JP6764852B2

JP6764852B2 - 蛋白質吸着抑制方法

Info

Publication number: JP6764852B2
Application number: JP2017500726A
Authority: JP
Inventors: 陽一熊田; 恭昂川口; あらんな根本; 史雄中島; 伸行坂元
Original assignee: Kyoto Institute of Technology NUC; NOF Corp
Current assignee: Kyoto Institute of Technology NUC; NOF Corp
Priority date: 2015-02-19
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2020-10-07
Anticipated expiration: 2036-02-18
Also published as: EP3260862A2; US10520486B2; EP3260862A4; WO2016133152A3; US20180031537A1; CN107110841A; WO2016133152A2; EP3260862B1; JPWO2016133152A1; CN107110841B

Description

本発明は、蛋白質の非特異的な吸着の抑制方法に関する。詳しくは、ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液及びホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液を使用する蛋白質吸着抑制方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本特願２０１５−０３１１５５号優先権を請求する。

臨床検査、診断薬の分野において、免疫反応を利用した測定方法が広く行われている。その中で、検査の高感度化が求められており、臨床検査、診断薬の感度向上は大きな課題になっている。高感度化のため、検出方式はペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼといった酵素反応を用いる方法から、蛍光や化学発光を用いる方法へと切り替わりつつある。検出方式を蛍光や化学発光とすることで、理論的には検査対象物質１分子の存在を確認できるといわれているが、実際には目的とする感度を得ることができていない。

免疫反応を利用して測定する際の検出感度を左右する要因の一つとして、測定対象となる抗体、抗原もしくは測定に利用するこれらの標識体の免疫反応容器や固相表面への非特異的吸着が挙げられる。また、検体として血清、血漿、細胞抽出物および尿といった複数種の生体分子が共存する物質を用いた場合、各種蛋白質のような不特定多数の共存物質が免疫反応容器や固相表面へ非特異的に吸着することによるノイズの発生も、高感度化を妨げる要因となっている。

これらの非特異的吸着を防止するために、従来から免疫反応に関与しないウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンといった生物由来の蛋白質を免疫反応容器や固相表面に吸着させることにより蛋白質の非特異的吸着を抑制する方法が用いられている。しかし、ウシ血清アルブミンのような生物由来の蛋白質を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題、ロット間差、保管温度および使用期限などの制限があることから、これらの問題を解決できる化学合成品を主成分とする蛋白質非特異的吸着抑制剤の開発が望まれている。

化学合成品を主成分とする蛋白質非特異的吸着抑制剤として、以下が開示されている。
特許文献１は、「ポリビニルアルコールを含むブロッキング剤」を開示している。特許文献２は、「２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体を含むタンパク質吸着防止剤」を開示している。
これらの方法は、固相表面へ蛋白質非特異的吸着抑制剤として化学合成品を物理吸着させることのみにより効果を発現させている。これらの手法は、ある程度、固相表面への非特異的吸着を回避することは可能だが、まだ十分ではなかった。さらに、本発明の検体処理液を開示又は示唆をしていない。

特開平４−１９５６１号公報特開平７−８３９２３号公報

上記の通り、本発明の目的は、新たな蛋白質の非特異的吸着抑制方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理し、ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理し、次に、処理した検体を処理した固相に添加することで、上記課題を解決できることの知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の工程を含む蛋白質非特異的吸着抑制方法、
（ｉ）ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理する工程、及び
（ｉｉ）ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理し、さらに、該処理した検体を（ｉ）で処理した固相に添加する工程、
又は、
（ｉｉｉ）ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理する工程、及び
（ｉｖ）ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理し、さらに、（ｉｉｉ）で処理した検体を該処理した固相に添加する工程。
２．前記ホスホリルコリン基含有ポリマーと前記ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せは、以下のいずれか１以上である前項１に記載の蛋白質非特異的吸着抑制方法、
（１）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（２）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（３）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びブチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（４）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びブチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（５）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
並びに、
（６）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ。

本発明の蛋白質非特異的吸着抑制方法は、使用した固相処理液及び検体処理液に含まれるポリマーが化学合成品でありながら高い蛋白質非特異的吸着抑制能を有する。したがって、ロット間差や生物汚染などといった問題を抱えながら使用され続けている生物由来の蛋白質非特異的吸着抑制剤の代替品として使用することができる。

本発明の蛋白質非特異的吸着抑制方法（以後、「本発明の方法」と称する場合がある）は、以下の工程を含む。
（ｉ）ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理する工程、及び（ｉｉ）ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理し、さらに、該処理した検体を（ｉ）で処理した固相に添加する工程、又は、
（ｉｉｉ）ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理する工程、及び（ｉｖ）ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理し、さらに、（ｉｉｉ）で処理した検体を該処理した固相に添加する工程。
以下、本発明の方法をさらに詳細に説明する。

