéaire, et constituée par au moins un second polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des seconds groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un second métal de transition, qui est lui-même lié à une seconde entité biologique susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible, et un marqueur.

Description

Procédé de mise en évidence d'un matériel biologique cible, phase de capture, phase de détection et réactif.
La présente invention relève du domaine de la mise en évidence ou détection d'un matériel biologique, dit matériel biologique cible, contenu dans un échantillon, par un procédé utilisant une phase de capture, et éventuellement une phase de détection, selon lequel on expose ledit matériel à la phase de capture au moins, puis on détecte le complexe phase de capture - matériel biologique cible formé, éventuellement avec ladite phase de détection.
Dans la présentation de l'invention qui suit, il est en particulier fait référence à la mise en évidence d'un matériel biologique cible protéique, mais bien entendu, la portée de l'invention ne saurait s'y limiter.
Ainsi, par matériel biologique, on entend selon l'invention, notamment, un matériel protéique ou glycoprotéique tel qu'un antigène, un haptène, un anticorps, une protéine, un peptide, une enzyme, un substrat, et fragments de ceux-ci ; mais aussi un matériel nucléique tel qu'un acide nucléique (ADN ou ARN) , un fragment d'acide nucléique, une sonde, une amorce ; une hormone. Conformément à l'article de M. Kempe et al. (1), on connaît un procédé de capture d'une protéine cible présentant des séquences polyhistidines, à savoir la RNase A, selon lequel on utilise la forte affinité du groupement imidazole de l'histidine pour les métaux. Ce procédé comprend les étapes suivantes :
- on dispose d'une phase de capture consistant en des particules de silice, fonctionnalisées par des groupes méthacrylates ,
- on met en contact la protéine cible et un agent complexant des métaux, à savoir, l'acide N-(4-vinyl)- benzyl-i inodiacétique (VBIDA) , avec un métal, pour obtenir un complexe résultant de liaisons de coordination entre le métal et les groupes i idazole de l'histidine, et de liaisons de coordination entre le métal et les groupes carboxyliques de VBIDA, et - on met en contact lesdites particules de silice fonctionnalisées avec le complexe formé ci-dessus.
Ce procédé d'immobilisation ne conduit pas à une fixation optimale de la protéine cible.
Le document US-A-4 246 350 décrit un procédé d'immobilisation d'une enzyme utilisant une phase de capture qui consiste en un polymère macroporeux ayant des groupements complexants liés à un métal de transition. L'inconvénient d'une telle phase de capture résulte directement de la nature macroporeuse du polymère. En effet si celle-ci permet de maximaliser l'adsorption de l'enzyme sur la phase de capture, elle devient désavantageuse au moment de la mise en évidence de l'enzyme à l'aide d'une phase de détection, car la proportion d'enzyme adsorbée dans les pores du polymère ne sera pas accessible à ladite phase de détection.
Selon la présente invention, on apporte un procédé de mise en évidence d'un matériel biologique cible, utilisant une phase de capture telle qu'elle permet d'optimiser la fixation de ce matériel sur celle-ci, tout en diminuant, voire éliminant, toute réaction secondaire d'adsorption dudit matériel sur ladite phase de capture. L'interaction entre la phase de capture est spécifique permettant ainsi, lors de la mise en évidence, de détecter la proportion de matériel biologique effectivement fixé sur la phase de capture.
A cette fin, le procédé de mise en évidence d'un matériel biologique cible, utilise une phase de capture présentant les caractéristiques suivantes : elle est sous forme microparticulaire ou sous forme linéaire. elle est constituée par au moins un premier polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile, et des premiers groupes complexants, fixés de manière covalente, les premiers groupes complexants sont liés par coordination à un premier métal de transition, le premier métal de transition est lui-même lié par chelation à une première entité biologique qui est susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible.
Selon une variante du procédé de l'invention, la phase de capture définie ci-dessus comprend un marqueur, pour obtenir une phase de détection.
Selon une autre variante du procédé, on dispose en outre d'une phase de détection qui présente les caractéristiques suivantes : elle est sous forme microparticulaire ou linéaire, elle est constituée par au moins un second polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des seconds groupements complexants , les seconds groupements complexants sont liés par coordination à un second métal de transition, le second métal de transition est lui-même lié par chelation à une seconde entité biologique susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible, et un marqueur, elle comprend un marqueur. Le terme "microparticulaire" signifie selon l'invention sous forme de particules d'une taille au plus égale à 10 μm. De préférence elles ont une taille ne dépassant pas 5 μm.
