JPWO2017155019A1 - 蛋白質吸着抑制剤および蛋白質吸着抑制の方法 - Google Patents
蛋白質吸着抑制剤および蛋白質吸着抑制の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017155019A1 JPWO2017155019A1 JP2018504575A JP2018504575A JPWO2017155019A1 JP WO2017155019 A1 JPWO2017155019 A1 JP WO2017155019A1 JP 2018504575 A JP2018504575 A JP 2018504575A JP 2018504575 A JP2018504575 A JP 2018504575A JP WO2017155019 A1 JPWO2017155019 A1 JP WO2017155019A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein adsorption
- water
- lcst
- adsorption inhibitor
- acrylic polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
- C08F20/10—Esters
- C08F20/26—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J7/00—Chemical treatment or coating of shaped articles made of macromolecular substances
- C08J7/04—Coating
- C08J7/056—Forming hydrophilic coatings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Abstract
Description
免疫反応を利用して測定する際の検出感度を左右する要因の一つとして、測定対象となる抗体、抗原若しくは測定に利用するこれらの標識体の、免疫反応容器や測定器具等の基材の固相表面への非特異的な吸着が挙げられる。また、検体として血清、血漿、細胞抽出物および尿といった複数種の生体分子が共存する物質を用いた場合、各種蛋白質を代表する不特定多数の共存物質が免疫反応容器や測定器具等の基材の固相表面へ非特異的に吸着することによるノイズの発生も、高感度化を妨げる要因となっている。
すなわち、本発明は次の〔1〕〜〔5〕を含む。
〔1〕下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、数平均分子量が5,000〜250,000であり、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)を有効成分として含有する、蛋白質吸着抑制剤。
〔2〕前記の〔1〕に記載の蛋白質吸着抑制剤と水とを含有する蛋白質吸着抑制剤塗布液。
〔3〕前記の〔1〕に記載の蛋白質吸着抑制剤の被覆層を表面に備えた基材。
〔4〕下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、数平均分子量が5,000〜250,000であり、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)により、基材表面に被覆層を形成して前記基材への蛋白質の吸着を抑制する、蛋白質吸着抑制の方法。
〔5〕下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、数平均分子量が5,000〜250,000であり、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)を含有し、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)を、基材表面に供給し、該基材表面に水溶性アクリル重合体(P)の被覆層を形成させることによる、基材への蛋白質吸着抑制性を付与する方法。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の蛋白質吸着抑制剤は、水溶性アクリル重合体(P)を有効成分として含有する。
(水溶性アクリル重合体(P))
本発明に用いる水溶性アクリル重合体(P)は、下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、該繰り返し単位[A]は、下記の式(2)で表される単量体の重合によって得られる。
式(2)で表される単量体としては具体的には、メチルジエチレングリコールアクリレート(R1=H、n=2、R2=CH3)、エチルトリエチレングリコールアクリレート(R1=H、n=3、R2=C2H5)、メチルジエチレングリコールメタクリレート(R1=CH3、n=2、R2=CH3)、メチルトリエチレングリコールメタクリレート(R1=CH3、n=3、R2=CH3)、メチルトリエチレングリコールアクリレート(R1=H、n=3、R2=CH3)等が挙げられる。これらの中では、メチルジエチレングリコールメタクリレート(R1=CH3、n=2、R2=CH3)が好ましく挙げられる。
なお、本発明におけるLCST(下限臨界共有温度)は、1質量%水溶液を昇温速度1℃/minで昇温したときの、波長500nmにおける透過率が50%となる温度をいう。