本発明の方法は、例えば、蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、脂質、ホルモン等、更に具体的には、各種抗原、抗体、レセプター、酵素等を利用した酵素反応、又は、免疫グロブリンの抗原抗体反応を利用して測定する免疫学的測定法等において使用可能である。
具体的には、公知の放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫法（ＣＬＩＡ）、ラテックス比濁法等、特に好ましくは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫法（ＣＬＩＡ）、ラテックス比濁法、ウェスタンブロッティング等に適用することができる。
これらの公知の免疫学的測定法において、固相表面に抗体あるいは抗原を結合させた後、抗体あるいは抗原が結合していない固相表面を、固相処理液で処理し、一方、検体処理液で検体を処理することにより、蛋白質の非特異的吸着を抑制する。

本発明の「固相」とは、免疫反応を行う場所（反応容器）を意味する。特に、固相表面には、免疫反応に関与する酵素、抗体、抗原、ペプチド等が物理的吸着、化学結合、生物学的結合等により固定することができる。
固相の材質は特に限定されるものではないが、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ガラス、金属、セラミック、シリコンラバー、ポリフッ化ビニリデン膜（以下ＰＶＤＦ膜）、ナイロン膜、ニトロセルロース膜等を挙げることができる。それらの中でも、ポリスチレンとポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートが好ましく、特にポリスチレンが好ましい。また、これら材質の形状は、特に限定されるものではないが、試験管、タイタープレート、ラテックス、磁性微粒子等を挙げることができる。
本発明の「検体」とは、全血、血清、血漿、細胞抽出物、涙液、唾液、尿、糞便等といった複数種の生体分子が共存する試料を意味するが、特に限定されない。

本発明の「固相処理液」とは、少なくとも、ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分として、固相を処理するため（特に、固相処理液を固相表面に接触させるため）の溶液である。本発明の固相処理液は、ホスホリルコリン基含有ポリマーを有すれば、特に、限定されないが、例えば以下のようなポリマーを１以上含有する。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ：ホスホリルコリン基含有
ポリマー）
ＭＰＣとブチルメタクリレート（ＢＭＡ：疎水基を持つポリマー）とグリセロールメタクリレート（Ｇｒ：水酸基を持つポリマー）の共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ）
ＭＰＣとＢＭＡとヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＭＡ：水酸基を持つポリマー）の共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ）
ＭＰＣとＧｒの共重合体（ＭＰＣ−Ｇｒ）
ＭＰＣとＨＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＨＭＡ）
ＭＰＣとＢＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ）
ＭＰＣとステアリルメタクリレート（ＳＭＡ：疎水基を持つポリマー）の共重合体（ＭＰＣ−ＳＭＡ）
ＭＰＣとラウリルメタクリレート（ＬＭＡ：疎水基を持つポリマー）の共重合体（ＭＰＣ−ＬＭＡ）
上記のホスホリルコリン基含有ポリマー中のＭＰＣの組成比（モル比）は、特に限定されないが、１〜１００％、好ましくは５〜１００％、より好ましくは２０〜８０％である。
本発明の固相処理液の溶媒としては、免疫学的測定方法に使用することができる緩衝液や純水であれば全て用いることができる。例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、生理食塩水等を用いることができるが、特に限定されない。
加えて、本発明の固相処理液の濃度は、０．０１２５〜５．０重量％（全ポリマーの重量で換算）であるのが好ましく、より好ましくは０．１〜０．５重量％である。

本発明の「検体処理液」とは、少なくとも、ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分として、検体を処理するための溶液である。検体を処理するとは、検体処理液で検体を希釈する、検体を検体処理液に添加する、検体処理液を検体に添加する等を意味する。
本発明の検体処理液は、ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを有すれば、特に、限定されないが、例えば以下のようなポリマーを１以上含有する。
ＭＰＣとＢＭＡとＧｒの共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ）
ＭＰＣとＢＭＡとＨＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ）
ＭＰＣとＢＭＡとヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭ：水酸基を持つポリマー）の共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ）
ＭＰＣとＳＭＡとＧｒの共重合体（ＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ）
ＭＰＣとＳＭＡとＨＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ）
ＭＰＣとＳＭＡとＨＰＭの共重合体（ＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ）
ＭＰＣとＬＭＡとＧｒの共重合体（ＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ）
ＭＰＣとＬＭＡとＨＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ）
ＭＰＣとＬＭＡとＨＰＭの共重合体（ＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ）
上記のホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー中のＭＰＣの組成比（モル比）は、特に限定されないが、１〜９５％、好ましくは５〜８０％、より好ましくは１０〜６０％である。
本発明の検体処理液の溶媒としては、免疫学的測定方法に使用することができる緩衝液や純水であれば全て用いることができる。例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、生理食塩水等を用いることができるが、特に限定されない。
加えて、本発明の検体処理液の濃度は、０．０１２５〜５．０重量％（全ポリマーの重量で換算）であるのが好ましく、より好ましくは０．１〜０．５重量％である。

本発明の方法は、初めに、ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液を固相表面｛免疫測定法用樹脂容器（タイタープレート等）｝に添加する。より詳細には、固相処理液は、固相表面に抗体又は抗原を結合させた後に、該固相に添加する。一方、ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を希釈し、該検体を処理した固相表面に添加する。より詳細には、検体処理液は、測定中に添加する試薬又は検体に添加しても良い。具体的には、検体処理液は、検出物質が含まれる血清、又は標識抗体若しくは標識抗原を含む試薬、又は、これら全てに添加して、混合する。さらに、検体である血清中の検出物質の固相への吸着が問題とならない場合においても、標識抗体又は標識抗原を添加する際に、検体処理液を混合しても良い。これらの操作により、検体中に含まれる目的以外の蛋白質（検出物質以外の蛋白質）の非特異的吸着を抑制できる

固相処理液の主成分であるホスホリルコリン基含有ポリマーと検体処理液の主成分であるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組み合わせとしては、具体的に以下のものを挙げることができるが、特に限定されない（左側のポリマーはホスホリルコリン基含有ポリマーであり、右側のポリマーはホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを示す）。
ＭＰＣとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧｒとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＧｒとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＨＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＢＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＢＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＢＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
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ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＳＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＳＭＡ−ＨＰＭ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−Ｇｒ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＭＡ
ＭＰＣ−ＬＭＡとＭＰＣ−ＬＭＡ−ＨＰＭ
上記の固相処理液の主成分であるホスホリルコリン基含有ポリマー中のＭＰＣの組成比（モル比）は、特に限定されないが、１〜１００％、好ましくは５〜１００％、より好ましくは２０〜８０％である。ＭＰＣ以外の共重合成分の組成比は、特に限定されないが、９９〜０％、好ましくは９５〜０％、より好ましくは８０〜２０％である。
また、上記の検体処理液の主成分であるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー中のＭＰＣの組成比（モル比）は、特に限定されないが、１〜９５％、好ましくは５〜８０％、より好ましくは１０〜６０％である。ＭＰＣ以外の共重合成分の組成比は、特に限定されないが、９９〜５％、好ましくは９５〜２０％、より好ましくは９０〜４０％である。

固相処理液の主成分であるホスホリルコリン基含有ポリマーと検体処理液の主成分であるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーのより好ましい組み合わせとしては、具体的に以下のものを挙げることができるが、特に限定されない。
構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー、
構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー、
構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びブチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー、
構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びブチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー、
構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー、
構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー

上記の固相処理液の主成分であるホスホリルコリン基含有ポリマーと検体処理液の主成分であるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーのより好ましい組み合わせにおいて、固相処理液の主成分であるホスホリルコリン基含有ポリマー中のＭＰＣの組成比（モル比）は、特に限定されないが、１〜９９％、好ましくは５〜９９％、より好ましくは２０〜８０％である。ＭＰＣ以外の共重合成分の組成比は、特に限定されないが、９９〜１％、好ましくは９５〜１％、より好ましくは８０〜２０％である。
また、上記の固相処理液の主成分であるホスホリルコリン基含有ポリマーと検体処理液の主成分であるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーのより好ましい組み合わせにおいて、検体処理液の主成分であるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマー中のＭＰＣの組成比（モル比）は、特に限定されないが、１〜９５％、好ましくは５〜８０％、より好ましくは１０〜６０％である。ＭＰＣ以外の共重合成分の組成比は、特に限定されないが、９９〜５％、好ましくは９５〜２０％、より好ましくは９０〜４０％である。

本発明の方法は、より具体的には、例えば、各種免疫学的測定法で使用する固相表面に、酵素や抗体といった蛋白質あるいは抗原を結合させた後に、固相処理液で該固相表面を処理すれば良い。固相処理液で処理される固相表面として、例えば、ポリスチレン製プレートを使用する場合には、該プレートに蛋白質を物理吸着または化学結合させ、洗浄した後に、固相処理液を該固相に添加することによって、蛋白質非特異的吸着抑制効果を持つ固相表面を得ることができる。
さらに、蛋白質非特異的吸着抑制効果を持つ固相表面を用いて測定をおこなう際に、検体処理液での処理は、目的物質（検出物質）の含まれる血清、標識抗体または標識抗原、又はこれら全てと混合すれば良い。混合方法は、特に限定されるものではないが、具体的には、検体処理液を、目的物質の含まれる血清、あるいは標識抗体または標識抗原を含む溶液に添加して、撹拌すれば良い。なお、検体処理液は、添加前に、自体公知の溶媒で希釈しても良い。

以下の実施例および比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例の範囲に限定されない。

（共重合体の合成）
本実施例で使用する高分子化合物及び比較例で使用する高分子化合物を合成した。具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とグリセロールメタクリレート（Ｇｒ）の共重合体（ＭＰＣ−Ｇｒ）、ＭＰＣとＧｒとブチルメタクリレート（ＢＭＡ）の共重合（ＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ）、ＭＰＣとＢＭＡとヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＭＡ）の共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ）、ＭＰＣとＨＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＨＭＡ）、及びＭＰＣとＢＭＡの共重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ）を合成した。

詳しくは、以下の７種類の重合体１〜６を合成した。
重合体１：ＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ共重合体Ａ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／Ｇｒ＝４０／２０／４０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／疎水基を持つポリマー／水酸基を持つポリマー）重量平均分子量１００ｋＤａ
重合体２：ＭＰＣ−ＢＭＡ−Ｇｒ共重合体Ｂ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／Ｇｒ＝４０／４０／２０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／疎水基を持つポリマー／水酸基を持つポリマー）重量平均分子量１００ｋＤａ
重合体３：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＨＭＡ共重合体
（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＨＭＡ＝２０／２０／６０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／疎水基を持つポリマー／水酸基を持つポリマー）重量平均分子量１０００ｋＤａ
重合体４：ＭＰＣ−Ｇｒ共重合体（ＭＰＣ／Ｇｒ＝５０／５０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／水酸基を持つポリマー）重量平均分子量３００ｋＤａ
重合体５：ＭＰＣ−ＨＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＨＭＡ＝７０／３０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／水酸基を持つポリマー）重量平均分子量５００ｋＤａ
重合体６：ＭＰＣ−ＢＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８０／２０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／疎水基を持つポリマー）重量平均分子量６００ｋＤａ
重合体７：ＭＰＣ−ＢＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＢＭＡ＝３０／７０＝ホスホリルコリン基含有ポリマー／疎水基を持つポリマー）重量平均分子量１００ｋＤａ
（括弧内には各重合体の仕込み組成におけるモル比、及び、各基を持つポリマーが示されている。）

各重合体のモノマーを重合容器に秤量した。反応溶媒としては、エタノールと水との混合溶媒を用い、総モノマー濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。そして、秤量したモノマーに、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加した。重合開始剤の濃度は１ｍｏｌ％とした。
次に、重合容器内を十分に窒素置換した後に、重合容器を６０℃で２４時間保持することにより重合反応を行った。そして、得られた反応混合物を氷冷した後、ジエチルエーテルに滴下することによりポリマーを沈殿させた。沈殿したポリマーを濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後に、減圧乾燥させた。これにより、白色粉末状の各重合体が得られた。得られた各重合体は、純水に溶解させ、５重量％の水溶液として保存した。
得られた各重合体の元素分析を行ったところ、仕込み組成どおりの共重合体が得られていることを確認した。

（蛋白質非特異的吸着抑制能測定方法）
合成した重合体１〜７および部分けん化ポリビニルアルコール（ＰＶＡ２０５クラレ（株）製）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をそれぞれダルベッコリン酸緩衝液（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製、以下Ｄ−ＰＢＳとする）に１重量％となるように溶解して、各重合体を含む固相処理液及びコントロールであるＢＳＡ溶液、Ｄ−ＰＢＳ溶液を作成した。
次に、１重量％に調製した各重合体を含む固相処理液、ＢＳＡ溶液又はＤ−ＰＢＳ溶液を、ポリカーボネート製９６ウェルプレートに分注（３００μＬ／ｗｅｌｌ）し、２５℃で３時間インキュベートした。さらに、インキュベート３時間後にアスピレーターで溶液を完全に除去し、Ｄ−ＰＢＳを３００μＬ／ｗｅｌｌでの分注、除去を繰り返し、５回洗浄した。
擬似血清溶液として、ヒト血清アルブミン５０ｍｇ／ｍＬ、ＨｕｍａｎＩｇＧ（ヒト免疫グロブリンＧ）を１０ｍｇ／ｍＬを含むＤ−ＰＢＳ擬似血清溶液を調製した。
合成した重合体１〜７および部分けん化ポリビニルアルコール、ＢＳＡの溶液もしくはＤ−ＰＢＳをそれぞれ終濃度１％含む、１０％擬似血清溶液（検体処理液、コントロールである重合体４、重合体５、ＢＳＡ溶液、又はＤ−ＰＢＳ溶液を含む）を調製した。
各検体処理液を含む１０％擬似血清溶液、コントロールである重合体４を含む１０％擬似血清溶液、コントロールである重合体５を含む１０％擬似血清溶液、コントロールであるＢＳＡ溶液を含む１０％擬似血清溶液、又は、コントロールであるＤ−ＰＢＳ溶液を含む１０％擬似血清溶液をポリカーボネート製９６ウェルプレートに分注（３００μＬ／ｗｅｌｌ）し、２５℃で１時間インキュベートした。１時間後に、アスピレーターで溶液を完全に除去し、Ｄ−ＰＢＳを分注（３００μＬ／ｗｅｌｌ）、除去を繰り返し、５回洗浄した。
５０００倍希釈したＰＯＤ−抗ヒトＩｇＧ抗体（ペルオキシターゼ標識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を分注（１００μＬ／ｗｅｌｌ）し、２５℃で１時間インキュベートした。１時間後にアスピレーターで溶液を完全に除去し、Ｄ−ＰＢＳを３００μＬ／ｗｅｌｌで分注、除去を繰り返し、５回洗浄した。洗浄後に、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＯＳＳ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で１５分間反応させた。発色反応は０．３ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液を分注（１００μＬ／ｗｅｌｌ）することで停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定し、吸着した蛋白質を検出した。
なお、使用した固相、固相処理液及び検体処理液の組合せは、以下の通りであった。
〔実施例１−１〕
固相に未処理のポリカーボネートを使用し、表１に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔実施例１−２〕
固相に未処理のポリスチレンを使用し、表２に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔実施例１−３〕
固相に未処理のポリメチルメタクリレートを使用し、表３に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔実施例１−４〕
固相にＭａｘｉｓｏｒｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、表４に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔比較例１−１〕
固相に未処理のポリカーボネートを使用し、表１に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔比較例１−２〕
固相に未処理のポリスチレンを使用し、表２に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔比較例１−３〕
固相に未処理のポリメチルメタクリレートを使用し、表３に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。
〔比較例１−４〕
固相にＭａｘｉｓｏｒｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、表４に示す組み合わせで蛋白質吸着抑制能を測定した。

実施例１−１、１−２、１−３、１−４及び比較例１−１、１−２、１−３、１−４の蛋白質非特異的吸着抑制能の測定結果を下記表１〜表４に示す。

上記表１〜表４の蛋白質非特異的吸着抑制能の測定結果より、ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液及びホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液を使用する本発明の蛋白質非特異的吸着抑制方法は、使用した固相処理液及び検体処理液に含まれるポリマーが化学合成品でありながら高い蛋白質非特異的吸着抑制能を有することを確認した。
なお、比較例１−１−３、１−２−３、１−３−２、１−３−３、１−４−２及び１−４−３の蛋白質非特異的吸着抑制能が低いのは、検体処理液に疎水基を持つポリマーが含有していないからである。

本発明は、新規な蛋白質非特異的吸着抑制方法を提供することができる。

Claims

以下の工程を含む蛋白質非特異的吸着抑制方法、
（ｉ）ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理する工程、及び
（ｉｉ）ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理し、さらに、該処理した検体を（ｉ）で処理した固相に添加する工程、
又は、
（ｉｉｉ）ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーを主成分とする検体処理液で検体を処理する工程、及び
（ｉｖ）ホスホリルコリン基含有ポリマーを主成分とする固相処理液で固相を処理し、さらに、（ｉｉｉ）で処理した検体を該処理した固相に添加する工程、
ここで、該ホスホリルコリン基含有ポリマーと該ホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せは、以下のいずれか１以上であり、
（１）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（２）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（３）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びブチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（４）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びブチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
（５）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びグリセロールメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
並びに、
（６）構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基含有ポリマーと構成単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートであるホスホリルコリン基と水酸基と疎水性基を合わせ持つポリマーの組合せ、
であることを特徴とする蛋白質非特異的吸着抑制方法。