FR2887888A1

FR2887888A1 - Nouveaux agents de transfert fonctionnalises pour polymerisation radiculaire controlee raft, procedes raft mettant en oeuvre de tels agents de transfert et polymeres susceptibles d'etre obtenus par de tels procedes

Info

Publication number: FR2887888A1
Application number: FR0552033A
Authority: FR
Inventors: Agosto Franck D; Mael Bathfield; Marie Therese Charreyre
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2005-07-04
Filing date: 2005-07-04
Publication date: 2007-01-05
Also published as: WO2007003782A3; WO2007003782A2

Abstract

L'invention a pour objet des agents de transfert réversible de chaîne pour polymérisation RAFT, appartenant à la famille des dithioesters, à la famille des xanthates ou à la famille des trithiocarbonates, comprenant un groupement de formule : dans lequel R est un groupe qui comprend au moins une fonction ester activé (I), ou bien comprenant un groupement de formule : dans lequel R' est un groupe qui comprend au moins une fonction amide-L, avec L choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères et les supports solides (II).

Description

-C-S-R I I

S

-C-S-R' I I

S

La présente invention concerne le domaine des polymères et de la polymérisation contrôlée. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet de nouveaux agents de transfert utilisables dans le procédé de polymérisation radicalaire contrôlée qui met en oeuvre un transfert réversible de chaîne par addition fragmentation, nommé RAFT (de l'anglais Reversible Addition Fragmentation chain Transfer ), permettant l'introduction d'un composé d'intérêt, à l'extrémité alpha (a) des polymères obtenus avec ces dits agents de transfert. L'invention est également relative aux procédés RAFT mettant en oeuvre de tels agents de transfert et aux polymères susceptibles d'être obtenus par de tels procédés.

Le développement de polymères répondant aux besoins de nouvelles applications est l'un des enjeux de la recherche. Les polymères de synthèse ont été utilisés depuis longtemps aussi bien dans le domaine thérapeutique pour vectoriser des molécules actives ou des gènes, que dans le domaine du diagnostic. Dans ce dernier cas, des ligands biologiques sont fixés sur les polymères par complexation, par covalence ou par reconnaissance spécifique, et les conjugués ainsi formés sont utilisés dans des tests de détection de molécules cibles, essentiellement pour augmenter la sensibilité.

Le brevet FR 2 688 788 (Charles M.H. et al.) décrit la synthèse et l'utilisation de conjugués ligands biologiques/copolymère à base d'anhydride malé ïque comme le copolymère anhydride maléïque/méthylvinyléther (AMVE) pour la fixation de ligands biologiques sur un support solide. De même, le brevet FR 2 707 010 (Mabilat C. et al.) décrit un copolymère à base de N-vinyl pyrrolidone comme le copolymère N-vinyl pyrrolidone/N-acryloxysuccinimide (NVPNAS) toujours pour h fixation de ligands biologiques sur un support solide. Ces mêmes copolymères ont été utilisés pour des réactions d'amplification de signal (voir brevet FR 2 710 075, Mandrand B. et al.) ou pour la synthèse in situ de conjugués (voir WO 99/07749, Minard C. et al.). Ces polymères, obtenus à partir de monomères fonctionnalisés (également nommés monomères fonctionnels), sont porteurs de plusieurs ligands biologiques. Bien que ces différents copolymères permettent une amélioration de la sensibilité dans les tests diagnostiques, ils présentent un certain nombre d'inconvénients. Le copolymère est adsorbé sur le support solide de manière aléatoire. On ne sait pas s'il est adsorbé via un ou des ligands biologiques, ou via des segments du squelette copolymère. De toute façon, le copolymère est adsorbé sur le support solide en plusieurs points répartis le long du squelette (mode boucles). Dans ce cas, la disponibilité des ligands biologiques pour réagir avec les molécules cibles est limitée. De plus, dans certains cas, les conjugués présentent une structure agrégée (voir par exemple Erout M. N. et al., Bioconjugate Chemistry, 7(5), 568-575, (1996) ou Delair T. et al., Polymers for Advanced Technologies, 9, 349361, (1998)). Ce phénomène d'agrégation est résolu totalement par les méthodes mises en oeuvre dans la demande WO 99/07749, mais la sensibilité des tests de détection des molécules cibles n'en est pas d'avantage améliorée.

Par ailleurs, il est bien évident que les propriétés physiques d'un polymère sont étroitement liées à sa structure macromoléculaire (architecture des chaînes, polymolécularité, etc.). Il est donc important de savoir contrôler la structure macromoléculaire des chaînes polymères, afin d'obtenir des polymères aux propriétés bien définies.

Il existe plusieurs techniques de polymérisation. La polymérisation radicalaire est bien plus employée que la polymérisation ionique, car elle est plus souple d'utilisation: la présence d'impuretés n'est pas rédhibitoire, la réaction peut être effectuée en milieu aqueux et de très nombreux monomères peuvent être utilisés. Mais, il est difficile de contrôler la structure macromoléculaire des polymères formés, en particulier il est difficile de synthétiser des copolymères à blocs.

La polymérisation radicalaire contrôlée (ou vivante), conjuguant les avantages de la polymérisation radicalaire et le contrôle des caractéristiques macromoléculaires est donc un sujet de recherche de première instance.

La polymérisation radicalaire comporte trois étapes: l'amorçage (création de radicaux libres et réaction avec la première unité de monomère), la propagation (additions successives d'unités monomères sur la chaîne en croissance ((macro)radical)) et la terminaison (arrêt de la chaîne) par couplage ou dismutation entre deux chaînes en croissance ou par transfert d'un proton sur une chaîne en croissance. Les réactions de terminaison et de transfert affectant les (macro)radicaux sont responsables de la perte de contrôle de la polymérisation (chaînes polymères de masse non prévisible, polymolécularité élevée). Pour obtenir une polymérisation radicalaire contrôlée, il convient donc de réduire fortement ces réactions de terminaison et de transfert irréversible, au profit des réactions de propagation. Le principe général consiste à désactiver de façon réversible les centres actifs en formant des espèces dormantes (non réactives), afin d'avoir une très faible concentration en (macro)radicaux dans le milieu tout au long de la polymérisation (de K. Matyjazewski, Controlled Radical Polymerization, American Chemical Society Symposium Series, 768, Washington DC, USA, 2000). Un type de désactivation des (macro)radicaux permettant d'obtenir une polymérisation radicalaire contrôlée, qui a été récemment développé, utilise le transfert réversible de chaîne, avec un agent de transfert incluant le motif suivant: C S ...

Il 10 S Un exemple d'un tel procédé de polymérisation radicalaire contrôlée utilisant un agent de transfert réversible de chaîne organosoufré est le procédé RAFT (Reversible Addition Fragmentation chain Transfer) tel que notamment décrit dans la demande de brevet WO98/01478 où l'agent de transfert de chaîne est un dithioester ou un trithiocarbonate. La demande de brevet WO99/31144, quant à elle, décrit le procédé de polymérisation RAFT dans lequel l'agent de transfert est choisi parmi les xanthates et les dithiocarbamates. L'utilisation des dithiocarbamates est limitée car elle s' applique à une variété moins grande de monomères.

Lorsque l'agent de transfert répond à la formule Z"-C(S)S-R", le procédé RAFT permet la synthèse de chaînes polymères de longueur contrôlée, et possédant à chacune de leurs extrémités, les groupements R" (extrémité a) et -SC(S)-Z" (extrémité co) provenant de l'agent de transfert réversible de chaîne utilisé. On peut donc envisager de se servir de cet agent de transfert pour introduire sélectivement et quantitativement des molécules d'intérêt à l'extrémité de chaque chaîne polymère.

La synthèse d'agents de transfert fonctionnalisés est donc un enjeu important pour la synthèse de polymères fonctionnalisés en extrémité de chaînes.

Plusieurs travaux récents se sont intéressés à cet aspect. Stenzel et al. dans J. Mater. Chem. 2003, 13, 2090 décrivent la synthèse d'un trithiocarbonate fonctionnalisé avec un sucre, à partir d'un sucre porteur de plusieurs fonctions OH et d'un dérivé chlorure d'acide d'un trithiocarbonate. Cette méthode fait intervenir un chlorure d'acide très peu stable. De plus, le trithiocarbonate fonctionnalisé obtenu comporte une fonction ester assez fragile.

Chen et al., dans Chem. Comm. 2002, 2276-2277, décrivent la préparation d'un dithioester fonctionnalisé avec un fluorophore, à partir d'un composé comprenant une ou plusieurs fonctions OH et d'un dithioester comportant une fonction acide carboxylique (dérivé de l'ACPA), par réaction d'activation au DCC/DMAP. Une polymérisation RAFT est ensuite réalisée avec cet agent de transfert fonctionnalisé, avec un monomère de type styrène-coumarine, acénaphtylène ou méthyl acrylate. Dans cette publication, la préparation de l'agent de transfert fonctionnalisé nécessite l'utilisation d'un agent activateur et la réaction d'estérification est lente et incomplète. De plus, là encore, l'agent de transfert fonctionnalisé obtenu comporte une fonction ester assez fragile.

Ces mêmes auteurs dans Macromolecules, 2004, 37, 5479-5481 ont préparés un dithioester fluorescent, à partir d'un dithioester et d'un monomère fluorescent, ce qui nécessite donc une étape préalable d'introduction d'une fonction polymérisable sur une molécule fluorescente. Une polymérisation RAFT avec un tel dithioester fluorescent et un monomère de type acénaphtylène et acide acrylique est également décrite. Par ailleurs, dans cette publication, les auteurs soulignent que leurs travaux précédents concernant la préparation d'un agent de transfert fonctionnalisé comportant une fonction ester sont limités par le manque de stabilité de cette fonction, dans des applications nécessitant la présence d'une base ou d'un acide. Ils soulignent également que le remplacement qui pourrait être envisagé de cette fonction ester par une fonction amide beaucoup plus stable est limité par le faible rendement de la réaction de couplage entre un agent de transfert RAFT comportant une fonction acide carboxylique et un chromophore porteur d'une fonction amine, dû à la réaction compétitive d'aminolyse du dithioester par cette fonction amine.

En effet, il est connu, que les composés aminés réagissent sur la fonction dithioester -SC(S)- pour former un composé thioamide et une fonction thiol S H. Par conséquent, il n'est pas possible de coupler directement, en une seule étape, un composé aminé d'intérêt, avec un agent de transfert RAFT de type dithioester, trithiocarbamate ou xanthate, ou avec les polymères obtenus classiquement avec lesdits agents de transfert selon le procédé RAFT. Or, la Demanderesse a maintenant découvert, contre toute attente, que l'introduction dans le groupe R" d'une fonction ester activé isolable permettait de défavoriser fortement, voire d'éviter cette réaction de compétition, étant donné que la réaction de cet ester activé avec une fonction nucléophile, et en particulier avec une fonction amine, se fait de façon prioritaire, très rapide, quasi quantitative et en une seule étape.

La présente invention se propose donc de fournir de nouveaux agents de transfert réversible de chaîne, parfaitement adaptés au procédé RAFT, permettant une synthèse aisée de polymères fonctionnalisés en bout de chaîne. En particulier, la fonctionnalisation peut alors être réalisée par formation d'une fonction amide très

stable.

Dans ce contexte, la présente invention a pour objet, des agents de transfert réversible de chaîne (I) pour polymérisation RAFT, appartenant à la famille des dithioesters, à la famille des xanthates ou à la famille des trithiocarbonates, comprenant un groupement de formule: C S R I I

S

dans lequel R est un groupe qui comprend au moins une fonction ester activé.

La présente invention a également pour objet les agents de transfert réversible de chaîne obtenus par couplage de l'un des agents de transfert réversible de chaîne tels que définis ci-dessus avec un composé aminé d'intérêt.

Un deuxième but de l'invention est de proposer un procédé de polymérisation permettant d'une part d'obtenir des polymères fonctionnalisés en bout de chaîne, en particulier à leur extrémité a, notamment par introduction d'un composé d'intérêt, et d'autre part de contrôler les masses molaires moyennes en nombre Mn des polymères obtenus et d'obtenir des polymères présentant un indice de polymolécularité (Mw/Mn) faible, c'est-à-dire au plus égal de préférence à 1,50, Mw étant la masse molaire moyenne en masse des chaînes polymères.

Ainsi, la présente invention a pour objet les procédés de polymérisation radicalaire contrôlée utilisant un agent de transfert réversible de chaîne organosoufré tel que défini ci-dessus.

En particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation de polymères mettant en oeuvre une étape de polymérisation RAFT, réalisée à partir de monomères identiques ou différents, en présence d'une source de radicaux amorceurs et d'un agent de transfert réversible de chaîne, dans lequel l'agent de transfert réversible de chaîne est tel que défini précédemment et est porteur d'au moins une fonction ester activé ou est obtenu par couplage entre un agent de transfert porteur d'au moins une fonction ester activé et un composé d'intérêt porteur d'une fonction nucléophile réactive vis-à-vis de la fonction ester activé.

Dans le cas où la polymérisation est réalisée avec un agent de transfert (I) porteur d'au moins une fonction ester activé, le procédé de préparation selon l'invention comportera avantageusement, après la polymérisation RAFT, une étape de couplage entre au moins une des fonctions ester activé situées à l'extrémité a du polymère obtenu, et un composé d'intérêt porteur d'une fonction nucléophile réactive vis-à-vis de la fonction ester activé.

Enfin, la présente invention a pour objet les polymères susceptibles d'être obtenus par un procédé tel que défini ci-dessus.

Avant de décrire plus en détails l'invention, certains termes employés dans la description et les revendications, outre ceux indiqués précédemment, sont définis ci-après.

On entend par masse molaire au sens de l'invention la masse molaire moyenne en nombre, Mn, des chaînes polymères formées. Dans le cas présent, elle est obtenue après analyse des échantillons par chromatographie d'exclusion stérique, en utilisant deux détecteurs, un détecteur de type réfractomètre couplé à un appareil de diffusion de lumière, ce qui permet d'avoir accès à des valeurs de masse molaire absolues. L'appareil de diffusion de lumière est un miniDawn (Wyatt Technology) et les masses molaires absolues sont déterminées avec le logiciel ASTRA (Wyatt Technology).

L'indice de polymolécularité est l'indice de distribution des masses molaires bien connu de l'homme du métier. Ainsi l'indice de polymolécularité est Ip, avec Ip=Mw/Mn, Mn et Mw étant telles que définies ci-dessus. Dans le cas présent, il a été également déterminé avec le logiciel ASTRA.

Le terme copolymère doit être compris comme un polymère formé par au moins deux entités différentes répétées et, notamment, les copolymères à blocs, les copolymères statistiques. Dans les copolymères statistiques, les entités sont réparties statistiquement le long de la chaîne macromoléculaire ou bien se succèdent régulièrement selon une structure générale (Bn'Cm' )p' dans laquelle n', m' et p' sont des nombres entiers identiques ou différents, on parle alors dans ce dernier cas de copolymères alternés.