Le premier et/ou second polymère particulaire ou linéaire est avantageusement un polymère hydrophile, et notamment un polymère fonctionnalisé obtenu par polymérisation d'un monomère hydrosoluble, d'acrylamide, d'un dérivé d'acrylamide, de méthacrylamide ou d'un dérivé de méthacrylamide, d'au moins un agent de réticulation et d'au moins un monomère fonctionnel. Pour l'obtention de ce polymère avantageux, le monomère hydrosoluble est de préférence choisi parmi le N- isopropylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n- propylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-n- isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide, le monomère étant de préférence le N-isopropylacrylamide (NIPAM) . Le ou les monomères fonctionnels appartiennent de préférence au groupe de ceux qui répondent à la formule (I) suivante : CH2 = C(Z) - (X)m - (R)p - (Y)n(I) dans laquelle :
Z représente H, un radical alkyle en C1-C5, le radical benzyle, -COOH, ou -CO-NH-CH(CH3) 2,
Y représente -CH2-COOH, -N(CH2-COOH) 2 , -N(CH-COOH) (CH2-COOH) , ou -N (CH2-CH2-NH2) 2 , (CH2-COOH)
X représente -NH(CH2-CH2-) , -N(CH2-CH2-) 2 , -N(CH2-COOH) (CH2-CH2-) , ou CH(COOH)-,
R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, éventuellement interrompue par au moins un hétéroatome, tel que O ou N, m et p sont chacun un entier qui, indépendamment l'un de l'autre, équivalent à 0 ou 1, et n est un entier variant entre 1 et 3. A titre d'exemple le monomère fonctionnel est choisi parmi les acides carboxyliques, éventuellement azotés, l'acide itaconique, les dérivés acryliques et les dérivés méthacryliques.
Comme dit précédemment, la phase de capture de 1 ' invention peut se présenter sous forme microparticulaire ou sous forme linéaire. Quand elle est particulaire, elle peut ne consister qu'en ledit polymère particulaire, ou bien elle peut posséder un support particulaire tel qu'un noyau organique ou inorganique, hydrophile ou hydrophobe, revêtu dudit premier polymère sous forme particulaire et/ou linéaire.
Ledit noyau est avantageusement choisi dans le groupe comprenant le polystyrène, la silice et les oxydes métalliques. Il peut en outre comprendre un composé magnétique.
La phase de capture peut aussi comprendre un support plan, recouvert en totalité ou en partie par le premier polymère sous forme particulaire et/ou linéaire.
Comme les exemples de la présente description l'illustreront, le premier et/second polymère particulaire préféré de l'invention est le poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) comprenant des groupes complexants dérivés de l'acide itaconique ou de l'anhydride maléique-co- méthylvinyléther . Le premier et/ou second métal de transition est avantageusement choisi parmi le zinc, le nickel, le cuivre, le cobalt, le fer, le magnésium, le manganèse, le plomb, le palladium, le platine et l'or.
Selon une mise en oeuvre préférentielle du procédé de l'invention, la mise en contact de la première entité biologique avec la phase de capture et/ou la mise en contact de la seconde entité biologique avec la phase de détection, est effectuée à un pH supérieur ou égal au point isoélectrique de ladite première et seconde entités biologiques, respectivement.
Par entité biologique, on entend un matériel biologique tel que défini précédemment, à l'état isolé, et présentant avec le matériel biologique cible une affinité, pour former avec ledit matériel un complexe du type antigène-anticorps, enzyme-substrat, hormone-récepteur, ADN-ADN, ADN-ARN, ... Avantageusement la première entité biologique est une protéine. A titre d'exemple c'est la protéine p24 ou gpl60 du VIH, en vue de la mise en évidence dans le sérum d'un patient d'anticorps dirigés contre l'une ou l'autre de ces protéines.
La première et/ou la seconde entité biologique comprend une partie susceptible de réagir avec un métal de transition, cette partie consiste de préférence en une région riche en histidine et/ou en cystéine. Les sites d'affinité de l'entité biologique pour les ions métalliques de transition, consistent avantageusement en des sites riches en acides aminés choisis parmi l' histidine, la cystéine, la tyrosine, le tryptophane et la phénylalanine. Les sites peuvent se présenter sous la forme de suites desdits acides aminés identiques ou différents, contigus ou non, mais voisins.
