WO2019049734A1

WO2019049734A1 - 新規ポリエチレングリコール誘導体および蛋白質吸着抑制剤

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Publication number: WO2019049734A1
Application number: PCT/JP2018/031801
Authority: WO
Inventors: 茜鹿取; 将松田; 朋澄野田; 佐々木　崇; 裕貴鈴木; 伸行坂元
Original assignee: 日油株式会社
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2019-03-14
Also published as: KR20200051761A; US20200271642A1; EP3683252A4; US11442062B2; CN111094391B; KR102479863B1; EP3683252A1; EP3683252B1; JPWO2019049734A1; JP6965933B2; CN111094391A

Abstract

免疫反応容器等の基材表面に効果的に吸着し、蛋白質等の非特異的吸着を防止する蛋白質吸着抑制効果が極めて高く、かつ、基材の洗浄操作前後で該効果が変化しない耐洗浄性に優れた化合物を提供する。また、当該化合物を用いた蛋白質吸着抑制剤、ホスホリルコリン修飾基材、及び蛋白質吸着抑制方法を提供する。この化合物は式（１）で示されるホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体である。本発明の蛋白質吸着抑制方法は、基材表面に該誘導体の吸着層を形成する工程を有する。

Description

新規ポリエチレングリコール誘導体および蛋白質吸着抑制剤

　本発明は、天然または合成の材料（基材）の表面処理、および蛋白質の表面処理に応用し得る新規化合物、特に、基材等への蛋白質の非特異吸着を抑制するための表面処理剤（蛋白質吸着抑制剤）として適用可能な新規化合物に関する。さらに、該化合物を蛋白質吸着抑制剤として用いた表面修飾材に関する。

　具体的には、免疫反応を利用した測定において、標識抗体もしくは抗原または検体中の蛋白質の、使用基材の表面への非特異吸着を防止する、新規なホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体、および該誘導体で表面被覆されたホスホリルコリン修飾基材に関する。さらに、該誘導体を蛋白質吸着抑制剤として使用する、基材への蛋白質吸着を抑制する方法に関する。

　従来、ホスホリルコリン基を有する化合物で各種材料表面を処理することにより、ホスホリルコリン基に起因する、生体適合性、抗血栓性、表面親水性等を付与しうる表面処理剤が広く提案されている。その用途としては、蛋白質を親水化するための蛋白質表面処理、工業用フィルター表面の防汚処理、医療用高分子材料に対する蛋白質や血球の吸着抑制のための表面処理が挙げられる。特に近年では、臨床検査、診断薬の分野において、免疫反応を利用した測定系で、ホスホリルコリン基含有化合物を成分とする蛋白質吸着抑制剤が利用されている。微量の生体成分を検出する測定法では、ホスホリルコリン基含有化合物を含む蛋白質吸着抑制剤の添加は、測定対象となる抗体あるいは抗原の免疫反応容器等の基材表面への非特異吸着を防止する点で重要であることが知られている。

　特許文献１は、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体の基材表面に対する蛋白質吸着抑制効果を開示している。特許文献１の発明は、強い蛋白質吸着防止能を有する該重合体を使用し、種々の生体関連物質の分析において、高精度で目的物質の分析を可能とすることを特徴としている。

　特許文献２および３は、化学反応によって基材表面と結合可能なアミノ基を有するホスホリルコリン化合物や新規ポリマーを開示している。特許文献２の発明は、発明に係る化合物が反応性の高いアミノ基を有するために基材表面を該化合物で修飾でき、該化合物の機能を基材に付与し得ることを特徴としている。特許文献３の発明は、上記新規ポリマーが基材表面に強固に結合するため、非特異的吸着を防止するためのブロッキング効果が高く、微量な生体成分を十分な感度で測定できることを特徴としている。

特開平０７－０８３９２３号国際公開２０１２／０８６７６２号特開２０１５－１１７２６９号

　しかしながら、特許文献１の開示の方法では、複数回の洗浄により、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体が基材から剥がれ、洗浄後の蛋白質吸着抑制効果が低下する可能性があるという問題がある。特許文献２で示される化合物は、アミノ基とホスホリルコリン基がエチル基で連結しているために、蛋白質吸着抑制効果の点では十分ではないという問題がある。また、特許文献３で示される化合物はポリマーであり、分子量が高く、抗体または抗原との立体反発により、蛋白質吸着抑制剤の結合率が高くなりにくく、蛋白質吸着抑制効果が十分ではない場合もあるという問題がある。特に、高感度測定を目的とする磁性微粒子への蛋白質吸着抑制は、従来技術では困難であった。