また、水溶性アクリル重合体(P)において、繰り返し構成単位[A]以外の繰り返し単位として、他のコモノマーを組み合わせて用いることもできる。
なお、上述の「中間水」とは、特有の挙動を示す水分子であり、最近の研究により、例えば以下の観察の結果などにより、生体適合性を示す材料中において存在すると考えられている。例えば、PMEA(ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)に水を含水した試料を−100℃まで冷却した後、毎分2.5℃の割合で昇温した際に観察される吸発熱量を示差走査熱量計(DSC)により測定すると、0℃以下の特定の温度域(例えば、−40℃近辺)において所定の発熱を生じると共に、−10℃近辺から0℃までの広い温度範囲において吸熱が観察される。さまざまな検討により、−40℃近辺での発熱はPMEAに含まれる水分子の一部が規則化したことに伴うものであり、−10℃近辺から0℃での吸熱は、その水分子が再び不規則化したことに伴うものであることが明らかになっており、このように、含水したPMEA中には水単体では生じない挙動を示す水分子が存在し、このような挙動を示す水が「中間水」と呼ばれている。
このような「中間水」は、生体由来のヒアルロン酸、へパリンなどの多糖類やゼラチン、アルブミンなどのタンパク質等やDNAやRNAなどの核酸、人工的に合成された生体適合性材料である上記PEGにも含まれるなど、生体適合性に優れる物質に含有されることが明らかになってきつつある。このように、「中間水」は物質における生体適合性の発現と密接に関連していると考えられている。
物質内に「中間水」が生成される理由は明らかでないが、物質内の高い分子運動性を有する高分子鎖と、水分子とが特定の分子間力で相互作用を生じる結果として生じるものであると考えられている。そして、生体適合性材料においては、材料表面と生体成分の水和殻の間に中間水が存在することで両者が直接触れることが阻害され、生体の異物反応が抑制されると考えられている。
本発明に係るポリアルキレングリコール(メタ)アクリレートは、所定の生体適合性を示すことが知られていた高分子である。一方、当該ポリアルキレングリコール(メタ)アクリレートにおいて、特定のLCSTの値を有する組成を用いることによって、意外にも、高性能な蛋白質吸着抑制剤として機能することが本発明により明らかにされた。すなわち、本発明に係る蛋白質吸着抑制剤を溶解した水溶液等を、当該蛋白質吸着抑制剤のLCST以下の温度で被処理物である基材の固相表面に接触させて除去することによって、抗体や酵素といった蛋白質が当該基材の固相表面に非特異的に吸着することを高いレベルで抑制可能であることが明らかになった。さらに、上記水溶液等を基材の固相表面に接触させて除去した後に各種洗浄を行った場合にも当該効果が維持されることから、実際に各種の評価等を行うに際して各種の洗浄を行った場合にも蛋白質の非特異吸着を抑制可能である。このような現象を生じる作用機序については解明された訳ではないが、本願構成の特定のポリアルキレングリコール(メタ)アクリレートはLCSTの温度下で水溶性であるが、特にLCST直下の温度域では析出の駆動力を有しており、水溶液が固体表面に接触した際に、その表面への吸着等の形態で当該高分子が析出し、その結果として蛋白質の非特異的吸着を阻害する被膜を形成するものと考えられる。すなわち本発明によれば、中間水を含む高分子により形成された被膜により基材への蛋白質の非特異的吸着を防止可能な、優れた蛋白質吸着抑制剤を実現できる。
本発明の蛋白質吸着抑制剤は、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)を有効成分として含むために、加熱せずに室温で使用しても容易に透明かつ均一な溶液とすることができる点においても優れている。
溶液重合法に用いられるモノマー溶液におけるモノマーの濃度は、特に限定されないが、重合の操作性、効率を考慮して10〜80質量%程度であることが好ましい。
上記で使用する重合開始剤は、特に限定されないが、例えば、アゾビスイソブチロニトリル(以下「AIBN」と省略する)、アゾイソブチロニチル、アゾイソ酪酸メチル、アゾビスジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等のアゾ系重合開始剤や過酸化物系重合開始剤等、ベンゾフェノン誘導体、ホスフィンオキサイド誘導体、ベンゾケトン誘導体、フェニルチオエーテル誘導体、アジド誘導体、ジアゾ誘導体、ジスルフィド誘導体等の光開始剤等が挙げられる。重合開始剤の量は、特に限定されないが、通常、モノマー100質量部に対して、0.01〜5質量部程度であることが好ましい。
重合により得られた重合体はそのまま水系媒質にて希釈溶解して使用することもできるが、不純物除去のために精製を行うことが好ましい。精製にあたっては既知の手法を適用することができる。具体的には、重合体を良溶媒に10〜80質量%の溶液としたものを、5〜50倍の貧溶媒と混和する沈殿精製法、重合体の良溶媒溶液を単量体と親和性のある吸着剤と接触させて単量体を分離する吸着処理法、重合体の良溶媒溶液の膜分離よるサイズ分離を利用した単量体の膜分離精製法が挙げられる。
また、蛋白質吸着抑制剤塗布液中に含有される、蛋白質吸着抑制剤は、0.01質量%以上であることが好ましく、0.1質量%以上であることがより好ましい。上限値としては、主溶媒である水に溶解する限り特に制限はないが、例えば、20質量%以下、好ましくは10質量%以下である。これらの範囲であれば有効な蛋白質吸着抑制効果が得られるからである。