Par composé d'intérêt, on entend tout type de composé moléculaire, macromoléculaire ou support solide, qu'il est intéressant de coupler à un polymère, pour telle ou telle application, en particulier pour une application en biologie, thérapeutique ou diagnostic. A titre d'exemple de composés d'intérêt, on peut citer les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères et les supports solides. La seule condition nécessaire pour le composé d'intérêt est qu'il porte une fonction réactive susceptible de réagir avec la fonction ester activé. La fonction réactive est choisie à titre d'exemple parmi les fonctions amine, hydrazine, hydrazide, azide, alcoxyamine, hydroxyle, thioL Le composé d'intérêt peut être lié au polymère selon l'invention par l'intermédiaire d'un bras espaceur qui porte alors la fonction réactive.

Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple, on peut citer, comme ligands biologiques, les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, la biotine...

Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6- purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les Hphosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides (FR 2 607 507), ou les PNA (Egholm M. et al., J. Am. Chem, Soc.,1992, 114, 1895-1897), ou les 2-0-alkyl ribose, ou les LNA (de l'anglais Loked Nucleic Acids , décrits notamment dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 00/66 604). Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique.

Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés.

Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4-hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N- méthyl- L- leucine, la staline (Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acides, Barett G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.

Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux- mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et les nucléotides.

Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires.

En tant que monosaccharide, on peut citer, par exemple, le glucose, le galactose, le mannose, le fructose, et en tant que disaccharide, par exemple, le saccharose, le cellobiose, le lactose, le maltose.

En tant que lipide, on peut citer, par exemple, le dip almitoylpho sphatidylcholine.

En tant que colorant, on peut citer le bleu de méthylène, le vert de bromocrésol, le rouge methyl, la safranine O. En tant que molécules fluorescentes, on peut par exemple citer la fluorescéine, la rhodamine, le pyrène, le phénanthrène, l'anthracène, la coumarine.

En tant que chaîne polymère, on entend un polymère naturel ou de synthèse ayant été modifié afin de porter au moins une fonction réactive vis-à-vis de la fonction ester activé. Comme polymère naturel, on peut par exemple citer les polysaccharides comme la cellulose, le dextrane, le chitosane, les alginates. Comme polymère de synthèse, on peut, par exemple, citer le polyoxyde d'éthylène, le polyoxyde de propylène, le polychlorure de vinyle, les polyéthylènes, polypropylènes, polystyrènes, polyacrylates, polyacrylamides, polyamides, polyméthacrylates, polyméthacrylamides, polyesters, ou copolymères à base de monomères vinyle aromatique, alkylesters d'acides alpha-beta insaturés, esters d'acides carboxyliques insaturés, le chlorure de vinylidène, les diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile), les copolymères de chlorure de vinyle et de propylène, de chlorure de vinyle et acétate de vinyle, les copolymères à base de styrènes ou dérivés substitués du styrène.

L'utilisation d'une chaîne polymère en tant que composé d'intérêt, permettra d'obtenir un copolymère à blocs porteurs de deux blocs de nature différente, le premier bloc étant la chaîne polymère mentionnée ci dessus, le deuxième bloc étant un polymère synthétisé par le procédé RAFT en présence du nouvel agent de transfert résultant du couplage de la chaîne polymère sur la fonction ester activé de l'agent de transfert réversible de chaîne selon l'invention. Cela est particulièrement intéressant si le premier bloc correspond à un polymère que l'on ne peut pas synthétiser par le procédé RAFT, par exemple les polyéthylènes, le polychlorure de vinyle, le polyoxyde d'éthylène, le polyoxyde de propylène, les polyesters, les polyamides. La chaîne polymère pourra être, selon l'application ultérieure, soit hydrophile, soit hydrophobe. Elle pourra, en outre, être biodégradable, notamment dans le cas d'applications thérapeutiques. Comme chaîne biodégradable, on peut citer le polyacide lactique, le polyacide glycolique, le polyacide malique, la polycaprolactone.

Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux permettant une utilisation dans des tests diagnostiques ou en thérapeutique, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment des polymères tels que polychlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylates, polyamides, polyméthacrylates, polyesters, ou copolymères à base de monomères vinyle aromatique, alkylesters d'acides alpha-beta insaturés, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile) ; des copolymères de chlorure de vinyle et de propylène, de chlorure de vinyle et acétate de vinyle; copolymères à base de styrènes ou dérivés substitués du styrène; des fibres synthétiques telles que le nylon; des matériaux inorganiques tels que la silice, le verre, la céramique, le quartz; des latex; des particules magnétiques; des dérivés métalliques. Le support solide selon l'invention peut être, sans limitation, sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes, particules ou analogues, d'un support plan comme un wafer de silice ou silicium. Le matériau est soit hydrophile, soit hydrophobe intrinsèquement ou par suite d'une modification chimique, comme par exemple un support hydrophile rendu hydrophobe.

Les supports solides susceptibles de réagir par formation de liaison covalente avec la fonction ester activé portée par l'agent de transfert, ou par le polymère obtenu avec un tel agent, présentent avantageusement des fonctions amine en surface. Par exemple, il est possible d'introduire, chimiquement, des fonctions amine, en surface d'un wafer de silice par silanisation, en utilisant un aminoalkylsilane comme 1' aminopropyldiméthylchlorosilane, 1' aminopropylméthyldichlorosilane ou 1' aminopropyltrichlorosilane.

Dans le cas où le support solide est sous la forme de particules de latex de polystyrène, la fonctionnalisation par des fonctions amines peut être obtenue, par exemple, par copolymérisation de styrène avec de l' aminométhylstyrène ou avec du méthacrylate d'aminoéthyle.

Par alkyle, on entend, lorsqu'il n'est pas donné plus de précision, un groupe hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié comportant de 1 à 18, avantageusement de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemples de groupe alkyle, on pourra citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, ürt-butyle, npentyle, n-hexyle et analogues.

Par alcoxy, on entend un groupe 0-alkyle, alkyle étant tel que défini cidessus.

Par halogène, on entend un atome de chlore, brome, iode ou fluor.

Les termes alcényle et alcynyle correspondent à un groupe hydrocarboné de 2 à 18, et de préférence de 2 à 6 atomes de carbone, comprenant respectivement au moins une double ou une triple liaison. Les exemples de groupe alcényle ou alcynyle sont, par exemple, des groupes vinyle, allyle, isopropényle, 1, 2- ou 3-butényle, pentényle, hexényle, éthynyle, 2propynyle, butynyle.

Le terme cycloalkyle, désigne un groupe alkyle, alcényle ou alcynyle, monocyclique ou polycyclique, par exemple bicyclique, comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, par exemple cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, des groupes cycloalkyle pontés tels que les groupes adamantyle, bicyclo [3.2.1] optanyle.

Le terme hétérocycloalkyle désigne un cycloalkyle tel que ci-dessus défini, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, sélectionnés parmi les atomes d'azote, oxygène et soufre.

Les groupes aryle désignent des carbocycles mono-, bi- ou polycycliques 20 comprenant au moins un groupe aromatique.

Le terme hétéroaryle désigne un groupe aryle tel que ci-dessus défini comprenant au moins un atome choisi parmi les atome s d'azote, oxygène ou soufre.

En tant qu'aryle ou hétéroaryle, on peut citer les groupes phényle, 1naphtyle, 2-naphtyle, indanyle, indényle, biphényle, benzocycloalkyle, c'est-à-dire bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triène, benzodioxolyle, tels que les groupes pyrrolyle, furanyle, thiényle, imidazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, pyridyle, pirazinyle, pyrimidyle, tétrazolyle, thiadiazolyle, oxadiazolyle, triazolyle, pyridazinyle, indolyle, pyrimidyle.

Les termes utilisés pour la définition des groupements chimiques sont ceux usuellement reconnus par l'homme du métier. Par exemple, un groupe du type cycloalkylalkyle signifie que le groupe est constitué d'un groupe alkyle lui-même substitué par un groupe cycloalkyle. Inversement, un groupe du type alkylcycloalkyle signifie que le groupe est constitué d'un groupe cycloalkyle lui-même substitué par un groupe alkyle.

Par groupe substitué, on entend un groupe porteur de un ou plusieurs substituants. Par substituants, on entend un groupe choisi parmi: les halogènes, cyano, alkyle, trifluoroalkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alcoxy, aryloxy, un groupe phényle éventuellement substitué, un groupe aromatique éventuellement substitué ou des groupes: alkoxycarbonyle ou aryloxycarbonyle (-COOR ), carboxy (-COOH), acyloxy (- O2CR ), carbamoyle (-CONR 2), isocyanato alkylcarbonyle, alkylarylcarbonyle, arylcarbonyle, arylalkylcarbonyle, phtalimido, maleïmido, succinimido, amidino, guanidino, allyle, époxy-SR , les groupes présentant un caractère hydrophile ou ionique tels que les sels alcalins d'acides carboxyliques, les sels alcalins d'acide sulfonique, les chaînes polyoxyde d'alkylène (POE, POP), les substituants cationiques (sels d'ammonium quaternaires) avec R' qui représente un groupe alkyle ou aryle.

Par polymère soluble en solution aqueuse, on entend un polymère qui, introduit dans une solution aqueuse à 25 C, à une concentration en poidségale à 1%, permet l'obtention d'une solution qui présente une valeur de transmittance maximale de la lumière, à une longueur d'onde à laquelle le polymère n'absorbe pas, à travers un échantillon de 1 cm d'épaisseur, d'au moins 70%, de préférence d'au moins 80%.

Par fluorophore hydrosoluble, on entend un fluorophore qui, introduit à 25 C, dans une solution aqueuse jusqu'à une concentration de 10-3 mol/L au moins, conduit à une solution homogène et transparente. La solution aqueuse dans laquelle la solubilité du polymère ou des fluorophores peut être testée est, par exemple, de l'eau pure ou une solution tampon de pH compris entre 5 et 10.

Le rendement quantique de fluorescence d'un fluorophore est le rapport entre le nombre de photons émis par ce fluorophore et le nombre de photons absorbés par ce fluorophore. Il est toujours inférieur ou égal à 1. Plus il est proche de 1, plus le fluorophore considéré à un rendement quantique élevé.

Le rendement quantique de fluorescence relatif d'un fluorophore immobilisé sur un polymère est le rendement quantique de fluorescence du fluorophore immobilisé divisé par le rendement quantique de fluorescence du fluorophore libre en solution.

On entend par facteur d'amplification de la fluorescence d'un polymère fluorescent, le produit du nombre de fluorophores immobilisés sur le polymère par leur rendement quantique relatif. Il est déterminé par la formule suivante: Facteur d'amplification de la fluorescence = nombre de LY/chaîne x ((DFLY immobilisé)/((DFLY libre) dans laquelle: LY = fluorophore (DFLY immobilisé = rendement quantique de fluorescence du fluorophore LY immobilisé sur le polymère (DFLY libre = rendement quantique de fluorescence du fluorophore LY libre en solution.

Ce facteur d'amplification de la fluorescence est rapporté à la masse molaire du polymère en le divisant par la masse molaire du polymère exprimée en Kg/mol.

Le rendement quantique d'un fluorophore libre en solution ou immobilisé sur un polymère est déterminé par une méthode utilisant comme standard une solution diluée de rhodamine 101 dans l'éthanol ayant un rendement quantique égal à 0,92 à 25 C. Les spectres de fluorescence du fluorophore libre en solution et du fluorophore immobilisé sur le polymère sont obtenus dans les mêmes conditions expérimentales (longueur d'onde d'excitation, largeur de bande des monochromateurs d'excitation et d'émission, géométrie optique) en utilisant un spectrofluorimètre SPEX Fluorolog F112A.

Le nombre de fluorophores immobilisés sur une chaîne polymère, est 25 déterminé en divisant le coefficient d'extinction molaire du polymère fluorescent par le coefficient d'extinction molaire du fluorophore libre en solution.

Le coefficient d'extinction molaire E d'un fluorophore libre en solution (ou d'un polymère fluorescent) est déterminé à partir de la pente de la courbe représentant l'absorbance (densité optique ou DO) du fluorophore (ou du polymère respectivement) en fonction de la concentration (C) du fluorophore (ou du polymère) selon la loi bien connue de Beer-Lambert: DO=E xlxC avec 1 = largeur de la cuve (ou chemin optique) en cm C = concentration en mol/L ou M EenMi.cm L'absorbance est déterminée à la longueur d'onde d'absorbance maximale avec 5 un spectrophotomètre UV/Vis JASCO V-650.

Le phénomène d'auto-association d'un fluorophore libre en solution aqueuse est déterminé à partir des spectres d'absorption UV de solutions de concentration croissante. La concentration à laquelle le phénomère d'auto-association se produit est déterminée comme étant la concentration où la courbe de Beer-Lambert dévie de la linéarité, et ceci pour une valeur d'absorbance inférieure à 1,0 en utilisant des cellules de chemin optique approprié (de 0,1 cm à 1cm selon la concentration en fluorophore).

Dans le cadre de l'invention, le coefficient d'extinction molaire et le rendement quantique de fluorescence sont mesurés dans une solution aqueuse, dans des conditions, notamment de pH et force ionique, où ces paramètres prennent des valeurs maximales. Le plus souvent, la solution aqueuse utilisée est une solution tampon de pH compris entre 5 et 10.

L' objet de l'invention va maintenant être décrit en détail.

La présente invention concerne des agents de transfert réversible de chaîne (I), appartenant à la famille des dithioesters, des xanthates ou des trithicarbonates, pour polymérisation RAFT, modifiés pour comporter au moins une fonction ester activé qui est beaucoup plus réactive que la fonction C(=S)S- présente au niveau du dithioester, du xanthate ou du trithiocarbonate, vis-à-vis d'un composé d'intérêt porteur d'une fonction nucléophile, par exemple une fonction amine. Par conséquent, l'agent de transfert selon l'invention est porteur d'une fonction ester activé, -C(0) OY, dans laquelle Y est avantageusement choisi de façon à ce que, lorsque l'agent de transfert est mis en présence d'une fonction nucléophile de type amine, la fonction ester activé réagisse avec cette dernière, préférentiellement à la fonction - C(=S)S-.

La notion d'ester activé est bien connue de l'homme de l'art. Une fonction ester activé peut être définie comme un ester dont la partie alcool est un bon groupe partant vis-à-vis de réactions de substitutions nucléophiles, c'est-à-dire un groupe partant qui permet d'effectuer une réaction de substitution nucléophile entre 0 et 100 C, préférentiellement entre 0 et 60 C, plus préférentiellement entre 0 et 40 C. De tels esters activés ont, par exemple, été décrits par W. Anderson et al, dans American Society, 1964, 46, 1839-1842 et par R. Arshady dans Advances in Polymer Science, 1994, 111, 1-41.

Par conséquent, l'utilisation d'un tel agent de transfert autorise le couplage en une seule étape de composés d'intérêt porteurs d'une fonction réactive vis-à-vis de cet ester activé, sans que la fonction C(=S)S- ne soit affectée. Le couplage avec le composé d'intérêt peut donc être réalisé, soit avant la réaction de polymérisation, c'est-à-dire directement sur l'agent de transfert, soit après la réaction de polymérisation, c'est-à-dire sur le polymère obtenu, la fixation se faisant alors en bout de chaîne du polymère, à l'extrémité a, porteuse de la fonction ester activé.