Ces sites peuvent exister naturellement dans l'entité biologique, quand elle est protéique notamment. Ou bien ils peuvent être "rapportés" préalablement dans l'entité biologique, sous forme de "tag" dont une définition est donnée ci-après, selon des techniques bien connues de l'homme du métier telles que celle employée pour la purification des protéines par le procédé IMAC (Immobilized Métal ion-Affinity Chromatography) sur des résines (2,3). A titre d'exemple, de tels sites peuvent être incorporés dans une entité biologique protéique et notamment une protéine, par génie génétique pour obtenir des protéines recombinantes. Un "tag" peut être défini comme une séquence d'acides aminés rapportée, c'est-à-dire ajoutée à l'entité biologique originale, qui est introduite en un lieu privilégié de la séquence originale où elle est exposée de façon pertinente vis-à-vis de sa chelation avec le métal de transition. Cette séquence contient des acides aminés choisis parmi ceux précités et qui sont distribués à l'intérieur de la séquence, soit de façon contigϋe (notamment deux acides aminés précités contigus, préférentiellement six acides aminés précités contigus) , soit avec une densité suffisante (notamment 25 %, préférentiellement supérieure ou égale à 33 %) . On préférera un "tag" qui consiste en une suite de 6 résidus histidine et/ou cystéine contigus.
Selon le procédé de l'invention, on peut mettre en évidence un matériel biologique cible par une réaction d'agglutination en utilisant une phase de capture décrite précédemment.
Le marqueur de la phase de détection est avantageusement choisi dans le groupe consistant en une enzyme, la biotine, 1 • iminobiotine, un composant fluorescent, un composant radioactif, un composant chémioluminescent, un composant d' électrodensité, un composant magnétique, un antigène, un haptène et un anticorps .
Selon le procédé de l'invention, on peut mettre en évidence un matériel biologique cible par la technique ELISA en utilisant une phase de capture et une phase de détection décrites précédemment.
L'invention concerne aussi :
- une phase de capture d'un matériel biologique cible, sous forme microparticulaire ou linéaire et constituée par au moins un premier polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des premiers groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un premier métal de transition, qui est lui-même lié à une première entité biologique susceptible de reconnaître le matériel biologique cible,
- une phase de détection d'un matériel biologique cible, sous forme microparticulaire ou linéaire et constituée par au moins un second polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des seconds groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un second métal de transition, qui est lui-même lié à une seconde entité biologique susceptible de reconnaître le matériel biologique cible, et un marqueur, - un réactif de mise en évidence d'un matériel biologique cible, comprenant une phase de capture et éventuellement une phase de détection telles que définies précédemment, chacune de la phase de capture et de la phase de détection présentant les caractéristiques déterminées précédemment .
Les caractéristiques et avantages de la présente invention sont ci-après illustrés par les Exemples 1 à 5 et les Figures 1 à 3 selon lesquelles: Figure 1 représente un isotherme de couplage du polymère AMVE sur des particules de polymère particulaire poly-(St-NIPAM-AEM) .
Figure 2 représente la variation de la quantité de protéine RH24 adsorbée sur un polymère particulaire poly-(St-NIPAM-AMVE) en fonction du pH et de la salinité du milieu.
Figure 3 représente la quantité de protéine RH24 complexée sur un polymère particulaire poly-(St-NIPAM-
AMVE) en fonction du pH et de la salinité du milieu et pour une concentration en ions Zn2+ de l'ordre de 0,3 M.
EXEMPLE l: Réactifs employés en vue de la préparation de la phase de capture de 1 ' invention
Monomère : - Styrène à 99 % (Janssen Chemica, refl3 279-87) ,
Mw=104,5 g.mol"1
Il est utilisé après purification par distillation sous vide.
- N-isopropylacrylamide (NIPAM) (Kodak ref 10 982), MW=113,16 g.mol-1 Il est recristallisé avant son utilisation, comme suit. Il est dissous dans un mélange hexane/toluène (60/40, v/v) .
Monomère fonctionnel : - Chlorure de 2-aminoéthyl méthacrylate (AEM)
(Kodak ref 18513), Mw=165,62 g.mol-1
Il est utilisé sans recristallisation.
Agent de réticulation :
- N,N-méthylène bisacrylamide (MBA) (Amilabo ref 10897), Mw=271.19 g.mol-1
II est utilisé sans recristallisation. Amorceur :
- Hydrochlorure de 2,2'azobis (2-amidino propane) (V50) (Wako trade name) , Mw = 271,19 g.mol-1 Le V50 est recristallisé avant son utilisation, comme suit. L' amorceur est dissous dans un mélange 60/40 d'eau et d'acétone. La solution est filtrée sous vide avec un rendement de 30%.