すなわち、通常この分野で用いられるその他の試薬類等であって、例えば、糖類、塩類、界面活性剤等が挙げられる。例えば、糖類としては、ラクトース、スクロース、トレハロース等が挙げられる。例えば、塩類としては、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸および有機酸の塩等が挙げられる。例えば、界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が挙げられる。
さらに、蛋白質吸着抑制剤の塗布液中に含有し得る化合物として、水溶性高分子、例えば、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)ポリマー、及びポリビニルアルコール等が挙げられる。
本発明に用いる基材の材質は、特に限定されるものではないが、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ガラス、金属、セラミック、シリコンラバー、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース等を挙げることができる。それらの中でも、ポリスチレンとポリフッ化ビニリデンが好ましく、特にポリスチレンが好ましい。
また、基材の形状としては特に限定されるものではないが、具体的には膜(フィルム)状、プレート状、粒子状、さらには、試験管形状、バイアル瓶形状、およびフラスコ形状等を例示することができる。
蛋白質吸着抑制剤の被覆層形成のための蛋白質吸着抑制剤塗布液において、その蛋白質吸着抑制剤の濃度は0.1〜5.0質量%であることが好ましく、より好ましくは1.0〜3.0質量%である。また本発明の蛋白質吸着抑制剤を希釈する溶媒としては、水、水/アルコール混合溶媒が好ましく、より好ましくは水である。
本発明の蛋白質吸着抑制剤においては、上述したように、基材表面に供給することによって基材上に該吸着抑制剤の被覆層を形成させることにより、各種測定時における基材への蛋白質の吸着を抑制する方法が、一つの使用形態である。すなわち、本発明に用いる水溶性アクリル重合体(P)が、免疫反応容器や測定器具等の基材の固相表面に当該被覆層となって吸着することにより、該固相表面上に蛋白質が吸着することを抑制するものである。
なお、蛋白質吸着抑制剤の被覆層を表面に備える基材をあらかじめ作製して、該基材を免疫反応容器や測定器具等に使用する方法の他に、各種測定において使用する試薬に本発明の蛋白質吸着抑制剤を添加する方法が挙げられる。つまり、各種測定の1工程として、基材上に該吸着抑制剤の被覆層を形成させる方法である。なお、測定を実施する際の全ての試薬や溶液に本発明の蛋白質吸着抑制剤を添加して使用することもできる。
このような使用方法において、各試薬および溶液中の蛋白質吸着抑制剤の濃度は、0.0125〜5.0質量%であることが好ましく、より好ましくは0.1〜5.0質量%である。ただし、各種測定の1工程として蛋白質吸着抑制剤を添加する場合には、測定対象物である血清、標識抗体または標識抗原等の蛋白質含有試料を添加する前に、蛋白質吸着抑制剤を添加する。
すなわち、上記免疫反応容器や測定器具等の基材の固定表面に、まず、抗体または抗原等の試料中に含まれる目的の成分と結合可能な蛋白質等を結合させた後、本発明の蛋白質吸着抑制剤で処理する方法である。例えば、ポリスチレン製プレートを使用する際に、該プレートに目的の成分と結合する蛋白質、例えば測定対象物と反応する物質を物理的、あるいは化学的に吸着させた後、本発明の蛋白質吸着抑制剤で処理する方法である。つまり、測定対象物と結合可能な物質をプレート表面に吸着させた後、該測定対象物と結合する物質が吸着していないプレート表面への蛋白質の吸着抑制するため、本願の吸着抑制剤を吸着させる方法である。これによって、蛋白質吸着抑制効果をもつ固相表面を得ることができる。
このような使用方法における基材としては、上記した「蛋白質吸着抑制剤の被覆層を表面に備える基材」と同様な種類および形状の基材を例示できる。
<メトキシジエチレングリコールモノアクリレート単独重合体の合成>
単量体としてメトキシジエチレングリコールモノアクリレート15gを四つ口フラスコに秤量し、ラジカル重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを15mg添加し、1,4−ジオキサン60gに常温で溶解した。開始剤の溶解確認後、オイルバスで75℃に昇温し、75℃に到達後、8時間重合反応を行った。重合反応終了後、1,000mLの反応液を約1,000mLヘキサンで希釈洗浄して有機相を取り除いて生成物を回収し、これを70mLのテトラヒドロフランに再溶解して、再度n−ヘキサンで洗浄することで生成物を回収し、一昼夜減圧乾燥することで目的のオキシアルキレン重合体を得た。1H−NMR測定により、生成物がメトキシジエチレングリコールモノアクリレート単独重合体であることを確認した。またGPCの分子量分析の結果では、数平均分子量(Mn)は13,000であった。さらに重合体が1質量%の水溶液を調製し、波長500nmにおけるUV測定により、その水溶液中の重合体のLCSTが43.1℃であることを確認した。
なお上述のように、本発明におけるLCST(下限臨界共有温度)は、1質量%水溶液を昇温速度1℃/minで昇温したときの、波長500nmにおける透過率が50%となる温度をいう。LCSTの測定には、日本分光株式会社製 紫外可視分光光度計 V−650を用い、光路長1.0cmのセルに1重量%の水溶液3mLを入れ、昇温速度1℃/minで昇温させたときの水溶液の透過率の値に基づき、測定した。