　そこで、本発明の課題は、免疫反応容器等の基材表面に効果的に吸着し、蛋白質等の非特異的吸着を防止する蛋白質吸着抑制効果が極めて高く、かつ、基材の洗浄操作前後で該効果が変化しない耐洗浄性に優れた化合物、および該化合物を用いた蛋白質吸着抑制剤を提供することにある。

　本発明の他の課題は、上記化合物を基材表面に吸着させてなるホスホリルコリン修飾基材を提供することにある。

　本発明の更なる課題は、上記化合物を用いて基材への蛋白質の吸着を抑制する効果的な方法を提供することにある。

　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、末端にアミノ基とホスホリルコリン基を有するポリエチレングリコール誘導体が、免疫反応容器等の基材表面への吸着特性が高く、且つ耐洗浄性に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明によれば、式（１）で示されるホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体が提供される。

　式（１）中、ｍは１～１０、ｎは２０～２００の整数である。

　本発明の別の観点の発明によれば、上記ホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を有効成分として含有する蛋白質吸着抑制剤が提供される。

　また別の観点の発明によれば、上記ホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を０．０１～２０質量％含有する、蛋白質吸着抑制剤溶液が提供される。

　さらに別の観点の発明によれば、基材と上記ホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体とからなり、該誘導体が基材表面に吸着している、ホスホリルコリン修飾基材が提供される。

　さらに別の観点の発明によれば、基材表面を上記蛋白質吸着抑制剤溶液で処理し、上記ホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体の吸着層を形成する工程を有する、基材への蛋白質吸着抑制方法が提供される。

　本発明のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体は、自身が免疫反応容器等の基材表面に効果的に吸着することにより、基材表面への蛋白質の非特異的吸着を高度に抑制できる。すなわち、高い蛋白質吸着抑制能を発揮する。さらに、基材への吸着力が強いので、洗浄に対して高い耐久性を有し、洗浄による基材からの脱離が極めて少ない。すなわち、耐洗浄性が極めて高いので、測定ごとに洗浄を繰り返しても、蛋白質吸着抑制能を高度に維持できる。

　本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液で基材表面を処理することにより、本発明のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を基材表面に強固に吸着させることができる。

　本発明のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を基材表面に吸着させて得られる本発明のホスホリルコリン修飾基材は、蛋白質吸着抑制能が高く、かつ耐洗浄性に優れるので、蛋白質吸着抑制能を高いレベルで維持できる。

　本発明の基材への蛋白質吸着抑制方法は、本発明のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を基材表面に強固に吸着させることができるので、蛋白質の非特異的吸着を高度に抑制することができる。

　本発明のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体は下記式（１）で示される。以後、式（１）で示される化合物を単に本発明の誘導体と称することもある。本発明の誘導体は、分子内にポリエチレングリコール部とホスホリルコリン基部を有し、免疫反応容器や測定器具等の各種基材の表面に強固に吸着し得るという特徴を備える。

　式（１）中、ｍは１～１０の整数であり、２～５が好ましい。ｎは式（１）の分子量等から算出される「－Ｏ－ＣＨ₂ＣＨ₂－」ユニット数を表し、２０～２００の整数である。ｎの数は２０～１００が好ましく、２０～５０がより好ましく、４０～５０が特に好ましい。ｎおよびｍの値がこの範囲であれば、免疫反応容器等の基材表面に効果的に吸着して、蛋白質の非特異的吸着を高度に抑制することができるからである。なお、式（１）で示される化合物は、ｍまたはｎの値等が異なる２種以上の化合物の混合物の状態で、後述する蛋白質吸着抑制剤や蛋白質吸着抑制剤溶液に使用することもできる。

　本発明の誘導体はアミン塩の構造であってもよい。すなわち、ポリエチレングリコール側末端のアミンが各種酸により各種塩を形成しているものであってもよい。塩の具体例としては、例えば、塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、臭酸塩、メタンスルホン酸塩等が挙げられる。

　次に、本発明の誘導体の製造方法の一実施形態について説明する。本発明の誘導体は、下記式（２）で示される化合物（α－アミノアルキル－ω－メルカプトエトキシ－ポリオキシエチレン）またはそのアミン塩と、下記式（３）で示される２－メタクリロイルオキシエチル－２－トリメチルアンモニオエチルホスフェート（以後、ＭＰＣと略す場合がある）とを、例えば、アルコール系溶媒中、ジイソプロピルアミン等のアミン触媒を用いて、反応させることにより製造することができる。以後、式（２）の化合物と称した場合は、そのアミン塩も含むものとする。該アミン塩を形成する酸としては、上記本発明の誘導体のアミン塩を形成する酸として例示したものを挙げることができる。