- Persulfate de potassium (Prolabo) , Mw = 270,32 g.mol-1
II est utilisé sans recristallisation. Groupes complexants :
- Acide itaconique (Aldrich) , Mw = 132 g.mol-1 Il est utilisé sans recristallisation. - Anhydride maléique-co-méthylvinyléther (AMVE)
(Polysciences)
Il est utilisé sans recristallisation.
EXEMPLE 2: Synthèse du polymère fonctionnalisé poly(N-isopropylacrylamide) -acide itaconique
Dans un réacteur thermostaté de 250 ml, sont versés 4,38 g de N-isopropylacrylamide, 200 g d'eau, 0,37 g de MBA, 0,5 g d'acide itaconique et 0,45 g d'acrylamide. Le mélange est maintenu sous agitation à 300 tours par minute sous atmosphère d'azote et à une température de 70°C. Le persulfate de potassium (0,05 g). amorceur hydrosoluble, est introduit (en solution dans 5 g d'eau) dans la solution au dernier moment pour démarrer la réaction de polymérisation.
La polymérisation est poursuivie pendant 5 heures dans les mêmes conditions.
Le taux de conversion de la polymérisation est évalué à 98%.
Le polymère fonctionnalisé obtenu présente les caractéristiques suivantes : - le diamètre des particules, mesuré par diffusion dynamique de la lumière, est de 1500 nm,
- le dosage des fonctions superficielles, suivi par conductimétrie, a donné 0,3 mmole/g de latex de groupements acide faible (-COOH) .
EXEMPLE 3 : Modification des particules hydrophiles aminées par greffage du polymère linéaire complexant poly-AMVE
1) Synthèse du polymère particulaire poly- (styrène-NIPAM) a) Préparation du polymère particulaire hydrophile
Selon cet exemple la préparation consiste : dans un premier temps, à synthétiser un polymère poly-(St-NIPAM) contenant les monomères de base, à savoir le styrène et le NIPAM, selon une polymérisation en réacteur fermé, avec 200 g d'eau, 18 g de styrène, 2 g de
NIPAM et 0,2 g de V50, puis dans un deuxième temps, à ajouter, à un degré de conversion donné, le monomère fonctionnel (AEM) , seul ou en présence des réactifs de base, à savoir 5 g de NIPAM, 0 à 4 % de AEM (par rapport au NIPAM), 0,122 g de V50 et
0,069 g de BA.
Cette technique permet d'optimiser l'incorporation en surface d'un monomère fonctionnel. Les conditions de synthèse sont les mêmes que celles de la polymérisation en réacteur fermé, c'est-à-dire température et agitation constante.
b) Caractéristiques du polymère particulaire obtenu
Les résultats sur la structure du polymère obtenu, sa taille et sa polydispersité, sont regroupés dans le tableau 1 suivant.
Tableau 1
Figure imgf000013_0001
(a) : Diamètre déterminé par diffusion dynamique de la lumière à 20°C et à 50°C (b) : La chevelure correspond à l'épaisseur de
PNIPAM à la surface des particules
(c) : Diamètre et indice de polydispersité obtenu par microscopie électronique.
Les taux de fonctionnalisation des polymères obtenus exprimés par les résultats du dosage des fonctions aminés présentes à la surface des polymères, sont mentionnés dans le tableau 2 suivant. Tableau 2
Figure imgf000014_0001
* : densité de charge calculée en utilisant la taille à 20°C déterminée par diffusion dynamique de la lumière.
2) Greffage du poly-AMVE sur les particules aminées On fixe de façon covalente sur les polymères obtenus selon 1) des groupes complexants, consistant, selon le présent exemple, en des groupes dérivés de l'AMVE (anhydride maléique-co-méthylvinyléther) , qui est un polymère linéaire. L'utilisation de l'AMVE présente deux avantages : d'une part, il permet, grâce à ses fonctions anhydrides très réactives, un couplage facile avec les aminés présentes à la surface du polymère particulaire, et, d'autre part, une fois le couplage réalisé, il expose de nombreuses fonctions dicarboxyliques complexantes, qui interagiront avec un métal de transition (Zn, Ni, Cu, Co, ... ) .