本発明に用いる水溶性アクリル重合体(P)においては、これらの式(2)で表される単量体の1種以上を選択して(共)重合して、そのLCSTが25〜45℃になるようにする。このLCSTの範囲は、好ましくは30〜45℃、より好ましくは33〜43℃である。共重合体のLCSTの設計は、単独重合体の加重平均値から予測して、所要の単量体配合比率を見積もることができる。
<エトキシトリエチレングリコールモノアクリレート単独重合体の合成>
原料としてエトキシトリエチレングリコールモノアクリレートを用いた他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定によりエトキシトリエチレングリコールモノアクリレート単独重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は14,000であり、LCSTは33.8℃であった。
<メトキシトリエチレングリコールモノメタクリレート単独重合体の合成>
原料として、メトキシトリエチレングリコールモノメタクリレートを用いた他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定によりメトキシトリエチレングリコールモノメタクリレート単独重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は105,000であり、LCSTは42.5℃であった。
<メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート − メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(50/50)の合成>
原料として、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレートを6.9gとメトキシトリエチレングリコールモノアクリレート8.1gとして合計15gとした他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート−メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート/メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート=47/53;モル比)であることを確認した。数平均分子量(Mn)は48,000であり、LCSTは37.2℃であった。
<メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート − メトキシトリエチレングリコールモノメタクリレート共重合体(60/40)の合成>
原料としてメトキシジエチレングリコールモノメタクリレート8.2gとメトキシトリエチレングリコールモノメタクリレート6.8gとして合計15gとした他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート−メトキシトリエチレングリコールモノメタクリレート共重合体(メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート/メトキシトリエチレングリコールモノメタクリレート=58/42;モル比)であることを確認した。数平均分子量(Mn)は188,000であり、LCSTは35.1℃であった。
<メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート − メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(40/60)の合成>
原料としてメトキシジエチレングリコールモノメタクリレート5.5gとメトキシトリエチレングリコールモノアクリレート9.5gとして合計15gとした他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート−メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート/メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体=35/65;モル比)であることを確認した。数平均分子量(Mn)は7,000であり、LCSTは37.2℃であった。
<メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート − メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(50/50、低分子量体)の合成>
原料としてメトキシジエチレングリコールモノメタクリレート3.5gとメトキシトリエチレングリコールモノアクリレート4.0gとして合計7.5gとし、開始剤30mgとした他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート−メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート/メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体=47/53;モル比)であることを確認した。数平均分子量(Mn)は17,000であり、LCSTは37.2℃であった。
<メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート単独重合体の合成>
原料としてメトキシトリエチレングリコールモノメタクリレートを用いた他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は12,000であり、LCSTは63.8℃であった。
<2−メトキシエチルビニルエーテル単独重合体の合成>
原料として2−メトキシエチルビニルエーテルモノマー15gを乾燥酢酸エチル15gで希釈して四つ口フラスコに秤量し、重合開始剤としての1−ブトキシエチルアセテート40mMのトルエン溶液15mLを加え、乾燥トルエン180mL中でアルゴン気流下、0℃に冷却した後、撹拌しながらルイス酸としてEt1.5AlCl1.5の1Mトルエン溶液3.75mLを添加した。これを0℃で30分撹拌後、反応液にエタノールを22.5mL添加し、反応停止した。重合反応終了後、反応液をトルエンで希釈して洗浄し、有機相から溶媒を留去し生成物を得た。次いで、80℃の温水で3回洗浄を行った。生成物を回収し、一昼夜減圧乾燥して目的のオキシアルキレン重合体を得た。得られたポリマーの構造は、1H−NMR測定により2−メトキシエチルビニルエーテル単独重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は26,000であり、LCSTは69.0℃であった。
<メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート − メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(20/80、低分子量)の合成>
原料としてメトキシジエチレングリコールモノメタクリレート1.3gとメトキシトリエチレングリコールモノアクリレート6.2gとして合計7.5gとし、開始剤を30mgとした他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート−メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体(メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート/メトキシトリエチレングリコールモノアクリレート共重合体=15/85;モル比)であることを確認した。数平均分子量(Mn)は4,000であり、LCSTは52.0℃であった。
<メトキシテトラエチレングリコールモノアクリレート単独重合体の合成>
原料としてメトキシテトラエチレングリコールモノアクリレートを用いた他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシテトラエチレングリコールモノアクリレート単独重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は87,000であり、LCSTは75℃以上であった。
<メトキシテトラエチレングリコールモノメタクリレート単独重合体の合成>
原料としてメトキシテトラエチレングリコールモノメタクリレートを用いた他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシテトラエチレングリコールモノメタクリレート単独重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は122,000であり、LCSTは75℃以上であった。
<比較合成例6>
<メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート単独重合体の合成>
原料としてメトキシジエチレングリコールモノメタクリレートを用いた他は、合成例1と同様に行った。1H−NMR測定により、生成物が、メトキシジエチレングリコールモノメタクリレート単独重合体であることを確認した。数平均分子量(Mn)は、25,000であり、LCSTは23.5℃であった。
※ Mn: 数平均分子量
※※LCST: 下限臨界溶液温度(Lower Critical Solution Temperature)
<蛋白吸着抑制溶液の調製>
合成例1の重合体をダルベッコリン酸緩衝液(Sigma−Aldrich社製、以後D−PBSと略称する)に0.1質量%となるように混合、ボルテックスミキサーで1時間攪拌溶解し、蛋白質吸着抑制剤塗布液とした。塗布液は室温において透明であり、投入した重合体の全量が溶解したものと考えられた。
上記実施例1の蛋白質吸着抑制剤塗布液について、以下のような方法によって、その蛋白質吸着抑制効果を測定した。