　式（２）中、ｍは１～１０、ｎは２０～２００の整数である。

　式（２）の化合物と式（３）の化合物との反応において、その反応割合は、式（３）の化合物１モルに対して、式（２）の化合物０．６～１．５モルが好ましい。０．６モル未満の場合、本発明の誘導体の製造収率が低くなるおそれがある。また、１．５モルを超える場合、式（３）のＭＰＣの分解反応が起きたり、式（２）の化合物のアミノ基が二重結合にマイケル付加反応したりする副反応のおそれがあり、やはり本発明の誘導体の製造収率が低くなる可能性がある。

　本発明の誘導体の製造における溶媒としては、式（２）および（３）の化合物を溶解し、これらの化合物と反応しない溶媒であれば特に制限はない。具体的には、上記のアルコール系溶媒の他、ケトン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、および含窒素系溶媒等を使用できる。アルコール系溶媒としてはメタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール等；ケトン系溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン等；エステル系溶媒としては酢酸エチル、酢酸ブチル等；エーテル系溶媒としてはテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等；含窒素系溶媒としてはアセトニトリル、ニトロメタン、Ｎ－メチルピロリドン等を挙げることができる。特にアルコール系溶媒が好ましい。

　溶媒の使用量としては、式（２）および（３）の化合物等の原料を溶解できる量であれば特に制限はなく、反応温度等他の条件も考慮して、本発明の誘導体の製造に好適な量とすればよい。

　式（２）および（３）の化合物を反応させる触媒としては有機塩基または無機塩基が使用できる。特に、溶媒に対する溶解性や反応性の観点から触媒はアミン化合物が好ましい。具体的には、一級アミンとしてメチルアミン、二級アミンとしてジイソプロピルアミン、三級アミンとしてトリエチルアミン等が挙げられ、特に、二級アミン、三級アミンが好ましい。触媒量としては、式（２）の化合物またはその塩１００モル％に対して５～２０モル％が好ましい。５モル％未満では反応速度が極端に遅くなるおそれがある。２０モル％を超えると、式（３）の化合物（ＭＰＣ）のエステル部の分解が生じるおそれがある。

　式（２）および（３）の化合物の反応における反応温度としては１０～６０℃が好ましい。１０℃未満の場合は、反応速度が非常に遅くなる可能性がある。６０℃を超える場合は、ＭＰＣのエステル分解反応が進行したり、式（２）の化合物のアミノ基が二重結合にマイケル付加反応したりする副反応のおそれがあり、本発明の誘導体の製造収率が低くなる可能性がある。

　式（２）および（３）の化合物の反応における反応時間としては、触媒および反応温度にもよるが、６～９６時間が好ましい。反応時間が６時間未満の場合、反応が終点に到達しない可能性がある。反応時間が９６時間を超えると反応生成物である本発明の誘導体が酸化を受け劣化するおそれがある。

　また、式（２）および（３）の化合物の反応において、反応容器内を窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気とすることが好ましい。ジスルフィド化合物の副生を防止することができるからである。

　続いて、本発明の蛋白質吸着抑制剤について説明する。本発明の蛋白質吸着抑制剤は、本発明の誘導体を有効成分として含有する。本発明の蛋白質吸着抑制剤中の、本発明の誘導体の含有量は５０～１００質量％が好ましい。効果的な蛋白質吸着抑制能を発現できるからである。本発明の蛋白質吸着抑制剤中に含有し得る、本発明の誘導体以外の物質としては、本分野で通常用いられる試薬類を挙げることができる。なお、本発明の蛋白質吸着抑制剤は本発明の誘導体を２種以上含有していてもよい。この場合、２種以上の誘導体の合計の含有量を上記範囲内に調整することが好ましい。

　本発明の蛋白質吸着抑制剤は、本発明の誘導体を有効成分として５０～１００質量％含有しているので、次のような用途に使用でき、優れた効果を発揮する。

　本発明の誘導体は、蛋白質吸着抑制剤以外として、例えば、コンタクトレンズやカテーテル、ガイドワイヤー等の各種医療機器基材の表面処理、マイクロ流路等の理化学機器の表面処理に利用することができる。

　特に、本発明の蛋白質吸着抑制剤は、例えば、蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、脂質、ホルモン等の存在下における、各種抗原、抗体、レセプター、酵素等を利用した、酵素反応、あるいは抗原抗体反応を利用して測定する免疫学的測定等において使用可能である。より具体的には、公知の放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス比濁法、ウエスタンブロッティング等に適応することができる。これらの免疫学的測定法において、例えば、免疫反応容器等の基材表面に抗体あるいは抗原を結合させた後、抗体あるいは抗原が結合していない基材表面部分を、本発明の蛋白質吸着抑制剤で処理することによって、本発明の誘導体が基材表面に強固に吸着されて蛋白質の吸着を抑制する。

　次に、本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液について説明する。本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液は、溶媒中に本発明の誘導体が０．０１～２０質量％溶解している溶液である。本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液中の本発明の誘導体濃度は、０．１質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上がさらに好ましい。また、１０質量％以下が好ましく、５．０質量％以下がより好ましい。この範囲であれば、基材表面を本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液で処理したときに、本発明の誘導体が基材表面に効果的に吸着されて、良好な蛋白質吸着抑制能が基材に付与される。なお、本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液は本発明の誘導体を２種以上含有していてもよい。この場合、２種以上の誘導体の合計の濃度を上記範囲内に調整することが好ましい。

　本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液は、本発明の誘導体または本発明の蛋白質吸着抑制剤を溶媒もしくは緩衝液等に溶解させることによって得られる。溶媒としては、精製水、純水、イオン交換水、もしくはメタノール、エタノール、２－プロパノールのアルコール等、有機溶媒を使用することができる。溶媒としては、水、エタノールが好ましく、より好ましくは水である。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、生理食塩水等、免疫学的測定法に使用することができる緩衝液であればすべて用いることができる。

　本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液は、本発明の誘導体以外に、反応性向上や溶液安定性を目的として本分野で通常用いられる試薬等の化合物を含有してもよい。具体的には、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸、および、アミノ酸塩、グリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩等の無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸および有機酸の塩等が挙げられる。

　本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液中の、本発明の誘導体以外のこれら化合物の含有量は、該溶液の使用目的を考慮し、本発明の誘導体による蛋白質吸着抑制作用を阻害しない範囲で適宜設定すればよい。

　続いて、本発明の誘導体を基材表面に吸着させてなるホスホリルコリン修飾基材について説明する。本発明に用いる基材としては、その材質は特に限定されるものではないが、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート、ガラス、金属、セラミック、シリコンラバー、ポリフッ化ビニリデン（以後、ＰＶＤＦと略称する）、ポリウレタン、ナイロン、ニトロセルロース、蛋白質、ポリペプチド、多糖類等を挙げることができる。それらの中でも、ポリスチレンとＰＶＤＦが好ましく、特にポリスチレンが好ましい。

　本発明の誘導体は磁性微粒子への蛋白質吸着抑制にも有用である。すなわち、本発明のホスホリルコリン修飾基材の基材は磁性微粒子であってもよい。磁性微粒子は磁気誘導により磁化され得る材料を含むものであれば特に制限されない。このような材料としては、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル等の金属や、コバルト、ニッケル、マンガン等の合金等が挙げられる。本発明の効果がより発揮される等の点から、磁性微粒子は表面にポリマー（樹脂）層、極性基、またはリガンドを有する粒子であることが好ましく、水系媒体中において安定な不溶性の粒子であることが好ましい。極性基を有する磁性微粒子としては特に制限されないが、例えば、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、トシル基、メルカプト基、およびエポキシ基等からなる群より選ばれる少なくとも１つの極性基を有する磁性微粒子であることがより好ましい。

　また、基材の形状としては特に限定されるものではないが、具体的には、膜（フィルム）状、プレート状、粒子状、多孔状、ゲル状、さらには、試験管形状、バイアル瓶形状、チューブ形状、およびフラスコ形状等を例示することができる。

　本発明の誘導体が基材に吸着して吸着層を形成する機構としては、次のように説明することができる。本発明の誘導体は、基材表面に存在する反応性官能基と化学反応することによってその表面に吸着し吸着層を形成してよい。具体的には、本発明の誘導体のアミノ基と、基材表面のカルボキシル基、エポキシ基、ビニル基、イソシアネート基等の反応性官能基とが反応して結合することにより本発明の誘導体が基材表面に吸着し得る。従って、基材表面には、これらの官能基の存在があると良い。

　基材表面にこのような官能基が存在しない場合、例えば、基材表面にアミノ基、水酸基等のアミノ基とは反応しない官能基のみしか存在しない場合には、例えば、ジイソシアネート、ジカルボン酸、ジエポキシ等の多官能性試薬を用いて、アミノ基と反応し得る官能基を基材表面に導入することが可能である。このような反応性官能基の基材表面への導入方法は特に制限はなく、基材の種類、その表面性質、および反応性官能基の所望導入量により、公知の条件から適宜選択して行うことができる。

　さらに、基材表面が疎水基のみである場合には本発明の誘導体をアルブミンや疎水性化合物と事前に反応させた後、それを溶液あるいは分散体として添加することで基材表面に物理吸着させることもできる。

　本発明の誘導体と結合し得る官能基を有する基材表面上に、該誘導体の吸着層を形成する具体的操作方法としては、例えば、次のような方法を挙げることができる。すなわち、本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液中に、基材を浸漬した後、室温または加温により十分に乾燥させることによって、本発明の誘導体が基材表面に結合により吸着した吸着層を形成させる。

　次に、本発明の誘導体を含有する本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液を用いた、免疫反応容器等の基材への蛋白質の吸着を抑制する方法の一実施形態について説明する。本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液中に、基材を浸漬し、基材表面に本発明の誘導体を反応により結合させて該誘導体の吸着層を形成できる。浸漬温度としては４～３７℃、浸漬時間としては４℃の場合、１２時間以上、４℃超２５℃未満の場合、１～１２時間、および２５～３７℃の場合、０．５～２時間が好ましい。本発明の蛋白質吸着抑制方法で使用する基材の例としては、上記ホスホリルコリン修飾基材に用いられる基材と同様のものが挙げられる。

　浸漬終了後、基材を本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液から取り出し、室温または加温により十分に乾燥させて、本発明の誘導体の吸着層が形成されたホスホリルコリン修飾基材を調製する。当該ホスホリルコリン修飾基材を、免疫反応を利用した測定に使用することにより、抗体もしくは抗原、または検体中の蛋白質が基材へ非特異的に吸着することを抑制する。なお、該乾燥前に、基材を水で洗浄してもよい。洗浄水としては、イオン交換水、精製水、純水等を使用することができる。また、室温または加温による乾燥は必須ではなく、乾燥工程を入れずに目的の測定を行ってもよい。

　本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液による基材への蛋白質の吸着を抑制する方法として、上記浸漬法を例示したが、当該抑制方法としては、該蛋白質吸着抑制剤溶液を基材表面に接触させることができれば、どの様な方法を用いてもよい。例えば、基材が容器等であれば、該容器中を当該蛋白質吸着抑制剤溶液で満たす方法を用いてもよい。

　本発明の蛋白質吸着抑制方法としては、上記したように、基材の表面に本発明の誘導体の吸着層を形成させることにより、各種測定時における基材への蛋白質の吸着を抑制する方法が、一つの実施形態である。すなわち、本発明の誘導体が、免疫反応容器や測定器具等の基材表面を吸着層として被覆することにより、蛋白質等の基材表面への接近を防止し、その吸着を抑制するものである。

　本発明の蛋白質吸着抑制方法の別の実施形態としては、免疫反応等の各種測定において使用する試薬に本発明の蛋白質吸着抑制剤を添加する方法が挙げられる。つまり、各種測定の一工程として、基材表面上に本発明の誘導体の吸着層を形成することにより、基材への蛋白質の吸着を抑制する方法である。当該方法において、本発明の蛋白質吸着抑制剤は、測定対象の試料以外であれば、使用する試薬や溶液のいずれに添加してもよい。本実施形態では、本発明の蛋白質吸着抑制剤を添加した試薬または溶液中の本発明の誘導体の濃度は、該試薬または溶液の全量に対して０．０１２５～５．０質量％であるのが好ましく、より好ましくは０．１～１．０質量％である。当然ながら、本実施形態においては、測定対象物である血清、標識抗体または標識抗原等の蛋白質含有試料が基材に接触する前に、当該試薬または溶液を基材に接触させる必要がある。

　さらに別の実施形態としては、上記免疫反応容器や測定器具等の基材の表面に、まず、酵素、標識抗体または標識抗原等の試料中に含まれる測定対象の蛋白質を結合させた後、本発明の蛋白質吸着抑制剤で基材を処理する方法を挙げることができる。例えば、ポリスチレン製プレートを使用する際に、該プレートに測定対象物である蛋白質を物理吸着または化学結合させ、適当な溶媒で洗浄した後、本発明の蛋白質吸着抑制剤溶液を接触させる。つまり、測定対象物をプレート表面に吸着させた後、対象物が吸着していないプレート表面部分への蛋白質の吸着を抑制するため、本発明の誘導体を吸着させる。これによって、以後の測定工程において基材への蛋白質の非特異的な吸着を抑制する方法である。