De plus, l'agent de transfert selon l'invention, comportant au moins une fonction ester activé, est un composé stable s'il est par exemple conservé sous azote, à une température inférieure àO C, ce qui le différentie des agents de transfert comportant une fonction chlorure d'acide, très peu stables, utilisés dans l'art antérieur (Stenzel et al. supra).

La fonctionnalisation peut donc être effectuée, en faisant réagir un composé d'intérêt comportant une fonction nucléophile, et en particulier une fonction amine primaire, secondaire, ou encore une fonction ammonium qui permettra de générer in situ une fonction amine réactive, sur la fonction ester activé. Cette réaction de couplage est facile, rapide, quantitative et en une seule étape, ce qui permet d'obtenir une liaison avec le composé d'intérêt, avec un rendement très élevé (proche de 100%). De plus, le couplage fonction amine/ester activé conduit à une liaison de type amide, ce qui en fait un composé très stable par rapport, notamment, à une fonction de type ester plus fragile et hydrolysable, obtenue dans l'art antérieur (Stenzel et al. et Chen et al. supra) Les agents de transfert (I) selon l'invention comprennent un groupe R comportant au moins une fonction ester activé C(0)OY, -OY étant un groupe partant, Y étant, par exemple, choisi parmi les groupes suivants: N-succinimidyle, 1benzotriazole, pentachlophényle, 2,4,5-trichlorophényle, L1nitrophényle, 3-pyridyle, 2-méthoxycarbonylphényle, N-phtalimidyle, et 2carboxyphényle. De façon préférée, Y est le groupe N- succinimidyle: A part cette particularité, tout type de groupement R décrit dans l'art antérieur peut être utilisé.

En particulier, les agents de transfert de chaîne (I) selon l'invention comprennent un groupe R qui est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant porteur d'au moins une fonction ester activé telle que précédemment définie et étant éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants.

Quand l'ester activé est C(0)-OY, R représente un groupe A-(C(0)-OY)n dans lequel: - A représente un groupe, éventuellement substitué, choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, - Y est tel que défini ci-dessus et, - n est un entier supérieur ou égal à 1, de préférence égal à 1.

Le procédé de polymérisation radicalaire contrôlée par utilisation d'un agent de transfert réversible de chaîne organosoufré, nommé RAFT, à la base de l'invention est largement connu de l'homme du métier. On peut le définir par la mise en contact de monomères identiques ou différents en présence d'un agent de transfert réversible de chaîne organosoufré et d'une source de radicaux amorceurs.

Les agents de transfert réversible de chaîne organosoufrés décrits dans l'art antérieur possèdent le motif suivant: z C s ... I I s Dans le cadre de l'invention, le groupe Z des agents de transfert est avantageusement choisi pour que l'agent de transfert appartienne à la famille des dithioesters (Z comportant un atome de H, C, P, ou halogène lié au thiocarbonyle du groupe C SI S), comme décrit dans la demande de brevet W098/01478, des xanthates, également nommés dithiocarbonates (Z comportant un atome d'oxygène C S- Il S lié au thiocarbonyle du groupe ), comme décrit notamment dans les demandes de brevet W098/58974, W099/31144, W000/75207 (dans lesquels le groupe Z est substitué par au moins un atome de chlore, brome ou fluor), W001/42312 et FR 2 809 829, ou des trithiocarbonates (Z comportant un atome de C SII soufre lié au thiocarbonyle du groupe S), également nommés trithioesters, comme décrit notamment dans les demandes de brevet W098/58974, W001/60792, W002/07057, WO 03/066685.

En particulier, l'invention a pour objet les agents de transfert de formule (Ia), 15 (lb) ou (Ic) : Z I I S R (Ia)

S

Z, (_ë S R)p (lb)

S

(Z C S )PR (Ic)

S

dans laquelle: - Z représente un atome d'hydrogène, un atome de chlore, COOH, -CN, ou un groupe choisi parmi les groupes suivants, éventuellement substitués: alkyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, ORa, -SRa, -COORa, -OZCRa, - CONRaRb, -CONHRa, -P(0)ORaRb, -P(0)RaRb, -OCRcRd-P(0)(ORa)(ORb), - O-CReRf-000H, -S-CReRf-COOH ou une chaîne polymère, - Z' est un dérivé d'un alkyle éventuellement substitué, d'un aryle éventuellement substitué ou dune chaîne polymère, sa liaison avec les groupes carbonylthio, se faisant par un carbone aliphatique, un carbone aromatique ou un atome de soufre, ou d'oxygène, - R est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant porteur d'au moins une fonction ester activé telle que précédemment définie et étant éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants, - p est un entier supérieur à 1, - Ra et Rb représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - Rc et Rd représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe -NO2, -SO3H, -S03Rg, -NCO, -CN, -Rg, - OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH2, NHRg, -NRgRh, -000H, -COORg, -O2CRg, - CONH2, -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, CmF2m+i avec m compris entre 1 et 20, de préférence égal à 1, Re et Rf représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyle ou aryle éventuellement substitué, - Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle.

Les agents de transfert de formule (Ia) sont préférés, et en particulier ceux dans lesquels R est substitué par une seule fonction ester activé.

De façon avantageuse, le groupe R des agents de transfert (I), (Ia), (Ib) et (Ic) tels que définis ci-dessus présente un atome de carbone secondaire ou tertiaire, situé en alpha de l'atome de soufre. En particulier, le groupe A du groupe R est une chaîne aliphatique, ramifiée, éventuellement substituée, présentant un atome de carbone secondaire ou tertiaire en alpha de l'atome de soufre.

De façon avantageuse, Z est choisi parmi les groupes: alkyle, cycloalkyle, aryle, -ORa, et SRa, lesdits groupes étant éventuellement substitués et Ra étant tel que défini précédemment pour (Ia), (lb) et (Ic).

A titre d'exemple de composé (Ia), on peut citer le succinimido-6-phényl6- thioxo - 5- thia- 4- cyano- 4- méthylhexanoate et le succinimido-4phényl-4-thioxo-3- thia-2-méthylbutanoate.

Les agents de transfert de formule (I), (Ia), (lb) et (Ic) sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art.

Un agent de transfert porteur d'une fonction acide est obtenu par exemple selon la référence Dupont WO98/01478 s'il s'agit d'un dithioester ou d'un trithiocarbonate, ou par exemple selon la référence Rhodia WO98/58974 s'il s'agit d'un dithiocarbonate encore appelé xanthate. Puis, la fonction acide de cet agent de transfert est transformée en fonction ester activé par exemple par addition de NHS (N-hydroxysuccinimide) en présence de DCC (dicyclohexylcarbodiimide).

Comme indiqué précédemment, ces agents de transfert sont particulièrement avantageux, car la présence d'au moins une fonction ester activé dans le groupe R autorise une réaction rapide, quantitative et en une seule étape, avec un composé ayant une fonction nucléophile (de préférence amine) et permet donc la synthèse de polymère fonctionnalisé en bout de chaîne.

Le couplage entre la fonction ester activé et un composé porteur d'une fonction nucléophile peut être effectuée, soit directement sur l'agent de transfert, soit sur le polymère porteur de la ou des fonctions ester activé à son extrémité a, obtenu par polymérisation RAFT, en présence dudit agent de transfert.

La présente invention a également pour objet les agents de transfert réversible de chaîne pour polymérisation RAFT, appartenant à la famille des dithioesters, des xanthates ou des trithiocarbonates, obtenus par couplage de l'un des agents de transfert porteur d'au moins une fonction ester activé, tels que définis ci-dessus avec un composé aminé d'intérêt. En particulier, ces agents de transfert réversible de chaîne sont des agents de transfert (II) qui comprennent un groupement de formule: C S R' I I

S

dans lequel R' est un groupe qui comprend au moins une fonction amide- L, avec L choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères et les supports solides.

En particulier, la fonction amide-L correspond à une fonction:

L C N,

X

O

avec L qui est tel que défini ci dessus, et avec X qui représente un atome d'hydrogène, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, ou bien une liaison covalente, de façon à former un cycle aminé avec le composé L. De façon avantageuse, par analogie avec les agents de transfert (I) porteur d'une fonction ester activé, le groupe R' des agents de transfert (II) est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant, d'une part, porteur d'au moins une fonction:

L C N

X

O

avec X et L tels que précédemment définis et, d'autre part, éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants.

En fait, R' représente un groupe:

L

A ( C N) Il X n

O

dans lequel: - A réprésente un groupe, éventuellement substitué, choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, - L et X sont tels que définis précédemment, et - n est un entier supérieur ou égal à 1, de préférence égal à 1.

De façon avantageuse, l'invention a pour objet les composés de formule (IIa), (IIb) ou (IIc) : Z C-S-R' (IIa)

S

Z'-(-C-S-R p ()

S

(Z C-S- PR' (IIc)

S

dans laquelle: - Z représente un atome d'hydrogène, un atome de chlore, COOH, -CN, ou un groupe choisi parmi les groupes suivants, éventuellement substitués: alkyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, ORa, -SRa, -COORa, -02CRa, - CONRaRb, -CONHRa, -P(0)ORaRb, -P(0)RaRb, -OCRcRd-P(0)(ORa)(ORb), - S-CReRf-COOH, -O-CReRf-COOH ou une chaîne polymère, - Z' est un dérivé d'un alkyle éventuellement substitué, d'un aryle éventuellement substitué ou d'une chaîne polymère, sa liaison avec les groupes carbonylthio, se faisant par un carbone aliphatique, un carbone aromatique ou un atome de soufre, ou d'oxygène, - R' est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant, d'une part, porteur d'au moins une fonction:

L

C-N..,

X

O

et, d'autre part, éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants, - X représente un atome d'hydrogène, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, ou bien une liaison covalente, de façon à former un cycle aminé avec le composé L, - p est un entier supérieur à 1, - Ra et Rb représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - Rc et Rd représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe -NO2, -SO3H, SO3Rg, -NCO, -CN, -Rg, - OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH2, -NHRg, -NRgRh, -000H, -COORg, -O2CRg, - CONH2, -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, CmF2m+i avec m compris entre 1 et 20, de préférence égal à 1, - Re et Rf représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyle ou aryle éventuellement substitué, - Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - L est tel que défini pour (II).

Les composés de formule (lia) et, en particulier, ceux dans lesquels R' est porteur d'une seule fonction:

L C N

X

O

sont préférés.

On comprend également que comme dans le cas des composés (I), (la), (lb) et (Ic), R' présente avantageusement dans les composés de formule (II), (lia), (IIb) et (IIc), un atome de carbone condaire ou tertiaire, situé en alpha de l'atome de soufre. De façon avantageuse, le groupe A du groupe R' est une chaîne aliphatique, ramifiée, éventuellement substituée, présentant un atome de carbone secondaire ou tertiaire, en alpha de l'atome de soufre.

De même, de façon avantageuse, Z représente un groupe choisi parmi: alkyle, cycloalkyle, aryle, -ORa, et SRa, lesdits groupes étant éventuellement substitués, et Ra étant tel que défini précédemment pour (lia), (Ilb) et (llc).

Le ligand L est, de préférence, un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, la biotine et les haptènes, ou bien un lipide, un monosaccharide ou une molécule fluorescente.

Dans le cas où l'agent de transfert porteur de la ou des fonctions ester activé est couplé avec un support solide, on obtient un agent de transfert supporté et la polymérisation RAFT est alors réalisée à partir de cet agent supporté, ce qui est appelé grafting from polymerization . Cette fixation permet, ultérieurement, d'effectuer une polymérisation RAFT d'un monomère à partir de ces supports et d'obtenir des brosses de polymère en surface.

Les composés tels que définis ci-dessus sont donc utilisés comme agents de transfert réversible de chaîne dans un procédé de polymérisation RAFT. le procédé de polymérisation RAFT est largement connu de l'homme de l'art et toutes ses variantes pourront être mises en oeuvre dans le cadre de l'invention, la seule condition est la mise en oeuvre soit d'un agent de transfert réversible de chaîne comme défini précédemment porteur d'au moins une fonction ester activé, soit d'un agent de transfert réversible de chaîne obtenu par couplage entre un agent de transfert réversible de chaîne comme défini précédemment porteur d'au moins une fonction ester activé et un composé porteur d'une fonction nucléophile réactive, vis-àvis de la fonction ester activé.

Dans le premier cas, la polymérisation RAFT conduit à un polymère dont l'extrémité a est porteuse d'au moins une fonction ester activé, qui va donc pouvoir réagir avec un composé porteur d'une fonction nucléophile réactive, vis-à-vis de la fonction ester activé, de façon à fixer le(s) composé(s) d'intérêt à cette extrémité.

Dans le deuxième cas, la polymérisation RAFT, conduit à un polymère dont l'extrémité a est porteuse d'un ou plusieurs composés d'intérêt.

Le couplage sur l'ester activé, avec un composé d'intérêt (porteur d'une fonction nucléophile), s'effectue donc: - soit, après la polymérisation RAFT effectuée en présence de l'agent de transfert-(ester activé), c'està-dire par réaction du composé d'intérêt sur le groupe R, situé à l'extrémité a de la chaîne polymère obtenue, - soit, avant la polymérisation RAFT, c'est-à-dire par réaction du composé d'intérêt sur le groupe R de l'agent de transfert (ester activé), obtenant ainsi un nouvel agent de transfert-(composé d'intérêt), capable de contrôler la polymérisation RAFT d'un monomère quelconque.

Ces différentes variantes permettent l'introductio n d'une grande diversité de composés, liés par une liaison covalente au polymère obtenu, à l'extrémité alpha de la chaîne polymère.

Le composé peut être n'importe quel composé moléculaire (en particulier d'intérêt biologique: biotine, sucre, peptide, oligonucléotide, protéine, etc., des lipides, fluorophores, mono- ou disaccharides, colorants, molécules fluorescentes) comportant une fonction nucléophile. Le composé peut également être un support solide (polymère, latex, silice, métaux...) présentant un groupement nucléophile (en surface). Des exemples de composés ont été détaillés précédemment.

Selon un mode de réalisation, le composé d'intérêt est choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères et les supports solides. De préférence, le composé d'intérêt est un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, bs polypeptides, les protéines, la biotine et les haptènes, ou bien un lipide, un monosaccharide ou une molécule fluorescente.

De façon préférée, le composé d'intérêt est porteur d'une fonction aminée, conduisant après couplage avec une fonction ester activé, à une fonction amide particulièrement stable.

De nombreuses méthodes sont disponibles pour introduire des fonctions réactives sur un ligand biologique: pour les protéines, antigènes, anticorps ou polypeptides, voir par exemple "Chemistry of protein conjugation and cross- linking", Wong S. S., CRC press, Boca Raton, 1991 ou "Bioconjugate techniques", Hermanson G. T., Academic Press, San Diego, 1996. Pour les acides nucléiques, on synthétise par exemple un polynucléotide par méthode chimique sur support solide ayant une fonction réactive à un endroit quelconque de la chaîne comme par exemple, l'extrémité 5' ou l'extrémité 3' ou sur une base ou sur un phosphate internucléotidique ou sur la position 2' du sucre (voir Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey). Des méthodes d'introduction de fonctions réactives sur des haptènes sont données notamment dans "Preparation of antigenic steroid-protein conjugate", F Kohen et al., dans Steroidimmunoassay, Proceedings of the fifth tenovusworkshop, Cardiff, Avril 1974, ed. EHD Cameron, SH.Hillier,K. Griffiths. Par exemple, dans le cas d'un ligand biologique de type protéine possédant une composition en lysine suffisante, les amines portées par la chaîne latérale de la lysine pourront être utilisées pour le couplage avec la ou les fonctions ester activé.