MaxiSoap plate(Thermofisher Scientific社製ポリスチレン製プレート)に、蛋白質吸着抑制剤塗布液を200μL/wellにて分注し、室温で2時間静置した。その後、アスピレーターで溶液を完全に除去し、一方はそのまま(表3中、「未洗浄時」と表記した欄に結果を記載)、もう一方は、直ちにD−PBSを200μL/wellに分注、アスピレータで液を除く操作をそれぞれ5回、繰り返した(表3中、「洗浄後」と表記した欄に結果を記載)。続いて、D−PBSで20,000倍希釈したPOD−IgG(ペルオキシダーゼ標識免疫グロブリンG、Biorad社製)を100μL/wellに分注し、室温で2時間静置した。その後、ツイーン20を0.05%の濃度で含有するD−PBSを200μL/wellに分注、アスピレータで溶液を完全に除去した。この操作を4回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。洗浄後に、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL社製)を用いて調製した発色液100μL/wellを加え、室温で7分間反応させた。発色反応を1mol/Lの硫酸溶液を50μL/wellに分注することで停止させ、450nmの吸光度を測定し、吸着した蛋白質を検出した。吸光度が小さいほど蛋白質の吸着が抑制されていることを示す。吸光度測定には、Spectra Max M3(Molecular Device社製)を使用した。評価結果を表3に示した。
また、蛋白質吸着抑制剤塗布液の耐洗浄性については、上記「未洗浄時」と、上記「洗浄後」の「蛋白質の吸着率の差」に基づいて、評価した。この「蛋白質の吸着率の差」(Δ%)の値が小さい吸着抑制剤は、洗浄されても基材の表面に良く保持されていたといえ、良好な耐洗浄性を示すものといえる。
合成例2〜7重合体を使用した以外は、実施例1と同様にして蛋白質吸着抑制剤塗布液を調製した。各塗布液は室温において透明であり、それぞれ投入した重合体の全量が溶解したものと考えられた。さらに、実施例1と同様にして蛋白質吸着抑制効果および耐洗浄性を評価した。結果を表3に示した。
合成例4の重合体をダルベッコリン酸緩衝液(Sigma−Aldrich社製、以後D−PBSと略称する)に0.04質量%となるように混合、ボルテックスミキサーで1時間攪拌溶解し、蛋白質吸着抑制剤塗布液とした。塗布液は室温において透明であり、投入した重合体の全量が溶解したものと考えられた。それ以外は、実施例1と同様にして評価を実施した。
<比較例1〜5>
合成例1の重合体の代わりに比較合成例1〜5の化合物を使用した以外は、実施例1と同様にして溶液を調整した。各溶液は室温において透明であり、それぞれ投入した重合体の全量が溶解したものと考えられた。さらに、実施例1と同様にして蛋白質吸着抑制効果および耐洗浄性を評価した。結果を表4に示した。
<比較例6>
合成例1の重合体の代わりに比較合成例6の化合物を使用したが、濁りが生じたため、タンパク質吸着抑制効果、及び耐洗浄性の試験は中止した。
合成例1の重合体の代わりに、アルブミン ウシ血清由来のたんぱく質(BSA)を使用した以外は、実施例1と同様にして蛋白吸着抑制溶液を調整した。さらに、実施例1と同様にして蛋白質吸着抑制効果および耐洗浄性を評価した。結果を表4に示した。
すなわち、各実施例の蛋白質吸着抑制剤は、比較例の蛋白質吸着抑制剤に比べて、「未洗浄時」と「洗浄後」のいずれにおいても、「蛋白質の吸着率」の値が全般的に低かったため、本発明の蛋白質吸着抑制剤が、非特異的蛋白吸着抑制能に優れていることが確認された。
さらに、本発明の蛋白質吸着抑制剤が、優れた耐洗浄性を有することが確認された。すなわち、本発明の各実施例においては、各蛋白質吸着抑制剤の水溶液と基材を接触させて除去した後に、更に洗浄を行った場合についても、未洗浄時との蛋白質の吸着率の差に相当する耐洗浄性(Δ%)の値が小さく、このことは、洗浄されても基材の表面に吸着抑制剤が良く保持されていたことを示す。これに対し、各比較例においては、耐洗浄性(Δ%)の値が大きかったことから、洗浄により吸着抑制剤が基材の表面から脱離し易いことが確認された。とくには実施例4、5、7、および8で示される被覆層を表面に備える基材はより優位に蛋白吸着抑制能力、ならびに耐洗浄を有していた。
なお、参考比較例として結果を表4に示したBSAは、蛋白吸着抑制剤および耐洗浄性に優れていることが知られている。このような参考比較例と比べても、各実施例の蛋白質吸着抑制剤は、吸着抑制効果においてほぼ同等である上に、耐久洗浄性がより高いことが分かる。特に、実施例4、5、7、および8の蛋白質吸着抑制剤は、参考例であるBSAよりも洗浄後の蛋白質吸着抑制能が優れている。以上のように、本発明の蛋白質吸着抑制剤を用いることにより、分析精度の安定性の向上が可能であることが確認された。
12:免疫反応容器の壁面
14:抗原(検体)
16:抗体
18:蛋白質吸着抑制剤
Claims (7)
- 下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、数平均分子量が5,000〜250,000であり、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)を有効成分として含有する、蛋白質吸着抑制剤。
- 請求項1に記載の蛋白質吸着抑制剤と水とを含有する蛋白質吸着抑制剤塗布液。
- 請求項1に記載の蛋白質吸着抑制剤の被覆層を表面に備えた基材。
- 下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、数平均分子量が5,000〜250,000であり、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)により、基材表面に被覆層を形成して前記基材への蛋白質の吸着を抑制する、蛋白質吸着抑制の方法。
- 下記の式(1)で表される繰り返し構成単位[A]を含み、数平均分子量が5,000〜250,000であり、LCSTが25〜45℃である水溶性アクリル重合体(P)を、基材表面に供給し、該基材表面に水溶性アクリル重合体(P)の被覆層を形成させることによる、基材への蛋白質吸着抑制性を付与する方法。