　以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例においては、式（１）の化合物を単に誘導体と称する。

＜合成例１：誘導体１（ｍ＝３，ｎ＝４４）の合成＞
　ＭＰＣ；２．１６ｇ（７．３１ｍｍｏｌ）を、温度計を付けた三口フラスコに仕込み、メタノール；３４．３２ｇを加えて均一に撹拌し、３０分間窒素を吹き込んだ。α－アミノプロピル－ω－メルカプトエトキシ－ポリオキシエチレン塩酸塩（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＳＨ－０２０ＰＡ（ｍ＝３，ｎ＝４４）、日油株式会社製）；１５．００ｇ（７．３１ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン；０．０７７ｍＬ（０．５８ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で４８時間撹拌した。得られた反応液を冷却した酢酸エチル中に滴下し、生成した沈殿物を濾過することにより白色固体を得た。

　得られた白色固体について、¹Ｈ－ＮＭＲ分析、ＩＲ分析を行った結果を以下に示す。ＩＲはＦＴ／ＩＲ－６１００（日本分光株式会社製）、ＮＭＲはＪＮＭ－ＡＬ４００（日本電子株式会社製）により測定した。

＜合成例１の白色固体のＩＲおよび¹Ｈ－ＮＭＲ測定結果＞
［ＩＲ］
　３４３０ｃｍ^-1（－ＮＨ₂）、２８７５ｃｍ^-1（－ＣＨ）、１６３９ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏ）、１４５７ｃｍ^-1（－ＣＨ）、１２４９ｃｍ^-1（Ｐ＝Ｏ）、１１０２ｃｍ^-1（－ＯＰＯＣＨ₂－）、９５３ｃｍ^-1（－Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃）
［¹Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ溶媒）］
　１．２５ｐｐｍ（－ＣＨ₃）、１．９４－１．９９ｐｐｍ（Ｈ₂ＮＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－）、２．７７－２．８９ｐｐｍ（－ＳＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）－、Ｈ₂ＮＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－）、３．１０－３．１４ｐｐｍ（ＮＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－）、３．２２ｐｐｍ（－Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃）、２．６６－３．７４ｐｐｍ（－ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ－）、３．８４－３．９０ｐｐｍ（－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃）、４．１１－４．１２ｐｐｍ（－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃）、４．３１－４．３６ｐｐｍ（－ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＰ－）

　上記測定結果から、得られた白色固体は下記式（１－１）に示す誘導体１であると同定した。

＜比較合成例１：共重合体１（ＭＰＣ／ＢＭＡ共重合体）の合成＞
　ＭＰＣ；１７．８５ｇ（６０．４５ｍｍｏｌ）とメタクリル酸ブチル（以下、ＢＭＡとする）；２．１５ｇ（１５．１２ｍｍｏｌ）をエタノール；３０ｇ、蒸留水：３０ｇの混合溶媒に溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの四口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、４０℃でアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を０．３２８ｇ加えて４時間重合後、７０℃に昇温し、さらに３時間反応させて重合体を得た。重合液をアセトン中に滴下し、沈殿物を濾過することにより共重合体１の白色固体を得た。

　得られた共重合体１をＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ（東ソー株式会社製）によりＧＰＣ分析した結果、その分子量はポリエチレングリコール換算で１，２１０，０００であった。

（実施例１）
＜蛋白質吸着抑制剤溶液１の調製＞
　合成例１で得た誘導体１を炭酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．８）に、その濃度が１．０質量％となるように溶解して蛋白質吸着抑制剤溶液１を調製した。

＜基材（アミノプレート）への蛋白質吸着抑制方法の実施、誘導体１が基材表面に吸着したホスホリルコリン修飾基材の調製、および蛋白質吸着抑制効果の評価＞
　以下のようにして免疫反応測定を行い、該測定においてアミノプレートへの蛋白質吸着抑制方法を実施して誘導体１が基材表面に吸着したホスホリルコリン修飾基材を調製し、蛋白質吸着抑制効果を評価した。

　アミノプレート（住友ベークライト社製）に５ｍＭのＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、以下、ＤＭＳとする）溶液（溶媒は０．２Ｍのトリエタノールアミン水溶液）を１００μＬ／ウェル加え、室温にて３０分間静置した。ＤＭＳ溶液を除去した後に、蛋白質吸着抑制剤溶液１を１００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置し、その後蛋白質吸着抑制剤溶液１を除去した。ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ　ＢＵＦＦＥＲＥＤ　ＳＡＬＩＮＥ（－）（以下、ＰＢＳとする）で７２０００倍希釈したＨＲＰ標識ＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ社製）を１００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置した。ウェル内のＨＲＰ標識ＩｇＧ溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の入ったＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、除去する洗浄工程を４回繰り返した。洗浄後に、ＨＲＰ用発色液（ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ウェル加え、室温にて７分間反応させ、７分後に２Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加えることで反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することでウェル内に吸着した蛋白質を検出した。吸光度は３回の測定の平均値を用いた。吸光度が小さいほど蛋白質の吸着が抑制されていることを示す。

　蛋白質吸着抑制効果は、実施例１の吸光度と下記の比較例１の吸光度とから下記式で算出する相対的な蛋白質吸着率により評価した。すなわち、実施例１のアミノプレートへの蛋白質吸着率を、比較例１のアミノプレートへの蛋白質吸着率を１００％としたときの相対吸着率で評価した。結果を表１に示す。
　　実施例１の蛋白質吸着率＝（実施例１の吸光度／比較例１の吸光度）×１００

（比較例１）
　蛋白質吸着抑制剤溶液１の代わりに、誘導体１が溶解していない炭酸緩衝液を使用した以外は実施例１と同様にして免疫測定反応を行い、実施例１と同様に吸光度を測定した。結果を表１に示す。比較例１の蛋白質吸着率を１００％とする。

　表１から明らかなように、誘導体１を使用して本発明の基材への蛋白質吸着抑制方法を実施した実施例１は、蛋白質吸着抑制方法を実施していない比較例１と比較して吸光度が半分以下であり、基材であるアミノプレートへの蛋白質吸着率が半分以下であった。従って、アミノプレートへの蛋白質の非特異的吸着を効果的に防止していることが判る。

（実施例２）
＜耐洗浄性（耐脱着性）＞
　合成例１で得た誘導体１の耐洗浄性を、以下に示す方法により共重合体１と比較して評価した。すなわち、誘導体１が基材表面に吸着している誘導体１修飾材の洗浄の有無での吸光度の相違と、共重合体１が基材表面に吸着している共重合体１修飾材の洗浄の有無での吸光度の相違とを比較し、誘導体１および共重合体１の耐洗浄性を評価した。具体的には、洗浄有のときの吸光度と、洗浄無のときの吸光度から下記式により耐洗浄性を算出して評価した。
　　耐洗浄性（％）＝（洗浄無のときの吸光度／洗浄有のときの吸光度）×１００

　耐洗浄性は、数値が大きいほど、すなわち洗浄の有無での吸光度の差が小さいほど、洗浄による基材に吸着した吸着物質の脱着が少なく（脱着率が小さく）、耐洗浄性が良好であることを示す。

（実施例２－１）
　蛋白質吸着抑制剤溶液１を使用し、実施例１と同様にして免疫反応測定を行い、同様に吸光度を測定した。

（実施例２－２）
　蛋白質吸着抑制剤溶液１を除去した後に、ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え除去する洗浄工程を３回繰り返したこと以外は実施例１と同様にして免疫反応測定を行い、同様に吸光度を測定した。

　実施例２－１の吸光度と実施例２－２の吸光度とから上記式で耐洗浄性を算出した。結果を表２に示す。

（比較例２－１）
　蛋白質吸着抑制剤溶液１の代わりに、共重合体１を１．０質量％となるようにＰＢＳに溶解した共重合体１のＰＢＳ溶液を用いた。さらに、Ｎｕｎｃ　ｍａｘｉｓｏａｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、ＤＭＳを添加しなかった。これらの点以外は実施例１と同様にして免疫反応測定を行い、同様に吸光度を測定した。

（比較例２－２）
　共重合体１のＰＢＳ溶液を除去した後に、ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え除去する洗浄工程を３回繰り返したこと以外は比較例２－１と同様にして免疫反応測定を行い、同様に吸光度を測定した。

　比較例２－１の吸光度と比較例２－２の吸光度とから上記式で耐洗浄性を算出した。結果を表２に示す。

（比較例２－３）
　蛋白質吸着抑制剤溶液１の代わりに、共重合体１を１．０質量％となるようにＰＢＳに溶解した共重合体１のＰＢＳ溶液を用いたこと以外は実施例１と同様にして免疫反応測定を行い、同様に吸光度を測定した。

（比較例２－４）
　共重合体１のＰＢＳ溶液を除去した後に、ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え除去する洗浄工程を３回繰り返したこと以外は比較例２－３と同様にして免疫反応測定を行い、同様に吸光度を測定した。

　比較例２－３の吸光度と比較例２－４の吸光度とから上記式で耐洗浄性を算出した。結果を表２に示す。

　表２から明らかなように、誘導体１の基材からの洗浄による脱着率は、共重合体１の洗浄による脱着率と比較して極めて小さく、耐洗浄性が優れていることが分かる。

（実施例３－１）
　以下のようにして免疫反応測定を行い、該測定において磁性微粒子への蛋白質吸着抑制方法を実施して、誘導体１が粒子表面に吸着している誘導体１結合磁性微粒子を調製し、蛋白質吸着抑制効果を評価した。