L'AMVE est utilisé en solution dans le DMSO anhydre afin d'éviter l'hydrolyse des fonctions anhydrides par lesquelles la réaction de couplage sur les fonctions aminés des polymères particulaires est possible. La réaction de couplage doit être conduite dans un milieu basique afin d'éviter la protonation des fonctions aminés des polymères. Le tampon utilisé est un tampon borate de pH 8,2 et de force ionique 10-2 M. Le milieu de couplage ne doit pas excéder 10 % en volume de DMSO.
Les résultats qui apparaissent à la Figure 1 montrent une bonne corrélation entre les deux méthodes d'analyse. La pente initiale de l'isotherme de couplage montre que la réaction est totale pour des faibles quantités d'AMVE introduites. La valeur du plateau est de
— 2
2,75 mg.m et est atteinte très rapidement pour des faibles concentration en AMVE.
EXEMPLE 4 : Complexation d'un métal de transition avec le polymère ayant des groupes complexants
L'introduction d'un métal de transition dans une solution du polymère ayant des groupes complexants obtenu selon l'Exemple 2 ou 3 doit permettre la fixation du métal par complexation sur les particules. Cette complexation s'effectue par le biais des atomes d'oxygène des fonctions anhydrides. La présence de doublets libres sur les atomes d'oxygène permet de former des liaisons de coordination avec le métal de transition.
Le métal utilisé (Zn2+) est introduit dans une solution du polymère afin d'obtenir une concentration en ion métallique en solution de 10~4 M. L'excès de cation métallique qui se trouve en solution est éliminé par des centrifugations successives.
EXEMPLE 5 : Complexation de la protéine RH24 utilisée comme entité biologique pour obtenir une phase de capture de 1 ' invention L'entité biologique retenue dans le cadre de cet exemple est la protéine recombinante modifiée (appelée RH24) en N-terminal par un "Tag" histidine (séquence de six résidus histidine contigus) (5) . Cette protéine a une
3 -1 masse de 27.10 g.mol et un point isoélectrique de 6,1. Cette modification à été mise à profit pour réaliser la complexation de la protéine sur un support particulaire, pour obtenir une phase de capture de l'invention.
Afin de pouvoir déterminer la concentration de protéine complexée sur le latex, des études d'adsorption de la protéine ont été menées en parallèle.
Comme l'état de la technique le montre, ce sont les interactions électrostatiques qui gouvernent l'adsorption des protéines sur un polymère hydrophile (6). On a donc étudié l'effet de la force ionique et du pH sur la quantité de protéines adsorbées, afin de déterminer les conditions pour lesquelles l'adsorption est négligeable, voire nulle.
La figure 2 montre l'adsorption de la protéine RH24 sur le poly- (St-NIPAM-AMVE) obtenu selon l'Exemple 3. Selon la figure 2, on observe que le taux d'adsorption de la RH24 est fortement dépendant du pH.
Une étude similaire a été effectuée pour la complexation en faisant varier les mêmes paramètres. La figure 3 montre les résultats de la complexation en fonction du pH, pour différentes forces ioniques et pour des concentrations constantes en ion complexant (Zn2+) .
Comme il est observé sur cette figure, la complexation de la protéine sur le poly- (St-NIPAM-AMVE) en présence de zinc est peu dépendante du pH excepté pour les faibles forces ioniques.
Ces résultats permettent de déterminer des conditions optimales de complexation au détriment de l'adsorption. Ainsi un pH supérieur ou égal à 7 permet d'avoir une adsorption quasi nulle tout en ayant une complexation proche de 1,5 mg.m"2. Quant à la force ionique il faut qu'elle soit minimale pour favoriser la complexation. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de mise en évidence d'un matériel biologique cible contenu dans un échantillon, selon lequel on dispose d'une phase de capture, on met en contact ledit matériel biologique cible avec au moins la phase de capture, et on détecte le complexe phase de capture - matériel biologique cible, ledit procédé étant caractérisé en ce que, la phase de capture est sous forme microparticulaire ou linéaire et est constituée par au moins un premier polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des premiers groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un premier métal de transition, qui est lui-même lié à une première entité biologique susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase de capture comprend un marqueur pour obtenir une phase de détection.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on dispose en outre d'une phase de détection qui est sous forme microparticulaire ou linéaire et est constituée par au moins un second polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des seconds groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un second métal de transition, qui est lui-même lié à une seconde entité biologique susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible, et un marqueur.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le premier et/ou le second polymère est choisi dans le groupe des polymères hydrophiles.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le premier et/ou le second polymère est un polymère fonctionnalisé obtenu par polymérisation d'un monomère hydrosoluble, d'acrylamide, d'un dérivé d'acrylamide, de méthacrylamide ou d'un dérivé de méthacrylamide, d'au moins un agent de réticulation et d'au moins un monomère fonctionnel.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le monomère hydrosoluble est choisi parmi le N- isopropylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n- propylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-n- isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide, le premier monomère étant de préférence le N-isopropylacrylamide (NIPAM) .
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le monomère fonctionnel répond à la formule (I) suivante :
CH2 = C(Z) - (X)m - (R)p - (Y)n (I) dans laquelle :
Z représente H, un radical alkyle en C1-C5, le radical benzyle, -COOH, ou -CO-NH-CH(CH3) 2 ,
Y représente -CH2-COOH, -N(CH2-COOH) 2 , -N(CH-COOH) (CH2-COOH) , ou -N(CH2-CH2-NH2 ) 2 , (CH2-COOH)
X représente -NH(CH2-CH2-) , -N(CH2-CH2-) 2 , -N(CH2-COOH) (CH2-CH2-) , θu CH(COOH)-,
R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, éventuellement interrompue par au moins un hétéroatome, tel que O ou N, m et p sont chacun un entier qui, indépendamment l'un de l'autre, équivalent à 0 ou 1, et n est un entier variant entre 1 et 3.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le monomère fonctionnel est choisi parmi les dérivés carboxyliques éventuellement azotés, l'acide itaconique, les dérivés acryliques et les dérivés méthacryliques .
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 , caractérisé en ce que la phase de capture et/ou la phase de détection est sous forme microparticulaire et en ce que la taille moyenne des particules est au plus égale à 5 μm.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase de capture comprend en outre un support plan ou particulaire.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support est particulaire et consiste en un noyau organique ou inorganique, hydrophile ou hydrophobe.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit noyau est choisi dans le groupe comprenant le polystyrène, la silice et les oxydes métalliques.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que ledit noyau renferme en outre un composé magnétique.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ledit noyau est revêtu dudit premier polymère, ce dernier étant linéaire.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ledit noyau est revêtu dudit polymère, ledit polymère étant particulaire.
16. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le premier et/ou le second polymère est le poly(N-isopropylacrylamide) et les groupes complexants sont dérivés de 1 ' acide itaconique ou de 1 ' anhydride maléique-co-méthylvinyléther .
17. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le premier et/ou second métal de transition est choisi parmi le zinc, le nickel, le cuivre. le cobalt, le fer, le magnésium, le manganèse, le plomb, le palladium, le platine et l'or.
18. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la mise en contact de la première entité biologique avec la phase de capture et/ou la mise en contact de la seconde entité biologique avec la phase de détection, est effectuée à un pH supérieur ou égal au point isoélectrique de ladite première et seconde entités biologiques, respectivement.
19. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la première et/ou la seconde entité biologique est riche en histidine et/ou en cystéine.
20. Procédé selon la revendication 1 et l'une quelconque des revendications 4 à 19 , caractérisé en ce qu'il met en jeu une réaction d'agglutination.
21. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le marqueur de la phase de détection est choisi dans le groupe consistant en une enzyme, la biotine, l' iminobiotine, un composant fluorescent, un composant radioactif, un composant chémioluminescent, un composant d' électrodensité, un composant magnétique, un antigène, un haptène et un anticorps.
22. Procédé selon la revendication 2 ou 3 et l'une quelconque des revendications 4 à 19 ou 21, caractérisé en ce qu'il met en jeu la technique ELISA.
23. Phase de capture d'un matériel biologique cible, caractérisée en ce qu'elle est sous forme microparticulaire ou linéaire et est constituée par au moins un premier polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des premiers groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un premier métal de transition, qui est lui-même lié à une première entité biologique susceptible de reconnaître le matériel biologique cible.
24. Phase de détection d'un matériel biologique cible, caractérisée en ce qu'elle est sous forme microparticulaire ou linéaire et est constituée par au moins un second polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des seconds groupements complexants, ces derniers étant liés par coordination à un second métal de transition, qui est lui-même lié à une seconde entité biologique susceptible de reconnaître le matériel biologique cible, et un marqueur.
25. Réactif de mise en évidence d'un matériel biologique cible, comprenant une phase de capture selon la revendication 23 et/ou une phase de détection selon la revendication 24.
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