- 前記水溶性アクリル重合体(P)を含む蛋白質吸着抑制剤を、前記水溶性アクリル重合体(P)のLCST以下の温度で前記基材の表面に接触させることをさらに含む、請求項4に記載の蛋白吸着抑制の方法。
- 前記水溶性アクリル重合体(P)を含む蛋白質吸着抑制剤を、前記水溶性アクリル重合体(P)のLCST以下の温度で前記基材の表面に接触させることをさらに含む、請求項5に記載の蛋白質吸着抑制性を付与する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016046829 | 2016-03-10 | ||
JP2016046829 | 2016-03-10 | ||
PCT/JP2017/009405 WO2017155019A1 (ja) | 2016-03-10 | 2017-03-09 | 蛋白質吸着抑制剤および蛋白質吸着抑制の方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017155019A1 true JPWO2017155019A1 (ja) | 2019-01-10 |
JP6803371B2 JP6803371B2 (ja) | 2020-12-23 |
Family
ID=59790614
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018504575A Active JP6803371B2 (ja) | 2016-03-10 | 2017-03-09 | 蛋白質吸着抑制剤および蛋白質吸着抑制の方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6803371B2 (ja) |
WO (1) | WO2017155019A1 (ja) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10153599A (ja) * | 1996-11-22 | 1998-06-09 | Nof Corp | 蛋白質非特異的吸着防止剤およびその用途 |
JP3443891B2 (ja) * | 1993-09-14 | 2003-09-08 | 日本油脂株式会社 | タンパク質吸着防止剤 |
WO2008146631A1 (ja) * | 2007-05-30 | 2008-12-04 | Jsr Corporation | 非特異吸着防止剤 |
JP2011225769A (ja) * | 2010-04-22 | 2011-11-10 | Kawamura Institute Of Chemical Research | 有機無機複合体分散液の製造方法 |
WO2013024815A2 (ja) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | 一般財団法人川村理化学研究所 | ブロック共重合体、および抗血栓コーティング剤 |
JP2013148484A (ja) * | 2012-01-20 | 2013-08-01 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | バイオチップの製造方法及びバイオチップ |
JP2014102194A (ja) * | 2012-11-21 | 2014-06-05 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 高分子物質、および高分子物質で表面が被覆された担体 |
-
2017
- 2017-03-09 WO PCT/JP2017/009405 patent/WO2017155019A1/ja active Application Filing
- 2017-03-09 JP JP2018504575A patent/JP6803371B2/ja active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3443891B2 (ja) * | 1993-09-14 | 2003-09-08 | 日本油脂株式会社 | タンパク質吸着防止剤 |
JPH10153599A (ja) * | 1996-11-22 | 1998-06-09 | Nof Corp | 蛋白質非特異的吸着防止剤およびその用途 |
WO2008146631A1 (ja) * | 2007-05-30 | 2008-12-04 | Jsr Corporation | 非特異吸着防止剤 |
JP2011225769A (ja) * | 2010-04-22 | 2011-11-10 | Kawamura Institute Of Chemical Research | 有機無機複合体分散液の製造方法 |
WO2013024815A2 (ja) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | 一般財団法人川村理化学研究所 | ブロック共重合体、および抗血栓コーティング剤 |
JP2013057058A (ja) * | 2011-08-15 | 2013-03-28 | Kawamura Institute Of Chemical Research | ブロック共重合体 |
JP2013148484A (ja) * | 2012-01-20 | 2013-08-01 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | バイオチップの製造方法及びバイオチップ |