Comme dit précédemment, le procédé de préparation de polymères mettant en oeuvre une étape de polymérisation RAFT avec un agent de transfert réversible de chaîne est tel que défini précédemment est réalisé, selon des techniques classiques bien connues de l'homme de l'art, à partir de monomères identiques ou différents, en présence d'une source de radicaux amorceurs. Les réactions de polymérisation radicalaire contrôlée sont, généralement, réalisées à partir de un ou plusieurs monomères éthyléniquement insaturés.

La quantité d'agent de transfert à utiliser est directement dépendante de la masse molaire des chaînes polymères souhaitée, selon l'équation suivante, définie pour les polymérisations radicalaires contrôlées utilisant un agent de transfert réversible de chaîne (comme décrit par exemple dans la demande de brevet W098/01478) : Mn = [monomère]o/[agent de transfert]o x conversion en monomère x Mm n + Mat où Mn est la masse molaire moyenne en nombre des chaînes polymères, [X]o signifie la concentration molaire en réactif X en début de polymérisation, Mm n et MI sont les masses du monomère et de l'agent de transfert, respectivement.

En ce qui concerne les conditions pour la polymérisation selon l'invention, on peut mentionner une température de polymérisation généralement comprise entre 20 et 160 C, notamment entre 50 et 150 C, et plus particulièrement entre 60 et 110 C, et une durée de polymérisation généralement comprise entre 1 et 24 heures. Par ailleurs, la polymérisation peut être conduite en masse, en solution ou en suspension, dans un milieu solvant tel que le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide,la N- méthylpyrrolidine, l' acétonitrile, le toluène, l'acétate de butyle, le tétrahydrofuranne, ou avantageusement le dioxane.

Les agents de transfert selon l'invention peuvent êtres mis en oeuvre pour la synthèse de n'importe quel type de polymères par le procédé RAFT: de type homopolymères, copolymères statistiques, copolymères alternés, copolymères à blocs.

Ces polymères, en fonction des monomères mis en oeuvre, pourront être de nature hydrophobe, hydrophile ou amphiphile et comprendre éventuellement une ou plusieurs fonctionnalisations, si des monomères fonctionnalisés sont utilisés. Dans la mesure où les monomères utilisés sont identiques, le procédé de l'invention permet de préparer des polymères de type homopolymère. Dans le cas contraire, il permet de préparer des polymères de type copolymère tels que des copolymères statistiques, alternés, à blocs, chaque bloc étant soit un homopolymère, soit un copolymère statistique.

Les monomères appropriés aux fins de l'invention sont tout monomère éthyléniquement insaturé et peuvent être choisis dans le groupe constitué du styrène, des styrènes substitués, des (méth)acrylates d'alkyles substitués ou non, de l'acrylonitrile, du méthacrylonitrile, de l'acrylamide, du méthacrylamide, des dérivés mono et bi-substitués sur l'azote de l'acrylamide et du méthacrylamide, de l'isoprène, du butadiène, de l'éthylène, de l'acétate de vinyle et de leurs combinaisons. Les versions fonctionnalisées de ces monomères conviennent également aux fins de l'invention.

Les monomères et comonomères spécifiques qui peuvent être utilisés dans l'invention, incluent le méthacrylate de méthyle, le méthacrylate d'éthyle, le méthacrylate de propyle (tous les isomères), le méthacrylate de butyle (tous les isomères), le méthacrylate de 2-éthylhexyle, le méthacrylate d'isobornyle, l'acide méthacrylique, le méthacrylate de benzyle, le méthacrylate de phényle, le méthacrylonitrile, l'améthylstyrène, l'acrylate de méthyle, l'acrylate de propyle (tous les isomères), l'acrylate de butyle (tous les isomères), l'acrylate de 2éthylhexyle, l'acrylate d'isobornyle, l'acide acrylique, l'acrylate de benzyle, l'acrylate de phényle, l'acrylonitrile, le styrène, le méthacrylate de glycidyle, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate d'hydroxypropyle (tous les isomères), le méthacrylate d'hydroxybutyle (tous les monomères), le méthacrylate de N,Ndiméthylaminoéthyle, le méthacrylate de N,N-diéthylaminoéthyle, le méthacrylate de triéthylèneglycol, le N méthacryloyloxysuccinimide, l'anhydride itaconique, l'acide itaconique, l'acrylate de glycidyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, l'acrylate d'hydroxypropyle (tous les isomères), l'acrylate d'hydroxybutyle (tous les isomères), l'acrylate de N,N-diméthylaminoéthyle, l'acrylate de N,N-diéthylaminoéthyle, l'acrylate de triéthylèneglycol, le N acryloyloxysuccinimide, le méthacrylamide, le N- méthylacrylamide, le N,N-diméthylacrylamide, le N-tertbutylméthacrylamide, le N-n-butylméthacrylamide, le Nméthylolméthacrylamide, le N- éthylolméthacrylamide, le N tertbutylacrylamide, le N octadécylacrylamide, le N-méthylolacrylamide, le Néthylolacrylamide, le N- acryloylmorpholine, l'acide vinylbenzoïque (tous les isomères), le diéthylaminostyrène (tous les isomères), l'acide améthylvinylbenzoïque (tous les isomères), le diéthylamino-a-méthylstyrène (tous les isomères), l'acide ou le sel sodique d'acide pvinylbenzènesulfonique, le méthacrylate de triméthoxysilylpropyle, le méthacrylate de tributoxysilylpropyle, le méthacrylate de diméthoxyméthylsilylpropyle, le méthacrylate de diéthoxyméthylsilylpropyle, le méthacrylate de dibutoxyméthylsilypropyle, le méthacrylate de diisopropoxyméthylsilypropyle, le méthacrylate de diméthoxysilylpropyle, le méthacrylate de diéthoxysilylpropyle, le méthacrylate de dibutoxysilylpropyle, le méthacrylate de diisopropoxysilylpropyle, l'acrylate de triméthoxysilylpropyle, l'acrylate de tributoxysilylpropyle, l'acrylate de diméthoxyméthylsilylpropyle, l'acrylate de diéthoxyméthylsilylpropyle, l'acrylate de dibutoxyméthylsilypropyle, l'acrylate de diisopropoxyméthylsilypropyle, l'acrylate de diméthoxysilylpropyle, l'acrylate de diéthoxysilylpropyle, l'acrylate de dibutoxysilylpropyle, l'acrylate de diisopropoxysilylpropyle, l'anhydride maléïque, le N- phénylmaléïmide, le N-butylmaléïmide, la N-vinylpyrrolidone, le butadiène, l'isoprène, le chloroprène, l'éthylène, l'acétate de vinyle, leurs formes fonctionnalisées et leur combinaison.

On utilisera, avantageusement, pour les applications en biologie, thérapeutique et diagnostic notamment, un ou des monomères hydrophiles, de façon à former un polymère hydrosoluble. Par monomère hydrophile, on entend un monomère dont le polymère présente en phase aqueuse une structure déployée, correspondant à un coefficient de Mark-Houwink Sakurada supérieur ou égal à 0,5. De préférence, on utilisera un monomère hydrophile choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide et de N- vinylpyrrolidone, les monomères saccharidiques non protégés et leurs dérivés. La Nvinylpyrrolidone (NVP), N,N-diméthylacrylamide et la N-acryloylmorpholine (NAM) sont préférés dans le cadre de l'invention.

Il pourra également être avantageux, pour certaines applications thérapeutiques, de diagnostic ou d'extraction, de préparer des polymères amphiphiles, c'est-à-dire composés d'au moins un segment polymère hydrophile et d'au moins un segment polymère hydrophobe, provenant de la polymérisation d'au moins un monomère hydrophobe, qui ont la propriété de s'associer sous forme d'agrégats micellaires en phase aqueuse.

Par monomère hydrophobe, on entend un monomère non hydrophile. A titre d'exemple de monomère hydrophobe, on peut citer les dérivés hydrophobes de méthacrylates, de méthacrylamides, d'acrylates, d'acrylamides, du styrène, avantageusement l' acrylate de rrbutyle, le t butylacrylamide, l' acrylate de t-butyl et le styrène.

Il pourra également être avantageux de préparer des polymères fluorescents à partir d'un ou plusieurs monomères fonctionnalisés, et en particulier des polymères fluorescents solubles en solution aqueuse. En particulier, la polymérisation RAFT pourra être réalisée pour préparer des polymères fluorescents solubles en solution aqueuse et présentant un facteur d'amplification de fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère. On pourra alors mettre en oeuvre les étapes suivantes: É une étape de polymérisation par homopolymérisation ou copolymérisation réalisée avec un monomère fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, de façon à obtenir un polymère porteur d'au moins 5 fonctions réactives X1, éventuellement sous forme protégée, réparties sur ledit polymère, É une étape de couplage d'au moins 5 fluorophores sur au moins une partie des fonctions réactives Xl, après déprotection desdites fonctions réactives si nécessaire, lesdits fluorophores présentant les caractéristiques suivantes: - les fluorophores sont hydrosolubles, - les fluorophores ne forment pas d'auto- association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10-4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10-3 mol/1, - les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M-'.cm i, de préférence supérieur à 5000 M-1.cm i, - les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6.

Selon une autre variante, la 'réparation d'un tel polymère fluorescent pourra mettre en oeuvre une étape de polymérisation par copolymérisation d'un monomère fonctionnalisé porteur d'un fluorophore, avec un monomère hydrophile, ou bien avec un monomère, qui après traitement, peut conduire à une entité hydrophile, lesdits fluorophores présentant les caractéristiques suivantes: - les fluorophores sont hydrosolubles, - les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10-4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10-3 mol/1, - les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M-'.cm i, de préférence supérieur à 5000 M-1.cm i, - les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6.

Dans ce cas, le monomère fonctionnalisé porteur d'un fluorophore pourra être obtenu par couplage d'un fluorophore, éventuellement, par l'intermédiaire d'un bras espaceur, sur un monomère fonc tionnalisé porteur d'une fonction réactive X1.

Bien entendu, l'étape de polymérisation est réalisée par un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée basé sur un transfert réversible de chaînes par addition/fragmentation (RAFT) et met en oeuvre un agent de transfert conforme à l'invention et avantageusement un agent de transfert (II) comme détaillé ci-après. 20

Notamment, on pourra mettre en oeuvre, dans de tels procédés conduisant à un polymère fluorescent, l'une des caractéristique s ci-dessous ou une combinaison des caractéristiques ci dessous, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre: les fluorophores utilisés comportent ou sont liés par l'intermédiaire d'un bras espaceur, comportant au moins un enchaînement CH2-CH2- situé entre la partie fluorescente du fluorophore et le polymère; les fluorophores comprennent au moins un groupe polaire ou ionisable en solution aqueuse; le polymère présente moins de 2,4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore; les fluorophores présentant un rendement quantique relatif de fluorescence au moins égal à 0,7, de préférence au moins égal à 0,75; les fluorophores sont tous identiques; les fluorophores sont choisis parmi: la N-(5aminopentyl)-4-amino-3,6- disulfo-1,8-naphthalimide, la 3,6- diamino-9(2- méthoxycarbonyl)phényle, le 9- (2,4-disulfophényl) -2,3,6,7,12,13,16, 17- octahydro-1H,5H,11H,15H xanthéno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j' ]diquinolizin18- ium, le 9- (2,4-disulfophényl)-3,6-bis(éthylamino)-2,7-diméthylxanthylium, le 3,6-bis(diéthylamino)-9-(2,4-disulfophényl)-xanthylium et leur dérivés; -les fluorophores sont identiques et sont la N-(5aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimide; les fluorophores sont insensibles aux variations de pH; les fluorophores sont photostables; le polymère obtenu se présente sous la forme d'un copolymère statistique, comportant au moins deux entités distinctes répétées, l'une porteuse du fluorophore et au moins une autre entité hydrophile; l'étape de couplage est réalisée de façon à ce que la partie fluorescente des fluorophores soit éloignée du polymère par un bras espaceur comportant au moins un enchaînement CH2-CH2- ; par exemple, les fluorophores comportent un bras espaceur, comportant au moins un enchaînement CH2-CH2-, situé entre la partie fluorescente du fluorophore et le polymère; le nombre de fluorophores fixés au polymère est ajusté, de façon à obtenir moins de 2, 4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore; l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation entre un monomère fonctionnalisé et un monomère hydrophile; préférentiellement, le monomère hydrophile est choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, de N-vinylpyrrolidone, les dérivés hydrophiles de monomères saccharidiques et, de préférence, parmi: la N-vinylpyrrolidone, le N,N-diméthylacrylamide et la Nacryloylmorpholine; - l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation statistique entre un monomère porteur d'une fonction réactive X1, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile, à l'exception des monomères saccharidiques hydrophiles non protégés, ou bien un monomère qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile; de préférence, on utilise un monomère porteur d'une fonction réactive X1, avantageusement choisi parmi les monomères fonctionnels suivants: le N- acryloxysuccinimide, le Nméthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2- hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2-aminoéthyle, 1'acrylate de 2-hydroxyéthyle, 1'acrylate de 2-aminoéthyle, l'anhydride maléïque et,de préférence, parmi le Nacryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque, etc. et, plus particulièrement, le N-acryloxysuccinimide (NAS) ; après l'étape de couplage, on réalise, de façon avantageuse, un traitement des fonctions X1 restantes sur le polymère, soit par désactivation, soit par couplage avec des molécules hydrosolubles non fluorescentes; - l'étape de polymérisation est réalisée par homopolymérisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive X1 sous forme protégée, ladite fonction étant déprotégée avant couplage des fluorophores; de préférence, le monomère porteur d'une fonction réactive X1 sous forme protégée est choisi parmi les dérivés d'un sucre, de préférence, le 1,2:3,4-di O-isopropylidène-6-0(2- vinyloxyethyl)- a-D- galactopyranose, le 6-0-acryloyl1,2:3,4-di-0isopropylidène-a-D-galactopyranose, le 6- 0- acryloylamino-6-désoxy-1,2:3, 4-di- 0- isopropylidène-a-D-galactopyranose et le 6-0-(8-acryloylamino-3, 6-dioxaoctyl)-1,2:3,4-di O-isopropylidène-a-D-galactopyrano se; - l'étape de polymérisation est réalisée par homopolymérisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive X1, avantageusement choisi parmi les monomères fonctionnels suivants: le N- acryloxysuccinimide, le Nméthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2- aminoéthyle, l' acrylate de 2-hydroxyéthyle, l' acrylate de 2-aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N-acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et, plus particulièrement, le N- acryloxysuccinimide (NAS) ; après l'étape de couplage des fluorophores, on réalise, de façon avantageuse, un traitement des fonctions Xl restantes sur le polymère, soit par désactivation, soit par couplage avec des molécules hydrosolubles non fluorescentes; - la fonction réactive Xl est choisie parmi les fonctions hydroxy, amine, aldéhyde, anhydride, acide carboxylique activé sous forme d'ester activé, par exemple de N- hydroxysuccinimide; la fonction acide carboxylique activé sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide étant préférée; Le N-(5-aminopentyl)- 4- amino- 3,6disulfo- 1,8- naphthalimide est un fluorophore particulièrement avantageux. Ce fluorophore est particulièrement intéressant, car en plus d'être hydrosoluble, non sensible au pH, de ne pas former d'auto-associations jusqu'à une concentration de 10-3 mol/L en solution aqueuse, de présenter une fonction NH2 aliphatique assurant sa liaison covalente avec le polymère, il présente d'une part un bras espaceur -(CH2)5- qui permet d'éloigner la partie fluorescente du squelette polymère et d'autre part une longueur d'onde d'émission de 531 nm, proche de la longueur d'onde d'émission de la fluorescéine, ce qui implique que les filtres habituellement utilisés pour la fluorescéine vont être directement utilisables. En utilisant de tels fluorophores, l'introduction d'un nombre croissant de ce fluorophores le long de la chaîne polymère, conduit à une augmentation quasi linéaire de l'intensité de fluorescence.

Il est également possible d'introduire différents fluorophores, en proportions définies, le polymère pouvant alors servir, par exemple, à établir un code d'identification de la chaîne polymère. Par exemple, l'immobilisation covalente de 2 ou 3 fluorophores différents tels que définis précédemment, sur la même chaîne polymère et en proportions définies, pourra servir à établir m code d'identification de la chaîne polymère dans la mesure où les fluorophores choisis ont une longueur d'onde maximale d'émission suffisamment distincte. Afin de limiter les phénomènes d'auto-associations et d'inter-associations, on veillera à choisir cés fluorophores porteurs de groupes ionisés du même signe (cationiques ou anioniques). Ainsi, par exemple, en couplant 3 fluorophores différents sur le polymère et en faisant varier la proportion de chacun de n = 1 à 5 (n entier), il existera 125 combinaisons possibles de marquage des chaînes polymères.

Pour réaliser de tels polymères fluorescents, la polymérisation peut être réalisée selon différentes voies.

La première voie consiste à utiliser un monomère B1 fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive X1, éventuellement sous forme protégée. On effectue alors, soit une réaction d'homopolymérisation de ce monomère B1, soit une réaction de copolymérisation de B1 avec un monomère B2 hydrophile, à l'exception des monomères saccharidiques hydrophiles non protégés, ou bien avec un monomère B2' qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile.

On pourra utiliser, en tant que monomère B2, un monomère hydrophile tel que défini précédemment.

En tant que monomère qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile, on peut choisir un monomère sous forme protégée, tel que les monomères saccharidiques protégés, par exemple le 1,2:3,4-di-Oisopropylidène-6-O-(2-vinyloxyethyl)-a-D-galactopyranose polymérisable par polymérisation cationique vivante, le 6-O-acryloyl 1,2:3,4-di Oisopropylidène-a-D- galactopyranose, le 6-O-acryloylamino-6-désoxy-1,2:3, 4-di O-isopropylidène-a-D-galactopyranose, le 6-0-(8-acryloylamino-3,6dioxaoctyl)-1,2:3, 4-di-O-isopropylidène-a-D-galactopyranose, ces trois monomères étant polymérisables par polymérisation radicalaire contrôlée, notamment par le procédé RAFT. Après polymérisation, un traitement approprié permettra de déprotéger les entités saccharidiques, de manière à obtenir des entités hydrophiles.

Un monomère hydrophobe porteur d'une fonction réactive, peut, également, après désactivation de la fonction réactive ou après couplage de cette dernière avec une molécule hydrosoluble, conduire à une entité hydrophile. A titre d'exemple de tels monomeres, on peut citer le Nacryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et plus particulièrement, le N- acryloxysuccinimide (NAS).

Le monomère B1, qui est porteur d'une fonction réactive X1, éventuellement sous forme protégée, peut être un monomère hydrophile ou hydrophobe. Bien entendu, ce monomère doit être polymérisable avec la technique de polymérisation sélectionnée.

La fonction réactive X1 doit être susceptible de réagir avec une fonction réactive X2 portée par le fluorophore ou le bras espaceur que l'on souhaite greffer. La fonction réactive X1 est choisie, à titre d'exemple, parmi les groupements amine, hydrazine, hydrazone, azide, isocyanate, isothiocyanate, alcoxyamine, aldéhyde (éventuellement un aldéhyde masqué, comme dans le cas des monomères saccharidiques), époxy, nitrile, maléïmide, halogénoalkyle, hydroxy, thiol, anhydride, acide carboxylique activé sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide, de pentachlorophényle, de trichlorophényle, de p-nitrophényle, de carboxyphényle. De préférence, la fonction réactive X1 est choisie parmi les fonctions amine, aldéhyde, anhydride, ou acide carboxylique activé sous forme d'ester de Nhydroxysuccinimide. Lorsque le fluorophore est porteur d'une fonction amine primaire, la fonction X1 sera avantageusement de type ester activé, aldéhyde, ou anhydride. L'utilisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive X1, vis-à-vis d'une fonction X2 portée par le fluorophore (ou le bras espaceur) que l'on souhaite fixer, permet d'effectuer un couplage direct du fluorophore (ou du bras espaceur) sur les fonctions réactives du polymère, en obtenant une liaison covalente stable.

En tant que monomère B1 hydrophile porteur d'une fonction réactive X1, on peut citer le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2aminoéthyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, l'acrylate de 2-aminoéthyle et les monomères saccharidiques, tels que le 6-0- (2- vinyloxyéthyl)-cx-Dgalactopyranose polymérisable par polymérisation cationique vivante, le 60- acryloyl-a-D- galactopyranose, le 6- 0-acryloylamino-6-désoxy-a-Dgalactopyranose, le 6-0- (8- aciyloylamino -3,6-dioxaoctyl)- - Dgalactopyranose, ces trois monomères étant polymérisables par polymérisation radicalaire contrôlée, notamment par le procédé RAFT.

En tant que monomère B1 hydrophobe porteur d'une fonction réactive X1, on peut citer le N- acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride 5 maléïque, et de préférence, le N-acryloxysuccinimide (NAS).

Il est également possible que le monomère B1 soit porteur d'une fonction réactive X1 sous forme protégée. C'est, par exemple, le cas des monomères saccharidiques protégés tels que définis ci-dessus.

Bien entendu, les monomères B1, B2, B2' sont choisis en fonction de la 10 technique de polymérisation sélectionnée.

Après polymérisation, une réaction de couplage du fluorophore sur les fonctions réactives X1 est réalisée, de façon à immobiliser le nombre de fluorophores désirés sur le polymère. Dans le cas où les fonctions réactives X1 se trouvent sous forme protégée, la réaction de couplage sera précédée d'une réaction de déprotection appropriée.

De façon avantageuse, le couplage des fluorophores est réalisé de façon à ce que la partie fluorescente des fluorophores soit éloignée du polymère par un bras espaceur comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2-. Aussi, dans ce cas, soit le fluorophore comprend un bras espaceur et est porteur d'une fonction X2 et est donc directement couplé avec la fonction réactive X1, soit le fluorophore utilisé ne comporte pas de bras espaceur ou n'est pas porteur de la fonction réactive X2, dans ce cas, le fluorophore sera modifié pour inclure le bras espaceur, si nécessaire, et la fonction réactive X2. Il peut également être prévu d'effectuer le couplage en deux étapes, une première consistant à coupler un bras espaceur sur la fonction réactive X1, la deuxième consistant à coupler le fluorophore sur le bras espaceur.

La fonction réactive X2, située à l'extrémité du fluorophore ou du bras espaceur, susceptible de réagir avec la fonction X1 est, de préférence, une fonction amine primaire ou secondaire. Dans ce cas, par réaction sur une fonction X1 de type ester activé, on obtient une fonction amide particulièrement stable, de sorte que les polymères fluorescents obtenus seront chimiquement stables.

Bien entendu, le monomère B2' est, de préférence, porteur d'une fonction réactives X1' sous forme protégée pour éviter, après polymérisation, des réactions compétitives de couplage du fluorophore sur les monomères B1 et B2'. Dans le cas où B2' est porteur de fonctions réactives X1' sous forme protégée, la réaction de déprotection de ces fonctions est réalisée seulement après couplage des fonctions X2 portées par le fluorophore ou le bras espaceur, sur les fonctions X1 présentes sur le polymère (provenant du monomère B1) et masquage des fonctions X1 résiduelles.

La répartition des fluorophores le long de la chaîne polymère est obtenue d'une part, par le fait que le couplage se fait de façon statistique sur les fonctions réactives X1 présentes sur le polymère et d'autre part, dans la cas où une copolymérisation est mise en oeuvre, par l'obtention d'un copolymère statistique.

Après couplage du nombre de fluorophores désiré sur le polymère, qui viennent donc, dans tous les cas, se répartir le long du polymère, il reste le plus souvent des fonctions réactives sur le polymère. Dans certains cas, il est nécessaire d'effectuer un traitement supplémentaire pour rendre hydrophiles les entités non porteuses du fluorophore. C'est, en particulier, le cas quand une homopolymérisation avec un monomère B1 hydrophobe a été réalisée. Selon une variante préférée du procédé de l'invention, on réalise alors une réaction de masquage des fonctions réactives résiduelles, soit par désactivation (par exemple une hydrolyse), soit par couplage avec un composé hydrosoluble non-fluorescent, ce qui permet, d'une part, d'éliminer les fonctions réactives résiduelles le long de la chaîne polymère et, d'autre part, d'apporter une hydrophilie supplémentaire au polymère. Dans le cas où la fonction réactive est un anhydride ou un acide carboxylique activé sous forme d'ester de Nhydroxysuccinimide, par exemple, on pourra utiliser un excès d'une amine hydrosoluble, telle que l' aminoéthylmorpholine.

La polymérisation sera, de préférence, réalisée entre un monomère porteur 25 d'une fonction réactive X1, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile. En particulier, entre: - un monomère B1 hydrophobe porteur d'une fonction réactive, tel que le N-acryloxysuccinimide, le Nméthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et de préférence, le Nacryloxysuccinimide (NAS), - et un monomère hydrophile, tel que les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d' acrylamide, de méthacrylamide et de N vinylpyrrolidone, et de préférence la Nvinylpyrrolidone (NVP), le N,N-diméthylacrylamide et la Nacryloylmorpholine (NAM).

ce qui ne nécessite aucune réaction de déprotection des fonctions réactives X1 et permet d'obtenir un polymère présentant une hydrophilie satisfaisante, après traitement des éventuelles fonctions réactives X1 restantes après couplage des fluorophores.

Une autre variante préférée consiste à réaliser une réaction d'homopolymérisation d'un sucre protégé, par exemple le 1,2:3,4-di-Oisopropylidène-6-0-(2-vinyloxyethyl)-a-D-galactopyranose polymérisable par polymérisation cationique vivante, le 6- 0-acryloyl-1,2:3,4-di- 0isopropylidène-a-D- galactopyranose, le 6-0-acryloylamino-6-désoxy-1,2:3, 4-di 0- isopropylidène-a-D- g alactopyrano se, le 6-0-(8-acryloylamino-3, 6-dioxaoctyl)-1,2:3, 4-di-0-isopropylidène-a-D-galactopyranose, ces trois monomères étant polymérisables par polymérisation radicalaire contrôlée, notamment par le procédé RAFT. Après polymérisation, les entités saccharidiques seront déprotégées pour permettre le couplage des fluorophores.

Une seconde voie qui peut également être envisagée, bien qu'elle ne soit pas préférée, est d'effectuer le couplage du fluorophore (ou du bras espaceur) sur le monomère B1 porteur de la fonction X1 et de réaliser la polymérisation avec ce nouveau monomère porteur du fluorophore. Cette voie consiste donc à utiliser un monomère B3 déjà porteur d'un fluorophore. On effectue alors une réaction de copolymérisation de ce monomère B3 avec un autre monomère B4 hydrophile, ou bien un monomère B4' qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile.

Le monomère B3 est, soit commercial, soit obtenu à partir d'un monomère B1 décrit ci dessus, par couplage, comme décrit précédemment, d'une fonction X2 portée par le fluorophore ou le bras espaceur, sur la fonction réactive X1 du monomère B1. Dans le cas où le monomère B1 est porteur d'une fonction réactive protégée, celle-ci sera bien entendu préalablement déprotégée.

De préférence, les monomères B4 et B4' correspondent, respectivement, aux monomères hydrophiles (B2), et aux monomères qui, après traitement, peuvent conduire à une entité hydrophile (B2' ), précédemment cités. On utilisera de préférence un monomère B4 hydrophile.

Dans le cas où un monomère B4' est utilisé, un traitement visant à rendre hydrophile l'entité résultante, comme décrit précédemment, sera mis en oeuvre après polymérisation.

Dans tous les cas, il faudra ajuster la quantité de monomèrefonctionnalisé B1 (réactif) ou B3 (fluorescent) pour disposer, au final, de suffisamment de fluorophores sur le polymère (au moins 5, de préférence au moins 10). Dans le cas où une réaction de copolymérisation est mise en oeuvre, l'homme du métier choisira le type de fonctions polymérisables des deux monomères mis en jeu, de telle sorte que la copolymérisation s'effectue de façon statistique, et qu'ainsi les fluorophores ou les fonctions réactives X1 soient réparties sur le polymère.

Dans les cas ci dessus, où l'on effectue la polymérisation RAFT avec un monomère fonctionnalisé, le plus souvent, b couplage entre la fonction ester activé et un composé porteur d'une fonction nucléophile est effectuée directement sur l'agent de transfert, qui est ensuite utilisé dans la polymérisation RAFT et permet donc la synthèse de polymères fonctionnalisés à leur extrémité a. Le couplage sur l'ester activé, avec un composé d'intérêt (porteur d'une fonction nucléophile) s'effectue donc, de préférence, avant la polymérisation RAFT.

Lorsque B1 est un monomère saccharidique protégé, soit homopolymérisé, soit copolymérisé avec un monomère hydrophile B2 ne portant pas de fonction réactive, il est également possible d'effectuer la polymérisation avec un agent de transfert (I).

On procède alors dans l'ordre suivant: - on effectue la polymérisation RAFT de B1 (homo ou copolymérisation) en présence de l'agent de transfert (I) ; on obtient donc un homopolymère (ou un copolymère) porteur d'au moins une fonction ester activé à son extrémité a, - on réalise le couplage d'un composé d'intérêt sur la fonction ester activé située à l'extrémité a du polymère (ou du copolymère), - on déprotège les entités saccharidiques portées par le (co)polymère, - et on réalise le couplage covalent d'un fluorophore aminé sur les fonctions réactives (aldéhyde) des entités saccharidiques.

La quantité de monomère à ajouter dans le procédé de l'invention n'est pas limitée par un quelconque des aspects du procédé et sera facilement déterminée par l'homme du métier.

La source de radicaux amorceurs peut être n'importe quelle méthode génératrice de radicaux libres, qui produit des radicaux libres capables de s'additionner sur des unités monomères pour donner des radicaux propageants.

La source de radicaux amorceurs inclut les sources telles que la scission homolytique induite thermiquement d'un ou plusieurs composés adaptés tels que les peroxydes, les peroxyesters ou les composés azo, la génération spontanée à partir de monomères, les systèmes d'amorçage redox, les systèmes d'amorçage photochimique et les rayonnements haute énergie tels que le faisceau électronique, le rayonnement X ou gamma. Le système d'amorçage est choisi de telle façon que, dans les conditions de réaction, il n'existe pas d'interaction défavorable significative entre l'amorceur ou des radicaux provenant de l'amorceur et l'agent de transfert. L'amorceur doit également posséder la solubilité requise dans le milieu de réaction ou le mélange de monomères.

Des exemples d'amorceurs qu'on peut utiliser aux fins de l'invention comprennent les composés azo et les peroxydes tels que le 2,2'-azobis(2,4diméthylvaléronitrile), le 2,2'-azobis(isobutyronitrile), le 2,2'azobis(2-cyano-2-butane), le 2,2'-azobis(isobutyrate méthylique) de diméthyle, le 4,4'-azobis(acide 4 cyanopentanoïque), le 4,4'- azobis(4cyanopentan- 1- ol), le 1,1'- azobis(cyclohexanecarbonitrile), le 2-(tbutylazo)-2-cyanopropane, le 2,2'-azobis[2- méthyl- N- (1,1)-bis (hydroxyméthyl)-2-hydroxyéthyl]propionamide, le 2,2'-azobis[2-méthyl Nhydroxyéthyl]propionamide, le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(N,N'diméthylèneisobutyramidine), le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2amidinopropane), le 2,2'-azobis(N,N'-diméthylèneisobutyramidine), le 2,2'azobis(2-méthyl-N-[1,1- bis(hydroxyméthyl) -2-hydroxyéthyl]propionamide), le 2,2'-azobis(2-méthyl-N-[1,1-bis(hydroxyméthyl)éthyl] propionamide, le 2,2'-azobis[2-méthyl N-(2-hydroxyéthyl)propionamide], le 2,2'-azobis (isobutyramide)dihydrate, le 2,2'-azonis(2,2,4-triméthylpentane), le 2,2'azobis(2-méthylpropane), le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-(Nphenylamidino)propane), le dichlorhydrate de 2,2'- azobi s (2- (N- (4chlorophenyl)-amidino)propane), le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-(N-(4hydroxyphenyl)-amidino)propane), le dichlorhydrate de 2, 2'-azobis(2- (Nbenzylamidino)propane), le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-(Nallylamidino)propane), le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(5-methyl (N, N'diméthylèneisobutyramidine)), le dichlorhydrate de 2,2'- azobis(2-(4, 5,6, 7-tetrahydro- lH-1,3-diazepin-2-yl)propane), le dichlorhydrate de 2,2'azobis(2-(3,4,5,6- tetrahydropyrimidin-2-yl)propane), le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-(5-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl)propane), le dichlorhydrate de 2,2'- azobis(2-(1- (2-hydroxyethyl)-2-imidazolin-2-yl) propane), le peroxyacétate de t-butyle, le peroxybenzoate de t-butyle, le peroxyoctoate de t-butyle, le peroxynéodécanoate de tbutyle, le peroxyisobutyrate de tbutyle, le peroxypivalate de tamyle, le peroxypivalate de tbutyle, le peroxydicarbonate de di isopropyle, le peroxydicarbonate de dicyclohexyle, le peroxyde de dicumyle, le peroxyde de dibenzoyle, le peroxyde de dilauryle, le peroxydisulfate de potassium, le peroxydisulfate d'ammonium, l'hyponitrite de di -t-butyle et l'hyponitrite de dicumyle. Selon un mode de réalisation particulier, l'amorceur utilisé est le 2,2'-azobis(isobutyronitrile) (AIBN).

Les radicaux amorceurs peuvent également être produits thermiquement à 15 partir du monomère (ex styrène), par voie photochimique, à partir de systèmes redox ou par une combinaison de ces méthodes.

Les systèmes d'amorçage photochimique sont choisis pour présenter la solubilité requise dans le milieu réactionnel ou le mélange de monomères et possèdent un rendement approprié pour la production de radicaux dans les conditions de polymérisation. Des exemples de tels systèmes incluent les dérivés de la benzoïne, la benzophénone, les oxydes d'acylphosphine et les systèmes photo-redox.

Les systèmes d'amorçage redox sont choisis pour présenter la solubilité requise dans le milieu réactionnel ou le mélange de monomères et possèdent une vitesse appropriée pour la production de radicaux dans les conditions de polymérisation. Des exemples de tels systèmes comprennent les associations des oxydants et réducteurs suivant: oxydants: peroxydisulfate de potassium, peroxyde d'hydrogène, hydroperoxyde de t- butyle réducteurs: fer (VII), titane (III), thiosulfite de potassium, bisulfite de potassium.

D'autres systèmes d'amorçages appropriés sont décrits dans la littérature (voir Moad and Solomon, The Chemistry of Free radical Polymerization, Pergamon, London, 1995, pp 53-95).

La quantité d'agent amorceur à ajouter dans le procédé de l'invention est choisie de telle sorte que le rapport molaire [agent de transfert]/ [amorceur] soit compris entre 1 et 100, de préférence entre 2 et 50, de préférence entre 3 et 20.

Comme indiqué dans WO2004/055060, il pourra être avantageux de contrôler le flux de radicaux amorceurs dans le milieu de polymérisation, de façon à obtenir des polymères de masses molaires supérieures à 100 000 g/mol, avec un degré de polymolécularité faible, en une durée de polymérisation inférieure à 8 heures et avec un taux de conversion en monomères supérieur à 75%.

Les polymères obtenus par un tel procédé RAFT conforme à l'invention présentent, en bout de chaîne du polymère, à l'extrémité a, soit une ou plusieurs fonctions ester activé, soit un ou plusieurs composés d'intérêt ayant été fixé par couplage covalent avec la ou les fonctions ester activé. De façon avantageuse, le composé d'intérêt est fixé par une liaison de type amide.

Les polymères sont nouveaux et constituent un autre objet de l'invention.

Ainsi, l'invention concerne également les polymères susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention.

Les polymères de l'invention présentent les caractérisitiques suivantes, seules ou en association: - leur indice de polymolécularité est d'au plus 2, de préférence d'au plus 1,5, - ils sont hydrophiles de sorte qu'ils sont adaptés au diagnostic.

Les ligands biologiques pouvant être fixés sur le polymère de la présente invention sont, par exemple, ceux utilisés dans les tests de détection de molécules cibles, par exemple dans le domaine du diagnostic, ou dans des domaines thérapeutiques, par exemple dans le cas de la vectorisation de molécules actives, de protéines ou de gènes.

Dans le cas du diagnostic, pour permettre la détection et/ou la quantification et/ou la purification de la molécule cible, le ligand biologique est capable de former un complexe ligand/anti ligand. En fonction de la nature de la cible à détecter, l'homme du métier choisira la nature du ligand biologique à fixer sur le polymère. A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique, le ligand biologique peut être un acide nucléique suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction et notamment la température ou la salinité du milieu réactionnel. Une étape de détection de la molécule cible peut être nécessaire comme dans le cas d'une hybridation sandwich (voir par exemple WO 91/19862) ou bien la molécule cible peut être directement marquée comme après une technique d'amplification enzymatique de type PCR (polymerase chain reaction) qui incorpore un nucléotide fluorescent (voir DNA probes, 2nd edition, Keller G. H. et Manak M., Stockton Press, 1993). A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique préalablement capturée sur un support, le ligand biologique peut être une biotine. Dans ce contexte, un polymère fluorescent selon l'invention porteur d'une biotine à son extrémité a pourra être utilisé. Dans ce cas, l'ante ligand sera une streptavidine immobilisée sur la cible via un acide nucléique marqué par une biotine et suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction et notamment la température ou la salinité du milieu réactionnel. Le polymère fluorescent permet alors directement la détection L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.

Exemple 1:

Synthèse de dithioesters précurseurs comportant une fonction ester activé: Exemple la: Synthèse du succinimido-6-phényl-6-thioxo-5-thia-4cyano-4-méthylhexanoate de formule suivante:

O

Cette synthèse présente trois étapes: a) synthèse du disulfide de dithiobenzoyle: Cette synthèse a lieu en deux étapes. Du bromure de phénylmagnésium (PhMgBr, 0,03 mol Aldrich ref 33,137-6) réagit avec du disulfure de carbone (CS2, 0,03 mol Aldrich ref 33,526-6) dans le THF. De l'eau (30 mL) est ensuite ajoutée pour hydrolyser le magnésien obtenu. Les sels de magnésium sont filtrés et le filtrat est ensuite acidifié par l'acide chlorhydrique fumant (environ 5g). La solution se colore et démixe en deux phases à pH = 1. La phase organique est alors extraite avec de l'éther en trois fois (3*40mL). Les phases éther sont rassemblées et séchées sur sulfate de magnésium MgSO4 anhydre, puis le solvant est évaporé. L'huile obtenue (acide dithiobenzoïque) est reprise dans 50 mL d'éthanol et quelques grains d'iode I2 sont ajoutés. On ajoute également 4,7 g de DMSO (0,06 mol) goutte à goutte. Au bout de quelques minutes des cristaux roses de disulfide de dithiobenzoyle se forment et la cristallisation est alors poursuivie à 0 C pendant une nuit. Les cristaux sont récupérés par filtration et séchés (rendement 60 %).

b) synthèse de l'acide 6-phényl-6-thioxo-5-thia-4-cyano-4méthylhexanoïque: Du disulfide de dithiobenzoyle (1 équivalent) obtenu à l'étape a) précédente, et de l'acide 4,4'-azobis(4-cyanopentanoïque) (ACPA, 1,5 équivalent fourni par Fluka, référence 11590) sont dissouts dans de l'acétate d'éthyle. Le mélange est chauffé à reflux pendant 12 heures. Le produit formé est ensuite purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant mélange acétate d'éthyle/hexane 33/66 v/v). Le produit purifié est obtenu avec un rendement de 68 %.

c) synthèse du succinimido-6-phényl 6- thioxo - 5- thia- 4- cyano -4méthylhexanoate Le produit purifié obtenu à l'étape b) précédente est dissout dans du chloroforme. Après refroidissement à 0 C, 1 équivalent de N-hydroxysuccinimide (NHS, Aldrich, référence 13,067-2) est ajouté. Après dissolution du NHS, 1 équivalent de I'N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, Aldrich, référence D8,000-2) est ajouté. Après 1h de réaction à 0 C puis 22h à température ambiante, le milieu réactionnel est filtré puis évaporé. Après reprise à l'acétate d'éthyle et une autre filtration suivie d'une évaporation du solvant, un produit rose est obtenu. Le rendement de cette étape est d'environ 80 %. Le produit attendu est obtenu avec un rendement global d'environ 33%.

1H RMN (CDCl3): 6 = 1,96 (s, CH3), 6 = 2,59-2,74 (m, C CHl-CH2-C(=O)-), 6 = 2,85 (s, -C(=O)-CH2-CH2-C(=O)-), 6 = 2,99 (m, CCH2-CH2-C(=O)-), 6 = 7, 41 (t, Harom, meta), 6 = 7,58 (t, Harom, para), 6 =7,91 (d, Harom, ortho) É Exemple lb: Synthèse du succinimido-4-phényl-4-thioxo-3-thia-2méthylbutanoate (nommé SEDB pour succinimidoxycarbonyléthyldithiobenzoate) de formule suivante: Cette synthèse présente deux étapes: a) synthèse de l'acide 4-phényl-4-thioxo-3-thia-2-méthylbutanoïque: Dans un réacteur de type Schlenk conditionné sous argon, 10,3 mL d'une solution de bromure de phénylmagnésium (PhMgBr, 1 mol.L 1 dans THF, fourni par Aldrich, référence 33,137-6) est ajoutée goutte à goutte à 0 C sous agitation modérée à un mélange de 0,93 mL de disulfure de carbone (CS2, fourni par Aldrich, référence 33,526-6) et d'environ 12 mL de THF. Après 1h de réaction et retour à température ambiante, 0,92 mL d'acide bromopropanoïque (fourni par Aldrich, référence 24,119-9) est ajouté goutte à goutte. Après 42h de réaction à température ambiante, le milieu est acidifié avec 20 mL d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 2 mo1.L-1. La phase organique est alors lavée 2 fois à l'aide de 50 mL d'acétate d'éthyle, puis séchée par du sulfate de magnésium MgSO4 anhydre. Après filtration puis évaporation des solvants, le produit obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (Silica gel 60, fourni par Merck; éluant mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 40-65 C, 60/40, v/v). Le produit purifié est obtenu avec un rendement d'environ 46%.

b) synthèse du SEDB: Dans un réacteur de type Schlenk conditionné sous argon, 1,24 g du produit purifié obtenu à l'étape a) précédente est dissout dans 30 mL de DMF. Après refroidissement à 5 C, 0,62 g de Nhydroxysucinimide (NHS, fourni par Aldrich, référence 13,067-2) sont ajoutés. Après la dissolution complète du NHS, le milieu est encore refroidi à 0 C puis 1,1 g de N-N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, fourni par Aldrich, référence D8,000-2) sont ajoutés. Après 17h de réaction à 0 C, le milieu réactionnel est filtré puis évaporé. Après reprise à l'acétate d'éthyle et une autre filtration suivie d'une évaporation du solvant, un produit rouge orangé est obtenu. Le rendement de cette étape est d'environ 96%.

La synthèse du SEDB offre un rendement global d'environ 44%.

1H RMN (CDCb): 6 = 1,82 (d, CH3), 6 = 2,83 (s, CH2-CH2), 6 = 5,09 (q, CH), 6 = 7,40 (t, 2Har0m, meta), 6 = 7,56 (t, Har m, para), 6 =8,01 (d, 2Har0m, rth )É 13C RMN (CDC13): 6 = 16,431 (CH3), 6 = 25,613 (CH2-CH2), 6 = 45,705 (CH), 6 = 127,108 (2C m, rtn ), 6 = 128,533 (2Car m, meta), 6 = 133,050 (C m, para), 6 =143,841 (-Çarom-C(=S)-), 6 = 167,282 (Ç(=O)N-C(=O)-), 6 = 168,642 (C(=O)-O-N), 6 = 223,962 (C=S).

Le SEDB est alors mis à réagir avec des ligands aminés, de façon à obtenir une amidation au niveau de la fonction ester activé.

Exemple 2:

Synthèse des dithioesters fonctionnalisés avec un ligand aminé L-NH2 à partir 15 du SEDB La fonctionnalisation du SEDB avec un ligand aminé est réalisable à l'aide de tout composé aminé de type L-NH2. Typiquement, dans un ballon de 50mL plongé dans un bain thermostaté à 30 C et muni d'un agitateur magnétique, 100 mg de SEDB sont dissous dans 10 mL de chloroforme CHCb. 1 équivalent molaire du composé aminé L-NH2 est dissous séparément dans 5 à 10 mL de chloroforme. Cette solution de composé aminé est alors versée dans la solution de SEDB en 4 ou 5 fractions avec un temps d'attente de 15 à 20 min entre les ajouts. Le milieu réactionnel est typiquement sorti du bain thermostaté après 1h30 à 2h de réaction. 5 lavages à l'eau permutée (50 mL) sont alors réalisés. Après séchage de la phase chloroforme (sulfate de magnésium MgSO4 anhydre), filtration et évaporation du solvant, un produit rouge orangé est obtenu. Une purification par chromatographie sur gel de silice (Silica gel 60, fourni par Merck) peut éventuellement être réalisée.

Amélioration: Dans certains cas, la solution de composé aminé (1 équivalent) peut être ajoutée en une seule fraction à la solution de SEDB.

Ce protocole a été appliqué à un composé aminé modèle, puis à divers ligands aminés d'intérêt biologique: Exemple 2a: Couplage avec un composé aminé modèle: le 4-(2-aminoéthyl)morpholine (AEM, fourni par Aldrich, référence A5,500-4) Aucune purification par chromatographie sur gel de silice n'a été réalisée.

Le N-(2-morpholinoéthyl)-4-phényl-4-thioxo-3-thia-2-méthylbutanamide (nommé MEDBA pour N-éthylMorpholine-EthylDithioBenzoate Amide) de formule suivante a été obtenu (rendement = 90 %).

1H RMN (CDCb): 6 = 1,68 (d, CH3), 6 = 2,36-2,46 (m, 6H, 3 -(CH2)-N), 6 = 3,33 (q, 10 -NH-CH2-), 6 = 3,63 (t, -CHl-O-CHl2-), 6 = 4,72 (q, CH), 6 = 6,95 (s, NH), 6 = 7,40 (t, 2Harom, meta), 6 =7,56 (t, Harom, para), 6 =8, 00 (d, 2Harom, ortho)É 13C RMN (CDCb): 6 = 16,020 (CH3), 6 = 36,037 (-NHCH2-CH2-N), 6 = 48,206 (CH), 6 = 53,232 (2 -N-CH2-CH2-O), 6 =56,584 (-NHCH2-), 6 = 66,988 (2 -CH2-O), 6 = 127,029 ((2Carom, ortho), 6 = 128,528 (2Carom, meta), 6 = 133,081 (Carom, para), 6 = 144,189 (-Carom-C(=S)-), 6 =170,314 (C=O), 6 = 227,147 (C=S).

Spectrométrie de masse ionisation FAB (Fast Atom Bombardment) : [M + H+]: C16H23N202S2 (339,1201 u.m.a.) ; masse expérimentale = 339,1205 u.m.a..

Exemple 2b: Couplage avec une biotine aminée: EZ-LinkTM Biotin-PEO-Amine (fourni par Pierce, référence 21346) Une purification par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec de 1' acétone puis avec un mélange dichlorométhane/éthanol, 70/30, v/v, a été réalisée.

Le N-[8-((+)-biotinamido)-3,6-dioxaoctyl] -4-phényl-4-thioxo-3-thia-2méthylbutanamide (nommé BEDBA pour Biotin-EthylDithioBenzoate Amide) de formule suivante:

O

HN NH H

N S H

a été obtenu. (rendement après purification = 72 %).

Pureté massique > 97% (analyse élémentaire).

1H RMN (CDC13): 6 = 1,44 (q, -CH2-CH-S-), 6 = 1,68 (d, CH3), 6 = 1,68 (sous le doublet précédent, -C(=O)-CH2- CH2- CH2-), 6 = 2,21 (t, -C(=O)CH2-), 6 = 2,69-2,75 (d, -NH-CH(-CH-)-CH-), 6 = 2,85-2,94 (dd, -NH-CH(-CH)-CH2-), 6 = 3,12 (q, -CH2-CH(-CH-)-S-), 6 = 3,40-3,57 (m, 12H, 4 -CH2-O+ 2 -CH2-NH-), 6 = 4,26-4,47 (m, -CH2-S-), 6 = 4,68 (q -CH-CH3), 6 = 5,30 et 6,26 (s, -NH-C(=O)-NH-), 6 = 6,48 (s, -CH2-NH-C(=O)-CH2-), 6 = 7,01/ (s, -CH2-NH-C(=O)-CH-), 6 = 7,40 (t, 2Harom, meta), 6 =7,55 (t, Harom, para), 6 =7,99 (d, 2Harom, ortho).

Spectrométrie de masse ionisation FAB (Fast Atom Bombardment) : [M + H+]: C26H39N4O5S3 (583,2083 u.m.a.) ; masse expérimentale = 583,2050 u.m.a..

Exemple 2c: Couplage avec un sucre aminé : le 6-amino-6-désoxy-1,2:3,4-diO-isopropylidène-a-D-galactopyranose., synthétisé selon la référence B. Badey, et al. Macromol. Chem. Phys. (1996), 197, 3711, à partir du 1,2:3, 4-di-O-isopropylidène-D-Galactose (Aldrich, ref D12,630-6).

Deux purifications par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/éthanol, 92/5/3, v/v/v puis avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/éthanol, 79/20/1, v/v/v, ont été réalisées. Le N- [6- desoxy- 1,2:3,4-di- O- isopropylidene -6- D- galactopyranosyl] -4-phényl-4-thioxo-3-thia-2-méthylbutanamide (nommé SEDBA pour Sucre- EthylDithioBenzoate Amide) de formule suivante: a été obtenu. (rendement après purification = 66 %).

Pureté massique > 96% (analyse élémentaire).

1H RMN (CDC13): 6 = 1,223, 1,306 et 1,437 (s, 12H, 4CH3), 6 = 1,66 (d, CH-CH3), 6 = 3,13-3,34 (m, 1H, 1+6), 6 = 3,58-3,92 (m, 2H, Ib + 1j6), 6 = 4,10-4,17 (m, HC2), 6 = 4,25-4,30 (m, Hu), 6 = 4,54-4,59 (m, 13), 6 = 4, 70 (q, CH), 6 = 5,45-5,51 (m, Iii), 6 = 6,62-6,71 (d, NH), 6 = 7,38 (t, 2Harom, meta), 6 =7,54 (t, I,om, para), 6 =7,99 (d, 2Haom, ortho).

Spectrométrie de masse ionisation FAB (Fast Atom Bombardment) : [M + H+]: C22H30NO6S2 (468,1515 u.m.a.) ; masse expérimentale = 468,1532 u.m.a..

Exemple 3:

Synthèse de dithioesters fonctionnalisés avec un ligand aminé L-NHs+ à partir du SEDB Dans le cas des composés aminés du type R-NH3+, un minimum de 1 équivalent d'amine tertiaire (triéthylamine, TEA ou 4dimethylaminopyridine, DMAP, fournis par Aldrich, référence respective 47, 128-3 et 10,770-0) est ajouté dans la solution du composé aminé. Ceci a été appliqué dans le cas d'un lipide aminé et d'un fluorophore aminé.

Exemple 3a: Couplage avec un lipide aminé : le 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro3-phosphoéthanolamine-N-(héxanoylamine) (fourni par Avanti Polar Lipids, Inc, référence 870125P) Une purification par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec de 1' acétone puis de l'acétate d'éthyle, puis avec un mélange dichlorométhane/éthanol, 70/30, v/v, a été réalisée.

2887888 49 Le N- [6- (1,2- dipalmitoyl- s n- glycéro- 3- pho sphoéthanolamine)- N- héxanoyl]- 4-phenyl- 4- thioxo -3- thia- 2méthylbutanamide (nommé LEDBA pour Lipid-EthylDithioBenzoate Amide) de formule suivante: o a été obtenu (rendement après purification = 69 %).

Pureté massique > 94% (analyse élémentaire) 1H RMN (CDCb): 6 = 0,87 (t, 6H, 2 alkyl-CH3), 6 = 1,24 (pic large, 52H, 2 - (CH2)13-), 6 = 1,56 (m, 6H, -(CH2)3-), 6 = 1,65 (d, -CH-CH3), 6 = 2,26 (m, 6H, 2 -0-C(=O)-CH2- et -NH-C(=O)-CHl-), 6 = 3,21 (m, -NH-CH2-CH2-CH2-), 6 = 3,48 (m, - NH-CHICHz-O-), 6 = 3,92 (m, 4H, NH-CHz-CHI-0- et -CH-CHl-0-C(=O)-), 6 = 4,13 et 4,34 (m, -P-O-CHz-CH), 6 = 4,68 (q, -S-CH-), 6 = 5,23 (s, -CH-O-C(=O)-), 6 = 6,97 (s, -CH-C(=O)-NH-), 6 = 7,25-7.30 (CHz-C(=O)-NH-), 6 = 7,36 (t, 2Harom, meta), 6 =7,53 (t, Har m,para), 6 =7,97 (d, 2Harom, ortho)É Spectrométrie de masse ionisation FAB (Fast Atom Bombardment) : [M + Ht]: C54H94N2O10PS2 (1013,6088 u.m.a.) ; masse expérimentale = 1013,6077 u.m.a. .

Exemple 3b: Couplage avec un fluorophore aminé : le chlorure de 442-20 phénanthréno)butylammonium synthétisé selon la référence: C A. M. Afonso and J. P. S. Farinha, Journal of Chemical Research (S), (2002), 11, 584.

Une purification par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange éther de pétrole 40-65 C /acétate d'éthyle, 70/30, v/v, a été réalisée.

Le N- (4- (2-phénanthréno)butyl)- 4- phényl- 4- thioxo - 3- thia-2méthylbutanamide 25 (nommé PHEDBA pour Phénantrène- EthylDithioBenzoate Amide) de formule suivante: a été obtenu. Rendement (après purification) = 60 % 1H RMN (CDCb): 6 = 1,65 (d, CH3), 6 = 1,77-1,81 (m, -CH2-CH2-), 6 = 3,10 (t, - CHz-CPh ), 6 = 3,33 (m, -NH-CH2-), 6 = 4,67 (q, -S-CH-), 6 = 6,39 (s, NH), 6 = 7,25 - 8,75 (14Harom).

Exemple 4:

Polymérisation du NAM par le procédé RAFT en utilisant un des agents de transfert obtenus aux exemples 1, 2, et 3a.

Le N-Acryloylmorpholine (NAM, vendu par POLYSCIENCES, INC, référence 21192) est distillé avant utilisation en polymérisation.

Le dioxane (solvant) (vendu par SDS, référence 27,053-9) est distillé sur LiAlH4 avant utilisation.

Le 2,2'-azobis-isobutyronitrile AIBN (amorceur de polymérisation) (Fluka, référence 11630) est recristallisé dans l'éthanol.

Le trioxane (référence interne pour le suivi R.M.N. 1H) (JANSSEN-CHIMICA, référence 14.029.61) est utilisé tel quel.

Mode opératoire des polymérisations RAFT: Les différents réactifs (monomère, agent de transfert, amorceur, trioxane, solvant) sont introduits dans un réacteur de type Schlenk à température ambiante, et le mélange est dégazé par une succession de cycles de congélation/vide/ décongélation, puis mis sous azote. Le mélange réactionnel est porté à 90 C et laissé sous agitation pendant 4 à 5h. Le polymère est précipité dans l'éther puis séché.

Conditions opératoires de l'homopolymérisation du NAM par le procédé RAFT: Conditions communes à tous les essais: - [NAM]o = 1,6 mo1.L-1 [NAM]o/[DT]o = 355 => Mn visée à 100% de conversion = 50000g/mol - [DT] o/[AIBN]o = 10 - T = 90 C, polymérisation dans le dioxane sous azote (en présence de trioxane).

[X] signifie concentration en réactif X. Tableau 1: nature du dithioester (DT) utilisé Référence El E2 E3 E4 E5 des essais Dithioester SEDB MEDBA BEDBA SEDBA LEDBA utilisé (DT) DT précurseur DT- DT- DT-Sucre DTLipide Morpholine Biotine Suivi cinétique Le suivi cinétique de la consommation du monomère est réalisé par R.M.N. 1H (Résonance Magnétique Nucléaire) sur un spectromètre Bruker AC 200 MHz.

Les échantillons à analyser sont préparés en mélangeant 200 L de chaque prélèvement à 400 L de solvant deutéré : le CDC1. Cette méthode présente l'avantage d'analyser le milieu réactionnel sans évaporer le solvant de synthèse et permet donc d'éviter d'éventuelles transformations des produits.

La diminution des pics relatifs aux protons vinyliques du monomère est suivie en fonction du temps par rapport à une référence interne, le trioxane. Le trioxane a la particularité de présenter un pic R.M.N. 1H sous la forme d'un singulet fin, intense, et isolé des protons vinyliques du monomère NAM.

( HNAM La conversion du monomère est obtenue par: 1 _ Htrioxane (H

NAM

C NAM

Htrioxane /0 avec CNAM: conversion du NAM, HNAM: intégrale relative à un proton du NAM, Htrioxane: intégrale relative aux six protons du trioxane.

Conditions d'analyses par Chromatographie d'Exclusion Stérique (C.E.S.) couplée à un détecteur de diffusion dynamique de la lumière (DDL) : Colonnes: Ultra Hydrogel 500 et 2000 (Waters) ; pompe: Waters 510; détecteur réfractométrique différentiel: Waters 410; détecteur Diffusion Dynamique de la Lumière: Trois angles, miniDawn, Wyatt Technology; éluant: tampon borate 0,05 M pH = 9,3 (mélange tampon borate 0,05M/ Ethanol, 80/20, v/v pour l'essai E5) ; débit: 0,5 mL.min-i. Logiciel d'exploitation des données brutes: ASTRA (Wyatt Technology).

Ces conditions d'analyse permettent d'accéder aux masses molaires absolues.

Caractéristiques des polymères obtenus (C.E.S. couplée à un détecteur DDL) Mn est la masse molaire moyenne en nombre des chaînes polymères formées, Mpic correspond à la masse molaire de la population majoritaire, et p est l'indice de polymolécularité reflétant l'homogénéité des masses des chaînes polymères (plus Ip est proche de 1, plus les chaînes polymères sont homogènes en masse).

= [NAM] o.M Nam.0 Nam Mnthéorique est obtenu par: Mn théorique + [DT] MDT avec [NAM]o: concentration initiale en NAM, [DT]o: concentration initiale en dithioester, CNAM: conversion du NAM, MNAM: masse molaire du NAM, MDT: masse molaire du dithioester.

Tableau 2: caractéristiques des polymères obtenus Référence des Temps de Conversion en Mn Mn théorique Mpic Ip essais réaction (heures) monomère(%)(g.mori) (g/mol) (g.mori) 0,6 42 28200 21200 29700 1,07 1,0 61 35600 30500 39100 1,05 El 1,5 69 39200 34400 43100 1,05 2,5 77 41300 38500 47800 1,08 4,5 82 42300 41000 51400 1,11 0,3 23 16000 11700 17600 1,04 0, 4 48 28200 23800 29700 1,03 E2 0,7 65 35700 32700 39000 1,06 1,1 76 40400 38000 45900 1,09 1,5 81 43400 40500 47300 1,07 0,8 15 8400 8300 10300 1, 03 1 28 15500 14800 16600 1,02 E3 1,9 40 26700 25800 29800 1,06 2,8 58 29100 29800 33500 1,10 3,7 63 31800 32100 36500 1,09 0,2 12 5200 6200 7100 1,18 0,3 30 16500 15600 17300 1,02 0,5 43 22600 22200 24000 1,02 E4 0,8 59 28500 30100 30600 1,02 1 66 33700 33500 34800 1,03 1,9 74 38200 37300 38600 1,03 0,5 28 7800* 15100 - 1,10 0,8 54 17000* 27900 - 1,17 E5 1 63 20100* 32400 - 1,09 1,8 74 22300* 38000 - 1,24 * valeurs approximatives et sous-estimées dû à la perturbation de la ligne de base par la présence d'agrégats de type micellaire formés par les chaînes polymères a-5 fonctionnalisées par un lipide.

Les masses molaires Mn des polymères synthétisés croissent avec la conversion de manière parfaitement linéaire et sont proches des valeurs théoriques. Cela permet d'envisager la synthèse de polymères de longueur variable selon la conversion à laquelle la polymérisation est stoppée, et cela de manière parfaitement contrôlée et reproductible. De plus, les indices de polymolécularité, Ip, sont très fiibles, ce qui indique que les chaînes polymères formées sont très homogènes en taille.

Exemple 5:

Polymérisation du DcAM par le procédé RAFT en utilisant l'agent de transfert obtenu à l'exemple 3b.

Le Décylacrylamide (DcAM), est purifié par chromatographie sur gel de silice avant utilisation en polymérisation.

La polymérisation et le suivi cinétique sont réalisés comme décrit à l'Exemple 4 Conditions opératoires de l'homopolymérisation du DcAM par le procédé RAFT: - [DcAM]o = 0,81 mol.L-1 - [DcAM]o/[DT]o = 10,2 => Mn visée à 100% de conversion = 25 8000g/mol - [DT]o/[AIBN]o = 10 - T = 90 C, polymérisation dans le dioxane sous azote (en présence de trioxane).

- Dithioester utilisé : PHEDBA (DT-Phénantrène) [X] signifie concentration en réactif X. Conditions d'analyses par Chromatographie d'Exclusion Stérique (C.E.S.) : Colonnes: Styragel HR4E (Waters) ; pompe: Waters 1515; détecteur réfractométrique différentiel: Waters 2410; éluant: THF (SDS, 99%) ; débit: 1 mL.min-i. Logiciel d'exploitation des données brutes: BREEZE (Waters) ; Calibration: étalons monodisperses de polystyrène.

Ces conditions d'analyse permettent d'accéder aux masses molaires relatives au polystyrène.

Tableau 3: Caractéristiques des polymères obtenus: Temps de Conversion Mn1PS Mn théorique MpiC/PS Ip réaction en (g.morl) (g/mol) (g.morl) (heures) monomère(%) 1,5 42 - 3700 - 2 48 3500 4200 3800 1,10 L'indice de polymolécularité est faible. Dans le cas de cet exemple, l'indice de polymolécularité obtenu avec les masses molaires relatives est supérieur à celui qui serait obtenu avec les masses absolues molaires. La masse molaire moyenne en nombre relative au polystyrène, est du même ordre de grandeur que la masse théorique.

Claims

REVENDICATIONS:

1 - Agent de transfert réversible de chaîne (I) pour polymérisation RAFT, appartenant à la famille des dithioesters, à la famille des xanthates ou à la famille des trithiocarbonate s, comprenant un groupement de formule: C S R I I

S

dans lequel R est un groupe qui comprend au moins une fonction ester activé.

2 - Agent de transfert réversible de chaîne (I) selon la revendication 1 caractérisé en ce que R est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, ledit groupe étant porteur d'au moins une fonction ester activé, et étant éventuellement porteur d'un ou plusieurs autres substituants.

3 - Agent de transfert réversible de chaîne, selon la revendication 1 ou 2, de formule (Ia), (lb) ou (Ic) : Z ë S R (Ia)

S

Z' (-C S R)p

S

(Z C S )p-R (Ic)

S

dans laquelle: - Z représente un atome d'hydrogène, un atome de chlore, COOH, -CN, ou un groupe choisi parmi les groupes suivants, éventuellement substitués: alkyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, ORa, -SRa, -COORa, -02CRa, - CONRaRb, -CONHRa, -P(0)ORaRb, -P(0)RaRb, -OCRcRd-P(0)(ORa)(ORb), - O-CReRf-COOH, -S-CReRf-COOH ou une chaîne polymère, - Z' est un dérivé d'un alkyle éventuellement substitué, d'un aryle éventuellement substitué ou d'une chaîne polymère, sa liaison avec les groupes carbonylthio, se faisant par un carbone aliphatique, un carbone aromatique ou un atome de soufre, ou d'oxygène, - R est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, ledit groupe étant porteur d'au moins une fonction ester activé, et étant éventuellement porteur d'un ou plusieurs autres substituants, - p est un entier supérieur à 1, - Ra et Rb représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - Rc et Rd représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe NO2, -SO3H, -S03Rg, -NCO, -CN, -Rg, -OH, -ORg, SH, -SRg, -NH2, -NHRg, -NRgRh, -000H, -COORg, -O2CRg, - CONH2, -CONHRg, CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, CmF2m+i avec m compris entre 1 et 20, de préférence égal à 1, - Re et Rf représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyle ou aryle éventuellement substitué, - Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle.

4 - Agent de transfert selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il est de formule (Ia) telle que définie à la revendication 3.

5 - Agent de transfert selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R représente un groupe A-(C(0)-OY)n avec: - A qui représente un groupe, éventuellement substitué, choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, Y étant, par exemple, choisi parmi les groupes suivants: N-succinimidyle, 1-benzotriazole, pentachlophényle, 2,4,5trichlorophényle, 4-nitrophényle, 3-pyridyle, 2-méthoxycarbonylphényle, Nphtalimidyle, et 2-carboxyphényle, et - n qui représente un entier au moins égal à 1.

6 - Agent de transfert selon la revendication 5 caractérisé en ce que n est égal à 1.

7 - Agent de transfert selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que le groupe Y est le groupe N-succinimidyle: 8 - Agent de transfert selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le groupe R présente un atome de carbone secondaire ou tertiaire, situé en alpha de l'atome de soufre.

9 - Agent de transfert selon l'une des revendications 5 à 8 caractérisé en ce que le groupe A est une chaîne aliphatique, ramifiée, éventuellement substituée, ladite chaîne présentant un atome de carbone secondaire ou tertiaire, en alpha de l'atome de soufre.

- Agent de transfert selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que Z est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, cycloalkyle, aryle, -ORa, et -SRa, lesdits groupes étant éventuellement substitués, Ra étant tel que défini à la revendication 3.

11 - Agent de transfert selon l'une des revendications 1 à 10 choisi parmi le succinimido-6-phényl 6-thioxo-5-thia-4-cyano-4-méthylhexanoate et le succinimido-4-phényl-4-thioxo-3- thia-2- méthylbutanoate.

12 - Agent de transfert réversible de chaîne obtenu par couplage de l'un des agents de transfert de chaîne tels que définis aux revendications 1 à 11 avec un composé aminé d'intérêt.

13 - Agent de transfert réversible de chaîne (II) pour polymérisation RAFT, appartenant à la famille des dithioesters, à la famille des xanthates ou à la famille des trithiocarbonate s, comprenant un groupement de formule: C S R' I I

S

dans lequel R' est un groupe qui comprend au moins une fonction amide-L, avec L choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères et les supports solides.

14 - Agent de transfert réversible de chaîne (II) selon la revendication 13 caractérisé en ce que R' comprend au moins une fonction:

L

dans laquelle: - X représente un atome d'hydrogène, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, ou bien une liaison covalente, de façon à former un cycle aminé avec le composé L, et - L est tel que défini à la revendication 13.

- Agent de transfert réversible de chaîne (II), selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce que R' est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant, d'une part, porteur d'au moins une fonction:

L

O

avec X tel que défini à la revendication 14 et L tel que défini à la revendication 25 13, et d'autre part, éventuellement porteur d'un ou plusieurs autres substituants.

16 Agent de transfert réversible de chaîne, selon l'une des revendications 13 à 15, de formule (lia), (IIb) ou (Ilc) : Z C S R' (IIa)

S

Z ( S R) p (IIb)

S

(Z C S )p R' (IIc)

S

dans laquelle: - Z représente un atome d'hydrogène, un atome de chlore, COOH, -CN, ou un groupe choisi parmi les groupes suivants, éventuellement substitués: alkyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, ORa, -SRa, -COORa, -02CRa, - CONRaRb, -CONHRa, -P(0)ORaRb, -P(0)RaRb, -OCRcRd-P(0)(ORa)(ORb), - O-CReRf-000H, -S-CReRf-COOH ou une chaîne polymère, - Z' est un dérivé d'un alkyle éventuellement substitué, d'un aryle éventuellement substitué ou d'une chaîne polymère, sa liaison avec les groupes carbonylthio, se faisant par un carbone aliphatique, un carbone aromatique ou un atome de soufre, ou d'oxygène, - R' est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant d'une part porteur d'au moins une fonction:

L C N,

X

O

avec X tel que défini à la revendication 14 et L tel que défini à la revendication 13, et d'autre part, éventuellement porteur d'un ou plusieurs autres substituants, - X représente un atome d'hydrogène, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, ou bien une liaison covalente, de façon à former un cycle aminé avec le composé L, - p est un entier supérieur à 1, - Ra et Rb représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - Rc et Rd représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou d'halo gène, un groupe -NO2, -SO3H, SO3Rg, -NCO, -CN, -Rg, - OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH2, -NHRg, -NRgRh, -000H, -COORg, -O2CRg, -CONH2, -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, CmF2m+i avec m compris entre 1 et 20, de préférence égal à 1, - Re et Rf représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyle ou aryle éventuellement substitué, - Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - L est tel que défini à la revendication 13.

17 - Agent de transfert selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est de formule (IIa).

18 - Agent de transfert selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que R' représente un groupe:

L

-A-( C-N) Il X n O avec - A qui représente un groupe, éventuellement substitué, choisi parmi les suivants: alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, - n qui représente un entier au moins égal à 1, et de préférence égal à 1, - X tel que défini à la revendication 14 et L tel que défini à la revendication 13.

19 Agent de transfert selon la revendication 18, caractérisé en ce que n est égal à 1.

Agent de transfert selon l'une des revendications 13 à 19 caractérisé en ce que le groupe R' présente un atome de carbone secondaire ou tertiaire, situé en alpha de l'atome de soufre.

21 - Agents de transfert selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisé en ce que le groupe A est une chaîne aliphatique, ramifiée, éventuellement substituée, présentant un atome de carbone secondaire ou tertiaire, en alpha de l'atome de soufre.

22 - Agent de transfert selon l'une des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que Z est choisi parmi les groupes suivants: alkyle, cycloalkyle, aryle, -ORa, et SRa, lesdits groupes étant éventuellement substitués, et Ra est tel que défini à la revendication 16.

23 - Agent de transfert selon l'une des revendications 13 à 22 caractérisé en ce que L est un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, la biotine et les haptènes, ou bien un lipide, une molécule fluorescente ou un monosaccharide.

24 - Procédé de préparation de polymères mettant en oeuvre une étape de polymérisation RAFT, réalisée à partir de monomères identiques ou différents, en présence d'une source de radicaux amorceurs et d'un agent de transfert réversible de chaîne caractérisé en ce que l'agent de transfert réversible de chaîne est tel que défini à l'une des revendications 1 à 11.

- Procédé de préparation selon la revendication 24 caractérisé en ce que la polymérisation RAFT est suivie d'une étape de couplage d'au moins une fonction ester activé située à l'extrémité a du polymère obtenu avec un composé d'intérêt porteur d'une fonction nucléophile réactive, vis-à-vis de la fonction ester activé.

26 - Procédé de préparation selon la revendication 25 caractérisé en ce que le composé d'intérêt est porteur d'une fonction aminée.

27 - Procédé de préparation selon la revendication 25 ou 26 caractérisé en ce que le composé d'intérêt est choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères, les supports solides.

28 - Procédé de préparation selon la revendication 27 caractérisé en ce que le composé d'intérêt est un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, la biotine et les haptènes, ou bien un lipide, un monosaccharide ou une molécule fluorescente.

29 - Procédé de préparation de polymères mettant en oeuvre une étape de polymérisation RAFT, réalisée à partir de monomères identiques ou différents, en présence d'une source de radicaux amorceurs et d'un agent de transfert réversible de chaîne, caractérisé en ce que l'agent de transfert réversible de chaîne est tel que défini à l'une des revendications 12 à 23.

30 - Procédé de préparation de polymères mettant en oeuvre une étape de polymérisation RAFT, réalisée à partir de monomères identiques ou différents, en présence d'une source de radicaux amorceurs et d'un agent de transfert réversible de chaîne, caractérisé en ce que l'agent de transfert réversible de chaîne est obtenu par couplage entre un agent de transfert réversible de chaîne tel que défini à l'une des revendications 1 à 11 et au moins un composé d'intérêt porteur d'une fonction nucléophile réactive, vis-à-vis de la fonction ester activé.

31 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 24 à 30 caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée à partir de un ou plusieurs monomères éthyléniquement insaturés.

32 - Procédé de préparation selon la revendication 31 caractérisé en ce que le ou les monomères utilisés sont choisis parmi le styrène, les styrènes substitués, les (méth)acrylates d'alkyles substitués ou non, l'acrylonitrile, le méthacrylonitrile, l'acrylamide, le méthacrylamide, les dérivés mono et bi- substitués sur l'azote de l'acrylamide et du méthacrylamide, l'isoprène, le butadiène, l'éthylène, l'acétate de vinyle, éventuellement fonctionnalisés.

33 - Procédé de préparation selon la revendication 31 ou 32 caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée avec au moins un monomère hydrophile.

34 - Procédé de préparation selon la revendication 32 caractérisé en ce que le ou les monomères hydrophiles utilisés sont choisis parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, de N- vinylpyrrolidone et les monomères saccharidiques non protégés et leurs dérivés, la N-vinylpyrrolidone (NVP), le N,Ndiméthylacrylamide et la N- acryloylmorpholine (NAM) étant préférées.

- Procédé de préparation selon l'une des revendication 24 à 34 caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée avec au moins un monomère hydrophobe.

36 - Procédé de préparation selon la revendication 35 caractérisé en ce que le ou les monomères hydrophobes utilisés sont choisis parmi les dérivés de méthacrylate, de méthacrylamide, d' acrylate, d' acrylamide, du styrène, l' acrylate de n-butyle, le t-butylacrylamide, l' acrylate de t -butyle et le styrène étant préférés.

37 - Polymère susceptible d'être obtenu par un procédé tel que défini aux

revendications 24 à 36.

38 - Polymère selon la revendication 37 caractérisé en ce qu'il présente un indice de polymolécularité d'au plus 2, de préférence d'au plus 1,5.

39 - Polymère selon la revendication 37 ou 38 caractérisé en ce qu'il est hydrophile.