＜磁性微粒子への反応＞
　１６μＬの磁性微粒子（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）　ＭｙＯｎｅ（商標）　Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ）をポリプロピレン製のマイクロチューブにとり、３２μＬのＭＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．０、以下、ＭＥＳ緩衝液とする）を加え除去する洗浄工程を２回実施した。そこに、２μＬの水溶性カルボジイミド溶液（２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＥＳ緩衝液に溶解）と２μＬのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド溶液（１２ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＥＳ緩衝液に溶解）を加え、室温で３０分間反応させた。反応後、３２μＬのＭＥＳ緩衝液を加え除去する洗浄を実施し、合成例１で得た誘導体１が１ｗｔ％となるように２５ｍＭのＣＡＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０、以下ＣＡＰＳ緩衝液とする）に溶解した溶液を８μＬ加え、撹拌した後に３７℃で２時間反応させた。これを誘導体１結合磁性微粒子として回収した。なお、磁性微粒子の洗浄と回収にはネオジム磁石を使用した。

＜誘導体１結合磁性微粒子の蛋白質吸着試験＞
　誘導体１結合磁性微粒子に７８４μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（以下、ＨＥＰＥＳ－Ｔ緩衝液とする）を加え、撹拌した後に、Ｖ底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル分注し、上清を廃棄した。そこにＨＥＰＥＳ緩衝液で１００００倍希釈したＨＲＰ標識ＩｇＧを１００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。その後、１００μＬ／ウェルのＨＥＰＥＳ－Ｔ緩衝液を加え、除去する洗浄工程を４回繰り返した。洗浄後、ＨＲＰ用発色液（ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ウェル加え、室温にて７分間反応させ、７分後に２Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加えることで反応を停止した。反応液を平底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル移し、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することでウェル内に吸着した蛋白質を検出した。結果を表３に示す。吸光度が小さいほど蛋白質の吸着が抑制されていることを示す。

　蛋白質吸着抑制効果は、実施例３－１の吸光度と下記の比較例３－１の吸光度とから下記式で算出する相対的な蛋白質吸着率により評価した。すなわち、実施例３－１の磁性微粒子への蛋白質吸着率を、比較例３－１の磁性微粒子への蛋白質吸着率を１００％としたときの相対吸着率で評価した。結果を表３に示す。
　　実施例３－１の蛋白質吸着率＝（実施例３－１の吸光度／比較例３－１の吸光度）×１００

（実施例３－２）
　誘導体１を３７℃で２時間反応させた後に、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４、以下ＨＥＰＥＳ緩衝液とする）を１６μＬ加え除去する洗浄工程を２回繰り返したこと以外は実施例３－１と同様にして免疫測定反応を行い、得られた吸光度から蛋白質吸着率を算出した。結果を表３に示す。

（実施例３－３）
　誘導体１の濃度を４ｗｔ％としたこと以外は実施例３－１と同様にして免疫測定反応を行い、得られた吸光度から蛋白質吸着率を算出した。結果を表３に示す。

（比較例３－１）
　誘導体１が溶解していない炭酸緩衝液を使用したこと以外は実施例３－１と同様にして免疫測定反応を行い、得られた吸光度から蛋白質吸着率を算出した。結果を表３に示す。

（比較例３－２）
　誘導体１の代わりに共重合体１を使用したこと以外は実施例３－１と同様にして免疫測定反応を行い、得られた吸光度から蛋白質吸着率を算出した。結果を表３に示す。

（比較例３－３）
　誘導体１の代わりに共重合体１を使用したこと以外は実施例３－２と同様にして免疫測定反応を行い、得られた吸光度から蛋白質吸着率を算出した。結果を表３に示す。

　表３から明らかなように、基材として磁性微粒子を用いた場合、本発明の誘導体は特に優れた蛋白質吸着抑制効果を示す。また、実施例３－１および３－２と比較例３－２および３－３との比較から、基材として磁性微粒子を用いた場合も、本発明の誘導体は優れた耐洗浄性を示すことが分かる。

Claims

　式（１）で示されるホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体。

［式（１）中、ｍは１～１０、ｎは２０～２００の整数である。］
　請求項１記載のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を有効成分として含有する、
　蛋白質吸着抑制剤。
　請求項１記載のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体を０．０１～２０質量％含有する、
　蛋白質吸着抑制剤溶液。
　基材と請求項１記載のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体とからなり、前記ホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体が前記基材の表面に吸着している、
　ホスホリルコリン修飾基材。
　基材表面を請求項３に記載の蛋白質吸着抑制剤溶液で処理し、請求項１記載のホスホリルコリン基含有ポリエチレングリコール誘導体の吸着層を形成する工程を有する、
　基材への蛋白質吸着抑制方法。