JP2014102194A (ja) * | 2012-11-21 | 2014-06-05 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 高分子物質、および高分子物質で表面が被覆された担体 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KITANO, HIROMI ET AL.: "Temperature-responsive polymer-brush constructed on a grass substrate by atom transfer radical polym", JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, vol. 345, JPN6017014780, 2010, pages 325 - 331, ISSN: 0004324147 * |
YOON, JEONG AE ET AL.: "Comparison of the Thermoresponsive Deswelling Kinetics of Poly(2-(2-methoxyethoxy)ethyl methacrylate", MACROMOLECULES, vol. 43, JPN6017014781, 2010, pages 4791 - 4797, XP055420903, ISSN: 0004324148, DOI: 10.1021/ma1004953 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6803371B2 (ja) | 2020-12-23 |
WO2017155019A1 (ja) | 2017-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5552474B2 (ja) | 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 | |
JP5365623B2 (ja) | 生理活性物質の固定化方法 | |
JP4821444B2 (ja) | バイオアッセイ用高分子化合物およびこれを用いたバイオアッセイ用基材 | |
JP5344148B2 (ja) | 非特異吸着防止剤および物品のコーティング方法 | |
JP4733335B2 (ja) | 再現性良好な凝集イムノアッセイ法及び試薬 | |
Lord et al. | Lysozyme interaction with poly (HEMA)-based hydrogel | |
JP2010117189A (ja) | 生理活性物質固定化用基板 | |
JP6764852B2 (ja) | 蛋白質吸着抑制方法 | |
JP4640150B2 (ja) | バイオチップおよびその使用方法 | |
JP5167811B2 (ja) | 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 | |
JP6803371B2 (ja) | 蛋白質吸着抑制剤および蛋白質吸着抑制の方法 | |
JP2006250667A (ja) | バイオチップ用基板およびバイオチップ | |
JP6299862B2 (ja) | コート剤組成物及びその利用 | |
JP2013228383A (ja) | 検出キットおよび検査方法 | |
JPWO2016039319A1 (ja) | 蛋白質吸着抑制剤及び蛋白質吸着抑制方法 | |
JP4682828B2 (ja) | バイオチップおよびその使用方法 | |
JP5958911B2 (ja) | 糖ペプチドアレイ | |
JP2012032260A (ja) | 糖鎖アレイ | |
JP6965933B2 (ja) | 新規ポリエチレングリコール誘導体および蛋白質吸着抑制剤 | |
JP5364971B2 (ja) | 生理活性物質の固定化方法 | |
JP2017044705A (ja) | 糖鎖アレイ | |
JP2015099162A (ja) | 糖鎖アレイ | |
JP2016114410A (ja) | タンパク質アレイの製造方法及びタンパク質アレイ | |
JP2008128854A (ja) | 生理活性物質の固定化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180702 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191015 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200818 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201012 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201117 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201130 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6803371 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |