FR2817968A1

FR2817968A1 - Dispositif de capture d'une molecule cible

Info

Publication number: FR2817968A1
Application number: FR0015940A
Authority: FR
Inventors: Pascale Hazot; Jean Paul Chapel; Thierry Delair; Hamid Elaissari
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2002-06-14
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: AU2002217221A1; FR2817968B1; WO2002046759A1

Abstract

L'invention concerne un dispositif de capture d'une molécule cible comprenant un support solide sur lequel est immobilisé un polymère susceptible de se lier directement ou indirectement à la molécule cible, caractérisé en ce que en combinaison le polymère est hydrophile et contient une moins un monomère possédant au moins une fonction acide boronique.L'invention concerne également un procédé de capture d'une molécule cible utilisant un tel dispositif.

Description

La présente invention a pour objet un dispositif de capture de molécules cibles, un procédé de capture desdites molécules cibles ainsi que des polymères utilisables pour la préparation de tels dispositifs.

Il est de pratique courante d'utiliser des supports sur lesquels sont immobilisés des ligands par exemple des protéines, haptènes, peptides, polypeptides, anticorps ou polynucléotides dans le but de les détecter et/ou les doser notamment dans la réalisation d'essais de diagnostic.

Le brevet FR 2 688 788 décrit la synthèse et l'utilisation de conjugués ligands/copolymère à base d'anhydride maléique comme le copolymère anhydride maléique/méthyl-vinyléther (AMVE) pour la fixation des ligands sur un support solide.

De même, le brevet FR 2 707 010 décrit un copolymère à base de N-vinyl pyrrolidone comme le copolymère N-vinyl pyrrolidone/N-acryloxysuccinimide (NVPNAS) toujours pour la fixation de ligands sur un support solide.

Les conjugués ainsi préparés présentent une structure agrégée (voir par exemple Erout M. N. et al., Bioconjugate Chemistry, 7 (5), p 568-575,1996 ou Delair T. et al., Polymers for Advanced Technologies, 9, p 349-361,1998) ce qui nuit à la capture de molécules cibles. En effet, le couplage entre le ligand et le polymère est covalent et les ligands, tels que des acides nucléiques, les protéines ou des peptides, possèdent de multiples fonctions réactives susceptibles d'interférer avec la spécificité du couplage covalent ce qui conduit à des réactions non contrôlées qui provoquent des phénomènes d'agrégation. Il existe donc un besoin pour de nouveaux dispositifs de capture plus spécifique.

L'interaction entre un dérivé d'acide boronique et un cis-diol, ou un a, ss amino-alcool est spécifique et bien connue dans la chimie des sucres comme par exemple Wulff G. et al, J. Am. Chem. Soc., 108, pl089, 1986 ou Wulff G. et al, Macromol. Chem., 188, p741,1987. La réactivité des dérivés phénylboroniques a été aussi démontrée pour des molécules d'acides ribonucléiques par Igloi G. L. et Kessel H. dans Nucl. Acid. Res., 13 (19), p 6881-6898,1985.

Cette propriété a été utilisée pour préparer des gels pour chromatographie ou pour préparer des particules hydrophobes. Des travaux traitant de la polymérisation de

monomère dérivé d'acide phénylboronique en présence du méthacrylate de méthyle ont été notamment publiés par A. Sarhan et al, dans Reactive Polymers, 11, p 57-70, 1989. De même Tsukagoshi K. et al, Chemistry letters, p 681-684,1994 décrivent la synthèse de particules présentant des groupements acide phénylboronique pour la complexation de sucres. Ces particules sont préparées par polymérisation en émulsion de styrène, acrylate de butyle et acide de m-acrylamidophénylboronique. Le latex obtenu est hydrophobe. Ce latex est ensuite utilisé pour la capture de glucose ou dérivés.

Dans tous ces travaux, les molécules cibles à capturer sont mises en contact directement en milieu liquide avec les particules de polymère ou les gels portant les fonctions acide boronique. D'autre part, du fait de leur hydrophobicité, les latex obtenus présentent l'inconvénient d'une adsorption non spécifique pour le matériel biologique. En effet, comme cela a été largement décrit dans la littérature notamment par J. Andrade dans Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, volume 2, Protein Adsorption , Plenum Press, New York, 1984, la nature et la charge de la surface d'adsorption et notamment son hydrophobicité ou hydrophilie a une influence sur la cinétique d'adsorption et sur la conformation des molécules cibles. Cette influence sur la conformation des molécules cibles pouvant aller jusqu'à une légère dénaturation entraînant une diminution de la spécificité..

La présente invention a mis en évidence pour la première fois que des polymères hydrophiles comportant des fonctions acide boronique peuvent être immobilisés de manière très efficace sur des supports solides tout en gardant des propriétés de fixation spécifiques pour des molécules cibles, pour aboutir à un dispositif de capture bidimensionnel de molécules cibles, dans lequel le polymère hydrophile permet une capture efficace desdites molécules cibles.

Un deuxième avantage de la présente invention est de proposer un dispositif universel de capture puisque le dispositif n'est pas limité à la capture de molécules cibles comportant un résidu diol mais le dispositif peut servir aussi à la capture de molécules cibles de toute nature par l'intermédiaire d'un ligand fixé sur le polymère si le ligand est capable de réagir avec la molécule cible pour former un complexe ligand molécule cible.

La présente invention décrit un dispositif de capture d'une molécule cible. Le dispositif comprend un support solide sur lequel est immobilisé un polymère hydrophile qui contient au moins un monomère contenant au moins une fonction acide boronique, et ce polymère est susceptible de se lier directement ou indirectement à la molécule cible.

Par molécule cible, on entend un composé chimique ou biologique dont la capture présente un intérêt et notamment à des fins de purification et/ou détection et/ou quantification.

Par monomère contenant une fonction acide boronique, on entend tout monomère possédant une double liaison vinylique et au moins un groupement acide boronique comme par exemple, les acrylate de l'acide phénoxyboronique ou méthacrylate de

l'acide phénoxyboronique, l'acide N- (méthylstyryl) N-phénylboronique, l'acide styrylboronique, les éthers vinyliques de l'acide phénoxyboronique, l'acide N-vinyl N- phénylboronique, le N- (acide phénylboronique) vinylbenzylamide.

De préférence, le monomère est un dérivé de type acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique.

Par polymère hydrophile, on entend un polymère dont le second coefficient du viriel dans l'eau est supérieur à zéro (voir par exemple la physicochimie des polymères édité par le GFP groupe Français d'étude et d'application des polymères.

Dans un premier mode de réalisation du dispositif, le polymère est un polymère hydrosoluble.

Avantageusement, le polymère est un copolymère entre un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phénylboronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l'acrylamide ou du méthacrylamide. A titre d'exemple un dérivé dérivé Nalkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide (qui englobe les N-N-dialkylacrylamide ou

les N-N-dialkylméthacrylamide), est choisi parmi le N-isopropylacrylamide, le Nméthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-n-

propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N, N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n- propylacrylamide.

Un dérivé N-alcoxy de l'acrylamide ou du méthacrylamide est choisi parmi les composés obtenus par réaction d'un chlorure d'acryloyl ou de méthacryloyl ou d'un

ester activé, sur une amine de formule générale HNCH2-CH2-O (CH2) y-CH3) z où x, y et z sont des nombres entiers, x est supérieur ou égal à 1, y est supérieur ou égal à zéro et z peut prendre les valeurs 1 ou 2.

Avantageusement au moins un des monomères est un monomère thermosensible.

De préférence, le polymère est un copolymère hydrosoluble de l'acide mméthacrylamidophényl boronique et le N-méthoxyéthylméthacrylamide.

Dans un deuxième mode de réalisation du dispositif, le polymère est sous forme d'une particule hydrophile. Par particule, on entend de petites parties d'une substance insoluble en milieu liquide et notamment en milieu aqueux, et ayant une taille inférieure à 10 micromètres. De préférence, les particules sont des particules colloïdales ou des latex.

En particulier, l'invention décrite a pour but d'apporter des groupements d'acide boronique en surface par polymérisation ou copolymérisation d'un monomère dérivé d'acide boronique au cours de la synthèse d'un latex ou dans un procédé en deux étapes impliquant une première étape de préparation d'un coeur dont les caractéristiques colloïdales peuvent être bien contrôlées.

Dans une première variante du deuxième mode de réalisation du dispositif, les particules sont organiques et issues de la polymérisation d'au moins un monomère porteur d'une fonction acide boronique avec au moins un monomère choisi parmi les monomères dérivés d'acrylamide, de méthacrylamide, d'acrylate et de méthacrylate, en particulier les N-alkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N-

isopropylacrylamide, le N-méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-npropylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-

cyclopropylacrylamide, le N, N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 1 à 3 atomes de carbone ; Le styrène, le méthylstyrène, l'éthylstyrène, le tertio-butyl-styrène le chlorométhylstyrène, le vinyltoluène leurs dérivés, les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone sont utilisables en combinaison avec un autre monomère hydrophile tels que les dérivés d'acrylamide, de méthacrylamide, les acrylates ou les méthacrylates cités précédemment.

Dans une deuxième variante du deuxième mode de réalisation du dispositif, les particules sont organiques et inorganiques, la partie organique provenant de la polymérisation d'au moins un monomère porteur d'une fonction acide boronique et d'au moins un monomère choisi parmi les monomères d'acrylamide et d'acrylate, en particulier les N-alkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le Nisopropylacrylamide, le N-méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-npropylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le Ncyclopropylacrylamide, le N, N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone ; leurs dérivés et les copolymères de ces monomères entre eux ; et la partie inorganique provenant d'oxydes métalliques, de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel ; la magnétite ; l'hématite, les ferrites, telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc ; les alliages de cobalt, nickel ; les zéolites ; le talc ; les argiles telles que bentonite et kaolin ; l'alumine ; la silice ; le graphite ; le noir de carbone ou autres matériaux inorganiques.

Dans une troisième variante du deuxième mode de réalisation du dispositif, les particules colloïdales organiques et/ou inorganiques, stables et fonctionnalisées, comprennent un coeur et une enveloppe. Le coeur est essentiellement solide, organique et/ou inorganique et peut être hydrophile ou hydrophobe. L'enveloppe hydrophile comporte au moins le dérivé polymérisé de l'acide boronique.

Dans un premier mode de réalisation de cette troisième variante, le coeur est organique et comprend au moins un polymère organique choisi parmi au moins un homopolymère ou un copolymère ou leurs mélanges, issu de la polymérisation d'au moins un monomère choisi parmi les monomères d'acrylamide et d'acrylate, en particulier les Nalkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N-isopropylacrylamide, le Nméthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-npropylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N, N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-npropylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone ; le styrène, le méthylstyrène, l'éthylstyrène, le tertio-butyl-styrène, le chlorométhylstyrène vinyltoluène ; leurs dérivés et les copolymères de ces monomères ente eux et/ou avec d'autres comonomères.

Dans un deuxième mode de réalisation de cette troisième variante, le coeur est organique et inorganique et comprend : au moins un polymère organique choisi parmi au moins un homopolymère ou un copolymère ou leurs mélanges, issu de la polymérisation d'au moins un monomère choisi parmi les monomères d'acrylamide et d'acrylate, en particulier les Nalkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N-isopropylacrylamide, le Nméthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-npropylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N, N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-npropylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone ; le styrène, le méthylstyrène, l'éthylstyrène, le tertio-butyl-styrène, le chlorométhylstyrène vinyltoluène ; leurs dérivés et les copolymères de ces monomères ente eux et/ou avec d'autres comonomères ; et des particules inorganiques choisies parmi les particules d'oxydes métalliques, de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel ; la magnétite ; l'hématite, les ferrites, telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc ; les

alliages de cobalt, nickel ; les zéolites ; le talc ; les argiles telles que bentonite et kaolin ; l'alumine ; la silice ; le graphite ; le noir de carbone ou autres matériaux inorganiques.

L'enveloppe hydrophile est un copolymère contenant le monomère à base d'acide boronique avec des dérivés acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide. A titre d'exemple un dérivé N-alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide (qui englobe les N-N-dialkylacrylamideet les N-N-dialkylméthacrylamide), est choisi parmi le Nisopropylacrylamide, le N-méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-npropylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le Ncyclopropylacrylamide, le N, N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide. Cette enveloppe peut être introduite soit à partir d'une semence de particules préformées, soit selon un procédé shot .

Avantageusement, l'enveloppe comprend au moins un monomère thermosensible tels que les dérivés de N-alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide.

Avantageusement dans la particule du dispositif, les monomères qui constituent le coeur sont des monomères hydrophobes tels que le styrène et ses dérivés ou les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone. L'enveloppe quant à elle est majoritairement constituée de dérivés d'alkylacrylamide ou d'alkylméthacrylamide avec éventuellement la présence de réticulant tels que le méthylènebisacrylamide ou éthylèneglycoldiméthacrylate.

De préférence, la particule du dispositif est composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des N-alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide et un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique.

Les polymères sous forme de particules colloïdales ou latex sont très intéressants car ils présentent de nombreux avantages, en particulier celui d'offrir une grande surface spécifique (plusieurs dizaines de ni') par gramme de particules.

L'efficacité de capture des molécules cibles est donc améliorée par le dispositif bidimensionnel dans lequel une particule est immobilisée sur un support solide. Une

application avantageuse de ces polymères sous forme particulaire est la formation de biopuces comme décrit dans les demandes WO 00/48000, WO 99/67641 ou WO 00/39587 dont le contenu est incorporé dans la présente demande.

D'autres réactifs sont utilisés dans la synthèse des particules comme par exemple un amorceur et un réticulant.

L'amorceur est choisi par exemple parmi les amorceurs thermiques, amorceurs photochimiques, amorceurs redox ; amorceurs cationique, anionique, nonionique, fonctionnel (c'est à dire contenant un ou plusieurs groupements phénylboronique), les dérives azobis amidino propane.

Le réticulant est choisi par exemple parmi le N', N méthylène bisacrylamide, le bis acrylamide, l'ethylène glycol diméthacrylate.

Il est possible de faire varier la granulométrie des particules de manière reproductible dans une large gamme de 50 nm à 5000 nm en contrôlant les conditions expérimentales de la formulation utilisée, notamment les concentrations des divers composés entrant dans la formulation de la polymérisation et aussi la température. Un diamètre préféré pour les particules du dispositif selon la présente invention est compris entre 100 et 800 nm.

La bonne homogénéité en taille ainsi que l'importante surface spécifique développée font de ces particules des supports de choix pour l'immobilisation de molécules cibles.

Leur hydrophilie permet de réduire considérablement les phénomènes d'adsorption non spécifique qui engendrent des problèmes de spécificité, sensibilité et de reproductibilité notamment pour des tests de diagnostic.

L'avantage des particules de polymère hydrophile et thermosensible portant en surface des groupements d'acides boroniques est de pouvoir s'affranchir de la réaction d'activation d'un coté et de réduire considérablement l'immobilisation non spécifique.

Cette propriété de thermosensibilité peut être utilisée pour favoriser l'affinité entre les molécules biologiques et le support au delà de la LCST dz low critical solubility temperature ) du polymère utilisé (dans le cas du polymère à base de Nisopropylacrylamide, la LCST est de 32OC). Une réduction de la température permet de

relarguer les entités non complexées par les groupements d'acides boroniques. Par monomère thermosensible, on entend un monomère qui, incorporé dans un polymère, confère cette propriété de thermosensibilité.

L'invention concerne également un polymère hydrosoluble composé d'au moins un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l'acrylamide ou du méthacrylamide.

Différents modes de polymérisation peuvent être utilisés pour préparer les particules de l'invention et notamment : la polymérisation à réacteur fermé appelée batch : les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de réaction avec les autres ingrédients et sans ajout ultérieur. En raison de la différence de réactivité des monomères, ce procédé conduit souvent à l'apparition d'une dérive de composition. Celle-ci se manifeste par l'obtention de macromolécules ayant des compositions qui varient considérablement en fonction de la conversion. Cette méthode est peu efficace pour l'incorporation en surface car une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à l'intérieur des particules, soit sous forme de polymère hydrosoluble. Lorsque la copolymérisation est effectuée en batch avec des monomères de nature polaire, on obtient des particules plus petites, en grand nombre, mais avec une conversion limitée.

Ce comportement est lié à l'importante solubilité dans l'eau de ces monomères, et il est attribué à la prépondérance du mécanisme de nucléation homogène.

Polymérisation en semi-continu : une partie au moins des monomères est introduite dans le réacteur sur une période comprise entre le début de la réaction et la fin de celle-ci. Ce rajout peut être effectué à une vitesse fixe ou bien suivant un profil donné. Le but est de contrôler l'addition du mélange de monomères de façon à obtenir un copolymère de composition contrôlée (contrôle de la composition de l'interface) ; c'est ainsi qu'on se place souvent dans des conditions d'addition telles que la vitesse de polymérisation soit plus grande que celle d'addition.

Polymérisation par addition différée appelée shot : une fois que la réaction de polymérisation est en cours, le monomère fonctionnel seul, ou en présence du monomère de base, est introduit dans le système d'une façon contrôlée. Le succès de l'opération dépend donc du degré de connaissance préalable de la cinétique de copolymérisation. C'est une méthode efficace pour favoriser l'incorporation superficielle. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du mélange des monomères) permet d'optimiser les rendements de surface.

Polymérisation sur semence : elle consiste à introduire le monomère fonctionnel dans le système contenant un latex déjà constitué et parfaitement caractérisé. Le monomère fonctionnel peut être additionné seul ou en mélange avec le monomère de base de la semence, en une étape ou en semi-continu.

Pour améliorer, les propriétés de fixation des molécules cibles sur le support solide, les techniques de polymérisation sur semence, polymérisation par addition différée, polymérisation en semi-continu sont préférées car elles conduisent à un maximum d'incorporation du dérivé portant le résidu phénylboronique en surface.

Le terme"support solide"inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé le polymère. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, comme par exemple le polychlorure de vinyle, polyoléfines (polyéthylène, polypropylène, polybutadiène...), polystyrènes, polyacrylate, polyamide, ou copolymères à base de monomères vinyl aromatiques, alkylesters d'acides alpha-béta insaturés, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile) ; des polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymère de chlorure de vinyle et acétate de vinyle ; copolymères à base de styrènes ou dérivés substitués du styrène ; des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux inorganiques tels que la silice, le verre, la céramique, le quartz ; des latex, des particules magnétiques ; des dérivés métalliques. Le support solide selon l'invention peut être, sans limitation, sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône,

d'un tube, d'un puits, d'un support plan comme un wafer de silice ou silicium. De préférence, le support solide est imperméable à l'eau. Le matériau est hydrophile ou hydrophobe soit intrinsèquement ou par suite d'une modification chimique comme par exemple un support hydrophobe rendu hydrophile. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le support solide comporte en surface des groupements hydrophiles comme des groupements hydroxyles ou amines. En particulier, le support solide est un dérivé plan de silice nue (c'est à dire SiOH) ou un dérivé de silice fonctionnalisé par un réactif silane aminé ou hydroxylé tel que, par exemple et sans aspect limitatif, l'amino propylméthyldiéthoxysilane, l'aminopropyl triéthoxysilane, l'aminopropyl diméthylméthoxy silane, l' (amino-3 phénoxy) -3 propyl triméthoxysilane, le butylamine-4 diméthyl méthoxy silane, l'hydroxyméthyl triéthoxysilane, le N- (hydroxyéthyl)-N-méthylaminopropyl triméthoxysilane, l'aminoéthyl)-3-

aminoisobutyl-méthyl-triméthoxysilane, l' (aminoéthylaminométhyl)-phénéthyl triméthoxysilane, le N- (2aminoéthyl)-3-aminopropyl méthyl diméthoxysilane, le N- (2aminoéthyl)-3-aminopropyl triméthoxysilane.

Dans un autre mode préféré, le support solide est constitué de matériaux organiques, tels que du polyéthylène, polybutadiène, polystyrène, polypropylène ; polychlorure de vinyl, et leur copolymères, fonctionnalisés par des techniques connues de l'homme de l'art telles que l'irradiation aux rayons gamma ou les traitements plasma permettant d'introduire des fonctions hydroxyle ou amine.

Dans un autre mode de réalisation du dispositif selon l'invention, un ligand susceptible de réagir avec la molécule cible est lié au polymère par l'intermédiaire des fonctions acides boroniques. Dans ce cas, le polymère se lie indirectement à la molécule cible par l'intermédiaire du ligand qui forme un complexe avec la molécule cible, ledit ligand étant fixé sur le polymère.

Dans une première variante de réalisation de ce dispositif, le polymère est immobilisé au préalable sur le support solide, puis le ligand est fixé sur le polymère dans une deuxième étape.

Dans un deuxième mode de réalisation de ce dispositif, le ligand est fixé au préalable sur le polymère puis le conjugué ligand/polymère est immobilisé sur le support solide dans une deuxième étape.

Par ligand on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt pour former un complexe ligand/molécule cible. Le complexe est notamment choisi parmi les complexes antigène/anticorps, anticorps/haptène, hormone/récepteur, chélatant/molécule chélaté, hybride d'acides nucléiques.

A titre d'exemple on peut citer comme ligands ou molécules cibles, les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes.

Le terme polynucléotide signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison intemucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les Hphosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides (FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem.

Soc., 114, pl895-1897, 1992 ou les 2'0-alkyl ribose. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Les articles de Lewis (1992. Genetic Engineering News, 12, pl-9) d'une part, et d'Abramson et Myers (1993. Curr. Opin. Biotechnol., 4, p41- 47), d'autre part, donnent des exemples d'amplification de cible. La technique d'amplification enzymatique est par exemple choisie parmi les techniques NASBA

(Nucleic Acid Sequence Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), SDA (Strand Displacement Amplification) ou LCR (Ligase Chain Reaction).

Par polypeptide on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés.

Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines,

les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4-hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-methyl-L leucine, la staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G. C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.

Le terme"haptène"désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et nucléotides.

Le terme"anticorps"inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que

des fragments Fab ou F (ab') 2. Le terme"antigène"désigne un composé susceptible de générer des anticorps. Le terme"protéine"inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique.

Les ligands qui se fixent directement avec les dérivés boroniques sont par exemple les anticorps, les enzymes, les ARN, oligoribonucléotides, les sucres ou les peptides. Dans le cas où les ligands ne comportent pas une telle fonctionnalité, l'introduction d'une fonction permettant la fixation du ligand sur le polymère est réalisée par des moyens connus en soi. A titre d'exemple, pour fixer un ligand oligodésoxyribonucléotide (ODN), la synthèse automatique de l'ODN sur support est terminée par un ribonucléotide convenablement protégé pour disposer d'un cis diol en position 5'ou bien la synthèse démarre sur un support ribonucléotide pour disposer sur l'ODN d'un cis diol en position 3' (voir par exemple Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).

De même les techniques de recombinaison génétique permettent d'exprimer une protéine avec une queue polypeptidique de type polyserine qui permettra la fixation de la protéine sur le polymère (voir par exemple le brevet FR 2 764 988 de la demanderesse).

L'invention décrit aussi un procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon l'invention dans lequel un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif, ladite cible réagissant directement avec les fonctions acides boroniques portées par le polymère.

A titre d'exemple, les molécules cibles qui réagissent directement avec les dérivés d'acide boronique sont les anticorps, les ARN, les glycoprotéines ou les peptides.

Dans leur région charnière, les immunoglobulines possèdent des sucres qui peuvent être complexés par des dérivés d'acide boronique, permettant ainsi une immobilisation orientée des anticorps dont le site actif restera totalement accessible.

Un exemple d'application de ce procédé est la simplification et l'amélioration des méthodes de fixation d'anticorps sur des supports solides pour le dosage ou la purification Tout peptide présentant une serine en position NH2 terminale pourra être complexé de façon spécifique par des dérivés d'acide boronique, ce qui constituera une méthode simple d'immobilisation qui conservera l'activité du peptide, puisque aucune autre fonction sera concernée par ce mode de fixation. Un exemple d'application concerne l'amélioration de la sensibilité, stabilité et spécificité des tests diagnostiques basés sur des peptides. Un autre exemple d'utilisation concerne le criblage de molécules thérapeutiques sur un grand nombre de peptides notamment des peptides préparés par chimie combinatoire comme décrit par Gallop et al. dans J. Medicinal Chem., 34 (10), pl234-1251, 1994 ou Gordon et al., J. Medicinal Chem., 37 (10), pl385-1401, 1994.

Dans un ARN, le ribose en extrémité 3'présente une fonction cis-diol, dont la complexation avec un acide boronique permettra l'immobilisation, sur un support, de la molécule d'ARN, ceci d'une façon spécifique, même en présence d'ADN car, en série déoxyribose, il n'y a pas de cis diol à l'extrémité 3', mais une seule fonction alcool qui ne peut pas se complexer.

Un exemple d'application de ce procédé est l'extraction spécifique de l'ARN d'un lysat cellulaire. Un autre exemple d'application concerne le criblage de gènes d'expression comme les ARN messagers pour la découverte de nouveaux médicaments.

L'invention porte aussi sur un procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon l'invention, dans lequel un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif, ladite cible formant un complexe avec le ligand fixé sur le polymère.

Dans un premier mode de réalisation du procédé, le ligand est préalablement fixé sur le polymère avant de réagir avec la molécule cible. Dans un deuxième mode de réalisation, le ligand et la molécule cible réagissent en solution pour former un complexe et le complexe est fixé sur le polymère. Dans un troisième mode de réalisation, la molécule cible réagit en solution pour former un complexe avec un premier ligand lui même lié de manière covalente ou non covalente à un antiligand capable de former un complexe avec un deuxième ligand fixé sur le polymère.

A titre d'exemple de ce troisième mode, la molécule cible est un acide nucléique, le premier ligand est un oligonucléotide capable de s'hybrider avec la cible et portant une biotine (antiligand) à l'extrémité 5'ou 3'et le deuxième ligand est une streptavidine fixée sur le polymère.

Dans un autre exemple, la molécule cible est un acide nucléique et le premier ligand est un oligonucléotide capable de s'hybrider avec la cible liée à un autre oligonucléotide ne s'hybridant pas avec la cible (antiligand) mais capable de s'hybrider avec un oligonucléotide complémentaire (le deuxième ligand) fixé sur le polymère. Les conditions de formation de ces complexes sont connues en soi de même que certaines étapes classiques dans un procédé selon la présente invention comme les étapes de passivation du support solide ou les étapes de lavage. Les brevets de la demanderesse FR 2 707 010 et FR 2 710 075 dont le contenu est incorporé dans la présente demande illustrent ces aspects.

L'invention concerne également un nouveau polymère hydrosoluble composé d'au moins un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phénylboronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l'acrylamide ou du méthacrylamide.

L'invention concerne également une nouvelle particule hydrophile composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des N-alkylacrylamide, un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un réticulant.

La figure 1 annexée représente une photographie en microscopie à force atomique d'un support de silice nue sur lequel sont immobilisées des particules non fonctionnalisées par un dérivé d'acide boronique.

La figure 2 annexée représente une photographie en microscopie à force atomique d'un support de silice nue sur lequel sont immobilisées des particules fonctionnalisées par un dérivé d'acide boronique.

La figure 3 annexée représente une photographie en microscopie à force atomique d'un support de silice SiNH2 sur lequel sont immobilisées des particules fonctionnalisées par un dérivé d'acide boronique.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Exemple 1 : Synthèse d'un polymère hydrophile contenant un dérivé d'acide phénylboronique.

Synthèse de l'acide m-méthacrylamidophénylboronique (PHBA) : Dans 10 ml d'acétone anhydre, on dissout 780 mg (5mmoles) de monohydrate de l'acide 3-aminophénylboronique (28, 751-2 Aldrich). A température ambiante, on ajoute 1 ml (environ 1 mmole) du chlorure de méthacryloyle (52, 321-6 Aldrich). On observe la formation d'un précipité et, après redissolution, on ajoute lml de N, N- diisopropyléthylamine (Aldrich, 29,896-4). Après trois heures d'agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est dilué dans 150 ml d'éther éthylique puis il est lavé successivement par des solutions saturées en bicarbonate et chlorure de sodium. Après séchage de la phase éthérée sur sulfate de sodium, le solvant est éliminé sous vide partiel. Le produit brut est purifié sur colonne de silice (éluant acétone/pentane 25/75). Le produit est caractérisé par RMN du proton.

Synthèse du N-méthoxyéthylméthacrylamide : Dans 50 ml d'éther anhydre refroidis à 0 C on verse rapidement 19,38 ml de chlorure de méthacryloyle (95,65 mmoles, Aldrich, 15, 631-0)). On ajoute alors goutte à goutte, un mélange de 9,14 ml de 2-méthoxyéthylamine (105,22 mmoles, Aldrich, 24,106-7) et 20 ml de triéthylamine dans 50 ml d'éther anhydre. Après 18 heures d'agitation à température ambiante, le précipité formé est filtré. Le solvant du filtrat est évaporé et le brut est purifié sur colonne de silice (éluant : éther 100%). On récupère 12,54 g de produit (Rendement = 91%). Le produit est caractérisé par RMN du proton.

RMN du proton (200 MHz, Brucker, référence TMS, ppm) : 6,5 (singulet IH, amide), 5,7 et 5,3 (deux singulets, 2 H, protons vinyliques), 3,48 (pic large, 4 H, protons méthyléniques), 3,36 (singulet, 3 H, protons méthoxy), 2 (singulet, 3 H, protons du méthyl vinylique). Copolymérisation radicalaire du N-méthoxyéthvlméthacrylamide et de l'acide m- méthacrylamidophenylboronique :

1, 047 mmole de chacun des deux monomères est dissous dans 15 ml d'eau pour le Nméthoxyéthylméthacrylamide et 15 ml de méthanol pour l'acide m- méthacrylamidophénylboronique. Le mélange des deux solutions précédentes est dégazé pendant une heure à 50 C sous azote avant l'introduction de 0,17g (3% molaire) de 4,4'azobis (acide 4-cyanovalérique). Le milieu réactionnel est agité 18

heures à 50 C avant concentration sous vide partiel et précipitation du polymère dans l'acétone. L'analyse RMN du polymère montre que sa composition est de 40% en dérivé d'acide boronique.

Exemple 2 : Détection spécifiques d'anticorps immobilisés par un polymère hydrosoluble Des IgG polyclonales en solution à 10 mg/1 dans un tampon carbonate de sodium 50 mM pH 9.7 sont incubées dans des puits d'immuno-modules Nunc maxisorp pendant deux heures à 37Oc. Après lavage au PBS-tween, les puits sont passivés par incubation pendant deux heures à 37 C de 200 al de PBS-TWEEN 0,05%, contenant 10% de sérum de chèvre. Le copolymère de l'exemple 1, dissout à 40 mg/1 dans un tampon

carbonate de sodium 50 mM pH 9. 7, est ensuite incubé pendant deux heures à 37Oc. Après lavage avec une solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9, 7 et PBSTween 0, 05% sérum de chèvre 10%, la phosphatase alcaline diluée à 20 ag/ml dans le tampon carbonate 50 mM pH 9, 7 est ensuite incubée à 37OC. Après deux lavages avec la solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,7 et PBS-Tween 0,05% sérum de chèvre 10%, le substrat de la phosphatase alcaline, le paranitrophénylphosphate (pNPP), est alors ajouté en solution dans le diéthanolamine pH 9,8 à 4 g/1. Au bout de 30 mn, la réaction est stoppée par ajout de 100 u. l par puits d'une solution molaire de soude. La densité optique est lue à 405 nm sur le spectromètre Axia de bioMérieux.

NO <SEP> d'expérience <SEP> Densité <SEP> optique <SEP> (1/1000'd'unité)
<tb> 1 <SEP> 1000
<tb> 2 <SEP> 200
<tb> 3 <SEP> 150
<tb>

Expérience 1 : réalisée en présence d'anticorps, de polymère et d'enzyme Expérience 2 : Témoin sans Anticorps Expérience 3 : Témoin sans polymère. Les résultats décrits dans le tableau ci dessus montrent que le polymère contenant un dérivé d'acide phénylboronique réagit avec les anticorps et la phosphatase alcaline.

Exemple 3 : dispositif pour la capture spécifique d'enzymes Deux solutions de copolymère de l'exemple 1, aux concentrations respectives de 40 et 10 mg/1 dans un tampon carbonate 50 mM pH 9.7, sont incubées séparément dans les puits d'une plaque de microtitration NUNC pendant deux heures à 37OC. Après lavage par une solution PBS-Tween 0,05% sérum de chèvre 10%, la phosphatase alcaline diluée à 20 gg/ml dans le tampon carbonate 50 mM pH 9,7 est ensuite incubée une heure à 37Oc. Le substrat, pNPP, est ensuite ajouté après deux lavages avec une solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,7 et PBS-Tween 0,05% sérum de

chèvre 10%, et la réaction est stoppée par ajout de soude IN après 20 mn. La densité optique à 405 nm est lue sur un spectromètre Axia de bioMérieux.

NO <SEP> d'expérience <SEP> Densité <SEP> optique <SEP> (1/1000'd'unité)
<tb> 4 <SEP> 2000
<tb> 51200
<tb> 6100
<tb> 7 <SEP> 100
<tb>

Expérience 4 : réalisée en présence de polymère à la concentration de 40 mg/1. Expérience 5 : réalisée en présence de polymère à la concentration de 10 mg/1.

Expérience 6 : Témoin sans enzyme.

Expérience 7 : Témoin sans polymère.

Comme le montrent les résultats ci-dessus, la phosphatase alcaline est bien capturée par le polymère immobilisé sur un support solide. Les bruits de fond observés aussi bien en absence d'enzyme que de polymère sont très faibles.

Exemple 4 : dispositif pour la capture spécifique de glycoprotéines issues de milieux de culture cellulaire.

La gap 120 virale ainsi que la région extracellulaire de la gp41 sont exprimées sous forme d'une protéine unique appelée gpl60 delta comme décrit dans B. Moss in Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 16.5, John Wiley & Sons ed, 1994-1997. Ce virus recombinant ainsi construit utilise l'enveloppe d'un isolat primaire provenant d'une primo-infection symptomatique.

Des cellules de rein de hamster (BHK-21) sont infectées par le virus recombinant.

Deux jours après infection, le surnageant de culture, qui contient la gpl60 delta sous forme soluble à une concentration moyenne de 1 mg/ml, est récolté, filtré sur 0, lmm et dialysé pendant une 36 heures en tampon carbonate 50mM pH9.7, pour éliminer le glucose présent dans le milieu de culture. Le surnageant cellulaire est dialysé pendant 36 heures contre du tampon carbonate 50 mM pH 9,7 pour éliminer toute trace de glucose.

Les puits de plaque de microtitration NUNC sont incubés comme dans l'exemple 3 avec une solution du copolymère de l'exemple 1 à 40 mg/1 pendant deux heures à 37OC. Après lavage au PBS-Tween, les puits sont passivés par incubation pendant deux heures à 37OC, d'une solution de PBS-Tween 0, 5%-sérum de chèvre 10%. Les surnageants de culture cellulaire sont incubés une heure à 37OC. Après lavages avec une solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,7 et PBS-Tween 0,05% sérum de chèvre 10%, l'anticorps monoclonal de souris anti-GP120 est dilué à diverses concentrations dans du PBS-Tween 0,05% sérum de chèvre 10% avant incubation une heure à 37OC. Après lavages avec du PBS-Tween 0,5%, le conjugué de détection anticorps anti-souris-PAL est dilué en de PBS-Tween 0, 5%-sérum de chèvre 10% puis incubé une heure à 37Oc. Après lavages, la détection est réalisée comme précédemment.

? <SEP> d'expérience <SEP> Densité <SEP> optique
<tb> (1/1000 <SEP> d'unité)
<tb> 81780
<tb> 91300
<tb> 10 <SEP> 1000
<tb> 11600
<tb> 12 <SEP> 280
<tb>
Expérience 9 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 10 p. g/ml. Expérience 10 : réalisée avec FIgG anti-GP120 à la concentration de 5 g/ml.

Expérience 11 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 1, 6 jg/ml.

Expérience 12 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 1 u. g/ml.

Expérience 13 : Témoin sans l'IgG anti-GP120. Les signaux obtenus sont bien dus à la fixation sélective de la glycoprotéine sur le support, comme le montre l'expérience 12 qui constitue un témoin négatif sans anticorps de détection. Il faut noter que le signal de ce témoin négatif est de l'ordre du bruit de fond dû au substrat seul. Le signal observé décroît avec la diminution de la concentration en anticorps de détection anti GP120, ce qui confirme la spécificité du signal obtenu.

Exemple 5 :. Etude du facteur de dilution du surnageant cellulaire.

Les expériences de cet exemple sont réalisées dans les conditions opératoires de l'exemple 4.

? <SEP> d'expérience <SEP> Densité <SEP> optique
<tb> (1/1000'd'unité)
<tb> 13 <SEP> 2000
<tb> 14 <SEP> 760
<tb> 15 <SEP> 383
<tb> 16283
<tb> 17 <SEP> 200
<tb>

Expérience 13 : réalisée sans dilution du surnageant cellulaire.

Expérience 14 : réalisée avec dilution au demi du surnageant cellulaire.

Expérience 15 : réalisée avec dilution au quart du surnageant cellulaire. Expérience 16 : réalisée avec dilution au huitième du surnageant cellulaire.

Expérience 17 : Témoin sans l'anti-GP120.

Lorsque que le surnageant cellulaire est dilué, le signal observé chute brutalement, mais reste toujours spécifique en comparaison avec le témoin négatif anticorps anti- GP120 (expérience 17).

Exemple 6 : préparation de particule thermosensible à base de NIPAM et de PHBA.

Le monomère principal N-isopropylacrylamide (NIPAM, Accros, 41278-5000), le réticulant N, N'-Méthylènebisacrylamide (MBA, Aldrich, 14,607-2) et éventuellement l'acrylamide (AM, Aldrich, 14,866-0) sont introduits ensemble en une seule étape avant

que la polymérisation ne soit amorcée par addition de l'amorceur persulfate de potassium (KPS, Sigma, P5592) qui se décompose sous l'effet de la chaleur. La durée de la polymérisation est de 1 heure. Les conditions d'introduction du monomère PHBA, portant la fonction acide boronique, sont indiquées pour chaque référence sous le tableau.

La formulation des différentes particules préparées est donnée dans le tableau cidessous. Les conditions communes pour les synthèses sont : température de polymérisation de 70 C et agitation lors de la polymérisation de 300 RPM.

<tb>
<tb> référence <SEP> NIPAM <SEP> MBA <SEP> KPS <SEP> AM <SEP> H20 <SEP> PHBA <SEP> Diamètre <SEP> B <SEP> b
<tb> (g) <SEP> (g) <SEP> (g) <SEP> (g) <SEP> (ml) <SEP> (nom) <SEP> ppm
<tb> BNIPAM-1 <SEP> 1, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 1080,036 <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 950 <SEP> BNIPAM-2 <SEP> 1, <SEP> 09 <SEP> 0,090 <SEP> 0,018 <SEP> 0,038 <SEP> 51 <SEP> 0, <SEP> 027 <SEP> 960 <SEP> 900
<tb> BNIPAM-3 <SEP> 1, <SEP> 05 <SEP> 0,090 <SEP> 0,016 <SEP> 0,035 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 084 <SEP> 920 <SEP> 230
<tb> BNIPAM-4 <SEP> 1, <SEP> 06 <SEP> 0,091 <SEP> 0, <SEP> 016 <SEP> 0 <SEP> 51 <SEP> 0, <SEP> 126 <SEP> ND <SEP> 1300
<tb> BNIPAM-5 <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 0,092 <SEP> 0, <SEP> 044 <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 100 <SEP> ND <SEP> ND
<tb> BNIPAM-6 <SEP> 1, <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 042 <SEP> 0, <SEP> 034 <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 164 <SEP> ND <SEP> ND
<tb>
(a) : Le diamètre des particules est mesuré par diffusion de lumière dans une solution de1mMNaClà20 C.

(b) détermination par analyse élémentaire du Bore (c) volume réactionnel ND non déterminé BNIPAM-1 : polymérisation en batch, introduction des réactifs en même temps.

Témoin négatif sans monomère PHBA.

BNIPAM-2 : Introduction de PHBA (solubilisé dans 1 ml H2O à pH basique) après 11 minutes de la polymérisation.

BNIPAM-3 : : Introduction de PHBA (solubilisé dans 2, 4 ml H2O à pH basique) en semi-continu (toutes les 10 minutes) après 30 minutes de début de la polymérisation.

BNIPAM-4 : Introduction de PHBA (solubilisé dans 2, 5 ml H2O à pH basique) après 10 minutes de la polymérisation.

BNIPAM-5 : Le PHBA (solubilisé dans 2 ml H2O à pH basique) est ajouté en plusieurs étapes (toutes les 2 minutes) après 10 minutes à partir du début de la

polymérisation.

BNIPAM-6 : Le PHBA (solubilisé dans 2 ml H2O à pH basique) est ajouté en deux étapes, 1 ajout après 5 minutes de début de la polymérisation et le 2ème après 10 minutes. Exemple 7 : Polymérisation en semi-continu de particules colloïdales contenant un dérivé phénylboronique en utilisant le NIPMAM comme monomère principal.

Le monomère principal N-isopropylméthacrylamide (NIPMAM) est synthétisé au laboratoire par condensation du chlorure de méthacryloyle sur l'amine correspondante.

Les conditions pour la synthèse de la particule (référence HAM4) sont les suivantes : volume total d'eau bouillie et dégazée 50ml ; NIPMAM 0.5g ; MBA 0.06g ; PHBA

0. 025g ; KPS 0. 005g ; Température 70 C.

L'ajout du monomère fonctionnel PHBA est effectué après lh30mn. Taille des particules :

<tb>
<tb> diamètre <SEP> la) <SEP> à <SEP> 20 C <SEP> Diamètre <SEP> (a) <SEP> à <SEP> 40 C <SEP> diamètre <SEP> (b) <SEP> MET
<tb> 1500 <SEP> 500 <SEP> 450
<tb>
(a) La taille mesurée en diffusion dynamique de la lumière dans 10' M NaCl (b) MET : microscope électronique à transmission.

Exemple 8 : synthèse de particule colloidale comportant un dérivé phénylboronique en utilisant le NEMAM comme monomère principal.

La polymérisation se déroule dans un réacteur thermostaté, surmonté d'un agitateur mécanique, sous atmosphère d'azote. La température de réaction est fixée à 90oC, et la vitesse d'agitation à 280 rpm. Trois protocoles de polymérisation sont utilisés.

Polymérisation batch

A 50 ml d'eau MQ, bouillie et dégazée pendant 2h, on ajoute 1g de N- éthylméthacrylamide (NEMAM, Polyscience, 02322) 0, 15 g d'éthylène glyco diméthacylate (EGDMA, Merck, 818847) et une solution contenant X g d'acide mméthacrylamidophénylboronique (PHBA), 1,9 ml de KOH 0, IN, et 3,5 ml d'eau. Après stabilisation du système pendant 1/2 heure, on ajoute O, Olg de KPS. La polymérisation est alors amorcée et le milieu passe de l'incolore à une couleur blanchâtre en quelques minutes.

La polymérisation est stoppée au bout de 6 heures en trempant le milieu réactionnel dans un bain de glace.

Polymérisation addition différée la variante 1 : A 50 ml d'eau MQ, bouillie et dégazée pendant 2h, on ajoute lg de NEMAM et 0,15 g d'EGDMA. Après stabilisation du système pendant 1/2 heure, on ajoute O, Olg de KPS.

La polymérisation est alors amorcée et le milieu passe de l'incolore à une couleur blanchâtre en quelques minutes. Au bout de 40 min, le stade de la polymérisation étant à environ 70% de conversion, une solution contenant X g de PHBA, 1,9 ml de KOH 0, 1N, et 3,5 ml d'eau, est insérée à raison de 1 mol toutes les 10 min.

Polymérisation addition différée selon la variante 2 : A 50 ml d'eau issu d'un système de purification de type MilliQ (Millipore) bouillie et dégazée pendant 2h, on ajoute 1g de NEMAM et 0,15 g d'EGDMA. Après stabilisation du système pendant 1/2 heure, on retire 5ml du milieu réactionnel, et on ajoute O, Olg de KPS. La polymérisation est alors amorcée et le milieu passe de l'incolore à une couleur blanchâtre en quelques minutes. Au bout de 40 min, le stade de la polymérisation étant à environ 70% de conversion, une solution contenant X g de PHBA, 1,9 ml de KOH O, IN, 3,5 ml d'eau, et les 5 ml du milieu réactionnel préalablement récupérés, est insérée à raison de 2ml toutes les 10 min.

Les caractéristiques des polymères synthétisés sont donnés dans les tableaux cidessous : Polymérisation batch

<tb>
<tb> Référence <SEP> Quantité <SEP> X <SEP> Conversion <SEP> Dl <SEP> D2 <SEP> WSP <SEP> Taux <SEP> Taux
<tb> particule <SEP> de <SEP> PHBA <SEP> PHBA <SEP> (nm) <SEP> (nm) <SEP> (%) <SEP> PHBA <SEP> PHBA
<tb> en <SEP> gramme <SEP> (%, <SEP> RMN) <SEP> (20 C) <SEP> (TEM) <SEP> (AE) <SEP> (ESCA)
<tb> HAM508741551803100
<tb> HAM6 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 85 <SEP> 2944 <SEP> 184 <SEP> 41 <SEP> 0, <SEP> 05
<tb> HAM7 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 80 <SEP> 3787 <SEP> 212 <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 0, <SEP> 33
<tb> HAM8 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 81 <SEP> 3425 <SEP> 194 <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 0, <SEP> 31
<tb>
AE signifie analyse élémentaire. Le taux de PHBA par AE est donné en pourcentage atomique et représente le taux moyen en masse dans la totalité de la particule. Le taux PHBA en ESCA (Electron Spectrometry for Chemical Analysis) est donné en pourcentage atomique et représente le taux en surface sur une profondeur d'une dizaine

d'angströms.

Dl représente le diamètre en nm déterminé à 20 C par spectroscopie de corrélation de photon (Malvem Zetasizer, 3000 HS).

D2 représente le diamètre en nm déterminé par microscopie électronique en transmission (TEM, sur appareil Philips CM 120, CME-ABG).

La conversion est suivie par Résonance Magnétique Nucléaire à 500 Mhz (appareil Varian Unity+) en contrôlant la disparition des pics correspondant aux protons vinyliques du monomère.

WSP correspond au pourcentage massique de polymère hydrosoluble non incorporé sur ou dans les particules.

Polymérisation addition différée selon la variante 1

<tb>
<tb> Référence <SEP> Quantité <SEP> X <SEP> Conversion <SEP> Dl <SEP> D2 <SEP> WSP <SEP> Taux <SEP> Taux
<tb> particule <SEP> de <SEP> PHBA <SEP> PHBA <SEP> (min) <SEP> (nm) <SEP> (%) <SEP> PHBA <SEP> PHBA
<tb> en <SEP> gramme <SEP> (%, <SEP> RMN) <SEP> (20 C) <SEP> (TEM) <SEP> (AE) <SEP> (ESCA)
<tb> HAM5 <SEP> 0 <SEP> 87 <SEP> 415 5 <SEP> 180 <SEP> 31 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> HAM10 <SEP> 0,01 <SEP> 80 <SEP> 345 2 <SEP> 39 <SEP> 0,03 <SEP> 0,44
<tb> HAM11 <SEP> 0,03 <SEP> 87 <SEP> 355 <SEP> 207 <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 11
<tb> HAM12 <SEP> 0,05 <SEP> 84 <SEP> 316~5 <SEP> 201 <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 61
<tb> HAM13 <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> 83 <SEP> 3805 <SEP> 206 <SEP> 35 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 73
<tb>
Définitions identiques au tableau précédent Polymérisation addition différée selon la variante 2 :

<tb>
<tb> Référence <SEP> Quantité <SEP> X <SEP> Conversion <SEP> Dl <SEP> D2 <SEP> WSP <SEP> Taux <SEP> Taux
<tb> particule <SEP> de <SEP> PHBA <SEP> PHBA <SEP> (non) <SEP> (nm) <SEP> (%) <SEP> PHBA <SEP> PHBA
<tb> en <SEP> gramme <SEP> (%, <SEP> RMN) <SEP> (20 C) <SEP> (TEM) <SEP> (AE) <SEP> (ESCA)
<tb> HAM5 <SEP> 0 <SEP> 87 <SEP> 4155 <SEP> 180 <SEP> 31 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> HAM15 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 76 <SEP> 3655 <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> HAM16 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 83 <SEP> 3625 <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 31
<tb> HAM17 <SEP> 0,05 <SEP> 80 <SEP> 375 5 <SEP> 39 <SEP> 0,16 <SEP> 0,52
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Définitions identiques au tableau précédent Exemple 9 : Immobilisation des particules sur des supports solides Fonctionnalisation des supports de silice : Des plaques de silice sont taillées de façon à avoir des surfaces de 0,8 x 0,8 cm2. Les plaques sont activées dans une solution piranah (mélange eau oxygénée 30% en volume et acide sulfurique concentrée dans les proportions volumiques respectives de 30/70) en ébullition pendant 15-20 min (face brillante vers le haut en évitant le recouvrement entre les plaques), puis des lavages successifs à l'eau distillée sont

effectués (au moins litre). Ce traitement permet de régénérer les fonctions silanols de la silice. Cette silice est appelée aussi silice nue Certaines plaques sont ensuite séchées individuellement sous un courant d'azote, puis immergées dans une solution d'aminopropylméthyldiéthoxysilane (AMPDES) à 2% (v/v) dans du toluène anhydre pendant au moins 2 heures (face brillante vers le haut en évitant le recouvrement entre les plaques). Les plaques sont ensuite rincées intensivement à l'acétone (au moins 500 ml) puis séchés sous courant d'azote. Ces surfaces sont appelées surfaces SiNH2.

Immobilisation des particules sur les surfaces Les plaques sont immergées dans une solution latex contenant es particlues telle que 20

al de solution de particules à environ 2% de taux de solide sont dissous dans 980 pu de solution tampon acétate 50 mM, pH=4, 2, 1 M KCI (dilution 1/50).

Après une nuit d'immersion, les plaques sont rincées abondamment dans de l'eau distillée, puis immergées successivement dans de l'eau distillée en ébullition pendant 10 min, de l'éthanol en ébullition pendant 10 min, de l'acétone en ébullition pendant 10 min.

Ce type de lavage intensif a pour but de décrocher les particules faiblement adsorbées et non fixées de façon stable sur la surface.

Les résultats sont visualisés par microscopie à force atomique (AFM) sur un appareil Nanoscope 3 de Digital Instruments en mode Tapping et sont représentées sur les figures 1 à 3.

La figure 1 représente une photo AFM d'une surface silice nue (SiOH), sur laquelle est immobilisée une dilution des particules non fonctionnalisées HAM5. (dilution 1/50 dans un tampon acétate, 50 mM, pH=4.2, IM KC1).

La figure 2 représente une photo AFM d'une surface silice nue (SiOH)) sur laquelle est immobilisée une dilution des particules fonctionnalisées HAM 11 (dilution 1/50 dans un tampon acétate, 50 mM, pH=4.2, 1M KC1).

La figure 3 représente une photo AFM d'une surface SiNH2, sur laquelle est immobilisée une dilution des particules fonctionnalisées HAM13 (dilution 1/50 dans un tampon acétate, 50 mM, pH=4.2, IM KC1).

L'amélioration apportée par l'incorporation de monomères portant des fonctions acides boroniques dans le polymère pour la réalisation d'un dispositif de capture apparaît clairement sur les photos puisque la densité de particules sur la surface est plus importante pour les particules comportant les fonctions acides boroniques.

Les fonctions d'acides boroniques présentes sur le polymère servent donc à la fois à immobiliser le polymère sur le support solide et à fixer la molécule cible sur le polymère.

Claims

REVENDICATIONS

1. Dispositif de capture d'une molécule cible comprenant un support solide sur lequel est immobilisé un polymère susceptible de se lier directement ou indirectement à la molécule cible, caractérisé en ce que en combinaison le polymère est hydrophile et contient au moins un monomère possédant au moins une fonction acide boronique.

2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le polymère est un polymère hydrosoluble.

3. Dispositif selon la revendication 2 caractérisé par le fait que le polymère est un copolymère entre un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l'acrylamide ou du méthacrylamide.

4. Dispositif selon la revendication 3 caractérisé par le fait que le polymère est un copolymère de l'acide m-méthacrylamidophenyl boronique et le Nmethoxyéthylméthacrylamide.

5. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le polymère est une particule colloïdale ou un latex.

6. Dispositif selon la revendication 5 caractérisé par le fait que la particule est composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des Nalkylacrylamide ou un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un réticulant.

7. Dispositif, selon l'une quelconque des revendication 1 à 6, caractérisé par le fait que le support solide comporte en surface des groupements hydrophiles comme des groupements hydroxyles ou amines.

8. Dispositif, selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le support solide est un dérivé plan de silice nue ou un dérivé de silice fonctionnalisé par un réactif silane aminé tel que l'amino propylméthyldiéthoxysilane.

9. Dispositif de capture, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'un ligand susceptible de former un complexe avec la molécule cible est lié aux fonctions d'acides boroniques portées par le polymère.

10. Procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif et ladite cible réagit avec les fonctions d'acides boroniques portées par le polymère.

11. Procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif, ladite cible formant un complexe avec le ligand fixé sur le polymère.

12. Procédé de capture selon la revendication 11, caractérisé par le fait le complexe est choisi parmi les complexes antigènes/anticorps, anticorps/haptène, hormone/récepteur, chélatant/molécule chélaté, hybride d'acides nucléiques.